TWI281911B

TWI281911B - Treatment of tumors with RARalpha selective retinoid compounds in combination with other anti-tumor agents

Info

Publication number: TWI281911B
Application number: TW090107695A
Authority: TW
Inventors: Alissar Nehme; Richard L Beard; Roshantha A Chandraratna
Original assignee: Allergan Inc
Priority date: 2000-04-04
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2007-06-01
Also published as: EP1268405A1; CA2405136C; EP1650188A1; ES2267754T3; ATE331703T1; AU2001253045A1; WO2001074759A1; EP1268405B1; US20010039293A1; CA2405136A1; DE60121145T2; US6387950B2; JP2003534246A; DE60121145D1

Description

1281911 A7

五、發明說明（）發明背景： 1 ·發明領域： (請先閱讀背面之注咅心事項再填寫本頁) 本發明係關於RAR α特定性或選擇性视黃醛化合物與干擾素和其他抗腫瘤劑合併使用之用途。更特定言之，本發明係關於RAR α特定性或選擇性化合物與干擾素和其他抗腫瘤劑合併用於治療乳癌的用途。還更特定言之，本發明係關於4-[(4-氯_3_羥基·5,5,8,8-四甲基-556,7,8-四氯-奈-2_藏基）-胺基]-2,6_二氣-苯甲¾^及相關化合物與干擾素及其他抗腫瘤劑合併使用之用途，其特定於4-[(4 -氯_3_ 羥基·5,5,8,8-四甲基-5,657,8_四氫-蓁-2羰基）_胺基卜 2,6-二氟-苯甲酸及相關化合物與干擾素和其他抗腫瘤劑合併用於治療乳癌的用途。 2 .背景技藝：天然的視黃酸及相關化合物，一般稱爲視黃醛在生藥學、醫學及相關技藝方面已知具有重要的生物活性，包括防止和抑制惡性的細胞增生。有大量的專利和科學文獻存在，係説明視黃醛化合物的合成，其生物活性，以及在人體及其他生物系統中，在體外和體内的條件下針對發現視黃醛作用的各種方式所做的研究。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製特定言之，在本技藝中一般接受抗細胞增生或抗腫瘤的領域之中，具有類似視黃醛化合物做爲活性成份的醫藥組合物有用於治療或防止皮膚的過度增生疾病，以及其他前惡係與惡性的過度增生疾病，如乳癌、皮膚癌、前列腺癌、頸癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、胃癌、肺癌、喉 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1281911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 2 五、發明說明（）癌、口腔癌、血癌和淋巴系統的癌症，組織變形、結構不良、贅生、黏膜自斑病和黏膜的乳頭淋瘤，以及治療卡布希氏（Kaposi)肉瘤。然而，用視黃醛治療哺乳動物一般已認知的壞處是其黏膜皮膚的毒性，其發生在以有效劑量的視黃醛進行局部或全身治療時，多於9 0 %的病患身上。目前在本技藝中亦爲普通常識的是有兩種主要型式的視黃醛受體存在於哺乳動物（及其他生物）體内。該二種主要型式或分類之受體分別稱爲RAR和RXR。在每種型式當中有其次型；在RAR家族之中，該次型稱爲RAR a，RAR 和RAR Γ，在RXR中，該次型稱爲RXR汉，RXR 0和RXR厂。在本技藝中亦已建立以下認知：即該二種主要的視黃酸受體型式及其數種次型在各種哺乳動物組織和器官中的分佈並不均勻。而且，在本技藝中一般接受許多不想要的視黃醛副作用，如黏膜皮膚之毒性是由一種或更多RAR受體的次型所調節的。Standeven等人的出版物 <〈毒物學通信 >>第92期（ 1997年）231 -240頁揭示以RAR α選擇性視黃酸治療老鼠會造成顯著降低皮膚刺激（黏膜皮膚毒性），甚於具有強的RAR 和尤其是RAR，激動劑活性之視黃酸治療者。美國專利案第5,965,60_6號揭示RAR α特定性或選擇性視黃醛治療腫瘤的方法，而此種視黃醛的合成則在此專利案以及美國專利案第5,856,490號中有説明。美國專利案第 5,965,606號之一種重要的RARa選擇性化合物（本專利參考文獻之化合物32)顯示在下方。 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---.---\------裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1281911 A7 B7 3 五、發明說明（）關於使用視黃酸與其他藥物合併治療腫瘤，在本技藝中有發表的報告指不某些視黃酸化合，物有加成作用，而某些甚至會與其他已知的抗腫瘤化學治療劑，如干擾素和其他藥物協同作用於數種乳癌細胞培養以壓制或抑止癌細胞的增生。Fanjnl等人在 << 癌症研究〉〉第56期，1571 - 1577頁 (1996年）中的發表文章説明數説視黃醛化合物的檢驗，包括一種在該發表文章中稱做SRI 11220之化合物與干擾素在數種癌細胞株之中合併的檢驗，並且陳述在某些細胞株之中，化合物SRJ 11220和干擾素的抗增生活性是協同的。此項先前技藝之化合物SRI 11220的結構顯示於下方。然而，顯然地Fanjnl等人之參考文獻將選擇性視黃醛與干擾素之抑制乳癌細胞歸因於RAR r受體之具潛勢的角色。事實上，SRI 11220化合物在此文獻中揭示爲RARr激動劑。 --V---W----：--_ 裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

化合物32，美國專利第5,965,606號化合物36，美國專利第5,856,490號經濟部智慧財產局員工消費合作社印製先前之技藝 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1281911

五、發明說明（

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 SRI 11220(先前之技藝） T〇ma等人在國際腫瘤與雜誌》，第10期：597-607頁 ( 1997年）之發表物中説明某些其他視黃醛，如完全反式的視黃酸（tRA)與從-干擾素（“ IFN)有協同效應，且與其他化學治療劑如塔莫科希芬（tam〇xifen，τAM )在MCF _ 7人類礼癌細胞株中有協同效應。作爲本發明之進一步的背景，吾人注意到Kurbacher等人在 << 癌症通信>> 第1〇3期（1996 年）183-189頁的發表物中説明維生素c與某些化學治療性的抗腫瘤用劑在MCF-7和MDA-MB 231人類癌細胞株中有協同作用。 ^ 美國專利案第5,856,490號揭示四氫莕之芳基或雜芳基醯胺類，其一般而言是RAR以特定性視黃醛。在化合物之中’特定説明以做爲該參考文獻之較佳具體實例的是2，6 _ 二氟 _4-[3’ -羥基-4、溴-5，，6，，7，，8’-四氫-5，，5，，8、8、四曱基萘-2、基）胺甲醯基]苯甲酸，其結構顯示於上方。在第5,856,490號參考文獻中，此化合物標記爲化合物3 6。發明摘述 -----——裝·丨 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · -7 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1281911 A7 B7 5 五、發明說明（） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明係關於RAR α特定性或選擇性視黃酸與其他抗腫瘤劑用於治療需要此種治療之哺乳動物體内的惡性疾病或狀況之用途。該RAR α特定性或選擇性視黃酸一般而·言係以包含一種醫藥上可接受之賦形劑和RAR α特定性或選擇性視黃醛做爲活性成份的醫藥組合物施用在需要此種治療的哺乳動物身上。該合併治療的其他抗腫瘤劑可在同樣或相異的醫藥組合物之中施用。本發明亦關於式1的化合物及該化合物之醫藥上可接受的鹽：

R = H或碳數較低至i至6個碳的烷基式1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製其中R代表Η或具有丨至6個碳之碳&較低的烷基，以及式1 化合物與其他抗腫瘤用劑合併用於治療需要此種治療之哺乳動物的惡性疾病或狀況上的用途。還有，本發明亦關於用以治療需要此種治療+哺乳動物身上的惡性腫瘤或狀況的醫藥組合物，其中該組合物的活性成份包含一種或更多的式1化合物。此種包含一種或更多式1化合物做爲其活性成份的醫藥組合物可有利地與一種或更多其他抗腫瘤用劑合併用於治療需要此種治療之哺乳動物的惡性腫瘤或狀 -8 - 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I28l9ii A7 ^—--51_____ 五、發明說明（6 ) 附圖之簡短説明·· 圖1是一張顯示本發明的化合物AGN 195 183 (化合物2 )和 α干擾素（IFN α )之組合在SKBR-3細胞中之抗增生效應的協同作用之作圖。圖2是一張顯示本發明的化合物AGN 195 183 (化合物2 )和 r\ — 卞擾素（IFN /?)之組合在SKBR- 3細胞中之抗增生效應的協同作用之作圖。圖3是一張顯示本發明的化合物AGN 195183 (化合物2)和 r干擾素（IFN r )之組合在SKBR-3細胞中之抗增生效應的協同作用之作圖。圖4是另一張顯示本發明的化合物agn 195183 (化合物2) 和α干擾素（IFN α )之組合在SKBR-3細胞中之抗增生效應的協同作用之作圖。圖5是另一張顯示本發明的化合物agn 195183 (化合物2) 和々干擾素（IFN /?)之組合在SKBR- 3細胞中之抗增生效應的協同作用之作圖。圖6是另一張顯示本發明的化合物agn 195 183 (化合物2 ) 和广干擾素（IFN r )之組合在SKBR-3細胞中之抗增生效應的協同作用之作圖。圖7是一張顯示本發明的化合物AGN 195 183 (化合物2 )和 “干擾素（IFN從）之組合在T47 - D細胞中之抗增生效應的協同作用之作圖。圖8是一張顯示本發明的化合物AGN 195 183 (化合物2 )和 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —/ —\— ：—_ 裝— (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 訂：經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1281911 Α7

五、發明說明（）乃干擾素（IFN卢）之組合在T47 _D細胞中之抗增生效應的協同作用之作圖。 ---,---\---^* 裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖9是一張顯示本發明的化合物agn 195183 (化合物2)和 ^干擾素（IFN r )之組合在T47-D細胞中之抗增生效應的協同作用之作圖。圖1 0是另一張顯示本發明的化合物AGN 195183 (化合物2) 和α干擾素（IFN^〇之組合在T47-D細胞中之抗增生效應的協同作用之作圖。圖1 1是另一張顯示本發明的化合物AGN 195183 (化合物2) 和冷干擾素（IFNy5 )之組合在T47-D細胞中之抗增生效應的協同作用之作圖。圖1 2是另一張顯示本發明的化合物AGN 195 183 (化合物2 ) 和r干擾素（IFN r )之組合在T47-D細胞中之抗增生效應的協同作用之作圖。圖1 3是另一張顯示本發明的化合物AGN 195 183 (化合物2) 在丁47_0細胞和在SKBR_3細胞中之效應的作圖。用於本發明檢驗以建立選擇性之RAR從特定性或選擇性化合物經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 RAR α特定性和/或RAR α選擇性化合物可如例如美國專利案第5,856,490號和5,9^5,606號所説明的方法獲得，該專利之説明書明確地以參考文獻併入本説明書中。這些參考文獻亦提供數據以顯示該化合物確實是RAR α特定性或選擇性的激動劑。本技藝中已知測試化合物並建立其是否爲 RAR α特定性或選擇性激動劑的檢驗法，且其在許多先前 -10- 用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1281911 A7 B7 五、發明說明（8 ) 技藝之出版物和專利中有説明。例如，一種嵌合受體轉活化檢驗係測試RAR a，RAR /?，RAR r，RXR α，受體次型中類似激動劑之活性者，且根據Feigmer P.L.和Holm. Μ-ΐ： 1989 年）在<< 焦點 >> ，第 112期之研究者，詳細説明於美國專利案第5,455,265號之中。美國專利案第5,455,265號之説明書以參考文獻方式明確地併在本明書中。全受體轉活化檢驗和配體結合檢驗係分別測量本發明之化合物的拮抗劑/激動劑類似活性，或其與數種視黃醛受體次型結合的能力，該檢驗説明在已出版之PCT申請案W 0 93/11755號（尤其是第3 0-3 3頁和第37_41頁），於1993年6 月2 4日出版者，該專利之説明書亦以參考文獻併在本説明書中。配體結合檢驗的説明亦提供於下方。配體結合檢驗所有的結合檢驗均以相似的方式進行。所有六種受體型式係得自在巴氏病毒（Baculovirus )内表現之表現的受體型式（RAR α，/3，r和RXR “，/?，r )。所有化合物的貯備溶液均製備爲10 mM乙醇溶液，並經過連續稀釋成爲1 : 1 DMSO ··乙醇。檢驗緩衝液包含以下物質，用於所有六種受體檢驗中：8 %甘油，120 mM KC1，8 mM Tris，5 mM CHAPS，4mMPTT 和 0.24mMPMSF，ρΗ-7·4@室溫。所有受體結合檢驗均以相同的方式進行。最終檢驗體積爲250微升，且包含自1 0 - 4 0微克抽取物蛋白質，視待檢驗的受體而定，且具有5 ηΜ [3 Η ]全部反式的視黃酸或10 ηΜ [3 Η ] 9 -順式視黃酸和不同的競爭配體濃度，該濃度範圍在 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I裝--------訂---- -----. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1281911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 9 五、發明說明（） 0 - 1 0_ 5 Μ。該檢驗經格式化用於9 6槽的微試管系統中。在 4 °C實行培育直到達到平衡。非特定性結合乃定義爲在1〇〇〇 nM適當標記之視黃酸異構物存在下所保留的結合狀態。在培育期間之末尾，將5 0微升6.25 %羥磷灰石添加劑適當的沖洗緩衝液中。該沖洗緩衝液包含100 mM KC1，100 mM Tris 和 5 mM CHAPS ( RXR π ，/?，尸）或〇.5%TritonX-100 (RAR α，r )。將該混合物振盪混合並且在4 °C培育 1 0分鐘，離心並將懸浮液除去。用適當的沖洗用緩衝液沖洗羥磷灰石三次。受體-配體複合物被羥磷灰石所吸收。以液態閃爍計數法計算羥磷灰石粒塊以測定受體·配體複合物的量。在校正非特定結合之後，測定I C 5 〇的値。I C 5 〇定義爲降低5 0 %特定性結合所需的競爭配體濃度。I c 5 〇的値係從數據之對數-對數作圖以作圖法測得。Kd値則是將陳-普魯梭夫（Cheng-Prussof)公式套用至1C 5 〇値，標記的配體濃度和標記之配體的Kd來測定。配體結合檢驗的結果係以K d數字表示（請參考Chang等人 <<生化藥理學 >>，第22卷，3099-3108頁，明確地以參考文獻方式併入本説明書中）。詳細之完全受體轉活化的實驗程序業經Heyman等人，< < 細胞〉〉，第 68 期，397-406 頁（ 1992 年）；Allegretto 等人， <<生物化學雜誌 >>，第268期，26625-26633頁，以及 Mangelsdorf等人，<<視黃酸：生物，化學與醫藥>>，第 3 I9-349頁），Raven Press公司出版，紐約，其明確地以參 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —^ —：.—*——裝— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂： 1281911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 10 五、發明說明（）考文獻併入本説明書中。在本檢驗中已獲得的結果係以 ec50數字來表示，亦如同其在嵌合受體轉活化檢驗中的表示方法。在嵌合轉活化檢驗中，本專利説明書之化合物2被發現具有180 nM的E C 5 〇値，而在RAR α受體中有7 5 %的效率，並且在受體結合檢驗中其Kd値爲5 ηΜ。對於RAR/?和RAR r 受體而言，化合物2經發現不具有激動劑活性，而其E C 5 〇値大於ΙΟ4 nM。還有另一項轉活化檢驗「PGR檢驗」説明在Klein等人， <<生物化學雜誌 >>，第271期，22692-22696頁（ 1996年）的發表物中，其明確地以參考資料併入本説明書中，而且詳細的説明亦提供於下方。PGR檢驗的結果亦以E C 5 〇數字 (nM濃度）來表示。 RAR-P-GR完整受體之轉活化檢驗以含有4個複本之R 5 G視黃醛DN A反應元素的蟲螢光素酶報導質體（MTV-4(R5G)-Luc(0.7微克/每槽））和RXR α表現用質體pRS-hRXRa (0.1微克/每槽）及以RAR-P-GR表現載體（0.05微克/每槽）中之一種在1 2孔槽的盤中經由磷酸鈣沉澱瞬間對C V - 1細胞（4 X 1 0 5個細胞/每槽）進行轉移感染，Chen等人（ 1987年）<<分子細胞生物學〉〉，第7期， 2745-2752頁，如Klein在 << 生物化學雜誌 >>，第271期， 22692頁中説明者，以上參考過。三種不同的RAR-P-GR 表現質體 pRS - RAR 汉-P - G R，pcDNA 3 RAR /5 P - G R 和 pcDNA 3 RAR r - P - G R 分別表現 RAR 汉，RAR 牙口 RAR r -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） IJ---/---f裝—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·. 鑣 1281911 A7 B7 五、發明說明（11 受體，其含有經修飾的DNA結合區位，使其「p-盒子區」改變成爲糖皮質激素的ΓΡ-盒子區」。這^rar；；_gI受體與RXR結合至DNA成爲異二聚體複合物。特定言之， RAR-P-GR受體與視黃酸反應元素，稱爲R5G者結合， R5 G包含兩個RAR半區位（核苷酸序列5，_GGTTCA_ 3，）由$ 個驗基對分隔，而其中3，_半區位業經修飾成爲糖表質激素受體的半區位5，-AGAACA-3,。爲了容許轉移感染效率之變化，故使用卢-半乳糖甞酶表現質體（〇〇1微克/每槽）做爲内部調整。或者，在一96孔微滴定盤格式（5〇〇〇細胞/每槽）中進行檢驗，其方式與以上説明者完全相同，除了在每槽中施加1 / 5量的DNA -磷酸鈣沉澱物（用2 〇微升取代1〇〇微升）。在加入DNA沉澱物後8小時，用磷酸緩衝之鹽液<pBS) 潤洗細胞並用D-MEM(Gibco_BRL出品）含10〇/〇活性碳萃取之胎牛血清（Gemini Bio_Products出品）者飼育之。用附圖中指出的化合物處理細胞1 8小時。用pbs潤洗之後，將細胞溶解，而用先前説明在de Wet ( 1987年），<< 分子細胞生物學》，第7期，725-737頁的方法測量蟲螢光素酶的活性。蟲螢光素酶的數値代表以-半乳糖酶活性正規化之三次重複測定的平均値土 SEM。本發明使用之較佳RARa選擇性激動劑化合物目前本發明之較佳的RAR α特定性或選擇性化合物係揭示於美國專利案第5,965,606號者。本發明之最佳rAr “特定性或選擇性化合物顯示於式1之中，這些化合物亦代表新的物質組合物且被認爲是新穎JL創新的。本發明化合物 -14 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝--------訂---------線屬經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1281911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _______B7 " 12 "------- 五、發明說明（）之較佳具體實例在式1之範疇中者是式i之中的R基團爲Η 或含1至3個破之較低碳數燒基者，或其醫藥上可接受的鹽。本發明之最佳化合物是其中化爲11者，或該化合物2醫藥上可接受的鹽。在此關聯之中要注意醫藥上可接受的鹽是任何保留母化合物之活性者且不會對其施用對象二其= 用前後過程給予任何損害或不幸的影響。醫藥上可接受的鹽類可得自有機或無機的鹼。該鹽可爲單價或多價的離子，尤其有興趣的是無機離子，鈉，鉀，鈣和鎂。有機鹽可用胺類製備，尤其是銨鹽如單·，二-和三烷基胺或乙醇胺。鹽亦可從咖啡因、三甲醇胺基甲烷和相似的分子形成。一般而言，式1的化合物可由美國專利案第5,856 49〇號説明的合成程序獲得，該專利明確地以參考文獻併1本説明書中。目前較佳之用於製備本發明較佳化合物，其中r 馬Η者以及對應之乙酯的合成方法在以下有詳細説明。本發明化合物之抗增生作用本發明化合物之抗增生作闕以本技藝中廣爲接受的檢驗證明。這些檢驗是在本發明之較佳化合物，即化合物2 上（亦稱爲AGN195183 )實行的，且在不含或與人的^重组 π，^和广干擾素在本芦藝中詳知爲抗腫瘤用劑者合併施用（AGN編號是在研究言中由本發明之指定者隨意指派給化合物的數字）。該材料與檢驗程序在以下有詳細之説明。 =驗程序實行之SKBR_3和T47_D亦爲本技藝中詳知且可得自本技藝所詳知的來源。特定言之，如吾人所知，丁_ 本紙張尺度適时關ϋ^έ)Α4規格⑽ ——：---^---ΓΙΦ! S —— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -15- 1281911

五、發明說明（） 4 7 D疋雌性激素受體陽性（E R + )之人類乳癌細胞株，而sK_ BR-3是一種雌性激素受體陰性（ER-)之人類乳癌細胞株。本身在本技藝中已詳知的檢驗程序，涉及測定5 -溴-2，-去氧尿^(BrdU)之併入細胞。如吾人所知，併入較少代表車父少的細胞增殖（抑制細胞增殖），並且這項檢驗在本技二中被接受做爲受檢試劑抗增殖或抗腫瘤活性的測量方法。當兩種或更多抗增殖或可能之抗增殖用劑的組合被檢驗時，其結果可能指出比吾人預期若個別用劑之作用爲加成性’或該作用代表兩種用劑之預期效果的算術乘積（加成性抑制）爲少的增殖抑制作用。或者，事實上以實驗觀察到的抑制作用可大於吾人預期兩種用劑之作用的簡單乘積。此種協同的抗腫瘤或抗增生效果是高度期望的，並且如以下説明在數種檢驗中被觀察到，即當本發明之化合物2與人類重組干擾劑合併使用時。該化合物與干擾素在治療腫瘤’尤其是乳癌時的協同作用，在先前技藝中並未被預期’並且是非顯然易見且令人驚奇的。該檢驗的材料與程序以及測定協同作用的論點説明於以下。測定協同作用試劑之材料、檢驗方法及論據人類重組干擾素從（IFy - “）和人類重組干擾素a (IFN ·卢）係購自Sigma化學公司（密蘇里州的聖路易市）。人類重組干擾素7* (IFN _ y )係購自Roche Diagnostics公司（位於印第安納州的 Indianapolis 市）。IFN _ “，IFN _ 0 和 IFN _ r 的貯備溶液係分別貯存在-7〇，4，和_2〇。0下。IFN操作溶液是在 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —^— -— -ί—裝— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂·· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1281911 A7 ____B7_五、發明說明（14 )使用前藉著在培養基中稀釋來製備的。化合物2 (AGN 195 183 )之5 mM貯備溶液是在DMSO中製備的，並且緊接 .著在培養基中稀釋成指定的最終濃度。較佳化合物之合成（反應流程圖1 )

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

化合物1 化合物2• 反應流程圖1 17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） · ϋ —>i —>i n ϋ an ϋ-A-—-口，I 1 ϋ ϋ a^i ϋ ϋ I I · 1281911 A7 B7 15 - 五、發明說明（) 王^-2,6·二氟甲氧某甲氣基_5·5.8,8-四甲農二 U，7,8_四氫-莕胺基卜笨甲酸酯（化合物Α) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在3 -甲氧基甲氧基-5,5,8,8-四甲基_5,6,7,8-四氫·萘_ 2·羧酸（化合物K，如美國專利案第5,856,49〇號中之説明， 112愛克’ 0.38耄莫耳）溶於6毫升無水二氯甲烷之溶液中添加4_(二甲基胺基）_吡啶（Dmap，1〇〇毫克，0.46毫莫耳），2,6-二氟-4_胺基苯甲酸甲酯（化合物hi，如美國專利案第5,856,490號中之説明77毫克，〇 38毫莫耳）和ι_(3_ 二甲基胺基丙基）·3 -乙基碳二醯胺鹽酸鹽（Edc，11〇亳克，0.57毫莫耳）。在室溫下攪拌該反應混合物至隔夜，然後濃縮至乾。用管柱層析法以乙酸乙酯：己烷（丨：9)純化殘留物而產生標題化合物（化合物A )，呈透明油液。 iH NMR CDC13 d 8.18 (s，1H)，7·38 (s，1H)，7.35 (s，1H)， 7.10 (s，1Η)，5·39 (s，2Η)，3·94 (s，3Η)，3·59 (s，3Η)，1·70 (s， 4H)，1.31 (s，3H)，1.30 (s，3H)。 ^6—-二氟-4-『（3-^^-5,5,8,8-四甲基二5,6,7,8-四新_笈_ 談基胺基1-苯甲酸（化合物B) 將2,6-二氟-4-[(3_甲氧基曱氧基_5,5,8,8 -四甲基· 5，6,7,8 -四氫-莕-2•羧基）-胺基]-苯甲酸甲酯（化合物A，經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 113毫克，0.26毫莫耳）寧於6毫升甲醇的濃液與3滴濃鹽酸在室溫下攪拌至隔夜，然後濃縮至乾。從乙酸乙醋：己虎中使固體再結晶產生呈白色固體之標題化合物（化合: B) 〇 iH NMR 丙酮-d6 d 10.2 (bs，1H)，7.94 (s，1H)，7 56 (s，1H), -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1281911 A7 B7 16 - 五、發明說明（） 7.53 (s5 1H)，6.94 (s, 1H), 1.69 (s5 4H)，1.27 (S，6H) 0 足,6 -二氟·4·|~(3-經基-5,5,8,8-四甲基_5,6,7 丄•莫- g-羰基胺基1·苯甲酸乙酯（化合物C) 在 2,6-二氟-4-[(3-羥基-5,5,8,8-四甲基_5,6,7,8_四氯 -萘-2-羰基）_胺基]-苯甲酸（化合物B，56毫克，〇 13毫莫耳）溶於4毫升丙酮的溶液中添加碳酸鉀（3 6亳克，〇 26毫莫耳）和碘乙烷（0.012毫升，0.14毫莫耳）。使反應混合物在室溫下攪摔4小時，然後濃縮並以管柱層析法用乙酸乙酯：己烷（1 : 9)純化產生呈白色固體之標題化合物（化合物C) 〇 1h NMR CDC13 J 8.00 (s，1H)，7.38 (s，1H)，7.35 (s，1H)， 6.95 (s5 1H), 4.40 (q，J=7.1 Hz，2H)，1.70 (S，4H)，1.41 (t， J=7.2 Hz，3H)，1.31 (s5 3H)，1.29 (s5 3H) 〇 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 裝訂·· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1281911 A7 __ B7 五、發明說明（17) 4 NMR CDC13 d 9.33 (b，1H)，8.56 (b，1H)，7.90 (s，1H)， 7.36 (d，J=9.83 Hz，2H)，4.39 (q，J=7.1 Hz，2H)，1.75 (m，2H)， 1.65 (m, 2H), 1.53 (s, 6H), 1.39 (t9 J=7.2 Hz, 3H)5 1.32 (s? 6H卜 1，6_二氟-4-『（3-#呈基-5,5,8,8_四甲基-5,6,7,8-四氫_基-_2 _羰基）-胺基1 ·苯甲酸（化合物2、在4-[(4·氯_3-#呈基·5,5,8,8_四曱基-5,6,7,8_四氫·萘-2_黢基）-胺基]-2,6-二氟-苯甲酸乙@旨溶於6毫升£1:011的溶液中添加2毫升2M NaOH(aq)。使反應在室溫下擺拌1 2小時’然後用10% HC1予以酸化至pH = 5。以旋轉裝置將多餘的醇蒸發去除，然後用乙酸乙酯（3 X 1 0毫升）對水液層進行萃取。將合併的有機層用水、鹽液沖洗，並以Na2S04乾燥。使溶劑蒸發後，得到呈粗製形式的標題化合物（化合物 2 )，將其在乙酸乙酯/己烷中再結晶產生純粹的標題化合物 (AGN 195183)，呈淺黃色固態。 iH NMR 丙酮-d6 d 7.97 (s，1H)，7·53 (d，J=10.2 Hz，2H)， 1·75 (m，2H)，1.65 (m，2H)，1.54 (s，6H)，1.31 (s，6H) 〇乳癌細胞株的培養將雌性激素受體陽性（ER + )細胞株T-47D和ER_細胞株 SK-BR - 3培養在Dulbecco氏之修飾過的Eagle氏培養基中 (DMEM Gibco BRL，Gaithersburg，MD)，補充以 10%胎牛血清（HyClone公司出品，位於猶他州的Logan市），2 mM左旋麩胺醯胺和1 %抗生素-抗黴菌素（Gibco BRL公司出品）。細胞株係得自美國型式培養收集中心（ATCC，位於馬 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —訂---------· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1281911 A7 B7 18 - i、發明說明（）里蘭州Rockville市，HTB 133和HTB 3 0分另ij是對於τ 4 7 D和SKBR-3)。將細胞培養在37〇C，含有5% (：02之濕度化的氛圍之中。細胞增殖檢驗癌細胞株的檢驗是利用市售之細胞增殖套組（R〇che Diagnostics公司出品）測定的，本質上是遵照製造商的指示進行。將細胞接種到9 6槽的組織培養盤（c〇rning公司出品，位於紐約Corning市）之中，使其濃度爲3000個細胞/每孔槽。24小時以後，用化合物2(AGN195183 )和/或干擾素 (IFNs)或只用溶劑處理細胞。用於本研究之適當的化合物 2 (AGN195183 )濃度是介於 ΙίΤ11]^ 和 10_6M 之間，ifn 的濃度則介於2 5和1000單位/每毫升之間。每7 2小時更換培養基一次。七天之後，將10微升5-溴_2, ·去氧尿苷（Brdu) 添加到每一孔槽中。24小時以後藉由添加100微升抗_Brdu 抗體的BrdU量係藉由測量波長450微米之吸收値得知。每一實驗均重複3次進行。協同作用之論據在細胞培養物中觀察到由於本發明之化合物2 (AGN195183 )與干擾素（IFNs)合併處理所造成的生長抑制經分析以暸解協同和加率作用。協同效應係藉由計算假設之加成性交互作用預期的細胞生長和眞正當兩種用劑合併時之細胞生長百分率的比率來測定的（數値> 1則指示協同政應）。協同政應之統計上的顯著性是利用雙邊學上的t _測驗測定的。 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------/---^--裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1281911 A7 B7 19 —--- 五、發明說明（）

協同作用定義爲：％A X %B>%aB 加成性定義爲：％Ax%B = %AB (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 其中A和B是每一個別用劑的效應，而ab是合併的效應，此係根據Aapro等人在 << 癌症化學療法之藥理學>>，第10 期：161-166頁，1983年，和Marth等人，<< 國家癌症機構雜誌 >>，第77期·· 1197-1202頁，1986年，二者均明確地以參考文獻併入本説明書之中。由檢驗測定到的抗增殖效應經濟部智慧財產局員工消費合作社印製現在參考附圖1至附圖1 2的作圖，其每一者代表得自以上説明之檢驗的結果，其中SKBR - 3和T 4 7 - D分別用本發明之化合物2和人類重組干擾素（IFN)從，0，和r分別處理。附圖1 3之作圖係説明這兩種細胞培養只以本發明之化合物2處理而不使用其他任何抗腫瘤劑的結果。這些作圖的每一者之中，將5-溴_2’·去氧尿：y：(Brdu)的併入畫在 Y(垂直）軸，而將本發明之化合物2的濃度或不同的IFN a，IFNyS或IFN r之濃度分別畫在X(水平）軸上。干擾素之濃度係以國際單位表現，並在本技藝中被接受，而化合物2的莫耳濃度則以對數尺規繪圖。在每一個作圖中，除附圖1 3的作圖之外，包括一條曲線指示出僅使用一種用劑的結果’以兩種用劑合野（化合物2和相對之干擾素）之眞正實驗結果，以及一條用以上説明方式計算的理論曲線，該曲線係假設兩種用劑的效應僅是加成，將BrdU之併入以百分率基底繪圖，相對於當不同濃度之用劑未用於相對作圖中的情形（0濃度代表100%併入）。 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1281911 A7 B7 i、發明說明（）現在特定地參考附圖i，若在該圖所描繪之SkBr_3細胞檢驗中’化合物2的濃度爲10 nM，而IFN α的濃度則有變化可見到實驗或實際觀察到之細胞增殖的抑制作用顯著大於（較少BrdU併入）只用IFNa，並且顯著大於理論之加成曲線，因而顯示化合物2與IFN以的協同效應。附圖2和3 的作圖相似地描緣出在SKBR - 3細胞中之檢驗，其中化合物2的濃度保持固定在10 ηΜ，而IFN 0或IFN广的濃度則分別有改變。附圖2和3的作圖亦顯示合併治療有顯著的協同效果。附圖4，5和6的作圖揭示在SKBR· 3細胞中的檢驗結果，其中IFN a，IFN 和IFN r分別保持在1〇〇國際單位/每毫升（U/ml)的固定濃度，而本發明之化合物2的濃度則有改變。這些作圖亦顯示顯著的協同效應，代表干擾素與化合物2的組合相較於根據這兩種用劑之個別效果所期望的結果有顯著超越的細胞增殖抑制效果。附圖7 ’ 8和9揭示在T47-D細胞中的檢驗結果，這是用固定之化合物2的濃度（1〇〇 nM)與不同濃度之IFN從，IFN 卢以及IFN r分別組合治療的結果。附圖7的作圖透露組合物的抑制作用在使用IFNa時於此細胞株中是加成性的。然而，當使用IFN >5和IFJSJ α時，則觀察到的抑制作用會有顯著的協同性。附圖10和11，12揭示在T4 7-D細胞中的檢驗結果，其中IFN a，IFN 和IFN r的濃度分別保持在1〇〇國際單位/ 每毫升（100 U/ml)的固定濃度，而本發明之化合物2的濃 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------\---:--裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) . # 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1281911 A7 〜^ --------- B7 .11!·! i —, 五、發明說明（）度則有變化。當IFN從使用在該組合中（附圖J 〇)，該組合並非十分有效且只是加成的，但是當使用IFN 0和IFN厂時，再次發現協同抑制作用，此作用曾在只有在高濃度之化合物2下以IFN r共同處理時被觀察到。先前的結果和尤其是本發明之化合物和人類重組干擾素在這兩種癌細胞株上之抗增殖作用的協同性是未預期且令人驚奇的，且其指示出RAR從特定性或RAR “選擇性化合物，並且尤其是本發明之較佳化合物也用於治療涉及惡性細胞增殖的疾病；如癌，而尤其是乳癌。事實上，先前的檢驗指出RARa特定性或RAR“選擇性的化合物，尤其是本發明的車父佳化合物有用於和干擾素合併用於醫療雌性激素受體陽性（T _ 4 7 D )的乳癌細胞株，以及雌性激素受體陰性（SK-BR-3)之人類乳癌細胞株。治療方法及施用方式 RARa特定性或RARq選擇性化合物，且尤其是本發明 <較佳化合物可根據本發明，以全身或局部的方式施用，視諸如：待治療的狀況，特定部位之治療需求，待施用之藥里等考慮以及其他各種考慮而定。對於治療乳癌及許多其他形式的惡性腫瘤，該化合物較爲適合全身施用，以包含此類在本技藝中已詳知適用於腫瘤化療的賦形劑或惰性成份之醫藥組合物來進行。更特定言之，若該化合物是以全身施用，其可調製成粉末、藥片、藥錠或類似者，或呈適用於口服的糖漿或酏劑。對於血管内及腹膜内施用而言，該化合物可製備成能以注射施用的溶液或懸浮液。在 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---.---\----ί--裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂-· # A7 B7 五、經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1281911 發明說明（22) 某些情形之中，藉由注射調配這些化合物可能有用，在某些其他的情形之中，將這些化合物調配成栓劑形式或用以野存在皮下或肌内注射的延長釋出調配物可能有用。 RAR α特定性或RAR從選擇性化合物，且尤其是本發明的較佳化合物可做爲化療用劑施用以治療腫瘤，其係以有用之醫療劑量施用，該劑量會隨狀況而有所改變，並且在某些情況下，會隨受治療狀況的嚴重性和待治療病患之容乂性而有所改變。因此’沒有單--種劑量可以一致使用的，而是需要視腫瘤的特殊性或待治療的惡性狀況而修改使用的劑量。此種劑量可經由例行的實驗達成，對於治療固體腫瘤，尤其是乳癌，吾人冀望對需要該化合物之病患施用化合物大約1至8週，以能有效制止、減緩腫瘤生長或使腫瘤消散的劑量施行之。較好是以口服方式施用該藥物，以較好是每曰劑量在大約50毫克/每日至5〇〇毫克/每日的範圍内施用。最佳的是用於該治療之化合物是本發明的化合物2。較好是將RARa特定性或RARa選擇性化合物，尤是本發明的較佳化合物，而最好是化合物2，依照本發明與其他化學治療劑，如干擾素而較好是人類的重组干擾素或其他已知的腫瘤治療劑合併施用。其他適於和該化合物合併用於治療的化學治_爲：塔莫科希芬（tamixGfen)和二杉醇與干擾素和某些其他的化學治療劑一起使用，可能發生協同性的抗腫瘤效果，且如以上説明之細胞培養檢驗程序所證實者。再此地，當該化合物用於合併治療時，有用 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -·裝 25- 1281911 A7 —-------_ 五、發明說明（23 ) 的治療劑量會隨狀況而有變化，而在某些情形中其會隨待治療的狀況之嚴重性和待治療病患的嚴重性而有變化。因此，所需的劑量可經由例行的實驗達成，這在腫瘤化療學中是慣常進行的。一般而g，吾人期望在合併治療和用於治療固體腫瘤如礼癌的情形中，該化合物之每日劑量在大約5 〇毫克/每日至500 ¾克/每日的範圍。與本發明之化合物合併使用之其他化學治療劑的每日劑量要視該化學治療劑的本性而定，且可利用例行之一般在本技藝中實行的實驗法來達成。當干擾素被用於治療腫瘤，例如乳癌，而與RAR “特定性或 RAR α選擇性化合物，以及尤其是與本發明之較佳化合物合併使用時，干擾素之每曰劑量在大約1至9百萬國際單位 /母日的乾圍内爲適宜。 Γ請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝---- 111111. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims

A8 B8 C8 D8 128 1蘇1〇1〇7695號專利申請案中文申請專利範圍替換本(94年9月) 々、申請專村

1. 一種下式之化合物，

COOR 其中R是Η，含1至6個碳之碳數較低的烷基，該化合物之醫藥上可接受的鹽。 2. 根據申請專利範圍第1項之化合物，其中R是含1至3個碳之碳數較低的烷基。 3. 根據申請專利範圍第1項之化合物，其中R是Η，或該化合物之醫藥上可接受的鹽。 4. 一種用於治療哺乳類動物之腫瘤之醫藥組合物，該組合物包含一種醫藥上可接受的賦形劑和醫療上有效劑量之下式化合物或該化合物之醫藥上可接受的鹽：

COOR 其中R是Η，含1至6個碳之碳數較低的烷基。本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) Αδ Β8

1281911 5·根據申請專利範圍第4項之醫藥組合物，其中在化合物之式中的R是含1至3個碳之碳數較低的烷基。 6·根據中請專利範圍第4項之醫藥組合物，其中在化合物之式中的R疋Η，或該化合物之醫藥上可接受的鹽。 7.根據中請專利範圍第4項之醫藥組合物，其尚包含對治療哺乳動物之腫瘤有效的干擾素。、 8·根據中請專利範固第5項之醫藥組合物，其尚包含對治療哺乳動物之腫瘤有效的干擾素。 9·根據中請專利範圍第6項之醫藥組合物，其尚包含對治療哺乳動物之腫瘤有效的干擾素。 10. 根據申請專利範圍第7項之醫藥組合物，其中該有效於治療哺乳動物之腫瘤的干擾素係至少一成員選自干擾^ α、干擾素/3及干擾素5所組成之群。 11. 根據中請專利範圍第8項之醫藥組合物，其中該有效於治療該腫瘤的干擾素係至少一成員選自干擾素“、干擾素 /3及干擾素5所組成之群。 12. 根據中請專利範圍第9項之醫藥组合物療該腫瘤的干擾素係至少一成員選自干擾素中二擾; /5及干擾素（5所組成之群。 13. 根據申請專利範圍第4項之醫藥組合物，其包含每日劑量大約為50¾克至500毫克之該化合物。 H.根據中請專利範圍第4項之醫藥組合物，其適用於治療乳癌腫瘤。 15.根據申請專利範圍第12項之醫藥組合物，其適用於治療 70256-940919.DOC

1281911 i BCD 1 —---- 六、申請專利範圍乳癌腫瘤。一種用於治瘃兩φ ^ # ，人仏歡而要此種治療之哺乳動物體内腫瘤的醫藥、:且&物，其包括醫藥上可接受之賦形劑和醫療上有效量之下式之化合物， ,里

COOR 了中R疋Η或含1至6個碳之碳數較低的烷基或該化合物之醫藥上可接受的鹽，及有效於治療哺乳動物體内腫瘤之干擾素。其中該化合物 17. 根據申請專利範圍第1 6項的醫藥組合物式中的R為含1至3個碳之碳數較低的烷基其中該化合物 18. 根據申請專利範圍第1 6項的醫藥組合物式中的R是Η，或該化合物之一種醫藥上可接受的鹽。 19·根據申請專利範圍第1 6項的醫藥組合物，其包括每日劑量大約為50亳克至5〇〇毫克之該化合物。 2〇.根據申請專利範圍第1 6項的醫藥組合物，其中該哺乳動物之腫瘤是乳癌。 21·根據申請專利範圍第1 6項的醫藥組合物，其中該干擾素係至少一成員選自干擾素α、干擾素/3及干擾素6所組 70256-940919.DOC - 3 · 本紙張尺度適财® S家鮮(CNS) Α4規格(210 X 297公嫠) 1281911 - C8 D8 六、申請專利範圍成之群。 22.根據申請專利範圍第2 0項的醫藥組合物，其中該干擾素係至少一成員選自干擾素α、干擾素/3及干擾素5所組成之群。 70256-940919.DOC - 4 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐)