ES2901792T3 - Procedimientos de estratificación de pacientes para el tratamiento con agonistas del receptor del ácido retinoico - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un agonista del receptor alfa del ácido retinoico (RARA) para su uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto humano que padece un cáncer, en el que el cáncer es una leucemia, un linfoma, un mieloma múltiple o un síndrome mielodisplásico (SMD) y se ha determinado que las células cancerosas del sujeto tienen un súper potenciador que tiene un locus asociado a un gen RARA localizado en chr17:38458152-38516681 en la estructura genómica hg19, en el que el súper potenciador tiene una fuerza, un intervalo ordinal o un intervalo de prevalencia que es igual o superior a un nivel umbral predeterminado; en el que el procedimiento comprende la etapa de administrar al sujeto la composición farmacéutica que comprende un agonista de RARA.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos de estratificación de pacientes para el tratamiento con agonistas del receptor del ácido retinoico ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los retinoides son una clase de compuestos estructuralmente relacionados con la vitamina A, que comprenden compuestos naturales y sintéticos. Diversas series de retinoides han resultado clínicamente útiles en el tratamiento de enfermedades dermatológicas y oncológicas. El ácido retinoico y sus otros análogos retinoides naturales (el ácido 9-cis retinoico, el ácido 3,4-didehidro retinoico all-trans, el ácido 4-oxo retinoico y el retinol) son compuestos reguladores pleiotrópicos que modulan la estructura y la función de una amplia variedad de células inflamatorias, inmunitarias y estructurales. Son importantes reguladores de la proliferación, diferenciación y morfogénesis de las células epiteliales en los pulmones. Los retinoides ejercen sus efectos biológicos a través de una serie de receptores nucleares hormonales que son factores de transcripción inducibles por ligando y que pertenecen a la superfamilia de los receptores esteroideos/tiroideos.

Los receptores de retinoides se clasifican en dos familias, los receptores de ácido retinoico (RAR) y los receptores de retinoides X (RXR), cada uno de los cuales consiste en tres subtipos distintos (a, p y ^y). Cada subtipo de la familia de genes RAR codifica un número variable de isoformas que surgen del empalme diferencial de dos transcritos primarios de ARN. El ácido todo-trans retinoico es la hormona fisiológica para los receptores de ácido retinoico y se une con aproximadamente la misma afinidad a los tres subtipos de RAR, pero no se une a los receptores RXR para los que el ácido 9-cis retinoico es el ligando natural. Los retinoides tienen efectos antiinflamatorios, alteran la progresión de la diferenciación de las células epiteliales e inhiben la producción de matriz de las células estromales. Estas propiedades han llevado al desarrollo de terapias tópicas y sistémicas con retinoides para trastornos dermatológicos tales como la psoriasis, el acné y las cicatrices cutáneas hipertróficas. Otras aplicaciones incluyen el control de la leucemia promielocítica aguda, el carcinoma de células adeno y escamosas y la fibrosis hepática.

Una limitación en el uso terapéutico de los retinoides ha surgido de la toxicidad relativa observada con los retinoides naturales, el ácido retinoico todo-trans y el ácido retinoico 9-cis. Estos ligandos naturales no son selectivos en cuanto al subtipo de RAR y, por lo tanto, tienen efectos pleiotrópicos en todo el organismo, que a menudo son tóxicos.

Se han descrito diversos retinoides que interactúan selectiva o específicamente con los receptores RAR o RXR o con subtipos específicos (a, p, y) dentro de una clase. Los agonistas específicos de RARA son muy prometedores para el tratamiento de los cánceres y muchos de ellos han entrado en ensayos clínicos en humanos. Sin embargo, sólo un agonista específico de RARA, el tamibaroteno, ha sido aprobado para el tratamiento del cáncer. Además, el tamibaroteno sólo está aprobado en Japón y únicamente para el tratamiento de la leucemia promielocítica aguda, a pesar de los ensayos llevados a cabo en Estados Unidos y Europa. La desconexión entre la eficacia teórica de los agonistas de RARA en el cáncer y la escasez de aprobaciones reglamentarias para tales agentes plantea la cuestión de por qué tales agonistas no son eficaces y seguros en los seres humanos. Por lo tanto, es necesario comprender mejor por qué los agonistas de RARA no han alcanzado su potencial terapéutico.

Los recientes avances en la tecnología genómica y la comprensión de los circuitos reguladores de los genes han conducido al descubrimiento de súper potenciadores. Mientras que muchos genes de un determinado tejido o tipo de cáncer pueden estar regulados por la presencia de potenciadores en la proximidad de la región de codificación del gen, una pequeña minoría de ellos representa una carga altamente asimétrica y desproporcionadamente grande de marcas y maquinaria transcripcional en relación con todos los demás genes activos. Descubrimientos recientes sugieren que estos potenciadores están vinculados a genes de especial relevancia para la función y la supervivencia de la célula que los alberga. Como tal, la asociación de un súper potenciador con un gen indica la importancia relativa de dicho gen para la supervivencia de esa célula. Estas observaciones pueden ser útiles para predecir la eficacia de diversas terapias.

Schlenk et al., Haematologica, The Hematology Journal: Órgano oficial de la Asociación Europea de Hematología, Fondazione Ferrata Storti, IT, vol. 94, Núm. 1, 1 de enero de 2009, páginas 54 a 60 informa de que, en pacientes de edad avanzada con leucemia mieloide aguda, las mutaciones en NPM1 se asocian a la consecución de una remisión completa, y el genotipo " NPM1 mutante sin FLT3-ITD" parece ser un marcador predictivo de la respuesta al ácido transretinoico administrado como complemento de la quimioterapia intensiva.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención es la que se expone en las reivindicaciones. La presente divulgación demuestra que las células (por ejemplo, las células cancerosas o las células de un sujeto que sufre de SMD, por ejemplo, las células de LMA, las células de SMD, las células de cáncer de mama) que contienen una o más de una fuerza súper potenciadora de RARA o un intervalo ordinal son más sensibles al efecto anticanceroso de un agonista de RARA (por ejemplo, un agonista RARA de ganancia de función; o un agonista específico de RARA (por ejemplo, un agonista que es al menos 10X, 100X, 1000X, 10000X o más específico para RAR-a, que para cualquiera de RAR-p o RAR-^y)) que las células que están por debajo de dicho valor umbral.

La invención, como se expone en las reivindicaciones, resuelve el problema de definir qué poblaciones celulares son sensibles a los agonistas del receptor alfa del ácido retinoico ("RARA"), identificar los subgrupos de pacientes que se beneficiarán del tratamiento con agonistas RARA (por ejemplo, estratificar a los pacientes para el tratamiento con un agonista RARA; separar a los que responden al agonista RARA de los que no responden) y proporcionar terapias de tratamiento dirigidas a dichos subgrupos de pacientes. La solución se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que un súper potenciador que tiene una fuerza o intervalo ordinal igual o superior a un valor umbral y que está asociado a un gen que codifica el receptor alfa del ácido retinoico ("RARA") en determinadas células cancerosas es indicativo de que dicha célula responderá al tratamiento con un agonista de RARA. También se desvela que los niveles de transcripción de ARN primario de RARA, en particular los niveles de ARNm, iguales o superiores a un nivel umbral en determinadas células cancerosas son también indicativos de que dichas células cancerosas responderán al tratamiento con un agonista de RARA. En ambos casos, los valores umbral asociados a estos parámetros parecen ser significativamente más predictivos que los niveles de proteína RARA.

En una primera realización, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un agonista del receptor alfa del ácido retinoico (RARA) para su uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto humano que padece un cáncer, en el que el cáncer es una leucemia, un linfoma, un mieloma múltiple o un síndrome mielodisplásico (SMD) y se ha determinado que las células cancerosas del sujeto tienen un súper potenciador que tiene un locus asociado a un gen RARA localizado en chr17:38458152-38516681 en la estructura genómica hg19, en el que el súper potenciador tiene una fuerza, un intervalo ordinal o un intervalo de prevalencia que es igual o superior a un nivel umbral predeterminado; en el que el procedimiento comprende la etapa de administrar al sujeto la composición farmacéutica que comprende un agonista de RARA.

En algunos aspectos de la primera realización, se ha determinado que las células cancerosas del sujeto tienen un súper potenciador asociado a un gen RARA que es al menos 1,75 veces más fuerte que una porción de un súper potenciador asociado a MALAT1, medido por medio de ChIP-seq, en el que la porción está localizada en chr11:65263724-65266724 en la construcción del genoma hg19.

En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer, por ejemplo, una leucemia (por ejemplo, leucemia mieloide aguda).

En la primera realización, se puede determinar que las células cancerosas del sujeto tienen: un súper potenciador asociado a un gen RARA que es al menos 1,5 veces más fuerte que un potenciador correspondiente asociado a un gen RARA en una célula humana o línea celular humana que se sabe que no responde a un agonista RARA.

En la primera realización, se puede determinar que las células cancerosas del sujeto tienen una o más de las siguientes características

a. un súper potenciador asociado a un gen RARA que tiene una fuerza correspondiente a un intervalo de prevalencia que es igual o superior a un corte de prevalencia predeterminado para la fuerza del súper potenciador del gen RARA ; y/o

b. Un súper potenciador asociado a un gen RARA que tiene una fuerza igual o superior a un corte de fuerza predeterminado del gen RARA ; y/o

c. Un súper potenciador asociado a un gen RARA que tiene un ordinal de fuerza correspondiente a un intervalo de prevalencia que es igual o superior a un corte de prevalencia ordinal de fuerza del gen RARA predeterminado; y/o

d. un súper potenciador asociado a un gen RARA que tiene un ordinal de fuerza que es igual o superior a un corte ordinal de fuerza del gen RARA predeterminado.

En ciertos aspectos más específicos, se determina cualquiera de los puntos de corte de prevalencia predeterminados expuestos anteriormente:

a. a partir de una ordenación por intervalo de la fuerza del súper potenciador RARA en una población de muestras del mismo tipo de células cancerosas, en la que se ha determinado que al menos una muestra responde al agonista RARA; y/o

b. a partir de una ordenación por intervalos del ordinal de fuerza del súper potenciador RARA en una población de muestras del mismo tipo de células cancerosas, en la que se ha determinado que al menos una muestra responde al agonista RARA.

En la composición farmacéutica del primer aspecto de la invención, el agonista de RARA puede ser el tamibaroteno. En el primer aspecto de la invención, la leucemia puede ser leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielocítica aguda (LMA) o leucemia mielocítica crónica (LMC), y el linfoma puede ser linfoma de Hodgkin o linfoma no Hodgkin. La LMA puede ser una LMA que no sea de tipo LPA.

En una segunda realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un agonista del receptor alfa del ácido retinoico (RARA) para su uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto que padece cáncer, en el que el cáncer es una leucemia, un linfoma, un mieloma múltiple o un síndrome mielodisplásico, y el procedimiento comprende las etapas de:

a. recibir información relacionada con: la fuerza, el intervalo ordinal o el intervalo de prevalencia de un súper potenciador que tiene un locus asociado a un gen RARA localizado en chr17:38458152-38516681 en la construcción genómica hg19 en una célula cancerosa del sujeto; y

b. administrar al sujeto un agonista de RARA si la información indica: el súper potenciador tiene una fuerza, un intervalo ordinal o un intervalo de prevalencia que es igual o superior a un nivel umbral predeterminado.

En la segunda realización, la etapa a. puede comprender la recepción de información relacionada con uno o más de: i. fuerza del súper potenciador y/o el intervalo de prevalencia de la fuerza del súper potenciador en una población a la que corresponde la fuerza; y/o

ii. el intervalo ordinal de la fuerza del súper potenciador en comparación con otros súper potenciadores en la célula y/o el intervalo de prevalencia del ordinal de fuerza del súper potenciador en una población a la que corresponde el intervalo ordinal; en el que la etapa b. comprende administrar al sujeto un agonista de RARA si la información indica uno o más de:

i. la fuerza del súper potenciador es igual o superior a un valor de corte predeterminado de la fuerza del súper potenciador en una población; y/o

ii. la fuerza del súper potenciador corresponde a un intervalo de prevalencia que es igual o superior a un corte de prevalencia predeterminado de la fuerza del súper potenciador en una población; y/o

iii. el intervalo ordinal de la fuerza del súper potenciador es igual o superior a un valor de corte ordinal predeterminado de la fuerza del súper potenciador ordinal en una población; y/o

iv. el intervalo ordinal de fuerza del súper potenciador corresponde a un intervalo de prevalencia que es igual o superior a un corte de prevalencia predeterminado del ordinal de fuerza del súper potenciador en una población.

En la segunda realización, la etapa b puede comprender la administración al sujeto de un agonista de RARA si la información indica que: el súper potenciador asociado a un gen RARA es al menos 1,75 veces más fuerte que una porción de un súper potenciador asociado a MALAT1 localizado en chr11:65263724-65266724 en la construcción del genoma hg19, o al menos una cantidad equivalente más fuerte que otro potenciador de referencia o locus de súper potenciador; y/o

En la segunda realización, la etapa a. puede comprender recibir información relacionada con uno o más de: i. la fuerza de un súper potenciador asociado a un gen RARA y/o el intervalo de prevalencia de la fuerza del súper potenciador del gen RARA en una población a la que corresponde la fuerza; y/o

ii. el intervalo ordinal de la fuerza de un súper potenciador asociado a un gen RARA en comparación con otros súper potenciadores en la célula y/o el intervalo de prevalencia del ordinal de fuerza de un súper potenciador del gen RARA en una población a la que corresponde el intervalo ordinal y la etapa b. comprende administrar al sujeto un agonista de RARA si la información indica uno o más de:

i. la fuerza de un súper potenciador asociado a un gen RARA es igual o superior a un valor de corte predeterminado de la fuerza del súper potenciador del gen RARA en una población; y/o

ii. la fuerza de un súper potenciador asociado a un gen RARA corresponde a un intervalo de prevalencia que es igual o superior a un corte de prevalencia predeterminado de la fuerza del súper potenciador del gen RARA en una población; y/o

iii. el intervalo ordinal de la fuerza de un súper potenciador asociado a un gen RARA es igual o superior a un valor de corte ordinal predeterminado de la fuerza del súper potenciador del gen RARA en una población; y/o iv. el intervalo ordinal de fuerza de un súper potenciador corresponde a un intervalo de prevalencia que es igual o superior a un corte de prevalencia predeterminado de la fuerza del súper potenciador del gen RARA ordinal en una población.

En la composición farmacéutica del segundo aspecto de la invención, el agonista de RARA puede ser el tamibaroteno.

En el segundo aspecto de la invención, la leucemia puede ser leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielocítica aguda (LMA) o leucemia mielocítica crónica (LMC), y el linfoma puede ser linfoma de Hodgkin o linfoma no Hodgkin. La LMA puede ser una LMA que no sea de tipo LPA.

Este texto desvela una composición farmacéutica envasada que comprende:

a. un agonista de RARA; y

b. un inserto o etiqueta escrita que comprende instrucciones para utilizar el agonista de RARA en un sujeto que padece un cáncer, y cuyas células cancerosas se han determinado de acuerdo con el primer y/o el segundo aspecto de la invención.

Este texto también desvela un procedimiento de predicción de la eficacia de un agonista de RARA en un tratamiento de un cáncer en un sujeto que comprende la etapa de determinar si, habiendo determinado si, o recibir información que:

a. un súper potenciador asociado a un gen RARA en el cáncer tiene una fuerza, un intervalo ordinal o un intervalo de prevalencia que es igual o superior a un nivel umbral predeterminado; en el que a. es predictivo de la eficacia del agonista RARA en el tratamiento.

Este texto también desvela un procedimiento para diagnosticar, pronosticar o tratar a un sujeto que sufre de un cáncer que comprende las etapas de:

a. obtener una muestra de células cancerosas del sujeto;

b. determinar, hacer determinar o recibir información sobre uno o varios de:

i. la fuerza, el intervalo ordinal o el intervalo de prevalencia de un súper potenciador asociado a un gen RARA en la muestra; y

c. administrar una composición terapéutica que comprenda un agonista de RARA si:

i. el súper potenciador tiene una fuerza, un intervalo ordinal o un intervalo de prevalencia que es igual o superior a un nivel de umbral predeterminado.

Este texto también describe un procedimiento que comprende las etapas de:

a. obtener células cancerosas de un sujeto que padece cáncer; y

b. medir las células cancerosas:

i. la fuerza, el intervalo ordinal o el intervalo de prevalencia de un súper potenciador asociado a un gen RARA en la muestra; y

c. comparar la medición obtenida en la etapa b. con un valor umbral.

La presente invención presenta una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece cáncer, en la que la composición comprende un agonista de RARA

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en la presente memoria. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la Descripción Detallada, las Figuras, los Ejemplos y las Realizaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las Figs. 1Ay 1B representan gráficamente el enriquecimiento log² del súper potenciador RARA medido por medio de ChIP-qPCR.

La Fig. 2 muestra el nivel de lecturas de H3K27Ac en el locus RARA determinado por medio de ChIP-seq en 5 líneas celulares diferentes de cáncer de mama. "RARA" indica la localización del gen RARA en el fragmento de ADN analizado.

La Fig. 3 es un listado de los resultados de ChIP-seq para una amplia variedad de líneas celulares y muestras de pacientes. Muestra la fuerza relativa del super reforzador RARA en comparación con una porción del super reforzador MALAT1 en cada una de estas células o muestras de pacientes.

La Fig. 4A muestra la ordenación de la fuerza de RARA SE, expresada como logio RARA/MALATIpara todas las líneas celulares de cáncer de mama y muestras de pacientes analizadas por medio de ChIP-seq en la Fig. 3. La Fig. 4B muestra la ordenación de la fuerza de RARA SE, expresada como logio RARA/MALAT1 para todas las líneas celulares de cáncer de LMA y las muestras de pacientes analizadas por medio de ChIP-seq en la Fig. 3. La Fig. 5 muestra la ordenación de la fuerza de RARA SE, expresada como logio RARA/MALAT1 para todas las líneas celulares hematológicas normales y las muestras de pacientes analizadas por medio de ChIP-seq en la Fig. 3.

La Fig. 6 muestra un gráfico de dispersión de la fuerza de RARA SE, expresada como logio RARA/MALAT1 para las muestras de pacientes frente a las líneas celulares en las distintas células de LMA y cáncer de mama analizadas por medio de ChIP-seq en la Fig. 3.

La Fig. 7 muestra la viabilidad de diversas líneas celulares de cáncer de mama en presencia de distintas dosis de tamibaroteno tras 5 días de tratamiento.

La Fig. 8 muestra la correlación entre el logio de la EC⁵⁰ de tamibaroteno frente a la fuerza de RARA SE ("enriquecimiento en pliegues de RARA/MALATi) para siete líneas celulares de cáncer de mama diferentes. La Fig. 9 muestra la viabilidad de diversas líneas celulares de LMA en presencia de distintas dosis de tamibaroteno tras 5 días de tratamiento.

La Fig. io muestra la correlación entre el logio de la EC⁵o de tamibaroteno frente a once líneas celulares diferentes de LMA.

La Fig. i i muestra los niveles de expresión de ARNm de los tres subtipos diferentes de RAR (RaR-a ("RARA"); RaR-p ("RARB"); y RaR-Y ("RARG")), medidos por el análisis Basado en Matrices de Affymetrix para una línea celular de cáncer de mama sensible al tamibaroteno (Au565) y no sensible (HCCii43).

La Fig. i2 muestra la correlación entre la expresión de ARNm (log² (i+FPKM)) y la fuerza de RARA SE (enriquecimiento en pliegues deRARA/MALATi) para 48 muestras diferentes de pacientes de LMA mediante el uso de ARN-Seq.

La Fig. 13 muestra el nivel de expresión del ARNm inverso medido por rt-qPCR y expresado como dCt para 5 líneas celulares de cáncer de mama diferentes.

La Fig. 14A muestra la correlación entre los niveles de expresión de ARNm medidos por rt-qPCR y la fuerza de RARA SE (enriquecimiento en pliegues deRARA/MALAT1) para siete líneas diferentes de cáncer de mama. La Fig. 14B muestra la correlación entre los niveles de expresión de ARNm medidos por rt-qPCR y la capacidad de respuesta al tamibaroteno (medida por log^-10 EC⁵⁰) para siete líneas celulares de cáncer de mama diferentes. La Fig. 15 es un Western blot que representa el nivel de proteína de tres isoformas conocidas de RARA en 5 líneas diferentes de cáncer de mama.

La Fig. 16 muestra el número de copias de los genes HER2 y RARA en una línea celular de cáncer de mama poco sensible al tamibaroteno (T47D, Fig. 16A) y en una altamente sensible (AU565, Fig. 16B).

La Fig. 17 muestra el nivel de lecturas de H3K27Ac en el locus RARA determinado por medio de ChIP-seq para muestras de pacientes de glioblastoma, neuroblastoma y cáncer colorrectal.

La Fig. 18 muestra la respuesta a diversas dosis diarias de tamibaroteno en un modelo de xenoinjerto de ratón de cáncer de mama derivado de la línea celular (HCC1945).

La Fig. 19 representa un gráfico ordenado por intervalos log^-10 de la fuerza súper potenciadora de RARA en 80 muestras de cáncer de mama, que incluyen la línea celular de cáncer de mama HCC1945.

La Fig. 20A representa un gráfico ordenado por intervalos log^-10 de la fuerza súper potenciadora de RARA en 48 muestras de cáncer de mama de pacientes. Las barras de color más claro representan las muestras cuyo ordinal de intensidad del súper potenciador RARA era igual o superior al corte de prevalencia. Las barras de color más oscuro representan las muestras cuyo ordinal de intensidad del súper potenciador RARA estaba por debajo del corte de prevalencia. La Fig. 20B representa el mismo gráfico ordenado por intervalo que el Panel A e indica además el subtipo específico de cáncer de mama (receptor hormonal positivo (HR+), h ER2 positivo (HER2+) o triple negativo (Tn )), así como el corte de prevalencia calculado para cada subtipo.

Las Figs. 21A y B representan la respuesta a la dosis diaria de tamibaroteno (SY1425) en dos modelos de cáncer de mama de ratón derivados de muestras de pacientes diferentes.

La Fig. 22 muestra los niveles de ARNm de RARA en nueve modelos de cáncer de mama de ratón derivados de muestras de pacientes. La barra blanca representa tanto el valor de CTG-1124 como el corte de prevalencia del 55,3% en esta población.

La Fig. 23A muestra la fuerza del súper potenciador RARA en 6 líneas celulares de LMA. La Fig. 23B representa la capacidad de respuesta de esas mismas 6 líneas celulares de LMA al tratamiento con tamibaroteno. La Fig. 23C representa un gráfico ordenado por intervalos log^-10 de la fuerza del súper potenciador RARA en 94 muestras de LMA que incluyen cuatro de las seis líneas celulares de LMA analizadas en la Fig. 20A y 20B - Sig-M5, MV411, HEL y Kasumi.

La Fig. 24 representa un gráfico ordenado por intervalos lógicos de la fuerza súper potenciadora de RARA en 70 muestras de pacientes de LMA. Las barras de color más claro representan las muestras cuyo ordinal de intensidad del súper potenciador RARA era igual o superior al corte de prevalencia. Las barras de color más oscuro representan las muestras cuyo ordinal de intensidad del súper potenciador RARA estaba por debajo del corte de prevalencia.

La Fig. 25 representa los niveles de ARNm de RARA en las 70 muestras de pacientes de LMA utilizadas en la Fig. 24 y clasificadas de acuerdo con si su ordinal de fuerza súper potenciadora de RARA estaba por encima (o igual) del corte de prevalencia ("RARA alto") o por debajo del corte de prevalencia ("RARA bajo").

Las Figs. 26A y 26D representan la respuesta, medida por el % de células CD45+, a la dosis diaria de tamibaroteno en dos modelos diferentes de LMA de xenoinjerto de ratón derivados de pacientes. Las Figs. 26B y 26E representan el % de células CD45+ en diferentes órganos y fluidos biológicos, y las Figs. 26C y 26F muestran el tiempo de supervivencia de los modelos de ratón.

La Fig. 27A y B muestra la respuesta, medida por el % de células CD45+, a la dosis diaria de tamibaroteno en otros dos modelos de LMA de xenoinjerto de ratón derivados de pacientes. La Fig. 27C representa el % de células CD45+ en diferentes órganos y fluidos biológicos en uno de esos modelos, y la Fig. 27D representa el tiempo de supervivencia en ese modelo.

La Fig. 28 representa los niveles de ARNm de RARA en 64 muestras de pacientes de LMA, que incluyen las cuatro utilizadas para crear modelos de xenoinjerto de ratón (véanse las Figs. 26 y 27). Las barras de color más claro representan las muestras cuyo ARNm de RARA era igual o superior al corte de prevalencia determinado a partir del ordinal de fuerza del súper potenciador de RARA . Las barras de color más oscuro representan muestras cuyo nivel de ARNm de RARA estaba por debajo de ese límite de prevalencia.

La Fig. 29A representa la respuesta de los ratones de xenoinjerto AM5512 a 4 mg/kg de ATRA BID, 3 mg/kg de tamibaroteno BlD y un control con vehículo, medida por el % de células CD45+. La Fig. 29B muestra la tasa de supervivencia de estos ratones durante el transcurso del experimento.

La Fig. 30 es una tabla de diferentes tipos de cáncer en los que más del 5% de las muestras analizadas tenían niveles de ARNm de RARA al menos 2 desviaciones estándar por encima de la media.

La Fig. 31 muestra los niveles de ARNm de RARA en muestras de pacientes con SMD frente a células de pacientes sanos ("normales").

La Fig. 32 representa la correlación entre la fuerza del potenciador RARA y la sensibilidad al tamibaroteno en 11 líneas celulares diferentes de LMA.

La Fig. 33 muestra la correlación entre el nivel de ARNm de RARA y la sensibilidad al tamibaroteno en 11 líneas celulares diferentes de LMA.

DEFINICIONES

A menos que se indique lo contrario, las estructuras representadas en la presente memoria también incluyen todas las formas isoméricas (por ejemplo, enantioméricas, diastereoméricas y geométricas (o conformacionales)) de la estructura; por ejemplo, las configuraciones R y S para cada centro asimétrico, los isómeros de doble enlace Z y E y los isómeros conformacionales Z y E. Por lo tanto, los isómeros estereoquímicos simples, así como las mezclas enantioméricas, diastereoméricas y geométricas (o conformacionales) de los presentes compuestos están dentro del alcance de la invención. A menos que se indique lo contrario, todas las formas tautoméricas de los compuestos de la invención están dentro del alcance de la invención. Además, a menos que se indique lo contrario, las estructuras representadas en la presente memoria también incluyen compuestos que difieren sólo en la presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, los compuestos que tienen las presentes estructuras que incluyen la sustitución del hidrógeno por deuterio o tritio, o la sustitución de un carbono por un carbono enriquecido en 13C o 14C están dentro del alcance de esta invención. Dichos compuestos son útiles, por ejemplo, como herramientas analíticas, como sondas en ensayos biológicos o como agentes terapéuticos de acuerdo con la presente invención.

Como se utiliza en la presente memoria, el término "sal aceptable para uso farmacéutico" se refiere a aquellas sales que son, dentro del ámbito del buen juicio médico, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de los seres humanos y los animales inferiores sin una toxicidad, irritación, respuesta alérgica y similares indebidas, y que son proporcionales a una relación beneficio/riesgo razonable. Las sales aceptables para uso farmacéutico son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, Berge et al., describen en detalle las sales aceptables para uso farmacéutico en J. Pharmaceutical Sciences, 1977, ^{6 6} , 1 a 19que se incorpora a la presente memoria por referencia. Las sales aceptables para uso farmacéutico de los compuestos de esta invención incluyen las derivadas de ácidos y bases inorgánicos y orgánicos adecuados. Los ejemplos de sales de adición de ácidos aceptables para uso farmacéutico y no tóxicas son las sales de un grupo amino formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico o con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico o mediante el uso de otros procedimientos conocidos en la técnica tales como el intercambio de iones. Otras sales aceptables para uso farmacéutico incluyen adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidroyoduro, ² -hidroxietanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, MALATIe, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, sales de valerato y similares. Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen sales de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio y N+(alquilo C^1-4 K . Las sales metálicas alcalinas o alcalinotérreas representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares. Otras sales aceptables para uso farmacéutico incluyen, cuando sea apropiado, amonio no tóxico, amonio cuaternario y cationes de amina formados mediante el uso de contraiones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato de alquilo inferior y sulfonato de arilo.

El término "solvato" se refiere a las formas del compuesto que se asocian con un disolvente, normalmente por una reacción de solvólisis. Esta asociación física puede incluir enlaces de hidrógeno. Los disolventes convencionales incluyen agua, metanol, etanol, ácido acético, DMSO, THF, éter dietílico y similares. Los compuestos descritos en la presente memoria, tales como los de Fórmula (I), se pueden preparar, por ejemplo, en forma cristalina, y se pueden disolver. Los solvatos adecuados incluyen solvatos aceptables para uso farmacéutico y además incluyen solvatos estequiométricos y solvatos no estequiométricos. En ciertos casos, el solvato será capaz de aislarse, por ejemplo, cuando una o más moléculas de solvente se incorporan a la red cristalina de un sólido cristalino. El término "solvato" abarca tanto los solvatos en fase de solución como los aislables. Los solvatos representativos incluyen hidratos, etanolatos y metanolatos.

El término "hidrato" se refiere a un compuesto que se asocia con el agua. Normalmente, el número de moléculas de agua contenidas en un hidrato de un compuesto está en una relación definida con el número de moléculas del compuesto en el hidrato. Por lo tanto, un hidrato de un compuesto puede estar representado, por ejemplo, por la fórmula general R-x H²O, en la que R es el compuesto y en la que x es un número mayor que 0. Un compuesto dado puede formar más de un tipo de hidratos, que incluyen, por ejemplo, monohidratos (x es 1), hidratos inferiores (x es un número mayor que 0 y menor que 1, por ejemplo, hemihidratos (R-0,5 H²O)), y polihidratos (x es un número mayor que 1, por ejemplo, dihidratos (R-2 H²O) y hexahidratos (R-6 H²O)).

Un "sujeto" al que se contempla la administración incluye, pero no se limita a, seres humanos (es decir, un hombre o una mujer de cualquier grupo de edad, por ejemplo, un sujeto pediátrico (por ejemplo, un bebé, un niño, un adolescente) o un sujeto adulto (por ejemplo, un adulto joven, un adulto de mediana edad o un adulto mayor)) y/o otros animales no humanos, por ejemplo, mamíferos ( por ejemplo, primates (por ejemplo, monos cynomolgus, monos rhesus); mamíferos de interés comercial tales como el ganado vacuno, los cerdos, los caballos, las ovejas, las cabras, los gatos y/o los perros) y aves (por ejemplo, aves de interés comercial tales como pollos, patos, gansos y/o pavos). En ciertas realizaciones, el animal es un mamífero. El animal puede ser un macho o una hembra y en cualquier fase de desarrollo. Un animal no humano puede ser un animal transgénico. En ciertas realizaciones, el sujeto es un humano.

Los términos "administrar", "en administración" o "administración", como se utilizan en la presente memoria, se refieren a implantar, absorber, ingerir, inyectar, inhalar o introducir de otro modo un compuesto inventivo o una composición farmacéutica del mismo.

Como se utilizan en la presente memoria, los términos "tratamiento", "tratar" y "en tratamiento" se refieren a revertir, aliviar, retrasar la aparición o inhibir el progreso de una "afección patológica" (por ejemplo, una enfermedad, trastorno o afección, o uno o más signos o síntomas de la misma) descrita en la presente memoria. En algunas realizaciones, "tratamiento", "tratar" y "en tratamiento" requieren que se hayan desarrollado o se hayan observado signos o síntomas del trastorno o afección de la enfermedad. En otras realizaciones, el tratamiento se puede administrar en ausencia de signos o síntomas de la enfermedad o afección. Por ejemplo, el tratamiento se puede administrar a un individuo susceptible antes de la aparición de los síntomas (por ejemplo, a la luz de un historial de síntomas y/o a la luz de factores genéticos u otros factores de susceptibilidad). El tratamiento también puede continuar después de que los síntomas se hayan resuelto, por ejemplo, para retrasar o prevenir la reaparición.

Como se utiliza en la presente memoria, los términos "afección", "enfermedad" y "trastorno" se utilizan indistintamente.

Una "cantidad efectiva" de un compuesto descrito en la presente memoria, tal como el de Fórmula (I), se refiere a una cantidad suficiente para provocar la respuesta biológica deseada, es decir, el tratamiento de la enfermedad. Como apreciarán los expertos en la técnica, la cantidad eficaz de un compuesto descrito en la presente memoria, tal como el de Fórmula (I), puede variar en función de factores tales como el objetivo biológico deseado, la farmacocinética del compuesto, la afección tratada, el modo de administración y la edad y la salud del sujeto. Una cantidad efectiva abarca el tratamiento terapéutico y profiláctico. Por ejemplo, en el tratamiento del cáncer, una cantidad eficaz de un compuesto inventivo puede reducir la carga tumoral o detener el crecimiento o la propagación de un tumor.

Una "cantidad eficaz para uso terapéutico" de un compuesto descrito en la presente memoria, tal como el de Fórmula (I), es una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico en el tratamiento de una afección o para retrasar o minimizar uno o más síntomas asociados con la afección. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz para uso terapéutico es una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico en el tratamiento de una afección o para minimizar uno o más síntomas asociados con la afección. Una cantidad eficaz para uso terapéutico de un compuesto significa una cantidad de agente terapéutico, solo o en combinación con otras terapias, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento de la afección. El término "cantidad eficaz para uso terapéutico" puede abarcar una cantidad que mejore la terapia general, reduzca o evite los síntomas o las causas de la afección, o potencie la eficacia terapéutica de otro agente terapéutico.

Los términos "neoplasia" y "tumor" se utilizan en la presente memoria indistintamente y se refieren a una masa anormal de tejido en la que el crecimiento de la masa supera y no está coordinado con el crecimiento de un tejido normal. Una neoplasia o tumor puede ser "benigna" o "maligna", dependiendo de las siguientes características: grado de diferenciación celular (que incluyen la morfología y la funcionalidad), tasa de crecimiento, invasión local y metástasis. Una "neoplasia benigna" suele estar bien diferenciada, tiene un crecimiento característicamente más lento que una neoplasia maligna y permanece localizada en el lugar de origen. Además, una neoplasia benigna no tiene la capacidad de infiltrarse, invadir o hacer metástasis en sitios distantes. Las neoplasias benignas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, lipomas, condromas, adenomas, acrocordones, angiomas seniles, queratosis seborreicas, lentigos e hiperplasias sebáceas. En algunos casos, ciertos tumores "benignos" pueden dar lugar posteriormente a neoplasias malignas, que pueden ser el resultado de cambios genéticos adicionales en una subpoblación de las células neoplásicas del tumor, y estos tumores se denominan "neoplasias premalignas" Una neoplasia premaligna ejemplar es un teratoma. En cambio, una "neoplasia maligna" suele estar poco diferenciada (anaplasia) y tiene un crecimiento característicamente rápido acompañado de una infiltración, invasión y destrucción progresivas del tejido circundante. Además, una neoplasia maligna suele tener la capacidad de hacer metástasis en lugares distantes.

Como se utiliza en la presente memoria, el término "cáncer" se refiere a una neoplasia maligna (Stedman's Medical Dictionary, 25a ed.; Hensly ed.; Williams & Wilkins: Filadelfia, 1990). Los cánceres ejemplares incluyen, entre otros, neuroma acústico; adenocarcinoma; cáncer de glándula suprarrenal; cáncer anal; angiosarcoma (por ejemplo, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, hemangiosarcoma); cáncer de apéndice; gammapatía monoclonal benigna; cáncer biliar (por ejemplo, colangiocarcinoma); cáncer de vejiga; cáncer de mama (por ejemplo, adenocarcinoma de mama, carcinoma papilar de mama, cáncer de mama, carcinoma medular de mama); cáncer cerebral (por ejemplo, meningioma, glioblastomas, glioma (por ejemplo, astrocitoma, oligodendroglioma), meduloblastoma); cáncer de bronquios; tumor carcinoide; cáncer de cuello de útero(por ejemplo, adenocarcinoma cervical); coriocarcinoma; cordoma; craneofaringioma; cáncer de tejido conectivo; carcinoma epitelial; ependimoma; endoteliosarcoma(por ejemplo, Sarcoma de Kaposi, sarcoma hemorrágico idiopático múltiple); cáncer de endometrio (por ejemplo, cáncer de útero, sarcoma uterino); cáncer de esófago (por ejemplo, adenocarcinoma de esófago, adenocarcinoma de Barrett); sarcoma de Ewing; cáncer de ojo (por ejemplo, melanoma intraocular, retinoblastoma); hipereosinofilia familiar; cáncer de vesícula biliar; cáncer gástrico (por ejemplo, adenocarcinoma de estómago); tumor del estroma gastrointestinal (GIST); cáncer de células germinales; cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer oral (por ejemplo, carcinoma oral de células escamosas), cáncer de garganta (por ejemplo, cáncer de laringe, cáncer de faringe, cáncer de nasofaringe, cáncer de orofaringe)); cánceres hematopoyéticos (por ejemplo, leucemias tales como la leucemia linfocítica aguda (LLA) (por ejemplo, LLA de células B, LLA de células T), leucemia mielocítica aguda (LMA) (por ejemplo, LMA de células B, LMA de células T), leucemia mielocítica crónica (LMC)(por ejemplo, (por ejemplo, LMC de células B, LMC de células T) y leucemia linfocítica crónica (LLC) (por ejemplo, LLC de células B, LLC de células T)); linfomas tales como el linfoma de Hodgkin (LH) (por ejemplo, LH de células B, LH de células T) y el linfoma no Hodgkin (LNH) (por ejemplo, LNH de células B tales como el linfoma difuso de células grandes (LDCG) (por ejemplo, linfoma difuso de células B grandes), linfoma folicular, leucemia linfocítica crónica/linfoma linfocítico pequeño (CLL/SLL), linfoma de células del manto (MCL), linfomas de células B de la zona marginal (por. ejemplo, linfomas del tejido linfoide asociado a las mucosas (MALT), linfoma de células B de la zona marginal nodal, linfoma de células B de la zona marginal esplénica), linfoma primario de células B mediastínico, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmocítico (es decir, Macroglobulinemia de Waldenstrom), la leucemia de células pilosas (LCC), el linfoma inmunoblástico de células grandes, el linfoma linfoblástico B precursor y el linfoma primario del sistema nervioso central (SNC); y los LNH de células T, tales como el linfoma/leucemia linfoblástica T precursor, el linfoma periférico de células T (LCCT) (por ejemplo, micosis fungoide, síndrome de Sezary), linfoma angioinmunoblástico de células T, linfoma extraganglionar de células T asesinas naturales, linfoma de células T tipo enteropatía, linfoma subcutáneo de células T tipo paniculitis y linfoma anaplásico de células grandes); una mezcla de una o más leucemias/linfomas como las descritas anteriormente; y mieloma múltiple (MM)), enfermedad de cadenas pesadas (por ejemplo, enfermedad de la cadena alfa, enfermedad de la cadena gamma, enfermedad de la cadena mu); hemangioblastoma; cáncer de hipofaringe; tumores miofibroblásticos inflamatorios; amiloidosis inmunocítica; cáncer de riñón (por ejemplo, nefroblastoma, también conocido como tumor de Wilms, carcinoma de células renales); cáncer de hígado (por ejemplo, cáncer hepatocelular (HCC), hepatoma maligno); cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma broncogénico, cáncer de pulmón de células pequeñas (CPCP), cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), adenocarcinoma de pulmón); leiomiosarcoma (LMS); mastocitosis (por ejemplo, mastocitosis sistémica); cáncer muscular; síndrome mielodisplásico (SMD); mesotelioma; trastorno mieloproliferativo (MPD) (por ejemplo, policitemia vera (PV), trombocitosis esencial (TE), metaplasia mieloide agnogénica (MMA) también conocida como mielofibrosis (MF), mielofibrosis crónica idiopática, leucemia mielocítica crónica (LMC), leucemia neutrofílica crónica (LNC), síndrome hipereosinofílico (HES)); neuroblastoma; neurofibroma(por ejemplo, neurofibromatosis (NF) tipo 1 o tipo 2, schwannomatosis); cáncer neuroendocrino (por ejemplo, tumor neuroendocrino gastroenteropancreático (GEP-NET), tumor carcinoide); osteosarcoma (por ejemplo, cáncer de hueso); cáncer de ovario (por ejemplo, cistadenocarcinoma, carcinoma embrionario de ovario, adenocarcinoma de ovario); adenocarcinoma papilar; cáncer de páncreas (por ejemplo, adenocarcinoma de páncreas, neoplasia mucinosa papilar intraductal (IPMN), tumores de células de los islotes); cáncer de pene (por ejemplo, Enfermedad de Paget del pene y del escroto); pinealoma; tumor neuroectodérmico primitivo (TNP); neoplasia de células plasmáticas; síndromes paraneoplásicos; neoplasias intraepiteliales; cáncer de próstata (por ejemplo, adenocarcinoma de próstata); cáncer de recto; rabdomiosarcoma; cáncer de glándulas salivales; cáncer de piel(por ejemplo, carcinoma de células escamosas (SCC), queratoacantoma (KA), melanoma, carcinoma de células basales (BCC)); cáncer de intestino delgado (por ejemplo, cáncer de apéndice); sarcoma de tejidos blandos (por ejemplo, histiocitoma fibroso maligno (HFM), liposarcoma, tumor maligno de la vaina del nervio periférico (MPNST), condrosarcoma, fibrosarcoma, mixosarcoma); carcinoma de las glándulas sebáceas; cáncer del intestino delgado; carcinoma de las glándulas sudoríparas; sinovioma; cáncer testicular (por ejemplo, seminoma, carcinoma embrionario testicular); cáncer de tiroides (por ejemplo, carcinoma papilar de tiroides, carcinoma papilar de tiroides (CPT), cáncer medular de tiroides); cáncer de uretra; cáncer de vagina; y cáncer de vulva (por ejemplo, enfermedad de Paget de la vulva).

El término "muestra biológica" se refiere a cualquier muestra que incluya muestras de tejido (tales como secciones de tejido y biopsias con aguja de un tejido); muestras de células (por ejemplo, frotis citológicos (tales como frotis de Papanicolaou o de sangre) o muestras de células obtenidas por microdisección); muestras de organismos enteros (tales como muestras de levaduras o bacterias); o fracciones, fragmentos u orgánulos celulares (tales como los que se obtienen al lisar las células y separar sus componentes por centrifugación o de otro modo). Otros ejemplos de muestras biológicas son la sangre, el suero, la orina, el semen, la materia fecal, el líquido cefalorraquídeo, el líquido intersticial, el moco, las lágrimas, el sudor, el pus, el tejido biopsiado (por ejemplo, obtenido por medio de una biopsia quirúrgica o una biopsia con aguja), los aspirados de pezón, la leche, el flujo vaginal, la saliva, los hisopos (tales como los hisopos bucales) o cualquier material que contenga biomoléculas que se deriven de una primera muestra biológica. Las muestras biológicas también incluyen aquellas muestras biológicas que son transgénicas, tales como el ovocito transgénico, el espermatozoide, el blastocisto, el embrión, el feto, la célula donante o el núcleo celular. En algún aspecto, una muestra biológica de un sujeto que padece LMA o SMD es un aspirado de médula ósea.

El término "gen RARA " se refiere a una secuencia de ADN genómico que codifica un receptor-a del ácido retinoico funcional y excluye específicamente las fusiones de genes que comprenden la totalidad o una parte del gen RARA . En la invención, el gen RARA está localizado en chr17:38458152-38516681 en la construcción del genoma hg19.

El término "potenciador" se refiere a una región del ADN genómico que actúa para regular los genes hasta 1 Mbp de distancia. Un potenciador se puede superponer, pero a menudo no está compuesto por regiones de codificación de genes. Un potenciador suele estar unido por factores de transcripción y designado por marcas de histonas específicas.

El término "súper potenciador" se refiere a un subconjunto de potenciadores que contienen una parte desproporcionada de marcas de histonas y/o proteínas transcripcionales en relación con otros potenciadores en una célula particular. Por ello, se predice que un gen regulado por un super reforzador es de gran importancia para la función de esa célula. Los súper potenciadores se suelen determinar por medio de un orden por intervalo de todos los potenciadores de una célula en función de su fuerza y la determinación, por medio de programas informáticos disponibles tales como ROSE (https://bitbucket.org/young_computation/rose), el subconjunto de potenciadores que tienen una fuerza significativamente mayor que la mediana de los potenciadores de la célula (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos 9.181.580que se incorpora por referencia en la presente memoria.

El término "transcrito primario de ARN", como se utiliza en la presente memoria, se refiere al producto de transcripción de ARN de la secuencia de ADN que incluye una o más de las regiones de codificación del gen, y un potenciador, o un súper potenciador asociado a ese gen. En algunas realizaciones, el término "transcrito de ARN primario" es intercambiable con el término "ARNe" o "ARN potenciador" cuando dicho ARN incluye el ARN derivado del ADN correspondiente a la región potenciadora. En otras realizaciones, el término "transcrito de ARN primario" se refiere al ARNm transcrito de la región codificante del gen.

El término "fuerza", cuando se refiere a una porción de un potenciador o un súper potenciador, como se utiliza en la presente memoria, significa el área bajo la curva del número de lecturas de H3K27Ac o de otro marcador genómico trazado contra la longitud del segmento de ADN genómico analizado. De este modo, la "fuerza" es una integración de la señal resultante de la medición de la marca en un par de bases determinado sobre el conjunto de pares de bases que definen la región que se elige para medir.

El término "intervalo de prevalencia" para un valor específico (por ejemplo, la fuerza de un súper potenciador asociado a un gen RARA ) significa el porcentaje de una población que es igual o mayor que ese valor específico. Por ejemplo, un intervalo de prevalencia del 35% para la fuerza de un súper potenciador asociado a un gen RARA en una célula de prueba significa que el 35% de la población tiene un potenciador del gen RARA con una fuerza igual o mayor que la célula de prueba.

El término "corte de prevalencia" para un valor específico (por ejemplo, la fuerza de un súper potenciador asociado a un gen RARA) significa el intervalo de prevalencia que define la línea divisoria entre dos subconjuntos de una población (por ejemplo, respondedores y no respondedores). De este modo, un intervalo de prevalencia igual o superior (es decir, un valor porcentual inferior) al corte de prevalencia define un subconjunto de la población; y un intervalo de prevalencia inferior (por ejemplo, un valor porcentual superior) al corte de prevalencia define el otro subconjunto de la población.

Los términos "corte" y "valor de corte" significan un valor medido en un ensayo que define la línea divisoria entre dos subconjuntos de una población (por ejemplo, respondedores y no respondedores). De este modo, un valor igual o superior al valor de corte define un subconjunto de la población; y un valor inferior al valor de corte define el otro subconjunto de la población.

Los términos "umbral" y "nivel de umbral" significan un nivel que define la línea divisoria entre dos subconjuntos de una población (por ejemplo, respondedores y no respondedores). Un nivel de umbral puede ser un corte de prevalencia o un valor de corte.

El término "población" o "población de muestras" se refiere a un número suficiente (por ejemplo, al menos 30, 40, 50 o más) de muestras diferentes que reflejen razonablemente la distribución del valor que se mide en un grupo mayor. Cada muestra de una población de muestras puede ser una línea celular, una muestra biológica obtenida de un ser vivo (por ejemplo, una biopsia o una muestra de fluido corporal), o una muestra obtenida de un xenoinjerto (por ejemplo, un tumor cultivado en un ratón por medio de la implantación de una línea celular o una muestra de un paciente), en la que cada muestra procede de un ser vivo que padece, o de una línea celular o xenoinjerto que representa, la misma enfermedad, afección o trastorno.

El término "intervalo ordinal" de un valor especificado significa el orden de intervalo de ese valor en comparación con un conjunto de otros valores. Por ejemplo, un intervalo ordinal de 100 en términos de la fuerza de un súper potenciador asociado con un gen RARA en una célula de prueba en comparación con otros súper potenciadores en la célula de prueba significa que otros 99 súper potenciadores en la célula de prueba tenían mayor fuerza que el súper potenciador asociado con un gen RARA.

El término "ordenación por intervalo" significa la ordenación de los valores de mayor a menor o de menor a mayor.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE CIERTAS REALIZACIONES DE LA INVENCIÓN

Identificación del súper potenciador RARA y determinación de los niveles de umbral

La identificación de un potenciador o súper potenciador se puede lograr por medio de diversos procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo como se describe en Cell 2013, 155, 934 a 947 y PCT/US2013/066957, ambos de los cuales se incorporan por referencia en la presente memoria. En algunas realizaciones, la identificación de un súper potenciador se consigue obteniendo material celular y ADN de una muestra de cáncer de un paciente (por ejemplo, de una biopsia). Las métricas importantes para la medición de potenciadores se dan en dos dimensiones: la longitud del ADN sobre la que se detectan contiguamente los marcadores genómicos (por ejemplo, H3K27Ac) y la incidencia compilada del marcador genómico en cada par de bases a lo largo de ese tramo de ADN que constituye la magnitud. La medición del área bajo la curva ("AUC") resultante de la integración del análisis de longitud y magnitud determina la fuerza del potenciador. Es la fuerza del súper potenciador RARA en relación con un control lo que se utiliza para determinar si un sujeto responderá o no a un agonista RARA. Será fácilmente aparente para los expertos en la técnica que si la longitud de ADN sobre la que se detectan los marcadores genómicos es la misma tanto para RARA como para el control, entonces la relación de la magnitud del súper potenciador de RARA en relación con el control será equivalente a la fuerza y también se puede utilizar para determinar si un sujeto responderá o no a un agonista de RARA.

Se ha determinado a través de los procedimientos de ChIP-seq de H3K27Ac que hay un locus súper potenciador asociado con el gen RARA en el chr17:38458152-38516681 (construcción del genoma hg19). Este locus se solapa en realidad con el propio locus del gen RARA y, por lo tanto, se consideró un locus súper potenciador asociado a ese gen por su proximidad/superposición. De este modo, en algunas realizaciones, la determinación de la fuerza de un súper potenciador asociado al gen RARA de acuerdo con la presente invención sólo requiere el análisis de esta porción específica del genoma, en lugar de requerir un análisis de todo el genoma.

La ChIP-secuenciación, también conocida como ChIP-seq, se utiliza para analizar las interacciones de las proteínas con el ADN. ChIP-seq combina la inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) con la secuenciación masiva de ADN en paralelo para identificar los sitios de unión de las proteínas asociadas al ADN. Se puede utilizar para cartografiar con precisión los sitios de unión global de cualquier proteína de interés. Anteriormente, la técnica ChIP-on-chip era la más utilizada para estudiar estas relaciones proteína-ADN. El éxito de la ChIP-seq depende de muchos factores, como la fuerza y el procedimiento de sonicación, las composiciones de los tampones, la calidad de los anticuerpos y el número de células; véase, por ejemplo, T. Furey, Nature Reviews Genetics 13, 840 a 852 (diciembre de 2012); M.L. Metzker, Nature Reviews Genetics 11, 31 a 46 (enero de 2010); y P.J Park, Nature Reviews Genetics 10, 669 a 680 (octubre de 2009)). Otros marcadores genómicos, además de H3K27Ac, que se pueden utilizar para identificar súper potenciadores por medio de ChIP-seq son: P300, CBP, BRD2, BRD3, BRD4, componentes del complejo mediador (J Loven, et al., Cell, 153(2):320 a 334, 2013), la histona 3 lisina 4 monometilada (H3K4me1), u otros factores de transcripción ligados al potenciador específico del tejido (E Smith & A Shilatifard, Nat Struct Mol Biol, 21(3):210 a 219, 2014) (S Pott & Jason Lieb, Nature Genetics, 47(1):8 a 12, 2015).

En algunas realizaciones, ya existen mapas de súper potenciadores de datos ChIP-seq de H3K27ac u otros marcadores de todo el genoma de una línea celular o una muestra de paciente. En estas realizaciones, simplemente se determinaría si la fuerza, o el intervalo ordinal del potenciador o súper potenciador en dichos mapas en el locus chr17:38458152-38516681 (construcción del genoma hg19) era igual o superior al nivel de umbral predeterminado. En algunas realizaciones, la determinación de la fuerza del potenciador o súper potenciador en el locus chr17:38458152-38516681 requiere una comparación de las lecturas ChIP-seq en esta región con una región que se sabe que comprende un súper potenciador o potenciador ubicuo que está presente en niveles similares en todas las células. Un ejemplo de esta región súper potenciadora ubicua es el locus súper potenciador MALAT1 (chr11:65263724-65266724). Por medio de la comparación de las lecturas de ChIP-seq en el locus RARA con las del locus MALAT1, se puede determinar si la fuerza de un súper potenciador en el locus RARA es igual o superior al nivel de umbral predeterminado y si las células en él responderán o no a un agonista RARA.

En algunas realizaciones de la presente invención, el nivel de umbral es cuando log-¹⁰ (AUC de las lecturas de ChIP-seq en el locus RARA ("R")/ AUC de las lecturas de ChIP-seq en el locus súper potenciador MALAT1 ("M")) es 0,25 o mayor. En algunos aspectos de estas realizaciones, el nivel de umbral para identificar respondedores a un agonista RARA es log-¹⁰ (R/M) de 0,3 o mayor, 0,35 o mayor, o 0,4 o mayor.

En algunas realizaciones de la presente invención, el nivel de umbral es cuando (AUC de las lecturas de ChIP-seq en el locus RARA ("R")/ AUC de las lecturas de ChIP-seq en el locus súper potenciador MALAT1 ("M")) es 1,75 o mayor. En algunos aspectos de estas realizaciones, el nivel de umbral para identificar respondedores a un agonista RARA es log-¹⁰ (R/M) de 2,0 o mayor, 2,25 o mayor, o 2,75 o mayor.

En algunas realizaciones de la presente invención, R, como se ha definido anteriormente, se compara con un locus potenciador o súper potenciador de control distinto de MALAT1 (el número de lecturas ChIP-seq en este otro potenciador o súper potenciador de control se denomina "C"). Cuando se utiliza otro locus potenciador o súper potenciador de control, C, los valores umbrales expresados como log10 ("V"), referidos anteriormente para su comparación con M, por ejemplo log-i0(R/M)>0,25, log-i0(R/M)>0,3, log-i0(R/M)>0,35, o log-i0(R/M)>0,4, se deben ajustar a un valor equivalente para compararlo con C a fin de tener en cuenta la fuerza relativa de C en comparación con M. Este "valor umbral equivalente ajustado" ("A") se calcula de la siguiente manera:

A = l o g i o ( M / C ) V

Como ejemplo no limitativo, si la fuerza calculada del súper potenciador MALAT1 (M) es 10 veces mayor que el potenciador o súper potenciador de control utilizado como comparador (C), y el valor umbral (V) es 0,25, entonces A=logio(10) 0,25=1,25 y el valor umbral ajustado es 1,25. Para este ejemplo, cuando se utiliza C como comparador, entonces log¹⁰(R/C) igual o mayor que 1,25 se considera el equivalente a un log¹⁰(R/M) igual o mayor que 0,25 cuando se utiliza M como comparador. Es evidente que un valor umbral ajustado se puede calcular de manera similar para cualquier comparador adicional basado en su fuerza relativa a la MALAT1 o a cualquier otro comparador para el que ya se haya determinado un valor umbral ajustado.

Los mismos ajustes anteriores se pueden llevar a cabo cuando se utilizan valores lineales comparados con M como niveles de umbral (por ejemplo, > 1,75 veces, > 2,0 veces, > 2,25 veces o 2,5 veces). En este caso, se obtiene la relación entre M y C y, a continuación, se multiplica el valor del umbral por dicha relación para obtener los valores de umbral adecuados al comparar R con C (es decir, (valor del umbral)c = (M/C)(valor del umbral^)

Se debe entender que la localización cromosómica específica tanto de RARA como de MALAT1 puede diferir para diferentes construcciones genómicas y/o para diferentes tipos celulares. Sin embargo, los expertos en la técnica pueden determinar tales ubicaciones diferentes por medio de la localización en esas otras construcciones del genoma, secuencias específicas correspondientes a los loci RARA y/o MALAT1 en la construcción del genoma hg 19.

Otros procedimientos para identificar súper potenciadores incluyen la inmunoprecipitación de cromatina (JE Delmore, et al., Cell, 146(6)904 a 917, 2011) y chip array (ChIP-chip), y la inmunoprecipitación de cromatina seguida de qPCR (ChIP-qPCR) mediante el uso de los mismos marcadores genómicos inmunoprecipitados y secuencias de oligonucleótidos que hibridan con el locus RARA chr17:38458152-38516681 (genome build hg19). En el caso del ChIP-chip, la señal se detecta típicamente por la fluorescencia de la intensidad resultante de la hibridación de una sonda y la muestra de ensayo de entrada, al igual que con otras tecnologías basadas en matrices. Para la ChIP-qPCR, se utiliza un colorante que se vuelve fluorescente sólo después de intercalar el ADN de doble cadena generado en la reacción de PCR para medir la amplificación de la plantilla.

En algunas realizaciones, la determinación de si una célula tiene un súper potenciador RARA por encima de un nivel umbral requerido se logra por medio de la comparación de la fuerza del potenciador RARA en una célula de prueba con la fuerza correspondiente de RARA en una célula que se sabe que no responde a RARA (una "célula de control"). Preferentemente, la célula de control es del mismo tipo que la célula de ensayo. En un aspecto de estas realizaciones, la célula de control es dicha célula en un HCC1143. En otro aspecto de estas realizaciones, la célula de control es cualquier célula enumerada en la Figura 3, en la que log¹⁰ (RARA/MALAT1) es inferior a 0,25, inferior a 0,2, inferior a 0,15, inferior a 0,1, o inferior a 0.

En algunas realizaciones, se determina que un sujeto responde a un agonista RARA si la fuerza de un súper potenciador RARA en una célula del sujeto es al menos 1,5 veces mayor que la fuerza de un potenciador/súper potenciador RARA correspondiente en una célula de control. En algunos aspectos de estas realizaciones, el nivel umbral es al menos 2,0 veces mayor, al menos 2,5 veces mayor, al menos 3 veces mayor, al menos 4 veces mayor o al menos 5 veces mayor que en la célula de control. En algunos aspectos de estas realizaciones, la fuerza de un súper potenciador RARA tanto en la célula de prueba como en la de control se normaliza antes de la comparación. La normalización implica el ajuste de la fuerza determinada de un súper potenciador RARA por medio de la comparación con otro potenciador o súper potenciador que es nativo y está presente en niveles equivalentes en ambas células (por ejemplo, MALAT1), o con un nivel fijo de ADN exógeno que se "introduce" en muestras de cada una de las células antes de la determinación de la fuerza del súper potenciador (DA Orlando et al., Cell Rep. 2014 Nov 6, 9(3):1163 a 1170 (2014) N Bonhoure et al., Genome Res, 24:1157 a 1168 (2014)).

En algunas realizaciones, la determinación de si una célula tiene una fuerza súper potenciadora de RARA por encima de un nivel de umbral requerido se logra por medio de la comparación de la fuerza potenciadora de RARA en una célula de prueba con la correspondiente fuerza de RARA en una población de muestras celulares, en la que cada una de las muestras celulares se obtiene de una fuente diferente (es decir, un sujeto diferente, una línea celular diferente, un xenoinjerto diferente). En algunos aspectos de estas realizaciones, sólo se utilizan muestras de células tumorales primarias de los sujetos para determinar el nivel de umbral. En algunos aspectos de estas realizaciones, al menos algunas de las muestras de la población se habrán sometido a pruebas de capacidad de respuesta a un agonista RARA específico a fin de establecer: a) la fuerza potenciadora de RARA más baja de una muestra de la población que responde a ese agonista RARA específico ("respondedor más bajo"); y, opcionalmente, b) la fuerza potenciadora de RARA más alta de una muestra de la población que no responde a ese agonista RARA específico ("no respondedor más alto"). En estas realizaciones, se establece un punto de corte de la intensidad del potenciador RARA por encima del cual se consideraría que una célula de prueba responde a ese agonista RARA específico: i) igual o hasta un 5% por encima de la intensidad del potenciador RARA en el menor respondedor de la población; o ii) igual o hasta un 5% por encima de la intensidad del potenciador RARA en el mayor no respondedor de la población; o iii) un valor entre la intensidad del potenciador RARA del menor respondedor y el mayor no respondedor de la población.

Se debe entender que en las realizaciones anteriores típicamente no todas las muestras en una población necesitan ser probadas para la capacidad de respuesta al agonista RARA, pero todas las muestras se miden para la fuerza del potenciador RARA . En algunas realizaciones, las muestras se ordenan de acuerdo con la fuerza del potenciador RARA . La elección de cuál de los tres procedimientos expuestos anteriormente se utilizará para establecer el punto de corte dependerá de la diferencia en la fuerza del potenciador RARA entre el menor respondedor y el mayor no respondedor de la población y de si el objetivo es minimizar el número de falsos positivos o minimizar la posibilidad de omitir una muestra o sujeto potencialmente respondedor. Cuando la diferencia entre el menor respondedor y el mayor no respondedor es grande (por ejemplo, cuando hay muchas muestras no probadas para la capacidad de respuesta que se encuentran entre el menor respondedor y el mayor no respondedor en un orden de intervalo de la fuerza del potenciador RARA), el punto de corte se establece normalmente igual o hasta un 5% por encima de la fuerza del potenciador RARA en el menor respondedor de la población. Este límite maximiza el número de posibles encuestados. Cuando esta diferencia es pequeña (por ejemplo, cuando hay pocas o ninguna muestra sin probar para la capacidad de respuesta que se sitúe entre la respuesta más baja y la no respuesta más alta en un orden de intervalo de la fuerza del potenciador RARA ), el punto de corte se establece normalmente en un valor entre la fuerza del potenciador RARA de la respuesta más baja y la no respuesta más alta. Este límite minimiza el número de falsos positivos. Cuando el mayor no respondedor tiene una fuerza potenciadora de RARA que es mayor que el menor respondedor, el punto de corte se establece típicamente en un valor igual o hasta el 5% por encima de la fuerza potenciadora de RARA en el mayor no respondedor de la población. Este procedimiento también minimiza el número de falsos positivos.

En algunas realizaciones, la determinación de si una célula tiene un súper potenciador RARA por encima de un nivel de umbral requerido se logra por medio de la comparación del ordinal de la fuerza del potenciador RARA en una célula de prueba con el ordinal de la fuerza del potenciador RARA en una población de muestras celulares, en la que cada una de las muestras celulares se obtiene de una fuente diferente (es decir, un sujeto diferente, una línea celular diferente, un xenoinjerto diferente). En estas realizaciones, al menos algunas de las muestras de la población habrán sido sometidas a pruebas de respuesta a un agonista RARA específico a fin de establecer: a) el ordinal de fuerza potenciadora RARA más bajo de una muestra de la población que responde a ese agonista RARA específico ("respondedor ordinal más bajo"); y, opcionalmente, b) el ordinal de fuerza potenciadora RARA más alto de una muestra de la población que no responde a ese agonista RARA específico ("no respondedor ordinal más alto"). En estas realizaciones, se establece un punto de corte del ordinal de intensidad del potenciador RARA por encima del cual se consideraría que una célula de prueba responde a ese agonista RARA específico: i) igual o hasta el 5% por encima del ordinal de fuerza potenciadora de RARA en el ordinal más bajo de respuesta de la población; o ii) igual o hasta el 5% por encima del ordinal de fuerza potenciadora de RARA en el ordinal más alto de no respuesta de la población; o iii) un valor entre el ordinal de fuerza potenciadora de RARA del ordinal más bajo de respuesta y el ordinal más alto de no respuesta de la población.

Se debe entender en las realizaciones anteriores, que típicamente no todas las muestras en una población necesitan ser probadas para la capacidad de respuesta al agonista RARA, pero todas las muestras se miden para la fuerza del potenciador RARA y se establece el ordinal de la fuerza del potenciador RARA en comparación con otros potenciadores en la misma muestra. El ordinal se obtiene típicamente por medio de la medición de la fuerza de todos los demás potenciadores en la célula y determinando qué intervalo (es decir, el ordinal) en términos de fuerza tiene el potenciador RARA en comparación con los demás potenciadores.

En algunas realizaciones, las muestras se ordenan en base al ordinal de la fuerza del potenciador RARA . La elección de cuál de los tres procedimientos expuestos anteriormente se utilizará para establecer el punto de corte dependerá de la diferencia en el ordinal de la fuerza del potenciador RARA entre el ordinal más bajo de los que responden y el ordinal más alto de los que no responden en la población y de si el punto de corte está diseñado para minimizar los falsos positivos o maximizar el número de respondedores. Cuando esta diferencia es grande (por ejemplo, cuando hay muchas muestras no probadas para la capacidad de respuesta que se encuentran entre el ordinal más bajo de respuesta y el ordinal más alto de no respuesta en un ordenamiento de los ordinales de la fuerza potenciadora de RARA ), el punto de corte se establece típicamente igual o hasta un 5% por encima del ordinal de la fuerza potenciadora de RARA en el ordinal más bajo de respuesta en la población. Cuando esta diferencia es pequeña (por ejemplo, cuando hay pocas o ninguna muestra sin probar para la capacidad de respuesta que caen entre el ordinal más bajo de respuesta y el ordinal más alto de no respuesta en un orden de intervalo del ordinal de la fuerza potenciadora de RARA ), el punto de corte se establece típicamente en un valor entre el ordinal de la fuerza potenciadora de RARA del ordinal más bajo de respuesta y el ordinal más alto de no respuesta. Cuando el ordinal más alto de no respuesta tiene un ordinal de fuerza potenciadora de RARA que es mayor que el de la respuesta más baja, el punto de corte se establece típicamente en un valor igual o hasta el 5% por encima del ordinal de fuerza potenciadora de RARA en el ordinal más alto de no respuesta de la población.

En algunos aspectos de las realizaciones en las que una célula o muestra de prueba se compara con una población, el valor o valores de corte obtenidos para la población (por ejemplo, la fuerza del potenciador RARA o el ordinal del potenciador RARA ) se convierte en un intervalo de prevalencia y el corte se expresa como un porcentaje de la población que tiene el valor de corte o superior, es decir, un corte de prevalencia. Sin estar obligados por la teoría, los solicitantes creen que el intervalo de prevalencia de una muestra de prueba será similar independientemente de la metodología utilizada para determinar la fuerza del potenciador RARA . De este modo, un corte de prevalencia determinado para un parámetro (por ejemplo, el ordinal de fuerza potenciadora de RARA ) es portátil y se puede aplicar a otro parámetro (por ejemplo, el nivel de ARNm de RARA) para determinar el valor de corte para ese otro parámetro. Esto permite determinar un valor de corte para cualquier parámetro sin tener que determinar experimentalmente la correlación entre los niveles de dicho parámetro y la capacidad de respuesta al agonista RARA. Lo único que hay que determinar es qué nivel de ese otro parámetro corresponde al límite de prevalencia determinado a priori en una población.

En otras realizaciones, una población se puede dividir en tres grupos: respondedores, respondedores parciales y no respondedores, y se establecen dos valores de corte o cortes de prevalencia. El grupo de respondedores parciales puede incluir a los que responden y a los que no responden, así como a aquellos miembros de la población cuya respuesta a un agonista RARA no fue tan alta como la del grupo de respondedores. En estas realizaciones, se determinan dos valores de corte o cortes de prevalencia.

Los procedimientos de cuantificación de secuencias específicas de ARN en una célula o muestra biológica son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, la hibridación fluorescente tales como la utilizada en los servicios y productos proporcionados por NanoString Technologies, la tecnología basada en matrices (Affymetrix), la qPCR de transcriptasa inversa como con SYBR® Green (Life Technologies) o la tecnología TaqMan® (Life Technologies), la secuenciación de ARN (por ejemplo, ARN-seq), la hibridación de ARN y la amplificación de la señal como la utilizada con RNAscope® (Advanced Cell Diagnostics), o northern blot.

Cánceres y otras enfermedades

Los productos farmacéuticos envasados de la presente invención son teóricamente útiles para tratar cualquier cáncer que se caracterice por la asociación de un súper potenciador con un gen RARA en dicho cáncer. Los genes RARA asociados a los súper potenciadores pueden ser más frecuentes en ciertos tipos de cáncer que en otros. Los inventores han descubierto súper potenciadores asociados a RARA en los cánceres de piel, mama, sangre, hueso, cuello uterino, colon, recto, esófago, ganglio linfático, pulmón, ovario, útero, páncreas, próstata, riñón y bazo; y, en particular, en la LMA (especialmente en la LMA no de tipo LPA y en otras formas de LMA que no se caracterizan por una translocación cromosómica que implique un gen RARA ), el síndrome mielodisplásico (SMD), el cáncer colorrectal, el de mama HER2+, el de mama ER+, el cáncer de mama triple negativo, un glioblastoma, un glioma, el cáncer gástrico, el carcinoma renal de células claras, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, un melanoma, un mieloma múltiple, un carcinoma pancreático, un feocromocitoma, un paraganglioma y un adenocarcinoma de próstata. Sin estar limitados por la teoría, los inventores creen que los genes RARA asociados a SE se encontrarán en subconjuntos de todos los cánceres y que los sujetos dentro de esos subconjuntos serán más sensibles a un agonista RARA que otros sujetos que tengan el mismo tipo de cáncer sin un gen RARA asociado a SE.

También se cree que el descubrimiento de RARA asociado a SE en tejidos en enfermedades no cancerosas sugiere un potencial para el uso efectivo de agonistas de RARA para tratar dichas enfermedades. Se ha detectado la presencia del súper potenciador RARA en el tejido adiposo, lo que sugiere un procedimiento para identificar a los pacientes que padecen diabetes u obesidad y que pueden ser tratados eficazmente con un agonista RARA. El ácido retinoico tiene un papel establecido en la diferenciación del tejido adiposo (J Mercader, et al., Endocrinology, 147(100):5325 a 5332, 2006). Además, se ha demostrado una relación entre PPAR-y y RARA (A Redonnet, et al., Int J Obesity, (26)920 a 927, 2002).

También se ha detectado un súper potenciador asociado al locus RARA en numerosos tipos de células hematológicas. Esto incluye las células madre hematopoyéticas CD133+, los monocitos CD14+, las células B tempranas CD19+, las células B CD20, las células T maduras CD3+, los progenitores hematopoyéticos CD34+, las células T helper CD4+, las células Asesinas Naturales CD56 y las células T citotóxicas CD8+. La presencia de súper potenciadores asociados a RARA en estas células sugiere que los agonistas de RARA pueden ser útiles para tratar subconjuntos de pacientes que padecen ciertas enfermedades autoinmunes, entre ellas la psoriasis, la esclerosis múltiple, la artritis reumatoide, la espondilitis anquilosante, la enfermedad celíaca, la miastenia gravis, el lupus eritematoso sistémico y la esclerodermia.

Se ha encontrado que las células de los pacientes que sufren de Enfermedad Renal Poliquística Autosómica Dominante también tienen un súper potenciador asociado a RARA y por lo tanto podrían ser candidatos para un tratamiento efectivo con un agonista de RARA. Hay algunas pruebas de que la PQRAD puede responder a los retinoides (Q Qian, et al., Kidney International, (59): 2005 a 2022, 2001), por lo que la identificación de los pacientes que también tienen un SE asociado al locus RARA se puede utilizar como procedimiento de estratificación para seleccionar mejor a los pacientes que tienen más probabilidades de responder a un agonista selectivo de RARA. La enfermedad a tratar por las composiciones farmacéuticas envasadas de la invención es el cáncer. En algunos aspectos de estas realizaciones, la enfermedad a tratar se selecciona entre el cáncer de mama, el glioblastoma, el neuroblastoma y la LMA. En algunos aspectos más específicos de estas realizaciones, la enfermedad a tratar se selecciona entre el cáncer de mama, el glioma, el carcinoma cervical y endocervical, el adenocarcinoma de colon y recto, el carcinoma escamoso de cabeza y cuello, el carcinoma renal de células papilares, el adenocarcinoma de pulmón, el adenocarcinoma pancreático, el feocromocitoma, el paraganglioma, el melanoma cutáneo, el carcinoma uterino, los SMD y la LMA. En algunos aspectos más específicos de estas realizaciones, la enfermedad a tratar se selecciona entre el cáncer de mama, los SMD y la LMA. En aspectos aún más específicos de estas realizaciones, la enfermedad a tratar es una LMA que no es de tipo LPA o una LMA que no se caracteriza por una translocación cromosómica que implique un gen RARA .

En algunas realizaciones, el sujeto a tratar con un agonista de RARA (por ejemplo, tamibaroteno) sufre de LMA recidivante o refractaria. Un sujeto se clasifica como con LMA en recaída o refractaria si: a) no demuestra una respuesta parcial después de un primer ciclo de quimioterapia de inducción; o b) no demuestra una respuesta completa después de un segundo ciclo de quimioterapia de inducción; o c) recae después de la quimioterapia convencional; o d) recae están sometidos a un único trasplante de células madre.

En algunas realizaciones, el sujeto a tratar con un agonista de RARA (por ejemplo, tamibaroteno) sufre de SMD refractario. Un sujeto se clasifica como SMD refractario si: a) está categorizado como SMD de alto riesgo o intermedio-2 (de acuerdo con el Sistema Internacional de Estadificación Pronóstica ("IPPS")) y no ha logrado ninguna mejora hematológica (de acuerdo con los criterios del IWG 2006) después de al menos 4 ciclos de terapia de inducción con agentes hipometilantes (por ejemplo azacitidina, decitabina), o ha recaído después de cualquier duración de la respuesta completa o parcial; o b) están categorizados como SMD de riesgo intermedio-1 o bajo del IPSS y son dependientes de transfusiones o han fracasado en el tratamiento con agentes estimulantes de la eritropoyesis (AEE).

En otras realizaciones, el sujeto a tratar con un agonista de RARA (por ejemplo, tamibaroteno) es un sujeto anciano no apto. El término "anciano no apto", como se utiliza en la presente memoria, significa que el sujeto es un humano de al menos 60 años de edad y que un médico determina que no es candidato a la terapia de inducción estándar. Agonistas RARA

La elección del agonista de RARA con el que se va a tratar a un paciente identificado como poseedor de un súper potenciador asociado a un gen RARA se puede llevar a cabo a partir de cualquier agonista de RARA conocido en la técnica. Es preferente que el agonista de RARA utilizado en los procedimientos de la invención sea específico para RARA y tenga una actividad agonística significativamente menor (al menos 10X menos, al menos 100^x menos, al menos 1,000X menos, al menos 10,000X menos, al menos 100,000X menos) contra otras formas de RaR, por ejemplo, RaR-p y RaR-Y.

En algunas realizaciones, el agonista de RARA se selecciona de un compuesto desvelado en o cualquier compuesto que cae dentro de los géneros establecidos en cualquiera de las siguientes Patentes de los Estados Unidos: US 4.703.110, US 5.081.271, US 5.089.509, US 5.455.265, US 5.759.785, US 5.856.490, US 5.965.606, US 6.063.797, US 6.071.924, US 6.075.032, US 6.187.950, US 6.355.669, US 6.358.995 y US 6.387.950cada uno de los cuales se incorpora por referencia.

En algunas realizaciones, el agonista de RARA se selecciona de cualquiera de los siguientes agonistas de RARA conocidos establecidos en la Tabla 1, o una sal aceptable para uso farmacéutico de los mismos, o un solvato o hidrato de los anteriores:

Tabla 1. Agonistas RARA ejemplares útiles en la invención.

En algunas realizaciones, el agonista RARA es tamibaroteno. En algunas realizaciones, el agonista de RARA es

Composiciones farmacéuticas envasadas

Las composiciones farmacéuticas envasadas de la presente invención comprenden un inserto o etiqueta escrita que comprende instrucciones para utilizar el agonista RARA en un sujeto que padece un cáncer y que se ha determinado que tiene un súper potenciador asociado a un gen RARA que tiene una fuerza, o intervalo ordinal igual o superior a un nivel umbral. Como se ha descrito en detalle anteriormente, el nivel umbral se determina en una población de muestras procedentes de sujetos a los que se les ha diagnosticado la misma enfermedad o de líneas celulares o modelos de xenoinjertos de la misma enfermedad para cuyo tratamiento está indicada la composición farmacéutica. Las instrucciones se pueden adherir o fijar de otra manera a un recipiente que contenga el agonista RARA. Alternativamente, las instrucciones y el recipiente que comprende el agonista RARA estarán separados uno del otro, pero se presentarán juntos en un solo paquete, caja u otro tipo de recipiente.

Las instrucciones en la composición farmacéutica envasada serán típicamente ordenadas o recomendadas por una agencia gubernamental que apruebe el uso terapéutico del agonista RARA. Las instrucciones pueden comprender procedimientos específicos para determinar si un súper potenciador está asociado a un gen RARA , así como procedimientos de cuantificación para determinar si un potenciador asociado a un gen RARA es un súper potenciador; y/o niveles umbrales de súper potenciadores a los que se recomienda y/o se supone que es eficaz para uso terapéutico el tratamiento con el agonista RARA envasado.

Las instrucciones pueden comprender opcionalmente información sobre la dosificación, los tipos de cáncer para los que se aprobó el tratamiento con el agonista RARA, información fisicoquímica sobre el agonista RARA; información farmacocinética sobre el agonista RARA, información sobre la interacción entre medicamentos. En algunos aspectos, las instrucciones indican que la composición se administre a un sujeto al que se le ha diagnosticado que padece una LMA no de tipo LPA. En otros aspectos, las instrucciones indican que la composición se administre a un sujeto al que se le ha diagnosticado cáncer de mama. En algunos aspectos, las instrucciones indican que la composición se administre a un sujeto diagnosticado de SMD. En algunos aspectos, la composición farmacéutica comprende tamibaroteno. En algunos aspectos, la composición farmacéutica comprende AGN-195183.

EJEMPLOS

A fin de que la invención descrita en la presente memoria se pueda comprender mejor, se exponen los siguientes ejemplos. Los ejemplos sintéticos y biológicos descritos en esta solicitud se ofrecen para ilustrar los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los procedimientos proporcionados en la presente memoria y no se deben interpretar en modo alguno como una limitación de su alcance.

Ejemplo 1. Análisis ChIP-seq para identificar el súper potenciador asociado a RARA.

I. Reticulación de células. En el caso de las células cultivadas, solemos reticular entre 5 x 107 y 1 x 108 células a la vez (lo que equivale a un 70 a 80% de confluencia para células adherentes en 8 a 12 placas de 15 cm2 o células en suspensión en 8 a 12 frascos de 175 cm2). Se utilizaron entre 20 y 50 millones de células para cada reacción de análisis de localización. Para las células adherentes, se añadieron 1/10 volumen de solución fresca de formaldehído al 11% (0,1M de NaCl, 1 mM de EDTA, pH 8, 0,5 mM de EGTA pH 8, 50 mM de Hepes) a las placas, se agitaron brevemente las placas y se dejaron reposar a temperatura ambiente ("RT") durante 8 min. A continuación, se añadieron 1/20 volumen de glicina 2,5M o 1/2 volumen de Tris 1M pH 7,5 para apagar el formaldehído y se incubaron durante al menos 1 minuto. A continuación, se enjuagaron las células 3 veces con 20 ml de solución salina tamponada con fosfato 1X fría ("PBS"); se recolectaronlas células mediante el uso de un raspador de silicona; y se hicieron girar las células a 2k durante 10 minutos a 4 °C en una centrifugadora de mesa. A continuación, las células se transfieren a tubos cónicos de 15 ml y se centrifugan a 2k durante 10 minutos a 4 °C. Las células granuladas se congelan en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 °C. Para las células en suspensión, se añadieron 1/10 de volumen de solución fresca de formaldehído al 11% a la suspensión celular, se mezclaron y se dejó que la mezcla reposara a TA durante 8 minutos. A continuación, se añadieron 1/20 volumen de glicina 2,5M o 1/2 volumen de Tris 1M pH 7,5 para apagar el formaldehído y se incubaron durante al menos 1 minuto. A continuación, se enjuagaron las células 3 veces con 20 a 50 ml de PBS 1X frío, se centrifugó durante 5 minutos a 2.000 RPM para granular las células antes y después de cada lavado. A continuación, las células se transfieren a tubos cónicos de 15 ml y se centrifugan a 2k durante 5 minutos a 4 °C. Se retiró el sobrenadante, se eliminó el líquido residual con una toallita Kimwipe y, a continuación, las células granuladas se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. Para las células derivadas de la sangre primaria, se reticularon entre 2 x 105 y 1 x 107 células por muestra por medio de la adición de 1/10 de volumen de solución fresca de formaldehído al 11% (0,1M de NaCl, 1 mM de EDTA, pH 8, 0,5 mM de EGTA pH 8, 50 mM de Hepes), se dejó que la reticulación se llevara a cabo a TA durante 8 minutos. A continuación, se añadió 1/20 volumen de glicina 2,5M o 1/2 volumen de Tris 1M pH 7,5 para apagar el formaldehído y se incubó durante al menos 1 minuto. A continuación, se enjuagaron las células 3 veces con 1 a 2 ml de PBS 1X frío y se recolectaron las células por medio de centrifugación. A continuación, los gránulos de células se someten directamente al análisis ChIP-seq, como se ha descrito.

Para las células derivadas de tejido sólido primario, se utilizaron 250 a 500 ug de tejido congelado por medio de ChIP. Los tejidos congelados se cortan en dados con una cuchilla de afeitar (en una superficie fría, <-80C) y con tijeras durante 2 minutos en una solución de formaldehído al 1% (1% de formaldehído; 0,1M de NaCl, 1 mM de EDTA, pH 8, 0,5 de mMEGTA pH 8, 50 mM de Hepes). Los tejidos se pican hasta formar una pasta fina durante 2 minutos y a la pasta se le añaden 9 ml de solución de formaldehído al 1%. Se dejó que la reticulación continúe hasta un tiempo total de 8 min. A continuación, se añadió 1/20 volumen de glicina 2,5M o 1/2 volumen de Tris 1M pH 7,5 para apagar el formaldehído y se incubó durante al menos 1 minuto. A continuación, se enjuagaron las células 3 veces con 1a 2 ml de PBS 1X frío y se recolectaron las células por medio de centrifugación. Las células se resuspendieron en 6 ml de PBS (que contenía inhibidores de la proteasa Complete™) y se homogeneizaron de forma dounce ~40X con un homogeneizador de mortero suelto. Las células se recuperaron por medio de centrifugación a 3.000RPM durante 2 min. Se retiró el sobrenadante y las células granuladas se congelaron en nitrógeno líquido para el análisis de ChIP-seq como se ha descrito.

II. Unión del anticuerpo a las perlas magnéticas. Se utilizaron 60 pl de Dynabeads® Protein G por 2 ml de inmunoprecipitado (Invitrogen). Las perlas se lavaron 3 veces durante 5 minutos cada una con 1,0 ml de tampón de bloqueo (0,5% de BSA p/v en PBS) en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Se utilizó un imán (Invitrogen) para recolectar las perlas (se permitió la unión con el imán durante al menos 1 minuto completo) después de cada lavado y luego se aspiró el sobrenadante. Las perlas lavadas se resuspendieron en 250ul de tampón de bloqueo al que se añadieron 6 pg de anticuerpo y se dejó incubar la mezcla con mezcla de extremo a extremo durante toda la noche (mínimo 6 horas). Las perlas unidas a anticuerpos se lavaron 3 veces durante 5 minutos cada una con 1 ml de tampón de bloqueo y se resuspendieron en tampón de bloqueo (60ul por IP). Estos últimos lavados y resuspensiones se llevan a cabo una vez que las células han sido sonicadas (véase la siguiente etapa) y justo antes de la inmunoprecipitación nocturna.

III. Preparación de células y fragmentación genómica. Se añadieron inhibidores de proteasa 1X (Complete, Roche; se prepararon por medio de la disolución de un comprimido en 1 ml de H²O para una solución 50X y se almacenaron en alícuotas a -20 °C) a todos los tampones de lisis antes de su uso. Cada tubo de células (aproximadamente 5 x 107 células) se resuspendió en 5 a 10 ml de tampón de lisis 1 (LB1; 140mM de NaCl, 1mM de EDTA, 10% de glicerol, 0,5% de NP-40, 0,25% de Triton X-100) y se agitó a 4 °C durante 10 minutos. Las células se centrifugaron a 2.000 RPM x 5 minutos en una centrífuga de mesa a 4 °C y se aspiró el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 5 ml de tampón de lisis 2 (LB2; 200mM de NaCl, 1mM de EDTA, 0,5mM de EGTA, 10mM de Tris pH 8) y se incubaron extremo a extremo a 4 °C durante 10 minutos. Las células se volvieron a granular a 2.000 RPM x 5 minutos en centrífuga de mesa a 4 °C y se lavaron en 2 a 5ml de tampón de sonicación Covaris (10mM de Tris pH 8,0, 1mM de EDTA, 0,1% de SDS). Los gránulos se centrifugaron a 2.000 RPM x 5min en centrífuga de mesa a 4 °C. Las células se granularon a 2.000 RPM x 5 min en centrífuga de mesa a 4 °C y se resuspendieron a una concentración de 20 a 50 millones de células/1ml de tampón de sonicación Covaris. Se introdujo un ml de lisado celular en microtubos Covaris de 12x12 y se sonicó durante 5 minutos en total (potencia máxima 140, factor de trabajo 5,0, ciclos/explosión 200). Se recombinaron los sonicados en un tubo de 15ml, se añadieron 1 volumen de mezcla de dilución 2x (300mM de NaCl, 2mM de EDTA, 50mM de Tris pH 8,0, 1,5% de Triton-X, 0,1% de SDS), se granuló la fracción insoluble a 14.000 RPM durante 10 min a 4 °C y se recolectó el sobrenadante en un solo tubo. El sobrenadante se utilizó como entrada de ChIP para las inmunoprecipitaciones de cromatina. También ser recolectó 50 pl del lisado celular para el control de la muestra de extracto de células enteras ("INGRESO").

IV. Inmunoprecipitación de cromatina. Se añadieron 50 pl de perlas conjugadas con anticuerpos de la etapa II a la solución de extracto celular aclarado (preparada en la etapa III) en tubos de 1,5 ml y se agitaron durante toda la noche a 4 °C (mínimo 8 horas) para inmunoprecipitar los complejos ADN-proteína.

V. Lavado, elución e inversión de enlaces cruzados. Todos los tampones utilizados en estas etapas están helados. Se utilizaron un soporte magnético para precipitar las perlas magnéticas, se lavó 3 veces durante 5 minutos cada una con una mezcla suave de extremo a extremo con 1 ml de tampón de lavado 1 (50mM de HEPES pH 7,5; 140mM de NaCl; 1mM de EDTA; 1mM de EGTA; 0,75% de Triton-X; 0,1% de SDS; 0.05% de DOC); se lavó una vez durante 5 minutos con 1 ml de tampón de lavado 2 (50mM de HEPES pH 7,5; 500mM de NaCl; 1mM de EDTA; 1mM de EGTA; 0,75% de Triton-X; 0,1% de SDS; 0,05% de DOC); y una vez durante 5 minutos con 1 ml de tampón de lavado 3 (10mM de Tris pH 8,0; 1mM de EDTA; 50mM de NaCl). Se aspiró todo el tampón de lavado residual, se hicieron girar las perlas suavemente a 2.000 RPM durante 1 minuto; se volvieron a colocar los tubos en el imán y se elimina todos los restos de tampón. A continuación, se añadieron 210 pl de tampón de elución (50 mM de Tris pH8; 10mM de EDTA; 1% de SDS) y se eluyeron a 65 °C durante 60 minutos con un breve vórtex para resuspender las perlas cada 15 minutos. Se separamos las perlas del sobrenadante mediante el uso del imán; se retiraron 200 pl de sobrenadante y se colocaron en un tubo limpio para la reticulación inversa. Se revirtieron las fracciones de IP y de extracto de células enteras durante la noche a 65 °C (mínimo de 8 horas, pero máximo de 18 horas). A continuación, se utilizó el calentamiento para reticular por separado tanto la muestra para la inmunoprecipitación como las fracciones del extracto de células enteras, por medio de la incubación toda la noche a 65 °C (mínimo de 8 horas, pero máximo de 18 horas). El calentamiento facilita la hidrólisis de los enlaces cruzados de formaldehído.

VI. Limpieza y purificación del ADN. Se añadieron 200 pl de TE (50 mM Tris pH8; 1mM EDTA) y 2,7pl de 30mg/ml de ARNasa (0,2mg/ml de concentración final) a cada muestra, se mezclaron e incubaron a 37 °C durante 2 horas. A continuación, se añadieron 5 pl de solución de cloruro de calcio (300mM CaCh en 10mM de Tris pH8,0) a cada muestra junto con 4pl de 20mg/ml de proteinasa K (0,2mg/ml de concentración final), se mezclaron e incubaron a 55 °C durante 60 minutos. A continuación, se añadieron 400 pl de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico en una proporción de 25:24:1 (Sigma Aldrich #P3803) a cada tubo, se mezclaron en un mezclador de vórtice a baja potencia (5/10) y se invirtió cada tubo para seguir mezclando.

Se preparó un tubo PhaseLock Gel™ (Qiagen, 3 Prime) para cada muestra haciendo girar el tubo a temperatura ambiente durante 30 segundos a 10.000 RPM. A continuación, se añadieron la muestra de ADN en fenol: cloroformo: alcohol isoamílico al tubo PhaseLock Gel™ y se centrifugó a 12.000 a 16.000xg durante 2 minutos a temperatura ambiente. Se transfirió la solución acuosa a un nuevo tubo de 1,6ml (fracción superior), se añadieron 20ul de NaCl 5M, y 1,5ul de 20ug/ul de glucógeno (30ug en total), luego se añadió 1ml de EtoH y se mezclaron por medio de vórtex o inversiones. A continuación, la muestra se incubó a -20 °C durante la noche (6 a 16 horas). A continuación, se centró la mezcla a 20.000xg durante 20 minutos a 4 °C para granular el ADN, se eliminó el sobrenadante con una punta de pipeta de 1 ml, se lavaron los gránulos en 800 pl de EtOH al 80%, se centraron a 20.000xg durante 20 minutos a 4 °C y se eliminó el sobrenadante con una punta de pipeta de 1 ml. Se volvió a centrar la muestra durante 1 minuto a 20.000xg, se eliminaron todos los restos del sobrenadante y se dejó secar al aire durante 5 a 20 minutos. Los gránulos no deben tener un halo de agua a su alrededor y deben ser vidriosos o escamosos y secos. A continuación, se disolvió el gránulo en 60 pl de agua, mediante el uso de 10 pl para la validación de la qPCR y 50 pl para la secuenciación. Para la ChIP-qPCR, la amplificación se llevó a cabo mediante el uso de 1uL de la muestra por pocillo con 0,8uM de cebadores directo (F) y reverso (R), cada uno mezclado con 2x Power SYBR Green PCR Master Mix de Life Technologies siguiendo el protocolo del fabricante. Los cebadores a utilizar son los que se muestran en la tabla siguiente, en la que V1, V2 y V3 son pares de cebadores diseñados para hibridar con diferentes regiones dentro del potenciador RARA y "abajo" es un par de cebadores diseñados para hibridar con la región de control no acetilada y no codificante del gen.

[i]

Los resultados de ChIP-qpCR para una línea celular fuertemente responsiva (Au565) y una débilmente responsiva (T47D) en comparación con un extracto de células enteras ("WCE") de cada célula se muestran en las Figs. 1A y B. Esta figura ilustra que estos cebadores son eficaces para medir un fuerte enriquecimiento para la marca H3K27ac en el potenciador para estas líneas celulares en el pull down pero no en el WCE después de la normalización a una región de control intergénica cercana.

VII. Análisis ChIP Seq y cuantificación del súper potenciador RARA. Se usó la metodología descrita anteriormente mediante el uso de H3K27ac ChIP-seq para identificar un locus súper potenciador que se solapa con el gen RARA en el chr17:38458152-38516681 (construcción del genoma hg19). Esta región cromosómica se designó por consenso sobre las muestras que se examinan, pero podría variar un poco en función del marcador genómico que se detecte o del tipo de tejido que se utilice. Para evaluar la fuerza de este locus súper potenciador a través de diferentes muestras, se llevó a cabo H3K27ac ChIP-seq en cada muestra y también se secuenció una muestra de entrada ChIP coincidente. Todos los H3K27ac y las muestras de entrada se alinean con el genoma hg19 mediante el uso de Bowtie2 (mediante el uso del parámetro -sensible). La visualización de la pista de genes mostrada en la Fig. 2 muestra una muestra representativa de células que muestra los recuentos de lecturas alineadas en bines de 1bp, en la que cada lectura se extiende 200bp en la dirección de la alineación. Los recuentos de lecturas se expresan en número de lecturas alineadas por millón de lecturas alineadas (RPM). El AUC se calcula por medio de la suma de las lecturas en cada par de bases dentro de un locus definido. En base a la localización del locus súper potenciador RARA , también se evaluó el nivel del súper potenciador RARA en relación con el locus súper potenciador MALAT1 en los mapas ChIP-seq de H3K27ac existentes en diversas líneas celulares y muestras de pacientes.

Para cada par de muestras H3K27Ac/Input (filas en la tabla de la Fig. 3), se cuenta el número de lecturas H3K27Ac o Input que se alinean con el súper potenciador RARA (chr17:38458152-38516681) o con el súper potenciador de control positivo en MALAT1 (chr11:65263724-65266724). Todos los recuentos de lectura están en RPM. A continuación, se resta la señal de entrada de la señal de H3K27Ac en ambos loci para obtener el enriquecimiento de las lecturas ChIP de H3K27ac sobre el fondo (columna DIFF). Por último, para evaluar la fuerza del súper potenciador RARA en relación con el súper potenciador de control positivo MALAT1, se calcula la proporción de la señal de enriquecimiento de H3K27Ac del súper potenciador RARA con respecto a la señal de enriquecimiento de H3K27Ac en el súper potenciador MALAT1 y se informa esta proporción en la columna RARA/MALAT1. Un valor más alto indicaba una puntuación más fuerte del súper potenciador RARA . También se calculó la relación log¹⁰ (RARA/MALAT1). Todos estos valores para cada muestra probada se muestran en la Fig. 3.

La relación de log¹⁰ de RARA/MALAT1 para todas las líneas celulares de cáncer de mama y LMA y las muestras de pacientes se grafican como se muestra en las Figs. 4A y 4B, respectivamente. El umbral de 0,4 log¹⁰ que se muestra en cada gráfico es la fuerza SE más baja que se ha encontrado sensible al tamibaroteno en líneas celulares in vitro . Como se puede observar en estos gráficos, un determinado porcentaje de muestras de cada tipo de cáncer se sitúa por encima de este umbral. La Fig. 5 muestra la relación log10 de RARA/MALAT1 para las líneas celulares hematológicas normales y las muestras de pacientes analizadas. Como se puede observar, un determinado porcentaje de muestras de cada célula hematológica analizada se sitúa por encima del umbral, lo que sugiere que este tipo de estratificación de pacientes sería útil para identificar a los sujetos con trastornos hematológicos que responderían a un agonista de RARA.

El intervalo RARA SE se calcula mediante el uso de ROSE como se describe en la Patente de los Estados Unidos 9.181.580cuya divulgación se incorpora por referencia en la presente memoria. En primer lugar, se utiliza ROSE para calcular las puntuaciones de los potenciadores para todas las líneas celulares de cáncer de mama y LMA y las muestras de pacientes. Dentro de cada muestra, los potenciadores se clasifican por puntuación, y el intervalo del súper potenciador RARA es el intervalo del potenciador que se solapa con el gen RARA (chr17:38465444-38513094) con la puntuación más alta.

La Fig. 6 muestra una comparación de la relación log^-10 de RARA/MALAT1 para líneas celulares frente a muestras de pacientes en cáncer de mama y LMA. Como se puede observar en esta figura, las muestras de pacientes de ambos tipos de cáncer tienen un nivel de RARA estadísticamente significativo más alto que las líneas celulares correspondientes. Esto demuestra que los altos niveles del súper potenciador RARA no son un fenómeno in vitro limitado a las líneas celulares. Además, esto ilustra que se esperaría que una mayor proporción de las muestras de pacientes mostrara una respuesta al agonista RARA que las líneas celulares.

Ejemplo 2. Cribado de diversos compuestos moduladores de RaR contra el panel de cáncer de mama.

I. Materiales. Todas las líneas celulares se obtienen de ATCC y se cultivan a 37 °C en 5% deCO². Todos se cultivan en RPMI1640 suplementado con 10mM de tampón HEPES, 2mM de L-glutamina, 50U/mL de penicilina, 50U/mL de estreptomicina y 10% de suero fetal bovino (FBS, todo de Invitrogen). Las líneas celulares incluían AU565, SKBR3, T47D, HCC1143, MCF7, ZR-75-1 y HCC1569.

El tamibaroteno, el AM580 y la tretinoína se obtienen a partir de Sigma Aldrich. El ácido tazaroténico se obtiene a partir de Carbosynth. El adapaleno, BMS195614, BMS493, BMS961 se obtienen a partir de Tocris. El etretinato se obtiene a partir de Santa Cruz. El tazaroteno se obtiene a partir de Selleckchem.

La especificidad agonista de los diversos compuestos de prueba para cada tipo de RaR se evalúa en Life Technologies mediante el uso de sus Servicios de Perfiles Nucleares SelectScreen®. Los valores obtenidos se muestran en la siguiente tabla:

Como se puede observar en la tabla anterior, el tamibaroteno, el BMS753 y el AM580 tienen la mayor especificidad para RARA sobre RaR-Y, lo que de ese modo confirma su condición de agonistas específicos de RARA. Esta especificidad es importante porque el agonismo del RaR-Y está asociado a la toxicidad. No se sabe que el agonismo del RaR-p contribuya a la eficacia o la toxicidad y, por lo tanto, no debería afectar al potencial terapéutico de un agonista.

II. Cribado de rendimiento medio. El día del experimento, las células se homogeneizan con Accumax (EMD Millipore), se cuentan y se ajustan a 40.000 células/ml para las líneas de cáncer de mama y a 60.000 células/mL para la LMA en medios de crecimiento adecuados. Mediante el uso de una Biotek EL406, se distribuyen 50|jl de células en placas de 384 pocillos blancas (ATPlite) o negras (CyQuant) (Thermo). Las células se devuelven a la incubadora a 37 °C para permitir la adhesión. Después de tres horas, los compuestos se añaden a las placas mediante el uso de un colector de transferencia de 384 pocillos de 20nl en una estación de trabajo Janus. Las cepas están dispuestas en 10 puntos de respuesta a la dosis por cuadruplicado en la cepa de DMSO en placas de compuesto de 384 pocillos. Tras la adición del compuesto, las placas se incuban durante cinco o diez días en un incubador a 37 °C.

La viabilidad de las células se lee con ATPlite (Perkin Elmer) o CyQuant (Life Technologies). En el caso de ATPlite, las placas se sacan de la incubadora y se llevan a temperatura ambiente antes de su uso. El polvo liofilizado del reactivo ATPlite se resuspende en tampón de lisis y se diluye 1:2 con agua destilada. Se añaden 25|jl de esta solución a cada pocillo mediante el uso del manipulador de líquidos Biotek. Las placas se incuban durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de leer la señal de luminiscencia en un Envision Plate Reader (Perkin Elmer). Para el CyQuant, los reactivos se mezclan de acuerdo con las instrucciones del fabricante en PBS (Gibco). El reactivo se añade con una pipeta multicanal y las placas se vuelven a colocar en la incubadora durante 30 minutos antes de la lectura en un Envision Plate Reader (Perkin Elmer).

Los datos adquiridos como se ha descrito se almacenan y agrupan en Excel de Microsoft y se analizan con el software GraphPad Prism. Los ajustes de las curvas para calcular la EC50 y la Emax se llevan a cabo en GraphPad Prism versión 6.0 mediante el uso de regresiones no lineales de cuatro parámetros (la pendiente de Hill no se supone igual a 1) con los datos transformados en log10 de las concentraciones de los compuestos trazados contra el porcentaje de viabilidad de las células cuando se normalizan con los pozos tratados sólo con DMSO incluidos en la placa. Se excluyeron los pozos de los bordes.

Como se muestra en la Fig. 7, cuatro líneas diferentes de cáncer de mama exhiben diferentes respuestas al tamibaroteno, con un orden de sensibilidad de SKBR3>Au565>ZR75>Hcc1143. Esto se correlaciona muy bien con el nivel de superpotencia en el sitio RARA, como se muestra en la Fig. 2. La correlación de la sensibilidad al tamibaroteno con la fuerza del súper potenciador (log10 EC50 frente a la proporción del súper potenciador RARA/MALAT1) para 7 líneas celulares de cáncer de mama diferentes se muestra en la Fig. 8 con un valor de correlación (R2)de 0,7086.

Como se muestra en la Fig. 9, tres líneas celulares diferentes de LMA muestran diferentes respuestas al tamibaroteno, con un orden de sensibilidad de SigM5>OCI M1>HEL. Como se muestra en las Figs. 23A y B, dos líneas celulares adicionales de LMA, MV411 y Kasumi, se ensayan junto con SigM5 y HEL para la sensibilidad a tamibaroteno y demostraron un orden de sensibilidad de SigM5>MV411>HEL=Kasumi. La correlación de la sensibilidad al tamibaroteno con la fuerza del súper potenciador (log10 EC50 frente a la proporción del súper potenciador RARA/MALAT1("IEA") para 11 líneas celulares diferentes de LMA se muestra en la Fig. 10 con un valor de correlación (R2) de 0,3635, pero ese valor aumenta a 0,5680 cuando no se tiene en cuenta una línea celular que muestra una desviación significativa de la norma (mayor SE pero menor sensibilidad de la esperada), HEL.

Ejemplo 3. Medición de los niveles de expresión de ARN y proteínas de RARA

Las mediciones del nivel de expresión se emplean para determinar el nivel de ARNm para el gen de RARA marcado. Los niveles de ARNm se correlacionan bien con los niveles del potenciador y, por lo tanto, también son predictivos de la sensibilidad a los agonistas RARA. Se utilizaron diversos medios para medir el ARN, como se indica a continuación.

I. Tecnología basada en matrices. Los niveles de expresión en HCC1143 y AU565 se evalúan con lotes triplicados de 1 x 106 células. El ARN se extrae de las células con Trizol® y se purifica con el kit de purificación de ARN mirVana™ (ambos de Life Technologies), siguiendo el protocolo del fabricante. Los niveles de ARN se leen en matrices Affymetrix PrimeView™ en el Dana Farber Cancer Institute Microarray Core (http://mbcf.dfci.harvard.edu/).

La Fig. 11 muestra los niveles de expresión de ARNm de diversos subtipos de RaR en una línea celular que responde al tamibaroteno (Au565) y otra que no responde (HCC1143), medidos por medio del protocolo anterior. La expresión del ARNm de RARA es 8 veces mayor en la línea celular receptiva frente a la no receptiva, mientras que la expresión de RaR-p y RaR-Y no es significativamente diferente entre las líneas celulares. Esto confirma que el análisis de la expresión de ARNm de RARA se correlaciona con la fuerza del súper potenciador de RARA y la sensibilidad a un agonista de RARA, además de demostrar que el nivel de ARNm de RARA se puede utilizar para predecir la sensibilidad a dicho agonista.

II. ARN-Seq. Los niveles de expresión de RARA se cuantifican por medio de ARN-Seq. Se lleva a cabo el ARN-Seq de Poly-A y las lecturas se alinean con el transcriptoma del HG19 mediante el uso del software RSEM (parámetros = --samtools-sort-mem 3G --ci-memory 3072 --bowtie-chunkmbs 1024 --quiet--output-genome-bam --bowtie2--strand-specific) y luego se lleva a cabo la cuantificación del ARNm mediante el uso de RSEM y se informa en Transcriptos Por Millón (TPM). Los valores trazados muestran los niveles log2(FPKM+1) para RARA (eje y) frente a la puntuación del súper potenciadorRARA/MALAT1) para 48 pacientes primarios de LMA (Fig. 12) tienen una Correlación de Spearman de 0,589 y un valorde R2 de 0,0457.

III. qPCR. La expresión también se estudia por medio de rt-qPCR. Se contaron las células y se sembraron a razón de 200.000 células por mL para cada línea celular. A continuación, las células se trataron con 500nM de tamibaroteno o vehículo durante 48 horas. El ARN se extrajo de las células con Trizol® y se purificó con el kit de purificación de ARN mirVana™ (ambos de Life Technologies), siguiendo el protocolo del fabricante. El ARN purificado se convirtió en ADNc mediante el uso de la transcriptasa inversa SuperScript® Vilo™ (Life Technologies) siguiendo el protocolo del fabricante. La abundancia del transcrito se midió entonces mediante el uso de sondas Taqman® (Life Technologies) para RARA y para 18s ARNr para su normalización. Para RARA, se utilizó la sonda Hs00940446_m1 con una longitud de amplicón de 68 y que abarca los exones 6 y 7. Para el 18S ARNr se utilizó la sonda 4319413E con un amplicón de 187 pb. La qPCR se lleva a cabo con la mezcla maestra de expresión génica Taqman® (Life Technologies) siguiendo el protocolo del fabricante. El análisis de los datos se lleva a cabo por medio del procedimiento delta Ct. El valor Ct del 18s ARNr se resta de cada muestra para normalizar la abundancia celular. Los valores dCt indican las diferencias de pliegues relativos en la abundancia de transcritos de ARN. Los valores de dCt más bajos indican una mayor expresión de ARNm. En la Fig. 13 se muestran los resultados de los valores de la rt-qPCR para 6 líneas celulares de cáncer de mama diferentes, graficados en orden de su fuerza SE (de la más alta (SKBR3) a la más baja (HCC1143). Como se puede observar, el valor de la rt-qPCR se correlaciona bien con la fuerza del súper potenciador en el locus RARA . Las Figs. 14A a B muestran que los valores de dCT tienen una alta correlación con la fuerza del SE y con la sensibilidad medida por la EC⁵⁰.

IV. Western Blotting. Se contaron las células y se ajustaron a 2 millones por línea celular y se granulan. Los gránulos de células se lisan mediante el uso del tampón RIPA (Life Technologies) más el cóctel de proteasas de Roche en un volumen de 100|jl. Las muestras se limpian por centrifugación a 20.000xg durante 5 minutos. Se cargan diez pl de muestra en geles Bis-Tris al 4 a 12% (Life Technologies). Los anticuerpos utilizados son Abcam 1791 histona H3 para el control de carga y Sigma Aldrich SAB1404298 para RARA. Los resultados se muestran en la Fig. 15. No parece haber una buena correlación entre los niveles de la proteína RARA y el tamaño del súper potenciador o la sensibilidad de las células a un agonista de RARA. Esto confirma los resultados anteriores de otro grupo que también demostró una falta de correlación entre la expresión de la proteína RARA y la sensibilidad a los retinoides (G Paroni et al., Oncogene, 31:3431 a 3443 (2012); véase la Fig. 1C en la referencia).

V. Puntuación Z de TCGA. Las puntuaciones Z de expresión de los conjuntos de datos del TCGA se obtienen del cBio Portal for Cancer Genomics (http://www.cbioportal.org/public-portal/).

VI. Mediciones de la expresión del MDS. Datos de expresión de Affymetrix en bruto de 159 pacientes con SMD y 17 normales asociados a Gerstung et al. (PMID: 25574665) se descargan del NCBI Gene Expression Omnibus (GSE58831). Los datos de expresión se normalizan en R mediante el uso de la función "justRMA" con parámetros por defecto para producir valores normalizados a nivel de sonda en todas las muestras. El valor de la sonda Affymetrix '203749_s_at' se utiliza para representar el nivel de ARNm de RARA. La media y la desviación estándar de los niveles de RARA en las 17 muestras normales se calculan y luego se utilizan para generar las puntuaciones Z de RARA ARNm.

Ejemplo 4. El número de copias del gen RARA no está relacionado con la sensibilidad al tamibaroteno.

A fin de descartar la posibilidad de que la sensibilidad al tamibaroteno se basara en el número de copias del gen HER2 y que la amplificación de RARA y HER2 fuera codependiente, como sugieren G. Paroni y otros, supra, se analizó el número de copias de los genes RARA y HER2 en dos líneas celulares de cáncer de mama que responden a la terapia: Au565 y T47D. El ADN se extrajo con el QlAamp® DNA Mini Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN purificado se analizó con un microarray Human Cytoscan® HD de Affymetrix. Los datos se procesaron mediante el uso del paquete Aroma de Bioconductor en el entorno estadístico R, y se graficaron mediante el uso de los gráficos base de R. Como se muestra en las Figs. 16A y B, mientras que la línea celular Au565 tiene un mayor número de copias del gen HER2 (Recuadro 1) que RARA (Recuadro 2), no se observa lo mismo en la línea T47D, igualmente sensible al tamibaroteno. Además, hay poca diferencia en el número de copias del gen RARA entre las dos líneas celulares. Esto demuestra que la amplificación del número de copias del gen RARA no depende del número de copias de HER2 y que la sensibilidad a un agonista de RARA no depende del número de copias de HER2.

Ejemplo 5. Identificación de súper potenciadores asociados a RARA en otros cánceres

Se utilizó la ubicación conocida del dominio súper potenciador RARA para sondear muestras de cáncer de pacientes adicionales para determinar si dichos cánceres tenían un súper potenciador RARA . Se encontró un gran súper potenciador asociado a RARA tanto en las muestras de pacientes de glioblastoma como de neuroblastoma, pero no en las de cáncer colorrectal (véase la Fig. 17). Esto sugiere que la estratificación de los pacientes para el tratamiento con un agonista de RARA también se puede llevar a cabo en pacientes que sufren de glioblastoma o neuroblastoma. Además, el análisis de Z-score de los niveles de ARNm de RARA sugiere que ciertos sujetos que padecen cáncer colorrectal pueden responder a un agonista de RARA, a pesar de estos resultados de superpotenciación (véase la Fig. 30).

Ejemplo 6. Sensibilidad de un xenoinjerto de células de cáncer de mama HCC1954 al tamibaroteno.

Los modelos de xenoinjerto derivados de la línea celular de cáncer de mama (HCC1954) en ratones inmunocomprometidos BALB/c son preparados por Crown Biosciences (Pekín, China) esencialmente como sigue.

Ratones BALB/c inmunocomprometidos de seis a ocho semanas de edad, con un peso de entre 18 y 20 g, son inoculados por vía subcutánea en la región del flanco derecho con células tumorales HCC1954 (5 x 106) en 0,1 ml de PBS (matrigel 1:1) para el desarrollo del tumor. Cuando el tamaño medio del tumor alcanza un volumen de entre 100 a 200 mm3 los animales son emparejados por el volumen del tumor en grupos de tratamiento que se utilizarán para la dosificación y se iniciará la misma. El tamibaroteno se administra por vía oral en PBS ajustado a pH 8 y DMSO al 1% en un programa diario (QD, PO) durante un máximo de 21 días. La dosis final en ratones es de 6 mg por kg al día en el brazo de dosis alta (n=10) y de 3 mg por kg al día en el brazo de dosis baja (n=10) en un volumen de 10ml/kg. Los ratones del brazo del vehículo (n=10) reciben el mismo esquema, volumen y formulación pero sin el fármaco. El volumen del tumor se mide dos veces por semana con un calibrador.

Los resultados de estos experimentos demuestran que el tamibaroteno reduce el volumen del tumor en este modelo de manera dependiente de la dosis (Fig. 18). La reducción del volumen tumoral está justo por debajo de la significación estadística en el brazo de dosis baja (p=0,0552) y es estadísticamente significativa en el brazo de dosis alta (p=0,0048) por medio de la prueba t mediante el uso de la corrección de Welch. Los resultados en este modelo de xenoinjerto confirman la sensibilidad de las células HCC1945 en cultivo al tamibaroteno.

Ejemplo 7. Corte del intervalo ordinal de la fuerza del súper potenciador RARA en el cáncer de mama El perfil potenciador/súper potenciador total de ciento setenta muestras de cáncer de mama (tanto muestras de pacientes como líneas celulares de cáncer de mama, que incluyen HCC1954) se analizan mediante el uso de H3K27Ac y ChIP-Seq como se describe en el Ejemplo 1. En cada una de las muestras, se determina el intervalo ordinal del potenciador asociado a RARA en términos de fuerza (medida por H3K27Ac) en comparación con otros potenciadores y súper potenciadores en la misma célula y los intervalos ordinales determinados se trazan en un gráfico de barras de orden de intervalo (Fig. 19). En el HCC1954 se determinó que el súper reforzador RARA era el 204° reforzador más fuerte en esa célula (véase la Fig. 19). En base a este resultado y en la capacidad de respuesta del HCC1954 al tamibaroteno, se estableció el punto de corte ordinal para las potenciales pacientes de cáncer de mama que responden al tamibaroteno como aquellas que tienen un súper potenciador RARA en su tumor que es al menos el 200° más fuerte. Como se determinó a partir de nuestro análisis de 48 muestras de células tumorales primarias de cáncer de mama procedentes de sujetos humanos, el 55,3% de esas muestras tenían un súper potenciador RARA que era al menos el 200 más fuerte en esas células (Fig. 20A). Por lo tanto, se fijó el punto de corte de la prevalencia en el 55,3%. Ese mismo corte de prevalencia se utiliza también como corte de prevalencia de ARNm de RARA cuando se identifican posibles respondedores al tamibaroteno en función de las mediciones de ARNm de RARA.

Cuando las muestras de cáncer de mama primario se desglosan además por subtipo, se generan diferentes puntos de corte de prevalencia para cada subtipo mediante el uso del mismo punto de corte ordinal del súper potenciador RARA de 200. Estos puntos de corte de la prevalencia son el 78,6% para el receptor hormonal positivo; el 56,3% para el HER2 positivo; y el 35,2% para el cáncer de mama triple negativo (Fig. 20B).

Ejemplo 8. Los niveles de ARNm de RARA se correlacionan con la capacidad de respuesta al tamibaroteno en PDX de cáncer de mama

Los modelos TumorGraft® de bajo paso de cáncer de mama humano en ratones hembra inmunocomprometidos (Harlan; nu/nu nude) son creados por Champions Oncology (Baltimore, Maryland) mediante el uso del siguiente protocolo.

Se implantan en ratones stock muestras de tumores de cáncer de mama de pacientes (n=3 para cada muestra de paciente por separado y para los controles), que se dejan crecer hasta 1 a 1,5 cm3. A continuación, se extraen los tumores de los ratones de reserva y se reimplantan fragmentos de los mismos de forma unilateral en el flanco izquierdo de los ratones de estudio previo (hembra; Harlan; nu/nu nude, de 5 a 8 semanas de edad; n=3 para cada muestra de paciente y para los controles). Cuando los tumores alcanzan aproximadamente 100 a 300 mm3, los animales anteriores al estudio se emparejan por el volumen del tumor en grupos de tratamiento que se utilizarán para la dosificación y ésta se inicia el Día 0. El tamibaroteno se administra por vía oral en PBS ajustado a pH 8 y DMSO al 1% en una pauta diaria a una dosis final de 6 mg por kg de peso corporal en un volumen de 10 ml/kg. Los ratones del brazo del vehículo reciben el mismo programa, volumen y formulación, pero sin tamibaroteno.

Los volúmenes de los tumores se miden con un calibrador dos veces por semana. El último día de tratamiento se lleva a cabo una medición final del volumen del tumor. Las Figs. 21A y B muestran la respuesta de dos de estos PDX (CTG-1059 (alto ARNm de RARA) y CTG-0012 (bajo ARNm de RARA) al tamibaroteno ("SY1425"). CTG-1059 demuestra una disminución estadísticamente significativa del volumen tumoral después de 25 días de tratamiento con tamibaroteno en comparación con un control sólo con vehículo. CTG-0012 no mostró ninguna diferencia significativa entre el tamibaroteno y el control.

Los niveles de ARNm de RARA en estos dos PDX, así como en otros 7 PDX de cáncer de mama, se determinan mediante el uso de ARN-seq como se describe en el Ejemplo 3. Se asume que estos 9 PDXs representan una población que tiene una distribución normal de los niveles de ARNm de RARA y mediante el uso del corte de prevalencia del 55,3% determinado en base al ordinal de la fuerza del SE de RARA , el CTG-1059 que responde al tamibaroteno tiene un valor de prevalencia del nivel de ARNm de RARA superior al 55,3%, mientras que el CTG-0012 que no responde tiene un valor de prevalencia del nivel de ARNm de RARA inferior al 55,3% (Fig. 22).

Ejemplo 9. Corte del intervalo ordinal de la fuerza del súper potenciador RARA en LMA

El perfil potenciador/súper potenciador total de 95 muestras de LMA (tanto muestras de pacientes como líneas celulares de LMA, que incluyen SigM5, MV411, HEL y Kasumi) se analizan mediante el uso de H3K27Ac y ChIP-Seq como se describe en el Ejemplo 1. En cada una de las muestras, se determina el intervalo ordinal del potenciador asociado a RARA en términos de fuerza (medida por H3K27Ac) en comparación con otros potenciadores y súper potenciadores en la misma célula y los intervalos ordinales determinados se trazan en un gráfico de barras de orden de intervalo (Figs. 23A a C). En MV411, se determinó que el potenciador asociado a RARA era el 133° potenciador más fuerte. MV411 es la línea celular confirmada que responde al tamibaroteno y que tiene el ordinal más bajo de fuerza súper potenciadora. En HEL, se determinó que el potenciador asociado a RARA era el 155° potenciador más fuerte. HEL es la línea celular confirmada que no responde al tamibaroteno y que tiene el ordinal más alto de fuerza súper potenciadora. Sobre la base de estos valores, se fijó el límite ordinal de la fuerza potenciadora de RARA en 150, un valor intermedio entre el ordinal de HEL y el ordinal de MV411.

Como se determinó a partir del análisis de 70 muestras de células primarias de LMA de sujetos humanos, el 36% de esas muestras tenían un súper potenciador RARA que era al menos el 150° más fuerte en esas células (Fig. 24). Por lo tanto, se fijó el punto de corte de la prevalencia en el 36%. Ese mismo corte de prevalencia se utiliza también como corte de prevalencia de ARNm de RARA cuando se identifican posibles respondedores de LMA a tamibaroteno en base a las mediciones de ARNm de RARA.

También se cuantificaron los potenciadores para un panel ampliado de líneas celulares de LMA por la relación entre el potenciador RARA y el potenciador MALAT1. Al trazar este valor de la relación de fuerza del potenciador contra la sensibilidad al tamibaroteno, se confirmó que 5 de 6 líneas celulares que tienen relaciones de fuerza del potenciador RARA por encima de 1 son sensibles, mientras que sólo 4 de 7 líneas celulares que tienen potenciadores por debajo de este nivel son sensibles (Fig. 32). Cuando el punto de corte se desplaza a una proporción de potenciadores RARA/MALAT de 1,4 o superior, todas las líneas celulares (4 de 4) responden.

Ejemplo 10. El corte de intervalo ordinal de la fuerza del súper potenciador RARA en la LMA se correlaciona con los niveles de ARNm de RARA

Las muestras de pacientes de LMA utilizadas para determinar el corte de prevalencia ordinal de la fuerza súper potenciadora de RARA del 36%, se dividen en dos grupos - los que tienen un intervalo de prevalencia del 36% o superior (es decir, un valor de % más bajo) y los que tienen un intervalo de prevalencia inferior al 36% (es decir, un valor de % más alto) - y se analizan para el nivel de ARNm de RARA mediante el uso de ARN-seq como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la Fig. 25. El grupo que se encuentra en el intervalo de prevalencia del 36% o más en el ordinal de fuerza súper potenciadora de RARA tiene un nivel de ARNm de RARA más alto y estadísticamente significativo que el grupo que se encuentra por debajo del intervalo de prevalencia (p<0,001). Esto confirmó de nuevo que un límite de prevalencia determinado a nivel de súper potenciador también se puede utilizar como límite de prevalencia a nivel de ARNm.

También se determinaron los niveles de ARNm de RARA en 11 líneas celulares diferentes de LMA mediante el uso de ARN-seq y se compararon los niveles de ARNm con la sensibilidad al tamibaroteno. Las líneas celulares de LMA analizadas se dividieron en dos grupos distintos en función de su sensibilidad o insensibilidad al tamibaroteno. Todas las líneas celulares sensibles al tamibaroteno tenían ARNm de RARA medido por ARN-seq >10 TPM, mientras que tres líneas celulares insensibles tenían niveles por debajo de este nivel de corte (Fig. 33).

Ejemplo 11. Sensibilidad de diversos xenoinjertos derivados de muestras de pacientes de LMA al tamibaroteno.

Diferentes muestras de pacientes de LMA (AM8096, AM5512, AM7577 y AM7440) derivadas de modelos de xenoinjertos en ratones inmunocomprometidos BALB/c son preparadas por Crown Biosciences (Beijing, China) esencialmente como sigue.

Se suspendieron aproximadamente 2 x 106 células de cada muestra de paciente en 100 pl de PBS y se inyectan en ratones separados (n=3 para cada muestra de paciente diferente y para el control) por inyección IV en la cola. En el caso de los xenoinjertos AM5512, AM7577 y AM7440, la carga tumoral se considera lo suficientemente alta como para iniciar el tratamiento cuando la concentración de células CD45+ humanas alcanza ~1 a 5% en la sangre periférica del animal. Las células CD45+ humanas se detectan en la sangre de ratón (obtenida a través de hemorragias oculares) mediante el uso de un clasificador celular activado por fluorescencia y FITC anti-CD45 humano (Biolegend, Núm. de Cat. 304037). Para los xenoinjertos AM8096, el tratamiento se inicia 40 días después de la inyección de las células.

El tamibaroteno se administra por vía oral en PBS ajustado a pH 8, 1% de DMSO en un programa diario a una dosis final de 6 mg por kg de peso corporal en un volumen de 10ml/kg. Los ratones del brazo del vehículo reciben el mismo programa, volumen y formulación, pero sin tamibaroteno. Los niveles de células CD45+ humanas en la sangre periférica de los animales tratados y de los animales de control se miden una vez a la semana.

Los xenoinjertos AM5512 y AM8096 muestran una reducción significativa del % total de células CD45+, así como del % de células CD45+ en la sangre, la médula ósea y el bazo, cuando se tratan con tamibaroteno en comparación con el control del vehículo tras 35 días de tratamiento (Figs. 26A a F). Por otro lado, AM7577 y AM7440 no muestran una reducción significativa del volumen tumoral entre los animales tratados con tamibaroteno y los tratados con vehículo, ni en general ni en ninguno de los casos de sangre, médula ósea o bazo (Figs. 27A a D).

La Fig. 28 muestra una ordenación de los niveles de ARNm de RARA de muestras de pacientes individuales utilizadas en el análisis de agrupación mostrado en la Fig. 25. Además, la Fig. 28 incluye los niveles de ARNm de RARA de cada una de las muestras de pacientes utilizadas en el estudio de xenoinjertos. Los dos que no responden en el estudio de xenoinjertos, AM7577 y AM7440, tienen niveles de ARNm de RARA muy por debajo del límite de prevalencia del 36%. Uno de los respondedores, AM8096, tiene un nivel de ARNm de ^rAR^a que está por encima del corte de prevalencia del 36%. La otra respuesta, AM5512, se sitúa ligeramente por debajo del límite de prevalencia del 36% (valor de prevalencia del 46,9%). Estos resultados del ARNm de RARA sugieren que el punto de corte de la prevalencia se podría ajustar a la baja (por ejemplo, al 46,9%) para maximizar el número de respondedores potenciales.

Ejemplo 12. El AM5512 es sensible al Tamibaroteno pero no al ATRA.

Los ratones de xenoinjerto AM5512 se preparan como se ha descrito anteriormente. Cuando la concentración de células humanas CD45+ alcanza ~1 a 5% en la sangre periférica del animal, se les trata con tamibaroteno (n=7; 3 mg/kg, BID), ácido transretinoico (ATRA; n=7; 4 mg/kg BID) o un vehículo de control (n=5). Mientras que el tamibaroteno es un agonista específico del RARA, el ATRA agoniza todos los receptores del ácido retinoico (RAR-a, RAR-p y RAR-y). Como se muestra en las Figs. 29A y B, los ratones de xenoinjerto AM5512 tratados con tamibaroteno muestran una reducción significativa del % de células CD45+ tras 28 días de tratamiento en comparación con los animales de control con vehículo y los tratados con ATRA, y 5 de los 7 animales sobreviven al curso del experimento. Sorprendentemente, aunque los ratones de xenoinjerto AM5512 tratados con ATRA muestran una reducción del % de células CD45+ en comparación con el control del vehículo tras 14 días de tratamiento, ninguno de esos ratones sobrevivió más allá del día 21.

Ejemplo 13. Subconjuntos de muestras de pacientes con otros cánceres tienen altos niveles de ARNm de RARA

Para un número de diferentes tipos de cáncer, se utilizaron las puntuaciones z del nivel de ARNm de RARA proporcionadas por TCGA como se describe en el Ejemplo 3. En una distribución normal de una población, el 5% de las muestras debería tener un nivel de ARNm RARA superior a 2 desviaciones estándar de la media. La Fig. 30 es una tabla que muestra los tipos de cáncer específicos que tienen más del 5% de las muestras con niveles de ARNm de RARA superiores a 2 desviaciones estándar de la media. Sin estar limitados por la teoría, creemos que cada uno de estos cánceres será susceptible de los procedimientos de estratificación y tratamiento expuestos en la presente memoria .

También se observaron específicamente las muestras de pacientes que sufren de síndrome mielodisplásico, que se cree que es un cáncer estrechamente relacionado con la LMA Los niveles de ARNm de RARA de 176 pacientes (17 normales; 159 con SMD) se obtienen como se describe en el Ejemplo 3. Las muestras se clasifican en función del estado de la enfermedad y los niveles de ARNm de RARA se representan como se muestra en la Fig. 31. El análisis estadístico de los resultados (prueba T) muestra que los niveles de ARNm de RARA son significativamente elevados en las muestras de pacientes con SMD en comparación con las muestras de pacientes normales (p = 0,08751). Para validar aún más la presencia de RARA elevada en los SMD, se llevó a cabo un análisis ChIP-seq del potenciador H3K27ac en muestras de médula ósea recolectadas de dos pacientes con SMD. En ambos pacientes, el locus del gen RARA tenía una señal H3K27ac notablemente más fuerte en las dos muestras de médula ósea de pacientes con SMD, en comparación con la señal encontrada en los blastos de donantes sanos. La fuerza del súper potenciador RARA en los pacientes con SMD era similar a la de los blastos del subconjunto de pacientes con LMA que tienen súper potenciadores RARA fuertes y altos niveles de ARNm RARA. Además, el súper potenciador RARA en las células de pacientes con SMD tenía un ordinal de fuerza potenciadora RARA elevado (9 y 60, respectivamente) en comparación con los tipos de células blásticas e inmaduras de sujetos sanos.

Sin estar limitados por la teoría, se cree que los pacientes de SMD también serán susceptibles a los procedimientos de estratificación y tratamiento expuestos en la presente memoria.

Equivalencias y ámbito de aplicación

En las realizaciones, los artículos tales como "un", "una", "la" y "el" pueden significar uno o más de uno a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto. Las realizaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno o todos los miembros del grupo están presentes, se emplean o son relevantes para un producto o proceso determinado, a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto. La invención incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo está presente en, empleado en, o de otra manera relevante para un producto o proceso dado. La invención incluye realizaciones en las que más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, empleados en, o de otra manera son relevantes para un producto o proceso dado.

Además, la invención abarca todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las que una o más limitaciones, elementos, cláusulas y términos descriptivos de una o más de las realizaciones enumeradas se introducen en otra realización. Por ejemplo, cualquier realización que dependa de otra realización se puede modificar para incluir una o más limitaciones encontradas en cualquier otra realización que dependa de la misma realización base. Cuando los elementos se presentan en forma de lista, por ejemplo, en formato de grupo de Markush, también se desvela cada subgrupo de los elementos, y cualquier elemento o elementos se pueden eliminar del grupo. Se debe entender que, en general, cuando se hace referencia a la invención, o a aspectos de la invención, como que comprende elementos y/o características particulares, ciertas realizaciones de la invención o aspectos de la invención consisten, o consisten esencialmente, en dichos elementos y/o características. En aras de la simplicidad, esas realizaciones no se han expuesto específicamente in haec verba en la presente memoria. También se observa que los términos "que comprende" y "que contiene" están pensados para ser abiertos y permiten la inclusión de elementos o etapas adicionales. Cuando se indican intervalos, se incluyen los puntos finales. Además, a menos que se indique lo contrario o que sea evidente por el contexto y la comprensión de los expertos en la técnica, los valores que se expresan como intervalos pueden asumir cualquier valor específico o subintervalo dentro de los intervalos indicados en diferentes realizaciones de la invención, hasta la décima de la unidad del límite inferior del intervalo, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

Los expertos en la técnica reconocerán o serán capaces de determinar, sin más que la experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas descritas en la presente memoria. El alcance de las presentes realizaciones descritas en la presente memoria no se pretende limitar a la Descripción anterior, sino que es como se establece en las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> SYROS PHARMACEUTICALS, INC.

<120> PROCEDIMIENTOS DE ESTRATIFICACIÓN DE PACIENTES PARA EL TRATAMIENTO CON

AGONISTAS DEL RECEPTOR ALFA DEL ÁCIDO RETINOICO

<130> S2172-7019WO

<140> PCT/US2016/025256

<141>2016-03-31

<150> 62/268.203

<151>2015-12-16

<150> 62/140.999

<151>2015-03-31

<160> 8

<170> PatenteIn versión 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético

<400> 1

aaacgtgtcc ccacctc 19

<210> 2

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético

<400> 2

ccagccaggc acataggg 18

<210> 3

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético <400> 3

gtcaccgcac tcacttccat 20

<210>4

<211> 20

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético <400> 4

aaatagcgct cggtggagaa 20

<210>5

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético <400> 5

ttcctagtgg tcccccttcc 20

<210>6

<211> 21

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético <400> 6

tgaagattgt ttgcaccccc t 21

<210>7

<211> 21

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético <400> 7

ctgctggtac ccagaagtga g 21

<210>8

<211> 22

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético <400> 8

tgttgagttt tgccagtctc tt 22

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un agonista del receptor alfa del ácido retinoico (RARA) para su uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto humano que padece un cáncer, en el que el cáncer es una leucemia, un linfoma, un mieloma múltiple o un síndrome mielodisplásico (SMD) y se ha determinado que las células cancerosas del sujeto tienen un súper potenciador que tiene un locus asociado a un gen RARA localizado en chr17:38458152-38516681 en la estructura genómica hg19, en el que el súper potenciador tiene una fuerza, un intervalo ordinal o un intervalo de prevalencia que es igual o superior a un nivel umbral predeterminado; en el que el procedimiento comprende la etapa de administrar al sujeto la composición farmacéutica que comprende un agonista de RARA.

2. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en la que la fuerza del súper potenciador se determinó por medio de la cuantificación de las modificaciones de la histona H3K27Ac mediante el uso de ChIP-seq.

3. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en la que el súper potenciador tiene:

a) una fuerza correspondiente a un intervalo de prevalencia que es igual o superior a un corte de prevalencia predeterminado para la fuerza del súper potenciador del gen RARA ; y/o

b) una fuerza que es igual o superior a un límite predeterminado de fuerza del gen RARA ; y/o

c) un ordinal de fuerza correspondiente a un intervalo de prevalencia que es igual o superior a un corte de prevalencia ordinal de fuerza génica RARA predeterminado; y/o

d) un ordinal de fuerza que sea igual o superior a un corte ordinal de fuerza genética predeterminado por RARA .

4. La composición farmacéutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el agonista de RARA es el tamibaroteno.

5. La composición farmacéutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la leucemia es leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielocítica aguda (LMA) o leucemia mielocítica crónica (LMC), y el linfoma es linfoma de Hodgkin o linfoma no Hodgkin.

6. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 5, en la que la LMA es una LMA que no es de tipo LPA

7. Una composición farmacéutica que comprende un agonista del receptor alfa del ácido retinoico (RARA) para su uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto que padece cáncer, en el que el cáncer es una leucemia, un linfoma, un mieloma múltiple o un síndrome mielodisplásico, y el procedimiento comprende las etapas de: a. recibir información relacionada con: la fuerza, el intervalo ordinal o el intervalo de prevalencia de un súper potenciador que tiene un locus asociado a un gen RARA localizado en chr17:38458152-38516681 en la construcción genómica hg19 en una célula cancerosa del sujeto; y

b. administrar al sujeto un agonista de RARA si la información indica: el súper potenciador tiene una fuerza, un intervalo ordinal o un intervalo de prevalencia que es igual o superior a un nivel umbral predeterminado.

8. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 7, en la que la etapa a. comprende recibir información relacionada con uno o más de:

i. la fuerza del súper potenciador y/o el intervalo de prevalencia de la fuerza del súper potenciador en una población a la que corresponde la fuerza; y/o

ii. súper potenciador el intervalo ordinal de la fuerza del en comparación con otros súper potenciadores en la célula y/o el intervalo de prevalencia del ordinal de fuerza del súper potenciador en una población a la que corresponde el intervalo ordinal;

en la que la etapa b. comprende administrar al sujeto un agonista de RARA si la información indica uno o más de:

i. la fuerza del súper potenciador es igual o superior a un valor de corte predeterminado de la fuerza del súper potenciador en una población; y/o

ii. la fuerza del súper potenciador corresponde a un intervalo de prevalencia que es igual o superior a un corte de prevalencia predeterminado de la fuerza del súper potenciador en una población; y/o

iii. el intervalo ordinal de la fuerza del súper potenciador es igual o superior a un valor de corte ordinal predeterminado de la fuerza del súper potenciador ordinal en una población; y/o

iv. el intervalo ordinal de fuerza del súper potenciador corresponde a un intervalo de prevalencia que es igual o superior a un corte de prevalencia predeterminado del ordinal de fuerza del súper potenciador en una población.

9. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en la que la fuerza del súper potenciador se determinó por medio de la cuantificación de las modificaciones de la histona H3K27Ac mediante el uso de ChIP-seq.

10. La composición farmacéutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que el agonista de RARA es tamibaroteno.

11. La composición farmacéutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que la leucemia es leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielocítica aguda (LMA) o leucemia mielocítica crónica (LMC), y el linfoma es linfoma de Hodgkin o linfoma no Hodgkin.

12. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 11, en la que la LMA es una LMA que no es de tipo LPA