CN107613969A - 对使用维甲酸受体‑α 激动剂治疗的患者进行分层的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了定义对RARA激动剂敏感的细胞群体以及鉴定将从使用RARA激动剂的治疗中获益的患者亚组的方法。本发明还提供了包装药物组合物，其包含RARA激动剂和用于确定是否此类激动剂适合用于治疗的说明书。

Description

对使用维甲酸受体-α激动剂治疗的患者进行分层的方法
发明背景
维甲酸类化合物(Retinoids)是结构上与维生素A相关的一类化合物，其包括天然的和合成的化合物。已经发现几种维甲酸类化合物在临床上可以用于治疗皮肤病和肿瘤疾病。维甲酸及其其他天然存在的维甲酸类似物(9- 顺式视黄酸、全反式3,4-二脱水视黄酸、4-羰基视黄酸和视黄醇)是多效性调控化合物，其调节多种炎症、免疫和结构细胞的结构和功能。其是肺部上皮细胞增殖、分化和形态发生的重要调控因子。维甲酸类化合物通过一系列激素核受体发挥其生物学效应，所述激素核受体是属于类固醇/甲状腺受体超家族的配体诱导型转录因子。
维甲酸类受体(retinoid receptor)分为两类：维甲酸受体(RAR)和维甲酸类X受体(RXR)，其均由三个不同的亚型(α、β和γ)组成。RAR基因家族的每个亚型编码由两个初级RNA转录物差异剪接产生的可变数量的同种型。全反式视黄酸是维甲酸受体的生理激素，并以大致相等的亲和性结合所有三个RAR亚型，但是其不结合至9-顺式视黄酸是天然配体的RXR受体。维甲酸类化合物具有抗炎作用，改变上皮细胞分化进展并且抑制基质细胞基质产生。这些性质导致开发了用于皮肤疾病(如牛皮癣、痤疮和增生性皮肤瘢痕)的局部和全身维甲酸疗法。其他应用包括控制急性早幼粒细胞白血病、腺癌和鳞状细胞癌以及肝纤维化。
维甲酸类化合物治疗用途的局限性源于在天然存在的维甲酸类化合物、全反式视黄酸和9-顺式视黄酸中观察到的相对毒性。这些天然配体针对RAR 亚型是非选择性的，并因此在整个机体中具有多效性作用，其通常是有毒性的。
已经描述了与RAR或RXR受体或与一类中的特定亚型(α、β、γ)选择性或特异性相互作用的多种维甲酸类化合物。RARA特异性激动剂对于癌症治疗具有很大希望并且很多已进入人类临床试验。然而，仅有一种RARA特异性激动剂他米巴罗汀已被批准用于癌症治疗。而且，尽管在US和欧洲进行了试验，但是他米巴罗汀仅在日本获批并且仅用于治疗急性早幼粒细胞白血病。RARA激动剂在癌症中的理论效能与此类药物缺乏监管机关批准之间的脱节引出了为什么此类激动剂在人体内不是有效和安全的问题。因此，需要更好地了解为什么RARA激动剂尚无法达到其治疗潜能。
基因组技术的最新进展和对基因调控回路的理解导致了超级增强子的发现。虽然在给定组织或癌症类型中的很多基因可以被在基因编码区附近存在的增强子所调控，但是这些中的少数相对于所有其他活性基因在转录标记和机制方面显示出高度不对称性和不成比例的大量负载。最近的发现表明此类增强子与一些基因捆绑在一起，这些基因与携带其的细胞的功能和存活特别相关。因此，超级增强子与基因的关联显示了所述基因对细胞存活的相对重要性。这些观察结果可能有助于预测各种疗法的疗效。
发明概述
本公开提供了用于检测等于或高于阈值的RARA超级增强子的强度或顺序排序或RARA mRNA水平的一个或多个的技术。本公开表明与低于此类阈值的细胞相比含有等于或高于阈值的RARA超级增强子的强度或顺序排序或 RARA mRNA水平的一个或多个的细胞(例如，癌细胞或来自患有MDS的对象的细胞，例如AML细胞、MDS细胞、乳腺癌细胞)对RARA激动剂(例如，获得功能的RARA激动剂；或RARA特异性激动剂(例如，与针对RAR-β或RAR-γ相比，针对RAR-α具有至少10X、100X、1000X、10000X或更高特异性的激动剂))的抗癌作用更加敏感。
本发明的各种实施方式、方面和替代方案解决了定义哪些细胞群对维甲酸受体α(“RARA”)激动剂敏感的问题，鉴定了将从使用RARA激动剂的治疗中获益的患者亚组(例如，对使用RARA激动剂治疗的患者分层；将 RARA激动剂应答者与无应答者加以区分)并且提供了针对此类患者亚组的治疗性疗法。该解决方案至少部分地基于我们的发现，在某些癌细胞中具有等于或高于阈值的强度或顺序排序并且与编码维甲酸受体α(“RARA”)的基因相关联的超级增强子提示此类细胞将对使用RARA激动剂的治疗产生应答。我们还发现在某些癌细胞中RARA初级RNA转录水平(特别是mRNA 水平)等于或高于阈值水平也提示此类癌细胞将对使用RARA激动剂的治疗产生应答。在这两种情况下，与这些参数相关的阈值似乎比RARA蛋白水平明显更具有预测性。
在第一个实施方式中，本发明涉及一种治疗患有癌症的对象的方法，其中已确定在所述对象中的癌细胞具有下述中的一种或多种：
a.与RARA基因相关的超级增强子，其中所述超级增强子具有等于或高于预先确定的阈值水平的强度或顺序排序；或者
b.来自RARA基因和/或与其相关的超级增强子的一部分的初级RNA转录物水平，所述初级RNA转录物水平等于或高于预先确定的阈值水平，
其中该方法包括向对象施用RARA激动剂的步骤。
在第一个实施方式的一些方面中，只在超级增强子具有等于或高于预先确定的阈值水平的强度或顺序排序；或者等于或高于预先确定的阈值水平的初级RNA转录物水平的时候，施用RARA激动剂。
在第一个实施方式的一些方面中，当已确定在对象中的癌细胞具有下述时：
a.与RARA基因相关的增强子或超级增强子，其中所述增强子或超级增强子具有低于预先确定的阈值水平的强度或顺序排序；或者
b.来自RARA基因和/或与其相关的超级增强子的一部分的初级RNA转录物水平，所述初级RNA转录物水平低于预先确定的阈值水平，
该方法包括向对象施用不同于RARA激动剂的治疗剂的步骤。
在第一个实施方式的一些方面中，已确定在对象中的癌细胞具有的与 RARA基因相关的超级增强子，通过ChIP-seq检测其比与MALAT1相关的超级增强子的一部分至少强1.75倍，其中该部分位于基因组构建hg19中的 chr11:65263724-65266724，或者至少比其他参考增强子或超级增强子基因座强相当的量。
在第一个实施方式的其他方面中，当已确定在对象中的癌细胞符合a.或 b.时，该方法包括向该对象施用不同于RARA激动剂的治疗(例如，治疗剂或标准护理)，例如化疗剂或移植。在一些实施方式中，对象患有癌症，例如白血病(例如，急性髓性白血病)。示例性的治疗包括化疗剂(例如，阿糖胞苷、吉西他滨、阿扎胞苷、地西他滨、氟尿嘧啶或蒽环类(例如，柔红霉素、多柔比星、表柔比星或伊达比星))或移植(例如，干细胞移植)。
在第一个实施方式的替代方面中，已确定在对象中的癌细胞具有下述中的一种或多种：
a.与RARA基因相关的超级增强子在强度上比在已知对RARA激动剂无应答的人细胞或人细胞系中的与RARA基因相关的相应增强子至少高1.5倍；和/或
b.RARA RNA初级转录水平比在已知对RARA激动剂无应答的人细胞或人细胞系中的相应RARA RNA初级转录水平至少高1.5倍。
在第一个实施方式的其他替代方面，已确定在对象中的癌细胞具有下述中的一种：
a.与RARA基因相关的超级增强子具有对应于出现频率排序的强度，所述出现频率排序等于或高于针对RARA基因超级增强子强度的预先确定的出现频率截止值；和/或
b.与RARA基因相关的超级增强子具有等于或高于预先确定的RARA基因强度截止值的强度；和/或
c.与RARA基因相关的超级增强子具有对应于出现频率排序的强度顺序，所述出现频率排序等于或高于预先确定的RARA基因强度顺序出现频率截止值；和/或
d.与RARA基因相关的超级增强子具有等于或高于预先确定的RARA基因强度顺序截止值的强度顺序；和/或
e.RARA mRNA水平，所述RARA mRNA水平等于或高于预先确定的 mRNA水平截止值；和/或
f.对应于出现频率排序的RARA mRNA水平，所述出现频率排序等于或高于预先确定的RARA mRNA出现频率截止值。
在某些更具体的方面，从下述中确定任意上文所述的预先确定的出现频率截止值：
a.从来自相同类型癌细胞的样品群体中RARA超级增强子强度的排序确定，其中已确定至少一个样品对RARA激动剂产生应答；和/或
b.从来自相同类型癌细胞的样品群体中RARA超级增强子强度顺序的排序确定，其中已确定至少一个样品对RARA激动剂产生应答；和/或
c.从来自相同类型癌细胞的样品群体中RARA mRNA水平的排序确定，其中已确定至少一个样品对RARA激动剂产生应答。
在第二个实施方式中，本发明提供了一种治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括下述步骤：
a.接收与下述中的一个或多个相关的信息：
i.在来自对象的癌细胞中与RARA基因相关的超级增强子的强度、顺序排序或出现频率排序；或者
ii.在来自对象的癌细胞中来自RARA基因和/或与其相关的超级增强子的一部分的初级RNA转录物的水平；和
b.如果信息提示下述中的一个或多个，则向对象施用RARA激动剂：
i.超级增强子具有等于或高于预先确定的阈值水平的强度、顺序排序或出现频率排序；或
ii.RNA转录物的水平等于或高于预先确定的阈值水平。
在第二个实施方式的一个方面中，如果信息提示下述，则向对象施用不同于RARA激动剂的治疗：
iii.超级增强子具有低于预先确定的阈值水平的强度、顺序排序或出现频率排序；或者
iv.RNA的转录水平低于预先确定的阈值水平。
在第二个实施方式的一个方面中，步骤a.包括接收与下述中的一个或多个相关的信息：
i.与在相同癌症中的对照增强子或超级增强子相比，与RARA基因相关的超级增强子的强度；和/或
ii.与在已知对RARA激动剂无应答的人细胞或人细胞系中的相应 RARA RNA初级转录水平相比，RARA RNA初级转录水平的水平。
在第二个实施方式的一个方面，步骤b.包括如果信息提示下述中的一个或多个，则向对象施用RARA激动剂：
i.与RARA基因相关的超级增强子比位于基因组构建hg19中的 chr11:65263724-65266724的与MALAT1相关的超级增强子的一部分至少强1.75倍，或者至少比其他参考增强子或超级增强子基因座强相当的量；和/或
ii.RARA RNA初级转录水平，所述RARA RNA初级转录水平比在已知对RARA激动剂无应答的人细胞或人细胞系中的相应RARA RNA初级转录水平至少高1.5倍。
在第二个实施方式的替代方面中，步骤a.包括接收与下述中的一个或多个相关的信息：
i.与RARA基因相关的超级增强子的强度和/或在对应于所述强度的群体中RARA基因超级增强子强度的出现频率排序；和/或
ii.与细胞中的其他超级增强子比较的与RARA基因相关的超级增强子的强度的顺序排序和/或在对应于顺序排序的群体中RARA基因超级增强子强度的出现频率排序；和/或
iii.RARA mRNA水平和/或在对应于mRNA水平的群体中RARA mRNA水平的出现频率排序；和
步骤b.包括如果信息提示下述中的一个或多个，则向对象施用RARA激动剂：
i.与RARA基因相关的超级增强子的强度等于或高于在群体中RARA 基因超级增强子强度的预先确定的截止值；和/或
ii.对应于出现频率排序的与RARA基因相关的超级增强子的强度等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度的预先确定的出现频率截止值；和/或
iii.与RARA基因相关的超级增强子的强度的顺序排序等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度顺序的预先确定的顺序截止值；和/或
iv.对应于出现频率排序的超级增强子强度的顺序排序等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度顺序的预先确定的出现频率截止值；和/或
v.RARA mRNA水平等于或高于对应于在群体中RARA mRNA水平的预先确定的截止值的RARA mRNA水平；和/或
vi.RARA mRNA水平对应于出现频率排序，所述出现频率排序等于或高于在群体中RARA mRNA水平的预先确定的出现频率截止值。
在第三个实施方式中，本发明提供了一种包装药物组合物，所述包装药物组合物包含：
a.RARA激动剂；和
b.书面插页或标签，其包括向患有癌症并且已确定其癌细胞具有下述中的
一种或多种的对象说明使用RARA激动剂：
i.与RARA基因相关的超级增强子，其中所述超级增强子具有等于或高于预先确定的阈值水平的强度或顺序排序或出现频率排序；或者
ii.来自RARA基因和/或与其相关的超级增强子的一部分的初级RNA 转录物水平，所述初级RNA转录物水平等于或高于预先确定的阈值水平。
在第三个实施方式的一些方面中，书面插页或标签包括向已确定其癌细胞具有下述中的一种或多种的对象说明使用RARA激动剂：
i.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子比位于基因组构建hg19中的chr11:65263724-65266724的与 MALAT1相关的超级增强子的一部分至少强1.75倍，或者至少比其他参考增强子或超级增强子基因座强相当的量；和/或
ii.RARA RNA初级转录水平，所述RARA RNA初级转录水平比在已知对RARA激动剂无应答的人细胞或人细胞系中的相应RARA RNA初级转录水平至少高1.5倍。
在第三个实施方式的一些方面中，书面插页或标签包括向已确定其癌细胞具有下述中的一种或多种的对象说明使用RARA激动剂：
i.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度预先确定的截止值的强度；和/或
ii.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有对应于出现频率排序的强度，所述出现频率排序等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度的预先确定的出现频率截止值；和/或
iii.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度顺序的预先确定的截止值的强度的顺序排序；和/或
iv.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有对应于出现频率排序的强度的顺序排序，所述出现频率排序等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度顺序的预先确定的出现频率截止值；和/或
v.RARA mRNA水平，所述RARA mRNA水平等于或高于在群体中 RARA mRNA水平的预先确定的截止值；和/或
vi.RARA mRNA水平，所述RARA mRNA水平对应于出现频率排序，所述出现频率排序等于或高于在群体中RARA mRNA预先确定的出现频率截止值。
在第四个实施方式中，本发明提供了一种预测RARA激动剂在癌症治疗中的效能的方法，所述方法包括确定是否，已确定是否或接收下述信息的步骤：
a.在癌症中与RARA基因相关的超级增强子具有等于或高于预先确定的阈值水平的强度、顺序排序或出现频率排序；或
b.在癌症中来自RARA基因和/或与其相关的超级增强子的一部分的初级RNA转录物的水平等于或高于预先确定的阈值水平，其中 a.或b.的任意一个可以预测RARA激动剂在治疗中的效能。
在第四个实施方式的一些方面中，在对象中预测RARA激动剂在癌症治疗中的效能包括确定是否癌症具有下述中的一个或多个特征的步骤：
a.与RARA基因相关的超级增强子比位于基因组构建hg19中的 chr11:65263724-65266724的与MALAT1相关的超级增强子的一部分至少强1.75倍，或者至少比其他参考增强子或超级增强子基因座强相当的量；和/或
b.RARA RNA初级转录水平，所述RARA RNA初级转录水平比在已知对RARA激动剂无应答的人细胞或人细胞系中的相应RARA RNA初级转录水平至少高1.5倍；
其中a.或b.的任意一个可以预测RARA激动剂在治疗中的效能。
在第四个实施方式的一些方面中，在对象中预测RARA激动剂在癌症治疗中的效能包括确定是否癌症具有下述中的一个或多个特征的步骤：
a.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度预先确定的截止值的强度；和/或
b.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有对应于出现频率排序的强度，所述出现频率排序等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度的预先确定的出现频率截止值；和/或
c.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度顺序的预先确定的截止值的强度的顺序排序；和/或
d.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有对应于出现频率排序的强度的顺序排序，所述出现频率排序等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度顺序的预先确定的出现频率截止值；和/或
e.RARA mRNA水平，所述RARA mRNA水平等于或高于在群体中 mRNA水平的预先确定的截止值；和/或
f.RARA mRNA水平，所述RARA mRNA水平对应于出现频率排序，所述出现频率排序等于或高于在群体中RARA mRNA水平预先确定的出现频率截止值。
在第五个实施方式中，本发明提供了一种诊断、预测或治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括下述步骤：
a.从对象获得癌细胞的样品；
b.确定、已确定或接收关于下述中的一个或多个的信息：
i.在样品中与RARA基因相关的超级增强子的强度、顺序排序或出现频率排序；或
ii.在样品中来自RARA基因和/或与其相关的超级增强子的一部分的初级RNA转录物的水平；和
c.如果满足下述中的一个或多个，则施用包含RARA激动剂的治疗组合物：
i.超级增强子具有等于或高于预先确定的阈值水平的强度、顺序排序或出现频率排序；或
ii.初级RNA转录物的水平等于或高于预先确定的阈值水平。
在第五个实施方式的一个方面中，步骤b.包括在样品中确定下述中的一个或多个：
i.在相同癌症中与对照增强子或超级增强子相比与RARA基因相关的超级增强子的强度；和/或
ii.与在已知对RARA激动剂无应答的人细胞或人细胞系中的相应 RARA RNA初级转录水平相比RARA RNA初级转录水平的水平。
在第五个实施方式的另一个方面中，步骤c.包括如果满足下述中的一个或多个，则施用或推荐施用包含RARA激动剂的治疗组合物：
i.与RARA基因相关的超级增强子比位于基因组构建hg19中的 chr11:65263724-65266724的与MALAT1相关的超级增强子的一部分至少强1.75倍，或者至少比其他参考增强子或超级增强子基因座强相当的量；和/或
ii.RARA RNA初级转录水平，所述RARA RNA初级转录水平比在已知对RARA激动剂无应答的人细胞或人细胞系中的相应RARA RNA初级转录水平至少高1.5倍；和/或
iii.RARA mRNA水平比在已知对RARA激动剂无应答的人细胞或人细胞系中的RARARNA水平至少高1.5倍。
在第五个实施方式的另一个方面中，步骤b.包括在样品中确定下述中的一个或多个：
i.与RARA基因相关的超级增强子的强度和/或在对应于所述强度的群体中RARA基因超级增强子强度的出现频率排序；和/或
ii.与细胞中的其他超级增强子比较的与RARA基因相关的超级增强子的强度的顺序排序和/或在对应于顺序排序的群体中RARA基因超级增强子强度的出现频率排序；和/或
iii.RARA mRNA初级转录水平和/或在对应于mRNA水平的群体中 RARA mRNA初级转录水平的出现频率排序。
在第五个实施方式的另一个方面中，步骤c.包括如果满足下述中的一个或多个，则施用或推荐施用包含RARA激动剂的治疗组合物：
a.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度预先确定的截止值的强度；和/或
b.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有对应于出现频率排序的强度，所述出现频率排序等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度的预先确定的出现频率截止值；和/或
c.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度顺序的预先确定的截止值的强度的顺序排序；和/或
d.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有对应于出现频率排序的强度的顺序排序，所述出现频率排序等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度顺序的预先确定的出现频率截止值；和/或
e.RARA mRNA水平等于或高于在群体中RARA mRNA水平的预先确定的截止值；和/或
f.对应于出现频率排序的RARA mRNA水平，所述出现频率排序等于或高于在群体中RARA mRNA水平的预先确定的出现频率截止值。
在第六个实施方式中，本发明提供了一种在对象中确定RARA mRNA水平的方法，所述方法包括步骤：a)从来自对象的生物样品中获得总mRNA； b)将天然不附加在此类mRNA分子上的其他核苷酸附加到每个mRNA分子上以使得mRNA分子能够结合至固体支持物；c)将mRNA分子测序；以及 d)确定RARA mRNA的水平。
在替代的第六个实施方式中，本发明提供了一种在对象中确定RARA mRNA水平的方法，所述方法包括步骤：a)从来自对象的生物样品中获得总 mRNA；b)由总mRNA建立cDNA文库；以及c)将cDNA文库与(i)特异性针对由RARA mRNA建立的cDNA的引物对；(ii)DNA聚合酶；以及 (iii)用于检测由引物对和DNA聚合酶产生的任意DNA分子的组分组合。在该替代的第六个实施方式的一些方面中，用于检测的组分是染料。在该替代的第六个实施方式的其他方面中，用于检测的组分是标记的(例如，放射性标记的或染料标记的)寡核苷酸。
在任意第六个实施方式的一些方面中，将在对象中检测到的mRNA水平与预先确定的阈值水平进行比较。
在任意第六个实施方式的一些方面中，患者患有选自AML、乳腺癌或 MDS的癌症。在更具体的方面，对象患有上述疾病之一并且如果确定RARA mRNA水平等于或高于预先确定的阈值则施用RARA激动剂(例如，他米巴罗汀)。
在任意第六个实施方式的一些方面中，预先确定的阈值是通过测定在具有或代表相同癌症的群体或样品的群体中RARA mRNA的水平并且鉴定至少一个群体成员对RARA激动剂产生应答确定的RARA mRNA截止值水平。在第六个实施方式的一些方面中，预先确定的阈值是通过基于在群体或样品的群体中(其中已鉴定为至少一个群体成员对RARA激动剂产生应答)超级增强子顺序排序计算的出现频率截止值并且使用计算得到的出现频率截止值以确定在相同或不同群体或样品的群体中RARA mRNA水平的截止值水平确定的RARA mRNA截止值水平。
在第七个实施方式中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含(i) 从对象的癌细胞群体(例如，来自患有AML或MDS的对象的骨髓细胞、乳腺癌细胞等)获得的mRNA逆转录的cDNA；(ii)特异性针对由RARA mRNA 转录的cDNA的引物对；(iii)DNA聚合酶；以及(iv)用于检测由引物对和 DNA聚合酶产生的任意DNA分子的组分。在第七个实施方式的一些方面中，用于检测的组分是染料。在第七个实施方式的其他方面中，用于检测的组分是标记的(例如，放射性标记的或染料标记的)寡核苷酸。在第七个实施方式的一些方面中，组分用于确定对象中的RARA mRNA水平。在第七个实施方式的一些具体的方面，将已确定的RARAmRNA水平与截止值比较并且利用比较结果确定是否应当向患者施用RARA激动剂(例如，他米巴罗汀)。
在第八个实施方式中，本发明提供了一种治疗患有癌症的一组对象的差异性方法，所述方法包括向其癌症的特征为RARA mRNA水平等于或高于预先确定的阈值的一组对象施用RARA激动剂；并且不向其癌症的特征为 RARA mRNA水平低于预先确定的阈值的一组对象施用RARA激动剂。
在该第八个实施方式的一些方面中，该组对象患有相同癌症且癌症选自AML、乳腺癌或MDS。在第七个实施方式的一些方面中，RARA激动剂是他米巴罗汀。在第七个实施方式的一些方面中，预先确定的阈值是通过测定在具有或代表相同癌症的群体或样品的群体中RARA mRNA的水平并且鉴定至少一个群体成员对RARA激动剂产生应答确定的RARA mRNA截止值水平。在第七个实施方式的一些方面中，预先确定的阈值是通过基于在群体或样品的群体中(其中已鉴定为至少一个群体成员对RARA激动剂产生应答)超级增强子顺序排序计算的出现频率截止值并且使用计算得到的出现频率截止值以确定在相同或不同群体或样品的群体中RARA mRNA水平的截止值水平确定的RARA mRNA截止值水平。
在第九个实施方式中，本发明提供了一种方法，所述方法包括步骤：
a.从患有癌症的对象获得癌细胞；以及
b.在癌细胞中检测：
i.样品中与RARA基因相关的超级增强子的强度、顺序排序或出现频率排序；或
ii.样品中来自RARA基因和/或与其相关的超级增强子的一部分的初级RNA转录物的水平；以及
c.将在步骤b.中获得的检测结果与阈值进行比较。
在任意和所有实施方式中，在一些方面中，本发明提供了用于治疗患有癌症的对象的药物组合物，其中所述组合物包含RARA激动剂。
本文阐述了本发明一个或多个实施方式的细节。本发明的其他特征、目的和优点将是从详细说明、附图、实施例和实施方式中显而易见的。
附图简述
图1A-1B图示了通过ChIP-qPCR检测的RARA超级增强子的log2富集。
图2描述了在5种不同乳腺癌细胞系中通过ChIP-seq确定的跨RARA基因座的H3K27Ac读数水平。“RARA”表示在所分析的DNA片段中RARA 基因的位置。
图3是各种细胞系和患者样品的ChIP-seq结果列表。其显示了在这些细胞或患者样品的每一个中与MALAT1超级增强子的一部分比较的RARA超级增强子的相对强度。
图4A显示了针对在图3中通过ChIP-seq分析的所有乳腺癌细胞系和患者样品的RARA SE强度的排序，以log10 RARA/MALAT1表示。图4B显示了针对在图3中通过ChIP-seq分析的所有AML癌细胞系和患者样品的RARA SE 强度的排序，以log10 RARA/MALAT1表示。
图5显示了针对在图3中通过ChIP-seq分析的所有正常血液细胞系和患者样品的RARA SE强度的排序，以log10 RARA/MALAT1表示。
图6显示了在图3中通过ChIP-seq分析的各种AML和乳腺癌细胞中患者样品对细胞系的RARA SE强度散点图，以log10 RARA/MALAT1表示。
图7显示了在存在不同剂量他米巴罗汀的条件下处理5天后不同乳腺癌细胞系的活力。
图8显示了针对7种不同乳腺癌细胞系的他米巴罗汀EC50的log10对 RARA SE强度(RARA/MALAT1富集倍数)之间的相关性。
图9显示了在存在不同剂量他米巴罗汀的条件下处理5天后不同AML 细胞系的活力。
图10显示了针对11种不同AML细胞系的他米巴罗汀EC50的log10对 RARA SE强度之间的相关性。
图11显示了针对他米巴罗汀应答性(Au565)和非应答性(HCC1143) 乳腺癌细胞系通过基于Affymetrix Array的分析检测的三种不同RAR亚型 (RaR-α(“RARA”)；RaR-β(“RARB”)；和RaR-γ(“RARG”))的mRNA 表达水平。
图12显示了针对48个不同的AML患者样品使用RNA-Seq确定的mRNA 表达(log2(1+FPKM))与RARA SE强度(RARA/MALAT1富集倍数)之间的相关性。
图13显示了针对5种不同乳腺癌细胞系通过rt-qPCR检测并且以dCt表示的反向mRNA表达水平。
图14A显示了针对7种不同乳腺癌细胞系通过rt-qPCR检测的mRNA表达水平与RARASE强度(RARA/MALAT1富集倍数)之间的相关性。图14B 显示了针对7种不同乳腺癌细胞系通过rt-qPCR检测的mRNA表达水平与对他米巴罗汀的应答情况(通过log10 EC50检测)之间的相关性。
图15是描述在5种不同乳腺癌细胞系中三种不同的已知RARA同种型的蛋白水平的Western印迹。
图16描述了在他米巴罗汀弱应答性(T47D，图16A)和高应答性(AU565，图16B)乳腺癌细胞系中HER2和RARA基因的拷贝数。
图17描述了针对胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤和结直肠癌患者的样品通过ChIP-seq确定的跨RARA基因座的H3K27Ac读数水平。
图18描述了在来自乳腺癌细胞系(HCC1945)的小鼠乳腺癌移植瘤模型中对他米巴罗汀不同每日剂量的应答。
图19描述了在包括乳腺癌细胞系HCC1945的80个乳腺癌样品中RARA 超级增强子强度顺序的log10排序图。
图20A描述了在48名患者的乳腺癌样品中RARA超级增强子强度顺序的log10排序图。较浅颜色的柱子表示RARA超级增强子强度顺序等于或高于出现频率截止值的样品。较深颜色的柱子表示RARA超级增强子强度顺序低于出现频率截止值的样品。图20B描述了与图A相同的排序图并且进一步显示了乳腺癌的特定亚型(激素受体阳性(HR+)、HER2阳性(HER2+)或三阴性(TN))以及针对各亚型的经计算的出现频率截止值。
图21A-B描述了在来自两个不同患者样品的小鼠乳腺癌移植瘤模型中对他米巴罗汀(SY1425)每日给药的应答。
图22描述了在来源于9个不同患者样品的小鼠乳腺癌移植瘤模型中的 RARA mRNA水平。白色柱子表示针对CTG-1124的值，以及在该群体中的出现频率截止值为55.3％。
图23A描述了在6个AML细胞系中RARA超级增强子的强度。图23B 描述了这些相同的6个AML细胞系对他米巴罗汀处理的应答情况。图23C 描述了在94个AML样品中的RARA超级增强子强度顺序的log10排序图，所述样品中包括在图20A和20B中分析的6个AML细胞系中的4个—— Sig-M5、MV411、HEL和Kasumi。
图24描述了在70个AML患者样品中的RARA超级增强子强度顺序的 log10排序图。较浅颜色的柱子表示RARA超级增强子强度顺序等于或高于出现频率截止值的样品。较深颜色的柱子表示RARA超级增强子强度顺序低于出现频率截止值的样品。
图25描述了在图24中使用的70个AML患者样品中的RARA mRNA水平并且根据其RARA超级增强子强度顺序高于(或等于)出现频率截止值(“高 RARA”)或低于出现频率截止值(“低RARA”)对其进行了分类。
图26A和26D描述了在来源于2名不同患者的小鼠AML移植瘤模型中对他米巴罗汀每日给药的应答，以CD45+细胞％检测。图26B和26E描述了在不同器官和生物流体中的CD45+细胞％，以及图26C和26F显示了小鼠模型的存活时间。
图27A-B描述了在来源于2名其他患者的小鼠AML移植瘤模型中对他米巴罗汀每日给药的应答，以CD45+细胞％检测。图27C描述了在这些模型的一个中在不同器官和生物流体中的CD45+细胞％，以及图27D描述了在该模型中的存活时间。
图28描述了在64个AML患者样品中的RARA mRNA水平，所述样品包括用于建立小鼠移植瘤模型的4个样品(见图26和27)。较浅颜色的柱子表示RARA mRNA等于或高于由RARA超级增强子的强度顺序确定的出现频率截止值的样品。较深颜色的柱子表示RARA mRNA水平低于出现频率截止值的样品。
图29A描述了根据CD45+细胞％检测的AM5512移植瘤小鼠对4mg/kg ATRABID、3mg/kg他米巴罗汀BID和溶剂(vehicle)对照的应答。图29B 显示了在实验过程中此类小鼠的存活率。
图30是不同癌症类型的表，其中超过5％的测试样品具有高于平均值至少2个标准偏差的RARA mRNA水平。
图31描述了在MDS患者样品中对比来自健康(“正常”)患者的细胞的 RARA mRNA水平。
图32描述了在11种不同的AML细胞系中RARA增强子强度与针对他米巴罗汀的敏感性之间的相关性。
图33描述了在11种不同的AML细胞系中RARA mRNA水平与针对他米巴罗汀的敏感性之间的相关性。
定义
除非另有说明，否则本申请所描述的结构还旨在包括所述结构的所有异构体(例如，对映体、非对映体以及几何(或构象))形式；例如，每一个不对称中心的R型和S型构型、Z型和E型双键异构体、以及Z型和E型构象异构体。因此，本发明的化合物的单个立体化学异构体以及对映体、非对映体、和几何(或构象)混合物落入本发明的范围内。除非另有说明，否则本发明的化合物的所有互变异构形式落入本发明的范围内。此外，除非另有说明，否则本申请所描述的结构还旨在包括不同之处仅在于存在一个或多个同位素富集原子的化合物。举例来说，具有本发明的结构并且包括氢被氘或氚置换、或碳被13C-或14C-富集碳置换的化合物落入本发明的范围内。根据本发明，这些化合物可用作例如分析工具、用作生物测定中的探针、或用作治疗剂。
如本文所用的术语“药学上可接受的盐”指的是那些在合理的医学判断的范围内适用于与人类和更低等动物的组织接触而没有不适当的毒性、刺激性、过敏反应等并且与合理的效益/风险比相称的盐。药学上可接受的盐是本领域公知的。举例来说，Berge等在J.Pharmaceutical Sciences，1977，66，1-19 中详细描述了药学上可接受的盐，该文献以引用的方式并入本文。本发明的化合物的药学上可接受的盐包括由合适的无机和有机酸和碱所产生的那些。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是与无机酸，如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸以及高氯酸，或与有机酸，如乙酸、草酸、顺丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸，或通过使用本领域已知的其他方法(如离子交换法) 形成的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、反丁烯二酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、顺丁烯二酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、丁二酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。由适当的碱产生的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐以及N+(C1-4烷基)4 -盐。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。在适当时，另外的药学上可接受的盐包括使用诸如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根以及芳基磺酸根之类的抗衡离子形成的无毒铵、季铵以及胺阳离子。
术语“溶剂化物”指的是与溶剂缔合，通常是通过溶剂分解反应缔合的化合物的形式。这一物理缔合可以包括氢键键合。常规的溶剂包括水、甲醇、乙醇、乙酸、DMSO、THF、乙醚等。本申请所述的化合物如式(I)可以被制备成例如结晶形式，并且可以被溶剂化。合适的溶剂化物包括药学上可接受的溶剂化物并且还包括化学计量溶剂化物和非化学计量溶剂化物这两者。在某些情况下，溶剂化物将能够分离，例如在一个或多个溶剂分子被并入到结晶固体的晶格中时。“溶剂化物”包括溶液相溶剂化物和可分离的溶剂化物这两者。代表性的溶剂化物包括水合物、乙醇化物、以及甲醇化物。
术语“水合物”指的是与水缔合的化合物。通常，化合物的水合物中所含的水分子的数目与水合物中化合物分子的数目呈确定的比率。因此，化合物的水合物可以例如由通式R·x H2O表示，其中R是化合物并且其中x是大于0的数。给定的化合物可以形成超过一种类型的水合物，包括例如一水合物(x是1)、低水合物(x是大于0并且小于1的数，例如半水合物 (R·0.5H2O))、以及多水合物(x是大于1的数，例如二水合物(R·2H2O) 和六水合物(R·6H2O))。
预期接受施用的“对象”包括但不限于人类(即任何年龄组的男性或女性，例如儿科对象(例如婴儿、儿童、青少年)或成人对象(例如年轻成人、中年成人或老年成人))和/或其他非人类动物，例如哺乳动物(例如灵长类动物(例如食蟹猴、恒河猴)；商业相关的哺乳动物，如牛、猪、马、绵羊、山羊、猫和/或狗)以及禽类(例如商业相关的禽类，如鸡、鸭、鹅、和/或火鸡)。在某些实施方式中，动物是哺乳动物。动物可以是雄性或雌性并且处于任何发育阶段。非人类动物可以是转基因动物。在某些实施方式中，对象是人。
如本文所用的术语“施用(administer)”、“施用(administering)”或“施用(administration)”指的是植入、吸收、摄取、注射、吸入或以其他方式引入本发明的化合物或其药物组合物。
如本文所用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”以及“治疗 (treating)”指的是逆转、缓解本文所述的“病理状态”(例如疾病、病症、或病况或其一个或多个体征或症状)、延缓其发病、或抑制其进展。在一些实施方式中，“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”以及“治疗(treating)”需要所述疾病、病症或病况的体征或症状已经产生或已经被观测到。在其他实施方式中，可以在不存在所述疾病或病况的体征或症状的情况下施用治疗。举例来说，可以在症状发病之前向易感个体施用治疗(例如根据症状的病史和/ 或根据遗传因素或其他易感因素)。在症状已经消退之后还可以继续治疗，例如以延缓或预防复发。
如本文所用的术语“病况”、“疾病”以及“病症”是可互换使用的。
本申请所述化合物如式(I)的“有效量”指的是足以引出所期望的生物反应，即治疗病况的量。如将由本领域普通技术人员所了解的那样，本申请所述化合物如式(I)的有效量可以根据诸如以下各项的因素而变化：所期望的生物终点、化合物的药物代谢动力学、所治疗的病况、施用方式以及对象的年龄和健康情况。有效量包括治疗性治疗和预防性治疗。举例来说，在治疗癌症中，有效量的本发明的化合物可以减轻肿瘤负荷或使肿瘤的生长或扩散停止。
本申请所述化合物如式(I)的“治疗有效量”是足以在治疗病况中提供治疗益处或足以使与所述病况相关的一个或多个症状延缓或减到最低限度的量。在一些实施方式中，治疗有效量是足以在治疗病况中提供治疗益处或足以使与所述病况相关的一个或多个症状减到最低限度的量。化合物的治疗有效量意指在治疗病况中单独或与其他治疗组合提供治疗益处的治疗剂的量。术语“治疗有效量”可以包括改善整体治疗、减少或避免所述病况的症状或病因、或提高另一种治疗剂的治疗功效的量。
术语“赘生物”和“肿瘤”在本文可互换使用并且指的是异常的组织块，其中该组织块的生长超过正常组织的生长并且与正常组织的生长不协调。赘生物或肿瘤可以是“良性的”或“恶性的”，这取决于以下特征：细胞分化的程度(包括形态和功能)、生长速率、局部侵袭以及转移。“良性赘生物”一般是分化良好的，在特征上比恶性赘生物生长得更慢，并且保持局限于起源部位。此外，良性赘生物没有浸润、侵袭、或转移到远处部位的能力。示例性良性赘生物包括但不限于脂肪瘤、软骨瘤、腺瘤、软垂疣、老年性血管瘤、脂溢性角化病、雀斑以及皮脂腺增生。在一些情况下，某些“良性”肿瘤随后可能产生恶性赘生物，这可能由肿瘤的赘生性细胞的一个亚群中发生另外的遗传变化所引起，并且这些肿瘤被称为“恶变前赘生物”。示例性恶变前赘生物是畸胎瘤。相比之下，“恶性赘生物”一般是低分化的(间变)并且具有特征性地快速生长，伴有进行性浸润、侵袭以及对周围组织的破坏。此外，恶性赘生物一般具有转移到远处部位的能力。
如本文所用的术语“癌症”指的是恶性赘生物(《斯特德曼医学词典 (Stedman’sMedical Dictionary)》，第25版；Hensyl编著；威廉斯·威尔金斯出版公司(Williams&Wilkins)：费城(Philadelphia)，1990)。示例性癌症包括但不限于听神经瘤；腺癌；肾上腺癌；肛门癌；血管肉瘤(例如淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、血管肉瘤)；阑尾癌；良性单克隆丙种球蛋白病；胆管癌(例如胆管上皮癌)；膀胱癌；乳腺癌(例如乳腺腺癌、乳腺乳头状癌、乳腺癌、乳腺髓样癌)；脑癌(例如脑膜瘤、成胶质细胞瘤、胶质瘤(例如星形细胞瘤、少突胶质瘤)、成神经管细胞瘤)；支气管癌；类癌肿瘤；宫颈癌(例如宫颈腺癌)；绒毛膜癌；脊索瘤；颅咽管瘤；结肠直肠癌(例如结肠癌、直肠癌、结肠直肠腺癌)；结缔组织癌；上皮癌；室管膜瘤；内皮肉瘤(例如卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、多发性特发性出血性肉瘤)；子宫内膜癌(例如子宫癌、子宫肉瘤)；食道癌(例如食道腺癌、巴雷特氏腺癌(Barrett’sadenocarcinoma))；尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)；眼癌(例如眼内黑色素瘤、成视网膜细胞瘤)；家族性嗜酸性粒细胞增多症；胆囊癌；胃癌(例如胃腺癌)；胃肠道间质瘤(GIST)；生殖细胞癌；头颈部癌(例如头颈部鳞状细胞癌、口腔癌(例如口腔鳞状细胞癌)、咽喉癌(例如喉癌、咽癌、鼻咽癌、口咽癌))；造血系统癌症(例如白血病，如急性淋巴细胞性白血病(ALL)(例如B细胞ALL、T细胞ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)(例如B细胞 AML、T细胞AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)(例如B细胞CML、T 细胞CML)、以及慢性淋巴细胞性白血病(CLL)(例如B细胞CLL、T细胞 CLL))；淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)(例如B细胞HL、T细胞HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)(例如B细胞NHL，如弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)(例如弥漫性大B细胞淋巴瘤)、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤(CLL/SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区B细胞淋巴瘤(例如粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤)、原发性纵隔性B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(即瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(macroglobulinemia))、毛细胞白血病(HCL)、成免疫细胞性大细胞淋巴瘤、前体B成淋巴细胞性淋巴瘤以及原发性中枢神经系统(CNS) 淋巴瘤；以及T细胞NHL，如前体T成淋巴细胞性淋巴瘤/白血病、外周T 细胞淋巴瘤(PTCL)(例如皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)(例如蕈样真菌病、塞扎里综合征(Sezary syndrome))、血管成免疫细胞性T细胞淋巴瘤、淋巴结外自然杀伤T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、以及间变性大细胞淋巴瘤)；如上文所述的一种或多种白血病/淋巴瘤的混合疾病；以及多发性骨髓瘤(MM))、重链病(例如α链病、γ链病、μ链病)；成血管细胞瘤；下咽癌；炎症性肌成纤维细胞瘤；免疫细胞性淀粉样变性；肾癌(例如肾母细胞瘤(也被称为维尔姆斯肿瘤(Wilms’tumor))、肾细胞癌)；肝癌(例如肝细胞癌(HCC)、恶性肝细胞瘤)；肺癌(例如支气管癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌)；平滑肌肉瘤(LMS)；肥大细胞增多症(例如系统性肥大细胞增多症)；肌肉癌；骨髓增生异常综合征(MDS)；间皮瘤；骨髓增生性病症(MPD)(例如真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、特发性髓样化生(agnogenic myeloidmetaplasia， AMM)(也被称为骨髓纤维化(MF))、慢性特发性骨髓纤维化、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性中性粒细胞白血病(CNL)、嗜酸性粒细胞增多综合征(HES))；成神经细胞瘤；神经纤维瘤(例如1型或2型神经纤维瘤病(NF)、神经鞘瘤病)；神经内分泌癌(例如胃肠胰腺神经内分泌肿瘤(GEP-NET)、类癌肿瘤)；骨肉瘤(例如骨癌)；卵巢癌(例如囊腺癌、卵巢胚胎癌、卵巢腺癌)；乳头状腺癌；胰腺癌(例如胰腺腺癌、导管内乳头状粘液性赘生物(IPMN)、胰岛细胞瘤)；阴茎癌(例如阴茎和阴囊的佩吉特氏病(Paget’s disease))；松果体瘤；原始神经外胚层肿瘤(PNT)；浆细胞瘤形成；副肿瘤综合征；上皮内赘生物；前列腺癌(例如前列腺腺癌)；直肠癌；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；皮肤癌(例如鳞状细胞癌(SCC)、角化棘皮瘤(KA)、黑色素瘤、基底细胞癌(BCC))；小肠癌(例如阑尾癌)；软组织肉瘤(例如恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、脂肪肉瘤、恶性外周神经鞘瘤(MPNST)、软骨肉瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤)；皮脂腺癌；小肠癌；汗腺癌；滑膜瘤；睾丸癌(例如精原细胞瘤、睾丸胚胎癌)；甲状腺癌(例如甲状腺乳头状癌、乳头状甲状腺癌(PTC)、甲状腺髓样癌)；尿道癌；阴道癌；以及外阴癌(例如外阴的佩吉特氏病)。
术语“生物样品”指的是任何样品，包括组织样品(如组织切片和组织的穿刺活检)；细胞样品(例如细胞学涂片(如巴氏涂片(Pap)或血涂片) 或通过显微解剖所获得的细胞的样品)；整个生物体的样品(如酵母或细菌的样品)；或细胞级分、片段或细胞器(如通过使细胞裂解并且通过离心或以其它方式分离其组分所获得)。生物样品的其他实例包括血液、血清、尿液、精液、粪便物、脑脊髓液、间质液、粘液、泪液、汗液、脓液、活检组织(例如通过手术活检或穿刺活检所获得)、乳头抽吸液、乳汁、阴道液、唾液、拭子(如颊拭子)、或含有源自于第一生物样品的生物分子的任何物质。生物样品还包括那些转基因生物样品，如转基因卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞、或细胞核。在一些方面，来自患有AML或MDS的对象的生物样品是骨髓抽吸物。
术语“RARA基因”指编码功能性维甲酸受体-α基因的基因组DNA序列并且特别地排除包含RARA基因的全部或部分的基因融合体。在一些实施方式中，RARA基因位于基因组构建hg19中的chr17:38458152-38516681。
术语“增强子”指对可达1Mbp远的基因起调控作用的基因组DNA区域。增强子可以重叠，但通常不由基因编码区组成。增强子通常与转录因子结合并且由特定的组蛋白标记物示出。
术语“超级增强子”指相对于特定细胞中的其他增强子含有不成比例的组蛋白标记物和/或转录蛋白的增强子子集。因此，预计由超级增强子调控的基因对细胞的功能具有较高重要性。超级增强子通常由根据强度对细胞中的所有增强子进行排序确定并且使用可用的软件如ROSE (https://bitbucket.org/young_computation/rose)确定，其是比细胞中的中位增强子具有显著更高强度的增强子子集(参见例如，美国专利9,181,580，其通过引入并入本申请)。
在文中使用的术语“初级RNA转录物”指来自DNA序列的RNA转录产物，其包含基因编码区和增强子或与该基因相关的超级增强子的一个或多个。在一些实施方式中，当此类RNA包含来源于对应于增强子区域的DNA 时，术语“初级RNA转录物”可与术语“eRNA”或“增强子RNA”互换使用。在其他实施方式中，术语“初级RNA转录物”指由基因编码区转录的mRNA。
当指增强子或超级增强子的一部分时，本文中使用的术语“强度”指 H3K27Ac或其他基因组标记物读数的数量对所分析的基因组DNA区段长度作图的曲线下面积。因此，“强度”是在限定于选择检测区域的碱基对跨度上检测给定碱基对处的标记物所得到信号的整合。
针对特定值(例如，与RARA基因相关的超级增强子的强度)的术语“出现频率排序”指等于或高于该特定值的群体的百分率。例如，针对在测试细胞中与RARA基因相关的超级增强子强度的出现频率排序为35％表示群体的 35％具有强度等于或高于该测试细胞的RARA基因增强子。
针对特定值(例如，与RARA基因相关的超级增强子的强度)的术语“出现频率截止值”指定义两个群体的子集(例如，应答者和无应答者)之间界限的出现频率排序。因此，等于或高于(即，较低的百分率值)出现频率截止值的出现频率排序定义群体的一个子集；以及低于(即，较高的百分率值) 出现频率截止值的出现频率排序定义群体其他的子集。
术语“截止”或“截止值”指在某项检测中测定的定义两个群体的子集 (例如，应答者和无应答者)之间界限的值。因此，等于或高于截止值的值定义群体的一个子集；以及低于截止值的值定义群体的其他子集。
术语“阈值”或“阈值水平”指定义两个群体的子集(例如，应答者和无应答者)之间界限的水平。阈值水平可以是出现频率截止或截止值。
术语“群体”或“样品群体”指合理地反映在更大组中测量值的分布的足够数量(例如，至少30、40、50个或更多个)的不同样品。在样品群体中的每个样品可以是细胞系、来自活体(例如，活检或体液样品)的生物样品或来自移植物(例如，通过植入细胞系或患者样品在小鼠中生长的肿瘤)的样品，其中每个样品来自患有相同疾病、病况或病症的活体或来自代表相同疾病、病况或病症的细胞系或移植物。
特定值的术语“顺序排序”指与一组其他值比较的值的排序。例如，与在测试细胞中的其他超级增强子相比在测试细胞中与RARA基因相关的超级增强子强度的顺序排序为100表示在测试细胞中有99个其他超级增强子的强度大于与RARA基因相关的超级增强子。
术语“排序”指从最高到最低或从最低到最高对值进行排序。
发明某些实施方式的详述
RARA超级增强子的鉴定和阈值水平的确定
可以通过本领域公知的多种方法实现增强子或超级增强子的鉴定，例如如在Cell2013,155,934-947和PCT/US2013/066957中所描述的，这两者均通过引用并入本申请。在一些实施方式中，通过从患者的癌症样品中(例如从活检中)获得细胞材料和DNA实现超级增强子的鉴定。增强子测量的重要指标表现在两个方面——对基因组标记物上(例如，H3K27Ac)的DNA长度的连续检测，以及沿着构成该量级的DNA跨距在各碱基对处基因组标记物的编辑发生率。由对长度和量级分析的积分得到的曲线下面积(“AUC”)检测结果确定增强子的强度。在本发明的一个方面使用RARA超级增强子相对于对照的强度确定对象是否将对RARA激动剂产生应答。本领域技术人员将意识到如果对于RARA和对照而言已检测在基因组标记物上的DNA长度是相同的，则RARA超级增强子相对于对照的量级比将等于强度并且其也可以用于确定对象是否将对RARA激动剂产生应答。
我们已通过H3K27Ac ChIP-seq法确定与RARA基因相关的超级增强子基因座位于chr17:38458152-38516681(基因组构建hg19)。该基因座实际上与 RARA基因座本身重叠，以及由于接近/重叠因而认为其是与该基因相关的超级增强子基因座。因此，在一些实施方式中，根据本发明确定与RARA基因相关的超级增强子的强度仅需要对基因组的这个特定部分进行分析，而不需要对整个基因组进行分析。
将ChIP-测序(也称为ChIP-seq)用于分析蛋白与DNA的相互作用。 ChIP-seq将染色质免疫沉淀(ChIP)与大规模平行DNA测序相结合以鉴定 DNA相关蛋白的结合位点。可以将其用于对任何目标蛋白的全部结合位点精确作图。以前，ChIP-on-chip是用于研究这些蛋白-DNA关系的最常用的技术。成功的ChIP-seq取决于很多因素，包括超声强度和方法、缓冲液组成、抗体质量和细胞数；参见例如，T.Furey,Nature Reviews Genetics13,840-852(2012 年12月)；M.L.Metzker,Nature Reviews Genetics11,31-46(2010年1月)；以及P.JPark,Nature Reviews Genetics10,669-680(2009年10月)。除了H3K27Ac 以外能够用于使用ChIP-seq鉴定超级增强子的基因组标记物包括P300、CBP、BRD2、BRD3、BRD4、中介体复合物的组分(J Loven等，Cell, 153(2):320-334,2013)、组蛋白3赖氨酸4单甲基化(H3K4me1)或与其他组织特异性增强子结合的转录因子(E Smith&AShilatifard,NatStructMolBiol,21(3):210-219,2014)(S Pott&Jason Lieb,Nature Genetics,47(1):8-12,2015)。
在一些实施方式中，细胞系或患者样品整个基因组的H3K27ac或其他标记物的ChIP-seq数据超级增强子图谱已经存在。在这些实施方式中，可以简单地确定在此类图谱chr17:38458152-38516681(基因组构建hg19)基因座的增强子或超级增强子的强度或顺序排序是否等于或高于预先确定的阈值水平。
在一些实施方式中，确定在chr17:38458152-38516681基因座的增强子或超级增强子的强度需要将该区域的ChIP-seq读数与已知包含在所有细胞中以相似水平存在的普遍存在的超级增强子或增强子的区域进行比较。此类普遍存在的超级增强子区域的一个实例是MALAT1超级增强子基因座 (chr11:65263724-65266724)。通过对在RARA基因座与在MALAT1基因座的ChIP-seq读数进行比较，可以确定在RARA基因座的超级增强子的强度是否等于或高于预先确定的阈值水平以及是否在其中的细胞将对RARA激动剂产生应答。
在本发明的一些实施方式中，阈值水平是log10(在RARA基因座 ChIP-seq读数的AUC(“R”)/在MALAT1超级增强子基因座ChIP-seq读数的AUC(“M”))是0.25或更高。在这些实施方式的一些方面中，鉴定针对 RARA激动剂的应答者的阈值水平是log10(R/M)为0.3或更高、0.35或更高或者0.4或更高。
在本发明的一些实施方式中，阈值水平是(在RARA基因座ChIP-seq读数的AUC(“R”)/在MALAT1超级增强子基因座ChIP-seq读数的AUC(“M”)) 是1.75或更高。在这些实施方式的一些方面中，鉴定针对RARA激动剂的应答者的阈值水平是log10(R/M)为2.0或更高、2.25或更高或者2.75或更高。
在本发明的一些实施方式中，将如上文所定义的R与除了MALAT1以外的对照增强子或超级增强子基因座进行比较(将在该其他对照增强子或超级增强子处的ChIP-seq读数的数量称为“C”)。当使用另一对照增强子或超级增强子基因座C时，必须将表示为log10(“V”)的阈值水平(指上文与M的比较，例如log10(R/M)≥0.25、log10(R/M)≥0.3、log10(R/M)≥0.35或 log10(R/M)≥0.4)调整为与C比较的等效值以说明C相对于M的相对强度。如下所示计算这种“等效调整的阈值(“A”)：
A＝log10(M/C)+V
作为非限制性实例，如果经计算MALAT1超级增强子的强度(M)是作为比较物的对照增强子或超级增强子(C)的10倍，并且阈值(V)是0.25，则 A＝log10(10)+0.25＝1.25且经调整的阈值是1.25。对于这个实例而言，当使用C作为比较物时，则将log10(R/C)等于或高于1.25认为相当于当使用M 作为比较物时log10(R/M)等于或高于0.25。显而易见的是，对于基于其与 MALAT1或经调整的阈值已确定的任意其他比较物的相对强度的任意其他比较物而言，可以以相同方式计算经调整的阈值。
当将与M相当的线性值作为阈值水平时(例如，≥1.75倍、≥2.0倍、≥2.25 倍或2.5倍)，可以做出与上文相同的调整。在这种情况下，得到M与C的比值，然后将阈值与该比值相乘以获得当将R与C比较时适当的阈值(即，(阈值)C＝(M/C)(阈值)M)。
应答理解的是，RARA和MALAT1的特定染色体位置针对不同的基因组构建和/或针对不同的细胞类型可能不同。然而，本领域技术人员能够通过在此类其他基因组构建中定位对应于在基因组构建hg19中的RARA和/或 MALAT1基因座的特定序列确定此类不同的位置。
用于鉴定超级增强子的其他方法包括染色质免疫沉淀(JE Delmore等， Cell,146(6)904-917,2011)和芯片阵列(ChIP-chip)，以及染色质免疫沉淀后接qPCR(ChIP-qPCR)，该方法使用相同的免疫沉淀基因组标记物和与 chr17:38458152-38516681(基因组构建hg19)的RARA基因座杂交的寡核苷酸序列。在ChIP-chip的情况下，与其他基于阵列的技术一样通常通过由探针与输入检测样品杂交产生的荧光强度检测信号。对于ChIP-qPCR而言，使用染料检测模板扩增情况，其仅当嵌入在PCR反应中产生的双链DNA后发出荧光。
在一些实施方式中，通过将在测试细胞中的RARA增强子强度与在已知对RARA不产生应答的细胞(“对照细胞”)中RARA的强度进行比较实现确定是否细胞具有高于规定阈值水平的RARA超级增强子。优选地，对照细胞是与测试细胞相同的细胞类型。在这些实施方式的一个方面中，对照细胞是在HCC143中的此类细胞。在这些实施方式的另一个方面中，对照细胞是图3 中所列的任意细胞，其中log10(RARA/MALAT1)小于0.25、小于0.2、小于0.15、小于0.1或小于0。
在一些实施方式中，如果在对象细胞中RARA超级增强子的强度是在对照细胞中相应RARA增强子/超级增强子强度的至少1.5倍，则确定对象将对 RARA激动剂产生应答。在这些实施方式的一些方面中，阈值水平的强度是在对照细胞中的至少2.0倍、至少2.5倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍。在这些实施方式的一些方面中，比较前对测试细胞和对照细胞中RARA超级增强子的强度进行归一化。归一化包括通过与在这两种细胞中天然地并且以等量水平存在的另一增强子或超级增强子(例如，MALAT1)或者在检测超级增强子的强度之前“掺入”各细胞样品的固定水平的外源性DNA进行比较调整已确定的RARA超级增强子的强度(DAOrlando等，Cell Rep.2014年11 月6日，9(3):1163-70(2014)；N Bonhoure等，GenomeRes,24:1157-68(2014))。
在一些实施方式中，通过将在测试细胞中的RARA增强子强度与在细胞群体样品中相应的RARA的强度进行比较实现确定是否细胞具有高于规定阈值水平的RARA超级增强子强度，其中每个细胞样品来自不同来源(即，不同对象、不同细胞系、不同移植物)。在这些实施方式的一些方面中，仅使用来自对象的原代肿瘤细胞样品确定阈值水平。在这些实施方式的一些方面中，将针对特定RARA激动剂的应答对群体中的至少一些样品进行测试以建立： a)对特定RARA激动剂产生应答的群体中样品的最低RARA增强子强度(“最低应答者”)；以及任选地，b)对特定RARA激动剂不产生应答的群体中样品的最高RARA增强子强度(“最高无应答者”)。在这些实施方式中，将高于其将认为测试细胞对特定RARA激动剂产生应答的RARA增强子强度的截止值设定为：i)等于或至多高于在群体的最低应答者中RARA增强子强度的5％；或ii)等于或至多高于在群体的最高无应答者中RARA增强子强度的5％；或 iii)在群体的最低应答者和最高无应答者的RARA增强子强度之间的值。
应当理解的是，在上述实施方式中通常不需要测试在群体中的所有样品对RARA激动剂的应答情况，但是需要检测所有样品的RARA增强子强度。在一些实施方式中，根据RARA增强子强度对样品排序。选择上文所述三种方法中的哪种用于建立截止值将取决于在群体中最低应答者和最高无应答者之间RARA增强子强度的差异以及目的是否是最大限度减少假阳性的数量或最大限度减少遗漏潜在应答样品或对象的机率。当最低应答者与最高无应答者之间的差异较大时(例如，当有很多样品没有进行应答测试时，RARA增强子强度排序落入最低应答者与最高无应答者之间)，通常将截止值设定为等于或至多高于在群体中最低应答者RARA增强子强度的5％。该截止值使潜在应答者的数量最大化。当该差异较小时(例如，当有很少样品或没有样品未进行应答测试时，RARA增强子强度排序落入最低应答者与最高无应答者之间)，通常将截止值设定为最低应答者与最高无应答者的RARA增强子强度之间的值。该截止值使假阳性的数量最小化。当最高无应答者具有高于最低应答者的RARA增强子强度时，通常将截止值设定为等于或至多高于在群体中最高无应答者RARA增强子强度5％的值。该方法也将假阳性的数量最小化。
在一些实施方式中，通过将在测试细胞中的RARA增强子强度顺序与在细胞群体样品中RARA增强子强度顺序进行比较实现确定是否细胞具有高于规定阈值水平的RARA超级增强子强度，其中每个细胞样品来自不同来源(即，不同对象、不同细胞系、不同移植物)。在这些实施方式中，将针对特定RARA 激动剂的应答对群体中的至少一些样品进行测试以建立：a)对特定RARA激动剂产生应答的群体中样品的最低RARA增强子强度顺序(“最低顺序应答者”)；以及任选地，b)对特定RARA激动剂不产生应答的群体中样品的最高 RARA增强子强度顺序(“最高顺序无应答者”)。在这些实施方式中，将高于其将认为测试细胞对特定RARA激动剂产生应答的RARA增强子强度顺序的截止值设定为：i)等于或至多高于在群体的最低顺序应答者中RARA增强子强度顺序的5％；或ii)等于或至多高于在群体的最高顺序无应答者中RARA 增强子强度顺序的5％；或iii)在群体的最低顺序应答者和最高顺序无应答者的RARA增强子强度顺序之间的值。
应当理解的是，在上述实施方式中，通常不需要测试在群体中的所有样品对RARA激动剂的应答情况，但是针对RARA增强子强度和与已建立的在相同样品中其他增强子比较的RARA增强子强度顺序对所有样品进行检测。通常通过检测在细胞中所有其他增强子的强度并确定RARA增强子与其他增强子相比在强度方面的排序(即，顺序)获得顺序。
在一些实施方式中，根据RARA增强子强度顺序对样品排序。选择上文所述三种方法中的哪种用于建立截止值将取决于在群体中最低顺序应答者和最高顺序无应答者之间RARA增强子强度顺序的差异以及是否是将截止值设计为使假阳性最小化或使应答者数量最大化。当该差异较大时(例如，当有很多样品没有进行应答测试时，RARA增强子强度顺序排序落入最低顺序应答者与最高顺序无应答者之间)，通常将截止值设定为等于或至多高于在群体中最低顺序应答者RARA增强子强度顺序的5％。当该差异较小时(例如，当有很少样品或没有样品未进行应答测试时，RARA增强子强度顺序排序落入最低顺序应答者与最高顺序无应答者之间)，通常将截止值设定为最低顺序应答者与最高顺序无应答者的RARA增强子强度顺序之间的值。当最高顺序无应答者具有高于最低应答者的RARA增强子强度顺序时，通常将截止值设定为等于或至多高于在群体中最高顺序无应答者RARA增强子强度顺序5％的值。
在将测试细胞或样品与群体进行比较的实施方式的一些方面中，将从群体(例如，RARA增强子强度或RARA增强子顺序)获得的截止值转化为出现频率排序并将截止值表示为具有截止值或更高值的群体的百分率，即出现频率截止值。不受理论的束缚，申请人相信无论用于确定RARA增强子强度的方法如何测试样品的出现频率排序将是相似的。因此，用于确定一个参数(例如，RARA增强子强度顺序)的出现频率截止值是普适性的并且能够用于另一参数(例如，RARA mRNA水平)以确定其他参数的截止值。其能够用于确定任意参数的截止值，而无需通过实验确定此类参数的水平与对RARA激动剂的应答之间的相关性。需要确定的仅为与此前在群体中确定的出现频率截止值对应的此类其他参数的水平。
确定RARA mRNA水平
我们对RARA超级增强子基因座的鉴定使得能够使用RNA转录物确定敏感性而不是使用超级增强子的水平确定对RARA激动剂的敏感性。来自超级增强子基因座本身的RNA转录物可以定量并且与在该基因座的超级增强子的水平具有非常好的相关性。我们还发现，编码RARA的mRNA转录物也与对RARA激动剂的灵敏度具有相关性，并且因此可以使用mRNA的水平鉴定将对RARA激动剂产生应答的细胞。
在一些实施方式中，使用对样品中RARA增强子RNA转录水平与在已知对RARA激动剂不产生应答的细胞或细胞系中相应RARA增强子RNA转录水平进行比较的定量技术对来自超级增强子基因座的RNA转录水平进行定量。此类方法包括基于通过(N Hah等，PNAS,112(3):E297-302,2015)读取与增强子相关的eRNA读数的方法的RNA阵列或测序，以及RNAqPCR。
在这些实施方式的一些方面中，将与在已知对RARA激动剂不产生应答的细胞或细胞系中相应RARA增强子RNA转录水平进行比较是RARA RNA 转录水平的至少1.5倍作为阈值以鉴定对RARA激动剂的敏感性。在这些实施方式的其他方面中，用于鉴定RARA激动剂应答者的阈值是与其在对照细胞中的RARA RNA转录水平相比的至少2.0倍、至少2.5倍、至少3倍、至少 4倍或至少5倍。
在一些实施方式中，使用RARA的mRNA水平鉴定RARA激动剂应答者。在这些实施方式的一个方面中，使用RNA-Seq或RNA-qPCR技术对mRNA 水平定量。在这些技术的每一个中，确定测试细胞中的RARA mRNA水平并与已知对RARA激动剂不产生应答的细胞(“对照细胞”，例如HCC1143细胞) 的RARA mRNA比较。在这些实施方式的一个方面中，在测试细胞中的RARA mRNA水平与对照细胞相比是至少1.5倍表明对RARA激动剂产生应答(即，预先确定的阈值与对照细胞相比是至少1.5倍)。在这些实施方式的其他方面中，在测试细胞中的RARAmRNA水平与对照细胞相比是至少2倍、至少2.5 倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍表明对RARA激动剂产生应答。在这些实施方式的另一个方面中，对照细胞是图3中列出的任意细胞，其中log10 (RARA/MALAT1)小于0.25、小于0.2、小于0.15、小于0.1或小于0。
在替代实施方式中，使用相同测定方法将在对象中(即，在肿瘤样品中，在癌细胞样品中，在血液样品中等)的RARA mRNA水平与在患有相同疾病或病况的对象群体中的RARAmRNA水平进行比较以减低RARA激动剂应答者。在这些实施方式中，将针对特定RARA激动剂的应答对群体中的至少一些样品进行测试以建立：a)对特定RARA激动剂产生应答的群体中样品的最低RARA mRNA水平(“最低mRNA应答者”)；以及任选地，b)对特定RARA 激动剂不产生应答的群体中样品的最高RARA mRNA水平(“最高mRNA应答者”)。在这些实施方式中，将高于其将认为测试细胞对特定RARA激动剂产生应答的RARA mRNA水平的截止值设定为：i)等于或至多高于在群体的最低mRNA应答者中RARA mRNA水平的5％；或ii)等于或至多高于在群体的最高mRNA无应答者中RARA mRNA水平的5％；或iii)在群体的最低 mRNA应答者和最高mRNA无应答者的RARA mRNA水平之间的值。
在一些实施方式中，不需要测试在群体中的所有样品对RARA激动剂的应答情况，但是对所有样品的RARA mRNA水平进行检测。在一些实施方式中，根据RARA mRNA水平对样品排序。选择上文所述三种方法中的哪种用于建立截止值将取决于在群体中最低mRNA应答者和最高mRNA无应答者之间RARA mRNA水平的差异以及是否是将截止值设计为使假阳性最小化或使潜在应答者数量最大化。当该差异较大时(例如，当有很多样品没有进行应答测试时，RARA mRNA水平排序落入最低mRNA应答者与最高mRNA无应答者之间)，通常将截止值设定为等于或至多高于在群体中最低mRNA应答者RARA mRNA水平的5％。当该差异较小时(例如，当有很少样品或没有样品未进行应答测试时，RARA mRNA水平排序落入最低mRNA应答者与最高mRNA无应答者之间)，通常将截止值设定为最低mRNA应答者与最高 mRNA无应答者的RARA mRNA水平之间的值。当最高mRNA无应答者具有高于最低mRNA应答者的RARA mRNA水平时，通常将截止值设定为等于或至多高于在群体中最高mRNA无应答者RARA mRNA水平5％的值。
在一些实施方式中，根据RARA mRNA水平对群体排序。在这些实施方式中，检测各样品中的RNAmRNA水平并与在细胞中的所有其他mRNA的 mRNA水平比较以获得RARA mRNA水平的顺序排序。然后基于在测试对 RARA激动剂应答的群体中的样品以与此前所述的用于确定RARA超级增强子强度顺序截止值的相同方法确定基于RARA mRNA顺序排序的截止值。然后将确定的RARA mRNA顺序截止值直接使用或用于确定出现频率截止值，然后将其中的任意一个用于针对对RARA激动剂的潜在应答将其他样品分层。
在一些实施方式中，如上所述，使用根据RARA增强子强度或RARA增强子强度顺序确立的出现频率截止值确定RARA mRNA水平的截止值。在这些实施方式的一些方面中，检测群体的mRNA水平并将此前确定的出现频率截止值用于该群体以确定mRNA截止值水平。在这些实施方式的一些方面中，绘制在群体中的RARA mRNA水平排序标准曲线，并将预先确定的出现频率截止值用于该标准曲线以确定RARA mRNA截止值水平。
在将测试细胞或样品与群体比较的实施方式的一些方面中，将从群体获得的截止mRNA水平值转化为出现频率排序并将mRNA水平截止值表示为具有截止值或更高值的群体的百分率，即出现频率截止值。
不受理论的束缚，申请人相信无论用于确定RARA mRNA水平的方法如何在群体中测试样品的出现频率排序和出现频率截止值将是相似的。
在这些实施方式的一些方面中，如果根据在群体中的RARA mRNA水平确定的对应于在群体中的出现频率排序的其RARA mRNA水平为79％、78％、 77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、 65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、 43％、42％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、 41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、 29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％或20％，则将对象鉴定为RARA激动剂应答者。在这些实施方式的一个方面中，截止值是根据针对RARA增强子强度确立的出现频率截止值确立的。在这些实施方式的一个替代方面中，截止值是根据针对RARA增强子强度顺序确立的出现频率截止值确立的。在这些实施方式的另一个替代方面中，截止值是根据RARA mRNA水平确立的。在这些实施方式的更具体的方面中，乳腺癌患者的截止值是根据针对RARA增强子强度顺序确定的出现频率截止值确立的，并将该出现频率截止值用于确定针对RARAmRNA水平的截止值。在这些实施方式的甚至更加具体的方面中，乳腺癌患者的截止值是使用50％和60％之间的出现频率值确定的值，例如50-55％、55-60％、50-56％、50-57％、51-55％、51-56％、 51-57％、52-55％、52-56％、52-57％、53-55％、54-56％、53-56％或54-55％。在这些实施方式的其他更加具体的方面中，截止值是使用55％或56％的出现频率值设置的。在这些实施方式的其他更加具体的方面中，AML患者的截止值是根据针对RARA增强子强度顺序确定的出现频率值确立的，并将该出现频率值用于确定针对RARA mRNA水平的出现频率值。在这些实施方式的甚至更加具体的方面中，AML患者的截止值是使用25-45％之间的出现频率截止值确定的值，例如25-30％、25-35％、25-40％、30-35％、30-40％、35-45％、35-40％、31-35％、32-35％、33-35％、34-35％、31-36％、32-36％、33-36％、 34-36％或35-36％之间。在这些实施方式的其他甚至更加具体的方面中，AML 患者的截止值是使用36％的出现频率值确定的。在这些实施方式的其他甚至更加具体的方面中，AML患者的截止值是使用25％的出现频率值确定的。
在其他实施方式中，可以将群体分成三组——应答者、部分应答者和无应答者，并设置两个截止值或出现频率截止值。部分应答者组可以包括应答者和无应答者，以及对RARA激动剂的应答不如应答者组高的那些群体成员。在这些实施方式中，确定两个截止值或出现频率截止值。当在最高RARA mRNA无应答者具有高于最低RARA mRNA应答者的RARAmRNA水平的群体中时，这种类型的分层可能是特别有用的。在这种情况下，将应答者和部分应答者之间的截止值水平或出现频率截止值设定为等于或至多高于最高 RARA mRNA无应答者RARA mRNA水平的5％；以及将部分应答者和无应答者之间的截止值水平或出现频率截止值设定为等于或至多低于最低RARA mRNA应答者RARA mRNA水平的5％。确定是否应向部分应答者施用RARA 激动剂将取决于主治医师的判断和/或主管机关的审批。
对细胞或生物样品中特定RNA序列定量的方法是本领域公知的，并且包括但不限于荧光杂交(如利用由NanoString Technologies提供的服务和产品)、基于阵列的技术(Affymetrix)、使用Green(Life Technologies)或技术(LifeTechnologies)的逆转录酶qPCR、RNA测序(例如， RNA-seq)、利用(AdvancedCell Diagnostics)进行的RNA杂交和信号放大或Northern印迹。
在这些实施方式的一些方面中，比较前对测试细胞和对照细胞两者中或群体所有成员中的RNA转录物水平(mRNA或另一RARA转录物)归一化。归一化包括通过与在这两种细胞中天然地并且以等量水平存在的另一RNA 转录物(例如，GADPH mRNA，18S RNA)或者在检测超级增强子的强度之前“掺入”各细胞样品的固定水平的外源性RNA进行比较调整已确定的 RARARNA转录物水平(J Lovén等，Cell,151(3):476-82(2012)；J Kanno等， BMCGenomics 7:64(2006)；J Van de Peppel等，EMBO Rep 4:387-93(2003))。
癌症和其他疾病
本发明的方法和包装药物在理论上可以用于治疗以在这种癌症中超级增强子与RARA基因相关为特征的任何癌症。与超级增强子相关的RARA基因可能在某些类型的癌症中与在其他类型的癌症相比更为普遍。发明人已在皮肤、乳腺、血液、骨、宫颈、结肠、直肠、食道、淋巴结、肺、卵巢、子宫、胰腺、前列腺、肾和脾的癌症中；以及特别是在AML(特别是在非-APL AML 中以及在不具有涉及RARA基因的染色体易位特征的其他形式的AML中)、骨髓增生异常综合征(MDS)、结直肠癌、HER2+乳腺癌、ER+乳腺癌、三阴乳腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、胃癌、肾透明细胞癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤和前列腺癌中发现与RARA相关的超级增强子。不受理论的束缚，发明人相信与SE相关的 RARA基因将存在于所有癌症的子集中且在那些子集中的对象与患有相同类型癌症但是无与SE相关的RARA基因的其他对象相比将对RARA激动剂具有更高的应答。
我们还相信在非癌疾病的组织中发现与SE相关的RARA提示有效使用 RARA激动剂治疗这些疾病的可能性。我们已检测到在脂肪组织中存在RARA 超级增强子，这提示了一种鉴定可以有效使用RARA激动剂治疗的患有糖尿病或肥胖的患者的方法。维甲酸在脂肪组织的分化中具有确定的作用(J Mercader等，Endocrinology,147(100):5325-5332,2006)。此外，已经证明了 PPAR-γ和RARA之间的关系(ARedonnet等，Int J Obesity,(26)920-927,2002)。
已在多种类型的血液细胞中检测到了与超级增强子相关的RARA基因座。其包括CD133+造血干细胞、CD14+单核细胞、CD19+早期B-细胞、CD20B- 细胞、CD3+成熟T-细胞、CD34+造血祖细胞、CD4+T辅助细胞、CD56自然杀伤细胞和CD8+细胞毒性T细胞。在这些细胞中存在与RARA相关的超级增强子表明可以将RARA激动剂用于治疗患有某些自身免疫性疾病的患者子集，包括但不限于牛皮癣、多发性硬化症、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、乳糜泻、重症肌无力、系统性红斑狼疮和硬皮病。
已在患有常染色体显性多囊性肾病患者的细胞中发现了具有与RARA相关的超级增强子并且因此其可能是使用RARA激动剂有效治疗的候选者。有一些证据表明ADPKD能够对维甲酸类产生应答(Q Qian等，Kidney International,(59):2005-2022,2001)，这样可以将鉴定还具有与SE相关的RARA基因座的那些患者作为分层方法以便更好地选择更有可能对RARA选择性激动剂产生应答的那些患者。
在一些实施方式中，在本发明的方法中和使用本发明的包装药物组合物治疗的疾病是癌症。在这些实施方式的一些方面中，待治疗的疾病选自乳腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤和AML。在这些实施方式的一些更具体的方面中，待治疗的疾病选自乳腺癌、神经胶质瘤、宫颈和宫颈内癌、结肠和直肠腺癌、头颈部鳞状细胞癌、肾脏肾乳头状细胞癌、肺腺癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、皮肤黑素瘤、子宫癌、MDS和AML。在这些实施方式的一些更具体的方面中，待治疗的疾病选自乳腺癌、MDS和AML。在这些实施方式的一些更具体的方面中，待治疗的疾病选自乳腺癌和AML。在这些实施方式的甚至更具体的方面中，待治疗的疾病是非-APL AML或不具有涉及RARA基因的染色体易位特征的AML。
在一些实施方式中，待使用RARA激动剂(例如，他米巴罗汀)治疗的对象患有复发性或难治性AML。将对象分类为患有复发性或难治性AML，如果其：a)在第一轮诱导化疗后未显示出部分应答；或者b)在第二轮诱导化疗后未显示出完全应答；或者c)在常规化疗后复发；或者d)在进行单一干细胞移植时复发。
在一些实施方式中，待使用RARA激动剂(例如，他米巴罗汀)治疗的对象患有难治性MDS。将对象分类为患有难治性MDS，如果其：a)分类为患有高风险或中间-2MDS(根据使用国际预后分期系统(“IPPS”)确定的) 并且在使用低甲基化剂(例如，阿扎胞苷、地西他滨)进行至少4轮诱导化疗后未能实现任何血液学改善(根据IWG 2006标准检测)，或者在任意持续时间的完全或部分应答后复发；或者b)分类为IPSS中间-1或低风险的MDS 并且依赖于输血或已使用红细胞生成刺激剂(ESA)治疗失败。
在其他实施方式中，待使用RARA激动剂(例如，他米巴罗汀)治疗的对象是老年不适宜的对象。在本文中使用的术语“老年不适宜的”指对象是年龄至少为60岁的人并且已由医师决定不是标准诱导疗法的候选者。
RARA激动剂
可以从本领域公知的任意RARA激动剂中选择使用其治疗已鉴定为具有与超级增强子相关的RARA基因的患者的RARA激动剂。在本发明的方法中使用的RARA激动剂优选对RARA具有特异性并且对其他形式的RaR(例如， RaR-β和RaR-γ)明显具有较低的(至少低10X、至少低100X、至少低1,000X、至少低10,000X、至少低100,000X)激动活性。
在一些实施方式中，RARA激动剂选自在下述美国专利中的任意一个中公开的化合物或落入其范围中的任意化合物：US 4,703,110、US 5,081,271、 US 5,089,509、US 5,455,265、US 5,759,785、US 5,856,490、US 5,965,606、 US 6,063,797、US 6,071,924、US6,075,032、US 6,187,950、US 6,355,669、 US 6,358,995和US 6,387,950，其均通过引用并入。
在一些实施方式中，RARA激动剂选自表1中列出的任意下述已知的 RARA激动剂，或其药学上可接受的盐或前述溶剂化物或水合物：
表1：在本发明中使用的示例性RARA激动剂
在一些实施方式中，RARA激动剂是他米巴罗汀。在一些实施方式中，RARA激动剂是
包装药物组合物
本发明的包装药物组合物包含书面插页或标签，其包括向患有癌症并且已确定具有与超级增强子相关的RARA基因的对象说明使用RARA激动剂，所述RARA基因具有等于或高于阈值水平的强度或顺序排序或者等于或高于阈值水平的RARA mRNA水平。如上文所详述的，在来自诊断为患有与药物组合物适用于治疗的相同疾病的对象或者相同疾病的细胞系或移植物模型的样品群体中确定阈值水平。说明书可以粘附或以其他方式附接在包含RARA激动剂的容器中。或者，说明书和包含RARA激动剂的容器将是彼此之间分离的，但是一起在单个包装、盒或其他类型的容器中。
包装药物组合物中的说明书通常将由批准RARA激动剂治疗用途的政府机构强制或推荐使用。说明书可以包括确定超级增强子与RARA基因是否相关的特定方法，以及确定与RARA基因相关的增强子是否是超级增强子的定量方法，确定RARA mRNA水平的定量方法；和/或超级增强子或RARA mRNA的阈值水平，在该水平下推荐使用包装RARA激动剂治疗和/或假定治疗有效。在一些方面中，说明书指示向RARA mRNA水平落入已检测RARA mRNA水平的群体的至少第30百分位的对象施用组合物。在这些实施方式的一些方面中，如果其RARAmRNA水平出现频率排序为已检测RARA mRNA 水平的群体中的79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、 69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、 57％、56％、55％、54％、43％、42％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、 45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、 33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、 21％或20％，则将对象鉴定为RARA激动剂应答者。在一些方面中，说明书指示向已通过特定测定方法检测RARA mRNA水平的对象施用组合物。
说明书可以任选地包括剂量信息、已批准使用RARA激动剂治疗的癌症类型、RARA激动剂的物理化学信息；关于RARA激动剂的药代动力学信息、药物相互作用信息。在一些方面中，说明书指示向诊断为患有非-APL AML 的对象施用组合物。在其他方面中，说明书指示向诊断为患有乳腺癌的对象施用组合物。在一些方面中，说明书指示向诊断为患有MDS的对象施用组合物。在一些方面中，药物组合物包含他米巴罗汀。在一些方面中，药物组合物包含AGN-195183。
实施例
为了可以更充分地了解本文所述的发明，阐述以下实施例。提供本申请中所述的合成实施例和生物学实施例以说明本文所提供的化合物、药物组合物、以及方法并且所述实施例不应当以任何方式被解释为限制他们的范围。
实施例1：鉴定与RARA相关的超级增强子的ChIP-seq分析
I.细胞的交联。对于培养细胞而言，我们通常一次交联5x 107至1x 108之间的细胞(相当于在8-1215cm2培养皿中70-80％融合的粘附细胞或在8-12 175cm2培养瓶中的悬浮细胞)。我们使用20-50万个细胞进行每个位置分析反应。对于粘附细胞而言，我们向皿中加入1/10体积的新鲜11％甲醛溶液(0.1M NaCl、1mM EDTA pH 8、0.5mM EGTApH 8、50mMHepes)，将皿短时涡旋并将其置于室温下(“RT”)8min。然后我们向淬灭甲醛中加入1/20体积的 2.5M甘氨酸或1/2体积的1M Tris pH 7.5并孵育至少1min。然后我们使用20 ml冷的1X磷酸盐缓冲液(“PBS”)冲洗细胞3X；使用硅刮刀收集细胞；并使用台式离心机在4℃下以2k将细胞离心10分钟。然后将细胞转移至15ml 锥形管中并在4℃下以2k离心10分钟。将沉淀的细胞在液氮中快速冷冻并在-80℃下储存。
对于悬浮的细胞而言，我们向细胞悬液中加入1/10体积的新鲜11％甲醛溶液，混合并将混合物在RT下放置8min。然后我们向淬灭甲醛中加入1/20 体积的2.5M甘氨酸或1/2体积的1M Tris pH 7.5并孵育至少1min。后我们使用20-50ml冷的1X PBS冲洗细胞3X，以2,000RPM离心5min以便在每次洗涤前后沉淀细胞。然后将细胞转移至15ml锥形管中并在4℃下以2k离心 5分钟。弃去上清液，使用Kimwipe吸去残留液体，然后沉淀的细胞在液氮中快速冷冻并在-80℃下储存。
对于来自原始血液的细胞而言，我们每个样品交联2x 105至1x 107之间的细胞，交联通过加入1/10体积的新鲜11％甲醛溶液(0.1M NaCl、1mM EDTApH 8、0.5mM EGTApH 8、50mM Hepes)进行，交联在RT下进行8min。然后我们向淬灭甲醛中加入1/20体积的2.5M甘氨酸或1/2体积的1M Tris pH 7.5并孵育至少1min。然后我们使用1-2ml冷的1X PBS冲洗细胞3X；并通过离心收集细胞。然后如上所述的将细胞沉淀直接用于ChIP-seq分析。
对于来自原始固体组织的细胞而言，我们每个ChIP使用250-500μg冰冻组织。用刀片(在冷表面上，<-80C)和剪子在1％甲醛溶液(1％甲醛；0.1M NaCl、1mM EDTApH 8、0.5mMEGTApH 8、50mM Hepes)中将冰冻组织切割2min。将组织切成细浆状物2min并向浆料中加入9ml 1％甲醛溶液。总共进行8min交联。然后我们向淬灭甲醛中加入1/20体积的2.5M甘氨酸或 1/2体积的1M Tris pH 7.5并孵育至少1min。然后我们使用1-2ml冷的1X PBS 冲洗细胞3X；并通过离心收集细胞。使用6ml PBS(含有CompleteTM蛋白酶抑制剂)重悬细胞并使用杜恩斯松杵匀浆器匀浆～40X。以3,000RPM离心2min 回收细胞。弃去上清并将细胞沉淀在液氮中速冻以用于如所述的ChIP-seq分析。
II.抗体与磁珠的结合。我们每2ml免疫沉淀物(Invitrogen)使用60μL蛋白G。在1.5ml Eppendorf管中使用1.0ml封闭缓冲液(含0.5％ BSAw/v的PBS)洗涤小珠3次，每次5分钟。每次洗涤后使用磁体(Invitrogen) 收集小珠(我们让磁体结合至少1分钟)，然后吸出上清液。使用250μL封闭缓冲液重悬经洗涤的小珠，向其中加入6μg抗体并将混合物上下颠倒混合孵育过夜(最少6小时)。使用1ml封闭缓冲液洗涤与抗体结合的小珠3X，每次5min并使用封闭缓冲液重悬(每次IP 60μL)。在进行免疫沉淀过夜之前，在最后的洗涤和重悬完成后立即对细胞进行超声(见下步)。
III.细胞制备和基因组片段化。在使用前我们向所有裂解缓冲液中加入 1X蛋白酶抑制剂(混合，罗氏；通过将1片溶于1ml H2O中制成50X溶液并将分装物在-20℃下保存)。将每管细胞(约5x107个细胞)重悬于5-10ml 裂解缓冲液1(LB1；140mM NaCl、1mM EDTA、10％甘油、0.5％NP-40、 0.25％Triton X-100)中并在4℃下摇动10分钟。使用台式离心机在4℃下以 2,000RPM将细胞离心5min并吸出上清液。使用5ml裂解缓冲液2(LB2；200mMNaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTA、10mM Tris pH 8)重悬细胞并在4℃下上下颠倒孵育10分钟。使用台式离心机在4℃下以2,000RPM再次将细胞离心5min并使用2-5ml Covaris超声缓冲液(10mM Tris pH 8.0、1mM EDTA、 0.1％SDS)洗涤。使用台式离心机在4℃下以2,000RPM离心5min沉淀细胞。使用台式离心机在4℃下以2,000RPM离心5min沉淀细胞并以20-50 万个细胞/1ml的浓度使用Covaris超声缓冲液重悬。
将1ml细胞裂解物加入12x12Covaris微管中并且总共超声5分钟(峰值功率140、占空系数5.0、循环/脉冲200)。我们将超声物合并加入一个15ml 管中，加入1体积2X稀释混合物(300mM NaCl,2mM EDTA,50mM Tris pH 8.0, 1.5％Triton-X,0.1％SDS)，在4℃下以14,000RPM离心10min将不溶性成分沉淀并上清液收集至一个管中。将上清液作为进行染色质免疫沉淀的ChIP 输入。我们还收集了50μL细胞裂解物作为全细胞提取(“INPUT”)样品对照。
IV.染色质免疫沉淀。将来自步骤II的50μL与抗体缀合的小珠加入在 1.5ml管中的已澄清的细胞提取(在步骤III中制备的)溶液中并在4℃下摇动过夜(最少8小时)以免疫沉淀DNA-蛋白复合物。
V.洗涤、洗脱和交联逆转。在这些步骤中使用的所有缓冲液都是冰冷的。我们使用磁力架沉淀磁性小珠，使用1ml洗涤缓冲液1(50mM HEPES pH 7.5； 140mM NaCl；1mM EDTA；1mM EGTA；0.75％Triton-X；0.1％SDS；0.05％ DOC)轻柔的上下颠倒混合洗涤3次，每次5分钟；使用1ml洗涤缓冲液2 (50mM HEPES pH 7.5；500mM NaCl；1mM EDTA；1mM EGTA；0.75％Triton-X；0.1％SDS；0.05％DOC)洗涤1次，持续5分钟；以及使用1ml 洗涤缓冲液3(10mMTris pH 8.0；1mM EDTA；50mM NaCl)洗涤1次，持续5分钟。我们吸去所有残留的洗涤缓冲液，以2,000RPM轻柔离心小珠1 min；将管放回磁体上并除去所有缓冲液。然后我们加入210μl洗脱缓冲液(50 mMTris pH8；10mM EDTA；1％SDS)并在65℃下洗脱60min，每15min 短暂涡旋1次以重悬小珠。我们使用磁体将小珠与上清液分离；弃去200μL 上清液并将其置于洁净的管中逆转交联。我们将x-连接的IP和全细胞提取物部分在65℃下逆转过夜(最少8小时，但是最长18小时)。然后我们使用加热，通过在65℃下孵育过夜(最少8小时，但是最长18小时)，分别逆转交联的用于免疫沉淀的样品和全细胞提取部分。加热促进了甲醛交联的水解。
VI.DNA的清洁和纯化。我们向各样品中加入200μl TE(50mMTris pH8； 1mM EDTA)和2.7μl 30mg/ml RNaseA(终浓度0.2mg/ml)，混合并在37℃下孵育2小时。然后我们向各样品中加入5μl氯化钙溶液(在10mM Tris pH8.0 含300mM CaCl2)以及4μL 20mg/ml蛋白酶K(终浓度0.2mg/ml)，混合并在 55℃下孵育60分钟。然后我们向各管中加入400μl比例为25:24:1的苯酚：氯仿：异戊醇(Sigma Aldrich#P3803)，在低设置(5/10)的涡旋混合器上混合以及颠倒各管以进一步混合。
我们通过在室温下以10,000RPM将管离心30秒制备各样品的PhaseLock GelTM管Qiagen,3Prime)。我们接下来将在苯酚：氯仿：异戊醇中的样品DNA 样品加入PhaseLockGelTM管中并在室温下以12,000-16,000xg离心2分钟。我们将水溶液转移至新的1.6ml管(上面的部分)中，加入20μl 5M NaCl和1.5μl 20μg/μl糖原(总计30μg)，然后加入1ml EtOH并通过涡旋或颠倒混合。然后将样品在-20℃下孵育过夜(6-16小时)。然后我们将混合物在4℃下以 20,000xg离心20分钟以沉淀DNA，使用1ml移液枪头除去上清液，在800μl 80％EtOH中洗涤沉淀，在4℃下以20,000xg离心20分钟并使用1ml移液枪头除去上清液。我们以20,000xg将样品再次离心1min，除去所有的上清液并将其空气干燥5-20分钟。沉淀在其周围不应该有水晕并且应该是玻璃状或片状干燥。然后我们将沉淀溶解在60μl水中，使用10μl用于qPCR和50μl 用于测序。对于ChIP-qPCR而言，按照生产厂商的方案，每孔使用1μL样品以及分别与来自Life Technologies的2x Power SYBR Green PCR Master Mix混合的0.8μM正向(F)和反向(R)引物进行扩增。使用的引物如下表中所示，其中V1、V2和V3是设计为与RARA增强子中的不同区域杂交的引物对和“下”是设计为与下游未乙酰化的非编码对照区杂交的引物对。
强应答(Au565)和弱应答(T47D)细胞系与来自各细胞的全细胞提取物(“WCE”)比较的ChIP-qpCR结果如图1A-B所示。该图说明了在归一化到附近的基因间对照区后在下拉中在针对这些细胞系的增强子处这些引物在检测针对H3K27ac标记物而非WCE的强富集是有效的。
VII.RARA超级增强子的ChIPSeq分析和定量。我们使用上文所述的方法学使用H3K27ac ChIP-seq鉴定在chr17:38458152-38516681(基因组构建hg19) 处与RARA基因重叠的超级增强子基因座。该染色体区域是在所检测的样品上被一致指定的，但是能够根据所检测的基因组标记物或所使用的组织类型略有改变。为了评估在不同样品中该超级增强子基因座的强度，我们在各样品中进行了H3K27ac ChIP-seq并且也对匹配的ChIP输入样品进行了测序。所有H3K27ac和输入样品均使用Bowtie2(使用灵敏度参数)与hg19基因组比对。图2中显示的基因轨迹可视化显示了以1bp二进制计的比对读数计数显示的典型细胞样品，其中各读数在比对方向上延伸200bp。读数计数以每百万比对读数的比对读数的数量(RPM)计。通过将在所定义的基因座中各碱基对处的读数求和计算AUC。根据RARA超级增强子基因座的位置，我们还评估了在来自各细胞系和患者样品的现有H3K27ac ChIP-seq图谱中RARA 超级增强子相对于MALAT1超级增强子基因座的水平。
对于各H3K27Ac/输入样品对(图3中表中的行)而言，对与RARA超级增强子(chr17:38458152-38516681)或在MALAT1 (chr11:65263724-65266724)的阳性对照超级增强子比对的H3K27Ac或输入读数的数量计数。所有读数计数以RPM计。然后我们从在这两个基因座的 H3K27Ac信号中减去输入信号以获得H3K27ac ChIP-seq读数在背景上的富集 (DIFF列)。最后，为了评估RARA超级增强子相对于MALAT1阳性对照超级增强子的强度，我们计算了RARA超级增强子H3K27Ac富集信号与在 MALAT1超级增强子处的H3K27Ac富集信号之比并在RARA/MALAT1列报告了该比例。值越高表明RARA超级增强子的评分越强。我们还计算了log10 (RARA/MALAT1)比值。所测试的各样品的所有这些值如图3中所示。
所有乳腺癌和AML细胞系以及患者样品的RARA/MALAT1log10比值分别如图4A和4B中所示。在各图中显示了0.4log10阈值是发现在体外细胞系中对他米巴罗汀敏感的最低SE强度。从这些图中可以看出，每种癌症类型有一定百分比的样品在该阈值以下。图5显示了对于所检测的正常血液细胞系和患者样品的和RARA/MALAT1log10比值。可以看出，所检测的每种血液细胞有一定百分比的样品在该阈值以下，提示这种类型的患者分层对于鉴定患有将对RARA激动剂产生应答的血液学病症的对象是有用的。
使用如美国专利9,181,580中所述的ROSE计算RARASE排序，其公开的内容通过引用并入本申请。首先，使用ROSE计算所有乳腺癌和AML细胞系以及患者样品的增强子评分。在每个样品中，按照评分对增强子排序，并且RARA超级增强子的排序是与RARA基因(chr17:38465444-38513094)重叠且具有最高评分的增强子排序。
图6显示了在乳腺癌和AML中针对细胞系对比患者样品对 RARA/MALAT1log10比值的比较。从该图中可以看出，与相应的细胞系相比，这两种癌症类型的患者样品具有统计学上显著更高水平的RARA。这表明较高的RARA超级增强子水平不是限于细胞系的体外现象。此外，这说明与细胞系相比预计有更高比例的患者样品将对RARA激动剂显示出应答。
实施例2：筛选对乳腺细胞癌症嵌板的各种RaR调节化合物
I.材料。所有细胞来自ATCC并且在37℃下5％CO2中培养。其均在补充了10mMHEPES缓冲液、2mM L-谷氨酰胺、50U/mL青霉素、50U/mL链霉素和10％胎牛血清(FBS，均来自Invitrogen)的RPMI1640中生长。细胞系包括AU565、SKBR3、T47D、HCC1143、MCF7、ZR-75-1和HCC1569。
他米巴罗汀、AM580和维甲酸来自Sigma Aldrich。他扎罗汀酸来自 Carbosynth。阿达帕林、BMS195614、BMS493、BMS961来自Tocris。依曲替酯来自Santa Cruz。他扎罗汀来自Selleckchem。
在Life Technologies使用其Nuclear Profiling Services评估了各种测试化合物针对各种类型RAR的激动特异性。获得的值如下表中所示：
从上表中可以看出，他米巴罗汀、BMS753和AM580对RARA比RaR-γ具有最高的特异性，从而证实了其作为RARA特异性激动剂的状态。这种特异性是重要的，因为RaR-γ的激动与毒性相关。尚不知晓RaR-β的激动对效能或毒性的作用，因此应该不会影响激动剂治疗潜能。
II.中通量筛选。在实验当天，使用Accumax(EMD Millipore)将细胞匀浆、计数并在适宜的生长培养基中将乳腺癌细胞系调整至40,000个细胞/ml 和将AML调整至60,000个细胞/mL。使用Biotek EL406，将50μl细胞分散入白色(ATPlite)或黑色(CyQuant)384孔板(Thermo)中。将细胞放回至 37℃培养箱中使其贴壁。3小时后，使用Janus工作站上的20nl384孔针状转移歧管将化合物加入板中。DMSO储备液在384孔化合物板中以10点四复管剂量应答阵列排布。加入化合物和后，将板在37℃培养箱中孵育5天或 10天。
使用ATPlite(Perkin Elmer)或CyQuant(Life Technologies)读取细胞活力。对于ATPlite而言，在使用前将板从培养箱中取出并使其达到室温。将 ATPlite试剂冻干粉在裂解缓冲液中重悬并使用蒸馏水按照1:2稀释。使用 Biotek移液器将25μL该溶液加入各孔中。在使用Envision酶标仪(Perkin Elmer)读取发光信号前，将板在室温下孵育15min。对于CyQuant而言，按照生产厂商的说明将试剂在PBS(Gibco)中混合。在Envision酶标仪(Perkin Elmer)上读数前，使用多道移液器加入试剂并且将板在培养箱中放置30分钟。
在Microsoft Excel中将如上所述采集的数据保存和分组并使用GraphPad Prism软件分析。当归一化为在板上包括的仅使用DMSO处理的孔后，在 GraphPad Prism(6.0版)中使用四参数(不假设Hill斜率等于1)非线性回归对使用化合物浓度log10转化数据对细胞活力百分率作图的曲线拟合计算 EC50和Emax。将边缘孔排除。
如图7中所示，四种不同的乳腺癌细胞系显示出对他米巴罗汀不同的应答，其敏感性顺序为SKBR3>Au565>ZR75>Hcc1143。这与如图2中所示的在 RARA位点的超级增强子水平具有非常好的相关性。针对7种不同乳腺癌细胞系的对他米巴罗汀的敏感性与超级增强子强度的相关性(log10EC50vs RARA/MALAT1超级增强子比值)如图8中所示，其具有的相关性(R2)值为0.7086。
如图9中所示，三种不同的AML细胞系显示出对他米巴罗汀不同的应答，其敏感性顺序为SigM5>OCI M1>HEL。如图23A-B中所示，与SigM5和HEL 一起检测了两个其他AML细胞系MV411和Kasumi对他米巴罗汀的敏感性并且表明敏感性顺序为SigM5>MV411>HEL＝Kasumi。针对11种不同AML 细胞系的对他米巴罗汀的敏感性与超级增强子强度的相关性(log10EC50vs RARA/MALAT1超级增强子比值(“IEA”))如图10中所示，其具有的相关性(R2)值为0.3635，但是不考虑显示出显著偏离标准(SE升高，但是预期敏感性降低)的一个细胞系HEL时，该值增至0.5680。
实施例3：RARARNA和蛋白表达水平的检测
使用表达水平检测确定标记的RARA基因的mRNA水平。mRNA水平与增强子水平具有很好的相关性，并且因此也能够预测对RARA激动剂的敏感性。我们使用了如下所示的多种方法检测RNA。
I.基于阵列的技术。使用3个批次1x106个细胞评估HCC1143和AU565 的表达水平。按照生产厂商的方案，使用从细胞中提取RNA并使用 mirVanaTM RNA纯化试剂盒对其进行纯化(这两者均来自Life Technologies)。在Dana Farber癌症研究所微阵列核心(http://mbcf.dfci.harvard.edu/)的 AffymetrixPrimeViewTM阵列上读取RNA水平。
图11显示了在使用上述方案检测的他米巴罗汀应答性(Au565)和无应答性(HCC1143)细胞系中各种RaR亚型的mRNA表达水平。RARA mRNA 在应答性细胞系中的表达是在无应答细胞系中的8倍，而RaR-β和RaR-γ的表达在细胞系之间无显著差异。这确证了RARA mRNA表达分析与RARA超级增强子的强度相关并且对RARA激动剂敏感，以及表明可以将RARA mRNA水平用于预测对此类激动剂的敏感性。
II.RNA-Seq.通过RNA-Seq对RARA表达水平定量。进行多聚-A RNA-Seq并使用RSEM软件(参数＝--samtools-sort-mem 3G--ci-memory 3072 --bowtie-chunkmbs 1024--quiet--output-genome-bam)将读数与HG19转录组比对，然后使用RSEM进行mRNA定量并以每百万转录物(TPM)表示。曲线值表示针对48名原发AML患者的RARAlog2(FPKM+1)水平(y-轴)对超级增强子评分(RARA/MALAT1)(图12)，其具有的斯皮尔曼相关系数为 0.589和R2值为.0457。
III.qPCR。还使用rt-qPCR对表达进行了研究。对于各细胞系而言，将细胞计数并以200,000个细胞每mL铺板。然后使用500nM他米巴罗汀或溶剂处理细胞48小时。按照生产厂商的方案，使用从细胞中提取RNA并使用mirVanaTM RNA纯化试剂盒对其进行纯化(这两者均来自Life Technologies)。按照生产厂商的方案，使用ViloTM逆转录酶(Life Technologies)将纯化的RNA转化为cDNA。然后使用针对RARA和针对用于归一化的18s rRNA的探针(Life Technologies)检测转录丰度。对于RARA而言，使用扩增子长度为68和外显子跨距为6-7的探针 Hs00940446_m1。对于18S rRNA而言，使用具有187bp扩增子的探针 4319413E。根据生产厂商的方案，使用Gene ExpressionMaster Mix (Life Technologies)运行qPCR。使用△Ct法进行数据分析。从各样品中减去18s rRNA的Ct值以便归一化为细胞丰度。dCt值表示RNA转录物丰度的相对差异倍数。dCt值越低表明mRNA表达水平越高。以SE强度顺序(从最高(SKBR3)到最低(HCC1143))作图的针对6种不同乳腺癌细胞系的rt-qPCR 值结果如图13中所示。可以看出rt-qPCR值与在RARA基因座的超级增强子强度具有良好的相关性。图14A-B显示了dCT值与SE强度和与通过EC50检测的敏感性具有较高相关性。
IV.Western印迹。对细胞计数并调整至每种细胞系2百万个细胞并沉淀。使用100μL体积的添加了罗氏蛋白酶混合物的RIPA缓冲液(Life Technologies)裂解细胞沉淀。以20,000xg离心5分钟澄清样品。将10μL样品上样至4-12％Bis-Tris凝胶(LifeTechnologies)。使用的抗体是Abcam 1791 组蛋白H3(针对上样对照)和Sigma AldrichSAB1404298(针对RARA)。结果如图15中所示。在RARA蛋白水平与超级增强子的尺寸或细胞对RARA 激动剂的敏感性之间未观察到良好的相关性。这证实了另一小组此前的结果，该小组也证明了RARA蛋白表达与维甲酸的敏感性之间缺乏相关性(G Paroni 等，Oncogene,31:3431-43(2012)；参见参考文献中的图1C)。
V.来自TCGA的Z-评分。从癌症基因组学的cBio入口 (http://www.cbioportal.org/public-portal/)获得来自TCGA数据集的表达Z- 评分。
VI.MDS表达检测。从NCBI基因表达综合数据库(GSE58831)下载与 Gerstung等(PMID:25574665)相关的159名MDS患者和17名正常人的原始Affymetrix表达数据。在使用利用缺省参数的“justRMA”功能的R中将表达数据归一化以在所有样品之间产生归一化的探针水平值。使用Affymetrix 探针‘'203749_s_at’的值表示RARA mRNA水平。计算在17个正常样品中 RARA水平的平均值和标准偏差，然后将其用于产生RARA mRNAZ-评分。
实施例4：RARA基因拷贝数与对他米巴罗汀的敏感性的不相关性
为了排除对他米巴罗的敏感性是基于HER2基因拷贝数以及RARA和 HER2的扩增是共同依赖的(由G.Paroni等提出，如上所述)可能性，我们在两个典型乳腺癌细胞系——Au565和T47D中分析了RARA和HER2基因的拷贝数。根据生产厂商的说明，使用DNAMini Kit(Qiagen)提取 DNA。使用来自Affymetrix的人HD微阵列分析纯化的DNA。在统计环境R中使用来自Bioconductor的Aroma包处理数据，并使用基本R图形作图。如图16A-B所示，与RARA(方框2)相比Au565细胞系具有更高的HER2基因拷贝数(方框1)，但是在同样的他米巴罗汀应答性T47D细胞系中未观察到相同的结果。而且，RARA基因拷贝数在两个细胞系之间略有差异。这表明RARA基因拷贝数的扩增不依赖于HER2拷贝数以及其对RARA 激动剂的敏感性不依赖于HER2拷贝数。
实施例5：在其他癌症中鉴定与RARA相关的超级增强子
我们使用已知的RARA超级增强子结构域的位置探测其他患者癌症样品以确定是否此类癌症具有RARA超级增强子。我们在胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤患者样品中发现了与RARA相关的较大超级增强子，但是在结直肠癌样品中未发现(见图17)。这提示也可以在患有胶质母细胞瘤或神经母细胞瘤的患者中进行针对使用RARA激动剂治疗的患者分层。而且，对RARA mRNA 水平的Z-评分分析提示尽管有这些超级增强子的结果，但是某些患有结直肠癌的对象可以对RARA激动剂产生应答(见图30)。
实施例6：HCC1954乳腺癌细胞移植瘤对他米巴罗汀的敏感性
由Crown Biosciences(Beijing,China)在BALB/c免疫功能受损的裸小鼠中制备来源于乳腺癌细胞系(HCC1954)的移植瘤模型，简述如下。
使用在0.1ml PBS(1:1matrigel)中的HCC1954肿瘤细胞(5x 106)向体重为18-20g之间的6至8周龄BALB/c免疫功能受损的裸小鼠的右肋皮下注射用于形成肿瘤。当平均肿瘤尺寸达到100-200mm3之间的体积时，通过肿瘤体积将动物匹配到用于给药的治疗组中并开始给药。按照每日计划(QD, PO)在调整为pH 8的PBS(含1％DMSO)中口服施用他米巴罗汀，达21 天。在小鼠中的最终剂量为在10ml/kg体积中在高剂量组(n＝10)中为每日每kg 6mg和在低剂量组(n＝10)中为每日每kg 3mg。给予在溶剂组(n＝10) 中的小鼠相同的给药计划、体积和制剂，但是不含药物。通过卡尺测量每周两次测定肿瘤体积。
这些实验的结果表明在该模型中他米巴罗汀以剂量依赖的方式缩小肿瘤体积(图18)。通过使用Welch校正的t检验，对肿瘤体积的缩小在低剂量组中略低于统计学显著性(p＝0.0552)和在高剂量组中具有统计学显著性 (p＝0.0048)。在该移植瘤模型中的结果确证了在培养物中的HCC1945细胞对他米巴罗汀的敏感性。
实施例7：在乳腺癌中的RARA超级增强子强度顺序排序截止值
使用如实施例1中所述的H3K27Ac和ChIP-Seq分析了170个乳腺癌样品(患者样品和乳腺癌细胞系，包括HCC1954)的总体增强子/超级增强子性质。在各样品中，通过与在相同细胞中的其他增强子和超级增强子比较确定根据强度(根据检测H3K27Ac)的与RARA相关的增强子的顺序排序以及在顺序强度柱状图上作图确定顺序排序(图19)。在HCC1954中，确定了RARA 超级增强子是在该细胞中第204强的增强子(见图19)。根据该结果和HCC1954对他米巴罗汀的应答，我们设定潜在他米巴罗汀应答性乳腺癌患者 (在其肿瘤中具有RARA超级增强子)的顺序截止值为至少第200强。根据我们对来自人对象的48个原发性乳腺癌肿瘤细胞样品的分析确定，那些样品的55.3％具有在那些细胞中至少第200强的RARA超级增强子(图20A)。因此，我们将出现频率截止值设定为55.3％。还将相同的出现频率截止值作为当根据RARA mRNA检测结果鉴定对他米巴罗汀潜在的乳腺癌应答者时的 RARA mRNA出现频率截止值。
当根据亚型将原发性乳腺癌样品进一步细分时，使用相同RARA超级增强子顺序截止值200产生针对各亚型的不同出现频率截止值。这些出现频率截止值针对激素受体阳性乳腺癌为78.6％；针对HER2阳性乳腺癌为56.3％；以及针对三阴性乳腺癌为35.2％(图20B)。
实施例8：在乳腺癌PDX中的RARA mRNA水平与对他米巴罗汀应答的相关性
使用下述方案由Champions Oncology(Baltimore,Maryland)在免疫功能受损的雌性小鼠(Harlan；nu/nu裸鼠)中制备人乳腺癌Low Passage 模型。
将患者乳腺癌肿瘤样品(对于每个单独的患者样品和对照n＝3)植入储备小鼠，允许其生长至1-1.5cm3。然后从储备小鼠中收集肿瘤并将其碎块单侧再植入预研究小鼠(雌性；Harlan；nu/nu裸鼠，5-8周龄；对于每个单独的患者样品和对照n＝3)的左肋。当肿瘤达到约100-300mm3时，通过肿瘤体积将预研究动物匹配到用于给药的治疗组中并在第0天开始给药。按照每日计划在调整为pH 8的PBS(含1％DMSO)中口服施用他米巴罗汀，最终剂量为在10ml/kg体积中每kg体重6mg。给予在溶剂组中的小鼠相同的给药计划、体积和制剂，但是不含他米巴罗汀。
通过卡尺每周两次测定肿瘤体积。在给药最后一天进行最终肿瘤体积测量。图21A-B显示了这些PDX中的两个(CTG-1059(高RARA mRNA)和 CTG-0012(低RARA mRNA))对他米巴罗汀(“SY1425”)的应答。与仅给予溶剂的对照相比，使用他米巴罗汀治疗25天后，CTG-1059的肿瘤体积显示出具有统计学意义的显著降低。CTG-0012在他米巴罗汀与对照之间未显示出任何显著性差异。
使用如实施例3中所述的RNA-seq确定了在这些PDX中的这两个以及7 个其他乳腺癌PDX中的RARA mRNA水平。我们假定这9个PDX代表了 RARA mRNA水平具有正态分布的群体并使用基于RARASE强度顺序确定的出现频率截止值55.3％，他米巴罗汀应答性CTG-1059具有高于55.3％的 RARA mRNA水平出现频率值，而无应答性CTG-0012具有低于55.3％的RARA mRNA水平出现频率值(图22)。
实施例9：在AML中的RARA超级增强子强度顺序排序截止值
使用如实施例1中所述的H3K27Ac和ChIP-Seq分析了95个AML样品 (患者样品和AML细胞系，包括SigM5、MV411、HEL和Kasumi)的总体增强子/超级增强子性质。在各样品中，通过与在相同细胞中的其他增强子和超级增强子比较确定根据强度(根据检测H3K27Ac)的与RARA相关的增强子的顺序排序以及在顺序强度柱状图上作图确定顺序排序(图23A-C)。在 MV411中，确定了RARA超级增强子是第133强的增强子。MV411是已确证的具有最低超级增强子强度顺序的他米巴罗汀应答性细胞系。在HEL中，确定了与RARA相关的增强子是第155强的增强子。HEL是已确证的具有最高超级增强子强度顺序的对他米巴罗汀无应答的细胞系。根据这些值，我们将 RARA增强子强度顺序截止值设定为150，该值在HEL的顺序与MV411的顺序之间。
根据我们对来自人对象的70个原发性AML细胞样品的分析确定，那些样品的36％具有在那些细胞中至少第150强的RARA超级增强子(图24)。因此，我们将出现频率截止值设定为36％。还将相同的出现频率截止值作为当根据RARA mRNA检测结果鉴定对他米巴罗汀潜在的AML应答者时的 RARA mRNA出现频率截止值。
我们还通过RARA增强子与MALAT1增强子之比对AML细胞系扩展嵌板的增强子进行了定量。将该增强子强度比值对针对他米巴罗汀的敏感性作图，我们确证了RARA增强子强度比值大于1的6个细胞系中的5个是应答性的，而增强子低于该水平的7个细胞系中仅有4个是应答性的(图32)。当将截止值变为RARA/MALAT的比值为1.4或更高时，所有这些细胞系(4个中的4个)均是应答性的。
实施例10：在AML中的RARA超级增强子强度顺序排序截止值与RARA mRNA水平的相 关性
将用于确定RARA超级增强子强度顺序出现频率截止值为36％的AML 患者样品分成两组——出现频率排序为36％或更高的那些(即，较低％值) 和出现频率排序低于36％的那些(即，较高％值)——并使用如实施例3中所述的RNA-seq测定RARA mRNA水平。结果如图25中所示。与出现频率排序较低的组相比，在RARA超级增强子强度顺序中出现频率排序等于或高于36％的组具有在统计学上显著更高的RARA mRNA水平(p<0.001)。这再次证实了在超级增强子水平上确定的出现频率截止值也能够作为在mRNA水平上的出现频率截止值。
我们还使用RNA-seq确定了在11个不同的AML细胞系中的RARA mRNA水平并将mRNA水平与对他米巴罗汀的敏感性进行了比较。根据其对他米巴罗汀敏感或不敏感，将所测试的AML细胞系分成了两个不同的组。他米巴罗汀敏感性细胞系均具有根据RNAseq检测>10TPM的RARA mRNA，而三个不敏感的细胞系具有低于该截止值水平的水平(图33)。
实施例11：来源于多个AML患者样品的移植瘤对他米巴罗汀的敏感性
由Crown Biosciences(Beijing,China)在BALB/c免疫功能受损的裸小鼠中制备来源于AML患者样品(AM8096、AM5512、AM7577和AM7440)的移植瘤模型，简述如下。
将来自各患者样品的约2x 106个细胞重悬于100μL PBS中并通过尾IV 注射注入各小鼠(对于各不同的患者样品和对照n＝3)中。对于AM5512、 AM7577和AM7440移植瘤而言，当在动物外周血中人CD45+细胞的浓度达到～1-5％时，认为肿瘤负荷高至足以开始治疗。使用荧光活化细胞分选和FITC 抗-人CD45抗体(Biolegend,Cat#304037)检测小鼠血液(通过眼部取血获得)中的人CD45+细胞。对于AM8096移植瘤而言，在注射细胞后40天开始给药。
按照每日计划在调整为pH 8的PBS(含1％DMSO)中口服施用他米巴罗汀，最终剂量为在10ml/kg体积中每kg体重6mg。给予在溶剂组中的小鼠相同的给药计划、体积和制剂，但是不含他米巴罗汀。每周一次检测给药动物和对照动物外周血中的人CD45+细胞水平。
在给药后35天，当对给予他米巴罗汀与给予溶剂对照的动物进行比较时，AM5512和AM8096移植瘤总CD45+细胞％，以及在血液、骨髓和脾中的CD45+细胞％均显示出显著降低(图26A-F)。另一方面，AM7577和AM7440在给予他米巴罗汀和溶剂的动物之间在总体或在血液、骨髓或脾中的任意一个均未显示出对肿瘤体积的显著降低(图27A-D)。
图28显示了来自在图25中所示的分组分析中使用的各患者样品的 RARA mRNA水平的排序。此外，图28包括在移植瘤研究中使用的各患者样品的RARA mRNA水平。在移植瘤研究中的两个无应答者AM7577和AM7440 的RARA mRNA水平远低于出现频率截止值36％。应答者之一AM8096的 RARA mRNA水平高于出现频率截止值36％。另一应答者AM5512略低于出现频率截止值36％(出现频率值为46.9％)。这些RARA mRNA结果提示可以将出现频率截止值向下调整(例如，至46.9％)以便将潜在应答者的数量最大化。
实施例12：AM5512对他米巴罗汀而非ATRA敏感
如上文所述制备AM5512移植瘤小鼠。当在动物外周血中人CD45+细胞的浓度达到～1-5％时，使用他米巴罗汀(n＝7；3mg/kg，BID)、全反式维甲酸 (ATRA；n＝7；4mg/kg BID)或溶剂对照(n＝5)对其进行治疗。他米巴罗汀是RARA特异性激动剂，而ATRA激动所有的维甲酸受体(RAR-α、RAR-β和RAR-γ)。如图29A-B所示，在给药28天后，与溶剂对照和使用ATRA治疗的动物相比，使用他米巴罗汀治疗的AM5512移植瘤小鼠CD45+细胞％显著降低，在实验过程中7只动物中的5只存活。令人吃惊的是，尽管在给药 14天后，与溶剂对照相比，使用ATRA治疗的AM5512移植瘤小鼠CD45+细胞％显示出降低，但是在第21天后那些小鼠均未存活下来。
实施例13：患有具有较高水平RARA mRNA的其他癌症的患者样品子集
对于多种不同癌症类型，在正态分布的群体中，5％的样品应该具有高于平均值2个标准偏差的RARA mRNA水平。图30是显示RARA mRNA水平高于平均值2个标准偏差的样品大于5％的那些特定癌症类型的表格。不受理论的束缚，我们相信这些癌症中的每一种均将对本申请所述的分层和治疗方法敏感。
我们还特别关注了来自患有骨髓增生异常综合征患者的样品，后者被认为是与AML密切相关的癌症。如实施例3中所述获得了来自176名患者(17 个正常；159个MDS)的RARA mRNA水平。根据疾病状态和RARA mRNA 水平将样品分组，如图31中所示。对结果的统计分析(T-检验)表明与正常患者样品相比在MDS患者样品中RARA mRNA水平显著升高(p＝0.08751)。
为了进一步验证在MDS中存在RARA升高，在从两名MDS患者中采集的骨髓样品上进行ChIP-seq H3K27ac增强子分析。对于这两名患者而言，与在健康供体胚细胞中检测到的信号相比，在这两名MDS患者骨髓样品中 RARA基因座具有显著更强的H3K27ac信号。在MDS患者中RARA超级增强的强度与在来自具有较强RARA超级增强子和较高水平RARA mRNA的AML 患者子集的胚细胞中的强度接近。而且，与来自健康对象的胚细胞和未成熟细胞类型相比，在MDS患者细胞中的RARA超级增强子具有较高的RARA 增强子强度顺序(分别为9和60)。
不受理论的束缚，我们相信MDS患者将对本申请所述的分层和治疗方法敏感。
等同方案和范围
在权利要求书中，除非有相反的指示或另外根据上下文显而易见，否则诸如“一个(种)(a/an)”和“所述”的冠词可以意指一个(种)或多于一个(种)。除非有相反的指示或另外根据上下文显而易见，否则在一组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或说明在一个、多于一个、或所有组成员存在于、被用于给定的产品或方法中、或以其它方式与给定的产品或方法有关的情况下被认为是满足的。本发明包括其中该组中只有一个成员存在于、被用于给定的产品或方法中、或以其它方式与给定的产品或方法有关的实施方案。本发明包括其中多于一个、或所有的组成员存在于、被用于给定的产品或方法中、或以其它方式与给定的产品或方法有关的实施方案。
此外，本发明涵盖了其中来自所列权利要求中的一项或多项的一个或多个限制条件、要素、条项、以及描述性术语被引入到另一项权利要求中的所有变化、组合以及排列。举例来说，从属于另一项权利要求的任何权利要求可以被修改以包括从属于同一项基础权利要求的任何其它权利要求中所存在的一个或多个限制条件。在要素以清单形式，例如以马库什组形式呈现的情况下，还公开了所述要素的每一个子组，并且任何一个或多个要素可以从该组中被去除。应当了解的是，一般来说，在本发明或本发明的方面包含/被称为包含特定的要素和/或特征的情况下，本发明或本发明的各方面的某些实施方案由这些要素和/或特征组成、或基本上由这些要素和/或特征组成。为了简单起见，那些实施方案在本文没有被具体地这样阐述。还应当指出的是，术语“包含”和“含有”意图是开放性的并且容许包括另外的要素或步骤。在给出范围的情况下，端点被包括在内。此外，除非另外指明或另外根据上下文和本领域的普通技术人员的理解显而易见，否则被表示为范围的值可以在本发明的不同实施方案中采用所述范围内的任何具体值或子范围，除非上下文另外明确规定，否则直到所述范围的下限的单位的十分之一为止。
本申请参考了各种授权专利、公开的专利申请、期刊文章、以及其它出版物，它们全部均以引用的方式并入本文。如果在所并入的参考文献中的任一篇与本说明书之间存在矛盾，那么应当以本说明书为准。此外，本发明的落入现有技术内的任何具体实施方案可以明确地被排除在权利要求中的任一项或多项以外。由于这些实施方案被认为是本领域的普通技术人员已知的，因此它们可以被排除，即使所述排除没有在本文被明确阐述。本发明的任何具体实施方案可以由于任何原因被排除在任何权利要求以外，无论与现有技术的存在相关与否。
本领域技术人员仅仅使用常规的实验就将认识到或能够确定本文所述的具体实施方案的许多等同方案。本文所述的本发明的实施方案的范围不意图限于上述说明，而是如所附权利要求书中所述。本领域的普通技术人员将了解的是，可以对本说明作出各种变化和改动而不脱离本发明的精神或范围，如以下权利要求书中所限定。

Claims (23)

1.一种治疗患有癌症的人类对象的方法，其中已确定在所述对象中的癌细胞具有下述中的一种或多种：
a.与RARA基因相关的超级增强子，其中所述超级增强子具有等于或高于预先确定的阈值水平的强度、顺序排序(ordinal rank)或出现频率排序(prevalence rank)；或者
b.来自所述RARA基因的mRNA转录物水平，所述来自所述RARA基因的mRNA转录物水平等于或高于预先确定的阈值水平其中所述方法包括向所述对象施用RARA激动剂的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述RARA基因位于基因组构建(genome build)hg19中的chr17:38458152-38516681。
3.根据权利要求1所述的方法，其中通过使用ChIP-seq对H3K27Ac组蛋白修饰进行定量确定所述RARA超级增强子的强度。
4.根据权利要求1所述的方法，其中已确定在所述对象中的癌细胞具有下述中的一种或多种：
a.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有对应于出现频率排序的强度，所述出现频率排序等于或高于针对RARA基因超级增强子强度的预先确定的出现频率截止值；和/或
b.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有等于或高于预先确定的RARA基因强度截止值的强度；和/或
c.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有对应于出现频率排序的强度顺序，所述出现频率排序等于或高于预先确定的RARA基因强度顺序出现频率截止值；和/或
d.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有等于或高于预先确定的RARA基因强度顺序截止值的强度顺序；和/或
e.RARA mRNA水平，所述RARA mRNA水平等于或高于预先确定的mRNA水平截止值；和/或
f.RARA mRNA水平，所述RARA mRNA水平对应于出现频率排序，所述出现频率排序等于或高于预先确定的RARA mRNA出现频率截止值。
5.根据权利要求4所述的方法，其中从下述中确定任意所述预先确定的出现频率截止值：
a.从来自相同类型癌细胞的样品群体中RARA超级增强子强度的排序确定，其中已确定至少一个样品对所述RARA激动剂产生应答；和/或
b.从来自相同类型癌细胞的样品群体中RARA超级增强子强度顺序的排序确定，其中已确定至少一个样品对所述RARA激动剂产生应答；和/或
c.从来自相同类型癌细胞的样品群体中RARA mRNA水平的排序确定，其中已确定至少一个样品对所述RARA激动剂产生应答。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中所述RARA激动剂是他米巴罗汀。
7.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌或AML。
8.根据权利要求7所述的方法，其中针对乳腺癌的任意所述预先确定的出现频率截止值在50-60％之间。
9.根据权利要求7所述的方法，其中针对AML的任意所述预先确定的出现频率截止值在25-40％之间。
10.一种治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括下述步骤：
a.接收与下述中的一个或多个相关的信息：
i.在来自所述对象的所述癌细胞中与RARA基因相关的超级增强子的强度、顺序排序或出现频率排序；或者
ii.在来自所述对象的癌细胞中来自所述RARA基因的mRNA转录物的水平；以及
b.如果所述信息提示下述中的一个或多个，则向所述对象施用RARA激动剂：
i.所述超级增强子具有等于或高于预先确定的阈值水平的强度、顺序或出现频率排序；或者
ii.mRNA转录物的水平等于或高于预先确定的阈值水平。
11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤a.包括接收与下述中的一个或多个相关的信息：
i.与RARA基因相关的超级增强子的强度和/或在对应于所述强度的群体中RARA基因超级增强子强度的所述出现频率排序；和/或
ii.与所述细胞中的其他超级增强子比较的与RARA基因相关的超级增强子的所述强度的顺序排序和/或在对应于所述顺序排序的群体中RARA基因超级增强子强度的所述出现频率排序；和/或
iii.RARA mRNA水平和/或在对应于所述mRNA水平的群体中RARA mRNA水平的所述出现频率排序。
12.根据权利要求10所述的方法，其中步骤b.包括如果所述信息提示下述中的一个或多个，则向所述对象施用RARA激动剂：
i.与RARA基因相关的超级增强子的所述强度等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度的预先确定的截止值；和/或
ii.与RARA基因相关的超级增强子的所述强度对应于出现频率排序，其等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度的预先确定的出现频率截止值；和/或
iii.与RARA基因相关的超级增强子的所述强度的所述顺序排序等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度顺序的预先确定的顺序截止值；和/或
iv.超级增强子强度的所述顺序排序对应于出现频率排序，其等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度顺序的预先确定的出现频率截止值；和/或
v.所述RARA mRNA水平等于或高于对应于在群体中RARA mRNA水平的预先确定的截止值的RARA mRNA水平；和/或
vi.所述RARA mRNA水平对应于出现频率排序，所述出现频率排序等于或高于在群体中RARA mRNA水平的预先确定的出现频率截止值。
13.根据权利要求10-12中任意一项所述的方法，其中与所述RARA基因相关的所述超级增强子位于基因组构建hg19中的chr17:38458152-38516681。
14.根据权利要求10-12中任意一项所述的方法，其中通过使用ChIP-seq对H3K27Ac组蛋白修饰进行定量确定所述RARA超级增强子的强度。
15.根据权利要求10-12中任意一项所述的方法，其中所述RARA激动剂是他米巴罗汀。
16.根据权利要求10-12中任意一项所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌或AML。
17.根据权利要求16所述的方法，其中针对乳腺癌的任意所述预先确定的出现频率截止值在50-60％之间。
18.根据权利要求16所述的方法，其中针对AML的任意所述预先确定的出现频率截止值在25-40％之间。
19.一种预测RARA激动剂在癌症治疗中的效能的方法，所述方法包括确定是否所述癌症具有下述中的一个或多个特征的步骤：
a.与RARA基因相关的超级增强子，其中所述超级增强子具有等于或高于预先确定的阈值水平的强度、顺序排序或出现频率排序；或者
b.来自所述RARA基因的mRNA转录物的水平，所述来自所述RARA基因的mRNA转录物的水平等于或高于预先确定的阈值水平，
其中a.或b.的任意一个预测RARA激动剂在所述治疗中的效能。
20.根据权利要求19所述的方法，其中在对象中预测RARA激动剂在所述癌症治疗中的所述效能包括确定是否所述癌症具有下述中的一个或多个特征的步骤：
a.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度预先确定的截止值的强度；和/或
b.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有对应于出现频率排序的强度，所述出现频率排序等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度的预先确定的出现频率截止值；和/或
c.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度顺序的预先确定的截止值的所述强度的顺序排序；和/或
d.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有对应于出现频率排序的强度，所述出现频率排序等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度顺序的预先确定的出现频率截止值；和/或
e.RARA mRNA水平，所述RARA mRNA水平等于或高于在群体中mRNA水平的预先确定的截止值；和/或
f.RARA mRNA水平，所述RARA mRNA水平对应于出现频率排序，所述出现频率排序等于或高于在群体中RARA mRNA水平的预先确定的出现频率截止值，
其中a.、b.、c.、d.、e.或f.的任意一个预测RARA激动剂在所述治疗中的效能。
21.一种诊断、预测或治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括下述步骤：
a.从所述对象获得所述癌症的样品；
b.在所述样品中确定下述中的一个或多个：
i.在来自所述对象的癌细胞中与RARA基因相关的超级增强子的强度、顺序排序或出现频率排序；或
ii.在来自所述对象的癌细胞中来自所述RARA基因的mRNA转录物的水平；以及
c.如果满足下述中的一个或多个，则施用或推荐施用包含RARA激动剂的治疗组合物：
i.所述超级增强子具有等于或高于预先确定的阈值水平的强度、顺序排序或出现频率排序；或者
ii.所述mRNA转录物的水平等于或高于预先确定的阈值水平。
22.根据权利要求21所述的方法，其中步骤b.包括在所述样品中确定下述中的一个或多个：
i.与RARA基因相关的超级增强子的强度和/或在对应于所述强度的群体中与RARA基因相关的超级增强子强度的所述出现频率排序；和/或
ii.与所述细胞中的其他超级增强子比较的与RARA基因相关的超级增强子的所述强度的顺序排序和/或在对应于所述顺序排序的群体中与RARA基因相关的超级增强子所述强度的顺序排序的所述出现频率排序；和/或
iii.RARA mRNA初级转录物水平和/或在对应于所述mRNA水平的群体中RARA mRNA初级转录物的所述出现频率排序。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中步骤c.包括如果满足下述中的一个或多个则施用或推荐施用包含RARA激动剂的治疗组合物：
a.与RARA基因相关的超级增强子的强度等于或高于对应于在群体中RARA基因超级增强子强度的预先确定的截止值；和/或
b.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有对应于出现频率排序的强度，所述出现频率排序等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度的预先确定的出现频率截止值；和/或
c.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度的预先确定的截止值的强度的顺序排序；和/或
d.与RARA基因相关的超级增强子，所述与RARA基因相关的超级增强子具有对应于出现频率排序的强度的顺序排序，所述出现频率排序等于或高于在群体中RARA基因超级增强子强度顺序的预先确定的出现频率截止值；和/或
e.RARA mRNA水平等于或高于在群体中mRNA水平的预先确定的截止值；和/或
f.RARA mRNA水平，所述RARA mRNA水平对应于出现频率排序，所述出现频率排序等于或高于在群体中RARA mRNA水平预先确定的出现频率截止值。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109310657A (zh) * 2016-04-08 2019-02-05 赛罗斯制药有限公司 用于治疗aml和mds的rara激动剂
CN112390731A (zh) * 2020-11-16 2021-02-23 成都大学 一种具有多靶点的维甲酸类衍生物及其制备方法与应用
US11053552B2 (en) 2016-04-08 2021-07-06 Syros Pharmaceuticals, Inc. Methods of stratifying patients for treatment with retinoic acid receptor-α agonists
US11447831B2 (en) 2015-03-31 2022-09-20 Syros Pharmaceuticals, Inc. Methods of stratifying patients for treatment with retinoic acid receptor-alpha agonists

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2969031A4 (en) 2013-03-15 2017-03-08 Avisenna Cosmetics LLC Topical compositions for reducing aging effects
WO2018067946A1 (en) * 2016-10-06 2018-04-12 Syros Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating patients with a retinoic acid receptor-alpha agonist and an anti-cd38 antibody
WO2018136961A1 (en) * 2017-01-23 2018-07-26 Syros Pharmaceuticals Inc. METHODS OF TREATING PATIENTS WITH A RETINOIC ACID RECEPTOR-α AGONIST AND AN ANTI-CD38 ANTIBODY
JP2019043865A (ja) * 2017-08-31 2019-03-22 ひまわり製薬株式会社 ざ瘡様疾患を治療又は予防するための皮膚外用組成物
WO2020069187A1 (en) * 2018-09-28 2020-04-02 The Children's Medical Center Corporation Combination therapy for acute myeloid leukemia
US20230285339A1 (en) * 2020-08-06 2023-09-14 Syros Pharmaceuticals, Inc. Therapies for treating aml and uses of rara agonists, hypomethylating agents, and bcl-2 inhibitors

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102083312A (zh) * 2008-05-06 2011-06-01 葛兰素史密丝克莱恩有限责任公司 苯磺酰胺噻唑和噁唑化合物
WO2013185105A1 (en) * 2012-06-07 2013-12-12 Children's Hospital Los Angeles Methods for treating neutropenia using retinoid agonists
US20140051760A1 (en) * 2010-02-11 2014-02-20 Universite De Montreal Hybrid Molecule Having Mixed Retinoic Acid Receptor Agonism and Histone Deacetylase Inhibitory Properties

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0170105B1 (en) 1984-07-07 1990-10-17 Koichi Prof. Dr. Shudo Benzoic acid derivatives
US5089509A (en) 1988-09-15 1992-02-18 Allergan, Inc. Disubstituted acetylenes bearing heteroaromatic and heterobicyclic groups having retinoid like activity
JP2752630B2 (ja) 1988-03-29 1998-05-18 大鵬薬品工業株式会社 新規安息香酸誘導体及びその製造方法
AU1666192A (en) 1991-03-22 1992-10-21 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Methods for detection and treatment of cancer
US5759785A (en) 1992-05-14 1998-06-02 Baylor College Of Medicine Method of identifying hormone antagonists and agonists
US5455265A (en) 1993-02-11 1995-10-03 Allergan, Inc. Method of treatment with compounds having selective agonist-like activity on RXR retinoid receptors
US5824685A (en) 1995-02-01 1998-10-20 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method of preventing proliferation of retinal pigment epithelium by retinoic acid receptor agonists
FR2739777B1 (fr) 1995-10-11 1997-11-14 Cird Galderma Ligand antagoniste rar-gamma ou agoniste rar-alpha en tant qu'inhibiteur d'apoptose
US5675024A (en) 1995-11-22 1997-10-07 Allergan Aryl or heteroaryl amides of tetrahydronaphthalene, chroman, thiochroman and 1,2,3,4,-tetrahydroquinoline carboxylic acids, having an electron withdrawing substituent in the aromatic or heteroaromatic moiety, having retinoid-like biological activity
US5965606A (en) 1995-12-29 1999-10-12 Allergan Sales, Inc. Methods of treatment with compounds having RAR.sub.α receptor specific or selective activity
HUP9902645A3 (en) 1996-03-18 1999-12-28 Eisai Co Ltd Fused-ring carboxylic acid derivatives
US6329179B1 (en) 1996-03-26 2001-12-11 Oncomedx, Inc. Method enabling use of extracellular RNA extracted from plasma or serum to detect, monitor or evaluate cancer
US5919970A (en) 1997-04-24 1999-07-06 Allergan Sales, Inc. Substituted diaryl or diheteroaryl methanes, ethers and amines having retinoid agonist, antagonist or inverse agonist type biological activity
CA2307613A1 (en) 1997-10-22 1999-04-29 Eisai Co., Ltd. Retinoic acid agonist as a prophylactic and therapeutic agent for nephritis
WO2000040749A2 (en) 1999-01-06 2000-07-13 Genenews Inc. Method for the detection of gene transcripts in blood and uses thereof
TWI281911B (en) 2000-04-04 2007-06-01 Allergan Inc Treatment of tumors with RARalpha selective retinoid compounds in combination with other anti-tumor agents
AU2002328226A1 (en) * 2001-09-17 2003-04-01 Angiogene Inc. Modulation of retinoic acid receptor gene expression and therapeutic uses thereof
WO2007108272A1 (ja) 2006-03-23 2007-09-27 Tmrc Co., Ltd. 癌治療用キットおよび癌治療用医薬組成物
US8768629B2 (en) 2009-02-11 2014-07-01 Caris Mpi, Inc. Molecular profiling of tumors
WO2008120711A1 (ja) 2007-03-30 2008-10-09 Tmrc Co., Ltd. タミバロテンカプセル剤
US20100099084A1 (en) 2008-10-17 2010-04-22 Maher Albitar Detection of npm1 nucleic acid in acellular body fluids
US20140296218A1 (en) 2012-10-25 2014-10-02 Whitehead Institute For Biomedical Research Super-enhancers and methods of use thereof
WO2014066848A1 (en) 2012-10-25 2014-05-01 Whitehead Institute For Biomedical Research Super-enhancers and methods of use thereof
CA2902167A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Abbott Molecular Inc. Method for amplification and assay of rna fusion gene variants, method of distinguishing same and related primers, probes, and kits
AU2014290186A1 (en) 2013-07-15 2016-02-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Medical uses of CD38 agonists
EA201691144A1 (ru) 2013-12-06 2016-11-30 Селджин Корпорейшн Способы определения эффективности лекарственного средства для лечения диффузной крупноклеточной b-клеточной лимфомы, множественной миеломы и злокачественных новообразований миелоидного ростка
US11077139B2 (en) 2013-12-30 2021-08-03 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Combination of an arsenic compound and at least one retinoid for treating acute myeloid leukemia
EP3267969A1 (en) 2015-03-09 2018-01-17 King's College London Combination therapy with rar alpha agonists for enhancing th1 response
BR122023024813A2 (pt) 2015-03-31 2024-02-20 Syros Pharmaceuticals, Inc. Uso de tamibaroteno ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou de uma composição farmacêutica embalada compreendendo o mesmo, e, composição farmacêutica embalada compreendendo tamibaroteno ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo
EP4098257A1 (en) 2015-11-25 2022-12-07 IO Therapeutics, Inc. Use of cyp26-resistant rar alpha selective agonists in the treatment of cancer
IL262156B2 (en) 2016-04-08 2024-03-01 Syros Pharmaceuticals Inc RARA agonists for the treatment of AML and MDS
US9868994B2 (en) 2016-04-08 2018-01-16 Syros Pharmaceuticals, Inc. Methods of stratifying patients for treatment with retinoic acid receptor-α agonists
WO2018067946A1 (en) 2016-10-06 2018-04-12 Syros Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating patients with a retinoic acid receptor-alpha agonist and an anti-cd38 antibody
WO2018136961A1 (en) 2017-01-23 2018-07-26 Syros Pharmaceuticals Inc. METHODS OF TREATING PATIENTS WITH A RETINOIC ACID RECEPTOR-α AGONIST AND AN ANTI-CD38 ANTIBODY

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102083312A (zh) * 2008-05-06 2011-06-01 葛兰素史密丝克莱恩有限责任公司 苯磺酰胺噻唑和噁唑化合物
US20140051760A1 (en) * 2010-02-11 2014-02-20 Universite De Montreal Hybrid Molecule Having Mixed Retinoic Acid Receptor Agonism and Histone Deacetylase Inhibitory Properties
WO2013185105A1 (en) * 2012-06-07 2013-12-12 Children's Hospital Los Angeles Methods for treating neutropenia using retinoid agonists

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAO YUAN，ET.AL.: ""A112, a tamibarotene dimethylaminoethyl ester, may inhibit human leukemia cell growth more potently than tamibarotene"", 《LEUKEMIA & LYMPHOMA》 *
K A ROBERTSON,ET.AL.: "Retinoic acid receptors in myeloid leukemia_ characterization of receptors in retinoic acid-resistant K-562 cells", 《BLOOD》 *
RICHARD F. SCHLENK,ET.AL.: "Gene mutations and response to treatment with all-trans retinoic acid in elderly patients with acute myeloid leukemia. Results from the AMLSG Trial AML HD98B", 《HAEMATOLOGICA》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11447831B2 (en) 2015-03-31 2022-09-20 Syros Pharmaceuticals, Inc. Methods of stratifying patients for treatment with retinoic acid receptor-alpha agonists
CN109310657A (zh) * 2016-04-08 2019-02-05 赛罗斯制药有限公司 用于治疗aml和mds的rara激动剂
US11053552B2 (en) 2016-04-08 2021-07-06 Syros Pharmaceuticals, Inc. Methods of stratifying patients for treatment with retinoic acid receptor-α agonists
CN109310657B (zh) * 2016-04-08 2022-12-13 赛罗斯制药有限公司 用于治疗aml和mds的rara激动剂
CN115737821A (zh) * 2016-04-08 2023-03-07 赛罗斯制药有限公司 用于治疗aml和mds的rara激动剂
CN115737821B (zh) * 2016-04-08 2024-04-12 赛罗斯制药有限公司 用于治疗aml和mds的rara激动剂
CN112390731A (zh) * 2020-11-16 2021-02-23 成都大学 一种具有多靶点的维甲酸类衍生物及其制备方法与应用

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