JP2018514517A - レチノイン酸受容体−αアゴニストによる処置のための患者を層別化する方法 - Google Patents

レチノイン酸受容体−αアゴニストによる処置のための患者を層別化する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＲＡＲＡアゴニストに対して感受性である細胞集団を定義し、ＲＡＲＡアゴニストによる処置が有益である患者サブグループを同定する方法を提供する。本発明は、ＲＡＲＡアゴニストを含む包装された医薬組成物、および、そのようなアゴニストが処置における使用に適するかどうかを決定するための指示も提供する。本発明の種々の実施形態、態様および代替は、いずれの細胞集団がレチノイン酸受容体アルファ（「ＲＡＲＡ」）のアゴニストに対して感受性であるかを定義すること、ＲＡＲＡアゴニストを用いた処置が有益になる患者サブグループを同定すること（例えば、ＲＡＲＡアゴニストを用いた処置のために患者を層別化すること；ＲＡＲＡアゴニストレスポンダーを非レスポンダーから分離すること）、およびそのような患者サブグループに向けた処置療法を提供することに関する問題を解決する。

Description

レチノイドは、天然化合物および合成化合物を含む、ビタミンＡと構造的に関連する化合物のクラスである。いくつかの一連のレチノイドが、皮膚科疾患および腫瘍性疾患の処置において臨床的に有用であることが見出されている。レチノイン酸およびその他の天然に存在するレチノイド類似体（９−シスレチノイン酸、オールトランス３，４−ジデヒドロレチノイン酸、４−オキソレチノイン酸およびレチノール）は、多種多様な炎症性の免疫細胞および構造細胞の構造および機能をモジュレートする多面的な調節化合物である。これらは、肺における上皮細胞の増殖、分化および形態形成の重要な調節因子である。レチノイドは、ステロイド／甲状腺受容体スーパーファミリーに属するリガンド誘導性転写因子である一連のホルモン核受容体を通じて、それらの生物学的効果を発揮する。
レチノイド受容体は、２つのファミリー、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）およびレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）に分類され、これらはそれぞれ、３つの別個の亜型（α、β、およびγ）からなる。ＲＡＲ遺伝子ファミリーの各亜型は、２種の一次ＲＮＡ転写産物の差次的スプライシングから生じる様々な数のアイソフォームをコードする。オールトランスレチノイン酸は、レチノイン酸受容体に対する生理的ホルモンであり、３種のＲＡＲ亜型の全てにほぼ等しい親和性で結合するが、９−シスレチノイン酸を天然のリガンドとするＲＸＲ受容体には結合しない。レチノイドには抗炎症効果があり、上皮細胞分化の進行を変更させ、また、間質細胞マトリックス産生を阻害する。これらの性質により、乾癬、ざ瘡、および肥大性皮膚瘢痕などの皮膚科障害に対する局所的レチノイド治療薬および全身性レチノイド治療薬の開発がもたらされている。他の適用として、急性前骨髄球性白血病、腺癌および扁平上皮細胞癌、ならびに肝線維症の制御が挙げられる。
天然に存在するレチノイドであるオールトランスレチノイン酸および９−シスレチノイン酸で観察される相対的毒性から、レチノイドの治療的使用における限定が生じている。これらの天然のリガンドは、ＲＡＲ亜型に関して非選択的であり、したがって、多くの場合に毒性である多面的な影響を全身に及ぼす。
種々のレチノイドが、ＲＡＲ受容体もしくはＲＸＲ受容体と、またはクラス内の特定の亜型（α、β、γ）と選択的にまたは特異的に相互作用することが記載されている。ＲＡＲＡ特異的アゴニストは、がんの処置に関して高い見込みを保持しており、多くがヒト臨床試験に入っている。しかし、がんの処置に関して承認されているのは、ＲＡＲＡ特異的アゴニストであるタミバロテン１種のみである。さらに、タミバロテンは、米国およびヨーロッパにおける試験にもかかわらず、日本でのみ、急性前骨髄球性白血病の処置に関してのみ、承認されている。がんにおけるＲＡＲＡアゴニストの理論的有効性と、そのような薬剤に対する規制当局の承認の不足とのずれから、そのようなアゴニストがなぜヒトにおいて有効かつ安全でないのかという疑問が生じる。したがって、なぜＲＡＲＡアゴニストがそれらの治療的潜在性に見合わないのかをよりよく理解する必要がある。
ゲノム技術における最近の進歩および遺伝子調節回路の理解により、スーパーエンハンサーの発見がもたらされた。所与の組織またはがんの型における多くの遺伝子は、遺伝子コード領域の近傍にエンハンサーが存在することによって調節され得るが、これらのうちの少数は、他の活性な遺伝子の全てと比較して高度に非対称かつ不均衡に大きな転写マークおよび機構の負荷を示す。最近の発見により、そのようなエンハンサーは、それらを有する細胞の機能および生存と特別な関連性がある遺伝子に紐づけされていることが示唆される。そのように、スーパーエンハンサーと遺伝子の関連により、その細胞の生存のための前記遺伝子の相対的重要性が示される。これらの知見は、種々の療法の有効性の予測において有用であり得る。
本開示は、閾値と等しいまたはそれを上回る、ＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度もしくは順位ランク（ｏｒｄｉｎａｌ ｒａｎｋ）、またはＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルのうちの１つまたは複数を検出するための技術を提供する。本開示は、閾値と等しいまたはそれを上回る、ＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度もしくは順位ランクまたはＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルのうちの１つまたは複数を含有する細胞（例えば、がん細胞またはＭＤＳに罹患している被験体由来の細胞、例えば、ＡＭＬ細胞、ＭＤＳ細胞、乳がん（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）細胞）は、そのような閾値を下回る細胞よりも、ＲＡＲＡアゴニスト（例えば、機能獲得型のＲＡＲＡアゴニスト；またはＲＡＲＡ特異的アゴニスト（例えば、ＲＡＲ−αに対する特異性が、ＲＡＲ−βまたはＲＡＲ−γのいずれかに対する特異性の少なくとも１０×、１００×、１０００×、１００００×またはそれ超であるアゴニスト））の抗がん効果に対する感受性が高いことを実証するものである。
本発明の種々の実施形態、態様および代替は、いずれの細胞集団がレチノイン酸受容体アルファ（「ＲＡＲＡ」）のアゴニストに対して感受性であるかを定義すること、ＲＡＲＡアゴニストを用いた処置が有益になる患者サブグループを同定すること（例えば、ＲＡＲＡアゴニストを用いた処置のために患者を層別化すること；ＲＡＲＡアゴニストレスポンダーを非レスポンダーから分離すること）、およびそのような患者サブグループに向けた処置療法を提供することに関する問題を解決する。この解決は、少なくとも一部において、ある特定のがん細胞において、閾値と等しいまたはそれを上回る強度または順位ランクを有し、レチノイン酸受容体アルファ（「ＲＡＲＡ」）をコードする遺伝子と関連するスーパーエンハンサーにより、そのような細胞が、ＲＡＲＡアゴニストを用いた処置に応答することが示されるという本発明者らの発見に基づく。本発明者らはまた、ある特定のがん細胞における、閾値レベルと等しいまたはそれを上回る、ＲＡＲＡ一次ＲＮＡ転写レベル、特にｍＲＮＡレベルによっても、そのようながん細胞がＲＡＲＡアゴニストを用いた処置に応答することが示されることも発見した。どちらの場合でも、これらのパラメータに関連する閾値は、ＲＡＲＡタンパク質レベルよりも有意に予測的なものであるようである。
第１の実施形態では、本発明は、がんに罹患している被験体を処置する方法であって、該被験体におけるがん細胞が、
ａ．所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回る強度または順位ランクを有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；または
ｂ．所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回る、該ＲＡＲＡ遺伝子および／またはそれに関連するスーパーエンハンサーの一部からの一次ＲＮＡ転写産物のレベル
のうちの１つまたは複数を有することが決定されており、
該被験体に、ＲＡＲＡのアゴニストを投与するステップを含む、方法に関する。
第１の実施形態の一部の態様では、スーパーエンハンサーが、所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回る強度もしくは順位ランク；または所定の閾値レベルと等しいもしくはそれを上回る一次ＲＮＡ転写産物のレベルを有する場合にのみ、ＲＡＲＡのアゴニストを投与する。
第１の実施形態の一部の態様では、被験体におけるがん細胞が、
ａ．ＲＡＲＡ遺伝子に関連するエンハンサーまたはスーパーエンハンサーであって、所定の閾値レベルを下回る強度または順位ランクを有するエンハンサーまたはスーパーエンハンサー；または
ｂ．所定の閾値レベルを下回る、ＲＡＲＡ遺伝子および／またはそれに関連するスーパーエンハンサーの一部（ｐｏｒｔｉｏｎ）からの一次ＲＮＡ転写産物のレベル
を有すると決定された場合、
方法は、被験体にＲＡＲＡのアゴニスト以外の治療薬を投与するステップを含む。
第１の実施形態の一部の態様では、被験体におけるがん細胞は、ＣｈＩＰ−ｓｅｑによって測定して、ＭＡＬＡＴ１に関連するスーパーエンハンサーの一部であって、ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ ｈｇ１９におけるｃｈｒ１１：６５２６３７２４−６５２６６７２４に位置するスーパーエンハンサーの一部よりも少なくとも１．７５倍強力である、または別の参照エンハンサーまたはスーパーエンハンサー遺伝子座よりも、少なくとも同等量強力である、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーを有すると決定されている。
第１の実施形態の他の態様では、被験体におけるがん細胞が、ａ．またはｂ．のいずれかに合致すると決定された場合、方法は、被験体に、ＲＡＲＡのアゴニスト以外の治療（例えば、治療剤または標準治療）、例えば、化学療法剤または移植を施すステップを含む。一部の実施形態では、被験体は、がん、例えば、白血病（例えば、急性骨髄性白血病）を有する。例示的な治療薬としては、化学療法剤（例えば、シタラビン、ゲムシタビン、アザシチジン、デシタビン、フルオロウラシル、もしくはアントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、もしくはイダルビシン））または移植（例えば、幹細胞移植）が挙げられる。
第１の実施形態の代替的態様では、被験体におけるがん細胞は、以下のうちの１つを有すると決定されている：
ａ．強度が、ＲＡＲＡアゴニストに対して非応答性であることが公知であるヒト細胞もしくはヒト細胞株における、ＲＡＲＡ遺伝子に関連する対応するエンハンサーより少なくとも１．５倍高い、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
ｂ．ＲＡＲＡアゴニストに対して非応答性であることが公知であるヒト細胞またはヒト細胞株における対応するＲＡＲＡ ＲＮＡ一次転写産物レベルより少なくとも１．５倍高い、ＲＡＲＡ ＲＮＡ一次転写産物レベル。
第１の実施形態の他の代替的態様では、前記被験体におけるがん細胞は、以下：
ａ．ＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度についての所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応する強度を有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
ｂ．所定のＲＡＲＡ遺伝子強度カットオフと等しいまたはそれを上回る強度を有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
ｃ．所定のＲＡＲＡ遺伝子強度順位分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応する、強度の順位を有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
ｄ．所定のＲＡＲＡ遺伝子強度順位カットオフと等しいまたはそれを上回る強度の順位を有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
ｅ．所定のｍＲＮＡレベルカットオフと等しいまたはそれを上回るＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベル；および／または
ｆ．所定のＲＡＲＡ ｍＲＮＡ分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応するＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベル
の１つを有することが決定されている。
特定のより具体的な態様では、上記に記載の前記所定の分布カットオフのいずれかは、
ａ．同じ型のがん細胞に由来する試料の集団におけるＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度のランク付けであって、少なくとも１つの試料がＲＡＲＡアゴニストに対して応答性であることが決定されている、ランク付け；および／または
ｂ．同じ型のがん細胞に由来する試料の集団におけるＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位のランク付けであって、少なくとも１つの試料が該ＲＡＲＡアゴニストに対して応答性であることが決定されている、ランク付け；および／または
ｃ．同じ型のがん細胞の試料の集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルのランク付けであって、少なくとも１つの試料が該ＲＡＲＡアゴニストに対して応答性であることが決定されている、ランク付け
から決定される。
第２の実施形態では、本発明は、がんに罹患している被験体を処置する方法であって、
ａ．
ｉ．該被験体由来のがん細胞における、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの強度、順位ランク、もしくは分布ランク；または
ｉｉ．該被験体由来のがん細胞における該ＲＡＲＡ遺伝子および／またはそれに関連するスーパーエンハンサーの一部からの一次ＲＮＡ転写産物のレベル
のうちの１つまたは複数に関連する情報を受け取るステップ；および
ｂ．該情報が、
ｉ．該スーパーエンハンサーが、所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回る強度、順位ランク、または分布ランクを有すること；または
ｉｉ．該ＲＮＡ転写産物のレベルが所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回ること
のうちの１つまたは複数を示す場合、該被験体にＲＡＲＡのアゴニストを投与するステップ
を含む方法を提供する。
第２の実施形態の一態様では、情報が、
ｉｉｉ．スーパーエンハンサーが、所定の閾値レベルを下回る強度、順位ランク、または分布ランク（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｒａｎｋ）を有すること；または
ｉｖ．ＲＮＡ転写産物のレベルが所定の閾値レベルを下回ること
を示す場合、被験体にＲＡＲＡのアゴニスト以外の治療薬を投与する。
第２の実施形態の一態様では、ステップａ．は、
ｉ．同じがんにおける対照エンハンサーもしくはスーパーエンハンサーと比較した、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの強度；および／または
ｉｉ．ＲＡＲＡアゴニストに対して非応答性であることが公知であるヒト細胞またはヒト細胞株における、対応するＲＡＲＡ ＲＮＡ一次転写産物レベルと比較した、ＲＡＲＡ ＲＮＡ一次転写産物レベルのレベル
のうちの１つまたは複数に関連する情報を受け取るステップを含む。
第２の実施形態の一態様では、ステップｂは、情報が、
ｉ．ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーが、ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ ｈｇ１９におけるｃｈｒ１１：６５２６３７２４−６５２６６７２４に位置する、ＭＡＬＡＴ１に関連するスーパーエンハンサーの一部よりも少なくとも１．７５倍強力である、または別の参照エンハンサーもしくはスーパーエンハンサー遺伝子座よりも、少なくとも同等量強力であること；および／または
ｉｉ．ＲＡＲＡアゴニストに対して非応答性であることが公知であるヒト細胞またはヒト細胞株における、対応するＲＡＲＡ ＲＮＡ一次転写産物レベルより少なくとも１．５倍高いＲＡＲＡ ＲＮＡ一次転写産物レベル
のうちの１つまたは複数を示す場合、被験体にＲＡＲＡのアゴニストを投与するステップを含む。
第２の実施形態の代替的な態様では、ステップａ．は、
ｉ．ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの強度および／もしくは該強度が対応する集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度の分布ランク；ならびに／または
ｉｉ．前記細胞における他のスーパーエンハンサーと比較した、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの該強度の順位ランクおよび／または該順位ランクが対応する集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度順位の分布ランク；ならびに／または
ｉｉｉ．ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルおよび／または該ｍＲＮＡレベルが対応する集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの分布ランク
のうちの１つまたは複数に関連する情報を受け取るステップを含み、
ステップｂ．は、前記情報が、
ｉ．ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの前記強度が、集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度の所定のカットオフ値と等しいまたはそれを上回ること；および／または
ｉｉ．ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの前記強度が、集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度の所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応すること；および／または
ｉｉｉ．ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの前記強度の順位ランクが、集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度順位の所定の順位カットオフ値と等しいまたはそれを上回ること；および／または
ｉｖ．スーパーエンハンサーの強度の順位ランクが、集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度順位の所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応すること；および／または
ｖ．ＲＡＲＡ ｍＲＮＡのレベルが、集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの所定のカットオフ値に対応するＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルと等しいまたはそれを上回ること；および／または
ｖｉ．該ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルが、集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応すること
のうちの１つまたは複数を示す場合に、前記被験体にＲＡＲＡのアゴニストを投与するステップを含む。
第３の実施形態では、本発明は、
ａ．ＲＡＲＡアゴニスト；および
ｂ．がんに罹患している被験体であって、該被験体のがん細胞が、
ｉ．所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回る強度、順位ランクまたは分布ランクを有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；または
ｉｉ．所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回る、ＲＡＲＡ遺伝子および／またはそれに関連するスーパーエンハンサーの一部からの一次ＲＮＡ転写産物のレベル
のうちの１つまたは複数を有することが決定されている被験体におけるＲＡＲＡアゴニストを使用するための指示（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を含む折込み書面またはラベル
を含む、包装された医薬組成物を提供する。
第３の実施形態の一部の態様では、折込み書面またはラベルは、そのがん細胞が、
ｉ．ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ ｈｇ１９におけるｃｈｒ１１：６５２６３７２４−６５２６６７２４に位置する、ＭＡＬＡＴ１に関連するスーパーエンハンサーの一部よりも少なくとも１．７５倍強力である、または別の参照エンハンサーもしくはスーパーエンハンサー遺伝子座よりも、少なくとも同等量強力であるＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
ｉｉ．ＲＡＲＡアゴニストに対して非応答性であることが公知であるヒト細胞またはヒト細胞株における、対応するＲＡＲＡ ＲＮＡ一次転写産物レベルより少なくとも１．５倍高いＲＡＲＡ ＲＮＡ一次転写産物レベル
のうちの１つまたは複数を有すると決定された被験体においてＲＡＲＡアゴニストを使用する指示を含む。
第３の実施形態の一部の態様では、折込み書面またはラベルは、該がんが、
ｉ．集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度の所定のカットオフ値と等しいまたはそれを上回る強度を有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
ｉｉ．集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度の所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応する強度を有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
ｉｉｉ．集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度順位の所定のカットオフ値と等しいまたはそれを上回る強度の順位ランクを有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
ｉｖ．集団における所定のＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度順位分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応する強度の順位ランクを有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
ｖ．集団における所定のＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルカットオフ値と等しいまたはそれを上回るＲＡＲＡ ｍＲＮＡのレベル；および／または
ｖｉ．集団における所定のＲＡＲＡ ｍＲＮＡ分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応するＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベル
のうちの１つまたは複数を有すると決定された被験体においてＲＡＲＡアゴニストを使用する指示を含む。
第４の実施形態では、本発明は、被験体におけるがんの処置におけるＲＡＲＡアゴニストの有効性を予測する方法であって、
ａ．該がんにおけるＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーが、所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回る強度、順位ランク、または分布ランクを有する；または
ｂ．該ＲＡＲＡ遺伝子からおよび／またはそれに関連するスーパーエンハンサーの一部の一次ＲＮＡ転写産物のレベルが、所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回る、
かどうかを決定する、かどうかが決定されている、またはその情報を受け取るステップを含み、
ａ．またはｂ．のいずれかにより、該処置におけるＲＡＲＡアゴニストの有効性が予測される、方法を提供する。
第４の実施形態の一部の態様では、被験体におけるがんの処置におけるＲＡＲＡアゴニストの有効性を予測することは、該がんが、
ａ．ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーが、ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ ｈｇ１９におけるｃｈｒ１１：６５２６３７２４−６５２６６７２４に位置する、ＭＡＬＡＴ１に関連するスーパーエンハンサーの一部よりも少なくとも１．７５倍強力である、または別の参照エンハンサーもしくはスーパーエンハンサー遺伝子座よりも、少なくとも同等量強力であること；および／または
ｂ．ＲＡＲＡアゴニストに対して非応答性であることが公知であるヒト細胞またはヒト細胞株における、対応するＲＡＲＡ ＲＮＡ一次転写産物レベルより少なくとも１．５倍高いＲＡＲＡ ＲＮＡ一次転写産物レベル
のうちの１つまたは複数によって特徴付けられるかどうかを決定するステップを含み、
ａ．またはｂ．のいずれかにより、該処置におけるＲＡＲＡアゴニストの有効性が予測される。
第４の実施形態の一部の態様では、被験体における前記がんの前記処置におけるＲＡＲＡアゴニストの有効性を予測するステップは、該がんが、
ａ．集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度の所定のカットオフ値と等しいまたはそれを上回る強度を有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
ｂ．集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度の所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応する強度を有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
ｃ．集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度順位の所定のカットオフ値と等しいまたはそれを上回る強度の順位ランクを有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
ｄ．集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度順位の所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応する強度の順位ランクを有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
ｅ．集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの所定のカットオフ値と等しいまたはそれを上回るＲＡＲＡ ｍＲＮＡのレベル；および／または
ｆ．集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応するＲＡＲＡ ｍＲＮＡのレベル
のうちの１つまたは複数を特徴とするかどうかを決定するステップを含む。
第５の実施形態では、本発明は、がんに罹患している被験体を診断、予後判定、または処置する方法であって、
ａ．該被験体からがん細胞の試料を得るステップ；
ｂ．該試料において、
ｉ．該試料における、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの強度、順位ランク、もしくは分布ランク；または
ｉｉ．該試料における該ＲＡＲＡ遺伝子および／またはそれに関連するスーパーエンハンサーの一部からの一次ＲＮＡ転写産物のレベル
のうちの１つまたは複数を決定するか、決定されている、またはそれについての情報を受け取るステップ；および
ｃ．
ｉ．該スーパーエンハンサーが、所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回る強度、順位ランク、または分布ランクを有するか；または
ｉｉ．該一次ＲＮＡ転写産物のレベルが所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回るか
のうちの１つまたは複数である場合に、ＲＡＲＡアゴニストを含む治療用組成物を投与するステップ
を含む方法を提供する。
第５の実施形態の一態様では、ステップｂ．は、
ｉ．同じがんにおける対照エンハンサーもしくはスーパーエンハンサーと比較した、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの強度；および／または
ｉｉ．ＲＡＲＡアゴニストに対して非応答性であることが公知であるヒト細胞またはヒト細胞株における、対応するＲＡＲＡ ＲＮＡ一次転写産物レベルと比較した、ＲＡＲＡ ＲＮＡ一次転写産物レベルのレベル
のうちの１つまたは複数を該試料において決定するステップを含む。
第５の実施形態の別の態様では、ステップｃ．は、
ｉ．ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーが、ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ ｈｇ１９におけるｃｈｒ１１：６５２６３７２４−６５２６６７２４に位置する、ＭＡＬＡＴ１に関連するスーパーエンハンサーの一部よりも少なくとも１．７５倍強力である、または別の参照エンハンサーもしくはスーパーエンハンサー遺伝子座よりも、少なくとも同等量強力である；
ｉｉ．ＲＡＲＡアゴニストに対して非応答性であることが公知であるヒト細胞またはヒト細胞株における、対応するＲＡＲＡ ＲＮＡ一次転写産物レベルより少なくとも１．５倍高いＲＡＲＡ ＲＮＡ一次転写産物レベル；および／または
ｉｉｉ．該ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルが、ＲＡＲＡアゴニストに対して非応答性であることが公知であるヒト細胞またはヒト細胞株における該ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルより少なくとも１．５倍高い
のうちの１つまたは複数の場合、ＲＡＲＡアゴニストを含む治療組成物を投与するかまたはその投与を推奨するステップを含む。
第５の実施形態の別の態様では、ステップｂ．は、前記試料において、
ｉ．ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの強度、および／または該強度が対応する集団におけるＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの強度の分布ランク；ならびに／または
ｉｉ．前記細胞における他のスーパーエンハンサーと比較した、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの前記強度の順位ランク、および／もしくは該順位ランクが対応する集団におけるＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの該強度の該順位ランクの分布ランク；ならびに／または
ｉｉｉ．ＲＡＲＡ ｍＲＮＡ一次転写産物レベル、および／もしくはｍＲＮＡレベルが対応する集団における該ＲＡＲＡ ｍＲＮＡ一次転写産物の分布ランク
のうちの１つまたは複数を決定するステップを含む。
第５の実施形態の別の態様では、
ａ．ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーが、集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度の所定のカットオフ値と等しいまたはそれを上回る強度を有すること；および／または
ｂ．集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度の所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応する強度を有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
ｃ．集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度順位の所定のカットオフ値と等しいまたはそれを上回る強度の順位ランクを有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
ｄ．集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度順位の所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応する強度の順位ランクを有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
ｅ．ＲＡＲＡ ｍＲＮＡのレベルが、集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの所定のカットオフ値と等しいまたはそれを上回ること；および／または
ｆ．集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る、分布ランクに対応するＲＡＲＡ ｍＲＮＡのレベル
のうちの１つまたは複数である場合に、ステップｃ．が、ＲＡＲＡアゴニストを含む治療用組成物を投与するまたは投与を推奨するステップを含む。
第６の実施形態では、本発明は、被験体におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡのレベルを決定する方法であって、ａ）被験体由来の生体試料から総ｍＲＮＡを得るステップ；ｂ）各ｍＲＮＡ分子に、そのようなｍＲＮＡ分子に天然には付加されていない追加のヌクレオチドを付加して、ｍＲＮＡ分子を固体支持体に結合できるようにするステップ；ｃ）ｍＲＮＡ分子の配列決定を行うステップ；およびｄ）ＲＡＲＡ ｍＲＮＡのレベルを決定するステップを含む方法を提供する。
第６の代替的実施形態では、本発明は、被験体におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡのレベルを決定する方法であって、ａ）被験体由来の生体試料から総ｍＲＮＡを得るステップ；ｂ）総ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製するステップ；およびｃ）ｃＤＮＡライブラリーを、（ｉ）ＲＡＲＡ ｍＲＮＡから作製されるｃＤＮＡに対して特異的であるプライマー対；（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ；および（ｉｉｉ）プライマー対およびＤＮＡポリメラーゼから生成する任意のＤＮＡ分子の検出用の構成成分と組み合わせるステップを含む方法を提供する。この第６の代替的実施形態の一部の態様では、検出用の構成成分は、色素である。この第６の代替的実施形態の他の態様では、検出用の構成成分は、標識した（例えば、放射標識または色素標識した）オリゴヌクレオチドである。
第６の実施形態のいずれかの一部の態様では、被験体において検出されたｍＲＮＡのレベルを所定の閾値レベルと比較する。
第６の実施形態のいずれかの一部の態様では、患者は、ＡＭＬ、乳がんまたはＭＤＳから選択されるがんに罹患している。より具体的な態様では、被験体は、上記の疾患のうちの１つに罹患しており、決定されたＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルが、所定の閾値と等しいまたはそれを上回る場合に、ＲＡＲＡアゴニスト（例えば、タミバロテン）の投与を受ける。
第６の実施形態のいずれかの一部の態様では、所定の閾値は、同じがんを有するまたは表す集団または試料の集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを測定し、ＲＡＲＡアゴニストに対して応答性である少なくとも１つの集団メンバーを同定することによって決定されるＲＡＲＡ ｍＲＮＡカットオフレベルである。この第６の実施形態の一部の態様では、所定の閾値は、少なくとも１つの集団メンバーがＲＡＲＡアゴニストに対して応答性であると同定されている集団または試料の集団におけるＲＡＲＡスーパーエンハンサー順位ランクに基づいて分布カットオフ（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｃｕｔｏｆｆ）を算出し、算出された分布カットオフを使用して、同じまたは異なる集団または試料の集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルのカットオフレベルを決定することによって決定されるＲＡＲＡ ｍＲＮＡカットオフレベルである。
第７の実施形態では、本発明は、（ｉ）被験体におけるがん細胞（例えば、ＡＭＬまたはＭＤＳに罹患している被験体由来の骨髄細胞、乳がん細胞など）の集団から得たｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ；（ｉｉ）ＲＡＲＡ ｍＲＮＡから転写されたｃＤＮＡに特異的なプライマー対；（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ；および（ｉｖ）プライマー対およびＤＮＡポリメラーゼから生成される任意のＤＮＡ分子の検出用の構成成分を含む組成物を提供する。この第７の実施形態の一部の態様では、検出用の構成成分は、色素である。この第７の実施形態の他の態様では、検出用の構成成分は、標識した（例えば、放射標識または色素標識した）オリゴヌクレオチドである。この第７の実施形態の一部の態様では、組成物を使用して、被験体におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを決定する。この第７の実施形態のより具体的な態様では、決定されたＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルをカットオフ値と比較し、その比較を利用して、患者にＲＡＲＡアゴニスト（例えば、タミバロテン）を投与すべきかどうかを決定する。
第８の実施形態では、本発明は、がんに罹患している被験体のセットを処置する示差的な方法であって、がんが、所定の閾値と等しいまたはそれを上回るＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを特徴とする被験体のサブセットにはＲＡＲＡアゴニストを投与し、がんが、所定の閾値を下回るＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを特徴とする被験体のサブセットにはＲＡＲＡアゴニストを投与しないことを含む方法を提供する。
この第８の実施形態の一部の態様では、被験体のセットは、同じがんに罹患しており、がんは、ＡＭＬ、乳がんまたはＭＤＳから選択される。第７の実施形態の一部の態様では、ＲＡＲＡアゴニストは、タミバロテンである。この第７の実施形態の一部の態様では、所定の閾値は、同じがんを有するまたは表す集団または試料の集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを測定し、ＲＡＲＡアゴニストに対して応答性である少なくとも１つの集団メンバーを同定することによって決定されるｍＲＮＡカットオフレベルである。この第７の実施形態の一部の態様では、所定の閾値は、少なくとも１つの集団メンバーがＲＡＲＡアゴニストに対して応答性であると同定されたものである集団または試料の集団におけるＲＡＲＡスーパーエンハンサー順位ランクに基づいて分布カットオフを算出し、算出された分布カットオフを使用して、同じまたは異なる集団または試料の集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルのカットオフレベルを決定することによって決定されるｍＲＮＡカットオフレベルである。
第９の実施形態では、本発明は、
ａ．がんに罹患している被験体からがん細胞を得るステップ；および
ｂ．がん細胞において、
ｉ．試料におけるＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの強度、順位ランク、もしくは分布ランク；または
ｉｉ．試料におけるＲＡＲＡ遺伝子および／もしくはそれに関連するスーパーエンハンサーの一部からの一次ＲＮＡ転写産物のレベル
を測定するステップ；および
ｃ．ステップｂ．において得られた測定値を閾値と比較するステップ
を含む方法を提供する。
ありとあらゆる実施形態において、一部の態様では、本発明は、がんに罹患している被験体の処置において使用するための医薬組成物であって、ＲＡＲＡのアゴニストを含む組成物を特徴とする。
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細が本明細書に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、詳細な説明、図面、実施例、および実施形態から明らかである。
図１Ａ〜１Ｂは、ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲによって測定した、ＲＡＲＡスーパーエンハンサーのｌｏｇ２富化を示すグラフである。
図２は、５種の異なる乳がん細胞株における、ＣｈＩＰ−ｓｅｑによって決定した、ＲＡＲＡ遺伝子座にわたるＨ３Ｋ２７Ａｃ読み取りのレベルを示すグラフである。「ＲＡＲＡ」は、解析したＤＮＡの断片におけるＲＡＲＡ遺伝子の位置を示す。
図３は、多種多様な細胞株および患者試料についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結果の一覧表である。それは、これらの細胞または患者試料のそれぞれにおける、ＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサーの一部と比較したＲＡＲＡスーパーエンハンサーの相対的な強度を示す。 図３は、多種多様な細胞株および患者試料についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結果の一覧表である。それは、これらの細胞または患者試料のそれぞれにおける、ＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサーの一部と比較したＲＡＲＡスーパーエンハンサーの相対的な強度を示す。 図３は、多種多様な細胞株および患者試料についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結果の一覧表である。それは、これらの細胞または患者試料のそれぞれにおける、ＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサーの一部と比較したＲＡＲＡスーパーエンハンサーの相対的な強度を示す。 図３は、多種多様な細胞株および患者試料についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結果の一覧表である。それは、これらの細胞または患者試料のそれぞれにおける、ＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサーの一部と比較したＲＡＲＡスーパーエンハンサーの相対的な強度を示す。 図３は、多種多様な細胞株および患者試料についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結果の一覧表である。それは、これらの細胞または患者試料のそれぞれにおける、ＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサーの一部と比較したＲＡＲＡスーパーエンハンサーの相対的な強度を示す。 図３は、多種多様な細胞株および患者試料についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結果の一覧表である。それは、これらの細胞または患者試料のそれぞれにおける、ＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサーの一部と比較したＲＡＲＡスーパーエンハンサーの相対的な強度を示す。 図３は、多種多様な細胞株および患者試料についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結果の一覧表である。それは、これらの細胞または患者試料のそれぞれにおける、ＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサーの一部と比較したＲＡＲＡスーパーエンハンサーの相対的な強度を示す。 図３は、多種多様な細胞株および患者試料についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結果の一覧表である。それは、これらの細胞または患者試料のそれぞれにおける、ＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサーの一部と比較したＲＡＲＡスーパーエンハンサーの相対的な強度を示す。 図３は、多種多様な細胞株および患者試料についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結果の一覧表である。それは、これらの細胞または患者試料のそれぞれにおける、ＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサーの一部と比較したＲＡＲＡスーパーエンハンサーの相対的な強度を示す。 図３は、多種多様な細胞株および患者試料についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結果の一覧表である。それは、これらの細胞または患者試料のそれぞれにおける、ＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサーの一部と比較したＲＡＲＡスーパーエンハンサーの相対的な強度を示す。 図３は、多種多様な細胞株および患者試料についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結果の一覧表である。それは、これらの細胞または患者試料のそれぞれにおける、ＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサーの一部と比較したＲＡＲＡスーパーエンハンサーの相対的な強度を示す。 図３は、多種多様な細胞株および患者試料についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結果の一覧表である。それは、これらの細胞または患者試料のそれぞれにおける、ＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサーの一部と比較したＲＡＲＡスーパーエンハンサーの相対的な強度を示す。 図３は、多種多様な細胞株および患者試料についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結果の一覧表である。それは、これらの細胞または患者試料のそれぞれにおける、ＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサーの一部と比較したＲＡＲＡスーパーエンハンサーの相対的な強度を示す。
図４Ａは、図３のＣｈＩＰ−ｓｅｑによって解析した全ての乳がん細胞株および患者試料についての、ｌｏｇ１０ＲＡＲＡ／ＭＡＬＡＴ１として表したＲＡＲＡ ＳＥ強度のランク付け（ｒａｎｋ ｏｒｄｅｒｉｎｇ）を示す図である。図４Ｂは、図３のＣｈＩＰ−ｓｅｑによって解析した全てのＡＭＬがん細胞株および患者試料についての、ｌｏｇ１０ＲＡＲＡ／ＭＡＬＡＴ１として表したＲＡＲＡ ＳＥ強度のランク付けを示す図である。
図５は、図３のＣｈＩＰ−ｓｅｑによって解析した、全ての正常な血液系細胞株および患者試料についての、ｌｏｇ１０ＲＡＲＡ／ＭＡＬＡＴ１として表したＲＡＲＡ ＳＥ強度のランク付けを示す図である。
図６は、図３のＣｈＩＰ−ｓｅｑによって解析した、種々のＡＭＬ細胞および乳がん細胞の、患者試料対細胞株についての、ｌｏｇ１０ＲＡＲＡ／ＭＡＬＡＴ１として表したＲＡＲＡ ＳＥ強度の散布図である。
図７は、様々な用量のタミバロテンの存在下での、処置の５日後の種々の乳がん細胞株の生存率を示すグラフである。
図８は、７種の異なる乳がん細胞株（ｂｒｅａｓｔ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ ｌｉｎｅ）についての、タミバロテンＥＣ５０のｌｏｇ１０対ＲＡＲＡ ＳＥ強度（ＲＡＲＡ／ＭＡＬＡＴ１富化倍率）の相関を示すグラフである。
図９は、様々な用量のタミバロテンの存在下での、処置の５日後の種々のＡＭＬ細胞株の生存率を示すグラフである。
図１０は、１１種の異なるＡＭＬ細胞株についての、タミバロテンＥＣ５０のｌｏｇ１０対（ｌｏｇ１０ ｏｆ ｔａｍｉｂａｒｏｔｅｎｅ ＥＣ５０ ｖｅｒｓｕｓ）の相関を示すグラフである。
図１１は、タミバロテン応答性乳がん細胞株（Ａｕ５６５）およびタミバロテン非応答性乳がん細胞株（ＨＣＣ１１４３）についてのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ａｒｒａｙに基づく解析によって測定された、３種の異なるＲＡＲ亜型（ＲａＲ−α（「ＲＡＲＡ」）；ＲａＲ−β（「ＲＡＲＢ」）；およびＲａＲ−γ（「ＲＡＲＧ」））、のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
図１２は、ＲＮＡ−Ｓｅｑを使用した、４８種の異なるＡＭＬ患者試料についての、ｍＲＮＡ発現（ｌｏｇ２（１＋ＦＰＫＭ））とＲＡＲＡ ＳＥ強度（ＲＡＲＡ／ＭＡＬＡＴ１富化倍率）の相関を示すグラフである。
図１３は、５種の異なる乳がん細胞株についての、ｒｔ−ｑＰＣＲによって測定し、ｄＣｔとして表した逆ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
図１４Ａは、７種の異なる乳がん細胞株についての、ｒｔ−ｑＰＣＲによって測定されたｍＲＮＡ発現レベルとＲＡＲＡ ＳＥ強度（ＲＡＲＡ／ＭＡＬＡＴ１富化倍率）の相関を示すグラフである。図１４Ｂは、７種の異なる乳がん細胞株についての、ｒｔ−ｑＰＣＲによって測定されたｍＲＮＡ発現レベルとタミバロテンに対する応答性（ｌｏｇ１０ ＥＣ５０によって測定される）の相関を示すグラフである。
図１５は、５種の異なる乳がん細胞株における３種の異なる公知のＲＡＲＡアイソフォームのタンパク質レベルを示すウエスタンブロットである。
図１６は、タミバロテンに対して弱く応答性である乳がん細胞株（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）（Ｔ４７Ｄ、図１６Ａ）およびタミバロテンに対して高度に応答性である乳がん細胞株（ＡＵ５６５、図１６Ｂ）におけるＨＥＲ２遺伝子およびＲＡＲＡ遺伝子のコピー数を示すグラフである。
図１７は、ＣｈＩＰ−ｓｅｑによって決定した、神経膠芽腫、神経芽細胞腫および結腸直腸がん患者試料についての、ＲＡＲＡ遺伝子座にわたるＨ３Ｋ２７Ａｃ読み取りのレベルを示すグラフである。
図１８は、乳がん細胞株（ＨＣＣ１９４５）由来のマウス異種移植乳がんモデルにおける、タミバロテンの種々の１日投与量に対する応答を示すグラフである。
図１９は、乳がん細胞株ＨＣＣ１９４５を含めた８０種の乳がん試料における、ＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位のｌｏｇ１０ランク付けグラフである。
図２０Ａは、４８種の患者の乳がん試料における、ＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位のｌｏｇ１０ランク付けグラフである。淡い色の棒は、ＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位が分布カットオフと等しかったまたはそれを上回った試料を表す。濃い色の棒は、ＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位が分布カットオフを下回った試料を表す。図２０Ｂは、乳がん（ホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）、ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２＋）、またはトリプルネガティブ（ＴＮ））の特定の亜型、ならびに、各亜型についての算出された分布カットオフをさらに示す、パネルＡと同じランク付けグラフである。 図２０Ａは、４８種の患者の乳がん試料における、ＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位のｌｏｇ１０ランク付けグラフである。淡い色の棒は、ＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位が分布カットオフと等しかったまたはそれを上回った試料を表す。濃い色の棒は、ＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位が分布カットオフを下回った試料を表す。図２０Ｂは、乳がん（ホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）、ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２＋）、またはトリプルネガティブ（ＴＮ））の特定の亜型、ならびに、各亜型についての算出された分布カットオフをさらに示す、パネルＡと同じランク付けグラフである。
図２１Ａ〜Ｂは、２種の異なる患者試料由来のマウス異種移植乳がんモデルにおける、タミバロテン（ＳＹ１４２５）の毎日の投薬に対する応答を示すグラフである。
図２２は、９種の異なる患者試料由来のマウス異種移植乳がんモデルにおけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。白色の棒は、ＣＴＧ−１１２４についての値、ならびに、この集団における５５．３％分布カットオフの両方を表す。
図２３Ａは、６種のＡＭＬ細胞株におけるＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度を示すグラフである。図２３Ｂは、それらの同じ６種のＡＭＬ細胞株の、タミバロテンによる処置に対する応答性を示すグラフである。図２３Ｃは、図２０Ａおよび２０Ｂにおいて解析した６種のＡＭＬ細胞株のうちの４種、Ｓｉｇ−Ｍ５、ＭＶ４１１、ＨＥＬおよびＫａｓｕｍｉを含めた９４種のＡＭＬ試料における、ＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位のｌｏｇ１０ランク付けグラフである。 図２３Ａは、６種のＡＭＬ細胞株におけるＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度を示すグラフである。図２３Ｂは、それらの同じ６種のＡＭＬ細胞株の、タミバロテンによる処置に対する応答性を示すグラフである。図２３Ｃは、図２０Ａおよび２０Ｂにおいて解析した６種のＡＭＬ細胞株のうちの４種、Ｓｉｇ−Ｍ５、ＭＶ４１１、ＨＥＬおよびＫａｓｕｍｉを含めた９４種のＡＭＬ試料における、ＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位のｌｏｇ１０ランク付けグラフである。
図２４は、７０種のＡＭＬ患者試料における、ＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位のｌｏｇ１０ランク付けグラフである。淡い色の棒は、ＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位が分布カットオフと等しかったまたはそれを上回った試料を表す。濃い色の棒は、ＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位が分布カットオフを下回った試料を表す。
図２５は、図２４で使用し、それらのＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位が分布カットオフを上回る（またはそれと等しい）（「高ＲＡＲＡ」）かそれとも分布カットオフを下回るか（「低ＲＡＲＡ」）に応じてビニングした７０種のＡＭＬ患者試料におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。
図２６Ａおよび２６Ｄは、２種の異なる患者由来のマウス異種移植ＡＭＬモデルにおける、％ＣＤ４５＋細胞によって測定された、タミバロテンの毎日の投薬に対する応答を示すグラフである。図２６Ｂおよび２６Ｅは、異なる器官および生体液における％ＣＤ４５＋細胞を示すグラフであり、図２６Ｃおよび２６Ｆは、マウスモデルにおける生存時間を示すグラフである。
図２７Ａ〜Ｂは、２種の追加の患者由来のマウス異種移植ＡＭＬモデルにおける、％ＣＤ４５＋細胞によって測定された、タミバロテンの毎日の投薬に対する応答を示すグラフである。図２７Ｃは、それらのモデルのうちの１つにおける、異なる器官および生体液における％ＣＤ４５＋細胞を示すグラフであり、図２７Ｄは、そのモデルにおける生存時間を示すグラフである。
図２８は、マウス異種移植モデルを作製するために使用した４種（図２６および２７を参照）を含めた６４種のＡＭＬ患者試料におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。淡い色の棒は、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡが、ＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位から決定された分布カットオフと等しかったまたはそれを上回った試料を表す。濃い色の棒は、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルが、その分布カットオフを下回った試料を表す。
図２９Ａは、％ＣＤ４５＋細胞によって測定された、ＡＭ５５１２異種移植マウスの、４ｍｇ／ｋｇのＡＴＲＡ、ＢＩＤ、３ｍｇ／ｋｇのタミバロテン、ＢＩＤおよびビヒクル対照に対する応答を示すグラフである。図２９Ｂは、実験の過程中のそのようなマウスの生存率を示すグラフである。
図３０は、試験した試料の５％超が、平均から少なくとも２標準偏差を超えるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを有する種々のがんの型の表である。
図３１は、ＭＤＳ患者試料におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを健康な（「正常な」）患者由来の細胞におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルに対して示すグラフである。
図３２は、１１種の異なるＡＭＬ細胞株における、ＲＡＲＡエンハンサー強度とタミバロテンに対する感受性の相関を示すグラフである。
図３３は、１１種の異なるＡＭＬ細胞株における、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルとタミバロテンに対する感受性の相関を示すグラフである。
定義
別段の指定のない限り、本明細書に記載されている構造はまた、その構造の全ての異性体（例えば、鏡像異性、ジアステレオ異性、および幾何的（またはコンフォメーション））形態；例えば、各不斉中心に対するＲおよびＳ立体配置、ＺおよびＥ二重結合異性体、ならびにＺおよびＥコンフォメーション異性体も含むものとする。したがって、本化合物の単一の立体化学的異性体、ならびに鏡像異性、ジアステレオ異性、および幾何的（またはコンフォメーション）混合物は、本発明の範囲内に入る。別段の指定のない限り、本発明の化合物の互変異性形態は全て本発明の範囲内に入る。さらに、別段の指定のない限り、本明細書に記載されている構造はまた、１つまたは複数の同位体的に富化された原子が存在することのみが異なる化合物も含むものとする。例えば、水素の重水素もしくはトリチウムによる置き換え、または炭素の１３Ｃ富化炭素もしくは１４Ｃ富化炭素による置き換えを含む本構造を有する化合物は、本発明の範囲内に入る。そのような化合物は、例えば、解析ツールとして、生物学的アッセイにおけるプローブとして、または本発明による治療剤として、有用である。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、良好な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などを伴わずにヒトおよび下等動物の組織と接触させて使用するのに適し、かつ妥当なベネフィット／リスク比に見合う塩を指す。薬学的に許容される塩は当技術分野で周知である。例えば、Ｂｅｒｇｅらは、参照により本明細書に組み込まれるＪ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９７７年、６６巻、１〜１９頁において薬学的に許容される塩を詳細に記載している。本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、適切な無機酸および有機酸ならびに適切な無機塩基および有機塩基に由来するものを含む。薬学的に許容される、非毒性の酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸などの無機酸を用いて、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、もしくはマロン酸などの有機酸を用いて、または、イオン交換などの当技術分野で公知の他の方法を使用することによって形成されるアミノ基の塩である。他の薬学的に許容される塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、ＭＡＬＡＴ１ｅ、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。適切な塩基に由来する塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩およびＮ＋（Ｃ１〜４アルキル）４ −塩が挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。別の薬学的に許容される塩としては、適切な場合、非毒性のアンモニウム、第四級アンモニウム、ならびにハライド、ヒドロキシド、カルボン酸、硫酸、リン酸、硝酸、低級アルキルスルホン酸、およびアリールスルホン酸などの対イオンを使用して形成されるアミンカチオンが挙げられる。
「溶媒和物」という用語は、通常は加溶媒分解反応により溶媒と会合した化合物の形態を指す。この物理的な会合は、水素結合を含み得る。従来の溶媒として、水、メタノール、エタノール、酢酸、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ジエチルエーテルなどが挙げられる。式（Ｉ）のものなどの本明細書に記載の化合物は、例えば結晶形で調製することができ、溶媒和することができる。適切な溶媒和物は、薬学的に許容される溶媒和物を含み、また、化学量論的な溶媒和物と非化学量論的な溶媒和物の両方をさらに含む。特定の例では、溶媒和物は、例えば、１つまたは複数の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子に組み入れられている場合、単離することが可能である。「溶媒和物」は、液相および分離できる溶媒和物の両方を包含する。代表的な溶媒和物としては、水和物、エタノレート、およびメタノレートが挙げられる。
「水和物」という用語は、水と会合した化合物を指す。一般には、化合物の水和物に含有される水分子の数は、水和物中の化合物分子の数に対して一定の比で存在する。したがって、化合物の水和物は、例えば、一般式Ｒ・ｘＨ２Ｏによって表すことができ、式中、Ｒは化合物であり、ｘは０よりも大きな数である。所与の化合物は、例えば、一水和物（ｘは１である）、低水和物（ｘは０よりも大きく、１よりも小さな数である、例えば、半水和物（Ｒ・０．５Ｈ２Ｏ））、および多水和物（ｘは１よりも大きな数である、例えば、二水和物（Ｒ・２Ｈ２Ｏ）および六水和物（Ｒ・６Ｈ２Ｏ））を含めた、１つ超の型の水和物を形成し得る。
投与が企図されている「被験体」としては、これだけに限定されないが、ヒト（すなわち、任意の年齢群の男性または女性、例えば、小児被験体（例えば、乳児、小児、青年）または成人被験体（例えば、若年の成人、中年の成人、または年配の成人））および／または他の非ヒト動物、例えば、哺乳動物（例えば、霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザル）；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、および／またはイヌなどの商業的に適切な哺乳動物）ならびに鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／またはシチメンチョウなどの商業的に適切な鳥類）が挙げられる。ある特定の実施形態では、動物は哺乳動物である。動物は、雄であっても雌であってもよく、また、任意の発生段階にあってよい。非ヒト動物は、トランスジェニック動物であってよい。ある特定の実施形態では、被験体はヒトである。
「投与する」、「投与すること」または「投与」という用語は、本明細書で使用される場合、発明の化合物またはその医薬組成物を埋め込むこと、吸収すること、経口摂取すること、注射すること、吸入すること、または他のやり方で導入することを指す。
本明細書で使用される場合、「処置」、「処置する」および「処置すること」という用語は、本明細書に記載の「病的状態」（例えば、疾患、障害、もしくは状態、または１つもしくは複数のその徴候もしくは症状）を逆転させること、緩和すること、その発症を遅延させること、またはその進行を阻害することを指す。一部の実施形態では、「処置」、「処置する」および「処置すること」には、疾患、障害または状態の徴候または症状が発生していることまたは観察されていることが必要である。他の実施形態では、処置は、疾患または状態の徴候または症状の不在下で施すことができる。例えば、処置は、かかりやすい個体に、症状の発症前に（例えば、症状の履歴を踏まえて、かつ／または遺伝学的または他の易罹患性因子を踏まえて）施すことができる。処置はまた、症状が消散した後に、例えば、再発を遅延させるまたは防止するために、継続することもできる。
本明細書で使用される場合、「状態」、「疾患」および「障害」という用語は、互換的に使用される。
式（Ｉ）のものなどの本明細書に記載の化合物の「有効量」とは、所望の生物学的応答を引き出すため、すなわち、状態を処置するために十分な量を指す。当業者には理解される通り、式（Ｉ）のものなどの本明細書に記載の化合物の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、化合物の薬物動態、処置される状態、投与形式、ならびに被験体の年齢および健康状態などの因子に応じて変動し得る。有効量は、治療的処置および予防的処置を包含する。例えば、がんの治療においては、発明の化合物の有効量は、腫瘍量を減少させることまたは腫瘍の成長もしくは拡散を停止させることができるものである。
式（Ｉ）のものなどの本明細書に記載の化合物の「治療有効量」は、状態の処置において治療的利益をもたらすため、または状態に関連する１つもしくは複数の症状を遅延させるもしくは最小限にするために十分な量である。一部の実施形態では、治療有効量は、状態の処置において治療的利益をもたらすため、または状態に関連する１つもしくは複数の症状を最小限にするために十分な量である。化合物の治療有効量とは、単独で、または他の療法と組み合わせて、状態の処置において治療的利益をもたらす治療剤の量を意味する。「治療有効量」という用語は、療法全体を改善する、状態の症状もしくは原因を軽減もしくは回避する、または別の治療剤の治療有効性を増強する量を包含し得る。
「新生物」および「腫瘍」という用語は、本明細書では互換的に使用され、組織の異常な塊であって、その塊の成長が正常な組織の成長に勝り、調和しない塊を指す。新生物または腫瘍は、以下の特性に応じて、「良性」または「悪性」であり得る：細胞の分化の程度（形態および機能性を含む）、成長の速度、局部浸潤、および転移。「良性新生物」は、一般に、よく分化しており、悪性新生物よりも成長が特徴的に遅く、また、発生部位に局在したままである。さらに、良性新生物は、遠位の部位に浸潤、侵入、または転移する能力を有さない。例示的な良性新生物としては、これだけに限定されないが、脂肪腫、軟骨腫、腺腫、アクロコルドン、老人性血管腫、脂漏性角化症、黒子、および皮脂腺過形成が挙げられる。一部の場合では、ある特定の「良性」腫瘍は、後に悪性新生物を生じさせ、これは、腫瘍の新生細胞亜集団における追加の遺伝子変化に起因し得、これらの腫瘍は、「前悪性新生物」と称される。例示的な前悪性新生物は奇形腫である。対照的に、「悪性新生物」は、一般に、低分化型（退形成）であり、成長が特徴的に急速であり、周囲組織への進行性の浸潤、侵入、およびその破壊を伴う。さらに、悪性新生物は、一般に、遠位の部位に転移する能力を有する。
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、悪性新生物を指す（Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、第２５版；Ｈｅｎｓｌｙ編；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９０年）。例示的ながんとしては、これだけに限定されないが、聴神経腫；腺癌；副腎がん；肛門がん；血管肉腫（例えば、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、血管肉腫）；虫垂がん；良性単クローン性高ガンマグロブリン血症；胆道がん（例えば、胆管癌）；膀胱がん；乳がん（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）（例えば、乳房の腺癌、乳房の乳頭癌、乳がん（ｍａｍｍａｒｙ ｃａｎｃｅｒ）、乳房の髄様癌）；脳がん（例えば、髄膜腫、神経膠芽腫、神経膠腫（例えば、星状細胞腫、乏突起神経膠腫）、髄芽腫）；気管支がん；カルチノイド腫瘍；子宮頸がん（例えば、子宮頸部腺癌）；絨毛癌；脊索腫；頭蓋咽頭腫；結合組織がん；上皮癌；上衣腫；内皮肉腫（例えば、カポジ肉腫、多発性特発性出血性肉腫）；子宮体がん（例えば、子宮がん、子宮肉腫）；食道がん（例えば、食道腺癌、バレット腺癌）；ユーイング肉腫；眼がん（例えば、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫）；家族性過好酸球増加症；胆嚢がん；胃がん（例えば、胃腺癌；消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）；胚細胞がん；頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮細胞癌、口腔がん（例えば、口腔扁平上皮細胞癌）、のどのがん（例えば、喉頭がん、咽頭がん、鼻咽頭がん、中咽頭がん）；造血系のがん（例えば、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）（例えば、Ｂ細胞ＡＬＬ、Ｔ細胞ＡＬＬ）、急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）（例えば、Ｂ細胞ＡＭＬ、Ｔ細胞ＡＭＬ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）（例えば、Ｂ細胞ＣＭＬ、Ｔ細胞ＣＭＬ）、および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）（例えば、Ｂ細胞ＣＬＬ、Ｔ細胞ＣＬＬ）などの白血病）；ホジキンリンパ腫（ＨＬ）（例えば、Ｂ細胞ＨＬ、Ｔ細胞ＨＬ）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（例えば、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫）、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（例えば、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫）、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫（すなわち、ワルデンストレームマクログロブリン血症）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫および中枢神経系（ＣＮＳ）原発リンパ腫などのＢ細胞ＮＨＬ；および前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）（例えば、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）（例えば、菌状息肉腫、セザリー症候群）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫、腸疾患型Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、および未分化大細胞型リンパ腫）などのＴ細胞ＮＨＬ）などのリンパ腫；上記の１つまたは複数の白血病／リンパ腫の混合物；および多発性骨髄腫（ＭＭ）、重鎖病（例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病、ミュー鎖病）；血管芽細胞腫；下咽頭がん；炎症性筋線維芽細胞腫瘍；免疫細胞アミロイドーシス；腎がん（例えば、腎芽腫、別名ウィルムス腫瘍、腎細胞癌）；肝がん（例えば、肝細胞がん（ＨＣＣ）、悪性ヘパトーマ）；肺がん（例えば、気管支原性癌、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌）；平滑筋肉腫（ＬＭＳ）；肥満細胞症（例えば、全身性肥満細胞症）；筋肉がん；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；中皮腫；骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）（例えば、真性赤血球増加症（ＰＶ）、本態性血小板増加症（ＥＴ）、特発性骨髄化生（ＡＭＭ）別名骨髄線維症（ＭＦ）、慢性特発性骨髄線維症、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性好中球性白血病（ＣＮＬ）、好酸球増加症候群（ＨＥＳ））；神経芽細胞腫；神経線維腫（例えば、神経線維腫症（ＮＦ）１型または２型、神経鞘腫症）；神経内分泌がん（例えば、胃腸膵神経内分泌腫瘍（ＧＥＰ−ＮＥＴ）、カルチノイド腫瘍）；骨肉腫（例えば、骨がん）；卵巣がん（例えば、嚢胞腺癌、卵巣胎児性癌、卵巣腺癌）；乳頭状腺癌；膵がん（例えば、膵臓腺癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、膵島細胞腫瘍）；陰茎がん（例えば、陰茎および陰嚢のパジェット病）；松果体腫；原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＴ）；形質細胞新形成；腫瘍随伴症候群；上皮内新生物；前立腺がん（例えば、前立腺腺癌）；直腸がん；横紋筋肉腫；唾液腺がん；皮膚がん（例えば、扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）、角化棘細胞腫（ＫＡ）、黒色腫、基底細胞癌（ＢＣＣ））；小腸がん（ｓｍａｌｌ ｂｏｗｅｌ ｃａｎｃｅｒ）（例えば、虫垂がん）；軟部組織肉腫（例えば、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、脂肪肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）、軟骨肉腫、線維肉腫、粘液肉腫）；脂腺癌；小腸がん（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）；汗腺癌；滑膜腫；精巣がん（例えば、セミノーマ、精巣胎児性癌）；甲状腺がん（例えば、甲状腺の乳頭癌、甲状腺乳頭癌（ＰＴＣ）、甲状腺髄様がん）；尿道がん；膣がん；および外陰がん（例えば、外陰部のパジェット病）が挙げられる。
「生体試料」という用語は、組織試料（例えば、組織切片および組織の針生検材料）；細胞試料（例えば、細胞学的塗抹標本（例えば、Ｐａｐもしくは血液塗抹標本）または顕微解剖によって得られる細胞の試料）；生物体全体の試料（例えば、酵母もしくは細菌の試料）；または細胞画分、断片または細胞小器官（例えば、細胞を溶解させ、その構成成分を遠心分離もしくは他のやり方で分離することによって得られるもの）を含めた任意の試料を指す。生体試料の他の例としては、血液、血清、尿、精液、排泄物、脳脊髄液、間質液、粘液、涙、汗、膿、生検組織（例えば、外科的生検または針生検によって得られる）、乳頭吸引物、乳、膣液、唾液、スワブ（例えば、頬側スワブ）、または第１の生体試料に由来する生体分子を含有する任意の材料が挙げられる。生体試料は、トランスジェニック卵母細胞、精子細胞、胚盤胞、胚、胎児、ドナー細胞、または細胞核などの、トランスジェニックである生体試料も包含する。一部の態様では、ＡＭＬまたはＭＤＳに罹患している被験体に由来する生体試料は、骨髄吸引物である。
「ＲＡＲＡ遺伝子」という用語は、機能的なレチノイン酸受容体α遺伝子をコードするゲノムＤＮＡ配列を指し、ＲＡＲＡ遺伝子の全部または一部を含む遺伝子融合物は具体的に排除される。一部の実施形態では、ＲＡＲＡ遺伝子は、ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ ｈｇ１９のｃｈｒ１７：３８４５８１５２−３８５１６６８１に位置する。
「エンハンサー」という用語は、最大１Ｍｂｐ離れた遺伝子を調節するように作用するゲノムＤＮＡの領域を指す。エンハンサーは遺伝子コード領域をオーバーラップし得るが、多くの場合、遺伝子コード領域から構成されない。エンハンサーは、多くの場合、転写因子が結合し、特異的なヒストンマークで表される。
「スーパーエンハンサー」という用語は、特定の細胞における他のエンハンサーと比較してヒストンマークおよび／または転写タンパク質の不釣り合いな共有（ｄｉｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｔｅ ｓｈａｒｅ）を含有するエンハンサーのサブセットを指す。これにより、スーパーエンハンサーにより調節される遺伝子は、その細胞の機能に関する重要性が高いことが予測される。スーパーエンハンサーは、一般には、細胞におけるエンハンサーの全てを強度に基づいてランク付けし、細胞における中央値エンハンサーよりも有意に高い強度を有するエンハンサーのサブセットをＲＯＳＥ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｔｂｕｃｋｅｔ．ｏｒｇ／ｙｏｕｎｇ＿ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ／ｒｏｓｅ）などの利用可能なソフトウェアを使用して決定することによって決定される（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，１８１，５８０号を参照されたい）。
「一次ＲＮＡ転写産物」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子コード領域、およびその遺伝子に関連するエンハンサーまたはスーパーエンハンサーのうちの１つまたは複数を含むＤＮＡ配列からのＲＮＡ転写産物を指す。一部の実施形態では、「一次ＲＮＡ転写産物」という用語は、そのようなＲＮＡが、エンハンサー領域に対応するＤＮＡに由来するＲＮＡを含む場合、「ｅＲＮＡ」または「エンハンサーＲＮＡ」という用語と交換することができる。他の実施形態では、「一次ＲＮＡ転写産物」という用語は、遺伝子コード領域から転写されるｍＲＮＡを指す。
「強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）」という用語は、エンハンサーまたはスーパーエンハンサーの一部について言及する場合、本明細書で使用される場合、解析したゲノムＤＮＡセグメントの長さに対してプロットしたＨ３Ｋ２７Ａｃまたは他のゲノムマーカー読み取りの数の曲線下面積を意味する。したがって、「強度」は、測定のために選択された領域を規定する塩基対の全長にわたって所与の塩基対におけるマークを測定することから生じるシグナルの積分である。
特定の値（例えば、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの強度）についての「分布ランク（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｒａｎｋ）」という用語は、その特定の値と等しいまたはそれよりも大きい集団の百分率を意味する。例えば、試験細胞におけるＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの強度について３５％分布ランクとは、集団の３５％が、試験細胞と等しいまたはそれよりも大きい強度を有するＲＡＲＡ遺伝子エンハンサーを有することを意味する。
特定の値（例えば、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの強度）についての「分布カットオフ（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｃｕｔｏｆｆ）」という用語は、集団の２つのサブセット（例えば、レスポンダーと非レスポンダー）の間の境界線を規定する分布ランクを意味する。したがって、分布カットオフと等しいまたはそれよりも高い（すなわち、百分率値が低い）分布ランクにより、集団の一方のサブセットが規定され、分布カットオフよりも低い（例えば、百分率値が高い）分布ランクにより、集団の他方のサブセットが規定される。
「カットオフ」および「カットオフ値」という用語は、集団の２つのサブセット（例えば、レスポンダーと非レスポンダー）の間の境界線を規定する、アッセイにおいて測定される値を意味する。したがって、カットオフ値と等しいまたはそれよりも高い値により集団の一方のサブセットが規定され、カットオフ値よりも低い値により集団の他方のサブセットが規定される。
「閾値」および「閾値レベル」という用語は、集団の２つのサブセット（例えば、レスポンダーと非レスポンダー）の間の境界線を規定するレベルを意味する。閾値レベルは、分布カットオフまたはカットオフ値であり得る。
「集団」または「試料の集団」という用語は、より大きな群において測定される値の分布を合理的に反映する、十分な数（例えば、少なくとも３０、４０、５０またはそれ超）の異なる試料を意味する。試料の集団内の各試料は、細胞株、生物（ｌｉｖｉｎｇ ｂｅｉｎｇ）から得た生体試料（例えば、生検もしくは体液試料）、または異種移植片（例えば、細胞株もしくは患者試料を埋め込むことによってマウスにおいて成長させた腫瘍）から得た試料であり得、各試料は、同じ疾患、状態もしくは障害に罹患している生物、またはそれを示す細胞株または異種移植片に由来するものである。
特定の値の「順位ランク（ｏｒｄｉｎａｌ ｒａｎｋ）」という用語は、その値の、他の値のセットと比較したランク順位を意味する。例えば、試験細胞におけるＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの強度に関して、試験細胞における他のスーパーエンハンサーと比較した順位ランクが１００であるとは、試験細胞において９９種の他のスーパーエンハンサーが、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーよりも高い強度を有することを意味する。
「ランク付け（ｒａｎｋ ｏｒｄｅｒｉｎｇ）」という用語は、最高から最低まで、または最低から最高までの、値の順位付けを意味する。
本発明のある特定の実施形態の詳細な説明
ＲＡＲＡスーパーエンハンサーの同定および閾値レベルの決定
エンハンサーまたはスーパーエンハンサーの同定は、例えば、その両方が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｅｌｌ、２０１３年、１５５巻、９３４〜９４７頁およびＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６６９５７に記載されている、当技術分野で公知の様々な方法によって達成することができる。一部の実施形態では、スーパーエンハンサーの同定は、患者におけるがん試料から（例えば、生検材料から）細胞性材料およびＤＮＡを得ることによって達成される。エンハンサー測定に関する重要な計量は、２つの寸法、ゲノムマーカー（例えば、Ｈ３Ｋ２７Ａｃ）が連続して検出されるＤＮＡの長さ、および、大きさを構成するＤＮＡの全長にわたる各塩基対におけるゲノムマーカーのコンパイルされた発生率で行う。長さおよび大きさ解析の積分により得られる曲線下面積（「ＡＵＣ」）の測定により、エンハンサーの強度が決定される。本発明の一態様では、被験体がＲＡＲＡアゴニストに対して応答性であるか否かを決定するために使用するのは、対照と比較したＲＡＲＡスーパーエンハンサーの強度である。ゲノムマーカーが検出されるＤＮＡの長さがＲＡＲＡと対照とで同じであれば、対照と比べたＲＡＲＡスーパーエンハンサーの大きさの比は強度と同等になり、これも被験体がＲＡＲＡアゴニストに対して応答性であるか否か決定するために使用することができることが当業者には容易に明らかである。
本発明者らは、Ｈ３Ｋ２７Ａｃ ＣｈＩＰ−ｓｅｑ法により、ｃｈｒ１７：３８４５８１５２−３８５１６６８１（ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ ｈｇ１９）にＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー遺伝子座が存在することを決定した。この遺伝子座は、ＲＡＲＡ遺伝子座自体と実際にオーバーラップしており、したがって、近傍／オーバーラップを理由として、その遺伝子に関連するスーパーエンハンサー遺伝子座であるとみなした。したがって、一部の実施形態では、本発明に従ったＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの強度の決定には、ゲノム全体の解析が必要とされるのとは対照的に、ゲノムのこの特定の部分を解析することのみが必要である。
タンパク質とＤＮＡの相互作用を解析するために、ＣｈＩＰ−ｓｅｑとしても公知のＣｈＩＰ−配列決定を使用する。ＣｈＩＰ−ｓｅｑは、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）と大量並列ＤＮＡ配列決定を組み合わせて、ＤＮＡ結合タンパク質の結合性部位を同定するものである。ＣｈＩＰ−ｓｅｑを使用して、任意の目的のタンパク質に関して、結合性部位全体を正確にマッピングすることができる。以前は、ＣｈＩＰ−オンチップが、これらのタンパク質−ＤＮＡの関係を研究するために利用される最も一般的な技法であった。上首尾のＣｈＩＰ−ｓｅｑは、超音波処理の強度および方法、緩衝液の組成、抗体の品質、および細胞数を含めた多くの因子に依存する。例えば、Ｔ． Ｆｕｒｅｙ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１３巻、８４０〜８５２頁（２０１２年１２月）；Ｍ．Ｌ． Ｍｅｔｚｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１巻、３１〜４６頁（２０１０年１月）；およびＰ．Ｊ Ｐａｒｋ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１０巻、６６９〜６８０頁（２００９年１０月）を参照されたい。ＣｈＩＰ−ｓｅｑを使用したスーパーエンハンサーの同定に使用することができるＨ３Ｋ２７Ａｃ以外の（ｏｔｈｅｒ ｔｈａｔ）ゲノムマーカーとして、Ｐ３００、ＣＢＰ、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、メディエーター複合体の構成成分（Ｊ Ｌｏｖｅｎら、Ｃｅｌｌ、１５３巻（２号）：３２０〜３３４頁、２０１３年）、ヒストン３リシン４モノメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１）、または他の組織特異的エンハンサーに紐づけされている転写因子（Ｅ ＳｍｉｔｈおよびＡ Ｓｈｉｌａｔｉｆａｒｄ、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２１巻（３号）：２１０〜２１９頁、２０１４年）（Ｓ ＰｏｔｔおよびＪａｓｏｎ Ｌｉｅｂ、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、４７巻（１号）：８〜１２頁、２０１５年）が挙げられる。
一部の実施形態では、細胞株または患者試料のゲノム全体のＨ３Ｋ２７ａｃまたは他のマーカーＣｈＩＰ−ｓｅｑデータスーパーエンハンサーマップがすでに存在する。これらの実施形態では、単に、そのようなマップにおいてｃｈｒ１７：３８４５８１５２−３８５１６６８１（ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ ｈｇ１９）遺伝子座におけるエンハンサーまたはスーパーエンハンサーの強度または順位ランクが所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回るレベルであるかどうかを決定する。
一部の実施形態では、ｃｈｒ１７：３８４５８１５２−３８５１６６８１遺伝子座におけるエンハンサーまたはスーパーエンハンサーの強度が所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回るレベルであるか否かの決定には、この領域におけるＣｈＩＰ−ｓｅｑ読み取りを、全ての細胞に同様のレベルで存在する遍在スーパーエンハンサーまたはエンハンサーを含むことが公知である領域と比較することが必要になる。そのような遍在スーパーエンハンサー領域の１つの例は、ＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサー遺伝子座（ｃｈｒ１１：６５２６３７２４−６５２６６７２４）である。ＲＡＲＡ遺伝子座におけるＣｈＩＰ−ｓｅｑ読み取りをＭＡＬＡＴ１遺伝子座におけるＣｈＩＰ−ｓｅｑ読み取りと比較することにより、ＲＡＲＡ遺伝子座におけるスーパーエンハンサーの強度が所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回るか否か、およびそこで細胞がＲＡＲＡアゴニストに応答するか否かを決定することができる。
本発明の一部の実施形態では、閾値レベルは、ｌｏｇ１０（ＲＡＲＡ遺伝子座におけるＣｈＩＰ−ｓｅｑ読み取りのＡＵＣ（「Ｒ」）／ＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサー遺伝子座におけるＣｈＩＰ−ｓｅｑ読み取りのＡＵＣ（「Ｍ」））が０．２５もしくはそれ超の場合である。これらの実施形態の一部の態様では、ＲＡＲＡアゴニストに対するレスポンダーを同定するための閾値レベルは、ｌｏｇ１０（Ｒ／Ｍ）が０．３もしくはそれ超、０．３５もしくはそれ超、または０．４もしくはそれ超である。
本発明の一部の実施形態では、閾値レベルは、（ＲＡＲＡ遺伝子座におけるＣｈＩＰ−ｓｅｑ読み取りのＡＵＣ（「Ｒ」）／ＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサー遺伝子座におけるＣｈＩＰ−ｓｅｑ読み取りのＡＵＣ（「Ｍ」））が１．７５もしくはそれ超である場合である。これらの実施形態の一部の態様では、ＲＡＲＡアゴニストに対するレスポンダーを同定するための閾値レベルは、ｌｏｇ１０（Ｒ／Ｍ）が２．０もしくはそれ超、２．２５もしくはそれ超、または２．７５もしくはそれ超である。
本発明の一部の実施形態では、上で定義したＲを、ＭＡＬＡＴ１以外の対照エンハンサーまたはスーパーエンハンサー遺伝子座と比較する（この他の対照エンハンサーまたはスーパーエンハンサーにおけるＣｈＩＰ−ｓｅｑ読み取りの数は、「Ｃ」と称される）。別の対照エンハンサーまたはスーパーエンハンサー遺伝子座、Ｃを利用する場合、Ｍとの比較のために、上で言及したｌｏｇ１０として表される閾値（「Ｖ」）、例えば、ｌｏｇ１０（Ｒ／Ｍ）≧０．２５、ｌｏｇ１０（Ｒ／Ｍ）≧０．３、ｌｏｇ１０（Ｒ／Ｍ）≧０．３５、またはｌｏｇ１０（Ｒ／Ｍ）≧０．４を調整して、Ｍと比較したＣの相対的な強度を説明するために、Ｃとの比較用に同等の値にしければならない。この「同等の調整された閾値」（「Ａ」）は、以下の通り算出される：
Ａ＝ｌｏｇ１０（Ｍ／Ｃ）＋Ｖ
非限定的な例として、算出されたＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサー（Ｍ）の強度がコンパレーターとして使用した対照エンハンサーまたはスーパーエンハンサー（Ｃ）の１０倍であり、閾値（Ｖ）が０．２５である場合、Ａ＝ｌｏｇ１０（１０）＋０．２５＝１．２５であり、調整された閾値は１．２５である。この例に関しては、Ｃをコンパレーターとして使用した場合、ｌｏｇ１０（Ｒ／Ｃ）が１．２５と等しいまたはそれよりも大きいことは、Ｍを、コンパレーターとして使用した場合のｌｏｇ１０（Ｒ／Ｍ）が０．２５と等しいまたはそれよりも大きいこと同等であると考えられる。任意の追加のコンパレーターについて、調整された閾値がすでに決定されているＭＡＬＡＴ１または任意の他のコンパレーターのいずれかに対するその相対的な強度に基づいて、調整された閾値を同様に算出することができることは容易に明らかである。
Ｍと比較した直線的な値（ｌｉｎｅａｒ ｖａｌｕｅ）を閾値レベルとしてとして使用する場合（例えば、≧１．７５倍、≧２．０倍、≧２．２５倍、または２．５倍）、上記と同じ調整を行うことができる。この場合、ＭとＣの比を得、次いで、閾値にその比を掛けて、ＲをＣと比較する際の適切な閾値を得る（すなわち、（閾値）Ｃ＝（Ｍ／Ｃ）（閾値）Ｍ）
ＲＡＲＡおよびＭＡＬＡＴ１の特定の染色体上の位置はどちらも、異なるｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄおよび／または異なる細胞型では異なり得ることが理解されるべきである。しかし、当業者は、そのような異なる位置を、そのような他のｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄにおいて、ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ ｈｇ １９におけるＲＡＲＡおよび／またはＭＡＬＡＴ１遺伝子座に対応する特定の配列の位置を特定することにより、決定することができる。
スーパーエンハンサーを同定するための他の方法としては、クロマチン免疫沈降（ＪＥ Ｄｅｌｍｏｒｅら、Ｃｅｌｌ、１４６巻（６号）９０４〜９１７頁、２０１１年）およびチップアレイ（ＣｈＩＰ−チップ）、ならびに、クロマチン免疫沈降、その後に、同じ免疫沈降させたゲノムマーカーおよびｃｈｒ１７：３８４５８１５２−３８５１６６８１（ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ ｈｇ１９）ＲＡＲＡ遺伝子座にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を使用したｑＰＣＲ（ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ）が挙げられる。ＣｈＩＰ−チップの場合では、シグナルは、一般には、他のアレイに基づく技術と同様に、プローブと投入アッセイ試料とのハイブリダイゼーションによって生じる蛍光強度によって検出される。ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲに関しては、ＰＣＲ反応で生成した二本鎖ＤＮＡにインターカレートした後にのみ蛍光を発する色素を使用して鋳型の増幅を測定する。
一部の実施形態では、細胞が、必要な閾値レベルを上回るＲＡＲＡスーパーエンハンサーを有するかどうかの決定は、試験細胞におけるＲＡＲＡエンハンサー強度を、ＲＡＲＡに応答しないことが公知である細胞（「対照細胞」）における対応するＲＡＲＡ強度と比較することによって達成される。対照細胞は試験細胞と同じ細胞型であることが好ましい。これらの実施形態の一態様では、対照細胞は、ＨＣＣ１１４３におけるものなどの細胞である。これらの実施形態の別の態様では、対照細胞は、図３に列挙されている任意の細胞であり、ここで、ｌｏｇ１０（ＲＡＲＡ／ＭＡＬＡＴ１）は、０．２５未満、０．２未満、０．１５未満、０．１未満、または０未満である。
一部の実施形態では、被験体は、被験体の細胞におけるＲＡＲＡスーパーエンハンサーの強度が対照細胞における対応するＲＡＲＡエンハンサー／スーパーエンハンサーの強度の少なくとも１．５倍であれば、ＲＡＲＡアゴニストに対して応答性であることが決定される。これらの実施形態の一部の態様では、閾値レベルは、対照細胞の少なくとも２．０倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍の強度である。これらの実施形態の一部の態様では、試験細胞および対照細胞の両者におけるＲＡＲＡスーパーエンハンサーの強度を比較前に正規化する。正規化は、決定されたＲＡＲＡスーパーエンハンサーの強度を、細胞の両方にネイティブであり、かつ同等のレベルで存在する別のエンハンサーもしくはスーパーエンハンサーのいずれか（例えば、ＭＡＬＡＴ１）と、または、固定レベルの、スーパーエンハンサー強度の決定前に細胞のそれぞれの試料に「スパイクされた」外因性ＤＮＡと比較することによって調整することを伴う（ＤＡ Ｏｒｌａｎｄｏら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、２０１４年１１月６日、９巻（３号）：１１６３〜７０頁（２０１４年）；Ｎ Ｂｏｎｈｏｕｒｅら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ、２４巻：１１５７〜６８頁（２０１４年））。
一部の実施形態では、細胞が、必要な閾値レベルを上回るＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度を有するかどうかの決定は、試験細胞におけるＲＡＲＡエンハンサー強度を、細胞試料の集団における対応するＲＡＲＡ強度と比較することによって達成され、ここで、細胞試料のそれぞれは、異なる供給源（すなわち、異なる被験体、異なる細胞株、異なる異種移植）から得る。これらの実施形態の一部の態様では、被験体由来の原発腫瘍細胞試料のみを使用して閾値レベルを決定する。これらの実施形態の一部の態様では、ａ）特定のＲＡＲＡアゴニストに応答する集団内の試料の最低ＲＡＲＡエンハンサー強度（「最低レスポンダー」）；および、任意選択で、ｂ）特定のＲＡＲＡアゴニストに応答しない集団内の試料の最高ＲＡＲＡエンハンサー強度（「最高非レスポンダー」）を確立するために、集団内の試料の少なくとも一部を、特定のＲＡＲＡアゴニストに対する応答性について試験されていることになる。これらの実施形態では、それを上回れば試験細胞をその特定のＲＡＲＡアゴニストに対して応答性であるとみなすものとするＲＡＲＡエンハンサー強度のカットオフを、ｉ）集団内の最低レスポンダーにおけるＲＡＲＡエンハンサー強度と等しいもしくはそれを最大５％上回る；またはｉｉ）集団における最高非レスポンダーにおけるＲＡＲＡエンハンサー強度と等しいもしくはそれを最大５％上回る；またはｉｉｉ）集団における最低レスポンダーおよび最高非レスポンダーのＲＡＲＡエンハンサー強度の間の値に設定する。
上記の実施形態では、一般には、集団内の試料の全てをＲＡＲＡアゴニストに対する応答性について試験する必要はないが、ＲＡＲＡエンハンサー強度については全ての試料を測定することが理解されるべきである。一部の実施形態では、試料をＲＡＲＡエンハンサー強度に基づいてランク付けする。カットオフを確立するために上記の３つの方法のいずれを使用するかの選択は、集団における最低レスポンダーと最高非レスポンダーの間のＲＡＲＡエンハンサー強度の差異、および目標が偽陽性の数を最小限にすることであるかまたは潜在的に応答性の試料または被験体を見落とす機会を最小限にすることであるかに左右される。最低レスポンダーと最高非レスポンダーの間の差異が大きい場合（例えば、ＲＡＲＡエンハンサー強度のランク付けにおいて最低レスポンダーと最高非レスポンダーの間に入る、応答性について試験されていない多くの試料が存在する場合）、カットオフは、一般には、集団内の最低レスポンダーにおけるＲＡＲＡエンハンサー強度と等しいもしくはそれを最大５％上回るところに設定する。このカットオフは、潜在的なレスポンダーの数を最大にするものである。この差が小さい場合（例えば、ＲＡＲＡエンハンサー強度のランク付けにおいて最低レスポンダーと最高非レスポンダーの間に入る、応答性について試験されていない試料が少数であるかもしくは全くない場合）、カットオフは、一般には、最低レスポンダーおよび最高非レスポンダーのＲＡＲＡエンハンサー強度の間の値に設定する。このカットオフは、偽陽性の数を最小限にするものである。最高非レスポンダーが最低レスポンダーよりも大きなＲＡＲＡエンハンサー強度を有する場合、カットオフは、一般には、集団における最高非レスポンダーにおけるＲＡＲＡエンハンサー強度と等しいもしくはそれを最大５％上回る値に設定する。この方法も、偽陽性の数を最小限にするものである。
一部の実施形態では、細胞が、必要な閾値レベルを上回るＲＡＲＡスーパーエンハンサーを有するかどうかの決定は、試験細胞におけるＲＡＲＡエンハンサー強度の順位を、細胞試料の集団における対応するＲＡＲＡエンハンサー強度の順位と比較することによって達成され、ここで、細胞試料のそれぞれは、異なる供給源（すなわち、異なる被験体、異なる細胞株、異なる異種移植）から得る。これらの実施形態では、ａ）特定のＲＡＲＡアゴニストに応答する集団内の試料の最低ＲＡＲＡエンハンサー強度順位（「最低順位レスポンダー」）；および、任意選択で、ｂ）特定のＲＡＲＡアゴニストに応答しない集団内の試料の最高ＲＡＲＡエンハンサー強度順位（「最高順位非レスポンダー」）を確立するために、集団内の試料の少なくとも一部を、特定のＲＡＲＡアゴニストに対する応答性について試験されていることになる。これらの実施形態では、それを上回れば試験細胞をその特定のＲＡＲＡアゴニストに対して応答性であるとみなすものとするＲＡＲＡエンハンサー強度順位のカットオフを、ｉ）集団内の最低順位レスポンダーにおけるＲＡＲＡエンハンサー強度順位と等しいもしくはそれを最大５％上回る；またはｉｉ）集団における最高順位非レスポンダーにおけるＲＡＲＡエンハンサー強度順位と等しいもしくはそれを最大５％上回る；またはｉｉｉ）集団における最低順位レスポンダーおよび最高順位非レスポンダーのＲＡＲＡエンハンサー強度順位の間の値に設定する。
上記の実施形態では、一般には、集団内の試料の全てをＲＡＲＡアゴニストに対する応答性について試験する必要はないが、ＲＡＲＡエンハンサー強度については全ての試料を測定し、同じ試料中の他のエンハンサーと比較したＲＡＲＡエンハンサー強度の順位を確立することが理解されるべきである。順位は、一般には、細胞における他のエンハンサー全ての強度を測定し、強度に関してＲＡＲＡエンハンサーが他のエンハンサーと比較してどのようなランク（すなわち、順位）を有するかを決定することによって得られる。
一部の実施形態では、試料をＲＡＲＡエンハンサー強度の順位に基づいてランク付けする。カットオフを確立するために上記の３つの方法のいずれを使用するかの選択は、集団における最低順位レスポンダーと最高順位非レスポンダーの間のＲＡＲＡエンハンサー強度の差異、およびカットオフが偽陽性の数を最小限にするように設計されるか、またはレスポンダーの数を最大化するように設計されるかに左右される。この差異が大きい場合（例えば、ＲＡＲＡエンハンサー強度の順位のランク付けにおいて最低順位レスポンダーと最高順位非レスポンダーの間に入る、応答性について試験されていない多くの試料が存在する場合）、カットオフは、一般には、集団内の最低順位レスポンダーにおけるＲＡＲＡエンハンサー強度の順位と等しいもしくはそれを最大５％上回るところに設定する。この差が小さい場合（例えば、ＲＡＲＡエンハンサー強度の順位のランク付けにおいて最低順位レスポンダーと最高順位非レスポンダーの間に入る、応答性について試験されていない試料が少数であるかもしくは全くない場合）、カットオフは、一般には、最低順位レスポンダーおよび最高順位非レスポンダーのＲＡＲＡエンハンサー強度の順位の間の値に設定する。最高順位非レスポンダーが最低レスポンダーの順位よりも大きなＲＡＲＡエンハンサー強度の順位を有する場合、カットオフは、一般には、集団における最高順位非レスポンダーにおけるＲＡＲＡエンハンサー強度の順位と等しいもしくはそれを最大５％上回る値に設定する。
試験細胞または試料を集団と比較する実施形態の一部の態様では、集団について得られたカットオフ値（複数可）（例えば、ＲＡＲＡエンハンサー強度またはＲＡＲＡエンハンサー順位）を分布ランクに変換し、カットオフを、カットオフ値またはそれ超を有する集団のパーセント、すなわち、分布カットオフで表す。理論に束縛されることなく、出願人らは、試験試料の分布ランクは、ＲＡＲＡエンハンサー強度を決定するために使用する方法体系にかかわらず同様になると考える。したがって、１つのパラメータ（例えば、ＲＡＲＡエンハンサー強度順位）について決定された分布カットオフは、ポータブルであり、別のパラメータ（例えば、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベル）に適用して、その他のパラメータについてのカットオフ値を決定することができる。これにより、任意のパラメータについてのカットオフ値を、そのようなパラメータのレベルとＲＡＲＡアゴニストに対する応答性の相関を実験的に決定する必要なく決定することが可能になる。そのような他のパラメータのどのレベルが集団における前に決定した分布カットオフに対応するかを決定することだけが必要である。
ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベル決定
本発明者らによるＲＡＲＡスーパーエンハンサー遺伝子座の同定により、ＲＡＲＡアゴニストに対する感受性を決定するために、スーパーエンハンサーレベルの代わりにＲＮＡ転写産物を使用して感受性を決定することが可能になる。スーパーエンハンサー遺伝子座自体に由来するＲＮＡ転写産物は、数量化する（ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ）ことができ、また、その遺伝子座におけるスーパーエンハンサーレベルと非常によく相関する。本発明者らは、ＲＡＲＡをコードするｍＲＮＡ転写産物は、ＲＡＲＡアゴニストに対する感受性とも相関し、したがって、ｍＲＮＡレベルを使用して、ＲＡＲＡアゴニストに応答する細胞を同定することができる。
一部の実施形態では、スーパーエンハンサー遺伝子座からのＲＮＡ転写レベルは、試料におけるＲＡＲＡエンハンサーＲＮＡ転写レベルをＲＡＲＡアゴニストに対して非応答性であることが公知である細胞または細胞株における対応するＲＡＲＡエンハンサーＲＮＡ転写レベルと比較する定量的技法を使用して数量化する。そのような方法としては、エンハンサーリードスルーに関連するｅＲＮＡを読み取るためのＲＮＡアレイまたは配列決定に基づく方法（Ｎ Ｈａｈら、ＰＮＡＳ、１１２巻（３号）：Ｅ２９７〜３０２頁、２０１５年）、ならびにＲＮＡ ｑＰＣＲが挙げられる。
これらの実施形態の一部の態様では、ＲＡＲＡアゴニストに対して非応答性であることが公知である細胞または細胞株における対応するＲＡＲＡエンハンサーＲＮＡ転写レベルと比較して少なくとも１．５倍のＲＡＲＡ ＲＮＡ転写レベルを、ＲＡＲＡアゴニストに対する感受性を同定するための閾値として使用する。これらの実施形態の他の態様では、ＲＡＲＡアゴニストレスポンダーを同定するための閾値は、対照細胞におけるＲＡＲＡ ＲＮＡ転写レベルと比較して少なくとも２．０倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍のＲＡＲＡ ＲＮＡ転写レベルである。
一部の実施形態では、ＲＡＲＡのｍＲＮＡレベルを使用してＲＡＲＡアゴニストレスポンダーを同定する。これらの実施形態の一態様では、ＲＮＡ−ＳｅｑまたはＲＮＡ−ｑＰＣＲ技法を使用してｍＲＮＡレベルを数量化する。これらの技法のそれぞれにおいて、試験細胞におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを決定し、ＲＡＲＡアゴニストに対して非応答性であることが公知である細胞（「対照細胞」）、例えば、ＨＣＣ１１４３細胞におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡと比較する。これらの実施形態の一態様では、試験細胞におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルが対照細胞と比較して少なくとも１．５倍高いことにより、ＲＡＲＡアゴニストに対する応答性が示される（すなわち、所定の閾値が、対照細胞と比較して少なくとも１．５倍高い）。これらの実施形態の他の態様では、試験細胞におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルが対照細胞と比較して少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍または少なくとも５倍高いことにより、ＲＡＲＡアゴニストに対する応答性が示される。これらの実施形態の別の態様では、対照細胞は、図３に列挙されている任意の細胞であり、ｌｏｇ１０（ＲＡＲＡ／ＭＡＬＡＴ１）は０．２５未満、０．２未満、０．１５未満、０．１未満、または０未満である。
代替実施形態では、同じアッセイを使用して、被験体（すなわち、腫瘍試料、がん細胞試料、血液試料など）におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを同じ疾患または状態を有する被験体の集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルと比較して、ＲＡＲＡアゴニストレスポンダーを同定する。これらの実施形態では、ａ）特定のＲＡＲＡアゴニストに応答する集団内の試料の最低ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベル（「最低ｍＲＮＡレスポンダー」）；ならびに、任意選択で、ｂ）特定のＲＡＲＡアゴニストに応答しない集団内の試料の最高ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベル（「最高ｍＲＮＡ非レスポンダー」）を確立するために、集団内の試料の少なくとも一部を、特定のＲＡＲＡアゴニストに対する応答性について試験されていることになる。これらの実施形態では、それを上回れば試験細胞をその特定のＲＡＲＡアゴニストに対して応答性であるとみなすものとするＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルのカットオフを、ｉ）集団内の最低ｍＲＮＡレスポンダーにおけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルと等しいもしくはそれを最大５％上回る；またはｉｉ）集団内の最高ｍＲＮＡ非レスポンダーにおけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルと等しいもしくはそれを最大５％上回る；またはｉｉｉ）集団内の最低ｍＲＮＡレスポンダーおよび最高ｍＲＮＡ非レスポンダーのＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの間の値に設定する。
一部の実施形態では、集団内の試料の全てをＲＡＲＡアゴニストに対する応答性について試験する必要はないが、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルについては全ての試料を測定する。一部の実施形態では、試料をＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルに基づいてランク付けする。カットオフを確立するために上記の３つの方法のいずれを使用するかの選択は、集団内の最低ｍＲＮＡレスポンダーと最高ｍＲＮＡ非レスポンダーの間のＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの差異、および、カットオフを、偽陽性が最小限になるように設計するかまたはレスポンダーの潜在数が最大になるように設計するかに左右される。この差が大きい場合（例えば、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルのランク付けにおいて最低ｍＲＮＡレスポンダーと最高ｍＲＮＡ非レスポンダーの間に入る応答性について試験されていない多くの試料が存在する場合）、カットオフは、一般には、集団内の最低ｍＲＮＡレスポンダーにおけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルと等しいもしくはそれを最大５％上回るところに設定する。この差が小さい場合（例えば、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルのランク付けにおいて最低ｍＲＮＡレスポンダーと最高ｍＲＮＡ非レスポンダーの間に入る、応答性について試験されていない試料が少数であるかもしくは全くない場合）、カットオフは、一般には、最低ｍＲＮＡレスポンダーおよび最高ｍＲＮＡ非レスポンダーのＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの間の値に設定する。最高ｍＲＮＡ非レスポンダーが、最低ｍＲＮＡレスポンダーよりも大きなＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを有する場合、カットオフは、一般には、集団内の最高ｍＲＮＡ非レスポンダーにおけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルと等しいもしくはそれを最大５％上回る値に設定する。
一部の実施形態では、集団を、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルに基づいてランク付けする。これらの実施形態では、各試料におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを測定し、細胞における他のｍＲＮＡ全てのｍＲＮＡレベルと比較して、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの順位ランキングを得る。次いで、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡ順位ランキングに基づくカットオフを、ＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位カットオフを決定するために前記されているのと同じ様式でＲＡＲＡアゴニストに対する応答性について試験した集団内の試料に基づいて決定する。次いで、決定されたＲＡＲＡ ｍＲＮＡ順位カットオフを、直接または分布カットオフを決定するために使用し、次いで、そのいずれかを使用して追加の試料を潜在的なＲＡＲＡアゴニストに対する応答性について層別化する。
一部の実施形態では、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルについてのカットオフを、上記の通りＲＡＲＡエンハンサー強度またはＲＡＲＡエンハンサー強度順位に基づいて確立された分布カットオフを使用して決定する。これらの実施形態の一部の態様では、集団をｍＲＮＡレベルについて測定し、前に決定した分布カットオフをその集団に適用してｍＲＮＡカットオフレベルを決定する。これらの実施形態の一部の態様では、集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルのランク順位検量線を作成し、所定の分布カットオフをその検量線に適用してＲＡＲＡ ｍＲＮＡカットオフレベルを決定する。
試験細胞または試料を集団と比較する実施形態の一部の態様では、集団について得たカットオフｍＲＮＡレベル値（複数可）を分布ランクに変換し、ｍＲＮＡレベルカットオフをカットオフ値またはそれ超を有する集団のパーセント、すなわち、分布カットオフで表す。
理論に束縛されることなく、出願人らは、集団における試験試料の分布ランクおよび分布カットオフは、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを決定するために使用する方法体系にかかわらず同様になると考える。
これらの実施形態の一部の態様では、被験体は、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルが、集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルによって決定して、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、４３％、４２％、５１％、５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、または２０％の集団における分布ランクに対応する場合、ＲＡＲＡアゴニストレスポンダーであると同定される。これらの実施形態の一態様では、カットオフ値を、ＲＡＲＡエンハンサー強度について確立された分布カットオフに基づいて確立する。これらの実施形態の代替的態様では、カットオフ値を、ＲＡＲＡエンハンサー強度順位について確立された分布カットオフに基づいて確立する。これらの実施形態の別の代替的態様では、カットオフ値を、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルに基づいて確立する。これらの実施形態のより具体的な態様では、乳がん患者についてのカットオフ値を、ＲＡＲＡエンハンサー強度順位について決定された分布カットオフに基づいて確立し、その分布カットオフ値を、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルについてのカットオフ値を決定するために使用する。これらの実施形態のさらに具体的な態様では、乳がん患者についてのカットオフ値は、５０％〜６０％、例えば、５０〜５５％、５５〜６０％、５０〜５６％、５０〜５７％、５１〜５５％、５１〜５６％、５１〜５７％、５２〜５５％、５２〜５６％、５２〜５７％、５３〜５５％、５４〜５６％、５３〜５６％、または５４〜５５％の間の分布値を使用して決定される値である。これらの実施形態のさらに他のより具体的な態様では、カットオフ値を、５５％の分布値または５６％の分布値を使用して設定する。これらの実施形態の他のより具体的な態様では、ＡＭＬ患者についてのカットオフ値を、ＲＡＲＡエンハンサー強度順位について決定された分布値に基づいて確立し、その分布値を使用してＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルについてのカットオフ値を決定する。これらの実施形態のさらに具体的な態様では、ＡＭＬ患者についてのカットオフ値を、２５〜４５％、例えば、２５〜３０％、２５〜３５％、２５〜４０％、３０〜３５％、３０〜４０％、３５〜４５％、３５〜４０％、３１〜３５％、３２〜３５％、３３〜３５％、３４〜３５％、３１〜３６％、３２〜３６％、３３〜３６％、３４〜３６％、または３５〜３６％の間の分布カットオフを使用して決定する。これらの実施形態の他のさらにより具体的な態様では、ＡＭＬ患者についてのカットオフ値を、３６％の分布値を使用して決定する。これらの実施形態のさらに他のさらにより具体的な態様では、ＡＭＬ患者についてのカットオフ値を、２５％の分布値を使用して決定する。
さらに他の実施形態では、集団を３つの群、レスポンダー、部分的なレスポンダー、および非レスポンダーに分けることができ、２つのカットオフ値または分布カットオフを設定する。部分的なレスポンダー群はレスポンダーおよび非レスポンダー、ならびにＲＡＲＡアゴニストに対する応答がレスポンダー群ほど高くなかった集団メンバーを含み得る。これらの実施形態では、２つのカットオフ値または分布カットオフを決定する。この型の層別化は、集団において、最高ＲＡＲＡ ｍＲＮＡ非レスポンダーが最低ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレスポンダーよりも高いＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを有する場合に特に有用であり得る。この筋書きでは、レスポンダーと部分的なレスポンダーの間のカットオフレベルまたは分布カットオフを、最高ＲＡＲＡ ｍＲＮＡ非レスポンダーのＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルと等しいもしくはそれを最大５％上回るところに設定し、部分的なレスポンダーと非レスポンダーの間のカットオフレベルまたは分布カットオフを、最低ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレスポンダーのＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルと等しいまたはそれを最大５％下回るところに設定する。部分的なレスポンダーにＲＡＲＡアゴニストを投与すべきかどうかの決定は、処置を行う医師の判断および／または規制当局による承認に依存する。
細胞または生体試料における特定のＲＮＡ配列を数量化する方法は、当技術分野で公知であり、それらとして、これだけに限定されないが、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより提供されるサービスおよび製品に利用されるものなどの蛍光ハイブリダイゼーション、アレイに基づく技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）もしくはＴａｑＭａｎ（登録商標）技術（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いるような逆転写酵素ｑＰＣＲ、ＲＮＡ配列決定（例えば、ＲＮＡ−ｓｅｑ）、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と共に利用されるようなＲＮＡハイブリダイゼーションおよびシグナル増幅、またはノーザンブロットが挙げられる。
これらの実施形態の一部の態様では、試験細胞および対照細胞の両方または集団の全メンバーにおけるＲＮＡ転写産物のレベル（ｍＲＮＡもしくは別のＲＡＲＡ転写産物のいずれか）を比較前に正規化する。正規化は、決定されたＲＡＲＡ ＲＮＡ転写産物のレベルを、両方の細胞にネイティブであり、かつ同等のレベルで存在する別のＲＮＡ転写産物（例えば、ＧＡＤＰＨ ｍＲＮＡ、１８Ｓ ＲＮＡ）、または、固定レベルの、スーパーエンハンサー強度の決定前に細胞のそれぞれの試料に「スパイクされた」外因性ＲＮＡのいずれかと比較することによって調整することを伴う（Ｊ Ｌｏｖｅｎら、Ｃｅｌｌ、１５１巻（３号）：４７６〜８２頁（２０１２年）；Ｊ Ｋａｎｎｏら、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、７巻：６４頁（２００６年）；Ｊ Ｖａｎ ｄｅ Ｐｅｐｐｅｌら、ＥＭＢＯ Ｒｅｐ ４巻：３８７〜９３頁（２００３年））。
がんおよび他の疾患
本発明の方法および包装された医薬品は、任意のがんにおけるＲＡＲＡ遺伝子とスーパーエンハンサーの関連を特徴とするかかるがんを処置するために理論的に有用である。スーパーエンハンサーと関連するＲＡＲＡ遺伝子は、ある特定の型のがんにおいて他のがんよりもより一般的であり得る。本発明者らは、皮膚、乳房、血液、骨、子宮頸部、結腸、直腸、食道、リンパ節、肺、卵巣、子宮、膵臓、前立腺、腎臓、および脾臓のがんにおいて、特に、ＡＭＬ（とりわけ非ＡＰＬ ＡＭＬおよびＲＡＲＡ遺伝子を伴う染色体転座を特徴としない他の形態のＡＭＬにおいて）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、結腸直腸がん、ＨＥＲ２＋乳がん、ＥＲ＋乳がん、トリプルネガティブ乳がん、神経膠芽腫、神経膠腫、胃がん、腎明細胞癌、非小細胞肺がん、黒色腫、多発性骨髄腫、膵癌、褐色細胞腫、傍神経節腫、および前立腺腺癌において、ＲＡＲＡに関連するスーパーエンハンサーを発見した。理論に束縛されることなく、本発明者らは、ＳＥと関連するＲＡＲＡ遺伝子は全てのがんのサブセットにおいて見出され、また、それらのサブセット内の被験体は、ＲＡＲＡアゴニストに対する応答性が、ＳＥと関連するＲＡＲＡ遺伝子を伴わない同じ型のがんを有する他の被験体よりも高いと考える。
本発明者らはまた、非がん疾患の組織におけるＳＥと関連するＲＡＲＡの発見により、そのような疾患を処置するための、ＲＡＲＡアゴニストの有効な使用の潜在性が示唆されると考える。本発明者らは、脂肪組織におけるＲＡＲＡスーパーエンハンサーの存在を検出し、これにより、ＲＡＲＡアゴニストを用いて有効に処置され得る、糖尿病または肥満症に罹患している患者を同定する方法が示唆される。レチノイン酸は脂肪組織の分化において確立された役割を有する（Ｊ Ｍｅｒｃａｄｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４７巻（１００号）：５３２５〜５３３２頁、２００６年）。さらに、ＰＰＡＲ−γとＲＡＲＡの間の関係が示されている（Ａ Ｒｅｄｏｎｎｅｔら、Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓｉｔｙ、（２６巻）９２０〜９２７頁、２００２年）。
ＲＡＲＡ遺伝子座に関連するスーパーエンハンサーは、多数の型の血液系細胞においても検出されている。これは、ＣＤ１３３＋造血幹細胞、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ１９＋初期Ｂ細胞、ＣＤ２０ Ｂ細胞、ＣＤ３＋成熟Ｔ細胞、ＣＤ３４＋造血前駆細胞、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞、ＣＤ５６ナチュラルキラー細胞、およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を含む。これらの細胞においてＲＡＲＡに関連するスーパーエンハンサーが存在することにより、ＲＡＲＡアゴニストが、これだけに限定されないが、乾癬、多発性硬化症、関節リウマチ、強直性脊椎炎、セリアック病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデスおよび強皮症を含めた、ある特定の自己免疫疾患に罹患している患者のサブセットを処置するために有用であることが示唆される。
常染色体優性多発性嚢胞腎に罹患している患者に由来する細胞も、ＲＡＲＡに関連するスーパーエンハンサーを有することが見出されており、したがって、ＲＡＲＡアゴニストを用いた有効な処置の候補になり得る。ＡＤＰＫＤがレチノイドに応答し得ることの証拠がいくつか存在し（Ｑ Ｑｉａｎら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、（５９巻）：２００５〜２０２２頁、２００１年）、したがって、ＲＡＲＡ遺伝子座に関連するＳＥも有する患者の同定を、ＲＡＲＡ選択的アゴニストに応答する可能性がより高い患者をより良好に選択するための層別化方法として使用することができる。
一部の実施形態では、本発明の方法において、および本発明の包装された医薬組成物によって処置される疾患は、がんである。これらの実施形態の一部の態様では、処置される疾患は、乳がん、神経膠芽腫、神経芽細胞腫およびＡＭＬから選択される。これらの実施形態の一部のより具体的な態様では、処置される疾患は、乳がん、神経膠腫、子宮頸部および子宮頚管内の癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ ａｎｄ ｅｎｄｏｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、結腸および直腸の腺癌、頭頸部扁平上皮癌、腎臓の乳頭状腎細胞癌（ｋｉｄｎｅｙ ｒｅｎａｌ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肺腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫、傍神経節腫、皮膚黒色腫（ｓｋｉｎ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｍｅｌａｎｏｍａ）、子宮癌、ＭＤＳおよびＡＭＬから選択される。これらの実施形態の一部のより具体的な態様では、処置される疾患は、乳がん、ＭＤＳおよびＡＭＬから選択される。これらの実施形態の一部のより具体的な態様では、処置される疾患は、乳がんおよびＡＭＬから選択される。これらの実施形態のさらに具体的な態様では、処置される疾患は、ＲＡＲＡ遺伝子を伴う染色体転座を特徴としない非ＡＰＬ ＡＭＬまたはＡＭＬである。
一部の実施形態では、ＲＡＲＡアゴニスト（例えば、タミバロテン）を用いて処置される被験体は、再発または難治性ＡＭＬに罹患している。被験体は、ａ）導入化学療法の第１のサイクル後に部分奏効が示されない；またはｂ）導入化学療法の第２のサイクル後に完全奏効が示されない；またはｃ）従来の化学療法後に再発する；またはｄ）再発が単回の幹細胞移植を受けている場合、再発または難治性ＡＭＬを有するとして分類される。
一部の実施形態では、ＲＡＲＡアゴニスト（例えば、タミバロテン）を用いて処置される被験体は、難治性ＭＤＳに罹患している。被験体は、ａ）高リスクもしくは中間−２ ＭＤＳ（国際予後判定システム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｔａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）（「ＩＰＰＳ」）を使用して決定される）を有するとしてカテゴリー化され、かつ、低メチル化剤（例えば、アザシチジン、デシタビン）を用いた少なくとも４サイクルの導入療法後にいかなる血液学的改善も達成できなかった（ＩＷＧ２００６判定基準によって測定される）、もしくは任意の持続時間の完全奏効もしくは部分奏効後に再発した；またはｂ）ＩＰＳＳ中間−１もしくは低リスクＭＤＳとしてカテゴリー化され、輸血依存性であるかもしくは赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）を用いた処置に失敗している場合、難治性ＭＤＳを有するとして分類される。
他の実施形態では、ＲＡＲＡアゴニスト（例えば、タミバロテン）を用いて処置される被験体は、高齢の不適当な被験体である。「高齢の不適当な」という用語は、本明細書で使用される場合、被験体が、少なくとも６０歳であり、標準の導入療法の候補にならないことが医師により決定されたヒトであることを意味する。
ＲＡＲＡアゴニスト
ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーを有すると同定された患者を処置するために用いるＲＡＲＡアゴニストの選択は、当技術分野で公知の任意のＲＡＲＡアゴニストから行うことができる。本発明の方法において利用するＲＡＲＡアゴニストは、ＲＡＲＡに特異的であり、他の形態のＲａＲ、例えば、ＲａＲ−βおよびＲａＲ−γに対するアゴニスト活性が有意に低い（少なくとも１０分の１、少なくとも１００分の１、少なくとも１，０００分の１、少なくとも１０，０００分の１、少なくとも１００，０００分の１）ことが好ましい。
一部の実施形態では、ＲＡＲＡアゴニストは、それぞれが参照により組み込まれる以下の米国特許：ＵＳ４，７０３，１１０、ＵＳ５，０８１，２７１、ＵＳ５，０８９，５０９、ＵＳ５，４５５，２６５、ＵＳ５，７５９，７８５、ＵＳ５，８５６，４９０、ＵＳ５，９６５，６０６、ＵＳ６，０６３，７９７、ＵＳ６，０７１，９２４、ＵＳ６，０７５，０３２、ＵＳ６，１８７，９５０、ＵＳ６，３５５，６６９、ＵＳ６，３５８，９９５、およびＵＳ６，３８７，９５０のいずれか１つに開示されている化合物またはそこに記載されている種類の範囲内に入る任意の化合物から選択される。
一部の実施形態では、ＲＡＲＡアゴニストは、表１に記載されている以下の公知のＲＡＲＡアゴニストのいずれか、または薬学的に許容されるその塩、または前述の溶媒和物または水和物から選択される：
一部の実施形態では、ＲＡＲＡアゴニストは、タミバロテンである。一部の実施形態では、ＲＡＲＡアゴニストは、
である。
包装された医薬組成物
本発明の包装された医薬組成物は、がんに罹患しており、かつ、閾値レベルと等しいまたはそれを上回る強度もしくは順位ランク、または閾値レベルと等しいまたはそれを上回るＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーを有することが決定された被験体におけるＲＡＲＡアゴニストの使用に関する指示を含む折込み書面またはラベルを含む。上で詳細に記載されている通り、閾値レベルは、処置のために医薬組成物が適応されるものと同じ疾患に罹患していると診断された被験体または同じ疾患の細胞株もしくは異種移植モデルのいずれかに由来する試料の集団において決定される。指示は、ＲＡＲＡアゴニストを含む容器に付着していてもよく、他のやり方で添付されていてもよい。あるいは、指示およびＲＡＲＡアゴニストを含む容器は互いと分離されていてもよいが、単一のパッケージ、箱または他の型の容器中に存在する。
包装された医薬組成物中の指示は、一般には、ＲＡＲＡアゴニストの治療的使用を承認する政府機関によって指令または推奨されたものである。指示は、スーパーエンハンサーがＲＡＲＡ遺伝子に関連するかどうかを決定する特定の方法、ならびにＲＡＲＡ遺伝子に関連するエンハンサーがスーパーエンハンサーであるかどうかを決定するための定量方法、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを決定するための定量方法；および／または、包装されたＲＡＲＡアゴニストを用いた処置が推奨され、かつ／または治療的に有効であると仮定される、スーパーエンハンサーもしくはＲＡＲＡ ｍＲＮＡの閾値レベルを含み得る。一部の態様では、指示は、組成物を、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルが、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルが測定された集団の少なくとも３０パーセンタイルに入る被験体に投与することを指示するものである（ｄｉｒｅｃｔ）。これらの実施形態の一部の態様では、被験体は、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの分布ランクが、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルが測定された集団において７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、４３％、４２％、５１％、５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、または２０％である場合、ＲＡＲＡアゴニストレスポンダーであると同定される。一部の態様では、指示は、組成物を、特定のアッセイによって測定されるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの被験体（ａ ｓｕｂｊｅｃｔ ｗｈｏｓｅ ＲＡＲＡ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌ ａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｓｓａｙ）に投与することを指示するものである。
指示は、任意選択で、投薬情報、ＲＡＲＡアゴニストを用いた処置が承認されたがんの型、ＲＡＲＡアゴニストに関する物理化学的情報；ＲＡＲＡアゴニストに関する薬物動態情報、薬物−薬物相互作用に関する情報を含み得る。一部の態様では、指示は、組成物を、非ＡＰＬ ＡＭＬに罹患していると診断された被験体に投与することを指示するものである。他の態様では、指示は、組成物を、乳がんに罹患していると診断された被験体に投与することを指示するものである。一部の態様では、指示は、組成物を、ＭＤＳに罹患していると診断された被験体に投与することを指示するものである。一部の態様では、医薬組成物は、タミバロテンを含む。一部の態様では、医薬組成物は、ＡＧＮ−１９５１８３を含む。
本明細書に記載の発明をより詳細に理解することができるように、以下の実施例を記載する。本出願に記載されている合成および生物学的例は、本明細書で提供される化合物、医薬組成物、および方法を例示するものであり、いかなる形でもそれらの範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
（実施例１）
ＲＡＲＡに関連するスーパーエンハンサーを同定するためのＣｈＩＰ−ｓｅｑ解析
Ｉ．細胞の架橋。培養細胞に関しては、概して、細胞５×１０７〜１×１０８個の間について一度に架橋を行う（８〜１２枚の１５ｃｍ２プレート中の付着細胞または８〜１２個の１７５ｃｍ２フラスコ中の浮遊細胞について７０〜８０％集密度と同等である）。各位置解析反応に２０００万〜５０００万個の細胞を使用する。付着細胞に関しては、１／１０体積の新鮮な１１％ホルムアルデヒド溶液（０．１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ８、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ）をプレートに添加し、プレートを簡単に回転させ、室温（「ＲＴ」）で８分間静置する。次いで、ホルムアルデヒドをクエンチするために１／２０体積の２．５Ｍのグリシンまたは１／２体積の１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５を添加し、少なくとも１分間インキュベートする。次いで、細胞を冷１×リン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）２０ｍｌで３回すすぎ、シリコンスクレーパーを使用して細胞を収集し、細胞を、卓上遠心分離機において４℃、２ｋで１０分間、遠心する（ｓｐｉｎ）。次いで、細胞を１５ｍｌの円錐管に移し、４℃、２ｋで１０分間、遠心する。ペレット化した細胞を液体窒素中で急速冷凍し、−８０℃で保管する。
懸濁液中の細胞に関しては、１／１０体積の新鮮な１１％ホルムアルデヒド溶液を細胞懸濁液に添加し、混合し、混合物を室温で８分間静置する。次いで、１／２０体積の２．５Ｍのグリシンまたは１／２体積の１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５を添加してホルムアルデヒドをクエンチし、少なくとも１分間インキュベートする。次いで、細胞を冷１×ＰＢＳ２０〜５０ｍｌで３回すすぎ、各洗浄の前後に２，０００ＲＰＭで５分間遠心分離して細胞をペレット化する。次いで、細胞を１５ｍｌの円錐管に移し、４℃、２ｋで５分間、遠心する。上清を除去し、残った液体はキムワイプを軽くはたくように当てることによって除去し、次いで、ペレット化した細胞を液体窒素中で急速冷凍し、−８０℃で保管する。
一次血液から得た細胞については、試料当たり細胞２×１０５〜１×１０７個について、１／１０体積の新鮮な１１％ホルムアルデヒド溶液（０．１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ８、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ）を添加することによって架橋を行い、架橋は、室温で８分間進行させた。次いで、１／２０体積の２．５Ｍのグリシンまたは１／２体積の１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５を添加してホルムアルデヒドをクエンチし、少なくとも１分間インキュベートする。次いで、細胞を冷１×ＰＢＳ１〜２ｍｌで３回すすぎ、細胞を遠心分離によって収集する。次いで、細胞ペレットを、記載されているＣｈＩＰ−ｓｅｑ解析に直接供する。
一次固形組織から得た細胞に関しては、ＣｈＩＰ当たり凍結組織２５０〜５００ｕｇを使用する。凍結組織を、かみそりの刃（冷表面上、＜−８０℃）およびはさみを用い、１％ホルムアルデヒド溶液（１％ホルムアルデヒド；０．１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ８、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ）中、２分間でさいの目に切る。組織を切り刻んで２分間で細かいスラリーにし、スラリーに１％ホルムアルデヒド溶液９ｍｌを添加する。架橋を進行させて総時間を８分にする。次いで、１／２０体積の２．５Ｍのグリシンまたは１／２体積の１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５を添加してホルムアルデヒドをクエンチし、少なくとも１分間インキュベートする。次いで、細胞を冷１×ＰＢＳ１〜２ｍｌで３回すすぎ、細胞を遠心分離によって収集する。細胞をＰＢＳ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤を含有する）６ｍｌに再懸濁させ、ルーズペストルホモジナイザー（ｌｏｏｓｅ ｐｅｓｔｌｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で約４０回ダウンスホモジナイズを行う。細胞を、３，０００ＲＰＭで２分間遠心分離することによって回収する。上清を除去し、ペレット化した細胞を、記載されているＣｈＩＰ−ｓｅｑ解析のために、液体窒素中で急速冷凍する。
ＩＩ．磁気ビーズへの抗体の結合。免疫沈降物２ｍｌ当たり６０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇを使用する（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ビーズを３回、それぞれ１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ ｗ／ｖ）１．０ｍｌを用いて５分間洗浄する。各洗浄後に磁石（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してビーズを収集し（磁石で少なくとも完全に１分間、結合させる）、次いで上清を吸引する。洗浄したビーズをブロッキング緩衝液２５０ｕｌに再懸濁させ、それに抗体６μｇを添加し、混合物を、転倒混合させながら一晩（最低６時間）インキュベートする。抗体が結合したビーズを３回、それぞれブロッキング緩衝液１ｍｌを用いて５分間洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＩＰ当たり６０ｕｌ）に再懸濁させる。これらの最後の洗浄および再懸濁は、細胞を一旦超音波処理し（次のステップを参照されたい）、一晩の免疫沈降の直前に行う。
ＩＩＩ．細胞調製およびゲノム断片化。１×プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ；錠剤１個をＨ２Ｏ１ｍｌに溶解させて５０倍溶液にすることによって調製し、一定分量、−２０℃で保管する）を全ての溶解緩衝液に使用前に添加する。細胞（およそ５×１０７個の細胞）のチューブそれぞれを溶解緩衝液１（ＬＢ１；１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．５％ＮＰ−４０、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）５〜１０ｍｌに再懸濁させ、４℃で１０分間振盪する。細胞を、卓上遠心分離機において４℃、２，０００ＲＰＭで５分間、遠心分離し、上清を吸引除去する。細胞を溶解緩衝液２（ＬＢ２；２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８）５ｍｌに再懸濁させ、転倒混合させながら４℃で１０分間インキュベートする。細胞を、卓上遠心分離機において４℃、２，０００ＲＰＭで５分間、再度ペレット化し、Ｃｏｖａｒｉｓ超音波処理緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）２〜５ｍｌで洗浄する。ペレットを卓上遠心分離機において４℃、２，０００ＲＰＭで５分間、遠心沈澱させる。細胞を卓上遠心分離機において４℃、２，０００ＲＰＭで５分間、ペレット化し、Ｃｏｖａｒｉｓ超音波処理緩衝液１ｍｌ当たり細胞２０００万〜５０００万個の濃度で再懸濁させる。
細胞溶解物１ｍｌを１２×１２ Ｃｏｖａｒｉｓマイクロチューブに入れ、全部で５分間、超音波処理する（最大出力１４０、デューティ比５．０、サイクル／バースト２００）。超音波処理物を１５ｍｌのチューブ１本に再度まとめ、１体積の２倍希釈用混合物（Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｉｘ）（３００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、０．１％ＳＤＳ）を添加し、不溶性画分を４℃、１４，０００ＲＰＭで１０分間にわたってペレット化し、上清を採取して単一のチューブに入れる。上清をクロマチン免疫沈降のためのＣｈＩＰ Ｉｎｐｕｔとして使用する。また、全細胞抽出物（「ＩＮＰＵＴ」）試料対照用に細胞溶解物５０μＬを採取する。
ＩＶ．クロマチン免疫沈降。ステップＩＩからの抗体とコンジュゲートしたビーズ５０μＬを、１．５ｍｌのチューブ中、清澄化した細胞抽出物（ステップＩＩＩにおいて調製）溶液に添加し、４℃で一晩（最低８時間）振盪して、ＤＮＡ−タンパク質複合体を免疫沈降させる。
Ｖ．洗浄、溶出、および脱架橋。これらのステップにおいて使用する緩衝液は全て氷冷のものである。磁気スタンドを使用して磁気ビーズを沈殿させ、３回、それぞれ、洗浄緩衝液１（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５；１４０ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ；１ｍＭのＥＧＴＡ；０．７５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ；０．１％ＳＤＳ；０．０５％ＤＯＣ）１ｍｌを用い、穏やかに転倒混合させながら５分間洗浄し、洗浄緩衝液２（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５；５００ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ；１ｍＭのＥＧＴＡ；０．７５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ；０．１％ＳＤＳ；０．０５％ＤＯＣ）１ｍｌを用いて５分間、１回洗浄し、洗浄緩衝液３（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０；１ｍＭのＥＤＴＡ；５０ｍＭのＮａＣｌ）１ｍｌを用いて５分間、１回洗浄する。残留した洗浄緩衝液の全てを吸引し、ビーズを２，０００ＲＰＭで１分間、穏やかに遠心し、チューブを磁石上に戻し、極微量の緩衝液を全て除去する。次いで、溶出緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８；１０ｍＭのＥＤＴＡ；１％ＳＤＳ）２１０μｌを添加し、６５℃で６０分間、１５分ごとに簡単にボルテックスしてビーズを再懸濁させて、溶出させる。磁石を使用してビーズを上清から分離し、上清２００μＬを取り出し、脱架橋（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）のために、きれいなチューブに入れる。ＩＰおよび全細胞抽出物画分の両方について６５℃で一晩（最低８時間、最大１８時間）、脱ｘ−架橋を行う（ｒｅｖｅｒｓｅ ｘ−ｌｉｎｋ）。次いで、加熱を使用して、免疫沈降用の試料および全細胞抽出物画分の両方について、６５℃で一晩（最低８時間、最大１８時間）インキュベートすることによって別々に脱架橋を行う。加熱により、ホルムアルデヒド架橋の加水分解が容易になる。
ＶＩ．ＤＮＡの清澄化および精製。ＴＥ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８；１ｍＭのＥＤＴＡ）２００μｌおよび３０ｍｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅＡ（最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌ）２．７μｌを各試料に添加し、混合し、３７℃で２時間インキュベートする。次いで、塩化カルシウム溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０中３００ｍＭのＣａＣｌ２）５μｌを２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度）４μＬと一緒に各試料に添加し、混合し、５５℃で６０分間インキュベートする。次いで、２５：２４：１の比のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｐ３８０３）４００μｌを各チューブに添加し、ボルテックスミキサーにおいて低設定（５／１０）で混合し、各チューブを反転させてさらに混合する。
ＰｈａｓｅＬｏｃｋ Ｇｅｌ（商標）チューブ（Ｑｉａｇｅｎ、３ Ｐｒｉｍｅ）を、各試料について、チューブを室温、１０，０００ＲＰＭで３０秒間遠心することによって調製する。次に、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール中の試料ＤＮＡ試料をＰｈａｓｅＬｏｃｋ Ｇｅｌ（商標）チューブに添加し、室温、１２，０００〜１６，０００×ｇで２分間遠心する。水溶液を新しい１．６ｍｌのチューブに移し（上の画分）、５ＭのＮａＣｌ、２０ｕｌ、および２０ｕｇ／ｕｌのグリコーゲン１．５ｕｌ（全部で３０ｕｇ）を添加し、次いで、ＥｔＯＨ、１ｍｌを添加し、ボルテックスまたは反転によって混合する。次いで、試料を−２０℃で一晩（６〜１６時間）インキュベートする。次いで、混合物を４℃、２０，０００×ｇで２０分間遠心してＤＮＡをペレット化し、１ｍｌのピペットチップを用いて上清を除去し、ペレットを８０％ＥｔＯＨ、８００μｌで洗浄し、４℃、２０，０００×ｇで２０分間遠心し、１ｍｌのピペットチップを用いて上清を除去する。試料を再度２０，０００×ｇで１分間遠心し、極微量の上清全てを除去し、５〜２０分風乾する。ペレットは、そのまわりに水の暈（ａ ｈａｌｏ ｏｆ ｗａｔｅｒ）を有すべきでなく、ガラス状またはフレーク状の乾燥したものであるべきである。次いで、ペレットを水６０μｌに溶解させ、１０μｌをｑＰＣＲ検証のために使用し、５０μｌを配列決定のために使用する。ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲに関しては、ウェル当たり試料１ｕＬを使用し、それぞれＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の２×Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘと混合した０．８ｕＭのフォワード（Ｆ）プライマーおよびリバース（Ｒ）プライマーを用い、製造者のプロトコールに従って増幅を実施する。使用するプライマーは下記の表に示されている通りであり、ここで、Ｖ１、Ｖ２、およびＶ３は、ＲＡＲＡエンハンサー内の異なる領域にハイブリダイズさせるために設計されたプライマー対であり、「ｄｏｗｎ」は下流の非アセチル化、非遺伝子コード制御領域にハイブリダイズさせるために設計されたプライマー対である。
強く応答性の細胞株（Ａｕ５６５）および弱く応答性の細胞株（Ｔ４７Ｄ）についてのＣｈＩＰ−ｑｐＣＲの結果が各細胞からの全細胞抽出物（「ＷＣＥ」）と比較して図１Ａ〜Ｂに示されている。この図では、これらのプライマーが、これらの細胞株についてのエンハンサーにおけるＨ３Ｋ２７ａｃマークの強力な富化の測定において、近くの遺伝子間の制御領域に対して正規化後、プルダウンにおいては有効であるがＷＣＥでは有効でないことが例示される。
ＶＩＩ．ＲＡＲＡスーパーエンハンサーのＣｈＩＰ Ｓｅｑ解析および数量化。Ｈ３Ｋ２７ａｃ ＣｈＩＰ−ｓｅｑを使用する、上記の方法体系を使用して、ｃｈｒ１７：３８４５８１５２−３８５１６６８１（ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ ｈｇ１９）におけるＲＡＲＡ遺伝子とオーバーラップしているスーパーエンハンサー遺伝子座を同定する。この染色体領域は、調査される試料にわたってコンセンサスによって指定されたが、どのゲノムマーカーを検出するかまたはどの組織の型が使用されるかに基づいて、いくらか変動し得る。異なる試料にわたってこのスーパーエンハンサー遺伝子座の強度を評価するために、各試料においてＨ３Ｋ２７ａｃ ＣｈＩＰ−ｓｅｑを実施し、また、適合するＣｈＩＰ Ｉｎｐｕｔ試料の配列決定も行う。全てのＨ３Ｋ２７ａｃ試料およびＩｎｐｕｔ試料を、Ｂｏｗｔｉｅ２（感受性パラメータを使用する）を使用してｈｇ１９ゲノムとアラインメントする。図２に示されている遺伝子追跡可視化は、１ｂｐのビン内でアラインメントされた読み取りの計数を示す代表的な細胞の試料を示し、各読み取りは、アラインメントの方向に２００ｂｐ伸長している。読み取りの計数は、アラインメントされた読み取り百万当たりのアラインメントされた読み取りの数（ＲＰＭ）である。ＡＵＣは、定義済みの遺伝子座内の各塩基対における読み取りを合計することによって算出される。ＲＡＲＡスーパーエンハンサー遺伝子座の位置に基づいて、種々の細胞株および患者試料からの既存のＨ３Ｋ２７ａｃ ＣｈＩＰ−ｓｅｑマップにおいてＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサー遺伝子座と比較したＲＡＲＡスーパーエンハンサーのレベルも評価した。
各Ｈ３Ｋ２７Ａｃ／Ｉｎｐｕｔ試料対（図３の表の横列）について、ＲＡＲＡスーパーエンハンサー（ｃｈｒ１７：３８４５８１５２−３８５１６６８１）またはＭＡＬＡＴ１における陽性対照スーパーエンハンサー（ｃｈｒ１１：６５２６３７２４−６５２６６７２４）のいずれかとアラインメントされるＨ３Ｋ２７Ａｃ読み取りまたはＩｎｐｕｔ読み取りの数を計数する。読み取りの計数は全てＲＰＭである。次いで、両方の遺伝子座におけるＨ３Ｋ２７ＡｃシグナルからＩｎｐｕｔシグナルを引いてバックグラウンド（ＤＩＦＦ縦列）に対するＨ３Ｋ２７ａｃ ＣｈＩＰ−ｓｅｑ読み取りの富化を得る。最後に、ＭＡＬＡＴ１陽性対照スーパーエンハンサーと比較したＲＡＲＡスーパーエンハンサーの強度を評価するために、ＲＡＲＡスーパーエンハンサーＨ３Ｋ２７Ａｃ富化シグナルの、ＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサーにおけるＨ３Ｋ２７Ａｃ富化シグナルに対する比を算出し、この比をＲＡＲＡ／ＭＡＬＡＴ１縦列に報告する。値が大きいほどより強力なＲＡＲＡスーパーエンハンサースコアを示した。ｌｏｇ１０（ＲＡＲＡ／ＭＡＬＡＴ１）比も算出する。試験した各試料についてのこれらの値の全てが図３に示されている。
乳がん細胞株およびＡＭＬ細胞株ならびに患者試料の全てについてのＲＡＲＡ／ＭＡＬＡＴ１のｌｏｇ１０比を、それぞれ図４Ａおよび４Ｂに示されている通りグラフ化する。各グラフに示されている０．４ｌｏｇ１０閾値は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞株においてタミバロテンに対して感受性であることが見出された最低ＳＥ強度である。これらのグラフからわかるように、各がんの型の試料のうちのある特定の百分率がこの閾値を上回る。図５は、試験した正常な血液系細胞株および患者試料についてのＲＡＲＡ／ＭＡＬＡＴ１のｌｏｇ１０比を示す。それからわかるように、試験した各血液系細胞の試料のうちのある特定の百分率が閾値を上回り、これにより、この型の患者層別化が、ＲＡＲＡアゴニストに対して応答性である血液障害を有する被験体を同定するために有用である。
ＲＡＲＡ ＳＥランクを、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，１８１，５８０号に記載されているＲＯＳＥを使用して算出する。まず、ＲＯＳＥを使用して、乳がん細胞株およびＡＭＬ細胞株ならびに患者試料の全てについてエンハンサースコアを算出する。各試料の中で、エンハンサーをスコアによってランク付けし、ＲＡＲＡスーパーエンハンサーのランクは、最高スコアを有する、ＲＡＲＡ遺伝子（ｃｈｒ１７：３８４６５４４４−３８５１３０９４）とオーバーラップしているエンハンサーのランクである。
図６は、乳がん細胞株およびＡＭＬ細胞株対乳がん患者試料およびＡＭＬ患者試料についてのＲＡＲＡ／ＭＡＬＡＴ１のｌｏｇ１０比の比較を示す。この図からわかるように、どちらのがんの型においても、患者試料では、対応する細胞株よりもＲＡＲＡが統計的に有意に高レベルである。これにより、ＲＡＲＡスーパーエンハンサーレベルが高いことは、細胞株に限定されるｉｎ ｖｉｔｒｏ現象ではないことが実証される。さらに、これにより、より高い割合の患者試料が、細胞株よりもＲＡＲＡアゴニストに対する応答性を示すことが予測されることが例証される。
（実施例２）
乳がん細胞パネルに対する種々のＲａＲモジュレーター化合物のスクリーニング
Ｉ．材料。細胞株は全てＡＴＣＣから入手し、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。全て、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、５０Ｕ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を補充したＲＰＭＩ１６４０中で成長させる。細胞株には、ＡＵ５６５、ＳＫＢＲ３、Ｔ４７Ｄ、ＨＣＣ１１４３、ＭＣＦ７、ＺＲ−７５−１、およびＨＣＣ１５６９を含めた。
タミバロテン、ＡＭ５８０、およびトレチノインはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手する。タザロテン酸はＣａｒｂｏｓｙｎｔｈから入手する。アダパレン、ＢＭＳ１９５６１４、ＢＭＳ４９３、ＢＭＳ９６１はＴｏｃｒｉｓから入手する。ＥｔｒｅｔｉｎａｔｅはＳａｎｔａ Ｃｒｕｚから入手する。タザロテンはＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから入手する。
ＲａＲの各型に対する種々の試験化合物のアゴニスト特異性をＬｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにおいてＳｅｌｅｃｔＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅｓを使用して評価する。得られた値を以下の表に示す：
上記の表からわかるように、タミバロテン、ＢＭＳ７５３およびＡＭ５８０は、ＲａＲ−γを超えてＲＡＲＡに対して最大の特異性を有し、したがって、ＲＡＲＡ特異的アゴニストとしてのそれらの地位が確認される。ＲａＲ−γのアゴニズムには毒性が伴うので、この特異性は重要である。ＲａＲ−βのアゴニズムは、有効性または毒性に寄与することは知られておらず、したがって、アゴニストの治療的潜在性に影響を及ぼさないはずである。
ＩＩ．ミディアムスループットスクリーニング。実験当日に、細胞を、Ａｃｃｕｍａｘ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してホモジナイズし、計数し、適切な成長培地中、乳がん株については１ｍｌ当たり細胞４０，０００個、ＡＭＬについては１ｍＬ当たり細胞６０，０００個に調整する。Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬ４０６を使用して、細胞５０μｌを白色（ＡＴＰｌｉｔｅ）または黒色（ＣｙＱｕａｎｔ）３８４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ）に分布させる。細胞を３７℃インキュベーターに戻して付着させる。３時間後、Ｊａｎｕｓワークステーションで２０ｎｌの３８４ウェルピントランスファーマニホールドを使用して化合物をプレートに添加する。ストックを、３８４ウェルの化合物プレートにおいて、ＤＭＳＯストック中１０点４つ組用量応答（１０ ｐｏｉｎｔ ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ ｄｏｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）に配列する。化合物を添加した後、プレートを３７℃インキュベーター中で５日間または１０日間インキュベートする。
細胞の生存率を、ＡＴＰｌｉｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）またはＣｙＱｕａｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して読み取る。ＡＴＰｌｉｔｅに関しては、プレートを、使用前にインキュベーターから取り出し、室温にする。ＡＴＰｌｉｔｅ試薬の凍結乾燥粉末を溶解緩衝液に再懸濁させ、蒸留水を用いて１：２に希釈する。この溶液２５μＬを、Ｂｉｏｔｅｋリキッドハンドラーを使用して各ウェルに添加する。プレートを室温で１５分間インキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で発光シグナルを読み取る。ＣｙＱｕａｎｔに関しては、試薬を、製造者の指示の通りＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中に混合する。多チャネルピペットを使用して試薬を添加し、プレートを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）での読み取り前の３０分間インキュベーターに戻す。
記載の通り取得したデータをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌに保存し、群分けし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して解析する。ＥＣ５０およびＥｍａｘを算出するための曲線当てはめを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．０において、４パラメータ（ヒルスロープを１と等しいと仮定しない）非線形回帰を使用して行い、プレートに含めた、ＤＭＳＯのみで処理したウェルに対して正規化するときには、化合物濃度のｌｏｇ１０変換したデータを、細胞のパーセント生存率に対してプロットする。エッジウェルは除外した。
図７に示されている通り、４種の異なる乳がん細胞株は、タミバロテンに対して異なる応答を示し、感受性の順位はＳＫＢＲ３＞Ａｕ５６５＞ＺＲ７５＞Ｈｃｃ１１４３である。これは、図２に示されている通り、ＲＡＲＡ部位におけるスーパーエンハンサーのレベルと非常によく相関する。７種の異なる乳がん細胞株についてのタミバロテンに対する感受性とスーパーエンハンサー強度の相関（ｌｏｇ１０ＥＣ５０対ＲＡＲＡ／ＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサー比率）が図８に示されており、相関（Ｒ２）値は０．７０８６である。
図９に示されている通り、３種の異なるＡＭＬ細胞株は、タミバロテンに対して異なる応答を示し、感受性の順位はＳｉｇＭ５＞ＯＣＩ Ｍ１＞ＨＥＬである。図２３Ａ〜Ｂに示されている通り、２種の追加のＡＭＬ細胞株、ＭＶ４１１およびＫａｓｕｍｉをＳｉｇＭ５およびＨＥＬと一緒にタミバロテンに対する感受性についてアッセイし、実証された感受性の順位はＳｉｇＭ５＞ＭＶ４１１＞ＨＥＬ＝Ｋａｓｕｍｉである。１１種の異なるＡＭＬ細胞株についてのタミバロテンに対する感受性とスーパーエンハンサー強度の相関（ｌｏｇ１０ＥＣ５０対ＲＡＲＡ／ＭＡＬＡＴ１スーパーエンハンサー比（「ＩＥＡ」）が図１０に示されており、相関（Ｒ２）値は０．３６３５であるが、その値は、標準からの有意な偏差を示す１種の細胞株（ＳＥはより高いが期待される感受性よりも低い）、ＨＥＬを考慮に入れない場合０．５６８０まで増大する。
（実施例３）
ＲＡＲＡ ＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルの測定
発現レベル測定値を用いて、タグを付けたＲＡＲＡ遺伝子についてのｍＲＮＡのレベルを確認する。ｍＲＮＡレベルはエンハンサーレベルとよく相関し、したがって、同様にＲＡＲＡアゴニストに対する感受性の予測になる。下記の通り種々のＲＮＡの測定手段を使用する。
Ｉ．アレイに基づく技術。ＨＣＣ１１４３およびＡＵ５６５における発現レベルを、細胞１×１０６個の３連のバッチを用いて評価する。ＲＮＡを、製造者のプロトコールに従って、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）を使用して細胞から抽出し、ｍｉｒＶａｎａ（商標）ＲＮＡ精製キットを使用して精製する（どちらもＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）。ＲＮＡレベルを、Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｃｏｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｂｃｆ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／）においてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＰｒｉｍｅＶｉｅｗ（商標）アレイで読み取る。
図１１は、上記のプロトコールを使用して測定した、タミバロテン応答性細胞株（Ａｕ５６５）およびタミバロテン非応答性細胞株（ＨＣＣ１１４３）における種々のＲａＲ亜型のｍＲＮＡ発現のレベルを示す。ＲＡＲＡ ｍＲＮＡの発現は、応答性細胞株では非応答性細胞株の８倍であるが、ＲａＲ−βおよびＲａＲ−γの発現は細胞株間で有意には異ならない。これにより、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡ発現解析が、ＲＡＲＡアゴニストに対するＲＡＲＡスーパーエンハンサーの強度および感受性と相関することが確認され、また、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを使用して、そのようなアゴニストに対する感受性を予測することができることが実証される。
ＩＩ．ＲＮＡ−Ｓｅｑ。ＲＡＲＡ発現レベルをＲＮＡ−Ｓｅｑによって数量化する。ポリ−Ａ ＲＮＡ−Ｓｅｑを実施し、読み取りをＲＳＥＭソフトウェア（パラメータ＝−−ｓａｍｔｏｏｌｓ−ｓｏｒｔ−ｍｅｍ ３Ｇ−−ｃｉ−ｍｅｍｏｒｙ ３０７２−−ｂｏｗｔｉｅ−ｃｈｕｎｋｍｂｓ １０２４−−ｑｕｉｅｔ−−ｏｕｔｐｕｔ−ｇｅｎｏｍｅ−ｂａｍ−−ｂｏｗｔｉｅ２−−ｓｔｒａｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）を使用してＨＧ１９トランスクリプトームとアラインメントし、次いで、ＲＳＥＭを使用してｍＲＮＡ数量化を行い、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ Ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ（ＴＰＭ）で報告する。プロット値は、４８種の原発性ＡＭＬ患者についての、スーパーエンハンサースコア（ＲＡＲＡ／ＭＡＬＡＴ１）に対するＲＡＲＡ（ｙ軸）についてのｌｏｇ２（ＦＰＫＭ＋１）レベルを示し（図１２）、スピアマン相関は０．５８９であり、Ｒ２値は．０４５７である。
ＩＩＩ．ｑＰＣＲ。発現をｒｔ−ｑＰＣＲを使用しても研究する。細胞を計数し、各細胞株について１ｍＬ当たり細胞２００，０００個でプレーティングする。次いで、細胞を５００ｎＭのタミバロテンまたはビヒクルを用いて４８時間処理する。ＲＮＡを、製造者のプロトコールに従って、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）を使用して細胞から抽出し、ｍｉｒＶａｎａ（商標）ＲＮＡ精製キットを使用して精製する（どちらもＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）。精製したＲＮＡを、製造者のプロトコールに従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｖｉｌｏ（商標）逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、ｃＤＮＡに変換する。次いで、ＲＡＲＡおよび正規化用に１８ｓ ｒＲＮＡに対してＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して転写産物の存在量を測定する。ＲＡＲＡに関しては、アンプリコン長が６８であり、エクソン６〜７にわたるプローブＨｓ００９４０４４６＿ｍ１を使用する。１８Ｓ ｒＲＮＡに関しては、１８７ｂｐのアンプリコンを有するプローブ４３１９４１３Ｅを使用した。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、製造者のプロトコールに従ってｑＰＣＲを行う。デルタＣｔ法を使用してデータの解析を実施する。１８ｓ ｒＲＮＡ Ｃｔ値を各試料から引いて細胞存在量に対して正規化する。ｄＣｔ値は、ＲＮＡ転写産物の存在量の相対的な差異倍率を示す。ｄＣｔ値が低いほど、ｍＲＮＡ発現が高いことが示される。ＳＥ強度の順（最高（ＳＫＢＲ３）から最低（ＨＣＣ１１４３）まで）にグラフにした６種の異なる乳がん細胞株についてのｒｔ−ｑＰＣＲ値に関する結果が図１３に示されている。それからわかるように、ｒｔ−ｑＰＣＲ値は、ＲＡＲＡ遺伝子座におけるスーパーエンハンサー強度とよく相関する。図１４Ａ〜Ｂは、ｄＣＴ値が、ＳＥ強度と、およびＥＣ５０によって測定される感受性と高い相関を有することを示す。
ＩＶ．ウエスタンブロッティング。細胞を計数し、細胞株当たり２百万個に調整し、ペレット化する。細胞ペレットを、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プラスＲｏｃｈｅプロテアーゼカクテルを１００μＬ体積で使用して溶解させる。試料を、２０，０００×ｇで５分間遠心分離することによって清澄化する。試料１０μＬを４〜１２％ビス−トリスゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にローディングする。使用する抗体は、ローディング対照に対してはＡｂｃａｍ１７９１ヒストンＨ３であり、ＲＡＲＡに対してはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＳＡＢ１４０４２９８である。結果が図１５に示されている。ＲＡＲＡタンパク質レベルと、スーパーエンハンサーのサイズまたはＲＡＲＡアゴニストに対する細胞の感受性のいずれにも良好な相関はないようである。これにより、同じくＲＡＲＡタンパク質の発現とレチノイド感受性の間に相関がないことを実証した別のグループによる以前の結果が確認される（Ｇ Ｐａｒｏｎｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、３１巻：３４３１〜４３頁（２０１２年）；参考文献の図１Ｃを参照されたい）。
Ｖ．ＴＣＧＡからのＺ−スコア。ＴＣＧＡデータセットからの発現のＺ−スコアをｃＢｉｏ Ｐｏｒｔａｌ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／ｐｕｂｌｉｃ−ｐｏｒｔａｌ／）から得る。
ＶＩ．ＭＤＳ発現測定。Ｇｅｒｓｔｕｎｇら（ＰＭＩＤ：２５５７４６６５）に関連するＭＤＳ患者１５９名および正常１７名の未加工のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現データをＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＳＥ５８８３１）からダウンロードする。試料全てにわたって発現データをＲにおいて「ｊｕｓｔＲＭＡ」機能を、デフォルトパラメータとともに使用して正規化して、正規化されたプローブレベル値をもたらす。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブ「２０３７４９＿ｓ＿ａｔ」の値を使用してＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを表す。１７の正常な試料におけるＲＡＲＡレベルに関する平均および標準偏差を算出し、次いで、それを使用してＲＡＲＡ ｍＲＮＡのＺ−スコアを生成する。
（実施例４）
ＲＡＲＡ遺伝子コピー数は、タミバロテンに対する感受性と相関しない。
Ｇ． Ｐａｒｏｎｉら、上記により示唆された、タミバロテンに対する感受性がＨＥＲ２遺伝子コピー数に基づくものであるという可能性、ならびにＲＡＲＡおよびＨＥＲ２の増幅が共依存性であるという可能性を除外するために、２種の応答性乳がん細胞株、Ａｕ５６５およびＴ４７ＤにおいてＲＡＲＡ遺伝子およびＨＥＲ２遺伝子のコピー数を解析する。ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、製造者の指示に従って抽出する。精製したＤＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ製のＨｕｍａｎ Ｃｙｔｏｓｃａｎ（登録商標）ＨＤマイクロアレイを使用して解析する。データをＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒからのパッケージＡｒｏｍａを使用して統計学的環境Ｒにおいて処理し、基本的なＲ図表を使用してグラフ化する。図１６Ａ〜Ｂに示されている通り、Ａｕ５６５細胞株はＲＡＲＡ（ボックス２）よりも高いＨＥＲ２遺伝子コピー数（ボックス１）を有するが、同等にタミバロテン応答性であるＴ４７Ｄ株では同じことは見られない。さらに、この２種の細胞株間にはＲＡＲＡ遺伝子コピー数に殆ど差がない。これにより、ＲＡＲＡ遺伝子コピー数の増幅がＨＥＲ２コピー数に依存しないこと、およびＲＡＲＡアゴニストに対する感受性がＨＥＲ２コピー数に依存しないことが実証される。
（実施例５）
他のがんにおけるＲＡＲＡに関連するスーパーエンハンサーの同定
追加の患者がん試料をプローブして、そのようながんがＲＡＲＡスーパーエンハンサーを有するかどうかを決定するために、ＲＡＲＡスーパーエンハンサードメインの公知の位置を使用する。神経膠芽腫および神経芽細胞腫患者試料の両方においてＲＡＲＡに関連する大きなスーパーエンハンサーが見出されたが、結腸直腸がん試料では見出されなかった（図１７を参照されたい）。これは、ＲＡＲＡアゴニストを用いた処置に関する患者の層別化を、神経膠芽腫または神経芽細胞腫のいずれかに罹患している患者においても行うことができることを示唆している。さらに、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルのＺ−スコア解析により、結腸直腸がんに罹患しているある特定の被験体が、これらのスーパーエンハンサーの結果にもかかわらず、ＲＡＲＡアゴニストに対して応答性であり得ることが示唆される（図３０を参照されたい）。
（実施例６）
ＨＣＣ１９５４乳がん細胞異種移植片のタミバロテンへの感受性
ＢＡＬＢ／ｃヌード免疫不全マウスにおける乳がん細胞株（ＨＣＣ１９５４）由来の異種移植モデルは、Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）により、基本的に以下の通り調製される。
６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃヌード免疫不全マウス、体重１８〜２０ｇに、腫瘍を発生させるために、ＰＢＳ０．１ｍｌ中のＨＣＣ１９５４腫瘍細胞（５×１０６）を右側側腹部領域に皮下接種する（１：１マトリゲル）。平均腫瘍サイズが１００〜２００ｍｍ３の体積に達したら、動物を、投薬に使用する処置群へと腫瘍体積によりマッチさせて、投薬を開始する。ｐＨ８に調整したＰＢＳ、１％ＤＭＳＯ中のタミバロテンを、毎日のスケジュール（１日１回、ＰＯ）で最大２１日間、経口投与する。マウスにおける最終の投与量は、１０ｍｌ／ｋｇの容量で、高用量治療群（ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ ａｒｍ）（ｎ＝１０）では１日当たり１ｋｇ当たり６ｍｇであり、低用量治療群（ｎ＝１０）では１日当たり１ｋｇ当たり３ｍｇである。ビヒクル治療群のマウス（ｎ＝１０）には、同じスケジュール、容量、および薬物を欠く製剤を与える。腫瘍体積を週２回、カリパス測定によって測定する。
これらの実験の結果から、タミバロテンにより、このモデルにおける腫瘍体積が用量依存的に減少することが実証される（図１８）。腫瘍体積の減少は、ウエルチ補正を使用したｔ検定により、低用量治療群では統計的有意性のすぐ下であり（ｐ＝０．０５５２）、高用量治療群では統計的に有意である（ｐ＝０．００４８）。この異種移植モデルにおける結果から、培養物中のＨＣＣ１９４５細胞のタミバロテンに対する感受性が確認される。
（実施例７）
乳がんにおけるＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位ランクカットオフ
１７０の乳がん試料（患者試料およびＨＣＣ１９５４を含めた乳がん細胞株の両方）の全エンハンサー／スーパーエンハンサープロファイルを、Ｈ３Ｋ２７Ａｃおよび実施例１に記載のＣｈＩＰ−Ｓｅｑを使用して解析する。試料のそれぞれにおいて、ＲＡＲＡに関連するエンハンサーの強度（Ｈ３Ｋ２７Ａｃによって測定される）に関する順位ランクを同じ細胞における他のエンハンサーおよびスーパーエンハンサーと比較して決定し、決定された順位ランクをランク順位の棒グラフにプロットする（図１９）。ＨＣＣ１９５４では、ＲＡＲＡスーパーエンハンサーが、その細胞において２０４番目に強力なエンハンサーであることが決定された（図１９を参照されたい）。この結果およびＨＣＣ１９５４のタミバロテンに対する応答性に基づいて、潜在的なタミバロテン応答性乳がん患者についての順位カットオフを、該患者らの腫瘍において、少なくとも２００番目に強力なＲＡＲＡスーパーエンハンサーを有する患者に設定する。ヒト被験体に由来する４８種の原発性乳がん腫瘍細胞試料に関する本発明者らの解析から決定された通り、それらの試料の５５．３％が、それらの細胞において、少なくとも２００番目に強力なＲＡＲＡスーパーエンハンサーを有した（図２０Ａ）。したがって、分布カットオフを５５．３％に設定する。その同じ分布カットオフを、タミバロテンに対する潜在的な乳がんレスポンダーをＲＡＲＡ ｍＲＮＡ測定値に基づいて同定するときのＲＡＲＡ ｍＲＮＡ分布カットオフとしても使用する。
原発性乳がん試料を亜型によってさらに細分する場合、同じＲＡＲＡスーパーエンハンサー順位カットオフ、２００を使用して、各亜型について異なる分布カットオフを生成する。これらの分布カットオフは、ホルモン受容体陽性乳がんについては７８．６％であり、ＨＥＲ２陽性乳がんについては５６．３％であり、トリプルネガティブ乳がんについては３５．２％である（図２０Ｂ）。
（実施例８）
ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルは、乳がんＰＤＸにおけるタミバロテンに対する応答性と相関する
免疫不全雌マウス（Ｈａｒｌａｎ；ｎｕ／ｎｕヌード）におけるヒト乳がんのＬｏｗ Ｐａｓｓａｇｅ ＴｕｍｏｒＧｒａｆｔ（登録商標）モデルをＣｈａｍｐｉｏｎｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）により、以下のプロトコールを使用して作製する。
ストックマウスに、患者乳がん腫瘍試料（別々の患者試料それぞれについて、および対照について、ｎ＝３）を埋め込み、それを、１〜１．５ｃｍ３まで成長させる。次いで、ストックマウスから腫瘍を収集し、その断片を、研究前のマウス（雌；Ｈａｒｌａｎ；ｎｕ／ｎｕヌード、５〜８週齢；別々の患者試料それぞれについて、および対照について、ｎ＝３）の左側側腹部に片側性に再度埋め込む。腫瘍がおよそ１００〜３００ｍｍ３に達したら、研究前の動物を、投薬に使用する処置群へと腫瘍体積によりマッチさせて、０日目に投薬を開始する。ｐＨ８に調整したＰＢＳ、１％ＤＭＳＯ中のタミバロテンを、毎日のスケジュールで、１０ｍｌ／ｋｇの容量で、体重１ｋｇ当たり６ｍｇの最終の用量で経口投与する。ビヒクル治療群のマウスには、同じスケジュール、容量、およびタミバロテンを欠く製剤を与える。
腫瘍体積を週に２回、カリパスによって測定する。最終の腫瘍体積測定を処置の最終日に行う。図２１Ａ〜Ｂは、これらのＰＤＸのうちの２種（ＣＴＧ−１０５９（高ＲＡＲＡ ｍＲＮＡ）およびＣＴＧ−００１２（低ＲＡＲＡ ｍＲＮＡ））のタミバロテン（「ＳＹ１４２５」）に対する応答性を示す。ＣＴＧ−１０５９では、２５日間のタミバロテンによる処置後に、ビヒクルのみの対照と比較して、腫瘍体積の統計的に有意な減少が実証される。ＣＴＧ−００１２では、タミバロテンと対照の間にいかなる有意差も示されなかった。
これらのＰＤＸの両方、ならびに７種の他の乳がんＰＤＸにおけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを、実施例３に記載のＲＮＡ−ｓｅｑを使用して決定する。これらの９種のＰＤＸは、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの正規分布を有する集団を表すと仮定し、また、ＲＡＲＡ ＳＥ強度順位に基づいて決定された５５．３％分布カットオフを使用すると、タミバロテン応答性ＣＴＧ−１０５９は、５５．３％を上回るＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベル分布値を有するが、非応答性ＣＴＧ−００１２は、５５．３％を下回るＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベル分布値を有する（図２２）。
（実施例９）
ＡＭＬにおけるＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位ランクカットオフ
９５のＡＭＬ試料（患者試料およびＳｉｇＭ５、ＭＶ４１１、ＨＥＬおよびＫａｓｕｍｉを含めたＡＭＬ株の両方）の全エンハンサー／スーパーエンハンサープロファイルを、Ｈ３Ｋ２７Ａｃおよび実施例１に記載のＣｈＩＰ−Ｓｅｑを使用して解析する。試料のそれぞれにおいて、ＲＡＲＡに関連するエンハンサーの強度（Ｈ３Ｋ２７Ａｃによって測定される）に関する順位ランクを同じ細胞における他のエンハンサーおよびスーパーエンハンサーと比較して決定し、決定された順位ランクをランク順位の棒グラフにプロットする（図２３Ａ〜Ｃ）。ＭＶ４１１では、ＲＡＲＡに関連するエンハンサーが、１３３番目に強力なエンハンサーであることが決定された。ＭＶ４１１は、最低スーパーエンハンサー強度順位を有する、確認されたタミバロテン応答性細胞株である。ＨＥＬでは、ＲＡＲＡに関連するエンハンサーが１５５番目に強力なエンハンサーであることが決定された。ＨＥＬは、最高スーパーエンハンサー強度順位を有する、確認されたタミバロテン非応答性細胞株である。これらの値に基づいて、ＲＡＲＡエンハンサー強度順位カットオフを、ＨＥＬの順位とＭＶ４１１の順位の間の値である１５０に設定した。
ヒト被験体に由来する７０種の原発性ＡＭＬ細胞試料に関する本発明者らの解析から決定された通り、それらの試料の３６％が、それらの細胞において、少なくとも１５０番目に強力なＲＡＲＡスーパーエンハンサーを有した（図２４）。したがって、分布カットオフを３６％に設定する。その同じ分布カットオフを、タミバロテンに対する潜在的なＡＭＬレスポンダーをＲＡＲＡ ｍＲＮＡ測定値に基づいて同定するときのＲＡＲＡ ｍＲＮＡ分布カットオフとしても使用する。
エンハンサーを、ＡＭＬ細胞株の拡大したパネルについても、ＲＡＲＡエンハンサーとＭＡＬＡＴ１エンハンサーの比によって数量化した。このエンハンサー強度比の値をタミバロテンに対する感受性に対してプロットすることにより、１を上回るＲＡＲＡエンハンサー強度比を有する６種の細胞株のうち５種が応答性であるが、このレベルを下回るエンハンサーを有する７種の細胞株のうち４種のみが応答性であることが確認された（図３２）。カットオフをＲＡＲＡ／ＭＡＬＡＴエンハンサー比１．４またはそれ超に動かすと、細胞株の全て（４種のうち４種）が応答性である。
（実施例１０）
ＡＭＬにおけるＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位ランクカットオフはＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルと相関する
３６％ＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位分布カットオフを決定するために使用するＡＭＬ患者試料を２つの群−３６％またはそれ超の分布ランク（すなわち、低％値）を有する群、および３６％未満の分布ランクを有する群（すなわち、高％値）にビニングし、実施例３に記載のＲＮＡ−ｓｅｑを使用してＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルについてアッセイする。結果が図２５に示されている。ＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位において３６％分布ランクまたはそれ超の群は、その分布ランクよりも下の群よりも統計的に有意に高いレベルのＲＡＲＡ ｍＲＮＡを有する（ｐ＜０．００１）。これにより、スーパーエンハンサーレベルで決定される分布カットオフをｍＲＮＡレベルでの分布カットオフとしても使用することができることが再度確認された。
１１種の異なるＡＭＬ細胞株におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルも、ＲＮＡ−ｓｅｑを使用して決定し、そのｍＲＮＡレベルをタミバロテンに対する感受性と比較した。試験ＡＭＬ細胞株を、それらがタミバロテンに対して感受性であるか非感受性であるかに基づいて２つの別個の群に分割した。タミバロテン感受性細胞株は全て、ＲＮＡｓｅｑによって測定されたＲＡＲＡ ｍＲＮＡが＞１０ＴＰＭであったが、非感受性細胞株３種のレベルはこのカットオフレベルを下回るものであった（図３３）。
（実施例１１）
種々のＡＭＬ患者試料由来の異種移植片のタミバロテンに対する感受性
ＢＡＬＢ／ｃヌード免疫不全マウスにおける異なるＡＭＬ患者試料（ＡＭ８０９６、ＡＭ５５１２、ＡＭ７５７７およびＡＭ７４４０）由来の異種移植モデルは、Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）により、基本的に以下の通り調製される。
各患者試料に由来する細胞およそ２×１０６個をＰＢＳ１００μＬに懸濁させ、別々のマウス（異なる患者試料それぞれについて、および対照について、ｎ＝３）に、ＩＶ尾部注射によって注射する。ＡＭ５５１２異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｐｈ）、ＡＭ７５７７異種移植およびＡＭ７４４０異種移植に関しては、動物の末梢血中のヒトＣＤ４５＋細胞の濃度が約１〜５％に達したら、腫瘍量が処置を開始するのに十分に高いとみなされる。マウス血液（眼からの出血によって得られる）中のヒトＣＤ４５＋細胞は、蛍光活性化細胞選別機およびＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ４５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０４０３７）を使用して検出する。ＡＭ８０９６異種移植に関しては、細胞を注射してから４０日後に処置を開始する。
ｐＨ８に調整したＰＢＳ、１％ＤＭＳＯ中のタミバロテンを、毎日のスケジュールで、最終の用量を１０ｍｌ／ｋｇの容量で体重１ｋｇ当たり６ｍｇとして経口投与する。ビヒクル治療群のマウスには、同じスケジュール、容量、およびタミバロテンを欠く製剤を与える。処置した動物由来の末梢血および対照の動物由来の末梢血におけるヒトＣＤ４５＋細胞レベルを週に１回測定する。
ＡＭ５５１２異種移植およびＡＭ８０９６異種移植では、タミバロテンを用いて処置した場合に、処置の３５日後に、ビヒクル対照と比較して、ＣＤ４５＋細胞の総％、ならびに血液、骨髄および脾臓におけるＣＤ４５＋細胞の％の有意な減少が示される（図２６Ａ〜Ｆ）。他方では、ＡＭ７５７７およびＡＭ７４４０では、タミバロテンで処置した動物とビヒクルで処置した動物の間で、全体的に、または血液、骨髄もしくは脾臓のいずれにおいても腫瘍体積の有意な減少は示されない（図２７Ａ〜Ｄ）。
図２８は、図２５に示されているビニング解析に使用した個々の患者試料に由来するＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルのランク付けを示す。さらに、図２８は、異種移植研究に使用した患者試料のそれぞれのＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを含む。異種移植研究における２種の非レスポンダー、ＡＭ７５７７およびＡＭ７４４０のＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルは、３６％分布カットオフを十分に下回る。レスポンダーのうちの１種、ＡＭ８０９６のＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルは、３６％分布カットオフを上回る。他のレスポンダー、ＡＭ５５１２では、３６％分布カットオフをわずかに下回る（４６．９％分布値）。これらのＲＡＲＡ ｍＲＮＡ結果から、潜在的なレスポンダーの数を最大にするために、分布カットオフを下向きに調整することができる（例えば、４６．９％まで）ことが示唆される。
（実施例１２）
ＡＭ５５１２は、タミバロテンに対しては感受性であるが、ＡＴＲＡに対しては感受性ではない。
ＡＭ５５１２異種移植マウスを上記の通り調製する。動物の末梢血中のヒトＣＤ４５＋細胞の濃度が約１〜５％に達したら、動物を、タミバロテン（ｎ＝７；３ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ）、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ；ｎ＝７；４ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ）またはビヒクル対照（ｎ＝５）のいずれかを用いて処置する。タミバロテンはＲＡＲＡ特異的アゴニストであるが、ＡＴＲＡは、全てのレチノイン酸受容体（ＲＡＲ−α、ＲＡＲ−βおよびＲＡＲ−γ）に対してアゴニスト作用を示す。図２９Ａ〜Ｂに示されている通り、タミバロテンを用いて処置したＡＭ５５１２異種移植マウスでは、処置の２８日後に、ビヒクル対照およびＡＴＲＡで処置した動物のどちらと比較してもＣＤ４５＋細胞の％の有意な低下が示され、また、動物７匹中５匹が実験の過程で生存する。驚いたことに、ＡＴＲＡを用いて処置したＡＭ５５１２異種移植マウスにおいて、処置の１４日後に、ビヒクル対照と比較してＣＤ４５＋細胞の％の低下が示され、それらのマウスに２１日目を超えて生存したものはなかった。
（実施例１３）
他のがんを有する患者試料のサブセットは高レベルのＲＡＲＡ ｍＲＮＡを有する
いくつもの異なるがんの型に対して、実施例３に記載の通りＴＣＧＡによりもたらされるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルのｚ−スコアを使用する。集団の正規分布では、試料の５％が、平均から２標準偏差高いＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを有するはずである。図３０は、試料の５％超が平均から２標準偏差高いＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを有する特定のがんの型を示す表である。理論に束縛されることなく、本発明者らは、これらのがんのそれぞれが、本明細書に記載の層別化および処置方法を受け入れることができるものであると考える。
さらに、ＡＭＬに密接に関連するがんであると考えられている骨髄異形成症候群に罹患している患者由来の試料について詳細に調べる。患者１７６名（正常１７名；ＭＤＳ１５９名）からＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルを、実施例３に記載の通りに得る。試料を、病態および図３１に示されている通りプロットされるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルに基づいてビニングする。統計解析の結果（Ｔ検定）からＭＤＳ患者試料では、正常な患者試料と比較して、ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルが有意に上昇することが示される（ｐ＝０．０８７５１）。
ＭＤＳにおけるＲＡＲＡの上昇の存在をさらに検証するために、ＭＤＳ患者２名から採取した骨髄試料に対してＣｈＩＰ−ｓｅｑ Ｈ３Ｋ２７ａｃエンハンサー解析を実施した。これらの患者のどちらに関しても、ＲＡＲＡ遺伝子座は、ＭＤＳ患者２名の骨髄試料において、健康なドナーの芽細胞において見出されたシグナルと比較して、著しく強力なＨ３Ｋ２７ａｃシグナルを有した。ＭＤＳ患者におけるＲＡＲＡスーパーエンハンサーの強度は、強力なＲＡＲＡスーパーエンハンサーおよび高レベルのＲＡＲＡ ｍＲＮＡを有するＡＭＬ患者のサブセットに由来する芽細胞におけるものと同様であった。さらに、ＭＤＳ患者細胞におけるＲＡＲＡスーパーエンハンサーのＲＡＲＡエンハンサー強度順位（それぞれ９および６０）は、健康な被験体に由来する芽細胞および未成熟の細胞型と比較して高いものであった。
理論に束縛されることなく、本発明者らは、ＭＤＳ患者もまた、本明細書に記載の層別化および処置方法を受け入れることができるものであると考える。
等価物および範囲
実施形態では、「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」、および「その、前記、該（ｔｈｅ）」などの冠詞は、それに反する指示がある、またはそうでないことが文脈から明らかである場合を除き、１つまたは１つ超を意味し得る。群の１つまたは複数のメンバーの間に「もしくは、または、あるいは（ｏｒ）」を含む実施形態または記載は、それに反する指示がある、またはそうでないことが文脈から明らかである場合を除き、群のメンバーのうちの１つ、１つ超、または全てが、所与の生成物またはプロセスに存在する、それに用いられる、または他の点でそれに関連する場合、満たされるとみなされる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが所与の生成物またはプロセスに存在する、それに用いられる、または他の点でそれに関連する実施形態を含む。本発明は、群のメンバーの１つ超、または全てが所与の生成物またはプロセスに存在する、それに用いられる、または他の点でそれに関連する実施形態を含む。
さらに、本発明は、列挙されている実施形態のうちの１つまたは複数からの１つまたは複数の限定、要素、条項、および記述的な用語が別の実施形態に導入された変形、組合せ、および入れ替えの全てを包含する。例えば、別の実施形態に依存する任意の実施形態を、同じ基礎となる実施形態に依存する任意の他の実施形態において見出される１つまたは複数の限定を含むように改変することができる。要素が、例えば、マーカッシュ群形式で列挙されている場合、その要素のサブグループのそれぞれも開示され、また、任意の要素（複数可）を、群から除去することができる。一般に、本発明、または本発明の態様が、特定の要素および／または特徴を含むものとして言及される場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様は、そのような要素および／または特徴からなる、またはそれから本質的になることが理解されるべきである。わかりやすくするために、それらの実施形態は、本明細書においてこういう言葉で具体的には記載していない。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、開放的であり、追加の要素またはステップの包含を許与することが意図されていることにも留意されたい。範囲が示されている場合、終点が含まれる。さらに、別段の指定がある場合、または文脈および当業者の理解からそうでないことが明らかである場合を除き、範囲として表されている値は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、任意の特定の値または本発明の異なる実施形態において明示された範囲内に入る部分範囲が、その範囲の下限の単位の１０分の１まで、想定され得る。
本出願は、種々の発行された特許、公開特許出願、学術論文、および他の刊行物を参照し、その全てが参照により本明細書に組み込まれる。組み込まれた参考文献のいずれかと本明細書の間に矛盾がある場合には、本明細書が支配するものとする。さらに、先行技術の範囲内に入る本発明の任意の特定の実施形態は、実施形態の任意の１つまたは複数から明確に排除され得る。そのような実施形態は当業者に公知であるとみなされるので、排除について本明細書に明確に記載されていなくとも排除され得る。任意の特定の本発明の実施形態は、任意の実施形態から、任意の理由で、先行技術の存在に関連するか否かにかかわらず、排除され得る。
当業者は、本明細書に記載の特定の実施形態に対する多くの等価物を、常套的な実験だけを使用して理解すまたは確認することができる。本明細書に記載されている実施形態の範囲は、上記の説明（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）に限定されるものではなく、添付の実施形態に記載されている通りである。当業者は、以下の実施形態において定義されている本発明の主旨または範囲から逸脱することなく、本記載に対する種々の変化および改変を行うことができることを理解されたい。

Claims (23)

  1. がんに罹患しているヒト被験体を処置する方法であって、該被験体におけるがん細胞が、
    ａ．所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回る強度、順位ランク、または分布ランクを有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；または
    ｂ．所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回る、該ＲＡＲＡ遺伝子からのｍＲＮＡ転写産物のレベル
    のうちの１つまたは複数を有することが決定されており、
    該被験体に、ＲＡＲＡのアゴニストを投与するステップを含む、方法。
  2. 前記ＲＡＲＡ遺伝子が、ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ ｈｇ１９においてｃｈｒ１７：３８４５８１５２−３８５１６６８１に位置する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＲＡＲＡスーパーエンハンサーの前記強度が、ＣｈＩＰ−ｓｅｑを使用してＨ３Ｋ２７Ａｃヒストン修飾を定量することによって決定されたものである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記被験体におけるがん細胞が、
    ａ．ＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度についての所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応する強度を有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
    ｂ．所定のＲＡＲＡ遺伝子強度カットオフと等しいまたはそれを上回る強度を有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
    ｃ．所定のＲＡＲＡ遺伝子強度順位分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応する、強度の順位を有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
    ｄ．所定のＲＡＲＡ遺伝子強度順位カットオフと等しいまたはそれを上回る強度の順位を有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
    ｅ．所定のｍＲＮＡレベルカットオフと等しいまたはそれを上回るＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベル；および／または
    ｆ．所定のＲＡＲＡ ｍＲＮＡ分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応するＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベル
    のうちの１つまたは複数を有することが決定されている、請求項１に記載の方法。
  5. 前記所定の分布カットオフのいずれかが、
    ａ．同じ型のがん細胞に由来する試料の集団におけるＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度のランク付けであって、少なくとも１つの試料がＲＡＲＡアゴニストに対して応答性であることが決定されている、ランク付け；および／または
    ｂ．同じ型のがん細胞に由来する試料の集団におけるＲＡＲＡスーパーエンハンサー強度順位のランク付けであって、少なくとも１つの試料が該ＲＡＲＡアゴニストに対して応答性であることが決定されている、ランク付け；および／または
    ｃ．同じ型のがん細胞の試料の集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルのランク付けであって、少なくとも１つの試料が該ＲＡＲＡアゴニストに対して応答性であることが決定されている、ランク付け
    から決定される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ＲＡＲＡのアゴニストが、タミバロテンである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記がんが、乳がんまたはＡＭＬから選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  8. 乳がんについての前記所定の分布カットオフのいずれかが、５０〜６０％の間である、請求項７に記載の方法。
  9. ＡＭＬについての前記所定の分布カットオフのいずれかが、２５〜４０％の間である、請求項７に記載の方法。
  10. がんに罹患している被験体を処置する方法であって、
    ａ．
    ｉ．該被験体由来のがん細胞における、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの強度、順位ランク、もしくは分布ランク；または
    ｉｉ．該被験体由来のがん細胞における該ＲＡＲＡ遺伝子からのｍＲＮＡ転写産物のレベル
    のうちの１つまたは複数に関連する情報を受け取るステップ；および
    ｂ．該情報が、
    ｉ．該スーパーエンハンサーが、所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回る強度、順位、または分布ランクを有すること；または
    ｉｉ．該ｍＲＮＡ転写産物のレベルが所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回ること
    のうちの１つまたは複数を示す場合、該被験体にＲＡＲＡのアゴニストを投与するステップ
    を含む方法。
  11. ステップａ．が、
    ｉ．ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの強度および／もしくは該強度が対応する集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度の分布ランク；ならびに／または
    ｉｉ．前記細胞における他のスーパーエンハンサーと比較した、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの該強度の順位ランクおよび／または該順位ランクが対応する集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度順位の分布ランク；ならびに／または
    ｉｉｉ．ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルおよび／または該ｍＲＮＡレベルが対応する集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの分布ランク
    のうちの１つまたは複数に関連する情報を受け取るステップを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. ステップｂ．が、前記情報が、
    ｉ．ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの前記強度が、集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度の所定のカットオフ値と等しいまたはそれを上回ること；および／または
    ｉｉ．ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの前記強度が、集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度の所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応すること；および／または
    ｉｉｉ．ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの前記強度の順位ランクが、集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度順位の所定の順位カットオフ値と等しいまたはそれを上回ること；および／または
    ｉｖ．スーパーエンハンサーの強度の順位ランクが、集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度順位の所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応すること；および／または
    ｖ．ＲＡＲＡ ｍＲＮＡのレベルが、集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの所定のカットオフ値に対応するＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルと等しいまたはそれを上回ること；および／または
    ｖｉ．該ＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルが、集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応すること
    のうちの１つまたは複数を示す場合に、前記被験体にＲＡＲＡのアゴニストを投与するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記ＲＡＲＡ遺伝子に関連する前記スーパーエンハンサーが、ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ ｈｇ１９においてｃｈｒ１７：３８４５８１５２−３８５１６６８１に位置する、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記ＲＡＲＡスーパーエンハンサーの前記強度が、ＣｈＩＰ−ｓｅｑを使用してＨ３Ｋ２７Ａｃヒストン修飾を定量することによって決定されたものである、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ＲＡＲＡのアゴニストが、タミバロテンである、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記がんが、乳がんまたはＡＭＬから選択される、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
  17. 乳がんについての前記所定の分布カットオフのいずれかが、５０〜６０％の間である、請求項１６に記載の方法。
  18. ＡＭＬについての前記所定の分布カットオフのいずれかが、２５〜４０％の間である、請求項１６に記載の方法。
  19. がんの処置におけるＲＡＲＡアゴニストの有効性を予測する方法であって、該がんが、
    ａ．所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回る強度、順位ランク、または分布ランクを有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；または
    ｂ．所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回る、該ＲＡＲＡ遺伝子からのｍＲＮＡ転写産物のレベル
    のうちの１つまたは複数を特徴とするかどうかを決定するステップを含み、
    ａ．またはｂ．のいずれかにより、該処置におけるＲＡＲＡアゴニストの有効性が予測される、方法。
  20. 被験体における前記がんの前記処置におけるＲＡＲＡアゴニストの有効性を予測するステップが、該がんが、
    ａ．集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度の所定のカットオフ値と等しいまたはそれを上回る強度を有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
    ｂ．集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度の所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応する強度を有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
    ｃ．集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度順位の所定のカットオフ値と等しいまたはそれを上回る強度の順位ランクを有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
    ｄ．集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度順位の所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応する強度の順位ランクを有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
    ｅ．集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの所定のカットオフ値と等しいまたはそれを上回るＲＡＲＡ ｍＲＮＡのレベル；および／または
    ｆ．集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応するＲＡＲＡ ｍＲＮＡのレベル
    のうちの１つまたは複数を特徴とするかどうかを決定するステップを含み、
    ａ．、ｂ．、ｃ．、ｄ．、ｅ．またはｆ．のいずれかにより、該処置におけるＲＡＲＡアゴニストの有効性が予測される、請求項１９に記載の方法。
  21. がんに罹患している被験体を診断、予後判定、または処置する方法であって、
    ａ．該被験体から該がんの試料を得るステップ；
    ｂ．該試料において、
    ｉ．該被験体由来のがん細胞における、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの強度、順位ランク、もしくは分布ランク；または
    ｉｉ．該被験体由来のがん細胞における該ＲＡＲＡ遺伝子からのｍＲＮＡ転写産物のレベル
    のうちの１つまたは複数を決定するステップ；および
    ｃ．
    ｉ．該スーパーエンハンサーが、所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回る強度、順位ランク、または分布ランクを有するか；または
    ｉｉ．該ｍＲＮＡ転写産物のレベルが所定の閾値レベルと等しいまたはそれを上回るか
    のうちの１つまたは複数である場合に、ＲＡＲＡアゴニストを含む治療用組成物を投与するまたは投与を推奨するステップ
    を含む方法。
  22. ステップｂ．が、前記試料において、
    ｉ．ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの強度、および／または該強度が対応する集団におけるＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの強度の分布ランク；ならびに／または
    ｉｉ．前記細胞における他のスーパーエンハンサーと比較した、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの前記強度の順位ランク、および／もしくは該順位ランクが対応する集団におけるＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの該強度の該順位ランクの分布ランク；ならびに／または
    ｉｉｉ．ＲＡＲＡ ｍＲＮＡ一次転写産物レベル、および／もしくはｍＲＮＡレベルが対応する集団における該ＲＡＲＡ ｍＲＮＡ一次転写産物の分布ランク
    のうちの１つまたは複数を決定するステップを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーの強度が、集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度の所定のカットオフ値に対応するＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度と等しいまたはそれを上回ること；および／または
    ａ．ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサーが、集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度の所定のカットオフ値と等しいまたはそれを上回る強度を有すること；および／または
    ｂ．集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度の所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応する強度を有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
    ｃ．集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度順位の所定のカットオフ値と等しいまたはそれを上回る強度の順位ランクを有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
    ｄ．集団におけるＲＡＲＡ遺伝子スーパーエンハンサー強度順位の所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る分布ランクに対応する強度の順位ランクを有する、ＲＡＲＡ遺伝子に関連するスーパーエンハンサー；および／または
    ｅ．ＲＡＲＡ ｍＲＮＡのレベルが、集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの所定のカットオフ値と等しいまたはそれを上回ること；および／または
    ｆ．集団におけるＲＡＲＡ ｍＲＮＡレベルの所定の分布カットオフと等しいまたはそれを上回る、分布ランクに対応するＲＡＲＡ ｍＲＮＡのレベル
    のうちの１つまたは複数である場合に、ステップｃ．が、ＲＡＲＡアゴニストを含む治療用組成物を投与するまたは投与を推奨するステップを含む、請求項２１または２２に記載の方法。
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