KR102457851B1 - Aml 및 mds 치료용 rara 효능제 - Google Patents

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크리스토퍼 피오레
매튜 루카스 이튼
에밀리 페이턴 리
크리스티안 프리츠
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사이로스 파마수티컬스, 인크.
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Abstract

본원에는 RARA 작용제에 감수성을 나타내는 세포 집단을 정의하고, RARA 작용제에 의한 치료로 인해 혜택을 보게 될 환자 집단을 식별하는 방법이 기재되었다. 상기 방법은 RARA 작용제를 환자 집단에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

Description

AML 및 MDS 치료용 RARA 효능제
관련 출원에 대한 상호참조
본원은 2016년 4월 8일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/320,352호의 우선권을 청구하며, 이의 개시내용은 그 전문이 본 명세서에 참고로 편입되어 있다.
천연 및 합성 화합물을 포함하는 레티노이드는, 비타민 A와 구조적으로 관련된 화합물의 부류이다. 레티노이드의 몇몇 일련물이 피부과 및 종양 질환의 치료에 임상적으로 유용한 것으로 밝혀졌다. 레틴산 및 이의 다른 자연 발생 레티노이드 유사체(9-시스 레틴산, 전체-트랜스 3,4-디데하이드로 레틴산, 4-옥소 레틴산 및 레티놀)는 다양한 염증성, 면역 및 구조적 세포의 구조 및 기능을 조절하는 다면발현성 조절 화합물이다. 이들은 폐에서 상피성 세포 증식, 분화, 및 형태발생의 중요한 조절자이다. 레티노이드는 스테로이드/갑상선 수용체 수퍼패밀리에 속하는 리간드 유도성 전사 인자인 일련의 호르몬 핵 수용체를 통해 이의 생물학적 효과를 발휘한다.
레티노이드 수용체는 각각 3개의 구별되는 하위유형(a, β 및 γ)으로 이루어진 2개의 계열인 레틴산 수용체(RAR) 및 레티노이드 X 수용체(RXR)로 분류된다. RAR 유전자 계열의 각각의 하위유형은 2개의 1차 RNA 전사체의 차별적인 스플라이싱으로부터 발생하는 가변성 수의 동형체를 암호화한다. 전체-트랜스 레틴산은 레틴산 수용체에 대한 생리적 호르몬이며, 3개의 RAR 하위유형 모두에 대해 대략 동일한 친화성으로 결합하지만, 9-시스 레틴산이 이에 대한 천연 리간드인 RXR 수용체에는 결합하지 않는다. 레티노이드는 항-염증성 효과를 가지며, 상피성 세포 분화의 진행을 변경시키고, 기질 세포 매트릭스 생산을 억제한다. 이들 특성은 피부과 장애, 예컨대 건선, 여드름, 및 비대성 피부 흉터에 대한 국소 및 전신 레티노이드 치료제의 개발을 이끌었다. 기타 적용은 급성 전골수구성 백혈병, 아데노- 및 편평상피 세포 암종, 및 간 섬유증의 조절을 포함한다.
레티노이드의 치료 용도에 있어서의 제한은 자연 발생 레티노이드, 전체-트랜스 레틴산 및 9-시스 레틴산으로 관찰된 상대적 독성으로부터 기인하였다. 이들 천연 리간드는 RAR 하위유형의 면에서 비-선택적이며 따라서 흔히 독성인, 바디 전체에 다면발현성 효과를 갖는다.
RAR 또는 RXR 수용체와 또는 부류내에서 특정 하위유형(α, β, γ)과 선택적으로 또는 특이적으로 상호작용하는 다양한 레티노이드가 기술되어 왔다. RARA 특이적 효능제는 암의 치료용으로 높은 가능성을 유지해 왔으며, 많은 것이 인간 임상시험에 도입되었다. 그러나, 단 하나의 RARA 특정 효능제인 타미바로텐 (tamibarotene)만이 암의 치료용으로 승인되었다. 또한, 타미바로텐은 미국 및 유럽에서의 시험에도 불구하고, 일본에서 유일하게 및 급성 전골수구성 백혈병의 치료용으로만 승인되어 있다. 암에서 RARA 효능제의 이론적 효능과 이러한 제제의 규제 승인의 부족 사이의 불연속성은, 이러한 효능제가 인간에게 효과적이지 않고 안전하지 않은 이유에 대한 질문을 제기하고 있다. 따라서, RARA 효능제가 이의 치료 잠재성을 충족시키지 않는 이유를 보다 더 이해할 필요가 있다.
최근 게놈 기술에 있어서의 발전 및 유전자 조절 회로의 이해는 슈퍼 인핸서의 발견을 이끌었다. 제공된 조직 또는 암 유형에서 많은 유전자는 유전자 코팅 영역에 근접한 인핸서의 존재에 의해 조절될 수 있는 반면에, 이들의 작은 소수는 모든 다른 활성 유전자에 대한 전사 마크 및 기전의 고도의 비대칭 및 불균형적으로 큰 부하(loading)를 나타낸다. 최근 발견들은, 이러한 인핸서가 이들을 잠복시키는 세포의 기능 및 생존과 특별한 관련성이 있는 유전자에 결속되어 있음을 시사한다. 이와 같이, 슈퍼 인핸서와 유전자의 연관관계는 이러한 세포의 생존에 대한 상기 유전자의 상대적인 유의성을 나타낸다.
본 개시내용은 하나 이상의 바이오마커 (예를 들어 IRF8 슈퍼 인핸서 강도, 순위(ordinal rank) 또는 유병률 순위 및 IRF8 mRNA 수준 또는 유병률 순위를 포함하는 예를 들어, 하나 이상의 IRF8 유전자 성분 또는 생성물의 존재, 수준, 형태 및/또는 활성)를 검출하기 위한 기술을 제공한다. 본 개시내용은, 하나 이상의 IRF8 바이오마커를 함유하는, 세포 (예를 들어, 비-APL AML 또는 MDS를 앓는 대상체 유래의 암 세포 또는 세포)는, RARA 효능제, 예컨대 타미바로텐의 효과에 더욱 취약하며, 여기서 상기 IRF8 바이오마커는 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서, 또는 상승된 IRF8 mRNA 수준 중 하나 이상의 발현이거나 이를 포함한다.
본 발명의 다양한 구현예, 양태 및 대안은 어느 세포 집단이 레틴산 수용체 알파 ("RARA")의 효능제에 대해 민감성인지를 정의하고, RARA 효능제를 사용한 치료로부터 유리할 환자 집단을 식별하며(예를 들어, RARA 효능제를 사용한 치료를 위해 환자를 계층화하고; 비-반응군으로부터 RARA 효능제 반응군을 분리하며); 이러한 환자 집단에서 지향된 치료요법을 제공하는 문제를 해결한다. 이러한 해결책은, 적어도 부분적으로, 특정 암 세포에서 하나 이상의 IRF8 바이오마커의 상승된 발현이, 이러한 세포가 RARA 효능제 (예를 들어, 타미바로텐)를 사용한 치료에 대해 상승된 IRF8 바이오마커를 가지지 않는 유사한 세포보다 실질적으로 더욱 반응성일 것임을 나타낸다는 본 발명자들의 발견을 기반으로 한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 대상체의 암 세포내에서 IRF8 mRNA의 수준을 기반으로 대상체(예를 들어, 인간) 내에서 암 (예를 들어, 비-APL AML 또는 MDS)을 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 방법은 상기 대상체에게 상기 질환을 치료하는데 효과적인 양의 RARA 효능제(예를 들어, 타미바로텐)를 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 구현예의 일부 양태에서, 대상체의 암 세포 중 IRF8 mRNA의 수준은 소정의 역치 수준 이상이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 방법은 암을 갖는 대상체에 타미바로텐을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 암은 IRF8 바이오마커를 갖는 것으로 계측되며, 상기 IRF8 바이오마커는 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서, 또는 상승된 IRF8 mRNA 수준 중 하나 이상의 발현이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서 또는 상승된 RARA mRNA 수준 중 하나 이상을 발현하지 않고; 그리고 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서 또는 상승된 IRF8 mRNA 수준 중 하나 이상을 발현하지 않는 것으로 계측된 대상체에 치료제를 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 요법은 타미바로텐의 투여를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (a) 이의 강도 및/또는 순위가 소정의 역치를 초과하는, RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서를 갖지 않거나, 또는 상승된 RARA mRNA 수준 중 하나 이상을 발현하지 않고; 그리고 (b) IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서 또는 상승된 IRF8 mRNA 수준 중 하나 이상을 발현하는 것으로 계측된 대상체에 치료제를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 요법은 타미바로텐이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서 또는 상승된 RARA mRNA 수준 중 하나 이상을 발현하지 않고; 그리고 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서 또는 상승된 IRF8 mRNA 수준 중 하나 이상을 발현하는 것으로 계측된 대상체에 치료제를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 요법은 타미바로텐이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 암을 앓고 있는 대상체에서 IRF8 mRNA 수준과 관련된 정보를 제공받는 단계; 및 상기 정보가 IRF8 mRNA 수준 또는 슈퍼 인핸서 수준이 참고 수준 이상인 경우 상기 대상체에게 타미바로텐을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 참고는 소정의 역치이다. 일부 양태에서, 소정의 역치는 컷오프 값 또는 유병률 컷오프이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: 암을 앓는 대상체에서 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서의 존재와 관련된 정보를 수용하는 단계; 및 상기 정보가 슈퍼 인핸서가 IRF8 유전자와 관련된다는 것을 나타낼 경우, 상기 대상체에게 타미바로텐을 투여하는 단계.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 암이 참고 수준 이상의 IRF8 mRNA 수준을 갖는 세포를 포함하는지를 계측하는 단계를 포함하는, 암의 치료시 RARA 효능제의 효능을 예측하는 방법에 관한 것이며, 여기서 참고 수준 이상의 상기 IRF8 mRNA 수준은 치료에 있어서 RARA 효능제 효능을 예측한다. 일부 양태에서, 참고치는 소정의 역치이다. 일부 양태에서, 소정의 역치는 컷오프 값 또는 유병률 컷오프이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 암을 앓고 있는 대상체에서, 암이 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서를 갖는 세포를 포함하는지를 계측하는 단계를 포함하는, 암의 치료시 RARA 효능제의 효능을 예측하는 방법에 관한 것이며, 여기서 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서의 존재는 RARA 효능제를 사용한 암의 치료가 유효함을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다: 암을 앓는 대상체 유래의 암 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서; 또는 IRF8 mRNA 수준 중 하나 이상이 참조치 이상을 생물학적 샘플 내에서 검출하는 단계. 일부 양태에서, 참고는 소정의 역치이다. 일부 양태에서, 소정의 역치는 컷오프 값 또는 유병률 컷오프이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 대상체로부터 암의 샘플을 수득하는 단계; 및 샘플 내에서 IRF8 mRNA 수준 중 하나 이상 또는 대상체에서 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서의 존재를 계측하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 진단하거나, 예측하거나 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 암을 앓는 대상체를 진단, 예측, 또는 치료하는 방법에 관한 것이며, 이는 하기 단계를 포함한다: 상기 대상체 유래의 암의 샘플을 수득하는 단계; 상기 대상체 중 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서의 존재 또는 샘플 IRF8 mRNA 수준을 계측하는 단계; 및 (a) IRF8 mRNA 수준이 참조치 이상이거나; 또는 (b) IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서 중 하나 이상인 경우, RARA 효능제를 포함하는 치료적 조성물을 투여하는 단계. 일부 양태에서, 참고는 소정의 역치이다. 일부 양태에서, 소정의 역치는 컷오프 값 또는 유병률 컷오프이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다: 암을 갖는 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내에서 RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서의 강도 또는 순위 또는 RARA mRNA 수준 중 하나 이상을 검출하는 단계; 및 생물학적 샘플이 소정의 역치 이상인 강도 또는 순위를 갖는 RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서 또는 참조치 이상인 상승된 RARA mRNA 수준 중 하나 이상을 발현하지 않을 경우, 생물학적 샘플 내에서 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서 또는 IRF8 mRNA 수준 중 하나 이상을 검출하는 단계. 일부 양태에서, 참고는 소정의 역치이다. 일부 양태에서, 소정의 역치는 컷오프 값 또는 유병률 컷오프이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다: 암을 갖는 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내에서 RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서의 강도 또는 순위 또는 RARA mRNA 수준 중 하나 이상을 검출하는 단계; 및 생물학적 샘플이 소정의 역치 이상인 RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서의 강도 또는 순위 또는 참조치 이상인 상승된 RARA mRNA 수준 중 하나 이상을 발현하는 경우, 생물학적 샘플 내 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서 또는 IRF8 mRNA 수준 중 하나 이상을 검출하는 단계.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다: 암을 갖는 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서 또는 IRF8 mRNA 수준 중 하나 이상을 검출하는 단계; 및 생물학적 샘플이 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서 또는 참조치 이상인 상승된 IRF8 mRNA 수준 중 하나 이상을 발현하지 않을 경우, 생물학적 샘플 내 RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서의 강도 또는 순위 또는 RARA mRNA 수준 중 하나 이상을 검출하는 단계.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다: 암을 갖는 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서 또는 IRF8 mRNA 수준 중 하나 이상을 검출하는 단계; 및 생물학적 샘플이 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서 또는 참조치 이상인 상승된 IRF8 mRNA 수준 중 하나 이상을 발현할 경우, 생물학적 샘플 내 RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서의 강도 또는 순위 또는 RARA mRNA 수준 중 하나 이상을 검출하는 단계.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 비-APL AML 및 MDS로부터 선택된 질환을 앓고 있는 인간 대상체를 진단하고 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a. 상기 대상체가, 상기 대상체 유래의 이환 세포의 샘플 내에 존재하는 것으로 사전에 계측된 IRF8 mRNA의 수준을 기반으로, 질환의 타미바로텐-민감성 형태를 가지는지의 여부를 진단하는 단계; 및
b. 상기 대상체에게 상기 질환을 치료하기에 효과적인 양의 타미바로텐을 투여하는 단계.
이러한 구현예의 일부 양태에서, IRF8 mRNA의 수준은 소정의 역치 이상이다.
타미바로텐을 사용한 상기 대상체의 치료를 포함하는 전술한 구현예의 임의의 일부 양태에서, 상기 대상체는 타미바로텐 및 제2 치료제의 조합을 투여받는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 대상체의 암 세포 내 IRF8 mRNA의 수준 및/또는 RARA mRNA의 수준에 기반하여 대상체 내 비-APL AML 또는 MDS로부터 선택된 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 치료는 타미바로텐 및 제2 치료제의 조합을 상기 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 이들 구현예의 일부 양태에서, 상기 대상체는 역치 값 이상의 RARA mRNA 수준을 갖는다. 이들 구현예의 일부 양태에서, 상기 대상체는 역치 값 이상의 IRF8 mRNA 수준을 갖는다. 이들 구현예의 일부 양태에서, 상기 대상체는 역치값 이상인 RARA mRNA 수준, 및 역치값 이상의 IRF8 mRNA 수준을 모두 갖는다. 이들 구현예의 일부 양태에서, 상기 대상체는 비-APL AML을 앓고 있다.
도 1은 7개의 상이한 AML 세포주에서 IRF8 mRNA 수준을 도시한다. 적색 막대로 나타낸 세포주는 타미바로텐 치료에 대한 실질적인 반응성을 입증한다. 청색 막대로 나타낸 세포주는 타미바로텐 치료에 대한 반응성이 거의 없거나 없는 것을 입증한다.
도 2는 RNA-서열에 의해 측정된 IRF8 mRNA 수준과 타미바로텐 항-증식성 효능(EC50 값, nM)과의 상관관계를 나타낸다. IRF8 mRNA 수준 = 1 (log10) 및 50μM (비-반응성)으로 입력된 타미바로텐 EC50 값을 사용한 상부-좌측 점은 낮은 IRF8 mRNA 수준 및 타미바로텐에 대한 항-증식성 반응이 없는 2개 AML 세포주로부터의 데이터를 나타냄에 주목한다. 타미바로텐 민감성과 IRF8 mRNA 수준의 상관관계는 매우 유의적이다(p = 0.0001, 스피어만 상관관계, 2-방향).
도 3은 RNA-서열에 의해 측정시 개별 환자 AML 샘플 및 AML 세포주에서 IRF8 mRNA 수준의 순위 그래프를 도시한다. AML 세포주 PL21는 임의의 반응성 세포주의 최저 IRF8 mRNA 수준을 가졌던 세포주이고, Kasumi는 타미바로텐에 대해 비반응성인 임의의 세포주의 최고 IRF8 mRNA 수준을 가졌던 세포주이다. 당해 집단에서, 25% 유병률 컷오프는 대략 log2(7)의 RNA-서열 TPM 값과 동일하다.
도 4는 타미바로텐에 대한 반응에 대해 시험된 비-APL AML 세포주에서 IRF8 mRNA 수준과 RARA mRNA 수준 사이의 상관관계를 도시한다.
도 5는 AML 환자 샘플의 집단에서 IRF8 mRNA 수준과 RARA mRNA 수준의 상관관계를 도시한다. 점선은 각각의 mRNA에 대한 25% 유병률 컷오프를 나타낸다.
도 6은 AML 세포주 내 IRF8 인핸서 강도와 타미바로텐 항-증식성 효능과의 상관관계를 도시한다. IRF8 RECOMB 인핸서 스코어의 함수로서의 AML 세포주 타미바로텐 민감성 (EC50 값, nM)의 도식. IRF8 인핸서 스코어 = 0 및 50 μM (비-반응성)으로서 귀속된 타미바로텐 EC50 값을 지닌 상부-좌측 점은 검출가능한 IRF8 인핸서 피크가 없고 타미바로텐에 대해 항-증식성 반응이 없는 3개의 AML 세포주의 결과를 나타냄에 주목한다.
도 7은 AML 환자 샘플에서 IRF8 인핸서 강도를 도시한다. 66개의 AML 환자 샘플에 대해 RECOMB 스코어링 방법 하에서의 IRF8 인핸서 강도의 순위 도식. 각각의 막대는 단일 AML 환자에 대한 IRF8 인핸서 강도를 나타낸다. Y-축은 슈퍼-인핸서(>1.0)와 전형적인 인핸서(<1.0) 사이의 컷오프 (1.0으로 정의됨, 점선으로 나타냄)의 배수로서 개별 IRF8 인핸서 강도를 입증한다. 이러한 역치 이상의 환자 샘플은 백색으로 채워져 있는 반면 이러한 역치 미만의 환자 샘플은 흑색으로 채워져 있다. 66개의 환자 샘플 중 14개(집단의 21%)는 1.0 역치를 초과하고 IRF8 SE를 갖는 것으로 간주되었다.
도 8은 AML 환자 샘플 내 IRF8 인핸서 강도와 IRF8 mRNA 수준과의 상관관계를 도시한다. 49개 1차 환자 샘플 (인핸서 및 발현 값 둘 다를 지닌 것들)에서 IRF8 RECOMB 인핸서 강도 (X-축)의 함수로서 사분위수 정규화된 RNA-seq (log2 TPM; Y-축)에 의한 IRF8 mRNA 전사체 존재도의 도식. 스피어만 Rho 상관관계 추정치는 0.81이고, p-값은 -2.2×10-12 이다.
도 9는 AML 세포주에서 IRF8 인핸서 강도의 분포를 나타낸다. 26개의 AML 세포주에 대해 RECOMB 스코어링 방법 하에서 IRF8 인핸서 강도의 도식. 각각의 막대는 단일 AML 환자에 대한 IRF8 인핸서 강도를 나타낸다. Y-축은 슈퍼-인핸서(>1.0)와 전형적인 인핸서(<1.0) 사이의 컷오프 (1.0으로 정의됨, 점선으로 나타냄)의 배수로서 개별 IRF8 인핸서 강도를 예시한다. 상기 역치 초과의 세포주는 백색으로 채워져 있는 반면 상기 역치 미만의 세포주는 흑색으로 채워져 있다. 26개의 AML 세포주 중 9개(집단의 34%)는 1.0 역치를 초과하고 IRF8 SE를 갖는 것으로 간주된다.
도 10은 AML 세포주 내 IRF8 인핸서 강도와 IRF8 mRNA 수준과의 상관관계를 도시한다. 이에 대해 RNA-seq 및 ChIP-seq 데이터 둘 다가 이용가능하였던 모든 비-APL AML 세포주에서 IRF8 RECOMB 인핸서 강도 (X-축)의 함수로서 사분위수 정규화된 RNA-서열 TPM (Y-축)에 의한 IRF8 mRNA 전사체 존재도의 도식. 스피어만 Rho 상관관계 추정치는 -0.82이고, p-값은 -2×10-6이다.
도 11는 CD45+ 세포 %에 의해 측정시, 2개의 상이한 환자-유래된 마우스 제노그래프 AML 모델에서 타미바로텐의 매일 투여에 대한 반응을 도시한다. 도 11은 또한 상이한 기관 및 생체액 내에서 CD45+ 세포 %뿐만 아니라 마우스 모델의 생존 시간도 도시한다.
도 12는 CD45+ 세포 %에 의해 측정시, 2개의 추가의 환자-유래된 마우스 제노그래프 AML 모델에서 타미바로텐의 매일 투여에 대한 반응을 도시한다. 도 12는 또한 상기 모델 내 상이한 기관 및 생체액 내에서 CD45+ 세포 %뿐만 아니라 상기 모델의 생존 시간도 도시한다.
도 13은 도 11 및 12에 묘사된 제노그래프 실험에 사용된 4개의 AML 환자 샘플 각각에서 IRF8 mRNA 수준 및 RARA mRNA 수준을 도시한다. 타미바로텐-반응성 제노그래프를 생산한 타미바로텐-반응성 AM8096 만이, 100 TPM 역치 초과의 IRF8 mRNA를 실증하였다. AM8096 및 AM5512(이는 타미바로텐에 대해 일부 반응성인 것으로 입증되었다)는 10 TPM 역치 초과의 RARA mRNA 수준을 실증하였다.
도 14는 다양한 AML 세포주, AML 1차 환자 샘플, 정상 혈구 및 AML PDX에서 검출된 IRF8 mRNA 수준의 순위 배치를 도시한다.
도 15는 다양한 AML 세포주에서 타미바로텐 및 아자시티딘의 조합에 대한 아이소볼로그램을 도시한다. 별표는 아이소볼로그램의 최대치 범위 외의 데이터 포인트를 나타낸다.
도 16은 다양한 AML 세포주에서 타미바로텐 및 삼산화비소의 조합에 대한 아이소볼로그램을 도시한다. 별표는 아이소볼로그램의 최대치 범위 외의 데이터 포인트를 나타낸다.
도 17은 다양한 AML 세포주에서 타미바로텐 및 Ara-C의 조합에 대한 아이소볼로그램을 도시한다. 별표는 아이소볼로그램의 최대치 범위 외의 데이터 포인트를 나타낸다.
도 18은 다양한 AML 세포주에서 타미바로텐 및 다우노루비신의 조합에 대한 아이소볼로그램을 도시한다. 별표는 아이소볼로그램의 최대치 범위 외의 데이터 포인트를 나타낸다.
도 19는 다양한 AML 세포주에서 타미바로텐 및 메토트렉세이트의 조합에 대한 아이소볼로그램을 도시한다. 별표는 아이소볼로그램의 최대치 범위 외의 데이터 포인트를 나타낸다.
도 20은 다양한 AML 세포주에서 타미바로텐 및 이다루비신의 조합에 대한 아이소볼로그램을 도시한다. 별표는 아이소볼로그램의 최대치 범위 외의 데이터 포인트를 나타낸다.
도 21은 다양한 AML 세포주에서 타미바로텐 및 소라페닙의 조합에 대한 아이소볼로그램을 도시한다. 별표는 아이소볼로그램의 최대치 범위 외의 데이터 포인트를 나타낸다.
정의
본원에서, 문맥으로부터 달리 명확하지 않으면, (i) 용어 "단수(a)"는 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해될 수 있으며; (ⅱ) 용어 "또는"은 "및/또는"을 의미하는 것으로 이해될 수 있고; (ⅲ) 용어들 "포함하는" 및 "포괄하는"은 자체로 또는 하나 이상의 추가의 성분 또는 단계와 함께 나타낸 것에 상관없이 항목화된 성분 또는 단계를 포함하는 것으로 이해될 수 있고; 및 (iv) 용어들 "약" 및 "대략"은 당해 분야의 숙련가에 의해 이해될 수 있는 바와 같은 표준 변화를 허용하는 것으로 이해될 수 있으며; 및 (v) 범위들이 제공되는 경우, 종료점이 포함된다.
당해 분야의 숙련가는 이의 구조가 본원에 묘사된 하나 이상의 화합물이 하나 이상의 이성질체 (예를 들어, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 및 기하학적 (또는 형태적)) 및/또는 호변이성질체 형태; 예를 들어, 각각의 비대칭 중심에 대해 R 및 S 배치형태, Z 및 E 이중 결합 이성질체, 및 Z 및 E 형태적 이성질체를 가질 수 있음을 인정할 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 포함된 교시는 임의의 및 모든 이러한 형태에 적용가능하고/하거나 포함될 수 있다. 따라서, 달리 명시되지 않을 경우, 단일 입체화학적 이성체, 및 본 발명의 화합물의 에난티오머, 부분입체이성체 및 기하하적 (또는 형태적) 혼합물이 모두 본 발명의 범위에 있을 수 있다. 유사하게, 달리 지칭되지 않는 한, 본 발명의 화합물의 모든 호변이성질체 형태는 본 발명의 범위 내에 있다. 게다가, 당해 분야의 숙련가는 일부 구현예에서, 본원에 묘사된 화학 구조가 하나 이상의 동위원소 증폭된 원자의 존재하에서만 상이한 화합물을 포함할 수 있음을 인정할 것이다. 예를 들어, 이의 구조가 중수소 또는 삼중수소에 의한 수소의 대체, 또는 13C- 또는 14C-증폭된 탄소에 의한 탄소의 대체를 제외하고는 묘사된 것과 동일한 화합물은 본 발명의 범위 내에 있다. 특정 구현예에서, 이러한 화합물은, 예를 들어, 분석적 도구로서, 생물학적 검정에서 프로브로서 및/또는 본 발명에 따른 치료제로서 유용할 수 있다.
효능제 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "효능제’는 이의 존재, 수준, 정도, 유형, 또는 형태가 또 다른 제제(즉, 효능화된 제제)의 증가된 수준 또는 활성과 관련된 제제, 상태, 또는 현상을 지칭하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 효능제는 예를 들어, 소분자, 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 금속 및/또는 관련된 활성화 활성을 나타내는 임의의 다른 독립체를 포함하는 임의의 화학 부류의 제제를 포함할 수 있거나 포함한다. 일부 구현예에서, 효능제는 직접적일 수 있으며(이 경우에 이는 이의 표적 시 직접적으로 이의 영향을 발휘한다); 일부 구현예에서, 효능제는 간접적일 수 있다(이 경우에 이는 이의 표적에 결합하는 것 외의 다른 것에 의해; 예를 들어, 표적의 조절자와의 상호작용에 의해 상기 표적의 수준 또는 활성을 변경시킴으로써 이의 영향을 발휘한다).
효능제 요법: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "효능제 요법(agonist therapy)"은 목적한 특정 표적을 효능화시켜 원하는 치료 효과를 달성하는 효능제의 투여를 지칭한다. 일부 구현예에서, 효능제 요법은 단일 용량의 효능제의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 효능제 요법은 다중 용량의 효능제의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 효능제 요법은 예를 들어, 관련된 집단에 대한 투여를 통해 지정된 정도의 통계적인 신뢰도로 확립되므로, 치료 효과를 달성하기 위해 공지되거나 기대된 투여 요법(regimen)에 따라 효능제를 투여하는 것을 포함한다.
길항제: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "길항제"는 이의 존재, 수준, 정도, 유형, 또는 형태가 또 다른 제제(예컨대, 억제된 제제, 또는 표적)의 감소된 수준 또는 활성과 관련된 제제, 상태, 또는 현상을 지칭하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 길항제는 예를 들어, 소분자, 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 금속 및/또는 관련된 억제성 활성을 나타내는 임의의 다른 독립체를 포함하는 임의의 화학 부류의 제제를 포함할 수 있거나 포함한다. 일부 구현예에서, 길항제는 직접적일 수 있으며(이 경우에 이는 이의 표적 시 직접적으로 이의 영향을 발휘한다); 일부 구현예에서, 길항제는 간접적일 수 있다(이 경우에 이는 이의 표적에 결합하는 것 외의 다른 것에 의해; 예를 들어, 표적의 조절자와의 상호작용에 의해 상기 표적의 수준 또는 활성을 변경시킴으로써 이의 영향을 발휘한다).
대략: 본원에 사용된 바와 같이, 목적하는 하나 이상의 값에 적용되는 용어 "대략적으로" 또는 "약"은 진술된 표준 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 명시되지 않으면 또는 문맥으로부터 달리 명백하지 않으면 지칭된 참조값의 어느 한쪽 방향으로 (보다 크거나 또는 보다 적은) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 이하의 범위에 들어가는 값의 범위를 포함한다 (상기 숫자가 가능한 값의 100%를 초과할 경우를 제외하고).
급성 전골수구성 백혈병: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "급성 전골수구성 백혈병(Acute Promyelocytic Leukemia)" 또는 "APL"은 인간 염색체 15번과 17번 간의 유전적 전좌를 특징으로 하는 급성 골수성 백혈병("AML")의 하위유형을 지칭한다. 따라서, 용어 "비-APL AML"은 그와 같은 유전적 전좌를 특징으로 하지 않는 AML의 임의의 하위유형을 지칭한다.
생물학적 샘플: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 샘플"은 조직 샘플(예컨대 조직 절편 및 조직의 바늘 생검); 세포 샘플(예를 들어, 세포학적 도말표본(예컨대 Pap 또는 혈액 도말표본) 또는 현미절개에 의해 수득된 세포의 샘플); 골수 샘플(이의 전체의, 완전한 세포 분획, 또는 상기 내의 세포의 하위집단); 또는 세포 분획, 단편 또는 소기관(예컨대 세포를 용해시키고 원심분리 또는 다른 방법에 의해 이의 성분을 단리함으로써 수득됨)을 포함하는, 본 발명의 방법으로 치료될 질환을 앓고 있는 개체로부터 수득된 임의의 샘플을 지칭한다. 생물학적 샘플의 다른 예는 혈액, 혈청, 소변, 정액, 대변, 뇌척수액, 간질액, 점액, 눈물, 땀, 고름, 생체검사된 조직(예를 들어, 외과적 생검 또는 바늘 생검에 의해 수득됨), 유두 흡인물, 밀크, 질액, 타액, 면봉(예컨대 구강 면봉), 또는 제1 생물학적 샘플로부터 유래된 생체분자를 함유하는 임의의 물질을 포함한다. 일부 양태에서, 비-APL AML 또는 MDS를 앓고 있는 대상체로부터의 생물학적 샘플은 골수 흡인물이다. 기타 양태에서, 비-APL AML 또는 MDS를 앓고 있는 대상체 유래의 생물학적 샘플은 분획화된 전혈 샘플이다. 추가의 특정 양태에서, 비-APL AML 또는 MDS를 앓는 대상체 유래의 생물학적 샘플은 대상체의 전혈 ("PBMC 샘플") 유래의 PBMC 분획이다. 더욱 더 구체적인 양태에서, 비-APL AML 또는 MDS를 앓고 있는 대상체로부터의 PBMC 샘플은 또한 다양한 농축 기술, 예컨대 항체-연결된 비드 농축 프로토콜, 형광 표지 세포 분류, 또는 당해 분야에 공지된 다른 기술("풍부한 PBMC 샘플")을 사용하여 특정 아세포에 대하여 농축된다. 일부 구현예에서, 문맥으로부터 명확해지는 바와 같이, 용어 "샘플"은 1차 샘플을 가공함으로써(예를 들어, 하나 이상의 성분을 제거하고/하거나 하나 이상의 제제(agent)를 가함으로써) 수득된 제제를 지칭한다. 그와 같은 "가공된 샘플"은, 예를 들어 샘플로부터 추출되거나 1차 샘플을 기술, 예컨대 mRNA의 증폭 또는 역전사, 특정 성분의 단리 및/또는 정제 등에 적용시켜 수득된 핵산 또는 단백질을 포함할 수 있다.
바이오마커: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "바이오마커"는 이의 존재, 수준, 또는 형태가 목적한 특정 생물학적 현상 또는 상태와 관련됨으로써 이러한 현상 또는 상태의 "마커"인 것으로 간주되는 독립체를 지칭한다. 그러나 몇가지 예를 제공하기 위해, 일부 구현예에서, 바이오마커는 특정 질환 상태 또는 단계에 대한, 또는 특정 질환, 장애 또는 병태가 발달할 수 있는 가능성에 대한 마커일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 특정 질환 또는 치료 결과, 또는 이의 가능성에 대한 마커일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 바이오마커는 예측성이며, 일부 구현예에서, 바이오마커는 진단성이고, 일부 구현예에서, 바이오마커는 관련된 생물학적 현상 또는 목적한 상태의 진단이다. 바이오마커는 임의의 화학 부류의 독립체일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 바이오마커는 핵산, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물, 소분자, 무기 제제(예를 들어, 금속 또는 이온), 또는 이들의 조합이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 세포 표면 마커이다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 세포 내의 것이다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 세포의 외부에서 발견된다(예를 들어, 세포의 외부, 예를 들어, 체액, 예컨대 혈액, 소변, 눈물, 타액, 뇌척수액 등에서 분비되거나 달리 생성되거나 존재한다). 일부 구현예에서, 용어는 특정 종양, 종양 서브클래스, 종양의 단계 등의 특징인 유전자 발현 생성물을 지칭한다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 구현예에서, 특정 마커의 존재 또는 수준은 특정 신호전달 경로, 예를 들어 종양의 특정 부류의 특징일 수 있는 활성(또는 활성 수준)과 관련된다. 바이오마커의 존재 또는 부재의 통계적 유의도는 특정한 바이오마커에 의존하여 가변할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오마커의 검출은 이것이, 종양이 특정 하위부류의 것이라는 높은 개연성을 반영한다는 점에서 고도로 특이적이다. 이러한 특이성은 민감성으로 인하여 발생할 수 있다(예를 들어, 음성 결과는 종양이 바이오마커를 발현하는 것으로 기대될 수 있는 종양인 경우에서도 발생할 수 있다). 일부 구현예에서, 바이오마커는 IRF8 바이오마커(예를 들어, IRF8 슈퍼 인핸서 강도, 순위, 또는 유병률 순위 및 IRF8 mRNA 수준 또는 유병률 순위를 포함하는, 예를 들어, 하나 이상의 IRF8 유전자 성분 또는 생성물의 존재, 수준, 형태 및/또는 활성)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 RARA 바이오마커(예를 들어, RARA 슈퍼 인핸서 강도, 순위, 또는 유병률 순위 및 RARA mRNA 수준 또는 유병률 순위를 포함하는, 예를 들어, 하나 이상 RARA 바이오마커 (예를 들어, 하나 이상의 RARA 유전자 성분 또는 생성물의 존재, 수준, 형태 및/또는 활성)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 바이오마커는 하나 이상의 바이오마커, 예컨대 IRF8 및 RARA의 조합을 지칭한다.
암: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 하기를 지칭한다: 악성 신생물 또는 종양 (Stedman’sMedical Dictionary, 25th ed.; Hensly ed.; Williams & Wilkins: Philadelphia, 1990). 용어들 "신생물" 및 "종양"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며 조직의 비정상적 매쓰(mass)를 지칭하고, 여기서 상기 매쓰의 성장은 정상 조직의 성장을 능가하며 이와 조화되지 않는다. "악성 신생물"은 일반적으로 저조하게 분화되며(역형성) 주위 조직의 진행성 침윤, 침습, 및 파괴를 동반한 특징적으로 신속한 성장을 갖는다. 게다가, 악성 신생물은 일반적으로 원위 부위로 전이하는 능력을 갖는다. 일부 구현예에서, 암은 임의의 악성 신생물 또는 종양이고, 여기서 IRF8 바이오마커는 RARA 효능제, 예컨대 타미바로텐에 대한 반응성과 관련된다. 일부 구현예에서, 암은 급성 골수구성 백혈병(AML)이다. 일부 구현예에서, 암은 비-APL AML이다.
병용 요법: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "병용 요법"은 대상체가 2종 이상의 치료 요법 (예를 들어, 2종 이상의 치료제)에 동시에 노출된 상황을 지칭한다. 일부 구현예에서, 2종 이상의 제제는 동시 투여될 수 있으며; 일부 구현예에서, 이러한 제제는 순차적으로 투여될 수 있고; 일부 구현예에서, 이러한 제제는 중첩 투여 요법으로 투여된다. 일부 구현예에서, 병용 요법의 "투여"는 조합된 다른 제제를 제공받는 대상체에게 하나 이상의 제제를 투여하는 것을 포함한다. 명백하게 하기 위해, 병용 요법은, 일부 구현예에서, 2종 이상의 활성제, 독립체, 또는 모이어티(moiety)가 복합 조성물로서, 또는 심지어 조합 화합물(예를 들어, 단일 화학적 복합체 또는 공유 독립체의 일부로서)로서 함께 투여될 수 있지만, 개별 제제가 단일 조성물과 함께(또는 심지어 반드시 동시에) 투여되는 것을 필요로 하지는 않는다.
컷오프 값: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "컷오프" 및 "컷오프 값"은 집단 (예를 들어, 반응군 및 비-반응군)의 2개의 서브세트 사이에서 분할된 선을 정의하는 검정에서 측정된 값을 의미한다. 따라서, 컷오프 값 이상인 값은 집단의 하나의 서브세트를 정의하며; 컷오프 값 미만인 값은 집단의 다른 서브세트를 정의한다.
진단 정보: 본원에서 사용된 바와 같이, "진단 정보" 또는 "진단에 사용하기 위한 정보"는 환자가 질환, 장애 또는 병태를 가지고 있는지를 계측하고/하거나 질환, 장애 또는 병태의 진단과 관련하여 유의성을 가진 표현형 카테고리 또는 임의의 카테고리로 질환, 장애 또는 병태를 분류하는데 유용한 정보이다. 유사하게, "진단"은 임의의 유형의 진단 정보, 비제한적으로, 대상체가 대상체에서 발현된 바와 같은 질환, 장애 또는 병태를 가지거나 이로 발병할 경향이 있는지의 여부를 포함하나, 이에 한정되지 않는 어떠한 유형의 진단 정보, 종양의 특성 또는 분류와 관련된 정보, 진단과 관련된 정보 및/또는 적절한 치료를 선택하는데 있어서 유용한 정보를 지칭한다. 치료의 선택은 특정 치료제 또는 다른 치료 양식, 예컨대 수술, 방사선 등의 선택, 요법을 견디거나 전달하는지의 여부의 선택, 투여 요법 (예를 들어, 특정 치료제 또는 치료제의 조합의 1회 이상의 용량의 빈도 또는 수준)의 선택 등을 포함할 수 있다.
투여 형태 또는 단위 투여 형태: 당해 분야의 숙련가는 용어 "투여 형태"가 대상체에게 투여하기 위한 활성제(예를 들어, 치료제 또는 진단제)의 물리적으로 별개의 단위를 지칭하는데 사용될 수 있음을 인정할 것이다. 전형적으로, 각각의 이러한 단위는 소정의 양의 활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 관련 집단에 (즉, 치료 투여 요법으로) 투여될 경우, 목적 또는 이로운 결과와 상관관계가 있는 것으로 계측된 투여 요법에 따른 투여에 적절한 단위 투여 양 (또는 이의 전체 분율)이다. 당해 분야의 숙련가는 특정 대상체에게 투여된 치료 조성물 또는 제제의 총량이 1명 이상의 주치의에 의해 계측되며 다중 투여 형태의 투여를 포함할 수 있음을 인정할 것이다.
투여 요법: 당해 분야의 숙련가는 용어 "투여 요법(dosing regimen)"이 기간에 의해 전형적으로 분리된, 대상체에게 개별적으로 투여되는 일련의 단위 용량(전형적으로 1 초과)을 지칭하는데 사용될 수 있음을 인정할 것이다. 일부 구현예에서, 제공된 치료제는 권고된 투여 요법을 가지며, 이는 1회 이상의 용량을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 투여 요법은 이들 각각이 다른 용량으로부터 시간적으로 분리되는 복수의 용량을 포함한다. 일부 구현예에서, 개별 용량은 상동한 길이의 기간으로 각각 분리되어 있으며; 일부 구현예에서, 투여 요법은 복수의 용량 및 적어도 2개의 상이한 기간으로 분리되는 개별 용량을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여 요법 내의 모든 용량은 동일한 단위 용량이다. 일부 구현예에서, 투여 요법 내의 상이한 용량은 상이한 양이다. 일부 구현예에서, 투여 요법은 제1 용량의 첫 번째 용량, 이어서 제1 용량과는 상이한 제2 용량의 하나 이상의 추가의 용량을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여 요법은 제1 용량의 첫 번째 용량, 이어서 제1 용량과 상동한 제2 용량의 하나 이상의 추가의 용량을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여 요법은 관련된 집단을 따라 투여된 경우(즉, 치료 투여 요법인 경우) 원하는 또는 유익한 결과와 상관관계가 있다.
유효량: 본원에서 사용된 바와 같이, 본 명세서에서 기재된 화합물, 예컨대 식 (I)의 "유효량"은 목적 생물학적 반응을 유도하기에, 즉, 상태를 치료하기에 충분한 양을 지칭한다. 당해 분야에서 통상적인 기술을 가진 자에 의해 인정되는 바와 같이, 본 명세서에서 기재된 화합물, 예컨대 식 (I)의 유효량은 목적 생물학적 종료점, 화합물의 약동학, 치료되는 상태, 투여 방식, 및 대상체의 연령 및 건강과 같은 인자에 의존하여 가변할 수 있다. 유효량은 치료적 및 예방적 치료를 포함한다. 예를 들어, 암을 치료하는데 있어서, 본 발명 화합물의 유효량은 종양 부하(tumor burden)를 감소시킬 수 있거나 종양의 성장 또는 확산을 중지할 수 있다.
인핸서: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인핸서"는 최대 1 Mbp 까지 이격된 유전자를 조절하는데 작용하는 게놈 DNA의 영역을 지칭한다. 인핸서는 오버랩될 수 있지만 흔히 유전자 암호화 영역으로 구성되지 않는다. 인핸서는 흔히 전사 인자에 의해 결합되고 특정 히스톤 마크에 의해 지정된다.
수화물: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "수화물"은 물과 관련된 화합물을 지칭한다. 전형적으로, 화합물의 수화물 내에 함유된 물 분자의 수는 수화물 내의 화합물 분자의 수에 대한 확실한 비로 존재한다. 따라서, 화합물의 수화물은 예를 들어, 일반식 R·x H2O (여기서 R은 화합물이고 여기서 x는 0 이상의 수임)으로 나타낼 수 있다. 제공된 화합물은 예를 들어, 일수화물(x는 1임), 보다 낮은 수화물(x는 0 초과 및 1 미만의 수임), 예를 들어, 반수화물(R-0.5 H2O)), 및 다중수화물(x는 1 초과의 수임, 예를 들어, 이수화물 (R-2 H2O) 및 헥사히드레이트(R-6 H2O))을 포함하는 수화물의 1 초과 유형을 형성할 수 있다.
IRF8 유전자: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "IRF8 유전자"는, 인터페론 공통 서열-결합 단백질 또는 이의 스플라이스 변이체를 암호화하는, 그리고 IRF8 유전자의 전체 또는 부분을 포함하는 유전자 융합물을 특이적으로 제외시키는, 게놈 DNA 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 이의 IRF8 유전자는 hgl9를 생성하는 게놈내 chrl6:85862582-85990086에 위치한다.
" 개선하다", " 증가하다" 또는 "감소하다": 본원에서 사용된 바와 같이 또는 이의 문법적 등가물은 참고 측정치, 예컨대, 본원에 기재된 치료의 개시 전에 동일한 개체에서의 측정치, 또는 본 명세서에서 기재된 치료의 부재시 대조군 개체(또는 다중 대조군 개체)내에서의 측정치에 대해 상대적인 값을 나타낸다. 일부 구현예에서, "대조군 개체"는 치료되는 개체로서 동일한 형태의 질환 또는 손상을 앓고 있는 개체이다.
메신저 RNA 전사체: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "메신저 RNA 전사체" 또는 mRNA는 하나 이상의 유전자 암호화 영역을 포함하는 DNA 서열로부터의 RNA 전사체 생성물을 지칭한다.
순위 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 지정된 값의 "순위(ordinal rank)"는 일련의 다른 값과 비교하여 당해 값의 순위를 의미한다. 예를 들어, 다른 슈퍼 인핸서와 비교하는 경우 시험 세포에서 RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서의 강도의 양태에서 100의 순위는 시험 세포내의 99개의 다른 슈퍼 인핸서가 RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서보다 더 큰 강도를 가졌음을 의미한다.
환자: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "환자" 또는 "대상체"는 제공된 조성물이 예를 들어, 실험, 진단, 예방, 화장 및/또는 치료학적 목적을 위해 것이거나 투여될 수 있는 임의의 유기체를 지칭한다. 전형적인 환자는 동물(예를 들어, 포유동물, 예컨대 마우스, 랫트, 토끼, 비-인간 영장류 및/또는 인간)을 포함한다. 일부 양태에서, 환자는 인간이다. 인간은 출생 이전 및 이후의 형태를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 하나 이상의 장애 또는 병태를 앓고 있거나 이에 취약하다. 일부 구현예에서, 환자는 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 나타낸다. 일부 구현예에서, 환자는 하나 이상의 장애 또는 병태를 지닌 것으로 진단된다
약제학적으로 허용가능한 염: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 건전한 의료 판단의 범위 내에 있고, 과도한 독성, 자극, 알러지성 반응 등 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며, 합리적인 유익/유해 비율이 맞는 염들을 의미힌다. 약제학적으로 허용가능한 염은 당해 기술에 공지되어 있다. 예를 들면, 버지(Berge) 등은 하기에서 약제학적으로 허용가능한 염을 상세히 기재한다: J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 119 (본원에서 참조로 편입됨). 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염은 적합한 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유래된 것들을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한, 비독성 산 부가 염의 예는 무기 산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산, 및 과염소산과 함께, 및 유기 산 예컨대 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 석신산, 또는 말론산과 함께 또는 다른 당해 분야에서 공지된 방법, 예컨대 이온 교환을 사용함에 의해 형성된 아미노 기의 염이다. 다른 약제학적으로 허용가능한 염은 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로아이오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토바이오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, MALAT1e, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p 톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염, 및 기타 동종의 것을 포함한다. 적절한 염기로부터 유래된 염은 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄 및 N+(C1-4 알킬)4 염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 및 기타 동종의 것을 포함한다. 추가의 약제학적으로 허용가능한 염은, 적절하게는, 반대이온, 예컨대 할라이드, 수산화물, 카복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 저급 알킬 설포네이트, 및 아릴 설포네이트를 사용하여 형성된 비독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 아민 양이온을 포함한다.
집단: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "집단" 또는 샘플의 "집단은 보다 큰 그룹에서 측정된 값의 분포를 적절하게 반영하는 충분한 수(예를 들어, 적어도 30, 40, 50 또는 그 초과)의 상이한 샘플을 의미한다. 샘플의 집단에서 각각의 샘플은 세포주, 살아있는 것으로부터 수득된 생물학적 샘플(예를 들어, 생검 또는 체액 샘플), 또는 제노그래프(xenograph)(예를 들어, 세포주 또는 환자 샘플을 이식함으로써 마우스에서 성장된 종양)일 수 있으며, 여기서 각각의 샘플은 동일한 질환, 병태 또는 장애를 앓고 있는 살아있는 것으로부터 또는 이를 나타내는 세포주 또는 제노그래프로부터 기원한다.
유병률 컷오프: 본원에서 사용된 바와 같이, 지정된 값(예를 들어, IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서의 강도)에 대한 용어 "유병률 컷오프"는 집단 (예를 들어, 반응군 및 비반응군)에 대한 2개의 서브세트 사이에서 분할된 선을 정의하는 유병률 순위를 의미한다. 따라서, 유병률 컷오프 (예컨대, 하한 백분율 값) 이상의 유병률 순위는 집단의 일 서브세트를 정의하며; 그리고 유병률 컷오프 (예컨대, 상한 백분율 값) 미만의 유병률 순위는 집단의 기타 서브 세트를 정의한다.
유병률 순위: 본원에서 사용된 바와 같이, 지정된 값 (예를 들어, IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서의 강도)에 대한 용어 "유병률 순위"는 특정 값 이상인 집단의 백분율을 의미한다. 예를 들어, 시험 세포 내 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서의 강도에 대한 35% 유병률 순위는, 상기 집단의 35%가 상기 시험 세포 이상의 강도로 IRF8 유전자 인핸서를 갖는다는 것을 의미한다.
진단성 및 예측성 정보: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "예후 정보" 및 "예측의 정보"는 치료의 부재 또는 존재하에서 질환 또는 병태의 과정의 임의의 측면을 나타내는데 사용될 수 있는 임의의 정보를 지칭하는데 사용된다. 이러한 정보는 비제한적으로, 환자의 평균 기대수명(average life expectancy), 즉, 환자가 주어진 시간의 양(예를 들어, 6개월, 1년, 5년, 등) 동안 생존할 가능성, 환자의 질환이 치유될 가능성, 환자의 질환이 특정 요법에 반응할 가능성(여기서 반응은 임의의 다양한 방법으로 정의될 수 있다)을 포함한다. 진단 및 예측의 정보는 진단 정보의 넓은 카테고리 내에 포함된다.
순위 배치: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "순위 배치(Rank Ordering)"는 최고로부터 최저까지의, 또는 최저로부터 최고까지의 값의 배치를 의미한다.
RARA 유전자: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "RARA 유전자"는 기능성 레틴산 수용체-α 유전자를 암호화하고 RARA 유전자의 일부 또는 모두를 포함하는 유전자 융합을 구체적으로 배제하는 게놈 DNA 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, RARA 유전자는 hgl9를 생성하는 게놈내 chrl7:38458152-38516681에 위치한다.
참고치: 비교가 수행된 표준 또는 대조군이 본원에서 사용된 바와 같이 기술된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열, 또는 관심 값은 참고치 또는 대조군 제제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값과 비교된다. 일부 구현예에서, 참고치 또는 대조군은 시험 또는 목적한 측정과 실질적으로 동시에 시험되고/되거나 측정된다. 일부 구현예에서, 참고치 또는 대조군은 실제하는 매질 내에서 임의로 형체화된 조직학적 참고치 또는 대조군이다. 전형적으로, 당해 분야의 숙련가에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 참고치 또는 대조군은 평가 하에서 이들에 대한 비교할만한 조건 또는 상황 하에서 계측되거나 특성규명된다. 당해 분야의 숙련가는 충분한 유사성이 신뢰도 및/또는 특정 가능한 참고치 또는 대조군에 대한 비교를 정당화하기 위해 나타나는 경우 인정할 것이다.
반응: 본원에서 사용된 바와 같이, 치료에 대한 반응은 치료의 결과로서 발생하거나 치료와 관련된 대상체의 상태에서의 임의의 유익한 변경을 지칭한다. 이러한 변경은 상태의 안정화(예를 들어, 치료의 부재하에서 발생할 수 있는 악화의 예방), 상태의 하나 이상의 증상의 빈도에 있어서 개시의 완화, 지연 및/또는 감소 및/또는 상태의 치유에 대한 전망 등을 포함할 수 있다. 일부 사례에서, 반응은 대상체의 반응일 수 있고; 일부 사례에서 반응은 종양의 반응일 수 있다. .
용매화물: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "용매화물"은 일반적으로 가용매분해 반응에 의해, 용매와 관련된 화합물의 형태를 지칭한다. 이러한 물리적 연관관계는 수소 결합화를 포함할 수 있다. 종래의 용매는 물, 메탄올, 에탄올, 아세트산, DMSO, THF, 디에틸 에테르, 및 기타 동종의 것을 포함한다. 본 명세서에서 기재된 화합물, 예컨대 식 (I)의 화합물은, 예를 들어, 결정형으로 제조될 수 있고, 용매화될 수 있다. 적합한 용매화물은 약제학적으로 허용가능한 용매화물을 포함하고 추가로, 화학양론적 용매화물 및 비-화학양론적 용매화물 둘 다를 포함한다. 특정 경우에서, 용매화물은 예를 들어, 하나 이상의 용매 분자가 결정성 고체의 결정 격자 내에 편입되는 경우, 단리될 수 있을 것이다. "용매화물"은 용액-상 및 분리가능한 용매화물 둘 다를 포함한다. 대표적인 용매화물은 수화물, 에탄올레이트, 및 메탄올레이트를 포함한다.
강도: 본원에서 사용된 바와 같이, 인핸서 또는 슈퍼 인핸서의 일부를 지칭하는 경우, 용어 "강도"는 본원에서 사용된 바와 같이, 분석된 게놈 DNA 분절의 길이에 대해 도식화된 H3K27Ac의 수 또는 기타 게놈 마커 판독물의 곡선하 면적을 의미한다. 따라서, "강도"는 측정하기 위해 선택된 영역을 정의하는 염기 쌍의 스판(span)에 걸쳐 소정의 염기쌍에서 마크(mark)를 측정하는 것으로부터 유발되는 신호의 적분값(integration)이다.
대상체: 본원에서 사용된 바와 같이, 이에 대한 투여가 고려되는 "대상체"는 인간(예를 들어, 임의의 연령 그룹의 남성 또는 여성, 예를 들어, 소아 대상체(예를 들어, 영아, 아동, 청소년) 또는 성인 대상체(예를 들어, 청소년, 중년 성인, 또는 노년 성인))가 고려된다.
슈퍼 인핸서: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "슈퍼 인핸서"는 특정 세포내에서 다른 인핸서에 대해 히스톤 표시 및/또는 전사 단백질의 불균형 지분(disproportionate share)을 함유하는 인핸서의 서브세트를 지칭한다. 이로 인하여, 슈퍼 인핸서에 의해 조절된 유전자는 이러한 세포의 기능에 대해 매우 중요한 것으로 예상된다. 슈퍼 인핸서는 강도를 기반으로 세포내에서 모든 인핸서의 순위 배치에 의해서 및 세포내에서 중간 인핸서보다 상당히 더 높은 강도를 갖는 인핸서의 서브세트를 이용가능한 소프트웨어 예컨대 ROSE (https://bitbucket.org/young_computation/rose)를 사용하여 계측함으로써 계측된다 (참조: 예를 들어, 미국 특허 9,181,580, 이는 본원에 참고로 편입됨).
역치: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "역치" 및 "역치 수준"은 집단 (예를 들어, 반응군 및 비-반응군)의 2개의 서브세트 사이에서 분할된 선을 정의하는 수준을 의미한다. 역치 또는 역치 수준은 유병률 컷오프 또는 컷오프 값일 수 있다.
치료: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "치료", "치료하다", 및 "치료하는"은 본원에 기재된 "병리 상태" (예를 들어, 질환, 장애, 또는 병태, 또는 이의 하나 이상의 징후 또는 증상)를 역전하거나, 경감하거나, 이의 개시를 지연시키거나, 이의 진행을 억제시키는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, "치료", "치료하다", 및 "치료하는"은 질환 장애 또는 병태의 징후 또는 증상이 발병하거나 관찰된 것을 필요로 한다. 다른 구현예에서, 치료는 질환 또는 병태 (예를 들어, 증상의 이력 측면에서 및/또는 유전적 또는 다른 민감성 인자의 측면에서)의 징후 또는 증상의 부재하에 투여될 수 있다. 치료는 또한, 증상이 해결된 후, 예를 들어, 재발을 지연시키거나 방지하기 위해 지속될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "병태", "질환", 및 "장애"는 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 특정 구현예의 상세한 설명
RARA 및 IRF8
레틴산 수용체 하위유형 알파(RARA)는 길항제에 의해, 및 효능제-결합된 상태의 유전자 활성제로서 결합되거나 미결합된 경우 전사 억제인자로서 작용하는 핵 호르몬 수용체이다. RARA의 천연 리간드는 전체-트랜스 레틴산 (ATRA)으로도 공지된 레틴산이며, 이는 비타민 A로부터 생산된다.
슈퍼-인핸서(SE)는 악성 세포에서 종양유전자를 포함하는, 주요 세포 동일성 유전자를 조절하는 크고, 고도로-활성인 염색질 영역이다. 유전자 대조군 플랫폼을 사용하여, 본 발명자들은 60개의 1차 AML 환자 샘플 내에서 SE 게놈-전체를 확인함으로써 신규한 종양 취약성의 발견을 가능하도록 하였다. 환자 샘플 내에서 차별적인 존재를 나타낸 SE 중 하나는 RARA를 암호화하는 RARA 유전자와 관련되었다.
연구는 타미바로텐 반응성과 RARA 슈퍼 인핸서 강도 및 mRNA 수준의 둘 중 하나 또는 모두 사이의 양호한 상관관계를 실증하였다. 그러나, 각각의 이들 잠재적인 RARA 바이오마커의 경우, 타미바로텐 반응성이 혼합된 중간 범위가 존재하였다. 본 개시내용은 이러한 모호한 반응성 결과를 해결하는데 도움을 주는 통찰력 및 기술을 제공하고 타미바로텐 요법에 대한 유사한 반응성을 기반으로 환자를 특성규명하거나, 확인하거나, 선택하거나, 계층화하는, 다른 것들 중에서도 유용한 다양한 조성물 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은, 하나 이상의 IRF8 바이오마커 (예컨대, 예를 들어 IRF8 슈퍼 인핸서 강도, 순위, 유병률 순위, 또는 IRF8 mRNA 수준를 포함하는, 하나 이상의 IRF8 유전자 성분 또는 생성물의 존재, 수준, 형태 및/또는 활성)을 구현하고/하거나, 정의하고/하거나, 그리고/또는 이용하는, 그리고 암 요법에서 이의 유용성을 입장하는, 기술을 제공한다.
RARA 인핸서, RARA mRNA 수준 및 타미바로텐에 대한 반응성의 강도 및 서수에 대해 이전에 분석된 다양한 AML 세포주 및 환자 샘플을 사용하여, 본 발명자들은 타미바로텐에 대한 반응성과 관련된 추가의 바이오마커를 찾아내었다. 인터페론 반응 인자 8 (IRF8) mRNA 수준이 RARA와 유사한 환자 집단에서 상향조절된 것으로 밝혀졌다. IRF8은 조혈에 중요한 것으로 공지된 인터페론 반응성 전사 인자이며 이의 신호전달 손실은 미성숙한 골수 세포의 비정상적인 팽창을 유발한다. AML에서, IRF8 과발현이 관찰되고 열악한 임상 결과와 관련될 수 있다. 이러한 상향조절에도 불구하고, IRF8 신호전달은 SE-유도된 억제상태인 경우, 억제성 전사 보조인자 및 잠재적으로 RARA에 의해 실제로 손상된다. 게다가, 인터페론-α 자체, IRF에 대한 업스트림 신호전달 리간드는, AML 및 RARA 경로와의 신호전달 혼선(cross-talk)에 있어서 전-분화 효과를 나타낸다.
본 개시내용은 IRF8 유전자 인핸서 강도의 상관관계, IRF8 mRNA 수준, 및 타미바로텐에 대한 민감성을 시험하기 위한 AML 환자 종양 샘플 및 세포주의 패널의 게놈-전체 발현 및 인핸서 수준 분석을 기술한다. AML 세포주의 패널은 RARA 효능제 타미바로텐의 항-증식성 효과에 대한 이의 민감성과 RARA 인핸서 강도 및 RARA mRNA 수준 둘 다 사이의 상관관계에 대해 이전에 시험되었고 이를 갖는 것으로 밝혀졌다. 본원에서 본 발명자들은 IRF8 mRNA 수준이 또한 RARA mRNA 수준을 가진 AML 세포주 및 AML 환자 샘플에서 상승되고 IRF8 mRNA 수준과 RARA 효능제, 예컨대 타미바로텐에 대한 반응성 사이에 상관관계가 존재함을 입증한다. 본 발명자들은 또한 IRF8 인핸서 강도 (예를 들어, IRF8과 관련된 슈퍼-인핸서의 존재), IRF8 mRNA 수준, RARA mRNA 수준 및, 타미바로텐에 대한 반응성 사이의 상관관계가 존재함을 입증한다. 따라서, IRF8 인핸서 강도 또는 IRF8 mRNA 수준은 단독으로, 또는 RARA 인핸서 강도 또는 RARA mRNA 수준과 함께 사용되어 RARA 효능제, 예컨대 타미바로텐을 사용한 치료에 대해 반응성일 환자를 식별할 수 있다.
IRF8 및 RARA 슈퍼 -인핸서 확인 및 역치 수준의 계측
인핸서 또는 슈퍼 인핸서의 식별은 예를 들어 Cell 2013, 155, 934-947 및 PCT/US2013/066957에 기술된 바와 같은 당해 분야에서 공지된, 다양한 방법에 의해 달성될 수 있으며, 이 둘 모두는 본 명세서에 참고로 편입된다. 일부 구현예에서, 슈퍼 인핸서의 식별은 환자 내 암 샘플(예를 들어, 생검)으로부터 세포 물질 및 DNA를 수득함으로써 달성된다. 인핸서 측정을 위한 중요한 매트릭스는 2개의 치수 - 게놈 마커 (예를 들어, H3K27Ac)가 인접하게 검출된 DNA의 길이 - 및 상기 규모를 구성하는 DNA의 스판(span)에 따른 각각의 염기쌍에서의 게놈 마커의 컴파일링된 발생빈도에 의하여 발생한다. 길이 및 규모 분석의 적분값(integration)으로부터 생성되는 곡선하 면적 ("AUC")의 측정은 인핸서의 강도를 계측한다. 대상체가 RARA 효능제 (예를 들어, 타미바로텐)에 대해 반응성인지의 여부를 계측하기 위하여 본 발명의 일 양태에서 대조군에 대한 IRF8 또는 RARA 슈퍼 인핸서의 강도가 사용된다. 게놈 마커가 검출되는 DNA의 길이가 IRF8 또는 RARA 및 대조군 둘 모두에 대하여 상동할 경우, 대조군에 대한 IRF8 또는 RARA 슈퍼 인핸서 규모의 비율은 상기 강도와 동등할 것이며, 그리고 대상체가 RARA 효능제에 반응성일 것인지 여부를 계측하는데 또한 사용될 수 있다는 것이, 본 명세서를 기반으로 하여 본 분야의 숙련가에게 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 세포에서 IRF8 또는 RARA 인핸서의 강도는 다른 샘플과 비교하기 전에 정규화된다. 정규화는 모든 세포에서 유사한 수준을 나타내는 도처에 존재하는 슈퍼-인핸서 또는 인핸서를 포함하는 것으로 공지된 동일한 세포내에서의 영역에 대해 비교함으로써 달성된다. 그와 같은 도처에 존재하는 슈퍼 인핸서 영역의 한가지 예는 MALAT1 슈퍼-인핸서 유전자좌 (chrl 1:65263724-65266724) (genome build hgl9)이다.
이는 chrl7:38458152-3851668l (genome build hgl9)에서 RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서 유전자좌가 존재하고 chrl6:85862582- 85990086 (genome build hgl9)에서 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼-인핸서 유전자좌가 존재하는 H3K27Ac ChIP-seq 방법에 의해 측정되어 왔다.
ChIP-seq로도 또한 공지된 ChIP-서열분석은 DNA-관련된 단백질의 결합 부위를 확인하기 위하여 염색질 면역침강 (칩)을 광대하게 평행한 DNA 서열분석과 결합시키는 DNA ChIP-seq을 사용하여 단백질 상호작용을 분석하기 위해 사용된다. 이는 목적한 임의의 단백질에 대해 정확하게 전반적인 결합 부위를 맵핑하기 위해 사용될 수 있다. 이전에, ChIP-온-칩(ChIP-on-chip)은 이들 단백질-DNA 관계를 연구하기 위해 이용된 가장 일반적인 기술이다. 성공적인 ChIP-seq은 초음파처리 강도 및 방법, 완충액 조성물, 항체 품질, 및 세포 수를 포함하는 많은 인자에 의존적이다; 예를 들어, T. Furey, Nature Reviews Genetics 13, 840-852 (December 2012); M.L. Metzker, Nature Reviews Genetics 11, 31-46 (January 2010); 및 P.J Park, Nature Reviews Genetics 10, 669-680 (October 2009))를 참고한다. ChIP-seq을 사용하여 슈퍼 인핸서를 확인하는데 사용될 수 있는 H3K27Ac 이외의 게놈 마커는 P300, CBP, BRD2, BRD3, BRD4, 매개체 복합체의 성분(J Loven, et al., Cell, 153(2):320-334, 2013), 히스톤 3 라이신 4 모노메틸화된 (H3K4mel), 또는 기타 조직 특정 인핸서 결속된 전사 인자 (E Smith & A Shilatifard, Nat Struct Mol Biol, 21(3):210-219, 2014) (S Pott & Jason Lieb, Nature Genetics, 47(1):8-12, 2015)를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포주 또는 환자 샘플의 전체 게놈의 H3K27Ac 또는 다른 마커 ChIP-seq 데이터 슈퍼-인핸서 맵은 이미 존재한다. 일부 구현예에서, chrl7:38458152-38516681 (genome build hgl9) 유전자좌에서 이러한 맵내 인핸서 또는 슈퍼인핸서의 강도, 또는 순위가 소정의 역치 수준 이상이었는지의 여부를 단순히 계측할 수 있다. 일부 구현예에서, chrl6:85862582-85990086 (genome build hgl9) 유전자좌에서 이러한 맵내 인핸서 또는 슈퍼-인핸서의 강도, 또는 순위가 소정의 역치 수준 이상이었는지의 여부를 단순히 계측할 수 있다.
IRF8, RARA, 및 MALAT1의 특정 염색체 위치는 상이한 게놈 빌드 및/또는 상이한 세포 유형에 대해 상이할 수 있음이 이해되어야 한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는 본 명세서의 양태에서, 게놈 빌드 hg 19 내의 RARA 및/또는 MALAT1 유전자좌에 상응하는 특이적 서열을 이러한 다른 게놈 빌드 내에 위치시킴으로서 이러한 상이한 위치를 계측할 수 있다.
슈퍼 인핸서를 확인하기 위한 다른 방법은 chrl7:38458152-38516681 (게놈 빌드 hgl9) RARA 유전자좌 또는 chrl6:85862582-85990086 (게놈 빌드 hgl9) IRF8 유전자좌에 하이브리드화하는 동일한 면역침강된 게놈 마커 및 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하는, 염색질 면역침강 (JE Delmore, et al., Cell, 146(6)904-917, 2011) 및 칩 어레이(ChIP-chip), 및 염색질 면역침강에 후속적인, qPCR(ChIP-qPCR)을 포함한다. ChIP-chip의 경우에, 신호는 다른 어레이 기반 기술을 사용하는 바와 같이 탐침 및 투입 검정 샘플의 하이브리드화로부터 생성되는 강도 형광에 의해 전형적으로 검출된다. ChIP-qPCR의 경우, PCR 반응에서 생성된 이중가닥 DNA의 삽입작용 후에만 형광이 되는 염료를 사용하여 템플레이트(template)의 증폭을 측정한다.
일부 구현예에서, 세포가 필수 역치 수준 이상의 IRF8 슈퍼 인핸서 강도를 가지는지의 여부에 대한 계측은 시험 세포 내의 IRF8 인핸서 강도를 세포 샘플의 집단 내의 상응하는 IRF8 강도와 비교함으로써 달성되며, 여기서 각각의 세포 샘플은 치료될 동일한 질환을 반영하는 상이한 공급원(예를 들어, 상이한 대상체, 상이한 세포주, 상이한 제노그래프)으로부터 수득된다. 이들 구현예의 일부 양태에서, 대상체로부터 원발성 종양 세포 샘플 만이 역치 수준을 측정하는데 사용된다. 이들 구현예의 일부 양태에서, 집단 내의 샘플의 적어도 일부는 a) 특정 RARA 효능제에 대해 반응하는 집단 내의 샘플의 최저 IRF8 인핸서 강도("최저 반응군"); 및, 선택적으로, b) 특정 RARA 효능제에 반응하지 않는 집단 내의 샘플의 최고 IRF8 인핸서 강도("최고 비-반응군")을 확립하기 위하여 특정 RARA 효능제에 대한 반응성에 대해 시험될 것이다. 이러한 구현예에서, 하기와 같은, 시험 세포가 특정 RARA 효능제가 반응성인 것으로 고려될 것인 IRF8 인핸서 강도의 컷오프가 설정된다: i) 집단 내 최저 반응군 중 IRF8 인핸서 강도를 최대 5% 초과하거나 이와 동일하거나; 또는 ⅱ) 집단 내 최고 비반응군 중 IRF8 인핸서 강도를 최대 5% 초과하거나 이와 동일하거나; 또는 ⅲ) 집단 내 최고 비-반응군 및 최저 반응군 중 IRF8 인핸서 강도 사이의 값.
상기 구현예에서 집단 내 모든 샘플이 RARA 효능제에 대한 반응성에 대해 시험될 필요가 있는 것이 아니라 모든 샘플이 IRF8 인핸서 강도 및/또는 IRF8 mRNA 수준에 대해 측정된다는 것이 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 샘플은 IRF8 인핸서 강도를 기반으로 순위 정렬된다. 상기 제시된 3개의 방법들 중 임의의 것의 선택을 사용하여 컷오프를 확립하는 것은, 집단 내의 최저 반응군과 최고 비반응군 사이의 IRF8 인핸서 강도에 있어서의 차이, 및 목표가 위양성의 수를 최소화하는 것인지 또는 잠재적으로 반응성인 샘플 또는 대상체의 누락 가능성을 최소화하는 것인지에 의존할 것이다. 최저 반응군 및 최고 비-반응군 사이의 차이가 클 경우 (예컨대, IRF8 인핸서 강도의 순위 배치 중 최저 반응군 및 최고 비-반응군 범위 내에 있는, 반응성에 대해 시험되지 않는 다수의 샘플이 존재하는 경우), 컷오프는 전형적으로 집단 내 최저 반응군 중 IRF8 인핸서 강도와 동등하거나 최대 5% 초과로 설정된다. 이러한 컷오프는 잠재적인 반응군의 수를 최대화한다. 이러한 차이가 작은 경우(예를 들어, IRF8 인핸서 강도의 순위 배치에 있어서 최저 반응군과 최고 비-반응군 사이에 속하는 반응성에 대해 시험되지 않은 샘플이 거의 없거나 없는 경우), 컷오프는 전형적으로 최저 반응군의 IRF8 인핸서 강도와 최고 IRF8 인핸서 강도 사이의 값으로 설정된다. 이러한 컷오프는 위양성의 수를 최소화한다. 최고 비-반응군이 최저 반응군 보다 더 큰 IRF8 인핸서 강도를 갖는 경우, 컷오프는 집단 내 최고 비-반응군에서 IRF8 인핸서 강도와 동일하거나 이를 5% 초과하는 값으로 전형적으로 설정된다. 이러한 방법은 또한 위양성의 수를 최소화한다.
일부 구현예에서, 세포가 필수 역치 수준 이상의 IRF8 슈퍼 인핸서를 가지는지의 여부에 대한 계측은 시험 세포 내의 IRF8 인핸서 강도의 서수를 세포 샘플의 집단 내의 IRF8 인핸서 강도의 서수와 비교함으로써 달성되며, 여기서 각각의 세포 샘플은 상이한 공급원(예를 들어, 상이한 대상체, 상이한 세포주, 상이한 제노그래프)으로부터 수득된다. 이들 구현예에서, 집단 내의 샘플의 적어도 일부는 a) 특정 RARA 효능제에 대해 반응하는 집단 내의 샘플의 최저 IRF8 인핸서 강도 서수("최저 서수 반응군"); 및, 선택적으로, b) 특정 RARA 효능제에 반응하지 않는 집단 내의 샘플의 최고 IRF8 인핸서 강도 서수("최고 서수 비-반응군")을 확립하기 위하여 특정 RARA 효능제에 대한 반응성에 대해 시험될 것이다. 이러한 구현예에서, 하기와 같은, 시험 세포가 특정 RARA 효능제가 반응성인 것으로 고려될 것인 IRF8 인핸서 강도 서수의 컷오프가 설정된다: i) 집단 내 최저 서수 반응군 중 IRF8 인핸서 강도 서수를 최대 5% 초과하거나 이와 동일하거나; 또는 ⅱ) 집단 내 최고 서수 비반응군 중 IRF8 인핸서 강도 서수를 최대 5% 초과하거나 이와 동일하거나; 또는 ⅲ) 집단 내 최고 서수 비-반응군 및 최저 서수 반응군 중 IRF8 인핸서 강도 사이의 값.
상기 구현예에서 전형적으로 집단 내 모든 샘플이 RARA 효능제에 대한 반응성에 대해 시험될 필요가 있는 것이 아니라 모든 샘플이 상동한 샘플 내 확립된 기타 인핸서와 비교하여 IRF8 인핸서 강도 및 IRF8 인핸서 강도의 서수에 대해 측정된다는 것이 이해될 것이다. 서수는 세포내 모든 다른 인핸서의 강도를 측정하고 강도의 측면에서 다른 인핸서와 비교하여 IRF8 인핸서가 어느 순위(예를 들어, 서수)를 갖는지를 계측함으로써 전형적으로 수득된다.
일부 구현예에서, 샘플은 IRF8 인핸서 강도의 서수를 기반으로 순위 배치된다. 상기 제시된 3개의 방법들 중 어느 것의 선택을 사용하여 컷오프를 확립하는 것은 집단 내의 최저 서수 반응군과 최고 서수 비반응군 사이의 IRF8 인핸서 강도의 서수에 있어서의 차이 및 컷오프가 위양성을 최소화하기 위하여, 또는 반응군의 수를 최대화하기 위하여 설계된 것인지 여부에 의존할 것이다. 차이가 클 경우 (예컨대, IRF8 인핸서 강도의 서수의 순위 배치 중 최저 서수 반응군 및 최고 서수 비-반응군 범위 내에 있는, 반응성에 대해 시험되지 않는 다수의 샘플이 존재하는 경우), 컷오프는 전형적으로 집단 내 최저 서수 반응군 중 IRF8 인핸서 강도의 서수와 동등하거나 최대 5% 초과로 설정된다. 이러한 차이가 작은 경우(예를 들어, IRF8 인핸서 강도의 서수의 순위 배치에 있어서 최저 서수 반응군과 최고 서수 비-반응군 사이에 속하는 반응성에 대해 시험되지 않은 샘플이 거의 없거나 없는 경우), 컷오프는 전형적으로 최저 서수 반응군 및 최고 서수 비-반응군의 IRF8 인핸서 강도의 서수 사이의 값으로 설정된다. 최고 서수 비-반응군이 최저 반응군 보다 더 큰 IRF8 인핸서 강도의 서수를 갖는 경우, 컷오프는 집단 내 최고 서수 비-반응군에서 IRF8 인핸서 강도의 서수와 동일하거나 이를 5% 초과하는 값으로 전형적으로 설정된다.
시험 세포 또는 샘플이 집단에 대해 비교되는 일부 구현예에서, 집단에 대해 수득된 컷오프 값(들) (예컨대, IRF8 인핸서 강도 또는 IRF8 인핸서 서수)은 유병률 순위로 전환되고 컷오프는 컷오프 값 이상, 예를 들어, 유병률 컷오프를 갖는 집단의 퍼센트로 표현된다. 이론에 의한 구속됨 없이, 출원인은 시험 샘플의 유병률 순위가 IRF8 인핸서 강도를 계측하는데 사용된 방법론과는 무관하게 유사할 것이라고 믿는다. 따라서, 일 파라미터(예를 들어, IRF8 인핸서 강도 서수)에 대해 계측된 유병률 컷오프는 포터블(portable)이며 다른 파라미터에 대한 컷오프 값을 계측하기 위해 또 다른 파라미터 (예를 들어, IRF8 mRNA 수준)에 적용될 수 있다. 이는 이러한 파라미터의 수준과 RARA 효능제에 대한 반응성 사이의 상관관계를 실험적으로 계측해야 할 필요없이 임의의 파라미터에 대한 컷오프 값의 계측을 허용한다. 계측할 필요가 있는 모든 것은 이러한 다른 파라미터의 어느 수준이 집단에서 이전에 결정된 유병률 컷오프에 상응하는지이다.
일부 구현예에서, 상기 논의된 방법을 이용하여 대상체로부터의 이환 세포가 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서를 갖는지의 여부를 단순히 계측할 수 있다. 이들 구현예에서, IRF8-관련된 슈퍼 인핸서의 존재는 상기 대상체가 RARA 효능제에 반응할 것임을 나타낸다. 이들 구현예의 일 양태에서, 세포는 IRF8-관련된 인핸서가 MALAT-1과 관련된 인핸서와 동일하거나 상기 이상의 강도를 갖는 경우 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서를 갖는 것으로 계측된다. 이러한 구현예의 대안적 양태에서, IRF8-관련된 인핸서가 세포 내 인핸서 전체의 강도 중앙값을 적어도 10-배 초과하는 강도를 가질 경우, 세포는 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서를 갖는 것으로 계측된다. 이러한 구현예의 기타 대안적 양태에서, IRF8-관련 인핸서가 탄젠트의 기울기가 세포 내 인핸서 중 각각의 강도의 순위-정렬된 그래프 중 1인 지점 초과의 강도를 가질 경우, 세포는 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서를 갖는 것으로 계측된다.
일부 구현예에서, 상기 검토된 방법은, 대상체 유래의 이환 세포가 소정의 역치 수준 이상인 강도, 순위, 또는 유병률 순위를 갖는 RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서를 발현하는지 여부를 추가로 계측하기 위하여 이용될 수 있다. 이러한 구현예의 일부 양태에서, a) 이환 세포가 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서를 갖는 것 (또는 상기 슈퍼 인핸서는 소정의 역치 수준 이상의 강도 또는 순위를 갖는 것); 또는 b) 이환 세포는 소정의 역치 수준 이상인 강도 또는 순위를 갖는 RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서를 갖는 것의 계측은, 대상체가 RARA 효능제에 반응할 것이라는 것을 표지한다. 이러한 구현예의 기타 양태에서, a) 이환 세포가 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서를 갖는 것 (또는 상기 슈퍼 인핸서는 소정의 역치 수준 이상의 강도 또는 순위를 갖는 것); 그리고 b) 이환 세포는 소정의 역치 수준 이상인 강도 또는 순위를 갖는 RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서를 갖는 것의 계측은, 대상체가 RARA 효능제에 반응할 것이라는 것을 표지한다.
IRF8 mRNA 수준 계측
일부 구현예에서, IFR8 mRNA 수준은 RARA 효능제에 대한 민감성을 계측하기 위해 슈퍼-인핸서 강도 또는 순위 대신에 사용될 수 있다. IRF8 mRNA는 정량화될 수 있고, 상기 유전자좌에서 슈퍼-인핸서 강도와 높은 상관관계가 있을 수 있다 (도 10). 본 발명자들은 IRF8을 암호화하는 mRNA 전사체가 RARA 효능제에 대한 민감성과 상관관계가 있으며 (도 8), 따라서 일부 구현예에서, IRF8 mRNA 수준이 RARA 효능제와 반응할 세포를 확인하는데 사용될 수 있음을 계측하였다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, 전사체 수준과 같은 후생유전자 마커)의 서열이 평가된다. 일부 구현예에서, DNA 서열분석은 개별 유전자, 보다 큰 유전적 영역 (예를 들어 유전자 또는 오페론의 클러스터), 전체 염색체 또는 전체 게놈의 서열을 계측하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 서열분석이 사용될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 개별 유전자, 보다 큰 유전적 영역 (예를 들어 유전자 또는 오페론의 클러스터), 전체 염색체 또는 전체 게놈의 서열을 측정하는데 이용가능한 다양한 방법을 이해할 수 있다. 일부 구현예에서, 차세대 서열분석이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 전체 게놈의 차세대 서열분석이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 서열분석은 전사체의 수준을 정량화하는데 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체 (예를 들어, 종양 샘플, 암 세포 샘플, 혈액 샘플, 등) 내에서 IRF8 mRNA 수준은 동일한 질환 또는 병태를 가진 대상체의 집단 내 IRF8 mRNA 수준에 대해 동일한 검정을 사용하여 비교함으로써 RARA 효능제 반응군을 확인할 수 있다. 이들 구현예에서, 집단 내의 샘플의 적어도 일부는 a) 특정 RARA 효능제에 대해 반응하는 집단 내의 샘플의 최저 IRF8 mRNA 수준("최저 mRNA 반응군"); 및, 선택적으로, b) 특정 RARA 효능제에 반응하지 않는 집단 내의 샘플의 최고 IRF8 mRNA 수준("최고 mRNA 비-반응군")을 확립하기 위하여 특정 RARA 효능제에 대한 반응성에 대해 시험될 것이다. 이러한 구현예에서, 하기와 같은, 시험 세포가 특정 RARA 효능제가 반응성인 것으로 고려될 것인 IRF8 mRNA 수준의 컷오프가 설정된다: i) 집단 내 최저 mRNA 반응군 중 IRF8 mRNA 수준을 최대 5% 초과하거나 이와 동일하거나; 또는 ⅱ) 집단 내 최고 mRNA 비반응군 중 IRF8 mRNA 수준을 최대 5% 초과하거나 이와 동일하거나; 또는 ⅲ) 집단 내 최고 mRNA 비-반응군 및 최저 mRNA 반응군 중 IRF8 mRNA 수준 사이의 값.
일부 구현예에서, 집단 내 모든 샘플이 RARA 효능제에 대한 반응성에 대해 시험될 필요가 있는 것이 아니라 모든 샘플이 IRF8 mRNA 수준에 대해 측정된다. 일부 구현예에서, 샘플은 IRF8 mRNA 수준을 기반으로 순위 정렬된다. 상기 제시된 3개의 방법들 중 어느 것의 선택을 사용하여 컷오프를 확립하는 것은 집단 내의 최저 mRNA 반응군과 최고 mRNA 비반응군 사이의 IRF8 mRNA 수준에 있어서의 차이 및 컷오프가 위양성을 최소화하기 위하여, 또는 반응군의 수를 최대화하기 위하여 설계된 것인지 여부에 의존할 것이다. 차이가 클 경우 (예컨대, IRF8 mRNA 수준의 순위 배치 중 최저 mRNA 반응군 및 최고 mRNA 비-반응군 범위 내에 있는, 반응성에 대해 시험되지 않는 다수의 샘플이 존재하는 경우), 컷오프는 전형적으로 집단 내 최저 mRNA 반응군 중 mRNA 수준의 서수와 동등하거나 최대 5% 초과로 설정된다. 이러한 차이가 작은 경우(예를 들어, IRF8 mRNA 수준의 순위 배치에 있어서 최저 mRNA 반응군과 최고 mRNA 비반응군 사이에 속하는 반응성에 대해 시험되지 않은 샘플이 거의 없거나 없는 경우), 컷오프는 전형적으로 최저 mRNA 반응군의 IRF8 mRNA 수준과 최고 mRNA 비반응군 사이의 값으로 설정된다. 최고 mRNA 비-반응군이 최저 mRNA 반응군 보다 더 큰 IRF8 mRNA 수준을 갖는 경우, 컷오프는 집단 내 최고 mRNA 비-반응군에서 IRF8 mRNA 수준과 동일하거나 이를 5% 초과하는 값으로 전형적으로 설정된다.
일부 구현예에서, 집단은 IRF8 mRNA 수준을 기반으로 순위 정렬된다. 이들 구현예에서, 각각의 샘플 내의 IRF8 mRNA 수준이 측정되어 세포내 모든 다른 mRNA의 mRNA 수준과 비교됨으로써 IRF8 mRNA 수준의 순위를 수득한다. IRF8 mRNA 순위를 기반으로 한 컷오프는 이후 IRF8 슈퍼 인핸서 강도 서수 컷오프를 계측하기 위해 이전에 기재된 바와 동일한 방식으로 RARA 효능제에 대한 반응성에 대해 시험된 집단 내 샘플을 기반으로 계측된다. 계측된 IRF8 mRNA 서수 컷오프는 이후 직접적으로 또는 유병률 컷오프를 계측하기 위해 사용되며, 이것 중 하나는 이후 RARA 효능제에 대한 잠재적인 반응성에 대해 추가의 샘플을 계층화하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, IRF8 mRNA 수준에 대한 컷오프가, 상기 기술된 IRF8 인핸서 강도 또는 IRF8 인핸서 강도 서수를 기반으로 하여 확립된 유병률 컷오프를 사용하여 계측된다. 이들 구현예의 일부 양태에서, 집단은 mRNA 수준에 대해 계측되고 소정의 유병률 컷오프는 mRNA 컷오프 수준를 계측하기 위해 이러한 집단에 적용된다. 이러한 구현예의 일부 양태에서, 집단 내 IRF8 mRNA 수준의 순위-배치 표준 곡선이 생성되고, 그리고 소정의 유병률 컷오프가 IRF8 mRNA 컷오프 수준을 계측하기 위하여 상기 표준 곡선에 적용된다.
시험 세포 또는 샘플이 집단에 대해 비교되는 구현예의 일부 양태에서, 집단에 대해 수득된 컷오프 mRNA 수준 값(들)은 유병률 순위로 전환되고 mRNA 수준 컷오프는 컷오프 값 이상, 예를 들어, 유병률 컷오프를 갖는 집단의 퍼센트로 표현된다.
이론에 의한 구속됨 없이, 출원인은 집단 내 유병률 컷오프 및 시험 샘플의 유병률 순위가 IRF8 mRNA 수준을 측정하는데 사용된 방법론과는 무관하게 유사할 것이라고 믿는다.
이들 구현예의 일부 양태에서, 대상체는 이의 IRF8 mRNA 수준이 다음의 집단 내 유병률 순위에 상응하는 경우 RARA 효능제 반응군으로서 확인된다: 약 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71 %, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 43%, 42%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 또는 20% (집단 내 IRF8 mRNA 수준에 의해 계측됨). 일부 구현예에서, 컷오프 값은 IRF8 인핸서 강도에 대해 확립된 유병률 컷오프를 기반으로 하여 확립된다. 일부 구현예에서, 컷오프 값은 IRF8 인핸서 강도 서수에 대해 확립된 유병률 컷오프를 기반으로 하여 확립된다. 일부 구현예에서, 컷오프 값은 IRF8 mRNA 수준을 기반으로 확립된다. 일부 구현예에서, AML, 비-APL AML, 또는 MDS 환자에 대한 컷오프 값은, IRF8 인핸서 강도 서수에 대하여 계측된 유병률 값을 기준으로 하여 확립되며, 그리고 상기 유병률 값은 IRF8 mRNA 수준에 대한 컷오프 값을 계측하기 위하여 사용된다. 일부 구현예에서, AML, 비-APL AML 또는 MDS 환자에 대한 컷오프 값은 약 20 내지 45% (예를 들어, 약 20 내지 25%, 25 내지 30%, 25 내지 35%, 25 내지 40%, 20 내지 30%, 20 내지 35%, 20 내지 40%, 20 내지 45%, 21 내지 34%, 22 내지 34%, 25 내지 34%, 21 내지 25%, 22 내지 25%, 23 내지 25%, 24 내지 25%, 또는 21 내지 22%)의 유병률 컷오프를 사용하여 계측된다. 일부 구현예에서, AML, 비-APL AML 또는 MDS 환자에 대한 컷오프 값은 34%의 유병률 값을 사용하여 계측된다. 일부 구현예에서, AML, 비-APL AML 또는 MDS 환자에 대한 컷오프 값은 25%의 유병률 값을 사용하여 계측된다. 일부 구현예에서, AML, 비-APL AML 또는 MDS 환자에 대한 컷오프 값은 22%의 유병률 값을 사용하여 계측된다. 일부 구현예에서, AML, 비-APL AML 또는 MDS 환자에 대한 컷오프 값은 21%의 유병률 값을 사용하여 계측된다.
추가의 기타 구현예에서, 집단은 반응군, 부분적 반응군 및 비-반응군인 3개 군으로 분할될 수 있으며, 그리고 2개 컷오프 값 또는 유병률 컷오프가 설정된다. 부분적인 반응군 그룹은 반응군 및 비-반응군 뿐만 아니라, RARA 효능제에 대한 이의 반응이 반응군 그룹과 같이 높은 수준이 아닌 집단 구성원을 포함할 수 있다. 이들 구현예에서, 2개의 컷오프 값 또는 유병률 컷오프가 결정된다. 이러한 유형의 계층화는 집단 내에서 최고 IRF8 mRNA 비반응군이 최저 RARA mRNA 반응군보다 더 큰 IRF8 mRNA 수준을 갖는 경우 특히 유용할 수 있다. 이러한 시나리오에서, 반응군과 부분적인 반응군 사이의 컷오프 수준 또는 유병률 컷오프는 최고 IRF8 mRNA 비-반응군의 IRF8 mRNA 수준과 동일하거나 최대 5% 초과로 설정되며; 부분적인 반응군과 비-반응군 사이의 컷오프 수준 또는 유병률 컷오프는 최저 IRF8 mRNA 반응군의 IRF8 mRNA 수준과 동일하거나 최대 5% 이하에서 설정된다. 부분적인 반응군이 RARA 효능제를 투여받아야 하는지의 여부의 결정은 치료하는 의사의 판단 및/또는 관리 기관의 승인에 의존할 것이다.
세포 또는 생물학적 샘플 내에서 특정 RNA 서열을 정량화하는 방법은 당해 기술에 공지되어 있고 비제한적으로, 예컨대 서비스에 이용된 것과 같은 형광 하이브리드화 및 NanoString Technologies, 어레이 기반 기술(Affymetrix), SYBR® Green (Life Technologies) 또는 TaqMan® 기술 (Life Technologies)을 사용하는 바와 같은 역전사효소 qPCR, RNA 서열분석(예를 들어, RNA-seq), RNAscope® (Advanced Cell Diagnostics)과 함께 이용된 바와 같은 RNA 하이브리드화 및 신호 증폭, 또는 노던 블랏에 의해 제공된 생성물을 포함한다.
이들 구현예의 일부 양태에서, 시험 세포 및 대조군 세포 둘 다에서 또는 집단의 모든 구성원에서 RNA 전사체(mRNA 또는 또 다른 RARA 또는 IRF8 전사체)의 수준은 비교 전에 정규화된다. 정규화는 세포 (예를 들어, GADPH mRNA, 18S RNA) 둘 다에서 원상태로 존재하고 동일한 수준으로 존재하는 또 다른 RNA 전사체에 대해, 또는 슈퍼-인핸서 강도 결정 전에 세포 각각의 샘플내로 "스파이킹된" 외인성 RNA의 고정된 수준에 대해 비교함으로써 IRF8 또는 RARA RNA 전사체의 결정된 수준을 조절하는 것을 포함한다(J Loven et al., Cell, 151(3):476-82 (2012); J Kanno et al., BMC Genomics 7:64 (2006); J Van de Peppel et al., EMBO Rep 4:387-93 (2003)).
암 및 다른 질환
본 개시내용의 방법은 슈퍼 인핸서와 이러한 암에서 역치 수준 이상인 IRF8 또는 IRF8 mRNA 수준의 연관관계를 특징으로 하는 임의의 암을 치료하는데 유용하다. 슈퍼 인핸서-관련된 IRF8 유전자는 기타의 것들보다는 특정 유형의 암에서 보다 만연할 수 있다. 일부 구현예에서, 슈퍼 인핸서-관련된 IRF8 유전자는 비-APL AML에서 및 다른 암 또는 전-암성 상태보다는 MDS에서 보다 만연할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에서 치료될 질환은 암이다. 일부 구현예에서, 치료될 질환은 비-APL AML 및 MDS로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 치료될 질환은 IRF8 유전자를 수반하는 염색체 전위에 의하여 특성화되지 않은 비-APL AML 및 MDS이다.
일부 구현예에서, RARA 효능제 (예컨대, 타미바로텐)로 치료될 대상체는 재발성 또는 난치성 비-APL AML을 앓고 있다. 대상체는 이들이 a) 유도 화학요법의 제1 사이클 후 부분적인 반응을 입증하지 않거나; b) 유도 화학요법의 제2 사이클 후 완전한 반응을 입증하지 않거나; c) 종래의 화학요법 후 재발하거나; 또는 d) 재발이 단일 줄기 세포 이식을 겪는 경우 재발한 또는 난치성 비-APL AML을 갖는 것으로 분류된다.
일부 구현예에서, RARA 효능제 (예컨대, 타미바로텐)로 치료될 대상체는 난치성 MDS를 앓고 있다. 대상체는 이들이 a) 고위험 또는 중간-2 MDS(국제 진단 병기 시스템 ("IPPS")을 사용하여 결정된 것으로서)를 갖는 것으로 분류되고 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘, 데시타빈)를 사용한 적어도 4개 사이클의 유도 요법 후 임의의 혈액성 개선(IWG 2006 기준으로 측정된 것으로서)을 달성하는데 실패하거나, 또는 완전한 또는 부분적인 반응의 임의의 지속기간 후 재발하거나; b) IPSS 중간-1 또는 저-위험 MDS로 분류되고 수혈 의존적이거나 적혈구생성 자극제 (ESA)를 사용한 치료에 실패한 경우 난치성 MDS를 갖는 것으로 분류된다.
다른 구현예에서, RARA 효능제 (예를 들어, 타미바로텐)로 치료될 상기 대상체는 고령의 부적합한 대상체이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "고령에 부적합한"은 상기 대상체가 적어도 60세이고 표준 유도 요법에 대한 후보가 아닌 것으로 의사에 의해 계측된 인간이다.
RARA 효능제
슈퍼 인핸서 수준을 가진 것으로 확인된 환자를 치료하기 위한 RARA 효능제의 선택은 당해 분야에 공지된 임의의 RARA 효능제로부터 제조될 수 있다. RARA에 대해 특이적인 본 발명의 방법에 이용되고 RaR의 다른 형태, 예를 들어, RaR-β 및 RaR-γ에 대해 상당히 적은(적어도 10배 적은, 적어도 100배 적은, 적어도 1,000배 적은, 적어도 10,000배 적은, 적어도 100,000배 적은) 효능적 활성을 가진 RARA 효능제가 바람직하다.
일부 구현예에서, RARA 효능제는 하기 미국 특허 중 임의의 하나에 개시된 화합물 또는 이들 내에 제시된 속(genera)에 속하는 임의의 화합물로부터 선택되며, 이들 각각은 참고로 편입된다: US 4,703,110, US 5,081,271, US 5,089,509, US 5,455,265, US 5,759,785, US 5,856,490, US 5,965,606, US 6,063,797, US 6,071,924, US 6,075,032, US 6,187,950, US 6,355,669, US 6,358,995, 및 US 6,387,950.
일부 구현예에서, RARA 효능제는 표 1에 제시된 임의의 하기 공지된 RARA 효능제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 전술한 용매화물 또는 수화물로부터 선택된다:
[표 1] 본 발명에 유용한 예시적인 RARA 효능제.
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일부 구현예에서, RARA 효능제는 타미바로텐이다.
치료 요법
마커 및 특성화
일부 구현예에서, 본 개시내용에 의하여 제공된 기술은, 환자가 앓고 있는 암의 유형의 평가를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 비-APL 급성 골수성 백혈병(AML)을 앓고 있다. 일부 구현예에서, 환자는 골수이형성 증후군(MDS)을 앓고 있다.
치료 요법 마커 및 특성규명 일반적으로, 본 개시내용은 이에 대해 대상체의 하나 이상의 마커 또는 특징이 분석되고/되거나 평가된 기술을 제공하며; 일부 구현예에서, 치료 결정은 이러한 분석 및/또는 평가를 기반으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 마커는 이의 존재, 형태, 수준 및/또는 활성이 관련된 특징(예를 들면, 암의 유형 또는 단계)을 지닌 관련된 집단과 관련된 제제 또는 독립체이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 RARA 효능제로의 비- APL AML의 치료와 관련된 하나 이상의 바이오마커의 확인, 분류 및/또는 특성규명을 고려한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 RARA 효능제로의 MDS의 치료와 관련된 하나 이상의 바이오마커의 확인, 분류 및/또는 특성규명을 고려한다.
일부 구현예에서, 특정 유형의 암을 앓고 있는 환자의 분류는 암의 단계의 평가를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 암의 특정 유형을 앓고 있는 환자의 분류는 환자 내 질환 부하 (예컨대, 체내 암세포의 수, 종양의 크기 및/또는 암의 양)의 평가를 포함할 수 있다.
일반적으로, 암의 유형은 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 인정될 바와 같이, 임의의 적절한 검정을 통해 본 발명에 따라 평가될 수 있다. 암 유형에 대한 다양한 검정은 조직학적 평가(예를 들어, 생검 샘플의), 이미지형성 (예를 들어, 자기 공명 영상(MRI), 양전자 방출 단층촬영(PET), 전산화단층촬영법(CT) 초음파, 내시경술, x-선 (예를 들어, 유방조영상, 바륨 스왈로우(barium swallow), 파노렉스(panorex), 유관조영술, 또는 골 스캔을 이용하는 것들을 포함하여, 당해 기술에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, RARA 효능제 요법은 비-APL AML 또는 MDS의 단계 또는 형태의 지표인 하나 이상의 바이오마커의 수준을 평가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, RARA 효능제 요법은 IRF8 mRNA 수준 및, 선택적으로, RARA mRNA 수준을 평가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, RARA 효능제 요법은 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서의 존재 및, 선택적으로, RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서의 강도 또는 순위를 포함한다. 일부 구현예에서, RARA 효능제 요법은 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서의 존재 또는 IRF8 mRNA 수준, 및 선택적으로, RARA mRNA 수준, RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서의 강도 또는 순위를 평가하는 것을 포함한다.
이론에 의한 구속됨 없이, 출원인은 CD34 또는 CD117 마커 중 단 하나를 갖는 PBMC의 서브세트가 IRF8 mRNA 또는 슈퍼-인핸서 수준을 계측하는데 효과적으로 사용될 수 있다고 믿는다. 또한, 특정 IRF8 mRNA 분석 기술, 예컨대 RNAScope®는 특정 올리고뉴클레오티드 하이브리드화/증폭 절차의 사용을 기반으로 원하는 세포로부터 분석적 농축 mRNA를 제공하므로 분석 전에 PBMC 샘플을 농축시킬 필요가 없다.
환자 집단
일부 구현예에서, RARA 효능제 요법은 본 개시내용에 따라 하나 이상의 환자 (예를 들어, 환자 집단)에게 본 명세서에서 기재된 바와 같이 투여된다.
일부 구현예에서, 환자 집단은 암을 앓는 하나 이상 대상체를 포함한다 (예컨대, 대상체를 포함하거나 상기로 이루어진다). 일부 구현예에서, 환자 집단은 비-APL AML을 앓고 있는 1명 이상의 대상체를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자 집단은 MDS를 앓고 있는 1명 이상의 대상체를 포함한다.
일부 구현예에서, 환자 집단은 암 (예컨대, 비-APL AML 또는 MDS)의 치료를 위하여 이전 요법을 수용한 하나 이상의 대상체를 포함한다 (예컨대, 대상체를 포함하거나 상기로 이루어진다). 일부 구현예에서, 환자 집단은 암 (예컨대, 비-APL AML 또는 MDS)의 치료를 위하여 이전 요법을 수용하지 않은 하나 이상의 대상체를 포함한다 (예컨대, 대상체를 포함하거나 상기로 이루어진다). 일부 구현예에서, 환자 집단은 비-APL AML 또는 MDS의 치료를 위해 이전의 요법을 수용하지 않은 환자를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 이전의 요법을 받은 환자는 화학요법, 면역요법, 방사선 요법, 일시적 처방 보호, 수술, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 이전의 요법을 수용하였을 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 이식을 수용하였다. 일부 구현예에서, 환자는 표준 세포독성 화학요법을 수용하였다. 일부 구현예에서, 표준 세포독성 화학요법은 사이타라빈 및/또는 안트라사이클린을 포함한다. 일부 구현예에서, 표준 세포독성 화학요법은 추가의 화학요법 및/또는 조혈 줄기 세포 이식(HSTC)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 메틸화억제제를 수용하였다. 일부 구현예에서, 환자는 레날리도미드를 수용하였다.
일부 구현예에서, 환자 집단은, 예를 들어 RARA 효능제 요법 (예컨대, 타미바로텐) 조성물은 기타 요법 (예컨대 화학치료제)와 병용하여 투여되도록, 기타 요법을 수용하였고/하였거나 수용하고 있는 하나 이상의 대상체를 포함한다 (예컨대, 대상체를 포함하거나 상기로 이루어진다). 일부 구현예에서, 이러한 다른 요법은 암 (예를 들어, 본 명세서에서 기재된 바와 같음), 통증, 메스꺼움, 변비에 대한 요법, 암 요법과 관련된 하나 이상의 부작용(예를 들어, 가려움증, 탈모, 불면 등) 등의 치료, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다. 본 발명은 비-APL AML 또는 MDS을 가진 것으로 확인된 환자를 치료적 유효량의 RARA 효능제 요법(예를 들어, 타미바로텐) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 치료하는 것을 포함하는, 비-APL AML 또는 MDS를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 예방 또는 개시를 지연시키는 것이 필요한 것으로 식별된 환자에게 비-APL AML 또는 MDS 예방적 유효량의 RARA 효능제 요법 (예를 들어, 타미바로텐) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, 비-APL AML 또는 MDS의 개시를 예방하거나 지연시키는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 치료 요법으로 사전 처리된 비-APL AML 또는 MDS에 대하여 환자를 치료하는 방법이 제공되며, 이는 RARA 효능제 요법 (예컨대, 타미바로텐) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 치료적 유효량을 상기 환자에게 투여함에 의한 화학요법을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 표준 요법이 존재하지 않는 비-APL AML 또는 MDS에 대한 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 표준 요법에 적합하지 않은 환자를 치료하기 위한 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 환자는 또한, MDS와 관련된 질환, 예컨대 골수 부전, 말초 혈액 혈구감소증 및 빈혈, 감염 또는 출혈의 관련 합병증을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 AML로 진행하는 MDS를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 환자 또는 환자 집단은 임신한 환자가 아닐 수 있다 (예를 들어, 상기가 배제될 수 있다). 일부 구현예에서, 환자 또는 환자 집단은, RARA 효능제 요법의 투여 이전에, 그리고/또는 상기 동안에 임신, 출산 및/또는 수유의 하나 이상의 징후에 대하여 모니터링될 수 있다. 일부 구현예에서, RARA 효능제 요법은 임신, 출산 및/또는 젖분비의 하나 이상의 징후를 나타내는 것으로 결정된 환자의 경우 감소되거나, 연기되거나, 종결될 수 있다.
일부 구현예에서, 환자 또는 환자 집단은 타미바로텐의 성분에 대한 과민감성의 사전 이력을 갖는 환자가 아닐 수 있다(예를 들어, 상기가 배제될 수 있다). 일부 구현예에서, 환자 또는 환자 집단은 비타민 A 제제를 수용하는 환자가 아닐 수 있다 (예를 들어, 상기가 배제될 수 있다). 일부 구현예에서, 환자 또는 환자 집단은 비타민과다증 A를 갖는 환자가 아닐 수 있다(예를 들어, 상기가 배제될 수 있다).
일부 구현예에서, 환자 또는 환자 집단은 고령 환자가 아닐 수 있다(예를 들어, 상기가 배제될 수 있다). 일부 구현예에서, 환자 또는 환자 집단은 1명 이상의 고령 환자일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 고령의 환자는 1명 이상의 젊은 환자와 비교하여 잠재적인 유해 사례(예를 들어, 저수준의 혈청 알부민 및/또는 혈장 내의 유리 약물의 상승된 농도 등)를 검출하기 위해 더 자주 모니터링될 수 있다. 일부 구현예에서, RARA 효능제 요법은 그와 같은 유해 사례의 하나 이상의 징후를 나타내는 것으로 결정된 고령의 환자에 대해 감소되고/되거나, 지연되고/되거나 종결될 수 있다.
일부 구현예에서, 환자 또는 환자 집단은 소아 환자가 아닐 수 있다(예를 들어, 상기가 배제될 수 있다). 일부 구현예에서, 환자 또는 환자 집단은 1명 이상의 소아 환자일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 소아 환자는 1명 이상의 고령의 환자와 비교하여 잠재적 부정적 사건 (예를 들어, 증가된 두개내압을 포함)을 검출하기 위하여 더욱 빈번하게 모니터링될 수 있다. 일부 구현예에서, RARA 효능제 요법은 그와 같은 유해 사례의 하나 이상의 징후를 나타내는 것으로 결정된 소아 환자에 대해 감소되고/되거나, 지연되고/되거나 종결될 수 있다.
일부 구현예에서, 환자가 하나 이상의 역반응 예컨대, 예를 들어 두통, 발진, 건조 피부, 습진, 박탈성 피부염, 뼈 통증, 관절 통증, 열병, 증가된 백혈구 수, 감소된 헤모글로빈, 증가된 AST, 증가된 ALT, 증가된 LDH, 증가된 ALP, 증가된 TG, 증가된 TC, 폴리시티스(follicitis), 모낭염, 증가된 CRP, 및 이들의 조합으로 진행되는 경우 및 진행되는 때에 본 개시내용에 따른 RARA 효능제 요법은 특정 환자에 대하여 감소되거나, 지연되거나 종결된다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 구현예에서, 환자가 하나 이상의 역반응 예컨대, 예를 들어 혈전증 (예를 들어, 뇌 경색, 폐 경색, 동맥 혈전증, 정맥 혈전증 등), 혈관염, 섬망, 독성 표피 괴사(Lyell 증후군), 홍반 다형성, 증가된 두개내 압력, 및 이들의 조합으로 진행되는 경우 및 진행되는 때에 특정 환자에 대하여 RARA 효능제 요법은 본 개시내용에 따라 감소되거나, 지연되거나 종결된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비-APL AML 또는 MDS를 치료하거나, 예방하거나 이의 개시를 지연시키는데 유용한 약제의 제조를 위한 화합물(예를 들어, 타미바로텐) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 환자는 암(예를 들어, 비-APL AML 또는 MDS)을 앓고 있다. 일부 구현예에서, 환자는 기타 요법 (예컨대, 화학요법)에 저항성인 암(예를 들어, 비-APL AML 또는 MDS)을 앓고 있다. 일부 구현예에서, 암은 바이오마커를 갖는 것으로 계측되며, 여기서 상기 IRF8 바이오마커는 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서 또는 상승된 IRF8 mRNA 수준 중 하나 이상의 발현이거나 상기를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 암은 보다 상승된 RARA mRNA 수준 또는 RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서를 발현하는 것으로 계측된다. 일부 구현예에서, 상기 암은 보다 상승된 RARA mRNA 수준 또는 RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서를 발현하지 않는 것으로 계측된다.
투여 형태 및 투여 요법
일반적으로, 본 발명에 따라 사용하기 위한 각각의 활성제(예를 들어, 타미바로텐)는 양호한 의료 실시와 일관되고 관련된 제제(들) 및 대상체에 적절한 약제학적 조성물 및 투여 요법을 사용하여 치료학적 유효량으로 제형화되고, 투여(dose)되며, 그리고 투여(administered)된다. 원칙적으로, 치료 조성물은 비제한적으로, 경구, 점막, 흡입에 의해, 국소, 구강, 비강, 직장, 또는 비경구 (예를 들어, 정맥내, 주입, 종양내, 결절내, 피하, 복강내, 근육내, 진피내, 경피, 또는 다른 종류의 투여)를 포함하는, 당해 분야에 공지된 임의의 적절한 방법으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, RARA 효능제 (예를 들어, 타미바로텐)는 경구로 투여될 것이다.
일부 구현예에서, 특정 활성제에 대한 투여 요법은, 예를 들어 요법을 수용한 대상체 내 하나 이상의 관심 조직 또는 유체 중 노출의 특정 목적 약동학 프로파일 또는 기타 패턴을 달성하도록, 간헐적 또는 연속 투여가 수반될 수 있다.
일부 구현예에서, 조합하여 투여된 상이한 제제는 상이한 경로의 전달을 통해 및/또는 상이한 스케줄에 따라 투여될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 구현예에서, 1회 이상의 용량의 제1 활성제는 하나 이상의 다른 활성제와 함께 실질적으로 동시에, 및 일부 구현예에서 일반적인 경로를 통해 및/또는 이와 함께 단일 조성물의 일부로서 투여된다.
제공된 치료 요법에 대한 경로 및/또는 투여 계획을 최적화하는 경우 고려될 인자는, 예를 들어, 치료될 특정한 징후, 대상체의 임상 조건(예를 들어, 연령, 전반적인 건강, 받은 사전 요법 및/또는 이에 대한 반응 등), 제제의 전달 부위, 제제의 특성, 제제의 투여 방식 및/또는 경로, 병용 요법의 존재 또는 부재, 및 개업의에게 공지된 다른 인자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 암의 치료시, 치료될 징후의 관련된 특징은 다른 것들 중에서, 암 유형, 단계, 위치 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 특정 약제학적 조성물 및/또는 이용된 투여 요법의 하나 이상의 특징은 예를 들어 원하는 치료 효과 또는 반응을 최적화시키기 위해, 경시적으로(예를 들어, 임의의 개별 용량 내의 활성제의 양의 증가 또는 감소, 용량 사이의 시간 간격의 증가 또는 감소 등) 변형시킬 수 있다.
일반적으로, 본 발명에 따른 활성제의 유형, 양, 및 빈도는 관련된 제제(들)이 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여되는 경우 적용하는 안전성 및 효능 요건에 의해 지배된다. 일반적으로, 투여의 이러한 특징은 요법의 부재하에 관찰된 것과 비교하여 특정, 및 전형적으로 검출가능한, 치료 반응을 제공하기 위해 선택된다. 일부 구현예에서, RARA 효능제 (예를 들어, 타미바로텐)는 연속적으로 투여될 것이다.
본 발명의 문맥에서, 예시적인 바람직한 치료 반응은 비제한적으로, 억제 및/또는 감소된 종양 성장, 종양 크기, 전이, 종양과 관련된 증상 및 부작용 중 하나 이상 뿐만 아니라 종양 세포의 증가된 세포자멸사, 하나 이상의 세포 마커 또는 순환하는 마커 및 기타 동종의 것의 치료적으로 관련된 감소 또는 증가를 포함할 수 있다. 이러한 기준은 임의의 다양한 면역학적, 세포학적, 및 문헌에 개시된 다른 방법에 의해 용이하게 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 종양의 특정 유형, 특정 종양, 특정 환자 집단(예를 들어, 유전자 마커를 수반함) 및/또는 특정 환자 여부에 대해 유도성 마커의 타이밍 및/또는 역치 발현 수준을 기반으로, 투여 요법을 조정하고, 특히 순차적인 투여 요법을 설계하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 그와 같은 구현예에서, 치료 투여 요법은 요법 이전에 그리고/또는 동안에 하나 이상의 유도성 마커의 발현을 평가하는 검출 방법의 측면에서 조합되거나 조정될 수 있다.
일부 구현예에서, RARA 효능제 (예컨대, 타미바로텐) 요법 요법은, 하기의 적어도 1회 용량을 포함한다 (또는 정확히 1회 용량를 포함하거나 상기로 이루어진다): 약 1 mg/m2, 2 mg/m2, 3 mg/m2, 4 mg/m2, 5 mg/m2, 6 mg/m2, 7 mg/m2, 8 mg/m2, 9 mg/m2, 10 mg/m2, 11 mg/m2, 12 mg/m2, 13 mg/m2, 14 mg/m2, 15 mg/m2, 16 mg/m2, 또는 타미바로텐의 상기 값 중 임의의 2개 사이의 용량. 일부 구현예에서, 타미바로텐 요법 요법은 6 mg/m2 의 용량을 포함한다. 일부 구현예에서, 타미바로텐 요법 요법은 4 mg/m2 의 용량을 포함한다. 일부 구현예에서, 타미바로텐 요법 요법은 2 mg/m2 의 용량을 포함한다. 일부 구현예에서, 타미바로텐 요법 요법은 1 mg/m2 의 용량을 포함한다.
일부 구현예에서, RARA 효능제 (예컨대, 타미바로텐) 요법 요법은 타미바로텐 조성물의 복수의 용량을 포함한다. 상기 일부 구현예에서, 타미바로텐 요법 요법은 예를 들어 2, 5, 10, 20, 30, 60, 90, 180, 365 용량 또는 이들 값의 임의의 2개 사이의 복수의 용량을 포함하고/하거나 반복된 패턴의 용량(예를 들어, 1일 2회 용량의 적어도 하나의 사이클, 여기서 상기 사이클은 임의로 교호적인 투여 기간 내에서, 또는 상이한 사이클을 분리하여, 임의로 투여 없이 반복될 수 있음)을 포함한다. 일부 구현예에서, 타미바로텐 요법 요법은 1일 2회 투여된다. 일부 구현예에서, 타미바로텐 요법 요법은 1일 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 타미바로텐 요법 요법은, 1일 2회의 경우 투여로서 분할된, 6 mg/m2 의 총 용량을 포함한다.
일부 구현예에서, RARA 효능제(예를 들어, 타미바로텐) 요법 요법은 투여 전, 동안 또는 후에, 일부 양의 음식을 소비하거나 소비하지 않은 대상체 또는 환자의 집단에게 투여될 수 있다. 음식 섭취와 관련하여 용어들 "투여전" 및 "투여 후"는 투여 이전 또는 이후로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 42, 또는 72 시간, 또는 더 긴 기간을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "음식 섭취와 관련하여 …를 투여하는"은 상기 대상체 또는 환자의 집단이 투여 전에 음식을 소비함(예를 들어, 공급 상태)를 의미한다. 일부 구현예에서, 용어 "음식 섭취와 관련하여 …를 투여하는"은 상기 대상체 또는 환자의 집단이 투여 후에 음식을 소비함을 의미한다. 일부 구현예에서, 용어 "음식 섭취와 관련하여 …를 투여하는"은 상기 대상체 또는 환자의 집단이 투여 동안에 음식을 소비함을 의미한다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 용어 "음식 섭취와 관련하여 …를 투여하는"은 상기 대상체 또는 환자의 집단이 투여 동안 단식 상태 중임을 의미한다.
일부 구현예에서, 음식 섭취는 고지방 식품 또는 고지방 다이어트를 포함한다. 일부 구현예에서, RARA 효능제 (예컨대, 타미바로텐) 요법 요법은 단식 상태의 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, RARA 효능제 (예컨대, 타미바로텐) 요법 요법은 배식 상태의 대상체에 투여된다.
제형
본원에서 사용된 바와 같이, 약제학적 조성물은 화합물, 예컨대 타미바로텐과, 다른 화학 성분, 예컨대, 담체, 안정화제, 희석제, 분산제, 현탁화제, 증점제 및/또는 부형제의 혼합물을 지칭한다. 약제학적 조성물은 유기체에 대한 화합물의 투여를 용이하게 한다. 화합물을 함유하는 약제학적 조성물은 치료적 유효량으로 비제한적으로 정맥내, 경구, 직장, 에어로졸, 비경구, 안과, 폐, 경피, 질, 귀, 비강, 및 국소 투여를 포함하는 당해 분야에 공지된 임의의 종래의 형태 및 경로에 의해 투여된다.
화합물을 전신 방식 이외에 국부로, 예를 들어, 데포(depot) 또는 지속 방출 제형으로 장기에 화합물을 직접적으로 주사함을 통해 투여할 수 있다. 게다가, 표적화된 약물 전달 시스템, 예를 들어, 장기-특정 항체로 코팅된 리포좀 내에 화합물을 함유하는 약제학적 조성물을 투여할 수 있다. 리포좀은 장기에 의해 표적화되거나 선택적으로 취해질 것이다. 또한, 화합물을 함유하는 약제학적 조성물은 빠른 방출 제형의 형태, 연장 방출 제형의 형태, 또는 중간 방출 제형의 형태로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 연장 방출 제형은 화합물을 1 시간에 걸쳐, 2 시간에 걸쳐, 3 시간에 걸쳐, 4 시간에 걸쳐, 6 시간에 걸쳐, 12 시간에 걸쳐, 24 시간 이상에 걸쳐 방출한다. 일부 구현예에서, 연장 방출 제형은 화합물을 1 시간에 걸쳐, 2 시간에 걸쳐, 3 시간에 걸쳐, 4 시간에 걸쳐, 6 시간에 걸쳐, 12 시간에 걸쳐, 24 시간 이상에 걸쳐 일정한 비율로 방출된다.
경구 투여의 경우, 화합물은 활성 화합물을 당해 분야에서 잘 알려진 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 배합시킴으로써 쉽게 제형화할 수 있다. 이러한 담체는 본 명세서에서 기재된 화합물이 치료될 대상체에 의한 경구 섭취를 위해 정제, 분말, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 엘릭시르, 슬러리, 현탁액 및 기타 동종의 것으로 제형화되도록 한다. 일반적으로, 부형제 예컨대 충전제, 붕해제, 활택제, 계면활성제, 재결정화 억제제, 윤활제, 안료, 결합제, 풍미제 등을 조성물의 특성에 영향을 미치지 않고 전형적인 양으로 관례적 목적을 위해 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 부형제는 락토스 수화물, 옥수수 전분, 하이드록시프로필 셀룰로스 및/또는 스테아르산마그네슘 중 하나 이상의 것이다. 일부 구현예에서, 타미바로텐은 락토스 수화물, 옥수수 전분, 하이드록시프로필 셀룰로스 및/또는 스테아르산마그네슘 중 하나 이상으로 제형화될 수 있다.
타미바로텐의 허용가능한 제형의 식별은 예를 들어 US 20100048708에 기술된 바와 같이 당해 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 달성될 수 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 편입된다.
병용 요법
당해 분야의 숙련가는, 본 개시내용의 판독시, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, RARA 효능제 (예를 들어, 타미바로텐)가 특정 구현예에서 예를 들어, 화학치료제, 다른 면역조절 제제, 방사선 요법, 고주파 초음파 요법, 수술, 암 치료용으로 FDA 승인된 요법 등의 투여를 포함하는 다른 항암 요법과 조합될 수 있음을 용이하게 인정할 것이다.
일부 구현예에서, RARA 효능제는 하나 이상의 기타 치료적 제제 또는 양식과 병용하여 이용된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 다른 치료제 또는 양식은 또한 항암제 또는 양식이며; 일부 구현예에서 상기 조합은 암을 치료하는데 있어서 상승작용 효과를 나타낸다.
암을 치료하는데 있어서 치료 효능을 나타내는 공지된 화합물 또는 치료는 예를 들어, 하나 이상의 알킬화제, 항-대사물, 항-미세소관 제제, 토포이소머라제 억제제, 세포독성 항생제, 혈관신생 억제제, 면역조절물질, 백신, 세포 기반 요법, 장기 이식, 방사선 요법, 수술 등을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, RARA 효능제(및/또는 이것이 조합된 다른 요법)는, 특정 암 환자가 앓고 있거나, 또는 특정 암 환자가 취약한, 관련된 암, 또는 다른 질환, 장애 또는 병태와 관련된 것으로 공지된 하나 이상의 증상을 완화시키는 경우, 하나 이상의 일시적 처방(예를 들어, 통증 경감, 항-메스꺼움, 항구토 등)과 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, 조합에 사용된 제제는 이들이 개별 사용을 위해 승인된 투여 요법에 따라 투여된다. 그러나, 일부 구현예에서, RARA 효능제 (예를 들어, 타미바로텐)와의 조합은 또 다른 제제가 RARA 효능제 (예를 들어, 타미바로텐)의 부재하에서 투여된 경우 이용된 것과 비교하여 하나 이상의, 보다 적은 및/또는 덜 빈번한 용량 및/또는 감소된 수의 사이클을 포함하는 투여 요법에 따라 상기 제제가 투여되도록 한다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 구현예에서, 적절한 투여 요법은 제제가 RARA 효능제 (예를 들어, 타미바로텐)의 부재하에 투여되는 경우 이용된 것과 비교하여 더 높은 및/또는 보다 빈번한 용량 및/또는 증가된 수의 사이클을 포함한다.
일부 구현예에서, 병용하여 투여되는 제제의 1회 이상의 용량은 동시에 투여되며; 일부 구현예에서, 제제는 상동한 조성으로 투여될 수 있다. 보다 통상적으로, 그러나, 제제는 상이한 조성물로 및/또는 상이한 횟수로 투여된다. 일부 구현예에서, 타미바로텐은 다른 치료제 (예를 들어, 화학요법)와 함께 순차적으로 및/또는 동시에 투여된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 병용 요법은, 대상체가 역치 값 이상의 RARA mRNA 수준을 가질 경우에만 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 병용 요법은, 대상체가 역치 값 이상의 IRF8 mRNA 수준을 가질 경우에만 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 병용 요법은 역치 값 이상의 RARA mRNA 수준 및 역치 값 이상의 IRF8 mRNA 수준 둘 모두를 갖는 대상체에게만 투여된다. 이들 구현예의 임의의 것의 일부 양태에서, 상기 대상체는 비-APL AML을 앓고 있다.
일부 구현예에서, RARA 효능제(예를 들어 타미바로텐)와 조합될 치료제는 DNA 메틸전달효소 억제제, DNA 합성효소 억제제, 토포이소머라제 억제제, FLT3 억제제, 폴레이트 억제제, BRD4 억제제, Zn 핑거 전사 인자 억제제, GCR 억제제, CDK7 억제제, HDAC 억제제, JMJD3/JARID1B 억제제, 또는 EZH2 억제제로부터 선택된다. 다른 구체적인 양태에서, 상기 제2 제제는 LSD1 억제제, 프로테아솜 억제제, DNA 손상 치유 억제제, PARP 억제제, mTOR 억제제, DOT1L 억제제, 튜불린 억제제, PLK 억제제, 또는 오로라(Aurora) 키나제 억제제로부터 선택된다.
일부 구현예에서, RARA 효능제 (예컨대, 타미바로텐)은 데시타빈, 아자시티딘, ara-C, 다우노루비신, 이다루비신, 삼산화비소 및/또는 flt3 억제제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, RARA 효능제(예를 들어, 타미바로텐)는 IDH 억제제, BRD4 억제제(예를 들어, JQ1), HDAC 억제제(예를 들어, SAHA 및 MC1568), HMT 억제제(예를 들어, EPZ6438, UNC0638, SGC707, EPZ5676, UNC037 및 PFI-2) 및/또는 KDM 억제제(예를 들어, GSKJ4, RN-1 및 GSK-LSD1)와 함께 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 AML을 앓고 있으며 타미바로텐은 아자시티딘, 삼산화 비소, 미도스타우린(고 FLT3 mRNA 수준을 특징으로 하는 AML 대상체에서만), 사이타라빈, 다우노루비신, 메토트렉세이트, 이다루비신, 소라페닙 (고 FLT3 mRNA 수준을 특징으로 하는 AML 대상체에서만), 데시타빈, 퀴자르티닙 (고 FLT3 mRNA 수준을 특징으로 하는 AML 대상체에서만), JQ1(BRD4 억제제), ATO, 프레드니손(고 GCR mRNA 수준을 특징으로 하는 AML 대상체에서만), SAHA, 및 GSKJ4(고 JMJD3/JARID1B mRNA 수준을 특징으로 하는 AML 대상체에서만)로부터 선택된 제2 제제와의 조합으로 투여된다.
키트
키트 하나 이상의 IRF8 바이오마커를 검출하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하는 키트는 키트 내에 제공될 수 있다. 일부 경우에서, 키트는 역치 수준 이상의 강도, 또는 순위, 또는 참조치 (예컨대, 역치 수준) 이상의 IRF8 mRNA 수준을 갖는, IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서를 갖는 것으로 계측되고, 그리고 암을 앓는 대상체 내 RARA 효능제 (예컨대, 타미바로텐)를 사용하는 설명서를 갖는 서면화된 삽입물 또는 표지를 포함하는, 본 발명의 포장된 약제학적 조성물을 포함한다. 위에서 상세히 기재한 바와 같이, 역치 수준은 동일한 질환을 앓고 있는 것으로 진단된 대상체 또는 세포주 또는 이에 대해 약제학적 조성물이 치료를 위해 처방된 바와 동일한 질환의 제노그래프 모델로부터의 샘플의 집단에서 계측된다. 설명서는 RARA 효능제를 포함하는 용기에 부착될 수 있거나 달리 부착될 수 있다. 대안적으로, 설명서 및 RARA 효능제를 포함하는 용기는 서로로부터 별개일 것이지만, 단일 키트, 패키지, 박스, 또는 다른 유형의 용기 내에 함께 존재한다.
키트 내의 설명서는 RARA 효능제의 치료 용도를 승인한 정부 기관에 의해 전형적으로 지시되거나 권고될 것이다. 설명서는 슈퍼 인핸서가 IRF8 유전자와 관련되어 있는지의 여부를 계측하는 특정 방법뿐만 아니라 IRF8 유전자와 관련된 인핸서가 슈퍼 인핸서인지의 여부를 계측하기 위한 정량화 방법, IRF8 mRNA 수준을 계측하기 위한 정량화 방법; 및/또는 포장된 RARA 효능제를 사용한 치료가 권고되고/되거나 치료적으로 효과적인 것으로 추정되는 슈퍼 인핸서 또는 IRF8 mRNA의 역치 수준을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 지시사항은, 조성물이, IRF8 mRNA 수준이, 이의 IRF8 mRNA 수준이 측정된 집단의 적어도 30번째 백분위수 범위에 속한 대상체에 투여되어야 한다는 것을 지시한다. 이러한 구현예의 일부 양태에서, 대상체는, 이의 IRF8 mRNA 수준 유병률 순위가 IRF8 mRNA 수준이 측정된 집단 내 약 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 43%, 42%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 또는 20%일 경우 RARA 효능제 반응군으로 식별된다. 일부 양태에서, 설명서는 조성물을 이의 IRF8 mRNA 수준이 특정 검정에 의해 측정시 대상체에게 투여하도록 지시한다.
설명서는 선택적으로 투여 정보, RARA 효능제를 사용한 치료가 승인된 암의 유형, RARA 효능제에 대한 물리화학 정보; RARA 효능제에 대한 약동학적 정보, 약물-약물 상호작용 정보를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 설명서는 조성물을 AML을 앓고 있는 것으로 진단된 대상체에게 투여하도록 지시한다. 일부 구현예에서, 설명서는 조성물을 비-APL AML을 앓고 있는 것으로 진단된 대상체에게 투여하도록 지시한다. 일부 양태에서, 설명서는 조성물을 MDS를 앓고 있는 것으로 진단된 대상체에게 투여하도록 지시한다. 일부 양태에서, 약제학적 조성물은 타미바로텐을 포함한다.
실시예
본원에 기재된 본 발명이 보다 충분히 이해될 수 있도록 하기 위해, 하기 실시예가 개시된다. 본원에 기재된 합성 및 생물학적 실시예는 본 명세서에서 제공된 화합물, 약제학적 조성물, 및 방법을 설명하기 위해 제공되며 어떤 식으로든 이의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 비-APL AML 세포주에서 IRF8 mRNA 수준은 RARA 효능제에 대한 반응성과 상관관계가 있다
본 발명자들은 타미바로텐에 대한 민감성에 대해 몇 개의 AML 세포주를 전에 시험하였고 민감성이 각각의 RARA 슈퍼 인핸서 강도, RARA 슈퍼 인핸서 강도 서수 및 RARA mRNA 수준과 매우 잘 관련됨을 입증하였다. 이는 아래에 기재된 바와 같이 수행하였다.
실험 일자에, 세포를 Accumax (EMD 밀리포어)를 사용하여 균질화하고, 계수하며, 적절한 성장 배지 내에서 60,000 세포/mL로 조절하였다. Biotek EL406을 사용하여, 50㎕의 세포를 백색 (ATPlite) 또는 흑색 (CyQuant) 384-웰 플레이트 (Thermo)에 분배하였다. 세포를 37℃ 인큐베이터에 넣어서 접착하도록 하였다. 3 시간 후에, 화합물을 야누스 워크스테이션(Janus workstation)에서 20 nl의 384-웰 핀 전달 매니폴드를 사용하여 플레이트에 가하였다. 스톡(stock)을 384-웰 화합물 플레이트 내에서 DMSO 스톡 중 10 포인트 쿼드러플리케이트 용량 반응으로 정렬하였다. 화합물의 첨가 후에, 플레이트를 5일 동안 37℃ 인큐베이터 내에서 항온처리하였다.
세포 생존력을 ATPlite (Perkin Elmer) 또는 CyQuant (Life Technologies)을 사용하여 판독하였다. ATPlite의 경우, 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고 사용 전에 실온에 두었다. ATPlite 시약의 동결건조된 분말을 세포용해 완충액에서 재현탁시키고 증류수로 1:2로 희석시켰다. 25 ㎕의 당해 용액을 Biotek 액체 핸들러를 사용하여 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 발광 신호가 Envision Plate Reader (Perkin Elmer)에서 판독되기 전에 실온에서 15분 동안 항온처리하였다. CyQuant의 경우, 시약을 제조자의 설명서에 따라 PBS(Gibco) 내에서 혼합하였다. 시약을 다중채널 피펫을 사용하여 가하고 플레이트를 Envision Plate Reader (Perkin Elmer) 에서 판독하기 전에 30분 동안 인큐베이터 내에 두었다.
기재된 바와 같이 획득한 데이터를 마이크로소프트 엑셀(Microsoft’s Excel)에 저장 및 그룹화하고 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. EC50 및 Emax를 계산하기 위한 곡선 적합(fit)을 GraphPad Prism 버전 6.0에서 4개의 파라미터 (1과 동일한 것으로 추정되지 않는 힐 슬로프(Hill slope)) 비선형 회귀와 플레이트에 포함된 DMSO 만으로 처리된 웰에 대해 정규화되는 경우 세포의 생존력 퍼센트에 대해 도식화된 화합물 농도의 log 10 전환된 데이터를 사용하여 수행하였다. 모서리 웰들은 배제하였다.
본 발명자들은 Affymetrix GeneChip® PrimeView™ 인간 유전자 발현 어레이를 사용하여, 타미바로텐 민감성 세포주에서 구체적으로 상승될 수 있는 다른 mRNA 및 잠재적인 후보로서 확인된 IRF8 mRNA에 대한 7개의 이들 AML 세포주(타미바로텐에 대해 4개의 민감성 - NOMO-1, OCI-AML3, MV-4-11, 및 Sig-M5; 및 3개의 비민감성 - KGla, OCI-Ml 및 Kasumi-1)을 초기에 시험하였다. 본 발명자들은 사전에 이들 7개 AML 세포주 중 각각에서 IRF8 mRNA 수준, 뿐만 아니라 하기 명시된 RNA-seq 분석을 수행함에 의하여 타미바로텐에 대한 민감성에 대하여 시험된 몇몇 기타 AML 세포주를 정량화하였다. 제1의 7개 세포주에 대한 결과를 도 1에 나타낸다. 흥미롭게도, NOMO-1은 높은 RARA mRNA 수준을 가지지 않았으나, 타미바로텐에 대해 반응성이었다. NOMO-1이 IRF8 mRNA 수준을 상승시켰다는 사실은 이러한 외견상의 비일관성을 명확하게 하는데 도움을 주었으며 타미바로텐에 대한 반응성을 예측하기 위한 IRF8 mRNA 수준의 사용을 추가로 입증하였다.
RNA 제조: 세포 현탁액을 마이크로원심관에 전달하고 1 mL의 PBS로 세정하였다. 세포 펠렛을 200㎕의 TRIzol에 재현탁시켰다. Ambion miRVana miRNA 단리 키트 (AM1561)로부터의 20㎕의 miRNA 균질물 첨가제를 첨가하고, 혼합하며, 얼음 위에서 10분 동안 항온처리하였다. 20㎕의 브로모클로로프로판을 첨가하고, 혼합하며, 실온에서 5분 동안 항온처리하고, 12,000×g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 62㎕의 수성 상을 78㎕의 에탄올에 첨가하고 필터 칼럼에 전달하였다. 단리를 Ambion의 총 RNA 단리 프로토콜에 따라 지속하였다. 샘플을 생체분석기(bioanalyzer) 위에서 품질 관리를 위해 시험한 후, 서열 분석을 위해 Whitehead Sequencing Core (매사츄세츠주 캠브릿지 소재)로 보냈다.
RNA - seq 데이터 처리: 판독물을 HG19 전사체에 rsem vl.2.21 소프트웨어(rsem-calculate-expression; 파라미터 = -p 4 --samtools-sort-mem 3G -ci-memory 3072 --bowtie-chunkmbs 1024 --quiet --output-genome-barn --bowtie2 --bowtie2- path /data/devtools/bowtie2-2.0.5 --strand-specific)을 사용하여 정렬한 후 mRNA 정량화를 동일한 rsem suite(rsem-parse-alignments, rsem-build-read-index, rsem-rum-em)을 사용하여 수행하고 백만부당 전사체(TPM)로 보고하였다. 모든 단백질 암호화 유전자를 이후에 각각의 샘플에 대해 추출하고 이의 스코어를 사분위수(quantile) 정규화하였다.
본 발명자들은 이후에 도 2 및 표 1에 나타낸 바와 같이 타미바로텐에 대한 민감성을 IRF8 mRNA 수준과 비교하였다.
표 1: AML 세포주 IRF8 mRNA 수준 및 타미바로텐 항-증식성 효력
Figure 112018110508794-pct00009
*HL60 은 APL 세포주임.
상기 표로부터 알 수 있는 바와 같이, HL60을 제외한 모든 타미바로텐-반응성 세포주는 검정에서 190 TPM (log2(7.57))를 초과하는 IRF8 mRNA 수준을 가졌지만, 비-반응성 세포주 모두는 16.5 TPM (log2(4.03)) 미만의 IRF8 mRNA 수준을 가졌다. 수반되는 고수준의 IRF8 mRNA (6.73 TPM)의 부재하에서 타미바로텐에 대한 HL60의 반응성은 IRF8 mRNA 수준과 타미바로텐 민감성 사이의 상관관계가 APL의 경우 유지되지 않을 수 있으며 따라서 비-APL AML을 앓고 있는 대상체를 계층화하기에 보다 더 적합할 수 있음을 시사한다. 도 2는 HL60에 대한 데이터 포인트를 제거한다.
IRF8 mRNA 수준은 다수의 상이한 유형의 샘플 - 정상 혈구, AML 세포주, 1차 AML 환자 샘플 및 AML PDX에 대해 계측된다. 수득된 데이터는 순위 순서로 도식화되며 결과는 표 14에 그래프로 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 도 14는 IRF8 mRNA 수준과 질환의 존재 사이의 임의의 상관관계를 나타내지 않으며; IRF8 수준은 이환 세포, 세포주 및 PDX와 비교하여 정상 세포에서 적당히 유사한 방식으로 분포된 것으로 여겨진다.
실시예 2: RARA 효능제 치료에 대한 IRF8 mRNA 역치 값의 결정
AML 세포주 결과는 RNA-Seq 검정에서 15.5 내지 190 TPM [즉, log2(4.03)과 log2(7.57)] 사이의 컷오프 값을 시사한다. 본 발명자들은 AML 환자 샘플의 집단(Stanford University에서 호의적으로 제공함)을 선택하여 IRF mRNA 수준의 분포를 시험하고 컷오프 값을 기반으로 유병률 컷오프를 계측하였다. 본 발명자들은 이러한 집단 AML 세포주에 가한 다음 순위-정렬된 그래프를 생성하였다. 도 3은 조합된 환자 샘플/AML 세포주 집단에서 IRF8 mRNA 수준의 순위-정렬된 분포를 나타낸다. 본 발명자들은 25%의 유병률 컷오프가 대략 log2(7)의 IRF mRNA 값에 상응하였음을 측정하였다.
실시예 3: IRF8 mRNA 및 RARA mRNA 수준의 상관관계
본 발명자들은 다음에 AML 세포주 및 환자 집단에서 IRF8 및 RARA mRNA 수준을 비교하여 상관관계를 측정하였다. 도 4는 타미바로텐에 반응한 일부 세포주가 상대적으로 낮은 RARA mRNA, 그러나 고 수준의 IRF8 mRNA를 가졌음을 나타낸다. 도 5는 환자의 서브세트가 또한 고 IRF8 mRNA 수준, 그러나 상대적으로 낮은 RARA mRNA 수준을 입증하며, 그 반대도 입증함을 나타낸다. 이는 환자에서 IRF8 및 RARA mRNA 둘 모두를 측정하고 RARA 효능제, 예컨대 타미바로텐을 사용한 치료를 위한 환자를 선택하는 것이, mRNA 수준이 역치 값을 초과하는 경우 치료가능한 환자 집단을 최적화시킬 수 있다는 사상을 뒷받침한다.
실시예 4: IRF8과 관련된 슈퍼 인핸서는 RARA 효능제 치료에 대한 반응성과 상관관계가 있다
본 발명자들은 다음에 몇 개의 AML 세포주 및 다음과 같은 환자에서 IRF8 인핸서 강도를 시험하였다.
세포 고정화: 현탁액 내의 세포에 대해, 전형적으로 1/10 용적의 신선한 11% 포름알데하이드 용액을 세포 현탁액에 첨가하고, 혼합하며 혼합물을 실온에서(RT) 8분 동안 두었다. 다음에 1/20 용적의 2.5 M 글리신 또는 1/2 용적의 1 M 트리스 pH 7.5를 첨가하여 포름알데하이드를 퀸칭(quenching)시키고 적어도 1분 동안 항온처리하였다. 세포를 20-50 mL의 차가운 1×포스페이트-완충 식염수(PBS)로 3회 세정하고, 5분 동안 1250×g에서 원심분리하여 각각의 세척 전후에 세포를 펠렛화하였다. 이후에 세포를 15 mL의 원뿔형 튜브로 전달하고 1250×g에서 5분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 잔존 액체를 Kimwipe로 두들겨 제거한 다음, 펠렛화된 세포를 액체 질소 내에 플래시 냉동시키고 -80℃에서 저장하였다.
비드 제조: 2 mL의 면역침전물(Invitrogen) 당 대략 60 ㎕의 Dynabeads® 단백질 G를 사용하였다. 비드를 1.5-mL 에펜도르프 튜브 내에서 1.0 mL의 차단 완충액(PBS 중 0.5% BSA w/v)으로 5분 동안 3회 세정하였다. 자석(Invitrogen)을 사용하여 각각의 세정 후 비드를 수집하고(및 적어도 총 1분 동안 자석이 결합하도록 함) 이후에 상청액을 흡인하였다. 세정된 비드를 250㎕의 차단 완충액 내에 재현탁시키고 여기에 6㎍의 항체를 첨가하고 혼합물을 밤새(최소 6 시간) 빙글빙글 회전시키면서 혼합하여 항온처리시켰다. 항체-결합된 비드를 각각 1 mL의 차단 완충액으로 5분 동안 3회 세정하고 차단 완충액 (IP당 60 ㎕) 내에 재-현탁시켰다. 세포를 초음파처리(참조 9.1.1.3)하고 밤새 면역 침강시키기 직전에 이들 마지막 세정 및 재현탁을 1회 수행하였다.
세포 용해: 1× (완전한, Roche; 하나의 정제를 50×용액의 경우 1 mL의 H20 내에 용해시켜 제조하고 분취액으로 -20℃에서 저장하였다)에서 프로테아제 억제제를 사용 전에 모든 세포용해 완충액에 첨가하였다. 세포(대략 5×107 개 세포)의 각각의 튜브를 5-10 mL의 세포용해 완충액 1(LBl; 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% 글리세롤, 0.5% NP-40, 0.25% 트리톤 X-100)에 재-현탁시키고 4℃에서 10분 동안 진동시켰다. 세포를 탁상용 원심분리기 내에서 4℃에서 1250×g로 5분 동안 원심분리하고 상청액을 흡인 제거하였다. 세포를 5 mL의 세포용해 완충액 2 (LB2; 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 10 mM 트리스 pH 8) 내에 재-현탁시키고 4℃에서 10 분 동안 빙글빙글 회전시키면서 항온처리하였다. 세포를 다시 1250×g에서 5분 동안 탁상용 원심분리기 내에서 4℃에서 펠렛화하고 2-5 mL의 Covaris 초음파처리 완충액(10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.1% SDS) 내에서 세정하였다. 펠렛을 1250 ×g에서 5분 동안 탁상용 원심분리기 내에서 4℃로 원심분리하였다. 세포를 1250× g에서 5분 동안 탁상용 원심분리기 내에서 4℃로 펠렛화하고, 20-50 백만개의 세포/1 mL 농도의 Covaris 초음파처리 완충액에서 재-현탁시켰다.
염색질 면역침전: 상기에 기재된 바와 같이 제조된 50㎕의 항체-접합된 비드를 다음 내에서 깨끗해진 세포 추출물 (세포 용해물 내에 상기에 기재된 바와 같음) 용액에 첨가하고: 1.5 ml의 튜브 및 밤새 4℃ (최소 8시간)에서 진동시켜 DNA-단백질 복합체를 면역침전시켰다.
세정, 용출, 및 교차-연결 역전: 이들 단계에 사용된 모든 완충액을 빙냉시켰다. 자기 스탠드를 사용하여 자기 비드를 침전시키고, 1 mL 세정 완충제 1 (50 mM HEPES pH 7.5; 140 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 0.75% 트리톤-X; 0.1% SDS; 0.05% DOC)과 함께 경도로 빙글빙글 회전시키면서, 각각 5분씩 3회 세정하고; 1 mL 세정 완충제 2 (50 mM HEPES pH 7.5; 500 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 0.75% 트리톤-X; 0.1% SDS; 0.05% DOC)을 5분 동안 1회 세정하며; 1 mL 세정 완충제 3 (10 mM 트리스 pH 8.0; 1 mM EDTA; 50 mM NaCl)로 5분 동안 1회 세정하였다. 모든 잔존 세정 완충제를 흡인하고 비드를 1250 xg에서 1분 동안 경도로 원심분리하고; 튜브를 자석으로 1회 대체하고 모든 미량의 완충액을 제거하였다. 210㎕의 용적에서 용출 완충액을 첨가(50 mM 트리스 pH 8; 10 mM EDTA; 1% SDS)하고 65℃에서 60분 동안 약한 소용돌이로 용출시켜 비드를 15분마다 재-현탁시켰다. 비드를 상청액으로부터 자석을 사용하여 분리하고 200㎕의 상청액을 제거하고 역 가교결합을 위해 세정된 튜브 내에 배치하였다. IP 및 전체의 세포 추출물 분획 둘 다를 밤새 65℃ (최소 8시간, 그러나 최대 18시간)에서 역 x-연결시켰다. 이후에 가열을 사용하여 샘플 둘 다를 면역침강 및 전체의 세포 추출물 분획에 대해 밤새 65℃ (최소 8 시간, 그러나 최대 18시간)에서 항온처리함으로써 별도로 역 가교결합시켰다. 가열은 포름알데하이드 가교결합의 가수분해를 용이하게 하였다.
DNA의 세정 및 정제: 트리스-EDTA 완충액 (50 mM 트리스 pH 8; 1 mM EDTA) 및 2.7㎕의 30 mg/ml RNaseA (0.2 mg/mL 최종 농도)를 200㎕의 용적에서 각 시료에 첨가하고, 혼합하며 37℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 이후에, 5㎕의 염화칼슘 용액(10 mM의 트리스 pH 8.0 중 300 mM CaCl2)을 각 시료에 4㎕의 20 mg/ml의 프로테이나제 K(0.2 mg/mL 최종 농도)와 함께 첨가하고, 혼합하며 55℃에서 60분 동안 항온처리하였다. 이후에, 400㎕의 25:24:1 비의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 (Sigma Aldrich #P3803)을 각각의 튜브에 첨가하고, 소용돌이 혼합기 내에서 낮은 설정(5/10)으로 혼합하고 각각의 튜브를 역전시켜 추가로 혼합하였다.
PhaseLock Gel™ 튜브(Qiagen, 3 Prime)를 각각의 샘플에 대해 튜브를, 실온에서 30초 동안 10,000 RPM에서 원심분리하여 제조하였다. 다음으로, 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알코올 중 샘플 DNA를 PhaseLock Gel™ 튜브에 첨가하고 12,000-16,000 ×g에서 2분 동안 실온에서 원심분리하였다. 이후에 수용액을 신규한 1.6 mL 튜브(최상부 분획)에 전달하고, 20㎕의 5 M NaCl, 및 1.5 ㎕의 20 ㎍/pL 글리코겐(총 30 pg)을 첨가한 후, 1 mL의 EtOH를 첨가하고, 와동으로 또는 역전으로 혼합하였다. 다음에, 샘플을 -20℃에서 밤새(6-16 시간) 항온처리하였다. 혼합물을 20,000 xg에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하여 DNA를 펠렛화하고, 상청액을 1 mL 피펫 팁으로 제거하고, 펠렛을 800㎕의 80% EtOH로 세정하고, 20,000×g에서 20분 동안 4℃로 원심분리하고, 상청액을 1 mL의 피펫 팁으로 제거하였다. 샘플을 다시 1분 동안 20,000 xg에서 원심분리하고, 상청액을 제거하고 펠렛을 5-20 분 동안 공기-건조되도록 하였다. 펠렛은 이들 주변에 물의 할로(halo)를 가지지 않아야 하며 유리같은 또는 박리성 건식이어야 한다. 이후에 펠렛을 60㎕의 물에, 서열분석을 위해 50㎕를 사용하여 용해시켰다.
ChIP - seq 데이터 처리: ChIP-seq IP 및 IN을 HG19 게놈에 대해 Bowtie2 v.2.0.5 소프트웨어(파라미터 = -p 4 민감성)를 사용하여 정렬하였다. 이는 IP 및 IN 서열분석 실험 둘 다의 정렬을 요약하는 게놈-전체 BAM 파일을 생성하였다.
보편적인 IRF8 인핸서 스코어 데이터세트의 생성: 모든 다운스트림 분석에 적용할 수 있는 보편적인 IRF8 인핸서 스코어 데이터세트를 생성하였다. 정렬된 IP BAM을 사용하여 MACS vl.4로 정렬된 H3K27Ac 판독 데이터 내에서 피크 관찰된 게놈-전체를 ChIP-seq 우위 데이터로 지정하고 정렬된 IN BAM을 대조군 배경 데이터로 지정하였다. 10-9 의 엄격한 p 값 컷오프를 사용하였으나, 기타의 경우에는 디폴트 파라미터를 사용하였다. 이후에, 이들 피크가 인간 참고 게놈내 이들 사이에 ≥12,500개의 염기쌍을 갖는 경우 병합하였다. 이러한 피크의 세트를 ROSE 피크로 지칭하고, 및 제공된 샘플에 대해 IRF8 전사체와 중첩되는 최고-스코어링 ROSE 피크의 순위를 이러한 샘플에 대해 "IRF8 ROSE 순위"로 기록한다.
이후에 ROSE 피크의 세트를 ENCODE (https://sites.google.com/site/ anshulkundaje/projects/blacklists) 및 ENCODE Project Consortium (2012)에 정의된 바와 같은 "블랙리스트 영역"에 대해 여과하여 ChIP-seq 인공물을 제거하였다.
이후에, 1차 환자 샘플로부터의 ROSE 피크의 여과된 세트를 다른 샘플로부터 이를 중첩한 모든 피크와 제공된 샘플로부터의 각각의 피크의 좌표의 연합을 취함으로써 보편적인 H3K27Ac 농축 맵 내로 통합하였다. 이는 H3K27Ac 농축된 보편적인 맵을 생성하였다. 이후에 각각의 농축된 영역을 제공된 영역에 대해 당해 영역내에서 맵핑된 IP 판독물의 수를 합하고 낙하 실험에서 판독물 맵핑의 수로 나눈 다음 백만을 곱함으로써("백만당 판독물", 또는 RPM) 각각의 샘플(세포주 포함)내 당해 보편적인 맵 내에서 정량화하였다. IN 판독에 대한 유사한 RPM 스코어를 계산하였다. IN RPM을 IP RPM으로부터 공제하여 제공된 샘플에 대한 보편적인 맵내에서 제공된 영역에 대한 전반적인 스코어를 달성하였다. 음성 이항식 분포는 R 질량 라이브러리 v7.3.45에서 fitdistr 기능을 사용하여 제공된 샘플에 대한 스코어에 대해 조정하였다. 분포의 테일(tail)을 당해 음성 이항식의 누적 분포 기능이 0.99(0.01의 p 값과 동일)를 교차한 지점으로 위치시켰다. 이러한 지점에 의해 모든 샘플의 영역에 대한 전반적인 스코어를 분할함으로써 적합화된 음성 이항식 분포의 하부 99%에서 스코어링된 풍부한 임의의 영역을 1 ("전형적인 인핸서"로 간주됨) 이하로 스코어링하였고 99% 초과로 스코어링된 임의의 영역을 1 초과("슈퍼-인핸서"로 간주됨)로 스코어링하였다. 이들 스코어는 보편적인 맵에 대해 각각의 샘플의 경우 "RECOMB" 스코어로 명명된다. 각각의 샘플의 RECOMB 스코어를 이후에 모든 다른 샘플에 대해 사분위수 정규화, 및 0에서의 플로어 세트(floor set)를 사용하여 정규화하였다.
ChIP-seq 데이터의 가시화: H3K27Ac의 게놈-전체 국지화는 BAM 파일을 MACS2를 사용하여 t 파일로 포맷팅한 IGV로 전환시켜 파일업(pileup)(extsize 200)을 생성시킨 후 Integrative Genomics Viewer (IGV) 버전 2.3.60 및 TDF command에 대한 igvtools v2.3.9 소프트웨어의 igvtool을 사용하여 가시화하였다. 각각의 트랙의 Y-축을 설정하여 노이즈의 수준 바로 위 (0.25)에서 시작하고 MALAT1 유전자에서 중심화된 대조군 영역에 걸쳐 피크의 전체 높이를 관찰하는데 요구된 수준의 대략 절반에 이르는 수준에서 종결한다.
표 2. AML 세포주 IRF8 인핸서 강도, mRNA 수준 및 타미바로텐 항-증식성 효력
Figure 112018110508794-pct00010
*HL60 은 APL 세포주임.
상기 데이터는 ≥ 1.0 (≥ 1.0의 RECOMB 스코어는 슈퍼 인핸서를 정의함)의 IRF8 RECOMB 인핸서 스코어가, 타미바로텐에 대한 반응성으로 높은 상관관계가 있음을 입증한다. HL60 APL 세포주를 제외하고, 시험된 12개의 비-APL AML 세포주 중, 컷오프 값은 1개 위양성 (Kasumi-1) 및 1개 위음성 (EOL-1)을 생산하였다. 컷오프를 ≥ 1.25의 RECOMB 스코어로 상승시키는 것은 위양성을 제거할 것이며, 한편 컷오프를 ≥ 0.75의 RECOMB 스코어로 저하시키는 것은 위음성을 제거할 것이다. 이러한 데이터는 또한 도 6에 그래프 형태로 나타낸다. IRF8 mRNA 수준과 타미바로텐에 대한 반응성 사이의 유사한 상관관계는, 모두 타미바로텐 민감성을 입증하는 4.25보다 더 큰 IRF8 mRNA TPM(log2) 값을 지닌 세포주를 사용하여 관찰하였다.
본 발명자들은 이후에 인핸서 프로파일링을 ChIP-seq에 의해 AML 환자 샘플의 서브세트에 적용하였다. IRF8 유전자좌 인핸서 강도는 66개의 AML 환자 샘플에서 광범위하게 가변하였으며, SE를 가진 환자의 21% (14/66)는 1.0을 초과하는 RECOMB 스코어로 나타났다(도 7). 대부분의 환자 샘플은 정량화가능한 IRF8 인핸서가 없는 최저 14% (9/66)를 포함하는 최소 인핸서 활성을 나타내었다.
실시예 5: IRF8 mRNA 및 IRF8 인핸서 강도의 상관관계
IRF8 인핸서의 정량화 및 ChIP - seq와 RNA - seq 데이터의 상관관계: 사분위수-정규화된 RECOMB 스코어를 IRF8: chrl6:85862582-85990086을 중첩한 보편적인 맵에서 인핸서로서 불리는 영역에 대해 모든 환자에 걸쳐 사용하였다. 이는 스피어만 상관관계를 사용하여 RSEM로부터의 전체 IRF8 유전자 모델에 대한 사분위수-정규화된 TPM 발현 평가치와 관련시켰다. RNA-seq 및 ChIP-seq 둘 다를 지닌 환자만을 사용하였다. 동일한 분석을 세포주에서 수행하였으나, APL 세포주는 배제하였다.
IRF8 mRNA 측정에 의한 IRF8 SE의 대리 추정을 가능하도록 하기 위해, 2개 사이의 상관관계를 동일한 AML 환자 집단에서 시험하였다. RNA-seq에 의해 측정된 IRF8 mRNA를 H3K27ac에 대한 RECOMB 스코어에 의해 IRF8 유전자좌 인핸서 척도와 비교하였다(도 8). IRF8 mRNA 수준 또한 당해 집단 내 샘플 중에서 광범위하게 변하였으며 IRF8 mRNA 수준은 IRF8 인핸서 강도와 고도로 상관되었다(스피어만 Rho 상관관계 추정치 ~.0.81, 2.2×10-12의 p-값).
본 발명자들은 또한 IRF8 인핸서 강도의 값 및 26개의 AML 세포주에서 IRF8 mRNA 수준을 프로파일링하였다. 몇 개의 이들 세포주를 타미바로텐에 대한 항증식성 민감성에 대해 미리 시험하였다(참조: 표 2). AML 환자 샘플에서 관찰된 바와 같이, AML 세포주는 넓은 분포의 IRF8 인핸서 강도를 나타내었다(도 9). IRF8 인핸서 강도 및 IRF8 mRNA 수준 또한 26 AML 세포주에서 광범위하게 가변하였으며, 이 중 9개(34%)는 ≥ 1.0의 IRF8 RECOMB 값을 가졌다.
AML 환자 샘플을 사용하는 경우, AML 세포주는 IRF8 인핸서 강도와 함께 IRF8 mRNA 수준의 강한 상관관계를 나타내었으며(도 10; Spearman Rho 상관관계 추정치 ~.0.82, 2×10-16의 p-값), 이는 따라서 IRF8 인핸서 강도의 대리 척도로서의 IRF8 mRNA를 뒷받침한다.
실시예 6: 타미바로텐에 대한 PDX 모델의 반응 및 IRF8 mRNA 수준과의 상관관계
BALB/c 누드 면역저하된 마우스에서 상이한 AML 환자 샘플(AM8096, AM5512, AM7577 및 AM7440)-유래된 이종이식 모델을 Crwon Biosciences (중국 베이징 소재)에 의해 본질적으로 하기와 같이 제조한다.
각각의 환자 샘플로부터 대략 2×106개의 세포를 100㎕의 PBS에 현탁시키고 별개의 마우스 (각각의 상이한 환자 샘플 및 대조군에 대해 n=3)에 IV 꼬리 주사로 투여한다. AM5512, AM7577 및 AM7440 제노그래프에 대하여, 인간 CD45+ 세포의 농도가 동물의 말초 혈액에서 ~1-5%에 도달한 경우 종양 부하가 치료를 시작하기에 충분히 높은 것으로 간주한다. 인간 CD45+ 세포를 마우스 혈액(눈 방혈을 통해 수득함) 내에서 형광 활성화된 세포 정렬기 및 FITC 항-인간 CD45 (Biolegend, 제품 번호 304037)를 사용하여 검출한다. AM8096 제노그래프에 대하여, 치료는 세포의 주사 후 40일째에 시작한다.
타미바로텐을 pH 8로 조정된 PBS, 1% DMSO 내에서 매일 일정으로 6 mg/kg 체중의 최종 용량에서 10ml/kg 용적으로 경구 투여한다. 비히클 아암(vehicle arm) 내의 마우스는 동일한 스케줄, 용적, 및 제형으로 제공되지만, 타미바로텐은 결여한다. 처리된 동물 및 대조군 동물로부터 말초 혈액 중 인간 CD45+ 세포 수준을 1주 1회 측정한다.
AM5512 및 AM8096 제노그래프는 처리 35일 후 비히클 대조군과 비교하여, 타미바로텐으로 처리하는 경우, CD45+ 세포의 총 %에서 뿐만 아니라 혈액, 골수 및 비장 내의 CD45+ 세포에서도 상당한 감소를 나타낸다(도 11). 다른 한편으로, AM7577 및 AM7440는 전반적인 또는 임의의 혈액, 골수 또는 비장에서 타미바로텐 처리된 동물과 비히클 처리된 동물 사이의 종양 부피에 있어서 상당한 감소를 나타내지 않는다(도 12).
이후에, 본 발명자들은 IRF8 및 RARA mRNA 수준 둘 다를 제노그래프 연구에 사용된 4명의 환자 샘플 각각에서 측정하였다(도 13). 제노그래프 연구에서 2개의 비-반응군인, AM7577 및 AM7440은 검정에서 100 이하의 TPM로 이격된 IRF8 mRNA 수준을 갖는다. 반응군 중 하나인, AM8096는 350 TPM 초과인 IRF8 mRNA 수준을 갖는다. 다른 반응군인, AM5512는 매우 저수준의 IRF8 mRNA를 갖는다. 흥미롭게도, 이들 4개의 샘플은 유사한 패턴의 RARA mRNA 수준을 나타내었으며, AM7577 및 AM7440은 임의의 결정된 유병률 컷오프(예를 들어, 36% 유병률 컷오프) 미만의 RARA mRNA 수준을 가지고; AM8096은 유병률 컷오프를 상당히 초과하며 AM5512는 또한 유병률 컷오프 미만이지만, AM7577 또는 AM7440 비-반응군보다 상당히 더 높은 RARA mRNA를 가진다.
실시예 7: IRF8 mRNA 수준 및 ChIP 서열분석을 측정하기 위한 환자 샘플의 수득 및 제조
혈액(8 mL)을 비-APL AML 환자로부터 채혈하고 8 mL의 BD 진공채혈기 CPT 나트륨 시트레이트 튜브내로 수집하였다. 채혈 후에, 튜브를 손으로 8 내지 10회 경도로 역전시켜 항응고제의 적절한 누락을 보장하였다. 튜브를 2시간의 수집 내에 수행된 원심분리 전에 실온에서 수직으로 저장하였다. 다음에 혈액 샘플을 실온(18-25℃)에서 20분 동안 1500-1800 RCF(상대적인 원심력)에서 원심분리하였다. 원심분리 후에, 혈액을 층으로 분리한다. 겔 플러그(gel plug) 아래의 바닥면 층은 절대 바닥층(absolute bottom)(적혈구)에서의 적색 층 및 상기 상의 얇은 회색 층(과립구 및 밀도 용액)이었다. 겔 플러그 바로 위에는 밀도 용액의 맑은 층이 있었고, 이후 백색 층(단핵 세포 및 혈소판)이 있었고, 그리고 상부에 황색 층(혈장)이 있었다. PBMC를 함유하는 백색 층(용적 내에서 1 mL 이하)을 Pasteur 피펫을 사용한 원심분리 직후에 제거하였다. 필요할 경우, PBMC는 경도의 손 역전, 후속적으로 적가에 의한 20% v/v BloodStor® 동결 매질(BioLife Solutions)을 함유하는 저온유리병 내에 저장될 수 있다.
이전의 단계에서 수득된 PBMC 분획(이전에 냉동된 경우 해동시킴)을 이후에 인간 CD117 마이크로비드 (Miltenyi Biotec) 및 인간 CD34 마이크로비드 (Miltenyi Biotec)로, 제조자의 지시에 따라 자기 라벨링 및 표지된 세포의 자기 분리를 위해 동시 처리하였다. 이후에, 메신저 RNA를 단리된 CD34+/CD117+ 세포로부터 추출하고 상기에 기재된 바와 같이 qPCR을 사용하여 정량화하였다.
실시예 8: 타미바로텐과 기타 제제 사이의 상승작용은 RARA mRNA 수준과 상관관계가 있다.
Biotek EL406을 사용하여, 20-60,000개의 세포/ml를 함유하는 50 ㎕의 세포 배지를 백색 384-웰 Nunc 플레이트 (Thermo) 내로 분포시켰다. 이후에, 현탁액 세포에 화합물을 즉시 제공하였으나 부착 세포주에게는 1시간 후에 제공하여 화합물 첨가 전에 플레이트의 표면에 재부착시켰다. 시험될 타미바로텐 및 제2 제제를 DMSO에 용해시키고 384 웰 화합물 저장 플레이트(Greiner)에 배열하였다. 각각의 화합물 플레이트는 소정의 세포주에 대한 소정의 화합물의 EC50 에서 대략 중앙화된 5회의 상이한 용량으로 각각 타미바로텐 및 일 제2 제제를 수용하여, 상기 2개 제제의 총 25회의 상이한 용량 조합을 제공하였다.
화합물 배열을 검정 플레이트에 Janus MDT 워크스테이션(Perkin Elmer)에서 20 nl 384-웰 핀 전달 매니폴드를 사용하여 검정 플레이트에 분포시켰다. 각각의 플레이트는 이의 자체의 4배로 각각의 화합물의 5개 용량 외에 5개 화합물 농도에 의해 총 5개의 8개 반복물을 함유하였다. 화합물의 첨가 후에, 세포 플레이트를 5일 동안 37℃ 인큐베이터 내에서 항온처리하였다. 세포 생존력을 ATPlite (Perkin Elmer)를 사용하여 제조자 프로토콜에 따라 평가하였다. 데이터를 상업적으로 입수가능한 CalcuSyn 소프트웨어를 사용하여 분석하고 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 시각화하였다. 타미바로텐 및 제2 제제의 25개의 용량 조합 각각을 도식화한 아이소볼로그램을 생성하고 상승작용의 존재에 대해 분석하였다. 아이소볼로그램에서, 1.0의 가로좌표 및 세로좌표 값을 연결하는 직선은 2개 화합물의 조합에 대한 첨가제였던 성장 억제를 나타낸다. 직선 미만에 속하는 도식은 상승작용적 성장 억제를 나타내며, 상기 선 및 가로좌표를 연결하는 선 미만에 속하는 도식 및 0.75의 세로좌표 값은 경도의 상승작용을 나타낸다. 0.75의 가로좌표 및 세로좌표 값을 연결하는 선과 0.25의 가로좌표 및 세로좌표 값을 연결하는 선 사이에 속하는 도식은 중간정도의 상승작용을 나타낸다. 0.25의 가로좌표 및 세로좌표 값을 연결하는 선 미만에 속하는 도식을 강한 상승작용을 나타낸다. 각각의 아이소볼로그램에서 최대치 범위 외의 데이터 포인트는 아이소볼로그램의 우상측 핸드 코너(hand corner)에서 별표(asterisk)의 수로 나타내며, 이는 상승작용이 없는 데이터 포인트를 나타낸다.
본 발명자들은 아자시티딘, 삼산화비소, 미도스타우린, 사이타라빈, 다우노루비신, 메토트렉세이트, 이다루비신, 소라페닙, 데시타빈, 퀴자르티닙, ABT199 (BCL2 억제제), JQ1(BRD4 억제제), ATO, 프레드니손, SAHA, GSKJ4(JMID3/JARID1B 억제제) 및 EPZ6438 (EZH2 억제제)를 다양한 AML 세포주에 대한 이들 검정에서 제2 제제로서 시험하였다. 도 15-21은 상이한 세포주에서 타미바로텐과 병용된 다양한 제2 제제에 대한 아이소볼로그램을 묘사한다.
아자시티딘 및 타미바로텐의 조합의 경우, 중간정도 내지 강한 상승작용이 Sig-M5에 대해 관측되었고; 중간정도 상승작용이 KG-la 및 NOMO-1에 대해 관측되었으며 경도의-내지-중간정도 상승작용이 MV-4-11에 대해 관측되었다(참조 도 15). 상승작용은 Kasumi-1 또는 OCI-M1에서 관찰되지 않았다(데이터는 도시되지 않음).
삼산화비소 및 타미바로텐의 조합의 경우, 강한 상승작용이 Sig-M5 및 MV41l에 대해 관찰되었고; 중간정도 상승작용이 NOMO-1에 대해 관찰되었다(참조 도 16). 부재-내지-경도의 상승작용이 Kasumi-1에 대하여 관찰되었고, 그리고 OCI-M1에서는 상승작용이 관찰되지 않았다.
사이타라빈 (Ara-C) 및 타미바로텐의 조합의 경우, 일부 중간정도 상승작용이 KG-la 및 OCI-Ml에 대해 관찰되었지만, HL-60에 대해서는 상승작용이 관측되지 않았다(참조 도 17). MV-411의 경우 최대치 범위 외의 큰 수의 데이터 포인트(25개 중 7개) 및 강한 상승작용을 나타낸 큰 수는 해석을 어렵게 만든다.
다우노루비신 및 타미바로텐의 조합의 경우, 강한 상승작용이 Kasumi-1 및 NOMO-1에 대해 관찰되었고; 중간정도 상승작용이 Sig-M5 및 MV-4-11에 대해 관찰되었다(참조: 도 18). 상승작용은 OCI-Ml에서 관찰되지 않았다(데이터는 도시되지 않음).
메토트렉세이트 및 타미바로텐의 조합에 대하여, 중간정도의 상승작용이 NOMO-1, Sig-M5 및 MV-4-11에 대하여 관찰되었다 (참고: 도 19). 부재-내지-경도의 상승작용이 Kasumi-1에 대하여 관찰되었고, 그리고 OCI-M1에 대하여 상승작용이 관찰되지 않았다.
이다루비신 및 타미바로텐의 조합에 대하여, 중간정도의 상승작용이 NOMO-1, Sig-M5 및 MV411에 대하여 관찰되었다 (참고: 도 20). 상승작용은 Kasumi-1 또는 OCI-M1에서 관찰되지 않았다(데이터는 도시되지 않음).
비확정적인 결과는 최대치 범위 외의 큰 수의 데이터 포인트 (참조 도 21)로 인하여 MV41l, NOMO-1, KG-la 및 Sig-M5에서 소라페닙 및 타미바로텐의 조합에 대해 관찰되었으나, 상승작용은 OCI-Ml에서 이러한 조합에 대해 관찰되지 않았다(데이터는 도시되지 않음). 소라페닙은 FLT3 억제제이며 본 발명자들은 타미바로텐 및 다른 FLT3 억제제의 조합, 예컨대 미도스타우린 및 퀴자르티닙의 조합이 세포주의 일부에서 관측되었다. 이론에 의한 구속됨 없이, 본 발명자는 FLT3 억제제를 사용한 상승작용이 높은 RARA 수준 및/또는 높은 IRF8 mRNA 수준, 뿐만 아니라 높은 FLT3 mRNA 수준을 요구하는 것으로 믿는다. 이러한 "조건적" 상승작용은 또한 GCR 억제제 프레드니손과 함께 관찰되었으며, 이는 높은 GCR mRNA 수준 뿐만 아니라 높은 RARA 및/또는 높은 IRF8 mRNA 수준을 요구하는 것으로 여겨진다. 이는 JMJD3/JARIDIB 억제제 GSKJ4를 사용하여 또한 관찰되었으며, 이는 높은 JMJD3/JARID1B mRNA 수준, 뿐만 아니라 높은 RARA 수준 및/또는 높은 IRF8 mRNA 수준이 상승작용을 관찰하기 위해 요구되는 것으로 여겨진다.
본 발명자들은 BCL2 억제제 ABT199 및 타미바로텐의 조합에 대해 시험된 임의의 세포주에서 상승작용이 없음을 관찰하였다. 본 발명자들은 또한 EZH2 억제제 EPZ6438 및 타미바로텐의 조합에 의한 상승작용을 관찰하지 못했다.
본 발명자들은, 그러나 높은 RARA 및/또는 높은 IRF8 mRNA AML 세포주에서의 HDAC 억제제 SAHA 및 타미바로텐의 조합에 대한 상승작용을 관찰하였다.
또한, 강한 상승작용이 HL-60 및 KG-1a 세포에서 데시타빈 및 타미바로텐의 조합에 대해 관측되었다 (데이터는 도시되지 않음).
본 발명자들은 또한, Zn 핑거 전사 인자 억제제 ATO 및 타미바로텐의 조합에 대한 상승작용을 관찰하였다.
임의의 특정 이론에 의한 구속됨 없이, 높은 RARA 수준, 높은 IRF8 수준, 또는 둘 모두의 조합을 특징으로 하는 비-APL AML은, 타미바로텐과 아자시티딘, 삼산화 비소, 미도스타우린(높은 FLT3 mRNA 수준을 특징으로 하는 AML 내), 사이타라빈, 다우노루비신, 메토트렉세이트, 이다루비신, 소라페닙 (높은 FLT3 mRNA 수준을 특징으로 하는 AML 내), 데시타빈, 퀴자르티닙 (높은 FLT3 mRNA 수준을 특징으로 하는 AML 내), JQ1(BRD4 억제제), ATO, 프레드니손(높은 GCR mRNA 수준을 특징으로 하는 AML 내), SAHA, 및 GSKJ4(높은 JMJD3/JARID1B mRNA 수준을 특징으로 하는 AML내) 중 하나 이상의 조합에 대해 상승작용적으로 반응할 공산이 있다는 가설을 세울 수 있다.
참고문헌
Figure 112018110508794-pct00011

Claims (41)

  1. 타미바로텐 (tamibarotene)을 포함하는, 대상체(subject)에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물로서,
    상기 암은 비-급성 전골수구성 백혈병 급성 골수성 백혈병(비-APL AML) 또는 골수이형성 증후군(MDS)이고;
    상기 대상체의 암 세포는 IRF8 또는 RARA 또는 이들 둘 모두의 바이오마커를 갖는 것으로 결정된 것이고, 여기서
    상기 IRF8 바이오마커는 IRF8 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서 또는 소정(pre-determined)의 역치와 동일하거나 이를 초과하는 IRF8 RNA 전사체 수준이거나 이를 포함하고,
    상기 RARA 바이오마커는 RARA 유전자와 관련된 슈퍼 인핸서 또는 소정의 역치와 동일하거나 이를 초과하는 RARA RNA 전사체 수준이거나 이를 포함하고;
    상기 타미바로텐은 아자시티딘, 미도스타우린, 사이타라빈, 다우노루비신, 메토트렉세이트, 이다루비신, 소라페닙, 데시타빈, 퀴자르티닙, ABT199, JQ1, 프레드니손, SAHA, GSKJ4 및 EPZ6438로부터 선택되는 제2 치료제와 조합하여 투여되는, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 암이 비-APL AML인, 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 암이 MDS인, 약제학적 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타미바로텐 및 상기 제2 치료제가 동시(concurrently) 투여되는, 약제학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타미바로텐 및 상기 제2 치료제가 순차(sequentially) 투여되는, 약제학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IRF8 전사체 수준 또는 상기 RARA RNA 전사체 수준이 형광 혼성화, PCR, qPCR, qRT-PCR, RNA 시퀀싱, RNA 혼성화 및 신호 증폭 또는 노던 블랏을 사용하여 독립적으로 결정된 것인, 약제학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 암 세포가 골수 흡인물(bone marrow aspirate) 또는 전혈 내에 존재하는, 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 골수 흡인물 또는 전혈이 가공되어 하나 이상의 성분을 이로부터 제거하는, 약제학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 전혈이 가공되어 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 샘플 또는 농축된 PBMC 샘플을 생성하는, 약제학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포가 IRF8 바이오마커를 갖는 것으로 결정된 것인, 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 IRF8 RNA 전사체가 인터페론 공통(consensus) 서열-결합 단백질 또는 이의 스플라이스 변이체를 암호화하고 IRF8 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 유전자 융합물을 특이적으로 제외하는 게놈 DNA 서열로부터 전사되고, 상기 IRF8 유전자는 게놈 빌드 hg19의 chr16:85862582-85990086에 위치하는, 약제학적 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 IRF8 RNA 전사체가 IRF8 mRNA인, 약제학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포가 RARA 바이오마커를 갖는 것으로 결정된 것인, 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 RARA RNA 전사체가 기능성 레틴산 수용체-α 유전자를 암호화하고 RARA 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 유전자 융합물을 특이적으로 제외하는 게놈 DNA 서열로부터 전사되고, 상기 RARA 유전자는 chr17:38458152-38516681에 위치하는, 약제학적 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 RARA RNA 전사체는 RARA mRNA인, 약제학적 조성물.
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