TWI274157B - Method of identifying compounds suitable for treatment and/or prophylaxis of obesity - Google Patents

Description

1274157 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 防 尤 如 A7 五、發明說明（1 ) ，、本發明係關於—種篩選化合物適用於治療及/或預防肥 胖之方’去此外’本發明亦有關於化合物之應用，其擁有在 哺礼類動物中，抑制新生脂肪之能力，且其基本上與中 經系統(二ZNS)指導之效果無關，用來製造作為治 防肥胖之藥物。 .、^ 3在7日’肥胖症係為_對國民健康而言日漸嚴重之問 〜尤其疋在工業發達的國家中，其大部份係由不均衡及過 多脂肪之食物咐丨起。隨著人口中肥胖百分比之增加，肥胖 足現象於曾加，因而產生從個人之不滿意感，到心臟循環疾 病或者有*些形式之糖尿病。對此已經有—些治療方法，其 目的為治療或獅肥胖。以抑制脂肪酶之化合物作例子， /、在腸道巾減八防續，並以此種方式減低由脂肪分解所 獲得之能量。食物中之脂肪在此治療方法中，至少部份未經 消化而被排出:其他可補充上述治療形式之用來治療及/或 預防肥胖之治療方法，乃甚受歡迎。 現已有驚人地發現，在哺乳類動物中，尤其是人麵，且 有可以抑制新生脂防之化合物，其在優先之方法下極適· 治療及/或預防肥胖。特別良好之結果為，當上述之化合物 在經過較長之咖，例如經過幾魅期而給藥。 本發明之_4—種_化合物適用於治療及/或預 月甘叫之方法，其中所選擇之化合物擁有在哺乳類動物中，尤 /、疋人狀抑制新生赌之能力。此外，本發明之内容亦有 關二U之翻’其擁有在哺乳類動物巾，抑制新生脂肪 、月匕力且/、尤其在大致上與中樞神經系統指導之效果 μ氏張尺度適用中國國家標準（CNS)A4i(21G x 297

------- -- ------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -6- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274157 A7 ____ B7 五、發明說明（2 ) 抗痙攣效果無關，用來製造作為治療及/或預防肥胖之藥物。 新生脂肪(de-novo-Lipogenese，以下簡稱為DNL)之意 義，乃指體内特有之脂肪酸，在哺乳類動物之機能中由碳水 化合物建立。此建立過程乃在體内細胞之細胞溶質中發生， 其基於所謂的檸檬酸循環或三-幾酸_循環。在一體内特有之 生物化學反應中，在此循環中由兩個組成部份，由碳水化合 物產生之丙酮酸鹽，及經過不同中間步驟產生之氫碳酸鹽— 其中包括順-丁晞二酸酿、反-丁晞二酸及戊二酸一最後 形成4宁樣敗。只要檸檬酸過量地製造，此會經過中間步驟之 乙醯基-酵素Α可轉化為游離脂肪酸(=脂肪性最終產物），其 形成脂肪且然後可在脂肪細胞中儲存。一個由脂肪酸形成之 脂肪體，在體内細胞過量之儲存，可導致相當普遍之肥胖。 在檸檬酸循環中有歸酵素參與。檸檬酸循環之新陳代謝乃 大體上取決於可供應氳碳酸鹽之份量。而可供應氫碳酸鹽之 份f則取決於其由二氧化碳卿成之速度。此釋放氫碳酸鹽 之平衡反應，乃藉由所謂的碳酸脫水酶而催化。目前習知 I碳酞脫水酶及其同功酶，在哺乳類動物中乃大部份屬於 亞型Π(- CA II)及亞型v(= CA V)之碳酸脫水.同功酶， 其皆參與催化作用，其中_酸鹽大量供應於棒權酸循環。 屬於亞型V之碳酸脫水酶尤其扮演—個重要的角色，因為 其在粒線體中域。而㈣義獅在粒線體中進行。 要抑制哺乳麵物細胞内之DNL有多種可能性，並所 有目的，均為減少在檸檬酸循環中出現之新陳代謝。^可 減少多餘屋生之可供脂防酸生產之摔樣酸濃度。符合本發明 冰張尺度適财關家標iT(CNS)A4規格（210 X 297公 ------------41^--------- ί-------線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -7-

1274157 的是’此DNL可優先地被抑制，其中之碳酸脫水酶被抑制， I 以致其可以催化在檸檬酸循環中產生氫碳酸鹽之反應。優先 : 符合本發明之目的為，可抑制屬於亞型II及/或V之碳酸脫 '水酶，優先者為亞型V。 . 可非專門地抑制碳酸脫水酶之化合物(=非專門或傳統 之CA_抑制劑）已為習知，且長時間在不同之醫療範圍内， 主要是作為利尿劑或在眼科中使用。此傳統之CA-抑制劑之 I 概要可例如在 C· T· Supuran，Expert Opinion on Therapeutic I Patents’丛（5) (2000) 575 - 600中找到。相反的’所了解的「專 門之CA-抑制劑」應該是只抑制一個CA_亞型(例如CA v)， 或是一個CA_亞型之特定組別。使用傳統之CA_抑制劑有目 的的來治療及/或預防肥胖，至今仍未習知。 Ί 一般相信，絕大多數肥胖之習知情況，乃由吸收營養中 ⑽過量之外來脂肪所造成。在經濟高度發展之國家如美 國，體態肥胖之人士所攝取之營養，高達3〇%為脂肪之形 式。根據現今之認知，導致肥胖之脂肪含量，大部份來自於 過度吸收之食物脂防，其不為以藉由抑制碳水化合物新陳代 經 謝為目的之DNL所影響。 | 雖然藉由抑制DNL亦可達到在脂脉細胞内，減少脂防 0 酸之儲存，料於其對脂減在人體細胞之儲細程中相對 | 微少之貢獻，以抑制DNL作為出發點乃被視為不適於治療 ί 及/或預防人類之肥胖。在學術界專業方向之-摘要，、:表 | 之意見例如參見M. K. He細tein，Ε则pean 1 Chmcal Nutrition發⑴（1999) 53 _ 65。此在學術界中主要之 本紙張尺度適用中國國家標準（0¾¾ (2fx 釐)__________

-ϋ n I 請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # ，訂Γ·-------線· 1274157 A7

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-9- 1274157 A7 -------------- 五、發明說明（5 ) 長，月研先中’作為副作用偶然地被發現。目前仍無法得知， 多比拉麻特在癲癇症病人身上使用而觀察到之體重減少，究 ，是屬於何種藥理特性。多比拉麻特屬於w〇 9_13〇之 $巳圍内’作為一種適用於洽療肥胖、抗痙攣有效之藥物組 之通式I之化合物。 、 根據本發明之方法，ί見在可顯示出多比拉麻特為一種有 /曰力之CA-抑制劑’尤其是_種在哺乳類動物中出現之屬於 亞型II及V之碳酸脫水酶之準抑制劑，且多比拉麻特可有 效地抑制在哺乳類動物細胞中之DNL。因此，利用根據本 發明之方法的幫助可以首次證明，至今仍未被了解之，在瘤 癇症病人中出現之作為多比拉麻特藥理性副作用之體重減 輕’大致上由於其能有效地抑制在哺乳麵物中之dnl所 造成。因此期待借助根據本發明之方法，可在將來筛選化合 物適用於治療及/或獅辦。贴雜本發狀方法，首 先么開-可此性，根據抑制DNL之原理，能相對快速且簡 單地發現有效之，具有藥理潛力之化合物。感謝本發明之努 力，現在可以找到-些根據上述原理作用之化合物，其適用 於治療及/或預防肥胖，至少在一個首先有目的之選擇過程 中’現在不需長相及昂貴之體内實驗，例如對實驗動物銀 食而選出。 此結果乃相當地驚人，為讀早騎纽拉麻特藥理 特性之研究中’其CA-抑制性效果常常不明顯，或甚至被視 f僅作為練絲理上無重要性(詳制如B. E.施啊也 等人 ’ Journal of Medicinal Chemistry 迎（1987) 880 - 887; B.

本紙張尺度適國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公iT -10- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 [274157 五、普明說明（6) E· Maryanoff 等人，J0urnal of Medicinal chemistry 虹 〇 朔) 1315 - 1343; S· J· Dodgson 等人，Epilepsia ϋ (1) (2000) s 35 _ S 39)。在上述較早之研究中，用來測量多比拉麻特引起之 CA-抑制之活性時，多比拉麻特使用不同之在測試溶液中含 有不同哺乳類動物之CA，此測試溶液更含有不同之身體部 份，如血液或器官組織。 a 在根據本發明方法之第一實施形式中，篩選化合物適用 於治療及/或預防肥胖，其中被選作為適合之化合物·，擁有 抑制至少一種在哺乳類動物中出現之碳酸脫水酶之活性之 月b力。例如可將至少一種待研究之化合物與至少一種碳酸脫 水酶接觸，並隨後以習知之方法鑒定化合物抑制至少一種 碳酸脫水酶之活性之能力。優先者為在此實施形式中，在 哺乳類動物中，如人類或嚙齒類動物，例如大鼠、小鼠或天 竺鼠中使用上述之碳酸脫水酶，尤其是屬於亞型π及/或v 之碳酸脫水酶。特別優先者為，在人類中使用上述之碳酸 脫水酶。適合之碳酸脫水酶可例如由上述之哺乳類動物中 分離出，並在有需要時純化，或可優先以習知之化學或生物 技術方法製得。 在第一實施形式之一優先變體中，碳酸脫水酶活性之改 、又在待研丸之化合物之影響下，可在一習知之在體外之酵素 /舌性測喊中測定，其中碳酸脫水酶作為分離及至少無伴隨 物品之酵素出現。優先者為使用根據化學或生物技術方法製 得之碳酸脫水酶，因為此可優先以純粹形式使用。用來測 量碳酸脫水酶活性之在體外之活性測試已為習知。在本發

---I----* I.-------^ . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -11- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274157 A7 B7 五、發明說明（7 ) 明之範圍内，適合之屬於體外之酵素活性測試，用來測量碳 酸脫水酶活性之改變，例如測量在碳酸脫水酶之影響下， 酸驗值之改變(參見 Κ· M. Wilbur，N. G. Andersen，Journal of Biological Chemistry 176 (1948) 147 - 154; G. Sanyal, T. H. Maren, Journal of Biological Chemisrty 256 (1981) 608 -612)，停止流動測量方法（參見R. G. Khalifah，Journal of Biological Chemistry _ (1971) 2561 - 2573)或 4-硝基苯基 乙酸_酯酶方法(參見 Υ· Pocker，J. T. Stone，Journai of the American Chemical Society 位（1965) 5497 - 5498)。在最後被 提及之測試中，在待研究之碳酸脫水酶之影響下，測量4_ 硝基苯基乙酸之水解速度，其中利用碳酸脫水酶之特性亦 作為酯酶而使用。 根據本發明’在此摘要中優先適^ —種用來測量化合物 CA-抑制特性之測試方法，其描述於c· T· Supuran等人， European Journal of Medicinal Chemistry 33 (1998) 577 - 594 (參見特別是第592頁；以下引稱為“Supuran等人，，)或A·

Scozzafava 等人，journai 〇f Medicinal Chemistry 42 (1999) 3690-3700(參見特別是第3697頁；以下引稱為“Sc〇zzafava 等人”）。在上述由Supuran等人及由Scozzafava等人描述之 測ΰ式方法中，在本發明公開内容之範圍内，明確地作為依 據。根據上述由Supuran等人或由Scozzafava等人所述之體 外標準活性測試中，仏-濃度值至少在10 ,〇1/1或以下(= 較高之有效程度)之化合物，在本發明之意義下，可被選作 為適合CA-抑制性有效之化合物卜CA_抑制劑）。如果需要測 i I I I In· ΙΓ------^ ^wi (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-12- [274157 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（8 量人體CA-亞型之活性時，以採用與4_硝基苯基乙酸_酯酶 方法不同者為較佳。尤其可採用亦能允許相對快速之反應結 果之方法。 在一根據Scozzafava等人(内.容如上所述)描述之4-硝基 苯基乙酸-酯酶方法之操作之酵素活性測試(原來由γ.

Pocker 及 J. T. Stone，Biochemistry g (1967) 668 _ 678 所描 述），在本發明之範圍内被證實，多比拉麻特對於根據生物 技術方法製得之屬於亞型π之人類碳酸脫水酶(IC5G二5 mnol/1)具有一種顯著之抑制性效果，且此抑制性效果明顯地 車父?*於藉由作為對照物質測量之傳統CA_抑制劑乙此p各醯 胺或曱u比咯醯胺各引起之抑制性效果。屬於亞型π之人類 碳酸脫水酶乃根據Scozzafava等人所提供之方法而製得。 在同一測試中亦證明，多比拉麻特對於根據生物技術方 法製得之屬於亞型Va(=mCA Va)之小鼠碳酸脫水酶，具有 一種顯著之抑制性效果叩別二74 nm〇1/l)。與Scozzafava等 人提供之實驗步驟不同，在此情況下，酵素mCA Va採用濃 度為 120 nM。此 mCA Va 乃根據 Η· R. Heck 等人，J0urnai 〇f Biological Chemistry 269 (1994) 24742 _ 24746 提供之方法， 以€知之方法製得。在此使用細菌株Escherichia coli BL 21 (DE3)，其藉由一質體載體使用。此質體載體含有政A Va 之基因碼序列，以藉由異丙基-β_Ε)_硫代半乳糖毗喃糖(IpTG) 可诱導之T7驅動子驅動。此細菌培養液在攝氏37度攪拌 下，放進一個含氨苄青黴素(100μ§/ηΊ1)之LB-液體培養基培 養，且其生長乃以600 nm色譜光儀追蹤。當細菌培養液到 — — — — — 1 i I I I I I L —Γ I I I I I 1^^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -13 - A7 1274157 五、發明說明（9 達指數之生長階段時，將IFTG之最後濃度加至！ mm〇1/1。 在3個小時之培養時間過後(在攝氏37度攪拌下），將細菌 培養液在7000 X g離心15分鐘之久，並將上清液倒掉。產 生之顆粒以〇·1 Vol雙重過滤之蒸顧水吸收，並加入溶菌酶 (100 pg/ml)。此細胞溶解過程在超音波下完成。將此含有細 菌懸浮液每10耄升往一開放之玻璃容器分成之小份中，將 此樣品以超音波3分鐘内處理4次。在每個聲音脈衝後，在 600nm測量樣品之吸收，其中一樣品之每1〇〇 μ卜以9〇〇 μ1 之雙重過濾蒸餾水稀釋。到達終點者，為一樣品在6〇〇 nm 之吸收值為大約起始值之十分之一。在細胞溶解完成後，將 氯化妈之連接緩沖劑(Stratagene公司)加入，並將製得之細 胞溶解物在純化時，放到一個鈣調解蛋白_親和性_樹脂酸 上。此純化過程乃依賴在樹脂上結合終範圍至鈣調解蛋白_ 連接蛋白肽之高度親和性，其在傳送mCA Va_蛋白之N端 末尾上出現。此純化過程乃以習知之方式完成（參見 Stmtagene 公司手冊，“Affmity LIC cl〇ning and Pr〇tdn Purification Kit Manual，，；）。 在根據本發明方法之第二實施形式中，篩選化合物適用 於治療及/或預防肥胖，其中被選作為適合之化合物，擁有 在分離哺乳類動物活細胞之擰檬酸循環中，或在檸檬酸循環 中之脂肪性最終產物，減低產生新陳代謝產物份量之能力。 作為知樣循ί衣之新陳代謝產物’其份量在待研究化合物之 影響下，減低之份量可被測量，適合者有酸可溶性之新陳代 謝產物如擰檬酸、順-丁烯二酸酯、反_丁埽二酸及/或…酮戊 -------------0------ί^ι-------^#1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -14- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 [274157 五、發明說明（10) 二酸。優先者為檸檬酸。其他適合作為新陳代謝產物的有， 檸檬酸循環之脂肪性最終產物，如游離脂肪酸。在第二會施 形式中，亦測量最後待研究之化合物之能力，其抑制至少一 種在哺乳類動物中出現之碳酸脫水酶之活性一但使用之測 試模式與第一次所述之實施形式不同。第二實施形式之方 法，乃基於習知之方式，於分離哺乳類動物活細胞中，利用 檸檬酸循環中以碳14-同位標記之基質，測量在擰檬酸循環 中新陳代謝之中間產物或最終產物放射性之吸收，並將求得 之結果與在相同情況下，但在CA-抑制性有效化合物之影響 下得到之結果相比。優先者為，在此方法變體中，使用從唱 齒類動物，如大鼠、小鼠或天竺鼠，或從人類分離出之活細 胞。優先者為人類之活細胞。如果使用嚙齒類動物之細胞， 則可使用脂肪細胞或肝細胞。優先者為嚙齒類動物之脂肪細 胞。如果使用人類之細胞，則可使用脂肪細胞或肝細胞。優 先者為人類之肝細胞。在此方法變體中使用之哺乳類動物細 胞，可根據一般飼養及/或選株方式而製得。此方法可使用 自然或生物科技上改變之哺乳類動物細胞。如果要測量在檸 檬酸循環中酸溶解性之中間產物放射性之吸收，作為碳14-同位標記之基質，乃優先使用竣14-氫碳酸鹽（= NaH[14C]〇3)。如果要測量在檸檬酸循環中，脂防性最終產 物放射性之吸收時，作為碳14-同位標記之基質，乃優先使 用[U-14C]葡萄糖。

用來測量化合物在哺乳類動物中抑制DNL之能力之第 二實施形式之一優先變體，由S· A· Hazen等人在FASEB 私紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

— — — — — — ^ . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -15- 1274157 A7 B7 五、發明說明（U)

Journal 丛（4) (1996) 481 - 490 (以下引稱為“Hazen 等人，，)中 提及。在上逑由Hazen等人描述之測試方法，在本發明公開 内各之範圍内，明確地作為依據。在根據由Hazen等人所述 足測試方法中，將放射性以碳14_同位標記基質加入，及可 利用在棒檬酸循環中作為預先步驟之化合物，例如在檸樣 酸、順-丁烯二酸酯、反-丁烯二酸及/或…酮戊二酸中加入碳 14或奴敎鹽’如其明頭地抑制ic%值至少為,〇1/丨或以 下(=較高之有效程度），則其可在本發明之意義下被選作為 適合之化合物。 在相同於Hazen等人描述之測試模式中，其在本發明 之範圍内進行，發現多比拉麻特對於由根據生物技術方法所 製得之屬於細胞系列數目3T3_F442A之大鼠脂肪細胞，在 檸檬酸循環巾產生之雜解性概鶴絲，_一個顯著 之抑制性效果。此多比拉麻特之抑制性效果(lC5〇 = 線 咖1/1)乃明顯地較作為對照物質測量之傳統ca-抑制劑乙 氧此P各醯胺之效果更為明顯。 在本發明之-特別優先之篩選化合物適用於治療及/或 預=肥胖之方法變體中，所選擇之化合物，在上述方法之第 -貫施形式中’尤其是在—個上述之料酵絲性測試中， 被選作為適用於抑制至少一種在哺乳類動物中出現之碳酸 脫水酶，且另外亦在上述方法之第二實施形式中，被選作 ，通合（化合物’魏力雜在麵哺__活細胞之摔 ^循環情產生之新陳代謝產物。在本核之第—督施形 式中’可快速且有效率地檢查化合物抑制在哺_動物中出 本紙張尺度適用中國國家標準（cns)A4規格^ -16- 1274157 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7 五、發明說明（12 ) 現之峡酉义脫水酶。此外，本方法之第二實施形式亦提供一 個娜〜jl：匕研先之化合物是否能進入哺乳類動物活細胞之 CAV、存放所在地义粒線體。被選作為適合之化合物，可在 上述I第-及第二實施形式中，平行或以任意之排列順序逐 —進行。 根據本發明適合之化合物，擁有在哺乳類動物中抑制 腦L之力’用來製鱗為治療及/或獅肥胖之藥物。所 ^擇（化合物，擁有抑制至少一種在哺乳類動物中出現之破 酉义脫水酶之此力。此選出之化合物當然必須能在生理上被 忍文，且能滿足一般對藥物有效物品提出之要求，相關的例 如有安全性和被忍受性。優先者為化合物之制，其能夠抑 制在哺乳類動物中出現之屬於亞型n及/或v之碳酸脫水 酉每。特別優先者為，能夠抑制特別是對於CA π及/或CA V， 尤其是CAV之化合物。 從前習知之具有CA_抑制性作用之化合物，其在長期給 樂下，具有減輕病人體重之效果，例如多比拉麻特亦具有顯 著之對中央神經系統指導之效果，如抗痙攣之效果。對於作 為長期性給藥，目的為適用於治療及/或預防肥胖之化合 物，我們不希望其對中央神經系統有副作用。根據上述本發 明之方法’被選作為適用於治療及/或預防肥胖之化合物， 可因此額外地研究其對於中央神經系統指導之效果。例如此 化合物可在有需要時，研究可能出現之抗痙攣特性。為了研 究抗痙攣之特性，適合者乃例如根據G. Chen等人， Proceedings of the Society for Experimental Biology and 本紙張尺度週用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爰） -------------0-------|>訂，·---------線· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -17- 1274157 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（13)

MedicmeK1954) 334 - 339 (以下引稱為“Chen 等人，，)及 j Ε· P· Toman 等人，Journal of Neurophysiology £ (1946) 231 (以下引稱為“T〇man等人’，)所謂之“超高電擊測試，，(二SES測 試，有時亦稱為“最高電擊測試，，，簡稱為MES測試）。上述 由Chen等人及Toman等人所描述之測試方法，乃在此在本 發明公開内容之範圍内，明確地作為依據。因此需要長時間 給藥於病人，目的為治療或預防肥胖之化合物，如果在上述 根據Chen等人及Toman等人所描述之SES測試中·，大致 上為無效，並應該優先地以較高之劑量，至少為1〇〇毫克/ 公斤之劑量以口服形式給藥，則有根據此測試之一般標準為 不明顯嚴重之效果，（即根據G. Chen等人之“保護性劑量，， PD%為口服劑量大於/等於丨00毫克/公斤；根據G· chen等 人提供之PDgcHi，因此大致上相同於較一般劑量上用作“最 少有效劑量” Minimal Effektive Dosis，MED)。在上述篩選化 合物適用之方法中，化合物被選作為適合的且其在根據 Chen等人所述之MES測試中大致上無效，特別適用於製造 藥物，以治療及/或預防肥胖。上述之SES(或MES)測試為 藥理上之標準測試，且可在相同之服務範圍内（例如在 “Panlabs”公司中），作為常用之方法來進行。 此根本發明之方法，適用於治療及/或預防肥胖而被發 現之化合物，一般而言可作為藥物與一般藥理性之輔助物 品’以加倫式製劑如藥丸、膠囊、栓劑或溶液中製得。此加 儉式製劑可根據一習知之方法而製得，使用一般固體狀或液 ta狀之負載物品，例如乳糖、殿粉或滑石，或液體狀石虫鼠， 本紙張尺度週用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -18- -----------If lull — ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1274157 A7 _B7__ 五、發明說明（14) 及/或使用一般藥理性之輔助物品，例如藥丸爆破劑、溶液 媒介劑或防席劑。根據本發明適合之藥理性製劑乃例如由 EP 0 138 441 A2 及 W0 98/00130 中習知。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -19-

Claims (1)

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09888 ABCD ο 申請專利範圍 2. 4· 經濟部智慧財產局員κ消費合作社印製 6. 第9〇117382號專利案申請專利範圍修正本 二種篩選化合物適用於治療及/或預防肥胖之方法，其 ，徵為’所選擇之化合物，擁有抑制至少—在哺乳類 ^物中出現之亞型π及/或V之碳魏水酶之活性之 能t ’及其等擁有在分離哺乳類動物活細胞之檸檬酸 循?衣中，減低產生新陳代謝產物份量之能力且另外在 —個用來測量抗痙攣特性之標準測試中，被鑑定為大 致上無效。 根據申請專鄕1項所述之方法，其巾，將至少 化e物與至少一峡脫水酶接觸，並隨後蓉定化合 物抑制至少一碳酸脫水酶之活性之能力。 根據申凊專利範圍第1項所述之方法，其中，在禮齒 類動物或人類中使用上述之碳酸脫水酶。 根據申請專利範圍第3項所述之方法，其中，在人類 中使用上述之碳酸脫水酶。 根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中，在人類 中使用上述之屬於亞型II及/或V之碳酸脫水酶。 根據申凊專利範圍第5項所述之方法，其中，在人類 中使用上述之屬於亞型V之碳酸脫水酶。 根據申請專利範圍第2項所述之方法，其中，碳酸脫 水酶可作為根據化學或生物技術方法所製得之分離 酵素存在，且在化合物之影響下，測量在一在體外之 酵素活性測試中碳酸脫水酶活性之改變。 — ______ 又用中ϋ褡準（CNS)A4規格（210 X 297公爱Γ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -線- -20- 1274157 A8 ------— D8_____ 六、申請專利範圍 8· 根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中，測量在 化合物之影響下，減低在細胞中之檸檬酸循環，形成 沖乎檬鉍、順-丁晞二酸酯、反·丁埽二酸及α__戍二酸 1 之份量’及/或減低在檸檬酸循環中脂肪性最終產物之 - 形成。 9· 根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中，使用由 鳴齒類動物或人類分離出之活細胞。 10. 根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中，使用脂 防細胞或肝細胞。 11. 一種篩選化合物適用於治療及/或預防肥胖之方法，其 特徵為，所選擇之化合物係為一種根據申請專利範圍 第7項，被鑒定作為適合之化合物，其擁有在分離哺 乳類動物活細胞之择權酸循環中，減低產生新陳代謝 產物份量之能力。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -21-