KR20030022284A - 비만의 치료 및/또는 예방에 적합한 화합물의 탐색방법 - Google Patents

비만의 치료 및/또는 예방에 적합한 화합물의 탐색방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비만의 치료 및/또는 예방에 적합한 화합물을 찾아내기 위한 방법으로서, 여기에서 포유류 및/또는 인간에 있어서 새로운(de novo) 지방질 생성을 억제하는 시험 화합물의 능력이 측정된다. 비만의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조에 이용되는 화합물로서, 포유류에 있어서 새로운 지방질 생성을 억제하는 능력을 지니고, 중추신경계(CNS)에 대한 직접적인 영향이 실질적으로 없는 화합물의 용도도 또한 기술되어 있다.

Description

비만의 치료 및/또는 예방에 적합한 화합물의 탐색 방법{METHOD FOR LOCATING COMPOUNDS WHICH ARE SUITABLE FOR THE TREATMENT AND/OR PROPHYLAXIS OF OBESITY}
오늘날, 특히 발전된 산업 국가에서 비만이 사람들의 건강에 관하여 더욱더 심각해져가는 문제인데, 이런 비만은 주로 균형없는 과도한 고지방 영양섭취에 의해 야기되며, 과체중인 사람들의 비율(%)의 증가는 비만에 따른 영향의 증가를 동반하는데, 이러한 영향은 개인적 불만으로부터 심장혈관질병 또는 어떤 형태의 당뇨병에 이른다. 그리하여, 이미 많은 수의 비만의 치료 또는 예방을 목적으로한 치료법들이 있다. 한가지 예로 장관(intestinal tract)내에서 지방분해를 감소시키고, 이를 통하여 음식물의 섭취에 따른 에너지수율을 감소시키는 리파아제-억제(lipase-inhibitory) 화합물이 있다. 따라서, 이 치료법에 의하면 최소한 소화지방의 일부가 분해되지 않은 상태로 배설된다. 그러나, 이미 공지된 형태의 치료법을 보완할 수 있는 비만의 치료 및/또는 예방을 위한 다른 새로운 치료법들을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명은 비만의 치료 및/또는 예방에 적합한 화합물을 발견하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 더 나아가서 포유류에 있어서 새로운 지방질 생성을 억제시킬 수 있고, 중추신경계(CNS)에 대한 영향이 실질적으로 없는 화합물의 용도로서, 비만의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에 이용되는 용도에 관한 것이다.
놀랍게도, 포유동물, 특히 인간에 있어서 새로운 지방질 생성을 억제시킬 수 있는 화합물이 비만의 효과적인 치료 및/또는 예방을 위해 훨씬 적합하다는 것을 발견하게 되었다. 특히, 상기 화합물을 장기간, 예컨대 수주일간에 걸쳐서 투여하므로써 좋은 결과를 얻었다.
본 발명의 주제는 비만의 치료 및/또는 예방에 적합한 화합물을 찾아내기 위한 방법으로, 이 방법에 의하면 포유동물, 특히 인간에 있어서 새로운 지방질 생성을 억제시킬 수 있는 화합물들이 선택된다. 또한, 본 발명의 주제는 포유동물에 있어서 새로운 지방질 생성을 억제시킬 수 있고, 특히, 경련억제 효과(anticonvulsant effect)와 같은 중추신경계에 대한 직접적인 영향이 없는 화합물의 용도로서, 비만의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조에 이용되는 용도이다.
새로운 지방질 생성(De novo lipogenesis; 이하 DNL로 약자표시)은 포유류 유기체내에서 탄수화물로부터 내생지방산(endogenous fatty acid)을 합성하는 것을 의미한다고 이해된다. 이 합성반응은 신체세포들의 시토졸(cytosol) 내에서 일어나는 것으로, 소위 시트르산회로(citric acid cycle) 또는 크렙-마르티우스회로(Krebs-Martius cycle)에 기반하고 있다.
내생의 생화학반응인 상기 회로에서, 시트레이트(citrate)는 궁극적으로 탄수화물에서 유래되는 피루베이트(pyruvate)와 비카보네이트(bicarbonate)의 두 성분으로부터 말레이트(maleate), 푸말레이트(fumarate) 및 α-케토글루타레이트(α-ketoglutarate)를 포함하는 다른 중간체들을 거쳐서 합성된다. 시트레이트가 과량으로 합성되면 시트레이트는 중간체인 아세틸-보조효소 A(acetyl-coenzyme A)를 통해 유리지방산(=지질 적종 생성물:lipidic subsequent products)으로 전환될 수 있으며, 유리지방산(free fatty acid)은 지방으로 생성된 다음에 지방세포(adipocyte)내에 저장될 수 있다. 신체세포 내에 지방산으로 부터 생성된 지방의 과도한 저장이 매우 일반적으로 비만을 초래할 수 있다. 다양한 효소들이 시트르산회로에 참여한다. 시트르산회로의 순환횟수는 실질적으로 이용가능한 비카보네이트의 양에 따라서 달라진다. 이용가능한 비카보네이트의 양은 이산화탄소로 부터 생성될 수 있는 속도에 따라 달라진다. 상기 비카보네이트-수율 평형반응은, 소위 말하는 탄산탈수효소에 의해 촉매화 된다. 공지된 탄산탈수효소(carboanhydrase)들과 이들의 동종효소(isozyme)들 가운데서, 주로 아류형(Subtype) Ⅱ(=CAⅡ)와 Ⅴ(=CAⅤ)의 탄산탈수효소 동종효소들이, 포유동물들에서, 시트르산회로를 위한 비카보네이트를 제공하는 반응의 촉매작용에 참여한다. 미토콘드리아내에 존재하는 아류형 Ⅴ의 탄산탈수효소는 특별한 역할을 갖고 있다. 시트르산회로도 또한 미토콘드리아 내에서 작동한다.
포유류동물의 세포들내에서 DNL을 억제하기 위해서는 여러가지로 생각할 수 있는 가능성들이 있는데, 이들의 대부분은 시트르산회로의 순환횟수를 감소시키는 것을 목적으로 한다. 이는 지방산의 합성에 이용될 수 있는 과도한 양으로 제조된시트레이트의 농도를 줄일 수 있게 한다. 본 발명에 따라서, DNL은 시트르산회로에 사용되는 비카보네이트의 생성반응을 촉매하는 탄산탈수효소를 억제시키므로써 바람직하게 억제될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 바람직하게는 아류형Ⅱ 및/또는 Ⅴ, 특히 바람직하게는 CA Ⅴ의 탄산탈수효소를 억제시킬 수 있다.
탄산탈수효소를 비특이적으로 억제시킬 수 있는 화합물(=비특이적 또는 통상적인 CA 억제제들)은 그 자체로 공지되어 있으며, 주로 이뇨 또는 안과학의 여러가지의 치료분야에서 꽤 오랜 기간동안 사용되어 오고 있다. 이러한 통상적인 CA 억제제들의 용도에 관한 분야의 조사는, 예컨대 C.T. Supuran, Expert Opinion on Therapeutic Patent,10(5) (2000) 575-600에서 발견할 수 있다. 반면에, "특이적인 CA 억제제(Specific CA inhibitors)"는 주로 단지 하나의 CA 아류형(예, CAⅤ) 또는 CA 아류형들의 규정된 그룹을 억제하는 화합물들을 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 비만의 특이적인 치료 및/또는 예방을 위한 통상적인 CA 억제제들의 용도는 공지되지 않았다.
아주 많은 경우의 비만은 일반적으로 음식물 섭취할 때 비교적 과도한 비율의 외생적 지방(exogenous fat)에 기인하는 것으로 인정된다. 미국과 같이 고도로 발전된 국가에서 비만인 사람들에 의해 소비되는 음식물의 30%가 지방의 형태이다. 통상적인 지식에 따르면, 비만을 초래하는 지방산의 축적은 주로 소화지방(alimentary fat)의 과도한 섭취로부터 유래된다. 이는 탄수화물 대사작용을 목표로 하는 DNL의 억제에 의해서는 영향을 받을 수가 없다.
따라서, 지방세포 내에서 지방산 저장의 감소가 DNL억제에 의해서도 이루어진다 할지라도, DNL억제는 신체 세포들내에서 지방산의 저장에는 본래부터 조금만 기여하기 때문에, 지금까지 인간의 비만을 치료 및/또는 예방하기 위한 출발점으로는 부적당한 것으로 간주되어 왔다. 이 주제에 대해 전문가들에 의해 발표된 의견들의 요약을, 예컨대 M.K. Hellerstein, European Journal of Clinical Nutrition53(1) (1999) 53-65 에서 발견할 수 있다. 전문가들 사이에서 일반적인 이같은 견해는, 지금까지도 DNL억제 원리에 기초를 두고 있거나, 이들의 개발 원리에 기초를 두고 있는 비만의 치료 및/또는 예방을 위한 약제들에 대한 특별한 연구에 방해가 되고 있다.
본 발명의 관점에서, 포유동물, 특히 인간에서 DNL을 억제할 수 있는 화합물은 비만의 치료 및/또는 예방을 위해 효과적이며, 특히 이 화합물을 6주 이상의 연장된 기간에 걸쳐서 대상 환자들에 투여시에 효과적임을 알게 되었다. 따라서, DNL 그자체가 지방세포 내에 저장된 체지방에 비교적 조금 밖에 기여하지 못할 지라도 DNL억제에 의해 연장된 기간동안 비만인 사람들의 상당한 체중감소가 이루어질 수 있다. 따라서, 연장된 기간에 걸친 DNL억제에 의하여 이 같은 고유의 작은 효과가 축적되어, 결과적으로 체중감소에 상당히 기여하게 된다.
예컨대 화합물 토피라메이트(topiramate)를 사용하므로써, 본 발명에 따른 방법이 비만의 치료 및/또는 예방을 위해 적합한 화합물을 특이적으로 발견하기에 적합하다는 것을 알 수 있다. 토피라메이트는 EP O 138 441 A2로 부터 공지된 간질병 약이다. 토피라메이트는 또한 작용에 있어 다인성 약리학적 스펙트럼(multifactorial pharmacological spectrum)을 가지고 있는 것으로 알려져있다. 따라서, 토피라메이트는 긴장상태에 의존(tension-dependent)하는 나트륨채널(sodium channel)을 막을 수 있기 때문에, 세포들의 막전위(membrane potential)를 안정화할 수 있고, GABA 수용체들을 활성화 하여, GABA-매개의 억제활동을 향상시키고, 탄산탈수효소 억제제로서 작용하며, 마지막으로 AMPA/카이네이트 수용체, 글루타메이트 수용체의 아류형을 억제할 수 있기때문에, AMPA-유도된 흐름(flow)이 나타나는 것을 억제시킨다. 따라서 토피라메이트는 CNS에 대한 뚜렷한 효과를 나타낸다. 토피라메이트의 항-간질병 성질이 상술한 약물학적으로 관련된 요인들에 기여할 수 있는지에 대해서는 알려지지 않고있다.
WO 98/00130으로 부터, 토피라메이트는 또한 비만 치료에 적합한 약물학적 성질들을 가지고 있음이 알려져 있다. 이 성질들은 간질병 환자들에 대한 장기간에 걸친 연구의 부수적인 효과로서 우연히 발견되었다. 간질병 환자들에서 관찰된 체중감소가 토피라메이트의 약물학적 성질때문인지는 아직까지도 알려진 바 없다. 토피라메이트는 WO 98/00130에 설명된 비만의 치료를 위하여 적합한 일반식 Ⅰ의 경련억제 화합물 그룹의 하나이다.
본 발명의 방법에 의하면 토피라메이트는 효능있는 CA 억제제이며, 특히 포유동물들에서 존재하는 아류형 Ⅱ와 Ⅴ의 탄산탈수효소에 대한 강력한 억제제이고, 토피라메이트는 포유동물 세포들내에서 DNL을 효과적으로 억제시킬 수 있음을 보여줄 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 지금까지 설명할 수 없었던 간질병 환자들에서 체중손실을 초래케하는 토피라메이트의 약물학적 부수 효과가 포유동물들에서 DNL을 효과적으로 억제시킬 수 있는 능력에 실질적으로 기초를 두고 있음을처음으로 밝혔다. 따라서, 본 발명에 따른 방법에 의해 미래에 비만의 치료 및/또는 예방을 위하여 적합한 화합물들을 발견할 수 있을 것으로 기대된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은, DNL억제의 원리에 따라서 작용하는 약물학적으로 효능이 있는 화합물을 보다 빠르고 쉽게 발견할 수 있는 가능성을 처음으로 열었다. 본 발명에 따르면, 상술한 원리에 따라서 작용할 뿐 아니라 비만의 치료 및/또는 예방을 위하여도 적합한 화합물을 실험동물 실험과 같이 많은 시간과 비용이 필요한 생체내 실험 없이, 최소한 일차적인 예비선택법으로 선택할 수 있다.
토피라메이트의 약물학적 성질에 관심을 가지고서 행해진 초기의 연구들에서 CA-억제 활성도가 항상 보통수준이거나 상당히 작았고, 치료적 중요성이 없었기 때문에(예를 들면, B.E. Maryanoff등, 의료화학지30(1987) 880-887 ; B.E. Maryanoff 등, 의료화학지41(1998) 1315-1343 ; S.J. Dodgson 등, Epilepsia41(1) (2000) P.35-P.39), 이 결과들은 놀라운 일이다. 상술한 초기의 연구에서, 토피라메이트의 CA-억제 활성도는 항상 다양한 포유동물들로 부터의 CA를 포함한 시험 용액(test solution)을 사용하여 결정되었는데, 이 용액에는 혈액 또는 기관조직과 같은 여러가지 신체성분들이 여전히 포함되어 있었다.
본 발명에 따른 방법의 첫번째 구체예에서, 비만의 치료 및/또는 예방을 위해 적합한 화합물은 포유류 동물들에서 존재하는 최소한 하나의 탄산탈수효소의 활성을 억제시키는데 적합한 화합물들을 선택하므로써 발견할 수 있다. 예를 들면, 최소한 하나의 시험용 화합물을 최소한 하나의 탄산탈수효소와 접촉시키고, 그리고 나서 최소한 하나의 탄산탈수효소의 활성을 억제시키는 화합물을 공지된 방법으로확인할 수 있다. 이 구체예에서는 사람 또는 설치류동물, 예를 들면, 쥐, 마우스 또는 기니아-피그와 같은 포유류동물들에 존재하는 탄산탈수효소, 특히 아류형 Ⅱ 및/또는 Ⅴ의 탄산탈수효소를 사용하는 것이 바람직하다. 특히 사람에 존재하는 탄산탈수효소를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 적합한 탄산탈수효소는 상술한 포유류들로부터 분리할 수 있고, 원한다면 정제할 수 있으며, 또한 이들을 바람직하게는 그 자체로 공지된 화학적 또는 생물공학적 방법에 의해 제조할 수 있다.
이와 같은 첫번째 구체예의 바람직한 변형에서, 시험용 화합물들의 영향하에서 탄산탈수효소들의 활성 변화는 공지된 생체외 효소활성 시험법으로 결정될 수 있으며, 이때 탄산탈수효소는 최소한 실질적으로 불순물들이 유리된 분리된 효소로서 존재한다. 탄산탈수효소들은, 특히 순수한 형태로 사용될 수 있다는 점 때문에, 화학적 또는 생물공학적 방법으로 제조된 탄산탈수효소를 사용하는 것이 바람직하다. 탄산탈수효소의 활성도를 결정하기 위한 생체외 활성 시험은 그 자체가 공지되어 있다. 본 발명의 범위내에서 탄산탈수효소의 활성 변화를 결정하는데 적합한 생체외 효소활성 시험법은 예컨대, 탄산탈수효소들의 영향하에서 pH값의 변화를 측정하는 것(K.M. Wilbur, N.G. Andersen, 생물화학지.176(1948) 147-154 ; G. Sanyal, T.H. Maren, 생물학지256(1981) 608-612), 정지-흐름-측정법(R.G. Khalifah, 생물학지246(1971) 2561-2573), 또는 4-니트로페닐아세테이트-에스테라제법(Y. Pocker, J.T. Stone, 미국화학회지87(1965), 5497-5498)이다. 후자의 시험법에서는, 조사연구될 탄산탈수효소들의 영향하에서 4-니트로페닐아세테이트의 가수분해 속도가 결정되고, 여기에서 에스테르분해효소(esterase)로도 작용할 탄산탈수효소의 성질이 이용된다.
이와 관련하여, 본 발명에 따르면, C.T. Supuran 등, 유럽 의료화학지33(1998) 577-594(특히 p. 592; 이하 "Supuran 등"으로서 인용됨) 또는 A. Scozzafava 등, 의료화학지42(1999) 3690-3700(특히 p. 3697 ; 이하 "Scozzafava 등"으로 인용됨)에 기재된 화합물들의 CA-억제 성질들을 결정하기 위한 시험방법이 가장 적합하다. 본 발명의 개시의 범위내에서, 상기 Supuran 등과 Scozzafava 등에 의해 기술된 시험방법은 참고로 언급된다. 상술한 Supuran 등 또는 Scozzafava 등에 따른 생체외 표준활성 시험중의 한가지 시험에서 최소한 10㎛ol/ℓ 또는 그 이하의 IC50값(=더 높은 활성도)을 갖는 화합물들은 본 발명의 관점에서 적합한 CA-억제 화합물(= CA 억제제)로서 선택될 수 있다. 인간 CA 아류형의 활성도가 결정되면, 4-니트로페닐아세테이트-에스테라제 방법 이외에 다른 방법이 더 적합할 수도 있다. 특히, 더 신속한 반응을 가능하게 하는 방법이 적합할 수 있다.
본 발명에 의하여, Scozzafava 등(상기 참고)에 의해 개시된 4-니트로페닐아세테이트-에스테라제법에 따라서 수행되는 효소활성 시험에서(최초로 Y. Pocker와 J.T. Stone에 의해 개시됨, 생화학지6(1967) 668-678), 토피라메이트는 생물공학적 방법으로 얻은 아류형 Ⅱ의 인간 탄산탈수효소에 대해 뚜렷한 억제작용(IC50= 5nmol/ℓ)을 갖고 있음이 입증되었으며, 이 억제작용은 참고물질로서 측정한 통상적인 CA 억제제인 아세타졸아미드(acetazolamide) 또는 메타졸아미드(methazolamide)에 의해 야기된 억제작용 보다 훨씬 더 강함이 입증되었다. 아류형 Ⅱ의 인간 탄산탈수효소는 Scozzafava 등에 의해 기술된 방법에 따라서 얻어졌다.
동일한 시험에서, 토피라메이트는 또한 생물공학적 방법으로 얻은 쥐의 아류형 Ⅴa의 탄산탈수효소(= mCA Va)에 대하여 뚜렷한 억제작용(IC50= 74nmol/ℓ)을 갖고 있음이 입증되었다. Scozzafava 등에 의해 기술된 시험법의 개시에 있어서, 효소 mCA Va가 120nM의 농도로 사용된다.
mCA Va는 H.R. Heck 등, 생화학지269(1994) 24742-24746에 개시된 공지방법에 따라 수득됐다. 이를 위하여, 박테리아 E.coli( Escherichia coli ) BL 21(DE3)의 균주가 사용됐으며, 이는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)로 유도될 수 있는 T7 프로모터의 조절하에서 mCA Va를 코딩하는 서열을 함유하는 플라스미드 벡터와 함께 사용되었다. 세균배양은 앰피실린을 함유하는 Luria-Bertani 액체 배지내 37℃에서 교반하여 접종했으며, 이의 성장은 600nm에서 광분석법(spectrophotometry)으로 모니터되었다. 세균배양이 지수성장상태가 되었을때, IPTG를 최종농도 1mmol/ℓ로 첨가하였다. 3시간 항온처리후에(37℃ 교반), 세균 배양액을 7000 ×g로 15분간 원심분리하고, 상등액을 버렸다. 이렇게 얻은 펠릿(pellet)을 두번 증류한 0.1부피의 물에 넣고, 여기에 리소자임(100㎍/㎖)을 첨가했다. 초음파 처리하에서 세포분해가 발생했다. 이를 위하여, 결과로 얻은 세균 현탁액을 10㎖ 분량씩 위가 개방된 유리용기속에 붇고, 이 시료 각각을 초음파로 3분간 4회 처리했다. 각각의 초음파 펄스(ultrasound pulse) 처리 후에, 시료의 흡수율을 600nm에서 결정하고, 이를 위해 시료 각 100㎕를 두번 증류한 900㎕의 물로 희석했다. 종말점은 시료의 600nm 흡수율값이 최초값의 약 1/10일때 도달했다. 일단 세포분해작용이 일어나면, CaCl2-결합용 완충액(Stratagene)을 첨가하고, 그로부터 얻은 세포분해생성물을 정제하기 위해 칼모듈린 친화성 수지 컬럼에 부었다. 정제는, 발현된 mCA Va 단백질의 N-말단에 존재하는 칼모듈린 결합용 펩티드 택(tag)에 대한 수지에 결합된 칼모듈린 도메인의 높은 친화성에 기초를 두고 있다. 정제는 공지된 방법으로 실시됐다(매뉴얼 "Affinity LIC Cloning and Protein Purification Kit Manual" from Stratagene).
본 발명에 따른 방법의 두번째 구체예에서, 분리된 포유류 생세포들의 시트르산회로에서 생성된 대사생성물 또는 시트르산회로의 지질 적종 생성물의 양을 감소시킬 수 있는 화합물을 선택하므로써 비만의 치료 및/또는 예방에 적합한 화합물을 발견할 수 있다. 시험 화합물들의 영향하에서 측정할 수 있을 정도로 그 양이 감소되는 적합한 시트르산회로의 대사생성물은 시트레이트, 말레이트, 푸마레이트, 및/또는 α-케토글루타레이트와 같은 산-가용성 대사생성물들이다. 시트레이트가 바람직하다. 또한 유리지방산과 같은 시트르산회로의 지질 적종 생성물들이 대사생성물로서 적합하다. 마지막으로, 이 두번째 구체예에서 사용된 시험 모델이 위에서 언급한 첫번째 구체예와는 상이하게 준비되었다 하더라도, 포유동물에 존재하는 최소한 하나의 탄산탈수효소의 활성을 억제할 수 있는 시험 화합물의 능력이 또한 결정된다. 두번째 구체예의 방법은,14C-동위원소로 라벨링된 시트르산회로의 기질로부터, 분리된 포유류동물 생세포의 시트르산회로의 대사 중간 생성물 또는 적종생성물로의 방사능의 흡수를 공지된 방법으로 결정하고, 그 결과를 CA-억제 화합물들의 영향하인 것 이외에 다른 조건들은 동일한 조건 하에서 얻은 결과들과 비교하는 원리에 기초를 두고 있다. 바람직하게 쥐, 마우스 또는 기니아-피그와 같은 설치류동물 또는 인간의 분리된 생세포는 상기와 같이 변형된 방법에 사용된다. 인간의 세포가 바람직하다. 만약 설치류 동물의 세포가 사용되면, 이들은 지방세포(adipocyte) 또는 간세포(hepatocyte)일 수 있다. 설치류의 지방세포가 바람직하다. 만약 인간세포가 사용되면, 지방세포 또는 간세포가 사용될 수 있다. 인간 간세포가 바람직하다. 이러한 변형된 방법에 사용되는 포유류세포는 통상적인 배양법 및/또는 클로닝법에 의해 얻어질 수 있다. 천연의 또는 생물공학적으로 변형된 포유류세포가 사용될 수 있다. 만약 시트르산회로의 산-가용성 중간생성물내에서의 방사능의 흡수가 결정될 수 있다면, 바람직하게는14C-수소 카보네이트(= NaH[14C]O3)가14C-라벨된 기질로서 사용된다. 만약 시트르산회로의 지질 적종 생성물에서 방사능의 흡수가 결정될 수 있다면, 바람직하게는 [U-14C]글루코스가14C-라벨된 기질로서 사용된다.
포유류에서 DNL을 억제하는 화합물들의 능력을 결정하기 위한 이 두번째 구체예의 바람직한 변형은, S.A. Hazen 등의 FASEB Journal10(4),(1996) 481-490(이하 "Hazen 등"으로 인용됨)에 개시되어 있다. 본 발명의 개시의 범위내에서,Hazen 등에 의해 기술된 상술한 시험법은 참고로 언급된다. Hazen 등에 따른 상술한 시험법에서, 시트르산회로에서 전구체(precursor)로서 역할을 할 수 있는14C-라벨된 물질로 부터 방사능의 혼입을 현저하게 억제하는, 예를 들면,14C-비카보네이트의 시트레이트, 말레이트, 푸마레이트 및/또는 α-케토글루타레이트로의 혼입을 억제하며, 최소한 10㎛ol/ℓ또는 그 이하의 IC50값(=더 높은 활성도)을 갖는 화합물은 본 발명에 의해 적합한 화합물로 선택될 수 있다.
본 발명의 범위 내에서 실시된, Hazen 등에 의해 기술된 내용에 상응하는 시험모델에서, 토피라메이트는 생물공학적 방법으로 얻은 3T3-F442A 세포주인 쥐 지방세포의 시트르산회로의 산-가용성 대사생성물의 생성에 대하여 뚜렷한 억제 효과를 나타냈다. 토피라메이트의 이같은 억제효과(IC50=348 nmol/ℓ)는 참고물질로서 측정한 통상적인 CA 억제제 에톡스졸아미드(ethoxzolamide)의 효과보다 더 뚜렷했다.
본 발명에서 비만의 치료 및/또는 예방에 적합한 화합물을 발견하기 위한 방법의 특히 바람직한 변형에서, 상기 방법의 상술한 첫번째 구체예, 특히 상술한 생체외 효소활성 시험에 있어서, 포유류에 존재하는 최소한 하나의 탄산탈수효소를 억제하는데 적합한 것으로 선택되어지고, 또한 부가적으로 상술한 두번째 구체예에서, 분리된 포유동물 생세포의 시트르산회로에서 생성된 대사생성물의 양을 감소시키기 위해 적합한 화합물이 선택된다. 상기 방법의 첫번째의 구체예에서, 포유동물에 존재하는 탄산탈수효소를 억제하는 화합물들의 능력이 신속하고 효과적으로 체크될 수 있다. 상기 방법의 두번째 구체예는 특히, 연구되는 화합물이 CA V가 위치하고 있는 포유류 생세포의 미토콘드리아를 또한 침투할 수 있는지 여부의 단서를 제공한다. 적합한 화합물들은 첫번째와 두번째의 상술한 구체예들을 동시에 또는 연속적인 순서로 실시하므로써 선택가능하다.
본 발명에 따르면, 포유류에서 DNL을 억제할 수 있는 화합물은 비만의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에 적합하다. 여기에서 선택된 화합물들은 포유류에 존재하는 최소한 하나의 탄산탈수효소를 억제할 수 있는 것들이다. 물론, 선택된 화합물들은 생리학적으로 허용가능하며, 약제학적 활성물질에 대한 일반적인 요건들, 예를 들어 안전성과 적합성을 충족시킬 수 있어야 한다. 포유류에 존재하는 아류형 Ⅱ 및/또는 Ⅴ의 탄산탈수효소들을 억제할 수 있는 화합물을 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 바람직한 화합물은 CA Ⅱ 및/또는 CA Ⅴ, 특히 CA Ⅴ를 억제할 수 있는 것이다.
이전에 알려진 화합물로서, 예컨대 토피라메이트와 같이 장기투여 되고나서 환자의 체중 감소를 일으키는 CA-억제 효과를 가진 화합물은 또한, 중추신경계에 대해 직접 작용하는 명백한 효과, 예컨대 경련억제(anticonvulsant) 효과를 갖는다. 중추신경계에 대한 직접적인 부작용은, 비만의 치료 및/또는 예방을 목적으로 장기 투여할 의도를 지니는 화합물들에게는 종종 바람직하지 않다. 그러므로, 본 발명에 따라 상기 언급된 방법에 의해 비만의 치료 및/또는 예방에 적합하다고 선택된 화합물은, 부가적으로 중추신경계에 대한 직접적인 영향들을 시험해 볼 수 있다. 예를 들면, 그 화합물들은 존재할 수도 있는 어떤 경련억제 성질들에 대해서 시험해 볼 수 있다. 화합물들의 경련억제 성질을 시험하는 적절한 방법의 예로는, G. Chen 등, Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine87(1954) 334-339 (이하 "Chen 등"으로 인용)와 J.E.P. Toman 등, Journal of Neurophysiology9(1946) 231 (이하 "Toman 등"으로 인용)에 의한, 소위 "초극대 전기충격 시험(supramaximal electroshock test)"(= SES 시험, 때로는 "극대 전기충격 시험(maximal electroshock test)" 또는 MES 시험이라고도 한다)이 있다. 본 발명의 범위 내에서, Chen 등과 Toman 등에 기술된 상기 시험법에 따라 특별 기준이 만들어진다. 따라서, 환자에게 장기간에 걸친 투여를 통해 비만의 치료 및/또는 예방을 목적으로 하는 화합물들은 상기 언급된 Chen 등과 Toman 등에 따른 SES 시험에서 심지어 최소한 100 mg/kg p.o.보다 높은 투여량에도 불구하고, 이 시험에 전통적으로 적용되는 기준에 의할 경우 의미있는 것으로 간주될 만한 효과가 전혀 없어야 한다(즉, G. Chen 등에 따른 방어량(protective dose)인 PD50≥100 mg/kg p.o.; G. Chen 등에 따른 PD50값은 여기에서는 실질적으로 최소유효량(minimum effective dose, MED)으로서 보다 더 일반적인 투여량 표시에 해당한다). 상기 언급된 화합물 탐색 방법에서 적합하다고 선택되고, 게다가 상기 언급된 Chen 등에 따른 MES 시험에서 실질적으로 효과가 없는 화합물이 특히 비만의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조에 적합하다. 상기 SES(또는 MES) 시험들은 표준적인 약리학 시험들이고, 적절한 서비스 제공자들(예컨대, "Panlabs")에 의한 일상적인 방법에의하여 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해 비만의 치료 및/또는 예방에 적합한 것으로 발견된 화합물들은, 예컨대 정제, 캡슐, 좌약 또는 용액과 같이 일반적으로 생약 제제에 있어서 전통적인 제약 보조 물질들과 함께 의약들로서 함유될 수 있다. 이러한 생약 제제는 원래 통상적인 고체 또는 액체 부형제, 예를 들면 유당, 녹말이나 활석 또는 액체 파라핀을 그 자체로 사용하는 방법 및/또는 전통적인 제약 보조 물질, 예를 들면 정제 분해 물질, 용해제 또는 보존제를 사용하는 방법으로 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예컨대 본 발명에 따른 적합한 약제학적 제제는 또한 EP 0 138 441 A2와 WO 98/00130으로 부터 알려져 있다.

Claims (19)

  1. 포유류, 특히 인간에 있어서 새로운 지방질 생성을 억제할 수 있는 화합물들을 선택하는 것을 특징으로 하는, 비만의 치료 및/또는 예방에 적합한 화합물의 탐색 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 적합한 것으로 선택된 화합물은 포유류에 존재하는 최소한 하나의 탄산탈수효소의 활성을 억제할 수 있는 것임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 최소한 하나의 화합물을 최소한 하나의 탄산탈수효소와 접촉시키고, 최소한 하나의 탄산탈수효소의 활성을 억제하는 화합물들을 동정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 탄산탈수효소는 설치류 또는 인간에게 존재하는 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 탄산탈수효소는 인간에게 존재하는 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 2항에 있어서, 포유류, 특히 인간에게 존재하는 아류형 II 및/또는 V 의탄산탈수효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 포유류, 특히 인간에게 존재하는 아류형 V 의 탄산탈수효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 3항에 있어서, 상기 탄산탈수효소는 화학적 또는 생물공학적 방법으로 얻어진 분리된 효소들로 존재하며, 상기 화합물들의 영향하에서의 상기 탄산탈수효소의 활성 변화는 생체외 효소활성 시험으로 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 적합한 것으로 선택된 상기 화합물은 분리된 포유류 생세포의 시트르산회로에서 생성되는 대사생성물의 양을 감소시키는 능력을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 화합물들의 영향에 의한, 세포의 시트르산회로에서 생성되는 시트레이트, 말레이트, 푸마레이트 및/또는 α-케토글루타레이트의 양의 감소 및/또는 시트르산회로의 지질 적종 생성물들의 생성의 감소를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 설치류 또는 인간의 분리된 생세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 지방세포 또는 간세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 8항의 방법 및 부가적으로 제 9항의 방법에 의해서 적합한 화합물들로 판명된 화합물들을 선택하는 것을 특징으로 하는, 비만의 치료 및/또는 예방에 적합한 화합물의 탐색 방법.
  14. 제 1항의 방법에 의해서 적합한 화합물들로 판명되고, 또한 경련억제 성질의 측정을 위한 표준 시험에서 실질적으로 효과가 없다고 판명된 화합물들을 선택하는 것을 특징으로 하는, 비만의 치료 및/또는 예방에 적합한 화합물의 탐색 방법.
  15. 비만의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조에 사용되는, 포유류에 있어서 새로운 지방질 생성을 억제할 수 있는 화합물의 용도.
  16. 제 15항에 있어서, 포유류에 존재하는 최소한 하나의 탄산탈수효소를 억제할 수 있는 화합물의 용도.
  17. 제 15항 또는 제 16항에 있어서, 포유류에 존재하는 아류형 II 및/또는 V의 탄산탈수효소를 억제할 수 있는 화합물의 용도.
  18. 제 15항에 있어서, 실질적으로 경련억제 성질이 없는 화합물의 용도.
  19. 비만의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조에 사용되는, 비만의 치료 및/또는 예방에 적합한 것으로 제 1항의 방법에 의해 최초로 판명된 화합물의 용도.
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