TWI267515B - Compounds capable of cleaving double-stranded DNA and method of utilization of the same - Google Patents

Description

1267515 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（1 ) [技術領域] 本發明係有關可將雙鏈DNA同時烧化並切斷之化合 而該化。物係由化學合成所製得者使用該等化 將雙鏈醒燒化及切斷之方法、以及使用該等化合物之 醫藥組成物。 [技術背景] 藉由人類基因組計劃’吾人「生命之設計圖」之全遺 傳基因之鹼基序列於數年内即將被解明。 該設計圖上若有先天缺陷或後天傷害則將引起疾病或 老化等狀況已然週知。由於人類基因組計劃之進展而能以 DNA層次瞭解包括癌症之多樣疾病，咸認為係可使以診 斷、預防等為主之醫學整體發生革命性變化。此外，有關 對上述疾病以DNA層次之瞭解為基礎之治療法，亦即開 發針對以病因之遺傳基因或其產物為標的之醫藥品亦深受 期盼，然而將基礎研究活用於臨床研究間之相互連接研究 則才剛剛起步。現今，所使用之抗癌劑大多為經篩選之抗 生物質，並非原本為了殺滅癌細胞之目的而由微生物產生 者，而基於對癌之分子生物學之發現者幾乎沒有。一般認 為若能自細胞外自由地控制細胞内特定遺傳基因之表現， 則可演變成為根本之遺傳基因層次治療法。 本案發明人等，近來對與抗生物質弟歐卡黴素 (Deukamycin)或弟斯黴素（Desmycin)等他類分子形成雜雙 體（Heterodimer)具協同作用之DNA分子進行識別，發現弟 歐卡黴素單獨存在時可有效率的將不同之驗基序列烷化 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 311254 ------^--------訂---------線 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 1267515 A7

五、發明說明（2 ) (Proc· Matl· Acad· Sci. USA 93, 14405, 1996)。基於此結果 以弟歐卡黴素之烷化部分作為DNA識別部位與吡咯咪唑 聚醯胺結合，而成功地合成了可依任意之鹼基序列將DNA 選擇性烷化之分子，而完成本專利申請案（日本特願平10_ 260710 號）。 然而，僅以弟歐卡黴素之烷化部分作為DNA識別部 位與吼洛咪嗤聚醯胺結合之化合物，其烷化能力並不充 分’該化合物係能識別單鏈之驗基序列。 因此，本案發明人等以上述化合物分子動力學等之電 腦模擬對該等分子與DNA之烷化進行詳細檢討，而確認 了經由在弟歐卡黴素具反應性之環丙烷部分（片斷A)導入 乙烯基等連接子，可望增加對DNA之烷化能力。 [發明之揭示] 本發明係提供烷化能力增強之DNA烷化劑。此外， 本案發明人於此研究中主張本發明之烷化劑係作用如雙 體，並發現其可將雙鏈DNA同時烷化及切斷，亦發現其 對特定之鹼基序列具有人工限制酶之作用。 請 先 閱

面 - 之1 注 I

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經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 因此’本發明係提供可將雙鏈DNA同時烷化及切斷 之新穎化學品，另亦提供使用此化學品將DNA烷化及切 斷之方法。 又’本發明亦提供使用上述化合物之抗癌劑。 [圖面之簡單說明] 第1圖示本發明之ImPyLDu86與DNA之反應結果， 係以照片代替圖面。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) 2 311254

經 濟 部 智 慧 財 產 局 消 費 合 作 社 印 製 1267515 五、發明說明（3 第 2 ' 圖不實驗中所用DNA之鹼基序列及ImPyLDu 86 之化學構造。 第 3 圖不以本發明化合物對DNA切斷區域之模式。 [實施本發明之最佳形態] 本發明係有關可將DNA之雙鏈同時切斷之化合物， 該化合物係式（I)所示之化合物：

B^L-A (I) ，中，B不可識別DNA鹼序列之化學構造，A示可與DNA 之種鹼基結合之化學構造，；l示能使人及6之化學構 結合之連接子）。 ^ 又’本發明又有關使用上述化合物將雙鏈Dna之特 定鹼基序列部分烷化之方法、以及將雙鏈DNA之特定鹼 基序列部分切斷之方法。 此外’本發明亦有關使用上述化合物之醫藥組成物， 特別是抗癌劑。 本發明之上述式（I)中，可識別DNA鹼基序列之化學 構造部分B，係以由可具有取代基之吡咯及/或咪唑衍生而 得之化學構造為佳。吡咯及咪唑之取代基並無特殊限制， 只要不妨礙對DNA鹼基序別之識別者即可，例如可例舉 如碳數1至10,較好為1至5之直鏈成分枝狀烷基、由上 述烷基衍生之烷氧基、羥基、胺基、由上述烷基衍生之N_ 烷基取代之胺基、由有機羧酸衍生之N-醯基胺基、脈基、 經取代之胍基等。例如，N-甲基吡咯、N-甲基味唾、至 基吡咯、N-甲基-3-羥基吡咯等。 -------1---.-----------訂---------線· C請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁} 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 3 311254 1267515 A7 ----------B7__ 五、發明說明（4 ) 又’可識別DNA鹼基序列之化學構造部分b，更具體 而言以吡咯咪唑聚醯胺之結合為佳。吡咯及咪唑之長度（個 數）並無特別限制，約為2至10個，以2至5個程度為佳。 可與DNA之一種鹼基結合之化學構造部分A，係以具 有％丙烷化學構造者為佳，以弟歐卡黴素之烷化部分 佳。 可使A及B二種化學構造結合之連接子部分l，以可 將片斷A及片斷B間隔以適當距離，且不損失燒化活性者 為佳。較佳之具體例可例舉如含乙烯基之化學構造。 式（I)所示之本發明化合物較佳為可例舉如下式所示 之化合物（下文稱為「PyPyLDu86」）： ------rir — 4-------- tr---------線 C請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 或下式所示之化合物（下文稱為「ImPyL〇u 86」）：CH^ 〇 CHa COOCH3 本紙張㈤(CNS)A4規格(21〇 x 297公釐） 4 311254 1267515 A7 B7 五、發明說明（6 ) 乙酸酯及NaH之處理、d)示水-甲醇中之氳氧化鈉之處理、 ❻）示DMF中以1，1-羰基二咪唑之處理、f)示於DMF中使 用風化納對Du 86片斷A之處理。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 檢視如此a成之PyPyLDu 86及imPyLDu 86與DNA 之反應性。使用ImPyLdu 86之烷化結果示於第ι圖。該 實驗中所使用之DNA及ImPyLDu 86示於第2圖。 右側之電泳圖為雙鏈DNA上鏈之結果，右側之電泳 圖為下鏈之結果。、經由加熱切斷之部分可發現燒化之位 置。由此結果可知低濃度時主要係在雙鏈dna之區域工 及區域2將雙鏈切斷，而判斷燒化反應係雙鍵同時發生。 引起此種切斷方式之化合物尚未有前例，真正可謂係人工 限制酶。X由所使用ImPyLDu86i量引起7〇%高效率之 切斷一事判斷，與以往合成之分子（參照日本特願平1〇_ 260710號）相比較確認有非常高之效率。 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 雙鏈同時發生烷化之原因’如第3圖所示，咸認係藉 由ImPyLDu 86形成雙體之連接子部分與咪唾可有效堆疊 而識別GC鹼基對，該物與雙鏈DNA之識別序列選擇性丨结 合而引起者。由此結果可知藉由分子設計所建議導入之連 接子，係可提高其反應性，或亦可作為咪唑與鹼基對之識 別單位。基於以上發現可謂向著以DNA之特定序列為標 的之新型遺傳基因治療藥之分子設計又踽近一步。 繼之，依據本發明化合物之上述性質檢討抗細胞活 性。亦即’對有關本發明之PyPyLDu 86、ImPyLDu 86及 作為抗癌劑之週知第歐卡黴素八對HeLaS3細胞（子宮頸； 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格⑵〇 x 297公釐）— 6 311254 1267515 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（7 ) 扁平上皮癌細胞）之抗細胞活性進行試驗。結果示於表1。 由此結果可確知本發明之化合物與弟歐卡黴素A相較其活 性為約3至7倍。 本發明之化合物係作為抗癌劑有用之物，可與製藥上 容許之醫藥載劑共同作成醫藥組成物。本發明之醫藥組成 物可藉由經口或非經口方式及視症狀而投藥。本發明醫藥 組成物之有效投藥量係依據患者之狀態及症狀等，一般係 於至100mg/kg/曰之範圍内適當加以選擇。又，本發 明之醫藥組成物可依據常用方法製劑化成為注射劑等。 [實施例] 下文以實施例具體說明本發明，但本發明並非受限於 此等實施例。 以下實施例中所使用試藥之簡稱如下述。 DIEA : Ν,Ν-二異丙基乙胺、 DMF : N，N-二甲基甲醯胺、 THF :四氳呋喃、 BOP :苯並三唑-^基氧基三（二甲基胺基）鱗、六氟磷 酸鹽。 以下實施例中，反應之進行係使用〇.25mm矽膠60平 板進行薄層層析（TLC)以254nm之螢光指示劑（默克（Merck) 社製）進行追蹤。以UV觀察TLC平板。 NMR圖譜係以四甲基矽氧烷為内標準，以ppm表示 々·NMR圖譜之化學位移。 EI(電子衝撞）質譜係使用JNM-AX 505，ESIMS(電子 不、、民浪尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 311254 -------l---.--------- (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) --訂---------線_ 1267515 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（8 ) 噴濺解離質譜）係使用PE SCIEX API 165測定之。

Ex Taq DNA聚合酶與遽管（Suprec-02)係購自寶酒 造’熱序列酶核心定序組套（thermo sequenase core sequencing kit)與負載色素（富辛紅之DMF溶液）係購自阿 馬廈穆公司’ 5-内德州紅（endotaxasred)修飾之DNA聚合 物（1 8體）係購自倉紡公司，50%廣區域（Longranger，商品 名）膠溶液係講自FMC Bioproduct公司。 聚丙烯醯胺膠體電泳係使用日立5500-S DNA定序儀 進行。 實施例1 :化合物2a(X=N)之製造 於 THF 30ml 中添加化合物 la 204.8mg(0.67mmol)、 BOP 326.3mg(0.74mmol)170ml、NaBH4 98mg(2.59mmol)。 該反應溶液於室溫下反應3小時後，減壓餾除溶劑所得之 殘渣中添加CH3OH 20ml與水5ml。將該溶液攪拌1小時， 獲得透明之溶液。減壓下餾除溶劑，黃色殘渣使用ch3oh 及CH2C12以快速層析法纯化獲得收量92.6mg之目的化合 物2a，收率為47.4%。 XH NMR (DMSO-d6) 6 10.24(s? 1H)? 9.62(s? 1H)? 7.38(s? 1H)? 7.10(d? J=2.0Hz? 1H)? 6.09(d? J=2.0Hz, 1H)9 4.86(t? J=5.5Hz? 1H)? 4.34(d5 J=5.5Hz9 2H)? 3.93(s，3H)，3.54(s，3H)，2.01(s，3H)· 實施例2 :化合物2brX=CH)之製造 與化合物2a之相同方法’獲得化合物2b ’收率為 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 8 311254 -------L---.-----------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 1267515 五、發明說明（9 ) 68.5% 〇 !H NMR (DMSO-d6) δ 9.76(s，1H)，9.64(s，1H)，7.10(d，J=2.0Hz, 1H)， 7.05(d，J=2.0Hz，1H)，6.78(d，J=2.0Hz，1H)， 6.01(t, J=2.0Hz5 1H)，4.82(t，J=5.5Hz，1H)， 4.34(d，J=5.5Hz，2H), 3.80(s，3H)，3.53(s，3H)， 1.96(s，3H). 宜例3 :化合物3a(X=N)之製造 於THp 30ml中添加化合物2a 85mg(0.29mmol)、活化 之Mn〇2(85%)550mg，室溫下攪拌1.5小時後，過濾之。 減壓餾除溶劑，以1H NMR測定所得殘渣，確認其純度足 夠直接用於下一反應，而無再純化之必要。 NMR (DMSO-d6) δ 10.21(s，1Η)，10.18(s，1Η)，9.50(s，1Η)， 7.63(s? 1H)? 7.43(s? 1H)? 7.10(d? J=2.0Hz? 1H)? 3.94(s? 3H)? 2.84(s? 3H)? 2.02(s? 3H). 實施例4 ··化合物3b(X=CH)之製造 與化合物3a之相同方法獲得化合物3b。 !H NMR (DMSO-d6) δ 9.99(s? 1H), 9.80(s? 1H)? 9,49(s? 1H)5 7.57(s, 1H)，7.14(d，J=1.0Hz，1H)， 6.98(d? J=1.0Hz? 1H)? 6.88(d? J=2.0Hz? 1H)? 3 87(s，3H)，3.82(s，3H)，1.97(s，3H)· 實施例5 ··化合物4a(X=N)之製造 ------MII.II4------- —訂---------線· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 9 311254 !267515 A7

五、發明說明（)

於冰冷下’將 NaH(60%)23· lmg(0.58mmol)溶解於 THF 6»1中，再添加三乙基膦乙酸酯n6m卜該反應溶液攪拌$ 分鐘後，於其中添加溶有化合物3a之THF 25ml，使反應 一夜。減壓餾除THF，所得殘渣使用乙酸乙酯以快速層析 法獲得收量88.5 mg之黃色固體化合物4a，收率為84 %(自 化合物2a之2階段之收率）。 'H NMR (DMSO-d6) δ 10.25(s，1Η)，9.87(s，1Η)，7.51(d，J=15.9Hz，1Η)， 7.44(d, J=l_8Hz，1H)，7.42(s，1H)， 6.84(d，J=1.8Hz，1H)，6.11(d，J=15.9Hz，1H)， 4.16(q? J=7.0Hz? 2H), 4.13(s5 3H)? 3.70(s, 3H), 2.02(s，3H)，1.24(t，J=7.0Hz, 3H)· 實施例6 ··化合物4b(X=CH)之製造 與化合物4a相同之方法獲得化合物4b，收率為55%。 'H NMR (DMSO-d6) δ 9.87(s，1Η)，9.78(s，1Η)，7.51(d，J=15.5Hz，1Η), 7.39(d，J=2.0Hz，1Η)，7.13(d，J=2.0Hz，1Η)， 6.85(d，J=2.0Hz，1H), 6.73(d，J=2.0Hz，1H)， 6.07(s，3H)，3.68(s, 3H)，1.97(s，3H)， 1.23(t? J=7.0Hz, 3H). 實施例7 :化合物5a(X=N)之製造 於 CH3OH 5 ml 中添加化合物 4a 70mg(0.2mmol)、2N 稀NaOH 1.5ml與水3ml，反應溶液於室溫下攪拌4.5小 時0 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 本 頁

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經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 10 311254 1267515 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（“） 減壓餾除溶劑後，添加水20mi。過濾該溶劑，濾液以 2N HC1調整至pH2至3。如此所得之膠狀沈澱經過濾後獲 得收量43mg之化合物5a，收率為67%。 lR NMR (DMSO-d6) δ 10.24(s，lH)，9.84(s，1Η)，7.43(d，J=15.0Hz，1Η)， 7.41(s, 1H)，7.40(s，1H)，6.78(s，1H)， 6.03(d, J=15.0Hz，1H)，3.94(s，3H)，3.67(s，3H)， 3.86(s, 3H); ESIMS m/e 以 C15H16N504 計； 計算值（M-H) 330.3 實測值 330.2 實施例8 :化合物5b(X=CH)之製造 與化合物5a之相同方法獲得化合物5b，收率為57%。 !H NMR (DMSO-d6) δ 9.83(s9 1Η)? 9.78(s? 1Η)? 7.38(d? J=16.0Hz? 1H)? 7.34(s? H)? 7.13(d, J=2.0Hz? 1H)? 6.84(d，J=2.0Hz，1H)，6.64(s，1H)， 5.99(d? J=16.0Hz? 1H)? 3.82(s? 3H)? 3.65(s9 3H), 1.99(s5 3H); ESIMS m/e 以 C16H17N404 計； 計算值（M-H) 329.3 實測值 329.4 f施例9 :化合物6a(X=N)之製造 於 DMF 2 ml 中添加化合物 5a26.4mg(0.08mmol)、l，l’- ------L---.-----------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 11 311254 A7 B7 ^67515 五、發明說明（u) 缓基二喷唾49.9mg(0.31mmol)。該反應溶液於室溫下攪拌 一夜後，添加水20ml，過濾獲得黃色沈澱物之化合物6a， 收量為20.5mg，收率為68%。 'H NMR (DMSO-d6) δ 10.23(s, lH)，10.04(s，1Η)，8.67(s，1Η)， 7.90(d，J=1.0Hz，1H)，7.88(d，J=15.5Hz，1H)， 7.50(d，J=2.0Hz，1H)，7.44(s, 1H)， 7.32(d，J=2.0Hz，1H)，7.16(d，J=15.5Hz5 1H)， 7.10(s，1H)，3.96(s，3H)，3.79(s，3H), 2.03(s，3H); ESIMS m/e 以 C18H18N703 計； 計算值（M-H) 380.4 實測值 380.4 實施例10 :化合物6b(X = CH)之製造 以與化合物6a之相同方法，獲得化合物6b，收率為 80%。 !H NMR (DMSO-d6) δ 10.1(s，1H)，9.82(s, 1H)，8.68(s，1H)， 7.91(t, J=2.0 and 2.0Hz, 1H), 7.87(d，J=15.0Hz，1H)，7.48(d) J=2.0Hz，1H)， 7.22(d，J=2.0Hz，1H)，7.16(d，J=1.5Hz，1H)， 7.14(d5 J=15.0Hz，1H)，7.10(s，1H)， 6.89(d，J=1.5Hz，1H)，3.84(s，3H)，3.78(s，3H)， 1.97(s，3H); 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 12 311254 ------1---.-----------訂---------線 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1267515 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（13) ESIMS m/e 以 C19H19N603 計； 計算值（M-H) 379.4 實測值 379.4 實施例11 :化合物7a(X=N)之製造 於- 50°C 下將氫化鈉（60%)3.21!^(〇.〇8111111〇1)溶解於 DMF 0.3ml中之溶液加至溶有DU 86之片斷A 6.1 mg (0.024mmol)之DMF 0.3ml之溶液中。該反應溶液於jo至 -40°C下攪拌3小時後，於-50°C下添加溶有化合物6a 10.811^(0.028111111〇1)之〇]^?11111之溶液，於_40。(：再攪拌5 小時後，於維持在-30°C之冷凍庫内放置2天。然後，添加 磷酸鈉緩衝液（0.01 M)3ml，室溫下攪拌5分鐘。減壓館除 溶劑’所得之黃色殘邊使用CH3OH與CHC13進行快速層 析以純化，獲得收量12 ·3mg之化合物7a，收率為9 1 %。 !H NMR (DMSO-d6) δ 12·36 (s，1Η)，10.24(s，1Η)，9.97(s，1Η)， 7.58(d? J=15.0Hz? 1H), 7.43(s? 1H)? 7.41(d，J=2.0Hz，1H)，6.99(d，J=2.0Hz，1H)， 6.85(s, 1H)，6_58(d，J=15.0Hz，1H)， 4.29(d，J=10,5Hz，1H)， 3.73(s? 3H)? 3.72(s, 3H)5 3.46(m? 1H)? 2.47(s，3H)，2.08(m，1H)，2.02(s，3H)， 1.29(t，J=4.5 and 3.5Hz，1H); ESIMS m/e 以 C29H28N706 計； 計算值（Μ·Η) 570.6 -------ί---.-----------訂---------線#t (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 13 311254 1267515 A7 B7 五、發明說明（14) 實測值 570.4 實施例12 :化合物7b(X=CH)之Μ造 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 以與化合物7a之相同方法獲得化合物7b，收率為 77% 〇 lR NMR (DMSO-d6) δ 12.36 (s, 1Η)，9.90(s, 1Η)，9.80(s，1Η)， 7.57((1, J=15.0Hz，1H)，7.38(d，J=1.5Hz，1H)， 7.14(d，J=2.0Hz，1H)，6.88(d，J=1.5Hz，1H)， 6.86(d，J=2.0Hz，1H)，6.84(s，1H)， 6.56(d，J=15.0Hz，1H)，4.29(d，J=10.5Hz，1H)， 4.19(dd，J=4.0 and 4.5Hz，1H)，3.83(s，3H)， 3.73(s，1H)，3.71(s，1H)，3.46(m，1H)， 2.47(s，3H)，2.09(m，1H)，1.97(s，3H)， 1.29(t，J=4.5 and 3.5Hz，1H); ESIMS m/e 以 C3〇H29N606 計； 計算值（M_H) 569.6 實測值 569.5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實施例13 : 450bi)之DNA M斷之烷化 (1)5’-德州紅-末端修飾之450鹼基對DNA片斷之合成。 以5、末端經德州紅修飾之18體作為引子，使用PCR 法製造5’-德州紅-末端修飾之450 bp DNA片斷p UC 18 F780*-1229 與 pUC 18 R1459*-1908(此二者為互補序列）， 並以Suprec-02純化。其濃度以溴化乙錠染色法決定。星 號（*)示德州紅之修飾位置，數字示複製開始點之核苷酸編 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） η 311254 1267515 A7 —__B7_ 五、發明說明（15 ) 號。該鹼基序列示於序列表之序列編號1及2。 (2)高分解能聚丙烯酸醯胺電泳。 將含溶有5’末端以德州紅標識之DNA片斷60nM之全 量為 10μ 1 之磷酸鈉緩衝液（pH7.0)12.5mM、DMF 5%(v/v) 與各種濃度藥劑之標準反應溶液置於微量離心管 (EPpend〇rf)中，室溫下回溫一夜後，添加小牛胸腺 DNA(5mM，1M1)，90°C加熱5分鐘。以乙醇沈澱而得DNA。 所得之DNA溶解於負載色素（富辛紅之dMF溶液）8/z 1 中。試樣溶液於94°C加溫放置20分鐘使DNA變性後，立 刻冷卻至（TC。取2从1使用5500_S DNA定序儀系統，以 6 %廣區域膠（商品名），進行聚丙烯醯胺膠體電泳。 复A例14 : HeLaS^細胞生育抑制試給 於24孔培養平板之各孔中分別注入〇 75ml以含1〇% 胎牛血清及2mM麩胺醯胺之MEM培養基將HeLaS3細胞 調整至2·67χ 1〇4個/…之試驗液。於二氧化碳培養槽内於 37°C下培養一夜後，分別添加以培養基適當稀釋之表i所 示各試驗化合物，每穴〇 25ml。 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 合 作 社 印 製 於二氧化碳培養箱内將細胞培養72小時後，去除培養 上清液，以胰蛋白晦、乙二胺四乙酸（edta)溶液分散細 胞，回收之。以細胞計數計測定細胞數，以無處理下之細 胞數與以已知$農度之試驗化合物處理情況之細胞數相比 較，計算對細胞增殖達50%，抑制時之試驗化合物濃度 (JCw)。結果示於以下表1。 本紙張尺度翻中關豕標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 15 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 311254 1267515

表1 試驗化合物 IC5〇(llM) PyPyLDu 86 -—--- 1.5 ~~ -------- ImPyLDu 86 ----— ----— 0.7 弟歐卡黴素A 4.7 ~ [產業上利用之可能性] 本發明係提供可將雙鏈DN A同時烷化及切斷之可合 成之化合物’不僅可作為人卫限制酶之用途，尚可Q 特定鹼基序列為標的之遺傳基因治療上之用 --------------訂---------線 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁> 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 16 311254 1267515 A7 B7 五、發明說明（17 ) 序列表 <110〉日本科學及技術合作 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) <120>分開雙股DN A之化合成物及其用途 <130> JA903009 <150> JP 11-83591 <151〉 1999-3-26 <160> 2 <210> 1 <211> 450 <212> DNA <Z13> pUC 18 <400〉 1 agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 60 ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 120 caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 180 gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 240 cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta 300 tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 360 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 420 cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 4γΠ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 17 311254 1267515 A7 B7 五、發明說明（18 ) <210〉 2 <211〉 450 <212> DNA <213〉 pUC 18 <400> 2 tcttagtccc ctattgcgtc ctttcttgta cactcgtttt ccggtcgttt tccggtcctt 60 ggcatttttc cggcgcaacg accgcaaaaa ggtatccgag gcggggggac tgctcgtagt 120 gtttttagct gcgagttcag tctccaccgc tttgggctgt cctgatattt ctatggtccg 180 caaaggggga ccttcgaggg agcacgcgag aggacaaggc tgggacggcg aatggcctat 240 ggacaggcgg aaagagggaa gcccttagca ccgcgaaaga gttacgagtg cgacatccat 300 agactcaagc cacatccagc aagcgaggtt cgacccgaca cacgtgcttg gggggcaagt 360 cgggctggcg acgcggaata ggccattgat agcagaactc aggttgggcc attctgtgct 420 gaatagcggt gaccgtcgtc ggtgaccatt 450 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 $紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 18 311254

Claims (1)

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89105426號專利申請案 申請專利範圍修正本 (95年7月U曰） —種可同時切斷DNA雙鏈之化合物， 化合物： ，、卜式所示之 CHi 〇 2·如申請專利範圍第i項之化合物，復加上製藥上容許 之載體，作為醫藥組成物。 3·如申請專利範圍第2項之化合物，其中，該醫藥組成 物係癌治療藥。 4· 一種醫藥組成物，係作為癌治療藥，且由申請專利範 圍第1項之化合物與製藥上容許之載體所組成 經濟部中央標準局員工福利委員會印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（21〇><297公釐） (修正本）311254