JP2000281679A - ２本鎖ｄｎａを切断できる化合物及びその使用方法 - Google Patents
２本鎖ｄｎａを切断できる化合物及びその使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は２本鎖ＤＮＡを同時にアルキル化
し、切断し得る新規な化学種を提供するものであり、さ
らにこれらの化学種を用いたＤＮＡのアルキル化および
切断方法を提供するものである。また、本発明はこれら
の化合物を用いた抗癌剤を提供するものである。 【解決手段】 本発明は、一般式（Ｉ） Ｂ−Ｌ−Ａ （Ｉ） （式中、ＢはＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造、
例えば置換基を有してもよいピロール−イミダゾールポ
リアミドを示し、ＡはＤＮＡの塩基の一種に結合し得る
化学構造、例えばデュオカルマイシンＡのアルキル化部
分を示し、ＬはＡ及びＢの化学構造を結合させ得るリン
カー、例えばビニル基を示す。）で表されるＤＮＡの２
本鎖を同時にアルキル化し切断することができる化合
物、これらの化合物を用いたＤＮＡのアルキル化方法、
２本鎖ＤＮＡの切断方法、及び、これらの化合物を用い
た医薬組成物に関する。
し、切断し得る新規な化学種を提供するものであり、さ
らにこれらの化学種を用いたＤＮＡのアルキル化および
切断方法を提供するものである。また、本発明はこれら
の化合物を用いた抗癌剤を提供するものである。 【解決手段】 本発明は、一般式（Ｉ） Ｂ−Ｌ−Ａ （Ｉ） （式中、ＢはＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造、
例えば置換基を有してもよいピロール−イミダゾールポ
リアミドを示し、ＡはＤＮＡの塩基の一種に結合し得る
化学構造、例えばデュオカルマイシンＡのアルキル化部
分を示し、ＬはＡ及びＢの化学構造を結合させ得るリン
カー、例えばビニル基を示す。）で表されるＤＮＡの２
本鎖を同時にアルキル化し切断することができる化合
物、これらの化合物を用いたＤＮＡのアルキル化方法、
２本鎖ＤＮＡの切断方法、及び、これらの化合物を用い
た医薬組成物に関する。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、化学合成により製
造し得る化合物を用いて２本鎖ＤＮＡを同時にアルキル
化し、切断し得る化合物、これらの化合物を用いたＤＮ
Ａのアルキル化方法、２本鎖ＤＮＡの切断方法、及び、
これらの化合物を用いた医薬組成物に関する。
造し得る化合物を用いて２本鎖ＤＮＡを同時にアルキル
化し、切断し得る化合物、これらの化合物を用いたＤＮ
Ａのアルキル化方法、２本鎖ＤＮＡの切断方法、及び、
これらの化合物を用いた医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトゲノムプロジェクトにより我々の
「生命の設計図」である全遺伝子の塩基配列が数年内に
解明されようとしている。この設計図に傷があったり、
後天的に傷がはいると、病気や老化を引き起こすことが
知られている。ヒトゲノムプロジェクトの進展により癌
を含む多くの疾病はＤＮＡレベル理解されるようにな
り、診断、予防などを中心とした医学全体が、革命的に
変化するものと考えられる。さらに、これらの疾病のＤ
ＮＡレベルでの理解に基づいた治療法、すなわち病因遺
伝子やその産物をターゲットとした医薬品の開発への期
待も大きいが、基礎研究を臨床研究に生かしてゆくため
の橋渡し的な研究はまだ、途についたばかりである。現
在、用いられている抗癌剤は、スクリーニングによって
選択された抗生物質が多く、もともと癌細胞を殺すため
に微生物が産生したものではなく、癌の分子生物学的知
見に基づいたものはほとんどない。細胞内の特定遺伝子
の発現を細胞外から自由自在にコントロールすることが
可能になれば、究極の遺伝子レベルでの治療法となると
考えられる。
「生命の設計図」である全遺伝子の塩基配列が数年内に
解明されようとしている。この設計図に傷があったり、
後天的に傷がはいると、病気や老化を引き起こすことが
知られている。ヒトゲノムプロジェクトの進展により癌
を含む多くの疾病はＤＮＡレベル理解されるようにな
り、診断、予防などを中心とした医学全体が、革命的に
変化するものと考えられる。さらに、これらの疾病のＤ
ＮＡレベルでの理解に基づいた治療法、すなわち病因遺
伝子やその産物をターゲットとした医薬品の開発への期
待も大きいが、基礎研究を臨床研究に生かしてゆくため
の橋渡し的な研究はまだ、途についたばかりである。現
在、用いられている抗癌剤は、スクリーニングによって
選択された抗生物質が多く、もともと癌細胞を殺すため
に微生物が産生したものではなく、癌の分子生物学的知
見に基づいたものはほとんどない。細胞内の特定遺伝子
の発現を細胞外から自由自在にコントロールすることが
可能になれば、究極の遺伝子レベルでの治療法となると
考えられる。
【０００３】本発明者らは、最近抗生物質デュオカルマ
イシンがディスタマイシンなどの他種分子とへテロダイ
マーを形成し協同的にＤＮＡの分子認識を行ない、デュ
オカルマイシン単独の場合とは異なる塩基配列を効率よ
くアルキル化することを発見した（Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 93,14405,1996）。この結果をもとにデュオカル
マイシンのアルキル化部分にＤＮＡ認識部位としてピロ
ール−イミダゾールポリアミドを結合させ、任意の塩基
配列でＤＮＡを選択的にアルキル化する分子の合成に成
功し、特許出願をした（特願平１０−２６０７１０
号）。
イシンがディスタマイシンなどの他種分子とへテロダイ
マーを形成し協同的にＤＮＡの分子認識を行ない、デュ
オカルマイシン単独の場合とは異なる塩基配列を効率よ
くアルキル化することを発見した（Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 93,14405,1996）。この結果をもとにデュオカル
マイシンのアルキル化部分にＤＮＡ認識部位としてピロ
ール−イミダゾールポリアミドを結合させ、任意の塩基
配列でＤＮＡを選択的にアルキル化する分子の合成に成
功し、特許出願をした（特願平１０−２６０７１０
号）。
【０００４】しかし、デュオカルマイシンのアルキル化
部分にＤＮＡ認識部位としてピロール−イミダゾールポ
リアミドを結合させだけの化合物ではアルキル化能が十
分なだけではなく、これらの化合物は１本鎖の塩基配列
しか認識できないものであった。そこで、本発明者ら
は、これらの化合物の分子動力学などのコンピュータモ
デリングを用いてこれらの分子とＤＮＡとのアルキル化
を詳細に検討すると、デュオカルマイシンの反応性のあ
るシクロプロパン部分（セグメントＡ）にビニル基など
のリンカーを導入することにより、ＤＮＡに対するアル
キル化能が増すことが期待できそうであることが判明し
た。
部分にＤＮＡ認識部位としてピロール−イミダゾールポ
リアミドを結合させだけの化合物ではアルキル化能が十
分なだけではなく、これらの化合物は１本鎖の塩基配列
しか認識できないものであった。そこで、本発明者ら
は、これらの化合物の分子動力学などのコンピュータモ
デリングを用いてこれらの分子とＤＮＡとのアルキル化
を詳細に検討すると、デュオカルマイシンの反応性のあ
るシクロプロパン部分（セグメントＡ）にビニル基など
のリンカーを導入することにより、ＤＮＡに対するアル
キル化能が増すことが期待できそうであることが判明し
た。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、アルキル化
能が増大したＤＮＡのアルキル化剤を提供するものであ
る。さらに、本発明者らは、この研究において本発明の
アルキル化剤がダイマー様の挙動をとり、２本鎖ＤＮＡ
を同時にアルキル化し切断することを見出し、特定の塩
基配列に対して人工の制限酵素としての作用を有するも
のであることを見出した。したがって、本発明は２本鎖
ＤＮＡを同時にアルキル化し、切断し得る新規な化学種
を提供するものであり、さらにこれらの化学種を用いた
ＤＮＡのアルキル化および切断方法を提供するものであ
る。また、本発明はこれらの化合物を用いた抗癌剤を提
供するものである。
能が増大したＤＮＡのアルキル化剤を提供するものであ
る。さらに、本発明者らは、この研究において本発明の
アルキル化剤がダイマー様の挙動をとり、２本鎖ＤＮＡ
を同時にアルキル化し切断することを見出し、特定の塩
基配列に対して人工の制限酵素としての作用を有するも
のであることを見出した。したがって、本発明は２本鎖
ＤＮＡを同時にアルキル化し、切断し得る新規な化学種
を提供するものであり、さらにこれらの化学種を用いた
ＤＮＡのアルキル化および切断方法を提供するものであ
る。また、本発明はこれらの化合物を用いた抗癌剤を提
供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、一般式（Ｉ） Ｂ−Ｌ−Ａ （Ｉ） （式中、ＢはＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造を
示し、ＡはＤＮＡの塩基の一種に結合し得る化学構造を
示し、ＬはＡ及びＢの化学構造を結合させ得るリンカー
を示す。）で表されるＤＮＡの２本鎖を同時に切断する
ことができる化合物に関する。また、本発明は、前記の
化合物を用いた２本鎖ＤＮＡの特定の塩基配列部分をア
ルキル化する方法、及び２本鎖ＤＮＡの特定の塩基配列
部分を切断する方法に関する。さらに、本発明はこれら
の化合物を用いた医薬組成物、特に抗癌剤に関する。
示し、ＡはＤＮＡの塩基の一種に結合し得る化学構造を
示し、ＬはＡ及びＢの化学構造を結合させ得るリンカー
を示す。）で表されるＤＮＡの２本鎖を同時に切断する
ことができる化合物に関する。また、本発明は、前記の
化合物を用いた２本鎖ＤＮＡの特定の塩基配列部分をア
ルキル化する方法、及び２本鎖ＤＮＡの特定の塩基配列
部分を切断する方法に関する。さらに、本発明はこれら
の化合物を用いた医薬組成物、特に抗癌剤に関する。
【０００７】本発明の前記一般式（Ｉ）における、ＤＮ
Ａの塩基配列を認識できる化学構造部分であるＢは、置
換基を有してもよいピロール及び／又はイミダゾールか
ら誘導される化学構造が好ましい。ピロールやイミダゾ
ールの置換基としては、ＤＮＡの塩基配列を認識する妨
げとならないものであれば特に制限はなく、例えば、炭
素数１〜１０、好ましくは１〜５の直鎖又は分枝状のア
ルキル基、前記したアルキル基から誘導されるアルコキ
シ基、水酸基、アミノ基、前記したアルキル基から誘導
されるＮ−アルキル置換アミノ基、有機カルボン酸から
誘導されるＮ−アシルアミノ基、グアニジノ基、置換グ
アニジノ基などが挙げられる。例えば、Ｎ−メチルピロ
ール、Ｎ−メチルイミダゾール、３−ヒドロキシピロー
ル、Ｎ−メチル−３−ヒドロキシピロールなどが挙げら
れる。また、ＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造部
分であるＢとしては、より具体的にはピロール−イミダ
ゾールポリアミド結合が好ましい。ピロールやイミダゾ
ールの長さ（個数）は特に制限はないが２〜１０個、好
ましくは２〜５個程度である。
Ａの塩基配列を認識できる化学構造部分であるＢは、置
換基を有してもよいピロール及び／又はイミダゾールか
ら誘導される化学構造が好ましい。ピロールやイミダゾ
ールの置換基としては、ＤＮＡの塩基配列を認識する妨
げとならないものであれば特に制限はなく、例えば、炭
素数１〜１０、好ましくは１〜５の直鎖又は分枝状のア
ルキル基、前記したアルキル基から誘導されるアルコキ
シ基、水酸基、アミノ基、前記したアルキル基から誘導
されるＮ−アルキル置換アミノ基、有機カルボン酸から
誘導されるＮ−アシルアミノ基、グアニジノ基、置換グ
アニジノ基などが挙げられる。例えば、Ｎ−メチルピロ
ール、Ｎ−メチルイミダゾール、３−ヒドロキシピロー
ル、Ｎ−メチル−３−ヒドロキシピロールなどが挙げら
れる。また、ＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造部
分であるＢとしては、より具体的にはピロール−イミダ
ゾールポリアミド結合が好ましい。ピロールやイミダゾ
ールの長さ（個数）は特に制限はないが２〜１０個、好
ましくは２〜５個程度である。
【０００８】ＤＮＡの塩基の一種に結合し得る化学構造
部分であるＡとしては、シクロプロパン環を有する化学
構造が好ましく、デュオカルマイシンのアルキル化部分
がより好ましい。Ａ及びＢの化学構造を結合させ得るリ
ンカー部分Ｌとしては、セグメントＡとセグメントＢと
を適当な距離隔てることができ、かつ、アルキル化活性
を失活させないものが好ましい。好ましい具体例として
はビニル基を含有する化学構造が挙げられる。
部分であるＡとしては、シクロプロパン環を有する化学
構造が好ましく、デュオカルマイシンのアルキル化部分
がより好ましい。Ａ及びＢの化学構造を結合させ得るリ
ンカー部分Ｌとしては、セグメントＡとセグメントＢと
を適当な距離隔てることができ、かつ、アルキル化活性
を失活させないものが好ましい。好ましい具体例として
はビニル基を含有する化学構造が挙げられる。
【０００９】一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物の
好ましいものとしては、次式
好ましいものとしては、次式
【化３】 で表される化合物（以下、「ＰｙＰｙＬＤｕ８６」とい
う。）、又は
う。）、又は
【化４】 で表される化合物（以下、「ＩｍＰｙＬＤｕ８６」とい
う。）が挙げられる。前記した化合物は、塩基配列ＴＧ
ＡＣＧ若しくはＣＧＡＣＧ又はそれらの相補鎖を認識す
る。
う。）が挙げられる。前記した化合物は、塩基配列ＴＧ
ＡＣＧ若しくはＣＧＡＣＧ又はそれらの相補鎖を認識す
る。
【００１０】本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物
は、公知の方法に準じて製造することができる。即ち、
Ａセグメント及びＢセグメントを常法により製造し、こ
れに順次リンカーセグメントＬを結合させ、次いで残り
のセグメントを結合させることにより製造することがで
きる。
は、公知の方法に準じて製造することができる。即ち、
Ａセグメント及びＢセグメントを常法により製造し、こ
れに順次リンカーセグメントＬを結合させ、次いで残り
のセグメントを結合させることにより製造することがで
きる。
【００１１】例えば、前記のＩｍＰｙＬＤｕ８６（７
ａ）及びＰｙＰｙＬＤｕ８６（７ｂ）の製造例を次の化
学反応式で示す。反応式中の各化合物の下の数字は化合
物の番号を示す。
ａ）及びＰｙＰｙＬＤｕ８６（７ｂ）の製造例を次の化
学反応式で示す。反応式中の各化合物の下の数字は化合
物の番号を示す。
【化５】 反応式中のａ）はベンゾトリアゾール−１−イルオキシ
トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオ
ロホスフェート（ＢＯＰ）のＴＨＦ溶液での処理、次い
でＮａＢＨ４処理を示し、ｂ）はＴＨＦ中でのＭｎＯ２
処理を示し、ｃ）はＴＨＦ中でのトリエチルホスホノア
セテート及びＮａＨ処理を示し、ｄ）は水−メタノール
中での水酸化ナトリウムによる処理を示し、ｅ）はＤＭ
Ｆ中での１，１−カルボニルジイミダゾールでの処理を
示し、ｆ）はＤＭＦ中での水素化ナトリウムを用いたＤ
Ｕ８６のセグメントＡとの処理を示す。
トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオ
ロホスフェート（ＢＯＰ）のＴＨＦ溶液での処理、次い
でＮａＢＨ４処理を示し、ｂ）はＴＨＦ中でのＭｎＯ２
処理を示し、ｃ）はＴＨＦ中でのトリエチルホスホノア
セテート及びＮａＨ処理を示し、ｄ）は水−メタノール
中での水酸化ナトリウムによる処理を示し、ｅ）はＤＭ
Ｆ中での１，１−カルボニルジイミダゾールでの処理を
示し、ｆ）はＤＭＦ中での水素化ナトリウムを用いたＤ
Ｕ８６のセグメントＡとの処理を示す。
【００１２】こうして合成されたＰｙＰｙＬＤｕ８６お
よび、ＩｍＰｙＬＤｕ８６のＤＮＡとの反応性を調べ
た。ＩｍＰｙＬＤｕ８６によるアルキル化の結果を図１
に示した。この実験に用いたＤＮＡ及び使用したＩｍＰ
ｙＬＤｕ８６を図２に示す。
よび、ＩｍＰｙＬＤｕ８６のＤＮＡとの反応性を調べ
た。ＩｍＰｙＬＤｕ８６によるアルキル化の結果を図１
に示した。この実験に用いたＤＮＡ及び使用したＩｍＰ
ｙＬＤｕ８６を図２に示す。
【００１３】右側の泳動図は２本鎖ＤＮＡの上のストラ
ンドの結果、中央の泳動図は下のストランドの結果であ
る。アルキル化の位置は加熱により切断バンドとしてみ
ることができる。その結果低濃度から主に２本鏡ＤＮＡ
はサイト１とサイト２で２本鎖の切断されていることが
わかり、アルキル化が２本鎖で同時に起っていることが
判断できる。このような切断を引き起こす化合物はこれ
までに例がなく、まさに人工の制限酵素ということがで
きる。また用いたＩｍＰｙＬＤｕ８６の量から７０％の
高率で切断が起っていることが判明し、以前に合成した
分子（特願平１０−２６０７１０号参照）にくらべて非
常に高い効率であることがわかる。
ンドの結果、中央の泳動図は下のストランドの結果であ
る。アルキル化の位置は加熱により切断バンドとしてみ
ることができる。その結果低濃度から主に２本鏡ＤＮＡ
はサイト１とサイト２で２本鎖の切断されていることが
わかり、アルキル化が２本鎖で同時に起っていることが
判断できる。このような切断を引き起こす化合物はこれ
までに例がなく、まさに人工の制限酵素ということがで
きる。また用いたＩｍＰｙＬＤｕ８６の量から７０％の
高率で切断が起っていることが判明し、以前に合成した
分子（特願平１０−２６０７１０号参照）にくらべて非
常に高い効率であることがわかる。
【００１４】２本鎖で同時にアルキル化が起った原因
は、図３に示すように、ＩｍＰｙＬＤｕ８６が２量体を
形成しリンカー部分とイミダゾールがよいスタッキング
をすることによりＧＣ塩基対を認識して、このものが２
本鎖ＤＮＡの認識配列に特異的に結合しておきているも
のと考えられる。これらの結果、分子設計により提案さ
れ導入したりンカーは反応性も向上させ、またイミダゾ
ールとのペアによる認識ユニットとしても利用できるこ
とが明らかになった。これらの知見に基づいてＤＮＡの
特定配列をターゲットとする新しいタイプの遺伝子治療
薬の分子設計に一歩近づいたと言える。
は、図３に示すように、ＩｍＰｙＬＤｕ８６が２量体を
形成しリンカー部分とイミダゾールがよいスタッキング
をすることによりＧＣ塩基対を認識して、このものが２
本鎖ＤＮＡの認識配列に特異的に結合しておきているも
のと考えられる。これらの結果、分子設計により提案さ
れ導入したりンカーは反応性も向上させ、またイミダゾ
ールとのペアによる認識ユニットとしても利用できるこ
とが明らかになった。これらの知見に基づいてＤＮＡの
特定配列をターゲットとする新しいタイプの遺伝子治療
薬の分子設計に一歩近づいたと言える。
【００１５】次に、本発明の化合物の前記した性質に基
づく抗細胞活性を検討した。即ち、本発明のＰｙＰｙＬ
Ｄｕ８６、ＩｍＰｙＬＤｕ８６と、抗癌剤として公知の
デュオカルマイシンＡについてＨｅＬａＳ３細胞（子宮
頚部扁平上皮癌細胞）の抗細胞活性を試験した。結果を
表１に示す。この結果、本発明の化合物はデュオカルマ
イシンＡに比べて約３〜７倍の活性があることがわかっ
た。
づく抗細胞活性を検討した。即ち、本発明のＰｙＰｙＬ
Ｄｕ８６、ＩｍＰｙＬＤｕ８６と、抗癌剤として公知の
デュオカルマイシンＡについてＨｅＬａＳ３細胞（子宮
頚部扁平上皮癌細胞）の抗細胞活性を試験した。結果を
表１に示す。この結果、本発明の化合物はデュオカルマ
イシンＡに比べて約３〜７倍の活性があることがわかっ
た。
【００１６】本発明の化合物は抗癌剤として有用であ
り、製薬上許容される医薬担体と共に医薬組成物とする
ことができる。本発明の医薬組成物は、経口投与又は非
経口投与により症状に応じて投与することができる。本
発明の医薬組成物の有効投与量は、患者の状態や症状な
どにもよるが、通常は１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の
範囲で適宜選択することができる。また、本発明の医薬
組成物は通常の方法により、注射剤などに製剤化するこ
とができる。
り、製薬上許容される医薬担体と共に医薬組成物とする
ことができる。本発明の医薬組成物は、経口投与又は非
経口投与により症状に応じて投与することができる。本
発明の医薬組成物の有効投与量は、患者の状態や症状な
どにもよるが、通常は１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の
範囲で適宜選択することができる。また、本発明の医薬
組成物は通常の方法により、注射剤などに製剤化するこ
とができる。
【００１７】
【実施例】次に実施例により本発明をより具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。
【００１８】以下の実施例において使用される試薬の略
称は次のとおりである。 ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、 ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、 ＴＨＦ：テトラヒドロフラン、 ＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス
（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホス
フェート。
称は次のとおりである。 ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、 ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、 ＴＨＦ：テトラヒドロフラン、 ＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス
（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホス
フェート。
【００１９】以下の実施例においては、反応の進行を
０．２５ｍｍシリカゲル６０プレートを用いた薄層クロ
マトグラフィー（ＴＬＣ）で２５４ｎｍの蛍光インジケ
ーター（メルク社製）によって追跡した。ＴＬＣプレー
トはＵＶによって観察した。ＮＭＲスペクトルは、テト
ラメチルシランを内部標準とし、Ｈ１−ＮＭＲスペクト
ルの化学シフトはｐｐｍで表記した。ＥＩ（Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｎ ｉｍｐａｃｔ）マススペクトルは、ＪＮＭ−Ａ
Ｘ５０５を用い、ＥＳＩＭＳ（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａ
ｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａ）
は、ＰＥ ＳＣＩＥＸ ＡＰＩ １６５を用いて測定し
た。Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼとフィルター
チューブ（Ｓｕｐｒｅｃ−０２）は、宝酒造から、ｔｈ
ｅｒｍｏ ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｃｏｒｅ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ ｋｉｔとローディング色素（フューシンレ
ッドのＤＭＦ溶液）はアマシャム社から、５’エンドテ
キサスレッド修飾ＤＮＡオリゴマー（１８ｍｅｒ）はク
ラボウから、５０％ロングレンジャー（登録商標）ゲル
溶液はＦＭＣバイオプロダクト社からそれぞれ購入し
た。ポリアクリルアミドゲル電気泳動はＨＩＴＡＣＨＩ
５５００−Ｓ ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて行
った。
０．２５ｍｍシリカゲル６０プレートを用いた薄層クロ
マトグラフィー（ＴＬＣ）で２５４ｎｍの蛍光インジケ
ーター（メルク社製）によって追跡した。ＴＬＣプレー
トはＵＶによって観察した。ＮＭＲスペクトルは、テト
ラメチルシランを内部標準とし、Ｈ１−ＮＭＲスペクト
ルの化学シフトはｐｐｍで表記した。ＥＩ（Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｎ ｉｍｐａｃｔ）マススペクトルは、ＪＮＭ−Ａ
Ｘ５０５を用い、ＥＳＩＭＳ（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａ
ｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａ）
は、ＰＥ ＳＣＩＥＸ ＡＰＩ １６５を用いて測定し
た。Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼとフィルター
チューブ（Ｓｕｐｒｅｃ−０２）は、宝酒造から、ｔｈ
ｅｒｍｏ ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｃｏｒｅ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ ｋｉｔとローディング色素（フューシンレ
ッドのＤＭＦ溶液）はアマシャム社から、５’エンドテ
キサスレッド修飾ＤＮＡオリゴマー（１８ｍｅｒ）はク
ラボウから、５０％ロングレンジャー（登録商標）ゲル
溶液はＦＭＣバイオプロダクト社からそれぞれ購入し
た。ポリアクリルアミドゲル電気泳動はＨＩＴＡＣＨＩ
５５００−Ｓ ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて行
った。
【００２０】実施例１（化合物２ａ（Ｘ＝Ｎ）の製造） ＴＨＦ３０ｍｌ中に化合物１ａ ２０４．８ｍｇ（０．
６７ｍｍｏｌ）、ＢＯＰ３２６．３ｍｇ（０．７４ｍｍ
ｏｌ）１７０ｍｌ、ＮａＢＨ４ ９８ｍｇ（２．５９
ｍｍｏｌ）を加えた。この反応溶液を室温下で３時間反
応させた後、溶媒を減圧留去して得られた残さにＣＨ３
ＯＨ ２０ｍｌと水５ｍｌを加えた。この溶液を１時間
撹拌し、透明な溶液を得た。減圧下で溶媒を留去し、黄
色の残査をＣＨ３ＯＨとＣＨ２Ｃｌ２を用いたフラッシ
ュクロマトグラフィーにより精製して収量９２．６ｍｇ
の目的の化合物２ａを収率４７．４％で得た。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.24 (s, 1H), 9.62 (s, 1H), 7.38 (s, 1H),7.10(d,
J=2.0Hz, 1H), 6.09 (d, J=2.0Hz, 1H),4.86 (t, J=5.5
Hz, 1H), 4.34 (d, J=5.5Hz, 2H),3.93 (s, 3H), 3.54
(s, 3H), 2.01 (s, 3H).
６７ｍｍｏｌ）、ＢＯＰ３２６．３ｍｇ（０．７４ｍｍ
ｏｌ）１７０ｍｌ、ＮａＢＨ４ ９８ｍｇ（２．５９
ｍｍｏｌ）を加えた。この反応溶液を室温下で３時間反
応させた後、溶媒を減圧留去して得られた残さにＣＨ３
ＯＨ ２０ｍｌと水５ｍｌを加えた。この溶液を１時間
撹拌し、透明な溶液を得た。減圧下で溶媒を留去し、黄
色の残査をＣＨ３ＯＨとＣＨ２Ｃｌ２を用いたフラッシ
ュクロマトグラフィーにより精製して収量９２．６ｍｇ
の目的の化合物２ａを収率４７．４％で得た。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.24 (s, 1H), 9.62 (s, 1H), 7.38 (s, 1H),7.10(d,
J=2.0Hz, 1H), 6.09 (d, J=2.0Hz, 1H),4.86 (t, J=5.5
Hz, 1H), 4.34 (d, J=5.5Hz, 2H),3.93 (s, 3H), 3.54
(s, 3H), 2.01 (s, 3H).
【００２１】実施例２（化合物２ｂ（Ｘ＝ＣＨ）の製
造） 化合物２ｂは化合物２ａと同様の方法で収率６８．５％
で得た。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 9.76 (s, 1H), 9.64 (s, 1H), 7.10 (d, J=2.0Hz, 1H),
7.05 (d, J=2.0Hz, 1H), 6.78 (d, J=2.0Hz, 1H),6.01
(d, J=2.0Hz, 1H), 4.82 (t, J=5.5Hz, 1H),4.34 (d, J
=5.5Hz, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.53 (s, 3H),1.96 (s, 3
H).
造） 化合物２ｂは化合物２ａと同様の方法で収率６８．５％
で得た。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 9.76 (s, 1H), 9.64 (s, 1H), 7.10 (d, J=2.0Hz, 1H),
7.05 (d, J=2.0Hz, 1H), 6.78 (d, J=2.0Hz, 1H),6.01
(d, J=2.0Hz, 1H), 4.82 (t, J=5.5Hz, 1H),4.34 (d, J
=5.5Hz, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.53 (s, 3H),1.96 (s, 3
H).
【００２２】実施例３（化合物３ａ（Ｘ＝Ｎ）の製造） ＴＨＦ３０ｍｌ中に化合物２ａ ８５ｍｇ（０．２９ｍ
ｍｏｌ）、活性化されたＭｎＯ２（８５％）５５０ｍｇ
を加え、室温下で１．５時間撹拌した後、ろ過した。溶
媒を減圧留去して得られた残査を１Ｈ ＮＭＲを測定
し、次の反応に直接使うのに十分な純度であり、さらに
精製する必要がないことを確認した。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.21 (s, 1H), 10.18 (s, 1H), 9.50 (s, 1H),7.63
(s, 1H), 7.43 (s, 1H), 7.10 (d, J=2.0Hz, 1H),3.94
(s, 3H), 2.84 (s, 3H), 2.02 (s, 3H).
ｍｏｌ）、活性化されたＭｎＯ２（８５％）５５０ｍｇ
を加え、室温下で１．５時間撹拌した後、ろ過した。溶
媒を減圧留去して得られた残査を１Ｈ ＮＭＲを測定
し、次の反応に直接使うのに十分な純度であり、さらに
精製する必要がないことを確認した。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.21 (s, 1H), 10.18 (s, 1H), 9.50 (s, 1H),7.63
(s, 1H), 7.43 (s, 1H), 7.10 (d, J=2.0Hz, 1H),3.94
(s, 3H), 2.84 (s, 3H), 2.02 (s, 3H).
【００２３】実施例４（化合物３ｂ（Ｘ＝ＣＨ）の製
造） 化合物３ｂは化合物３ａと同様の方法で得られた。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 9.99 (s, 1H), 9.80 (s, 1H), 9.49 (s, 1H),7.57 (s,
1H), 7.14 (d, J=1.0Hz, 1H),6.98 (d, J=1.0Hz, 1H),
6.88 (d, J=2.0Hz, 1H),3.87(s, 3H), 3.82 (s, 3H),
1.97 (s, 3H).
造） 化合物３ｂは化合物３ａと同様の方法で得られた。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 9.99 (s, 1H), 9.80 (s, 1H), 9.49 (s, 1H),7.57 (s,
1H), 7.14 (d, J=1.0Hz, 1H),6.98 (d, J=1.0Hz, 1H),
6.88 (d, J=2.0Hz, 1H),3.87(s, 3H), 3.82 (s, 3H),
1.97 (s, 3H).
【００２４】実施例５（化合物４ａ（Ｘ＝Ｎ）の製造） 氷冷下で、ＴＨＦ６ｍｌにＮａＨ（６０％）２３．１ｍ
ｇ（０．５８ｍｍｏｌ）を溶解させ、さらにトリエチル
ホスホノアセテート１１６ｍｌを加えた。この反応溶液
を５分間撹拌した後、ＴＨＦ２５ｍｌに溶解した化合物
３ａを加え、終夜反応させた。ＴＨＦを減圧留去し、得
られた残査から酢酸エチルを用いたフラッシュクロマト
グラフィーにより収量８８．５ｍｇの黄色の固体の化合
物４ａを収率８４％で得た。（化合物２ａからの２段階
での収率）．１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.25 (s, 1H), 9.87 (s, 1H), 7.51 (d, J=15.9Hz, 1
H),7.44 (d, J=1.8Hz, 1H), 7.42 (s, 1H),6.84 (d, J=
1.8Hz, 1H), 6.11 (d, J=15.9Hz, 1H),4.16 (q, J=7.0H
z, 2H), 4.13 (s, 3H), 3.70 (s, 3H),2.02 (s, 3H),
1.24 (t, J=7.0Hz, 3H).
ｇ（０．５８ｍｍｏｌ）を溶解させ、さらにトリエチル
ホスホノアセテート１１６ｍｌを加えた。この反応溶液
を５分間撹拌した後、ＴＨＦ２５ｍｌに溶解した化合物
３ａを加え、終夜反応させた。ＴＨＦを減圧留去し、得
られた残査から酢酸エチルを用いたフラッシュクロマト
グラフィーにより収量８８．５ｍｇの黄色の固体の化合
物４ａを収率８４％で得た。（化合物２ａからの２段階
での収率）．１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.25 (s, 1H), 9.87 (s, 1H), 7.51 (d, J=15.9Hz, 1
H),7.44 (d, J=1.8Hz, 1H), 7.42 (s, 1H),6.84 (d, J=
1.8Hz, 1H), 6.11 (d, J=15.9Hz, 1H),4.16 (q, J=7.0H
z, 2H), 4.13 (s, 3H), 3.70 (s, 3H),2.02 (s, 3H),
1.24 (t, J=7.0Hz, 3H).
【００２５】実施例６（化合物４ｂ（Ｘ＝ＣＨ）の製
造） 化合物４ｂは化合物４ａと同様の方法で収率５５％で得
た。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 9.87 (s, 1H), 9.78 (s, 1H), 7.51 (d, J=15.5Hz, 1
H),7.39(d, J=2.0Hz, 1H), 7.13 (d, J=2.0Hz, 1H),6.8
5 (d, J=2.0Hz, 1H), 6.73 (d, J=2.0Hz, 1H),6.07 (d,
J=15.5Hz, 1H), 4.16 (q, J=7.0Hz, 2H),3.82 (s, 3
H), 3.68 (s, 3H), 1.97 (s, 3H),1.23 (t, J=7.0Hz, 3
H).
造） 化合物４ｂは化合物４ａと同様の方法で収率５５％で得
た。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 9.87 (s, 1H), 9.78 (s, 1H), 7.51 (d, J=15.5Hz, 1
H),7.39(d, J=2.0Hz, 1H), 7.13 (d, J=2.0Hz, 1H),6.8
5 (d, J=2.0Hz, 1H), 6.73 (d, J=2.0Hz, 1H),6.07 (d,
J=15.5Hz, 1H), 4.16 (q, J=7.0Hz, 2H),3.82 (s, 3
H), 3.68 (s, 3H), 1.97 (s, 3H),1.23 (t, J=7.0Hz, 3
H).
【００２６】実施例７（化合物５ａ（Ｘ＝Ｎ）の製造） ＣＨ３ＯＨ ５ｍｌ中に化合物４ａ ７０ｍｇ（０．２
ｍｍｏｌ）、２Ｎ稀ＮａＯＨ １．５ｍｌと水３ｍｌを
加えた反応溶液を室温下で４．５時間撹拌した。 溶媒
を減圧留去により除去した後、水２０ｍｌを加えた。こ
の溶液をろ過し、ろ液を２Ｎ ＨＣｌによりｐＨ２〜３
にした。これにより得られたゲル状の沈殿物をろ過し、
収量４３ｍｇで化合物５ａを収率６７％で得た。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.24 (s, 1H), 9.84 (s, 1H), 7.43 (d, J=15.0Hz, 1
H),7.41 (s, 1H), 7.40 (s, 1H), 6.78 (s, 1H),6.03
(d, J=15.0Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.67 (s, 3H),3.86
(s, 3H); ＥＳＩＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１５Ｈ１６Ｎ５Ｏ４として；計算値（Ｍ−Ｈ） 330.3 実測値 330.2
ｍｍｏｌ）、２Ｎ稀ＮａＯＨ １．５ｍｌと水３ｍｌを
加えた反応溶液を室温下で４．５時間撹拌した。 溶媒
を減圧留去により除去した後、水２０ｍｌを加えた。こ
の溶液をろ過し、ろ液を２Ｎ ＨＣｌによりｐＨ２〜３
にした。これにより得られたゲル状の沈殿物をろ過し、
収量４３ｍｇで化合物５ａを収率６７％で得た。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.24 (s, 1H), 9.84 (s, 1H), 7.43 (d, J=15.0Hz, 1
H),7.41 (s, 1H), 7.40 (s, 1H), 6.78 (s, 1H),6.03
(d, J=15.0Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.67 (s, 3H),3.86
(s, 3H); ＥＳＩＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１５Ｈ１６Ｎ５Ｏ４として；計算値（Ｍ−Ｈ） 330.3 実測値 330.2
【００２７】実施例８（化合物５ｂ（Ｘ＝ＣＨ）の製
造） 化合物５ｂは化合物５ａと同様の方法で収率５７％で得
た。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 9.83 (s, 1H), 9.78 (s, 1H), 7.38 (d, J=16.0Hz, 1
H),7.34 (s, H), 7.13 (d, J=2.0Hz, 1H),6.84 (d, J=
2.0Hz, 1H), 6.64 (s, 1H),5.99 (d, J=16.0Hz, 1H),
3.82 (s, 3H),3.65 (s, 3H), 1.99 (s, 3H); ＥＳＩＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１６Ｈ１７Ｎ４Ｏ４として；計算値（Ｍ−Ｈ） 329.3 実測値 329.4
造） 化合物５ｂは化合物５ａと同様の方法で収率５７％で得
た。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 9.83 (s, 1H), 9.78 (s, 1H), 7.38 (d, J=16.0Hz, 1
H),7.34 (s, H), 7.13 (d, J=2.0Hz, 1H),6.84 (d, J=
2.0Hz, 1H), 6.64 (s, 1H),5.99 (d, J=16.0Hz, 1H),
3.82 (s, 3H),3.65 (s, 3H), 1.99 (s, 3H); ＥＳＩＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１６Ｈ１７Ｎ４Ｏ４として；計算値（Ｍ−Ｈ） 329.3 実測値 329.4
【００２８】実施例９（化合物６ａ（Ｘ＝Ｎ）の製造） ＤＭＦ２ｍｌ中に化合物５ａ ２６．４ｍｇ（０．０８
ｍｍｏｌ）、１，１’−カルボキシルジイミダゾール４
９．９ｍｇ（０．３１ｍｍｏｌ）を加えた。この反応溶
液を室温下で終夜撹拌した後、水２０ｍｌを加え、ろ過
して黄色の沈殿物として化合物６ａを収量２０．５ｍｇ
収率６８％で得た。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.23 (s, 1H), 10.04 (s, 1H), 8.67 (s, 1H),7.90
(d, J=1.0Hz, 1H), 7.88 (d, J=15.5Hz, 1H),7.50 (d,
J=2.0Hz, 1H), 7.44 (s, 1H),7.32 (d, J=2.0Hz, 1H),
7.16 (d, J=15.5Hz, 1H),7.10 (S, 1H), 3.96 (s, 3H),
3.79 (s, 3H),2.03 (s, 3H); ＥＳＩＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１８Ｈ１８Ｎ７Ｏ３として；計算値（Ｍ−Ｈ） 380.4 実測値 380.4
ｍｍｏｌ）、１，１’−カルボキシルジイミダゾール４
９．９ｍｇ（０．３１ｍｍｏｌ）を加えた。この反応溶
液を室温下で終夜撹拌した後、水２０ｍｌを加え、ろ過
して黄色の沈殿物として化合物６ａを収量２０．５ｍｇ
収率６８％で得た。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.23 (s, 1H), 10.04 (s, 1H), 8.67 (s, 1H),7.90
(d, J=1.0Hz, 1H), 7.88 (d, J=15.5Hz, 1H),7.50 (d,
J=2.0Hz, 1H), 7.44 (s, 1H),7.32 (d, J=2.0Hz, 1H),
7.16 (d, J=15.5Hz, 1H),7.10 (S, 1H), 3.96 (s, 3H),
3.79 (s, 3H),2.03 (s, 3H); ＥＳＩＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１８Ｈ１８Ｎ７Ｏ３として；計算値（Ｍ−Ｈ） 380.4 実測値 380.4
【００２９】実施例１０（化合物６ｂ（Ｘ＝ＣＨ）の製
造） 化合物６ｂは化合物６ａと同様の方法で収率８０％で得
た。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.1 (s, 1H), 9.82 (s, 1H), 8.68 (s, 1H),7.91 (t,
J=2.0 and 2.0Hz, 1H),7.87 (d, J=15.0Hz, 1H), 7.48
(d, J=2.0Hz, 1H),7.22 (d, J=2.0Hz, 1H), 7.16 (d, J
=1.5Hz, 1H),7.14 (d, J=15.0Hz, 1H), 7.10 (s, 1H),
6.89 (d, J=1.5Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.78 (s, 3H),
1.97 (s, 3H); ＥＳＩＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１９Ｈ１９Ｎ６Ｏ３として；計算値（Ｍ−Ｈ） 379.4 実測値 379.4
造） 化合物６ｂは化合物６ａと同様の方法で収率８０％で得
た。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 10.1 (s, 1H), 9.82 (s, 1H), 8.68 (s, 1H),7.91 (t,
J=2.0 and 2.0Hz, 1H),7.87 (d, J=15.0Hz, 1H), 7.48
(d, J=2.0Hz, 1H),7.22 (d, J=2.0Hz, 1H), 7.16 (d, J
=1.5Hz, 1H),7.14 (d, J=15.0Hz, 1H), 7.10 (s, 1H),
6.89 (d, J=1.5Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.78 (s, 3H),
1.97 (s, 3H); ＥＳＩＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１９Ｈ１９Ｎ６Ｏ３として；計算値（Ｍ−Ｈ） 379.4 実測値 379.4
【００３０】実施例１１（化合物７ａ（Ｘ＝Ｎ）の製
造） −５０℃においてＤＭＦ０．３ｍｌ中に水素化ナトリウ
ム（６０％）３．２ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ）を溶解さ
せた溶液を、ＤＭＦ０．３ｍｌにＤＵ８６のセグメント
Ａ６．１ｍｇ（０．０２４ｍｍｏｌ）を溶解させた溶液
を加えた。この反応溶液を−５０〜−４０℃下で３時間
撹拌した後にＤＭＦ １ｍｌに化合物６ａ１０．８ｍｇ
（０．０２８ｍｍｏｌ）を溶解させた溶液を−５０℃下
で加えて、更に−４０℃下で５時間撹拌した後、−３０
℃に保つ冷凍庫で２日間置いた。その後、リン酸ナトリ
ウム緩衝液（０．０１Ｍ）３ｍｌを加えて、室温下で５
分間撹拌した。溶媒を減圧留去して得られた黄色の残さ
をＣＨ３ＯＨとＣＨＣｌ３を用いたフラッシュクロマト
グラフィーにより精製して収量１２．３ｍｇの化合物７
ａを収率９１％で得た。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 12.36 (s, 1H), 10.24 (s, 1H), 9.97 (s, 1H),7.58
(d, J=15.0Hz, 1H), 7.43 (s, 1H),7.41 (d, J=2.0Hz,
1H), 6.99 (d, J=2.0Hz, 1H),6.85 (s, 1H), 6.58 (d,
J=15.0Hz, 1H),4.29 (d, J=10.5Hz, 1H),4.19 (dd, J=
5.0Hz and 4.5Hz, 1H), 3.95 (s, 3H),3.73 (s, 3H),
3.72 (s, 3H), 3.46 (m, 1H),2.47 (s, 3H), 2.08 (m,
1H), 2.02 (s, 3H),1.29 (t, J=4.5 and 3.5Hz, 1H); ＥＳＩＭＳ ｍ／ｅ Ｃ２９Ｈ２８Ｎ７Ｏ６として；計算値（Ｍ−Ｈ） 570.6 実測値 570.4
造） −５０℃においてＤＭＦ０．３ｍｌ中に水素化ナトリウ
ム（６０％）３．２ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ）を溶解さ
せた溶液を、ＤＭＦ０．３ｍｌにＤＵ８６のセグメント
Ａ６．１ｍｇ（０．０２４ｍｍｏｌ）を溶解させた溶液
を加えた。この反応溶液を−５０〜−４０℃下で３時間
撹拌した後にＤＭＦ １ｍｌに化合物６ａ１０．８ｍｇ
（０．０２８ｍｍｏｌ）を溶解させた溶液を−５０℃下
で加えて、更に−４０℃下で５時間撹拌した後、−３０
℃に保つ冷凍庫で２日間置いた。その後、リン酸ナトリ
ウム緩衝液（０．０１Ｍ）３ｍｌを加えて、室温下で５
分間撹拌した。溶媒を減圧留去して得られた黄色の残さ
をＣＨ３ＯＨとＣＨＣｌ３を用いたフラッシュクロマト
グラフィーにより精製して収量１２．３ｍｇの化合物７
ａを収率９１％で得た。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 12.36 (s, 1H), 10.24 (s, 1H), 9.97 (s, 1H),7.58
(d, J=15.0Hz, 1H), 7.43 (s, 1H),7.41 (d, J=2.0Hz,
1H), 6.99 (d, J=2.0Hz, 1H),6.85 (s, 1H), 6.58 (d,
J=15.0Hz, 1H),4.29 (d, J=10.5Hz, 1H),4.19 (dd, J=
5.0Hz and 4.5Hz, 1H), 3.95 (s, 3H),3.73 (s, 3H),
3.72 (s, 3H), 3.46 (m, 1H),2.47 (s, 3H), 2.08 (m,
1H), 2.02 (s, 3H),1.29 (t, J=4.5 and 3.5Hz, 1H); ＥＳＩＭＳ ｍ／ｅ Ｃ２９Ｈ２８Ｎ７Ｏ６として；計算値（Ｍ−Ｈ） 570.6 実測値 570.4
【００３１】実施例１２（化合物７ｂ（Ｘ＝ＣＨ）の製
造） 化合物７ｂは化合物７ａと同様の方法で収率７７％で得
た。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 12.36 (s, 1H), 9.90 (s, 1H), 9.80 (s, 1H),7.57 (d,
J=15.0Hz, 1H), 7.38 (d, J=1.5Hz, 1H),7.14 (d, J=
2.0Hz, 1H), 6.88 (d, J=1.5Hz, 1H),6.86 (d, J=2.0H
z, 1H), 6.84(s, 1H),6.56 (d, J=15.0Hz, 1H), 4.29
(d, J=10.5Hz, 1H),4.19 (dd, J=4.0 and 4.5Hz, 1H),
3.83 (s, 3H),3.73 (s, 1H), 3.71 (s, 1H), 3.46 (m,
1H),2.47 (s, 3H), 2.09 (m, 1H), 1.97 (s, 3H),1.29
(t, J=4.5 and 3.5Hz, 1H); ＥＳＩＭＳ ｍ／ｅ Ｃ３０Ｈ２９Ｎ６Ｏ６として；計算値（Ｍ−Ｈ） 569.6 実測値 569.5
造） 化合物７ｂは化合物７ａと同様の方法で収率７７％で得
た。１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ 12.36 (s, 1H), 9.90 (s, 1H), 9.80 (s, 1H),7.57 (d,
J=15.0Hz, 1H), 7.38 (d, J=1.5Hz, 1H),7.14 (d, J=
2.0Hz, 1H), 6.88 (d, J=1.5Hz, 1H),6.86 (d, J=2.0H
z, 1H), 6.84(s, 1H),6.56 (d, J=15.0Hz, 1H), 4.29
(d, J=10.5Hz, 1H),4.19 (dd, J=4.0 and 4.5Hz, 1H),
3.83 (s, 3H),3.73 (s, 1H), 3.71 (s, 1H), 3.46 (m,
1H),2.47 (s, 3H), 2.09 (m, 1H), 1.97 (s, 3H),1.29
(t, J=4.5 and 3.5Hz, 1H); ＥＳＩＭＳ ｍ／ｅ Ｃ３０Ｈ２９Ｎ６Ｏ６として；計算値（Ｍ−Ｈ） 569.6 実測値 569.5
【００３２】実施例１３（４５０ｂｐのＤＮＡフラグメ
ントのアルキル化） （１）５’−テキサスレッド−末端修飾４５０塩基対Ｄ
ＮＡフラグメントの合成。 ５’−テキサスレッド−末端修飾４５０ｂｐＤＮＡフラ
グメントｐＵＣ１８Ｆ７８０＊−１２２９とｐＵＣ１８
Ｒ１４５９＊−１９０８（これらは相補的配列）は、
５’−末端テキサスレッド修飾１８ｍｅｒｓをプライマ
ーとして用いたＰＣＲ法により製造され、Ｓｕｐｒｅｃ
−０２によって精製された。これらの濃度はエチヂュウ
ムブロマイド染色法によって決定された。アスタリスク
はテキサスレッド修飾位置を示し、数字は複製開始点か
らのヌクレオチド番号を示している。この塩基配列を配
列表の配列番号１及び２に示す。 （２）高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動。 全量１０μｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
１２．５ｍＭ中に５’末端がテキサスレッドでラベルさ
れたＤＮＡフラグメント６０ｎＭ、ＤＭＦ５％（ｖ／
ｖ）とさまざまな濃度の薬剤を含む標準反応溶液を微量
遠心分離管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に入れて室温下で一
晩温置した後、ｃａｌｆ ｔｈｙｍｕｓＤＮＡ（５ｍ
Ｍ，１μｌ）を加えて９０℃５分間加熱した。ＤＮＡは
エタノール沈殿により得られた。得られたＤＮＡはロー
ディング色素（フューシンレッドのＤＭＦ溶液）８μｌ
に溶解させた。サンプル溶液はＤＮＡを変性させるた
め、９４℃２０分温置した後、すぐに０℃に冷却した。
２μｌについて、５５００−ＳＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅｒ ｓｙｓｔｅｍを用いた、６％ ロングレンジャー
（登録商標）を用い、ポリアクリルアミドゲルでの電気
泳動にかけられた。
ントのアルキル化） （１）５’−テキサスレッド−末端修飾４５０塩基対Ｄ
ＮＡフラグメントの合成。 ５’−テキサスレッド−末端修飾４５０ｂｐＤＮＡフラ
グメントｐＵＣ１８Ｆ７８０＊−１２２９とｐＵＣ１８
Ｒ１４５９＊−１９０８（これらは相補的配列）は、
５’−末端テキサスレッド修飾１８ｍｅｒｓをプライマ
ーとして用いたＰＣＲ法により製造され、Ｓｕｐｒｅｃ
−０２によって精製された。これらの濃度はエチヂュウ
ムブロマイド染色法によって決定された。アスタリスク
はテキサスレッド修飾位置を示し、数字は複製開始点か
らのヌクレオチド番号を示している。この塩基配列を配
列表の配列番号１及び２に示す。 （２）高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動。 全量１０μｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
１２．５ｍＭ中に５’末端がテキサスレッドでラベルさ
れたＤＮＡフラグメント６０ｎＭ、ＤＭＦ５％（ｖ／
ｖ）とさまざまな濃度の薬剤を含む標準反応溶液を微量
遠心分離管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に入れて室温下で一
晩温置した後、ｃａｌｆ ｔｈｙｍｕｓＤＮＡ（５ｍ
Ｍ，１μｌ）を加えて９０℃５分間加熱した。ＤＮＡは
エタノール沈殿により得られた。得られたＤＮＡはロー
ディング色素（フューシンレッドのＤＭＦ溶液）８μｌ
に溶解させた。サンプル溶液はＤＮＡを変性させるた
め、９４℃２０分温置した後、すぐに０℃に冷却した。
２μｌについて、５５００−ＳＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅｒ ｓｙｓｔｅｍを用いた、６％ ロングレンジャー
（登録商標）を用い、ポリアクリルアミドゲルでの電気
泳動にかけられた。
【００３３】実施例１４（ＨｅＬａＳ３細胞生育阻害試
験） ２４穴カルチャープレートの各ウェルに１０％牛胎児血
清および２ｍＭグルタミンを含むＭＥＭ培地で２．６７
×１０４個／ｍｌに調整したＨｅＬａＳ３細胞を０．７
５ｍｌずつ分注した。炭酸ガスインキュベーター内で一
晩３７℃で培養後、培地により適宜希釈した表１に示す
各試験化合物を０．２５ｍｌずつ各ウェルに加えた。炭
酸ガスインキュベーター内で細胞を７２時間培養後、培
養上清を除去し、トリプシン・エチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）溶液で細胞を分散、回収した。セルカウン
ターで細胞数を測定し、無処理での細胞数と既知濃度の
試験化合物で処理した場合の細胞数を比較することによ
り、細胞の増殖を５０％阻害する試験化合物の濃度（Ｉ
Ｃ５０）を算出した。その結果を下表に示す。
験） ２４穴カルチャープレートの各ウェルに１０％牛胎児血
清および２ｍＭグルタミンを含むＭＥＭ培地で２．６７
×１０４個／ｍｌに調整したＨｅＬａＳ３細胞を０．７
５ｍｌずつ分注した。炭酸ガスインキュベーター内で一
晩３７℃で培養後、培地により適宜希釈した表１に示す
各試験化合物を０．２５ｍｌずつ各ウェルに加えた。炭
酸ガスインキュベーター内で細胞を７２時間培養後、培
養上清を除去し、トリプシン・エチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）溶液で細胞を分散、回収した。セルカウン
ターで細胞数を測定し、無処理での細胞数と既知濃度の
試験化合物で処理した場合の細胞数を比較することによ
り、細胞の増殖を５０％阻害する試験化合物の濃度（Ｉ
Ｃ５０）を算出した。その結果を下表に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【発明の効果】本発明は、２本鎖のＤＮＡを同時にアル
キル化又は切断することができる合成可能な化合物を提
供するものであり、人工の制限酵素として有用なばかり
でなく、特定の塩基配列をターゲットとして遺伝子治療
において有用なものである。
キル化又は切断することができる合成可能な化合物を提
供するものであり、人工の制限酵素として有用なばかり
でなく、特定の塩基配列をターゲットとして遺伝子治療
において有用なものである。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science And Technology Corporation <120> Compound to cleavage double-stranded DNA and their use <130> PA908444 <160> 2 <210> 1 <211> 450 <212> DNA <213> pUC 18 <400> 1 agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 60 ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 120 caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 180 gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 240 cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta 300 tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 360 gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 420 cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 450 <210> 2 <211> 450 <212> DNA <213> pUC 18 <400> 2 tcttagtccc ctattgcgtc ctttcttgta cactcgtttt ccggtcgttt tccggtcctt 60 ggcatttttc cggcgcaacg accgcaaaaa ggtatccgag gcggggggac tgctcgtagt 120 gtttttagct gcgagttcag tctccaccgc tttgggctgt cctgatattt ctatggtccg 180 caaaggggga ccttcgaggg agcacgcgag aggacaaggc tgggacggcg aatggcctat 240 ggacaggcgg aaagagggaa gcccttagca ccgcgaaaga gttacgagtg cgacatccat 300 agactcaagc cacatccagc aagcgaggtt cgacccgaca cacgtgcttg gggggcaagt 360 cgggctggcg acgcggaata ggccattgat agcagaactc aggttgggcc attctgtgct 420 gaatagcggt gaccgtcgtc ggtgaccatt 450
【図１】図１は、本発明のＩｍＰｙＬＤｕ８６とＤＮＡ
との反応の結果を示した、図面に代わる写真である。
との反応の結果を示した、図面に代わる写真である。
【図２】図２は、実験に使用したＤＮＡの塩基配列及び
ＩｍＰｙＬＤｕ８６の化学構造を示したものである。
ＩｍＰｙＬＤｕ８６の化学構造を示したものである。
【図３】図３は、本発明の化合物によるＤＮＡの切断サ
イトを模式的に示したものである。
イトを模式的に示したものである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年５月９日（２０００．５．９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】 左側の泳動図は２本鎖ＤＮＡの上のスト
ランドの結果、右側の泳動図は下のストランドの結果で
ある。アルキル化の位置は加熱により切断バンドとして
みることができる。その結果低濃度から主に２本鏡ＤＮ
Ａはサイト１とサイト２で２本鎖の切断されていること
がわかり、アルキル化が２本鎖で同時に起っていること
が判断できる。このような切断を引き起こす化合物はこ
れまでに例がなく、まさに人工の制限酵素ということが
できる。また用いたＩｍＰｙＬＤｕ８６の量から７０％
の高率で切断が起っていることが判明し、以前に合成し
た分子（特願平１０−２６０７１０号参照）にくらべて
非常に高い効率であることがわかる。
ランドの結果、右側の泳動図は下のストランドの結果で
ある。アルキル化の位置は加熱により切断バンドとして
みることができる。その結果低濃度から主に２本鏡ＤＮ
Ａはサイト１とサイト２で２本鎖の切断されていること
がわかり、アルキル化が２本鎖で同時に起っていること
が判断できる。このような切断を引き起こす化合物はこ
れまでに例がなく、まさに人工の制限酵素ということが
できる。また用いたＩｍＰｙＬＤｕ８６の量から７０％
の高率で切断が起っていることが判明し、以前に合成し
た分子（特願平１０−２６０７１０号参照）にくらべて
非常に高い効率であることがわかる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 HA09 HA11 HA20 4C050 AA01 AA07 AA08 BB04 CC04 EE02 FF02 FF03 GG03 HH04 4C086 AA01 AA02 AA03 CB03 MA01 MA02 MA04 MA05 NA14 ZB21 ZB26 ZC41
Claims (10)
- 【請求項１】 一般式（Ｉ） Ｂ−Ｌ−Ａ （Ｉ） （式中、ＢはＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造を
示し、ＡはＤＮＡの塩基の一種に結合し得る化学構造を
示し、ＬはＡ及びＢの化学構造を結合させ得るリンカー
を示す。）で表されるＤＮＡの２本鎖を同時に切断する
ことができる化合物。 - 【請求項２】 ＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造
が、置換基を有してもよいピロール及び／又はイミダゾ
ールから誘導される化学構造である請求項１に記載の化
合物。 - 【請求項３】 ＤＮＡの塩基の一種に結合し得る化学構
造が、シクロプロパン環を有する化学構造である請求項
１又は２に記載の化合物。 - 【請求項４】 Ａ及びＢの化学構造を結合させ得るリン
カーが、ビニル基を含有する化学構造である請求項１〜
３のいずれかに記載の化合物。 - 【請求項５】 一般式（Ｉ）で表される化合物が次式 【化１】 又は 【化２】 で表される化合物である請求項１〜４のいずれかに記載
の化合物。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載の化合物
を用いて、２本鎖ＤＮＡの特定の塩基配列部分をアルキ
ル化する方法。 - 【請求項７】 請求項１〜５のいずれかに記載の化合物
を用いて、２本鎖ＤＮＡの特定の塩基配列部分を切断す
る方法。 - 【請求項８】 特定の塩基配列が、ＴＧＡＣＧ若しくは
ＣＧＡＣＧ又はそれらの相補鎖である請求項６又は７に
記載の方法。 - 【請求項９】 請求項１から５のいずれかに記載の化合
物及び製薬上許容される担体からなる医薬組成物。 - 【請求項１０】 癌の治療薬である請求項９に記載の医
薬組成物。
Priority Applications (8)
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|---|---|---|---|
| JP08359199A JP3649617B2 (ja) | 1999-03-26 | 1999-03-26 | ２本鎖ｄｎａを切断できる化合物及びその使用方法 |
| CA002328903A CA2328903C (en) | 1999-03-26 | 2000-03-10 | Compounds capable of cleaving double-stranded dna and method of utilization of the same |
| PCT/JP2000/001461 WO2000058312A1 (fr) | 1999-03-26 | 2000-03-10 | Composes capables de cliver la double helice d'adn et mode d'utilisation |
| US09/701,264 US6713633B1 (en) | 1999-03-26 | 2000-03-10 | Compounds capable of cleaving double-stranded DNA and method of utilization of the same |
| KR1020007012137A KR100745440B1 (ko) | 1999-03-26 | 2000-03-10 | 2본쇄 디엔에이를 절단할 수 있는 화합물 및 그 사용 방법 |
| EP00907992A EP1083177B1 (en) | 1999-03-26 | 2000-03-10 | Compounds capable of cleaving double-stranded dna and method of utilization of the same |
| DE60035154T DE60035154T2 (de) | 1999-03-26 | 2000-03-10 | Verbindungen zum spalten von doppelstrang-dns sowie verfahren zu deren verwendung |
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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- 1999-03-26 JP JP08359199A patent/JP3649617B2/ja not_active Expired - Fee Related
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- 2000-03-10 CA CA002328903A patent/CA2328903C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-10 US US09/701,264 patent/US6713633B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-24 TW TW089105426A patent/TWI267515B/zh not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
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