TWI246930B - Electro-kinetic device and electrode disk for electroporation and method for electroporating cells - Google Patents

Description

1246930 九、發明說明： [發明所屬之技術領域] 本案係尚未獲准之美國專利申請案序號Ν〇· 10/360,768 ’案名為「電穿孔之固定電流電極裝配」 C_nt Electrode Assembly for Electroporation，，），申請曰為 2〇〇2 年 3 月7日，之部分連縯案，該申請案之全部内容以參考資料 合併於本文。 本發明係關於一種電穿孔裝置及其於身體或植物之經 選定之組織之細胞中幫助巨分子導入之用法。該電穿孔裝 置包括一電動裝置（EKD)，其依照使用者之控制及輸入之脈 衝參數，於電極陣列間提供一系列程式控制之固定-電流脈 衝圖案，且可儲存及取得數據。該電穿孔裝置亦包括一可 置換或可替換之具有針狀電極陣列之電極盤、注射針之 中央注射通道、以及可移除之引導盤。 [先前技術] 傳、、先上，將質體轉移技術限制於顯微鏡下，這係因為 、呈由裸路之DNA轉移而產生之體内表現程度相當低，其片 &僅月b藉由病母基因轉移而達成。許多研究人員已揭示以 ，骨乍為DNA載體而注射至動物及人類時，該安全性及毒 性之考WPilaro及Serabian’ 1999)。因此，直接注射質體 DNA成為更吸弓i人之實行上之替代方案。持續性之質體 A轉移係應用—系列電脈衝以驅動DNA進入穩定、非_ 刀裂之、、、田胞族群而完成。骨骼肌細胞於DNa疫苗及其他應 1246930 用等之直接質體轉移上提供了 一理想的標的（M〇r及Eliza， 2001 ; Stoll及Calos，2002)。利用電穿孔增強質體遞送可 使經注射之肌肉成為生物反應器以持續地生產及分泌蛋白 質至血液中。藉由超過單獨注射質體達二至三級時可將表 現程度增加至可與腺病毒-中介之基因遞送相比之程度，以 及於某些例子中可達到生理範圍。 體内質體遞送之方法，稱為電穿孔、電-通透作用、或 電動增強法，係簡單、有效且具有再現性之方法。其有助 於基礎研究’且於基因轉移及DNA疫苗上具有良好效能。 電穿孔已成功地用於轉染經注射質體後之腫瘤細胞或於人 類中用於將抗·腫瘤藥物平陽激素（bleomycin)遞送至皮膚 及皮下腫瘤。電穿孔已廣泛地用於小鼠、大鼠、狗及豬， 俾遞送可編碼各種激素、細胞激素、酵素或抗原之治療性 基因。許多組織及器官已成為電穿孔之標的物包含肝、皮 膚、眼、睪丸、心肌、平滑肌、不同位置之腫瘤、以及骨 絡肌。 廣泛地’電穿孔係利用穿膜電場脈衝於生物膜中誘導 出微通道（孔洞）。這些孔洞通常稱為「電孔」（electr〇p〇res)。 由於此等孔洞之存在，使巨分子、離子、以及水可從膜之 一側通往另一側。因此，已將電穿孔用於使藥物、DNA或 其他分子導入至多細胞組織中，以及證明其可有效治療特 定疾病。然而，於活體中使用電穿孔仍具有數種問題，包 含由熱及電孔無法復原所造成之細胞死亡。因先前技藝之 電穿孔法會產生過多的熱而使細胞死亡故藥物或巨分子之 1246930 有益的效果受到限制。 為了更加明瞭電穿孔之程序，需要了解一些簡單的方 程式。當於經植入組織之電極間施加一電位差（電壓）時， 可產生-電場⑻，其係所施加之電壓（v)除上電極間之距 離⑷。 E=V/d 當用公式表示將藥物或巨分子遞送至受者之細胞中的 電穿孔規程時，μ前技藝中電場強度為非常重要之 值。電壓固料，電場強度與電極間之距離成反比，亦即 當電極間之距離減少時，電場強度則增加。然而，應注音， 於組織中可用絕緣電極產生電場（亦即，離子流非為建^電 場所需之條件)。然不欲受限於理論，於電穿孔期間係離子 流打開電孔且使分子移動至受者之細胞。導體或介質中具 有電位差之兩點間的電荷流動稱為電流 '组織中，電極間 的電流係由離子或帶電荷之+ ▼电订之拉子形成，其可於組織及病患 中改變。再者’自電脈衝開始至電脈衝結束，組織中電傳 導離子之流動可發生改變。 當組織具有小部分之電傳導離子時，電阻增加，熱能 產生且殺死細胞。歐姆定使本、去 臥；&律表達出電流⑴、電壓（v)、及電 阻（R)間之關係：

R=V/I 之帶電粒子而 組織内之電阻會 兩電極間組織之電阻會根據其中存在 變。因此，自電脈衝開始至電脈衝結束， 改變。 1246930 熱月b係電極間阻抗（亦即電阻與電抗之組合，且單位以 歐姆計）之產物’且與電流、電壓及脈衝持續時間之乘積成 正比。熱能亦可表示為電流的平方與脈衝持續時間（t，時 間）。例如，電穿孔期間，於支持組織中產生之熱能或功率 (w，瓦特）可由下列方程式表示·· W=I2Rt 概括地，先前技藝揭示將金屬電極與組織接觸且對電 極施加預先決定電壓之短脈衝，俾使細胞短暫地開啟膜孔 洞。目則的電穿孔程序係用所得到之電場強度E (其係取決 於與電極間之距離成比例之電壓短脈衝）決定，而不考慮電 流。因此，不能依欲進行電穿孔之組織來決定電阻或熱能， 其造成利用不同之脈衝電壓電穿孔程序會得到不各種結 果。备然，有效的電穿孔程序及造成細胞死亡之電穿孔程 序間電壓脈衝之上限振幅的差異很小。此外，已發現因短 電壓脈衝之上限振幅所造成細胞死亡及細胞熱間的確切關 係。因此，電極間之細胞過熱係造成任何給定之電穿孔電 壓脈衝程序無效的主要原因。再者，電極間之電流係作為 決定任何給定之脈衝程序是否有效之主要因素，而非電極 間之電壓。 當電遞送至受者之細胞時’該電量可由電荷（Q)予以精 確地表示，其係電流（I)及時間⑴之乘積，公式如下： Q=It 若電流不固定，如先前技藝中之電穿孔儀器，Q代表工 的時間積分。此方面，帶電粒子（其為離子或分子）以類似 1246930 之方式表現。例如，當銀離子沉積於電極俾界定電荷之標 準早位（庫倫）時，只有該電荷，如上所界定者，係重要的。 需要一特定最小電壓俾產生電流，但沉積之離子的數量無 法由預先決定之電壓所確定。相對地，電穿孔中經遞送至 、、、田I之^Γ電何的粒子的數量無法由施加至電極上之電壓而 確定。 雖然電穿孔已廣泛地用於實驗室基因轉染且於非_病 毒基因療法上日趨重要，但因缺乏預測電穿孔對細胞作用 之方法而通常利用嘗試與錯誤來使實驗方法最適化 (Canatella及prausnitz，2001)。例如，已顯示可藉由對經注 射枭體DNA之肌肉施加電場而顯著地改善質體基因轉移 至骨胳肌之效率 '然而，此電轉移會對肌肉造成顯著的傷 害而大量損失經轉染之肌肉纖維（McMah〇n等人，2〇〇1)。 此技術採用減少電壓之方法而能降低對肌肉之傷害，同時 運算式也簡化，而經轉染之纖維數量並未顯著降低。 電穿孔之功效受限於脈衝強度之閥值（thresh〇u vaiue)，低於該閥值日夺，不會發±電穿孔，上限高於閱值時 則會摧毀細胞。實驗證據顯示因上下限間之差異非常小故 很難可在不過度進行實驗下去設計有效之脈衝程序。而使 技術之利用性變得困難。 技藝中與電穿孔裝置相關之參考文獻闡明電極裝置及 電穿孔之體内方法兩者之實用性。相對地，許多美國專利 係請求具體電極，或電穿孔之方法。例如，美國專利第 號係關於美容應用方面藉由電力輔助局部遞送 1246930 藥劑之方法及裝置；美國專利第5,676,646號係關於一種藉 由電牙孔裝置將分子植入病患之活體細胞之流；美國專利 第ό，241，701與6,233,482號說明經由電穿孔遞送藥物及基 因之方法及裝置。詳言之，此等專利說明一種用於治療腫 瘤之電穿孔療法（ΕΡΤ)的方法及裝置，亦即將使用本發明裝 置進行之電穿孔法與化療藥劑組合俾於體内使腫瘤產生衰 L，美國專利第6,2 1 6,034號說明一種設計用於組織之電穿 孔療法之針狀電極陣列之方法；美國專利第6,2〇8,893號說 明一種具有連接性電極模板之電穿孔裝置；美國專利第 6,192,270號說明一種裝置之電極配件以及穿透·表面分子 之遞送方法，美國專利第·6，181，964號說明一種微型侵入裝 置以及利用電穿孔將藥物及基因遞送至組織中之方法。如 本發明所述利用ΕΡΤ，藉由使用本發明之裝置進行之電穿 孔與化療藥劑之組合，經治療之腫瘤可於體内發現腫瘤衰 L美國專利第6，150，148號說明一種於電穿孔過程中可控 制溫度之電穿孔裝置，其係根據使用者-指定之脈衝及溫度 側繪計畫藉由產生及施加電場而控制溫度；美國專利第 6，120,493號說明一種利用電場電穿孔裝置導入治療劑之 方法；美國專利第6,096,020號說明一種根據使用者指定 之脈衝計畫而產生及施加電場之電穿孔方法及裝置；美國 專利第6,〇68,650號說明一種選擇性施加針狀陣列構型來 進行體内電牙孔療法之方法；以及美國專利第 號說明一種將電穿孔施用於病患之部分身體上之電極裝 置，該裝置具有可感應電極間之距離且可產生距離訊號（該 1246930 訊號與該電極間之距離成比例）的感應元件，以及回應該距 離訊號之工具，俾對電極施加與電極間之距離成比狀高 振幅電子訊號脈衝。所有弓丨用之專利係以參考資料合併於 本文。 最近已發現於活體内利用電穿孔在增強質體表現方面 有顯著的進展且經分泌之蛋白質可達到生理程度 (Draghia-Akli等人，2002)。研究結果顯示注射可表現生長 激素釋放激素（GHRH)之質體，接著進行電穿孔係可行的， 且代表於治療大型哺乳動物方面可穩定地產生所分泌之蛋 白質（Draghia-Akli 等人，2003a ; Draghia_Akli 等人， 2〇〇3b)。儘管近來於裸質體遞送上有所進展（Dean等人， 2003;Fattori等人，2002)，電穿孔技術上仍需要其他改善。 先前研究人員已將電穿孔裝置用於質體DNa之轉 移，其概念上皆係基於固定之電壓系統，利用預先決定之 電極間之電壓。由於經包埋於組織内之電極間的阻抗係隨 案例或組織而變，故預先決定之電壓無法產生出預先決定 之電流。於脈衝持續期間，除了損失掉完整的方波功能外， 預先決定之電壓脈衝於流經肌肉組織時會造成電流不規則 的增加。反之，固定·電流來源實際上可於固定電流流經肌 肉組織時維持方波功能。然而，目前市售之電穿孔裝置不 具有可測量細胞暴露於其下確實之電流量的韌體設計。習 用之電穿孔裝置所產生之不規則電流會使組織中產生熱能 而輕易地殺死細胞（Martin等人，2002 ; Pliquett等人， 2〇〇2)。例如，平均電流為5安培（A，或Amp)之50毫秒（ms) 11 1246930 的電脈衝經過25歐姆的負载阻抗時，理論上可使組織溫度 增加7.5。(；，此足以殺死細胞。由電休克（eiectHcai sh〇ck) 造成組織傷害之物理學可參見Lee等人之著述（Lee等人， 2000)。反之，固定電流系統中功率消耗減少，以及控制組 織發熱，而減少對組織之傷害且有助於電穿孔程序上全面 f生的成功。因此，需要藉由提供一種可有效控制經遞送至 細胞之電量的裝4，卩避免產±與固定電壓冑穿孔法相關 之技術上之問題，因而完成專業的電穿孔。 先刖技藝中所呈現之電極問題係起因於脈衝能量集甲 於陣列之中央’即欲轉染之物質經沉澱處 '结果，能量遞 达之空間分布呈現出非常不均勻之狀態。因此，僅小部份 體積之經包含於電極配件之細胞受到電穿孔作用。故亦需 要提供一種裝置，其可藉由精確地控制打到細胞膜之導管 上的離子流，以有效地控制於電極内之空間中所遞送至細 胞之電量。 再者，市售可得之電穿孔裝置及針狀陣列一般無法於 一個組合操作中進行注射及電穿孔。利用此等器具，該程 序需要將注射針插入標的之肌肉以遞送質體，然後移開。 接著，將電極插入肌肉上經注射之區域附近，通常係在皮 膚上作記號以幫助識別。然而，下層之肌肉可能更多或收 縮使彳于在針狀電極之範圍下的注射位置不完整。因此，需 j要一種電穿孔裝置，其可於一個組合操作中進行注射及電 穿孔，俾於整個電穿孔程序中使針狀電極可涵蓋注射位置。 此外使用皮膚及肌肉侵入性可替換之針狀陣列作為 12 Ϊ246930 έ電極以遞送電流之電穿孔裝置，t需要替換針狀陣列時應 ，持於無菌狀態。此係需求係基於醫療工作與管理條例之 觀點典型地’若於電穿孔儀器把手及電極盤上出現孔洞， 而注射針必須通過該孔洞以將溶液遞送至組織，該孔洞非 為無菌者。根據操作者之技術，該注射針可能會或者不會 碰觸到該孔洞之非-無菌表面。再者，一般係以人工替換‘ :極盤，0而該針狀陣列具有遭到污染之風險。因此，亦 而要提么種電極盤，其可於無菌狀態下遞送該醫藥溶液 以及替換該針狀陣列。 [發明内容] -本發明係關於-種電穿孔裝置，及其於身體或植物之 ，選定之組織之細胞中幫助巨分子導入之用途。該電穿孔 匕括電牙孔賦予器（electroporation enducer)，或電動 裝置（EKD)，其可提供固定電流以產生電場且具有供使用者 由控制器（例如單一-晶片微控制器）控制之硬體以及軟體 或勒體應帛，俾控制電脈衝參數以及以文件紀錄各脈衝之 電特徵。本發明亦一種亦關於一種可替換、或彳置換之電 極皿包括固定於支持結構上之針狀電極陣列，該支持結 構，、有仏主射針之中央注射通道，或中央埠。該中央通道 可使插人針狀電極之同時插人注射針而可於無菌遞送該醫 藥/合液時以電極界定注射區域。亦對電極盤提供可變厚度 之引導盤’使操作者可控制針狀電極穿透之深度以及於不 須接觸該無菌針下替換該電極盤。 13 1246930 該電穿孔裝置與該EKD可用於對細胞進行電穿孔以及 將質體DNA遞送至相鄰之細胞而不會造成永久性之傷 害。再者，利用該電穿孔裝置可增加電穿孔之功效，亦即 僅需小量之質體即可產生足量之標的蛋白質。 該電動裝置（EKD)依照各種使用者-程式控制之脈衝圖 案經由電極針狀陣列提供固定-電流電場，且於身體或植物 之經選定之組織之細胞中幫助巨分子導入。該ekd包括一 具有數個針狀電極之電極配件；電流波形產生器，用於施 加可通過電極陣列之固定·電流脈衝圖案或電流脈衝列波 形；電源；控制電流波形產生器及其他周邊裝置之操作的 控制器，以及波形紀錄器（wavef〇rml〇gger)以紀錄電穿孔 電壓與所產生之波形。EKD之控制器係經由軟體或韌體來 操作，其可讓使用者輸入所欲之參數而控制該EKD之運 轉。該EKD亦包含阻抗測試機（impedance tester)，可視需 要監測標的組織之電阻量。其他構成EKD之元件包含：輸 入裝置，係用於輸入操作參數；狀態-回報裝置，係用於回 報狀悲之為訊，連接埠（C〇mmUniCati〇nSp〇rt);記憶體；以 及電源開關。另一方面該EKD係電極配件，其較佳包含非 -傳導性把手。該電極把手配件包含該針狀電極陣列以及可 包含狀態·回報裝置以及啟動開關。該把手配件亦適用於接 收該可替換之電極盤。 電極盤之中央通道，或埠，可讓適用者於一個操作步 驟中/主射該醫藥溶液以及對該組織區域進行電穿孔，其確 保該注射區域可由針狀電極所涵蓋。該電極盤亦可消除以 14 1246930 相同設備接受注射溶液且伴隨進行電穿孔群組中之受者間 的父叉污染。各盤可經消毒，並藉由抓住該引導盤而插入 至該把手，以及經由中央通道注射該醫藥溶液且無注射針 或該電極污染之風險。 該EKD可產生列於針狀電極配件之至少任兩個電極間 之固定電流脈衝列波形。該EKD可將分散之固定_電流脈 衝遞送至組織區域因此不會發展出電穿孔重疊點 (eleCtroporation overlap p〇ints)。再者，相較於先前技藝， 利用固定-電流脈衝具有數種優點，一優點為可降低熱之產 生因而減；經電穿孔之組織的死亡。本發明之模組電極系 統攜帶容易以及可經由電池包運作。 本發明亦關於辅助巨分子運送至身體或植物之經選定 之組織之細胞中之方法。簡言之，操作者可穩固地將數個 斗狀電極插入身體或植物中經選定之組織。於較佳具體實 :也例中’該針狀電極係可替換之電極盤之部分。可使用該 可移除式引導盤控制該針狀電極之穿透深度。然後將注射 、十L過電極盤之無菌巾央通道。經由注射針將巨分子遞送 至所選擇之組織。啟動該EKD，進入電穿孔序列，以及對 數個針狀電極施加該電極，發序列。經施加之固定-電流 :脈衝有助於將巨分子導入至位於數個電極間之細胞中。 ^由將固I電流維持低於特定臨界值下，可防止因細胞過 熱造成之細胞死亡。當替換電極盤時，可藉由引導盤將電 和盤抓住以確保針狀電極持續於無菌狀態。 15 1246930 [實施方式] 本文中使用之「電流」係指於導體或介質中具有不同 電位之兩點間電荷之流動或流動速率，—般係以安培表示。 本文中使用之「安培」係指測量電流強度之標準單位。 其係導體或導電介質中電荷之流動速率，亦即每秒一庫倫。 本文中使用之「庫倫」係指電荷以米、千克、秒組成 的早位，其大小等於6·28χ1〇18個電子之電荷或於ι秒中 由1安培之電流運送通過導體的電荷。 本文中使用 < 電壓」係指電動勢，或電位差，以伏 特表示’其係電動勢或電場中兩關之電位差之實際單 位，亦即需要ι焦耳的功將丨庫 犀％之正電何自低電位端移 到高電位端。 本文中使用t功率」係指物理或機械力或能量之來 源，其在做工或可用於做工，例如「電力、水力」。 本文中使用t阻抗」係指電路對單頻率交流電電流 產生之總阻力。其係電阻與電抗之組合且以歐姆衡量。 本文中使用之「場」係指自特定點遍佈一區域空間之 物理量。 本文中使用之「快速分離4 、疋刀離機構」係指可安全地固定數 個針狀電極以及快速地自該固定-電流脈衝產生器子系統 分離之任何連接機構。當安全 ^ 田文王地固疋該針狀電極後，該快 速分離機構亦可維持與固定-電流脈衝產生器子系統間之 電性連接。於工程技術中有許多已知之不同類型的快速分 離機構。 16 1246930 本文中使用之「振幅」係指變動量之最大範圍，如交 流電或擺錘之擺盈，-般係以極值之平均或中間值衡量。 其係某事物延伸之量或程度。 本文中使用之「頻率」係指每單位時間之周期性振蕩、 震動、或波動數。通常以赫茲（Hz)表示。 本文中使用之「巨分子」係指核酸序列、蛋白質、脂 質、微泡（例如裝載藥物之囊）、以及藥劑。 本發明係關於一種電動裝置（EKD)，其可對針狀電極陣 列提供固定-電流電場而有助於將巨分子導入至身體或植 物中經選定之組織細胞。該EKD可產生電流脈衝列波形且 與程式序列一致通過電極針陣列之電極，以及於電穿孔進 行期間可監測及紀錄該波形。 本發明亦關於一種可替換、或可置換之電極盤，該電 極盤具有與電穿孔裝置（例如EKD)相關之針狀陣列。該電 極盤具有中央通道或中央埠，其中可將注射針插入俾將該 醫藥溶液無菌遞送，以及具有引導盤，以控制針狀電極之 穿透深度以及幫助電極盤之替換。 第1圖顯示EKD之一較佳具體實施例之系統圖。EKD 之主要功能元件係顯示於該圖中。各元件係由各元件之硬 體機能方面加以說明。由硬體產生之事件的序列係由諸如 下述之軟體或韌體所控制。 EKD之核心元件係該控制器，其負責控制各種與其相 連之周邊裝置。該控制器負責管理電穿孔之程序，包含： (1)產生電穿孔觸發序列或由控制該電流波形產生器產生 17 1246930 供給電極陣列之固定-電流脈衝圖案；（2)進行阻抗試驗俾決 定是否應進行電穿孔；（3)感應及處理使用者之指令；（4) 對使用者提供電穿孔狀態之資訊；經由連接埠將電穿孔 數據傳送至外部電子裝置；以及（6)將電穿孔數據（例如電壓 及電流曲線）儲存至記憶體及自記憶體取得電穿孔數據等 操作。 該控制器較佳係單-晶片微控制器（例如，Texas

Instruments msp430F149、或 Motorola 68HC908AZ60A)， 第2圖顯不微控制器之例。第2圖中標示為「周邊設備」 之區塊代表EKD之任何周邊裝置，其顯示於第丨圖且於下 文中將予以說明。指導該電穿孔程序步驟之軟體較佳為韌 體’這係因為該軟體係永久設定於該微控制器中且係自該 單-晶片微控制器開始執行。 構成EKD之另一元件係電流波形產生器。該電流波形 產生器可產生電流脈衝列波形，其與程式序列一致通過電 極陣列之電極。該脈衝列之形狀為方形且脈衝數係受限於 該軟體或韌體。將一脈衝施加至各電極組。典型地，各脈 衝持續52ms以及產生率為1Hz。脈衝列之振幅係由操作者 予以程式化且範圍自〇.丨八至15A，增加量為〇lA。該電 流波形產生器可由一般功率_電晶體類比電路 (powe卜transistor analog circuits)所組成，其功能由該控制 器指揮。 EKD之其他元件係阻抗測試機。該阻抗測試機可決定 所載物（例如肌肉組織）之電阻是否夠低。若電阻過高，通 18 1246930 t電★之電I可⑨太南而產生熱並傷害細胞。因此在進行 電牙孔處理刚先進行阻抗測試。若任何阻抗之測量值超過 1 00Ω 士 5 Ω，則未通過該阻抗測試因此不會起始電穿孔序 列。該阻抗測試係_種操作者程式控制化之裝置，其可由 权體或|57體所控制且可於操作期間將其㈣。該阻抗測試 機係由般的運算放大器（op-amp)類比電路所組成，其功 能由該控制器指揮。 為了使阻抗測試機成為操作上安全的裝置，該阻抗測 試機亦可作為EKD中之安全裝置。其可指示出是否所有的 電極皆已穿透相同的組織以及確立電路。當電極與空氣接 觸時’尤其係乾空4，具有非常高之電阻。若開始進行電 穿孔而一或多個電極並未穿透至組織中時，產生之電極電 壓可為數千伏特，進而造成致命的結果以及亦損壞該 EKD。基於此原因，應具有超載電壓保護作用以防止電極 負載過畺之電壓。例如，不顧電的負載（例如空氣或肌肉組 、、哉）大小’若Vij超過200V —段不大於ims的時間，即啟 動超-電壓保護作用（over_voltage pr〇tecti〇n)。v〖j係通過電 極1及j之電壓，其中5。若啟動超_電壓保護作 用，Vij即接近〇v直到啟動下次電穿孔脈衝。同時Εκβ亦 為關閉狀態，通過任何電極對之電壓可能不超過1〇v。 EKD之另一元件為波形紀錄器。該波形紀錄器可紀錄 電牙孔電壓以及電流波形，且於進行電穿孔處理期間連續 不斷地採樣紀錄電壓及電流波形。藉由採樣及監測該電穿 孔程序之參數，操作者可輕易地分析電穿孔程序失敗或未 19 1246930 達到所欲結果之事件中可能的問題及調整設定。示範性採 樣速率係每秒200個樣本，各5個電流脈衝約為i 〇4個樣 本。不範性總採樣期間為41 52ms，於第一個脈衝啟動前約 5〇ms開始採樣以及最後一個脈衝後5〇聊停止採樣。該電 壓及電流波形可定量為具有±1最小有效位（least significant bit，LSB)線性之12_位元數位呈現（叫丨^ presentation)。該電流波形解析較佳應至少為5mA以及電 壓波形解析較佳應至少為〇.25V。該波形紀錄器可由一般 〇p-amp類比電路以及適合與控制器一起使用之類比轉數位 (A/D)轉換器所組成。 EKD之另一元件為一種用於輸入使用者指令之輸入裝 置。例如，該EKD操作參數可由操作者經由數字鍵盤（例 如，Grayhill 88AB2)予以鍵入。較佳具體實施例中，於鍵 盤上鍵入之數字係顯示於液晶顯示器（LCD)。可程式控制之 典型的參數係電穿孔脈衝電流、阻抗測試之啟動/關閉、以 及電穿孔觸發延遲。與鍵盤相關之裝置亦可由控制器所指 揮。 EKD之其他可能的元件包含狀態-回報裝置，其可顯示 或通知操作者系統之狀態。此等狀態-回報裝置可包含一資 訊顯示面板，例如液晶顯示器（LCD)(例如，Lumex LCM-S02004DSF，或 Optrex DMC-20434N)。該 LCD 較佳 係子元顯示型且較佳可顯示每行20個字共4行之顯示器。 該LCD較佳係配有背-光’其可耩由板扭開關（t〇ggie switch) 之裝置將其打開或關閉。狀態之資訊亦可由聲音提供警 20 1246930 報’例如在各種情況下警報器⑽如，CUICEP-2202AS)所 發出之聲響。較佳地，每種情況皆具有不同意義，且為軟 體或勃體所控制。例如，警報器之音量可具有3種程式控 制之设定且音量大小係距離警報器1公尺處大約自至 80dB。音壓等級之範圍僅供參考。音量應為可聽見之程度， 若於吵雜之環境（例如農場）下可設定成最大聲以及若於安 靜之環境（例如辦公室）下可設定成最小聲。此外，該ekd

可配有發光一極體（LED)(例如，Lumex SSI-LXR1612ID， 或任何面板式-安裝之紅LED)以表明哪個組件係開啟或關 閉者。 KD之又元件係連接埠（communications port)，其可 用於將電牙孔波形數據上傳至外部電子裝置，例如個人數 位助理（PDA)或個人電腦（pc)，以達查看之目的。較佳地， 該連接埠係光學系列連接埠，例如紅外線⑽）璋（例如， Transceiver ： Vishay TFDU4100 , 4 Zil〇g Zhx1201 ；

Encoder : Microchip Mcp212〇，或 τι tiri〇⑼）。 該EKD亦可具有記憶體元件。該記憶冑元件可儲名 穿孔波形數據以及操作參數。較佳地，該記憶體（例如 AtmelAT45DB321B)係非易變性的，亦即，即使於細 閉時仍可保存其數據。丨了節省記憶體，僅於電穿孔舰 列活動期間將電穿孔波形數據健存至記憶體。於非活動 間=任-波形超過指定之閥值，則將採樣之數據儲存 Π體。例如，此等間值可為之電堡闕值以及1〇誕 電邊。於電流脈衝列非活動期間錯存至記憶體之數 21 1246930 可依時間予以標記’因此當重現該波形時可知道該數據之 時間標德。可規定於脈衝列非活動期間内儲存之數據高達 4〇個樣本（20ms)。可將儲存限制於2〇ms，這係因為軟體可 心定若於累計大於2GmS之期間超過任—閥值則將其餘之 電穿孔序列中jL。當執行上述壓縮技術時一電穿孔波形 數據組需要約2kB之記憶體。該EKD較佳含有 少600個電穿孔波形數據組之記憶容量。 該EKD之另一元件係電源以及電源開關。該電源較佳 係電池（例如，2 X P〇wersonic ps_64〇 F1，或卩繼叩仏 LC-R064R2P)且對各EKD之電路提供電力。這些電路包含 供給控制器及其周邊裝置之低電壓/低功率電容電源供應 器，供給阻抗測試機之低電壓及低功率電容電源供應器， 以及供給電流波形產生器之高功率電容電源供應器。電源

開關（例如，E-Switch R5CBLKBLKEF0，或任何 DPDT 10A 平板-固定按鍵開關）控制EKD之電源以及可為開啟或關 閉。於關閉狀態時，所有電極配件之電性連接於電源關閉 5秒内呈電中性。 該EKD亦包含電極把手配件（eiectr〇de handle assembly)。較佳地，該電極把手配件包含三種元件··針狀 電極陣列、回報EKD狀態之狀態-回報裝置、以及啟動開 關（activator switch)。於較佳具體實施例中，該針狀電極陣 列係圓形且由五個針狀電極組成。EKD之狀態較佳係經由 利用一或多種LED顯示於把手配件，該LED可藉由改變顏 色以及程式控制間歇性之閃爍以顯示電極觸發序列之各種 22 1246930 階段。該把手配件啟動開關較佳係用於開啟電極觸發序列 之各種階段。 本發明之另一具體實施例係可替換之電極盤，其係可 移動式的固定於電穿孔裝置之把手。於較佳具體實施例 中，該可替換之電極盤係固定於EKD之電極把手配件。第 3圖顯示該電極盤的侧視圖以及第4圖顯示該電極盤的頂 視圖。於第3及第4圖中’電極盤1G具有數個在空間排列 上固定於支持結構102上之針狀電極1〇1以穿透該選定之 組織。較佳之具體實施例中’該空間排列係呈環形陣列。 位於電極盤之把手邊的針狀陣列中之各個電極係呈純端且 去除毛邊以插入把手中相配之電接觸附件。該把手内較佳 自針狀電極至脈衝產生器或EKD處設有電子連接器。該電 極盤支持結構1〇2亦具有無菌中央注射通道1〇3 (以虛線表 示），注射針可經由該注射通道注射該巨分子。通道1〇3較 佳係向電Μ 1〇之頂側延伸，穿過該支持結構1〇2以及把 手’以形成足夠的長度俾建立—通過把手與盤之無菌管。 因此，該把手提供使用者-種可將針狀電極植人至經選定 之組織以及同時將巨分子注射至組織中之簡易裝置。 、 /|UJA 「 之引導盤。第5圖顯示該引導盤的侧 J训祝圖以及第6圖顯示 該引導盤的頂視圖。如第5及第6圖所示，該引導盤2〇具 有數個引導孔洞20 1，其在物理空門 卜 二間上係與針狀電極101 (第3及第4圖）相對應，以及且有_由 汉/、有中央過道203，其係與 電極盤之中央通道1〇3 (第3及第 及弟4圖）相對應，供注射針 23 1246930 插入。该電極盤之厚度係可變的，俾使操作者控制該針狀 電極之穿透深度。該引導盤亦可使操作者在不需碰觸該無 菌針之狀況下替換該電極盤。第7圖顯示該固定於電極盤 10上之引導盤20。 於較佳具體實施例中，位於EKD電極配件以及可替換 之電極盤中的針狀電極係呈環狀陣列。另一較佳具體實施 例中’數個針狀電極係由五個針狀電極組成。其他較佳具 體實施例中，該五個針狀電極係排列成半徑約1〇公分之 圓的内接五角形之環狀陣列。 由於電穿孔所需之波形係由軟體或任體指定，該Ekd 與其他電穿孔裝置不同處在於硬體規格。例如，第8圖所 示，於指定為程式〇〇〇〇 (program 〇〇〇〇)之程式控制序列 中’脈衝數為5。至於脈衝1，電流係自電極1至電極3及 4 °因此電極1係陽極且電極3及4係陰極。電極2及5與 電極1、3及4係電性隔離（electrically isolated)。隔離電壓 至少為200V。完整的序列描述係電極1至5相繼成為陽性 電極而兩個陰性電荷之電極係位於五角形陣列之相對頂 點。電極之表面配置的代碼係p=陽性、〇=關閉、以及N = 陰性。利用習知之物理學註記，該複合型係所有脈衝以及 電流方向之總合。 第9A圖顯示程式0000產生之典型的電流脈衝。第9B 圖顯不各電流脈衝之波形。該波形參數為： 週期（tp) : 1000 ms 土 250 。 上升時間（tr):最大值20 。 24 1246930 趨穩時間（ts):最大值20 ps。 脈衝寬度（tw) ·· 52 ms 士 100 下降時間（tf):最大值20 。 6(〇·1Α? 0.2Α, 0.3Α ... 8圖所示之任五組電 標稱電流（Ιη):於th期間Ιη係八 1·5Α} 土 1〇〇/0 以及 Rl$ 1〇〇Ω。Ri 係第 極組間之負載電阻。 第9Β圖僅指明該電流波形。電壓波形之型式係根據當 觸發電流脈衝時（th期間）電極之阻抗。由於u期間該阻抗係 未知的故此期間並未指明該阻抗。ti期間通過任何電極組 之電壓係0V。 變欲進行電穿孔之組織的體積、與反向流經相同組織體積 之電流相關之潛在危險性、以及每組織體積之總電流。 該EKD可經由程式控制來利用各種電極脈衝圖案。此 等脈衝圖案之實例係說明於第1G至18圖。各圖案可㈣ 與提供最適合之基因轉殖表現相關之假說，該測試包括改 相L在電穿孔中出現之基本現象於所有案例中都是相 同的C並未對產生所觀察到之作用的確實機制予以說 月，，、、不奴又限於理論’當細胞暴露於電脈衝作用後，電 穿孔之效果顯著的表現為細胞膜變成可暫時性地透過大分 子。細胞壁上有管道穿㉟，於正f情形下，藉由雙向之離 子移動，維持9〇mV之休息穿膜電位。 然不欲受限於理論，電穿 迫高離子流通過此等結構且將 中，金屬電極係與組織接觸以 孔利用相同的結構，藉由強 管道開啟或增大。先前技藝 及施加預定之電壓，該電壓 25 1246930 與電極間之距離成比例。電穿孔之法則係由所得之電場強 度，根據公式E = V/d而決定，其中斤）係電場、（v)係施加 之電壓’以及（d)係電極間之距離。 當以公式規劃電穿孔法則俾將藥物或巨分子遞送至受 者之細胞中時’於先前技藝中電場強度已為非常重要之數 值。此外’可藉由施加預定電壓（該電壓與電極間之距離成 比例）之脈衝以計算各種法則之任何電場強度。然而，應注 意可利用絕緣電極於組織中產生電場（亦即，離子流非為建 立電場之必要條件）。然不欲受限於理論，電穿孔成功之必 要條件係電流，而非電場本身。EKD電流波形產生器之啟 動會將固疋-電流電脈衝分配至數個針狀電極，俾於一區域 中形成分散之電穿孔情況，該區域中並未形成全等之電穿 孔重豐點。該分散之電穿孔區域中的細胞其通透性增加且 巨为子可遞送至受者之細胞中而不會對細胞或組織造成過 熱及傷害。 本發明係關於一種用於將巨分子導入至動物或植物之 一或多個細胞中之電穿孔裝置。該電穿孔裝置包括EkD以 及電極配件。該電穿孔裝置亦可包括一可替換、或置換之 電極盤，該電極盤具有數個針狀電極、中央通道或埠，以 及視需要可移除之引導盤。該可替換、或置換之電極盤與 引導盤一起構成針狀電極配件，其可固定於電穿孔裝置之 把手上。該把手包含一電子連接器，其係自針狀電極配件 至固疋-電流脈衝產生器子系統或EKD。該把手係非導電性 的且係没计用於提供使用者一種簡單之工具以將針狀電極 26 ^46930 配件植入至所選定之組織中。於把手上採用拋棄式電極針 配件以及脫卸式固件可使使用者快速地安裝及拆卸該針狀 電極配件該引導盤提供一種工具，其可抓住該電極配件 但不會污染該無菌針。該電穿孔裝置，尤其係Ekd，之電 源可使用電池，特別係於使用插電電源不安全或不方便的 場所。 應了解，在不悖離本發明申請專利範圍所界定之精神 /、範市下，可對EKD及其電極配件進行多種改變與修改。 例如，於另一具體貫施例中，本發明提供一種將巨分子遞 送至構成血管壁之細胞或僅為培養之細胞之方法。若具有 修改時，可將針狀電極陣列轉換成導管電極陣列（catheter electrode array)其係連接至與本文所述相同之ekd。該導 &可置於血管内且利用本文所述之固定_電流法則將巨分 子直接遞送至血管壁中，此方法不會使血管過熱或損毀血 官壁。該固定_電流脈衝係由EKD產生。此方法不會因過 熱而造成細胞死亡。此儀器以及方法為直接以及更加管理 化地將巨分子遞送至血流中之極佳之機制。 該概念可擴大至任何數目之電極，例如三-電極陣列。 選定距離L俾使點B之能量強度為點a之三分之一。三次 脈衝後，（1至2，2至3，3至1}，點B所受到之累積劑量 專於點A所文到之累積劑量。當陣列中之電極數增加時， 必須能產生均勻之能量分配之距離L成比例地增長。L=k χ η其中η係電極數’以及k係比例常數。因此，選擇較多 數目之電極時可涵蓋較大體積之組織。所選擇之理想的電 27 1246930 極數可根據欲進行轉染之材料的體積以及注射與電穿孔間 之分布距離。 亦可使用具有特別設計之巨分子注射芯以將單一劑量 /辰度之預先殺菌的巨分子遞送至身體或植物中。此巨分子 注射忍可為含有單一劑量濃度之預先殺菌的巨分子之塑膠 八的P刀以及自塑膠容器部分延伸且經過預先殺菌的中空 大針，當針插入身體或植物中時，可將液體自容器輸送至 中空針的頂端。電極盤之中央注射通道可確保該預先殺菌 的巨分子以及針在注射過程中不會受到污染。 [實施例] 貫施例I電動裝置（EKD)之操作 。控制器之操作顯示於第19及2〇圖，其說明ekd之較 佳操作序列。較佳具體實施财，資訊顯示板LCD顯示各 序列之v驟以促成容易使用之操作。操作該之前，將 電極配件穩固地插入標的組織。 首先，打開電源以及啟動EKD。該動體仍為閒置狀態 直到接收到使用者所輸人之資料。為了啟動電穿孔序列， 輸入f碼以於LCD上獲得準備事項。此時，壓下把手配件 啟動益開關（handle assembly activat()r switeh)。然後使用者 =財’較佳為動物的ID編號，該編㈣與每個脈衝之 it起記錄儲存㈣㈣下載。該編號較佳係利用數字 然後經由警報器發出#「料」聲提醒使用者 ;二關繼續進行電穿孔序列。壓下啟動開關後，不 珊阻抗測試機是否準備好’皆確定_。若阻抗測試機已 28 1246930

雷芦、、目丨丨#人—立即進行一系列之阻抗測量。該_體以低DC 的^電極間之阻抗。儘快進行測量以得到充分的精確 沾貝—於測4阻抗期間，把手配件上之紅色led係亮著 里=5個阻抗測！中有任何失敗，即發出錯誤的長音「口畢 :畢二聲，把手LED停留在紅色，咖將顯示出錯誤，以及 早刃體會回到閒置狀態。 若5個測量皆通過，則發出短音「料」聲，亮出把 己件上之綠色LED，以及顯示提醒使用者壓下啟動開關 、、=進仃&序。勒體會等待再次按下把手啟動開關以繼續 進行該序列。此㈣按下鍵盤上之任—按鍵，即發出錯誤 的長s畢畢」聲且該單位會回到閒置狀態。 、所典型地，係於序列中之此時將質體注入肌肉中。當完 成貝體注射時，使用者按下啟動開關以繼續進行電穿孔序 列。發出短音「,噪」聲，以及該動體利用程式控制之觸 發延遲進行進入實際上電極_觸發序列之倒數。於觸發延遲 期間，把手配件上之綠色LED每秒閃爍一次。此時若按到 鍵盤上之任一按鍵，即發出錯誤的長音「嗶嗶」聲且該單 位會回到閒置狀態。電穿孔開始前5秒，警報器每秒會發 出中長音「°畢°畢」聲。 。、觸發延遲結束時，韌體執行觸發序列依照選定之脈衝 程式所放逐者。於5_秒之電穿孔期間，把手配件上之紅色 LED每秒發亮持續5〇〇 ms。當電穿孔序列成功地完成時， EKD回到閒置狀態。若經遞送之總電流小於韌體所指定 者，將會顯示出錯誤訊息。與指定者相比，經遞送之電流 的片段係以完成百分比表示。 實施例2.數據之取得與儲存 該EKD軟體或韌體可即時取得數據及儲存於非-揮發 29 1246930 性圯憶體（non-volatile memory)。第21圖說明第一部分之 數據其可於電穿孔過程中收集而得。檔頭之第一節包含檔 名以及動物的編號。表中之數據係敘述序列中之脈衝、脈 衝前之等待時間、脈衝寬度、以及五個電極中之各個脈衝 電机第22圖就明第二部分之數據，其可鑑別各電極於指 定之脈衝序列中之配置。直列的值係第一脈衝之數據，'電 極1係陽性，電極2係切斷的，電極3係陰性，電極4係 陰性’以及電極5係切斷的。脈衝2、3、4、及5之電極 配置組成數據表中之其他部分。第23圖說明同一個電穿孔 原始數據之第三部分版本，其由1〇個時間點組成，相隔約 20 ms，有五個電極。直列的值係第一脈衝之數據，第1行 記錄電壓以及第2行記錄電流。脈衝2、3、4、以及5之 電壓-電流數據係分別記錄於第3及4行、第5及6行、第 7及8行、以及第9及1 〇行。 貫施例3 ·質體設計、遞送方法、以及實驗動物 質體構築。質體pSP_SEAp (5〇19 bp)係一種分泌之胚 胎鹼性磷酸酶（secreted embry〇nic alkaline ph〇sphatase， SEAP)的肌肉專一性表現質體。啟動子係spc5_12，一種強 效、肌肉專一性、合成的啟動子（Li等人，1999)，以及該 SEAP轉錄物之3,端具有SV40 late poly(A)訊號。該質體 係藉由插入394 bp之Acc65I_HindIII片段，包含334 bp之 SPC5-12啟動子序列，位於pSEAP_2基礎載體（cl〇ntech Laboratories，lnc.，pai〇 Alt〇, CA)之 Acc65i 及 mndIII 間而 構成的。 電穿孔條件。於所有實驗中係使用方波脈衝。電穿孔 條件依各實驗指定。於所有案例中，固定電流係於〇.4至 1·〇 Amps，3或5個脈衝，52毫秒/脈衝下使用，以及脈衝 30 1246930 間相隔1秒。該ekd電穿孔裝置包含一種由五段相等距離 之 21G 立體不銹鋼針狀電極（21_gauge solid stainless steel needle electrodes)組成之環形陣列（直徑^公分），固定於非 導電丨生材料上。該電極盤具有中央通道，經由該通道，可 將注射針插入肌肉中，而將質體遞送至由環繞之五個電極 所界定之區域内。所有電極之長度為2公分且於全部之處 理中係完全插入皮膚深至肌肉。除了 一個實驗外，皆係使 用EKD (ADViSYS)。於最後一個實驗中，為了進行比較， 係使用不同型式之電穿孔裝置（ADViSYs Enducer Model BB) 〇 於豬中進行質體DNA之肌内注射。SEAp研究（n = 6 至7/組/實驗）中係使用混合性別之年幼的雜種豬，3至6週 齡、體重15至40公斤。將同組動物關在一起使其任意攝 食 24%蛋白質之飼料（Producers c〇〇perative Ass〇ciati〇n，

Bryan，TX)以及水。將不含内毒素之質體製備物以無菌水稀 釋且以1 %重量/重量之比例與聚-L-麩胺酸進行配製。於實 驗之第0天，以人工將動物固定以及利用2 1G之針將SEAP 負體溶液直接穿過完整的皮膚注射至半膜肌。當尋找適當 的注射位置時’應避開所有主要的表面血管。於注射質體 後經過預定的時間間隔後，經由該5-電極陣列進行電穿孔。 血液之收集。於各實驗之第0、3、7、1〇、及14天， 將動物秤重以及藉由頸靜脈穿刺將血液收集至 MICROTAINER血清分離管。於室溫下使血液凝集1 〇至i 5 分鐘接著於3000 X g下離心10分鐘。將血清儲存於 直到進行進一步之分析。 分泌之胚胎鹼性磷酸酶分析。將血清樣本解;東以及利 用 Phospha_LightTN1 Chemiluminescent Reporter Assay Kit 31 1246930 (Applied Bi〇systems，Bedford，MA)，根據製造商之操作指 南取50微升進行SEAP活性分析。該分析之檢測底限係3 微微克/¾升。較濃的血清樣本可於進行SEAp活性分析前 以1 : 10之比例於小鼠血清中稀釋。所有樣本係利用 LUMIstar GalaxyTM 冷光測定儀（bmg Labtechn〇i〇gies， Offenburg，Germany)讀取讀值。 統计資料。利用Microsoft ExcelTM統計軟體分析數 據。圖示中顯示之值係平均士 SEM。比值（Specific values) 係由使用t-檢定或單因子變異數分析（〇ne_way an〇va)之 比較而得。將ρ<〇·〇5之值視為統計上有意義之值。 實施例4.質體劑量之影響 將動物注射0.5毫克或1毫克之SEAP表現質體（總體 積為2毫升）。使用程式〇〇〇〇 (第8圖），電場的強度係〇.5Α。 /主射質體與進行電穿孔間的間隔時間為8 〇秒。如第2 4圖 所示，SEAP之表現係取決於所投予之質體量。於第7天， 注射SEAP後，經注射1毫克之質體的動物其表現係經注 射〇_5毫克質體者之2· 1倍（71.6 士 22對33.7 土 10微微克/ 毫升/公斤，* Ρ < 0.09，由於高動物間之變異性以較高的質 體劑量）。於後續之實驗中，使用0.5毫克之質體劑量。 實施例5·質體注射體積之影響 對動物注射0.5毫克之SEAP表現質體，其總體積分別 為2、3、或4毫升之水。使用程式〇〇〇〇 (第8圖），電場的 強度係0.5A。注射質體與進行電穿孔間的間隔時間為8〇 秒。如第25圖所示，SEAP之表現係取決於質體之注射體 積。第3天時，經投予2毫升注射體積之質體的動物其SEAp 表現顯著地較高：54 土 17微微克/毫升/公斤，* P < 〇〇2相 對於3毫升-處理組之11 ± 3微微克/ ¾升/公斤，以及4毫 32 1246930 升-處理組之〇·13 ± 0.3微微克/ ¾升/公斤，卞p < 〇·〇3 ;第 7天時，38·5±18微微克/毫升/公斤，卞p<〇〇5相對於4 宅升-處理組之1 ± 〇·3微微克/ ¾升/公斤；第1〇天時，相 對於3毫升·處理組* p < 〇.〇4。 實施例6.電場強度之影響 在理想的質體攝入以及轉殖基因之表現方面，電場強 度與脈衝圖案有關。於第一實驗中，所有動物皆注射總體 積為2毫升之〇·5毫克之SEAP表現質體。注射質體與進行 電穿孔間的間隔時間為80秒。使用EKD程式〇〇〇〇 (第8 圖）脈衝圖案，如第26圖所示，電場強度自i Amp陽性對 (positive control)開始下降至〇·6 Amp，同時表現增加。 選擇1 Amp之條件係因為具有得自固定電壓電穿孔裝置之 文獻内容中建議此電場強度可產生最佳之表現程度（Mir等 人’ 1998)。如圖所示，此案例中使用〇.6 Amp之電場強度 了付到最佳之結果。第3天時-0.6 Amp之* p < 〇〇4以及 〇·5 Amp 之卞 Ρ<〇·〇3 ;第 7 天時-0.6 Amp 之*P<0.03 ;以 及第 10 天時- 0.6 Amp 之 * P < 〇.〇 1。 利用不同的脈衝圖案模式進一步比較各電場強度。使 用程式0005脈衝圖案（第14圖-三個脈衝，無反向之電場）， 電場強度為0.4、0.5及0.6 Amp，與使用程式〇〇〇〇脈衝圖 案（第8圖-五個脈衝，完全反向之電場）之1Amp (作為陽性 對照參考）進行比較。所有動物皆注射總體積為2毫升之〇.5 耄克之SEAP表現質體。注射質體與進行電穿孔間的間隔 時間為80秒。使用此等脈衝圖案，如第27圖所示，僅使 用0.4 Amp之電場強度可得到最佳之結果··第3天時_〇 * Amp 之* ρ < 0·〇2 ;第 7 天時_〇·4 Amp 之* p < 〇 〇3 ·，以及 第10天時-0.4 Amp之* P < 0.03。於所有試驗之時間點， 33 1246930 以〇·5 Amp處理之組別其SEAP值具有增加之傾向 (P = 0.06-0.07) 實施例7.間隔時間之影響 先前技藝之實驗中，注射質體與進行電穿孔間的間隔 時間為 2 分鐘（Draghia-Akli 等人，1999 ; Mir 等人，1999)。 為了有助於此技術之大規模應用，考慮儘量縮短間隔時間 係重要的。然而，如第2 8圖所示，注射質體與進行電穿孔 間的間隔時間應不少於80秒。此實驗中，所有動物皆注射 總體積為2毫升之0.5毫克之SEAP表現質體。電場強度為 〇·5Α。當間隔時間由80秒減少至7〇、6〇、或5〇秒，SEAp 的表現程度亦降低。在間隔時間少於80秒時，SEAP的表 現程度明顯地降低：第1〇天時-注射後8〇秒進行電穿孔與 注射後50秒進行電穿孔之組別間之* p < 〇 〇5。然不欲受 限於理論，此間隔時間需使經注射之質體於通電及反向重 整（reversibly restructured)前分布於肌肉中且結合至細胞 膜之表面。 貝施例8·注射面積之界定（delineation of injection area) 市售之電牙孔裝置及針狀陣列無法允許注射及電穿孔 於同一組合操作中。此等儀器，於進行電穿孔程序時需要 將注射針插入至標的肌肉中以遞送質體，然後再自肌肉移 除。然後將電極插入該注射區域附近之肌肉，通常係根據 皮膚上之標示。然而，下層之肌肉可能會移動或收縮，因 此該注射位置可能不會完全包含於針狀電極所界定之範圍 中。 此實驗中，所有動物皆注射總體積為2毫升之〇 5古 克之SEAP表現質體。電場強度為〇·5Α。注射與進行電$ 孔間的間隔時間為8〇秒。一組之動物係於整個程序中將插 34 1246930 入標的肌肉之針停留於原處。第二組係於注射質體後立即 將針取出，1 5秒後目測皮膚將針再插入同樣之注射位置， 以及開始倒數80秒。第7天時，A組中SEAP之表現程度 係43.5 士 16.8微微克/毫升/公斤相對於9 士 1.7微微克/毫升 /公斤，* P < 0·02 ;以及第10天時，係45 6 ± 16微微克/ 毫升/公斤相對於12 士 2.5微微克/毫升/公斤，* ρ < 〇.〇2。 如第28圖所示，非-正確性之電穿孔位置可使質體表現降 低達75%。此發現突顯出為達成較佳之基因表現，準確及 精確地使該注射位置進行電穿孔之重要性。 實施例9 ·比較性研究 依照先前之實例自0至10毫克逐步增加投予 pSP-SEAP之計量。注射質體後，使用不同之電穿孔裝置 (ADViSYS Enducer Model BB，美國專利申請案序號第 1〇/360,768號）進行電穿孔。如第3〇圖所示，表現程度係 與劑量呈相依性。不過，注射後第7天時，SEAp之表現程 度平均為7 ± 2.2微微克/毫升/公斤，然而於相對應之時間 點上’使用EKD所顯示之SEAP表現平均為33.7 土 10微 微克/¾升/公斤，增加了 4倍之多。然不欲受限於理論，表 現作用之增加可能係由致能步驟（enabling step)造成，其可 讓操作者確認所有的針係位於相同的肌肉中；顯示作用， 其可即時控制該程序；軟體，其可使各脈衝形象化；以及 若第一次電穿孔程序失敗可接著調整參數。 [圖示簡單說明] 第1圖顯示EKD之較佳具體實施例之系統圖，或流程 圖。 第2圖顯示一種適用於ΕΚ]〇之控制器的實例。 35 1246930 第3圖顯示可替換之電極盤的側視圖。 第4圖顯示可替換之電極盤的頂視圖。 第5圖顯示引導盤的側視圖。 第6圖顯示引導盤的頂視圖。 第7圖顯示固定於可替換之電極盤上之引導盤的側視 圖。 第8圖顯示EKD之程式化電極脈衝圖案之實例，其標 示為程式〇〇〇〇。 r 第9 A圖顯示電流脈衝之藝術表現圖以及第9B圖顯示 電流波形之藝術表現圖，兩者皆由第8圖之脈衝圖案所產 生。 、 第1 〇圖顯示EKD之程式化電極脈衝圖案之實例，其 標示為程式0001。 ’、 之程式化電極脈衝圖案之實例，其 第U圖顯示EKD ；^示為程式0002。 案之實例，其 案之實例，其 第12圖顯示EKD之程式化電極脈衝圖 才不示為程式0003。 弟1 3圖顯不EKD之程式化電極脈衝圖 "^示為程式0004。 弟1 4圖顯示EKD之程式化電極脈衝圖案之每 不不為程式〇〇〇5。 第1 5圖顯示EKD之程式化電極脈衝圖案之實立 標示為程式0006。 、歹1 ，八 第1 6圖顯示EKD之程式化電極脈衝圖案之實例，其 36 1246930 才示示為程式0007。 其 第1 7圖顯示EKD之程式化電極脈衝圖案之 標示為程式0008。 ' 案之實例，其 第1 8圖顯示EKD之程式化電極脈衝圖 才示示為程式0009。 解 解 第19圖顯示EKD之樣本遞送操作序列前半部分之圖 第20圖顯示Ekd之樣本遞送操作序列後半部分之目 “ #第21圖顯示第一組數據之實例，該數據可於樣本進行 電穿孔程序時由EKD取得且儲存。 第22圖顯示第二組數據之實例，該數據可於樣本進行 電穿孔程序時由EKD取得且儲存。 第23圖顯示第三組數據經編排之實例，該數據可於樣 本進行電穿孔程序時由EKD取得且儲存。 、， 第24圖顯示SEAP於動物中之表現程度，對動物注射 不同含量之質體PSP-SEAP以及以脈衝圖案為程式_〇之 EKD進行電穿孔。 第25圖顯示SEAP於動物中之表現程度，對動物注射 相同含量但體積不-樣之質體pSp_SEAp以及以脈衝圖案 為程式0000之EKD進行電穿孔。 第26圖顯示SEAP於動物中之表現程度，對動物注射 同3里之貝體PSP-SEAP以及於不同電場強度下以脈衝 圖案為程式0000之EKD進行電穿孔。 37 1246930 第27圖顯示SEAP於動物中之表現程度，對動物注射 相同含量之質體PSP-SEAP以及於不同電場強度下以不同 脈衝圖案之EKD進行電穿孔。 第28圖顯不SEAP於動物中之表現程度，對動物注射 相同含量之質體PSP-SEAP以及於注射質體後經過不同的 延滯時間後以脈衝圖案為程式〇0〇〇之EKD進行電穿孔。 第29圖顯示SEAP於動物中之表現程度，對動物注射

相同含量之質體PSP-SEAP以及於移除電極之同時進行電 牙孔或將電極再插入至肌肉中後進行電穿孔。 第30圖顯示SEAP於動物中之表現程度，對動物注射 不同含賣之質體pSP_SEAP以及以另 電穿孔。 [主要元件之符號說明] 一種電穿孔裝置進行

10 電極盤 20 引導盤 101 針狀電極 102 支持結構 103 中央注射通道 201 引導孔洞 203 中央過道 38 1246930 參考文獻 參考方式併入本案 下列美國專利及公開文件以 美國專利文件

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Claims (1)

1246930 (2005年8月修正) % ^ f，/ 十、申請專利範圍： I 一種電動裝置（EKD),其係用於經選定組織之細胞 之電穿孔程序，以幫助巨分子之導入，其包括： —電極配件，其具有數個針狀電極以穿透該經選定之 組織； 二 一電流波形產生器，其與數個針狀電極間具有電性連 接以於任何數個電極間提供固定電流脈衝圖案； 一電源，其與電流波形產生器間具有電性連接；以及 一控制器’其與電流波形產生器以及電源間具有電性參 連接’其中該控制器係管理該電穿孔程序。 2.如申請專利範圍第i項之電動裝置（EKD)，復包括 一波形記錄器，該記錄器與該控制器間具有電性連接以取 樣及記錄與固定電流脈衝圖案相關之電穿孔數據。 3·如申請專利範圍第i項之電動裝置（EKD)，復包括 一阻抗測試機’該測試機與該數個針狀電極間具有電性連 接以測定電阻。 •如申明專利範圍第i項之電動襞置（ekd)，復包括 | 一輸入裝置俾將指令輪入至該控制器。 如申靖專利範圍第4項之電動裴置（EKD)，其中該 輸入裝置係鍵盤。 t如申請專利範圍第！項之電動袭置（ekd)，復包括 一狀態_回報裝置以回報電穿孔程序進行時之狀態資訊。 如申請專利範圍第6項之電動裳置（EKD)，其中該 狀態-回報裝置係一資訊顯示面板、聲音警報器、發光二極 43 1246930 (2005年8月修正；） 體（LED) ’或其組合。 8·如申睛專利範圍第1項之電動裝置（EKD)，復包括 連接埠，邊連接埠係與該控制器相連以將與固定電流脈 衝圖案相關之數據傳送至外部電子裝置。 9·如申凊專利範圍第2項之電動裝置（EKD)，其中該 連接埠係光學系列連接埠。 1〇_如申％專利範圍第3項之電動裝置（EKD)，其中該 連接璋係紅外線埠。 11 ·如申明專利範圍帛4項之電動裝置（EKD)，復包括（着 記憶體’該記憶體係與該控制器相連以儲存與固定電流脈 衝圖案相關之電穿孔數據。 I5 6·如申明專利範圍第11項之電動裝置（EKD)，其中該 δ己憶體係非•揮發性記憶體。 13.如申請專利範圍第1項之電動裝置（EKD)，其中該 電源係電池。 44 1 7 8 9 10·如申請專利範圍第1項之電動裝置（EKD)，其中該Λ 2 16·如申明專利執圍帛j項之電動裝置邮〇)，其中該 3 電極配件復包括-狀態·回報裝置以回報電穿孔程序進行 4 時之狀態資訊。 5 電極配件復L #有固定結構之把手’俾將該數個針狀 6 電極固定至把手。 7 如申明專利範圍第14項之電動裝置（εκ〇)，其中該 8 電極配件復包括一固定於加车 9 、把手且與該控制器相連之啟動開 10 關。 1246930 (2005年8月修正) 17·如申請專利範圍第16項之電動裝置（EKD)，其中該 狀態-回報裝置係發光二極體（led)。 18·如申請專利範圍第1項之電動裝置（EKD)，其中該 數個針狀電極係環形陣列。 19.如申請專利範圍第is項之電動裝置（Ekd)，其中該 環形陣列之直徑約1 ·〇公分。 20·—種適用於具有把手配件之電穿孔裝置之電極 盤，包括： 一支持結構’其係可移動性地固定於把手配件以及該 支持結構具有可接受注射針之中央注射通道；以及 數個針狀電極，其係固定於支持結構且具有空間排 列。 2 1 ·如申明專利範圍第2 〇項之電極盤，其中該數個針 狀電極之空間排列係環形陣列。 22·如申請專利範圍第21項之電極盤，其中該環形陣 列之直徑約1·〇公分。 23·如申請專利範圍第2〇項之電極盤，其中該中央通 迢之長度足以延伸穿過該把手配件。 24.如申請專利範圍第2〇項之電極盤，復包括一弓丨導 盤，其具有與該針狀電極之空間排列上相對應之孔洞以及 與支持結構之中央通道相對應之中央過道，其中該引導盤 係可移除地固定於數個針狀電極。 25·如申請專利範圍第24項之電極盤，其中該引導盤 45 1246930 (2005年8月修正) 之厚度相對應於該數個針狀電極所欲之穿透深度。 26.如申請專利範圍第24項之電極盤，其中該電極盤 係藉由抓住該引導盤而可移除地固定於該把手配件。 2 7 ·，種對經選疋之組織之細胞進行電穿孔以幫助巨 分子之導入之方法，包括： 將具有中央通道之數個針狀電極插入該經選定之組

測量該數個針狀電極之電阻以決定是否可安全地透 過該經選定之組織建立電路； 藉由將針通過該穿過數個針狀電極之中央通道以注 射該巨分子之溶液； 利用幸人體為主之應用於任何數個電極間 流脈衝圖案； i u & % 施加該固定電流脈衝圖案；以及 通過電子手段記錄與該固定電流脈衝圖案相關之數據

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