TWI235662B

TWI235662B - Method for preserving a hemoglobin blood substitute

Info

Publication number: TWI235662B
Application number: TW088117769A
Authority: TW
Inventors: Maria S Gawryl; Robert A Houtchens; William R Light
Original assignee: Biopure Corp
Priority date: 1998-10-14
Filing date: 1999-10-14
Publication date: 2005-07-11
Also published as: HK1041415A1; US6271351B1; HK1041415B; JP2002527360A; WO2000021366A1; DK1121016T3; AU743248B2; CA2346466A1; EP1121016B1; DE69904960T2; EP1121016A1; ATE230924T1; CN1233230C; JP4674358B2; AU6424999A; CN1323159A; NZ511008A; ES2186418T3; DE69904960D1

Description

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235662 A7 ___ _ B7 五、發明說明（/ ) 發明背景對於以血液替代物治療或預防起因於血液流失（例如，起因於急性出血或在外科手術的期間）、起因於貧血（例如，惡性貧血或鐮刀細胞貧血）、或起因於休克（例如，容積不足性休克、過敏性休克（anaphylactic)、敗血性休克、或過敏性休克）的缺氧是有需要的。血液以及血液成份在可作爲血液替代物的這些能力中之使用是伴隨著危險的。例如，全血的使用是伴隨傳染產生肝炎之病毒以及產生愛滋病之病毒的危險，這些病毒可使病患的復原惡化或導致病患的死亡。此外，全血的使用需要測定血型以及交叉配對，以防止免疫血液學上的問題以及提供者之間的不相容。人類血紅素，作爲血液替代物，具有滲透壓活性以及運輸以及轉移氧氣的能力，但是它具有從藉由腎臟路徑以及通過血管壁的循環中快速消失的缺點，導致非常短、並因此典型令人不滿意的半生期。此外，人類血紅素也經常被有毒程度的內毒素、細菌及/或病毒所污染。非人類血紅素也受到和人類血紅素相同的缺陷。此外 ’來自非人類來源的血紅素也典型地被蛋白質所污染，例如’可在接受者體內引起免疫系統反應的抗體。在之前，已至少使用四種其他形式的血液替代物，包括全氟化物（perfluorochemicals；)、合成的血紅素類似物 '脂質體包覆的血紅素以及化學修飾的血紅素。然而，許多的這些血液替代物是典型地具有短的血管內停留時間， 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^ 7 —-------^^^1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235662 A7 B7 五、發明說明（α) 如同外來物質般地藉由循環系統而移除，或裝載於肝臟、脾臟以及其他組織中。此外，許多的這些血液替代物是與活體系統生物學上地不相容。因此，雖然最近在以血紅素爲基礎之血液替代物的製劑上有進展，但是對於血液替代物仍有持續的需要，此血液替代物具有足夠低的污染程度，例如，內毒素、細菌、病毒、磷脂質以及非血紅素蛋白質，以一般地預防起因於注入血液替代物的免疫系統反應以及任何毒理學上的作用。此外，此血液替代物也必須具有在周圍條件下運輸以及轉移足夠量的氧氣至組織的能力，並且必須具有良好的血管內停留時間。此外，較佳的是，血液替代物：（1)具有與全血一般地相等的腫脹（oncotic)活性；（2)可輸血至大部分的接受者，而不需交叉配對或敏感性測試；以及（3)可以最少的冷藏量長時間的儲存。發明摘述本發明是有關於一種用於保存去氧的血紅素血液替代物之方法，以及有關於保存的去氧血液替代物。本發明是描述一種用於保存去氧的血紅素血液替代物之方法，其包括在氧氣屏障薄膜初級包裝中，維持去氧的血紅素血液替代物，此初級包裝包括一種透明的薄片材料，該薄膜在大約25°C以及大約50%的外界相對溼度下，每 24小時、每大氣壓、每1〇〇平方英吋，具有低於大約1.0 毫升的氧氣可通透性（或大約每1〇〇平方公分有0.155毫 5 ^ --------Γ 訂.i-------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235662 A7 B7 五、發明說明（？）系統組成，微循環系統包括較小的血管構造，例如，毛細管。本發明之血管替代物較佳地具有將不會導致顯著免疫系統反應，並且對接受者是不具毒性之程度的內毒素、磷脂質、外來蛋白質以及其它污染物。較佳地，血液替代物是極端的純。如同在此處定義之極端的純，意指包含少於 0.5內毒素單位/毫升的內毒素、少於3.3奈莫耳（nmole) / 毫升的磷脂質以及幾乎沒有可測到之程度的非血紅素蛋白質，例如，血淸白蛋白或抗體。名詞“內毒素”是指與細胞結合的脂多糖，如同格蘭氏陰性細菌細胞壁之外層部份而產生，其在許多狀況下是有毒的。當注射進入動物時，內毒素可引起發燒、腹瀉、出血性休克以及其它的組織損害。內毒素單位（EU)已藉由1983的美國藥典協定，第3014頁，而定義爲在美國參考標準品批號EC-5之0·1奈克（ng)所包含的活性。一個小玻璃瓶的EC-5包含10,000個內毒素單位。適合用於測定在血液替代物中之內毒素濃度的方法之例子，包括由麻薩諸塞州，Woods Hole，Cape Cod聯盟所發展的“動力/濁度鱟蟹變形細胞溶解物（Limulus Amebocytic Lysate ; LAL )5000方法論”的方法。穩定的聚合化之血紅素，如同此處所定義的，是以血紅素爲基礎之攜帶氧氣的組成物，當儲存在低氧氣的環境中時’在適合的儲存溫度之儲存期間，其在分子量的分布上及/或在變性血紅素（methemoglobin)的含量上，不會 12 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）： --------^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235662 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7 五、發明說明（/C ) 實質上地增加或減少，此期間達二年或更長的期間’較佳的是達二年或更長的期間。適合用於儲存一年或更長的儲存溫度，是在大約〇°C至大約40°C之間。較佳的儲存溫度範圍是在〇°C至大約25°C之間。將適合的低氧環境，或實質上是無氧氣的環境’定_ 爲超過至少大約二個月，較佳的是至少大約一年’或更佳的是至少大約二年的儲存期間，與血液替代物接觸的氧氣累積量，而此氧氣累積量將導致在血液替代物中少於大約 15重量百分比的變性血紅素（methemoglobin)濃度。此氧氣的累積量包括滲入血液替代物包裝之氧氣，以及血液替代物和包裝之原本的氧氣含量。在整個方法中，從紅血球（RBC)的收集到血紅素的聚合化，將血液溶液物、紅血球以及血紅素維持在足以使微生物生長或生物負擔（bioburden)最小化的條件下，例如，將溫度維持在低於大約2(TC並且在0°C以上。較佳地，將溫度維持在大約15°C或更低的溫度。更加地，將溫度維持在10土2°C。在這個方法中，用於製備穩定聚合化的血紅素血液替代物之方法的部份成份，是充分地消毒以產生無菌的產品。無菌是如同在此技藝中所定義的，特別地，此溶液符合美國藥典對於無菌的要求，提供於美國藥典第22卷（:p XXII)，第71節，第1483-1488頁。此外，與製程液體 (process stream)接觸的部份成份，通常是以不會與製程液體反應或污染製程液體的材料組裝或覆蓋。這樣的材^ 13 一紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） ^ --------； t-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印别农 1235662 A7 B7 五、發明說明（|丨）可包括不鏽鋼以及其它的鋼合金，例如，Inconel 。適合的紅血球來源包括人類血液、牛血液、羊血液、豬血液、來自其它脊椎動物的血液以及轉殖基因生產的血紅素，例如，說明於仝歡/友游7，卷12 :頁55-59 ( 1994 ) 之轉殖基因生產的Hb。血液可從活的或新鮮宰殺的提供者收集。收集牛全血的一種方法說明於Rausch等人，美國專利第5,084,558號以及第5,296,465號。較佳的，血液是以一種衛生的方法收集。在收集時或立刻在收集之後，將血液與至少一種抗凝血劑混合，以防止血液之顯著的凝塊。對於血液之適合的抗凝血劑是如同在此技藝中所傳統熟知的，包括，例如，檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸以及肝素。當與血液混合時，抗凝血劑可以是固體的形式，例如，粉末，或是水溶液的形式。應了解的是，血液溶液來源可來自新鮮收集的樣本或來自老的樣本，例如，來自血庫之過期的人類血液。此外，血液溶液可先前地在冷凍及/或水溶液狀態中維持。較佳的，血液溶液在使用於此方法之前是未冷凍的。在另一具體實施例中，在將血液溶液引導進入抗凝血劑之前，分析在血液溶液中的抗生素程度，例如，青黴素。測定抗生素程度，藉由證實血液樣本的提供者並沒有以抗生素治療，以提供血液樣本並沒有負擔感染性微生物之保證的等級。用於抗生素之適合的分析之例子，包括，使 14 本紙張尺^適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）丨 Φ------- -I訂---------線{ f請先閱讀背面之；tti意事項再填寫本頁} 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1235662 A7 _ _ B7 五、發明說明（（：L ) 用標題爲“快速偵測在牛奶中的青黴素”的方法之青黴素分析套組（Difco，底特律，密西根）。較佳的，血液溶液包含低於或等於大約0.008單位/毫升的青黴素含量。另外，可使用放牧管理的計畫，以監測在牛隻中沒有疾病或抗生素治療的牛隻。較佳地，將血液溶液在抗凝血步驟之前或期間過濾’ 例如，藉由過濾以移除大的聚集物以及粒子。600個網目的網篩是適合之過濾器的一個例子。在血液溶液中的紅血球接著藉以適合的方法淸洗’例如，藉由透析過濾（diafiltration)、或以至少一種溶液’ 例如等張溶液，藉由分離的稀釋以及濃縮步驟之組合’以從細胞外的血漿蛋白質中分離紅血球，血漿蛋白質例如血淸白蛋白或抗體（例如，免疫球蛋白（IgG))。應了解的是，紅血球可以批次（batch)的模式或以連續供應（feed )的模式淸洗。可接受的等張溶液是在此技藝中所熟知的，並且包括溶液，例如，檸檬酸/鹽水溶液，其具有不會使紅血球的細胞膜破裂的酸鹼値（pH)以及滲透壓，並且其可取代全血的血漿部份。較佳的等張溶液具有中性的PH以及在大約 285-315毫滲透壓（mOsm)之間的滲透壓。在一較佳具體實施例中，等張溶液是由檸檬酸鈉二水合物（6.0公克/公升）以及氯化鈉（8.G公克/公升）的水溶液所組成。可使用於本發明之方法中的水包括蒸餾水、去離子水 '注射用水（WFI)及/或低熱原水（LPW)。較佳的注射 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱_) . --------:tr--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1235662 A7 B7 五、發明說明（6) 用水是去離子的蒸餾水，符合美國藥理學對於注射用水的規格。注射用水更說明於藥學工程學，卷11，頁15-23 ( 1991)。較佳的低熱原水是包含少於0.002內毒素單位/毫升的去離子水。較佳的是，等張溶液在加入至血液溶液前過濾。適合的濾膜之實例包括Millipore 10,000道耳呑的超濾膜，例如，Millipore 目錄編號 CDUF 050 G1 漉膜或 a/G Technology 的中空纖維，1〇,〇〇〇道耳吞（目錄編號UFP-10-C-85)。在一較佳具體實施例中，在血液溶液中的紅血球藉由透析過濾而淸洗。適合的透析濾膜包括可將紅血球從實質上較小的血液溶液成份中分離之孔洞大小的微孔膜，例如 0.1微米至0.5微米的濾膜（例如，0.2微米的中空纖維濾膜，Microgon Krosflo II微過濾匣）。一致地，過濾的等張溶液是以相等於濾液穿過透析濾膜所流失之速度（或體積），以補充方式持續地加入（或批次地加入）。在淸洗紅血球期間，將直徑顯著小於紅血球的血液溶液成份，或是成份是流體（例如，血漿），通過在濾液中透析濾膜的壁。將紅血球、血小板以及稀釋血液溶液的較大物體，例如，白血球細胞，保留並且與等張溶液混合，將等張溶液持續地加入，或批次地加入，以形成透析的血液溶液。在一更佳具體實施例中，在透析過濾槽中的血液溶液體積，一開始藉由將一份體積之過濾的等張溶液加入透析過濾槽而稀釋。較佳地，所加入之等張溶液的體積是大約相等於血液溶液的初始體積。 16 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----------------- ^---------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235662 A7 一 B7 五、發明說明（〖(A) 在另一具體實施例中，紅血球經由一系列的連續（或反向的連續）稀釋以及濃縮步驟而淸洗，其中血液溶液藉由加入至少一種等張溶液而稀釋，並且藉由流過濾膜而濃縮，藉此形成透析的血液溶液。當血漿蛋白質污染紅血球的含量已顯著地減少（典型地至少大約90% )時，紅血球完成淸洗。典型地，當從透析濾膜34排出之濾液的體積等於透析過濾槽中所包含之血液溶液體積（在以過濾的等張溶液稀釋血液溶液之前）的大約300%或更多時，紅血球完成淸洗。額外的紅血球淸洗可將細胞外的血漿蛋白質從紅血球中進一步分離。例如，使用6倍體積之等張溶液的透析過濾可從血液溶液中移除至少大約99%的IgG。接著使透析的血液溶液接觸到用於將在透析血液溶液中之紅血球，從白血球細胞以及血小板中分離出來的方法，例如，藉由離心的方法。應了解的是，可使用其它在此技藝中所一般熟知，用於從其它血液成份中分離紅血球的方法。例如，沈降作用，其中此分離的方法在紅血球從其它血液成份中分離之前，並不會使顯著量之紅血球的細胞膜破裂，例如，低於大約30%的紅血球。在分離紅血球之後，藉由用於溶解紅血球的方法將紅血球溶解，以從紅血球中釋放血紅素，而形成包含血紅素的溶液。溶解紅血球的方法可使用各種溶解方法，例如，機械性溶解、化學性溶解、低張性溶解或其它已知的溶解 17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱) . --------- ^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235662 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印？衣五、發明說明（八）方法，其可釋放血紅素，而不會顯著地損害Hb運輸以及釋放氧氣的能力。在另一具體實施例中，可將重組產生的血紅素，例如，房#，卷356 :頁258-260 ( 1992)中所說明之重組產生的血紅素，在本發明的方法中處理以取代紅血球。將包含血紅素的細菌細胞淸洗，並從以上所說明之污染物中分離。接著藉由在此技藝中所熟知的方法，例如，球磨機，使這些細菌細胞機械性地破裂，以從細胞中釋放血紅素並且形成溶解的細胞相。接著，如同溶解的紅血球相，而處理. 這個溶解的細胞相。

在溶解之後，接著超過濾此溶解的紅血球相，以移除較大的細胞殘骸，例如，具有大約iOOAOO道耳吞以上之分子量的蛋白質。一般而言，細胞殘骸包括所有完整的以及片I又的細胞成份，除了 Hb、較小的蛋白質、電解皙、輔酶以及有機的代謝中間物之外。可接受的超濾膜包括，例如’由Millip〇re (目錄編號CDUF 〇5〇 H1)以及由a/G

Technology (Needham，MA ;型號 XJFP100E55)所製造的 100,000道耳吞的濾膜。較佳的，持續超過濾直到在溶解之紅血球相中的Hb 濃度少於8公克/公升（g/1)爲止，以使可供聚合化作用之血紅素的產量最大化。可使用其它用於從溶解的紅血球相中分離Hb—的方法，包括，沈降作用、離心或微量過爐。可接者超過德Hb超過濾液，以移除較小的細胞殘骸例如’电解質、輔H、代謝中間物及分子、於大約 ----------ΙΦ------- 丨訂-I-------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 18 1235662 A7 ______ B7 五、發明說明（π ) 卷 120 :頁 321-333 ( 1976 )。色層分析管柱首先藉由以第一洗提液沖洗而作前處理，其可加速Hb的結合。接著將濃縮的Hb溶液注射進入管柱中的介質。在注射濃縮的Hb溶液之後，色層分析管柱接著相繼地以不同的洗提液淸洗，以產生分離的、純化的 Hb洗出液。在一較佳具體實施例中，在色層分析管柱中使用pH 梯度，以分離蛋白質污染物，例如，來自Hb的酵素碳酸酐酶、磷脂質、抗體以及內毒素。相繼的導引每一系列具有不同pH値的緩衝液，以在色層分析管柱中的介質內產生pH梯度。較佳的，緩衝液是過濾的，例如使用10,000 道耳呑之去熱原的濾膜。用來分離Hb的緩衝液應該具有低離子強度，使得Hb以及非血紅素污染物的洗提是一般地取決於pH，而不是顯著地取決於離子強度。典型地，具有大約50毫莫耳濃度，或更低之離子濃度的緩衝液，具有適合的低離子強度。第一緩衝液將濃縮的Hb溶液運輸進入色層分析管柱中的介質，並且加速Hb與介質結合。第二緩衝液接著調整管柱內的pH，以洗提污染的非血紅素成份，但維持Hb 與介質結合。第三緩衝液接著洗提Hb。接著收集Hb洗出液。較佳的，將Hb洗出液導引通過無菌濾膜。適合的無菌濾膜包括0.22微米的濾膜，例如，Sartorius Sartobran 目錄編號5232507 G1PH濾膜。在一較佳具體實施例中，將前3%至4%的Hb洗出液 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱i I Φ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線一經濟部智慧財產局員工消費合作社印剩衣經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1235662 A7 B7 五、發明說明（π ) 以及最後3%至4%的Hb洗出液導引進入廢液，以提供 Hb洗出液之純度的保證。其中，色層分析管柱是要重複使用的，接著藉由第四緩衝液，洗提仍留在管柱中之污染的非血紅素蛋白質以及內毒素。用於從非血紅素污染物中分離Hb之pH梯度的使用，是更進一步地說明於美國專利第5,691，452號，申請曰 1995年6月7日。在一較佳具體實施例中，第一緩衝液是三羥基甲基胺基甲烷（Tds)溶液（濃度大約20毫莫耳濃度；pH大約8·4至大約9.4)。第二緩衝液是第一緩衝液以及第三緩衝液的混合液，第二緩衝液具有pH大約8.2至大約8.6。第三緩衝液是Tris溶液（濃度大約50毫莫耳濃度；pH大約6.5至大約7.5 )。第四緩衝液是NaCl/Tris溶液（濃度大約1_〇莫耳濃度的NaCl以及大約20毫莫耳濃度的丁ris ; pH大約8.4至大約9.4，較佳地是大約8.9-9.1 )。特別較佳的，第二緩衝液的pH是介於大約8.2以及大約8.4之間。典型地，所使用的緩衝液是介於大約〇°C以及大約50 °C之間的溫度。較佳地，在使用期間，緩衝液的溫度是介於大約12.4±1.0°C。此外，緩衝液典型地是在大約9。(：至大約11°C之間的溫度儲存。較佳地，在聚合化作用之前，接著將Hb洗出液去氧 ’以形成去氧的Hb溶液（在此之後稱爲去氧-Hb)，藉由實質上地將Hb去氧但不顯著地減少在Hb洗出液中的Hb 21 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)a4規格（210 X 297公釐） ^ --------^---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235662 A7 B7 五、發明說明（β) 之運輸以及釋放氧氣的能力，例如，這些能力的影響會從氧化血紅素之形成的變性（metHb)而發生。在一具體實施例中，Hb洗出液藉由將惰性氣體轉移通過相濾膜（phase membrane)而去氧。這樣的惰性氣體包括，例如，氮氣、氬氣以及氦氣。應了解的是，可使用在此技藝所熟知之其它用於將血紅素溶液去氧的方法，將Hb 洗出液去氧。這樣的其他方法可包括，例如，將氮氣引入 Hb洗出液、以還原劑（例如，N-乙醯基-L-半胱氨酸（ NAC)、半胱氨酸、連二亞硫酸鈉或抗壞血酸）作化學的淸除，或藉由光的光解作用。從色層分析管柱中洗提之後，較佳地，將Hb洗出液濃縮以增進此方法的效率。將Hb洗出液通過超濾膜而再循環，以濃縮Hb洗出液而形成濃縮的Hb溶液。適合的超濾膜包括，例如，30,000或低於30,000道耳吞的超濾膜（例如，Millipore Helicon，目錄編號 CDUF050G1 或 Amicon目錄編號54〇430)。典型地，當Hb的濃度介於大約1〇〇至大約120公克/公升之間時，完成Hb洗出液的濃縮。在濃縮Hb洗出液時，Hb洗出液的溫度較佳地是維持在大約8-12°C。接著將緩衝液導引進入Hb溶液（較佳地是濃縮的Hb 溶液），以調整Hb溶液的離子強度而增強Hb的去氧。較佳的，調整離子強度至介於大約150毫當量/公升以及大約 2〇〇毫當量/公升之間，以減少在Hb溶液中之Hb的氧氣親合性。適合的緩衝液包括，具有將不會導致Hb蛋白質之 22 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------1--------------^---------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235662 A7 B7 五、發明說明（) 顯著變性’但將具有足夠高的離子強度以促使Hb去氧之 pH的緩衝液。適合的緩衝液之實例包括具有大約PH 6.5 至大約8·9範圍之鹽水溶液。較佳的緩衝液是具有大約pH 8.9之1·〇莫耳濃度NaCl、20毫莫耳濃度Tris溶液的水溶液。較佳地，接著將所產生之緩衝的Hb溶液通過超濾膜而再循環，以再次濃縮Hb溶液而增進此方法的效率。在一較佳具體實施例中’當Hb的濃度是大約1〇〇公克/公升至大約12〇公克/公升時，完成濃縮。在去氧作用的期間，將Hb溶液通過適合的相轉移濾膜而循環。適當的相轉移濾膜包括，例如，〇·〇5微米的聚丙烯中空纖維微濾膜（例如，Hoechst-Celanese目錄編號 5PCM-107)。一致地，將相反流向的惰性氣體通過相轉移濾膜。適合的惰性氣體包括，例如，氮氣、氬氣以及氯氣。氣體在相轉移濾膜之間交換，藉此淸除Hb溶液的氧氣〇持續地去氧直到氧氣的分壓（P〇2)降低至一程度爲止，其中在Hb溶液中之含氧的Hb (氧合血紅素或Hb02 )的含量是大約20%或更低。在一較佳具體實施例中，在 Hb溶液中之Hb02的含量是大約10%或更低。在去氧作用期間，Hb溶液的溫度典型地是維持在可平衡去氧的速度對形成變性血紅素的速度之程度。維持溫度以限制變性血紅素的含量至低於20%。最適的溫度將導致低於大約5%的變性血紅素含量，較佳地是低於大約2.5% 23 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235662 A7 B7 五、發明說明（>| ) 的變性血紅素含量，同時仍將Hb溶液去氧。典型地，在去氧作用期間，Hb溶液的溫度維持介於大約19°C以及大約31°C之間。在去氧作用期間，以及實質上在整個發明的方法之剩下的步驟中，將Hb維持在低氧的環境下，使Hb吸收氧氣達最小化，並且使Hb02的含量維持在低於大約20%，較佳地是低於大約10%。接著，去氧的Hb較佳地與低氧含量的儲存緩衝液平衡，其包含锍基化合物i以形成氧化作用穩定化的去氧Hb 。適合的毓基化合物包括不具毒性的還原劑，例如，N-乙醯基半胱氨酸（NAC)、D，L-半胱氨酸、r-穀胺醯基-半胱氨酸、穀胱甘肽、2,3-毓基-1-丙醇、1，4-丁烷二硫赶、锍基醋酸鹽以及其它生物學上可相容的锍基化合物。低氧含量的儲存緩衝液之氧氣含量必須夠低，而不會顯著地減少在緩衝液中锍基化合物的濃度，並將在氧化作用穩定化之去氧Hb中的氧合血紅素之含量，限制在大約20%或更低，較佳地是低於大約10%。典型地，儲存的緩衝液具有低於大約50陶爾（torr )的氧氣分壓。在一較佳具體實施例中，儲存的緩衝液應具有適合於平衡Hb聚合化作用以及變性血紅素之形成的pH，典型地是介於大約7.6以及大約7.9之間。 I荒基化合物與去氧Hb混合的量是夠高的量，以在聚合化作用期間增加Hb之分子內的交叉聯結，並且是夠低的量，以不會顯著地減少Hb分子之分子間的交叉聯結（ 24 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）一； ---------訂---------線· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1235662 A7 B7 五、發明說明（》) 由於高的離子強度）。典型地，介於大約0.25莫耳至大約 5莫耳之間的去氧Hb，需要大約1莫耳的锍基官能基（— SH)，以使氧化作用穩定化。在一較佳具體實施例中，儲存的緩衝液包含大約25_ 35毫莫耳濃度的磷酸鈉緩衝液（pH 7.7-7.8)，並且包含一定量的NAC，使得在氧化作用穩定化之去氧Hb的NAC 濃度，是介於大約0.003%以及大約0.3%的重量百分比之間。更佳地，在氧化作用穩定化之去氧Hb的NAC濃度，是介於大約〇·〇5%以及大約0.2%的重量百分比之間。較佳地，在與去氧Hb混合之前，過濾儲存的緩衝液，例如，通過1〇,〇〇〇道耳吞的超濾膜（Millipore Helicon ，目錄編號 CDUF050G1 或 A/G Technology Maxcell 目錄編號 UFP-10-C-75)。在一具體實施例中，接著將氧化作用穩定化的去氧Hb 流過一可視需要的濾膜。適合的濾膜包括0.2微米的聚丙烯前濾膜，以及〇·5微米的無菌微濾膜（pall profile π，目錄編號ABIY005Z7或Gelman Supor)。去氧Hb是維持在實質上無氧的大氣中。這個可藉由例如，在以氧化作用穩定化的去氧Hb塡充之前以及之後，以惰性氣體，例如，氮氣，淸除並覆蓋此方法的裝置而達成。可視需要地，在將氧化作用穩定化的去氧Hb轉移至聚合化作用之前，將適當量的水分加入聚合化作用的反應器。在一具體實施例中，當氧化作用穩定化的去氧Hb加入至聚合化作用的反應器時，適當量的水分會導致濃度大 25 本紙張尺度剌中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮) . --------，訂·丨.—^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235662 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（Η ) 約10至大約100公克/公升Hb的溶液。較佳地，水分是去除氧氣的。在聚合化作用的步驟中，在水中的氧氣分壓降低至足以限制Hb〇2的含量至大約20%的程度之後（典型地是低於大約50陶爾），以惰性氣體（例如氮氣）覆蓋聚合化作用的反應器。接著將氧化作用穩定化的去氧Hb轉移進入聚合化作用的反應器，其一致地以適當的惰性氣體流動而覆蓋。當與交聯劑接觸的時候，將在聚合化作用反應器之氧化作用穩定化的去氧Hb溶液的溫度，提升至使氧化作用穩定化的去氧Hb之聚合化作用最適化的溫度。典型地，氧化作用穩定化的去氧Hb之溫度，在整個聚合化作用期間，是大約25°C至大約45t，較佳地是大約41°C至大約 43°C。用於加熱聚合化作用反應器之可接受的熱轉移方法是套層加熱系統，其藉由將熱的乙二醇導引穿過套層而加熱。氧化作用穩定化的去氧Hb在足以使氧化作用穩定化的去氧Hb聚合化的溫度下，接著與適合的交聯劑接觸，經過大約2小時到大約6小時的期間，以形成聚合化的血紅素（聚(Hb) ; poly(Hb))之溶液。適合的交聯劑之實例，包括可交叉聯結Hb蛋白質的多官能基作用劑，例如，戊二醛、丁二醛、聚氧化乙烯和葡聚糖的活化形式、α-羥基醛，例如，乙醇醛、N-順式丁烯二醯亞胺-6-氨基己醯-(2’-硝基，4’-磺酸)-苯基酯、間-順 26 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) " ' . --------Γ 訂· —-------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235662 A7 B7 五、發明說明（从）式丁烯二醯亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀醯亞胺酯、琥珀醯亞胺基-4-(N-順式丁烯二醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯、硫代號珀醯亞胺基-4-(N-順式丁烯二醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯、間-順式丁烯二醯亞胺苯甲醯-N-羥基琥珀醯亞胺基酯、間-順式丁烯二醯亞胺苯甲醯-N-羥基硫代琥珀醯亞胺基酯、N-號珀醯亞胺基(4_碘乙醯）氨基苯甲酸酯、硫代琥珀醯亞胺基(4-碘乙醯)氨基苯甲酸酯、琥珀醯亞胺基-4-(對-順式丁烯二醯亞胺苯基)丁酸酯、硫代琥珀醯亞胺基-4_(對-順式丁嫌二醯亞胺苯基)丁酸酯、1-乙基_3-(3-二甲基氨基丙基) 碳化二亞胺-氫氯化物、N，N’-次苯基二順式丁烯二醯亞胺以及屬於雙醯亞胺類、醯基二疊氮化物類或芳基二鹵化物類等的化合物。適合的交聯劑的量，是可提供分子內的交叉聯結以穩定Hb，並且提供分子間交叉聯結以形成Hb聚合物的交聯劑量，藉此增加血管內的停留時間。典型地，適合的交聯劑的量，是其中交聯劑對Hb的莫耳比超過大約2 : 1的量。較佳地，交聯劑對Hb的莫耳比是介於大約20 : 1到40 :1之間。較佳地，聚合化作用是在pH介於大約7.6到大約7.9 之間的緩衝液中進行，此緩衝液具有低於或等於大約35毫莫耳濃度的氯離子濃度。在一較佳具體實施例中，將適合的交聯劑的量加到氧化作用穩定化之去氧Hb，然後藉由低剪力的混合工具而混合。適合的低剪力混合工具包括一靜態的混合器。適合的 27 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） ^ --------^訂-I--------線 ^^1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 1235662 五、發明說明（π) 靜態混合器是，例如，購自Chemineer公司的“Kenics”靜態混合器。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在一具體實施例中，將氧化作用穩定化的去氧Hb以及交聯劑通過靜態混合器而再循環，引起混亂的流動狀態，伴隨著一般地一致的混合交聯劑以及氧化作用穩定化之去氧Hb，藉此降低形成包含高濃度交聯劑之去氧Hb 口袋的可能性。一般地一致的混合交聯劑以及去氧Hb，減少高分子量Hb聚合物的形成，也就是，分子量大於500,000道耳吞的聚合物，並且在聚合化作用期間，提供交聯劑以及去氧Hb之較快的混合。此外，在Hb聚合化作用期間，由於锍基化合物的存在，較佳地是NAC，將產生顯著的Hb 分子內之交叉聯結。雖然不淸楚锍基化合物與戊二醛及/或 Hb之交互作用的確切機轉，但推測锍基化合物是以至少部份地抑制高分子量Hb聚合物之形成，並且較佳地以形成穩定化之四聚體Hb的方式，而影響Hb/交聯劑之化學上的鍵結。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製如果Hb分子的大部分（例如，至少大約50%)是化學地結合在聚(Hb)中，並且只有少量，例如，少於大約15 %是包含在高分子量聚合化的血紅素鏈中，則聚(Hb)是定義爲具有顯著的分子內之交叉聯結。高分子量聚(Hb)分子是例如，具有分子量在500,000道耳吞以上的分子。在一較佳具體實施例中，使用戊二醛作爲交聯劑。典型地，每公斤之氧化作用穩定化的去氧Hb使用大約10至大約70公克的戊二醛。更佳地，加入戊二醛，經過5小時 28 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235662 A7 B7 五、發明說明（d) 的期間，直到每公斤之氧化作用穩定化的去氧Hb加入大約29-31公克的戊二醛爲止。在聚合化作用之後，在聚合化作用反應器中之聚(Hb) 溶液的溫度，典型地降低至大約15°C至大約25t。當所使用的交聯劑不是醛類時，則所形成的聚(Hb) — 般是穩定的聚(Hb)。當所使用的交聯劑是醛類時，則所形成的聚(Hb)直到與適合的還原劑混合，一般才是穩定的，以減少在聚（Hb)中之較不穩地的鍵結，而形成較穩定的鍵結。適合的還原劑之實例包括，氫硼化鈉、氰基氫硼化鈉、連二亞硫酸鈉、三甲基胺、第三-丁基胺、嗎啉甲硼烷以及吡啶甲硼烷。在加入還原劑之前，聚(Hb)溶液可視需要地藉由超過濾而濃縮，直到聚(Hb)溶液的濃度增加至介於大約75至大約85公克/公升之間爲止。適合的超濾膜之實例是30,000道耳吞的濾膜（例如，Millipore Helicon，目錄編號CDUF050LT或Amicon目錄編號540430)。接著調整聚(Hb)溶液的pH至鹼性的pH範圍，以保存還原劑以及防止氫氣的形成，氫氣可在後續的還原期間使 Hb變性。在一具體實施例中，調整pH至大於1〇。在聚合化作用的期間或之後，可藉由加入緩衝溶液至聚(Hb)溶液而調整pH。典型地純化聚(Hb)以移除非聚合化的血紅素。這可藉由透析過濾或氫氧磷灰石色層分析而達成（參見，例如，美國專利第5,691，453號）。在調整pH之後，將至少一種還原劑，較佳地是氫棚化鈉溶液，典型地通過去氧化作用線圈而加入聚合化作用 29 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ϋ ϋ· ϋ ·1_— ·ϋ H ϋ i^i tm§ «1 · ϋ β·— tM— n ·ϋ n n ·1 y ememm ϋ 1 met «Βϋ —al eaamm I i I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1235662 A7 ___ B7 五、發明說明（π) 的步驟。典型地，在聚(Hb)中，每莫耳的Hb四聚體（每 64,000道耳吞的Hb)加入大約5至大約8莫耳的還原劑。在一較佳具體實施例中，在聚合化次系統98中之每9公升的聚(Hb)溶液，以〇·ΐ至0.12公升/分鐘（lpm)的速度加入1公升之0.25莫耳濃度的氫硼化鈉溶液。穩定的聚(Hb)之pH以及電解質，接著藉由以透析過濾溶液（具有適合的pH以及生理上的電解質程度），將穩定之聚(Hb)透析過濾，而回復至生理上的程度，以形成穩定之聚合化的血紅素血液替代物。較佳地，透析過濾溶液是一緩衝溶液。其中聚(Hb)藉由還原劑而還原，透析過濾溶液具有酸性的pH，較佳地是介於大約4至大約6之間。也可將不具毒性之锍基化合物加入至穩定的聚(Hb)溶液，作爲氧氣淸除劑，以增強最終聚合化之血紅素血液替代物的穩定性。可加入锍基化合物作爲透析過濾溶液的部份及/或分開地加入。加入一定量的疏基化合物以建立可淸除氧氣的锍基濃度，而在儲存期間維持少於15%的變性血紅素含量。較佳地，锍基化合物是NAC。典型地，所加入之疏基化合物的量，是足以建立介於大約0.05%以及大約 0.2%重量百分比之間的锍基濃度的量。在一較佳具體實施例中，血液替代物是在無菌操作的條件下，同時以惰性氣體維持壓力（實質上是無氧氣的大氣）在聚合化作用的反應器以及剩下的運輸裝置中包裝。藉由本發明之方法所形成之適合的穩定聚合化的血紅 30 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐)~~ . --------τ 訂-------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235662 A7 B7 五、發明說明（J ) 素血液替代物之規格，在表I中提供。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表I 參數結果 pH (18-22〇C) 生理學上可接受內毒素生理學上可接受無菌測試符合測試磷脂質a 生理學上可接受全血紅素 10-250公克/公升變性血紅素 <15% 氧合血紅素 <10% 鈉，Na+ 鉀，K+ 氯，cr 生理學上可接受鈣，Ca〇硼戊二醛生理學上可接受 N-乙醯基心半胱氨酸生理學上可接受分子量> 500,000 ^ 15% 分子量S 65,000 <10% 分子量< 32,000 <5% 微粒狀物質內容物〉10微米 < 12/毫升微粒狀物質內容物> 25微米 <2/毫升 a :以聚合化作用前的Hb測量 31 I --------Γ1Τ·-:-------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235662 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（4) 接著將穩定的血液替代物儲存在短期的儲存容器或無菌的儲存容器中，每個皆具有以上所詳述之低氧環境。儲存容器也應該是對水蒸汽的通過是足夠地不通透的，以防止在儲存期間藉由蒸發所造成之血液替代物的顯著濃縮。血液替代物之顯著的濃縮，是導致血液替代物之一種或多種參數高於規格外的濃縮。根據本發明之方法所形成之穩定聚合化的血紅素血液替代物之合成，進一步說明於美國專利第5,296,465號。可接受本發明之方法所形成之血液替代物的脊椎動物，包括，哺乳動物，例如，人類、非人類靈長類、狗、貓、大鼠、馬或綿羊。此外，可接受該血液替代物的脊椎動物，包括，胎兒（出生前的脊椎動物）、出生後的脊椎動物、或在出生時的脊椎動物。本發明之血液替代物可給藥至循環系統，藉由將血液替代物直接及/或間接地注射進入脊椎動物的循環系統。直接注射的方法之實例包括，血管內注射，例如，靜脈內以及動脈內注射、以及心臟內注射。間接注射之方法的實例包括，腹膜內注射、皮下注射，使得血液替代物藉由淋巴系統而運輸進入循環系統，或藉由套針或導管的工具而注射進入骨髓。較佳地，血液替代物是靜脈內地給藥。在灌入血液替代物之前、在灌入血液替代物的期間、及/或在灌入血液替代物之後，要被治療的脊椎動物，可以是正常血量的、高血量的或低血量的。血液替代物可藉由 ’例如，上方負載的方法以及藉由交換方法，而導引進入 32 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^ --------Γ β_ι------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235662 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣五、發明說明（π ) 循環系統。血液替代物可醫療性地給藥，以治療在脊椎動物內之缺氧的組織，此缺氧的組織是起因於許多不同的原因，包括在部份循環系統或整個循環系統中，減低的紅血球流動、貧血以及休克。此外，血液替代物可預防地給藥，以防止在脊椎動物內之組織的氧氣缺乏，氧氣缺乏可起因於對脊椎動物的組織或在整個循環系統中，紅血球流動之可能的或預期的減低。血紅素之用於醫療地或預防地治療缺氧 (特別地是來自部份動脈阻礙或來自微循環的部份阻斷）之給藥的進一步討論，以及在那裡所使用的劑量，提供於審查中的美國專利申請案序號第08/409,337號，申請日 1995年3月23日，現在是美國專利第5,854,209號。典型地，適合的劑量、或血液替代物之劑量的組合，是當包含在血漿內時，導致脊椎動物之血液的全血紅素濃度，介於大約〇·1至大約10公克Hb/ΙΟΟ毫升之間或更多的量，如果需要補足大體積的血液流失的話。本發明現在藉由以下的實施例，將進一步且特別地說明。實施例1 穩定聚合化之Hb血液替代物的合成如同說明於美國專利編號第5,296,465號，收集牛全血的樣本，與檸檬酸鈉抗凝血劑混合，以形成血液溶液。在收集之後，每個血液溶液樣本維持在大約2°C的溫度，並且接著以600網目之網篩過濾，以移除大的聚集物 33 本&張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I--------------τ 訂 -------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235662 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（糾）和粒子。合在一起之前，使用標題爲“快速偵測在牛奶中的青黴素”的方法，以購自Difco (底特律，密西根）的分析套組試劑分析在每個血液溶液樣本中的青黴素程度，以確保在血液溶液樣本中的青黴素程度小於〇·〇〇8單位/毫升。接著將血液溶液樣本合在一起，並且與去熱原的水溶液檸檬酸鈉溶液混合，以形成在牛全血中是0.2%重量百分比的檸檬酸鈉溶液（在此之後，以“0.2%檸檬酸鈉血液溶液”表示）。接著將0.2%檸檬酸鈉血液溶液連續地通過800微米以及50微米的聚丙烯濾膜，以移除直徑大約50微米或更大的大血液溶液殘骸。接著淸洗紅血球，以將細胞外的血漿蛋白質，例如，牛血淸白蛋白或IgG，從紅血球中分開。爲了淸洗包含在血液溶液中的紅血球，在透析過濾槽中的血液溶液之體積，一開始就藉由將相同體積之過濾的等張溶液加入透析過濾槽中而稀釋。等張溶液以Millipore (目錄編號CDUF 050 G1 )之10,000道耳呑的超濾膜過濾。等張溶液由在注射用水（WFI)中之6.0公克/公升的檸檬酸鈉二水合物以及8.0公克/公升的氯化鈉所組成。稀釋的血液溶液接著藉由通過0.2微米中空纖維透析濾膜（Microgon Krosflo II微過濾匣）超過濾，而濃縮回其原始的體積。一致地，過濾的等張溶液是以相等於濾液通過〇·2微米透析濾膜所流失的速度，如同組成份般的持 34 P氏張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） " " I------€------- τ訂-------- 線% (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235662 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（p) 續地加入。在透析過濾期間，將稀釋的血液溶液之成份，其在直徑上顯著地比紅血球小、或是流體，例如’血漿’ 與濾液一起通過〇·2微米透析濾膜的壁。稀釋的血液溶液之紅血球、血小板、以及較大的物體，例如，白血球，與持續加入的等張溶液一起停留，以形成透析的血液溶液。在淸洗紅血球期間，將稀釋的血液溶液維持在介於大約10至25°C之間的溫度，並使在透析濾膜的入口之流體壓力維持在介於大約25磅/平方英吋以及大約30磅/平方英吋之間，以增進此方法的效率。當從透析濾膜排出之濾液的體積等於血液溶液之體積 (在以過濾的等張溶液稀釋血液之前）的大約600%時，紅血球完成淸洗。接著以幫浦將透析的血液溶液持續地以大約4公升/分鐘的速度抽至Sharpies Super離心機，型號AS-16 (以28 號ringdam安裝）。當一致地供應透析的血液溶液時，操作離心機，以將紅血球從白血球以及血小板中分離。在操作期間，離心機以足夠將紅血球分離進入重的紅血球相（ RBC phase)、同時也將大部分的白血球及血小板分離進入輕的白血球相之速度運轉，特別地是大約15,〇〇〇轉/分鐘 (rpm)。在操作期間，紅血球相以及白血球相的部份分別地以及持續地從離心機排出。在紅血球分開之後，溶解紅血球以形成包含血紅素的溶液。當從離心機排出紅血球的時候，將大部分的紅血球機械性地溶解。紅血球的細胞膜藉由以對於來自離心的紅 35 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------------^訂-------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235662 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（G) 血球相之流動的角度，擠壓紅血球相排出線的壁而破裂，藉此將血紅素（Hb)從紅血球釋放進入紅血球相。溶解的紅血球相接著流過紅血球相排出線，進入靜態混合器（Kenics I/2英吋，具有6個元件，Chemineei•公司 )。與紅血球相轉移至靜態混合器一致，等量的注射用水也注射進入靜態混合器，其中注射用水與紅血球相混合。紅血球相以及注射用水進入靜態混合器的流速皆在大約 0.25公升/分鐘。在靜態混合器中混合紅血球相與注射用水產生溶解的紅血球膠狀體。接著將溶解的紅血球膠狀體從靜態混合器轉移進入Sharpies Super離心機（型號AS-16 Sharpies Division of Alfa-Laval Separation 公司），此離心機適合於將Hb從非血紅素的紅血球成份中分離。此離心機以足夠將溶解的紅血球膠狀體分離進入輕的Hb相以及重相的速度運轉。輕的相由Hb組成，並且包含非血紅素成份，其密度大約等於或小於Hb的密度。

Hb相持續地從離心機排出，通過0.45微米MilliP〇re Pellicon Cassette，目錄編號HVLP 000 C5微濾膜，並進入留置槽，以用於純化Hb的製備。細胞基質接著與留存液 (retentate)從微濾膜回到留置槽。在微過濾的期間，在留置槽之內的溫度維持在10°C或更低。爲了增進效率，當在微濾膜入口的流體壓力從大約10磅/平方英吋的起始壓力增加至大約25磅/平方英吋的時候，完成微過濾。Hb的微濾液接著從微濾膜轉移進入微濾液槽。 36 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) ---------------------q 訂- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) S. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235662 A7 B7 五、發明說明（冰）後續地，將Hb微濾液以幫浦抽過100,000 Millipore 目錄編號CDUF 050 HI的超濾膜。大部分包含在Hb微濾液中的Hb及水分，通透1〇〇,〇〇〇道耳吞的超濾膜以形成 Hb超濾液，但是，較大的細胞殘骸，例如，具有分子量大於100,000道耳呑的蛋白質會被擋住，並再循環回到微濾液槽。一致地，爲了在超過濾中的水分流失，將注射用水如同組成份般的持續地加入微濾液槽。一般而言，細胞殘骸包括所有完整的以及片段的細胞成份，除了 Hb、較小的蛋白質、電解質、輔酶以及有機代謝中間物之外。持續超過濾，直到在微濾液槽中的Hb濃度低於8公克/公升（g/1 )爲止。當超過濾Hb的時候，微濾液槽的內部溫度維持在大約l〇°C。將Hb超濾液轉移進入超濾液槽，其中Hb超濾液接著再循環通過30,000道耳吞Millipore目錄編號CDUF 050 T1的超濾膜，以移除較小的細胞成份，例如，電解質、輔酶、代謝中間物、以及分子量小於大約3〇,〇〇〇道耳呑的蛋白質、以及來自Hb超濾液中的水分，藉此形成包含大約 1〇〇公克Hb/公升的濃縮Hb溶液。接著將濃縮的Hb溶液從超濾液槽導引進入包含在平行色層分析管柱（長2英尺，內直徑8英吋）中的介質’ 以藉由高效能液相色層分析法而分離Hb。色層分析管柱包含適合從非血紅素蛋白質中將Hb分離的陰離子交換介質。陰離子交換介質是由二氧化矽膠體而形成。二氧化矽膠體是與r-縮水甘油氧基丙基矽烷接觸以形成活性的環氧化 37 ----------------------:訂 it-------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235662 A7 B7 五、發明說明（u) 物基團，並且接著與C3H7(CH3)NC1接觸以形成四級銨陰離子交換介質。這個處理二氧化矽膠體的方法說明於色層分析法雜誌（《/⑽，卷 120 :頁 321_ 333 ( 1976 )。每個管柱以加速Hb結合的第一緩衝液沖洗色層分析管柱而前處理。然後，將4·52公升的濃縮Hb溶液注射進入每個色層分析管柱。在注射濃縮的Hb溶液之後，色層分析管柱接著藉由連續地導引三種不同的緩衝液通過色層分析管柱而淸洗，以產生Hb洗出液（藉由在管柱內產生 pH梯度）。在使用的期間’每個緩衝液的溫度大約是12.4 °C。在注射進入色層分析管柱之前，緩衝液通過1〇,〇〇〇道耳吞的超瀘膜而前過濾。第一緩衝液，20毫莫耳濃度的三羥基甲基胺基甲烷 (Tris) (pH大約8.4至大約9·4)，將濃縮的Hb溶液運輸進入在色層分析管柱中的介質以結合Hb。第二緩衝液是第一緩衝液與第三緩衝液的混合液，具有pH大約8.3，接著調整在色層分析管柱內的pH，以從色層分析管柱中沖提污染的非血紅素成份，但保留Hb。每個管柱以大約3.56 公升/分鐘的流速，用第二緩衝液平衡，持續大約30分鐘。將來自第二緩衝液的洗出液丟棄至廢液。第三緩衝液是 5〇毫莫耳濃度的Tris (pH大約6.5至大約7.5)，接著從色層分析管柱中沖提Hb。接著將Hb洗出液導引通過無菌的0.22微米Sartobran 目錄編號5232507 G1PH濾膜至收集Hb洗出液的槽體。將 38 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 J--- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235662 A7 B7 五、發明說明（从）前3%至4%的Hb洗出液以及最後3%至4%的Hb洗出液導引進入廢液。如果此洗出液包含少於0.05內毒素單位/毫升的內毒素以及包含少於3.3奈莫耳/毫升的磷脂質，則進一步使用此Hb洗出液。將9公升的1.0莫耳濃度之NaC卜20毫莫耳濃度Tds (pH 8.9)加入具有濃度100公克Hb/公升的 60公升之超純洗出液，藉此形成具有離子強度160毫莫耳濃度的Hb溶液，以減少在Hb溶液中之Hb的氧氣親和力。Hb溶液接著在l〇°C，藉由通過超濾膜（特別地是 10,000 道耳呑 Millipore Helicon，目錄編號 CDUF050G1 的濾膜）再循環而濃縮，直到Hb的濃度爲110公克/公升爲止。藉由通過0.05微米的Hoechst-Celanese公司，目錄編號G-240/40的聚丙烯微濾膜相轉移膜，以12公升/分鐘的流速再循環Hb溶液，而接著將Hb溶液去氧，直到Hb溶液的氧氣分壓降到Hb02含量大約10%的程度爲止，以形成去氧的Hb溶液（在此處之後以“去氧Hb”表示）。一致地，將60公升/分鐘流動的氮氣導引通過相轉移膜的另一邊。在去氧作用期間，Hb溶液的溫度維持在介於大約 19°C以及大約31°C之間。也是在去氧作用期間以及後續地在整個方法中，將Hb 維持在低氧的環境下，使Hb吸收氧氣達最小化，並且使氧化的Hb (氧合血紅素或Hb02)的含量在去氧的Hb中維持低於大約10%。 39 -------1--------------^訂. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235662 A7 B7 五、發明說明（π) 接著將60公升的去氧Hb與180公升的儲存緩衝液’ 通過超濾膜而透析過濾’儲存緩衝液包含0·2%重量百分比的N-乙醯基-L-半胱氨酸、具有小於50陶爾氧氣分壓之33 毫莫耳濃度的磷酸鈉緩衝液（ΡΗ 7.8)，以形成氧化作用穩定化的去氧Hb。在與去氧Hb混合之前’儲存緩衝液以 10,000 道耳吞 Millipore Helicon，目錄編號 CDUF050G1 的去熱原濾膜而去熱原。以大約相等於流體通過超濾膜所流失之速度，持續地加入儲存緩衝液。持續透析過濾，直到流體經由通過超濾膜之透析過濾所流失的體積，大約是去氧Hb之起始體積的3倍爲止。在將氧化作用穩定化的去氧Hb轉移進入聚合化作用的裝置之前，將去除氧氣的注射用水加入聚合化作用的反應器中，以淸除聚合化作用反應器的氧氣，防止氧化作用穩定化之去氧Hb的氧化。當氧化作用穩定化的去氧Hb加入聚合化作用的反應器時，加入聚合化作用裝置之注射用水的量，是可導致具有大約40公克Hb/公升之濃度的Hb 溶液的量。接著將注射用水在整個聚合化作用的裝置中再循環，藉由流過0.05微米的聚丙烯微濾膜相轉移濾膜（ Hoechst-Celanese公司，目錄編號5PCM-108，80平方英尺 )，對抗相反流向的加壓氮氣，而將注射用水去氧。通過相轉移濾膜之注射用水以及氮氣的流速，大約分別是10至 20公升/分鐘以及40至60公升/分鐘。在聚合化作用的裝置內之注射用水的氧氣分壓降至低 40 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I--------------r tl-T--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235662 μ B7 五、發明說明（j) 於大約2陶爾氧氣分壓之後’以大約20公升/分鐘氮氣的流速，使氮氣進入聚合化作用反應器的上端空間而覆蓋聚合化作用反應器。聚合化作用在pH 7.8之12毫莫耳濃度的磷酸鹽緩衝液中處理，磷酸鹽緩衝液具有低於或等於大約35毫莫耳濃度的氯離子濃度。後續地將氧化作用穩定化的去氧Hb以及N-乙醯基-L-半胱氨酸，緩慢地與交聯劑（戊二醛）混合，特別地，在經過5小時的期間，每公斤的Hb加入29.4公克的戊二醛，同時在40°C加熱，並且將Hb溶液通過具有6個元件之 Kenics 1·1/英吋靜態混合器（Chemineer公司）而再循環，以形成聚合化的Hb (聚(Hb))溶液。將氧化作用穩定化的去氧Hb以及戊二醛，通過靜態混合器而再循環，引起混亂的流動狀態，伴隨著一般地一致的混合交聯劑以及氧化作用穩定化之去氧Hb，藉此降低形成包含高濃度戊二醛之去氧Hb 口袋的可能性。一般地一致的混合交聯劑以及去氧Hb，減少高分子量聚(Hb)的形成（具有大於500,000道耳吞的分子量），並且在聚合化作用期間，提供戊二醛以及去氧Hb之較快的混合。此外，在Hb聚合化作用期間，由於N_乙醯基_L_半胱氨酸之存在於Hb聚合化作用上的效果，導致顯著的Hb分子內之交叉聯結。在聚合化作用之後，在聚合化作用反應器內之聚(Hb) 溶液的溫度降至介於大約15°C至大約25°C之間的溫度。 41 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公髮） . --------- J------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235662 A7 ____ B7 五、發明說明（θ) 聚(Hb)溶液接著藉由將聚(Hb)溶液通過超濾膜再循環而濃縮，直到聚(Hb)溶液的濃度增加至大約85公克/公升爲止。適合的超濾膜是30,000道耳吞的濾膜（例如， Millipore Helicon，目錄編號 CDUF050LT)。後續地，再將聚(Hb)溶液與66.75公克的氫硼化鈉混合，並且再一次通過靜態混合器而再循環。特別地，對於每9公升的聚(Hb)溶液，以0.1至0.12公升/分鐘的速度加入1公升的〇·25莫耳濃度之氫硼化鈉溶液。在加入氫砸化鈉至聚(Hb)溶液之前，聚(Hb)溶液的pH 藉由調整pH至大約pH 10而鹼化，以保存氫硼化鈉，並且防止氫氣的形成。聚(Hb)溶液的pH藉由以大約215公升之12毫莫耳濃度的硼酸鈉緩衝液（去熱原、去氧、具有大約1〇·4至大約10.6的pH)，將聚(Hb)溶液透析過濾而調整。藉由從聚合化作用的反應器中，通過30仟道耳吞的超濾膜再循環，而將聚(Hb)溶液透析過濾。將硼酸鈉緩衝液以大約相等於流體從透析過濾通過超濾膜所流失的速度，加入聚(Hb)溶液。持續透析，直到流體從透析過濾通過超濾膜所流失的體積，大約是去氧Hb在聚合化作用反應器中之起始體積的3倍爲止。在pH調整之後，將氫硼化鈉溶液加入聚合化作用的反應器中，以減少在聚(Hb)溶液中的鍵結，形成在溶液中穩定的聚(Hb)。在添加氫硼化鈉的期間，將在聚合化作用反應器中的聚(Hb)溶液，持續地通過靜態混合器以及〇.〇5 微米聚丙烯微濾膜相轉移濾膜而再循環，以移除溶解的氧 42 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------Γ 訂------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农 1235662 A/ B7 五、發明說明（⑹）氣以及氫氣。流過靜態混合器也提供混亂的氫硼化鈉溶液流動狀態，其快速且有效地混合氫硼化鈉與聚(Hb)溶液。聚(Hb)溶液以及氮氣通過0.05微米相轉移濾膜的流速，分別介於大約2.0至4.0公升/分鐘以及大約12至18公升/分鐘之間。在完成氫硼化鈉的添加之後，持續聚合化反應器中的還原作用，同時包含在那裡的攪拌器以大約75轉/分鐘而運轉。大約在添加氫硼化鈉後1小時，穩定的聚(Hb)溶液從聚合化作用的反應器通過30,000道耳吞的超濾膜而再循環，直到穩定的聚(Hb)溶液之濃度爲110公克/公升爲止。在濃縮之後，藉由以過濾的、去氧的、低pH的緩衝液（其含有在注射用水中之27毫莫耳濃度的乳酸鈉、12毫莫耳濃度的NAC、115毫莫耳濃度的NaCl、4毫莫耳濃度的 KC1以及1.36毫莫耳濃度的CaCl2 (pH 5.0))，將穩定之聚(Hb)通過30,000道耳吞的超濾膜而透析過濾，使穩定的聚(Hb)溶液之pH以及電解質回復至生理上的程度，以形成穩定之聚合化的血紅素血液替代物。持續透析過濾，直到流體由通過超濾膜之透析過濾所流失的體積，是濃縮的Hb產物之透析過濾前的體積的6倍爲止。在pH以及電解質回復至生理上的程度之後，接著藉由將過濾的、去氧的低pH緩衝液加入聚合化作用的反應器，而將穩定之聚合化的血紅素血液替代物稀釋至5.0公克/100毫升的濃度。接著將稀釋的血液替代物，藉由從聚合化作用反應器通過靜態混合器以及1〇〇,〇〇〇道耳吞純化 43 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^ --------- ^ ---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 線% 1235662 A7 B7 五、發明說明（d) 。(：，100%/50%相對溼度）。水蒸汽通透性是25·〇鼋克 /100平方英吋/大氣壓-日（25°C，1〇0%/50%相對溼度）（或3.87毫克/100平方公分/大氣壓-曰（25C ’ 100%/50% 相對溼度））。在取樣N-乙醯基-L-半胱氨酸（NAC)、雙-N-乙醯基-L-半胱氨酸（NAC2)、全Hb (THb)、氧化的血紅素（ Hb02)以及變性血紅素（MetHb)的濃度及/或程度之後，在沒有覆蓋物的情況下，在加速穩定的狀態下維持包裝的血液替代物達90天。加速穩定的狀態是40°C以及75%的相對溼度（RH)。因爲在較高的溫度以及相對溼度下’包裝材料的屏障性質會降低，所以這些加速穩定的狀態可相當於在周圍條件（25t以及50%相對溼度）下所測量的穩定，達至少一年。結果在表II中提出。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣表II 加速穩定性數據月 NAC nac2 THb (公克 Hb02 MetHb (%) (%) /100毫升） (%) (%) 0 0.18 0.01 12.4 3 1 3 0.03 0.21 12.0 3 6 規格 <0.24 <0.24 12.0-14.0 <10 <15 45 丨線赢本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235662 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（β) 實施例4 聚合化的血紅素分析在血紅素產物中的內毒素濃度，藉由“動力/濁度法 LAL 5000方法論”的方法而測定，此方法是由Cape Cod 聯盟所發展（Woods Hole，麻薩諸塞州），J. Levin等人，乂 Z以· C/z>2. Mec/·，卷 75 :頁 903-911 ( 1970)。各種方法使用於測試基質的任何痕跡，方法例如，沈澱分析、免疫墨漬、以及酵素連結免疫吸附分析法（ELISA)，用於熟悉於此技藝者所知道之特定的細胞膜蛋白質或糖脂質。微粒物質的計數是藉由“在注射中的微粒事件：對於單一劑量注入的大體積注射”的方法而測定（実激藥典，卷 22 :頁 1596，1990)。爲了測定戊二醛的濃度，將血紅素產物之400微升的代表性樣本與二硝基苯基肼一起衍生化，並且接著在27°C ，以1毫升/分鐘的速度，將100微升分裝的衍生溶液注射進入具有梯度的YMC AQ-303 ODS管柱中。梯度由二種移動相所組成：在水中的0.1%三氟乙酸（TFA)以及在乙腈中的0.08%三氟乙酸。梯度的流動由以下所組成：恆定的 60%之在乙腈中0.08%的三氟乙酸6分鐘，線性梯度至 85°/。之在乙腈中0.08%的三氟乙酸，超過12分鐘，線性梯度至100%之在乙腈中0.08%的三氟乙酸，超過4分鐘，保持於100%之在乙腈中0.08%的三氟乙酸2分鐘，並且以40%之在水中的0.1%三氟乙酸再平衡。在360 nm的波長測量紫外光的偵測。 46 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） I --------:訂 -------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235662 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（料）爲了測定NAC的濃度，分裝的血紅素產品用去除氣體的磷酸鈉（在水中），以1 : 1〇〇稀釋，並且將50微升注射進入具有梯度的YMC AQ-303 ODS管柱。梯度緩衝液由在水中的磷酸鈉溶液，以及在水中之80%乙腈和0.05% 三氟乙酸的混合液組成。梯度流動由以下所組成：1〇〇%的磷酸鈉（在水中）15分鐘，接著以線性梯度至100%的80 %乙腈及0.05%三氟乙酸之混合液5分鐘，並且再保持5 分鐘。此系統接著以100%的磷酸鈉再平衡20分鐘。磷脂質分析藉由根據包含在以下二篇文章中的方法而達成：Kolarovic等人，“用於從生物來源分離磷脂質脂萃取方法的比較”，/«〇/·价卷156 :頁244-250， 1986以及Duck-Chong，C. G·，“用於測定涉及以硝酸鎂消化的磷脂質磷之快速靈敏的方法”，1妒心，卷14:頁 492-497 ， 1979 ° 滲透壓藉由Advanced Cryomatic滲透儀而測定，型號 3C2，先進儀器公司，Needhan，麻薩諸塞州。全血紅素，變性血紅素以及氧合血紅素的濃度在Co-Oximeter上測定，型號482，購自儀器實驗室，萊星頓市，麻薩諸塞州。

Na+、K+、Cl'、Ca++、氧氣分壓的濃度藉由Novastat

Profile 4而測定，Nova生醫公司，Waltham，麻薩諸塞州〇氧热結合常數’ P5G藉由Hemox分析儀而測定’ TCS 公司，Southhampton，賓夕法尼亞州。 47 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） .!!φ-------.訂·1__ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 線% 1235662 A7 B7 五、發明說明（ΦΙ) 溫度以及pH藉由熟悉於此技藝者所知道的標準方法而測定。分子量（M.W.)藉由在分離的狀態下，將凝膠滲透色層分析（GPC)導引在血紅素之上而測定。血紅素產品之代表性的樣本對於分子量分布作分析。血紅素產品在50毫莫耳濃度之雙-三羥基甲基胺基甲烷（pH 6.5)、750毫莫耳濃度之MgCl2以及0.1毫莫耳濃度之乙二胺四乙酸（ EDTA)的移動相內，稀釋至4毫克/毫升。這個緩衝液用以從聚(Hb)中將Hb四聚物解離成雙聚體，此雙聚體已不會與其他Hb雙聚體透過分子內或分子間的交叉聯結而交叉聯結。將此稀釋的樣本注射進入TosoHaas G3000SW管柱。流速是0.5毫升/分鐘，並且在280 nm的波長記錄紫外光的偵測。對於以上在獸醫（OXYGLOBIN™)以及人類Hb血液替代物上所測試的結果，其根據本發明之方法所形成，分別摘述於表III以及表IV中。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---------.訂 i,-------線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 48 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235662 A7 B7 五、發明說明（从）

表III 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製參數結果 pH ( 18-22〇C ) 生理學上可接受的pH 內毒素 < 0.5內毒素單位/毫升無菌測試符合測試磷脂質a <3.3奈莫耳/毫升全血紅素 12.0-14.0^/100 變性血紅素 <15% 氧合血紅素 <10% 鈉 ’ Na+ 145-160毫莫耳濃度鉀，K+ 15-5.5毫莫耳濃度氯，cr 105-120毫莫耳濃度鈣，Ca— 0.5-1.5毫莫耳濃度硼 < 10 ppm (百萬分之一）滲透壓 290-310毫滲透壓戊二醛 <3.5微克/毫升 N-乙醯基-L-半胱氨酸 <0.2% 分子量> 500,000 <15% 未修飾的四聚體 <5% 微粒狀物質內容物>10微米 < 12/毫升微粒狀物質內容物> 25微米 <2/毫升 a :以聚合化作用前的Hb測量 49 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） •11 — — — — —^^OJ n n I n I ϋ . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # 線

A7 1235662 _B7 五、發明說明（)

表IV 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製參數結果 pH ( 18-22〇C ) 生理學上可接受的pH 內毒素 < 0.5內毒素單位/毫升無菌測試符合測試磷脂質a <3.3奈莫耳/毫升全血紅素 12.0-14.0 公克/100 毫升變性血紅素 <15% 氧合血紅素 <10% 鈉，Na+ 145-160毫莫耳濃度鉀，K+ 3·5-5·5毫莫耳濃度氯，cr 105-120毫莫耳濃度鈣，Ca* 0·5·1.5毫莫耳濃度硼 < 10 ppm (百萬分之一）滲透壓 290-310毫滲透壓戊二醛 <3.5微克/毫升 N-乙醯基心半胱氨酸 ^0.2% 分子量> 500,000 ^15% 分子量S 65,000 <10% 分子量<32,000 <5% 微粒狀物質內容物>1〇微米 < 12/毫升微粒狀物質內容物> 25微米 <2/毫升 a :以聚合化作用前的Hb測量 50 --------訂J-------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ♦

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235662 A7 _B7 五、發明說明（Μ ) 熟悉於此技藝者將了解，或可確定許多相等於此處所說明之本發明的特定具體實施例，而不需要更多例行的實驗。這些以及其它所有的相等物是包括在以下申請專利範圍之內。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---- ----一訂—.I-------線

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235662 A7 B7 五、發明說明（）升的氧氣可通透性）。本發明也描述保存的去氧血紅素血液替代物。該保存的血液替代物包括去氧的血紅素血液替代物，以及一種氧氣屏障薄膜初級包裝。該氧氣屏障薄膜初級包裝包括一種透明的積層材料，在大約25°C以及大約50%的外界相對溼度下，每24小時、每大氣壓、每10〇平方英吋，具有低於大約1·〇毫升的氧氣可通透性（或大約每100平方公分 0.155毫升的氧氣可通透性），將去氧的血紅素血液替代物密封在包裝內，藉此將去氧的血紅素血液替代物保存在實質上無氧氣的環境中。本發明的一種優點是，根據本發明之方法所生產以及儲存的血紅素，具有較高等級的純度以及較長的儲存期。具有高度氧氣屏障的初級包裝使得初級包裝在塗覆高度屏障的外包裝物（overwrap)之前、或在移除外包裝物之後，保護產品的穩定性。此外，透明的初級包裝提供生產狀況之視的檢驗。此外，本發明藉由排除在保存血紅素血液替代物上，對於額外屏障的需要（例如，外包裝物），導致減量的塑膠以及醫療廢棄物。血液替代物可在室溫下保持穩定長達二年或更久，這是優於先前方法的顯著改善。此外，使用本發明之純化的血紅素，一物種的血紅素可成功地在不同物種中使用作爲血液替代物，而不會使接受的物種受到顯著的副作用。發明詳述本發明之方法的特徵以及其他細節，現在將更特別地 6 -----------裝-------丨訂·、-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235662 A7 B7 五、發明說明（在申睛專利範圍中說明並指出。應了解的是，本發明所示的特定具體實施例僅是作爲舉例，而不是作爲本發明的限制。本發明的主要特徵，在不脫離本發明的範疇外，可在各種具體實施例中使用。在一具體實施例中，本發明是有關於一種保存去氧的血紅素血液替代物之穩定性的方法。這個方法包括在一種氧氣屏障薄膜初級包裝中，維持去氧的血紅素血液替代物。在〜具體實施例中，此氧氣屏障薄膜初級包裝包括一種透明的聚合物薄膜，其在大約25它以及大約5〇%的外界相對淫度下，每24小時、每大氣壓、每100平方英吋，具有低於大約1.0毫升的氧氣可通透性（或大約每1〇〇平方公分0·155毫升的氧氣可通透性）。較佳地，在^它下，每 24小時、每大氣壓、每100平方英吋，此初級包裝具有低於大約0.6毫升的氧氣可通透性（或大約每1〇〇平方公分 0·093毫升的氧氣可通透性）。在另一具體實施例中，此聚合物薄膜是一種積層品。在另一具體實施例中，本發明是有關於保存去氧的血紅素血液替代物，其包括去氧的血液替代物以及氧氣屏障薄膜初級包裝。在一具體實施例中，此氧氣屏障薄膜初級包裝包括一種透明的聚合物薄膜。此初級包裝在大約25°C 以及大約50%的外界相對溼度下，每24小時、每大氣壓、每100平方英吋，具有低於大約1.0毫升的氧氣可通透性（或大約每1〇〇平方公分0.155毫升的氧氣可通透性），將去氧的血紅素血液替代物密封在包裝內，藉此將去氧 iiTm尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） t 裝--------訂---------_ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235662； …--ίττ:—Β7__ 五、發明說明（）的血紅素血液替代物保存在實質上無氧氣的環境中。在另一具體實施例中，此聚合物薄膜是一積層品。氧氣屏障薄膜包括適合的氧氣屏障材料，使得此材料在25°C以及周圍溼度下，例如，50%的相對溼度，具有適合的氧氣屏障性質。在本發明的一具體實施例中，此氧氣屏障材料包括具有至少一層的透明聚合物薄膜。在一特別的具體實施例中，此薄膜包括一片外部的聚烴烯層（例如，聚乙烯或聚丙烯）、一氧氣屏障薄膜以及內部的聚烴烯層之積層品，其中內層與包裝的內容物接觸。本發明的聚烴烯可包括二種或多種單體的共聚物，其中單體可以是，例如，聚丙烯、聚乙烯或丁烯。在另一具體實施例中，在共聚物中也包括其它的單體，例如，乙烯醋酸乙烯酯。根據氧氣屏障層的形式，積層品可視需要地包括一支持層。然而並非意欲受到理論的限制，但使用自動化裝置時，此支持層可加速袋子的生產。在一較佳具體實施例中，此支持層是二軸定向的材料，例如，醯胺纖維（尼龍）。在一具體實施例中，使用在此技藝中所熟知的方法，可使透明材料預防光降解。在一具體實施例中，外部的聚烴烯層以及氧氣屏障層是一起擠壓成形的。在一較佳具體實施例中，外部的聚烴烯層是中度密度的聚乙烯，並且氧氣屏障層是乙烯乙烯醇 (ethylene vinyl alcohol) 〇在本發明的另一具體實施例中，氧氣屏障薄膜包括具有大約0.0022央吋（或大約56微米（# m))厚度之共同擠 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱）* 一1 —--- -------訂 ^--------· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235662

(O A7 _ B7 .in 1，ΓΤίΓ" ,.mi1 ......... ,. ,, . „ ,, L1LJ ,,„,.............. 五、發明說明（） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 壓成形的中度密度聚乙烯/乙烯乙烯醇層、具有大約 0.00048英吋（或大約12.2微米）厚度的尼龍層、以及具有大約〇·〇〇2〇英吋（或大約50.8微米）厚度的低密度聚乙烯層。然而並非要受到理論的限制，內部及外部的聚乙燦層是蒸氣屏障。兩者中任一層的蒸氣屏障性質可藉由增加此層的厚度而增加。在包裝的外面並不需要具有蒸氣屏障，然而，爲了無菌袋的自動化生產，具有外部的聚烴烯層是需要的，例如，中度密度聚乙烯層，因爲此層在滅菌期間 ’可保護氧氣屏障層的穩定性。例如，此層在拉薄膜通過過氧化氫浴的期間，可保護氧氣屏障層。其他適合的外層包括，例如，線性低密度的聚乙烯、低密度的聚乙烯、高密度的聚乙烯或聚丙烯。應了解的是，例如，如果不需要滅菌的程序，將不需要外部的聚烴烯層。此外，如果使用不同的滅菌技術，其中氧氣屏障薄膜不會受到影響、或氧氣屏障薄膜會抵抗滅菌方法，那就不需要外部的聚烴烯層〇在本發明的另一具體實施例中，氧氣屏障層包括基本上無法通透氧氣的聚合物，其包括一塗覆的支持材料。在一具體實施例中，支持材料可以是，例如，聚酯或聚醯胺 (例如，尼龍），並且塗餍可以是’例如，氧化砂（SiOx )或其他材料，例如，金屬氧化物，其可沈積在支持物上使它無法通透氧氣。可視需要地，可使用覆蓋物（overwraP)。覆蓋物是 9 本紙張尺度適用中國國家標準X 297公爱） 1235662 A7 B7 五、發明說明（）從適合的材料製造，例如，聚合物薄膜（例如，基本上無法通透氧氣的聚酯、聚丙烯、乙烯乙烯醇（EVOH)或尼龍）或積層品，例如，箔積層品（例如，銀或鋁箔積層品 )或其他的氧氣屏障積層品。當覆蓋物是薄膜，例如聚酯薄膜時，可藉由各種適合的方法使此薄膜基本上無法通透氧氣。在一具體實施例中，如所製造的薄膜是基本上無法通透氧氣的。另外，當此聚合材料的氧氣不通透性不足以符合所需的規格時，可將此薄膜積層或用其它的方法處理，以減少或消除氧氣的通透。在一較佳具體實施例中，可使用箔積層品，其中箔是鋁、銀、金或其他金屬。箔層較佳地是具有介於大約0.0001以及0·001英吋（或大約2·54 以及25·4微米）之間的厚度，更佳地是大約〇·〇〇〇3英吋 (或大約7.62微米）。此積層品典型地包含一層或多層的聚合物層。此聚合物可以是各種聚合的材料，包括，例如，聚酯層（例如，48號（48 gauge)的聚酯，或大約12·2 微米）、尼龍、乙烯乙烯醇、聚偏二氯乙烯等。如果存在的話，初級包裝以及覆蓋物可以是各種的構造，包括小玻璃瓶、圓筒容器、箱子等。在一較佳具體實施例中，初級包裝是袋子的形式。適合的袋子可藉由例如，ί寸綸地在其周圍黏合一片或多片（例如，二片）而形成緊幣封閉、無法通透氧氣、具有可塡充中心的構造。可以用任何適合的材料達到黏合。當使用線性低度、低度、中度或局度密度的聚乙嫌作爲材料的內層時，這一片可藉由在適虽條件下加熱而密封。在此技藝中所熟知的是，聚本紙張尺㈣用中賴家標準 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

I235662 ； π、” A7 ...................: _B7 五、發明說明（）乙嫌可在適當的條件下用熱對它自己密封。在此技藝中戶斤熟知的是，參數可有所不同，以獲得薄膜的聚烴烯表面之恰當的黏合，這些參數包括，溫度、壓力以及“存在時間 ”，其中存在時間是這片被放在壓力以及溫度下之持續的時間。典型地，線性低密度的聚乙烯需要較少的熱，並且逐漸增加之高密度的聚乙烯，是逐漸地需要更多的熱。例如，將在二片之內側表面上具有1.5密爾（〇·〇〇15英吋或 38·1微米）之線性低密度聚乙烯的積層材料，在5〇膀/平方英吋下（psi，或34.47牛頓/平方公分），暴露於3〇〇τ (149°C ) 1秒鐘，導致適合於本發明之方法的密封。此外 ’較高密度的聚烴烯，在黏合過程的期間典型地容忍較高的壓力。一般而言，如果壓力超過，加熱的材料可能從接觸的區域被強行移開，產生較弱的密封。在聚酯/箱積層材料的例子中，可使用例如聚酯的黏著劑。在一較佳具體實施例中，血液替代物在實質上缺乏氧的空氣下包裝。適合之空氣的例子包括氮氣、氬氣以及氦氣。如同在此處所定義的，血液替代物是用於人類、哺乳動物以及其他脊椎動物之以血紅素爲基礎之攜帶氧氣的組成物’其至少有能力運輸以及轉移氧氣至重要的器官以及組織，並且可維持足夠的血管內的腫脹壓力。脊椎動物是如同傳統定義的，包括，人類或任何其他在循環系統中使用血液以轉移氧氣至組織的脊椎動物。此外，循環系統的疋義是如同傳統定義的，由心臟、動脈、靜脈以及微循環 11 II-------^ I ^ ·------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)Xnm (210 X 297 ^17 A7 1235662 — — _^B? 五、發明說明（） 30,000道耳吞的蛋白質，以及來自Hb超過濾液中的水分。適合的超濾膜包括30,000道耳吞的超濾膜（Millipore目錄編號 CDUF 050 T1 及/或 Armicon 編號 540 430)。可接著將濃縮的Hb溶液導引進入一個或多個平行的色層分析管柱，以藉由高效能液相色層分析法（HPLC)，進一步從其它污染物中，例如，抗體、內毒素、磷脂質及酵素以及病毒中，將血紅素分離。適合的介質之實例包括，陰離子交換介質、陽離子交換介質、厭水性交互作用介質以及親合性介質。在一較佳具體實施例中，色層分析管柱包含適合將Hb從非血紅素蛋白質中分離的陰離子交換介質。適合的陰離子交換介質包括，例如，二氧化矽 (silica)、氧化鋁、二氧化鈦膠體、交叉聯結的葡聚糖、瓊脂或衍生化的分子部份（moiety)，例如，聚丙烯醯胺、聚經基乙基-甲基丙烯酸或苯乙烯二乙烯基苯，其以陽離子化學官能基而衍生，例如，二乙基胺基乙基或四級胺基乙基基團。與其它蛋白質及污染物比較，用於Hb (其可能是在溶解的紅血球相中）之選擇性吸收及吸附之適合的陰離子交換介質以及對應的洗提液（eluant)，可容易地藉由熟於此技藝者而決定。在一更佳具體實施例中，使用一種從二氧化矽膠體中形成陰離子交換介質的方法，其係以熱水處理以增加孔洞大小，接觸r-縮水甘油氧基丙基矽烷以形成活性的環氧化物基團，並且接著接觸C3H7(CH3)NC1以形成四級銨陰離子交換介質。這個方法說明於Jowma/ 〇/ ， 19 本紙張尺度適1中國國家、標準各（210 ~ -------------------訂·-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235662 A7 B7_ 五、發明說明（）濾膜而再循環’對過濾的去氧緩衝'液（其含有在注射用水中之27毫莫耳濃度的乳酸鈉、12毫莫耳濃度的NAC、115 毫莫耳濃度的NaCl、4毫莫耳濃度的KC1以及1.36毫莫耳濃度的CaCl2 (pH 7.8))而透析過瀘。當在分離的狀態下進行時，藉由凝膠滲透色層分析（GPC)而持續透析過濾，直到血液替代物包含少於或等於大約！〇%之修飾的或未修飾的四聚物爲止。在具有限制的通透線之低穿透膜的壓力下使用純化濾膜。在移除大部分之修飾的四聚體Hb以及未修飾的四聚體Hb之後，將血液替代物持續通過30,000道耳吞的超濾膜而再循環，直到血液替代物的濃度大約爲130公克/公升爲止。接著將穩定的血液替代物儲存於適合的容器中，其具有低氧環境以及低氧氣滲漏。實施例2 血紅素血液替代物的儲存··初級包裝血紅素血液替代物，如同在實施例1中所製備，是包裝在氧氣屏障的初級包裝中（E-13135以及E13242， Amedacn National Can)。初級包裝的構造在以上詳細地討論。初級包裝是具有大約0.005英吋厚度（或大約127 微米）的積層材料，包括中度密度聚乙烯/乙烯乙烯醇層、尼龍層以及線性低密度聚乙烯密封層。積層品的氧氣通透性是0.0084毫升/100平方英吋/大氣壓-日（25t，ι〇〇% /5〇%相對溼度）或1.3ΧΚΓ3毫升/平方公分/大氣壓_日（25 44 本紙張尺度適用中國1ίϋϊΤΒϋϋ見格（210 X 297公釐） —---- ------------#裝—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂？--------

Claims

1235662 ，年日修正丨I ....... ]D8 I ............㈣W1 — I …_·_ΙΙ Ι·Η···秦撕斯―抑·—和 __________________ ( ^ 六、申請專利範圍 1· 一種用於保存去氧的血紅素血液替代物之方法，其包括將去氧的血紅素血液替代物維持在氧氣屏障薄膜初級包裝中’該初級包裝包括透明聚合物材料，其具有至少一層包括乙烯乙烯醇（ethylene vinyl alcohol)之氧氣屏障層 ’該初級包裝在大約25°C以及大約50%的外界相對溼度下，每1〇〇平方公分、每24小時、每大氣壓，具有低於約 0.155 cc的氧氣可通透性。 2_根據申請專利範圍第1項之方法，其中該聚合物材料另包括一外層，其包括聚烴烯。 3·根據申請專利範圍第2項之方法，其中該外層包括中度密度的聚乙烯。 4·根據申請專利範圍第3項之方法，其中該外層以及該氧氣屏障層是共擠壓的。 5 ·根據申g靑專利朝圍弟1項之方法，其中該氧氣屏障層另包括氧化矽覆蓋的聚酯層。 6·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該聚合物材料另包括一內層，其包括聚烴烯。 7 ·根據申請專利範圍第6項之方法，其中該內層包括線性低密度聚乙烯。 8·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該血紅素血液替代物是在氮氣、氬氣或氦氣下維持。 9· 一種保存的去氧血紅素血液替代物，其包括： (a) —去氧的血紅素血液替代物；以及 (b) —氧氣屏障薄膜初級包裝，其包括透明聚合物材本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Μ規格(210 X 297公釐) 1235662 A8 B8 C8 1)8 『丨―—--- _ 「一六、申請專利範圍料’其具有至少一層包括乙烯乙烯醇之氧氣屏障靥，該初級包裝在大約25°C以及大約5〇%的外界相對溼度下^每 1〇〇 +方公分、每24小時、每大氣壓，具有低於約〇 155 CC的氧氣可通透性，去氧的血紅素血液替代物密封在其內 ’藉此將去氧的血紅素血液替代物保存在實質上無氧氣的環境中。 10·根據申請專利範圍第9項之保存的去氧血液替代物’其中該聚合物材料另包括一外層，其包括聚烴烯。 π·根據申請專利範圍第10項之保存的去氧血液替代物，其中該外層包括中密度的聚乙烯。 I2·根據申請專利範圍第U項之保存的去氧血液替代物’其中該中密度層以及該氧氣屏障層是共擠壓的。 13·根據申請專利範圍第9項之保存的去氧血液替代物’其中該氧氣屏障層另包括氧化矽覆蓋的聚酯層。 14.根據申請專利範圍第9項之保存的去氧血液替代物，其中該聚合物材料另包括一內層，其包括聚烴烯。 15·根據申請專利範圍第14項之保存的去氧血液替代物，其中該內層包括線性低密度聚乙烯。 16.根據申請專利範圍第9項之保存的去氧血液替代物’其中該血紅素血液替代物是在氮氣、氬氣或氦氣下維持0 本紙張尺度適用中國國各?票準（CNS)A4規格(210 X 297公梦)