TWI235659B - Methods and compositions that affect melanogenesis - Google Patents

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TWI235659B
TWI235659B TW091107018A TW91107018A TWI235659B TW I235659 B TWI235659 B TW I235659B TW 091107018 A TW091107018 A TW 091107018A TW 91107018 A TW91107018 A TW 91107018A TW I235659 B TWI235659 B TW I235659B
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Seth J Orlow
Andrea Hall
Prasheila Manga
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Enw York University
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Description

l235659 五、發明說明（！） 領域： 本發明係關於醫學及細胞生物學領域。具體而言，本 發明係關於發掘新藥領域及皮膚學領域，更特定地係關於 皮膚色素生物學領域。 發明背景：
已知動、植物體内的黑色素除了可保護動、植物不受 紫外線輻射照射的傷害外，還可提供動物皮膚、眼睛、頭 髮及毛皮一種裝飾性的顏色（參見Riley, P.A. 1 997，/«r· J.
Ce// 5io/_ 1 1:123 5-3 9)。黑色素可分成兩大類·· 棕/黑色之真黑色素（eumelanin)，及黃/紅色之親黑色素 (pheomelanin)。黑色素細胞為特化的表皮細胞，可產生黑 色素，並由體内一複雜的細胞間訊遞系統來決定每一黑色 素細胞究應產生真黑色素亦或親黑色素（參見 Brilliant， M.H. and Barsh，G.S·，1998，in The Pigmentary System: Physiology and Pathophysiology· 217-229. Oxford University, New York (Nordlund； J.J. et a 1., eds.)) ° 黑色素係於黑色素細胞内一稱為黑素粒（melanosomes) 的特化胞器中製造（參見 Orlow S.J·， 1 998， in The
Pigmentary System: Physiology and Pathophysiology, 97-106. Oxford University, New York (Nordlund, J.J. et aL, eds.))。黑素粒是由兩類液泡所融合而成。一類液泡稱前 黑素粒（premelanosomes)，其顯然是衍生自平滑粒線體或 稱反式高基氏體網。另一類液泡則衍生自反式高基氏體 -4- 1235659 五、發明說明（2) 網。每一類液泡都提供了執行黑素粒功能所必須之蛋白 質。 若黑色素的製造路徑上出現缺陷，會導致諸如白化症 這類色素不足的現象。從色素異常株老鼠的基因分析中， 已鑑別出60種以上與正常製造黑色素相關的基因（參見 Silvers，W.K.，1979，The Coat Colors of Mice: A Model for Mammalian Gene Action and Interaction. Springer-Verlag, Basel)。其中一個係可轉錄出酷氨酸酶的基因。路氨酸酶 蛋白質是一種多功能酵素，可催化黑色素製造路徑上許多 反應步驟；酪氨酸酶的活性包括將酪氨酸轉化成二經基苯 丙氨酸（dihydroxyphenylalanine，DOPA)之速率限制步驟， 將DOPA轉化成多巴醌之速率限制步驟（參見Lerner，A.b_ and Fitzpatrick， T.B.， 1 950， Physiol. Rev. 30:91-126)，以 及將5，6 -二羥基蚓哚轉化成5，6 -吲哚醌之速率限制步驟(Korner and Pawelek，1 982，Science 21 7:1 163-1 165)。不論 老鼠或人類，只要缺乏酪氨酸酶活性，就會產生嚴重的白 化症。 兩種與酷氨酸酶相關的蛋白質（分別是由老鼠棕色 (brown)基因所編碼轉錄而成的TRP-1蛋白質，以及由老 鼠slaty基因所編碼轉錄而成的TRP-2蛋白質亦與黑色素 之生成習習相關（參見Hearing，V.J·，1993，dm. J. Gaw. 52:1-7。每一種TRP蛋白質與酪氨酸酶及其彼此間 之序列相同度約達40%左右。這三種酵素（即trp-1、TRp_ 2、與酪氨酸酶）之每一種，都被預測含有一個跨臈區域 -5- 1235659 五、發明說明（Ο (transmembrane domain)。他們一起形成一個連接在黑素粒 膜上的高分子量複合體（high molecular weight complex)(〇rlow S.J.? et aL9 1994, J. Invest. Dermatol. 103:196-201)。 另一種與製造黑色素習習相關的蛋白質就是P蛋白。 在老鼠身上’其是粉紅眼稀釋（P)基因（pink-eye dilution (P) gene)的產物。在人類身上，其則是p基因的產物。相較於 野生種老鼠而言，不含p基因之老鼠的黑色素生成量明顯 偏低（Silvers，一野生型人類p基因，而非突變種 之人類Ρ基因，可與低色素型、不含ρ基因之老鼠的黑色 素細胞互補（Sviderskaya，E.V.，ei α/·，1997，J. Jnvesi· Dermah/. l〇8:3〇-34)。很顯然，製造真黑色素，而非親黑 色素，需要P蛋白參與（Lamoreux，M.L.，以α/·，1 995， Pigment. Cell Res. 8:263-270) ο 赂氨酸酶所致之眼及皮膚的白化症（Tyrosinase positive oculocutaneous albinism，Ty-pos OCA)或稱第 2 型眼及皮 膚白化症（OCA2)，乃是全球最常見的白化症。其係肇因於 粉紅眼稀釋（P)基因之突變（King，Ρ·Α· βί α/·，1 995, Scriver， CR, et al., (eds) The Metabolic Basis of Inherited Disease, McGraw-Hill, New York, pp 4353-4392; Ramsay, M. et al.9 1992, Am. J. Hum. Genet. 5 1:879-884; Rinchik, EM. et al.9 1993, 361:72-76)。受影響個體的皮膚、頭髮及眼睛 會出現色素不足的現象（Manga Ρ·以a/·，1 999，t/· Dermaii)/· 26:738-747)，因此較易產生因紫外線輻射照射所致之腫瘤 -6- 1235659 五、發明說明（4) (kromberg, JG et al., 1 989, Clin. Genet· 36:43-52)。 一般預測該 P基因之產物（P)具有 12個跨膜區域 (Gardner, JM et al., 1992, Science 2 5 7:1 121-1 1 24; Rinchik, EM a/·, 1993，iVaiwre 361:72-76)，且位於生成黑色素之 黑色素細胞中（Rosemblat，S. ei α/·，1994，Proc. iVw/. dead Sc/· (USA) 91:12071 -12075)。雖然p基因顯然只和真黑色 素的合成有關（Russell，ES. 1949，Geweizcs 34:146-166)， 但其真正的功能仍有待進一步研究。 許多學者亦曾建議P蛋白的功能只是作為一種酪氨酸 傳送子（tyrosin transporter)而已，藉由將酪氨酸泵至黑素 粒中，使其能被酪氨酸酶轉化成黑色素（參見Rinchik，EM Η α/·，1993，361:72-76)。首先，P 蛋白與許多原核 細胞中的傳送蛋白相似；其次，缺乏p基因之老鼠黑色素 細胞所產生的黑色素量雖明顯低於野生型老鼠，但細胞培 育時’在培養基中添加高濃度的酪氨酸，卻可使黑色素的 生成 S 明顯增加（Sviderskaya， EV·， a/.， Rosemblat，S· w α/·, 1998，Ce// 及以 239:344-352)。 但是，與此建議相反的是，已知缺乏P基因之老鼠黑色素 細胞之黑素粒再吸收酪氨酸的速率，幾乎與野生型老鼠黑 色素細胞之黑素粒再吸收酪氨酸之速率相同（0&111, WA. Η β/·，1 995, Res. 8:229-233)。這點讓該文作者 建議道’ P蛋白可能對傳送其他與黑色素生成相關之小分 子進入黑素粒而吕是不可或缺的（summarized in Brilliant， Μ·Η· and Barsh，G.S·，1 998，⑽ra)。 -7- 1235659 五、發明說明（Ο 其他學者也懷疑P蛋白在黑素粒中係扮演一種結構蛋 白的角色（Lamoreux，M.L·，w a/., swpra)。已知在缺乏p蛋 白的細胞中，黑素粒的完整性會受損。具體而言，從缺乏 p基因之老鼠的皮膚及眼睛之黑色素細胞中所萃出的酪氨 酸酶活性’明顯低於野生型老鼠（Lam〇reux，μ.L·，μ α/.，Chiu，Ε·，α/·，1 993,五e 及以· 57:301-05)。再 者’缺乏ρ基因之老鼠細胞萃出物中的酪氨酸酶、TRp-1 及TRP-2蛋白質之量，亦低於獲自野生型老鼠細胞萃出物 之篁（Rosemblat5 S. ei a/·，。此外，相較於野生型老 鼠’在缺乏ρ基因之老鼠細胞萃出物中，有較高比例的酪 氨酸酶、TRP-1及TRP-2蛋白質係以單體形式存在，而非 以高分子量複合體形式存在（Lamoreux，M.L.，w a/., Chiu，E·，以 α/·，1 993, .办 e 及以.57:301-05),而且在缺 乏P基因之老鼠的眼睛組織中，酪氨酸酶、TRP-1及TRP-2蛋白質會被快速降解（Chiu，Ε.，Μ α/·，。最後，也 有一些學者觀察到’缺乏ρ基因之老鼠組織及培育之黑色 素細胞中，其黑素粒並不正常（Russell，E.S.， 1949, 34:146-66; Rosemblat，S· ei α/·，1998，swpra)。來 自有P-基因突變之老鼠眼睛的黑色素細胞中只有極少量的 黑素粒（Orlow，S.J. and Brillant Μ.Η” 1999，£χ/7·五少己 iies. 68:147-5 4)。在有突變的黑色素細胞培育物中，其黑素粒 之量高於正常值，但其體積較野生型老鼠黑色素細胞之黑 素粒來得小 R〇selnblat，S. α/·5 1 998，swpra)。 因此，雖然已知P蛋白對皮膚、頭髮及眼睛製造正常 -8- 1235659 五、發明說明（6) 置的黑色素而言非常重嚴 . 夏要’但此路徑中p蛋白的真正功能 尚有待進一步闡明。擧从 f亦曾從抑制的角度來尋找其他可 能的分子標的物。例如，牙 承所周知的酪氨酸酶酵素活性， 其易於進行生化分析的輯/|4 ^ w w W性、及其在黑色素生成過程中不 可或缺的角色，均使i ώ^ 八或為抑制研究中熱門的研究對象（參 見 Tasaka, L. et al λ πη〇 ，5 1 998, Meth. Find. Exp. Clin.
Pharmacol· 20:99-109* T/ , 5 ida5 K. et al., 1 995, Planta Med. 61:425-28; Reish? 0 et al λ 0Q T ^ 5 al·，1 995，Am. J. Hum. Genet. 57:127-32; Shirota, S. et aL, 1994, Biol. Pharm. Bull 17:266-69; Kameyama, K.? ^ aLy i989^ Differentiation 42:28-3 6) ^學者也曾將焦點放在細胞間訊遞系統對黑色素 生成過程的影響（參見 Furuniura，M· ei α/.，1998，jProc. Natl. Acad, Sci. (USA) 95:7374-78; Sakai3 C., et al.^ 1997, EMBO J, 1 6:3544-52; McLeod, S.D. et al., 1 995, J.
Endocrinol. 146:439-47)。 已知哺乳動物及果蠅的色素異常，在某些情況下，係 與涉及細胞内蛋白質運送過程之蛋白質缺陷有關（Spritz 1999，1 5:3 3 7-3 40)。例如，與赫曼斯基-布雷 氏症候群（Hermansky-Pudlak Syndrome，HPS)相關的色素不 足現象，似乎與AP 3蛋白質所調控的蛋白質運送過程有關 (Dell，Angelica Μ α/.，1999, Mo/· Ce// 3:1卜21)。 對各種年齡層的許多人來說，黑色素生成量異常或過 量會造成一些化妝上的難題。舉例來說，許多小孩在釀過 太陽後會產生雀斑；而對中年人而言，曬傷後產生雀斑、 -9- 1235659 五、發明說明（〇 及色素沉著的次數會隨著年齡增長而變得更頻繁。此外， 這些色素沉著問題並不會很快消失，且似乎會隨著年紀增 長而變得更嚴重。 已有許多產品被研發出來以減輕或降低皮膚色素沉著 問題。其中一類產品係包含羥基醌，一種知名、可降低皮 膚色素沉著的活性物質（參見美國專利第6，1 39,854號）。但 是’如果長期使用羥基醌亦會產生嚴重的副作用。例如， 在皮膚上施用羥基醌可降低皮膚色素沉著，但亦會增加皮 膚曝曬於紫外線下時，其對光的敏感度。因此，在某些國 豕，以經基酿來降低皮膚色素沉著問題只能於有限度的情 況下使用，至於其他國家則是完全禁用。 有許多不同的物質被提出用以控制或抑制皮膚色素沉 著問題。但幾乎所有這些物質的作用不是藉由漂白已有的 色素就是藉由抑制新色素合成（透過抑制黑色素製造過程中 的速率限制酵素-酪氨酸酶酵素活性來達成）來達成。舉例 來說，美國專利第6，123,959號描述了一種水性組合物， 其係包含脂肪粒，至少一種黑色素合成酵素的競爭性抑制 劑’及至少一種黑色素合成酵素的非競爭性抑制劑。美國 專利第6,123,959號描述了以某一特定間-苯二盼衍生物來 作為皮膚美白劑。WO 99/64025A1描述了一種皮膚美白組 合物’其係包含萃自加拿大原生之雙子葉植物中的一種路 氨酸酶抑制劑。美國專利第5,58〇,549號描述了一種皮膚 美白外用藥，其係包含2-羥基苯甲酸衍生物及其之鹽類， 用以抑制酪氨酸酶。。WO 99/0901 1A1描述了一種可抑制 -10- 1235659 五、發明說明（〇 至少一種峻諾綱 5,21 4,028 號及 解物作為酪氨酸 皮膚紅腫和/或皮膚色素的藥劑，其係包含 (carbostyril)衍生物及其鹽類。美國專利第 第5，389,611號描述了一種以乳鐵蛋白水 酶抑制劑的藥劑。 ’仍然需要研發一 其係能更迅速有效 可美白皮膚之新的 ’這類美白產品的 。因此，亟需研發 儘管有上述這些及其他皮膚美白劑 種毒性較低、且更安全的皮膚漂白劑， 地抑制黑色素的生成。同時亦需要一種 改良方法，依照目前化妝品業界的估計 全球市場需求，每年約超過1 〇億美元 種可限制或抑制皮膚色素生成的新藥劑。 發明摘述 本發明提供一種新的篩選方法，其係可鑑別出能抑制 或增加黑色素細胞中黑色素生成之化合物。這些分析方法 的研發，部分係基於發現某些化合物抑制黑色素生成係透 過將路氣酸酶（控制黑色素生成的主要酵素）移轉至錯誤位 置的方式來達成。 p蛋白是降低或增加皮膚、頭髮及眼睛色素之一種主要 標的物或化合物。因此，本發明的第一態樣是，首次提供 一種可_選能抑制或提高P蛋白功能之化合物的方法，已 知若細胞欲能正常地移轉酪氨酸酶及其他黑素粒蛋白質的 話’就必須具備P蛋白；同時，若黑色素類細胞（例如黑 色素細胞及黑色瘤細胞）之黑色素生成過程及完整的酪氨酸 酶活性，同樣也需要p蛋白。 -11- 1235659 五、發明說明（9) 野生型黑色素細胞之酪氨酸酶活性主要位於黑素粒 上；同時，這些細胞也會分泌一些酪氨酸酶。但在p蛋白 不足的:累色素細胞中，其酪氨酸酶活性卻出現在錯誤的位 置上。化些P蛋白不足的黑色素細胞所分泌的路氨酸酶量 遠高於野生型黑色素細胞；同時，在其非_黑素粒的液泡中 亦可測到路氨酸酶活性。無論是野生型黑色素細胞或p蛋 白不足的黑色素類細胞，從這些黑色素細胞所分泌出來的 氨酉夂酶於生長基質或培育基質中均具有酵素活性，並 能將酪氨酸轉變成黑色素。 本發明態樣之-是提供一種可筛選能抑制黑色素細胞 中黑色素生成過程之化合物的方法，該方法包含將這些細 胞培育在内含一種欲進行測試之化合物的生長基質中以 鑑別出該化合物是否能引發這些黑色素細胞改變其中之路 氨酸酶的位置。路氨酸酶在這些細胞中位置的改變，表示 該化合物能抑制黑色素生成過程。 本發明進一步之態樣是提供一種可篩選能提高黑色素 細胞中黑色素生成過程之化合物的方法，該方法包含將這 些細胞培育在内含一種欲進行測試之化合物的生長基質 中，以鑑別出該化合物是否能降低這些細胞所分泌之酿氣 T酶的量，此係相對於仍留存於這些細胞中的酪氨酸酶的 量而言，其中這些相對降低的路氨酸酶量顯示該化合物可 能是可增加黑色素生成過程之潛在化合物。 本發明另-態樣，其一部分是基於非'黑色素細胞亦能 製造具活性的酪氨酸酶這樣的發現而來，其係藉由將外源 -12- 1235659 五、發明說明（ίο) 性可編碼酿氨酸酶的基因轉殖入這些非-黑色素細胞中而達 成。如果同時亦將外源性可編碼P蛋白之基因轉殖入這些 非-黑色素細胞中的話’將可大幅提高其之酪氨酸酶活性。 因此，這些細胞中酪氨酸酶活性是否可達最大值，係視P 蛋白的功能而定。當可同時表現外源性酪氨酸酶及外源性 p蛋白的細胞，以能抑制p蛋白功能的化合物（例如，丙咪 嗪）處理時，其酪氨酸酶活性將降低至當細胞只表現外源性 酪氨酸酶時之活性值。丙咪嗪及其他可抑制P蛋白功能的 藥物，並不會影響只表現外源性酪氨酸酶而不表現P蛋白 之細胞中的酪氨酸酶活性 因此，本發明更係關於提供一種篩選能影響（即，抑制 或增加）一般而言並不表現酪氨酸酶和/或p蛋白之細胞内 p蛋白功能的化合物，該方法包含調控這些細胞使其能同 時表現酪氨酸酶及p蛋白，並以所欲測試之化合物來處理 這些細胞。測量這些細胞中的路氨酸酶活性。可影響（即， 抑制或增加）這些細胞中路氨酸酶活性、但卻不影響單獨只 表現路氣酸酶之細胞中路氨酸酶活性的化合物，即係視p 蛋白功能而定來影響酪氨酸酶活性的化合物。 本發明更係關於提供一種方法，其係關於建立已知可 影響或模擬P蛋白功能之化合物的模型之方法。筛選或設 計該模型化合物之類似物，並篩選其能影響或模擬P蛋白 功能的能力。藉由使用這些已知能影響或模擬p蛋白功能 之類似物，可透過本發明方法找到能影響或模擬p蛋白功 能之更新且更好的化合物。 -13- 1235659 五、發明說明（11 ) 本發明更係關於提供一種把會影響或模擬p 1 ^ 贫白功能 之化合物用於醫學組合物或化妝品組合物中的方、、1 j々音，以治 療一涉及黑色素製造（過量或不足）之疾病、狀況、 、蘇異 常 本發明之發明人亦同時定出具有能改良内囊體/溶酶體 傳送過程後期之能力的藥劑，藉由改變與黑色素合 口
J 或缺之酪氨酸酶及其他蛋白質的傳送過程，來達到修飾色 素沉著的目的。此發現已提供並用於本發明的其他雖樣 中’包括方法及藥學組合物，其係包含能改良内囊體/溶酶 體傳送過程後期的藥劑。這些方法及藥學組合物對降低和 或抑制黑色素製造非常有用，因此能降低、減輕或預防皮 膚色素沉著。 因此，本發明更係關於提供一種可降低、減輕或預防 黑色素細胞製造黑色素的方法，其係包含讓黑色素細胞接 觸一藥學有效量之化合物，該化合物係能影響黑色素細胞 内囊體/溶酶體傳送過程後期之一種變化，其中該内囊體 Λ各酶體傳送過程後期之變化會導致黑色素細胞降低黑色素 k。在某一特定實施例中，該内囊體/溶酶體傳送過程 後期之變化係藉由讓黑色素細胞接觸一可拮抗内囊體/溶酶 襄、、，、 = 适過程後期之化合物來達成。在另一特定實施例中， Λ内囊體/溶酶體傳送過程後期之變化係該内囊體/溶酶體 膽固醇傳送過程後期之變化。 在某些特定實施例中，該内囊體/溶酶體傳送過程 之變# Μ 0 ^ ’、藉由讓黑色素細胞接觸一選自下列族群之化合物 -14- 1235659 五¥蓄日4<明包（髮〉黃體®1、一脂溶性胺、神經鞘氨醇 (sphingosine)、及以下式（I)之化合物 R2
(I)
其中X是0或S ;在一較佳實施例中，X是〇。 Ri 是-C^OKCrCd烷基或-(CHJn-CMCi-C^)烷基、或-(CH2)n-NR7R8，其中η是0_3，其中每一 R7及R8係分別選 自Η及（Ci-CJ烷基。較佳是，每一 R7及R8係分別選自-¢:(0)((^-03)烷基、或-(CHzh-NiCi-Cs 烷基）2。更佳是，每 一 R7 及 R8 係分別選自-C(〇)CH3、-CH2-0-CH3、或-(CH2)2-N(CH3)2。 R2是Η或（CVC6)烷基；在某些實施例中，R2是（Cl-C3) 烷基；在一較佳實施例中，R2是-CH3。 R3是Η或（CVC6)烷基；在某些實施例中，r3是（Ci-CO 烧基；在一較佳實施例中，R3是-CH3。 R4 是-CCOKCi-Cd烷基。較佳是，R4 基。更佳是，R4 是- C(0)CH3 或- C(0)CH2CH3。 R5是Η或（CVC6)烷基；較佳是，1^5是Η或CH3 ;在另 一實施例中，R4及Rs —起形成=〇。 R6 是 Η 或烷基或- (CH2)n_NR9Rl〇，其中每一 r9 -15- 1235659 五、發明說明（I3) 及R1()係分別選自Η及（Ci-Cd烷基。較佳是，R6是Η或-CH3、或-CH2CH3或-CH2NH2。在另一實施例中，R5及R6 與其個別相接的碳原子一起形成一 C5-C8的碳環’且較佳 是一 C6的碳環，其可被1至3個選自鹵素、OH、-(CpC6) 烷基、烷氧基、氨基、=0、-(CpCd烷基氨基、 二-((Ci-CJ烷基）氨基）、三氟曱基、或-〇CF3之取代基所 取代，該取代基可取代於碳環上的任一可進行取代的位置 上。 在某些實施例中，該化合物是黃體酮。在其他實施例 中，該化合物則是脂溶性胺。在一些特定實施例中，該脂 溶性胺係選自啡噻啉及一種三環的抗憂鬱藥。在其他實施 例中，該化合物是啡噻啉。在本發明之某些特定實施例 中，該今卜屢琳係擇自三氟拉嗓（trifluoperazine)、氯丙嗓 (chlorpromazine)、丙氣拉嗓（prochlorperazine)、三氟丙嗓 (triflupromazine)、丙 養(promazine)、硫 達嗓 (thioridazine) 中達嗓（mesoridaine)、旅乙醯嗓 (piperacetazine)、輕略氣丙♦ (perphenazine)、氟旅氯丙唤 (fluphenazine)、乙醯旅氣丙 4 (acet〇phenazine)、及硫代乙 基拉嗪（thiethylperazine)。在其他實施例中，該化合物是 一種三環的抗憂鬱藥。在本發明之某些特定實施例中，該 二環的抗憂鬱藥係選自丙口米♦、去甲替林（nortriptyline)、 丙去甲替林（protriptyline)、三丙口米痛：（trimipramine)、及 多慮平（doxepin)。在其他特定實施例中，該化合物是神經 ,鞘氨醇。在其他實施例中，該三環的抗憂鬱藥不是丙咪 -16- 1235659 五、發明說明（ι〇 嗓。 在其他實施例中，該化合物是一種可拮抗後内囊體/溶 酶體傳送蛋白質之頡抗劑。在某些特定實施例中，該化合 物具式I結構
其中X及RpiU基團的定義如上述。再一較佳實施例 中，該化合物係選自下列物質所組成的族群中：
-17- 1235659 五、發明說明（l5
,νη2 (ΠΙ)
H3C，、 h3c、 、0
、ch3 (IV)
-18- 1235659
及
及其藥學上可接受的鹽類或溶合物。 在另一態樣中，本發明係關於提供一種可降低皮膚色 -19- 1235659 五、發明說明（l7) 素的方法。在此方法中，讓亟需此治療之患者皮膚與一藥 學有效量之可影響内囊體/溶酶體傳送過程後期變化的化合 物接觸，其中之變化可導致皮膚色素降低。在一特定實施 例中，該内囊體/溶酶體傳送過程後期之變化係藉由讓皮膚 細胞接觸一種可拮抗後内囊體/溶酶體傳送蛋白質之頡抗 劑。在另一特定實施例中，該内囊體/溶酶體傳送過程後期 之變化係指該内囊體/溶酶體膽固醇傳送過程後期之變化。 在某些特定實施例中，該内囊體/溶酶體傳送過程後期 之變化係藉由讓皮膚接觸一藥學有效量之下列化合物來達 成，包含g體酮、一種脂溶性胺、神經鞘氨醇 (sphingosine)、及任一擇自如上定義之式（1)至式（Vlli)t 合物’或其之藥學上可接受的鹽類或溶合物。 在某些特疋實施例中，該化合物是黃體酮。在其他實 施例中，該化合物是一種脂溶性胺。在一特定實施例中， 該腊溶性胺係選自由啡噻啉及一種三環的抗憂鬱藥所組成 的族群中。在其他實施例中，該化合物是啡遂淋。在特定 實施例中’ 5亥徘屬琳係擇自三氟拉嗓（trifluoperazine)、 氯丙嗪（chlorpromazine)、丙氯拉嗪（prochl〇rperazine)、三 氟丙嗪（triflupromazine)、丙嗪（promazine)、硫達嗓 (thioridazine)、中達嗪（mesoridaine)、哌乙醯♦ (piperacetazine)、經旅氣丙者（perphenazine)、氟旅氯丙嗓 (fluphenazine)、乙醯旅氯丙療（acetophenazine)、及硫代乙 基拉♦ (thiethylperazine)。在其他實施例中，該化合物是 一種三環的抗憂鬱藥。在某些特定實施例中，該三環的抗 -20- 1235659
五、發明說明（18) 憂鬱藥係選自丙咪嗪、去甲替林（nortriptyline)、丙去曱替 林（protriptyline)、三丙咪療（trimipramine)、及多慮平 (doxepin)。在其他實施例中，該三環的抗憂鬱藥不是丙味 嗪。在其他特定實施例中，該化合物是神經鞘氨醇。在某 些特定實施例中，該化合物是一種可拮抗後内囊體/溶酶體 傳送蛋白質之頡抗劑。在某些特定實施例中，該化合物是 任一具如上定義之式（I)至式（VIII)化合物，或其之藥學上 可接受的鹽類或溶合物。 本發明另一態樣係提供一種可降低皮膚色素的藥學組 合物。該組合物包含一藥學有效量之可影響皮膚細胞中内 囊體/溶酶體傳送過程後期之變化的化合物，且更包含—藥 學上可接受的載體。在某些特定實施例中，該細胞中内囊 體/溶酶體傳送過程後期之變化係藉由讓黑色素細胞與—種 可抬抗後内囊體/溶酶體傳送蛋白質之頡抗劑接觸來達成。 在某一特定實施例中，該内囊體/溶酶體傳送過程後期之變 化係指該内囊體/溶酶體膽固醇傳送過程後期之變化。該藥 學組合物較佳係能被改良成適合局部表面施用。 在某些特定實施例中，可影響内囊體/溶酶體傳送過輕 後期變化的化合物係擇自 種脂溶性胺、神經鞘 氨醇（sphingosine)、及任一具如上定義之式⑴至式（νιπ) 化合物’或其之藥學上可接受的鹽類或溶合物。 在某些特定實施例中’該化合物是黃體酮。在其他實 施例中，該化合物是一種脂溶性胺。在特定實施例中， 該脂溶性胺係選自由4遂琳及一種三環的抗憂鬱藥所組成 -21- 1235659 五、發明說明（！9) 的族群中。在某些實施例中，該化合物是啡噻啉。在特定 實施例中’该P非邊淋係擇自三氟拉嗓（triflu〇perazine)、氣 丙療（chlorpromazine)、丙氣拉療（pr〇chi〇rperazine)、三氟 丙嗪（triflupromazine)、丙嗪（promazine)、硫達嗪 (thioridazine)、中達嗓（mes〇ridaine)、旅乙醯♦ (piperacetazine)、羥哌氯丙嗪（perphenazine)、氟哌氯丙嗪 (fluphenazine)、乙醯旅氯丙唤（aeet〇phenazine)、及硫代乙 基拉嗪（thiethylperazine)。在其他實施例中，該化合物是 一種二環的抗憂鬱藥。在某些特定實施例中，該三環的抗 憂鬱藥係選自丙味♦、去曱替林（n〇rtriptyljne)、丙去甲替 林（protriptyline)、三丙咪嗪（trimipramine)、及多慮平 (doxepin)。在其他實施例中，該三環的抗憂鬱藥不是丙咪 嗪。在其他特定實施例中，該化合物是神經鞘氨醇。在某 些特定實施例中，該化合物是一種可拮抗後内囊體/溶酶體 傳送蛋白質之頡抗劑。在某些特定實施例中，該化合物是 任一具如上定義之式（I)至式（VIII)化合物，或其之藥學上 可接受的鹽類或溶合物。 本發明另一態樣係提供一種可活化黑色素生成過程的 方去。該方法包含讓具有較低p蛋白活性甚或不具p蛋白 活性之黑色素細胞’與一藥學有效量之可抑制Ατρ酶之化 合物接觸，並藉由抑制黑色素細胞中的ATP酶活性達到活 化黑色素生成過程的目的。在一特定實施例中，具較低p 蛋白活性甚或不具P蛋白活性之黑色素細胞，係與一藥學 有效量之下列化合物接觸，包含貝非黴素（bafi〇lmycin)、 -22- 1235659 五、發明說明（2〇) 豆球黴素（cone an amyc in)、及其之衍生物。在一較佳實施 例中，具較低P蛋白活性甚或不具P蛋白活性之黑色素細 胞，係與一藥學有效量之貝非黴素（bafiolmycin)或其之衍 生物接觸。在另一實施例中，具較低P蛋白活性甚或不具 P蛋白活性之黑色素細胞，係與一藥學有效量之豆球黴素 (concanamycin)或其之衍生物接觸。 本發明另一態樣係提供一種可治療路氨酸酶所致之眼 及皮膚的白化症的方法。該方法包含讓患者皮膚與一藥學 有效量之可抑制ATP酶之化合物接觸，並藉由抑制黑色素 細胞中的ATP酶活性達到活化因酪氨酸酶所致之眼及皮膚 之白化症患者體内黑色素生成過程的目的。在一特定實施 例中’患者的皮膚係與一藥學有效量之下列化合物接觸， 包含貝非黴素（bafiolmycin)、豆球黴素（concanamycin)、及 其之何生物。在一較佳實施例中，患者的皮膚係與一藥學 有效量之貝非黴素（bafi〇lmyCin)或其之衍生物接觸。在另 一實施例中，患者的皮膚係與一藥學有效量之豆球黴素 (e〇ncanamycin)或其之衍生物接觸。 本發明另一態樣更係關於提供一種包含一容器之套 組，該容器内包含一如上述之本發明藥學組合物。該套組 更包含一封裝内頁，該封裝内頁上印有如何以該藥學組合 物來_控（亦即’漂白或加深皮膚色素）皮膚色素的指示性 文字，以適合該特定藥學組合物之目的。 / 說明 -23- 1235659 五、發明說明（21) 第1圖顯示培育之黑色素細胞生長基質中的路象酸酶 活性。將來自黑色小鼠之黑素-a黑色素細胞及來自缺乏P 基因碼之老鼠的黑素-p黑色素細胞，分別培育在内含低 (0.03mM)或高濃度（0.3mM)路氨酸酶之DMEM基質中〆段 指示時間。在特定時間間隔點測定來自黑色素細胞生長基 質中之酪氨酸酶活性，在測量酪氨酸酶活性前，先將生長 基質透析，並以每小時所產生之3H_H2〇的cpm值來表 示。▲黑素-a，高濃度酪氨酸酶；•黑素-a，低濃度酪氨酸 酶，△黑素-pi，高濃度酪氨酸酶；〇黑素_pl，低濃度酪氨 酸酶。提高缺乏P基因之黑素_p黑色素細胞生長基質中的 絡氨酸酶濃度’發現其生長基質中酪氨酸酶活性亦隨著增 加，顯不提高生長基質中的酪氨酸酶濃度會提高這些細胞 分泌酪氨酸酶的能力。相反的，代表野生型黑色素細胞之 黑素-a細胞，其所分泌進生長基質的酪氨酸酶量則明顯較 -P細胞，可部分減輕 低。在高濃度酿氨酸酶下生長的黑素 缺乏P基因之表現型。 第2A及2B圖分別為黑素-a細胞萃出物及其生長基質
處理之黑色素細胞；第4攔，以6 苯[b，f]氮萆丙胺（丙咪嗪） 以6-硝基-2-(1-哌嗪基卜喹啉 -24- 1235659 五、發明說明（22) 羥丁二酸酯（硝化唼拉嗪）處理之黑色素細胞。在第2A圖 (左方）黑素-a細胞萃出物之酿氨酸經基酶活性係以 cpm[3H]H2〇/60pg蛋白質/小時來表示。在第2B圖（右 方），黑素-a細胞生長基質之酿氨酸經基酶活性係以已將 細胞萃出蛋白質量常規化後之cPm[3H]H2〇/小時來表示。 與芊托品（第2A圖，第2攔）及硝化奎拉嗪（第2A圖，第4 攔）一同培育之黑素-a細胞萃出物之酪氨酸羥基酶活性， 較為處理細胞之量來得高。以丙咪嗪處理（第2A圖，第3 攔）之黑色素細胞萃出物中的酪氨酸經基酶活性則降低了。 藥物對細胞萃出物中酵素活性的影響，並未反映在分泌於 生長基質中之酵素活性上。雖然苄托品（第2A圖’第2欄） 對活性幾乎沒有影響，但丙0米4 (第2 A圖，第3欄）及石肖 化喳拉嗪（第2 A圖，第4欄）則會明顯提高生長基質中的 酵素活性。 第3圖顯示經轉移感染之COS細胞中，其相對的酪氨 酸酶活性。以二劑量之轉移物轉移感染COS細胞，分別為 兩劑载體（V + V)，一劑载體加上一劑帶有酪氨酸酶基因的 载體（V + T)，一劑載體加上一劑帶有P蛋白基因的載體 (V + P)，或兩劑分別帶有酪氨酸酶基因及P蛋白基因的載 體（T + P)。分析每一萃出蛋白中的酪氨酸羥基酶活性。所 示之相對活性係將測試樣品活性除以V + T樣品活性後的計 鼻結果。引入一帶有赂氨酸酶基因（v+τ)的表現載體可使 c〇s細胞出現酪氨酸羥基酶活性。此活性係直接肇因於該 帶有酪氨酸酶基因的載體之故，因轉移載體（V + V)並不會 -25- 1235659 五、發明說明（23) 使細胞具有酪氨酸羥基酶活性。在帶有酪氨酸酶基因載體 之細胞中，其酪氨酸羥基酶活性可藉由同步轉移p蛋白基 因（T + P)而被提供約4倍。此增加之活性是肇因於酪氨酸 酶及P蛋白間的作用之故，因為在只引入P蛋白（V + P)而 未引入酿氨酸酶的細胞中，其酿氨酸經基酶的活性並不會 增加。 第4圖顯示轉移感染之c〇S細胞的酷氨酸酶活性。如 第3圖，以帶有酪氨酸酶基因的載體轉移感染c〇S細胞， 或是以分別帶有酪氨酸酶基因及P蛋白基因的載體轉移感 染COS細胞’之後再如第2圖般’以爷托品、丙咪嗓、硝 化啥拉嗪處理，或是不處理。並如第丨圖一樣分析細胞萃 出物及其生長基質中的路氨酸酶活性。第1攔，未處理之 轉移感染細胞；第2攔，以芊托品處理之轉移感染細胞； 第3攔，以ι〇，ιι_二氫-n，n-二甲基-5H-二苯[b，f]環氮己三 烯-5-丙胺（丙咪嗪）處理之轉移感染細胞；第4攔，以卜硝 基-2-(1-哌嗪基喳啉羥丁二酸酯（硝化喳拉嗪）處理之轉移 感染細胞。酪氨酸羥基酶活性係以cpm[3H]H2〇/6〇|^g蛋白 質/小時來表示。相較於只轉移感染酪氨酸酶基因的細胞 (V + T)而言，同時轉移感染p蛋白 細胞（τ+ρ), P蛋白基因及酪氨酸酶基因的
效果並不因糸 (第4攔）中f 蛋白的功效5 胞中的酪氨i -26- 1235659
五、發明說明（24) 第5A圖及第5B圖顯示黑素-pi細胞所分泌的酪氨酸酶 量會增加，但卻可被半胱氨醯蛋白酶所抑制。（A)將黑素· P1細胞分別培育在低漢度（0.03 mM)及高濃度（〇3 mM)酪 氨酸下，再以增加濃度之蛋白酶抑制劑ε64(^μ)處理Μ 小時。生長基中的路氨酸酶活性可以萃出物及生長基質中 之總活性百分比來表示。（Β)黑色素濃度係藉由將細胞溶解 後測量其於470 nm下的吸光值來決定。 第6A圖及第6B圖為培育之黑色素細胞結構的電顯 圖。在黑素-a黑色素細胞（A)及黑素_pl黑色素細胞（B)的 細胞核周圍（peri-nuclear)可看到高基氏體結構（G)。在黑 素-a細胞中的黑素粒係處於第I、π、Ιπ階段，且最主要 是位於第IV階段（箭頭所示之處）。在黑素-pi細胞中的黑 素粒係處於第I及π階段，偶而會在第ΠΙ階段初期（箭頭 所示之處），但從未出現第IV階段。標呎=1〇微米。 第7Α圖及第7Β圖為經dopa組織化學處理過之培育 的黑色素細胞結構電顯圖。在黑素-a黑色素細胞（Α)及黑 素-Pi黑色素細胞（Β)的細胞核周圍（peri_nuciear)可看到高 土氏體結構（G)，其上之潑泡（cisternae)及50 nm之TGN 液/包具有與D0Pa反應後之產物。對黑素細胞而言，該 5 0 nm之液泡侷限於Τ(}Ν ;但在黑素邛工細胞，則是成輻 射狀遠離TGN(箭頭所示之處），並可看到其係與細胞膜緊 密相接’偶而會看到位於第ΠΙ階段的黑素粒。標呎=i .〇 微米。 第8A圖及第8B圖顯示在黑素-A細胞及黑素-P細胞中 -27- 1235659 五、發明說明（25) 酸性磷酸酶的位置。自黑素-A細胞（方形）及黑素-P (圓形）之細胞膜部分測得的酸性磷酸酶活性詳述於實 5中。第8A圖=小顆粒部分，第8B圖=大顆粒部分。 第9A圖及第9B圖顯示在黑素-A細胞及黑素-P細 β-半乳糖苷酶的位置。自黑素-A細胞（方形）及黑素-P (圓形）之細胞膜部分測得的β -半乳糖苷酶活性詳述於 例5中。第9Α圖=小顆粒部分，第9Β圖=大顆粒部分 第10Α圖及第10Β圖顯示在黑素-Α細胞及黑素-Ρ 中β -己醣胺酶的位置。自黑素-Α細胞（方形）及黑素-Ρ (圓形）之細胞膜部分測得的β -己醣胺酶活性詳述於實 5中。第10Α圖=小顆粒部分，第10Β圖=大顆粒部分 第11Α圖及第11Β圖顯示在黑素-Α細胞及黑素-Ρ 中β-己醣胺酶的位置。自黑素-a細胞（方形）及黑素-ρ (圓形）之細胞膜部分測得的β -己醣胺酶活性詳述於實 5中。第11Α圖=小顆粒部分，第11Β圖=大顆粒部分 第12Α圖及第12Β圖顯示在黑素-Α細胞及黑素-Ρ 中β -葡萄糖苷酸酶的位置。自黑素-a細胞（方形）及黑 細胞（圓形）之細胞膜部分測得的β -葡萄糖苷酸酶活性 於實施例5中。第1 2Α圖=小顆粒部分，第1 2Β圖=大 部分。 第1 3圖為以黃體酮處理黑素-a細胞後，其黑色素 學活性（0D)。細胞分別處理如下：無藥物處理，即 組；300 μΜ之1-苯基-2-硫代尿素（PTU) ; 10Q μΜ之 曱基黃嘌呤素（IBMX)，其係為一種磷酸二酯酶抑制劑 細胞 施例 胞中 細胞 實施 〇 細胞 細胞 施例 細胞 細胞 施例 0 細胞 素-P 詳述 顆粒 的光 控制 異丁 :或 -28- 1235659 五、發明說明（26) 20 μΜ之黃體g^|。 第1 4圖為以丙咪嗪處理黑素-a細胞後，其黑色素的光 學活性（OD)。控制組細胞係未經任何藥物處理；測試組細 胞則經300 μΜ之PTU、10Q μΜ之ΙΒΜχ或20 μΜ之丙 咪嗪（IMP)處理。 第15圖為以3β-(2-二乙氨乙氧基）_雄烯酮氣化氫鹽（以 下簡稱「U1 8666A」）處理黑素-a細胞後，其黑色素的光學 活性（OD)。控制組細胞係未經任何藥物處理；測試組細胞 則經 300 μΜ 之 PTU、i〇Q μΜ 之 ΙΒΜΧ、2·5χ1(Γ4 μΜ 之 U1 8666A、2·5χ1〇_3 μΜ 之 U1 8666A、0·025μΜ 之 U18666A、0.25μΜ 之 U1 8666A 或 2·5 μΜ 之 U1 8666A 處 理。 第16圖為以U1 8666A之衍生物處理黑素-a細胞後，其 黑色素的光學活性（OD)。控制組細胞係未經任何藥物處 理；測試組細胞則經300 μΜ之PTU(Sigma，St. Louis， MO)、l〇Q μΜ 之 IBMX(Sigxna，St. Louis，MO)、2.5 μΜ 之 U18666A 、 及5 μΜ之U18666A類似物處理，該類似物 如下：5μΜ 之 CP-59875501、5μΜ 之 CP-602367(式 IV 化 合物）、5μΜ 之 UK-204039、5 μΜ 之 UK-204042(Pfizer， Inc.，Groton，CT)處理。 第17圖為以U1 8666A合併IBMX處理黑素-a細胞後， 其黑色素的光學活性（OD)。控制組細胞係未經任何藥物處 理；測試組細胞則經300 μΜ之PTU、1Q μΜ之ΙΒΜΧ、 2·5 μΜ 之 U1 8666A 或 2·5 μΜ 之 U1 8666Α 加上 1 () μΜ
-29- 1235659 五、發明說明（27) 之IBMX處理。 第1 8A圖為以U1 8666A處理黑素-a細胞後，其細胞萃 出物中的酪氨酸酶活性。控制組細胞係未經任何藥物處 理；測試組細胞則經300 μΜ之PTU、1Q μΜ之IBMX、 或 2.5 μΜ 之 U1866 6A 處理。 第1 8Β圖為相較於未經任何藥物處理之控制組細胞而 言，以 U1 8666A處理之黑素-a細胞中，以西方墨點顯示 之酪氨酸酶量。 第19圖顯示經PTU及U1 8666A處理之黑素-a細胞， 經蔗糖梯度分餾後，由小顆粒部分所測量到的酪氨酸酶活 性。 第20圖顯示經PTU及U1 8666A處理之黑素-a細胞， 經蔗糖梯度分餾後，由大顆粒部分所測量到的酪氨酸酶活 性。 第21圖顯示各種濃度（0 μΜ、1.0 μΜ、2.0 μΜ、及2.5 μΜ)之貝非黴素Α1處理，對黑素-a、黑素-ρ、Β16 '及黑 素-ρ(Ρ 10)細胞的影響。黑素-a細胞為野生型黑色素細胞； 黑素-P為P蛋白活性極小甚或缺乏的黑色素細胞；B 1 6細 胞為缺乏酪氨酸酶及 P蛋白之黑色素瘤細胞；及黑素-p(P 1 0)細胞為轉移感染了粉紅眼稀釋基因且P蛋白活性極 小甚或缺乏的黑色素細胞。 第22圖為各種濃度（0 μΜ、0_5 μΜ、及1.0 μΜ)之豆球 黴素 Α處理對黑素-a、黑素-ρ、Β16、及黑素-ρ(Ρ10)細胞 之黑色素含量的影響。 -30- 1235659 五、 發明說明（28 詳細說明 本文中引述的專利或文獻僅係為了重建熟習此技藝人 早已熟知的知識…’所有引述的專利、申請案或文 默’其全文以參考文獻方式併入本文中。 基本上，本發明之-部分係基於以下發現：亦即可 弓丨發黑色素細胞將酪氨酸酶送到細胞内錯誤位置的化合物 (即’增加分泌之酪氨酸酶量或增加在非_黑素粒液泡中的 路氨酸酶量），也可抑制黑色素的生成過程。在本發明中， 「可產生黑色素的細胞或黑色素生成 取、、、田胞（melanogenic eells)」一詞定義為含有黑素粒的細胞（亦 萤 n w a, ^ …、巴常細胞 及黑色素瘤細胞）。可產生黑色素的細胞包括，例如，可表 現外源性黑素粒蛋白質之黑色素細胞。在較佳實施例中， 可將老鼠黑色素生成細胞中可編碼產生ρ蛋白的基因、可 編碼產生酪氨酸酶的基因、TRP-1基因、和或TRpj美 加以突變或删除，並使細胞產生該經突變或刪除美= 白質產物。 土 4資 本發明也係基於以下發現··即，ρ蛋白 u 疋最主要控制細 胞如何將酪氨酸酶轉移至細胞膜黑素粒 工的蛋白質。本發 明的另一態樣是基於以下發現：即，經 ^ ϋ a P制P蛋白功能 之化D物處理後的黑色素細胞，其細胞内所聚積的黑色素 量會大幅減少’且會將較高量的酪氨酸酶分泌到Z長芙 中。本發明的另一態樣則是基於以下發現： " - β — 1 尸蛋白可 大幅提高培育細胞中酪氨酸酶蛋白質的活性。 本發明的另 -31- 1235659 五、發明說明（29) 〜 一態樣是基於以下發現：即，當黑色素細胞與可抑制内 體/溶酶體傳送過程後期之抑制劑接觸並因而影響酿& *囊 的傳送時，會抑制黑色素生成過程及黑色素的合成。 此，本發明提供了一種新穎的方法，其係可篩檢能抑制2 色素生成過程之化合物。以本發明方法鑑別出來的化2 物’可有效地用來治療與黑色素不足或黑色素過量相關的 疾病與化妝問題。 本發明也揭示了具正常p蛋白功能之野生型黑色素生 成細胞具有可分泌一些酪氨酸酶這樣的事實，且可視p蛋 白之有無來提兩路氨酸酶分泌量的化合物，同時亦會抑制 黑色素生成過程這樣的事實。因此，本發明提供了 一種新 賴的方法，其係可藉由提高p蛋白質的功能來增加黑色素 的生成。為此應用之故，可增加p蛋白功能的化合物及可 降低P蛋白功能的化合物，在此通稱為「可影響p蛋白功 能的化合物」。本發明之另一態樣係關於一種藉由模擬p 蛋白功能來增加黑色素生成的方法。為此應用之故，可模 蛋白功能的化合物及不是p蛋白的化合物，當被施用 至黑色素細胞上或與黑色素細胞一同培育時，均可至少部 刀回復或修正酪氨酸酶之移送錯誤，並將其轉移至可生成 黑色素的細胞膜上。不含P蛋白的黑色素生成細胞可能是 不表p -ρ. ^ r蛋白的細胞（例如，黑素-Ρ細胞）或無法表現具正 常Ρ蛋白功能的黑色素生成細胞。 p Α | α抑制黑色素細胞中内嚢體/溶酶體傳送過程後期可 &低4或抑制黑色素的生成，且後續減少的黑色素量可降低 -32- 1235659 五、發明說明（3〇)
皮膚色素0因此，可拍7岳丨丨W A主A 帝“、、色素、··田胞中内囊體/溶酶體傳送 過程後期的化合物，1右可收把斗4 /、有了降低或抑制黑色素生成過程及 降低黑色素細胞及皮膚組織色素的功能。 本發明也係關於抑制黑色素細胞中Ατρ酶以活化黑色 素生成過程這樣的新發現。因此，可抑制—酶的化合物 具有可活化黑色素生成過程’及增加黑色素細胞與皮膚組 織色素的功能。此發現被開發轉變成因酪氨酸酶所致之眼 及皮膚白化症之治療上，以增加患者體内的黑色素量。 可用於本發明方法及組合物中之化合物，不限於：諸 如丙咪嗓這類可影像Ρ蛋白功能的化合物；諸如黃體嗣這 類可影響内囊體/溶酶體傳送過程後期的化合物；月旨溶性 胺；神經勒氨醇；與刪66Α同類之化合物或衍生自 m8666A之化合物；及諸如貝非徽素（bafi〇imycin)及豆球 黴素（concanamycin)這類可抑制ATP酶的化人物。 —~或誘發黑色素生成之化合方去 1 ·1以黑色素生成細胞來篩選可抑制田今十τ ， ~生成之 劑的方法 為使黑色素細胞能大量生成黑色素，其必須能將路氨 酸酶大量移送至黑素粒族上…，本發明的某一態樣即 係關於一種篩選化合物的方法，該化合物係能使黑色素生 成細胞將酪氨酸酶移送到錯誤的位置去。 奴使細胞能正確 地移送酪氨酸酶，p蛋白的功能是不可或缺的。 因此，本發明的另一態樣係關於一稀餘、肢士丄 裡師選方法，其係 -33- 1235659 五、發明說明（31) 能篩檢出可抑制p蛋白功能之化合物，以使黑色素生成細 胞將路氧酸酶移送到錯誤的位置去。這類方法部分係基於 已知P蛋白功能被移除之培育的黑色素生成細胞，較野生 型細胞，會分泌更多的酪氨酸酶至生長基中。
諸如丙味嗓這類可降低或影響p蛋白功能的化合物即 具有欲求的效果。因此，以測試化合物處理過之細胞，其 細胞中酪氨酸酶被移送到錯誤位置的現象，顯示該測試化 口物可抑制黑色素生成過程。因酪氨酸酶被移送到細胞中 錯誤位置所致之分泌，開始時可藉由偵測生長基質中或細 胞中的酪氨酸酶量或是蛋白質量而得知。能造成酪氨酸酶 分泌量上升或降低細胞内酪氨酸酶量的化合物，即為可藉 由抑制P蛋白功能而抑制黑色素生成過程的潛力化合物。 透過深入研究這類潛力化合物，了解其對黑色素生成過程 的影響，和/或其於有無P蛋白下對黑色素生成過程的影 [這些研究將詳述於下。如果這些潛力化合物的效果視 P蛋白之有無而定，則此化合物即為可抑制p蛋白功能的 化合物。
由於在含高量酪氨酸酶之生長其睹 焚暴質中培育缺乏P蛋白 之黑色素細胞，可回復部份的P 1 a 蛋白功能，因此較佳（但 非必要）是在含低量酿氨酸酶（即，η Π Ί υ·〇1 - 0.05 mM)的生長 基質中進行篩檢黑色素生成過程扣卩制如 狂抑制劑的工作；更佳係於
含0.01 4-0· 03 mM酪氨酸酶的生I 王長基質中進行篩檢黑色素 生成過程抑制劑的工作。 1.2 分析 酶活彳yv ,^ —^ t法來篩選可抑¢1¾ -34· 1235659 五、發明說明（η) 色素生成之抑制劑—的方注 活體外培育之野生型黑色素細胞就像活體内細胞一樣 可合成黑色素。在這些培育的細射，其路氨酸酶主要係 位於黑★粒膜上，但亦有冑分路氨酸酶係被分泌至細胞 外。在黑素粒膜上的酪氨酸酶係藉由其c端跨膜區被固定 在細胞μ，且其活性位置係朝向黑素粒内腔。相反的， 在那些因為Ρ蛋白突變或是因為有會抑制ρ蛋白功能之化 合物存在而導致黑色素生成過程被抑制的細胞中，其酷氨 酸酶會被傳送到錯誤的位置上，且其赂氨酸酶被分泌至生 長基中的比例明顯遠高於正常細胞。此外，被分泌的酷氨 酸酶胜肽亦較野生型黑色素細胞之赂氨酸酶胜肽來得短， 因為其欠㈣可將蛋白f固定於細胞膜上的C端跨膜區。 但是’該被分泌出的赂氨酸酶在生長基中仍具活性，因此 仍可將細胞外的酪氨酸轉變成黑色素。因此，來自 生成過程被抑制之黑色素細胞之含路氨酸的生長基’:、舞 會轉變成黑色。生長基質中的絡氨酸濃度愈高，顏色就會 愈冰、愈黑’且變黑的速率會更快。因未受抑制之黑色素 氰酉文酶篁較少，因此培育其之該 酸的生長基並不會變黑。 職風 此項發現可用於兮I a， …X 了師檢出能抑制或調控黑色 過程之化合物的新賴方法中。黑色素細胞係被培育在^ 酪孰酸的生長基中。以測試化合物處理該黑色素細胞二 果該測試化合物可造成路氨酸酶的誤 胞中被釋出，則該生長其由从〆 自才示的細 暴中的酪氣酸會被轉變成黑色素， 1235659 ---^ 五、發明說明（33 ) 而使生長基顏色變黑。將此顏色與同樣培育 丨月况下但未以 測試化合物處理之黑色素細胞（控制組）的生 焚基顏色相比 較，如果以測試化合物處理過之細胞的生县 K暴顏色變得比 控制組來得深，就表示該化合物可能是能抑 w…、色素生成 過程之潛在化合物。 為獲得半定性資料，一般在分析酪氨酸酶活性前，典 型地需先將生長基質過遽、離心和/或透析。這此前處理叮 去除後續可能會與受質競爭且内含酪氨酸酶的細胞或物質 (例如，黑素粒或膜的碎片），和/或去除可能會和已加標之 酿氨酸酶競爭之過量、且自由存在的酪氨酸酶。可使用任 何一種能測量酪氨酸酶的方法進行測量，例如使用任一路 氨酸酶酵素活性，包括但不限於將酪氨酸轉變成二經基苯 丙胺酸（DOPA)，將DOPA轉變成多巴醌，並將5,6-二經基 蚓哚氧化成5，6-吲哚醌。舉例來説，當分析酪氨酸酶之路 氨酸酶經基酶活性時，可使用除酿氨酸酶以外之非-絡氨酸 或經改變之酪氨酸受質或酪氨酸酶。在某一態樣中，將黑 色素細胞培養在含有測試化合物之生長基中。將生長基質 預處理後’在生長基質中添加/养-赂氨酸或經改變之絡氨 酸受質。該受質可以是一酪氨酸的天然或人造之同質物、 類似物、或衍生物。生長基質中的酪氨酸酶活性可將受質 轉變成其產物。 之後用另一分析方法來偵測是否有產物和/或受質存 在。一種非限制性的方法是比色法。在使用比色法之篩檢 方法中’所挑選的受質係在被酪氨酸酶作用後會改變顏色 -36- 1235659 五、發明說明（3〇 的物質。亦即，受質之吸收光波長係與經酿氨酸酶催化後 所生產物的吸收光波長不同。受質之吸收光波長和/或產物 的吸收光波長可以在可見光、紅外光或紫外光範圍内。可 挑選受質的濃度、培育時間及反應條件，以使顏色的變化 速度和/或強度可與生長基細胞中的酪氨酸酶活性成正比。 可透過直接觀察或借助諸如光譜儀之類的儀器偵測，並比 較以各種濃度之產物所製備而成的標準物之顏色來測知該 顏色的變化。 將欲 法之可抑制黑色素生成過程化合物的諸多篩檢法中， 進行抑制黑色素生成過程測試的化合物之一，添加至黑色 素細胞的生長基中。在生長基質經過濾、離心和/或透析 後，將L-DOPA加到生長基質中。在一較佳實施例中，生 長基質中L-D〇pA的最終濃度約為5x10-3m，pH約為 7·4 ’溫度則約為25°C。生長基質在475 nm下的吸收度辦 加顯示味I装栖9 食暴質中的酪氨酸酶催化形成多巴發色團， 測試：合物可抑制黑色素生成過程。 欲/者因多巴發色團係吸收可見光下的光波，故多P 發色團的在^ ^ ，亦即黑色素生成過程的抑制，可於不使 先谱儀的愔況τ 4 1從用 不’透過直接檢查反應來決定。
刀析方法是放射線分析法（radiometric assa^O 在使用此方法的复枷餘仏、+ ^ ”）。 示後，並添加到““ 將又霄以放射線同位素標 該路氨酸酶d 果生長基中含有路氨酸酶， 、又質裂解成加標的產物及未加標的產物。 -37- !235659 五、發明說明（35) /則量該加標受質中已被轉變成加標產物的量。可挑選受 濃度、培育時間、及其他反應條件，使所產生之加標產 的量正比於進行分析之生長基中的酪氨酸酶的量。經測 化合物處理過之細胞生長基中所含加標產物的量，明顯 才目同狀況下、未經測試化合物處理過之細胞生長基中所 的加標產物量來得高許多。此結果顯示，該測試化合物 可抑制黑色素生成過程。 此種分析法的範例之一為放射性酪氨酸羧基酶分析 在此分析中，測量從[3H]酪氨酸中所釋出之[3H]H2〇 里’作為絡氨酸酶酵素活性中酷氨酸經基酶活性之指標 在藉此法篩選出可抑制黑色素生成過程之化合物的方 中’先收獲黑色素生成細胞之生長基質並將其中的細胞 除。此外，進行分析前還可先將生長基質透析。分析時 在生長基質中加入1_5μ(Μ之[3H]酪氨酸並於適當溫度下 育一段時間。以Dowex樹脂溶液將未反應的酪氨酸 生長基質中移除，在生長基質中混入足量的閃爍計數物 並於β計數器中進行讀值。相較於生長在類似狀況下的 胞而言，經測試化合物處理過之細胞的生長基質中，所 [3Η]Η2〇的量明顯較高，顯示該測試化合物為一潛在可 制黑色素生成過程之化合物。 此類酶分析的另一例子是放射性黑色素合成分析。 此分析中，測量被併入[14C]黑色素中的[MC]酪氨酸 [c]dopa里。在藉此法篩選出可抑制黑色素生成過程 化合物的方法中，讓黑色素生成細胞生長或培育於内含 質 物 試 較 含 係 的 〇 法 去 9 培 細 含 抑 在 或 之 測 -38 - 1235659 五、發明說明（36) 試化合物之生長基質中。收獲該生長基質，並加入l]Ci 之[14C]酪氨酸並於適當溫度下培育 4小時。以冰冷的 10%(w/v)TCA溶液來終止反應，將混合物混合後冷凍24 小時。將混合物融解，於4°C下以l〇〇〇g的速度離心。將 沉澱物重新懸浮於冰冷的5%(w/v)TCA溶液中。重複此步 驟2次。將内含[14 C ]黑色素之最終沉澱物溶於S ο 1 u e n e ® -3 50(Packard Instrument Company, Meriden, CT) 4 小時， 混入足量的閃爍計數物後並計數。或者，亦可將沉澱物收 集於濾紙上後計數。相較於生長在類似狀況下的細胞而 言’經測試化合物處理過之細胞的生長基質中，所含[μ c ] 黑色素的量明顯較高，顯示該測試化合物為一潛在可抑制 黑色素生成過程之化合物。 另一種分析方法是螢光法。在此法中，生長基質和/或 產物係可發出螢光。生長基質之吸收光波長和/或發射光波 長係與產物之吸收光波長和/或發射光波長不同。在藉此法 筛選出可抑制黑色素生成過程之化合物的方法中，讓黑色 素生成細胞生長或培育於有或無測試化合物之生長基質 中。經過一段時間後，移除生長基質，並添加酪氨酸，以 一螢光計來測量生長基或培育基中的螢光強度。可選擇生 長基質的濃度、培育時間、溫度或其他反應條件，使螢光 的變化係能正比於所分析生長基質中酪氨酸酶活性。相較 於生長在類似狀況下的細胞而言，經測試化合物處理過之 細胞的生長基質中之螢光強度明顯較高，顯示該測試化合 物為一潛在可抑制黑色素生成過程之化合物。 -39- 1235659
五、發明說明（37) 另種分析方法涉及反應產物之沉澱。在藉此法篩選 ^可抑制黑色素生成過程之化合物的方法中，讓酪氨酸酶 又質與在可促進酪氨酸酶活性條件下所收獲之生長基或培 月基起培月。該嗳質為酪氨酸酶作用產生一可沉澱的產 物。讓該反應產物沉殿。可藉由增加或降低生長基質之溫 度酸驗值、離子強度、或鹽類濃度使該反應產物沉殿； 或適田地改變生長基質，或離心(如果該反應產物係不可溶 的話）來使該反應產物沉殿。可選擇受f濃度、培育時間、 =育溫度、及其他反應條件，使該反應產物的量正比於所 分析之生長基質中的酪氨酸酶量。相較於類似狀況下但未 經測試化合物處理的細胞生長基質而t，經測試化合物處 ^過之細⑽生長|質中所沉澱出I的反應產㉟量明顯較 门顯不該測.式化合物為一潛在可抑制黑色素生成過程之 化合物。 的分析方 U 以可分 抑制黑色素吐忐♦w ^ 、 ~抑制劑的方法 前述篩選方法可藉由八" 日田刀析酪氰酸酶活性（即，蛋白質之 酵素活性）來鑑別出可抑制 μ制黑色素生成之抑制劑。本發明更 提供一藉由分析細胞外十z h 卜或細胞内酪氨酸酶量來篩選可抑制 黑色素生成之抑制劑的 J万法。如刖述，酪氨酸酶主要係位 於黑色素生成細胞的墅主 “、、素粒膜上。能使酪氨酸酶傳送至錯 誤位置的化合物即可蚯心 j抑制黑色素的生成。在下列_選方法 中，使用了能定出酪 氣酸酶含董和/或位置的分析方法。此 可藉由習知可偵測蛋白傲^ 白質的標準方法來達成。在此所使用 -40- 1235659 五、發明說明（3〇 可偵測蛋白質的分析方法描述於Harlow及Lane兩人所 者的書中（Harlow，E. and Lane，D.，1 988, Antibodies: A La^〇xat〇ry Manaual, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor，New York)，其全部内容在此以參考文 獻方式併入本文。這些分析方法包括，但不限於，免疫分 析（包括西方點墨法、固相放射性免疫分析、原位雜合（以 hybridization)、及免疫沉澱）。酪氨酸酶抗體乃習知 的’並可以習知的技術來產生新的酪氨酸酶抗體。 在一非限制性之可抑制黑色素生成之化合物的篩選方 法中，黑色素細胞係生長或培育在内含一測試化合物的生 長基質中。以上述可測定生長基質中酪氨酸酶存在與否、 其濃度或含量的分析方法進行分析。相較於未經測試化合 物處理過的細胞而言，測試細胞可使受測細胞分泌更多酪 氨酸酶，顯示其為潛在可抑制黑色素生成之化合物。 另種可用於此篩選方法的分析方法係可定出酪氨酸
方法的非限制性實施例中， 刺黑aI生成之化合物的篩選 黑色素細胞係生長或培育在内 -41- 1235659
五、發明說明（3〇 含一測試化合物的生長基質中，並收獲該細胞。之後決定 酪氨酸酶在所收獲細胞中的分佈位置，並與培育於類似生 長條件但未經測試化合物處理之細胞其中酪氨酸酶的分佈 來互相比》。這些分析方法中可併用任何f知的技術或技 術組合，包括次細胞分餾技術（例如，蔗糖或Per⑶丨丨之密 度梯度離心）、、細胞内含物之西方點s法及每一細胞分顧部 分之酪氨酸酶活性分析。相較於未經測試化合物處理之細 胞而言，經測試化合物處理後之細胞，在其黑素粒部分之 總酪氨酸酶活性的下降、或在非·黑素粒部分之總酪氨酸酶 活性的增加，顯示該測試化合物為潛在可抑制黑色素生成 之化合物。 亦可使用其他的定性方法，例如以顯微鏡檢視經測試 化合物處理後之細胞。舉例來說，可使用習知之細胞染色 技術。讓細胞生長或培育在内含一測試化合物的生長基質 中。以可抗-酷氨酸酶之抗體來將細胞_色，之後以顯微鏡 檢視該受處理的細胞。在一使用了此分析方法之篩選方法 的非限制性實施例中，黑色素細胞係生長或培育在内含一 測試化合物的生長基質中，並以習知的技術或方法來準備 細胞染色。參見Harlow and Lane, 1 98 。以可抗路 氨酸酶之抗體來將細胞染色。可將該可抗-酪氨酸酶之抗體 與一可供偵測之表位形成共軛。較佳是使用一種次2抗 體。該次級抗體係可辨識該可抗-酪氨酸酶之抗體並與之^ 合。較佳是，該次級抗體係與一可供偵測之表位形成共 軛。或者，亦可使用一種三級抗體。較佳是，該三級抗體 -42- 1235659 五、發明說明（4〇) 係與一可供偵測之表位形成共輛。該可供偵測抗體之共輛 表位的實施例係包含螢光分子（例如，螢光素 (fluoroscien)、鹼性蕊香紅（rhodamine)、霍克斯特 3325 8(Hoechest 33258)、或德州紅（Texas red))、酵素（例 如，辣根過氧化酶、鹼性磷酯酶、或β -半乳糠苷酶）、金 粒、放射性同位素及生物素。視所使用之標示表位來選 擇分析方法。舉例來說，可以螢光顯微鏡來偵測並檢視螢 光標示抗體。對於以酵素共輛抗體染色的細胞而言，該細 胞被進一步以適當的受質處理，以便轉換該結合了抗體的 酵素，之後才以光學顯微鏡檢視。該受處理的細胞。至於 經金粒標示的抗體則可以光學顯微鏡或電子顯微鏡檢視。 經放射性同位素標示的抗體則可以放射性感光底片進行偵 測。對於生物素共軛抗體，可進一步以鍊球生物素 (sheptaVidin)或抗生物素蛋白處理。該鍊球生物素或抗生 物素蛋白係與一可供偵測之表位形成共軛，例如，一螢光 刀子、一酵素、金粒、或放射性同位素。較佳是，該細胞 係同時以一抗體或一特定次細胞組成（即，内囊體、溶酶 體、黑素粒等）之專一抗體進行染色。使用任一技術，或其 他^知技術來偵測經抗體染色之細胞中的抗體，可定出酪 氨酸酶夕 -人細胞分佈。如果測試化合物可增加非-黑素粒液 泡上的路氨酸酶量，並降低黑素粒上的酪氨酸酶量，則該 化合物係可抑制黑色素生成。 另 、 一類型的分析方法是可用來決定該酪氨酸酶蛋白質 C 山 -端存在與否的分析方法。此分析方法之一部分係基於 -43- 1235659 五、發明說明（W) 抑制黑色素生成（即，抑制P蛋白功能的化合物或突變）之 黑色素細胞内含缺乏c-端（包括其跨膜區域及其蛋白質分 類訊號）的酷··ilSsL酶並且亦會分泌此類蛋白的發現上。如前 述，此部分受截之赂氨酸酶仍保留有催化活性。在基於此 分析之篩選方法的一非限制性實例中，黑色素細胞係生長 或培育在内含一測試化合物的生長基質中。選擇一可定出 路氨酸酶蛋白質之長度和/或質量的分析方法。舉例來說， 使用能辨識此酪氨酸酶蛋白質之N-端或中央部分之抗體的 西方點墨法或其他免疫化學技術，或其他可用來決定蛋白 質之長度和/或質量的標準分子生物技術，並將這這些技術 用在這些細胞的萃出物和/或其生長或培育生長基質中。以 標準免疫技術來制備適於此分析使用的抗體。參見Harlow and Lane，1 988, 。如果分析結果顯示相較於在類似生 長條件下培育但未經測試化合物處理之細胞而言，該經測
蛋白或缺乏 P ，在非-變性之 完整長度的酪氨酸酶，及由具抑制之p 蛋白之黑色素細胞所分泌之截短的酪氨酸酶 -44- 1235659 五、發明說明（4〇 聚丙烯胺凝膠上測試時，發現其仍保留催化活性。部分此 發現係另一用來分析截短的酪氨酸酶分析方法的基礎。因 此，收集生長或培育之基質，或細胞萃出物，並將其用於 非-變性之聚丙烯胺凝膠電泳中。將濾紙或濾膜（即，硝基 纖維素）泡在L-DOPA中，然後放到凝膠上。凝膠上的酪氨 酸酶活性可將L-DOPA轉變成黑色素，使濾紙或濾膜變黑 並顯示其位置，及該酪氨酸酶之相對大小。如果經測試化 合物處理後之細胞在濾紙或濾膜上產生兩個黑點，其中一 點與在同樣生長條件下培育但未經測試化合物處理之細胞 所產生的黑點類似，另一點則是體積較小的酪氨酸酶，則 該測試化合物乃是潛在可抑制黑色素生成之化合物。 具正常P蛋白功能之野生型黑色素細胞内，完整長度 的酪氨酸酶通常出現在細胞萃出物之不溶部分。必須使用 清潔劑（例如，Triton X-100TM)方能將其釋出。相反的，P 蛋白功能被抑制之黑色素細胞中，其較短、體積較小的酪 氨酸酶則出現在可溶部分中的液泡内。部分這些觀察係另 一常用來偵測P蛋白功能不足細胞中截短之酪氨酸酶分析 法的基礎。因此，黑色素細胞係生長或培育在内含一欲進 行測試之化合物的生長基質中。將收獲的細胞以清潔劑處 理後，將其中原固定於細胞膜上的蛋白質與可溶蛋白彼此 分離開來。舉例來說，可將細胞溶於置於冰上且内含 Triton X-1 14TM清潔劑之緩衝溶液中。於4°C下離心，將 不溶的污染物分離。之後，於室溫下將内含可溶蛋白之上 清液藉分層分離，或提高溫度使其分離成清潔劑相與液 -45- 1235659
五、發明說明（43) 相。定出在清潔劑相(其將包括内含可將酪氨酸酶固定於細 胞膜上之蛋白質C端的酪氨酸酶）中的酪氨酸酶量與液相 中？氨酸酶量之比例。或者，收獲細胞後，以冷;東/融解 循衣方式來破壞細胞膜。將受損之細胞分成可溶部分及固 疋於、、田胞膜上之不可溶部分。定出在可溶部分之胳氨酸酶 量與固定於細胞臈上之不可溶部分中的酪氨酸酶量之比 例。相較於未經測試化合物處理之細胞而t，經測試化合 物處理後之細I ’如果其可溶部分（路氨酸酶量高於其固 疋於、田胞膜上之不可溶部分中的酪氨酸酶量，I示該測試 化合物為潛在可抑制黑色素生成之化合物。
月J述路氨酸酶的分泌及傳送錯誤，以及酪氨酸酶 活I*生的下降’ f非抑制黑色素生成過程後會出現的唯一結 果’、他與黑色素生成相關的酵素活性亦會受影響，黑素 粒的生物生成過程亦然。 藉由可抑制P蛋白功能之突變來抑制黑色素生成過 程，會造成由黑色素細胞所製造的數種黑色素生成蛋白質 (包括TRP_1、TRp_2、及LAMp]基因之基因產物（〇ri〇w， S’J·’ and Bniilant，M Η，1999，之量大幅改變。在 野生型老鼠眼睛中，TRP-1及TRP-2基因之基因產物量， 於出生時是最高的，之後即大幅下降，2週時又逐漸達到 另一 A峰值’之後到約4〇天左右，即永久性地滑落至— 無法债測到的程度。在缺乏p蛋白基因的老鼠中，這些蛋 白質量在出生時即已較低，且僅數天即到達一無法偵測到 -46- 1235659 五、發明說明（μ) 的程度。 藉由可抑制P蛋白功能之突變來抑制黑色素生成過程 的另一種影響即為其會使包含酪氨酸酶、TRP-丨蛋白質、 及T R P 2蛋白質在内的「兩分子罝複合體（h i g h m ο 1 e c lx 1 a r weight Compiex)」之結構瓦解（〇rl〇w，S J，et al，i994, wpra)。在本發明文中，「高分子量複合體」定義為彼此 以共價鍵和/或非共價鍵方式結合在一起，且在整個非-變 性式的凝膠過濾過程、HPLC、或蔗糖梯度沉降（sucr〇se gradient sedimentati〇n)中彼此仍保持聯結狀態且其表面 分子量介於約200 kD至約700 kD間之一群蛋白質。在野 型黑色素細胞中’此與黑素粒結合在_起的「黑色素複 2體（《-lanogenic complex)」&含非常顯* —部分之細胞 ::補赂氨酸酶、TRP]蛋白質、及TRp_2蛋白質。在 ^，口制p蛋白功此來抑制黑色素生成過程之黑色素細胞 中。有非吊》篁的延類蛋白質會出現在高分子量複合體 種分析方法即是利用 旦/ 在一使用τ \ 4 艳二衫響之一部分來達成。 選方法沾此 卩制黑色素生成之化合物的篩 碾万去的非限制性實施例中， 内含一測1 ^ H “、、色素細胞係生長或培育在 測減化合物的生長義 破、並分顧 4 \ 。收獲該細胞、將其打 降之一I V _ 、梯度沉降法達成。取梯度沉 *部分體積分^ t ^ 在，例‘ T疋否有黑色素生成蛋白質存 牡例如，以可分析路氨 风貧 蛋白質活《夕八h (酶、TRW蛋白質、及trp-2 性之刀析方法進行合 刀析’或以諸如免疫墨點法之 1235659 五、發明說明（45) 類的免疫組織化學法進行分析。相較於未經測試化合物處 理之細胞而言，在經測試化合物處理之細胞中，增加任= 這三種蛋白質在低密度部分之量，或提高任何這^種蛋^ 質在高密度部分的4’表示該測試化合物為潛在可抑制黑 色素生成之化合物。 抑制黑色素生成過程的另-個後果是將使黑素粒的發 展脫軌。野生型黑色素細胞典型地合 ^ 糾里本， 豐^、完整、深黑色 的黑素粒。這類完整、深黑色的黑素，在黑色素生成丹 程受抑制的黑色素細胞(因生長或培育在含低濃度路氨酸： 生，基質中，導致可編碼產生P-蛋白的基因突變之故）中 的量較少’甚至沒有。相反的’這些細胞内含異常高量的 不成熟的黑素粒。此現象部分係另—可用的分析法之基 礎。在—使用了此分析方法之可抑制黑色素生成之化合: 的筛選方法的非限制性實施例中’黑色素細胞係生長或拉 育在内含一測試化合物的生長基質中。分析細胞中黑素^ 的數目、大小、形狀和/或顏色。此分析法已係習知。舉例 來說，將細胞固定、染色後，以光學顯微鏡進行觀察^ ^ 者，可將固定、染色、切片後，以電子顯微鏡進行觀察一。 或者，以密度離新法將細胞分餾。成熟的黑素粒密度較未 成熟的黑素粒來得高，因此可藉由密度差異將其彼此、 開。相較於生長在類似情況下但未經測試化合物 : 胞而言，經測試化合物處理過的細胞，其黑素粒的數目 大小、形狀和/或顏色均有所改變，顯示該測試化合物為潛 在可抑制黑色素生成之化合物。 -48- 1235659 五 '發明說明（私） 1 ·5 3Γ·抑制ρ蛋白功能的t選空 如刖述’ p蛋白在黑色素的生成過程中扮演相當重要的 角色。在可編冑P蛋白之基因上發生突變的黑色素細胞 中’其黑色素生成過程會受到抑制。在缺纟p蛋白或p蛋 白受抑制的細胞中，黑色素生成過程之抑制係與酪氨酸酶 的傳送位置錯誤有關…型黑色素細胞之赂氨酸酶主要 係位於黑素粒上，但在可編碼p蛋白之基因有突變的黑色 素細胞中，其酪氨酸酶主要係被分泌至或被發現係位於非_ 黑素粒之液泡上。以可抑制p蛋白功能之化合物來處理野 生！，"、色素細胞可模擬黑色素生成過程之抑制及酪氨酸酶 的傳送錯誤。 攻些發現之部分係許多黑色素抑制劑之篩選方法的基 礎這些篩選方法係藉由鑑別P蛋白質功能之抑制劑來鑑 別黑色素生成過程之抑制劑。因此，黑色素細胞係生長或 培育在内含一欲測試其抑制p蛋白能力之化合物的生長基 質中。該化合物之影響，如果有的話，係以任何一種上述 的T法來測定。.在一非限制性的實施例中，可測量細胞培 月或生長基質中的酪氨酸酶活性。舉例來說，可添加酪氨 酸於生長基質中，並監測其轉化成黑色素的過程。或者， 在生長基質中加入非-酪氨酸或經修飾或改良的酪氨酸受質 或酪氨酸酶，並以比色法（例如，DOPA氧化酶分析）、放 射〖生法（即，放射性羥基養基酶或放射性黑色素合成分 析）、螢光法或反應產物沉澱法，來追蹤其為酪氨酸酶轉變 成反應產物的過程。這些方法已詳述於前。 1235659 五、發明說明（47) 或者，亦可使用赂氨酸酶分析法。這些分析法可測量 經測試化合物處理後之細胞生長基質中的酪氨酸酶量，酪 氨酸酶於細胞中的位置（即，藉次細胞分餾或細胞染色後再 以顯微鏡觀察），或細胞中酪氨酸酶分子的長度及質量。這 些方法已詳述於前。 其他可用的分析法包括那些可測量抑制P蛋白功能之 其他影響的方法。例如，這些方法可測量經測試化合物處 理後之細胞中其TRP-1及TRP-2蛋白質之量或活性、其高 分子量黑色素複合體的豐富度及組成、或脫執黑素粒之有 無。這些方法已詳述於前。 另一種可用的分析法涉及測量細胞内標的物，某一類 型溶酶體水解酶在細胞内的含量和/或分泌之有無。正常情 況下，新合成的溶酶體水解酶係自反式高基氏網被傳送至 一後内囊體腔，該後内囊體腔之一部分一般係認為其終會 彼此融合形成溶酶體。這些溶酶體含大部分的細胞内溶酶 體水解酶活性，可在以分餾細胞製備而成的大顆粒部分中 測得。如以下非限制性實施例所示，相對於黑素-a細胞而 言，部分（但非全部）溶酶體水解酶並非被正確地傳送至黑 素-P細胞中内含溶酶體之大顆粒部分。具體而言，溶酶體 水解酶係藉由與不會積聚在大顆粒部分之甘露糖-6-磷酸酶 /第II型似胰島素生長因子受體（即，「M6P/IGF-II受體」） 結合而被從反式高基氏網被傳送至一後内囊體腔。這種標 的不正確的溶酶體水解酶尚包括β -己糖苷胺酶、β -葡萄糖 苷酶、β -葡萄糖苷酸酶、及β -半乳糖苷酶。相反的，不會
-50- 1235659 五、發明說明（μ) 藉M6P/IGF-II受體而被傳送到後内囊體之酸性磷酸酶會正 確地聚積在黑素_a細胞及黑素_b細胞中的大顆粒部分。因 此’ P蛋白功能亦是將溶酶體酵素藉M6P/IGF-II受體傳送 到正確後内囊體位置之一種不可或缺的蛋白質。若出現缺 陷’則該酵素會被分泌至細胞外。 这些結果之部分係其他用來篩選可影響p蛋白功能之 方法的基礎。因此，除了酪氨酸酶傳送錯誤外，還可藉由 篩選、、]忒化合物對任一藉由受體而被傳送到後 内囊體之水解酶的含量和/或位置之影響來進行篩選，該水 括但不限於’卜己糖苷胺酶、β -葡萄糖苷酶、β_ 葡萄糖芽酸酶、及卜半乳糖芽酶。因為這些溶酶體水解酶 /、氨酉文酶、蛋白質、及特定酵素一樣，可以任何上述用 斤疋否有酪氨酸酶酵素活性和/或蛋白質之方法來分析 、酶體水解酶。分析這些酵素的方法乃是此領域中習知 的方法（部分描述於以下之非限制性實施例中），且這些酵 :、、基馱結構及抗體亦是習知的。例如，可分析全細胞 或胞萃出物、細胞萃出物中的大顆粒部分、和/或經測試 過之細胞的生長基質中是否含有溶酶體水解酶 和/或复人胃 y a置。能降低這類溶酶體酶在細胞中（特定言之， :在Γ顆粒部分)的聚積量’或提高這類酵素分泌量的化合 二即為可抑制P蛋白功能的潛在化合物，進一步以本發 或其他方法來分析這類化合物。 累色盍生盛蛋白功能和/或模擬p 方法 -51-
1235659 五、發明說明（49 ) 如前述，野生型黑色素典型地 酶至體外谇育峰4其哲士 會刀4 一部分的酪# 卜培月生長基質中。雖然這此八 酶仍具酵素活性，作卻對發夺/4 _刀泌出去的酪象 生m P對發生在細胞内黑素粒上的黑色 成過程沒有貢獻。如上述， 成葙谇X L 社”，、色素細胞中的黑色素 正比於位於黑素粒上的絡氨酸酶之比例多寡。能 ^ , 的化口物即可抑制黑色素生成 :。相反的，能降低分泌出去之路氣酸酶含量的化合物 而增加黑素粒上的酪氨酸酶含量之化合物，即可預期 會增加黑色素生成過程。如前述，將路氨酸酶傳送至黑 粒的過程需要Ρ蛋白參與。因此，可提高黑色素細胞内 蛋白活性之化合物，以及可模擬ρ蛋白活性之化合物， 可藉由降低備分泌之酪氨酸酶含量來提高黑色素生成 率。 許多篩選方法之部分係以上述這些觀察及預測為 礎’來鑑別可提高黑色素生成效率之化合物、可提高ρ 白功能之化合物、和/或模擬Ρ蛋白功能之化合物。舉例 說’亦可變化使用上述這些以黑色素細胞來鑑別黑色素 成抑制劑及Ρ蛋白功能之分析方法來進行鑑別。黑色素 胞係生長或培育在内含一欲測試化合物的生長基質中， 測試其增加黑色素生成效率、提高ρ蛋白功能、或模擬 蛋白功能的能力。該化合物之影響，如果有的話，係以 何一種上述的方法來測定。舉例來說，可測量細胞培育 生長基質中的酪氨酸酶活性。生長基質中酪氨酸酶活性 能係表示被分泌出去的酪氨酸酶量變少’且該化合物可 k酸 酸 素 生 降 過 9 其 素 P 將 效 基 蛋 來 生 細 以 P 任 或 可 能 -52- 1235659 五、發明說明（5〇) 因此可提高黑色素生成效率或P蛋白功能。
或者，或此外，可ιν τ A 不3 p蛋白功能之黑色素細胞 (即，黑素·ρ細胞）來篩選 J模擬ρ蛋白功能的化合物。在 可用於本發明之一種分析法 啊次中，將不含p蛋白功能之黑色 素細胞培育在内含欲泡丨4 t 3欲測试化合物其模擬P蛋白功能及增加 黑色素生成能力之生長美暂由 ^ 一 長基質中。與正常黑色素細胞不同的 疋’ 類不含 p蛋白夕哲A _JU ., 來以 < 黑色素細胞的顏色較淺（動物體亦 然）。如果相較於不含卩蛋白之黑色素細胞的顏色而言，該 不S P蛋白之黑色素細胞的顏色，在有測試化合物存在時 會變得較深，則表示該化合物可完全或部分模擬P蛋白功 能。這些細胞的顏色可透過定性方法測量，例如，藉由肉 眼檢視；或透過定量方法測量，例如，藉由反射。或者， 以欲測”式之化合物來處理該不含p蛋白之黑色素細胞，並 分析釋出至細胞外的酪氨酸酶量。如果以測試化合物處理 後該不3 P蛋白之黑色素細胞（即，黑素_ p細胞）的生長
基質中的酪氨酸酶量會下降，則該測試化合物係可模擬P 蛋白功能的潛在化合物。以上述任一技術來測量生長基質 中的酪氨酸酶活性。舉例來說，在生長基質中添加酪氨 酸’並監測其轉變過程。如前述，在生長基質中添加酪数 酸，並監測其轉變為黑色素的過程。 或者’亦可使用分析酪氨酸酶蛋白質的分析方法來進 行分析。這些分析方法可測量諸如經測試化合物處理過之 細胞生長基質中的酪氨酸酶含量、酪氨酸酶在細胞中的位 置（亦即，藉由次細胞分餾法或染色後再輔以顯微鏡觀 -53- 1235659 五 、發明說明（51) 察）、或酸^ 氰酸酶在細胞中的長度及質量。無論是分泌至生 長基質中 ±、 的路氨酸酶含量降低，或黑素粒上絡氨酸酶含詈 l· 口 至 曰加，均I 一
jI示該測試化合物是可增加黑色素生成或模擬或 知高P I A 人 龙白功能的潛在化合物。如果這些測試化合物在不 各 P蛋匕
Jt 曰功能的黑色素細胞中引起類似的效果的話，這此 結果即表〜 #布該測試化合物可模擬P蛋白功能。這些分析方 法已詳述於前。 "αΓ m J用的分析方法包括那些可測量P蛋白功能上 、模擬P蛋白功能、和/或增加黑色素生成之其他效果的 ^ 舉例來說，這些分析方法係可測量經測試化合物處 理過$ & & 心、、、田胞内TRP-1和/或TRP-2蛋白質或其活性、高分 了 曰 γ泛 里“、、色素複合體之豐富度或組成、或有或無如前述脫執 之黑素粒發育的情況。TRP-1和/或TRP-2蛋白質量或其活 性增加’這些蛋白質出現在高分子量黑色素複合體的量增 加’或高分子量黑色素複合體的數目增加，均代表該測試 化合物係一種可增加黑色素生成或Ρ蛋白功能的潛在化合 物。如果這些測試化合物可在不含ρ蛋白功能的黑色素細 胞中（如，黑素-ρ細胞）引起類似的效果的話，這些結果即 表示該測試化合物可模擬ρ蛋白功能。這些分析方法已詳 述於前。 在這些篩選方法的一些變化中，該酪氨酸酶分泌量係 與細胞内的酪氨酸酶含量相比較。黑色素細胞係生長或培 月在内含一測試化合物的生長基質中。以任何一種上述的 方法來測定生長或培育基質中的酪氨酸酶含量，同時炎定 -54- 1235659 五、發明說明（52) 出細胞内的酷氨酸酶含量。計算細胞内酪氨酸酶量與酪氨 酸酶分泌量兩者間之比值。如果經測試化合物處理過之細 胞所得之比值’較生長於類似情況下但未經測試化合物處 理過之細胞所得之比值來得高的話，表示該測試化合物可 增加黑色素生成。在一非限制性的實施例中，所觀察到這 類細胞内路氣酸酶量與路氨酸酶分泌量兩者間之比值，對 一細胞所分泌之總酪氨酸酶量而言，並無改變（即，降 低）。同樣的，如果不含p蛋白功能的黑色素細胞中（如， 黑素-P細胞）係生長或培育在内含一測試化合物的生長基 質中，則經測試化合物處理過之細胞所得之比值，較生長 於類似情況下但未經測試化合物處理過之細胞所得之比值 來得兩’此亦代表該測試化合物可模擬p蛋白功能，因而 可增加黑色素生成。 ί.7m、色i生成細胞來篩選可影響p蛋白功能之化 合物的方法 大部分非-黑色素生成細胞都不會表現P蛋白或酪氨酸 酶在本發明中’ 「非-黑色素生成細胞（non-melanogenic cells)」一詞定義為不含黑素粒之細胞。但是，可以人為方 式使非-黑色素生成細胞表現P蛋白及酪氨酸酶，並使其 合成黑色素。在本發明中，「以人為方式使非-黑色素生成 細胞表現P蛋白及酪氨酸酶（cells made ί0 express both P protein and tyrosinase)」一詞定義為以任何諸如分子遺傳 技術這類習知的技術，讓一般而言不會表現P蛋白和/或酪 氨酸酶的細胞，開始表現P蛋白及酪氨酸酶。舉例來說， -55- 1235659 五、發明說明（53) 可藉由諸如轉移感染 （transfection)、 轉形 (transformation)、或轉導（transduction)的方式，將異源性 路氨酸酶和/或 P蛋白之基因引入細胞中。在本發明中， 「異源性（heterologous)」一詞定義為天然狀態下不會存在 於一有機體中的一基因或基因產物，或是一般狀況下不會 在該類細胞中表現的一基因或基因產物。或者，可活化内 源性（endogenous)，但一般狀態下處於 「靜止態 (quiescent)」之絡氨酸酶和/或P蛋白之基因，使其表現絡 氨酸酶和/或P蛋白（即，藉由同源重組轉錄控制序列或任 何其他活化方法）。本發明許多方法係以非-黑色素生成細 胞表現P蛋白及酪氨酸酶時，其酪氨酸酶活性是單獨只表 現酪氨酸酶活性時的四倍這樣的觀察為基礎而得的。表現 P蛋白而非酪氨酸酶之細胞，則沒有可偵測到的酪氨酸酶 活性，顯示在這些細胞中，P蛋白對酪氨酸酶活性的影響 完全視酪氨酸酶之有無而定。 以人為方式使表現P蛋白及酪氨酸酶之細胞中的酪氨 酸酶活性對可抑制P蛋白功能之化合物相當敏感。當這些 細胞以啡噻啉處理時，這些細胞中的酪氨酸酶活性會大幅 下降。這些化合物對酪氨酸酶活性的影響完全視P蛋白活 性之有無而定。表現酪氨酸酶而不表現P蛋白之細胞，其 酪氨酸酶活性並不會因測試化合物之存在與否而有所變 在許多能影響（即，增加或減少）P蛋白功能之化合物的 篩選方法中，已針對這些觀察進行探索並開發。讓一般不
-56- 1235659 五、發明說明（μ) 具酪氨酸酶和/或P蛋白活性的細胞表現這兩種蛋白質，並 讓細胞生長或培育在内含一測試化合物的生長基質中。測 量這些細胞中的酪氨酸酶含量。以任何一種上述的方法來 測定酪氨酸酶含量，包括放射性酪氨酸羥基酶分析、 DOPA氧化酶比色法、DHICA轉化分析、將[14c]D〇pA轉 化成TCA可沉澱物之能力分析、或任何其他習知的方法。 如果經測試化合物處理過之細胞萃出物的酪氨酸酶活性比 生長在類似情況但未經測試化合物處理過之細胞萃出物的 赂氨酸酶活性來的⑻，且如果該測試化合物並不會降低該 會表現酿氨酸酶但不表現p蛋白之細胞巾㈣氨酸酶活 性’則表示該測試化合物可降低p蛋白功能。相反的，如 果經測試化合物處理過之細胞 肥卒出物的酪氨酸酶活性比生 長在類似情況但未經測試化合 卜^ σ物處理過之細胞萃出物的酪 氣酸酶活性來的高，日‘里# *的° 1如果該測試化合物並不會增加該會 表現酪氨酸酶但不表現ρ蛋 會 白之細胞中的酪氨酸酶活性， 則表示該測試化合物可增加ρ蛋白之功能。 以可表現酪氨酸酶和Ρ卷 所進行的另-種筛選方法，：：活性之非黑色素生成細胞 培育後會因黑色素沉積而轉 ^在長㈣ 理會表現酪氨酸酶和P蛋白主 以測試化合物來處 ^ P蛋白活性之細胞，或 酶而非P蛋白活性之細胞。 七 表見酪虱酸 充分表現酪氨酸酶和ρ I H使，、月b 和P蛋白活性以沉積黑色素 測試化合物處理細胞。以肉 ”仁並未以 檢視細胞，分析經處理及I I ♦的方法 及未經處理之細胞中的黑色素含 -57、 1235659 五、發明說明（55 ) 量。如果經測試化合物處理過之可表現赂氨酸酶和p蛋白 活性之細胞萃出物的黑色素含量比生長在類似情況但未經 測試化合物處理過之細胞中黑色素含量來的低，則表示該 測试化合物可降低黑色素的生成。相反的，如果經測試化 合物處理過之可表現酪氨酸酶和P蛋白活性之細胞萃出物 的黑色素含量比生長在類似情況但未經測試化合物處理過 之細胞萃出物的黑色素含量來的高，則表示該測試化合物 可增加黑色素的生成。如果該化合物同時也無法提高可表 現路氨酸酶而非P蛋白之非-黑色素生成細胞中黑色素的 生成，則表不該化合物可提高p蛋白功能。 或者，亦可將破碎細胞萃出物系統設計成可用來研究 路氨酸酶在細胞内的傳送過程。在一非限制性實施例中， 將來自野生型黑色素細胞之高基氏體膜及細胞質，與來自 具赂氨酸酶突變基因致使該酪氨酸酶不具活性之老鼠細胞 所製備而成的黑素粒合併在一起。之後，可觀察酪氨酸酶 自贈予者高基氏體膜轉移至缺乏酪氨酸酶的黑素粒上。添 加可抑制P蛋白功能的化合物·將可抑制此種轉移現象。 對於使用異源性基因的方法而言，可自任何恰當的來 源取得該異源性酪氨酸酶及P蛋白基因。較佳是，其係來 自一動物體。更佳是，其係來自哺乳動物，例如用於下列 實施例中之老鼠。最佳是，其係來自諸如人類之類的靈長 動物體。酪氨酸酶基因係此領域人士所熟知的（參見 Expression of the Human gene cDNA in Bouchard et al·， 1 989，J· Med· 169(6)，2029-2042 及 MEDLINE 資料
-58- 1235659 五、發明說明（56) 庫：例如 NM — 000372、M27196、及 U01 873)。p 蛋白基因 亦係此領域人士所熟知的（參見 Rinchik ei α/ 1993, 361 (6407)，72-76，及 MEDLINE 資料庫：例如 NM —000275、及 U19152)。 典型係以表現匣（expression cassettes)在選定細胞中表 現異源性基因。每一表現匣含有控制序列（regulat〇ry sequences) ’其係設計成可表現，例如，該酪氨酸酶和/或 P蛋白基因。若在原核細胞中表現，較佳是表現匣中的每 一編碼序列係可操作式地連結至至少一控制序列上，亦 即，一啟動子序列。經由「可操作式地連結（〇peratively linked)」’係表示該控制序列的功能係可調控表現序列 (即，控制該表現序列的表現時間及表現量，決定開始或終 止轉譯或轉錄過程，或影響訊息之安定度）。若在真核細胞 中表現，較佳是表現匣中的每一編碼序列係可操作式地連 結至至少兩控制序列上，亦即，一啟動子序列及一聚A序 列（P〇lyA sequence)。每一表現匣係可操作式地連結至一載 體的聚核苷酸上。每一載體較佳係包含一聚核苷酸，該聚 核誓酸係能容許該載體於轉移感染細胞中進行篩選、複 製、及維持，且該載體係可以一自發性染色體外元件形式 存在或以一或多個染色體之一整合性組件形式存在於該轉 移^染1^中。該内含表現g之載體可被調整成能表現任 各♦ 已商業化之編碼序列。這類載體之非限制性實施 例’係 乂蹲自 Invitrogen (San Dieg〇, CA)之 pcDNA 載體為 例詳述於下。 -59- 1235659 五、發明說明（5〇 任何可促進一足夠高效率之表現的啟動子，均可用於 表現匿中。該啟動子可以是天然的或是可誘發式的。參見 Resendez et al.? 1 988, Mol. Cell Biol. 8:4579-4584 ； Changet al·，1987，Proc· Natl. Acad· Sci. USA 84:680-684 ;此兩 篇文獻中描述了可誘發式的啟動子。啟動子的選擇視篩選 方法中所選用的細胞類型，及編碼酪氨酸酶及/或p蛋白之 異源性基因的欲求表現量而定。參見G〇sseri et al.，1 995， Science 2 6 8:1766-1769; Gossen and Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-555 1 及美國專利第 5，851，984號、美國專利第5,849,997號、美國專利第 5,827,687號、美國專利第5,811，260號、美國專利第 5,789,2 1 5號、美國專利第5,665,578號、美國專利第 5,5 1 2,483號、美國專利第5,302,5 1 7號、美國專利第 4,959,313號、及美國專利第4,935,352號，其全部内容在 此以參考文獻方式併入本文中。 啟動子序列及元件之其它非限制性實施例包括SV40早 期啟動子區（Bernoist and Chambon，1981，290:304-310)，在 Rous肉瘤病毒 3’長端重複區中的啟動子 (Yamamoto，以 α/.，1980，Ce// 22:78 7-79 7)，疱疹腺核苷激 酶啟動子（Wagner Η α/·，1981，iVoc· A^i/· dcai/· Scz··「CASA 78:1441-1445)’金屬麥角硫因基因之控制序列（Brinster α/·，1 982，WWwre 296:39-42)，諸如β-内酯酶啟動子之類的 原核表現載體（Villa-Kamaroff，d W.，1 978，ZVoc. iVai/. Acad. Sci. (USA) Ί 5··3ΊΊΊ，tac 1 動 + (DeBoer，d -60- 1235659 五、發明說明（58) α/·，1 983，Proc. had. Scz·. Γί/α) 80:21 -25)，參見 丨丨Useful proteins from recombinant bacteria” in Scientific American，1 9 80，242:74-94，内含藍伊紅合成酶啟動子區 (nopaline synthetase promoter region)之植物表現載體 (Herrera-Estrella α/·，303:209-213)或花葉菜跳動 病毒 35S RNA 啟動子（Gardner，以 α/·，1981，#wc/· dczA 及u· 9:2871)，及光合酵素二磷酸核酮糖羧化酶之啟動子區 (Herrera-Estrella α/.，1984，iVarwre 310:115-120)，諸如 Gal 4啟動子這類來自酵母及其他黴菌之啟動子，ADC (酒 精去氫酶）啟動子，PGK(磷酸甘油激酶）啟動子，鹼性磷酸 酶啟動子，及下列具組織專一性且已用於轉殖動物上之動 物轉譯控制序列：在胰臟腺泡細胞中活化之彈性酶I基因 控制序列（Swift Μ α/. (1 984) CW/ 38:639-646; Ornitz W β/·， 1986， Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald，198 7，7:425-5 1 5)、在胰臟 β細胞中活 化之騰島素基因控制序列（Hanahan，1985，iVfl/wre 3 1 5 :1 1 5-122)、在淋巴細胞中活化之免疫球蛋白基因控制序列 (Grosschedl et al” 1 984， Cell 3 8:647-658; Adames et aL， 1 985, Nature 3 1 8:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. 〇//· 5ζ·ο/. 7:143 6-1444)、在睪丸、胸部、淋巴及肥大細胞 中活化之老鼠乳癌病毒控制序列（Leder以α/.，1 986，Ce// 45:485-495)、在肝臟活化之白蛋白基因控制序列（pinkert α/.，198 7，d 1:268-276)、在肝臟活化之 α-胎蛋白基因控制序列（Krumlauf α/.，1 985，Mo/. Ce//. -61 - 1235659 五、發明說明（5〇 Biol. 5:1 639-1648; Hammer et al.^ 1 987, Science 235:53-58)、在肝臟活化之OU -抗胰蛋白酶基因控制序列（Kelseyd a/·，1987，Gwes and Deve/. 1:161-171)、在骨趙細胞中活 化之β-球蛋白基因控制序列（Mogram a/.，1985，iVWwre 3 1 5:33 8-340; Kollias a/.，1 986，CW/ 46:89-94)、在腦部 寡樹突細胞中活化之鹼性髓鞘蛋白基因控制序列（Rea(jhead W α/·，1 987，Ce// 48:703-712)、在骨骼肌中活化之肌球蛋 白輕鍊-2 基因控制序列（Sani，1 985, 314:283-286)、 在下視丘活化之促性腺激素釋放激素基因控制序列（Mason α/·，1986, Sczace 234:1 372-1 378)。 其他可用於真核細胞表現之表現匣中的調控元件為聚A 序列（或聚A訊息），其應能有效地誘發一轉錄物之聚腺苷 4匕’該轉錄物是一可操作式地連結了聚A序列的序列碼。 參見下列討論聚A序列的美國專利第5,861，290號、第 5,851，984 號、第 5,840,525 號及第 5,627,033 號之内 容。 在另一非限制性實施例中，依據本發明可用之表現匣 更包含一增強子元件（enhancer element)、一 5,或3,未轉譯 序列、一或多個插入子（introns)、一可調控RNA安定度之 序列、或一或多個上述元件之組合。任一符合上述之類型 之序列均可用於本發明載體中。參見討論控制元件之美國 專利第 5,861，290 號、第 5,851，984 號、第 5,840,525 號、第5,681，74 4號及第5,627,033號之内容。「5,未轉譯 序列（5’ untranslated sequence)」係指一位於開始轉錄處及
-62- 1235659
開始轉譯處之間的mRNA分子序列。「3，未轉譯序列 untranslated sequence)」係指一位於轉譯終止處及聚A尾 五、發明說明（6〇) 端之間的mRNA分子序列。 用於這些分析中的異源性基因典型地係藉由轉移感 染、轉導（transduction)、轉形（transformati〇n)、或任何習 知之恰當方式，將該異源性基因引入選定的細胞中。例 如，電穿洞（electroporation)、磷酸鈣共沉澱、顯微注射、 脂感染（lipofection)等。參見描述這些轉移感染方法之美國 專利第5,8 14,618號、第5,789,215號。細胞係經由將該異 源性基因併入其基因體中或維持其成為一部分染色體外元 件的方式來吸收該異源性基因。因此，可於載體中包含入 一挑選用的標記物，以便於從不含該载體之細胞中辨識出 含有該標記物（亦即含有該異源性基因）之細胞。是否需要 以-選定標記物來製備可用於分析之細胞，視所選用將載 體送入細胞的方法而定。舉例來說，相較於以電穿洞方式 將載體送入細胞的方法而言，如果載體係藉由顯微注射方 式被傳送至細胞内，則其是否含有標記物就不是這麼重要 了 ，此係因為經由顯微注射傳送載體的表現頻率較高之 故。舉例來說，該標記物可容許細胞生長在特定條件下， 即不含此標記物（例如， 呤基因）的細胞將無法生 抗新黴素（neomycin)基因或次黃嘌 長。一標記物亦可提供另一種鑑別 細胞是否吸收了該異源性亨妨让 愿f生承核士酸分子或載體的方法。參 見討論選擇性標記物之美國專利帛WWW號及第 5,789,21 5號’其全部内容在此以參考文獻方式併入本文 -63- 1235659 五、發明說明（61) 中 〇 用於此類分析之細胞典型地係衍生自任何來源。用於 此類分析之細胞可以是衍生自一哺乳動物，例如：羊、 牛、豬或其他農場動物；貓、狗、或其他家畜；小鼠、大 鼠、或其他齧齒動物；猴子、猿、或其他靈長類動物；且 最佳是人類。或者，用於此類分析之細胞可以是衍生自一 非-哺乳類動物，例如，鳥、魚、爬蟲類、兩棲類、或昆 蟲。衍生自動物並可用於此類分析之細胞可以是來自，例 如，纖維母細胞、神經膠質細胞、角質細胞、肝細胞、室 管膜細胞、骨髓細胞、海馬迴細胞、幹細胞、胚胎幹細 胞、造血幹細胞、嗅覺粘膜細胞、腎上腺細胞、白血球細 胞、淋巴細胞、嗜鉻細胞、神經、免疫系統細胞、巨噬細 胞、史旺細胞（Schwann cells)、寡樹突細胞、星形細胞 (astrocytes)、胚細胞（germline cells)、體細胞、上皮細 胞、内皮細胞、腎上腺髓質細胞、骨母細胞、破骨細胞、 肌纖維母細胞、胰臟細胞（例如藍蓋罕氏之島形細胞）、或 上述任一類細胞之組合。或者，用於此類分析之細胞可以 是衍生自一植物性來源，例如諸如菸草之類的雙子葉植 物，或是諸如玉米之類的單子葉植物。或者，用於此類分 析之細胞可以是衍生自一單細胞原核有機體，例如原蟲、 或酵母或其他單細胞黴菌。這類細胞的生長培育方法視不 同細胞而定，且係習知的。 在一較佳實施例中，可使用來自上述任一來源所衍生 製備而成的細胞株。這些細胞株的實例包括，但不限於，
-64- 1235659 五、發明說明（62) 市售（亦即，來自 American Type Culture Collection, Manassas，VA)之中國倉鼠卵巢細胞（CHO)、HeLa細胞、 NRK細胞、A293細胞、及COS細胞。這些細胞在體外培 育時可持續繁殖。將異源性基因引入細胞後，篩選已吸入 該異源性基因的細胞，這類細胞，在一較佳實施例中，對 於建立一可再體外培育條件下生長、再生長一段長時間之 細胞株有相當大的助益。參見美國專利第5,814,618號， 其全部内容在此以參考文獻方式併入本文中。 K8 模慧-P蛋电化合物的高產率筛選方 I白功能之化合物的方法可 上述篩選可影響或模擬 同時用來測試個別化合物或少量或大量的化合物。較佳係 使用業者熟知之高產率的篩選方法。 在本發明中’「高產率之筛選方法(highthr。吻以 method of screening)」定義 年同時有大量化合物進 灯測试的方法。在此篩選方法 的每一 +職々 了衫響或模擬P蛋白功能 的母步驟或全部步驟，對此高產率之舖掣古、土由从 物而言均是可接θ 羊之師選方法中的化合 J疋J接文的。較佳是 分戋全1 ώ & 此阿產率之篩選方法的部 刀次全口Ρ係自動化的，因此可 注程度。暴彻也％ 、 低對母一測試化合物的關 幻來說’增加釋出至 量，或增加政#破& 生長基質中的酪氨酸酶 场加酪氰酸酶活性總量， 產座、防 輕易地於典型用於太萬 產羊之師選方法中的型態（諸 u於本间 高產率之筛選方法乃係習知#之培養盤)中偵測到。 行。自動化實驗室，包括機器人：於任一種型態中執 可明顯降低篩選大量化 -65- 1235659 五、發明說明（《) 合物所需的時間，且可購自下列公司··例如 Tecan(Research Triangle park, NC) 、 Scitec laboratory Automation S A (Lausanne, Switzerland) 、 Rosy s (New
Castle，DE)、Rixan Associates Inc. (Dayton，OH)、CRS Robotics (Burlington，Ontario Canada)、Fanuk Robotics、 及 Beckman-Coulter Sagian (Indianapolis，IN)等。在鑑別 出潛在化合物後，即可使用第二重篩選方法來決定這些潛 在化合物對細胞和/或P蛋白功能的體外影響。
1 9可影響或模幾_蛋白功能之化合物的第二重筛撰方 法及其他篩潠方沐 每一種上述篩選方法本身都可用來鑑別出可影響或模 擬P蛋白功能之化合物。或者，可使用一系列的上述方法 來更精確地決定出一或多種化合物其影響p蛋白的性質。 舉例來說，任一上述篩選方法均可作為一主要的篩選方 法，再接續以第二重筛選方法（sec〇ndary meth〇d 〇f SCreening)。在本發明中，「主要篩選方法（primary meth〇d of screening)」係定義為用來測試一化合物其可影響或模
擬P蛋白功能之能力的第一餘、联+、_L , , , J ^ 師選方法。在本發明中，「第 二重篩選方法（secondarv . ·、 Υ thod of screening)」係定義為 並非主要師選方法之任一餘、瞾+. 締選方法。當主要師選方法係基 於鑑別出可容許產生鲂供敲> △ 季乂低絡虱酸酶活性、或黑色素生成 量、或降低酪氨酸酶分泌昜 啊刀▲里之化合物為基礎的話，該第二 重篩選方法就顯得特別番曼 置要。亦可使用酪氨酸酶的直接抑 制劑來降低赂氨酸酶活性及黑色素的生成量，或在不必然 -66- 1235659 五、發明說明（6〇 會影響P蛋白功能的情況下，降低酪氨酸酶活性。 任一上述的篩選方法亦可作為一第二重篩選方法 用。舉例來說，可以一主要篩選法藉由篩選一化合物於 可表現酿氨酸酶及p蛋白之細胞對路氨酸酶活性之影響 但卻不影響只表現酪氨酸酶之細胞中酪氨酸酶之活性， 鑑別一潛在化合物。由此主要篩選法找到的潛在化合物 進一步以第二重篩選方法測試該等化合物對酪氨酸酶在 胞中位置和或黑色素生成細胞中溶酶酵素之影響。在上 篩選方法中’那些仰賴酪氨酸酶位置錯誤或活性高低或 積大小所作之鑑別者，係較佳的第二重篩選方法。 在一實施例中，以一第二重筛選方法來區別一可影 黑色素生成途徑，特別是p蛋白功能之測試分子的效果 以及那些可抑制蛋白質合成、傳送及裂解之測試分子的 果。舉例來說，在一 p蛋白功能活化劑之試驗中，一第 重篩選方法可僅作為肉眼檢視測試之黑色素細胞之用， 保證其顏色確實變深及，較佳是保證p蛋白活性增加， 非只是該測試分子之抑制一般蛋白質的合成、傳送或 解，致使路氨酸酶分泌量降低的結果。或者，可以組織 方式檢視該細胞，較佳是藉由電子顯微鏡，或者合併使 =OPA染色（如實施W 4所討論的），以決定其黑素粒 量。一 P蛋白活性的真正活化劑可促進黑素粒自第卜 階段成熟至第ΙΠ-Ιν階段，至於蛋白質合成、傳送及降 之抑制劑，則不可能可促進黑素粒的成熟過程。 亦可使用其他的筛選方法。舉例來說，首先可先筛 使 來 可 細 述 體 響 效 以 而 降 學 用 含 III 解 選 «67- 1235659 五、發明說明（e) 一化合物對純化的P 士人 蛋白之π 口親和性。或者，吁進一步 測试一以是否可影響ρ 白 d , 贪曰功版為基礎之主要篩選法所鑑 別出的化合妨J，甘 ,a(/、與純ρ蛋白間的體外結合親和性，·或自 !測忒化合物處理過 „ m 、气了表現p蛋白的細胞中與p蛋白被 共同純化的能力。任一述締 ^ ^ 上迷之師選方法可用來決定該等化 奋物市否可直接鱼 /、Ρ蛋白結合。一可直接與Ρ蛋白結合， 且會影響酪氨酸酶活+ ·· 舌眭、位置或黑色素生成過程之其他特 徵的化合物，亦極可 』&會直接衫響p蛋白的功能。或者，
、座由主要篩選法所鑣 口 m w出會影響p蛋白功能的化合物，也
可備進一步測試其影響酪氨酸酶活性的能力。舉例來說， 可將該測減化合物添加至-内含酪氨酸酶、而# p蛋白的 系統中。這類系統，可以是，例如，一内含純化或部分純 酸酶且幾乎不含p蛋白的體外系統。或者，其可 、疋可表現酪氨酸酶而非p蛋白之細胞。如果該測試化 合物對赂4酸酶活性的影響視p蛋白之有無而定，則1示 該測試化合物並不會影響P蛋白功能。如果該測試化合物 =酪氨酸酶活性的影響在缺乏細胞傳送（即，在純化的:氨 酉文酶蛋白質，而非細胞中）的狀況下也可觀察的到的話，則 表示該測試化合物並無法模擬P蛋白功能。 雖然較佳之主要篩選法，特別是那些高產率的篩選方 去，是那些價格較低的方法（即，可在極低密度的人_龄督 下，並使用最少材料的情況下被快速執行），而第二重篩選 方法則須花較多的時間、勞力、及材料，方能被執行。此 係因第一重篩選方法只在經主要篩選法挑選合格能影響戋 -68- 1235659 五、發明說明（66) 模擬P蛋白功能之化合物上被執行之故。—般預期這也化 合物係佔大量、經高產率測試法測試之總剩試化合物量中 很小-部分。較適合第二重篩選方法而非主要筛選法之筛 選方法實例包括施用（即，表面塗抹、皮下、或口服)一測 試化合物相當於動物之皮膚的細胞肖育物上， 當皮膚或相當於皮膚之培育物帛色變⑨即表示該化合物可 抑制p蛋白功能。或是，對可模擬P蛋白功能的化合物來 説，第二重篩選方法可包括施用測試化合物至一黑素邛動 物成相當於動物之皮膚的細胞培育物上，#皮膚或相二於 皮膚之培育物顏色變深時即表示該化合物可模擬p蛋^功 能。 亦可以筛選法中的主要筛選法來鑑別可影響或模擬p 蛋白功能的化合物。—旦該可影響或模擬p蛋白功能的化 合物藉由主要篩選法而被梦别Φ办么 稷鯭別出來後，即可選擇或創造該 化合物之化學類似物。基於此目的，本發明中「化學類似 物（chemical analog)」係宗μ盔你口 从 保疋義為與另一其他化合物在化學 上相關之-種化合物。其中的關係較好是結構上的，如習 之技藝熟知的，例如，兩化合物的差別僅在於取代基位置 2同，例如’-經基或—院基，或彼此為化學類似物。或 中的關係：以是功能上的，例如，兩種化合物均影 ;:機制’換s之’兩種化合物都是激酶抑制劑 :師選化學類似物的方法詳述於以下2.…。之後可藉 上述方法來測试這些化學類似物其影響或模擬 白功能的能力。第二重筛選方法可以和主要筛選法相同或 -69- 1235659 五、發明說明（a f同-所欲筛選的化學類似物係較其原始化合物更能影響 p :白功能之化合物。可順序重複這些步驟以鑑別或：造 ®活性更高的化合物。 1,10 鑑別出的其他化 上述本發明方法亦可為習知技藝人士輕易地用來鑑別 可抑制或可誘發黑色素生成過程之化合物。藉由非限制 性實施例’可以本發明篩選方法來鑑別出可5丨起後期内囊 體/溶酶體傳送過程之變化，並因而降低或抑制黑色素生成 和或色素沉著的化合物。這類化合物可作為皮膚美白劑。 在某些實施例中，此篩選方法可用來鑑別出可引起後 期内囊體/溶酶體傳送過程之變化，並因而降低或抑制雾色 素生成和或色素沉著的化合物。這類化合物可作為皮膚美 白劑。細胞内的膽固醇來源有兩處：（1)血漿脂蛋白的胞飲 作用（endocytosis of Plasma npoprotein)，其係含自由態及 S旨化態之膽固醇及三酸甘油脂；及（2)内質網（ER)上之内生 性膽固醇合成。胞飲之膽固醇及内生性合成之膽固醇兩種 均在細胞内傳送，且最終被分送至各胞膜上，以膽固醇酯 之形式儲存於油脂顆粒中，或運送出細胞到血漿脂蛋白 上。一般來說，膽固醇的傳送涉及血漿脂蛋白的胞飲作 用，該血漿脂蛋白係被傳送至晚期之内囊體/溶酶體以水解 該膽固醇酯並將後續生成的自由態膽固醇從晚期之内囊體/ 溶酶體傳送至ER或胞漿膜上（piasrna membrane，PM)。從 ER，膽固醇可被傳送至反式-高基氏體網（TGN)，並自反 式"高基氏體網被傳送至胞漿膜上。膽固醇也可自胞漿膜上 -70- 1235659 五、發明說明（6〇 移送回 ER (LiScum α/, (1 999)扪“Μ所扔叩 1438:19-37)。雖然目前對涉及後期内囊體/溶酶體傳送過 程之機制尚不清楚，但已明確知道至少一種蛋白質是與此 相關的。已知缺陷式尼曼匹克第C1型蛋白質（Defective Niemann Pick Type Cl，Npci)可移動膽固醇至 Μ 或 ， 將自由態的膽固醇陷在溶酶體或一膽固醇儲存空間中（Cruz e’ α/·，（2000) J. Boil. Chem. 275:401 3-21)。 本發明的篩選方法可用來鑑別出可引起後期内囊體/溶 酶體傳送過程之變化，在某些情況下，並影響後期内囊體/ 溶酶體膽固醇傳送過程之變化。 2 可抑制或誘發黑0之化合物 2Λ抑^制 '增加羞ρ蛋白功能的化厶物 可依據本發明進行篩選的化合物包括但不限於那些能 進入細胞並影響ρ蛋白活性之有機小分子。許多化合物資 料庫係來自商業公司’例如Pharmac〇peia (princent〇n， N.J·)、Arqule (Medford，ΜΑ)、Enzymed (Iowa City，ΙΑ)、 Sigma-Aldrich (St. Louis，MO)、Maybridge (Trevillett， United Kingdom)、Trega (San Diego，CA)、及 PanLabs (Bothell，WA)等。可從已知化合物資料庫（包括天然物或合 成物）以及生物活性物質（包括蛋白質）進行篩選，尋找可 影響或模擬P蛋白功能之化合物。 可用於本發明方法之一類較佳化合物包含丙味4之化 學類似物。如上述，丙咪嗪可抑制ρ蛋白功能。丙咪嗪為 71- 1235659 五、發明說明（69) 一種三環的三級胺，用於治療憂鬱。參見Gilman，A.G. d al.，eds. 1990 Goodman and Gilman: The Pharmacological Basis of Therapeutics, English Edition，405-14，Pergamon Press，New York。其他可用來治療憂鬱之三環的三級胺為 諸如胺去甲替林（amitriptyline)、三丙口米療、或多慮平 (Sigma，St· Louis MO)這類的化合物，其係可用於本篩選 方法中，來篩選可影響P蛋白功能的化合物。治療憂鬱之 二級胺為諸如脫丙咪嗓（desipramine)、去甲替林、丙去甲 替林、氣慮平 （amoxapine)、 或麥普替林 (maprotiline)(Sigma，St· Louis MO)這類的化合物，參見本 發明篩選方法之較佳化合物。這些丙咪嗪之化學類似物都 與丙ϋ米療一樣具有類似的結構和功能。其他可用於本發明 篩選方法且為較佳化合物之丙咪嗪的化學類似物包括結構 和/或功能與丙咪嗪類似之化學類似物。舉例來說，諸如氣 哌三唑酮（trazodone)、及氟苯氧丙胺（fiuoxetine) (sigma， St· Louis M〇)這類非典型抗憂鬱藥的化合物，與丙咪嗪的 結構並不雷同，但與丙咪嗪同樣具有抗憂鬱之功能，也是 可用於本發明篩選方法之較佳化合物。不具抗憂鬱效果之 一環化物、二級胺、及二級胺，亦為可用於本發明篩選方 法之較佳化合物。 另一類可用來抑制P蛋白功能的化合物是p蛋白編碼 基因之反義核苷酸。P蛋白編碼基因之反義核苷酸在此係 指一寡核苷酸或聚核苷酸分子，其係具有一基於某種程度 序列互補性而此與P蛋白編碼r N A (較好是m R N A)之一 -72- 1235659 五、發明說明（70) 部分序列雜合之核芽酸序列。此 mRNA之任一編@ & 義核苷酸應與P I & 任編碼和/或非編碼區序列万姑 與P蛋白
蛋白合成量來達成抑制p蛋白功能的目的。，以藉由降低P 本發明之反義核苷酸可以是寡核芬酸 或單股之RNA或DNA、或其之改良^以是雙股 直接施用至一細胞、或— 3 1似物，其係可 異源基因而由胞内自行合成。 錄所引入之 在-實施例中’本發明係關於抑制一 中p蛋白核芽酸序列之表現的方 ：真核細胞 七从瓦 丹主夕包含提供纟田朐 -有效量之組合物，該組合物至少包含一本發 、、 產生Ρ蛋白之基因的反義核贫酸序列。 之可編碼 本發明之可編碼產生ρ蛋白之基因的反義核*酸序列 長度至少有六個核芬酸，且較佳是—介於約6個寡核安酸 至約50個寡核苷酸之個寡核苷酸。在一明確的態樣中， 該寡核苷酸是至少約1〇個寡核苷酸，至少約〗5個寡核苷 酸，至少約100個寡核苷酸，或至少為約2〇〇個寡核苷酸 之長度。該寡核苷酸可以是一 DNA或一 RNA，或其嵌合 物或竹生物’及其之改良物，並可以是單股或雙股。該寡 核苷酸的鹼基、糖基、或磷酸骨架可被加以改良。該寡核 苷酸可包含其他附屬基團，例如胜肽、或可促進傳送過細 胞膜之物質（參見 Letsinger et al.，1989，尸rw. iVa". dead. Sci. (USA) 8 6:6553-6556; Lemaitre et al.? 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:648-652; PCT Published No. WO 8 8/098 1 0, published December 15，1 988)、雜合誘發切斷劑 -73- 1235659 五、發明說明（η) (參見，Krol et al·，1988，6:958-976)或搬入 劑（參見 Zon，1988, 尸/zarm. 5:539-549)。在本發明一 較佳態樣中，一可編碼產生P蛋白之基因的反義核苷酸序 列乃是一單股的DNA分子。 該寡核苷酸之任一位置均可以習知的取代基加以修 飾。該可編碼產生P蛋白之基因的反義寡核苷酸序列可至 少包含一已修飾的鹼基，其係選自一包含但不 於下列物 質所組成的族群：5 -氟尿嘧啶、5 -溴尿嘧啶、* 、氮尿癌
咬、碟尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯胎 呢嘧啶、5- (羧經甲基）尿嘧啶、5-羧曱氨甲基-2_硫代尿嘧变 子乂皆、5 - 羧曱氰曱基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-Ε)_半乳糖 ^ ^核苷（β- D-galatosylqueosine)、肌苷、Ν6-異戊烯基腺苷、1 嘌吟、1 -曱基肌苷、2，2 -二曱基鳥嘌吟、2 _甲基腺苷 、、、 基鳥嗓吟' 3 -曱基胞嘧啶、5 -曱基胞嘧啶、Ν6、賒# 甲 跟咩、7-甲 基鳥嘌呤、5 -甲基氨甲基尿喊唆、5 -曱氧基氨甲 基、2 -炉抑 尿嘧啶、β-D-甘露糖Q核苷、5Ν-甲氧羧曱基尿、；，L n 甲氧尿嘧啶、2-曱基硫-N6-異戊烯基腺苷、尿嘧啶疋一 5
酸（V)、外布脫辛（Wybut〇xosine)、假尿嘴咬、 _氧乙 W核爷：、9 硫代胞嘧啶、5-曱基-2-硫代胞嘧啶、硫代尿嘧心 代尿嘧啶、5·曱基尿嘧啶、尿嘧啶氧乙酸曱龍疋、4_硫 啶-5-氧乙酸（v)、5-曱基-2-硫代尿嘧啶、3 >曰、尿嘧 鐵* ** 3 - N 9 雜 丙基）尿嘧啶、（acp3)w、及2,6-二氨嘌呤。 …後 在另一實施例中，該寡核苷酸包含至少一芒 基，其係選自包括但不限於下列物質所組 :良之糖 、拜中··阿 -74- 1235659 五、發明說明（72) 拉伯糖、2 -氟阿拉伯糖、木酮糖、及已糖。在另一實施例 中，該寡核¥酸包含至少一改良之磷酸骨架組成，其係選 自由下列物質所組成之族群中：硫代磷酸酯、二礙代碟酸 醋' 硫代磷酸氨酯、硫代磷酸醯胺酯、硫代磷酸二醯胺 酯、磷酸甲酯、磷酸三烷酯、及甲縮醛或其之類似物。在 另一實施例中’該寡核苷酸是一 α-異頭寡核苷酸（α_ anomeric oligonucleotide)。α-異頭寡核苷酸與互補的RNA 形成一明確的雙股雜合體，與一般常見卜單元不同的是， 該雙股係彼此平行（Gautier W α/.，1 987 dcz.A hi 15:6625-6641) 〇 寡核苷酸可與諸如胜肽、雜合誘發的交聯劑、傳送 劑、雜合誘發的切斷劑之類的分子形成共輛。 本發明之募核苷酸可以習知的標準方法進行合成，例 如藉由自動化DNA合成儀（例如 Bioresearch、Applied Biosystems等公司所販售的）。舉例來說，硫代磷酸酯寡核 苷酸可以Stein等人的方法進行製備（Stein W α/.，1 988, 1 6:3209)，而磷酸甲酯寡核苷酸可以 Sarin 等人的方法進行製備（Sarin ei α/.，1 988，尸roc. Acad. Sci. (USA) 85:7448-745 1)。 在一明確實施例中，P蛋白反義募核苷酸包含催化性 RNA，或一核糖酶（參見1 990年10月4日公告之PCT國 際申請案 W0 90/1 1364 ; Sarver W α/·，1990，Science 247:1222-1225)。在另一實施例中，該寡核苷酸是2’-0-甲 基核糖核苷酸（Inoue W α/·，1987 jcz·心 15:6131- -75- 1235659 五、發明說明（73) 6148)或一嵌合之RNA-DNA類似物（InoUeeία/，1987 F2 1 5:327-330)。
在另一實施例中，本發明可編碼產生P蛋白之基因的 反義核苷酸係藉由轉錄一異源性基因序列而由細胞内自我 合成。舉例來說’將一載體引入活體内使細胞吸入該載 體，在該細胞内轉錄該載體或蛋白質，產生一本發明之反 義核苷酸（RNA)。這類載體内含有一可編碼產生p蛋白基 因之反義核苷酸的序列。只要此載體能轉錄出欲求的反義 RNA，則此載體可保持游離基因組或被整合至宿主的染色 體中。可藉由習知標準的重組DNA技術來製備此類載 體。該載體可以疋質粒、病毒載體、或其他習知用於補乳 動物細胞之複製及表現的載體。可編碼產生p蛋白之基因 的反義核苗酸序列之表現可以任何習知可於此類細胞中作 用的啟動子進行調控。這類啟動子可以是誘發式（inducible) 的或組成型式的（constitutive)，但不限於已在此所述的方 法進行誘發。
本發明之反義核皆酸包含一序列，其係能與至少部分P 蛋白基因（較佳是一人類P蛋白基因）之RNA轉錄物互補。 雖然較好是具有絕對互補性，但並非必要，只要該反義核 苷酸具有足夠的互補性，能與RNA雜合，形成一安定的 雙股螺旋即可。若是一雙股之可編碼產生p蛋白之基因的 反義核苷酸序列，可測試雙股DNA中的一股，或是亦可 分析所形成的三股螺旋。雜合的能力視該反義核苷酸的互 補性及其長度而定。一搬來說，雜合之核苷酸愈長，其愈 -76- 1235659 五、發明說明（74) 可能含有更多與p蛋白基因RNA不相符的驗基對’然仍 能形成一安定的雙股螺旋（或三股螺旋，視情況而定）。習 知技藝人士可以標準程序（例如’決定該雜合複合體之熔點） 來決定其對不相符鹼基對的容忍度。 能提高或模擬p蛋白功能的化合物包括貝非黴素A1 (bafiolmycin A1)及豆球徽素 A(concanamycin A)。貝非徽 素及豆球黴素係分離自鏈黴菌屬之罕見的抗生素（Drose，S. α/·，（1997) /·五λ:5b/. 200:1-8)，已知這些化合物在微 莫耳濃度（Bowman, E.J. d α/·，（1 988) iVoc. SCZ·. (17 3八）85:7972-6)下即具有可抑制液泡八丁？酶（¥-八丁？&868) 的活性。此外，貝非黴素A1及豆球黴素A、B在微莫耳 >辰度（Sharom，F.J· ei β/·，（1995) «/. 308:381-90) 下即具有可抑制p-糖蛋白ATP酶的活性。在毫微濃度下 (nanomolar)，貝非黴素A1及豆球黴素A可活化某些可表 現酪氨酸酶之真黑色素細胞中之黑色素生成過程（Ancans， J· e’ α/·，（2000)只五似 478:57-60)。 本發明提供了可於黑素_p黑色素細胞中活化黑色素生 成過程之化合物及其類似物。貝非黴素A1及豆球黴素A 可如刖述刀離自鏈黴菌屬或可購自公司（Sigma，st Louis, MO) 〇 2,2 酶體傳送過程之化合物 本發月方法進行篩選之化合物包括但不限於那些能 進入細胞並改變或抑制後期内囊體/溶酶體傳送過程之變化 、有機i刀子。可使用商業公司所提供的許多化合物資料 -77- 1235659 五 ’例如 Pharmacopeia (Princenton, N. J.) Arqule (Medford, MA) > Enzymed (Iowa City, IA) ^ Sigma- Aldrich (St. Louis，MO)、Maybridge (Trevillett，United
Kingdom)、Trega (San Diego，CA)、及 PanLabs (Bothell， WA)等。可從已知化合物資料庫（包括天然物或合成物）以 及生物活性物質（包括蛋白質）進行篩選，尋找可改變或抑 制後期内囊體/溶酶體傳送過程之變化的化合物。 後期内囊體/溶酶體傳送過程之變化可藉由讓黑色素細 胞與一諸如黃體酮、一脂溶性胺、神經鞘氨醇、一後期内 囊體/溶酶體傳送蛋白質之頡抗劑或以下式⑴之化合物來 達成
r4 r2 r5
(I)
其中X是0或S;在一較佳實施例中，x是0。
Ri S-C^OKCrCe)烷基或-(CHA-O-d-Cd烷基、或_ (CH2)n-NR7R8，其中n是〇-3，其中每一 R7及r8係分別選 自Η及（C1 -C6)烧基。較佳是，每一 R7及Rs係分別選自· qOKCVCO烷基、或烷基）2。更佳是，每 一 R7 及 R8 係分別選自-C(0)CH3、-CH2-〇-CH3、或 _ (CH2)2-N(CH3)2 〇 -78- 1235659 五、發明說明（π) R2是Η或（CVC6)炫基；在某些實施例中，R2是（Ci-Cy 烷基；在一較佳實施例中，R2是-CH3。 R3是Η或（CVC6)烷基；在某些實施例中，R3是（CVcy 烷基；在一較佳實施例中，R3是-CH3。 R4是-qOKCi-Cd烷基。較佳是，R4是-CCOKCpCO燒 基。更佳是，r4 是-C(0)CH3 或-C(0)CH2CH3。 R5是Η或（CVC6)烷基；較佳是，115是η或CH3;在另 一實施例中，R4及R5 —起形成=〇 〇 R6 疋 Η 或-(Ci-C6)烧基或- (CH2)n_NR9Ri〇，其中每一 r9 及R10係分別選自Η及（CrC6)烷基。較佳是，r6是Η或-CH3、或-CH2CH3或-CH2NH2。在另一實施例中，r5及R6 與其個別相接的碳原子一起形成一 C5_c8的碳環，且較佳 是一 C6的碳環，其可被1至3個選自_素、〇H、·（CpQ〕 烷基、-(Ci-Cj)烷氧基、氨基、=〇、烷基氨基、 二-((Ci-C6)烷基）氨基）、三氟甲基、或_〇ci^之取代基所 取代，該取代基可取代碳環上任一可進行取代的位置上。 「烷基㈣川」一詞，除非另做說明，否則在此係包4 具直鍵、支鏈或環形基團或其之組合之飽和單價碳氫自〗 基。在該烧基上之任-取代基或官能基，可取代於此烧』 之任一位置上。 「鹵（halo)」一詞，除非另做說明 氯、氟、溴及碘之鹵素。 式I化合物可包含不對偁中心，因 物及鏡像異構物型式存在 ’否則在此係指包括 此可以不同立體異構 本發明係關於式I化合物之所
-79- 1235659 五、發明說明（77 有光學異構物、立體異構物及互變 雙吳構物，其之混合物， 及所有包含或使用到式I化合物 物之樂學組合物及治療方 法。 式I ’如上疋義’亦包括盘卜；ΛΙ. Lit J L ^興上述結構相同，但其中一或 多個氫原子、石反原子或其他原子係 丁你被其同位素所取代之化 合物。這類化合物可能齎姓入q政 此對、、、口 口 5式驗中代謝藥學動力研究或 分析工具非常有用。
本發明也係關於前述任__V' T /L A J 式I化合物之藥學上可接受的 酸加成物及驗鹽。酸係用爽劊供义 又货、用來I備則述本發明鹼性化合物之 藥學上可接受的酸加成物， 八係為來自無毒之酸加成鹽 類，即含有樂學上可接受之降_ 获又之陰離子的鹽類，例如氯化氫、 溴化氫、破化氫、硝酸雎、放 月暇鹽硫酸鹽、雙硫酸鹽、磷酸鹽、 酸性磷酸鹽、醋酸鹽、别舱絲 ^ 礼酸鹽、檸檬酸鹽、酸性檸檬酸 鹽、酒石酸鹽、二酒石酸鹽、 號珀酸鹽、順-丁烯二酸鹽、 反-丁烯二酸鹽、葡g铋缺碰 糖、醣酸鹽、苯曱酸鹽、甲苯磺 酸鹽、乙苯磺酸鹽、對-甲贫戍故邮 只西文孤、及香矛醋（pamoate， 亦即1，1_次甲基·雙1 & Μ技基_3·奈甲酸酯） 依據本發明有用的蛤人 驗&化合物，可與各種有機酸或無 機酸形成一廣泛的不同豳糕 Π鹽類。雖然這類鹽類必須是藥學上
可接受的或可施用至勤你辨L 動物體上’但較好是分離之初係以藥 學上不可接受的鹽類形★左— I式存在，後來才以鹼性試劑將其由 自由態的鹼轉變成藥學上可接受的酸加成鹽。本發明鹼活 性化合物之此酸加成鹽可藉由與溶於適當溶劑（例如曱醇或 乙醇）之等當量的礦物酸或有機酸接觸而輕易地製備出來。 -80- 1235659 五、發明說明（7〇 在小心地將溶劑揮發後，即可得欲求的化合物。 依據本發明有用的酸性化合物，可與各種藥學上可接 受的陽離子形成一鹼性鹽類。這類鹽類的例子包括鹼金屬 鹽或鹼土金屬鹽，且特別是鈉鹽及鉀鹽。這些鹽類可由傳 統方法製備。作為試劑來製備本發明之藥學上可接受的鹼 鹽的化學驗是那些可與酸性式Γ化合物形成無毒驗鹽之化 學鹼。這類無毒化學鹼鹽包括那些衍生自諸如鈉、鉀、 鈣、及鎂等之藥學上可接受的陽離子。這些_可 含欲求之藥學上可接受的陽離子之溶液來處;其相對的酸 性化合物而輕易地製備出來，將所得溶液揮發至乾，較好 是在減壓了，即可得欲求的化合物。或者，可將酸性化合 物之低碳數的烷醇溶液與欲求之烷氧鹼金屬混合，如上= 將所得溶液揮發至乾，即可得欲求的化合物。無論是哪一 種情況’較好式使用等化學當量的試劑以確保完全反應及 欲求化合物得最佳產率。 揭不之通式1化合物可依W0 00/58549、及美國專利第 5’232’917、3,21()，3 86、3 389 G51、2 794 8 1 5 等文獻之揭 示内容進行製備。 康本發明有用的化合物及其藥學上可接受的鹽類可 用來治療人1員色素丨冗著異常，包括曬斑及一般的雀斑（包含 年齡斑及肝破、 )、黑變病/褐斑及發炎後低色素沉著。這翻 化合物可蕤士心A m 積由抑制黑色素的製造來降低皮膚黑色素量，益 論該黑色素的匍 …、 的灰造係組成性的或是因受UV照射所誘發 (例如日曬引如、 、 ^趣）。因此，用於本發明中之某些活性化合物 -81- 1235659 五、發明說明（π 可用來降低非-病理性狀態下的皮膚黑色素量，以誘發使用 者欲求之-較淺色的皮膚色調，或防止已受uv照射處所 誘發的黑色素沉積。其也可和皮膚脫皮劑(包括葡萄糖酸或 三氣醋酸臉部脫皮劑）合用，以降低皮膚色調並防止皮膚色 素再沉著。依據本發明之其他有用的化合物及其藥學上可 接受的鹽類，係可治療皮膚色素製造不足或使用者單純化 妝上的理由希望擁有一 「無日曬痕跡的顏色（suniess tan)」〇 適當的劑量療程，每一施用劑量，及兩活性成分施用 間之明確間隔，將視所使用之特定活性成分、患者的皮膚 狀況、病情或欲治療之病況的特性及嚴重程度而定。較佳 是’該活性成分的施用量及間隔係可使欲治療的病況獲得 改善或治瘡。 對降低皮膚顏色而言，本發明所使用的活性化合物亦 可與防曬劑（UVA或UVB阻斷劑）合用，以防止皮膚色素 再沉著，並保護皮膚不致因日曬或UV之誘發而變黑，或 提高皮膚降低皮膚黑色素及漂白皮膚的能力。對降低皮膚 顏色而言，本發明所使用的活性化合物也可與視黃酸或其 衍生物或任一可和視黃酸受體反應之化合物合併使用，以 加速或促進本發明降低皮膚黑色素的能力及皮膚漂白的能 力，或提高本發明防止皮膚黑色素沉積的能力。對降低皮 膚顏色而言’本發明所使用的活性化合物可與4 _經基茴香 醚合用。對降低皮膚顏色而言，本發明所使用的活性化合 物亦可與抗壞血酸、其衍生物及以抗壞血酸為底所製成的 -82- 1235659
五、發明說明（8(〇 產物（例如，抗壞血酸鎂）或其他可加速或促進降低皮膚黑 色素沉著能力及漂白皮膚能力之具抗氧化物機制(如，保留 醇（resveratrol))之產物一起始用。 可用來改變膽固醇之後期内囊體/溶酶體傳送過程變化 之化合物的非限制性實施例包括U1 8666A(式νπι化合物） 及其衍生物（即，式Π_νι)，無論是單獨施用或合併施用。 U1 8666A衍生物之有用的例子包括cP-598755-〇1 (式m)、 CP-352369(式 II)、UK-2〇4〇39(式 v)、UK 2〇4〇41(式 VI)、及UK-204042(式VII)。在此所示之通式j係衍生自 U1 8666A及其衍生物（參見第16圖）。 黃體鲷是另一種可用於本發明方法及組合物中以降低 黑色素的製造及降低皮膚色素沉著的有用化合物。黃體酮 可獲自許多來源，例如Sigma公司（St. Louis，M0)。 或者可使用一脂溶性胺於本發明方法及組合物中。 「脂溶性胺（hydrophobic amine)」一詞係指一化合物，其 係具有包含一脂溶性環結構及一内含陽離子胺官能基之脂 溶性支鏈的脂溶性結構。較佳的脂溶性胺包含啡噻啉及一 種三環的抗憂鬱藥。特定較佳之脂溶性胺係擇自三氟拉嗪 (trifluoperazine)、氣丙嗪（chlorpromazine)、丙氣拉嗪 (prochlorperazine)、三氟丙嗪（triflupromazine)、丙嗪 (promazine)、 硫 達 漆(thioridazine)、 中 達 4 (mesoridaine)、旅乙醯療（piperacetazine)、羥旅氯丙》# (perphenazine)、氟略氯丙嗪（fluphenazine)、乙醯旅氯丙 嗓（acetophenazine)、及碰代乙基拉嗓（thiethylperazine) -83- 1235659 五、發明說明（si) (Sigma，St. Louis，MO)。三環的抗憂鬱藥為可用於本發明 方法及組合物之其他較佳的脂溶性胺。特定較佳之三環的 抗憂鬱藥係選自丙咪嗓、去甲替林（nortriptyline)、丙去甲 替林（protriptyline)、三丙 口米療（trimipramine)、及多廣平 (doxepin) (Sigma，St· Louis，M0)。 可用於本發明方法及組合物之其他化合物是神經鞘氨 醇，其係可構自諸如Sigma之類的商業公司（St. L〇uis5 M0)。 後期内囊體/溶酶體傳送蛋白質頡抗劑可用於本發明方 法及組合物中，以降低黑色素製造量或降低皮膚色素沉 著。「後期内囊體/溶酶體傳送蛋白質頡抗劑（Antagonist of a late endosomal/lysosomal trafficking protein)」一詞係 指一藥劑，其係可干擾或降低直接或間接涉及膽固醇之後 期内囊體/溶酶體傳送蛋白質活性並導致此傳送過程之變 化。該可影響後期内囊體/溶酶體傳送試劑之非限制性實施 例可以是有機小分子或一蛋白質或一多醣等。 該可影響後期内囊體/溶酶體傳送之頡抗劑可以是一蛋 白質，例如，一抗體，其係可完全結合至一傳送蛋白質、 脂蛋白、及糖蛋白等（參見Kobayashi et al.，（1999) Nature Cell Biol. 1:113-116，其係揭露一可明確結合磷脂溶二磷 脂酸作為膽固醇傳送之頡抗劑）。 製造一抗抗原決定表未知專一性抗體的方法乃是習知 的，參見 Current Protocols in Immunology, Coligan et al·, eds. (2000) John Wiley & Sons, New York, N.Y., and in
-84- ，丨 1235659 五、發明說明（8〇 Harlow & Lane，Antibodies: A Laboratory Manual (1 988) Cold Spring Harbor Press，cold Spring Harbor, N.Y. 本發明也提供可降低黑色素製造量或降低皮膚色素沉 著之下列化合物：
其中 X及基團的定義如上述。在一較佳實施例 中，明確的式I化合物包括下列：
(II)
-85- 1235659
-86- 1235659 五、發明說明（84)
(VII) 及
(VIII) 及其藥學上可接受的鹽類或溶合物 2.3 合理的藥物設計 經由本發明方法所鑑別出來的化合物，可作為用來設 -87- 1235659 五、發明說明（85) 計其之更有效化學類似物之分子模型的技術基礎。舉例來 δ兒’丙咪嗪，或任一上述之其他較佳化合物，可以這些或 其他模型技術來創造。分子模型系統的例子有CHARM (Polygen corporation， Waltham， MA)及 QUANTA (Molecuiar simulations Inc· San Diego，CA)程式。CHARM 程式可執行能量最低化及分子動力學功能。QUANTA則容 許互動式的建構、改良、辨識，及分析每一分子的行為乂 舉例來說，一旦可影響和/或模擬p蛋白功能和/或改變 或抑制後期内囊體/溶酶體傳送過程的化合物被鑑別出來 後’可以該化合物來建構一理論或假說。這類理論可以諸 如规特斯程式（Catalyst Program)(Molecular Simulations Ine·，San Diego，CA)來產生本發明所使用之任一較佳化合 物。此外’凱特斯程式可使用該理論來研究或搜尋已有的 負料庫’諸如劍橋小分子資料庫（Cambridge，England)，及 其他資料庫或化學數據庫，亦即上述之資料庫，以鑑別本 發明之其他化合物。本發明化合物可進一步以諸如！^以、11^81^11、（：2-Minimizer and Affinity (Molecular Simulations Inc.5 San Diego，CA)之類的套裝模型系統進行設計。一較佳的套裝 模型系統 MacroModel(Columbia University，New York， NY卜 本發明化合物可進一步當作研發合理組合資料庫之基 礎。也可篩選這類資料庫來鑑別更有效的化合物。組合資 料庫的性質視以下各種因素而定：自本發明化合物中挑選 -88- 1235659 五、發明說明（86) 出來作為該資料庫基礎之特定化合物的性質、以樹脂合成 資料庫的慾望。本發明化合物可提供一適合諸如C2_ QSAR(Moleculai: Simulations Inc.，San Diego，CA)這類組 合設計程式使用的資料。 3 抑制或誘發黑色素生成的方法 3.1羞提高或模擬p蛋_允功制黑色素生成的 可影響或模擬P蛋白功能的化合物可用來治療患有因 黑色素製造或黑色素過量所引起的疾病、狀況或異常之動 物，較佳是人類。這類疾病、狀況或異常包括那些特徵為 皮膚或毛髮褪色的疾病，例如色素沉著不足；因發炎或疾 病所引起的疾病，例如黑皮病、或褐斑（如caf0 au iaitA macules)。或者，一個體可能想使其毛髮或皮膚顏色變 淺。可提高或模擬P蛋白功能的化合物可用來治療患有因 黑色素製造不足所引起的疾病、狀況或異常之動物，較佳 是人類’例如發炎後的色素沉著不足、白慷疹（pityriasis alba)及某些型式的白化症，如〇cA II型白化症。此外， 這類化合物也可用來加深個體之毛髮或皮膚顏色。在此應 用目的下，名詞「治療（treatment)」、「藥學用途 (therapeutic uses)」、或「醫藥用途（medicinal uses)」係 指本發明組合物之任一或其全部用途，其係可治療一疾病 狀態或一或多種症狀，或防止、阻礙、延緩、或逆轉疾病 的演進或一或多種其他不欲求的症狀。 3,2 i^ilAji内嚢體/溶酶體傳送過程來抑制黑 -89- 1235659 五、發明說明（87) 色素生成的方法_ 本發明更提供抑制皮膚色素沉著的方法及藥學組合物， 其係包含使用可改良後期内囊體/溶酶體傳送過程之藥劑。 些方法及藥學組合物對降低和/或抑制黑色素製造非常有 用’因此也對降低皮膚色素沉著非常有用。這些藥劑可單 獨使用，彼此合用，或與其他可抑制色素沉著的藥劑合併 使用。藉由非限制性實施例，可抑制色素沉著的其他藥劑 包括諸如酪氨酸酶抑制劑之類的藥劑。較佳是，本發明方 法及樂學組合物係用於脊驗動物上，更佳是，用於喝乳動 物上，最佳是用於人類上。 已知有許多藥劑可抑制後期内囊體/溶酶體之傳送過 程。諸如U1 8666A、黃體酮、及神經鞘氨醇這類的脂溶性 胺可抑制膽固醇從PM被移送至ER的過程，抑制其從内 囊體/溶酶體被傳送至ER的過程，及從晚期之内囊體/溶酶 體傳送至PM上的過程（Liscum a/.，¢1 999)扪w/ni 扪叩/jci 1 438··19-37)。這些藥劑可作為缺陷式尼曼匹 克第C1型蛋白質的藥學模型（Lange ei α/·5 (1 998) J. Chem. 273:1 891 5-22; Roff et al(1991) Dev. Neurosci. 13:315-19)。NPCI蛋白質本身的傳送即會受到U18666A的 影響，將蛋白質自晚期的内囊體傳送至反式-高基氏體網 (TGN)及溶酶體（Higgins a/.，Mo/. 68:1- 13)。已知U18666A可改變CD63/lamp3蛋白質之傳送，一 般來說CD63/lamp3係與多液泡-多層内囊體晚期之内膜及 一般只和反式-高基氏體網相連之IGF2/MPR蛋白質彼此相 -90- 1235659 五、發明說明（μ) 連（Kobayashi α/，（2〇〇〇) 別0/ Ce//· 1 1:1 829-43; K〇bayaShi α/·，（1999) Ce// /. 1:113-118)。至於 這些藥劑如何改變後期内嚢體/溶酶體之傳送過程的機制， 目前仍不清楚。 本發明係利用抑制後期内囊體/溶酶體之傳送過程導致黑 色素細胞降低黑色素生成量這點進行研發的。因此，本發 明之_態、樣係提供一種降低黑色素細胞之黑色素生成量的 方法’該方法包含讓黑色素細胞與一藥學有效量之可影響 黑色素細胞後期内囊體/溶酶體傳送過程之化合物接觸的步 驟。其對後期内囊體/溶酶體傳送過程之改變可降低黑色素 細胞之黑色素生成量。 約（ab〇ut)」一柯在此係指大約（approximately)、粗略 地（roughly)、附近（ar〇und)或在某個範圍内（in the regi〇n 〇f)。當「約」字與一數目字合併使用時，係表示所指範圍 匕5該數目子以上或以下的範圍。一般來說，「約」字在 此係指所示數目以上或以下約2〇%的範圍。 降低黑色素製造（decrease in melanin production)」一 詞係指當黑色素細胞被暴露於可改變後期内囊體/溶酶體傳 达過程之化合物下後，相較於未經該化合物處理之控制組 、田胞而5 ，由該黑色素所重新合成之黑色素的降低量 (lowering 〇f the amount of meianin)為一可測得的值。「降 低（lowering)」一詞較佳係指重新合成之黑色素的降低量介 於約至約1〇〇%間；更佳係指重新合成之黑色素的降低 量介於約20%至約100%間；最佳係指重新合成之黑色素的 -91- 1235659 五、發明說明（89) 降低量介於約50%至約100%間。 「後期内囊體/溶酶體傳送過程（late endosomal/lysomal trafficking )」一詞係指蛋白質、脂肪、或其他化合物在不 同的細胞内結構中移動。這些位置包括這些化合物從後期 内囊體移動到溶酶體、或從溶酶體移動到後期内囊體、從 後期内囊體或溶酶體移動到反式高基氏體網、及從反式高 基氏體網移動到後期内囊體或溶酶體的過程。 後期内囊體/溶酶體傳送過程之改變可藉由讓黑色素細胞 與諸如黃體酮、脂溶性胺、神經鞘氨醇、一後期内囊體/溶 酶體傳送過程之頡抗劑、或任一如上定義之式⑴至式（νιπ) 的化合物接觸來啟動。 揭示之通式I化合物可依WO 00/58549、及美國專利第 5’23 2’917、3,21〇,3 86、3,3 89,05 1、2,794,815 等文獻之揭示 内容進行製備。 習知技藝人士在看了本發明揭露内容後也會知道，本發 月方法可單獨使用或與其他方法合用。再者，本發明方法 匕s已知會影響黑色素合成之化合物（例如，酪氨酸酶抑 制劑）的其他用途。這類抑制劑係習知的，且包含間-苯二酚 之各種衍生物、氫醌、麯酸（kojic acid)、黑色胺、及各種 植物萃出物。 因此’本發明係關於調控皮膚色素的方法，其中依照本 發明揭示之活性化合物、或其藥學上可接受的鹽類、及一 或夕種上述之其他活性物質，係一同被施用或作為同一藥 學組成物之部分而被分別以適當劑量施用，以獲得合併施 -92- 1235659
五、發明說明（9〇 ) :之好處。該適當的療程、# 一施用劑量、及每一施用劑 量之時間間隔，將視所用活性物質之組合、欲治療患者之 狀況、病情的嚴重性與否而冑。一般來說，開始時先施用 匕該化口物最佳劑量更低的劑量。之後，卩少量地漸漸提 高劑量直到到達最佳劑量為止。經FDa核准可施用於人類 患者身上的各活性物質之劑量已係公知的。 舉例來說’任一根據本發明降低皮膚顏色之方法而使用 的化合物’可與任一習知或未來可能發展出之酪氨酸酶抑 制劑或其他皮膚美白劑一起使用，包括任一已揭示於下列 專利案之化合物：1981年7月14日授與Nagai等人之美國 專利第4,278,656號；1 983年1月18日授與Nagai等人之 美國專利第4,369，174號；1 990年9月25日授與Torihara 等人之美國專利第4,959,393號；1996年12月3曰授與 Fukuda等人之美國專利第5,580,549號；2000年9月26曰 授與Jones等人之美國專利第6,123,959號；2000年10月 17日授與Hu等人之美國專利第6,132,740號；2000年12 月12日授與Tulop等人之美國專利第6，159,482號；1999 年7月1日公告之L，0real公司之W0 99/32077號專利； 1999年12月16日公告之Fytokem Prod. Inc.公司之W0 99/64025號專利；2000年9月28日公告之Pfizer Inc·公司 之W0 00/56702號專利；2000年12月12日公告之Shisedo Co. Ltd.公司之W0 00/76473號專利；2000年5月3日公告 之L’Oreal公司之EP 997140號專利；1993年8月31日公 告之 Kunimasa Tomoji 公司之 JP 5221 846 號專利 ’ 1 995 年 -93- 1235659 五、發明說明（w) 9月19日公告之Shisedo Co. Ltd.公司之JP 7242687號專 利；1 995年12月12日公告之Itogawa Η之JP 7324023號 專利；1996年1月16日公告之Shisedo Co· Ltd.公司之JP 8012552 號專利；1996 年 1 月 16 日公告之 Shisedo Co· Ltd. 公司之 JP 801 2554號專利；1 996年 1月 16日公告之 Shisedo Co. Ltd·公司之 JP 80 1 2557 號專利；1 996 年 1 月 16 日公告之Shisedo Co· Ltd.公司之JP 8012560號專利；1996 年1月16日公告之Shisedo Co. Ltd.公司之JP 8012561號 專利；1 996年 5月 28日公告之 Fujisawa公司之 JP 8134090號專利；1996年7月2日公告之Kirinjo KK公司 之JP 8168378號專利；1996年10月22曰公告之Kirinjo KK公司之JP 8277225號專利；1997年1月7日公告之 Sanki Shoji KK 公司之 JP 9002967 號專利；1997 年 11 月 18日公告之Yagi Akira公司之JP 9295927號專利；1998年 3月17日公告之Kansai Kouso公司之JP 10072330號專 利；1998年3月31日公告之Kamiyama KK公司之JP 1 008 1626號專利；1998年4月21日公告之Kansai Kouso 公司之JP 1 0 1 0 1 543號專利；1 999年3月16日公告之 Maruzen Pharm 公司之 JP 1 107123 1 號專利；1999 年 3 月 23日公告之Kyodo Nyugyo公司之JP 1 1 〇79934號專利； 1999年 9月14日公告之Shisedo Co· Ltd.公司之 JP 1 1 246347號專利；1 999年9月14日公告之Shised0 Co· Ltd·公司之JP 1 1246344號專利；2000年3月21日公告之 Kanebo Ltd·公司之 JP 2000-080023 號專利；2〇〇q 年 4 月 4 -94- 1235659 五、發明說明（92) 日公告之Kose KK公司之JP 2000-095663號專利；2000年 6 月 13 日公告之 Hai Tai Confectionary Co. Ltd.公司之 JP 2000-159681 號專利；2000 年 9 月 12 日公告之 Kanebo Ltd. 公司之JP 2000-247907號專利；1997年1月 7日公告之 Sanki Shoji KK 公司之 JP-9002967 號專利；1995 年 8 月 8 日公告之Nikken Food KK公司之JP-7206753號專利；1993 年12月3日公告之Kunimasa T之JP-5320025號專利；及 1984 年 9 月 6 日公告之 Yakurigaku Chuou KE 之 JP- 591 57009號專利；以上專利之全部内容已參考文獻方式併 入本文中。 依據本發明加深皮膚顏色之方法所用的任一化合物可與 任一習知或將來可能發展出之曬黑劑一起使用，包括任一 已揭示於下列專利案之化合物：1997年1月7日授與 Fuller之美國專利第5,59M23號；1997年5月13曰授與 Fuller之美國專利第5,628,987號；2〇〇〇年4月19曰公告 之L’Oreal公司之EP 993826號專利；1 999年^月^日 公告之 Galderma Res· & Dev.公司之 w〇 99/56740 號專利· 以上專利之全部内容已參考文獻方式併入本文中。 ， 可改變後期内囊體/溶酶體傳送過程之化合物的非限制性 實例包括U1 8666A及其衍生物（即，式π_νιπ 、化合物）， 單獨或合併使用。特定之衍生物已揭 叫不XT、工 貢體酮是另 一種可用於本發明方法及藥學組合物以降低黑色素生 降低皮膚色素沉著之化合物。 3 或者， 本發明方法及藥學組合物也可使用 脂溶性胺 -95- 1235659 五、發明說明（93 ) 「脂溶性胺」一詞在此係指一化合物，其結構係包含一親 油性環及一内含胺陽離子之親水性支鍊。較佳之脂溶性坡 包含啡嘍琳及一種三環的抗憂鬱藥。較佳之啡遷淋包括前 述之三氟拉 (trifluoperazine)、氯丙療（chlorpromazine)、 丙氣拉療（prochlorperazine)、三氟丙♦ (triflupromazine)、 丙嗓（promazine)、硫達嗓（thioridazine)、中達嗓 (mesoridaine)、喊乙酿 4 (piperacetazine)、經旅氣丙嗓 (perphenazine)、氟哌氯丙嗪（fiuphenazine)、乙醯哌氯丙嗓 (acetophenazine)、及硫代乙基拉嗪（thiethylperazine)。三環 的抗憂鬱藥及其他較佳之脂溶性胺係用於本發明方法藥學 組合物中。特別佳之三環的抗憂鬱藥為前述之丙咪嗪、去 甲替林（nortriptyline)、丙去曱替林（pr〇triptyline)、三丙咪 嗪（trimipramine)、及多慮平（d〇xepin)。另一可用於本發明 方法藥學組合物中的化合物為神經鞘氨醇。 本發明之另一態樣為提供一種可降低皮膚色素沉著的方 法。在此方法中，皮膚係與一有效量可影響後期内囊體/溶 酶體傳送過程之變化的化合物接觸，其中後期内囊體/溶酶 體傳送過程之變化可降低皮膚色素沉著。 降低皮膚色素，儿著（reducing skin pigmentati〇n)」一詞 係才曰皮膚中黑色素的降低量達到一可摘測得到的程度，較 佳是因此黑色素合成量的降低之故導致皮膚變白。「降低 (low — )」一詞較佳係指重新合成之黑色素的降低量介於 約1 〇%至約1 〇〇%間，更佳係指重新合成之黑色素的降低量 介於約鳩至約100%間；最佳係指重新合成之黑色素的降 -96- 1235659 五、發明說明（叫） 低量介於約50%至約1〇〇%間。重 較佳係肉π p 成之黑色素的降低® 救住係肉眼即可區別， 裝置即可知。 ”·、累藉助顯微鏡或其他偵測 本發明也提供一降低皮膚色辛 虔膚届邱妓細 皮價已常，儿者的方法，其係藉由讓 之化合物。可用μ欲 《期内囊體/溶酶體傳送過程 前。 一力凌的有用化合物已揭示如 4,__ 途而言’較佳是可影響或模擬P蛋白功能的化 可抑制後期内囊體/溶酶體傳送過程之化合物係為本 發明樂學組合物之—部份。藥學組合物，&含—有效量之 這類化合物於__藥學上可接受的載體中，&藥學組合物可 被施用至-患有—與黑色素製造不^或製造過量相關的疾 病、異常、或狀況之患者、人、或動物身上。 可有效治療一特定疾病、異常、或狀況之該化合物的量 視該特疋疾病、異常、或狀況的情況而定，並可以標準臨 床技術來決定。可能的話，較好是先決定該化合物在欲進 行治療之組織之活體外毒性試驗，之後於人類身上測試並 使用前，最好先決定其於一有用的動物模型系統中的活體 内毒性試驗。 可以任何方式施用可降低或増加黑色素合成之化合物， 使哺乳動物身體與該活性藥劑接觸，並能於該接觸部位作 用。該化合物可以任何傳統可與藥物合用的方式施用，單 -97- 1235659 五、發明說明（％) 獨施用或合併施用。 與一藥學載體合併於用一化合物均可單獨施用，但較佳是 準藥學應用方法來Γ 學載體係視施用途徑、及標 服、注射、直腸：選。*發明之藥學組合物可適於口 用。注射施用包括作較佳疋局部塗抹’並可以單一劑型施 、生鼾^内 不限於皮下注射、靜脈注#、腹膜内 注射、或肌肉注射。β 狀联門 但疋，較佳是局部表面塗抹。 5· 化妝品應用 除了藥學用途外，太各 卜本發明方法也可用於化妝用途上。本 發明方法在化妝上的 的應用匕括表面塗用該内含一或多種可 提高或改變肉眼對古虐七 $皮膚或頭髮之外觀的組合物。皮膚或頭 髮上因黑色素製造、過量或不足所致之不欲求的色素沉著 可以本發明方法進行治療。 6.終點及劑詈 可藉由一傳統方法，由實驗動物之低劑量開始，逐步增 加劑量並監控反應，同時可系統性地改變劑量及療程，以 決定出一有效劑量或一有效療程。通常是以動物試驗，較 佳是哺乳動物試驗，來決定每一公斤體重之生物活性劑之 最大容忍劑量（the maximal tolerable dose，MTD)。習知技藝 人士可外插算出有效劑量以避免對其他包括人類在内的物 種造成毒性。 以人體進行效力試驗前，可先藉由在正常人身上所進行 的第一期臨床試驗來建立相關的安全劑量範圍。臨床醫師 -98- 1235659 五 '發明說明（％) 在決定一特定患者之最佳劑量前，需先考慮許多因素。最 主要的考量之一就是選定可影響或模擬p蛋白功能或可抑 制後期内嚢體/溶酶體傳送過程之化合物的毒性及半生期。 其他因素包括患者的體重、年齡、身體一般狀況、特定疾 病及狀況、或所欲治療的異常、是否服用其他藥物、欲求 的效果等等。在考量了動物試驗的結果及臨床文獻後，才 選定所欲進行試驗的劑量。 習知技藝人士將能了解在某一特定案例中選定的終點將 視疾病、狀況、或所欲治療的異常、欲求的效果、受測 者'治療之醫師等其他因素而定。當組合物係用來減輕或 加深皮膚顏色時，例如逆轉因諸如發炎或諸如黑色素瘤之 類的疾病所致之色素過度沉著，或減輕或加深毛髮顏色 時’可選定許多終點之一為之。舉例來說，終點可定義 為，例如，當受測者只是「滿意治療結果」。對藥學應用 而言’此終點可由患者、或治療的醫師來決定是否滿意治 療結果。或者，也可客觀地來決定終點。舉例來說，可將 患者或受測者進行治療之皮膚或毛髮與一色表互相比較。 當該患者或受測者進行治療之皮膚或毛髮顏色與色表上之 顏色相似時，即可終止治療。或者，可量取進行治療之皮 膚或毛髮的反射率，當該進行治療之皮膚或毛髮之反射率 達疋數值時，即可終止治療。或者，該進行治療之皮膚 或毛髮之黑色素含量達到某一明確值時，即可終止治療。 黑色素含量可藉由任何習知的方法進行測量，包括有或無 藉由黑色素株來提高效果之組織學方法。 -99- 1235659
五、發明說明（97) L施用 可影響或模擬Ρ蛋白功能或可抑制後期内囊體/溶酶體傳 送過程或可㈣ATP酶(即’活性劑或成分)之化合物可 以諸如貼布(patches)、軟膏(。intments)、乳膏(…㈣、凝 膠（gels)、乳液（lotions)、溶液或穿透皮膚之方式來施用。 該化合物也可以固體或半固體的劑量形式來施用，例如硬 膠囊或軟膠囊、藥錠、或粉末；或以液態劑型來施用，例 如酿劑H或懸浮液。此外，亦可以非經腸胃道方式 施用’例如無菌液態劑型或栓劑。 因欲將本發明用於體内，因此組合物較佳係具高純度且 幾乎不含任何潛在可能的污染物，即，其至少需達國家食 品級（National Food (NF) grade)，一般需至少達分析等級， 且較佳式至少達藥學等級。一選定化合物在使用前需已合 成，此合成或後續純化過程較佳係能使一化合物幾乎不含 任何潛在可能的污染物。 以下詳述可用來施用可影響或模擬ρ蛋白功能或可抑制 後期内囊體/溶酶體傳送過程或可抑制ATP酶之化合物的藥 學劑型。 該藥學組合物可直接施用於皮膚上。或者，可藉由各種 可穿透皮膚之藥物傳送系統（例如，習知之可穿透皮膚之貼 布）施用。舉例來說，對局部表面施用而言，該活性成分可 配方成溶液、凝膠、乳液、軟膏、乳膏、懸浮液、糊劑 (paste)、擦劑（liniment)、粉末、酊劑（tincture)、氣霧配 -100- 1235659 五、發明說明（9〇 方、貼布等習知之藥學或化妝學上可接受的形式及方法。 該組合物可以是習知藥學或化妝學上可用於動物或人類之 局部表面的許多種形式中之任一種，包括溶液、乳液、噴 劑、乳膏、軟膏、油膏（slaves)、凝膠等，詳述於下。較佳 的藥劑需具足夠的黏度使能停留在欲治療的部位’且不易 揮發，和/或不易被水洗去，或不易藉由諸如肥皂、清潔 劑、和/或洗髮精之助而洗去。製備局部表面塗用之配方的 方法已是習知，參見 Remington's Pharmaceutic al Sciences. 1990 (supra); Pharmaceutical Dosage Forms and Drus Delivexy Systems, 6th ed.，Williams & Wilkins (1 995)。 為提高活性藥劑於皮膚的吸收，可添加一或多種如下之 藥劑於表面塗用之配方中，包括但不限於，二曱亞颯、二 甲基乙酿胺、二甲基曱醯胺、表面活性劑、氮酮（az〇ne)、 酒精、丙嗣、丙二醇及乙二醇。此外，亦可使用物理方法 來提兩皮膚穿透度，例如藉助電離子滲入法 (i〇ntophoresis)、或超音波滲入法。或者，或 除此外亦可採用脂肪微粒（liposomes)方式施用。 、本發月可供局部施用之組合物含一藥學有效量之可影 或模擬P蛋白#能# π t 。 力此次可抑制後期内囊體/溶酶體傳送過輕 了抑制此所述之ATP疏 , 酶功能的化合物，及可作為載體之 y頁成分，例如一受丨郝| 一 ^ 、 礼劑、孔膏、藥膏、眼藥膏、水溶液、 、或氣霧配方。這類. I顯载體之非限制性實施例詳細揭示 2〇〇〇年1〇月八 q “ A 告之 WO 00/62742、及 1 997 年 11 25曰授與Mason礬人a 寺人之美國專利第5,691，3 80號、1999 -101- 1235659 五、發明說明（"） 10月19曰授與Deckner等人之美國專利第5,968,528號、 1979年2月13曰授與Chidsey等人之美國專利第 4，139,619號、1987年8月4日授與Orentriech等人之美國 專利第4,684,635號，其全部内容以參考文獻方式併入本文 中。適當的藥學載體更詳述於本領域一專用參考書中： Remington^ Pharmaceutical Sciences， 17th ed.5 Mack Publishing Company，Easton, PA (1990) 〇 本發明之藥學組合物亦可包含其他選擇性加入之組成 (optional components)。這類選擇性加入之組成應適於表皮 組織應用，亦即當其被併入本發明組合物時，當其與皮膚 接觸時，不會造成任何皮膚毒性、不相容、過敏反應、等 類似反應。此外，這類選擇性加入之組成並不會改變本發 明活性成分之各項優點。CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, 2nd ed.? (1 992)描述了一廣泛範圍之一般常用於 皮膚照護產業之化妝及藥學成分，其係可用於本發明組合 物中。這類成分之類別包括：摩擦劑（abrasives)，吸附劑 (absorbents)，諸如香料、顏料（pigents)、色料（c〇i〇ring)/著 色物（colorants)、精油（essential oils)、皮膚感覺劑（skin sensates)、收斂劑（astrigents)(即，丁香油、甲醇、樟腦、 桉樹油、丁香酚、乳酸甲酯、榛木餾出物）等之類的美感劑 (aesthetic components)，抗粉刺劑，抗結塊劑，消泡劑，抗 微生物劑（例如，胺基甲醯碘化丙丁酯），抗氧化劑，膠黏 劑’生物性添加物’緩衝劑’膨服劑’螯合劑（c h e 1 a t i n g agent)，化學添加物，著色劑，化妝收斂劑，化妝殺菌劑 -102- 1235659 五、發明說明（100) ( et^c biociders) ’ 去變性劑（denaturants)，藥物收斂 劑’外部止痛劑，薄膜形成劑或薄膜形成物，例如具可幫 助薄膜形成特性之聚合物（例如，二十烯和乙烯毗咯酮），不 透明劑’酸鹼調節劑，推進物（pr〇pellants)，還原劑，多價 餐合劑（sequestrants)，潤膚劑（例如包括不同類及同類之保 濕劑（humectants))，皮膚滑順和/或癒合劑（例如泛醇及其衍 生物（即’乙基泛醇）），蘆薈，泛酸及其衍生物，尿囊素 (allantoin)、甜沒藥萜醇（bisab〇1〇1)、甘草酸二鉀鹽 (dipotassium glycyrrhizinate)、皮膚處理劑、增稠劑、和維 他命及其衍生物。 除了有效量之此所述的藥劑外，本發明表面局部塗用組 合物也包含一皮膚學上可接受的載體。「皮膚學上可接受 的載體（dermatologically acceptable carrier)」一詞係指一適 合皮膚（即，角質組織）表面局部塗用的載體，其具有美學性 質，並與本發明活性物質即任何其他組成相容，且無任何 女全上或毋性的顧慮。一安全且有效量之載體之量係介於 總組合物重約50%至約99.99%間；較佳係介於約80%至約 99.9%間；更佳係介於約90%至約98%間；最佳係介於約 90%至約95%間。 可用於本發明組合物之載體形式非常廣泛。這些包括乳 化載體’包括但不限於油在水中（〇il-in-water)、水在油中 (water-in-oil) ^ 水-油-水（water-in-oil-in-water)、油-水-石夕 乳化液（〇il-in-water-in-silicone emulsions)、乳膏、藥膏、 眼藥膏、水溶液、乳液、或氣霧配方。習知技藝人士將能 -103- 1235659 五、發明說明（lG1) 瞭解，視所選定組成之水溶性/分散性而定，一選定組成將 主要分布於水或油/發相中。 依據本發明之乳化液，一般含醫藥學有效量之此所揭示 的藥劑及一油脂或一油。油脂及油可來自動物、植物、或 石油，且可以是天然的或合成的（即，人造的）。較佳的乳化 劑亦含有一諸如甘油之類的保濕劑。以載體總重為基準， 乳化液較佳更含約1%至約10%間之乳化物（emulsifier);更 佳係含約2%至約5%之乳化物。乳化物可以是非離子性 的、陽離子性、或陰離子性。適當的乳化物已揭示於，例 如1973年8月28日授與Dickert等人之美國專利第 3，755,560號、1983年12月20日授與Dixon等人之美國專 利第 4,421，769 號、及 Mccutcheon，s Detergents and Emulsifiers，North American Edition，pp.3 17-324 (1 986)。 乳化液亦可包含一消泡劑，其係可使本發明組合物在被 施用至角質組織上時其發泡情況能被減至最小。例示性的 低黏度乳化液，較佳係具有約5〇 cs (centistoks)或更低的 黏度，更佳係具有約〗〇 cs或更低的黏度；最佳係具有5 u 或更低的黏度。乳化液亦可包含一消泡劑，其係可使本發 明組合物在被施用至角質組織上時其發泡情況能被減至最 小。消/包劑包括高分子量矽及其他習知適於此目的的物 質。 导 液的其中一類是水溶於妙（water-in-silicone)乳化 液水’谷於石夕乳化液含一連續的矽相及一分散的溶液相。 較佳的水溶於矽乳化液包含約i %至約6〇%之一連續的矽 -104- 1235659 五、發明說明（l〇2) 相；更佳是包含約5%至約4G%之—連續的發相；最佳是包 含約10%至約20%之一連續的石夕相。該連續的石夕相係以包 含或圍繞該不連續的溶液相形式存在之一外部相。 連續的石夕相亦可 a 人 x . 力了包含一聚有機矽氧烷油 (P〇ly〇rganosiloxne 〇u)。一較佳之水溶於石夕乳化液系統係 :皮配方成可提供-不被氧化的載體，以傳送此所揭示之一 樂學有效量的藥劑。此較佳乳化液之連續的石夕相包含介於 約50%至約99.9%之聚有機石夕氧烧油，* 5〇%以下之非__ 油。在一特別佳的實施例中，以該連續的石夕相重量為準， 吞連續的矽相包含至少5〇%，較佳係介於約⑽％至約 99.9%’更佳係介於約7〇%至約99 9%，最佳係介於約議 至約99.9%之聚有機矽氧烷油；及高達5〇%之非石夕油，較 佳係低於約40%，更佳係低於約3〇%，最佳係低於1〇〇/〇， 極佳係低於、約2%。相較於内含低濃度聚有機石夕氧烧油之水 /合於油乳化劑系統而言，這些有用的乳化劑系統可提供長 時間不會氧化的安定性。在連續的矽相中非_矽油的濃度已 被極小化甚或完全去除，以進一步提高成本發明活性物質 之氧化安定性。此類水溶於矽乳化液揭示於丨997年丨丨月 25曰授與Mason等人之美國專利第5,69138〇號。 可用於本發明組合物之聚有機矽氧烷油可以是揮發性 石夕、非-揮發性秒、或是由揮發性矽及非-揮發性矽組成之混 口物。非-揮發性（nonvolatile)」一詞在此係指室溫下呈液 態、且燃點（一大氣壓下）約高於1 〇 〇之矽。「揮發性 (volatile)」一詞在此係指所有其他的矽油。適當的聚有機 -105- 1235659 五、發明說明（103) 石夕氧烧油可選自揮發性範圍及黏度範圍寬廣的石夕化物中。 適當的聚有機矽氧烷油包括聚烷基矽氧烷、環形聚烷基石夕 氧烧、及聚烧基芳香基石夕氧烧，皆係熟習此技藝人士所熟 知且可購自一般商業公司者。 該連續石夕相可包含一或多種非-矽油。非-矽油在連續石夕 相中之 >辰度較佳係已被極小化甚或完全不存在，以進一步 提高藥學有效藥劑在組合物中的氧化安定性。適當的非-矽 油之熔點在一大氣壓下約為乃t或以下。適用於連續矽相 之非-石夕油已是化學領域中個人皮膚照護產品習知的且常以 水溶於油乳化液形式存在，亦即礦物油、植物油、合成 油、半合成油等。 本發明適於局部表面施用的組合物包含約30%至約90% 之一分散的液相，更佳係約50%至約85%之一分散的液 相，最佳係約70%至約8〇%之一分散的液相。在乳化液領 域中，分散相（dispersed phase)」一詞已為習知技藝人士 所熟知’且係指以小顆粒或小滴形式存在之一相，其係懸 淨於並被一連續相所圍繞。分散相亦為習知之内部相或不 連續相。分散的液相係由懸浮於並被一連續的矽相所圍繞 之小液態顆粒或小滴。該液相可以是水、或是由水及一或 夕種水/合性的或可分散的成分所組成。這類選擇性成分支 非限制性實例包括增稠劑、酸、鹼、防曬劑、著色劑等類 似物。 ϋ明適於局部表面施用的組合物包含約25%至約90% 之水於分散液相中，較佳係包含約40%至約8 0%之水於分 -106- 1235659 五、發明說明（1(M) 散液相中，更佳係包含約6〇%至約8〇%之水於分散液相 中，該百分比係相對於組合物之重量而言。 本發明之水/合於矽乳化液較佳係包含一乳化物。再一較 佳的實施例中，組合物係包含約〇1%至約1〇〇/。之乳化物， 告佳係包含約0·5〇/ο至約7 5%之乳化物，最佳係包含約 至約5%之乳化物，該百分比係相對於組合物之重量而言。 乳化物可幫助該液相分散並懸浮於一連續的矽相中。 可用於此以形成較佳之水溶於矽乳化液的乳化物種類繁 多。只要所選擇乳化物之化性及物性可與組合物中重要組 成相容，並可提供欲求的分散特性，則亦可使用習知的或 傳統的乳化物。適當的乳化物包括矽乳化物，亦即經過有 機式改良的有機聚矽氧烷，亦即習知技藝人士所稱之矽表 面活性劑、不含矽之乳化物、及其之混合物，均為習知技 藝人士所熟知並經常使用於局部表面個人照護產品上者。 有用的乳化物種類繁多，包括許多矽乳化物。這些矽乳 化物為典型之經過有機式改良的有機聚矽氧烷，亦即習知 技藝人士所稱之矽表面活性劑。適合的乳化物揭示於 Mccutcheon^S Detexgents and Fjnulsifiers. North American Edition (1 986)， published by allured Publishing Corporation ; 1991年4月30日授與ciotti等人之美國專利 第5，011，681號；1983年12月20日授與Dixon等人之美國 專利第4,421，769號；1973年4月28曰授與Dickert等人 之美國專利第3,755,560號。 其他適合的表面載體包括油溶於水之乳化液，其具有一 -107- 1235659 五、發明說明（1〇5 ) 連續的液相及一油溶性、非水溶性的相（「油相」）。内含油 溶於水乳化液之適當載體的例子揭示於1991年12月17曰 授與Turner D.J·等人之美國專利第5,〇73,371號；1991年 12月17曰授與Turner D.J·等人之美國專利第5,073,372 號° 一特別佳之油溶於水乳化液，内含一結構劑、脂溶性 表面活性劑、及水，詳述於後。 一較佳之油溶於水乳化液内含一有助於形成一液晶凝膠 網路結構之結構劑。在不受限於理論的情況下，一般相信 該結構劑有助於提供一流體特性予組合物，其對組合物的 女疋性有所貢獻。該結構劑的功能類似 性劑。本發明組合物較佳係包含約〇 5%至約2〇%之一結構 劑；更佳係包含、約1%至約10%之一結構劑；最佳係包含約 1 %至約5%之一結構劑。本發命較佳之結構劑係選自硬脂 酸、棕櫊酸、硬脂基醇、•綠躐基醇、山簽醇 alcohol)、具約個至約21個環氧乙基單元之硬脂基醇的 聚乙二醇醚、具約丨個至約5個 彳固衣氧乙基皁兀之鯨躐基醇 的聚乙二醇趟。 …油溶於水乳化液包含約0〇5%至約1〇%之至少 =散於水相中之脂溶性物質的脂溶性表面活性劑， =含、約，約6%之至少—種可分散於 性物質的脂溶性表面活性劑，更 月曰 S丨、 尺佳係包含約1〇/〇至約〇0/ 至 > 一種可分散於水相中之腊溶性物質的主/0 劑(百分比係以表面塗用之载體重曰洛 面活 至少須具備足夠能分散於水中C)。該表面活性 之知溶性質。適當的表面 -108- 1235659 五、發明說明（1〇6) 性劑包括任一種已知的陽離子型、陰離子型、兩性離子 型、及兩性的表面活性劑。參見Mccutcheon，S Detergents and. Em_ulsifiers9 North American Edition (1986)，published by allured Publishing Corporation ; 1991 年 4 月 30 日授與 Ciotti等人之美國專利第5,011,681號；1983年12月20曰 授與Dixon等人之美國專利第4,421,769號；1973年4月 28日授與Dickert等人之美國專利第3,755,560號。洽當之 表面活性劑的挑選視組合物的酸鹼值及其中的其他成分而 定。較佳是陽離子型表面活性劑，特別是二烷基四級銨鹽 化合物，這類化合物的例子揭示於19 9 2年9月2 9日授與 McCall等人之美國專利第5,151，209號；1992年9月29曰 授與Steuri等人之美國專利第5，151，210號；美國專利第 5，120,532號；美國專利第4,387,090號；美國專利第 3，1 55,591號；美國專利第3,929,678號；美國專利第 3,959,461 號，Mccutcheon^S Detergents and Emulsifiers, North American Edition (1 979)， M.C· Publishing Corporation，及 Schwartz，et al·，Surface Active Agents, 工舡 e ir~gh e m i s t r y_and_Technology. New York: Interscience Publishers，1 949 〇 或者，其他有用的陽離子型乳化物包括氨基-醯胺。這些 陽離子型乳化物的非限制性實施例包括硬脂醯胺丙基PG-二 氨氯磷酸鹽、山蓊醯胺丙基PG_二氨氯、硬脂醯胺丙基乙基 二氨乙醇硫酸鹽、硬脂醯胺丙基二甲基（乙酸肉莖蔻酯）氯化 銨、硬脂醯胺丙基二甲基鯨蠟基甲苯磺醯錢、硬脂醯胺丙 -109- 1235659
基一甲基氯化銨、硬脂醯胺丙基二甲基乳酸銨及其混合物 等。 亦有許多陰離子型表面活性劑可用。參見ι 975年月 3〇日授與Laughlin等人之美國專利第3,929,678號。此 外’亦可使用兩性及兩性離子型的表面活性劑。 較佳之油溶於水乳化液包含約2 5 %至約9 8 %之水，較佳 包含約65%至約95%之水，更佳包含約7〇%至約9〇%之 永，此係以表面塗用之載體重量來計算。 油脂相係分散於連續的液相中。該油脂相可含水不可溶 之物質或水部份可溶之物質，例如習知之，包括但不限於 前述矽溶於水乳化液中提及的矽化物，及其他在乳化液中 提及的油及油脂。 本發明適於表面塗用之組合物，包括但不限於乳液及乳 膏’並可包含一表皮可接受的潤滑藥（em〇Uient)。這類組合 物較佳係含約2%至約50%之潤滑藥。此所述之「潤滑藥 (emollient)」係指一有用之可防止或減輕乾燥、以及保護皮 膚的物質。許多習知適當的潤滑藥可適用於此目的。參見 Sagarin, Cosmetics, Science and Technology, 2nd Edition, v〇l· 1，pp· 3 24 3(19 72)，其中列舉了許多適於作為潤滑藥的 物質。較佳的潤滑藥是甘油。甘油的用量較佳係約介於 0.001%至或約20%間，更佳係約介於0.01%至或約1〇%間， 最佳係約介於0.1 %至或約5%間，例如3%。 依據本發明之乳液（lotions)及乳膏（cream) —般含一溶液 式載體系統及一或多種潤滑藥。乳液典型係包含從約1 %至 -110- 1235659 五、發明說明（l〇8 ) 約20%，較佳係從約5°/❽至約10%之潤滑藥；從約50%至約 90%，較佳係從約60%至約80%之水；及一藥學有效量之此 所述的藥劑。一乳膏典型係包含從約5 %至約5 0 %，較佳係 從約1〇°/。至約200%之潤滑藥；從約45%至約85%，較佳係 從約50%至約 70%之水；及一藥學有效量之此所述的藥 劑。 本發明之軟膏（ointments)可包含一簡單的動物性或植物 性油或半固體式碳氫化物（〇leaginous)之載體基底；可吸收 水形成乳化液之吸附性軟膏基底；或水溶性載體，亦即水 溶性溶液載體。軟膏可更包含一增稠劑，例如詳述於 Sagarin, Cosmetics, Science and Technology, 2nd Edition, vo 1· l，pp· 72-73(1972)中之物質，在此以參考文獻方式併入 本文中’和/或一潤滑藥。舉例來說，一軟膏可包含從約2〇/0 至約10%之一潤滑藥；從約〇 1%至約2%之一增稠劑；及一 藥學有效量之此所述的藥劑。 以下實施例係為說明之用，本發明並不限於此實施例， 1 〇〇〇克之表面塗用乳膏係由以下類型及重量之組成所配製 而成··一藥學有效量之此所揭示的藥劑；常態塔格酸 (tegacid regular) ("Ο 克）（Goldschmidt chemical Corporation，NeW Y〇rk，Νγ生產的一種可自我乳化的單 硬脂酸甘油酯）；聚山梨酯80 (50克）；鯨臘（1〇〇克）；丙二 醇（5〇克）；對二甲苯（1克）；及可達1〇〇〇克之足量的去離 子水。將塔格酸及鯨臘在70 — 80 °C下融解在一起。對二甲苯 溶於約500克水中，之後將丙二醇、聚山梨酯8〇、及卜氨 -111- 1235659 五、發明說明（109 基-1，2-二氫-1-羥基亞胺-和哌啶基嘧啶自由鹼加入，保持 溫度在75-8(TC下。將對二曱苯混合物緩緩倒入塔格酸及鯨 臘融熔物中，同時不斷攪拌。此不斷攪拌之添加過程持續 約30分鐘直到溫度滑落至4〇-45t：為止。最後，加入足量 的水使總重量達1 〇〇〇克，將製備物攪拌直到其達足夠的均 勻度’冷卻並成凝膠狀。 以下實施例係為說明之用，本發明並不限於此實施例， 1 000克之表面塗用軟膏係由以下類型及重量之組成所配製 而成：一藥學有效量之此所揭示的藥劑；氧化鋅 克）；爐甘石（calamine) (50克）；液態凡士林（重型）（25〇 克）；羊毛脂（200克）；及可達1〇0〇克之足量的白色凡士 林。簡言之，將白色凡士林及羊毛脂熔解，並加入1〇〇克 的凡士林。將藥學有效量之此所揭示的藥劑、氧化鋅、及 爐甘石加入至剩下的液態凡士林中，研磨混合物直至其成 均勻分散的粉末顆粒。將混合物攪拌至白色凡士林中，融 解並冷卻成凝膠狀。 以下實施例係為說明之用，本發明並不限於此實施例， 1 〇〇〇克之表面塗用軟膏，即一内含一藥學有效量之此所揭 不藥劑之眼科用軟膏，係由以下類型及重量之組成所配製 而成··一藥學有效量之此所揭示的藥劑；液態凡士林（輕型） (250克）；羊毛脂（2〇〇克）；及可達ι〇〇〇克之足量的白色凡 士林。簡言之，將藥學有效量之此所揭示的藥劑分散並添 加至該輕型的液態凡士林中。將白色凡士林及羊毛脂炼 解’並調整溫度至45-50°C。加入液態凡士林、攪拌直至其 -112- 1235659 五、發明說明（110) 冷卻成凝膠狀。 以下實施例係為姑 馬說明之用，本發明並不限於此實施例， 一内含一藥學有絲θ 文®之此所揭示藥劑之1 〇 〇 〇毫升溶液 即 由以下類型及番Θ 此 吡 之組成所配製而成：一藥學有效量之 所揭示的Μ齋丨· & 、 ’ t乙二醇4000 (120克）；肉笪蔻-γ-甲基 唆氣（0.2克）；平^ ^ 也乙烯吡咯酮（1克）；及可達1000毫升之 "的去離子水。簡言之，將各成分溶於水中’並 遽所得溶液。 以下實施例係Α知 巧說明之用，本發明並不限於此實施例， I7 —内含一藥學有 田 β双篁之此所揭示藥劑之1 〇〇〇克乳液，係 田以下類型及重晋> / 路& 里 < 組成所配製而成：一藥學有效量之此
厅揭示的藥劑；N 县^ T基吡咯酮（40克）；及可達1000克之足 1的丙二醇。
以下實施例係為M aQ βρ 祝明之用，本發明並不限於此實施例， ρ一内含一藥學有旦 以Τ上 、量之此所揭示藥劑之氣霧配方，係由 Λ下類型及重量之 撝 、、且成所配製而成：一藥學有效量之此所 揭不的藥劑；絕對 及-备 '精（4.37克）；二氣二氟乙烷（1.43克）； 久一氣四氟乙烷（5 7η 示 ·克）。簡言之，將藥學有效量之此所揭 旧樂劑溶於絕對 粒。脸、々 /酉精中，過濾所得溶液以除去任何顆 將溶液冷卻至約 入-备 ^ 、’、· 0 C。之後，在此冷卻的混合物中加 八一氯二氟乙烷及— ^〜氣四氟乙烷。 對口服配方而t , 可含、& Μ Λ、\ ^ ，明膠膠囊或液體_充填之軟明膠膠囊中 β活性成分及於士、 粉、输維| / Μ末或液態載體，例如乳糖、卵磷脂澱 纖維素衍生物、 硬脂酸鎂、硬脂酸等類似物。亦可使 -113 - 1235659 五、發明說明（111) 用類似的稀釋劑來製備壓縮藥錠。藥錠及膠囊均可製成適 當的釋出產品以便能連續釋放藥物一段長時間。壓縮藥# 外可包被糖衣或薄膜以掩蔽任何不愉悅的味道，以保護藥 旋不受外界環境影響’或可包被腸衣以選擇性地在腸胃道 之標的位置分解。口服液態劑型亦可含著色劑和/或風味劑 以提高患者的接受度。 二杜I盟水、葡萄糖溶液、$ 山梨醋、及相關的糖溶液，和諸如乙二醇或聚乙二醇之海 :二醇物，均為可供注射用的適當載體。供… 或乳化液較佳係包含約5_15 ^ 本 〜 之1山梨酯80或卵磷脂，道 虽的女疋劑及，如果必要的 ^ 如m於 的話’緩衝物。抗氧化劑，你 如，但不限於亞硫酸氫鈉、硫酸 是單獨使用或合併使用， ：納、或抗壞血酸，無雜 有用的是檸檬酸及其鹽類，和ζ二安定劑。另外：同摘 液也可含防腐劑，例如，作 鈉鹽。此外，注射滿 chloride)、甲基-或丙基 #不限於殺藻胺（benzalkoniUr 習之技藝人士將能瞭及氣化丁醇。 亦可以套組形式供廡。 明之組合物及藥學組合彩 八w。本發明 或影響P蛋白功能、 、、且包含一或多種可模擬和 仰制後期內蚤 制ATP酶之組合物 叢體/溶酶體傳送過程或和 7和/或藥學組人 ^ 各印製好作為標籤或 〇物。或者，該套組可更自 何使用這些試劑來調控皮膚的說明書，以指示使用者女 組合物所適合用來減輕或加=素沉著現象，亦即，視特芳 物係提供於一用來防止卜 皮膚顏色的作用。這些化名 污染的容士 两甲’以減少組合物之泰 -114- 1235659 五、發明說明（ιι〇 發或乾燥等等。該化合物可或不可以單一劑量或劑型方式 存在。 本發明内容已揭示如前，下列實施例僅供闡述本發明之 用0 實施例 實施例1:標的功能m選 在此實施例中調查了 P蛋白對細胞内酪氨酸酶標的之 影響。此功能係於可抑制p蛋白活性之化合物的筛選中進 行開發及探索。 將一種衍生自C57BL16J野生型老鼠之P位址的永久黑 色素細胞株’即黑素-a細胞w “/，1 987, /W. J. 39:414_418)維持在杜必可改良之伊果培養基 中（Dulbecco’s modification 〇f Eagle，s medium，dMEM)。將 來自因具有重疊之基因篩除（α/α, pcp/p25H)所致之缺乏全部p 基因轉譯物的黑素-pi黑色素細胞（Sviderskaya μ α/，1997, 丄hv川·顧化/· 1 08:30-34)維持在漢斯F10(Ham，s F10) 培養基中。兩種培養基中均添加了 1 〇%胎牛血清、5%丙酮 酸鈉、5%榖胺酸、每毫升5單位之盤尼西林、5|llg/mi之鏈 黴素、1 %非必須氨基酸及2 0 〇 nM之1 2 - Ο -十四醇基佛波醇 (phorbol) 13-乙酸酯。此外，還添加了 2〇〇 pM的霍亂弧菌 毒素。 將細胞維持在適當的生長基中，之後再以缺乏酪氨酸的 DMEM(DME-D)來取代該適當的生長基，其中對於低量酪氨 -115- 1235659 五、發明說明（m) 酸之生長基而言’其係添加了 0.03 mM的酪氨酸；對高量 酿氨酸之生長基而言，其係添加了 〇.3 的高量酪氨酸 (Bennett et al.9 1 987, jnt j Cancer 39:414-418)， (Sviderskaya μ a/·，1 997, j …，廳…1〇8:3〇_34) 〇 抽取少量的培養基，以pH6 8之〇1M磷酸鈉緩衝液進行透 析’並以放射性路氨酸羥基酶試驗來分析酪氨酸酶活性 (Orlow, S.J· ei α/·，1990，j /万以以 厂 94:461-64)。 以这些測試化合物進行治療時，將培育之黑素_a黑色素 細胞在含低濃度酪氨酸及爷托品（benz〇tr〇pine)(終濃度為 1〇μΜ)、或丙咪嗪（終濃度為1〇μΜ)、硝化喳拉嗪（終濃度為 3 ΟμΜ)的生長基中培f 48小時，或不加處理。之後如前述 分析生長基中的酪氨酸酶活性。 在低濃度赂氨酸中生長之黑素_p細胞培育物之基質的路 乱酸酶活性增加，顯示這些細胞可分泌相當高量的路氨酸 培育基中(第1圖)。相反的，代表野生型黑色素細胞 …素-a細胞所分泌至培育基的赂氨酸酶量則相對 1圖）。雖然在過量酪氨酸中培養對黑素 - 小，A璽冬4 、、、田胞的影響很 素…胞所分泌之酵素量降低。如前述，路氨酸 、^正黑素-P1細胞中部分被傳送錯誤的酪氨酸酶。 以卡托品治療並不會改變分泌至黑素·& 路氨酸酶量(第2圖)。以丙―:胞二育基中的 增加分泌至細胞培育基中的酿氨酸酶量(第2:;:療則會明顯 黑素-a細胞係衍生自野生型老鼠的黑色 白及酪氨酸酶的功能完整，並可產生黑色素、，其P蛋 " 然而，黑素-p -116- 1235659 五、發明說明（1H) 、’、田胞則係衍生自整條P蛋白基因已被刪除之缺乏P蛋白的 老鼠，因此，其不會生成任何P蛋白。因此，相較於黑素 細胞’黑素-P細胞的路氨酸酶量明顯較低且所製造的黑色 素量也較低。 此實施例可於任一型黑色素細胞中執行，顯示相較於具 正常p蛋白功能的細胞而言，缺乏p蛋白功能之黑色素細 胞明顯會分泌較多的酪氨酸酶至其生長基或培育基中。無 論該細胞之基因是否被改變以降低或完全去除P蛋白功 月b» ’ 一如黑素-p細胞（第1圖），或是以一諸如丙咪嗓之化合 物進行處理以抑制該p蛋白功能，均可獲得同樣的結果。 實施例2 :酿氨酸酶活性之篩撰 在此實施例中研究調查了來自因基因改良而表現出酪 氨酸酶之細胞中，P蛋白對可量測之酪氨酸酶酵素活性的 影響。任一可表現P蛋白或酪氨酸酶之黑色素細胞，或任 一使表現P蛋白及酪氨酸酶的細胞均可使用。此功能係於 可抑制P蛋白活性之化合物的篩選中進行開發及探索。
以實施例1所述方法將黑素-a黑色素細胞培育在含有苄 托品（benzotropine)(終濃度為1〇μΜ)、或丙咪嗪（終濃度為 ΙΟμΜ)、硝化哇拉嗪（終濃度為30μΜ)的生長基中48小時， 或不加處理。之後清洗細胞並以 50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、2 mM EDTA、150 mM NaCl 及 1% Triton X-100 進行 萃取。以放射性酪氨酸羥基酶試驗來分析細胞萃出物中的 酷氨酸酶活性（〇1>1〇\¥，8.<1.泛/6?/.，19905</./^；己15^./)以所(^6>/. -117- 1235659 五、發明說明（ll5 )94:461-64) ° 將表現載體建構成可於培育細胞中表現p蛋白及酪氨酸 酶基因。詳言之，將酪氨酸酶基因移出以作為來自TYBS培 育株之 Hindlll-EcoRl 片段（Yokohama Μ α/·5 1 990，Nucl. Acids· Res· 1 8:7293-72 98)，並將其轉植入 pcDNA 1/amp 之 Hindlll/EcoRl位置（Invitrogen，CA)。將P蛋白基因序列移 出以作為來自 MC2701培育株之 BamHI-EcoRl片段 (Gardner ei α/_，1992，supra)，並將其轉植入 pCDNA 3 及 pcDNA 3.1 /V5/His-ΤΟP0 之 BamHI-EcoRV 位置（Invitrogen， CA)。以 pcDNA 1-為底之質體及以 FuGENETM6(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)作為轉移感染劑 來轉移感染COS細胞48小時。以下列物質來將細胞轉形·· (1)只有載體；（2)帶有酷·氨酸酶基因之載體；（3)帶有p蛋白 基因之載體；或（4)帶有酪氨酸酶基因及p蛋白基因之載 體。之後如前述測量酷·氨酸酶活性。在6 0毫克之細胞蛋白 質上執行酪氨酸酶分析試驗。 以帶有一酪氨酸酶基因的載體，或一帶有酪氨酸酶基因 及P蛋白基因之載體來轉移感染COS細胞，同時如前述以 苄托品、丙味4、或确化峰拉4來處理細胞，或不處理； 並如前述製備細胞萃出物。 如第2A圖所示’以爷托品或石肖化峻拉唤處理之黑素_a 細胞較未處理之細胞具有更高的酪氨酸酶活性。相較於未 處理之細胞而言，以丙咪嗪處理之細胞具有較低的酪氨酸 酶活性。 -118- 1235659 五、發明說明（ιι〇 如第3圖所示，來自只轉移感染了载體（v + V)或帶有p 蛋白基因之載體（V + P)的COS細胞萃出物並沒有可量測得到 的酪氨酸酶活性。來自轉移感染了帶有酪氨酸酶基因之載 體（V + T)的細胞萃出物具有可量測得到的酪氨酸酶活性，·但 來自轉移感染了帶有酪氨酸酶基因及P蛋白基因之載體 (T + P)的cos細胞萃出物之酪氨酸酶活性約為轉移感染了帶 有酪氨酸酶基因之載體（v+τ)的細胞萃出物之酪氨酸酶活性 的4倍。 第4圖顯示三種化合物其個別對p蛋白功能的影響。石肖 化咬拉嗓（4)可使表現酪氨酸酶之c〇S細胞萃出物之酪氨酸 酶活性降低，無論該細胞是否表現p蛋白與否。苄托品（2) 對這些萃出物之路氨酸酶活性並沒有明顯的影響。丙咪嗪（3) 貝J可大巾田降低表現酷氨酸酶及p蛋白之細胞中的酪氨酸酶 /舌性’但對只表現路氨酸酶之細胞的酪氨酸酶活性則沒有 太大影響。 此實施例探帝了鈿& # '、、、’胞卒出物中ρ蛋白功能及赂氨酸酶活 性的關係。藉由Ρ 4 之用了抑制ρ蛋白功能之化合物讓可表現Ρ 蛋白之黑色素細胞禮魅 模擬缺乏Ρ蛋白之細胞。黑素-a細胞為 帶有P蛋白基因之野 王型細胞。但來自這些經丙咪嗪處理 之細胞萃出物的酪氨 卜私也 文酶活性較未處理之黑素-a細胞的酪 氰酸酶活性來得低（第 ^ ^ ^ ^ 2圖）。相反的，來自經苄托品或硝化 喳拉嗪處理之細胞萃 ^ 物則較未處理之黑素_a細胞的路氨 酸酶活性來得高（第2圖）。 COS細胞係衍生 猶子的腎臟細胞。一般來說’其並不 -111 1235659 五、發明說明（m) 會表現酪氨酸酶或P蛋白。此實施例顯示藉由將酪氨酸酶 基因或P蛋白基因轉移感染至cos細胞，可產生一種「人 造的黑色素細胞（artifical melanocyte)」。這些細胞表現出 具活性的酪氨酸酶或P蛋白（第3圖），甚至可製造出黑色 素。同時轉移感染酪氨酸酶基因及p蛋白基因至C〇S細胞 上’可產生一種具有4倍酪氨酸酶活性之COS細胞（相較於 只轉移感染酪氨酸酶基因之細胞的酪氨酸酶活性而言第3 圖）。此結果顯示P蛋白在這些細胞中被表現且具有活性， 因該細胞中的酷·氨酸酶活性因P蛋白的表現而被增強了。 以酪氨酸酶基因及P蛋白基因加以轉形並進一步以丙咪 嗪處理之COS細胞的萃出物，相較於未以丙咪嗪處理之細 胞萃出物而言，只含約1 /3的酿氨酸酶活性（第4圖）。只以 酪氨酸酶基因加以轉形並以丙咪嗪處理之COS細胞的萃出 物，其酪氨酸酶活性與未以丙咪嗪處理之細胞萃出物間並 無明顯差異（第4圖）。此結果顯示丙味療會藉由抑制p蛋白 功能而降低絡氨酸酶活性。相反的，苄托品則不會降低經 轉移感染之COS細胞萃出物的酪氨酸酶活性，無論該細胞 是否可表現P蛋白與否（第4圖）。此外，硝化喳拉漆亦會降 低經轉移感染之C 0 S細胞萃出物的酪氨酸酶活性，無論該 細胞是否可表現P蛋白與否（第4圖）。此結果顯示硝化喳拉 嗪並非P蛋白的抑制劑。 f施例3 :黑音-P細胞酶係肇因於唇白質_鲜 雖然吾人在基質中觀察到絡氨酸酶活性，但Potterf等 420- 1235659 五、發明說明（118) 人（1 988，Exp. Cell Res. 244:3 19-326)以 αΡΕΡ7 並無法在基 質中偵測到酪氨酸酶蛋白質的存在。酪氨酸酶是固定在細 胞膜上的第I型膜蛋白，因此極可能需透過蛋白質裂解，去 掉其尾部，才可能被分泌出來。該截短的蛋白質無法被專 門偵測尾部的αΡΕΡ7偵測到，雖然蛋白質的催化區仍保持 完整。因此，我們檢視了 一系列蛋白質酶抑制劑對黑素 細胞及黑素-p 1細胞中酪氨酸酶分泌的影響。吾人發現 E64，種環氧琥珀酿基胜肽及一種強效的半光胺酸蛋白酶 抑制劑，對降低分泌至黑素_pl細胞基質中的酪氨酸酶量最 有效（第5A圖），因此顯示可藉由抑制半光胺酸蛋白酶活性 來抑制酪氨酸酶的分泌。 如果蛋白質裂解及酪氨酸酶的分泌係酪氨酸酶傳送錯誤 中的/儿澱因子，則E64應該會使酪氨酸酶聚積於黑素_p i細 胞中。進一步調查E64的影響，及其與可降低基質中分泌 量之酪氨酸間的協同作帛。在低濃度(〇 〇3罐)及高濃度 (〇.3 mM)酪氨酸下測試一系列不同濃度之EM的影響。 隹ϋ·〇3 mM之 一 ~ pm列ED# f使分泌至暴 質中的酪氨酸酶量由7.1%降低至4〇%(第5a圖）；但在高 農度下（25 μΜ)，E64的效果只提升了些許（基質中活性約為 3篇)。在高漠度赂氨酸下(〇·3福)，EM亦可降低分泌至 基質中的酷氨酸酶量，從6·5%降低至3.9%。較高濃度的 Ε64則不會更有效。意外地’在高濃度酪氨酸下，腿 ::胞内黑色素的製造量。目此，雖然其可抑制黑素f細 的蛋白質裂解及絡4酸酶之分泌，E64並無法使赂氨酸 -121- 1235659 五、發明說明（ιι〇 酶被再度傳送至黑素粒上，使黑色素合成及沉積重新開 始。 實_施例4 :比較_黑素-a細胞及黑素_p 1細胞中酪氨酸酶的結 構及分布 將黑色素細胞種植在Lab-Tab室載玻片上（Nunc，Inc.， Naperville，II)，並使其生長達 90%融合度（confluence)。 室溫下以溶於 0·2 Μ二甲砷酸鈉鹽緩衝液（sodium cacodylate buffer) (pH 7.2)之半-強度的 Karnovsky 固定劑 將所培育的黑色素細胞固定在培養孔中（Strum α/·， (1970) «/· [//irwirwci. 3 1 (3):323 -33 6)。對二羥基苯丙 氨酸（DOPA)(Sigma，St· Louis，MO)之組織染色而言，將 固定的細胞與0.1% L-DOPA —同培育兩次共2.5小時。以 緩衝液清洗細胞3次並以内含1.5%鐵氰酸鉀（Strum， 之1 · 0°/〇四氧化锇處理3 0分鐘。清洗細胞後，以0.5 %醋酸 鈾染色30分鐘，脫水，並包埋於Eponate 12中。將含有 Epo的部分剪下，架在Epo pegs上並以RMC MT 6000-XL 超微刀切小片。以醋酸鈾（2%)溶液及擰檬酸鉛（0.3%)溶液 將該切下的超薄片染色15分鐘，之後以JEOL JEM-100CX 穿透式電子顯微鏡檢視該結構並照相。 前述之研究顯示缺乏P蛋白會導致結構缺陷（Moyer， 1 966, Am. Zool. 6:43-66; Sidman and Pearlstein, 1 965, Dev. BioL 12:93-116; Orlow and Brilliant, 1 999, Exp. Eye. Res. 68:147-154)及細胞内酪氨酸酶傳送位置錯誤（？(^61^以^7/.， -122- 1235659 五、發明說明（no) 1 998，swpra)。為能同時調查此兩現象，吾人在有或無 DOPA組織染色下以電子顯微鏡定出黑素-a及黑素-pi細 胞中細胞内的結構及酪氨酸酶的分布情形。 如前述（Rosemblat ei α/·，1 998, Exp. Cell Res. 239:344-3 5 2 )，培育之p位址野生型黑素-a細胞所含的黑素粒主要 處於第IV階段（第6A圖）。相反的，無P蛋白之黑素-pi 細胞中的黑素粒則主要處於第I及II階段，偶而會在第 ΠΙ階段初期，但從未出現第iv階段（第6B圖）。 經DOPA處理過之黑素-a細胞，酪氨酸酶活性出現在 反式雨基氏體網路（TGN)及50 nm之液泡上，該液泡係揭 限於高基氏體網附近（第7A圖）。經DOPA處理過之黑素-Pi細胞，在反式高基氏體網路（TGN)及鄰近的50 nm液泡 上也可看到反應產物（第7B圖）。此外，反應產物也存在於 某些黑素-pl細胞的黑素粒上。但是，許多位於細胞本體 及樹突之黑素粒，則仍然沒有反應產物（第7B圖）。與黑 素-a細胞不同的是（第7A圖），黑素-Pi細胞中，遠離細胞 核周圍之高基氏體結構的5〇 nm液泡（第7A圖），及相當 靠近細胞臈（第7B圖）的50 nm液泡上才會出現反應產物， 顯示酪氨酸酶在此類液泡上的不正常聚積。 缺乏P蛋白會導致内含酪氨酸酶之小液泡增生，且不 再侷限於圍繞纟TGN附近之液泡。因此，酿氨酸酶會被 傳送到此兩種細胞内不同的液泡+，或者，傳送到同類的 液泡中’但其傳送途徑卻因缺乏p蛋白而被阻斷。再這些 不正常液泡中㈣氨酸酶可^ DGPA染色而測得，且具酵 -123- 1235659 五、發明說明（m) 素活性。培育在高濃度酪氨酸下之黑素-P 1細胞中成熟黑 素粒數目的增加，並未伴隨著直徑5 0 nm大小液泡數目的 降低，此結果顯示，部分，但不完全，之p顯性可因酪氨 酸而獲得修正。 實施例5 :傳送黑素-a細胞及黑素-p 1細胞中溶酶體羥基酶 至標的位置的過程 此實驗顯示黑素-p 1細胞無法將某一類溶酶體羥基酶正 確地傳送到溶酶體上。 如實施例1所示，將黑素-a細胞及黑素-p 1細胞以高密 度種植並生長於内含低濃度（14μΜ)酪氨酸之DMEM中。 依上述Rosemblat等人之方法及Seiji之方法（Seiji，1963， Annals N.Y. Acad· Sci· 1 00 :497-53 3)製備大顆粒及小顆粒 部分，並於預-分層的蔗糖梯度中離心，並自頂層往下收集 各部分。 於0.2M醋酸鈉溶液、1% Triton X-100中製備可供溶酶 體酵素分析使用之適當的反應基質，該適當的反應基質如 下： β -己醣胺酶-4mM 4 -甲基繳形基-N-乙醯基：β-D -葡萄 糖胺； β -葡萄糖苷酸酶-4.6mM 4 -曱基繳形基-Ν·乙醯基：β- D -葡萄糖配物； β -葡萄糖醛酸酶-4.6mM 4 -曱基繳形基-N-乙醯基：β- D -葡萄糖醛酸配物； β-半乳糖酸酶-4.6mM 4-曱基繳形基-N-乙醯基：β-D- -124- 1235659 五、發明說明（l22) 半乳糖配物； 酸性磷酸酶-22.5mM 4-甲基繳形基-N-乙醯基-磷酸配 物； 在96孔平盤底部製備反應混合物，在每一孔中加入25 μΐ之梯度部分、2.5 μΐ之1M的乙酸鈉及27.5 μΐ之適當 的基質混合物。以保鮮膜包覆培養盤並在37°C下培育。β-己醣胺酶反應係培育50分鐘，β-葡萄糖苷酸酶、β-葡萄糖 醛酸酶、及β-半乳糖酸酶反應係培育20分鐘，酸性磷酸 酶反應則係培育10分鐘。加入20Q μΐ之終止緩衝液（132 mM甘油、68 mM氯化鈉、83 mM無水碳酸鈉）來終止反 應’且立即以370 nm的激發光及460 nm的發射光來讀培 養盤之光線讀值。 在黑素- a細胞及黑素_p細胞中，小顆粒部分中只有極 少量的溶酶體羥基酶可被偵測到（參閱第8_12圖）。此結果 乃是預期的’因為小顆粒部分主要係由一般來說不會聚集 酪氨酸酶之小液泡所組成。大顆粒部分含内質網、高基氏 體、溶酶體、及黑素粒，因此，應該含有大部分的溶酶體 魏基酶。至於酸性罐酸酶，相較於黑素_ a細胞，黑素_ p細 胞中大顆粒部分的酵素活性只稍微低了一些（第8 a圖）。 此外’相較於黑素細胞，黑素叩細胞中酸性磷酸酶的位 置也猶微移至密度稍低部分。但是，對其他分析之溶酶體 为1基酶來說’黑素_a細胞與黑素-p細胞間的差異卻極大。 事實上相較於黑素-a細胞而言’黑素-p細胞中之β _己· 胺酶、β-葡萄糖苷酸酶、卜葡萄糖醛酸酶、及卜半乳糖酸 -125- 1235659 123 五、發明說明 酶的整體活性稍微降低了一些（參閱第9-12圖，右方圖）。 活性喪失並非肇因於細胞中酵素移動之故，因為相較於黑 素-a細胞而言，黑素-p細胞之全細胞萃出物也表現出類似 的活性降低情形；但無論是黑素-a細胞或黑素_p細胞，其 驗性磷酸酶總量並沒有明顯差異（結果未示出）。而來自累 素-a細胞内含酸性磷酸酶之同樣的大顆粒部分，同樣也含 有大部分的β-己醣胺酶、β-葡萄糖苷酸酶、葡萄糖藤酸 酶、及β -半乳糖酸酶之活性；黑素-P細胞大顆粒部分中這 些酵素的活性則明顯降低。因此，β-己醣胺酶、β-葡萄糖 芽酸酶、β -葡萄糖醛酸酶、及β -半乳糖酸酶並不會正確地 聚集在黑素-Ρ細胞的溶酶體中。 與酸性磷酸酶不同的是， 酶 Ρ葡萄糖駿酸酶、及β_半乳糖酸酶在到達溶酶體前， 並不會被傳送到細胞表面上。相反的，這些酵素係藉由 Μ6P/IGF-II受體之活性被從反式-高基氏網路上傳送到後 期0囊^ ρ 。黑素-Ρ細胞與黑素-a細胞中這兩類溶酶體羥 基酶傳送標的位置之差異顯示破壞P蛋白功能會影響 M6P/IGIMI 森触 α # 又體所媒介之標的位置傳送過程。由我 果可看出，自里妾 h “、、素-P細胞分泌酪氨酸酶、耗盡同類細胞大 顆粒部分中& β 1 的卜己醣胺酶、β-葡萄糖苷酸酶、β-葡萄糖醛 酸酶、及β-半3丨 亍孔糖酸酶，這類溶酶體酵素應會自黑素細 胞中分泌出爽。 、 因此，這些酵素的標的位置、藉分析分泌 增加篁或降低、玄 合酶體膜上的聚集量，可作為能影響ρ蛋白 功能之化合铷eτ 赏曰 匆師選方法分析之一部分。 -126- 1235659 ---------- ----—-------— 五、發明說明（l24) 复施例6 :改#後期内章艚/體傳送過程之化合物 實驗目的係為了定出各種玎改變後期内囊體/溶酶體傳 送過程之化合物對黑色素製造的影響。用於本試驗之細胞 為前述之黑素-a黑色素細胞。 將黑素-a黑色素細胞培育在DMEM中（10%胎牛血清、 2 mM L-穀氨醯胺、imM丙酮酸鈉、1 % MEM非必要氨 基酸100X、50pg/ml盤尼西林、5(^g/ml鏈黴素）。在使用 生長基質前，立即加入200 nM的之12-0-十四醇基佛波醇 (phorbol) 13 -乙酸酯。以每毫升4xl04個細胞、每個培養 瓶4.5毫升的量種植在T-25培養瓶中（融合度約10-20%)， 並於5%C02、3 7°C下培育。24小時後，在生長基質中加 入測試化合物（稀釋於0 · 5毫升的生長基質中）。添加藥物 48小時後，更換生長基質及藥物。再隔48小時或72小時 後即可收取細胞。
收獲細胞後，即可將試劑及細胞保存在4。(：。簡言之， 自細胞中取出生長基，如果稍後需進行酪氨酸酶活性測 試，則需保留1毫升的生長基。以約50Q μΐ冷的1倍鱗 酸生理緩衝液（PB S)清洗細胞，直到用來清洗的ρβ S溶液 呈透明潔淨為止。加入50Q μ!冰冷的萃出缓衝液（5〇mM
Tris (ρΗ7·2)、2 mM EDTA (pH 7·8)、150 mM NACE、1〇/〇 Triton X-100 (Sigma，St· Louis，MO))，讓樣品在冰上培育 數分鐘或直到細胞開始從培養瓶底部脫落。輕敲培養瓶幫 助細胞脫離，移去該50〇 μΐ冰冷的萃出緩衝液/細胞，並 -127- 1235659 五、發明說明（l25) 將其置於離心小管中。4〇c下以14,〇 ν ϋ x g的速度離心約5 …除去上清液，留下沉澱進行蛋白質分析(如果必要的 話，還可進行絡氨酸酶活性測試）。在進行黑色素分析前可 將細胞沉澱物儲存在4它下隔夜，戋 Γ ^ ^ 4儲存在-2(TC下一段更 長的時間。 為分析黑色素，在每一細胞沉澱物小管中加入3〇_ 500 之乙醇/乙_(1:1)混合物。將每一小管震盈並靜 置約10分鐘或直到可在溶劑中看到沉澱蛋白質為止。必 要的話，還可用小杵輕輕地將沉澱壓碎。但須注意不要壓 付太碎，否則將使後續分離溶劑（留下黑色素）的步驟變得 較困難。重複萃取步驟，之後讓沉澱自然乾燥。接下來， 在每一小管中加入25Q μ1溶於20%二曱基亞颯（DMS〇)之 2N NaOH。將樣品在60_7(rc下加熱直到黑色素完全溶解 為止。從每一測試樣品中取出20q μΐ該Na0H/黑色素溶 液’並轉移至96孔培養盤上。以溶於2〇%二甲基亞颯之 2N NaOH溶液作為空白對照組，在49〇 nm下讀取其讀 值。以總樣品中每一計算蛋白質之黑色素吸光值來表示該 數據。 為決定黃體酮對黑色素製造之影響，讓黑素-a細胞培 育在内含20 μΜ黃體酮（Sigma, St. Louis，MO)的生長基 中。此外，分別以 3 00 μΜ PTU (Sigma，St. Louis，MO)(其 係為一種酪氨酸酶的直接抑制劑）、或l〇Q μΜ之ΙΒΜχ (Sigma，St· Louis，MO)(其係為一種磷酸二酯酶抑制劑）來 處理黑素-a細胞。 -128- 1235659 五、發明說明（！26) 結果示於第13圖。20 μΜ之黃體酮可降低黑素_a細胞 的色素沉著現象約52%。其他實驗顯示10 μΜ之黃體酮可 降低黑素-a細胞的色素沉著現象約45%。 為測定脂溶性胺對黑色素製造之影響，讓黑素細胞 培育在内含 20 μΜ 丙咪嗪（IMP) (Sigma，St. Louis，MC〇 (其係為一種陽離子型兩性藥劑）的生長基中。此外，分別 以 300 μΜ PTU (Sigma，St. Louis，MO)、或 i〇Q μΜ 之 ΙΒΜΧ (Sigma，St· Louis，ΜΟ)來處理黑素 _a 細胞。 結果示於第14圖。20 μΜ之IMP可降低黑素-a細胞的 色素沉著現象約3 3 %。 同時還進行了各種濃度之U1 8666A對黑色素製造之影 響的實驗。此實驗的結果示於第15圖。相較於控制組細 胞’ 2.5 μΜ之U18666A可降低黑素- a細胞的色素沉著現 象約6 0 % ;即使在2 0 η Μ的低濃度下，其仍可明顯降低色 素沉著現象。 同時還比較了數種U18666A類似物對黑色素製造之影 響的實驗。此實驗的結果示於第16圖。需注意的是 U1 8666A 的類似物：CP-3 52369、CP-598755-01、CP-602367(式 IV 化合物）、UK-204039、UK-204042 (Pfizer， Inc·，Groton，CT)，可明顯降低黑素-a細胞中的色素沉著 現象。為測定 U1 8666A 是否可降低 IBMX (Sigma，St. Louis， MO)單獨使用時的效果，將細胞同時以U18666A及IBMX (Sigma，St· Louis，MO)來處理。此實驗的結果示於第ι7 -129- 1235659 五、發明說明（m) 圖。U1 8 666A合併使用磷酸二酯酶抑制劑-IBMX (Sigma， St. Louis，MO)可降低IB MX單獨使用時之色素沉著現象達 75%。 實施例7 :細胞暴露在U1 8666A中並不會影響酪氨酸酶活 為測定經脂溶性胺U1 8 6 6 6 A處理過之細胞中黑色素量 的降低是否肇因於其對酪氨酸酶活性的影響，故測定了經 U1 8666A處理之黑素-a細胞，其細胞萃出物中的酪氨酸酶 活性。在這些實驗中，經3H標定的酪氨酸會被酪氨酸酶 轉變成多巴醌，並釋出水為其產物。藉由測量從3H標定 的酪氨酸所釋出的3H20，可測定酪氨酸酶活性。 樣品係以二重複或三重複方式進行測量（Ιμΐ 3H«酪氨酸 3 (H-Tyr) 46.0 Ci/mmole/sample)(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。將3H-Tyr均勻地分布於離心小 管中，以便能迅速乾燥。以保鮮膜覆蓋小管並以注射針在 保鮮膜上戳出小洞來。快速真空乾燥該離心小管〗5分 鐘。以等體積的酒精清洗該小管兩次，並以10倍其原來 體積的 DOPA(Sigma，St. Louis，ΜΟ)(0·5 毫克 / 毫升之 DOPA 溶於 0.1Μ NaP04，pH 6.8)來重組該 3H-Tyr。將所 有的3H-Tyr樣品集中，依下列方式在矽酸硼管中製備反應 混合物。簡言之，將 Η) μΐ 3H-Tyr加到50μ1内含1% Triton Χ-100之0_1M NaP04樣品中，讓樣品在37°C的水 浴中培育1小時。終止反應時，可加入1毫升溶於〇. 1Μ -130- 1235659 五、發明說明（i2〇 停檬酸之1 0 %活性碳並劇烈震盪。活性碳可吸附自由浮動 的有機化合物，例如3H-Tyr。之後，將樣品以每分鐘700 轉的速度離心5分鐘，收集上清液（670μΐ)，並將其載入已 充填了 AG 500W-X8 樹脂（200-400 網目）（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)之陽離子交換樹脂管柱中。再 加入緩衝液（0.5毫升之1M檸檬酸）至管柱中以清洗樣 品。加入1 0亳升的閃爍計數液，並劇烈震盪。以閃爍計 數器來讀取3H活性值。 此實驗的結果示於第18A圖。結果顯示相較於味精處 理的控制組細胞而言，經U1 8 6 6 6 A處理之細胞，其細胞萃 出物中的總酪氨酸酶活性有明顯差異。此結果表示當以 U1 8666A處理黑素-a細胞後，其黑色素的降低並非因細胞 中總總酪氨酸酶量降低之故，表示黑色素量的降低係因為 酪氨酸酶傳送位置倍改變之故。 為了確認酪氨酸酶活性的結果，以西方點墨法來比較 控制組細胞、經U1 8 6 6 6 A處理之細胞中的總酿氨酸酶量。 蛋白質電泳以及將蛋白質轉移至支持性膜上的標準操作方 法可參考 Molecul ar Cloni,n_g；__.A-_.,Lab〇rat〇ry Manual (1989) Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd Edition, Sambrook, J.? Fritsch, E.F., and Maniatis, T·)。簡言之，以35伏的電位讓蛋白質樣品在7·5%之SDS 聚丙醯胺凝膠膠片上泳動隔夜。將蛋白質從凝膠膠片上轉 移至400毫安培之硝基纖維素片上移動約1 · 5小時。將基 纖維素片在溶於磷酸衝液（PBS)之3%牛乳中培育1小時， -131- 1235659 五、發明說明（m) 以去除任何非—專一性結合。之後讓膠片與溶於磷酸衝液 (PBS)之3%牛乳溶液内之一級抗體（Rep 7，1:2〇〇〇，來自Vincent Hearing，NIH，Bethesda5 MD)在 4°C 下培育隔夜。 以内含0.05% Tween 20之PBS(PBS-T)清洗膠片6次，每 次數分鐘。之後，再以溶於3%牛乳之p]BS溶液之二級抗 體（山葵過氧化酶抗-兔子，1:2000，來自Amer sham Life Science，Piscataway，NJ)培育 1 小時。接著以 pBS_T 清洗 8次’每次數分鐘，讓膠片與eCL偵測劑（NEN LifeScience Products，Boston，ΜA) — 同培育 1 分鐘，以標準方 式執行放射性顯影。 西方點墨法的結果示於第1 8B圖，由圖中可看出經 U1 8666A處理之黑素-a細胞之總酪氨酸酶量與控制組細胞 間並無明顯差異。 實施例__ 8 :細胞基露在U1 8666A中會改變細胞内酪氨酸醢 的傳送位琶 為測定經脂溶性胺U 1 8666A是否會改變細胞内酪氨酸 酶的傳送位置，以U1 8666A處理細胞後，再以蔗糠梯度離 心來分餾經U1 8666A處理之黑素- a細胞。 依前述 Seiji 的方法（Seiji, (1 963) 见广 100 :497-53 3)在預-分層的蔗糖梯度溶液中離心分離大顆粒 部分及小顆粒部分。 自頂層往下收集蔗糖分餾部分，並以前述方法分析酪 氨酸酶活性。 -132- 1235659 五、發明說明（l3〇) 結果示於第19圖（小顆粒部分）及第2〇圖（大顆粒部 分）。攻些結果顯不酪氨酸酶的位置會受到U1 8666A的影 響。舉例來說，在第i 9圖中，比較第5部分控制組及經 U1 8666A處理之部分，可明顯看到酪氨酸酶分佈位置的變 化。此變化在大顆粒部分可看得更明顯（參見第2〇圖第 6-8部分，控制組大顆粒部分（LGF C)，及U1 8666A處理 組大顆粒部分（LGF-U18))。 這些結果可支持U1 8666A係可藉由改變酪氨酸酶的分 佈位置來抑制黑色素的製造這樣的結論。 宽„拖―例9 ·以豆球黴素或貝非黴素來處理細胎 本實驗使用了下列細胞：衍生自C57BL16J野生型老鼠 之p位址的永久黑色素細胞株，即黑素-a細胞（β/α，尸; 衍生自缺之p蛋白之老鼠的黑素-pl黑色素細胞株（α/α, Ρ<：Ρ/ρ25Η); 一種已穩定轉移感染了一帶有粉紅眼稀釋基因載 體之黑色素細胞株，即黑素-pi (P10); 一種黑色素瘤細胞 株’即B 1 6 ;及一具有輕微色素沉著現象的黑色素瘤細胞 株，即 B16F10。 細胞係培育在 RMPI-1640 (Sigma, St. Louis，M0)中 24 小時，並補充添加了 10%胎牛血清、5°/。丙酮酸鈉、5%穀胺 酸、每毫升5單位之盤尼西林、5 pg/ml之鏈黴素、1%非必 須氨基酸及200 πΜ之12-0-十四醇基佛波醇（phorbol) 13-乙酸酯。之後，以内含0、1、2、或2.5 μΜ之貝非黴素 八1(81§1113，81：1〇1^，？^0)或是内含〇、〇.5、1.(} μΜ 之豆球 -133- 1235659 五、發明說明（131)
素 A ’、 (Sigma，St. Louis，MO)的 RP MI 基質來取代。36 小 日夸4灸 ’移去生長基並以ΙΟΟμΙ之萃取緩衝液（1% Triton X-〇 50 mM Tris，2mM EDTA，150 mM NaCl)來萃取細 胞。在離心小管中以每分鐘13,000轉的速度離心30分鐘。 去除上清液，並以蛋白質分析套組（Bi〇Rad，Richm〇nd，CA) 分析蛋白質量。 去除上清液後再測定沉澱中黑色素量。每一樣品係以 〇·5毫升之乙醇：乙鰱（1 :丨）處理，室溫下劇烈震盪分 鐘。移除溶劑，再以乙醇：乙醚（1 : 1}清洗黑色素。第二次 清洗後’加入200μ1 NaOH、20% DMSO後將樣品加熱至60 C直到黑色素溶解為止。將樣品轉移至9 6孔的培養盤中， 並在490 nm下讀取其吸光值。將光學密度以蛋白質量常態 化。 第21及22圖顯示以豆球黴素a或貝非黴素A1來處理 細胞的結果。第21圖顯示野生型黑色素細胞（黑素_a細 胞）’及P蛋白功能減弱或缺乏P蛋白功能但穩定植入帶有 粉紅眼稀釋基因載體之細胞（黑素-ρ(ρι〇)細胞）中的黑色素量 一開始隨著μΜ濃度之貝非黴素A1的存在而上升，但在更 高測試濃度下’其黑色素量卻下跌。在缺乏p蛋白的細胞 中（黑素-P細胞），黑色素量隨著貝非黴素A1濃度之升高而 升南。缺乏胳氨酸酶及P蛋白之黑色素瘤細胞對貝非 黴素A1則無反應，但具可偵測量之酪氨酸酶，而非p蛋白 的第二種黑色素瘤細胞（B16F-10)之色素沉著的上升現象， 會隨著貝非黴素A1濃度增加反而逐漸下降。 -134- 1235659 五、發明說明（m) 第22圖顯示野生型黑色素細胞（黑素-a細胞），及p蛋白 功能減弱或缺乏P蛋白功能但穩定植入帶有粉紅眼稀釋基 因載體之細胞（黑素-p(P10)細胞）中的黑色素量隨著μΜ濃度 之豆球黴素Α的存在而下降。在缺乏Ρ蛋白的細胞中（黑 素-P細胞），黑色素量隨著豆球黴素A濃度之升高而升高。 缺乏赂氨酸酶及P蛋白之黑色素瘤細胞（B16)對豆球黴素A 則無反應’但具可偵測量之酪氨酸酶，而非ρ蛋白的第二 種黑色素瘤細胞（B16F-10)之色素沉著的上升現象，會隨著 豆球破素A濃度增加反而逐漸下降。 這些結果顯示黑色素生成過程在缺乏ρ蛋白的細胞中可 藉由暴露在ATP酶抑制劑下（即，豆球黴素A或貝非黴素 A1)而會被活化。 等效物 刖述說明已可使習知技藝人士了解並實施本發明。確 實，上述執行本發明之手段的各種變化及改良，對分子生 物領域的習知技藝人士言，應屬顯而易見，惟這些變化應 仍視為本發明申請專利範圍之範疇。

Claims (1)

1235659
六、申請專利範圍 1 · 一種可降低黑色素細胞所生成之黑色素量的方法，其 係包含讓一黑色素細胞接觸一有效量可影響黑色素細 胞後期内囊體/溶酶體傳送過程之變化的化合物，其中 該後期内囊體/溶酶體傳送過程之變化可導致黑色素細 胞所生成之黑色素量降低，其中該可影響皮膚細胞中 後期内囊體/溶酶體傳送過程之變化的化合物係選自下 列： h3c 〇
-136- 1235659 六、申請專利範圍 h3c、
、0 0
137- 1235659 六 申請專利範圍
(VII) 及
及其藥學上可接受的鹽類或溶合物。 2. —種可降低皮膚色素沉著的藥學組合物，其係包含一 有效量可降低皮膚色素沉著的化合物，該化合物係可 影響皮膚細胞中後期内囊體/溶酶體傳送過程之變化； 及一藥學上可接受的載體； 其中該藥學組合物係為可供表面施用的配方形式，且 其中該可影響皮膚細胞中後期内囊體/溶酶體傳送過程 之變化的化合物係選自下列： -138- 1235659 六、申請專利範圍
h3c、
、ch3 (IV) -139- 、0 1235659
(VI)
(VII) 及 -140- 1235659 六、申請專利範圍
及其藥學上可接受的鹽類或溶合物。 3 · —種可活化黑色素生成之方法，其係包含讓一具有 低或缺乏P蛋白活性之黑色素細胞與一藥學有效量 可抑制ATP酶的化合物互相接觸，藉由抑制ATP酶 活性可活化該具有降低或缺乏P蛋白活性之黑色素 胞中的黑色素生成過程。 4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該熹有降 或缺乏P蛋白活性之黑色素細胞係與&藥學有效量 化合物接觸，其中該化合物係擇自貝非黴 (bafiolmycin)、豆球黴素（concanamycin)、及其之衍 物0 5. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該具有降 或缺乏P蛋白活性之黑色素細胞係與一藥學有效量 貝非黴素（bafiolmycin)或其衍生物接觸。 降 之 的 細 低 之 素 生 低 之 -141- 1235659 六、申請專利範圍 6·如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該具有降低 或缺乏P蛋白活性之黑色素細胞係與一藥學有效量之 豆球黴素（concanamycin)或其衍生物接觸。 7. —種套組，其係包含一種可供表面施用的藥學組合 物，該藥學組合物包含一藥學有效量之可調控黑色素 生成的化合物，該化合物係藉由影響P蛋白功能、抑 制後期内囊體/溶酶體傳送過程、或抑制一 ATP酶來 調控黑色素生成過程；其中該可抑制後期内囊體/溶酶 體傳送過程的化合物係選自下列化合物： h3c 〇
-142- 1235659
h3c、 、0
、ch3 (IV)
h3c^\〇 -143- 1235659
(VI)
(VII)
及
及其藥學上可接受的鹽類或溶合物。 8.如申請專利範圍第7項所述之套組，其更包含一組描 -144- 1235659 化合物來調控皮膚色素沉著之說明書 9· 一種用來製備可降低皮膚色素沉著之藥物的化合物的 用途，其中該化合物可影響皮膚細胞中後期内囊體/溶 酶體傳送過程之變化且該後期内囊體/溶酶體傳送過程 之變化係可導致皮膚色素沉著之降低，其中該可影響 皮膚細胞中後期内囊體/溶酶體傳送過程之變化的化合 物係選自下列：
(III) -145- 1235659 六、申請專利範圍
(IV)
-146-
1235659
及
及其樂學上可接受 10· 一種用來製備可治療因酪氨酸酶所致 义眼及皮膚的 化症之化合物的用途，其中該化合物係 、 、4抑制ATP 並藉由抑制ATP酶的活性來活化該具有降低或缺乏 蛋白活性之黑色素細胞中的黑色素生成過程。 11.如申請專利範圍第10項所述之用途，其中該化合物係 與一受測者皮膚接觸，且其中該化合物係擇自貝非黴 素（bafiolmycin)或其之衍生物，及豆球黴素 -147- 1235659 六、申請專利範圍 (concanamycin)或其之衍生物中° 1 2.如申請專利範圍第1 1項所述之用途，其中該化合物係 貝非黴素（bafiolmyc、in)或其衍生物。 1 3 .如申請專利範圍第1 1項所述之用途，其中該化合物係 豆球黴素（concanamycin)或其衍，生物。 -148-
TW091107018A 2001-04-06 2002-04-08 Methods and compositions that affect melanogenesis TWI235659B (en)

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