KR101077179B1 - Ｐｉｇ３를 이용한 ｄｎａ 손상 보호방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PIG3를 이용한 DNA 손상 보호방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 PIG3(p53-inducible gene 3)가 자외선(UV) 또는 방사능유사약물(radiomimetic drug) 등의 DNA 손상인자(DNA damaging agents)에 대한 세포의 민감도를 억제하고, DNA 손상에 대한 회복에 관여하며, DNA 손상 점검점 경로의 활성에 관여하며, DNA 손상에 대한 반응에서 핵내 응집체를 형성하고, Chk1, Chk2 및 H2AX의 인산화에 관여하며, ATM 및 ATR의 다운스트림으로 기능함으로써, 상기 PIG3가 DNA 손상 반응 경로의 중요한 구성 성분이며 DNA 손상 신호 전달에 직접적인 역할을 하는 것을 알 수 있으므로 DNA 손상 보호에 유용하게 이용할 수 있다.

PIG3, DNA 손상 보호, DNA 손상 반응 경로, DNA 손상 신호 전달.

Description

ＰＩＧ３를 이용한 ＤＮＡ 손상 보호방법{A method for protecting DNA damage using PIG３}

본 발명은 PIG3를 이용한 DNA 손상 보호방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 PIG3(p53-inducible gene 3)가 DNA 손상인자(DNA damaging agents)에 의해 유발되는 DNA 손상에 대한 반응 경로에 관여하고, 상기 DNA 손상에 의한 신호 전달에 직접적인 역할을 함으로써 이를 이용한 DNA 손상 보호에 관한 것이다.

DNA 손상(DNA damage)은 암 및 노화 촉진을 포함한 많은 질환의 발병 원인으로 알려져 있다. 이를 극복하기 위하여 세포 내에는 DNA 손상을 인지하여 세포주기를 멈추고 이를 복구시키는 시스템이 존재한다. 그러나 많은 질환 세포에서 이 시스템이 정상적으로 작동되지 않음이 관찰되었다. 따라서 DNA 손상 후 DNA 손상 반응(DNA damage response)이 정상적으로 작동되어 이들 손상이 돌연변이를 발생하지 않고 복구되도록 하는 것은 DNA 돌연변이 관련 질환을 예방하고 치료하는데 매우 중요한 의미를 지니다.

DNA 손상 반응은 DNA 손상에 반응하여 급속히 활성화하는 다양한 세포의 사건의 조직화와 관련된 복잡한 신호 경로이다. 이런 신호 경로는 세포주기(cell cycle)를 억제하고 DNA 회복[DNA 손상 점검점(NA damage checkpoint)이라 부름]을 촉진하며 DNA 손상이 회복되기에 너무 많이 손상되면 세포사멸을 유도하는, 많은 인자들이 관여한다(Harper, J.W. and Elledge, S.J., Mol Cell, 28, 739-745, 2007; Bartek, J. and Lukas, J., Curr Opin Cell Biol, 19, 238-245, 2007).

포유류 세포에서, 포스파티딜이노시톨-3-키나아제 유사 키나아제(phosphatidylinositol 3-kinase-like kinase; PIKK) 계열, 운동실조 모세혈관 확장성 돌연변이(ataxia telangiectasia mutated; ATM), ATM 및 Rad3 관련 단백질(ATM and Rad3 related; ATR), 및 DNA 의존성 단백질 키나아제(DNA dependent protein kinases; DNA-PK)는 염색체의 손상을 인지 및 반응하는 중요한 역할을 한다(Shiloh, Y., Curr Opin Genet Dev, 11, 71-77, 2001; Falck, J., Coates, J. and Jackson, S.P., Nature, 434, 605-611, 2005).

DNA 손상 반응은 센서(sensor)로 개시된 초기 손상 신호를 매개자(mediator) 및 전달자(transducer)로 전달하고, 상기 매개자 및 전달자가 상기 신호를 변환하여 많은 효과자(effector)로 전달하는 선형적 진행으로 이루어지는 것으로 고려되고 있다. 인간 세포에서 DNA 손상 반응 경로의 붕괴는 유전자 불안정성(genomic instability) 및 암 진행(cancer progression)의 증가된 위험성을 야기한다(Kastan, M.B. and Bartek, J., Nature, 432, 316-323, 2004; Zhou, B.B. and Elledge, S.J., Nature, 408, 433-439, 2000). 그러므로, 암 진행 및 치료의 지식 을 위해 상기 복합 기작을 분자적 수준에서 이해하는 것이 필요하다.

지난 몇 년 동안, 많은 연구원들은 DNA 손상 신호가 DNA 손상에 대한 세포 반응에서 어떻게 통합적으로 실행되는지를 연구하였으나, 세포내 DNA 파괴 신호의 펼쳐짐에 선행하는, DNA 손상에 의해 자극되는 초기 사건을 개시하는 기작에 관해서는 알려진 바가 거의 없다.

p53 유도 유전자 3(p53 inducible gene 3; PIG3)은 세포사멸의 개시 전에 p53에 의해 유도되는 유전자임을 확인하기 위한 연구에서 유전자 발현의 분석을 통해 확인되었다(Polyak, K., et al., Nature, 389, 300-305, 1997). p53은 p53에 의한 PIG3 프로모터의 전사활성에 요구되는 PIG3 프로모터[(TGYCC)n, 여기서 Y= C 또는 T]내 펜타뉴클레오티드 미세부수체 서열(pentanucleotide microsatellite sequence)과 상호작용한다(Contente, A., et al., Nat Genet, 30, 315-320, 2002). PIG3의 아미노산 서열이 NADH 퀴닌 옥시도리덕타제1(NADH quinine oxidoreductase1; NQO1)의 아미노산 서열과 상당한 상동성을 나타냄으로써 PIG3가 NQO1와 유사하고, PIG3가 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS)의 발생에 관여하고(Polyak, K., et al., Nature, 389, 300-305, 1997), p53 의존 세포사멸 반응의 중요한 다운스트림 매개자(downstream mediator)임이 제시되었다.

또한, 인간 세포사멸 민감성 단백질(human cellular apoptosis susceptibility protein; hCAS/CSE1L)이 PIG3 프로모터와 상호작용하고, PIG3 발현 조절에 의해 p53 의존 세포사멸에 영향을 준다(Tanaka, T., et al., Cell, 130, 638-650, 2007). 그러나 PIG3의 단독 발현은 세포사멸 유도에 불충분하기 때문에(Polyak, K., et al., Nature, 389, 300-305, 1997), 세포사멸을 야기하는 여러 인자가 협력하는 것이 추정된다.

한편, UV 조사는 프로테아좀(proteasome) 분해 경로에 의해 급속히 분해되는 유전자 단편 변이 단백질(splice variant protein)을 생산하기 위해, PIG3 pre-mRNA의 대체 스플라이싱을 유도하고, 이는 세포의 DNA 손상 반응 및 대체 스플라이싱의 조절 사이 신규한 범례를 가져온다(Nicholls, C.D., et al., J Biol Chem, 279, 24171-24178, 2004). 또한, 이종 핵 리보핵 단백질(heterogeneous nuclear ribonuclear protein; hnRNP) A1 및 A2는 UV-유도 대체 스플라이싱과 관련없는 PIG3의 정상적 대체 스플라이싱에 기여하고, 이는 PIG3의 정상 및 UV-유도 대체 스플라이싱을 매개하는 기작과는 다른 기작임을 제시한다(Nicholls, C.D. and Beattie, T.L., Biochim Biophys Acta, 1779, 838-849, 2008). 따라서 PIG3는 DNA 손상 반응 경로의 협력에 의해 알려지지 않은 기능을 조정하는 것으로 고려된다.

DNA 손상시 세포주기를 일시 정지시키는 현상인 세포주기 점검점(cell cycle checkpoint)이 발생하는데, 이같은 현상은 손상된 부위에서 유전자 돌연변이 발생을 막기 위하여 발생하는 현상으로 유전자 안전성에 매우 중요한 역할을 수행한다. DNA 손상시 세포주기 점검점은 G2/M 점검점(세포가 둘로 나눠지기 직전에 세포주기를 멈추는 현상)과 DNA가 둘로 나눠지는 과정에서 이를 멈추는 인트라-S 점검점이 존재한다.

DNA 점검점 활성(DNA checkpoint activation)은 DNA 손상 회복, 세포주기 억류 및 세포사멸을 포함하는 DNA 손상 반응을 조절하는 신호를 통합한다(Abraham, R.T., Genes Dev, 15, 2177-2196, 2001; Shiloh, Y. Nat Rev Cancer, 3, 155-168, 2003). 인트라-S 단계 점검점은 자발적 복제 분기점(replication-fork) 붕괴, 및 DNA 손상 후 인트라 S-단계 진행을 억제하는 역할을 한다(Bartek, J., et al., Nat Rev Mol Cell Biol, 5, 792-804, 2004). G2/M 점검점은 손상된 DNA 또는 불완전한 DNA를 가진 세포가 유사분열을 진행하는 것을 억제하기 위해 활성화한다. 인트라 S-단계 점검점 활성에 실패한 세포는 G2/M 점검점을 활성화시킴으로써 유사분열로의 진행을 억제할 수 있다(Sancar, A., et al., Annu Rev Biochem, 73, 39-85, 2004).

손상된 DNA에 의한 ATM 및 ATR의 활성은 직간접적으로 많은 다운스트림 표적의 인산화 또는 활성을 야기한다. 점검점 키나아제 Chk1 및 Chk2는 세포주기 조절에 있어 중요한 역할을 한다(Su, T.T., Annu Rev Genet, 40, 187-208, 2006; Bartek, J., et al., Nat Rev Mol Cell Biol, 2, 877-886, 2001). Chk1 및 Chk2는 유전자 독성 노출에 의해 각각 세린 345(serine 345) 및 트레오닌 68(threonine 68)에서 인산화된다. Chk1 또는 Chk2의 붕괴가 인트라-S 및 G2/M 점검점의 손실을 야기하는 것을 통해, DNA 손상에 대한 반응에서 Chk1 및 Chk2의 역할을 알 수 있다. ATM/Chk2 경로는 방사선 조사에 의해 유도되는 DSB에 주로 반응하는 반면에, ATM/Chk2 경로는 UV 조사 또는 복제 분기점 붕괴에 따른 다량의 DNA 손상에 의해 활성화된다(Zhou, B.B., Nature, 408, 433-439, 2000).

DNA 손상에 대한 반응에서, H2AX는 Ser139(γ-H2AX)에서 인산화되고, DNA 손상 부위에서 분산되어 위치한다(Su, T.T., et al., Annu Rev Genet, 40, 187-208, 2006). DNA 손상에 대한 반응에서 인산화된 H2AX에 대한 PIKK의 능력은 회복 기작의 적절한 위치가 요구되어진다. 따라서, H2AX의 인산화는 DNA 손상 반응 경로가 DNA 손상 자극에 대한 반응으로 활성화되는지를 나타내는 지표이다(Ward, I.M. et al., J Biol Chem, 276, 47759-47762, 2001; Rogakou, E.P., et al., J Biol Chem, 273, 5858-5868, 1998).

다양한 DNA 손상 신호 단백질들은 ATM/ATR-매개 인산화를 위한 표적이고, 다운스트림 표적에 대한 DNA 손상 신호의 전달에 관여한다. DNA 손상 후, 상기 단백질들은 DNA 손상 부위에 모이고, 각 단백질들은 DNA 손상에 의해 유도된 핵내 응집체를 형성한다. 이런 사건의 순서 및 시기는 점검점 반응 및 DNA 회복에 중요한 것으로 고려되고 있다(Stewart, G.S., et al., Nature, 421, 961-966, 2003).

이에, 본 발명자들은 PIG3가 DNA 손상에 대한 세포 반응에 관여하는 분자적 기작을 연구하던 중, PIG3의 녹다운(knockdown)이 세포의 UV 및 방사능유사약물(radiomimetic drug)에 대한 민감도를 증가시키고, DNA 손상에 대한 반응에서 S 단계내(intra-S phase) 및 G2/M 점검점에 결함을 야기하며, DNA 손상에 따른 Chk1 및 Chk2 인산화의 효율적인 유도가 불안정해지며, DNA 손상에 대한 반응에서 H2AX 인산화 및 γ-H2AX 응집을 억제하는 것을 확인함으로써, PIG3가 DNA 손상 억제 신호 경로의 활성 및 유지에 중요한 DNA 손상 경로의 업스트림 성분으로서 기능한다는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 PIG3(p53-inducible gene 3)를 이용하여 방사선 또는 자외선 등의 DNA 손상을 유발하는 유해물질에 대한 DNA 손상을 보호함으로써 세포 저항성을 높이는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PIG3(p53-inducible gene 3)의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암 치료 보조제를 제공한다.

또한, 본 발명은 PIG3의 발현 또는 활성 억제제를 암세포에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 PIG3를 유효성분으로 함유하는 노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 PIG3 유전자 컨스트럭트를 유효성분으로 함유하는 노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 PIG3 또는 PIG3 유전자 컨스트럭트를 유효성분으로 함유하는 조성물을 세포에 투여하는 단계를 포함하는 DNA 손상인자(DNA damaging agents)에 대한 세포의 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 PIG3를 유효성분으로 함유하는 DNA 손상 보호용 조성물은 자외선(UV) 또는 방사선 유사약물에 의하여 발생되는 세포 독성을 억제하고, 세포주기 점검 시스템(cell cycle ckeckpoint)이 정상적으로 작동되는데 관여하며, DNA 손상을 인지하는 DNA 손상 센서가 DNA 손상을 정상적으로 인지하는데 관여함으로써 방사선 또는 자외선 등과 같은 DNA 손상을 유발하는 유해물질에 대한 세포 저항성을 높여 세포의 생존과 유전자 안전성에 기여할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 PIG3의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암 치료 보조제를 제공한다.

상기 PIG3는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 PIG3의 발현 억제제는 PIG3(p53-inducible gene 3) 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA) 또는 작은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA; shRNA)인 것이 바람직하며, PIG3의 활성 억제제는 PIG3에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 암은 직장암, 결장암, 대장암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 PIG의 DNA 손상 반응 관련성을 알아보기 위해, PIG3 siRNA를 이용한 PIG3 녹다운(knockdown) 암세포를 제조한 후, UV 또는 방사능 유사물질 등의 DNA 손상인자에 대한 암세포의 민감도를 세포생존분석(Cell survival assay)을 통해 확인하였다. 그 결과, PIG3 녹다운 세포가 대조군 세포에 비해 DNA 손상인자에 대해 보다 높은 민감도를 나타내었다(도 1b 및 도 1c 참조).

또한, 본 발명자들은 PIG3 녹다운 세포의 DNA 손상 인자에 대한 증가된 민감성이 DNA 손상 회복의 결함에 영향을 미치는지 알아보기 위해, 염색체 지문분석(Pulsed-Field Gel Electrophoresis: PFGE)을 이용하여 DNA 이중 가닥 절단(DNA double-strand break; DSB)의 유지 정도를 확인하였다. 그 결과, PIG3 녹다운 세포가 대조군 세포에 비해 높은 비율로 DSB를 유지하였다(도 2 참조).

따라서, PIG3가 DNA 손상인자에 대한 세포의 민감도를 증가시키고 DNA 손상 회복에 관여한다는 것을 알 수 있다.

또한, 본 발명자들은 PIG3가 DNA 손상에 따른 인트라-S 점검점(intr-S checkpoint) 및 G2/M 점검점(G2/M checkpoint)의 조절에 관여하는지 알아보기 위해, 대조군 및 PIG3 녹다운 암세포에 DNA 손상 인자를 처리한 후, DNA 합성 억제 정도를 브로모디옥시유리딘 결합 분석(BrdU incorporation assay) 및 G2/M 점검점 분석법(G2/M checkpoint analysis)을 이용하여 세포주기 점검점 활성을 분석하였다. 그 결과, 대조군 세포는 상당한 DNA 합성 억제 정도를 나타내었고 G2 단계에서 정지한 반면에, PIG3 녹다운 세포는 효율적으로 인트라-S 단계 점검점 활성을 억제하여 낮은 수준의 DNA 합성 억제 정도를 나타내었고 G2 단계에서 정지하지 않고 유사분열이 진행되었다(도 3a 내지 도 3c 참조).

따라서 PIG3가 DNA 손상시 발생하는 세포주기 점검점 활성에 관여한다는 것을 알 수 있다.

또한, 본 발명자들은 PIG3가 Chk1/Chk2 신호 경로 조절에 관여하는지 알아보기 위해, 대조군 및 PIG3 녹다운 암세포에 DNA 손상 인자를 처리한 후 Chk2, Cdc25A 및 Chk1의 인산화 정도를 면역침강분석(Immunoprecipitation assay) 및 웨스턴블랏분석(western blot analysis)을 이용하여 확인하였다. 그 결과, PIG3 녹다운 세포는 대조군 세포에 비해 DNA 손상 인자에 대한 반응에서 활성 부위인 Thr68에서 Chk2의 인산화 정도가 억제되었고, Cdc25A 발현 수준의 급격한 감소가 억제되었으며, Chk1 Ser345 인산화가 감소하였다(도 4a 내지 도 4c 참조).

따라서 PIG3가 DNA 손상에 대한 반응에서 Chk1/Chk2를 조절하는 것을 알 수 있다. Chk2 및 Chk1의 인산화는 DNA 손상 후 발생하는 세포주기 점검점의 중요한 매개물질로 알려져 있으므로, PIG3가 DNA 손상에 대한 반응으로 Chk1 및 Chk2를 인산화시켜 세포주기 점검점을 정상적으로 작동시키는 것을 알 수 있다.

또한, 본 발명자들은 PIG3가 H2AX 단백질에 의한 DNA 손상 신호에 관여하는지 알아보기 위해, 대조군 및 PIG3 녹다운 암세포에 DNA 손상 인자를 처리한 후 면 역형광현미경(immunofluorescence microscopy) 및 웨스턴블랏분석을 이용하여 γ-H2AX의 응집(foci) 형성 및 H2AX의 인산화 정도를 확인하였다. 그 결과, PIG3 녹다운 세포는 대조군 세포에 비해 DNA 손상 인자에 대한 반응에서 γ-H2AX의 응집 정도 및 H2AX 인산화 정도가 상당히 감소하였다(도 5a 내지 도 5d 참조).

따라서, PIG3가 H2AX 단백질에 대한 DNA 손상 신호에 관여하는 것을 알 수 있으며, PIG3가 DNA 손상 인자에 대한 반응에서 점검점의 활성 뿐만 아니라 DNA 회복을 야기하는 신호에 관여한다는 것을 알 수 있다.

또한, 본 발명자들은 DNA 손상 후 PIG3의 세포내 위치를 알아보기 위해, 암세포에 DNA 손상 인자를 처리한 후 핵 및 세포질 분획(fraction)을 제조하여 각 분획에서 웨스턴블랏분석을 이용하여 PIG3 발현 정도를 분석하였다. 그 결과, PIG3는 주로 세포질 분획에 위치하였으나 약 30%는 핵내에 존재하였다(도 6a 참조). 또한, PIG3의 전장(GFP-tagged full-length), C-말단(1-480 nt) 결핍 돌연변이, 및 N-말단(421-999 nt) 결핍 돌연변이를 암호화하는 발현 컨스트럭트를 제조하여(도 6b 참조) 이를 각각 암세포로 형질전환시킨 후, PIG3 발현 수준을 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. 그 결과, PIG3의 N-말단 부위(1-480 nt)가 핵내 위치에 필수적인 부위인 것을 확인하였다(도 6c 참조).

따라서, PIG3가 N-말단 부위에 의해 핵내에 위치하며, 상기 핵내 PIG3가 DNA 손상 신호에 관여한다는 것을 알 수 있다.

또한, 본 발명자들은 PIG3가 DNA 손상에 대한 반응에서 핵내 응집체 형성 정도 및 위치, 및 DNA 손상 신호 단백질의 응집체와의 관련성을 알아보기 위해, 암세 포에 DNA 손상 인자를 처리한 후 면역형광염색을 이용하여 분석하였다. 그 결과, PIG3 응집체는 핵내 분산되어 있다가 DNA 손상에 대한 반응으로 DNA 절단(break) 부위에 높은 수준의 응집체를 형성하였고, 상기 PIG3 응집체가 γ-H2AX 및 53BP1 응집체와 함께 위치하였으며, γ-H2AX와 결합이 있음을 확인하였다(도 7a 내지 도 7d 참조).

따라서, DNA 손상에 의해 유도된 PIG3 응집이 DSB 프로세싱(processing)의 부위를 나타내며, PIG3가 DNA 손상 신호의 업스트림인 것을 알 수 있으며, PIG3가 DNA 손상에 대한 손상 센서 시스템에 작용하여 정상적인 DNA 손상 모니터링이 이루어지는데 관여하는 것을 알 수 있다.

또한, 본 발명자들은 PIG3가 DNA 손상에 대한 반응에서 PIKK, ATM, ATR, DNA-PK 및 p53에 대한 관련성이 있는지 알아보기 위해, PIKK 억제제를 처리한 세포, ATM, ATR 및 DNA-PK를 녹다운시킨 세포, 및 p53^-/- 세포에서 DNA 손상 인자를 처리한 후 웨스턴블랏분석을 이용하여 PIG3 발현 정도를 확인하였다. 그 결과, PIG3의 응집체는 PIKK 억제제에 의해 발현이 감소하였고, ATM, ATR 및 DNA-PK의 각각의 녹다운에 의해 발현의 유의적 차이가 없었으며, p53^-/- 세포에서 PIG3의 높은 응집체를 형성하였다(도 8a 내지 도 8e 참조).

따라서, PIG3 응집체 형성이 PIKK 계열 중 하나 이상에 의해 관여되고 p53에 의존적인 것을 알 수 있으며, PIG3가 DNA 손상 신호 전달에 직접적으로 관여하는 것을 알 수 있다.

상기 결과를 통해, PIG3의 발현 또는 활성 억제는 자외선 또는 방사능유사약물 등의 DNA 손상인자에 대한 세포의 민감도를 증가시키고, DNA 손상에 대한 반응에서 인트라-S 단계 및 G2/M 점검점의 결함을 야기하며, DNA 손상에 따른 Chk1 및 Chk2 인산화의 효율적인 유도가 불안정해지며, DNA 손상에 대한 반응에서 H2AX 인산화 및 γ-H2AX 응집을 억제하며, Chk1/Chk2의 신호 전달을 억제하여 DNA 손상에 대한 반응 경로의 흠결을 야기함으로써 암세포의 DNA 손상인자에 대한 저항성을 감소시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 PIG3의 발현 또는 활성 억제제는 암세포 치료에 있어서 방사선 또는 항암제 등의 DNA 손상인자 처리시 암세포의 사멸을 증진시킬 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 암 치료 보조제는 상기 PIG3의 발현 또는 활성 억제제에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 암 치료 보조제는, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환 약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 뉴클레오티드 또는 핵산은, 국소, 비경구, 비 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 안 내, 경피 등의 투여를 목적으로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 핵산 또는 벡터가 주사가능한 형태로 사용된다. 이에 따라서 특히 처리될 영역으로는 직접적인 주입을 위하여 주사 가능한 조성물을 위한 임의의 약학적으로 허용되는 매개체와 혼합될 수 있다. 본 발명의 보조제는 특히 등장 멸균 용액 또는 건조 특히 멸균수 또는 적절한 생리 식염수의 첨가에 따라 주사 가능한 용액의 조성을 가능케 하는 동결건조 조성물을 포함할 수 있다. 환자의 종양으로의 핵산의 직접적인 주입은 치료 효율을 감염된 조직에 집중시키도록 하므로 유리하다. 사용되는 핵산의 투여량은 다양한 파라미터, 특히 유전자, 벡터, 사용되는 투여 방식, 문제시되는 질병 또는 대안적으로 요구되는 치료기간에 의해 조절될 수 있다. 또한, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 약 0.001 내지 10.0 mg/kg이고, 바람직하게는 0.01 내지 1.0 mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 PIG3의 발현 또는 활성 억제제를 암세포에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.

상기 PIG3는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 PIG3의 발현 억제제는 PIG3(p53-inducible gene 3) 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA) 또는 작은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA; shRNA)인 것이 바람직하며, PIG3의 활성 억제제는 PIG3에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 암은 직장암, 결장암, 대장암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

암세포에 PIG3의 발현 또는 활성 억제제의 투여는, 자외선 또는 방사능유사약물 등의 DNA 손상인자에 대한 세포의 민감도를 증가시키고, DNA 손상에 대한 반응에서 인트라-S 단계 및 G2/M 점검점의 결함을 야기하며, DNA 손상에 따른 Chk1 및 Chk2 인산화의 효율적인 유도가 불안정해지며, DNA 손상에 대한 반응에서 H2AX 인산화 및 γ-H2AX 응집을 억제하며, Chk1/Chk2의 신호 전달을 억제하여 DNA 손상에 대한 반응 경로의 흠결을 야기함으로써 암세포의 DNA 손상인자에 대한 저항성을 감소시킬 수 있다.

본 발명은 PIG3(p53-inducible gene 3)를 유효성분으로 함유하는 노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 PIG3는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 PIG3(p53-inducible gene 3) 유전자 컨스트럭트를 유효성분으로 함유하는 노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 PIG3 유전자는 서열번호 2로 기재되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

PIG3은 자외선(UV) 또는 방사능유사약물(radiomimetic drug) 등의 DNA 손상인자(DNA damaging agents)에 대한 세포의 민감도를 억제하고, DNA 손상에 대한 회복에 관여하며, DNA 손상 점검점 경로의 활성에 관여하며, DNA 손상에 대한 반응에서 핵내 응집체를 형성하고, Chk1, Chk2 및 H2AX의 인산화에 관여하며, ATM 및 ATR의 다운스트림으로 기능함으로써, 상기 PIG3가 DNA 손상 반응 경로의 중요한 구성 성분이며 DNA 손상 신호 전달에 직접적인 역할을 하는 것을 알 수 있으므로 DNA 손상 보호함으로써 노화 방지에 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 상기 PIG3를 화장료 조성물로 사용하는 경우, 상기 PIG3를 유효성분으로 함유하여 제조되는 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다.

적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 PIG3에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

아울러, 본 발명은 PIG3(p53-inducible gene 3) 또는 PIG3 유전자 컨스트럭트를 유효성분으로 함유하는 DNA 손상 보호용 조성물을 세포에 투여하는 단계를 포함하는 DNA 손상인자(DNA damaging agents)에 대한 세포의 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

상기 PIG3는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 PIG3 유전자는 서열번호 2로 기재되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 DNA 손상인자는 자외선(UV) 또는 방사능유사약물(radiomimetic drug)인 것이 바람직하고, 상기 방사능유사약물은 블레오마이신(bleomycin) 또는 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 PIG3는 자외선 또는 방사능유사약물 등의 DNA 손상인자에 대한 세포의 민감도를 억제하고, DNA 손상에 대한 회복에 관여하며, DNA 손상 점검점 경로의 활성에 관여하며, DNA 손상에 대한 반응에 있어서 핵내 응집체를 형성하고, Chk1, Chk2 및 H2AX의 인산화에 관여하며, ATM 및 ATR의 다운스트림으로 기능함으로써, DNA 손상 반응 경로의 중요한 구성 성분이며 DNA 손상 신호 전달에 직접적인 역할을 하는 것을 알 수 있다.

따라서, PIG3를 유효성분으로 함유하는 DNA 손상 보호용 조성물은 DNA 손상을 유발하는 유해물질에 대한 세포 저항성을 높여 세포의 생존과 유전자 안전성에 기여할 수 있음을 알 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이 며, 본 발명의 내용이 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 세포의 배양 및 DNA 손상 인자 처리

본 발명자들은 직결장암 세포(Colorectal carcinoma cell)인 HCT116 p53^+/+ 및 p53^-/-를 10% 열 불활성 우태혈청(heat inactivated fetal bovine serum)(Cambrex Corp., Walkersville, MD), 100 units/ml 페닐실린, 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 황산염(streptomycin sulfate)(Invitrogen, Carlsbad, CA)가 첨가된 Iscove's modified Dulbecco's 배지(IMDM; Gibco-BRL, Grand Island, NY)에서 5% CO₂ 습식 인규베이터에서 37℃로 배양하였다. HeLa 자궁경부선암세포(cervix adenocarcinoma cell)는 Dulbecco's modified Eagle 배지(DMEM; Gibco-BRL)에서 배양하였다.

방사능유사약물인 블레오마이신(bleomycin)(Sigma, St. Louis, MO) 및 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin)(Sigma)을 최종 농도가 각각 5 mU 및 200 ng/ml가 되도록 상기 세포 배지에 첨가하였다. UV 처리는 세포를 세척한 후, 최소 부피의 무혈청 배지에서 254-nm UVC 램프(UVP; Model UVGL-25)를 이용하여 10 J/m²의 조사선량으로 UV를 노출시켰다. UV를 노출한 세포를 37℃에서 혈청을 포함한 배지에서 배양하였다.

<실시예 2> PIG3 녹다운(knockdown) 세포의 제조

본 발명자들은 PIG3 발현을 녹다운(knockdown)시키기 위하여, NCBI Entrez 뉴클레오티드 데이타베이스로부터 받은 인간 종양 단백질인 p53 유도성 단백질 3(p53 inducible protein 3; TP53I3; PIG3) mRNA 서열(GenBank accession number NM_004881)로부터 작은 간섭 RNA(Small interfering RNA, siRNA) 표적 부위를 선별하였다. 상기 표적 부위가 인간 PIG3에 특이적인지 확인하기 위해, 표적부위를 BLAST 검색(National Center for Biotechnology Information)을 이용하여 조사하였다. 21개의 뉴클레오티드로 구성된 센스 및 안티센스 RNA의 서열은 다음과 같다: 5'-AAAUGUUCAGGCUGGAGACUAdTdT-3'(서열번호: 3) 및 5'-UAGUCUCCAGCCUGAACAUUUdTdT-3'(서열번호: 4). 음성 대조군인 siRNA 듀플렉스(duplex)(Bioneer company, Korea)의 서열은 다음과 같다: 5'-CCUACGCCAAUUUCGUdTdT-3'(서열번호: 5) 및 5'-ACGAAAUUGGUGGCGUAGGdTdT-3'(서열번호: 6). 상기 siRNA 듀플렉스들은 RNAiMAX(Invitrogen)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 세포 내로 형질전환시켰다. 이런 shRNA들은 pSilencerTM hygro 키트(Ambion, Austin, TX)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 전사를 근거로 하는 방법으로 제조하였다. 세포에 인간 U6 프로모터 및 하이그로마이신(hygromycin) 저항 유전자를 포함하는 상기 제조된 pSilencer hygro 벡터(Ambion)를 근거로 하는 shRNA 발현 플라스미드를 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 이용하여 형질전환시켰다. PIG3의 안정적인 녹다운을 위해, psilencer-empty 또는 psilencer-PIG3 벡터로 형질전환시킨 다음 300 μg/ml 하이그로마이신(hygromycin) 내성 콜로니들을 선별하였다. ATM, ATR 및 DNA-PK siRNA 이합체(duplex)는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)에서 구입하였다.

<실시예 3> 전장 PIG3, N-말단 결핍 PIG3, 및 C-말단 결핍 PIG3를 포함하는 세포의 제조

PIG3의 전장, N-말단 결핍 및 C-말단 결핍을 제조하기 위해, 다음과 같은 서열의 PIG3 올리고 프라이머를 이용하는 RT-PCR에 의해 인간 섬유아세포 GM00637로부터 인간 PIG3 cDNA의 각 부위를 증폭하였다: 전장 PIG3 제조를 위한 센스(sense), 5'-AAGGAAATAACCACCATGTTAGCCGTGCAC-3'(서열번호: 7) 및 안티센스(antisense) 5'-CTGGGGCAGTTCCAGGACGATCTT-3'(서열번호: 8); C-말단 결핍 PIG3 제조를 위한 센스, 5'-AAGGAAATAACCACCATGTTAGCCGTGCAC-3'(서열번호: 9) 및 안티센스 5'-GAGTTGGATAGCAGCTGTGCCCACA-3'(서열번호: 10); N-말단 결핍 PIG3 제조를 위한 센스, 5'-AAGGAAARAACCACCATGGGAGACTATGTGCTA-3'(서열번호: 11) 및 안티센스 5'-CTGGGGCAGTTCCAGGACGATCTT-3'(서열번호: 12). 증폭된 PIG3 PCR 산물은 pCR8/GW/TOPO 벡터(invitrogen)로 클론화된 다음, Gateway LR clonase TM II Enzyme Mix(invitrogen)에 의한 LR 반응을 이용하는 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein; GFP)을 포함하는 포유류 발현 pcDNA-DEST47 Gateway^® 벡터 내로 삽입하였다. PIG3 서열 및 배향(orientation)은 자동화된 DNA 시퀀싱(automated DNA sequencing)에 의해 확인하였다. 상기 벡터를 세포에 LipofectAMINE 2000(Invitrogen)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 적절한 플라스 미드 내로 형질전환하였다.

<실험예 1> PIG3 녹다운(knockdown) 세포에서 PIG3의 발현 정도 조사

본 발명자들은 PIG3의 DNA 손상 반응 관련성을 알아보기 위해, PIG3-표적 작은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA; shRNA) 발현 벡터를 포함하는 HCT116 및 HeLa 세포주를 제조한 후, 면역침강분석(Immunoprecipitation assay) 및 웨스턴블랏분석(western blot analysis)을 이용하여 PIG3의 발현 정도를 확인하였다.

구체적으로, 면역침강분석 및 웨스턴블랏분석은 다음과 같이 수행하였다: 세포를 포르테아제 억제제(Roche Diagnostic Corp., Indianapolis, IN)를 포함하는 RIPA 완충용액[50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.5% 소디움 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 0.1% SDS(sodium dodecyl sulfate)] 또는 M-PER 완충용액포유류 단백질 추출 시약([Mammalian Protein Extraction Reagent)(Pierce, Rockford, IL)]에 용해시켰다. 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride, PVDF) 막(Millipore, Bedford, MA) 내로 전기이동(electrotransfer)에 의한 6 ~ 15% SDS-PAGE로 동등한 양의 단백질을 분리하였다. 상기 막은 5% 비-지방 우유를 포함하는 TBS-t(10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 및 0.1% tween-20)로 1시간 동안 블락(block)시킨 다음, 1차 항체로 실내 온도에서 배양하였다. 상기 블락은 TBS-t를 포함하는 0.1% Tween 20로 15분 동안 4번 세척한 후, 퍼록시다제(peroxidase)-결합 2차 항체(1:5000, Jackson ImmunoResearch Inc., West Grove, PA)로 1시간 동안 배양하였다. 상기 막을 4번 세척한 후, 화학 발광 탐지 시스템(chemiluminescence detection system)(ECL; GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)을 이용하여 현상하였다. 면역침강 분석을 위해, RIPA 추출물을 단백질 A-세파로즈 비드(protein A-sepharose bead)(GE Healthcare.)로 전-정제(pre-clear)한 다음, 적절한 항체로 4℃에서 밤새 배양하였다. 단백질 A-세파로즈 비드의 첨가 후, 반응을 순환으로 4℃에서 3시간 동안 배양하였다. 상기 비드를 프로테아제 억제제를 포함하지 않은 RIPA 완충용액으로 5번 세척한 후, SDS 샘플 완충용액에서 재현탁한 다음, 5분 동안 끓였다. 그런 다음, 상기 샘플을 적절한 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. 이때, PIG3 단백질은 1:1000 희석액에서 래빗 다클론 PIG3 항체(rabbit polyclonal PIG3 antibody)(H300, Santa Cruz Biotechnology)에 의해 탐색되었다. 이하, 웨스턴블랏 분석을 위해 다음과 같은 항체들이 사용되었다: 항-αtubulin mAb(TU-02, 1:5000), 항-Cdc25A mAb(1:500), 항-myc mAb(1:500, Santa cruz); 항-Chk1 pAb(1:1000), 항-Chk1-p(S345) pAb(1:1000), 항-Chk2 pAb(1:1000), 항-Chk2-p(T68) pAb(1:1000, Cell Signaling Technology).

그 결과, PIG3 shRNA로 안정적으로 형질전환된 HCT116 및 HeLa 세포주는 각각 스크램블된(대조군) shRNA 형질전환된 세포들에 비해 PIG3의 발현이 90% 이상 감소하였다(도 1a).

<실험예 2> PIG3 녹다운 세포에서 DNA 손상 인자에 대한 민감도 조사

본 발명자들은 대조군 shRNA 및 PIG3 shRNA 발현 세포에서 DNA 손상 시약에 대한 반응을 조사하기 위해, 대조군 및 PIG3 녹다운 HCT116 및 HeLa 세포에 UV 조사 및 방사능 유사물질인 BLM을 각각 처리한 후, 세포생존분석(Cell survival assay)을 수행하였다.

구체적으로, 상기 세포생존분석은 다음과 같이 수행하였다: 대조군 및 PIG3 녹다운 HCT116 및 HeLa 세포에 UV 및 BLM을 각각 처리한 후, 5 × 10² 세포를 60 mm 디쉬(dish)에 접종한 다음 콜로니를 형성하도록 37℃에서 2 ~ 3주 동안 배양하였다. 콜로니를 2% 메틸렌 블루(methylene blue)/50% 에탄올(ethanol)로 염색한 후 카운팅하였다. 살아있는 세포의 분획은 처리하지 않은 세포에 대한 처리된 세포의 플레이팅 효율(plating efficiency)의 비율로 산출하였다. 모든 데이타는 3개의 독립적인 실험을 통해 평균 ± 표준편차를 결정하였으며, 통계적 비교는 이표본 t검정(unpaired t test)를 이용하여 수행되었다. p 값 < 0.01이 통계적 유의성이 있는 것으로 고려되었다.

그 결과, PIG3 녹다운 세포들은 대조군 세포들에 비해 UV 및 BLM에 대해 상당히 높은 민감도를 나타내었다(도 1b 및 도 1c).

<실험예 3> PIG3 녹다운 세포에서 DNA 손상의 회복 정도 조사

본 발명자들은 PIG3 녹다운 세포의 DNA 손상 인자에 대한 증가된 민감성이 DNA 손상 회복의 결함에 영향을 미치는지 알아보기 위해, 염색체 지문분석(Pulsed-Field Gel Electrophoresis: PFGE)을 이용하여 PIG3 녹다운 세포들에서 UV-유도 DNA 손상에 대한 회복 활성 정도를 조사하였다. PIG3 녹다운 세포 및 대조군 세포에 각각 UV 조사 후, DNA 이중 가닥 절단(DNA double-strand break; DSB)의 유지 정도를 확인하였다.

구체적으로, 상기 염색체 지문분석은 다음과 같이 수행하였다: DSB 재결합(rejoining) 정도를 조사하기 위해, 우선 세포를 10 J/m2의 UV 조사에 노출시켰다. 다양한 회복 시간(0, 4, 8, 12, 16 및 20시간)후, 상기 세포를 1% CleanCut 아가로즈(Bio-Rad, Hercules, CA)에 재현탁한 다음, 아가로즈 플러그(agarose plug) 내로 넣었다. 고체화된 아가로즈 플러그(solidified agarose plug)를 제조사(Roche Diagnostic Corp., Indianapolis, IN)의 지시에 따라 1% N-라울로일 사르코신(N-lauroyl sarcosine), 100 mM EDTA[pH 8.0], 0.2% 소디움 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 및 1 mg/ml 프로테이나제 K(proteinase K)에서 밤새 용해시켰다. 상기 플러그를 세척 완충용액에 세척한 후, 1.5 V/cm의 전계 강도(field strength)를 가지는 14℃, 0.5 × TBE에서 CHEF DRII 기구(Bio-Rad)를 이용하여 CHEF 겔 전기영동을 수행하였다. 펄스(Pulse) 시간은 50 ~ 65시간 동안 50에서 5000까지 증가하였다. 겔을 0.5 μg/ml EtBr(ethidium bromide)로 염색하였다. 플러그로부터 레인 내로 이동한 DNA 분획(추출된 % DNA)을 UV 트랜스일루미네이터(transilluminator)를 이용하여 측정한 후 Scion 이미지 소프트웨어(Scion Corp., Frederick, MD)를 이용하여 이미지를 분석하였다.

그 결과, PIG3 녹다운 세포가 대조군 세포에 비해 높은 비율로 DSB를 유지하였다(도 2). 대조군 HCT116 및 HeLa 세포는 20시간 동안 결합되지 않고 남은 DNA 절단이 20% 이하로써 대부분의 DSB를 효율적으로 회복한 반면에, PIG3-결핍 HCT116 및 HeLa 세포는 결합되지 않고 남은 DNA 절단이 약 40 ~ 50%로써 DSB 회복에서 높은 결함을 나타내었다. 따라서 PIG3 녹다운이 DNA 손상을 회복시키는 능력을 손상시키는 것을 알 수 있었다.

<실험예 4> PIG3 녹다운의 인트라(intra)-S 및 G2/M DNA 손상 점검점에 미치는 영향 조사

본 발명자들은 PIG3가 DNA 손상에 따른 인트라(intra)-S 및 G2/M 점검점의 조절에 관여하는지 조사하였다. 우선, 인트라-S 단계 점검점에서 PIG3의 역할을 결정하기 위해, 대조군 및 PIG3 결핍 HeLa 세포를 UV, BLM 및 NCS로 각각 처리한 후, DNA 합성 억제 정도를 브로모디옥시유리딘 결합 분석[BrdU(bromodeoxyuridine) incorporation assay]을 이용하여 측정하였다.

구체적으로, 상기 BrdU 결합 분석은 다음과 같이 수행하였다: S 단계에 있는 세포군을 조사하기 위해, 제조사(Roche Diagnostic)의 지시에 따라 BrdU의 결합을 DNA 합성의 매개변수로 이용하여 모니터하였다. 대조군 및 PIG3-결핍 세포를 48-웰 플레이트에 접종한 후 24시간 동안 NCS, BLM 및 UV로 각각 처리하였다. 24시간 후, 10 μM BrdU를 새롭게 합성된 DNA 내로 결합시키기 위해 배양 배지에 첨가한 다음, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 고정시킨 후, 세포내 DNA를 뉴클레아제(nuclease) 처리에 의해 부분적으로 용해시켰다. BrdU에 대한 퍼록시다제(peroxidase)-표지 항체 및 퍼록시다제 기질을 연속적으로 첨가하여 세포 내 DNA로 통합된 BrdU 수준의 비율로 착색된 산물을 생산하였다. 착색된 산물을 대략 490 nm에서 표준 파장을 가지는 마이클로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 405 nm에서 측정하였다. 상대적인 DNA 합성은 대조군 세포의 흡광도에 대한 DNA 손상 인자로 처리된 세포의 흡광도의 비율로 산출하였다. 모든 데이타는 3개의 독립적인 실험을 통해 평균 ± 표준편차를 결정하였으며, 통계적 비교는 이표본 t검정(unpaired t test)를 이용하여 수행되었다. p 값 < 0.01이 통계적 유의성이 있는 것으로 고려되었다.

그 결과, 도 3a에서 보는 바와 같이 UV, BLM 및 NCS로 각각 처리한 Hela 대조군 세포들은 상당한 DNA 합성 억제 정도를 나타낸 반면에, PIG3-결핍 세포들은 효율적으로 인트라-S 단계 점검점 활성을 억제하여, 낮은 수준의 DNA 합성 억제 정도를 나타내었다(도 3a). 따라서, PIG3가 인트라-S 단계 점검점 활성에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 G2/M 점검점에서 PIG3 녹다운의 효과를 조사하기 위해, 대조군 및 PIG3 결핍 HeLa 세포를 처리하지 않거나(mock-treated) NCS 또는 UV로 처리한 후, G2/M 점검점 분석법(G2/M checkpoint analysis)을 수행하였다.

구체적으로, 상기 G2/M 점검점 분석은 기존에 보고된 방법(Kolas, N.K., et al., Science, 318, 1637-1640, 2007; Reinhardt, H.C., et al., Cancer Cell, 11, 175-189, 2007)에 따라 수행하였다. 대조군 및 PIG3 결핍 HeLa 세포를 200 ng/ml NCS 및 10 J/m2 UV로 각각 처리한 후, 3시간 동안 100 ng/ml 노코다 졸(nocodazole)-포함 배지에 접종하였다. 상기 세포를 채취한 후, PBS로 세척한 다음, 37℃에서 10분 동안 1% 포름알데하이드(formaldehyde)로 고정시켰다. 상기 세포를 1분 동안 냉각시킨 다음, 0℃에서 90% 메탄올로 밤새 투과하였다. 상기 고정된 세포를 PBS로 세척한 후, 배양 완충용액(0.5% BSA 포함 PBS)으로 10분 동안 블락시켰다. 상기 세포를 암실에서 실내온도로 1시간 동안 배양 완충용액에서 1:10로 희석한 항-인산-히스톤 H3(S10)-Alexa Fluor 647-결합 항체(Cell Signaling Technology, Boston, MA)로 염색한 후, 세척한 다음, 50 μg/ml 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide, PI)를 포함한 PBS에 재현탁하였다. 적어도 10,000개의 세포가 형광-활성 세포 분류기[fluorescence-activated cell sorting(FACSort, Becton Dickinson, San Jose, CA)]에 의해 분석되었다. 획득한 데이타는 CellQuest Pro 소프트웨어(Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다.

그 결과, 도 3b 및 도 3c에서 보는 바와 같이 대조군 세포는 G2 단계에서 정지한 반면에, 대부분의 PIG3 결핍 세포들은 유사분열이 진행되었다(도 3b 및 도 3c). 따라서, PIG3가 DNA 손상에 대한 저항에 관여하는 DNA 손상 점검점에서 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다.

<실험예 5> PIG3 녹다운의 DNA 손상 후 Chk1 및 Chk2의 인산화에 미치는 영향 조사

본 발명자들은 PIG3 녹다운 세포들에서 세포주기 흠결의 분자적 특성이 관찰되는지 알아보기 위해, PIG3가 NCS에 대한 반응으로 Chk1/Chk2 신호 경로를 조절하는 역할을 하는지 조사하였다. 대조군 및 PIG3-결핍 HeLa 세포들에 NCS를 처리한 후, Chk2의 인산화 정도를 상기 <실시예 1>과 같은 방법의 면역블랏팅을 이용하여 조사하였다.

그 결과, 도 4a에서 보는 바와 같이 PIG3-결핍 세포는 대조군 세포에 비해 NCS로 처리되었을 때 활성 부위인 Thr68에서 Chk2의 인산화 정도가 억제되었다(도 4a). 대조군 HeLa 세포는 NCS 처리 3시간 후에 Thr68-인산화된 Chk2가 축적되어 NCS 처리 후 6시간에 걸쳐서 지속되었다. 이와 대조적으로, PIG3 결핍 세포는 특정 시점에서 Chk2의 인산화가 상당히 감소하였다. 따라서, 비인산화된 Chk2의 수준은 세포가 대조군 또는 PIG3 siRNA를 발현하는지를 나타내고, 이는 PIG3-결핍 세포에서 Chk2 인산화의 결핍이 내생 Chk2 수준을 조절하는 PIG3에 기인하는 것이 아님을 알 수 있었다.

또한, 활성화된 Chk2가 인산화분해효소인 Cdc25A의 인산화 및 퇴화에 관련성이 있으므로(Sancar, A., et al., Annu Rev Biochem, 73, 39-85, 2004), NCS에 노출된 대조군 및 PIG3-결핍 HeLa 세포에서 Cdc25A의 발현 수준을 상기 <실시예 1>과 같은 방법의 면역블랏팅을 이용하여 조사하였다.

그 결과, 도 4b에서 보는 바와 같이 PIG3-결핍 HeLa 세포는 대조군 세포에 비해 NCS 처리 후 Cdc25A 발현 수준의 급격한 감소가 나타나지 않았다(도 4b).

또한, UV 조사에 따른 Chk1의 활성에 대한 PIG3 녹다운의 영향을 상기와 동일한 방법으로 조사하였다.

그 결과, 도 4c에서 보는 바와 같이 PIG3-결핍 HeLa 세포는 대조군 세포에 비해 UV에 반응한 Chk1 Ser345 인산화가 감소하는 것으로 나타났다. 대조군 HeLa 세포는 UV 조사 후 6시간 후에 Ser345-인산화된 Chk1가 축적된 반면에, PIG3 결핍 HeLa 세포는 Chk1 인산화가 상당히 억제되었다(도 4c).

따라서 PIG3가 DNA 손상에 대한 반응에서 Chk1/Chk2를 조절하는 역할을 하는 것을 알 수 있었다.

<실험예 6> PIG3 녹다운의 DNA 손상 후 H2AX의 인산화에 미치는 영향 조사

본 발명자들은 PIG3 녹다운 세포에서 불안정 점검점 신호로부터 야기되는 세포독성 효과 및 점검점 회피가 관찰되는지 알아보기 위해, 히스톤 변이 H2AX의 인산화 정도를 조사하였다. 이에, 대조군 HeLa 및 HCT116 세포, 및 PIG3 녹다운 HeLa 및 HCT116 세포에서 γ-H2AX의 응집(foci) 형성이 나타나는지를 알아보기 위해, 면역형광현미경(immunofluorescence microscopy) 분석을 이용하여 조사하였다.

구체적으로, 상기 면역형광 현미경 분석은 다음과 같이 수행하였다: 핵내 응집체를 시각화하기 위해, 폴리-L-라이신(poly-L-lysine)(Sigma)으로 코팅된 커버 슬립에 배양된 세포에 UV, NCS 및 BLM로 각각 처리된 다음, 적절한 시간 동안 회복시켰다. 상기 세포를 PBS로 두번 세척한 후, 10분 동안 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 및 5분 동안 얼린 98% 메탄올로 고정시킨 다음, 실내 온도에서 0.3% Triton X-100로 투과하였다. 그런 다음, 커버 슬립을 PBS로 세번 세척한 후, 1시간 동안 5% BSA 포함 PBS에서 블락시켰다. 상기 세포를 4℃에서 밤새 다양한 단백질에 대한 1차 항체로 단독 또는 이중 면역염색하였다. 그런 다음, 상기 세포를 PBS로 세척한 후, Alexa Fluor 488-(green, Molecular Probes) or Alexa Fluor 594-(red, Molecular Probes) 결합 2차 항체로 염색하였다. 세척 후, 상기 세포를 4,6 디아미디노-2-페닐인돌(4,6 diamidino-2-phenylindole)(Vector Laboratories, Burlingame, CA)을 포함하는 Vectashield 고정 배지(mounting medium)를 이용하여 고정시켰다. 형광 이미지(Fluorescence images)를 전하-결합 소자 카메라(charge-coupled device camera) 및 ISIS 소프트웨어(MetaSystems, Altlussheim, Germany)가 갖추어진 Zeiss Axioplan 2 이미징 형광 현미경(imaging epifluorescent microscope)을 이용하여 촬영하였다.

이때, PIG3 응집체(foci)는 1:50 희석액으로 PIG3 항체를 이용한 면역형광 염색(immunofluorescence staining)으로 탐색하였다. γ-H2AX는 1:200 및 1:1000 희석액에서 각각 마우스 단클론 항체(mouse monoclonal antibody), 클론 JBW301(Upstate Biotechnology, Temecula, CA)를 포함하는 IF 및 WB에 의해 탐색하였다. H2AX 항체는 Upstate로부터 구입하였다. 면역형광염색을 위해 다음과 같은 항체들이 사용되었다: 항-53BP 다클론 항체(Santa cruz, 1:50), 항-ATM 단백질 키나아제 pS1981 단클론 항체(Rockland, Immunochemicals Ins., 1:500), 항-DNA-PK 다클론 항체(Santa cruz, 1:50), 및 항-ATR 다클론 항체(Santa cruz, 1:50).

그 결과, 도 5a 및 도 5b에서 보는 바와 같이 대조군 HeLa 및 HCT116 세포는 γ-H2AX의 응집 형성 유도가 즉시 나타났으며, 상기 응집 형성이 NCS 및 UV를 각각 처리한 후 약 30분에 더 크고 밝게 나타났다(도 5a 및 도 5b). γ-H2AX 응집수는 NCS 및 UV를 각각 처리한 후 24시간에 감소하였다. 반면에, PIG3 녹다운 세포들은 대조군 세포들에 비해 NCS 및 UV 처리 후 γ-H2AX의 응집이 급속도로 형성되었으나 상기 γ-H2AX의 응집 정도가 상당히 감소하였다. 관찰된 γ-H2AX의 응집수는 DSB에 상응하지 않았다. 이는 탐지 역가 이하의 약한 γ-H2AX 신호 때문일 것이다.

또한, PIG3가 DNA 손상 후 H2AX 인산화에 미치는 영향을 상기 <실시예 1>과 같은 방법의 면역블랏팅을 이용하여 조사하였다.

그 결과, 도 5c 및 도 5d에서 보는 바와 같이 PIG3-결핍 세포는 UV 및 NCS 처리 후 상당히 감소된 H2AX 인산화를 나타내었으며 이는 면역형광 분석 결과와 일치하는 것이었다. 대조군 HeLa 및 HCT116 세포는 NCS 및 UV에 각각 노출된 후 1 내지 3시간 내에 급속히 증가한(도 5c 및 도 5d) 반면에, PIG3 녹다운 세포는 대조군 세포에 비해 H2AX의 인산화가 거의 나타나지 않았다.

따라서, PIG3 결핍이 H2AX 단백질에 대한 DNA 손상의 신호를 억제하는 것을 알 수 있으며, 이는 PIG3가 UV 또는 방사능 유사약물에 대한 반응에서 점검점의 활성 뿐만 아니라 DNA 회복을 야기하는 신호에 관여한다는 것을 알 수 있었다.

<실험예 7> PIG3의 N-말단 부위(terminal region)의 핵내 위치 조사

PIG3가 p53을 발현하는 H1299 세포의 세포질에 위치한다는 보고가 있으나(Flatt, P.M., et al. Cancer Lett, 156, 63-72, 2000) DNA 손상 반응 관련 신호 단백질은 종종 핵내에서 기능한다.

이에, 본 발명자들은 DNA 손상 후 PIG3의 세포내 위치를 조사하였다. 우선, UV 처리 또는 처리되지 않은 HCT116 세포로부터 핵 및 세포질 분획(fraction)을 제조한 후, 각 분획에서 PIG3 발현 정도를 분석하였다.

구체적으로, 세포내 분획의 제조는 다음과 같이 수행하였다: HCT116 세포를 채취한 후, 프로테아제 억제제(Roche)를 포함하는 세포질 추출물 완충용액[CEB; 10 mM HEPES [pH 7.5], 3 mM MgCl2, 14 mM KCl, 5% 글리세롤(glycerol), 1 mM DTT]에서 냉장고에서 10분 동안 용해하였다. 완전한 용해를 위해, 0.2% NP-40를 첨가한 후 10초 동안 보르텍싱(vortexing)하였다. 8,600 × g로 2분 동안 원심분리한 후, 상청액(세포질 추출물)을 새로운 튜브에 이동시켰다. 펠렛(pellet)을 CEB에 3번 세척한 다음, 프로테아제 억제제를 포함하는 핵 추출물 완충용액(NEB; 10 mM HEPES [pH 7.5], 3 mM MgCl2, 400 mM NaCl, 5% glycerol, 1 mM DTT)에서 4℃에서 30분 동안 용해시킨 후, 13,200 rpm으로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액은 핵 추출물을 포함하였다. 상기 세포질 및 핵 분획은 알파-튜블린(α-tubulin) 및 γ-H2AX가 상기 각 분획에 양립할 수 없게 존재하는 것을 확인함으로써 성공적인 분획화가 이루어졌음을 알 수 있었다.

그 결과, PIG3는 주로 세포질 분획에 위치하였으나 약 30% 정도는 핵내에 존재하였다(도 6a).

또한, PIG3의 세포내 위치를 추가적으로 확인하기 위해, 상기 <실시예 3>과 같이 제조된 GFP로 표지된 PIG3의 전장(GFP-tagged full-length), C-말단(1-480 nt) 결핍 돌연변이, 및 N-말단(421-999 nt) 결핍 돌연변이를 암호화하는 발현 컨스트럭트를(도 6b) 각각 HCT116 세포로 형질전환시킨 후, 각 컨스트럭트로부터 PIG3 발현 수준을 PIG3 및 GFP 항체를 이용하여 상기 <실험예 1>과 같이 웨스턴 블랏팅 으로 분석하였다.

그 결과, 도 6c에서 보는 바와 같이 PIG3의 N-말단 부위(1-480 nt)가 핵내 위치에 필수적인 부위이고, 상기 부위는 UV 조사에 의해 증가하는 것을 확인하였다(도 6c). 따라서 PIG3는 핵과 세포질 모두에서 위치하며, 핵내 PIG3가 DNA 손상 신호에 관여한다는 것을 알 수 있었다.

<실험예 8> PIG3가 DNA 손상에 대한 반응으로 핵내 응집을 형성하고 γ-H2AX와 함께 위치(colocalize)하는지 조사

본 발명자들은 PIG3가 UV- 또는 NCS-유도된 핵내 응집체를 형성하는지 상기 <실험예 6>과 같은 방법의 면역형광 염색을 이용하여 조사하였다.

그 결과, UV 또는 NCS로 처리하지 않은 HeLa 및 HCT116 세포에서는 핵내 분산된 염색이 나타났으나(도 7a), UV 및 NCS로 각각 처리한 세포들은 PIG3가 즉시 핵내 응집체를 형성하였고 상기 응집체의 수 및 정도가 증가하였다.

또한, UV 또는 NCS에 의해 유도된 PIG3 응집은 DNA 절단(break)의 실제 부위를 나타내는지 알아보기 위해, DNA 손상 유도 PIG3의 응집체의 위치를 조사하였다.

그 결과, PIG3의 응집체가 γ-H2AX 및 53BP1 응집체와 함께 위치하고, γ-H2AX와 물리적 상호작용이 있음을 확인하였다(도 7b 내지 도 7d). 따라서, UV 또는 NCS에 의해 유도된 PIG3 응집이 DSB 프로세싱(processing)의 부위를 나타내며, PIG3가 DNA 손상 신호의 업스트림인 것을 알 수 있었다.

또한, ATM, ATR 및 DNA-PK 단백질은 MRN 복합체, γH2AX 및 53BP1의 응집체 형성에 관여하는 것이 보고된 바 있다(Yang, J., et al., Carcinogenesis, 24, 1571-1580, 2003).

이에, PIG3 응집체 형성이 PIKK에 의존적인지를 조사하였다. PIKK 억제제인 워트만닌(wortmannin)으로 처리한 후 DNA 손상에 대한 반응에서 PIG3 응집체 형성 정도를 관찰하였다.

그 결과, 워트만닌 처리 후 PIG3 응집체가 감소하였다(도 8a).

또한, ATM, ATR 및 DNA-PK를 이들에 특이적인 siRNA로 형질전환시켜 결핍시킨 HeLa 세포에서 PIG3의 응집체 형성 정도를 관찰하였다.

그 결과, 대조군 세포와 ATM, ATR 및 DNA-PK를 각각 녹다운시킨 세포들 사이 PIG3 응집체 형성 정도에서 유의적인 차이는 없었다(도 8b 내지 도 8d). 따라서 PIG3 응집이 PIKK 계열 중 하나 이상에 의해 관여되는 것을 알 수 있었다.

또한, PIG3가 p53의 다운스트림 표적 유전자이므로 PIG3 응집체 형성이 p53에 의존적인지 조사하였다.

그 결과, PIG3으로 형질전환된 HCT116 p53^-/- 세포에서 DNA 손상 후 PIG3 응집체가 관찰되었다(도 8e). 따라서 PIG3 응집체 형성이 p53에 의존적인 것을 알 수 있었다.

하기는 본 발명의 PIG3을 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<제조예 1> 정제(직접 가압)

PIG3 5.0 ㎎을 락토스 14.1 ㎎, 크로스포비돈 USNF 0.8 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 0.1 ㎎을 혼합하고 가압하여 정제로 제조하였다.

<제조예 2> 정제(습식 조립)

PIG3 5.0 ㎎을 락토스 16.0 ㎎과 녹말 4.0 ㎎을 섞었다. 폴리솔베이트 80 0.3 ㎎을 순수한 물에 녹인 후 이 용액의 적당량을 첨가한 다음, 미립화하였다. 건조 후에 미립을 체질한 후 콜로이달 실리콘 디옥사이드 2.7 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 2.0 ㎎과 섞었다. 미립을 가압하여 정제로 제조하였다.

<제조예 3> 분말과 캡슐제

PIG3 5.0 ㎎을 락토스 14.8 ㎎, 폴리비닐 피롤리돈 10.0 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎와 함께 혼합하였다. 상기 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 채웠다.

<제조예 4> 주사제

PIG3 100 mg을 함유시키고, 그 밖에도 만니톨 180 mg, Na₂HPO₄12H₂O 26 mg 및 증류수 2974 mg를 함유시켜 주사제를 제조하였다.

<제조예 5> 유화 제형의 화장품 제조

하기 표 1에 기재된 조성으로 유화제형의 화장품을 제조하였다. 제조 방법은 하기와 같다.

1) 1 내지 9의 원료를 혼합한 혼합물을 65∼70℃로 가열하였다.

2) 10의 원료를 상기 단계 1)의 혼합물에 투입하였다.

3) 11 내지 13의 원료의 혼합물을 65∼70℃로 가열하여 완전히 용해시켰다.

4) 상기 단계 3)을 거치면서, 상기 2)의 혼합물을 서서히 첨가하여 8,000 rpm에서 2∼3분간 유화시켰다.

5) 14의 원료를 소량의 물에 용해시킨 후 상기 단계 4)의 혼합물에 첨가하고 2분간 더 유화시켰다.

6) 15 내지 17의 원료를 각각 평량한 후 상기 단계 5)의 혼합물에 넣고 30초간 더 유화시켰다.

7) 상기 단계 6)의 혼합물을 유화 후 탈기과정을 거쳐 25∼35℃로 냉각시킴으로써 유화제형의 화장품을 제조하였다.

유화 제형 1, 2, 3의 조성

조성		유화제형 1	유화제형 2	유화제형 3
1	스테아린 산	0.3	0.3	0.3
2	스테알리 알콜	0.2	0.2	0.2
3	글리세릴 모노스테아레이트	1.2	1.2	1.2
4	밀납	0.4	0.4	0.4
5	폴리옥시에틸렌솔비탄 모노라우린산 에스테르	2.2	2.2	2.2
6	파라옥시안식향산 메틸	0.1	0.1	0.1
7	파라옥시안식향산 프로필	0.05	0.05	0.05
8	세틸에틸헥사노에이트	5	5	5
9	트리글리세라이드	2	2	2
10	사이클로메티콘	3	3	3
11	증류수	~ 100	~ 100	~ 100
12	농글리세린	5	5	5
13	트리에탄올아민	0.15	0.15	0.15
14	폴리아크릴산 중합체	0.12	0.12	0.12
15	색소	0.0001	0.0001	0.0001
16	향	0.10	0.10	0.10
17	PIG3	0.0001	1	10

<제조예 6> 가용화 제형의 화장품 제조

하기 표 2에 기재된 조성으로 가용화 제형의 화장품을 제조하였다. 제조 방법은 하기와 같다.

1) 2 내지 6의 원료를 1의 원료(정제수)에 넣고 아직믹서를 이용하여 용해시켰다.

2) 8 내지 11의 원료를 7의 원료(알코올)에 넣고 완전용해시켰다.

3) 상기 단계 2)의 혼합물을 상기 단계 1)의 혼합물에 서서히 첨가하면서 가용화시켰다.

가용화 제형 1, 2, 3의 조성

조성		가용화 제형 1	가용화 제형 2	가용화 제형 3
1	정제수	~ 100	~ 100	~ 100
2	농글리세린	3	3	3
3	1,3-부틸렌글리콜	2	2	2
4	EDTA-2Na	0.01	0.01	0.01
5	색소	0.0001	0.0002	0.0002
6	PIG3	0.1	5	5
7	알코올(95%)	8	8	8
8	파라옥시안식향산 메틸	0.1	0.1	0.1
9	폴리옥시에틸렌 하이드로제네이디트에스테르	0.3	0.3	0.3
10	향	0.15	0.15	0.15
11	사이클로메티콘	-	-	0.2

본 발명의 PIG3는 자외선 또는 방사능유사약물 등의 DNA 손상인자에 의해 유발되는 DNA 손상에 대한 세포 저항성 증가방법 연구에 이용될 수 있으며, 암세포에서 PIG3의 발현을 억제하여 DNA 손상에 대한 세포 저항성을 감소시켜 DNA 손상인자에 의한 세포사멸 촉진방법 연구에 이용될 수 있다.

도 1a는 PIG3 shRNA 발현 벡터를 포함하는 PIG3 녹다운(knockdown) HCT116 및 HeLa 세포에서 웨스턴블랏분석(western blot analysis)을 이용하여 분석한 PIG3의 발현 정도를 나타내는 그림이다.

도 1b는 PIG3 녹다운 HCT116 및 HeLa 세포에서 UV 처리 후, 세포생존분석(Cell survival assay)을 이용하여 분석한 세포 생존률을 나타내는 그래프이다.

도 1c는 PIG3 녹다운 HCT116 및 HeLa 세포에서 블레오마이신(bleomycin; BLM) 처리 후, 세포생존분석을 이용하여 분석한 세포 생존률을 나타내는 그래프이다.

도 2는 PIG3 녹다운 HCT116 및 HeLa 세포에서 UV 처리 후, 염색체 지문분석(Pulsed-Field Gel Electrophoresis: PFGE)을 이용하여 분석한 DNA 이중나선절단(DNA double strand breaks; DSBs)의 복구 정도를 나타내는 그래프이다.

도 3a는 PIG3 녹다운 HeLa 세포에서 UV, BLM 및 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin; NCS)로 각각 처리한 후, 브로모디옥시유리딘 결합 분석[BrdU(bromodeoxyuridine) incorporation assay]을 이용하여 분석한 DNA 합성 정도를 나타내는 그래프이다.

도 3b는 PIG3 녹다운 HeLa 세포에서 무처리(mock-treated), NCS 또는 UV로 처리한 후, G2/M 점검점 분석법(G2/M checkpoint analysis)을 이용하여 형광-활성 세포 분류기(fluorescence-activated cell sorting)로 측정된 pH3 양성 세포수(M 단계에 존재하는 세포 정도)를 나타내는 그래프이다.

도 3c는 상기 도 3B의 데이타를 통합하여 상대적인 pH3 양성 세포 정도를 비교하여 나타내는 그래프이다.

도 4a는 PIG3 녹다운 HeLa 세포에서 NCS를 처리한 후, 웨스턴블랏분석을 이용하여 분석한 Chk2의 인산화 정도를 나타내는 그림이다.

도 4b는 PIG3 녹다운 HeLa 세포에서 NCS를 처리한 후, 웨스턴블랏분석을 이용하여 분석한 Cdc25A의 발현 정도를 나타내는 그림이다.

도 4c는 PIG3 녹다운 HeLa 세포에서 UV를 처리한 후, 웨스턴블랏분석을 이용하여 분석한 Chk1의 인산화 정도를 나타내는 그림이다.

도 5a는 PIG3 녹다운 HeLa 세포에서 NCS를 처리한 후, 면역형광현미경(immunofluorescence microscopy) 이용하여 분석한 γ-H2AX의 응집(foci) 형성 정도를 나타내는 그림이다.

도 5b는 PIG3 녹다운 HeLa 세포에서 UV를 처리한 후, 면역형광현미경 이용하여 분석한 γ-H2AX의 응집체(foci) 형성 정도를 나타내는 그림이다.

도 5c는 PIG3 녹다운 HCT116 및 HeLa 세포에서 NCS를 처리한 후, 웨스턴블랏분석을 이용하여 분석한 γ-H2AX의 발현 정도를 나타내는 그림이다.

도 5d는 PIG3 녹다운 HCT116 및 HeLa 세포에서 UV를 처리한 후, 웨스턴블랏분석을 이용하여 분석한 γ-H2AX의 발현 정도를 나타내는 그림이다.

도 6a는 UV 처리 또는 처리되지 않은 HCT116 세포로부터 핵 및 세포질 분획(fraction)을 제조한 후, 각 분획에서 웨스턴블랏분석을 이용하여 분석한 PIG3 발현 정도를 나타내는 그림이다.

도 6b는 GFP로 표지된 PIG3의 전장(GFP-tagged full-length), C-말단(1-480 nt) 결핍 돌연변이, 및 N-말단(421-999 nt) 결핍 돌연변이를 암호화하는 발현 컨스트럭트를 나타내는 그림이다.

도 6c는 상기 도 6B의 컨스트럭트를 각각 HCT116 세포로 형질전환시킨 세포에서 UV를 처리한 후, 웨스턴블랏분석을 이용하여 분석한 PIG3 발현 정도를 나타내는 그림이다.

도 7a는 HeLa 세포에서 UV 및 NCS를 각각 처리한 후, 면역형광 현미경을 이용하여 분석한 핵내 응집체 형성 정도를 나타내는 그림이다.

도 7b는 HeLa 세포에서 UV, BLM 및 NCS를 각각 처리한 후, 면역형광 현미경을 이용하여 분석한 PIG3와 γ-H2AX의 응집체 위치를 나타내는 그림이다.

도 7c는 HeLa 세포에서 UV, BLM 및 NCS를 각각 처리한 후, 면역형광 현미경을 이용하여 분석한 PIG3와 53BP1 응집체 위치를 나타내는 그림이다.

도 7d는 HeLa 세포에서 UV를 처리한 후, 면역형광 현미경을 이용하여 분석한 PIG3와 γ-H2AX이 결합함을 나타내는 그림이다.

도 8a는 HeLa 세포에서 PIKK 억제제인 워트만닌(wortmannin)을 처리한 후, 면역형광 현미경을 이용하여 분석한 PIG3 응집체 형성 정도를 나타내는 그림이다.

도 8b는 HeLa 세포에서 운동실조 모세혈관 확장성 돌연변이(ataxia telangiectasia mutated; ATM) siRNA로 형질전환시켜 ATM을 결핍시킨 후, UV 또는 NCS를 각각 처리한 다음, 면역형광 현미경을 이용하여 분석한 PIG3의 응집체 형성 정도를 나타내는 그림이다.

도 8c는 HeLa 세포에서 ATM 및 Rad3 관련 단백질(ATM and Rad3 related; ATR) siRNA로 형질전환시켜 ATR을 결핍시킨 후, UV 또는 NCS를 각각 처리한 다음, 면역형광 현미경을 이용하여 분석한 PIG3의 응집체 형성 정도를 나타내는 그림이다.

도 8d는 HeLa 세포에서 DNA 의존성 단백질 키나아제(DNA dependent protein kinases; DNA-PK) siRNA로 형질전환시켜 DNA-PK를 결핍시킨 후, UV 또는 NCS를 각각 처리한 다음, 면역형광 현미경을 이용하여 분석한 PIG3의 응집체 형성 정도를 나타내는 그림이다.

도 8e는 PIG3으로 형질전환된 HCT116 p53^-/- 세포에서 UV, BLM 및 NCS를 각각 처리한 후, 면역형광 현미경을 이용하여 분석한 PIG3의 응집체 형성 정도를 나타내는 그림이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University <120> A method for protecting DNA damage using PIG3 <130> 8p-12-45 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Ala Val His Phe Asp Lys Pro Gly Gly Pro Glu Asn Leu Tyr 1 5 10 15 Val Lys Glu Val Ala Lys Pro Ser Pro Gly Glu Gly Glu Val Leu Leu 20 25 30 Lys Val Ala Ala Ser Ala Leu Asn Arg Ala Asp Leu Met Gln Arg Gln 35 40 45 Gly Gln Tyr Asp Pro Pro Pro Gly Ala Ser Asn Ile Leu Gly Leu Glu 50 55 60 Ala Ser Gly His Val Ala Glu Leu Gly Pro Gly Cys Gln Gly His Trp 65 70 75 80 Lys Ile Gly Asp Thr Ala Met Ala Leu Leu Pro Gly Gly Gly Gln Ala 85 90 95 Gln Tyr Val Thr Val Pro Glu Gly Leu Leu Met Pro Ile Pro Glu Gly 100 105 110 Leu Thr Leu Thr Gln Ala Ala Ala Ile Pro Glu Ala Trp Leu Thr Ala 115 120 125 Phe Gln Leu Leu His Leu Val Gly Asn Val Gln Ala Gly Asp Tyr Val 130 135 140 Leu Ile His Ala Gly Leu Ser Gly Val Gly Thr Ala Ala Ile Gln Leu 145 150 155 160 Thr Arg Met Ala Gly Ala Ile Pro Leu Val Thr Ala Gly Ser Gln Lys 165 170 175 Lys Leu Gln Met Ala Glu Lys Leu Gly Ala Ala Ala Gly Phe Asn Tyr 180 185 190 Lys Lys Glu Asp Phe Ser Glu Ala Thr Leu Lys Phe Thr Lys Gly Ala 195 200 205 Gly Val Asn Leu Ile Leu Asp Cys Ile Gly Gly Ser Tyr Trp Glu Lys 210 215 220 Asn Val Asn Cys Leu Ala Leu Asp Gly Arg Trp Val Leu Tyr Gly Leu 225 230 235 240 Met Gly Gly Gly Asp Ile Asn Gly Pro Leu Phe Ser Lys Leu Leu Phe 245 250 255 Lys Arg Gly Ser Leu Ile Thr Ser Leu Leu Arg Ser Arg Asp Asn Lys 260 265 270 Tyr Lys Gln Met Leu Val Asn Ala Phe Thr Glu Gln Ile Leu Pro His 275 280 285 Phe Ser Thr Glu Gly Pro Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Asp Arg Ile 290 295 300 Tyr Pro Val Thr Glu Ile Gln Glu Ala His Lys Tyr Met Glu Ala Asn 305 310 315 320 Lys Asn Ile Gly Lys Ile Val Leu Glu Leu Pro Gln 325 330 <210> 2 <211> 1675 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ccagccgtcc attccggtgg aggcagaggc agtcctgggg ctctggggct cgggctttgt 60 caccgggacc cgcaggagcc agaaccactc ggcgccgcct ggtgcatggg aggggagccg 120 ggccaggagt aagtaactca tacgggcgcc ggggacccgg gtcgggctgg gggcttccaa 180 ctcagaggga gtgtgatttg cctgatcctc ttcggcgttg tcctgctctg ccgcatccag 240 ccctgtaccg ccatcccact tcccgccgtt cccatctgtg ttccgggtgg gatcggtctg 300 gaggcggccg aggacttccc aggcaggagc tcggggcgga ggccgggtcc gcggcagacc 360 agggcagcga ggcgctggcc ggcagggggc gctgcggtgc cagcctgagg ctgggctgct 420 ccgcgaggat acagcggccc ctgccctgtc ctgtcctgcc ctgccctgtc ctgtcctgcc 480 ctgccctgcc ctgtcctgtc ctgccctgcc ctgccctgtg tcctcagaca atatgttagc 540 cgtgcacttt gacaagccgg gaggaccgga aaacctctac gtgaaggagg tggccaagcc 600 gagcccgggg gagggtgaag tcctcctgaa ggtggcggcc agcgccctga accgggcgga 660 cttaatgcag agacaaggcc agtatgaccc acctccagga gccagcaaca ttttgggact 720 tgaggcatct ggacatgtgg cagagctggg gcctggctgc cagggacact ggaagatcgg 780 ggacacagcc atggctctgc tccccggtgg gggccaggct cagtacgtca ctgtccccga 840 agggctcctc atgcctatcc cagagggatt gaccctgacc caggctgcag ccatcccaga 900 ggcctggctc accgccttcc agctgttaca tcttgtggga aatgttcagg ctggagacta 960 tgtgctaatc catgcaggac tgagtggtgt gggcacagct gctatccaac tcacccggat 1020 ggctggagct attcctctgg tcacagctgg ctcccagaag aagcttcaaa tggcagaaaa 1080 gcttggagca gctgctggat tcaattacaa aaaagaggat ttctctgaag caacgctgaa 1140 attcaccaaa ggtgctggag ttaatcttat tctagactgc ataggcggat cctactggga 1200 gaagaacgtc aactgcctgg ctcttgatgg tcgatgggtt ctctatggtc tgatgggagg 1260 aggtgacatc aatgggcccc tgttttcaaa gctacttttt aagcgaggaa gtctgatcac 1320 cagtttgctg aggtctaggg acaataagta caagcaaatg ctggtgaatg ctttcacgga 1380 gcaaattctg cctcacttct ccacggaggg cccccaacgt ctgctgccgg ttctggacag 1440 aatctaccca gtgaccgaaa tccaggaggc ccataagtac atggaggcca acaagaacat 1500 aggcaagatc gtcctggaac tgccccagtg aaggaggatg gggcaggaca ggacgcggcc 1560 accccaggcc tttccagagc aaacctggag aagattcaca atagacaggc caagaaaccc 1620 ggtgcttcct ccagagccgt ttaaagctga tatgaggaaa taaagagtga actgg 1675 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense RNA <400> 3 aaauguucag gcuggagacu a 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense RNA <400> 4 uagucuccag ccugaacauu u 21 <210> 5 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA duplex <400> 5 ccuacgccaa uuucgu 16 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA duplex <400> 6 acgaaauugg uggcguagg 19 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIG3 sense primer <400> 7 aaggaaataa ccaccatgtt agccgtgcac 30 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIG3 antisense primer <400> 8 ctggggcagt tccaggacga tctt 24 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal deletion PIG3 sense primer <400> 9 aaggaaataa ccaccatgtt agccgtgcac 30 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal deletion PIG3 antisense primer <400> 10 gagttggata gcagctgtgc ccaca 25 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal deletion PIG3 sense primer <400> 11 aaggaaaraa ccaccatggg agactatgtg cta 33 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal deletion PIG3 antisense primer <400> 12 ctggggcagt tccaggacga tctt 24

Claims (17)

1. 서열번호 3으로 기재되는 센스(sense) RNA 및 서열번호 4로 기재되는 안티센스(anti-sense) RNA로 구성되는 PIG3(p53-inducible gene 3)에 대한 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)를 유효성분으로 함유하는 암 치료 보조제
2. 제 1항에 있어서, 상기 PIG3는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 암 치료 보조제.
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 상기 암은 직장암, 결장암, 대장암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 치료 보조제.
6. 서열번호 3으로 기재되는 센스(sense) RNA 및 서열번호 4로 기재되는 안티센스(anti-sense) RNA로 구성되는 PIG3(p53-inducible gene 3)에 대한 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)를 인간을 제외한 포유류의 암세포에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 PIG3는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료방법.
8. 삭제
9. 삭제
10. 제 6항에 있어서, 상기 암은 직장암, 결장암, 대장암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료방법.
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제

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