TWI232884B - Enhanced virus-mediated DNA transfer - Google Patents

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1232884 Λ7 Β7 4 經濟部中泱栋準扃男工消贽合作社印^1 五、發明説明（1 ) 發明領域 本發明大體關於藉病毒提高細胞轉導效率之方法，特別 係關於利用纖維蛋ή膠及/或纖維蛋白膠斷片，促迆病棄 媒介之基因移轉入細胞之方法。 發明背景 對多種人類疾病之分子基礎了解的進展Κ及基因移轉技 術的改良，導致晚近嘗試發展嚴重蕋因疾病的體蕋因治療 方法。目前可能成為人類蕋因療法標的的#病包含 酶或其 他蛋白質有缺陷或缺失但酶或蛋白質之漓度無需精確調整 之疾病，特別是構成上需要調整者及缺陷出現於病人骨髓 者0 例如可用蕋因治療之疾病之一為腺核苷脫胺酶（Λ D A )缺. 陷，導致厫重的綜合免疫缺乏症（S C I D )。A D A缺陷病人的 骨髓細胞內很少或無可檢测的酶。然而A D A缺陷可藉相合 的骨髄移棺治療痊癒。Λ I) Λ正常纟Π1胞與Λ D A缺乏細胞相較， 具有競爭優勢，可使病人骨髓再生。 由於费髓組鄉易於試管内操作且含有可再生之细胞，故骨 髓細胞乃體基因治療之良好目標。另外，先前驗證人類臜 帶血液含大量原始先驅細胞。成功地將蕋因移轉入造血幹 細胞（此乃可長期再生之細胞），可對此等细胞子代衷琨的 多種疾病予K终身治癒的的:果。 多個研究學者曾經在鼠體中將.基因移轉入再生之幹細胞 ，且獲得長期范因表琨。怛於大型動物如犬及露長類逛行 活體内K驗的成功有限，主要原因為原始造血幹細胞的感 木紙ifc尺度適州中國國家標準（CNS ) Μ規枋（2!0'乂 297公炖） , (請先閲讀背而之注意事項填寫本頁) 丨參 j---Λ 訂一' H. 爹丨 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1232884 Α7 Β7 五、發明説明（2 ) 染效率低。現行甚因移轉技術之限制，當運用於人體時， 白3於多種因素更為複雜化，此等®制包含成人骨髓U B Μ) 中幹細胞數目少5缺乏適當的綑胞純化方法，及原始细胞 於細胞周期中所占比例低。 在鼠及大型動物體内所做的费題綑胞砑究發現同時培着 目標細胞與反錄病毒生產者細胞株之方察最為成功。又， 大半F D Α核淮的人體莶因移轉試驗依靠基因轉導用之重組 反錄病毒載體。重組反錄病毒載體由於可有效移轉並精確 、穩定地將夕卜源D N A整合入细胞D N A内，故為基因治療所需 。此等載體含有供基因移轉用之外源D N A且被進一步修改 Μ消除病毒致病力。由於此等修改，病毒生產通常伴隨使 用包含反錄病毒包裝細胞完成·。然而供臨床基因治療用時 ，由於具有生物安全性及品管方面之考量，則欲利周無紐1 胞的轉導作用。不幸的是，若未與產病毒细胞共同培養， 通常無法將基因有效移轉入造血綑胞和幹細胞。 近來曾顯示基因移轉效率可藉感染中將目標綑胞暴露於 基質綑胞而提高基因移轉效率。基質細胞為造血顯微環境 (Η Μ )之主要成份，Η Μ由巨噬細胞、蕋質綑胞、內皮綑胞、 脂肪細胞、及複雜的胞外基體（E C Μ )組成的網路所組成 (ECM由多種特定的黏著分子組成ECM分子如昆布胺酸 (j s in ί η ]’ η );膠原（t h r、〇 IT! b c s Ρ ο n ch· ri )，蛋白聚糖類，·糖胺 聚糖類，及纖維強白膠提供造血簡胞及生長因子定位部位 。促進基質對反錄病毒感染效果増強的潛在機轉未明，但 已知當進血细胞與Η Μ細胞直接接觸時會出現造Μ细胞的增 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )六4規格（2]0X 297公蝥）

1232884 A7 B7五、發明説明（3 ) 問 有 仍 胞 细 他 其 和 胞 细 幹 血 造 ο 生 用再 作期 節長 調入 理 轉 生 移 之 因 化 基 分效 及 有 生 癒效可 治有明 轉質發 移物 本 因 因 。 基基制 之將® 病可與 疾種險 他 一 危 其要的 及需法 病此方 疾因去 血 。 過 造 用 無 前應而 目泛胞 7廣 细 礙的類 妨察乳 此方哺 因療入 ; 治 轉 題性移 等逑 此概 足 明 滿發 之 言 0 體 載 毒 病 錄 反 0 種 1 供 提 侈 具 佳 較 之 明 ο 發 求 本 需 ， 陷膠 缺白 製強 複維 以纖 含或 包 \ 法及 方 膠 該白 ο 蛋 法維 方纖 之質 率純 頻致 導大 轉於 胞體 綑載 血 毒 造病 高組 提重 UL·， ^ 高 自 提生 效 衍 有片 毒斷 病P ϊ/ 錄白 反蛋 0 維 而纖 因或 ， // 胞及 細膠 血白 造蛋 的維 活纖 染-感率 下頻 在導 存轉 片胞 斷細 技此 成 〇 合 合 學組 化的 或質 組物 重 成 藉合 如與 例然 /•V 生天 自 衍生 式生 Ϊ iil /il ^ 成或 合 ) M程 可 Η 或因 質基 物行 然« 天術 膠轉 白 加 蛋 增 維之 «ΠΗ- 然發 天本 含 成 包達 肽有 多 具 。 膠供肽 白提多 蛋可性 維其能 纖要功 用 只 之 所，質 明變性 發突著 本列黏 解序的 了 酸需 需基所 外胺導 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —.f訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 種i纖一 i的 之 供Λ定 ifDNli 法源 、 方外膠 佳 帶 白 較攜蛋 一 Μ 維 另 含 纖 之包的 明，定 發法固 本方於 產 ， 生 之毒 病 0 r 錄 反 組 until 重 型 陷 缺 製 綑 血 造 之 導 轉 固 其 或 ·、 片 1 膠 白 蛋 維 率 頻 之 胞 ffl 導 轉 毒 病 綠 反 高 提。 效胞 有 ® 可 血 Κ 造 ， 的 下活 茌染 存感 锪 ， 合 最 混數 定 供物 提動 例1¾ 體 ： 具驟 佳 步 較列 一 下 另 含 之 包 明法 發方 本 該 法胞 方緦 良 血 改造 之 的 植活 移得 胞獲 0 者 種 予 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X 297公釐） 6 1232884 1 Λ7 ’· " Β7五、發明説明（4 ) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 造其活中 植缺或俾含包朐 膠領白二轉 導步該結高细 a或的式 移製 \ , 包及细 白合蛋此毒. 轉列，毒提1|11 的 / _ 愼 胞複及胞也，之蛋結維用病 體下I1A病體造 導及轉佳 細以膠 ffl 明群片 維-纖使綠 載含多錄成導 轉膠經較 於含白血發族植 孅-I烘。反 毒包一反構轉 經 S 將在 用包蛋造本胞移 用素提列賴 病法至域等經 生蛋及。 適法維之 C 细胞所肝及序進 錄方合領此用 產雒；片 得方纖血率的细 ，之，酸增 反該偶合用利 而纖率植 獲本之帶頻導為 樣膠列基著 使 C1I結利及 胞之頻移一 種。量 P 導轉作 態 in 序胺顯 稱法共 Β 含， ® 式導胞· 。 一法定自轉經體 定蛋酸二 為 一製體素包率 血形轉細者供方固得之的物 特維基第極 洪之合ΑΤ1Κ頻 造定离為予提之效染胞活動 更嫌胺的可 提體配之明之 染固提作給例胞有感细之ii之供一性赏 例成的膠發胞 感在效者體體細於，血血引 例提第活證 體構胞白本刖 體存有受自具液體下造帶群 體含的合， 具之則 載於可接進佳血戦莅高臜族 具可性結域。佳加摺維列 ΙΠ 毒係.此物引較帶毒存提自胞 明片活胞領率較增^孅序定 病染如励被 一 臍病片體得則 發斷合則合效.一率 ¥供酸ιίί 錄感，迆胞另導錄斷戰得的 本膠結域结之另頻合提蕋導 反該行引 S 之轉反膠毒所導。述白毒領膠胞之之结可胺轉 組，维朐染明經組白病法轉法前蛋病~1白細明 _ 可有之涛 厘胞下卵感發之望蛋錄方經方據維綠CS蛋標發目將含性病 Μ 细 Μ 血被本程型維反此將植根纖反之維 g 本定：肽活錄 ;)(!1斷造， 過陷纖賴賴含移 或域膠纖導 預驟多合反 (請先閱讀.背而之注意事項再填寫本頁)

U 、1Τ 本紙張尺度適用中國國家標卒（CNS ) Λ4規格（21 OX 297公f ) 1232884 1 Λ7 ) '， '' Β7 五、發明説明（5 ) 胞的移植程序。 本發明之另一較佳具體例提供一 m %局限化一數最病毒 之方法，包括於有效最經固定的綳維蛋白膠或纖維蛋白膠 斷片存在下，培育含病毒之介質，以便局限化一數量病毒 ，其中該纖維蛋甶膠或其斷片具有肝素n結合領域之病毒 結合活性。 本發明之又有其他較佳具體例概略提供經轉導的活造血 细胞及其他含大體純質及/或固定的纖維蛋白膠或其斷片 之细胞培着物，K及進行反錄病惠媒介的D N A移轉人细胞 之套件組，彼等將於下文說明。 本發明之g的係提供哺乳類細胞之宵效反錄病毒感染方 法。 本發明玉又一回的係提供一種茌無霈共培養下，Μ反錄病 毒載體移轉基因之方法。 本發明之又一目的係提供自體及/或同種细胞移植之改 (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消贽合作社印製 優 的 目 。 他 物其 養 及 ο 培等 明 胞此自 細之然 及明顯 法發將 方本明 良說 文 下 由 士 人 界 業 對 點 特 及 明 說 之 式 圖 之 段 片0 蛋 乳 凝 腴 含 為 Μ—i 圆 意 示 之 子 分 膠 白 蛋 0 表 下 在 存 片 斷 膠 白 蛋 維 於 示

率 效 之 包 ΠΜΜ- 田 女··· 區 5- 先 2 人 3 II的II E—* 用 ¾ 下 在 存 片 斷 膠 白 0 β0 於 較 比 定 各 染。染 體例體 載賀載 0.^0 E 5 E N F N K I K 於 明 Λύ 步 木紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（21〇Χ297公f ) A7 1232884 B7 五、發明説明（6 ) 種定型的人類先驅造血細_之效率，進一·步說明於下文筲 例1 0 HI 4比較賴下列各法轉導之#髋细朐被移植入小鼠後， 小鼠體内i 在在情況：（i )共同培養今3、（線2 - 4 )，（ ii )於 固定的纖維蛋白膠斷片存莅下，上清液之感染（線5 - 7)， 及於B S Λ存在下，上清液之感染（線8 - 1 0 )，進一步說明於 下文實例7。h Λ Λ D之對照示於線]及].2，小鼠Λ D Α示於線1 1。 圆5驗證反錄病毒結合至纖維蛋Θ膠斷片，迆-·步說明 下文實例8。 圓6驗證反錄病毒結合至纖維蛋白膠斷片係與劑贵有關 ，進一步說明於下文宵例8。 圆7為下文實例9 - 1 1所用之各種Μ組纖維蛋白膠澌片之 示意說明圖。 . .... 圖8顯示結合至各種纖維蛋白膠斷片（包含數種Μ組斷片 )之反錄病毒，如下文赏例9所述。 圖9驗證肝素封丨沮反錄病毒結合至纖維蛋白膠斷片，如 下文實例9所述。 圆1 0顯示於各種纖維蛋白膠斷片存在下，鼠造血細胞之 反錄病毒感染效率，進一步報告於下文實例].0。 圖1 1比較賴下列各法糟導之骨SS ffl胞移植入小鼠後，小 鼠體h Λ 1) Λ内之存在愦況：（i )共同培養法，（ii )於多種纖 維蛋白膠斷片之上清液感染，（iii )於B S Λ之上清液感染， 詳述於下文實例]1。 較佳具體例之說明 本纸张尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公f ) (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中夾標準局負工消t合作社印製 1232884 1 Λ7 ' 、 . Β7 五、發明説明（7 ) 欲促進對本發明原理之了解，琨在參照特定具體例並採 用特殊語言說明之。雖然如此，但霈了解此等具體例絕非 常II匿I限本發明之範圃，業界人士應當了解含Μ於此處說 明之本發明原理的變化，進一步修改及應用皆_於本發明 之相關範圍。 如前述本發明提供一種藉病毒如反錄病毒提高活ffl胞轉 導頻率之方法。本發明也提供使用重組反錄病毒載體有效 移轉蕋因入活细胞之方法，獲得轉導细胞之方法及獲得自 體及其他细胞移植物之方法及材料。 經濟部屮央標準局月工消f合作社印製 (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 木發明之一特點為發現纖維膠（F N )及含F N之C S - I细胞 黏蕃領域之孅維蛋β膠斷片可明顯促進反錄病毒所媒介之 蕋因移轉入细胞，例如造血Gb [如定型的先_ ffl胞及原 始的造血幹细胞或長期培養之引發细胞（L Τ Ο I C )];造血 細胞掮帶纖維摄丨3膠受體，因此可結合至纖維蛋白膠或其 斷片。此種效率增高使得與產病毒細胞共同培養變成不需 要，此乃有利之事。本發明之其他特點為發琨纖維蛋白膠 之病毒結合領域位在肝素I結合領域。該病毒結合領域於 多種應用中，包含在將病毒_送至目標細胞的多種構成體 中，被用於將病毒顆粒定位。 根據本發明之第些較佳態樣之Μ組病毒載體含有外源 DNAfl.為非致病性，亦即複製上有缺陷。此等載體可有效 移轉且精確穩定地將外源DO?；!舍入寄主细胞，如動物細胞 ，特別是哺乳類卵胞之細胞D Ν Λ。例如在本發明中，包含 丨莳感興趣蕋因之煸碼序列得到之連續驗藤之核苷酸序列， 木紙张尺度適川中阈國家標準（CNS )八4規格（210X 297公後） -1 〇 - 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 1232884 1 Λ7 Λ7 ' 1丨 ' Β7 五、發明説明（8 ) 可於能驅動骓因之適當啟動子（通常為外生啟動子）控制下 ，併、入重組反錄病毒載體内。就此方而而言，外源DN A含宿 天然或人工生產的D N A旦可得自不同來源所衍生的部分， 該部分可為天然或化學合成分子，及其中該部分賴接合或 業界已知其他手段接合。如所示，引進核苷酸序列係於啟 動子控制之下迆行，因此一般位在啟励子下游。換言之， 啟動子序列一般位在編碼基闪上游（亦即於5 ’端）。就此方 而而言，眾所周知可有或無其他調節單《亦即促進子序列） 與啟動子及轉錄起始密碼子合作，達成外源編碼序列之轉 錄。「於控制之下」一詞含Μ存在有達成引進菡因輔錄所 需的其他壞元。又，Μ組D Ν Λ較佳包含位在引進的編碼序 列下游之终止序列。 可使用包含能提供可選擇搮記或苒他可21擇優點之外源 D Ν Λ之反錄病璨載體。例如載體可含一種或多ί»Τ!可剌各種 選擇藥劑（包括抗生素如新黴素（n e 〇 m y c丨η ))產生抗性之外 源基因。在本發明中有用之載體之代表例包含例如Ν 2 / Z i ρ 丁 Κ Ν Ε 0 載體（Τ Ο Ε Ο Κ力價 1 x 1 0 S G 4 1 f cf u / ml 於 NlH 3 Τ 3 细 胞），Ζ ί P P G Κ - h Λ I) Λ戧體及Z i ρ P G Κ - m Λ D Α載體全部皆早先報 告於 Μ 〇 r i t z e t a ] . U 9 9 3) J · E X ρ · M e d · 1 7 8 : 5 2 9。T KA/£〇 載 體中，η e 〇磷酸移岬酶系列藉單純&疹胸腺核苷激酶啟動 子於訊息取向表琨（相對於5”長末端重複LTR)。此種載體 含有提供新徽素抗性俾便辨別轉導細胞之可選擇標記蕋因 。Ζ ί ρ P G Κ - h Λ丨)Λ載體中人_ Λ D Λ ( ” h Λ D'Λ ) c 1) Ν Λ賴人類磷酸甘 油酸基酶（P G Κ)啟動子於相對於5 ’ L T R之訊息取向表琨。其 本紙乐尺度適川个阀國家墚苹（CRS )八4彳见格（2丨OX297.公焚） -1 ]- (請先間讀背而之注意事項再填寫本頁) ••HI今 訂 1232884 ) . , A7 B7 五、發明説明（9 ) 僅含一可表琨骓因序列而缺乏顯性可選擇 πι Λ D A ( P G K - m Λ D Λ )載體與 Z i p P G K - h Λ D Α 體相同，但人類 Λ D Λ c D Ν Λ被鼠Λ I) Λ ( ” m Λ丨)A ”）D Ν Λ替代。此等及其他病毒載體 及其生產技術為眾所周知，而其赏施及用於本發明屬於業 界人士了解本揭示内容之範圃。 本發明所用病毒載體可結合至纖維蛋白膠（包拉人類纖 維蛋白膠）之肝素II結合領域的胺_?S酸序列。如後文的Μ論 者，雖然本發明不受任何理論所限，但相信藉著病毒及0 標细胞結合至個別功能領域，而使病毒與ffl胞被共同局限 於一區，有助於促進絍1胞受病毒轉導。就此方而而言，病 丨 1 .---- (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 力 tt 之 例 列宵 序下 酸如 其丄 用 胺使 域 可 領， 合 用 結作 E 掷 素發 肝效 至有 合 能 結中 毒明 及 發程 本行 於例 此之 因明 ’ 說 9 含肽 至 多 合定 結固 粒從 顆止 毒防 病可 定此 测因 析， 分 度 定程 檢肽 等 多 此定 ， 固 之 的 ^s域 略領 概合 。 结 定 Π 確 素 序 肝 維孔 纖 ， 含後 有然 含 。 於育 可培 液内 清孔 上的 毒肽 病 多 合定 如固 例 之 ， 域 之 領 ^目 合 簡 結 ο 丌 掉素 洗肝 上膠 體白 基 蛋 、1Τ 4 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 中相 孔憤 於力 毒或 病性 與活 胞染 细感 標估 目 評 後 。 隨 度 ， 程^η 洗.染 氟感 徹 留 液殘 衡 内 媛孔 水定 鹽測 理 ， 生 窗 以培 對 的 似 類 ίί\ 並 度 程 低 減 價 力 之 者顯 液孔較 淸?1相 上塗孔 mΛ-照 病BS對 初用與 0 使 價 於如力 對 例之 較-比 高 較 組 殘 所 孔 之 域 領 丑 素一 肝 發 本 於 用 適 毒 病 標 回 示 表

0 • J > 51 可 有 含 體 1^-4 毒 病 述 前 如 序 程 僉 4ΜΊ 篩 便 " ο fek- 態 之 U 因 記 標 0 用 所 明0 本 源 X.、 成 合 或 然 天 -AJ:i0 可 H 0 膠0 木紙张尺度適;丨1中阀阀Ϋ標$ ( )以現枋（2丨ΟΧ 297.公鋒） 經濟部中央樣準局員工消贽合作社印製 1232884 1 Λ7 1' 1 Β7 五、發明説明（10 ) 可以筲質純質由天然物質製備，如早先說明於R li 0 S 1 a h t i e t a 1 . U 9 8 1 )J . B i o1 . C h e m. 2 5 6 ： 7 2 7 7 ； P a t e 1 and L o d i s h (19 8 6) J · C e] ] . B i。1 · 10 2:4 4 9 ;及 B e r n a r d ί e t a ] · ( 1 9 8 7 )J C e ] 1 . B i ο 1 . ] 0 5 ·· 4 8 9。就此方而而言，此處述及宵質純質 纖維蛋白膠或纖維蛋白膠斷片表示大體不含天然與纖維蛋 白膠一起出現的其他蛋白質。本發明使用之實質純質纖維 蛋白膠或纖維蛋白膠斷片，也可K Μ組方式生產例如概略 述於1 9 9 3年3月3 0曰頒與T a g u c h i e t a】.旦謅予日本京部 寶酒造公司之美國專利5 , 1 9 8，4 2 3。特別下列齊例標示為 Η - 2 7 1、1丨 _ 2 9 6 ·、C Η _ 2 7 1、C Η _ 2 9 6 及 C - C S I 及其獲得方法詳 述於Μ 2 3專利案。下列實例所用C 2 7 4斷片係如美國專利 5 , 1 0 2，9 8 8所述獲得。此等斷片或可例行衍生之斷片可經 由培養寄存於日本工業科技部發醇研究所之大腸桿菌獲得 ，寄存編號卩 E R Μ Ρ - 1 0 7 2 ] ( Η - 2 9 6 )、F E R Μ Β Ρ - 2 7 9 9 ( C - 2 7 7 藉蛋胺酸結合至li - 2 7 1 )、F E R Μ Β Ρ. - 2 8 0 0 ( C - 2 7 7賴蛋胺酸結 合至Η - 2 9 6 )及F E R Μ P - 2 2 6 4 CH - 2 7 1 )，也述於美_専利 5 , 1 9 8，4 2 3 ◦此外，有關此處使用纖維蛋白膠斷片及斷片 厚料之資訊見於 k ]· m i z u k a e t a 1 · , J . B i 〇 c h e m . 1 1 0，2 8 4 -2 9 1 ( 1 9 9 ])，該報告又級述前述重組斷片；EMBO J .，4， ]7 5 5 -] 7 5 9 (Ί 9 8 5 )，報告人類娜維蛋白膠基因構造；及 B i 〇 c h e m i s t r y , 2 5，4 9 3 6 - 4 9 4 1 ( 1 9 8 G )，報告人類纖維蛋臼 膠之肝素]I結合領域。發現含苻C S - 1细胞黏蕃領域及肝素 J1結合領域之纖維蛋白膠斷片，例如含於約3 0或3 5 k d .斷 片（3 0 / 3 5 F N )及含於下列筲例報枵之不同重組斷片者，至 本紙ifL尺度適;Π巾阈國家標準（CNS ) Λ4規格（2丨0:< 297公焚） -13- (請先閱讀背而之注意事項*#填寫本艽) 衣· 1232884 ! 1 kl \ ' B7 五、發明説明（11) 目前為止可顯著促進骓因移轉入造血姻胞效率且為.本發明 之較佳者。因此需了解廣義言之，本發明所用識維蛋ΰ膠 相關多肽可提供具有維Μ甶膠之CS-lffl胞黏著領域之細 胞结合活性的胺®酸序列，从纖雄Μ fi膠之可結合病瑢的 肝素Η結合領域之胺基酸序列。業界人士將了解賴功能性 纖維蛋白膠領域之天然胺S酸列，Κ及與天然序列不同 但又充分類似而具有細胞結合與病毒結合活性之胺蕋酸序 列可提供所需細胞-及病毒結合活性。類似的胺蕋酸序列 具有大體對應天然序列同種的序列可包含其中胺基酸已經 被_失、取代及/或改質序列，雖然如此胺蕋酸序列仍具 葙m霈細胞結合或病毒結合特性。 就此方而而言，相關生物技術逃展至可例行迆行目標官 能诏域之胺避酸μ失、取代、加入或其他改質的階段。則 所得胺蕋酸序列可例行篩檢所需细胞結合或病蔚結合活性 。例如纖維蛋白膠之肝素]1結合領域之突變株或改質型的 病毒結合活性可概略如前述筛檢，特別詳述於下文實例8 及9，使用病毒培《、洗滌及病靡力（I檢定分析测定.與對 照比較感染力的保持性。雖然此處提供此等教示，但此等 結合檢定分ffi表示業界人士從事的例行實驗。 經濟部中央標準局員工消费合作社印^ (請先閱讀背而之注意事項再填商本頁) 則胞結合至纖維蛋S膠之C S -]细胞黏合領域之改質型或 突麥梨、或結合至其他細胞結合多肽，同理可使用習知程 序檢定分析。例如此等程序包含N a t u r e 3 5 2 : 4 3 8 - 4 4 1 ( 1 9 9 1 )所述。關言之，细胞結合多肽塗在塑膠皿上及葙持 檢定分析的细胞族群鋪在培蒋貍上經歷3 0分鐘至2小時。 培窗期後回收未黏著於蛋Θ質之细胞計算數目並檢定分析 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規·格（210X297公釐） 1232884 A7 B7 五、發明説明（12) (請先閱讀背面之注意事項ymf寫本頁)

、1T 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 存活能力。使用胰蛋白酶或 也回收結合至多肽之綑胞， 些例中例如造血群落生成细 Μ確定細胞之群落生成特性 與標準剽照品如牛血清血蛋 化。目標綑胞大體结合至檢 組合適用於本發明，多肽可 錄病毒结合斷片，Κ製造可 的本發明構成體。 有關本發明之更特定態樣 導之病毒结合多肽包括（i ) 類纖維蛋白膠之肝素E结合 下式表示（序列識別編號1 ): Ala lie Pro A]a Pro T h r T h r Pro T h r S e r Leu S e r

Va 1 Gin Leu Thr G 1 y Tyr G I u L y s Thr G ] y Pro Met Asp S e r S e r S e r Va 1 Va I Thr L y s Tyr G 1 υ V a ) S e r Leu Thr S e r A r δ Pro Ala G 1 υ A s n V a ] S e r Pro Pro Λ 1 a Thr G 1 υ Thr Thr I 1 e Τ h r G 3 υ T h r ]]e Thr G ] y A 1 ε A s n G ] y Gin Thr Pro 綑胞溶解緩衝液（例如G ί b c o 計算數目並測定存活能力，某 胞，細胞逡一步培養]2 - 1 4日 。然後計算黏著细胞百分率並 白（B S A )塗覆之皿比較以標準 定分析的多肽表示多肽/細胞 被偶合至得自纖維蛋白膠之反 促進目標细胞被病毒載體感染 ，用K促進藉反錄病毒載體轉 第一 胺基 酸序 列， 其對 應於 人 領域 的A 1 169C a 丨-Thr1960 ，以 Asp Leu L y s Phe Thr G ] η Va 1 A ] a Gin T r p Thr Pro Pro A s n A r g Va 1 A r g Va I Thr Pro L y s L y s G 1 υ I 1 e A s n Leu Ala Pro Va 1 S e r G I y Leu Met Va ) A I a Va 1 Tyr h ] δ Leu L y s Asp Thr Gin G 1 y Va I Vs 1 Thr Thr Leu A r g A r g k 1 a A r g Va I Thr Asp Thr I 1 e S e r Tr p A r g Thr L y s Phe Gin Va 1 A s p A 3 a Va ] Pro lie Gin hr g T h r I 1 e C y s Pro 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) Α4規格（2】〇Χ297公釐） 15 1232884 Λ7 Β7 五、發明説明（i3) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A s P Va ] Ar g Se Γ Ty Γ Th Γ I J e Th Γ G 1 y Le U G 1 η Pr 0 G ] y 丁 h Γ h S P T y Γ Ly S 3 1 e Ty r Le υ Ty Γ Th 厂 L e υ h S η A s P As η A ] δ A r ε Se Γ Se Γ P r 0 Va ] V'9 1 I 1 G As Ρ A I a S e Γ Th Γ A 1 ε I 1 e As Ρ A 1 a P r 0 S e Γ As η Le υ A r g Ph e L e υ A i a Th Γ T h r P r 0 A s ΐΊ S e Γ L e U L e υ Vs ] Se r Tr Ρ G 1 η Pr 0 Pr 0 A r ε A I a hr ε J 3 e Th Γ G 1 y Ty r I ] e I 1 e L y s Ty Γ G 1 υ Cy s Pr 0 G ] y Se r Pr 0 Pr 0 i\ r g G ] u Vs ] Va Pr 0 hr ε Pr 0 A r g Pr 0 G 1 y v a 1 Th Γ G 1 u A 1 9 Th r I 1 e Th r G 1 y L e υ G ] u Pr 0 G 1 y Th r G i υ T y Γ Th Γ II e Ty r V a 1 I 1 e k } a L e υ Ly ε As n As η Gin Ly s S e Γ G 1 υ P r 0 L e u I】 e G 1 y hr ε Ly S Ly s Th r ♦ 或 具 有 结 合 反 錄 病 毒 能 力 之 充 分 類 似 的 胺 基 酸 序 列 及 ( ϋ )第二胺基酸序列， 其對應方: $人類纖維蛋白膠之] 01 CS結 合 領 域 — 部 份 (CS - 1细胞結合領域） * Μ 下 式 表 示 (序列 識 別 m 號 2) • A s P G 1 U L e υ Pr 0 G ) η L e u Va ] Th r L e υ Pr 0 Hi s Pr 0 A s n Le υ Hi S G ] y Pr 0 G i υ I i e L e υ As P Va ] Pr 0 Se r Th Γ ， 或 顯 示 具 有 與 造 血 m 胞 如 原 始 先 驅 細 胞 及 / 或 可 長 期 再 生 之 (幹） 細 胞 結 合 之 能 力 之 充 分 類 似 胺 基 酸 序 列 0 如 前 逑 需 了 解 於 本 發 明 實 務 m 圍 内 此 等 天 序 列 之 某 些 改 質 及 / 或 突 變 為 Pj 能 只 要 所 得 胺 基 酸 序 列 充 分 類 似 天 序 列 而 有 能 力 結 合. 病 毒 (Κ Βι F素 結合領域為例） 及 有 能 力 結 g 標 W 胞 (K c S - ]領域為例）即 可 0 本 發 明 一 態 樣 提 供 — 種 體 基 因 治 療 方 法 ， 包 括 試 ·Λ：Λ- Έ 試 驗 之 细 胞 治 療 及 m 後 將 S 標 細 胞 移 植 Λ 寄 主 ， 亦 名 寄 主 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2】〇Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 線 -16 - 1232884 A7 137 五、發明説明（14 ) 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 哺可旦幹莠反衷實 其佳繼等或高下例者片 包的之 他胞一含培在激證。或較或此陷提片 予植 法常療:» 其细。富鄉可剌。率膠。P，缺效斷21給移 療Is治δΗ 或血集其組胞先子效白率白染質有膠引體作 治或學J5 1造收使於_细預因之蛋頻煩感白以白式自用 因陷化 5 *λ如血而如核述激導維之維毒蛋足蛋方佳胞-$缺如AD 略例帶理例單所剌轉纖導 _ 病他最維知較細 或質法含 方。臍處胞度處長毒與轉的組其在雛習，液 記白療包 準胞兒術细密此生病述毒定® 或存或Μ者血 標 Μ 治病 標細胎技血低及於錄所病固Μ酶於膠可受待 因·、他疾 用他人準造性界顆反中錄如胞内係白胞接期 蕋病其性 使興或搮後著業暴被文反例細胞染蛋 ffl 片在 之血對表 。 或液以然黏。前胞如被性後細感維血植別 病白、K 代 J 胞血性。無·激之細並胞溶然正處纖造移特 疾、改之 植细邊擇胞間剌毒血胞細不。校此之的胞者。種症M用 移血周選細期以病造細加或育可；率導細後1^)多癌胞有 Γ 造或可II此予錄良稽增 \培有毒頻轉物 ，¥^於如細明 胞集髓胞先於.先反改收以及起含病之經動植0用例血發 細收骨细始。預於可，，怕 一 為錄導得1|移5^可含造木 標源者血原商前施激後育純片如反轉所引種(^法包改 。 目來予造或培染暴剌激培經斷例之毒後射同此方，修療 的物紿 ，\ 當感在先剌同與膠毒因病然注含如明病及治 導動類後及適毒胞預先共係白病基被。脈也為發髄，之 轉類人集胞上病细種預片朐蛋組常胞行靜但尤本费病性 經乳.1?1收细板錄示此 斷卵維重異綑维1如，時 含疾抗 (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 木紙张尺度通川十國國家彳票準·（ CNS )六4规格（2丨0X 297公絶） 7 1232884 A7 】37 五、發明説明（15 ) 例如缺乏Λ I) Λ之S C I D，小兒急性费熥性白血病（Λ M L )，神經 母细胞瘤，及人A M L，及急性淋巴球性白血病（A L L )。 本發明之特佳具體例中，用於细胞移植片之ffl flS得自人 類臍帶血。因此，可收集人類臍帶血，其富含活的原始造 血先驅細胞及/或幹細胞1例如可獲得無黏著性、低密度爾 核细胞族群，然後此族群視霈要可預先予Μ剌激並於反綠 病毒載體及固定的及/或經純化的纖維蛋白膠或纖維蛋白 膠斷片存在下培養，俾增進載體轉導細胞之效率。就此方 而而言，發現得自臍帶血液之原始造血ffl胞及/或幹细胞 之轉導通常於纖維蛋白膠或纖維潢白膠斷片存在下大為增 進；即使.嫌維蛋白膠不構成臍帶血之E C Μ之一部分，或即 使得自臍帶血之原C尤驅細胞及幹细胞已經特微化而與來自 骨髓者不同亦復如此。更特定而言，臍帶血幹ffl胞M C D 3 / 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (請先閱讀背而之注意事項再填』％本頁) ，HLA-DRh為特徵，而得自獨’ δΙ之幹细胞M CD34f ，HLA - DR+為特徵。Φ請人發現得自臍帶血之原始先驅细胞 可於纖維蛋白膠或纖維蛋白膠斷片存茌下促進轉導，因此 為方便且富含辟细胞的造血細胞來源。此外，以富含原始 先驅細朐及幹細胞之臍帶血同種移植物，成功地移植多種 病人的證據使得臍帶血變成造血细胞之極佳來源。參見 Κ 〇 h 1 i ~ R u m id e r e t a ] . , B r* j t . H e a e m a t o ] . 8 5-4 1 9 - 4 2 2 (1993) ； Broxmeyer et a]., Blood Cell 17^313-329 (19 9 1); G ] u c k ni a n e t a 1 . , B r . J . 11 e a e in a t o ] . 45-557 ( 1 9 8 0 ) ； H e i d e ] b e r* g ： S p r* i n g e r4 - V e r ] a 8 P P · 6 0 ~ 6 8 ( 1 9 8 9 ) ； Wagner e t a 1 . , Blood 7 9 ： 1 8 7 4 - 1 8 8 ] ( 1 9 9 2 )； 木紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规格（2丨OX 297公敖） -18- 1232884 » ) A7 '__B7___ 五、發明説明（16 ) 及 W a g n e r e t a ] · , β 1 ο 〇 d 8 2 - 8 b a ( A b s t r a c t) · 鞋有所满，可以測試收稷到之經轉導造血細胞或其他® 胞之轉導效率及蕋因表現。例如，本發明提供反錄病毒媒 介之蕋因轉移顯藉改善，（可被下述特定實施例證明），描 敘數種於纖維蛋白膠或有效維蛋η·膠斷衍t在下，藉以|、病 毒之高度感染及邀：因移轉效率。特別W P G K - h A D A反錄病毒 感染的鼠類造血細胞可髙度表琨經移轉的A D A c D Ν Λ。同理 ，個別P G Κ 1 Λ D Λ病毒感染的人類先II群落表琨鼠Λ D Λ程度 高達内源人類Λ D Λ蛋白質之1 0倍。因此，嚴格分析轉移效 率，僅在經移轉niADA之表現Ί於或大於.內源人類ADA澹度時 方被認為先驅細朐群落已被轉導。得自由T K N E 0載體之N e 〇 之髙度衷琨可賴G 4 1 8抗藥性檢那I，即测定新撇素磷酸移轉 酶（n e 〇基因產物）之活性。 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 如前述，本發明方法之有利處在於可在無需與產反錄病 毒细胞共同培養下迆行。如此，根據本發明之一態樣，反 錄病毒所媒介之蕋因移轉，可於大體無造血或其他目標細 胞以外之細胞存在下進行。例如，含反錄病毒載體質體之 生產者细胞可經培養及收集上清液。然後，含反錄病毒之 上清液可於纖維蛋白膠及/或纖維蛋白膠斷片存在下感染 造血卵胞，濰維蛋白膠較佳成固定型，例如塗在道行感染 之蕋質上或與感染介質接觸。就此方而而言，任何可產生 髙力價不含肋手细胞之反錄病毒的生產者细胞預期皆適合 用於本發明。包含例如包與細胞胞如P s i _ 2、C 2、Ρ Λ 1 2、 Ρ Λ 3 1 7 ·、及G Ρ + e η ν Λ Μ ] 2，及業界已知之其他包翦刖胞株。 本紙张尺度適/0中國國家摞準（CNS ) Λ4規格（210 X 2()7公犛） -1 ϋ - 1232884 Λ7 \ 'ι 1 Β7 五、發明説明（17 ) 根據本發明之其他特點，結合至綳維蛋白膠肝素]I結合 領域之胺蕋酸的強病盡，可用於構成廣泛多種細胞類型之 病毒治療用之輸藥糸統。欲達此目的，含得自纖維蛋白膠 之反錄病毒結合領域的多肽，可共價*偶合至任何配合基， 因而使此種構成體獲得目標細胞之特異性。此種方法克服 早先需要對個別目搮细胞營構特定反錄病毒ffl胞株之需求 (K a s a h a r a , N. , A . M. Dozy , and Y. W. K a n . , Science, \/〇].2 6 6,卩卩.1 3 7 3 - 1 376( 1 994)及\/3156513-1^1:1：11丨311", S.,A. Drynda, G. Deleage, M. Aumailley, J.M. Heard, 0· Da nos, G· Verdi er,及 F.L· Cosset, J· Viro]·, Vol 6 8 , p p 4 6 0 9 - 4 6 1 9 ( 1 9 9 4 )。目標構成體之特異性可利用配 合莶提供，包含例如（1 )細胞黏著性蛋白質，（2 )激素或細 胞激素，（3 )目標姻胞之壤株抗〆4 )可結合gi標细胞之碳 水化合物（G . Λ s h V/ e ] 1 , e t a 1 · , A η n U I? e v . β ί 〇 c h e m .， V ο 1 · 5 1，p p . 5 3 1 - 5 5 4 ( 1 9 8 2 ))，（Γ))目標 ffl 胞之代謝產物， 或（6 )可結合目標细胞之功能多肽。構成體之：11因輸送效 率可藉含括數種肝素ϋ病毒结合領域而改良，因此提高輸 送至目標卵胞的病啬顆粒1。例如，美國專利5 ,] 9 8 , 4 2 3 所述，對應於Pro 70 Π -Ser ρ 之人類纖維蛋 膠之细胞結合領域，顯然可結合至含BHK及B16-F10之细胞 (Kimizuka et al., J. Biochein. V〇]. 110, pp. 28 5 - 291 (1 9 9 1 ))。此外，肝素JI領域本身顯示可結合至繼維母細 胞，內皮細胞及Μ痫细胞。此等多肽序列可偶合至得自孅 維蛋白膠之反綠病棄結合領域，因此使預定细胞瞄準目搮 本紙張尺度適/Π中國國家標準（CNS ) A4«L格（2丨0 X 297公t ) -20- ih 先 閱 讀 背 而 冬 經濟部中央標準局員工消t合作社印？水 意 事 項 存

κι 經濟部中央標準局負工消f合作社印製 1232884 ' Β7 五、發明説明（18 ) 接受病涛感染。 造血系統之應用例也含紅血球生成素典G - C S F偶合至纖 維蛋白膠之反錄病毒結合領域之構成體，分別陥準高度特 異性紅血球或顆粒球前驅刖胞。本發明之另一種常見應用 係組合反錄病璨結合領域與特別或主要結合至惡性细胞之 配合基。例如，於試管試驗或甚至活體試驗中，使用結合 於目極細胞受體物質可影響乳癌细胞的生長，此等物質例 如泌乳激素釋放衍生物；[E m ο n s， G . e t a 1 . , H u m . R e p r 〇 d . 9 : 1 3 6 4 - 1 3 7 9 ( 1 9 9 4 )]，雌激素類[T o 1 c h G r , A · W · , 0 n c ο Ι- δ : 3 9 - 4 3 (1 9 9 4 ) ] ， 或抗 I跳激 素類 [ Η o w e ] 1 , A · e t a 1 · ， U n c e t 3 4 5 : 2 9 - 3 0 ( 1 9 9 5 )]，孕激素類或抗孕激素類[ K ] i ,) η . F . G . e t a ] , Hum. R e p r o d . 9 S u p p ] . 1*181-189 (1994)； Griffiths, K. eL al, Semin. Oncol. 21*672- 6 8 7 ( 1 9 9 4 )]，其作為含一種或多種得自纖維蛋白膠之結 - · » 合領域的本發明榄成體之配合蕋。至於其他例，甲狀腺（ 癌）細胞可使用含J ◦ d i d之構成體予以高度特異性瞄维；及 肝（癌）細胞可藉含Η I) L之構成體或其部分予Μ瞄準。最終 ，閗株抗體與濰維孭β膠之反錄病毒結合領域的構成體可 腦维該抗體所對抗之任何细胞或器官。因此廣泛種類之哺 乳類细胞可藉蕃孅維蛋白膠之反錄結合領域結合並局限化 病毒載體的能力而被瞄準。 因此，本發明之另一較佳具體例包括製備可用於促進目 搮姻胞之病毒轉導作用的構成體。纖雒蛋白膠之肝素]I結 合領域的病毒結合胺蕋酸列被偶合至0標細胞結合的配合 木紙张尺度適用中國國家榡準（CNS ) Λ4·規格（210Χ29*7^#· ) - 2 1 - (請先閲讀背而之注意事項#填寫本页)

1232884 Λ7 —__B7__ 五、發明説明（19 ) 基。如前_配合蕋例如可為得自纖維蛋膠或另一蛋白質之 多肽（包含細胞黏著蛋白質如毘布胺酸、膠原、 (請先閱讀背而之注意事項孙填寫本頁) \/ i t r ο n e c t i η、c.s t e o r) ο n t ί n 或 t h r o m b o s p ο n d i η )、激素、 代謝產物，抗體（含雖株抗體），或任何其他可結合（較佳 特異性結合）至目標细胞的配合基。所得整體構成體可K 固定形式以類似纖維蛋白膠多肽之方式使用，特別舉例說 明於下列筲例。 此等構成體及則胞瞄準目標方法可如前述用於試管試驗 ，也可於活體内暇準反錄病毒，考慮於生理條件下之多種 因素如構成體之安定性及特異性，Μ及反錄病毒構成體於 生理條件下的交互作用。特異性也可藉著修改輸藥糸統將 構成體之輸送局阳於0槱細胞而遴成，例如門靜脈插殚赀 供瞄维肝細胞。 - 、- 經濟部中央標氺局負工消t合作社印製 預期利用此種特別設計用於赏施本發明方法之套件組， 可進行高度方便的反錄病毒媒介的D Ν Λ移轉。因此，本發 明之另一態樣提供含定量前述質質純質多肽或構成體，可 促迆目標細胞受反錄病毒轉導，Κ及可進行反錄病毒感染 之.基質。多肽或其他構成體可分開提供或塗於人工基質上 。以人類造血細胞感染方案為例，套件組包含细胞預先剌 激用之造血細胞生畏因子。此外转件組含有前述轉辫用之 Μ組反綠病毒赖體。概略言之，鸾件組包含無菌包褒，可 確保套件組各犯件彼此里分開關係，足夠防止各組件於袞 件組處理過程中破裂。例如，常見筲務係利用具有多個隔 問或區域，將袞汴組各組件容納於分開關係的横製塑膠伴。 木紙张尺度過/Π巾阀國家標卒（CHS )糾规格（？·丨OX2()Hf ) - 22 - 經濟部中决標準局員工消t合作社印製 木纸依尺度適川巾阀國家標( CNS ) AWL·格（2丨〇·Χ297公梦） 1232884 、 ‘ ，‘ A7 、 * · · ι 五、發明説明（20 ) 欲促迆迆一步了解本發明提出下列特例。但需了解此等 K例僙供舉例說明而絕非囿限性質。 莨例1 使用T K N E 0將®•因移轉人骨髓细胞 1 . 1 .病毒上淸液之製滿_ 含反錄病毒質體之Τ Ο E 0載體之G P + E n v Λ Μ 1 2生產者細胞（ 參見 M a r k 〇 w i 12: e t a ] · Π 9 8 8 ) V i r ο ] 〇 g y 1 6 7 : 4 0 0 )於尹斯 可夫氐（I s c o v e ’ s )改質杜別克（D u 1 b e c c o s )培卷蕋（I Μ I) Μ , G i b c ο， G a i 1: h e r s b u r· g， M D )中培着，I M D M 令為 /。之胎牛血 清（F C S， 1彳 y c 1 ο n e , L 〇 g a n , U T )及]0 0 U / in 1 青微素及 1 0 0 u g / m 1 _徼素（P I S二者皆得自G】· b C 0 )。賴將含2 0 % F C S之1 0 id I 1 M D M加至融合培着平皿，隔夜收集含病毒上清液。收稍的 培養基通過0 . 4 5微米過總膜（G e 1 m a n S c i e n c e s , η η Λ「b ο r， Μ I )過滤，並儲存於8 0 PC至使用的崙止·， 1 · 2纖維蛋白膠斷）彳之製備 如先前於 R u 〇 s 】a h t i e t a ] . , M e t h 〇 d s E n z y m 〇 ] , 8 2 : 8 0 3 - 8 3 1 U 9 8 2 )所述，由人類血清（L i f e s omc e , G 1 e n v i e w , 1L)但在Μ 4M尿素溶離FN之前，明膠-瓊脂糊柱M 1 Η尿素洗滌。純化後的F N於4 T：對1 0 m Μ 3 _ (環己胺$ ) - 1 -丙 烷礦酸（C Λ P S )，1 5 0 τη Μ N a c 1， 2 m M C a c ] 2 pH 1 1 · 〇 徹底透析 ，並分成數份儲存於-8 0nC。F.N之凝乳肫蛋白簡细胞結合 頂域（C B D ) ( C S -].)及肝素]ΐ结合斷片如前述純化（R υ 〇 s 1 a h t i e t a 1 . ( 1 9 8 2 ) , S υ p i·' a , Patel and L o d i s h , J . Cell.

Biol. 102, p r> . 9 一 4 5 β ( Π) 8 6 )，5 Ρ)·α「n a r d ί e t; a 1 .， ，I . -2 3 一 (锖先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) -'Γ訂 經濟部中央標準局货工消费合作社印製 1232884 ) Λ7 '' Β7 五、發明説明（2 1 ) r B i ο 1 . 1 Ο 5 , p p . 4 8 9 _ 4 9 8 ( 1 9 8 7 )。於得自肝素-璃脂糖膠 柱之/ Μ N a c】溶離分獲得三個主要肝素結合斷片（3 0 K D， 3 5 K D及4 2 Κ ί))。欲進一步純化肝素結合斷片，/ Μ N a c 1溶液 於4 °C荆]0 m Μ ]> i s - H C I， p Η 7 . 0透析隔夜，並通過事先Μ 1 0 in Μ T r i s - H C I ρ Η 7，0平衡的陰離子交換柱（2 m 1 D E A Ε西法 羅斯（s e ρ h a r o s e )快速流（P h a r m a c i a F i n e C h e m i c a 1 s， Uppsala Swecien)/iiigii| 白質）。3 0 / 3 5 K D 斷片 M 未結合溶離 分收集，而4 2 K Γ)斷Η Μ 1 0 0 m M 1彳a c ]由柱溶離。由5 0 0 m g F N 獲得約2 6 m g 3 0 / 3 5 K D斷片及h g 4 2 K D斷片。4 2 K D蜥片（但 非3 0 / 3 5 K D斷片）辦認為抗_維蛋白结合領域抗體，藉办考墨 點技術測定。又，4 2 K D斷片結合至繼維蛋白-西法羅斯親 和柱。 用於感染計創，纖維蛋白膠斷Η如P a t e 1及L 〇 cH s h (1 9 8 6 )，上文所述，Μ 7 5 p m ο】/ an 固定於3 5或1 0 0 n丨m培養皿（ F a 1 c ο η , L】· n c ο 1 η， N J )。對照培養平 皿Μ類似方式塗上 2% (不含 FN)牛血淸白蛋白（BSA， Boehr inger Mannheim， Mannheim，德國）° 1 . 3 .反錄病毒感染計剷· 得自健康成人給予者之倚髓樣品，根據印地安那大學縣 學校組織章程委貝脅核準方案，收集於含無菌但不含保藏 劑之硫两1納肝素管内。經由於F i c 〇 ] 1 - H y p a g u e (密度]· 0 7 7 g / m 1， P li an a c i a， P i s c a i: a w a y， N J )於 2 5 °C 離心 Ί 5 分鐘雖 備低密度SI核细朐。於3 7 °C:於！) 0 2·於含2 S; F C S之I M D H在組 織培養皿上，又培莠4至]6小時而從低密度骨髓细胞分離 木紙適川屮阀阀家榡卑（rNS ) /UMV格（2丨ΟΧ297.公#_ ) 2 4 (請先Μ讀背而之注意事項孙填寫本頁) - 1232884 Λ7 B7 五、發明説明（22 ) 塑性黏著细胞。 黏著陰性低密度軍核細胞預先剌激，丨適後如前U s k e y e t a ] . ( 1 9 9 2 ) B 1 ο o d 8 Ο : 3 9 6所述，感染反錄病毒4 8小時 ，感染係於 3 7 °C 及 5 Si C 0 2 於含 2 0 % F C S，1 0 0 lj / m 1 r、h I L - 6 , lOOng/in] rhSCF (二者皆得自 Amgen，Thousand Oaks, CA) 及P / S之I M D Μ M细胞密度1 x 1 0 4细胞/ m I於培養皿進行。 藉激烈滴量去除鬆鬆附著於塑膠上的细胞而收稽經前剌激 的ffl胞。 前剌激細胞（5 X 1 0纟细胞V m j )於逢％有B S Λ (對照之平皿） 或纖維蛋白膠或其斷.片（接受紫外光照射使得蛋白質更黏 著於塑膠板）之平皿上培育6小時。然後Μ病毒上清液於生 1¾因子（如前述）7 · 5 u g / m】聚凝胺（A 1 d r丨c h C h b m i c a I , Μ Π w a u k e e， W I )存莅下感染。2小時替換病毒上清液含生 長因子及5 . 0 U R / m 1聚凝胺）細胞又培菏1 2至2 4小時。各次 改變培#蕋時再加入非黏著细胞。 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 感染方案後，傾析去除非黏著ffl胞，根據製造商指示， 使用細胞解離緩衝液（C D B )(不含酵素/ Μ P B S為主，Gi b c 〇 ) 由培養收集黏著的造血細胞。黏著細胞加至非黏著部分， 洗滌二次並計算數目。收稽的卵胞被接種於甲蕋纖維素上 ，進行先驅細胞生成細胞群落之檢定分析或予Μ長期#髓 培養。 1 . 4 .長期骨髓培養 根據略為修改之前述方法Κ胞L T C - I C (人類幹细胞）檢定 分析。S u t h c r ] a n (j f) t; a ] . β 1 ο 〇 d 7 4 : ] 5 6 3 ( 1 9 8 9 ) ° 簡言 -2 5 (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙张尺度適用中國阀家標卒（CN55 )以現格（2丨ΟΧ29*?公趙） 1232884 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 Λ7 Β7 五、發明説明（23 ) 之，0 . 5 - 1…^感染纟丨11胞播種於長期骨髓培養物（L T M c )中’ 該L T M C係於6孔組娜培養皿（C 〇 s t a r， C a m b r i d g e， M A )上’ 一 Γ

於含 1 0 % F S C，1 〇 % 馬血清（S ]· ε 爪 a )及 P / S 1 x 1 〇 M hydrocortis〇rie(lJpjohn, Kalamazoo，Ml )及 320 mosmo] 氯化納之5 m】I M D M中’培養融合且如前述經預先照射之同 種人類骨髓繼維母綑胞（B M F )而得。L T M C於3 3 C及5 % 1 0 2下 培養且每週取出5 〇 %培養菡及黏错细胞·。五週後，L T C - I C 培養物使用CDB由BMF去除黏著Α迮血细胞而犧牲。非黏著及 黏著的造血细胞合併並接種於甲蕋纖維素獲得衍生自L T C -1C的群落。 1. 5 .在甲蕋纖維素上生成則胞群?客之檢定分析 甲基繼維素檢定分析彳系如前T 〇 k s 〇 2： e t a ] . P r 〇 c . N a 1, 1. Acad. Sci·，USA，Vo】· 89，P7350U 9 9 2 )所述進行，但 略有修改。簡言之，2-5 x ] 0斗個被感染的成人骨甄_色與5 躍位 / m 1 紅血球生成素（Ε ί> 〇 , A m g e η ) >1 0 〇 n g / m ] r h S C F 1 0 n g / m 1 r h I L - 3 ( G e n z y m e，C a m b r i d g e，M A )-起接種於含 2 5 3! F C S， 1 0 S：人血漿，：l 0 ^ Μ Θ -氫硫S•乙醇（S U m a )及P / S之 lml X4%IMDM甲基 _ 維素（Fluka, Ronkonkorna， NY)中。 培養物於3 7 °C在5 ：« C 0 2 / 9 5 %空氣中培育且於第1 3日使用反 相顯微鏡觀穿群落（7 5 0细胞）並記錄其厲C F U G Μ (含顆粒球 及巨d细胞），CFU_M IX (含骨髓刖胞及成紅血球的原生卵 朐）.，亦或Β ΠΙ _ Ε (僅含成紅血球的原生细胞）。 1 · 6 .反錄病毒感染之分析 丁 Κ Ν Ε 0病毒感染效率係於第1 3日測定對1 . iT m g / π» 1 (乾粉 本紙张尺度適川T國國家標準（CNS ) Λ4規格（2丨0 X 297公辞） - 2 β - (請先閱讀背而之注意事項再填艿本頁) 訂 1232884 Α7 Β7 經濟部中央標準局負工消f合作杜印製 五、發明説明（2 4 ) G i b c 〇 ) G 4 1 8有抗性之甲基孅維素群落百分率继行分析。於 各次實驗經由將骨熥细胞於不含重組病毒之G P + E n v Λ Μ 1 2包 翦株一起培育，而進行偽感染。與1 . 5 m g / m I G 4 1 8共同培 育之偽感染细胞培莠物一致顯示背景群落低於1 Γ。 1 . 7 .基因移轉入定型先驅姻胞___(C oj U t e_l progenitor cel 1 s ) ^ 轉導效率係經由感染骨髓細胞同時接種於3 〇·/ 3 5 F n 一或 B S A -塗覆皿而比較。此等條件下未經選擇感染後所得群落 數目未見差異。第2 _顯示感染後G 4 1 8 ^群落百分率。發 現來自各型先驅細胞[包括限制譜系細胞（B F 1丨-E及C F U - G Μ ) Μ及多譜糸（CFU-MIX)先驅細胞]之30/3Γ) FN上，G418r群 落之百分率較髙。於30/35 FN上感染所有定型先驅細胞之 百分率比在B S Λ上者提高9倍。 1 . 8 .基因移轉人長期培養引發細胞（L TC - I C )之效率 基因移轉人L T C - I C之效率係使用Τ Κ Ν Ε 0載體評估。結果 備在3 0 / 3 5 FN上感染方測得蕋因移轉人LTC-IC所衍生之群 落（茌3 0 / 3 5 F Ν與B S Λ上感染率之比為1 6 ；»： G 4 1 8 1對0 ΰ4 1,群落）〇 1 . 9 . 3 0 / 3 5 F Ν之特異性對造血細胞感染效令^影锶 欲測定於30/35 FN上基因移轉效率增高之特異性，在塗 覆有下列物質之平Μ上迆行ΤΚΝΕ0感染：BSA，30/35 FN， 完整纖維蛋白膠，]]5 K D F丨m片包含R G DS四肽序列之中央 ffl胞結合領域（C B丨)），及4 2 K』C -端F N澌片（4 2 F Μ )，其特徵 為含肝素]丨結合領域但缺CSM序列（圖1)。於BS Λ感染獲得 本紙张尺度通用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2】〇 X 297公釐） -27- (請先閱讀背而之注意事項存填β本頁) 彳訂 1232884 Α7 Β7 五、發明説明（25 ) r 3 土 l%G4 18r BF1J-E， 1 dh Ug4 18r CFU-GM及 〇 土 〇M418 C F U _ Μ I X。於C B D未見G 4〗8广群落比率有顯著馉高’但於4 2 F Ν見β F U - Ε感染略為增高（6 . 0 土 _ I % )(圖3 )。然而完整丨7 Ν 使蕋因移轉入所葙定型先驅细胞之效率增高。於完整F Ν上 感染後，G4lf .群客之百分率於各譜糸皆低在30/35 FN上感 染者，完整F N組與3 0 / 3 5 F N組茌各譜糸中之感染率之比分 別如下：B F U - Μ ] 6 士 m 2 4 土 4 3；)，〔: F U - G Μ ( 5 士 2 對 2 0 土 4 X )及 C F 1丨-Μ ί Μ 6 土 1 對 9 土 1 ;完整 F Ν 比較 3 0 / 3 5 F Ν )。 資例2 使用PGK-πιΛ1)Λ將親：因移轉人费髄ffl胞 2 . 1 —般程序 按筲例1製偫T K N E 0之法製備l> G K _ m Λ D Λ上澝液。如前質例 1所述製備纖維蛋白膠之凝乳胰蛋白酶澌片（圏1 )接著進行 實例1之反錄病毒感染方案。根據實例1 ®施L T C - I C (人幹 細胞）檢定分析及甲基_維素檢定分析。 2 . 2反錄病毒感染分析 經濟部中央標準局員工消费合作社印繁 Μ P G Κ - in A D Α載體感染之效率係使用Λ I) Λ同功酶霜泳分析 ίΐ白質而測定。tr '乏驅細胞群落分析像如前Μ 〇 r i t z ( 1 9 9 3 )及 L i ni e t a ] . ( 1 9 8 9 ) P r 〇 c . Natl. Acad. S c i . , USA, Vo]. 8 6 , P 8 8 9 2所述施行。厫格分析移轉效率，僅可於内源人 類in A 1) Λ相等或更高程度表琨ιη Λ D Λ之群落被認為已被轉導。 欲分析歴集的群落，將由甲蕋纖維素培養物檢出的群落合 併裝入1 · 5 η!】微試管（R a i η】· n， W 〇 b u r η , Μ Λ )中，以溫熱培 莠蕋及疏酸緩衝镧水洗滌，離心並儲存於-20°C。供Λ D Λ 28 -------^----- (請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) 木紙ift尺度適Λ1中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2ΐ〇χ297公敖） 經濟部中央標準局員工消费合作杜印製

1232884 ' Λ7 I . Λ7 ' _ B7 五、發明説明（26 ) 分析之用，細胞在5.XX 1溶裂媛衝液中，藉反覆冷凍-解凍循 環溶裂並如前述資施同力酶電泳。 2 . 3莶因移轉入定型先驅細胞之欸率. — 丨一 __ 1 ........... ------ 感染骨髓细胞同時接種於塗有B S A或3 0 / 3 5 F N之m上，然 後比轉導效率。於此等條件下，未觀察到未經選擇之感染 後所獲得之群落數目有所差異。如表1所示，於3 0 / 3 5 F N上 感染入所有定型先驅細胞之效率比在B S Λ上感染者大體增 高。如使用高力價（〜1 X 1 0 7病毒顆粒/ m I )載體所預期者 ，定型先驅細胞之轉導效率極髙。參照表1，在二分開實 驗中W P G K - m A D Λ於3 0 / 3 5 F N上感染谓·髓皆幾乎1 0 0 %轉導定 型先驅细胞。 表 1 使用P G Κ - m Λ D Λ載體於纖維蛋ft膠3 0 / 3 5斷片上感染定型 人類先驅细胞之效率 實 驗 BSA 30/35FN E X P 1 1/18 ^ 13/14 E X p 2 2/1 3 12/13 *表琨ιη Λ I) Λ之群落之數13 /被分析之群落總數 2 . 4基因移轉入長期培養引發細胞之效率 在用P G Κ - m A D Λ進行之四項獨立赏驗中，由5週舲L T M C ( 亦即L T C _ I C衍生群落）衍之先驅卵胞群落有顯著比例表琨 經移轉的鼠類Λ D Λ蕋因。表琨率為被分析群落之]7 S： ( 2 / 1 2 ) 至1 0 0 % ( 6 / 6 )(表2 )。於所有被認定屬於陽性的群落中，引 itt ιπ Λ I) Λ蕋因之表現超過或至少等於内源人類Λ ί) Α之表現。 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2丨OX 297公潴） - 2 9 - (#先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) -訂 Λ7 Β7 經濟部中央標準局負工消费合作社印裝 1232884 五、發明説明（27 ) •^7卜^0纟感染效率高於了((1^0效率。如表二所述，在二獨 立赏驗中，使用P G K - m A D Λ於3 0 / 3 5 F N i感染费髓約可1 0 0 % 轉導定型先驅细胞。 表 2 使用P G K 1 Λ D Λ載體感染人類長期培：養引發細胞（L Τ Ο I C ) 之效率 實 驗 BSA 3 0 / 3 5 F N Exp] 0/14::: 10/19 E X p 2 N/A 2/12 E X p 3 0/4 3/5 E X p 4 0/4 6/6 總計 0/22 21/42 :::m Λ D Α陽性群落之數（i /被分析之群漆總數 N / Λ :未分析 2 · 5 . 3 0 / 3 5 F Ν之特異性對造血细胞感染效率之影m 於3 0/ 3 5 FN基因移轉人LTC - 1C之效率增高。由於自LTC -I C繼代衍生之群落之規橫相當小，故於頭一群落實施蛋白 質分析之能力有阳。於B S Λ、完整纖維蛋白膠及4 2 F N上用 P G Κ - m Λ D Α感染L T C - I (:-衍生之群落後鼠Λ D Α之表現率分別為 0 / 6、0 / 4及0 / 3 ;而於3 0 / 3 5 F N上感染L T C - J C·衍生之群落後 ，m Λ D Λ之表琨率為3 / 5。此外，於二次額外實驗分析之前 ，匯集多個LTC-IC衍生群落，mADA表琨僅在30/35 FN及完 整F N上感染後被檢测得（後者表現程度較低）；於4 2 F N或 B S Λ上感染未檢测得表琨。

S Ν C /—\ 準 惊 δ 國 國 17 ;π ί ,k 尺 张 纸 木 格

Μ 公 7 9 2 X 1232884 Λ7 B7 五、發明説明（2S) 宵例3 使用PGK-hADA將蕋丨 轉人骨髓刖{1(3 3.1 —般程序 P K G _ h A D A病裔上清液係按脔例1 .製備T K N E 0之方法製備。 繼維蛋白膠之凝乳液蛋白酶斷片（_])係如前實例]所述製 備及隨後進行赏例1之反錄病毒感染方察。L TC - I C及甲蕋 纖維素檢定分析係如實例1贳施。 3 . 2反綠毒感染分析 欲分析匯集的群落，凼甲蕋孅維素培養檢出的群落合併 裝於].5 m】微試If ( R a i n i n , W 〇 b u r η Μ Λ )中，Μ溫熱培養基 及PBS洗-:條，離心並儲存於-20 °C。供AD Α分析之用，细胞 於5微升溶裂緩衡液内藉反覆冷凍_解凍循環溶裂，並如前 • -- 述贳施同功酶電泳。 實例4 使用T K N E 0蕋因移轉人臍帶血細胞 4.1 一般程序 經濟部中央標準局負工消f合作社印製 丁 K N E 0病毒上清液及纖維蛋白膠之凝乳液蛋白酶斷片（圖 1 )係如前於實例1所述製備。遵照宵例1之反錄病毒感染方 衆胆啪正常足月新也兒所得臍m血根據印安那大舉躲學校 組缬章程委員會核準的方案收集於含肝素試管内，並用K 替代骨髓细胞。L T C - I C (人類幹细胞）及π基纖維素檢定分 析係根據實例]筲施。 4 . 2蕋因移入定型先驅Μ胞之效率 荏三項獨立®驗中，於F Ν 3 0 / 3 5上之感染率比在B S Λ上者 3 1 (讀先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 本紙烺尺度適;Π中國國家樣準（CNS ) Μ規格（2j〇x2()7公赞） 1232884 A7 B7 經濟部中央标準局月工消费合作社印繁 五、發明説明（29) 增高四倍K上（表3 )。 丧 3 使用3 0 / 3 5 F N斷片與T K N E 0載體感染臍帶血先驅细胞之效 率 BSA 12土] 7 30/35 55土 16 質例5 使用PGK-mADAMlgi狩轉入臍帶血液细胞 5 · 1 —般程序 P6卜πιΛΙ)Λ病毒上清液及繼維蛋白膠之凝乳液蛋白胸斷片 • (圖1 )係如前於筲例1所逑製備。遵照贳1之反錄病毒感染 方案，但由正常足月新生兒所得臍帶血，根據印地安那大 學翳學校組纈章程裘員會核準的方蓀，收集於含犴素試管 内，並用以代替骨髓細胞。L T C - I C及甲基纖維素檢定分析 係根據實例1實施。 5 . 2基因移轉入長期培養引發綑胞之效率 使用高力價P G Κ - m Λ D Λ戰體，分析L T C - I C -衍生的群落， 顯示引進的m Λ D A c D Ν Λ僅茌用上清液於F Ν 3 0 / 3 5上感染臍帶 血所建立的培養物上 有髙度表琨。於B S Λ對照平|上感 染的L Τ (> ] 0衍生群落僅檢测得低度m Λ D Λ表現 贳例4及5所示結果驗證當使用臍帶血先驅细胞及幹細胞 時，也可使用F Ν 3 0 / 3 5獲得改良感染效率。 赏例6 使用P G Κ - h Λ D Λ ；!·因轉人臍帶血液细胞 木·紙悵尺度適州巾國國家標準（CNS ) Λ4規格（2Urx2V7公t ) (請先闊續背而之注意事項-?)-填寫本頁) k訂 -32 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 1232884 Λ7 、 Λ7 、丨 、 Β7 ------~* -------------- 五、發明説明（30 ) P K G - h Λ D A病涛上淸液及鏘維廣白膠之凝乳液爾白酶斷片 (圖1 )係如前於質例1所述製備°遵照實例丨之反錄病毒感染 方案，但丨由正常足月新生兒所得胸帶血根據印地安那大與 縣學校組織章程委員·會核準的方案收集於含肝素試管内， 並用Μ代替费熥細胞。LTC_ 1C及甲基罐維素檢定分析係很 據實例1實施。 實例7 - 1 1 實例7 - 1 1之反錄病毒載體及生產者之細胞株 實例7 - 11使用二株可產生反錄病毒之包褢細胞株：_親0

定性 G P + Ε 8 6 ( M a r k 〇 w i 1: z , D · , S ♦ G 〇 f f，a n d Λ · B a n k , J V 】· r 〇 j · , V ο 1 · 6 2，P P 1 1 2 0 - Π 2 4 ( 1 9 8 8 ))和親兩性 G p + e n v Λ M 1 2 细胞株（M a r k o w i t z , D · , S . G o f f · a n d A · B a n k，

Virology , V o j ♦ 16 7， P P 4 0 0 - 4 0 6 U 9 8 8 ))。研究所用反 錄病毒載體及生齑者純株列攝於表4。 表 4

載 體 生產者/純株 •----------· 表琨的cDNA PGR-hADA GP^E86/EPII A-5 人類A D A P Μ 5 n e 〇 GP^E86/EAL2a n e o磷酸移轉酶，l a C -乙 TKNeo GP+E86/TKNeo n e o磷酸移轉酶 PGK~mADA GP + EnvAM 12/55/6 鼠類Λ D A 全部ffl胞株皆於杜別克氏改質篪氏培養基（D Μ ε ; i b G r a n d I s U n d， N Y )培養，D Η 含有]0 ¾ 胎牛血清（i? C s , H y c ] ο n e，L 〇 g a n，I) T )及 1 0 0 U / m ]青撇素及 1 0 〇 U g / m 1 鏈撇 素（P / S， b o t h G ]· b c ο );但 E A 2 a 細胞於含 1 0 % F C S 加 P / $ 之 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2丨OX 297公f ) 33 (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁} k- 丁 、一-·«» 翁 1232884 Λ7 Β7 五、發明説明（3 1 ) D Μ E - F 1 2 ( G i b c 〇 )生長。經由將]0 m ]供鼠细胞用之α _最低 必需培養蕋（α Μ Ιί M, G ί b c 〇 )或供人類细胞用之尹斯可夫杜 別克培養基·（ ] H D Μ，G i b c 〇 )(各含]0 S： F C S加P / S )加至會合1 0 cn!平皿並培莠糙夜，然後收旗含病毒之上清液。收稚之培 養基通過 0·45微朱'過滤膜（Ge]man Sciences, Ληη Arbor， Μ I )並儲存於~ 8 0 °C至使用時。 啻例7 鼠類造血細胞之初次轉導 7 ♦ 1實驗 用於鼠類細胞之研兔）6至8週龄（3 fl / H e J小鼠投予1 5 0 m g / k g 5- 氣尿核并·（Solo Pack Laboratories， Frank 】]·η Park, I L )後2曰，由股锊及脛骨收集骨髓（L丨m， B .， J . F:. 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) Λρ per ley, S.II. Or kin, and D.A. Williams, Proc. Natl. Acad. Sc i . USA . Vo). 86;PP8892-8896 ( 1989 ))〇 細月包於 5 x 1 0 i细胞/ m 1之濃度下，於I M D M / 2 0 8： F C S加P / S中，使用]0 0 ng/m]大鼠重組幹细胞因子（rrSCF; Amgen, Thousands 0 a k s , C A )及 1 0 0 爾位 / m ] M 組人類介白素-6 ( r h I L - 6 ; P e p r o ΐ e c h I n c ·， R o c k li i Π , N J )預先剌激 4 8 小時（L u s k e y , B · D. , M. Rosenblatt, K. Z s e b o , and D.A. Williams) B]ood· Vol. 80，PP 3 96-402 U9y2 )·)。随後使用 E P 11 A - 5 生產者ffl胞產生的P G K _ h Λ D Λ載體迆行蕋因移轉效率，使用 三種不同感染方案進行比較：（1 )上清液感染；（2 )於F Ν 3 0 / 3 5之上清液感染；（3 )於Ε Ρ Η Λ - 5 it /|者細胞共同培養。因 此1 0 0 |謂細菌培養].1H塗覆2 . 5Αε / a〆 F Ν 3 0 / 3 Γ)(相當於7 5 ρ τη ο 1 本紙張尺度適用中國國家標牵（CNS ) Λ4規格（2丨ΟΧ 297公麓） -34 經濟部中央標準局眞工消费合作社印製 本紙张尺度通用中國國家橾卒（CNS ) Λ4·規格（2】0X 297公後） 1232884 ) ) kl ' __^__^_ 五、發明説明（32 ) / cm Λ )溶解於5 m 1磷酸鹽緩衝擷（P B S : G i b c ο )之溶液，皿蓋 打開，於紫外光下於室滥照射1小時，而另1小時則M上皿 Μ。於室溫使用2 %牛血清白蛋白（B S Λ ,部分，V ; Β 〇 e h r i n g e r M a η n h e ί m , I n d i a n a p o】i s , I N )封丨沮3 0分鐘後，皿M補充 自2 . 5 % ( v / v ) I Μ H e p e s之漢克氐平衡溶液（Η B S S )(二者皆 得自G i b c o )洗一次。用於上·清液感染·，皿僅塗。5 x 1 個經預先刺激之紿予者细朐與如前述得自Ε ΡΗ Λ - 5之補充 有 100U/ml rhll，6, 100ng/m] hrSCF 及 7.5xig/m] P ο 1 y b r e n e之]0 m 1病毒上清液共同培育。收集未黏著细胞 並再度添加新鮮病毒上清液。供共同培養用，E P II A - 5細胞 於4 m ]培着蓮於3 7 °C與]0/U g / m 1 in i t 〇 m y c i n C共同培育2小時 ，經洗滌及胰蛋甶酶消化並將3 x ] 0 個細胞（於〗0 πι】 α Μ Ε Μ / 2 0 X I7 C S加IVS.牛德特於1 0 0酬組雛培養皿上。次日加入5 X 1 0 *"個經預先刺激之骨髓ffl胞與1 〇 〇 U / in 1 r h I L - 6， 1 0 0 n s / m 1 r r S C F及g / m 1聚凝胺並培窗歷4 8小時。it行感染方 案後，傾析未黏著細胞並根據製造商指示使用細胞溶解媛 衝液（C D B )(不含酵素/以P B S為主，G丨b c 〇 )將黏著的造血ffl 胞收集於培着上。黏1:細胞加至未黏著部分，洗二次並懸 浮於約1 m 1 11 B S S /丨丨e p e s。得自5 X 1 〇ί:|個預刺激细胞之细 胞全體注入三隻接受者小鼠尾靜脈，小鼠曾經接受致命性 總體照射（7 0 0 加 4 0 0 C G y， ，ν7 (：·、-穿；緣 )(Luskey , B . D . , M. Rosenblatt, K . Z e s b o, and D. Λ . williams, B 1 ο o d , V o ]· 8 0， p p 3 9 6 M 0 2 ( 1 9 9 2 ))。藉檢·查處理後的 小鼠是否表琨引迆的人類A 1) Λ 而道行分析造血幹细胞 一 3 5 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) d 、1' 1232884 Λ7 Β7 五、發明説明（33 ) 請 先 閱 讀 背 而 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 之轉導。ΛϋΛ同功酶分析係於移植小鼠莨施，經由繊維素 乙酸_就地酶分析檢査周邊血球中：提否出琨h Λ D Λ蛋白質（ L ί m , Β . , D , Λ . williams, and S. Η . Ο r k i η , Mol. C e Π · Β ο ί I ·，V ο 1 · 7 · ρ ρ 3 4 5 9 - 3 4 6 5 ( 1 9 8 7 ))。檢查始於 移植後4個月且每月重複進行。 7 · 2結果 經濟部中夾標準局員工消费合作社印製 以基因操作造血幹細胞長期處理小鼠骨熥，一般認為足 夠於移植後4個月測定幹細胞轉導效率。7個月後藉同功酶 分析，分祈轉導骨髓接受者顯示··（ 1 )共同培養或使用F N 3 0 / 3 5進行上清液感染顯示有人類A D A cfWA表ί.!ί，但未使用 F Ν 3 0 / 3 5進行上淸液感染後移植組未見表現及；（2 )共同培 養組及F Ν 3 0 / 3 5組之表現程度相當。如第4圖線2 - 4所示， 三隻小鼠，移植入藉與Ε Ρ Η A _ 5共同培養而轉導的骨髄後， 顯示具有易被檢知之人類Λ D A。移植有_ F / 3 5上之上清 液感染而轉導之造血細胞（第4圖線5 - 7 )之三隻小鼠也可檢 禮1噹濃度之人類Λ丨)Λ。相反地，移植有藉B S Λ上之上清液感 染而轉導之造血細胞（圖4線8 _ 1 0 )之三隻小鼠，未檢得人 類Λ D Λ。人類Λ D Α位置對照組示於線1 - ] 2 ;鼠A D Λ示於圖4線 1 1。線2 - 1 0之小鼠帶顯示負載等最蛋白質。此等資料顯示 藉F Ν 3 0 / 3 5上之上清液感染長期調整造血幹纟〇]胞之轉導作 用，等於共同培養所能達成者，而遠優於未使用F Ν 3 0 / 3 5 之上清液感染所能達成者。 實例8 _反錄病毒載體結合至F Ν 3 0 / 3 5改良轉襟機轉 -3 6 - 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（2丨〇Χ2【)7公焚） 1232884 經濟部中央標準局—工消费合作社印製 木纸张尺度適州中國國家標準（（^)/14规搞（210>< 297公赞) Λ7 Β7 i '發明説明（34 ) 欲测試轉導增髙搓否為病毒與造血細胞共同局限化結果 ’發明人分析靡組反綠病毒顆粒是否結合至F N 3 0 / 3 5。因 此，塗有F N 3 0 / 3 5之平皿預先與含T K E e 〇㈣上淸液共同培育 3 0分_ , 後撤底洗滌。上清液病毒力價使用N l Η / 3 T 3紐1 胞根據標準程序測定（M a r k 〇 w ί t z D ·， S · G 〇 f f , a n d A . β a n k · j . V 】· r o 1 ·，V ο 1 · 6 2，P P ] 1 2 0 - 1 1 2 4 ( 1 9 8 δ ) ) ° 簡 言之，3T3细胞Μ ] 〇〇〇細胞/孔濃度接種於6-孔組鄉培養平 ®並生長隔夜。病毒上清液之一系列稀釋液加至含7 · 5A/ m J 聚凝ftU各孔並3 7 °C培育2 ♦ 5小時，随後加入2 m】培養基。2 4 小時後，培養蒴Μ含G 4 ] 8 ( 0 · 7 5 m g / m 1乾粉，G i b c 〇 )之培養 親1特代及平皿培育1 〇 - ] 2日。1 0 - 1 2日後，將G 4 1 8抗性群落 (G Ή 8 t )染色並評分。每孔群落數 乘Μ病毒上清液稀釋 度用作上淸液之感染顆粒（c f u )/ m 1與病毒上清液進行前培 育，並藉每個3 5丽細菌培養mi加入1 0 0 ΙΠ丨1 / 3 T 3细胞及聚凝 胺徹底洗3條後，評估塗有F N 3 υ / 3 5或塗有B S A之3 5漏平皿上 所殘留的反錄病毒顆粒量及测定其”力價”。2 4小時後，培 養餵入含0 · 7 5 ηι β / in j G 4 1 8 (乾粉）之培養基及細胞又培育1 〇 - ]2日。培脔期後，黏著病毒賴訐算G 4 1 8抗性N I Η / 3 T 3群落 而定贵。 欲評估病_結合至F丨彳3 〇 / 3 5之最是否與劑量宵關’ Μ漸 J曾濃度之F Ν 3 0 / 3 5塗II皿靈複前述實驗。因此3 5 imii細菌皿 如前述塗有i、^、】〇及FN30/35。事先測定力價 為]X 1 0 4傳染顆粒1 ηι 1之ΐ K N e 0病毒Μ料之1 ·· 5 0稀釋液於 一 37 - (#先間讀背而之注意事項再填寫本頁) 訂 1232884 . ) Λ7 I i 1 137 五、發明説明（35 ) F N 3 Ο / 3 5塗覆平皿上培育3 0分鐘。經徹良洗滌後2 Ο Ο Ο NI Π / 3 T3細胞加至各孔。如前述進行選擇並於選擇1 0日後計算 G 4 1 8抗性Ν I Η / 3 Τ 3群落。 8 * 2結果- 圆 5例槊三次代 表 性 η 驗 之 —. 的 結 果 〇 使 用 TK Ne 〇上清液 9 m 於 Ν I Η / 3 Τ 3 細 胞 中 之 G4 18 群 落 測 得 反 錄 病 裔 力 價， 就 塗 覆 BSA之平皿 而 —a— m 低 過 3 log s (4 X 1 〇'4 降至0 ) ，但就 塗 覆 30/35FN之平 ΠΠ 而 9 力 價 僅 低 11 〇 g 0 此 等 數 據證 明 反 錄 病毒定最結合至FN30/35 但 未 結 合 至 塗 BSA之 ra (對照皿）。圖6顯 示 當 含 病 毒 上 清 液 於 塗 有 漸 增 m 度 之 FN30 / 3 5之平皿上培育 時 檢 測 得 G 4 1 8 抗 性 群 落 增 加 〇 因 此 病毒 结 合 至 F Ν 3 0 / 3 5 係 劑 量 相 m 方 式 進 行 0 η 例 9 病 毒 結合至重組纖維蛋白·膠煦片 9 . 1贺驗 早先Ki m ί Z u k a等報告經選殖的F N D Ν Α序列於大腸桿菌表 Jjl (K ί m i z u k a , F . , Y « T a ε υ c 1) i , Y , 0 h d a t e , Y . K a w a s e , 經濟部中央標準局月工消费合作杜印製 T . S h ί m o j o , 1) . H a s h i η o , ] . K a t ο , K . S e k ί g u c h i , and K. Titani, J. Biochem., V〇]. 110, PP 284-291(1991) ).經選殖的嵌合肽包含纖維蛋白膠中已知參與細胞黏著之 若干重要序列之序列或序列組合（包含R G D S , C S - I及肝素 結合位置），參見圆7。欲分析反錄病毒是否結合至麗組F N 斷片，使用含]X 1 0 f傳染顆粒/ m 1之冷凍反錄病毒T K N e 〇 備料之兩稲不同稀釋液U : 1 0及1 : 1 0 0 )於塗苻Μ組斷H C - 一 3 8 - (請先間讀背而之注意事項再填湾本頁) 木紙張尺度適川中國國家標準（CNS ) Λ4〗見格（210X 297.公漦） 1232884 ) , , Λ 7 1 Β7 五、發明説明（36 ) 2 7 4、2 7 ]、Η - 2 9 6、C Η - 2 7 1、C 1卜 2 9 6 及 C - C S ]之平皿 W 及 F Ν 3 0 / 3 5作為陽性對照，噩複道行3 Τ3纟ίΠ胞群落生成檢定分 析。F Ν 斷片之使用湄度為]2 0 - 1 3 Ο ρ m ο 1 / 〇/ ( C - 2 7 4、Η - 2 7 1 、Η —2 9 6 、 C 一CS1 、 FN 3 0 / 3 5 113 Μ ΤΛ 4^g/cm^ 而 CH — 27 1、 C 11 一 2 9β相當於8.Μ/αη> )。簡言之，平皿經塗覆，加人病毒， 徹底洗滌平板，加入ΝΙ丨1/3 Τί刖胞經歷24小時，然後於選 擇培養基生長1 0日，随後群落經染色及計算敷目。 9 · 2結果 _1 8驗證G 4 1 8抗性群落（因此病毒黏著）數目於斷片Η - 2 7 1 、Η - 2 9 6、C Η _ 2 7 1及C Η - 2 9 6增髙。此外顯示重組斷j=|及F Ν 3 0 / 3 5之病毒結合量約略相等，但該研究中，（:Η _ 2 7 1斷片 里現最高度病毒結合作用。此5種F Ν斷片之共通處為具第 DI型重複子1 2 - 1 4，其含高度親和力肝素結合位置（ Ruoslahti, E . , Λ η n . Rev. Β i ο c h e in . , V o ] . 57， p p 375 -4 1 3(1988KRK]’mizuka，F.，Y.Taguchi，Y.01idate, Y . K a v a s e , Ϊ . S h i m o j ο , K . 11 a s h i η ο , I . K a t ο , K . S e k i g u c h ]·， a nd K · 了 i L a n i， · B ]· o c h e m ·， V o 1 · ] 1 0， 經濟部中央標準局只工消f合作社印製 (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) p p 2 8 4 - 2 9 ] (] 9 9 1 ))可能位在 M 複子 1 3 U i m】· z u k a , F . , Y . Taguchi, Y, Ohdate, Y. Ravase, T. Shimo,io, K. II a s h ί η ο , I . K a t ο , K . S e k i g u c h i , and K . T ί t a n i , J . B ί o c： h e m · , V o ] · 1 1 0 , p p 2 8 4 - 2 9 ] . ( 1 9 9 1 ))。此暗示病毒 結合彳糸經由『，亥hi知黏著位置TJ ϋ經由塗有4/U g / ου C H — 2 7 1之皿與漸增濃度（1 0 _ 1 0 0 Ο λι g / ni 1 )之肝素疏酸鹽共同前 培脔可證，肝素疏酸鹽為高度m m分子，已知可抑制則胞 本紙烺尺度適Λ!中國國家標率（CNS ) Λ4規格（210X29*7公犛） . 一 39 - 經濟部中央標準局員工消f合作社印製 1232884 ) Λ7 \ ： ' B7 五、發明説明（3 7 ) 結合至肝素結合位置。如圖9可見，於Π·1-27].與漸增濃度 的肝素硫酸鹽共同培齋後G 4 ]. 8抗性群落數目減少。資料提 示病毒結合至F Ν係經由F Ν羧端領域中恰毗鄰C S -]位置的髙 度親和力肝素結合位貿媒介。 赏例]0 於重組纖維蛋β膠斷片上造血ffl胞之轉導 1 0 . 1實驗 欲分析前述F 1U 0 / 3 5上造血細胞轉導之增髙是否也見於 重組F N斷片，發明人使用高度：r/准孓因而具生成群落潛力之 細胞（HPP-CFC)檢定分析，红試管試驗中評估上清液感染 的轉導效宰。經由採用Ε Λ L 2 a載體，比較多種重組F N斷片 相對於F N 3 0 / 3 5上清液感染於B S A對造血細胞轉導之影響， 使用Μ ] 8抗性群落生長作為基因移轉的指慄。此外，比較 以黏著於F Ν撕片之病盡顆粒（相對於上清液病毒）轉禅造血 细胞的能力。0 . 5至1 X ] 0 6前剌激骨髓細胞於3 5 nnii塗有F Ν 之培養皿上於含前述生長因子及5aj g / m ]聚凝胺之1 - 2 in ]含 Ε Λ L 2 a病毒之上清液内培育。欲藉病毒結合至F N斷片評估

造血細胞的轉導，與含病毒上清液共同培育的3 5 ηπιι塗有F N 之皿Μ 2 m ] P B S各洗三次。随後Ο . 5至1 x 1 Ο6經過前刺溯 的骨熥ffl胞加至2 in 1補充有生長因子及聚凝胺之培養蕋。 2 2小時後如所逑收·細胞並接種於含或未含1 . 5 m g / m】 G 4 ] 8 之 Η P P - C F C 檢定分析（B r a <j ] e y , T , R · a n d Μ (：) t c a 1 f， Λ υ s t · J · E x p · B 丨‘ ϋ 1 · M (〕(J · S c i · , V 〇 ] . 4 4 p p 2 8 7 - 2 i) 3 ( ]6 ))。培養if於7 C 0 z及3:彳°<〇培育14日，並以04].8抗性 木紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4规格（2丨Ο X 297公犛） · -----,--^---jml衣-- (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) --Γ訂 -^ 0 ~ 1232884 丨 , A7 B7 五、發明説明（38 ) 群m百分率計萬骓因移轉靣分率。 1 0 . 2結果 經由上清液感染轉鹚原始造血细胞（圆1 0 )對於全部含肝 素結合位置（Η B S )及至少一個更具活性的細胞黏合位置（宵 心柱）之斷片而言，皆顯著高於上清液感染。重組斷片C Η _ 2 7 1、丨彳-2 9 6、C Η _ 2 9 6及C - C S 1之轉導效率類似F Ν 3 0 / 3 5之效 果，全部三斷片皆含有肝素結合位置及C S _ 1位置。其他例 中轉導驚人地降低。資料驗證先前於F Ν 3 0 / $ 5顯示的原始 造血細朐轉禅作用增髙可於重組FN斷片符琨。又驗證病m 直接結合至纖維蛋Θ膠可基因轉導造血細胞。最後證實存 在笮I位賈及肝素結合位貿對原始造血前驅（幹）细胞轉 導之兩途。 實例1 1 使用鼠類給予漭细胞於重組纖維蛋白膠斷Η上轉導而長 期重構小鼠骨· η . 1實驗 經濟部中失標準局負工消t合作·社印製 (請先M讀背而之注意事項再填寫本頁) 發明人對原始造血先驅细胞虛複前述試管試驗研究（芮 例1 0 )，Κ比較在B S Α上，F Ν 3 0 / 3 5上/3重組F Ν斷片上之上清 液感染以及與使用骨髓移植之共培養比較，以分析對重建 血幹ffl胞的影響。簡言之，接受致命照射的小鼠被注入給 予者ffl胞，給予莕細胞使用含人類ADA cPA/Λ的ΕΡ1ΙΛ-5載體 - 轉導。1個月後於Λ D Λ同酶1¾’分析，分析得自周邊血液的.基 因移轉效率。 1 ] . 2結梁 本纸张尺度適)0中國國家榡準（CNS ) Λ4規格（210X 297公#:) ^ 1 - 1232884 ) , , 八7 ' ' 137 . 五、發明説明（39 ) 圖1 ]明白顯示含肝素結合位置及C S _]二者之纖維蛋白膠 斷片H - 2 9 6與F H 3 0 / 3 5及共同培着獲得的結果類似。不含此 二位置之斷片用於.轉導可移植的造血纟丨II胞時較無效。資料 驗證原始造血幹细胞及反錄病毒結合至含C S - 1及肝素結合 位置二者之重組F N斷片之共同局限化作用可有效轉導可移 植的造血ffl胞。 雖然已經於前文樂例詳细說明本發明，但前文說明需視 同舉例說明而非囿限特性，需了解僅描述較佳具體例而其 屬於本發明精神範圓内之全部變化及修改希望接受保謂。 此處引述之公開文獻皆併述於此Μ供參考。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局—工消费合作社印製 -42 木紙张尺度適/ί]中國國家標牟（CNS ) Μ規格（210X 297公楚）

Claims (1)

1232884 Αδ Β8 C8 D8 93· 9· 1 〇替换本 六、申請專利範圍 1 · 一種藉複製缺陷型重組反錄病毒載體提高活造血細胞 之轉導頻率之方法，包括以複製缺陷型重組反錄病毒載 體，在含有可提供CS - 1領域之細胞結合活性的胺基酸序列 和選自包含H- 29 6、CH- 296及其混合物之族群的胺基酸序 列之重組纖維蛋白膠斷片的存在下感染活造血細胞，以藉 反錄病毒載體提局造血細胞轉導頻率。 2 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該造血細胞具有 蛋白質缺陷或異常，及重組反錄病毒載體包含編碼該蛋白 質的外生基因。 3 .如申請專利範圍第2項之方法，其中該外生基因爲編 碼腺核苷脫胺酶之基因。 4 .如申請專利範圍第3項之方法，其中該外生基因爲編 碼人類腺核苷脫胺酶之基因。 5 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該等造血細胞包 含人類幹細胞。 6 .如申請專利範圍第5項之方法，其中該等造血細胞之 特徵爲無黏著性、低密度之單核細胞。 7 . —種生產經轉導的臍帶血來源細胞之方法，包含： 以複製缺陷型重組反錄病毒，在含有可提供CS-1領域之 細胞結合活性的胺基酸序列和包含H- 296及CH- 296斷片的 胺基酸序列之重組纖維蛋白膠斷片的存在下，感染培養之 活造血細胞，以產生經轉導的造血細胞。 8 .如申請專利範圍第7項之方法，其中包含收穫經轉導 的造血細胞。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 Αδ Β8 C8 D8 六 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1232884 、申請專利範圍 9 ·如申請專利範圍第7項之方法，其中該造血細胞具有 蛋白質缺陷或異常，及重組反錄病毒載體包含編碼該蛋白 質的外生基因。 1 〇 ·如申請專利範圍第7項之方法，其中該造血細胞具有 酶缺陷或異常，及該外生基因爲編碼該酶之基因。 11.如申請專利範圍第10項之方法，其中該等造血細胞 爲具有酶缺陷或異常之人類臍帶血液來源細胞，及外生基 因爲編碼酶之人類基因。 1 2 .如申請專利範圍第1 0項之方法，其中該等臍帶血液 來源細胞具有腺核苷脫胺酶缺陷，而外生基因爲編碼腺核 苷脫胺酶。 1 3 .如申請專利範圍第1 1項之方法，其中該等人類臍帶 血液來源細胞具有腺核苷脫胺酶缺陷，及外生基因爲編碼 腺核苷脫胺酶。 1 4 .如申請專利範圍第1 1項之方法，其中該等臍帶血液 來源細胞包含人類幹細胞。 1 5 .如申請專利範圍第1 4項之方法，其中該等臍帶血液 來源細胞之特徵爲無黏著性、低密度之單核細胞。 1 6 . —種能維持活造血細胞之培養基，其含有重組纖維蛋 白膠斷片，該斷片含有可提供CS -1領域之細胞結合活性的 胺基酸序列和可提供H- 296及CH- 296纖維蛋白膠斷片之反 錄病毒結合活性的胺基酸序列。 1 7 . —種於活臍帶血液來源細胞內改良藉由反錄病毒做 基因移轉之方法，包含於固定的重組纖維蛋白膠斷片存在 本ϋ尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------—I—訂———丨 *5^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 2 1232884 六 經濟部智慧財產局員工消費合作社印？衣 Αδ Β8 C8 D8、申請專利範圍 下，進行藉由反錄病毒進行之基因移轉，該斷片含有可提 供CS-1領域之細胞結合活性的胺基酸序列和包含H-296 及CH- 296纖維蛋白膠斷片的胺基酸序列。 1 8 .如申請專利範圍第1 7項之方法，其中該等造血細胞 包括哺乳類幹細胞。 19. 一種藉複製缺陷型重組反錄病毒載體提高造血細胞 轉導頻率之方法，包含以複製缺陷型重組反錄病毒載體於 有效量經固定的含H- 29 6及CH- 296纖維蛋白膠斷片及可提 供纖維蛋白膠CS - 1領域之細胞結合活性的第二胺基酸序 列存在下，感染富含造血幹細胞之活造血細胞族群，俾藉 反錄病毒載體提高臍帶血液來源細胞轉導頻率。 20 ·如申請專利範圍第19項之方法，其中該等造血細胞 具有蛋白質缺陷或異常及重組反錄病毒載體包含編碼該蛋 白質的外生基因。 2 1 ·如申請專利範圍第20項之方法，其中該外生基因爲 編碼腺核苷脫胺酶之基因。 22 ·如申請專利範圍第2 1項之方法，其中該外生基因爲 編碼人類腺核苷脫胺酶之基因。 23 ·如申請專利範圍第20項之方法，其中該等造血細胞 之特徵爲無黏著性、低密度之單核細胞。 24 ·如申請專利範圍第丨9項之方法，其中該感染係包含 感染於同時含有（i )下式表示之第一胺基酸序列： Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) IT----------線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210>< 297公釐） 3 1232884 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Cys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro.Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Cys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr 或類似的胺基酸序列俾具有結合反錄病毒之能力；及（ii ) 下式表示之第二胺基酸序列： Asp Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu lie Leu Asp Val Pro Ser Thr 或充分類似的胺基酸序列俾具有結合原始臍帶血液來源細 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1232884 AS B8 C8 D8 、申請專利範圍 胞之能力之多肽存在下進行。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 25.—種局限化反錄病毒之方法，包括： 於與有效量之含可提供H- 29 6及CH- 2 96纖維蛋白膠斷片 之反錄病毒結合活性的胺基酸序列之已固定的多肽接觸 下，培育含反錄病毒之培養基。 26 .如申請專利範圍第25項之方法，其中該多肽含有下 式表不之胺基酸序列： Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Val Val.Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Cys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Cys Pro Gly 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A8 B8 C8 D8 1232884 六、申請專利範圍 Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pr〇 Gly Val Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr 或其類似的胺基酸序列而具有纖維蛋白膠肝素Π領域之反 錄病毒結合活性。 27· —種製造可用於增進反錄病毒載體之DNA移轉入預 定的目標細胞之構成體之方法，包括： 選擇與該目標細胞具有結合特異性之配合基，及 共價偶合該配合基至含有具有H-296及CH-296纖維蛋白 膠斷片之反錄病毒結合活性的胺基酸序列之多肽。 28 ·如申請專利範圍第27項之方法，其中該配合基爲細 胞黏著性蛋白質、激素、細胞激素、單株抗體、碳水化合 物、代謝產物，或得自纖維蛋白膠以外之蛋白質之多肽。 29 ·如申請專利範圍第28項之方法，其中該目標細胞爲 惡性腫瘤細胞及該配合基爲激素。 3〇 ·如申請專利範圍第29項之方法，其中該目標細胞爲 乳癌細胞及該配合基爲泌乳激素釋放激素，雌激素，孕激 素或抗孕激素。 31.—種用於進行藉反錄病毒之DNA移轉之套件組，包 括： (a )實質純質之重組多肽含有（i )可提供人類纖維蛋白 膠肝素Π領域之反錄病毒結合活性的第一胺基酸序列及 (Π )可提供人類纖維蛋白膠CS -1領域之細胞結合活性的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐〉 Λ -- -- --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 6 1232884 as C8 _ D8 六、申請專利範圍 第二胺基酸序列； (b )人工基質，於基質上可與人類臍帶血液來源細胞接觸 而培育反錄病毒載體；及 (c )前刺激臍帶血液來源細胞用之造血細胞生長因子。 3 2 ·如申請專利範圍第3 1項之套件組，其中該實質純質 之多肽係固定於人工基質上。 3 3 ·如申請專利範圍第3 1項之套件組，其也包含： (a )供轉導人類造血細胞之重組反錄病毒載體。 3 4 .如申請專利範圍第3 1項之套件組，其中該實質純質 之多肽（a )包括具有下式表示之胺基酸序列的重組多肽： Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn. Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr Leu 身 -- -r -------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） Αδ Β8 C8 D8 232884 申請專利範圍 lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Va 1 Ser Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Cys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr 或其類似的胺基酸序列而具有反錄病毒結合活性。 3 5 ·如申請專利範圍第34項之套件組，其中該實質純質 之重組多肽係固定於人工基質上。 3 6 ·如申請專利範圍第3 5項之套件組，其也包括： (d )供轉導人類造血細胞之重組反錄病毒載體。 3 7 · —種製備可存活的原始造血細胞族群之方法，包含使 含活造血細胞之細胞族群與有效量之具有H-.29 6及CH-296 纖維蛋白膠斷片之細胞結合活性經固定的多肽接觸，因而 使原始造血細胞結合至該定量固定的多肽上。 3 8 ·如申請專利範圍第3 7項之方法，其中多肽具有下式 表示之胺基酸序列： Asp Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu Hi s Gly Pro Glu lie Leu Asp Val Pro Ser Thr 或其類似的胺基酸序列而具有結，合原始造血細胞之能力。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） Λ - _ -- --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 8