JP2001169789A - ウイルス仲介ｄｎａ導入の増強 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明は、増強された遺伝子導入を利用した体
細胞遺伝子治療のための改良法、レトロウイルス仲介に
よる細胞へのＤＮＡ導入を増強するための細胞集団およ
び新規な構築体、ならびにそれらの使用を提供すること
を目的とする。 【解決手段】レトロウイルスによる造血細胞その他の細
胞の形質導入効率を増大させる方法は、細胞をフィブロ
ネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントの存在下
で感染させることを含む。図面から分かるように、フィ
ブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントは細
胞、特にコミッティッド前駆細胞および未発達の造血幹
細胞を含めた造血細胞へのレトロウイルス仲介による遺
伝子導入を有意に増強させる。
細胞遺伝子治療のための改良法、レトロウイルス仲介に
よる細胞へのＤＮＡ導入を増強するための細胞集団およ
び新規な構築体、ならびにそれらの使用を提供すること
を目的とする。 【解決手段】レトロウイルスによる造血細胞その他の細
胞の形質導入効率を増大させる方法は、細胞をフィブロ
ネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントの存在下
で感染させることを含む。図面から分かるように、フィ
ブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントは細
胞、特にコミッティッド前駆細胞および未発達の造血幹
細胞を含めた造血細胞へのレトロウイルス仲介による遺
伝子導入を有意に増強させる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は一般にウイルスによ
る細胞の形質導入効率を高める方法、より詳細にはフィ
ブロネクチンおよび／またはフィブロネクチンフラグメ
ントを用いてウイルス仲介による細胞内への遺伝子導入
を増強する方法に関するものである。
る細胞の形質導入効率を高める方法、より詳細にはフィ
ブロネクチンおよび／またはフィブロネクチンフラグメ
ントを用いてウイルス仲介による細胞内への遺伝子導入
を増強する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ヒトの疾病の多くについて分子基準での
理解が進み、かつ遺伝子導入技術が向上したことによ
り、最近では重篤な遺伝病に対して体細胞遺伝子療法の
ためのプロトコールの開発が試みられるようになった。
現在、ヒトの遺伝子療法にとって有望な候補である疾病
には、酵素または他のタンパク質が欠損または欠如して
いるものであって、酵素または他のタンパク質の水準を
厳密に調節する必要のない場合、特にそれらが構成的に
調節されているもの、および患者の骨髄に見られる欠損
が含まれる。
理解が進み、かつ遺伝子導入技術が向上したことによ
り、最近では重篤な遺伝病に対して体細胞遺伝子療法の
ためのプロトコールの開発が試みられるようになった。
現在、ヒトの遺伝子療法にとって有望な候補である疾病
には、酵素または他のタンパク質が欠損または欠如して
いるものであって、酵素または他のタンパク質の水準を
厳密に調節する必要のない場合、特にそれらが構成的に
調節されているもの、および患者の骨髄に見られる欠損
が含まれる。
【０００３】たとえば遺伝子療法の候補である疾病の１
つは、重篤な複合型免疫不全病（ＳＣＩＤ）をもたらす
アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症である。ＡＤ
Ａ欠損患者は骨髄中に検出しうる酵素をほとんど、また
は全く含まない。しかしＡＤＡ欠損症は適合骨髄移植に
よって治癒している。ＡＤＡ正常細胞はＡＤＡ欠損細胞
より選択的利点をもち、患者の骨髄を正常にリポピュレ
ート（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）するであろう。
つは、重篤な複合型免疫不全病（ＳＣＩＤ）をもたらす
アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症である。ＡＤ
Ａ欠損患者は骨髄中に検出しうる酵素をほとんど、また
は全く含まない。しかしＡＤＡ欠損症は適合骨髄移植に
よって治癒している。ＡＤＡ正常細胞はＡＤＡ欠損細胞
より選択的利点をもち、患者の骨髄を正常にリポピュレ
ート（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）するであろう。
【０００４】骨髄組織はインビトロで容易に取り扱うこ
とができ、かつリポピュレートする細胞を含むので、骨
髄細胞は体細胞遺伝子療法の良好な標的である。あるい
はヒトの臍帯血が未発達の前駆細胞を多数含有すること
もこれまでに証明されている。長期的にリポピュレート
する細胞である造血幹細胞中への遺伝子導入に成功すれ
ば、これらの細胞の子孫において顕性となる多様な疾病
を生涯にわたって治癒することができる。
とができ、かつリポピュレートする細胞を含むので、骨
髄細胞は体細胞遺伝子療法の良好な標的である。あるい
はヒトの臍帯血が未発達の前駆細胞を多数含有すること
もこれまでに証明されている。長期的にリポピュレート
する細胞である造血幹細胞中への遺伝子導入に成功すれ
ば、これらの細胞の子孫において顕性となる多様な疾病
を生涯にわたって治癒することができる。
【０００５】リポピュレートする幹細胞中への遺伝子導
入およびそこでの長期的な遺伝子発現が、ネズミモデル
において多数の研究者により達成された。しかしより大
型の動物、たとえばイヌおよび霊長類におけるインビボ
実験の成功は限定されている。これは未発達の造血幹細
胞の感染効率が低いことが大きな原因である。現在の遺
伝子導入技術の制限は、ヒトのプロトコールに適用した
場合、幾つかの要因によってさらに複雑になる。これら
の要因には成人骨髄（ＡＢＭ）中に存在する幹細胞数が
少ないこと、これらの細胞を精製する適切な方法がない
こと、および細胞周期においてこのような未発達細胞の
部分が少ないことが含まれる。
入およびそこでの長期的な遺伝子発現が、ネズミモデル
において多数の研究者により達成された。しかしより大
型の動物、たとえばイヌおよび霊長類におけるインビボ
実験の成功は限定されている。これは未発達の造血幹細
胞の感染効率が低いことが大きな原因である。現在の遺
伝子導入技術の制限は、ヒトのプロトコールに適用した
場合、幾つかの要因によってさらに複雑になる。これら
の要因には成人骨髄（ＡＢＭ）中に存在する幹細胞数が
少ないこと、これらの細胞を精製する適切な方法がない
こと、および細胞周期においてこのような未発達細胞の
部分が少ないことが含まれる。
【０００６】骨髄細胞に関するネズミおよび大型動物双
方の実験において、成功例のプロトコールは大部分が標
的細胞とレトロウイルス産生細胞系の同時培養を採用し
ていることが指摘された。同様に、ＦＤＡが承認したヒ
トの遺伝子導入の試みは大部分が遺伝子導入のために組
換えレトロウイルスベクターに依存している。組換えレ
トロウイルスベクターは外因性ＤＮＡを細胞内ＤＮＡ中
へ効果的に導入し、正確かつ安定に組み込むので、遺伝
子療法にとって望ましい。これらのベクターは遺伝子導
入のための外因性ＤＮＡを含有し、ウイルス病原性を排
除するためにさらに修飾される。これらの修飾がなされ
ているため、ウイルスの産生は一般にレトロウイルスパ
ッケージング細胞を用いて行われる。しかし臨床遺伝子
療法には、生物学的安全性および品質管理の懸念から無
細胞形質導入の方が望ましい。残念ながら造血細胞、た
とえば幹細胞への効果的な遺伝子導入はウイルス産生細
胞との同時培養なしには一般に不可能であった。
方の実験において、成功例のプロトコールは大部分が標
的細胞とレトロウイルス産生細胞系の同時培養を採用し
ていることが指摘された。同様に、ＦＤＡが承認したヒ
トの遺伝子導入の試みは大部分が遺伝子導入のために組
換えレトロウイルスベクターに依存している。組換えレ
トロウイルスベクターは外因性ＤＮＡを細胞内ＤＮＡ中
へ効果的に導入し、正確かつ安定に組み込むので、遺伝
子療法にとって望ましい。これらのベクターは遺伝子導
入のための外因性ＤＮＡを含有し、ウイルス病原性を排
除するためにさらに修飾される。これらの修飾がなされ
ているため、ウイルスの産生は一般にレトロウイルスパ
ッケージング細胞を用いて行われる。しかし臨床遺伝子
療法には、生物学的安全性および品質管理の懸念から無
細胞形質導入の方が望ましい。残念ながら造血細胞、た
とえば幹細胞への効果的な遺伝子導入はウイルス産生細
胞との同時培養なしには一般に不可能であった。
【０００７】最近、感染に際して標的細胞を間質細胞に
暴露することにより遺伝子導入効率を高めうることが示
された。間質細胞は造血ミクロエンバイロンメント（Ｈ
Ｍ）の主成分である。ＨＭはマクロファージ、間質細
胞、内皮細胞、脂肪細胞、および多様な特定の付着分子
から構成される複雑な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の
統制された網状構造からなる。ＥＣＭ分子、たとえばラ
ミニン、コラーゲン、トロンボスポンジン、プロテオグ
リカン、グリコサミノグリカンおよびフィブロネクチン
が、造血細胞と成長因子の双方に対する足場部位を提供
する。間質細胞がレトロウイルス感染に及ぼすこの促進
作用の基礎となるメカニズムは不明であるが、造血細胞
の増殖および分化の生理学的調節はこれらの細胞がＨＭ
の細胞と直接に接触した際に起こることが最近知られ
た。
暴露することにより遺伝子導入効率を高めうることが示
された。間質細胞は造血ミクロエンバイロンメント（Ｈ
Ｍ）の主成分である。ＨＭはマクロファージ、間質細
胞、内皮細胞、脂肪細胞、および多様な特定の付着分子
から構成される複雑な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の
統制された網状構造からなる。ＥＣＭ分子、たとえばラ
ミニン、コラーゲン、トロンボスポンジン、プロテオグ
リカン、グリコサミノグリカンおよびフィブロネクチン
が、造血細胞と成長因子の双方に対する足場部位を提供
する。間質細胞がレトロウイルス感染に及ぼすこの促進
作用の基礎となるメカニズムは不明であるが、造血細胞
の増殖および分化の生理学的調節はこれらの細胞がＨＭ
の細胞と直接に接触した際に起こることが最近知られ
た。
【０００８】長期的にリポピュレートする造血幹細胞お
よび他の細胞への効果的な遺伝子導入には依然として問
題が多く、このことが現在では遺伝子導入プロトコール
を造血および他の疾病の治癒的療法に広範に適用するの
を妨げている。従来法がもつ危険性および制限なしに遺
伝物質を哺乳動物細胞に効果的に導入する方法が依然と
して求められている。本発明はこれらの要求に応えるも
のである。
よび他の細胞への効果的な遺伝子導入には依然として問
題が多く、このことが現在では遺伝子導入プロトコール
を造血および他の疾病の治癒的療法に広範に適用するの
を妨げている。従来法がもつ危険性および制限なしに遺
伝物質を哺乳動物細胞に効果的に導入する方法が依然と
して求められている。本発明はこれらの要求に応えるも
のである。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】すなわち本発明の好ま
しい１態様は、レトロウイルスベクターによる造血細胞
の形質導入頻度を増大させる方法を提供する。この方法
には、生存可能な造血細胞に複製欠損性組換えレトロウ
イルスベクターを、レトロウイルスによる細胞形質導入
を増大させるのに有効な実質的に純粋なフィブロネクチ
ンおよび／またはフィブロネクチンフラグメントの存在
下で感染させることが含まれる。フィブロネクチンおよ
び／またはフィブロネクチンフラグメントは天然物質に
由来するものであってもよく、または合成によるもの
（たとえば組換え法により遺伝子工学的に合成されたも
の、または化学的合成法によるもの）、もしくは天然物
質と合成物質の組合わせに由来するものであってもよ
い。さらに本発明に用いられるフィブロネクチンポリペ
プチド（１または２以上）には、天然フィブロネクチン
アミノ酸配列に対する突然変異体であって、それにもか
かわらず本発明による形質導入の増大を達成するのに必
要な付着性を備えたものが含まれることは理解されるで
あろう。
しい１態様は、レトロウイルスベクターによる造血細胞
の形質導入頻度を増大させる方法を提供する。この方法
には、生存可能な造血細胞に複製欠損性組換えレトロウ
イルスベクターを、レトロウイルスによる細胞形質導入
を増大させるのに有効な実質的に純粋なフィブロネクチ
ンおよび／またはフィブロネクチンフラグメントの存在
下で感染させることが含まれる。フィブロネクチンおよ
び／またはフィブロネクチンフラグメントは天然物質に
由来するものであってもよく、または合成によるもの
（たとえば組換え法により遺伝子工学的に合成されたも
の、または化学的合成法によるもの）、もしくは天然物
質と合成物質の組合わせに由来するものであってもよ
い。さらに本発明に用いられるフィブロネクチンポリペ
プチド（１または２以上）には、天然フィブロネクチン
アミノ酸配列に対する突然変異体であって、それにもか
かわらず本発明による形質導入の増大を達成するのに必
要な付着性を備えたものが含まれることは理解されるで
あろう。
【００１０】本発明の他の好ましい態様は、生存可能な
造血細胞に外因性ＤＮＡを保有する複製欠損性組換えレ
トロウイルスを、レトロウイルスによる細胞形質導入頻
度の増大に有効な量の固定化されたフィブロネクチン、
固定化されたフィブロネクチンフラグメント、またはそ
の固定化された混合物の存在下で感染させることを含
む、形質導入された造血細胞の調製方法を提供する。
造血細胞に外因性ＤＮＡを保有する複製欠損性組換えレ
トロウイルスを、レトロウイルスによる細胞形質導入頻
度の増大に有効な量の固定化されたフィブロネクチン、
固定化されたフィブロネクチンフラグメント、またはそ
の固定化された混合物の存在下で感染させることを含
む、形質導入された造血細胞の調製方法を提供する。
【００１１】本発明の他の好ましい態様は、改良された
細胞移植法を提供する。本方法には、ドナー動物から生
存可能な造血細胞を採取し；これらの造血細胞に組換え
レトロウイルスベクターを感染させて、形質導入された
生存可能な造血細胞を調製し、その際感染は固定化され
た形の、かつ形質導入頻度を増大させるのに有効なフィ
ブロネクチンおよび／またはそのフラグメントの存在下
で行われ；そして形質導入された生存可能な造血細胞を
細胞移植体としてレシピエント動物に導入する工程が含
まれる。好ましい１態様においては、感染細胞を自己ド
ナー(ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｄｏｎｏｒ）に導入するこ
とができる。
細胞移植法を提供する。本方法には、ドナー動物から生
存可能な造血細胞を採取し；これらの造血細胞に組換え
レトロウイルスベクターを感染させて、形質導入された
生存可能な造血細胞を調製し、その際感染は固定化され
た形の、かつ形質導入頻度を増大させるのに有効なフィ
ブロネクチンおよび／またはそのフラグメントの存在下
で行われ；そして形質導入された生存可能な造血細胞を
細胞移植体としてレシピエント動物に導入する工程が含
まれる。好ましい１態様においては、感染細胞を自己ド
ナー(ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｄｏｎｏｒ）に導入するこ
とができる。
【００１２】本発明の他の好ましい態様は、細胞移植法
に適した形質導入された臍帯血細胞を得る方法を提供す
る。本方法には、臍帯血由来の造血細胞に複製欠損性組
換えレトロウイルスベクターを、レトロウイルスベクタ
ーによる造血細胞の形質導入頻度を増大させるのに有効
な固定化された量のフィブロネクチンおよび／またはそ
のフラグメントの存在下で感染させることが含まれる。
本発明は、その方法で得られた、臍帯血細胞由来の生存
可能な形質導入細胞集団、およびそれらの形質導入細胞
集団を動物に細胞移植体として導入することをも包含す
る。
に適した形質導入された臍帯血細胞を得る方法を提供す
る。本方法には、臍帯血由来の造血細胞に複製欠損性組
換えレトロウイルスベクターを、レトロウイルスベクタ
ーによる造血細胞の形質導入頻度を増大させるのに有効
な固定化された量のフィブロネクチンおよび／またはそ
のフラグメントの存在下で感染させることが含まれる。
本発明は、その方法で得られた、臍帯血細胞由来の生存
可能な形質導入細胞集団、およびそれらの形質導入細胞
集団を動物に細胞移植体として導入することをも包含す
る。
【００１３】以上に述べた本発明の態様のより具体的な
観点によれば、使用されるフィブロネクチンまたはフィ
ブロネクチンフラグメントは、フィブロネクチンのヘパ
リン−ＩＩ結合性ドメインがもつレトロウイルス結合活
性を与える第１アミノ酸配列、およびフィブロネクチン
のＣＳ−１ドメインがもつ細胞結合活性を与える第２ア
ミノ酸配列を含むであろう。フィブロネクチンのこれら
２結合ドメインを合わせて使用することにより、レトロ
ウイルスによる標的細胞の形質導入効率が著しく増大す
ることが証明された。
観点によれば、使用されるフィブロネクチンまたはフィ
ブロネクチンフラグメントは、フィブロネクチンのヘパ
リン−ＩＩ結合性ドメインがもつレトロウイルス結合活
性を与える第１アミノ酸配列、およびフィブロネクチン
のＣＳ−１ドメインがもつ細胞結合活性を与える第２ア
ミノ酸配列を含むであろう。フィブロネクチンのこれら
２結合ドメインを合わせて使用することにより、レトロ
ウイルスによる標的細胞の形質導入効率が著しく増大す
ることが証明された。
【００１４】本発明の他の好ましい態様は、レトロウイ
ルスベクターによる予め定めた標的細胞の形質導入頻度
を増大させる構築体の製造方法を提供する。本方法に
は、標的細胞に結合するリガンドを、フィブロネクチン
のヘパリン−ＩＩ結合性ドメインがもつレトロウイルス
結合活性を与えるアミノ酸配列を含むポリペプチドに共
有結合させる工程が含まれる。本発明は、これらの構築
体をレトロウイルスベクターによる予め定めた標的細胞
の形質導入頻度を増大させるために使用する方法、およ
び形質導入細胞を用いる移植法をも包含する。
ルスベクターによる予め定めた標的細胞の形質導入頻度
を増大させる構築体の製造方法を提供する。本方法に
は、標的細胞に結合するリガンドを、フィブロネクチン
のヘパリン−ＩＩ結合性ドメインがもつレトロウイルス
結合活性を与えるアミノ酸配列を含むポリペプチドに共
有結合させる工程が含まれる。本発明は、これらの構築
体をレトロウイルスベクターによる予め定めた標的細胞
の形質導入頻度を増大させるために使用する方法、およ
び形質導入細胞を用いる移植法をも包含する。
【００１５】本発明の他の好ましい態様は、ウイルスを
含有する培地を、一定量のウイルスの局在化に有効な固
定化された量のフィブロネクチン、またはヘパリン−Ｉ
Ｉ結合性ドメインがもつウイルス結合活性を含むフィブ
ロネクチンフラグメントの存在下でインキュベートする
ことを含む、一定量のウイルスを局在化する方法を提供
する。
含有する培地を、一定量のウイルスの局在化に有効な固
定化された量のフィブロネクチン、またはヘパリン−Ｉ
Ｉ結合性ドメインがもつウイルス結合活性を含むフィブ
ロネクチンフラグメントの存在下でインキュベートする
ことを含む、一定量のウイルスを局在化する方法を提供
する。
【００１６】本発明のさらに他の好ましい態様は一般
に、実質的に純粋な、および／または固定化されたフィ
ブロネクチンまたはそのフラグメントを含有する形質導
入された生存可能な造血細胞および他の細胞の培養物、
ならびに細胞内へのレトロウイルス仲介によるＤＮＡ導
入を実施するためのキットを提供する。
に、実質的に純粋な、および／または固定化されたフィ
ブロネクチンまたはそのフラグメントを含有する形質導
入された生存可能な造血細胞および他の細胞の培養物、
ならびに細胞内へのレトロウイルス仲介によるＤＮＡ導
入を実施するためのキットを提供する。
【００１７】本発明の目的は、哺乳動物細胞の効果的な
レトロウイルス感染方法を提供することである。本発明
の他の目的は、同時培養の必要がない、レトロウイルス
ベクターによる遺伝子導入方法を提供することである。
レトロウイルス感染方法を提供することである。本発明
の他の目的は、同時培養の必要がない、レトロウイルス
ベクターによる遺伝子導入方法を提供することである。
【００１８】本発明の他の目的は、自己および／または
同種間細胞移植のための方法および細胞培養物を提供す
ることである。本発明のこれらおよび他の目的、利点お
よび特色は、以下の記載から当業者に自明であろう。
同種間細胞移植のための方法および細胞培養物を提供す
ることである。本発明のこれらおよび他の目的、利点お
よび特色は、以下の記載から当業者に自明であろう。
【００１９】
【課題を解決するための手段】本発明の原理を理解しや
すくするために本発明の特定の態様を参照し、具体的な
語を用いてそれを説明する。ただしこれは本発明の範囲
の限定を意図するものでないことは理解されるであろ
う。本明細書に示すような本発明の原理の変更、さらに
修正および適用は本発明に関連する技術分野の専門家が
普通に行うものと解される。
すくするために本発明の特定の態様を参照し、具体的な
語を用いてそれを説明する。ただしこれは本発明の範囲
の限定を意図するものでないことは理解されるであろ
う。本明細書に示すような本発明の原理の変更、さらに
修正および適用は本発明に関連する技術分野の専門家が
普通に行うものと解される。
【００２０】前記のように、本発明はウイルス、たとえ
ばレトロウイルスによる生存可能な細胞の形質導入頻度
を増大させる方法を提供する。本発明は、組換えレトロ
ウイルスベクターを用いた生存可能な細胞中への効果的
な遺伝子導入法、形質導入細胞を得る方法、ならびに自
己および他の細胞移植を達成するための方法および材料
をも提供する。
ばレトロウイルスによる生存可能な細胞の形質導入頻度
を増大させる方法を提供する。本発明は、組換えレトロ
ウイルスベクターを用いた生存可能な細胞中への効果的
な遺伝子導入法、形質導入細胞を得る方法、ならびに自
己および他の細胞移植を達成するための方法および材料
をも提供する。
【００２１】本発明の１特色は、フィブロネクチン（Ｆ
Ｎ）、およびＦＮのＣＳ−１細胞付着ドメインを含むフ
ィブロネクチンフラグメントが、フィブロネクチン受容
体を保有することによりフィブロネクチンまたはそのフ
ラグメントへの結合能を示す細胞、たとえば造血細胞、
たとえばコミッティッド前駆細胞および未発達の造血幹
細胞または長期培養−開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）中への
レトロウイルス仲介による遺伝子導入を有意に増強する
という知見である。有利には、この増大した効率により
ウイルス産生細胞との同時培養が不必要になる。本発明
の他の特色は、フィブロネクチンのウイルス結合性ドメ
インがヘパリン−ＩＩ結合性ドメイン内にあるという知
見を利用する。このウイルス結合性ドメインは、たとえ
ばウイルスを標的細胞へ運搬するための広範な構築体を
含めた多くの用途において、ウイルス粒子を局在化する
ために使用しうる。
Ｎ）、およびＦＮのＣＳ−１細胞付着ドメインを含むフ
ィブロネクチンフラグメントが、フィブロネクチン受容
体を保有することによりフィブロネクチンまたはそのフ
ラグメントへの結合能を示す細胞、たとえば造血細胞、
たとえばコミッティッド前駆細胞および未発達の造血幹
細胞または長期培養−開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）中への
レトロウイルス仲介による遺伝子導入を有意に増強する
という知見である。有利には、この増大した効率により
ウイルス産生細胞との同時培養が不必要になる。本発明
の他の特色は、フィブロネクチンのウイルス結合性ドメ
インがヘパリン−ＩＩ結合性ドメイン内にあるという知
見を利用する。このウイルス結合性ドメインは、たとえ
ばウイルスを標的細胞へ運搬するための広範な構築体を
含めた多くの用途において、ウイルス粒子を局在化する
ために使用しうる。
【００２２】本発明の特定の好ましい観点による組換え
ウイルスベクターは、外因性ＤＮＡを含有し、非病原
性、すなわち複製欠損性である。これらのベクターは外
因性ＤＮＡを宿主細胞、たとえば動物細胞、特に哺乳動
物細胞の細胞ＤＮＡ中へ効果的に導入し、正確かつ安定
に組み込む。たとえば本発明においては目的とする遺伝
子のコード配列に由来する一連の塩基を含むヌクレオチ
ド配列を、遺伝子を駆動するための適切なプロモータ
ー、一般に外因性プロモーターの制御下に、組換えレト
ロウイルスベクター中へ取り込ませることができる。こ
れに関して外因性ＤＮＡは天然または合成により産生さ
れたＤＮＡを含むことができ、かつ異種供給源に由来す
る部分であってもよく、それらの部分は天然分子または
化学合成された分子のいずれであってもよく、かつそれ
らの部分はライゲーションまたは当技術分野で既知の他
の手段で結合される。前記のように、導入されたヌクレ
オチド配列はプロモーターの制御下にあり、したがって
一般にプロモーターの下流にある。言い換えると、プロ
モーター配列は一般にコード配列の上流（すなわち５’
末端）にある。その際、プロモーターと協同作用する他
の調節要素（たとえばエンハンサー配列）、および外因
性コード配列の転写を行う転写開始コドンが存在しても
よく、存在しなくてもよいことは周知である。“の制御
下にある”という字句は、導入された遺伝子の転写を行
うためにこのような他の要素が必要であることを表す。
同様に組換えＤＮＡは好ましくは、導入されたコード配
列の下流に終止配列を含む。
ウイルスベクターは、外因性ＤＮＡを含有し、非病原
性、すなわち複製欠損性である。これらのベクターは外
因性ＤＮＡを宿主細胞、たとえば動物細胞、特に哺乳動
物細胞の細胞ＤＮＡ中へ効果的に導入し、正確かつ安定
に組み込む。たとえば本発明においては目的とする遺伝
子のコード配列に由来する一連の塩基を含むヌクレオチ
ド配列を、遺伝子を駆動するための適切なプロモータ
ー、一般に外因性プロモーターの制御下に、組換えレト
ロウイルスベクター中へ取り込ませることができる。こ
れに関して外因性ＤＮＡは天然または合成により産生さ
れたＤＮＡを含むことができ、かつ異種供給源に由来す
る部分であってもよく、それらの部分は天然分子または
化学合成された分子のいずれであってもよく、かつそれ
らの部分はライゲーションまたは当技術分野で既知の他
の手段で結合される。前記のように、導入されたヌクレ
オチド配列はプロモーターの制御下にあり、したがって
一般にプロモーターの下流にある。言い換えると、プロ
モーター配列は一般にコード配列の上流（すなわち５’
末端）にある。その際、プロモーターと協同作用する他
の調節要素（たとえばエンハンサー配列）、および外因
性コード配列の転写を行う転写開始コドンが存在しても
よく、存在しなくてもよいことは周知である。“の制御
下にある”という字句は、導入された遺伝子の転写を行
うためにこのような他の要素が必要であることを表す。
同様に組換えＤＮＡは好ましくは、導入されたコード配
列の下流に終止配列を含む。
【００２３】選択マーカーまたは他の選択性利点を与え
る外因性ＤＮＡを含むレトロウイルスを使用しうる。た
とえばベクターは、抗生物質、たとえばネオマイシンを
含めた種々の選択試薬に対する耐性を与える１または２
以上の外因性遺伝子を含むことができる。本発明に使用
しうる代表的ベクターには、たとえば下記のものが含ま
れる：Ｎ２／ＺｉｐＴＫＮＥＯベクター（ＴＫＮＥＯ）
（力価：ＮＩＨ ３Ｔ３細胞上で１×１０5 Ｇ４１８r
ｃｆｕ／ｍｌ）、ＺｉｐＰＧＫ−ｈＡＤＡベクター、
およびＺｉｐＰＧＫ−ｍＡＤＡベクター、これらはすべ
てＭｏｒｉｔｚら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１
７８：５２９により報告されている。ＴＫＮＥＯベクタ
ーにおいては、ｎｅｏホスホトランスフェラーゼ配列が
単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターによりセン
ス配向で（５’側ロングターミナルリピート−ＬＴＲに
対して）発現する。このベクターは、形質導入された細
胞の同定を容易にするためのネオマイシン耐性を与える
選択マーカー遺伝子を含む。ＺｉｐＰＧＫ−ｈＡＤＡベ
クターにおいては、ヒトＡＤＡ（“ｈＡＤＡ”）がヒト
ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターに
より５’ＬＴＲに対してセンス配向で発現する。それは
発現しうる遺伝子配列１個のみを含み、優性選択マーカ
ーを欠如する。ＺｉｐＰＧＫ−ｍＡＤＡ（ＰＧＫ−ｍＡ
ＤＡ）ベクターはヒトＡＤＡ ｃＤＮＡがネズミＡＤＡ
（“ｍＡＤＡ”）ＤＮＡで置換された点以外はＺｉｐＰ
ＧＫ−ｈＡＤＡベクターと等しい。これらおよび他のウ
イルスベクターならびにそれらの調製法は周知であり、
それらの実施および本発明における使用は本明細書の記
載から当業者が容易になしうるものである。
る外因性ＤＮＡを含むレトロウイルスを使用しうる。た
とえばベクターは、抗生物質、たとえばネオマイシンを
含めた種々の選択試薬に対する耐性を与える１または２
以上の外因性遺伝子を含むことができる。本発明に使用
しうる代表的ベクターには、たとえば下記のものが含ま
れる：Ｎ２／ＺｉｐＴＫＮＥＯベクター（ＴＫＮＥＯ）
（力価：ＮＩＨ ３Ｔ３細胞上で１×１０5 Ｇ４１８r
ｃｆｕ／ｍｌ）、ＺｉｐＰＧＫ−ｈＡＤＡベクター、
およびＺｉｐＰＧＫ−ｍＡＤＡベクター、これらはすべ
てＭｏｒｉｔｚら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１
７８：５２９により報告されている。ＴＫＮＥＯベクタ
ーにおいては、ｎｅｏホスホトランスフェラーゼ配列が
単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターによりセン
ス配向で（５’側ロングターミナルリピート−ＬＴＲに
対して）発現する。このベクターは、形質導入された細
胞の同定を容易にするためのネオマイシン耐性を与える
選択マーカー遺伝子を含む。ＺｉｐＰＧＫ−ｈＡＤＡベ
クターにおいては、ヒトＡＤＡ（“ｈＡＤＡ”）がヒト
ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターに
より５’ＬＴＲに対してセンス配向で発現する。それは
発現しうる遺伝子配列１個のみを含み、優性選択マーカ
ーを欠如する。ＺｉｐＰＧＫ−ｍＡＤＡ（ＰＧＫ−ｍＡ
ＤＡ）ベクターはヒトＡＤＡ ｃＤＮＡがネズミＡＤＡ
（“ｍＡＤＡ”）ＤＮＡで置換された点以外はＺｉｐＰ
ＧＫ−ｈＡＤＡベクターと等しい。これらおよび他のウ
イルスベクターならびにそれらの調製法は周知であり、
それらの実施および本発明における使用は本明細書の記
載から当業者が容易になしうるものである。
【００２４】本発明に用いられるウイルスベクターは、
ヒトフィブロネクチンを含めたフィブロネクチンのヘパ
リン−ＩＩ結合性ドメインのアミノ酸配列への結合能を
示す。本発明はいずれかの理論によって限定されるもの
ではないが、後記の節に述べるように、ウイルスおよび
標的細胞がそれぞれの官能性ドメインに結合することに
よりウイルスおよび細胞が同時局在（ｃｏ−ｌｏｃａｌ
ｉｚａｔｉｏｎ）することによって、ウイルスによる細
胞の形質導入が促進されると考えられる。これに関して
ウイルスがヘパリン−ＩＩ結合性ドメインのアミノ酸配
列に結合し、したがって本発明において効果的に作用す
る効力は、ルーティン方法、たとえば後記実施例８およ
び９に記載された方法で容易に確認しうる。一般にこれ
らのアッセイ法は、ヘパリン−ＩＩ結合性ドメインを含
む固定化されたポリペプチドにウイルス粒子が結合し、
したがって固定化されたポリペプチドマトリックスから
の洗浄に耐える程度を測定するものである。以下に要約
する：たとえばフィブロネクチンヘパリン−ＩＩ結合性
ドメインを含む固定化されたポリペプチドを収容したウ
ェル内でウイルスを含有する上清をインキュベートする
ことができる。次いでウェルを生理食塩緩衝液で徹底的
に洗浄したのち、ウイルスに対する標的細胞をウェル内
でインキュベートして、ウェル内に残存する感染活性の
水準を測定する。初期ウイルス上清と比較した感染活
性、すなわち力価の低下を評価し、同様な対照試験（た
とえばＢＳＡコーティングしたウェルの使用）のものと
比較する。対照ウェルと比較してヘパリン−ＩＩ結合性
ドメイン含有ウェル内に残存する力価の方が有意に高い
ことは、被験ウイルスが本発明の観点に使用するのに適
していることを示す。このスクリーニング法を容易にす
るために、ウイルスベクターは前記のように選択マーカ
ーを含んでもよい。
ヒトフィブロネクチンを含めたフィブロネクチンのヘパ
リン−ＩＩ結合性ドメインのアミノ酸配列への結合能を
示す。本発明はいずれかの理論によって限定されるもの
ではないが、後記の節に述べるように、ウイルスおよび
標的細胞がそれぞれの官能性ドメインに結合することに
よりウイルスおよび細胞が同時局在（ｃｏ−ｌｏｃａｌ
ｉｚａｔｉｏｎ）することによって、ウイルスによる細
胞の形質導入が促進されると考えられる。これに関して
ウイルスがヘパリン−ＩＩ結合性ドメインのアミノ酸配
列に結合し、したがって本発明において効果的に作用す
る効力は、ルーティン方法、たとえば後記実施例８およ
び９に記載された方法で容易に確認しうる。一般にこれ
らのアッセイ法は、ヘパリン−ＩＩ結合性ドメインを含
む固定化されたポリペプチドにウイルス粒子が結合し、
したがって固定化されたポリペプチドマトリックスから
の洗浄に耐える程度を測定するものである。以下に要約
する：たとえばフィブロネクチンヘパリン−ＩＩ結合性
ドメインを含む固定化されたポリペプチドを収容したウ
ェル内でウイルスを含有する上清をインキュベートする
ことができる。次いでウェルを生理食塩緩衝液で徹底的
に洗浄したのち、ウイルスに対する標的細胞をウェル内
でインキュベートして、ウェル内に残存する感染活性の
水準を測定する。初期ウイルス上清と比較した感染活
性、すなわち力価の低下を評価し、同様な対照試験（た
とえばＢＳＡコーティングしたウェルの使用）のものと
比較する。対照ウェルと比較してヘパリン−ＩＩ結合性
ドメイン含有ウェル内に残存する力価の方が有意に高い
ことは、被験ウイルスが本発明の観点に使用するのに適
していることを示す。このスクリーニング法を容易にす
るために、ウイルスベクターは前記のように選択マーカ
ーを含んでもよい。
【００２５】本発明に使用するフィブロネクチンのフラ
グメントは天然または合成のいずれに由来するものであ
ってもよく、天然材料からたとえば先にＲｕｏｓｌａｈ
ｔｉら（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：
７２７７；ＰａｔｅｌおよびＬｏｄｉｓｈ（１９８６）
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０２：４４９；ならびにＢ
ｅｒｎａｒｄｉら（１９８７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１０５：４８９が記載したように、実質的に純粋に
調製することができる。これに関して本明細書中で、実
質的に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチン
フラグメントという場合、フィブロネクチンが天然にそ
れらと共に存在する他のタンパク質を本質的に含有しな
いことを意味するものとする。本発明に使用する実質的
に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラ
グメントは組換えにより、たとえば米国特許第５，１９
８，４２３号明細書（１９９３年３月３０日にタグチら
に交付され、京都の宝酒造株式会社に譲渡された）に一
般的に記載された方法に従って製造することもできる。
特に後記実施例においてＨ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ
−２７１、ＣＨ−２９６およびＣ−ＣＳ１と定める組換
えフラグメントならびにそれらを得る方法が、この第
５，１９８，４２３号明細書に詳述されている。後記実
施例で用いたＣ２７４フラグメントは米国特許第５，１
０２，９８８号明細書の記載に従って得られた。これら
のフラグメントまたはそれらをルーティンに誘導しうる
フラグメントは、工業技術院生命工学工業技術研究所に
ＦＥＲＭＰ−１０７２１（Ｈ−２９６）、ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−２７９９（メチオニンによりＨ−２７１に結合した
Ｃ−２７７）、ＦＥＲＭ ＢＰ−２８００（メチオニン
によりＨ−２９６に結合したＣ−２７７）、およびＦＥ
ＲＭ ＢＰ−２２６４（Ｈ−２７１）として寄託された
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を同様に米国特許第５，１９
８，４２３号明細書に記載された方法に従って培養する
ことにより得られる。さらに、本発明に使用しうるフィ
ブロネクチンに関して、またはそれらのフラグメントの
出発原料に関して有用な情報が下記に見られる：Ｋｉｍ
ｉｚｕｋａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０，２８４−
２９１（１９９１）、これは前記の組換えフラグメント
につきさらに報告する；ＥＭＢＯ Ｊ．，４，１７５５
−１７５９（１９８５）、これはヒトフィブロネクチン
遺伝子の構造につき報告する；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，２５，４９３６−４９４１（１９８６）、これはヒ
トフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合性ドメインに
つき報告する。ＣＳ−１細胞付着ドメインおよびヘパリ
ン−ＩＩ結合性ドメインの両方を含むフィブロネクチン
フラグメント、たとえば約３０または３５ｋｄフラグメ
ント（３０／３５ＦＮ）および後記実施例に報告する種
々の組換えフラグメントに含まれるものが造血細胞中へ
の遺伝子導入効率を著しく増大させることがこれまでの
研究で認められ、本発明に使用するのに好ましい。した
がっておおまかに言うと、本発明に使用されるフィブロ
ネクチン関連ポリペプチドは、フィブロネクチンのＣＳ
−１細胞付着ドメインがもつ細胞結合活性、およびウイ
ルスを結合する、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結
合性ドメインのアミノ酸配列を提供する。必要な細胞結
合活性およびウイルス結合活性が両方とも、これらの官
能性フィブロネクチンドメインの天然アミノ酸配列によ
り、ならびに天然配列とは異なるがなお細胞結合活性お
よびウイルス結合活性を示すのに十分なほど類似するア
ミノ酸配列により提供されることは、当業者には自明で
あろう。これらの類似アミノ酸配列はそれらに対応する
天然アミノ酸配列に実質的に相同な配列を示し、アミノ
酸が欠失、置換および／または修飾されたにもかかわら
ず目的とする細胞結合性またはウイルス結合性を備えた
アミノ酸配列を提供するものを包含しうる。
グメントは天然または合成のいずれに由来するものであ
ってもよく、天然材料からたとえば先にＲｕｏｓｌａｈ
ｔｉら（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：
７２７７；ＰａｔｅｌおよびＬｏｄｉｓｈ（１９８６）
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０２：４４９；ならびにＢ
ｅｒｎａｒｄｉら（１９８７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１０５：４８９が記載したように、実質的に純粋に
調製することができる。これに関して本明細書中で、実
質的に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチン
フラグメントという場合、フィブロネクチンが天然にそ
れらと共に存在する他のタンパク質を本質的に含有しな
いことを意味するものとする。本発明に使用する実質的
に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラ
グメントは組換えにより、たとえば米国特許第５，１９
８，４２３号明細書（１９９３年３月３０日にタグチら
に交付され、京都の宝酒造株式会社に譲渡された）に一
般的に記載された方法に従って製造することもできる。
特に後記実施例においてＨ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ
−２７１、ＣＨ−２９６およびＣ−ＣＳ１と定める組換
えフラグメントならびにそれらを得る方法が、この第
５，１９８，４２３号明細書に詳述されている。後記実
施例で用いたＣ２７４フラグメントは米国特許第５，１
０２，９８８号明細書の記載に従って得られた。これら
のフラグメントまたはそれらをルーティンに誘導しうる
フラグメントは、工業技術院生命工学工業技術研究所に
ＦＥＲＭＰ−１０７２１（Ｈ−２９６）、ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−２７９９（メチオニンによりＨ−２７１に結合した
Ｃ−２７７）、ＦＥＲＭ ＢＰ−２８００（メチオニン
によりＨ−２９６に結合したＣ−２７７）、およびＦＥ
ＲＭ ＢＰ−２２６４（Ｈ−２７１）として寄託された
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を同様に米国特許第５，１９
８，４２３号明細書に記載された方法に従って培養する
ことにより得られる。さらに、本発明に使用しうるフィ
ブロネクチンに関して、またはそれらのフラグメントの
出発原料に関して有用な情報が下記に見られる：Ｋｉｍ
ｉｚｕｋａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０，２８４−
２９１（１９９１）、これは前記の組換えフラグメント
につきさらに報告する；ＥＭＢＯ Ｊ．，４，１７５５
−１７５９（１９８５）、これはヒトフィブロネクチン
遺伝子の構造につき報告する；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，２５，４９３６−４９４１（１９８６）、これはヒ
トフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合性ドメインに
つき報告する。ＣＳ−１細胞付着ドメインおよびヘパリ
ン−ＩＩ結合性ドメインの両方を含むフィブロネクチン
フラグメント、たとえば約３０または３５ｋｄフラグメ
ント（３０／３５ＦＮ）および後記実施例に報告する種
々の組換えフラグメントに含まれるものが造血細胞中へ
の遺伝子導入効率を著しく増大させることがこれまでの
研究で認められ、本発明に使用するのに好ましい。した
がっておおまかに言うと、本発明に使用されるフィブロ
ネクチン関連ポリペプチドは、フィブロネクチンのＣＳ
−１細胞付着ドメインがもつ細胞結合活性、およびウイ
ルスを結合する、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結
合性ドメインのアミノ酸配列を提供する。必要な細胞結
合活性およびウイルス結合活性が両方とも、これらの官
能性フィブロネクチンドメインの天然アミノ酸配列によ
り、ならびに天然配列とは異なるがなお細胞結合活性お
よびウイルス結合活性を示すのに十分なほど類似するア
ミノ酸配列により提供されることは、当業者には自明で
あろう。これらの類似アミノ酸配列はそれらに対応する
天然アミノ酸配列に実質的に相同な配列を示し、アミノ
酸が欠失、置換および／または修飾されたにもかかわら
ず目的とする細胞結合性またはウイルス結合性を備えた
アミノ酸配列を提供するものを包含しうる。
【００２６】これに関して、関連のバイオテクノロジー
技術分野は対象となる官能ドメインにおいてアミノ酸の
欠失、置換、付加または他の修飾をルーティンに実施し
うる状態にまで進歩している。得られたアミノ酸配列
を、次いで目的とする細胞結合活性およびウイルス結合
活性につきルーティンにスクリーニングすることができ
る。たとえばフィブロネクチンの突然変異形または修飾
形のヘパリン−ＩＩ結合性ドメインは一般的に先に述べ
たように、かつ実施例８および９に詳述するように、ウ
イルスのインキュベーション、洗浄、および対照と比較
した感染性の保持を測定するためのウイルス力価アッセ
イによりスクリーニングすることができる。本明細書に
示す教示を考慮すると、これらの結合アッセイは当業者
にはルーティン実験にすぎないであろう。
技術分野は対象となる官能ドメインにおいてアミノ酸の
欠失、置換、付加または他の修飾をルーティンに実施し
うる状態にまで進歩している。得られたアミノ酸配列
を、次いで目的とする細胞結合活性およびウイルス結合
活性につきルーティンにスクリーニングすることができ
る。たとえばフィブロネクチンの突然変異形または修飾
形のヘパリン−ＩＩ結合性ドメインは一般的に先に述べ
たように、かつ実施例８および９に詳述するように、ウ
イルスのインキュベーション、洗浄、および対照と比較
した感染性の保持を測定するためのウイルス力価アッセ
イによりスクリーニングすることができる。本明細書に
示す教示を考慮すると、これらの結合アッセイは当業者
にはルーティン実験にすぎないであろう。
【００２７】フィブロネクチンの修飾形もしくは突然変
異形のＣＳ−１細胞付着ドメインへの、または他の細胞
結合性ポリペプチドへの細胞の結合も、同様に常法によ
りアッセイしうる。たとえばそれらの方法にはＮａｔｕ
ｒｅ ３５２：４３８−４４１（１９９１）に記載され
たものが含まれる。以下に要約する：細胞結合性ポリペ
プチドをプラスチック皿にコートし、アッセイすべき細
胞集団を培地に入れて３０分ないし２時間載せておく。
このインキュベーション期間後に、タンパク質に付着し
ていない細胞を回収し、計数し、生存性につきアッセイ
する。ポリペプチドに付着した細胞をトリプシンまたは
細胞解離用緩衝液（たとえばギブコ）を用いて同様に回
収し、計数し、生存性につきアッセイする。場合によ
り、たとえば造血コロニー形成細胞については、細胞を
さらに１２−１４日間培養して、細胞のコロニー形成性
を確認する。次いで付着細胞の％を計算し、標準対照、
たとえばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）コートしたプラ
スチック皿と比較する。アッセイされるポリペプチドに
標的細胞が実質的に結合した場合、そのポリペプチド／
細胞の組合わせが本発明に適しており、そのポリペプチ
ドをフィブロネクチンからのレトロウイルス結合性フラ
グメントに結合させて、ウイルスベクターによる標的細
胞の感染を増強するための本発明構築体を製造しうるこ
とを示す。
異形のＣＳ−１細胞付着ドメインへの、または他の細胞
結合性ポリペプチドへの細胞の結合も、同様に常法によ
りアッセイしうる。たとえばそれらの方法にはＮａｔｕ
ｒｅ ３５２：４３８−４４１（１９９１）に記載され
たものが含まれる。以下に要約する：細胞結合性ポリペ
プチドをプラスチック皿にコートし、アッセイすべき細
胞集団を培地に入れて３０分ないし２時間載せておく。
このインキュベーション期間後に、タンパク質に付着し
ていない細胞を回収し、計数し、生存性につきアッセイ
する。ポリペプチドに付着した細胞をトリプシンまたは
細胞解離用緩衝液（たとえばギブコ）を用いて同様に回
収し、計数し、生存性につきアッセイする。場合によ
り、たとえば造血コロニー形成細胞については、細胞を
さらに１２−１４日間培養して、細胞のコロニー形成性
を確認する。次いで付着細胞の％を計算し、標準対照、
たとえばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）コートしたプラ
スチック皿と比較する。アッセイされるポリペプチドに
標的細胞が実質的に結合した場合、そのポリペプチド／
細胞の組合わせが本発明に適しており、そのポリペプチ
ドをフィブロネクチンからのレトロウイルス結合性フラ
グメントに結合させて、ウイルスベクターによる標的細
胞の感染を増強するための本発明構築体を製造しうるこ
とを示す。
【００２８】本発明のより具体的な観点によれば、レト
ロウイルスベクターによる形質導入を増強するために用
いるウイルス結合性ポリペプチドは下記を含む：（ｉ）
次式（配列番号：１）で表される、ヒトフィブロネクチ
ンのヘパリン−ＩＩ結合性ドメインのＡｌａ1690−Ｔｈ
ｒ1960に相当する第１アミノ酸配列：
ロウイルスベクターによる形質導入を増強するために用
いるウイルス結合性ポリペプチドは下記を含む：（ｉ）
次式（配列番号：１）で表される、ヒトフィブロネクチ
ンのヘパリン−ＩＩ結合性ドメインのＡｌａ1690−Ｔｈ
ｒ1960に相当する第１アミノ酸配列：
【００２９】
【化３】
【００３０】またはレトロウイルスの結合能を示すのに
十分なほどこれと類似するアミノ酸配列；および（ｉ
ｉ）次式（配列番号：２）で表される、ヒトフィブロネ
クチンのＩＩＩＣＳ結合性ドメインの一部（ＣＳ−１細
胞結合性ドメイン）に相当する第２アミノ酸配列：
十分なほどこれと類似するアミノ酸配列；および（ｉ
ｉ）次式（配列番号：２）で表される、ヒトフィブロネ
クチンのＩＩＩＣＳ結合性ドメインの一部（ＣＳ−１細
胞結合性ドメイン）に相当する第２アミノ酸配列：
【００３１】
【化４】
【００３２】あるいは造血細胞、たとえば未発達の前駆
細胞および／または長期リポピュレーションする（幹）
細胞の結合能を示すのに十分なほどこれと類似するアミ
ノ酸配列。
細胞および／または長期リポピュレーションする（幹）
細胞の結合能を示すのに十分なほどこれと類似するアミ
ノ酸配列。
【００３３】前記のように、得られるアミノ酸配列がウ
イルスの結合能（ヘパリン−ＩＩ結合性ドメインの場
合）および標的細胞の結合能（ＣＳ−１細胞結合性ドメ
イン）を示すのに十分なほど類似している限り、本発明
の実施に際してこれらの天然配列の一定の修飾および／
または突然変異を行うのが可能であることは理解される
であろう。
イルスの結合能（ヘパリン−ＩＩ結合性ドメインの場
合）および標的細胞の結合能（ＣＳ−１細胞結合性ドメ
イン）を示すのに十分なほど類似している限り、本発明
の実施に際してこれらの天然配列の一定の修飾および／
または突然変異を行うのが可能であることは理解される
であろう。
【００３４】本発明の１観点は、インビトロ細胞療法、
次いで宿主への標的細胞の移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ
ａｔｉｏｎ）を伴う、体細胞遺伝子治療法を提供する。
これは宿主への形質導入された標的細胞の“移植（ｅｎ
ｇｒａｆｔｍｅｎｔ）”としても知られている。造血細
胞または他の細胞はヒトその他の哺乳動物源から標準プ
ロトコールにより採集することができる。たとえば造血
細胞はヒトドナーの骨髄もしくは末梢血から、またはヒ
ト胎児臍帯血から採集することができる。採集したの
ち、造血細胞を幹細胞および／または未発達の前駆細胞
に富むものにするために、所望によりそれらを標準法で
処理することができる。次いで造血細胞を適宜、たとえ
ば組織培養プレート上でインキュベートしうる。所望に
よりこの期間に付着陰性の低密度単核細胞をレトロウイ
ルス感染前に予備刺激することができる。当技術分野で
知られており、本発明に用いられる予備刺激とは、細胞
をレトロウイルス暴露する前に増殖刺激因子に暴露させ
ることを意味する。このような予備刺激はレトロウイル
スによる造血細胞の形質導入を向上させることが証明さ
れた。
次いで宿主への標的細胞の移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ
ａｔｉｏｎ）を伴う、体細胞遺伝子治療法を提供する。
これは宿主への形質導入された標的細胞の“移植（ｅｎ
ｇｒａｆｔｍｅｎｔ）”としても知られている。造血細
胞または他の細胞はヒトその他の哺乳動物源から標準プ
ロトコールにより採集することができる。たとえば造血
細胞はヒトドナーの骨髄もしくは末梢血から、またはヒ
ト胎児臍帯血から採集することができる。採集したの
ち、造血細胞を幹細胞および／または未発達の前駆細胞
に富むものにするために、所望によりそれらを標準法で
処理することができる。次いで造血細胞を適宜、たとえ
ば組織培養プレート上でインキュベートしうる。所望に
よりこの期間に付着陰性の低密度単核細胞をレトロウイ
ルス感染前に予備刺激することができる。当技術分野で
知られており、本発明に用いられる予備刺激とは、細胞
をレトロウイルス暴露する前に増殖刺激因子に暴露させ
ることを意味する。このような予備刺激はレトロウイル
スによる造血細胞の形質導入を向上させることが証明さ
れた。
【００３５】予備刺激ののち、細胞を収穫し、本明細書
に記載するようにレトロウイルスによる細胞形質導入頻
度を増大させるフィブロネクチンまたはそのフラグメン
トと共にインキュベートすることができる。好ましくは
精製した、および／または不溶性の、たとえば固定化し
たフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメン
トと共に細胞をインキュベートする。次いで細胞に組換
えウイルス、たとえば細胞における酵素または他のタン
パク質の欠損または異常を適正化するための遺伝子を含
むレトロウイルスに、ウイルスによる細胞の形質導入頻
度を増大させるのに有効な量のフィブロネクチンまたは
フィブロネクチンフラグメントの存在下で感染させる。
得られた形質導入された造血細胞を、次いで細胞移植体
レシピエント動物、好ましくは自己ドナーに常法によ
り、たとえば静脈内へ導入することができる。これには
同種異系移植体も包含され、これは特に後記のように移
植体として臍帯血細胞を用いる場合に利用される。
に記載するようにレトロウイルスによる細胞形質導入頻
度を増大させるフィブロネクチンまたはそのフラグメン
トと共にインキュベートすることができる。好ましくは
精製した、および／または不溶性の、たとえば固定化し
たフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメン
トと共に細胞をインキュベートする。次いで細胞に組換
えウイルス、たとえば細胞における酵素または他のタン
パク質の欠損または異常を適正化するための遺伝子を含
むレトロウイルスに、ウイルスによる細胞の形質導入頻
度を増大させるのに有効な量のフィブロネクチンまたは
フィブロネクチンフラグメントの存在下で感染させる。
得られた形質導入された造血細胞を、次いで細胞移植体
レシピエント動物、好ましくは自己ドナーに常法によ
り、たとえば静脈内へ導入することができる。これには
同種異系移植体も包含され、これは特に後記のように移
植体として臍帯血細胞を用いる場合に利用される。
【００３６】本発明方法は、がん、白血病などを含めた
骨髄障害、タンパク質の欠損または異常を伴う障害を含
む、多様な障害の遺伝子マーキングまたは遺伝子治療プ
ロトコールに、および他の治療プロトコール、たとえば
化学療法に対する抵抗性を改善するために造血細胞を改
質する治療に利用しうる。本発明を利用しうる代表的障
害には、たとえばＡＤＡ欠乏症、たとえばＡＤＡ欠乏性
ＳＣＩＤ、小児急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、神経芽細
胞腫、ならびに成人ＡＭＬおよび急性リンパ性白血病
（ＡＬＬ）が含まれる。
骨髄障害、タンパク質の欠損または異常を伴う障害を含
む、多様な障害の遺伝子マーキングまたは遺伝子治療プ
ロトコールに、および他の治療プロトコール、たとえば
化学療法に対する抵抗性を改善するために造血細胞を改
質する治療に利用しうる。本発明を利用しうる代表的障
害には、たとえばＡＤＡ欠乏症、たとえばＡＤＡ欠乏性
ＳＣＩＤ、小児急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、神経芽細
胞腫、ならびに成人ＡＭＬおよび急性リンパ性白血病
（ＡＬＬ）が含まれる。
【００３７】本発明の特に好ましい１態様においては、
細胞移植に用いられる細胞をヒト臍帯血から得る。たと
えばヒト臍帯血を採集し、たとえば付着陰性かつ低密度
の単核細胞集団を得ることにより、生存可能な未発達の
造血前駆細胞および／または幹細胞を富化することがで
きる。次いでこの集団を所望により予備刺激し、レトロ
ウイルスベクター、ならびにベクターによる細胞の形質
導入効率を増大させるために、固定化したおよび／また
は精製したフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフ
ラグメントの存在下でインキュベートする。これに関し
て、フィブロネクチンは臍帯血中のＥＣＭの一部を構成
せず、また臍帯血由来の未発達の前駆細胞および／また
は幹細胞は骨髄由来の細胞と異なることが解明されてい
るが、臍帯血由来の未発達の前駆細胞および／または幹
細胞の形質導入はフィブロネクチンまたはフィブロネク
チンフラグメントの存在下で大幅に増強されることが見
出された。特に臍帯血幹細胞はＣＤ３４+、ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ＋であることが解明され、これに対し骨髄由来の幹細
胞はＣＤ３４+、ＨＬＡ−ＤＲ−であることが解明され
ている。臍帯血由来の未発達の前駆細胞はフィブロネク
チンまたはフィブロネクチンフラグメントの存在下で増
強された様式で効果的に形質導入されるという本発明者
らの知見により、簡便な、かつ高度に幹細胞富化した造
血細胞源の利用が可能となる。さらに、未発達の前駆細
胞および／または幹細胞を富化した同種異系移植体を用
いた多数の患者の移植に成功したという証拠により、臍
帯血は極めて好ましい造血細胞源となる。Ｋｏｈｌｉ−
Ｋｕｍｍｅｒら，Ｂｒｉｔ．Ｈｅａｅｍａｔｏｌ．８
５：４１９−４２２（１９３３）；Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ
ら，Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ １７：３１３−３２９（１
９９１）；Ｇｌｕｃｋｍａｎら，Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅａｅｍ
ａｔｏｌ．４５：５５７（１９８０）；Ｈｅｉｄｅｌｂ
ｅｒｇ：スプリンガー−フェルラーク，ｐｐ．６０−６
８（１９８９）；Ｗａｇｎｅｒら，Ｂｌｏｏｄ ７９：
１８７４−１８８１（１９９２）；およびＷａｇｎｅｒ
ら，Ｂｌｏｏｄ ８２−８６ａ（抄録）を参照された
い。
細胞移植に用いられる細胞をヒト臍帯血から得る。たと
えばヒト臍帯血を採集し、たとえば付着陰性かつ低密度
の単核細胞集団を得ることにより、生存可能な未発達の
造血前駆細胞および／または幹細胞を富化することがで
きる。次いでこの集団を所望により予備刺激し、レトロ
ウイルスベクター、ならびにベクターによる細胞の形質
導入効率を増大させるために、固定化したおよび／また
は精製したフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフ
ラグメントの存在下でインキュベートする。これに関し
て、フィブロネクチンは臍帯血中のＥＣＭの一部を構成
せず、また臍帯血由来の未発達の前駆細胞および／また
は幹細胞は骨髄由来の細胞と異なることが解明されてい
るが、臍帯血由来の未発達の前駆細胞および／または幹
細胞の形質導入はフィブロネクチンまたはフィブロネク
チンフラグメントの存在下で大幅に増強されることが見
出された。特に臍帯血幹細胞はＣＤ３４+、ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ＋であることが解明され、これに対し骨髄由来の幹細
胞はＣＤ３４+、ＨＬＡ−ＤＲ−であることが解明され
ている。臍帯血由来の未発達の前駆細胞はフィブロネク
チンまたはフィブロネクチンフラグメントの存在下で増
強された様式で効果的に形質導入されるという本発明者
らの知見により、簡便な、かつ高度に幹細胞富化した造
血細胞源の利用が可能となる。さらに、未発達の前駆細
胞および／または幹細胞を富化した同種異系移植体を用
いた多数の患者の移植に成功したという証拠により、臍
帯血は極めて好ましい造血細胞源となる。Ｋｏｈｌｉ−
Ｋｕｍｍｅｒら，Ｂｒｉｔ．Ｈｅａｅｍａｔｏｌ．８
５：４１９−４２２（１９３３）；Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ
ら，Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ １７：３１３−３２９（１
９９１）；Ｇｌｕｃｋｍａｎら，Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅａｅｍ
ａｔｏｌ．４５：５５７（１９８０）；Ｈｅｉｄｅｌｂ
ｅｒｇ：スプリンガー−フェルラーク，ｐｐ．６０−６
８（１９８９）；Ｗａｇｎｅｒら，Ｂｌｏｏｄ ７９：
１８７４−１８８１（１９９２）；およびＷａｇｎｅｒ
ら，Ｂｌｏｏｄ ８２−８６ａ（抄録）を参照された
い。
【００３８】所望により、収穫した形質導入された造血
細胞その他の細胞を形質導入効率および遺伝子発現につ
き試験することができる。たとえば本発明により得られ
るレトロウイルス仲介遺伝子導入における著しい改良
は、後記の具体的な実施例において証明される。実施例
にはフィブロネクチンまたは有効なフィブロネクチンフ
ラグメントの存在下でのレトロウイルスによる高い感染
および遺伝子導入効率を証明する幾つかの試験を記載す
る。特にＰＧＫ−ｈＡＤＡレトロウイルスに感染したネ
ズミ造血細胞は高水準の導入ＡＤＡ ｃＤＮＡを発現し
た。同様に個々のＰＧＫ−ｍＡＤＡウイルス感染したヒ
ト前駆細胞コロニーは、内因性ヒトＡＤＡタンパク質よ
り最高１０倍高いネズミＡＤＡタンパク質を発現した。
したがって導入効率を厳密に分析するために、前駆細胞
コロニーは導入されたｍＡＤＡの発現が内因性ヒトＡＤ
Ａ水準以上である場合にのみ形質導入されたとみなされ
た。ＴＫＮＥＯベクターからのｎｅｏの高水準の発現
は、ネオホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ遺伝子生成
物）活性のアッセイと同様にＧ４１８薬物耐性により検
出された。
細胞その他の細胞を形質導入効率および遺伝子発現につ
き試験することができる。たとえば本発明により得られ
るレトロウイルス仲介遺伝子導入における著しい改良
は、後記の具体的な実施例において証明される。実施例
にはフィブロネクチンまたは有効なフィブロネクチンフ
ラグメントの存在下でのレトロウイルスによる高い感染
および遺伝子導入効率を証明する幾つかの試験を記載す
る。特にＰＧＫ−ｈＡＤＡレトロウイルスに感染したネ
ズミ造血細胞は高水準の導入ＡＤＡ ｃＤＮＡを発現し
た。同様に個々のＰＧＫ−ｍＡＤＡウイルス感染したヒ
ト前駆細胞コロニーは、内因性ヒトＡＤＡタンパク質よ
り最高１０倍高いネズミＡＤＡタンパク質を発現した。
したがって導入効率を厳密に分析するために、前駆細胞
コロニーは導入されたｍＡＤＡの発現が内因性ヒトＡＤ
Ａ水準以上である場合にのみ形質導入されたとみなされ
た。ＴＫＮＥＯベクターからのｎｅｏの高水準の発現
は、ネオホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ遺伝子生成
物）活性のアッセイと同様にＧ４１８薬物耐性により検
出された。
【００３９】前記のように、本発明方法はレトロウイル
ス産生細胞の存在下で同時培養する必要なしに有利に実
施することができる。したがって本発明の１観点によれ
ば、レトロウイルス仲介遺伝子導入を、標的である造血
細胞その他の細胞以外の細胞が実質的に存在しない状態
で実施することができる。たとえばレトロウイルスベク
タープラスミドを含む産生細胞を培養し、上清を採集す
ることができる。次いでレトロウイルス含有上清を、フ
ィブロネクチンおよび／またはフィブロネクチンフラグ
メントの存在下で造血細胞の感染に用いることができ
る。これらは好ましくは固定化された形のものであり、
たとえば支持体にコートし、この上で感染を行うか、ま
たは他の方式で感染用培地と接触させる。これに関し
て、高力価の無ヘルパーレトロウイルスを産生する任意
の産生細胞が本発明に使用するのに適していると考えら
れる。これらには、たとえばパッケージング細胞、たと
えばＰｓｉ−２、Ｃ２、ＰＡ１２、ＰＡ３１７、および
ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２、ならびに当技術分野で知られて
いる他の多数のパッケージング細胞系が含まれる。
ス産生細胞の存在下で同時培養する必要なしに有利に実
施することができる。したがって本発明の１観点によれ
ば、レトロウイルス仲介遺伝子導入を、標的である造血
細胞その他の細胞以外の細胞が実質的に存在しない状態
で実施することができる。たとえばレトロウイルスベク
タープラスミドを含む産生細胞を培養し、上清を採集す
ることができる。次いでレトロウイルス含有上清を、フ
ィブロネクチンおよび／またはフィブロネクチンフラグ
メントの存在下で造血細胞の感染に用いることができ
る。これらは好ましくは固定化された形のものであり、
たとえば支持体にコートし、この上で感染を行うか、ま
たは他の方式で感染用培地と接触させる。これに関し
て、高力価の無ヘルパーレトロウイルスを産生する任意
の産生細胞が本発明に使用するのに適していると考えら
れる。これらには、たとえばパッケージング細胞、たと
えばＰｓｉ−２、Ｃ２、ＰＡ１２、ＰＡ３１７、および
ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２、ならびに当技術分野で知られて
いる他の多数のパッケージング細胞系が含まれる。
【００４０】本発明の他の観点によれば、フィブロネク
チンのヘパリン−ＩＩ結合性ドメイン内のアミノ酸への
強いウイルス結合を利用して、広範な細胞タイプにわた
るウイルス療法に用いる運搬システムを構築しうる。こ
のためには、フィブロネクチン由来のレトロウイルス結
合性ドメインを含むポリペプチドを、この構築体に標的
細胞に対する特異性を与える任意のリガンドに共有結合
させることができる。この方法によれば、各標的細胞に
特異的なレトロウイルス細胞系を予め構築する必要性が
回避されるであろう（Ｋａｓａｈａｒａ，Ｎ．，Ａ．
Ｍ．ＤｏｚｙおよびＹ．Ｗ．Ｋａｎ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，Ｖｏｌ．２６６，ｐｐ．１３７３−１３７６（１９
９４）、ならびにＶａｌｓｅｓｉａ−Ｗｉｔｔｍａｎ
ｎ，Ｓ．，Ａ．Ｄｒｙｎｄａ，Ｇ．Ｄｅｌｅａｇｅ，
Ｍ．Ａｕｍａｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．Ｈｅａｒｄ，Ｏ．Ｄ
ａｎｏｓ，Ｇ．ＶｅｒｄｉｅｒおよびＦ．Ｌ．Ｃｏｓｓ
ｅｔ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６８，ｐｐ．４６０
９−４６１９（１９９４））。標的構築体の特異性は、
たとえば下記を含めたリガンドの使用により与えること
ができる：１）細胞付着性タンパク質、２）ホルモンま
たはサイトカイン、３）標的細胞に対するモノクローナ
ル抗体、４）標的細胞に結合する炭水化物（Ｇ．Ａｓｈ
ｗｅｌｌら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖ
ｏｌ．５１，ｐｐ．５３１−５５４（１９８２））、
５）標的細胞に関する代謝産物、または６）標的細胞に
結合する官能性ポリペプチド。遺伝子運搬のための構築
体の効率は、数種類のヘパリン−ＩＩウイルス結合性ド
メインを含有させ、したがって標的細胞に運搬されるウ
イルス粒子の量を増加させることによって、改善するこ
とができる。たとえば米国特許第５，１９８，４２３号
明細書に記載されたフィブロネクチンのＰｒｏ1239−Ｓ
ｅｒ1515に相当するヒトフィブロネクチン細胞結合性ド
メインは、ＢＨＫおよびＢ１６−Ｆ１０細胞を含めた細
胞に結合することが示された（Ｋｉｍｉｚｕｋａら，
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０，２８４−２９１（１９９
１））。さらに、ヘパリン−ＩＩドメイン自体が線維芽
細胞、内皮細胞、および腫瘍細胞に結合することが示さ
れた。これらのポリペプチド配列をフィブロネクチン由
来のレトロウイルス結合性ドメインに結合させて、レト
ロウイルスによる感染のために予め定めた細胞をターゲ
ティングすることができる。
チンのヘパリン−ＩＩ結合性ドメイン内のアミノ酸への
強いウイルス結合を利用して、広範な細胞タイプにわた
るウイルス療法に用いる運搬システムを構築しうる。こ
のためには、フィブロネクチン由来のレトロウイルス結
合性ドメインを含むポリペプチドを、この構築体に標的
細胞に対する特異性を与える任意のリガンドに共有結合
させることができる。この方法によれば、各標的細胞に
特異的なレトロウイルス細胞系を予め構築する必要性が
回避されるであろう（Ｋａｓａｈａｒａ，Ｎ．，Ａ．
Ｍ．ＤｏｚｙおよびＹ．Ｗ．Ｋａｎ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，Ｖｏｌ．２６６，ｐｐ．１３７３−１３７６（１９
９４）、ならびにＶａｌｓｅｓｉａ−Ｗｉｔｔｍａｎ
ｎ，Ｓ．，Ａ．Ｄｒｙｎｄａ，Ｇ．Ｄｅｌｅａｇｅ，
Ｍ．Ａｕｍａｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．Ｈｅａｒｄ，Ｏ．Ｄ
ａｎｏｓ，Ｇ．ＶｅｒｄｉｅｒおよびＦ．Ｌ．Ｃｏｓｓ
ｅｔ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６８，ｐｐ．４６０
９−４６１９（１９９４））。標的構築体の特異性は、
たとえば下記を含めたリガンドの使用により与えること
ができる：１）細胞付着性タンパク質、２）ホルモンま
たはサイトカイン、３）標的細胞に対するモノクローナ
ル抗体、４）標的細胞に結合する炭水化物（Ｇ．Ａｓｈ
ｗｅｌｌら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖ
ｏｌ．５１，ｐｐ．５３１−５５４（１９８２））、
５）標的細胞に関する代謝産物、または６）標的細胞に
結合する官能性ポリペプチド。遺伝子運搬のための構築
体の効率は、数種類のヘパリン−ＩＩウイルス結合性ド
メインを含有させ、したがって標的細胞に運搬されるウ
イルス粒子の量を増加させることによって、改善するこ
とができる。たとえば米国特許第５，１９８，４２３号
明細書に記載されたフィブロネクチンのＰｒｏ1239−Ｓ
ｅｒ1515に相当するヒトフィブロネクチン細胞結合性ド
メインは、ＢＨＫおよびＢ１６−Ｆ１０細胞を含めた細
胞に結合することが示された（Ｋｉｍｉｚｕｋａら，
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０，２８４−２９１（１９９
１））。さらに、ヘパリン−ＩＩドメイン自体が線維芽
細胞、内皮細胞、および腫瘍細胞に結合することが示さ
れた。これらのポリペプチド配列をフィブロネクチン由
来のレトロウイルス結合性ドメインに結合させて、レト
ロウイルスによる感染のために予め定めた細胞をターゲ
ティングすることができる。
【００４１】造血系における用途の例には、それぞれ高
特異性赤血球または顆粒球の前駆細胞をターゲティング
するための、フィブロネクチンのレトロウイルス結合性
ドメインに結合したエリトロポエチンまたはＧ−ＣＳＦ
の構築体が含まれる。本発明による他の一般的用途は、
レトロウイルス結合性ドメイン（１または２以上）を、
悪性細胞に特異的にまたは主として結合するリガンドと
結合させることであろう。たとえば標的細胞上の受容体
に結合する物質、たとえば下記のものを用いて、乳がん
細胞のインビトロ増殖に、またインビボ増殖にすら影響
を及ぼしうることが示された：黄体形成ホルモン放出性
誘導体、Ｅｍｏｎｓ，Ｇ．ら，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．
９：１３６４−１３７９（１９９４）；エストロゲン、
Ｔｏｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｗ．，Ｏｎｃｏｌ．８：３９−４
３（１９９４）；またはアンチエストロゲン、Ｈｏｗｅ
ｌｌ，Ａ．ら，Ｌａｎｃｅｔ ３４５:２９−３０(１９
９５);プロゲストーゲンまたはアンチプロゲストーゲ
ン、Ｋｌｉｊｎ．Ｆ．Ｇ．ら，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．
９ Ｓｕｐｐｌ．１：１８１−１８９（１９９４）；Ｇ
ｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｋ．ら，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．
２１：６７２−６８７（１９９４）；これらはフィブロ
ネクチン由来のウイルス結合性ドメイン１または２以上
を含む本発明の構築体においてリガンドとして用いられ
るであろう。他の例として、ヨウ化物を含む構築体を用
いて甲状腺（がん）細胞を高度に特異的にターゲティン
グすることができ、またＨＤＬもしくはその一部を含む
構築体により肝（がん）細胞を高度に特異的にターゲテ
ィングすることができる。最後に、モノクローナル抗体
およびフィブロネクチンのレトロウイルス結合性ドメイ
ンの構築体は、抗体が得られるいかなる細胞および器官
をもターゲティングすることができるであろう。したが
ってフィブロネクチンのレトロウイルス結合性ドメイン
がウイルスベクターを結合および局在化しうる能力を利
用することにより、広範な哺乳動物細胞タイプをターゲ
ティングすることができる。
特異性赤血球または顆粒球の前駆細胞をターゲティング
するための、フィブロネクチンのレトロウイルス結合性
ドメインに結合したエリトロポエチンまたはＧ−ＣＳＦ
の構築体が含まれる。本発明による他の一般的用途は、
レトロウイルス結合性ドメイン（１または２以上）を、
悪性細胞に特異的にまたは主として結合するリガンドと
結合させることであろう。たとえば標的細胞上の受容体
に結合する物質、たとえば下記のものを用いて、乳がん
細胞のインビトロ増殖に、またインビボ増殖にすら影響
を及ぼしうることが示された：黄体形成ホルモン放出性
誘導体、Ｅｍｏｎｓ，Ｇ．ら，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．
９：１３６４−１３７９（１９９４）；エストロゲン、
Ｔｏｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｗ．，Ｏｎｃｏｌ．８：３９−４
３（１９９４）；またはアンチエストロゲン、Ｈｏｗｅ
ｌｌ，Ａ．ら，Ｌａｎｃｅｔ ３４５:２９−３０(１９
９５);プロゲストーゲンまたはアンチプロゲストーゲ
ン、Ｋｌｉｊｎ．Ｆ．Ｇ．ら，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．
９ Ｓｕｐｐｌ．１：１８１−１８９（１９９４）；Ｇ
ｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｋ．ら，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．
２１：６７２−６８７（１９９４）；これらはフィブロ
ネクチン由来のウイルス結合性ドメイン１または２以上
を含む本発明の構築体においてリガンドとして用いられ
るであろう。他の例として、ヨウ化物を含む構築体を用
いて甲状腺（がん）細胞を高度に特異的にターゲティン
グすることができ、またＨＤＬもしくはその一部を含む
構築体により肝（がん）細胞を高度に特異的にターゲテ
ィングすることができる。最後に、モノクローナル抗体
およびフィブロネクチンのレトロウイルス結合性ドメイ
ンの構築体は、抗体が得られるいかなる細胞および器官
をもターゲティングすることができるであろう。したが
ってフィブロネクチンのレトロウイルス結合性ドメイン
がウイルスベクターを結合および局在化しうる能力を利
用することにより、広範な哺乳動物細胞タイプをターゲ
ティングすることができる。
【００４２】したがって本発明の他の好ましい態様は、
標的細胞のウイルス形質導入を増強するために使用しう
る構築体を製造するものである。フィブロネクチンのヘ
パリン−ＩＩ結合性ドメインのウイルス結合性アミノ酸
配列を、標的細胞が結合するリガンドに結合させる。前
記のように、リガンドはたとえばフィブロネクチン由来
のもしくは他のタンパク質（細胞付着性タンパク質、た
とえばラミニン、コラーゲン、ビトロネクチン、オステ
オポンチンまたはトロンボスポンジンを含む）由来のポ
リペプチド、ホルモン、代謝産物、抗体（モノクローナ
ル抗体を含む）、または標的細胞に、好ましくは特異的
に結合する能力を示す他の任意のリガンドであってもよ
い。得られた構築体全体を、後記の実施例に具体的に例
示するフィブロネクチンポリペプチドに用いたと同様な
様式で固定化された形で用いることができる。
標的細胞のウイルス形質導入を増強するために使用しう
る構築体を製造するものである。フィブロネクチンのヘ
パリン−ＩＩ結合性ドメインのウイルス結合性アミノ酸
配列を、標的細胞が結合するリガンドに結合させる。前
記のように、リガンドはたとえばフィブロネクチン由来
のもしくは他のタンパク質（細胞付着性タンパク質、た
とえばラミニン、コラーゲン、ビトロネクチン、オステ
オポンチンまたはトロンボスポンジンを含む）由来のポ
リペプチド、ホルモン、代謝産物、抗体（モノクローナ
ル抗体を含む）、または標的細胞に、好ましくは特異的
に結合する能力を示す他の任意のリガンドであってもよ
い。得られた構築体全体を、後記の実施例に具体的に例
示するフィブロネクチンポリペプチドに用いたと同様な
様式で固定化された形で用いることができる。
【００４３】構築体の安定性および特異性、ならびに生
理的条件下でのレトロウイルス構築体の相互作用など種
々の要因を考慮して、これらの構築体および細胞ターゲ
ティング法を前記のようにインビトロでの、またインビ
ボでのレトロウイルスによるターゲティングに用いるこ
とができる。運搬システムを改変して標的細胞への構築
体の運搬を局在化することにより、たとえば肝細胞をタ
ーゲティングするために門脈にカテーテル挿入すること
により、特異性を改良することもできる。
理的条件下でのレトロウイルス構築体の相互作用など種
々の要因を考慮して、これらの構築体および細胞ターゲ
ティング法を前記のようにインビトロでの、またインビ
ボでのレトロウイルスによるターゲティングに用いるこ
とができる。運搬システムを改変して標的細胞への構築
体の運搬を局在化することにより、たとえば肝細胞をタ
ーゲティングするために門脈にカテーテル挿入すること
により、特異性を改良することもできる。
【００４４】本発明方法を実施するために特に設計され
たキットを用いると、レトロウイルス仲介ＤＮＡ導入が
極めて簡便に実施されると考えられる。したがって本発
明の他の観点は、レトロウイルスによる標的細胞の形質
導入を増強する量の前記の実質的に純粋なポリペプチド
または構築体、およびレトロウイルス感染を実施しうる
人工的支持体を含むキットを提供する。ポリペプチドま
たは他の構築体は別個に、または人工的支持体にコート
して供給することができる。ヒト造血細胞に関する感染
プロトコールの場合、キットは細胞の予備刺激のための
造血細胞成長因子をも含むであろう。さらにキットは形
質導入のための前記の組換えレトロウイルスベクターを
含むことができる。一般にキットは、キットの取り扱い
中に成分が漏出するのを防止するのに十分な程度に互い
に間隔をおいてこれらの各種キット成分を保管する無菌
のパッケージングを含むであろう。たとえばキット成分
を互いに間隔をおいた関係に保持するための多数のコン
パートメントまたは領域を備えたプラスチック成形品を
用いるのが一般的である。
たキットを用いると、レトロウイルス仲介ＤＮＡ導入が
極めて簡便に実施されると考えられる。したがって本発
明の他の観点は、レトロウイルスによる標的細胞の形質
導入を増強する量の前記の実質的に純粋なポリペプチド
または構築体、およびレトロウイルス感染を実施しうる
人工的支持体を含むキットを提供する。ポリペプチドま
たは他の構築体は別個に、または人工的支持体にコート
して供給することができる。ヒト造血細胞に関する感染
プロトコールの場合、キットは細胞の予備刺激のための
造血細胞成長因子をも含むであろう。さらにキットは形
質導入のための前記の組換えレトロウイルスベクターを
含むことができる。一般にキットは、キットの取り扱い
中に成分が漏出するのを防止するのに十分な程度に互い
に間隔をおいてこれらの各種キット成分を保管する無菌
のパッケージングを含むであろう。たとえばキット成分
を互いに間隔をおいた関係に保持するための多数のコン
パートメントまたは領域を備えたプラスチック成形品を
用いるのが一般的である。
【００４５】本発明をさらに理解および認識しやすくす
るために、以下の具体例を提示する。これらの例は説明
のためのものであって限定する性質のものでないことは
理解されるであろう。
るために、以下の具体例を提示する。これらの例は説明
のためのものであって限定する性質のものでないことは
理解されるであろう。
【００４６】
【実施例】実施例１ ＴＫＮＥＯを用いた骨髄細胞への
遺伝子導入 １．１．ウイルス上清の調製 レトロウイルスプラスミドＴＫＮＥＯベクターを含むＧ
Ｐ＋ＥｎｖＡＭ １２産生細胞（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら
（１９８８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６７：４００）を、
１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ、ハイクローン、ユタ州
ローガン）ならびに１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび
１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、両方
ともギブコ）を含有するイスコブ（Ｉｓｃｏｖｅ）の改
変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、ギブコ、マリーランド州
ガイザースバーグ）中で培養した。２０％ＦＣＳを含有
するＩＭＤＭを１０ｍｌ添加して平板を一夜で集密化す
ることにより、ウイルスを含有する上清を採集した。収
穫した培地を０．４５ミクロンのフィルター（ゲルマン
・サイエンシズ、ミシガン州アンアーバー）で濾過し、
使用時まで−８０℃に保存した。
遺伝子導入 １．１．ウイルス上清の調製 レトロウイルスプラスミドＴＫＮＥＯベクターを含むＧ
Ｐ＋ＥｎｖＡＭ １２産生細胞（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら
（１９８８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６７：４００）を、
１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ、ハイクローン、ユタ州
ローガン）ならびに１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび
１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、両方
ともギブコ）を含有するイスコブ（Ｉｓｃｏｖｅ）の改
変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、ギブコ、マリーランド州
ガイザースバーグ）中で培養した。２０％ＦＣＳを含有
するＩＭＤＭを１０ｍｌ添加して平板を一夜で集密化す
ることにより、ウイルスを含有する上清を採集した。収
穫した培地を０．４５ミクロンのフィルター（ゲルマン
・サイエンシズ、ミシガン州アンアーバー）で濾過し、
使用時まで−８０℃に保存した。
【００４７】１．２．フィブロネクチンフラグメントの
調製 Ｒｕｏｓｌａｈｔｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．８２：８０３−８３１(１９８２)の記載に従ってヒ
ト血漿(ライフソース、イリノイ州グランビュー）からＦ
Ｎを精製した。ただし４Ｍ尿素によるＦＮの溶離前にゼ
ラチン−アガロースカラムを１Ｍ尿素で洗浄した。精製
ＦＮを４℃で１０ｍＭ ３−（シクロヘキシルアミノ）
−１−プロパン−スルホン酸（ＣＡＰＳ）、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ１１．０に対し
て徹底的に透析し、少量ずつに分けて−８０℃に保存し
た。ＦＮのキモトリプチック細胞結合性ドメイン（ＣＢ
Ｄ）（ＣＳ−１）およびヘパリン−ＩＩ結合性フラグメ
ントを先の記載に従って精製した（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ
ら（１９８２），前掲、ＰａｔｅｌおよびＬｏｄｉｓ
ｈ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０２，ｐｐ．４４９−
４５６（１９８６）、並びにＢｅｒｎａｒｄｉら，Ｊ．
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５，ｐｐ．４８９−４９８
（１９８７））。ヘパリン−アガロースカラムからの１
Ｍ ＮａＣｌ溶出液中に３つの主要なヘパリン結合性フ
ラグメント（３０ｋＤ、３５ｋＤおよび４２ｋＤ）が得
られた。これらのヘパリン結合性フラグメントをさらに
精製するために、１Ｍ ＮａＣｌ溶出液を４℃で１０ｍ
Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に対して一夜透析
し、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.０）で平衡化し
たアニオン交換カラム（２ｍｌ ＤＥＡＥセファロース
高速用（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ、スウェ
ーデン国ウプサラ）／ｍｇタンパク質）に導通した。３
０／３５ｋＤフラグメントは結合しない画分中に採集さ
れ、一方４２ｋＤフラグメントはカラムから１００ｍＭ
ＮａＣｌで溶離された。５００ｍｇのＦＮからほぼ２
６ｍｇの３０／３５ｋＤフラグメントおよび４ｍｇの４
２ｋＤフラグメントを得た。ウェスタンブロッティング
法で測定すると、４２ｋＤフラグメントはフィブリン結
合性ドメインに対する抗体により認識されたが、３０／
３５ｋＤフラグメントは認識されなかった。４２ｋＤフ
ラグメントはフィブリン−セファロースアフィニティー
カラムにも結合する。
調製 Ｒｕｏｓｌａｈｔｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．８２：８０３−８３１(１９８２)の記載に従ってヒ
ト血漿(ライフソース、イリノイ州グランビュー）からＦ
Ｎを精製した。ただし４Ｍ尿素によるＦＮの溶離前にゼ
ラチン−アガロースカラムを１Ｍ尿素で洗浄した。精製
ＦＮを４℃で１０ｍＭ ３−（シクロヘキシルアミノ）
−１−プロパン−スルホン酸（ＣＡＰＳ）、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ１１．０に対し
て徹底的に透析し、少量ずつに分けて−８０℃に保存し
た。ＦＮのキモトリプチック細胞結合性ドメイン（ＣＢ
Ｄ）（ＣＳ−１）およびヘパリン−ＩＩ結合性フラグメ
ントを先の記載に従って精製した（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ
ら（１９８２），前掲、ＰａｔｅｌおよびＬｏｄｉｓ
ｈ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０２，ｐｐ．４４９−
４５６（１９８６）、並びにＢｅｒｎａｒｄｉら，Ｊ．
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５，ｐｐ．４８９−４９８
（１９８７））。ヘパリン−アガロースカラムからの１
Ｍ ＮａＣｌ溶出液中に３つの主要なヘパリン結合性フ
ラグメント（３０ｋＤ、３５ｋＤおよび４２ｋＤ）が得
られた。これらのヘパリン結合性フラグメントをさらに
精製するために、１Ｍ ＮａＣｌ溶出液を４℃で１０ｍ
Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に対して一夜透析
し、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.０）で平衡化し
たアニオン交換カラム（２ｍｌ ＤＥＡＥセファロース
高速用（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ、スウェ
ーデン国ウプサラ）／ｍｇタンパク質）に導通した。３
０／３５ｋＤフラグメントは結合しない画分中に採集さ
れ、一方４２ｋＤフラグメントはカラムから１００ｍＭ
ＮａＣｌで溶離された。５００ｍｇのＦＮからほぼ２
６ｍｇの３０／３５ｋＤフラグメントおよび４ｍｇの４
２ｋＤフラグメントを得た。ウェスタンブロッティング
法で測定すると、４２ｋＤフラグメントはフィブリン結
合性ドメインに対する抗体により認識されたが、３０／
３５ｋＤフラグメントは認識されなかった。４２ｋＤフ
ラグメントはフィブリン−セファロースアフィニティー
カラムにも結合する。
【００４８】感染プロトコールに用いるために、フィブ
ロネクチンフラグメントをＰａｔｅｌおよびＬｏｄｉｓ
ｈ（１９８６）、前掲、の記載に従って３５または１０
０ｍｍのペトリ皿（ファルコン、ニュージャージー州リ
ンカーン・パーク）上に７５ｐｍｏｌ／ｃｍ2の濃度で
固定化した。対照の皿に２％（無ＦＮ）ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ、ベーリンガー・マンハイム、ドイツ国マ
ンハイム）で同様にコートした。
ロネクチンフラグメントをＰａｔｅｌおよびＬｏｄｉｓ
ｈ（１９８６）、前掲、の記載に従って３５または１０
０ｍｍのペトリ皿（ファルコン、ニュージャージー州リ
ンカーン・パーク）上に７５ｐｍｏｌ／ｃｍ2の濃度で
固定化した。対照の皿に２％（無ＦＮ）ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ、ベーリンガー・マンハイム、ドイツ国マ
ンハイム）で同様にコートした。
【００４９】１．３．レトロウイルス感染プロトコール 健康な成人ドナーから骨髄試料を、インディアナ医科大
学Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａ
ｒｄにより立証されたプロトコールに従って、無菌の、
防腐剤を含有しない硫酸ナトリウムヘパリンを入れた試
験管中へ採集した。フィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏ
ｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）（密度１．０７７ｇ／ｍｌ、フ
ァルマシア、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）上
において２５℃で４５分間遠心分離することにより、低
密度単核細胞を調製した。さらに３７℃で２％ＦＣＳを
含有するＩＭＤＭ中、５％ＣＯ2において４−１６時
間、組織培養皿上でインキュベートすることにより、プ
ラスチック付着細胞を低密度骨髄細胞から除去した。
学Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａ
ｒｄにより立証されたプロトコールに従って、無菌の、
防腐剤を含有しない硫酸ナトリウムヘパリンを入れた試
験管中へ採集した。フィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏ
ｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）（密度１．０７７ｇ／ｍｌ、フ
ァルマシア、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）上
において２５℃で４５分間遠心分離することにより、低
密度単核細胞を調製した。さらに３７℃で２％ＦＣＳを
含有するＩＭＤＭ中、５％ＣＯ2において４−１６時
間、組織培養皿上でインキュベートすることにより、プ
ラスチック付着細胞を低密度骨髄細胞から除去した。
【００５０】付着陰性の低密度単核細胞をレトロウイル
ス感染前に、先にＬｕｓｋｅｙら（１９９２）Ｂｌｏｏ
ｄ ８０：３９６が記載したものに従って３７℃で４８
時間、２０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ−６、
１００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＳＣＦ（両方ともアムゲン、カ
リフォルニア州サウザンド・オークス）、およびＰ／Ｓ
を含有するＩＭＤＭ中、５％ＣＯ2において細胞密度１
×１０6個／ｍｌでペトリ皿内において予備刺激した。
激しくピペッティングしてプラスチックにゆるく付着し
た細胞を除去することにより、予備刺激した細胞を収穫
した。
ス感染前に、先にＬｕｓｋｅｙら（１９９２）Ｂｌｏｏ
ｄ ８０：３９６が記載したものに従って３７℃で４８
時間、２０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ−６、
１００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＳＣＦ（両方ともアムゲン、カ
リフォルニア州サウザンド・オークス）、およびＰ／Ｓ
を含有するＩＭＤＭ中、５％ＣＯ2において細胞密度１
×１０6個／ｍｌでペトリ皿内において予備刺激した。
激しくピペッティングしてプラスチックにゆるく付着し
た細胞を除去することにより、予備刺激した細胞を収穫
した。
【００５１】予備刺激した細胞（５×１０5細胞／ｍ
ｌ）を、ＢＳＡ（対照のプレート）またはフィブロネク
チンもしくはそのフラグメント（タンパク質をより良く
プラスチックプレートに付着させるためにＵＶ照射し
た）でコートしたプレート上で６時間インキュベート
し、次いで成長因子（前記）および７．５μｇ／ｍｌの
ポリブレン（アルドリッヒ・ケミカル、ワイオミング州
ミルウォーキー）の存在下にウイルス上清を感染させ
た。ウイルス上清を２時間後に交換し（成長因子および
５．０μｇ／ｍｌのポリブレンを含有）、細胞をさらに
１２−２４時間インキュベートした。培地交換の度に付
着していない細胞を再添加した。
ｌ）を、ＢＳＡ（対照のプレート）またはフィブロネク
チンもしくはそのフラグメント（タンパク質をより良く
プラスチックプレートに付着させるためにＵＶ照射し
た）でコートしたプレート上で６時間インキュベート
し、次いで成長因子（前記）および７．５μｇ／ｍｌの
ポリブレン（アルドリッヒ・ケミカル、ワイオミング州
ミルウォーキー）の存在下にウイルス上清を感染させ
た。ウイルス上清を２時間後に交換し（成長因子および
５．０μｇ／ｍｌのポリブレンを含有）、細胞をさらに
１２−２４時間インキュベートした。培地交換の度に付
着していない細胞を再添加した。
【００５２】感染プロトコールに従って、付着していな
い細胞をデカントし、付着した造血細胞を培養物から細
胞解離用緩衝液（ＣＤＢ）（無酵素／ＰＢＳ系、ギブ
コ）により採集した。付着細胞を非付着画分に添加し、
２回洗浄し、計数した。収穫した細胞をクローン原性メ
チルセルロース前駆細胞アッセイまたは長期骨髄培養に
おいて平板培養した。
い細胞をデカントし、付着した造血細胞を培養物から細
胞解離用緩衝液（ＣＤＢ）（無酵素／ＰＢＳ系、ギブ
コ）により採集した。付着細胞を非付着画分に添加し、
２回洗浄し、計数した。収穫した細胞をクローン原性メ
チルセルロース前駆細胞アッセイまたは長期骨髄培養に
おいて平板培養した。
【００５３】１．４．長期骨髄培養 ＬＴＣ−ＩＣ（ヒト幹細胞）アッセイを先に記載された
方法に従い、わずかに改変して実施した。Ｓｕｔｈｅｒ
ｌａｎｄら，Ｂｌｏｏｄ ７４：１５６３（１９８
９）。以下に要約する。０．５−１×１０6個の感染細
胞を、６ウェル組織培養プレート（コスター、マサチュ
セッツ州ケンブリッジ）中で、１０％ＦＣＳ、１０％ウ
マ血清（シグマ）およびＰ／Ｓ、１×１０-5Ｍヒドロコ
ルチゾン（アップジョン、ミシガン州カラマズー）なら
びに３２０ｍｏｓｍｏｌ塩化ナトリウムを含有するＩＭ
ＤＭ５ｍｌ中の、集密的な前照射した（前記に従う）同
種ヒト骨髄線維芽細胞（ＢＭＦ）上での長期骨髄培養
（ＬＴＭＣ）に接種した。ＬＴＭＣを３３℃において５
％ＣＯ2中でインキュベートし、５０％の培地および付
着していない細胞を分離することにより週１回供給し
た。５週間後に、付着した造血細胞をＣＤＢによりＢＭ
Ｆから分離することによって、ＬＴＣ−ＩＣ培養物を殺
した。付着していない造血細胞および付着した造血細胞
の両方を合わせてメチルセルロース中で平板培養し、Ｌ
ＴＣ−ＩＣ由来のコロニーを得た。
方法に従い、わずかに改変して実施した。Ｓｕｔｈｅｒ
ｌａｎｄら，Ｂｌｏｏｄ ７４：１５６３（１９８
９）。以下に要約する。０．５−１×１０6個の感染細
胞を、６ウェル組織培養プレート（コスター、マサチュ
セッツ州ケンブリッジ）中で、１０％ＦＣＳ、１０％ウ
マ血清（シグマ）およびＰ／Ｓ、１×１０-5Ｍヒドロコ
ルチゾン（アップジョン、ミシガン州カラマズー）なら
びに３２０ｍｏｓｍｏｌ塩化ナトリウムを含有するＩＭ
ＤＭ５ｍｌ中の、集密的な前照射した（前記に従う）同
種ヒト骨髄線維芽細胞（ＢＭＦ）上での長期骨髄培養
（ＬＴＭＣ）に接種した。ＬＴＭＣを３３℃において５
％ＣＯ2中でインキュベートし、５０％の培地および付
着していない細胞を分離することにより週１回供給し
た。５週間後に、付着した造血細胞をＣＤＢによりＢＭ
Ｆから分離することによって、ＬＴＣ−ＩＣ培養物を殺
した。付着していない造血細胞および付着した造血細胞
の両方を合わせてメチルセルロース中で平板培養し、Ｌ
ＴＣ−ＩＣ由来のコロニーを得た。
【００５４】１．５．クローン原性メチルセルロースア
ッセイ メチルセルロースアッセイを先にＴｏｋｓｏｚら，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏ
ｌ．８９，ｐ７３５０（１９９２）が記載したものに従
い、わずかに改変して実施した。以下に要約する：２−
５×１０4個の感染した成人骨髄細胞を、５Ｕ／ｍｌの
エリトロポエチン（Ｅｐｏ、アムゲン）、１００ｎｇ／
ｍｌ ｒｈＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＩＬ−３(ゲ
ンザイム、マサチュセッツ州ケンブリッジ）と共に、２
５％ＦＣＳ、１０％ヒト血漿、１０-5Ｍベータ−メルカ
プトエタノール（シグマ）およびＰ／Ｓを含有する２．
４％ＩＭＤＭメチルセルロース（フルカ、ニューヨーク
州ロンコンコーマ）１ｍｌ中で平板培養した。培養物を
３７℃で５％ＣＯ2／９５％空気中においてインキュベ
ートし、１３日目に倒立顕微鏡で観察することによりコ
ロニー（＞５０細胞）をＣＦＵ−ＧＭ（顆粒球およびマ
クロファージを含有）、ＣＦＵ−Ｍｉｘ（骨髄様および
赤血球様要素を含有）、またはＢＦＵ−Ｅ（赤血球様要
素のみを含有）として計数した。
ッセイ メチルセルロースアッセイを先にＴｏｋｓｏｚら，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏ
ｌ．８９，ｐ７３５０（１９９２）が記載したものに従
い、わずかに改変して実施した。以下に要約する：２−
５×１０4個の感染した成人骨髄細胞を、５Ｕ／ｍｌの
エリトロポエチン（Ｅｐｏ、アムゲン）、１００ｎｇ／
ｍｌ ｒｈＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＩＬ−３(ゲ
ンザイム、マサチュセッツ州ケンブリッジ）と共に、２
５％ＦＣＳ、１０％ヒト血漿、１０-5Ｍベータ−メルカ
プトエタノール（シグマ）およびＰ／Ｓを含有する２．
４％ＩＭＤＭメチルセルロース（フルカ、ニューヨーク
州ロンコンコーマ）１ｍｌ中で平板培養した。培養物を
３７℃で５％ＣＯ2／９５％空気中においてインキュベ
ートし、１３日目に倒立顕微鏡で観察することによりコ
ロニー（＞５０細胞）をＣＦＵ−ＧＭ（顆粒球およびマ
クロファージを含有）、ＣＦＵ−Ｍｉｘ（骨髄様および
赤血球様要素を含有）、またはＢＦＵ−Ｅ（赤血球様要
素のみを含有）として計数した。
【００５５】１．６．レトロウイルス感染の分析 １３日目に１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（乾燥粉末、ギ
ブコ）に対して耐性であるメチルセルロースコロニーの
％を測定することにより、ＴＫＮＥＯウイルスによる感
染効率を分析した。各実験において、骨髄をＧＰ＋Ｅｎ
ｖＡＭ １２パッケージング系上で組換えウイルスを形
成させずにインキュベートすることにより、模擬感染を
行った。これらの模擬感染細胞を１．５ｍｇ／ｍｌのＧ
４１８と共に培養したものは、常に＜１％のバックグラ
ウンドコロニーを示した。
ブコ）に対して耐性であるメチルセルロースコロニーの
％を測定することにより、ＴＫＮＥＯウイルスによる感
染効率を分析した。各実験において、骨髄をＧＰ＋Ｅｎ
ｖＡＭ １２パッケージング系上で組換えウイルスを形
成させずにインキュベートすることにより、模擬感染を
行った。これらの模擬感染細胞を１．５ｍｇ／ｍｌのＧ
４１８と共に培養したものは、常に＜１％のバックグラ
ウンドコロニーを示した。
【００５６】１．７．コミッティッド前駆細胞への遺伝
子導入効率 骨髄細胞を３０／３５ ＦＮコートまたはＢＳＡコート
した皿で平板培養した状態で感染させることにより、形
質導入効率を比較した。これらの条件下では選択なしに
感染させたのちに得られたコロニー数には差がなかっ
た。図２は感染後のＧ４１８rコロニーの％を示す。系
列限定（ｌｉｎａｇｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）前駆細
胞（ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＭ）および多系列（ｍ
ｕｌｔｉｌｉｎａｇｅ）前駆細胞（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）に
由来するものを含めてすべてのタイプの前駆細胞に由来
する３０／３５ ＦＮ上に、高率のＧ４１８rコロニー
が認められた。ＢＳＡと対比して３０／３５ ＦＮ上で
はすべてのコミッティッド前駆細胞への感染が９倍増大
した。
子導入効率 骨髄細胞を３０／３５ ＦＮコートまたはＢＳＡコート
した皿で平板培養した状態で感染させることにより、形
質導入効率を比較した。これらの条件下では選択なしに
感染させたのちに得られたコロニー数には差がなかっ
た。図２は感染後のＧ４１８rコロニーの％を示す。系
列限定（ｌｉｎａｇｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）前駆細
胞（ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＭ）および多系列（ｍ
ｕｌｔｉｌｉｎａｇｅ）前駆細胞（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）に
由来するものを含めてすべてのタイプの前駆細胞に由来
する３０／３５ ＦＮ上に、高率のＧ４１８rコロニー
が認められた。ＢＳＡと対比して３０／３５ ＦＮ上で
はすべてのコミッティッド前駆細胞への感染が９倍増大
した。
【００５７】１．８．長期培養開始細胞への遺伝子導入
効率 ＴＫＮＥＯベクターを用いてＬＴＣ−ＩＣへの遺伝子導
入を評価した。ＬＴＣ−ＩＣ由来のコロニーへの遺伝子
導入は３０／３５ ＦＮ上での感染後に検出されたにす
ぎない（１６％Ｇ４１８rコロニー対０％Ｇ４１８rコロ
ニー、３０／３５ ＦＮ対ＢＳＡ）。
効率 ＴＫＮＥＯベクターを用いてＬＴＣ−ＩＣへの遺伝子導
入を評価した。ＬＴＣ−ＩＣ由来のコロニーへの遺伝子
導入は３０／３５ ＦＮ上での感染後に検出されたにす
ぎない（１６％Ｇ４１８rコロニー対０％Ｇ４１８rコロ
ニー、３０／３５ ＦＮ対ＢＳＡ）。
【００５８】１．９．造血細胞の感染効率に対する３０
／３５ ＦＮ作用の特異性 ３０／３５ ＦＮ上で見られた遺伝子導入効率増大の特
異性を判定するために、ＴＫＮＥＯによる感染を下記の
ものでコートした皿上で実施した：ＢＳＡ、３０／３５
ＦＮ、無傷のフィブロネクチン、ＲＧＤＳテトラペプ
チド配列を含む中心−細胞結合性ドメイン（ＣＢＤ）を
含む１１５ｋｄのＦＮフラグメント、ヘパリン−ＩＩ結
合性ドメインを特色とし、ただしＣＳ−１配列を欠如す
る４２ｋｄ Ｃ−末端ＦＮフラグメント（４２ＦＮ）
（図１）。ＢＳＡ上での感染では、３±１％のＧ４１８
r ＢＦＵ−Ｅ、１±１％のＧ４１８r ＣＦＵ−ＧＭ、
および０±０％のＧ４１８r ＣＦＵ−Ｍｉｘが得られ
た。ＣＢＤ上ではＧ４１８rコロニーの割合には有意の
増大が認めらず、一方４２ＦＮ上ではわずかに高いＢＦ
Ｕ−Ｅ（６．０±１％）の感染が見られた（図３）。し
かし無傷のＦＮはすべてのコミッティッド前駆細胞への
遺伝子導入の増大を促進した。無傷のＦＮ上での感染後
のＧ４１８rコロニーの割合は、下記を含めてすべての
系列において３０／３５ ＦＮ上でのものより低かっ
た：ＢＦＵ−Ｅ（１６±２対２４±４％）、ＣＦＵ−Ｇ
Ｍ（５±２対２０±４％)、およびＣＦＵ−Ｍｉｘ(６±
１対９±１％);それぞれ無傷のＦＮ対３０／３５ Ｆ
Ｎ。
／３５ ＦＮ作用の特異性 ３０／３５ ＦＮ上で見られた遺伝子導入効率増大の特
異性を判定するために、ＴＫＮＥＯによる感染を下記の
ものでコートした皿上で実施した：ＢＳＡ、３０／３５
ＦＮ、無傷のフィブロネクチン、ＲＧＤＳテトラペプ
チド配列を含む中心−細胞結合性ドメイン（ＣＢＤ）を
含む１１５ｋｄのＦＮフラグメント、ヘパリン−ＩＩ結
合性ドメインを特色とし、ただしＣＳ−１配列を欠如す
る４２ｋｄ Ｃ−末端ＦＮフラグメント（４２ＦＮ）
（図１）。ＢＳＡ上での感染では、３±１％のＧ４１８
r ＢＦＵ−Ｅ、１±１％のＧ４１８r ＣＦＵ−ＧＭ、
および０±０％のＧ４１８r ＣＦＵ−Ｍｉｘが得られ
た。ＣＢＤ上ではＧ４１８rコロニーの割合には有意の
増大が認めらず、一方４２ＦＮ上ではわずかに高いＢＦ
Ｕ−Ｅ（６．０±１％）の感染が見られた（図３）。し
かし無傷のＦＮはすべてのコミッティッド前駆細胞への
遺伝子導入の増大を促進した。無傷のＦＮ上での感染後
のＧ４１８rコロニーの割合は、下記を含めてすべての
系列において３０／３５ ＦＮ上でのものより低かっ
た：ＢＦＵ−Ｅ（１６±２対２４±４％）、ＣＦＵ−Ｇ
Ｍ（５±２対２０±４％)、およびＣＦＵ−Ｍｉｘ(６±
１対９±１％);それぞれ無傷のＦＮ対３０／３５ Ｆ
Ｎ。
【００５９】実施例２ ＰＧＫ−ｍＡＤＡを用いた骨髄
細胞への遺伝子導入 ２．１．一般法 ＰＧＫ−ｍＡＤＡウイルス上清を、実施例１においてＴ
ＫＮＥＯにつき記載したと同様に調製した。フィブロネ
クチンのキモトリプチックフラグメント（図１）を先に
実施例１に記載したと同様に調製し、実施例１のレトロ
ウイルス感染プロトコールに従った。ＬＴＣ−ＩＣ（ヒ
ト幹細胞）アッセイおよびメチルセルロースアッセイを
実施例１に従って実施した。
細胞への遺伝子導入 ２．１．一般法 ＰＧＫ−ｍＡＤＡウイルス上清を、実施例１においてＴ
ＫＮＥＯにつき記載したと同様に調製した。フィブロネ
クチンのキモトリプチックフラグメント（図１）を先に
実施例１に記載したと同様に調製し、実施例１のレトロ
ウイルス感染プロトコールに従った。ＬＴＣ−ＩＣ（ヒ
ト幹細胞）アッセイおよびメチルセルロースアッセイを
実施例１に従って実施した。
【００６０】２．２．レトロウイルス感染の分析 ＰＧＫ−ｍＡＤＡベクターによる感染効率を、ＡＤＡア
イソザイム電気泳動によるタンパク質分析により測定し
た。個々の前駆細胞コロニーの分析を、先にＭｏｒｉｔ
ｚ（１９９３）およびＬｉｍら（１９８９）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８
６，ｐ８８９２が記載したと同様に実施した。導入効率
を厳密に分析するために、内因性ヒトＡＤＡと同じか、
またはより高い水準のｍＡＤＡを発現するコロニーのみ
を形質導入されたとみなした。プールしたコロニーの分
析のために、メチルセルロース培養物から取り出したコ
ロニーを１．５ｍｌミクロ試験管（レイニン、マサチュ
セッツ州ウーバン）内で一緒にし、温培地およびリン酸
緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、遠心分離し、−２０℃
に保存した。ＡＤＡ分析のために、細胞を５μｌの細胞
溶解用緩衝液中で反復凍結融解サイクルにより溶解し、
先の記載に従ってアイソザイム電気泳動を実施した。
イソザイム電気泳動によるタンパク質分析により測定し
た。個々の前駆細胞コロニーの分析を、先にＭｏｒｉｔ
ｚ（１９９３）およびＬｉｍら（１９８９）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８
６，ｐ８８９２が記載したと同様に実施した。導入効率
を厳密に分析するために、内因性ヒトＡＤＡと同じか、
またはより高い水準のｍＡＤＡを発現するコロニーのみ
を形質導入されたとみなした。プールしたコロニーの分
析のために、メチルセルロース培養物から取り出したコ
ロニーを１．５ｍｌミクロ試験管（レイニン、マサチュ
セッツ州ウーバン）内で一緒にし、温培地およびリン酸
緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、遠心分離し、−２０℃
に保存した。ＡＤＡ分析のために、細胞を５μｌの細胞
溶解用緩衝液中で反復凍結融解サイクルにより溶解し、
先の記載に従ってアイソザイム電気泳動を実施した。
【００６１】２．３．コミッティッド前駆細胞への遺伝
子導入効率 骨髄細胞を３０／３５ ＦＮコートまたはＢＳＡコート
した皿上で平板培養した状態で感染させることにより、
形質導入効率を比較した。これらの条件間に、選択なし
の感染後に得たコロニー数の差は見られなかった。表１
に示すように、すべてのコミッティッド前駆細胞への感
染効率がＢＳＡに対比して３０／３５ＦＮ上で実質的に
増大した。高力価（約１×１０7ウイルス粒子／ｍｌ）
ベクターを用いる場合に予想されたように、コミッティ
ッド前駆細胞の形質導入効率は著しく高かった。表１を
参照すると、３０／３５ ＦＮ上での骨髄のＰＧＫ−ｍ
ＡＤＡ感染により、別個の２実験でコミッティッド前駆
細胞のほぼ１００％の形質導入が得られた。
子導入効率 骨髄細胞を３０／３５ ＦＮコートまたはＢＳＡコート
した皿上で平板培養した状態で感染させることにより、
形質導入効率を比較した。これらの条件間に、選択なし
の感染後に得たコロニー数の差は見られなかった。表１
に示すように、すべてのコミッティッド前駆細胞への感
染効率がＢＳＡに対比して３０／３５ＦＮ上で実質的に
増大した。高力価（約１×１０7ウイルス粒子／ｍｌ）
ベクターを用いる場合に予想されたように、コミッティ
ッド前駆細胞の形質導入効率は著しく高かった。表１を
参照すると、３０／３５ ＦＮ上での骨髄のＰＧＫ−ｍ
ＡＤＡ感染により、別個の２実験でコミッティッド前駆
細胞のほぼ１００％の形質導入が得られた。
【００６２】
【表１】
【００６３】２．４．長期培養開始細胞への遺伝子導入
効率 ＰＧＫ−ｍＡＤＡを用いて行った４つの独立した実験
で、有意の割合の５週齢ＬＴＭＣ由来の前駆細胞コロニ
ー（すなわちＬＴＣ−ＩＣ由来のコロニー）が、導入さ
れたネズミＡＤＡ遺伝子を発現した。発現は分析したコ
ロニーのうち２／１２（１７％）−６／６（１００％）
に及んだ（表２）。導入されたｍＡＤＡ遺伝子の発現
は、陽性であるとみなされたすべてのコロニーにおいて
内因性ヒトＡＤＡ活性を上回るか、または少なくともそ
れと同等であった。ＰＧＫ−ｍＡＤＡに関する感染効率
はＴＫＮＥＯに関するよりも高かった。表２に示すよう
に、２つの別個の実験において３０／３５ ＦＮ上での
骨髄のＰＧＫ−ｍＡＤＡ感染により、コミッティッド前
駆細胞のほぼ１００％の形質導入が得られた。
効率 ＰＧＫ−ｍＡＤＡを用いて行った４つの独立した実験
で、有意の割合の５週齢ＬＴＭＣ由来の前駆細胞コロニ
ー（すなわちＬＴＣ−ＩＣ由来のコロニー）が、導入さ
れたネズミＡＤＡ遺伝子を発現した。発現は分析したコ
ロニーのうち２／１２（１７％）−６／６（１００％）
に及んだ（表２）。導入されたｍＡＤＡ遺伝子の発現
は、陽性であるとみなされたすべてのコロニーにおいて
内因性ヒトＡＤＡ活性を上回るか、または少なくともそ
れと同等であった。ＰＧＫ−ｍＡＤＡに関する感染効率
はＴＫＮＥＯに関するよりも高かった。表２に示すよう
に、２つの別個の実験において３０／３５ ＦＮ上での
骨髄のＰＧＫ−ｍＡＤＡ感染により、コミッティッド前
駆細胞のほぼ１００％の形質導入が得られた。
【００６４】
【表２】
【００６５】２．５．造血細胞の感染効率に対する３０
／３５ ＦＮ作用の特異性 ＬＴＣ−ＩＣ中への遺伝子導入効率が３０／３５ ＦＮ
上で増大した。これらの二次ＬＴＣ−ＩＣ由来コロニー
の大きさが比較的小さいため、単一コロニーにつきタン
パク質分析を行う可能性には限界があった。ＢＳＡ、無
傷のフィブロネクチン、および４２ ＦＮ上でのＰＧＫ
−ｍＡＤＡ感染後にネズミＡＤＡの発現を示したのは、
それぞれ０／６、０／４および０／３のＬＴＣ−ＩＣ由
来コロニーであったが、３０／３５ ＦＮ上で感染させ
たＬＴＣ−ＩＣ由来コロニー３／５がｍＡＤＡを発現し
た。さらに、多数のＬＴＣ−ＩＣ由来コロニーをプール
したのち２つの追加実験で分析した場合、ｍＡＤＡ発現
は３０／３５ ＦＮ上、およびこれより低いが無傷のＦ
Ｎ上での感染後にのみ検出され、４２ ＦＮまたはＢＳ
Ａ上では検出されなかった。
／３５ ＦＮ作用の特異性 ＬＴＣ−ＩＣ中への遺伝子導入効率が３０／３５ ＦＮ
上で増大した。これらの二次ＬＴＣ−ＩＣ由来コロニー
の大きさが比較的小さいため、単一コロニーにつきタン
パク質分析を行う可能性には限界があった。ＢＳＡ、無
傷のフィブロネクチン、および４２ ＦＮ上でのＰＧＫ
−ｍＡＤＡ感染後にネズミＡＤＡの発現を示したのは、
それぞれ０／６、０／４および０／３のＬＴＣ−ＩＣ由
来コロニーであったが、３０／３５ ＦＮ上で感染させ
たＬＴＣ−ＩＣ由来コロニー３／５がｍＡＤＡを発現し
た。さらに、多数のＬＴＣ−ＩＣ由来コロニーをプール
したのち２つの追加実験で分析した場合、ｍＡＤＡ発現
は３０／３５ ＦＮ上、およびこれより低いが無傷のＦ
Ｎ上での感染後にのみ検出され、４２ ＦＮまたはＢＳ
Ａ上では検出されなかった。
【００６６】実施例３ ＰＧＫ−ｈＡＤＡを用いた骨髄
細胞への遺伝子導入 ３．１．一般法 ＰＧＫ−ｈＡＤＡウイルス上清を実施例１においてＴＫ
ＮＥＯにつき記載したと同様に調製する。フィブロネク
チンのキモトリプチックフラグメント（図１）を先に実
施例１に記載したと同様に調製し、実施例１のレトロウ
イルス感染プロトコールに従う。ＬＴＣ−ＩＣアッセイ
およびメチルセルロースアッセイを実施例１に従って実
施する。
細胞への遺伝子導入 ３．１．一般法 ＰＧＫ−ｈＡＤＡウイルス上清を実施例１においてＴＫ
ＮＥＯにつき記載したと同様に調製する。フィブロネク
チンのキモトリプチックフラグメント（図１）を先に実
施例１に記載したと同様に調製し、実施例１のレトロウ
イルス感染プロトコールに従う。ＬＴＣ−ＩＣアッセイ
およびメチルセルロースアッセイを実施例１に従って実
施する。
【００６７】３．２．レトロウイルス感染の分析 プールしたコロニーの分析のために、メチルセルロース
培養物から取り出したコロニーを１．５ｍｌミクロ試験
管（レイニン、マサチュセッツ州ウーバン）内で一緒に
して、温培地およびＰＢＳで洗浄し、遠心分離し、−２
０℃に保存する。ＡＤＡ分析のために、細胞を５μｌの
細胞溶解用緩衝液中での反復凍結融解サイクルにより溶
解し、前記に従ってアイソザイム電気泳動を実施する。
培養物から取り出したコロニーを１．５ｍｌミクロ試験
管（レイニン、マサチュセッツ州ウーバン）内で一緒に
して、温培地およびＰＢＳで洗浄し、遠心分離し、−２
０℃に保存する。ＡＤＡ分析のために、細胞を５μｌの
細胞溶解用緩衝液中での反復凍結融解サイクルにより溶
解し、前記に従ってアイソザイム電気泳動を実施する。
【００６８】実施例４ ＴＫＮＥＯを用いた臍帯血細胞
への遺伝子導入 ４．１．一般法 ＴＫＮＥＯウイルス上清およびフィブロネクチンのキモ
トリプチックフラグメント（図１）を先に実施例１に記
載したと同様に調製した。実施例１のレトロウイルス感
染プロトコールに従い、ただし正常な満期新生児からの
臍帯血をインディアナ医科大学Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ
ａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより立証されたプロ
トコールに従ってヘパリンを入れた試験管中へ採集し、
骨髄細胞の代わりに使用した。ＬＴＣ−ＩＣ（ヒト幹細
胞）アッセイおよびメチルセルロースアッセイを実施例
１に従って実施した。
への遺伝子導入 ４．１．一般法 ＴＫＮＥＯウイルス上清およびフィブロネクチンのキモ
トリプチックフラグメント（図１）を先に実施例１に記
載したと同様に調製した。実施例１のレトロウイルス感
染プロトコールに従い、ただし正常な満期新生児からの
臍帯血をインディアナ医科大学Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ
ａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより立証されたプロ
トコールに従ってヘパリンを入れた試験管中へ採集し、
骨髄細胞の代わりに使用した。ＬＴＣ−ＩＣ（ヒト幹細
胞）アッセイおよびメチルセルロースアッセイを実施例
１に従って実施した。
【００６９】４．２．コミッティッド前駆細胞への遺伝
子導入効率 ３つの別個の実験において、３０／３５ ＦＮ上での感
染はＢＳＡと比較して４倍以上増大した（表３）。
子導入効率 ３つの別個の実験において、３０／３５ ＦＮ上での感
染はＢＳＡと比較して４倍以上増大した（表３）。
【００７０】
【表３】
【００７１】実施例５ ＰＧＫ−ｍＡＤＡを用いた臍帯
血細胞への遺伝子導入 ５．１．一般法 ＰＧＫ−ｍＡＤＡウイルス上清およびフィブロネクチン
のキモトリプチックフラグメント（図１）を、先に実施
例１に記載したと同様に調製した。実施例１のレトロウ
イルス感染プロトコールに従い、ただし正常な満期新生
児からの臍帯血をインディアナ医科大学Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより立証さ
れたプロトコールに従ってヘパリンを入れた試験管中へ
採集した。ＬＴＣ−ＩＣアッセイおよびメチルセルロー
スアッセイを実施例１に従って実施した。
血細胞への遺伝子導入 ５．１．一般法 ＰＧＫ−ｍＡＤＡウイルス上清およびフィブロネクチン
のキモトリプチックフラグメント（図１）を、先に実施
例１に記載したと同様に調製した。実施例１のレトロウ
イルス感染プロトコールに従い、ただし正常な満期新生
児からの臍帯血をインディアナ医科大学Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより立証さ
れたプロトコールに従ってヘパリンを入れた試験管中へ
採集した。ＬＴＣ−ＩＣアッセイおよびメチルセルロー
スアッセイを実施例１に従って実施した。
【００７２】５．２．長期培養開始細胞への遺伝子導入
効率 高力価ＰＧＫ−ｍＡＤＡベクターを用いた場合、ＬＴＣ
−ＩＣ由来のコロニーの分析により、上清をＦＮ３０／
３５上で用いて感染させた臍帯血から株化された培養物
からのみ、導入ｍＡＤＡ ｃＤＮＡの高水準の発現が証
明された。ＢＳＡ対照プレートで感染させたＬＴＣ−Ｉ
Ｃ由来のコロニーにはほとんどｍＡＤＡの発現が検出さ
れなかった。
効率 高力価ＰＧＫ−ｍＡＤＡベクターを用いた場合、ＬＴＣ
−ＩＣ由来のコロニーの分析により、上清をＦＮ３０／
３５上で用いて感染させた臍帯血から株化された培養物
からのみ、導入ｍＡＤＡ ｃＤＮＡの高水準の発現が証
明された。ＢＳＡ対照プレートで感染させたＬＴＣ−Ｉ
Ｃ由来のコロニーにはほとんどｍＡＤＡの発現が検出さ
れなかった。
【００７３】実施例４および５に示した結果は、臍帯血
前駆細胞および幹細胞を用いた場合にもＦＮ３０／３５
を用いることによって改良された感染効率を達成しうる
ことを証明する。
前駆細胞および幹細胞を用いた場合にもＦＮ３０／３５
を用いることによって改良された感染効率を達成しうる
ことを証明する。
【００７４】実施例６ ＰＧＫ−ｈＡＤＡを用いた臍帯
血細胞への遺伝子導入 ＰＧＫ−ｈＡＤＡウイルス上清およびフィブロネクチン
のキモトリプチックフラグメント（図１）を、実施例１
にＴＫＮＥＯにつき記載したと同様に調製する。実施例
１のレトロウイルス感染プロトコールに従い、ただし正
常な満期新生児からの臍帯血をインディアナ医科大学Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄに
より立証されたプロトコールに従ってヘパリンを入れた
試験管中へ採集し、骨髄細胞の代わりに使用する。ＬＴ
Ｃ−ＩＣアッセイおよびメチルセルロースアッセイを実
施例１に従って実施する。
血細胞への遺伝子導入 ＰＧＫ−ｈＡＤＡウイルス上清およびフィブロネクチン
のキモトリプチックフラグメント（図１）を、実施例１
にＴＫＮＥＯにつき記載したと同様に調製する。実施例
１のレトロウイルス感染プロトコールに従い、ただし正
常な満期新生児からの臍帯血をインディアナ医科大学Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄに
より立証されたプロトコールに従ってヘパリンを入れた
試験管中へ採集し、骨髄細胞の代わりに使用する。ＬＴ
Ｃ−ＩＣアッセイおよびメチルセルロースアッセイを実
施例１に従って実施する。
【００７５】実施例７−１１ 実施例７−１１のレトロウイルスベクターおよび産生細
胞系 実施例７−１１には２種類のレトロウイルス産生パッケ
ージング細胞系を用いた：それぞれエコトロピックＧＰ
＋Ｅ８６細胞系（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｄ．，Ｓ．Ｇｏ
ｆｆおよびＡ．Ｂａｎｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．
６２，ｐｐ１１２０−１１２４（１９８８））およびア
ンフォトロピックＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２細胞系（Ｍａｒ
ｋｏｗｉｔｚ，Ｄ．，Ｓ．ＧｏｆｆおよびＡ．Ｂａｎ
ｋ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６７，ｐｐ４００−
４０６（１９８８））。ここに記載した実験で用いたレ
トロウイルスベクターおよび産生クローンを表４に挙げ
る。
胞系 実施例７−１１には２種類のレトロウイルス産生パッケ
ージング細胞系を用いた：それぞれエコトロピックＧＰ
＋Ｅ８６細胞系（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｄ．，Ｓ．Ｇｏ
ｆｆおよびＡ．Ｂａｎｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．
６２，ｐｐ１１２０−１１２４（１９８８））およびア
ンフォトロピックＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２細胞系（Ｍａｒ
ｋｏｗｉｔｚ，Ｄ．，Ｓ．ＧｏｆｆおよびＡ．Ｂａｎ
ｋ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６７，ｐｐ４００−
４０６（１９８８））。ここに記載した実験で用いたレ
トロウイルスベクターおよび産生クローンを表４に挙げ
る。
【００７６】
【表４】
【００７７】細胞系はすべて１０％のウシ胎児血清（Ｆ
ＣＳ、ハイクローン、ユタ州ローガン）および１００Ｕ
／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプ
トマイシン（Ｐ／Ｓ、両方ともギブコ）を含有する改変
ダルベッコ培地（ＤＭＥ、ギブコ、ニューヨーク州グラ
ンドアイランド）中で培養された。ただしＥＡＬ２ａ細
胞は１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含有するＤＭＥ−Ｆ１
２（ギブコ）中で増殖させた。ネズミ細胞については、
それぞれ１０％ＦＣＳプラスＰ／Ｓを含有するアルファ
最小必須培地（αＭＥＭ、ギブコ）またはヒト細胞につ
いてはイスコブのダルベッコ培地（ＩＤＭＥ、ギブコ）
１０ｍｌを添加して、１０ｃｍのプレートを一夜集密化
させることにより、ウイルスを含有する上清を採集し
た。収穫した培地を０．４５ミクロンのフィルター（ゲ
ルマン・サイエンシズ、ミシガン州アンアーバー）で濾
過し、使用時まで−８０℃に保存した。
ＣＳ、ハイクローン、ユタ州ローガン）および１００Ｕ
／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプ
トマイシン（Ｐ／Ｓ、両方ともギブコ）を含有する改変
ダルベッコ培地（ＤＭＥ、ギブコ、ニューヨーク州グラ
ンドアイランド）中で培養された。ただしＥＡＬ２ａ細
胞は１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含有するＤＭＥ−Ｆ１
２（ギブコ）中で増殖させた。ネズミ細胞については、
それぞれ１０％ＦＣＳプラスＰ／Ｓを含有するアルファ
最小必須培地（αＭＥＭ、ギブコ）またはヒト細胞につ
いてはイスコブのダルベッコ培地（ＩＤＭＥ、ギブコ）
１０ｍｌを添加して、１０ｃｍのプレートを一夜集密化
させることにより、ウイルスを含有する上清を採集し
た。収穫した培地を０．４５ミクロンのフィルター（ゲ
ルマン・サイエンシズ、ミシガン州アンアーバー）で濾
過し、使用時まで−８０℃に保存した。
【００７８】実施例７ 一次ネズミ造血細胞の形質導
入 ７．１．実験 ネズミ細胞を用いる実験のために、６−８週齢のＣ３Ｈ
／ＨｅＪマウスの大腿骨および脛骨から、１５０ｍｇ／
ｋｇの５−フルオロウラシル（ソロパック・ラボラトリ
ーズ、イリノイ州フランクリン・パーク）投与の２日後
に骨髄を収穫した（Ｌｉｍ，Ｂ．，Ｊ．Ｆ．Ａｐｐｅｒ
ｌｅｙ，Ｓ．Ｈ．ＯｒｋｉｎおよびＤ．Ａ．Ｗｉｌｌｉ
ａｍｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ
ＳＡ，Ｖｏｌ．８６，ｐｐ８８９２−８８９６（１９８
９））。細胞を５×１０5細胞／ｍｌの濃度においてＩ
ＭＤＭ／２０％ＦＣＳプラスＰ／Ｓ中で、１００ｎｇ／
ｍｌのラット組換え幹細胞因子（ｒｒＳＣＦ；アムゲ
ン、カリフォルニア州サウザンズ・オークス）および１
００Ｕ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−６（ｒｈ
ＩＬ−６；ペプロ・テク・インコーポレーテッド、ニュ
ージャジー州ロックヒル）により４８時間予備刺激した
（Ｌｕｓｋｅｙ，Ｂ．Ｄ．，Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｌａｔ
ｔ，Ｋ.ＺｓｅｂｏおよびＤ.Ａ.Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂ
ｌｏｏｄ，Ｖｏｌ.８０，ｐｐ３９６−４０２（１９９
２））。次いでＥＰＨＡ−５産生細胞が産生したＰＧＫ
−ｈＡＤＡベクターによる遺伝子導入効率を３つの異な
る感染プロトコールにより比較した：１）上清感染；
２）ＦＮ３０／３５上での上清感染；３）ＥＰＨＡ−５
産生細胞上での同時培養。したがって１００ｍｍの細菌
皿に、５ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ギブコ）に
溶解した２．５μｇ／ｃｍ2のＦＮ３０／３５（７５ｐ
ｍｏｌ／ｃｍ2に相当）で室温においてＵＶ光線下に、
皿の蓋を開けた状態で１時間、そして皿の蓋を閉じた状
態でさらに１時間コートした。２％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ、フラクションＶ；ベーリンガー・マンハイ
ム、インディアナ州インディアナポリス）により室温で
３０分間ブロッキングしたのち、２．５％（ｖ／ｖ）の
１Ｍ Ｈｅｐｅｓを補充したハンクスの平衡塩類溶液
（ＨＢＳＳ）（両方ともギブコ）で皿を１回洗浄した。
上清感染のためには皿をＢＳＡのみでコートした。５×
１０6個の予備刺激したドナー細胞を、前記に従ってＥ
ＰＨＡ−５細胞から得たウイルス上清１０ｍｌに１００
Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍｌのｈｒＳＣ
Ｆおよび７．５μｇ／ｍｌのポリブレンを補充したもの
と共にインキュベートした。付着していない細胞を採集
し、新鮮なウイルス上清を再添加した。同時培養のため
には、培地４ｍｌ中のＥＰＨＡ−５細胞を１０μｇ／ｍ
ｌのマイトマイシンＣと共に３７℃で２時間インキュベ
ートし、洗浄し、トリプシン処理し、１００ｍｍの組織
培養皿に１０ｍｌのαＭＥＭ／２０％ＦＣＳプラスＰ／
Ｓ中３×１０6個の細胞濃度で接種した。翌日、１００
Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍｌのｈｒＳＣ
Ｆおよび４μｇ／ｍｌのポリブレンで予備刺激した５×
１０6個の骨髄細胞を４８時間添加した。感染プロトコ
ール後に付着していない細胞をデカントし、付着した造
血細胞を培養物から細胞解離用緩衝液（ＣＤＢ）（無酵
素／ＰＢＳ系、ギブコ）により、製造業者の指示に従っ
て採集した。付着細胞を非付着画分に添加し、２回洗浄
し、約１ｍｌのＨＢＳＳ／Ｈｅｐｅｓに懸濁した。５×
１０6個の予備刺激した細胞から得た全細胞を、致死量
の全身照射（７００プラス４００ｃＧｙによる、13 7Ｃ
ｓ−源）した３匹のレシピエントマウスの尾静脈に注射
した（Ｌｕｓｋｅｙ，Ｂ．Ｄ．，Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｌａ
ｔｔ，Ｋ．ＺｓｅｂｏおよびＤ．Ａ．Ｗｉｌｌｉａｍ
ｓ，Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．８０，ｐｐ３９６−４０２
（１９９２））。再構成マウスを、導入したヒトＡＤＡ
ｃＤＮＡの発現につき検査することにより、造血幹細
胞の形質導入を分析した。このＡＤＡアイソザイム分析
は、移植したマウスにおいて末梢血細胞を酢酸セルロー
スｉｎ ｓｉｔｕ酵素分析によりｈＡＤＡタンパク質の
存在につき検査することによって実施された（Ｌｉｍ，
Ｂ．，Ｄ．Ａ.ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＳ．Ｈ．Ｏｒｋ
ｉｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ.,Ｖｏｌ．７，ｐｐ
３４５９−３４６５（１９８７））。検査は移植後４カ
月目から実施し、月毎に反復した。
入 ７．１．実験 ネズミ細胞を用いる実験のために、６−８週齢のＣ３Ｈ
／ＨｅＪマウスの大腿骨および脛骨から、１５０ｍｇ／
ｋｇの５−フルオロウラシル（ソロパック・ラボラトリ
ーズ、イリノイ州フランクリン・パーク）投与の２日後
に骨髄を収穫した（Ｌｉｍ，Ｂ．，Ｊ．Ｆ．Ａｐｐｅｒ
ｌｅｙ，Ｓ．Ｈ．ＯｒｋｉｎおよびＤ．Ａ．Ｗｉｌｌｉ
ａｍｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ
ＳＡ，Ｖｏｌ．８６，ｐｐ８８９２−８８９６（１９８
９））。細胞を５×１０5細胞／ｍｌの濃度においてＩ
ＭＤＭ／２０％ＦＣＳプラスＰ／Ｓ中で、１００ｎｇ／
ｍｌのラット組換え幹細胞因子（ｒｒＳＣＦ；アムゲ
ン、カリフォルニア州サウザンズ・オークス）および１
００Ｕ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−６（ｒｈ
ＩＬ−６；ペプロ・テク・インコーポレーテッド、ニュ
ージャジー州ロックヒル）により４８時間予備刺激した
（Ｌｕｓｋｅｙ，Ｂ．Ｄ．，Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｌａｔ
ｔ，Ｋ.ＺｓｅｂｏおよびＤ.Ａ.Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂ
ｌｏｏｄ，Ｖｏｌ.８０，ｐｐ３９６−４０２（１９９
２））。次いでＥＰＨＡ−５産生細胞が産生したＰＧＫ
−ｈＡＤＡベクターによる遺伝子導入効率を３つの異な
る感染プロトコールにより比較した：１）上清感染；
２）ＦＮ３０／３５上での上清感染；３）ＥＰＨＡ−５
産生細胞上での同時培養。したがって１００ｍｍの細菌
皿に、５ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ギブコ）に
溶解した２．５μｇ／ｃｍ2のＦＮ３０／３５（７５ｐ
ｍｏｌ／ｃｍ2に相当）で室温においてＵＶ光線下に、
皿の蓋を開けた状態で１時間、そして皿の蓋を閉じた状
態でさらに１時間コートした。２％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ、フラクションＶ；ベーリンガー・マンハイ
ム、インディアナ州インディアナポリス）により室温で
３０分間ブロッキングしたのち、２．５％（ｖ／ｖ）の
１Ｍ Ｈｅｐｅｓを補充したハンクスの平衡塩類溶液
（ＨＢＳＳ）（両方ともギブコ）で皿を１回洗浄した。
上清感染のためには皿をＢＳＡのみでコートした。５×
１０6個の予備刺激したドナー細胞を、前記に従ってＥ
ＰＨＡ−５細胞から得たウイルス上清１０ｍｌに１００
Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍｌのｈｒＳＣ
Ｆおよび７．５μｇ／ｍｌのポリブレンを補充したもの
と共にインキュベートした。付着していない細胞を採集
し、新鮮なウイルス上清を再添加した。同時培養のため
には、培地４ｍｌ中のＥＰＨＡ−５細胞を１０μｇ／ｍ
ｌのマイトマイシンＣと共に３７℃で２時間インキュベ
ートし、洗浄し、トリプシン処理し、１００ｍｍの組織
培養皿に１０ｍｌのαＭＥＭ／２０％ＦＣＳプラスＰ／
Ｓ中３×１０6個の細胞濃度で接種した。翌日、１００
Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍｌのｈｒＳＣ
Ｆおよび４μｇ／ｍｌのポリブレンで予備刺激した５×
１０6個の骨髄細胞を４８時間添加した。感染プロトコ
ール後に付着していない細胞をデカントし、付着した造
血細胞を培養物から細胞解離用緩衝液（ＣＤＢ）（無酵
素／ＰＢＳ系、ギブコ）により、製造業者の指示に従っ
て採集した。付着細胞を非付着画分に添加し、２回洗浄
し、約１ｍｌのＨＢＳＳ／Ｈｅｐｅｓに懸濁した。５×
１０6個の予備刺激した細胞から得た全細胞を、致死量
の全身照射（７００プラス４００ｃＧｙによる、13 7Ｃ
ｓ−源）した３匹のレシピエントマウスの尾静脈に注射
した（Ｌｕｓｋｅｙ，Ｂ．Ｄ．，Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｌａ
ｔｔ，Ｋ．ＺｓｅｂｏおよびＤ．Ａ．Ｗｉｌｌｉａｍ
ｓ，Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．８０，ｐｐ３９６−４０２
（１９９２））。再構成マウスを、導入したヒトＡＤＡ
ｃＤＮＡの発現につき検査することにより、造血幹細
胞の形質導入を分析した。このＡＤＡアイソザイム分析
は、移植したマウスにおいて末梢血細胞を酢酸セルロー
スｉｎ ｓｉｔｕ酵素分析によりｈＡＤＡタンパク質の
存在につき検査することによって実施された（Ｌｉｍ，
Ｂ．，Ｄ．Ａ.ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＳ．Ｈ．Ｏｒｋ
ｉｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ.,Ｖｏｌ．７，ｐｐ
３４５９−３４６５（１９８７））。検査は移植後４カ
月目から実施し、月毎に反復した。
【００７９】７．２．結果 遺伝子操作した造血幹細胞によるマウスの長期骨髄再構
成は、一般に移植の４カ月後に幹細胞形質導入効率を判
定するのが適切であると受け取られている。７カ月後に
レシピエントの形質導入骨髄をアイソザイム分析により
分析して、下記のことが明らかになった：１）ヒトＡＤ
Ａ ｃＤＮＡ発現は同時培養またはＦＮ３０／３５上で
の上清感染を採用した場合に存在したが、ＦＮ３０／３
５なしの上清感染後に移植した群には存在しなかった；
および２）発現の水準は同時培養群とＦＮ３０／３５群
で同等であった。図４、２−４列に示すように、ＥＰＨ
Ａ−５細胞上での同時培養により形質導入された骨髄を
移植した３匹のマウスは容易に検出しうるヒトＡＤＡを
立証した。同様な水準のヒトＡＤＡが、ＦＮ３０／３５
上でのの上清感染により形質導入された造血細胞を移植
した３匹のマウスに検出された（図４、５−７列）。こ
れに対し、ＢＳＡ上での上清感染により形質導入された
３匹のマウスにはヒトＡＤＡが検出されなかった(図
４、８−１０列)。ヒトＡＤＡの位置に関する対照を図４
の１および１２列に、ネズミＡＤＡに関する対照を１１
列に示す。２−１０列のネズミバンドは等量のタンパク
質が装填されたことを明らかにする。これらのデータは
ＦＮ３０／３５上での上清感染による長期再構成性の造
血幹細胞の形質導入が同時培養と同等であり、かつＦＮ
３０／３５なしの上清感染よりはるかに優れていること
を立証する。
成は、一般に移植の４カ月後に幹細胞形質導入効率を判
定するのが適切であると受け取られている。７カ月後に
レシピエントの形質導入骨髄をアイソザイム分析により
分析して、下記のことが明らかになった：１）ヒトＡＤ
Ａ ｃＤＮＡ発現は同時培養またはＦＮ３０／３５上で
の上清感染を採用した場合に存在したが、ＦＮ３０／３
５なしの上清感染後に移植した群には存在しなかった；
および２）発現の水準は同時培養群とＦＮ３０／３５群
で同等であった。図４、２−４列に示すように、ＥＰＨ
Ａ−５細胞上での同時培養により形質導入された骨髄を
移植した３匹のマウスは容易に検出しうるヒトＡＤＡを
立証した。同様な水準のヒトＡＤＡが、ＦＮ３０／３５
上でのの上清感染により形質導入された造血細胞を移植
した３匹のマウスに検出された（図４、５−７列）。こ
れに対し、ＢＳＡ上での上清感染により形質導入された
３匹のマウスにはヒトＡＤＡが検出されなかった(図
４、８−１０列)。ヒトＡＤＡの位置に関する対照を図４
の１および１２列に、ネズミＡＤＡに関する対照を１１
列に示す。２−１０列のネズミバンドは等量のタンパク
質が装填されたことを明らかにする。これらのデータは
ＦＮ３０／３５上での上清感染による長期再構成性の造
血幹細胞の形質導入が同時培養と同等であり、かつＦＮ
３０／３５なしの上清感染よりはるかに優れていること
を立証する。
【００８０】実施例８ ＦＮ３０／３５へのレトロウイ
ルスベクター結合による形質導入改良のメカニズム ８．１．実験 形質導入の増大がウイルスと造血細胞の同時局在の結果
であるか否かを調べるために、組換えレトロウイルス粒
子がＦＮ３０／３５への結合を示すか否かを分析した。
したがってＦＮ３０／３５コートしたプレートを、ＴＫ
ＮＥＯウイルスを含有する上清と共に３０分間プレイン
キュベートしたのち、徹底的に洗浄した。上清のウイル
ス力価を標準法により、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を用いて測
定した（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｄ．，Ｓ．Ｇｏｆｆおよ
びＡ．Ｂａｎｋ，Ｊ．Ｖｉｌｏｌ．，Ｖｏｌ．６２，ｐ
ｐ１１２０−１１２４（１９８８））。以下に要約す
る：３Ｔ３細胞を１０００個／ウェルの濃度で６ウェル
組織培養プレートに接種し、一夜増殖させた。各ウェル
にウイルス上清の系列希釈液を７．５μｇ／ｍｌのポリ
ブレンと共に添加し、３７℃で２．５時間インキュベー
トしたのち、２ｍｌの培地を添加した。２４時間後に培
地をＧ４１８（０．７５ｍｇ／ｍｌ、乾燥粉末、ギブ
コ）含有培地と交換し、プレートを１０−１２日間イン
キュベートした。Ｇ４１８耐性コロニー（Ｇ４１８r）
を１０−１２日後に染色し、計数した。コロニー／ウェ
ル×ウイルス上清希釈度の数値を、感染性粒子数（ｃｆ
ｕ）／上清ｍｌとして用いた。ＦＮ３０／３５コートま
たはＢＳＡコートした３５ｍｍのプレートをウイルス上
清と共にプレインキュベートし、徹底的に洗浄したの
ち、３５ｍｍの細菌用皿当たり１０００個のＮＩＨ／３
Ｔ３およびポリブレンを添加することにより、プレート
上に残留するレトロウイルス粒子の量を評価“力価測
定”した。２４時間後に培養物に０．７５ｍｇ／ｍｌの
Ｇ４１８（乾燥粉末）を含有する培地を供給し、細胞を
さらに１０−１２日間インキュベートした。このインキ
ュベーションののち、Ｇ４１８耐性ＮＩＨ／３Ｔ３コロ
ニーを計数することにより付着ウイルスの存在を定量し
た。
ルスベクター結合による形質導入改良のメカニズム ８．１．実験 形質導入の増大がウイルスと造血細胞の同時局在の結果
であるか否かを調べるために、組換えレトロウイルス粒
子がＦＮ３０／３５への結合を示すか否かを分析した。
したがってＦＮ３０／３５コートしたプレートを、ＴＫ
ＮＥＯウイルスを含有する上清と共に３０分間プレイン
キュベートしたのち、徹底的に洗浄した。上清のウイル
ス力価を標準法により、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を用いて測
定した（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｄ．，Ｓ．Ｇｏｆｆおよ
びＡ．Ｂａｎｋ，Ｊ．Ｖｉｌｏｌ．，Ｖｏｌ．６２，ｐ
ｐ１１２０−１１２４（１９８８））。以下に要約す
る：３Ｔ３細胞を１０００個／ウェルの濃度で６ウェル
組織培養プレートに接種し、一夜増殖させた。各ウェル
にウイルス上清の系列希釈液を７．５μｇ／ｍｌのポリ
ブレンと共に添加し、３７℃で２．５時間インキュベー
トしたのち、２ｍｌの培地を添加した。２４時間後に培
地をＧ４１８（０．７５ｍｇ／ｍｌ、乾燥粉末、ギブ
コ）含有培地と交換し、プレートを１０−１２日間イン
キュベートした。Ｇ４１８耐性コロニー（Ｇ４１８r）
を１０−１２日後に染色し、計数した。コロニー／ウェ
ル×ウイルス上清希釈度の数値を、感染性粒子数（ｃｆ
ｕ）／上清ｍｌとして用いた。ＦＮ３０／３５コートま
たはＢＳＡコートした３５ｍｍのプレートをウイルス上
清と共にプレインキュベートし、徹底的に洗浄したの
ち、３５ｍｍの細菌用皿当たり１０００個のＮＩＨ／３
Ｔ３およびポリブレンを添加することにより、プレート
上に残留するレトロウイルス粒子の量を評価“力価測
定”した。２４時間後に培養物に０．７５ｍｇ／ｍｌの
Ｇ４１８（乾燥粉末）を含有する培地を供給し、細胞を
さらに１０−１２日間インキュベートした。このインキ
ュベーションののち、Ｇ４１８耐性ＮＩＨ／３Ｔ３コロ
ニーを計数することにより付着ウイルスの存在を定量し
た。
【００８１】ＦＮ３０／３５へのウイルスの結合が用量
依存性様式で起こるか否かを評価するために、皿をコー
トするＦＮ３０／３５の濃度を漸増させて上記実験を反
復した。したがって３５ｍｍの細菌用皿を上記に従って
１、４、１０および２０μｇ／ｃｍ2のＦＮ３０／３５
でコートした。予め感染性粒子１×１０4個／ｍｌと力
価測定されたＴＫＮＥＯウイルス原液の１：５０希釈液
を、ＦＮ３０／３５コートしたプレート上で３０分間イ
ンキュベートした。徹底的に洗浄したのち、各ウェルに
２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を添加した。上記に従
って選択を行い、１０日間の選択後にＧ４１８耐性ＮＩ
Ｈ／３Ｔ３コロニーを計数した。
依存性様式で起こるか否かを評価するために、皿をコー
トするＦＮ３０／３５の濃度を漸増させて上記実験を反
復した。したがって３５ｍｍの細菌用皿を上記に従って
１、４、１０および２０μｇ／ｃｍ2のＦＮ３０／３５
でコートした。予め感染性粒子１×１０4個／ｍｌと力
価測定されたＴＫＮＥＯウイルス原液の１：５０希釈液
を、ＦＮ３０／３５コートしたプレート上で３０分間イ
ンキュベートした。徹底的に洗浄したのち、各ウェルに
２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を添加した。上記に従
って選択を行い、１０日間の選択後にＧ４１８耐性ＮＩ
Ｈ／３Ｔ３コロニーを計数した。
【００８２】８．２．結果 図５に代表的な３実験中の１つの結果を提示する。ＴＫ
ＮＥＯ上清を用いた場合、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞中のＧ４
１８rコロニーにより測定したレトロウイルス力価が、
ＢＳＡコートしたプレート上では３ ｌｏｇ以上低下し
た（４×１０3から０）が、力価低下は３０／３５ Ｆ
Ｎコートしたプレート上では１ ｌｏｇにすぎなかっ
た。これらのデータは、レトロウイルスがＦＮ３０／３
５には定量的に結合するが、ＢＳＡコートした皿（対照
の皿）のは結合しないことを証明する。図６は、ウイル
ス含有上清をより高い濃度のＦＮ３０／３５でコートす
ると、より多数のＧ４１８耐性コロニーが検出されたこ
とを示す。したがってＦＮ３０／３５へのウイルスの結
合は用量依存性の様式で起こる。
ＮＥＯ上清を用いた場合、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞中のＧ４
１８rコロニーにより測定したレトロウイルス力価が、
ＢＳＡコートしたプレート上では３ ｌｏｇ以上低下し
た（４×１０3から０）が、力価低下は３０／３５ Ｆ
Ｎコートしたプレート上では１ ｌｏｇにすぎなかっ
た。これらのデータは、レトロウイルスがＦＮ３０／３
５には定量的に結合するが、ＢＳＡコートした皿（対照
の皿）のは結合しないことを証明する。図６は、ウイル
ス含有上清をより高い濃度のＦＮ３０／３５でコートす
ると、より多数のＧ４１８耐性コロニーが検出されたこ
とを示す。したがってＦＮ３０／３５へのウイルスの結
合は用量依存性の様式で起こる。
【００８３】実施例９ 組換えフィブロネクチンフラグ
メントへのウイルスの結合 ９．１．実験 Ｋｉｍｉｚｕｋａらは先に大腸菌におけるクローン化Ｆ
Ｎ ＤＮＡ配列の発現につき報告した（Ｋｉｍｉｚｕｋ
ａ，Ｆ．，Ｙ．Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｏｈｄａｔｅ，
Ｙ．Ｋａｗａｓｅ，Ｔ．Ｓｈｉｍｏｊｏ，Ｄ．Ｈａｓｈ
ｉｎｏ，Ｉ．Ｋａｔｏ，Ｋ．Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉおよび
Ｋ．Ｔｉｔａｎｉ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１
１０，ｐｐ２８４−２９１（１９９１））。クローン化
およびキメラペプチドは細胞の付着に関与することが知
られている、フィブロネクチン中の幾つかの重要な配列
の１つまたは組合わせを含む（ＲＧＤＳ、ＣＳ−１およ
びヘパリン結合部位を含む）。図７を参照されたい。レ
トロウイルスがこれらの組換えＦＮフラグメントに結合
しうるか否かを分析するために、陽性対照としての組換
えフラグメントＣ−２７４、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、
ＣＨ−２７１、ＣＨ２９６、Ｃ−ＣＳ１およびＦＮ３０
／３５でコートしたプレート上で、感染性粒子１×１０
4／ｍｌの凍結レトロウイルスＴＫＮＥＯ原液の２種類
の異なる希釈液（１：１０および１：１００）を用いて
３Ｔ３細胞コロニー形成アッセイを反復した。ＦＮフラ
グメントは１２０−１３０ｐｍｏｌ／ｃｍ2の濃度で用
いられた（Ｃ−２７４、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、Ｃ−
ＣＳ１、ＦＮ３０／３５については４μｇ／ｃｍ2、Ｃ
Ｈ−２７１、ＣＨ２９６については８μｇ／ｃｍ2に相
当）。要約すると、プレートをコートし、ウイルスを添
加し、プレートを徹底的に洗浄し、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞
を２４時間添加し、次いで選択培地中で１０日間選択し
たのちコロニーを染色し、計数した。
メントへのウイルスの結合 ９．１．実験 Ｋｉｍｉｚｕｋａらは先に大腸菌におけるクローン化Ｆ
Ｎ ＤＮＡ配列の発現につき報告した（Ｋｉｍｉｚｕｋ
ａ，Ｆ．，Ｙ．Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｏｈｄａｔｅ，
Ｙ．Ｋａｗａｓｅ，Ｔ．Ｓｈｉｍｏｊｏ，Ｄ．Ｈａｓｈ
ｉｎｏ，Ｉ．Ｋａｔｏ，Ｋ．Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉおよび
Ｋ．Ｔｉｔａｎｉ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１
１０，ｐｐ２８４−２９１（１９９１））。クローン化
およびキメラペプチドは細胞の付着に関与することが知
られている、フィブロネクチン中の幾つかの重要な配列
の１つまたは組合わせを含む（ＲＧＤＳ、ＣＳ−１およ
びヘパリン結合部位を含む）。図７を参照されたい。レ
トロウイルスがこれらの組換えＦＮフラグメントに結合
しうるか否かを分析するために、陽性対照としての組換
えフラグメントＣ−２７４、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、
ＣＨ−２７１、ＣＨ２９６、Ｃ−ＣＳ１およびＦＮ３０
／３５でコートしたプレート上で、感染性粒子１×１０
4／ｍｌの凍結レトロウイルスＴＫＮＥＯ原液の２種類
の異なる希釈液（１：１０および１：１００）を用いて
３Ｔ３細胞コロニー形成アッセイを反復した。ＦＮフラ
グメントは１２０−１３０ｐｍｏｌ／ｃｍ2の濃度で用
いられた（Ｃ−２７４、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、Ｃ−
ＣＳ１、ＦＮ３０／３５については４μｇ／ｃｍ2、Ｃ
Ｈ−２７１、ＣＨ２９６については８μｇ／ｃｍ2に相
当）。要約すると、プレートをコートし、ウイルスを添
加し、プレートを徹底的に洗浄し、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞
を２４時間添加し、次いで選択培地中で１０日間選択し
たのちコロニーを染色し、計数した。
【００８４】９．２．結果 図８は、フラグメントＨ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−
２７１およびＣＨ２９６においてＧ４１８耐性コロニー
数（したがってウイルスの付着）が増加したことを証明
する。さらにこれは、結合したウイルスの量がこれらの
組換えフラグメントとＦＮ３０／３５との間でほぼ同等
であったことを示す。ただしこの実験ではＣＨ−２７１
フラグメントが最高水準のウイルス結合を示した。これ
ら５種類のＦＮフラグメントすべてに共通して、高親和
性のヘパリン結合部位を含むタイプＩＩＩ反復配列１２
−１４がある（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．，Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５７，ｐｐ３７５−
４１３（１９８８）、およびＫｉｍｉｚｕｋａ，Ｆ．，
Ｙ．Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｏｈｄａｔｅ，Ｙ．Ｋａｗａ
ｓｅ，Ｔ．Ｓｈｉｍｏｊｏ，Ｋ．Ｈａｓｈｉｎｏ，Ｉ．
Ｋａｔｏ，Ｋ．ＳｅｋｉｇｕｃｈｉおよびＫ．Ｔｉｔａ
ｎｉ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１１０，ｐｐ２
８４−２９１（１９９１））。この部位は恐らく反復配
列１３内に位置すると思われる（Ｋｉｍｉｚｕｋａ，
Ｆ．，Ｙ．Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｏｈｄａｔｅ，Ｙ．Ｋ
ａｗａｓｅ，Ｔ．Ｓｈｉｍｏｊｏ，Ｋ．Ｈａｓｈｉｎ
ｏ，Ｉ．Ｋａｔｏ，Ｋ.ＳｅｋｉｇｕｃｈｉおよびＫ．
Ｔｉｔａｎｉ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ.,Ｖｏｌ.１１０，
ｐｐ２８４−２９１（１９９１）)。これは、ウイルス
結合がこの既知の付着部位により起こっていることを示
唆する。これは、４μｇ／ｃｍ 2のＣＨ−２７１でコー
トした皿を、漸増する濃度（１０−１０００μｇ／ｍ
ｌ）のヘパリン硫酸、すなわちヘパリン結合部位への細
胞の結合を阻害することが知られている高度に帯電した
分子と共にプレインキュベートすることにより証明され
た。図９に示すように、ヘパリン硫酸の濃度が増大する
のに伴ってＣＨ−２７１のプレインキュベーションによ
りＧ４１８耐性コロニー数が減少する。これらのデータ
は、ＦＮへのウイルスの結合がＦＮのカルボキシル末端
のＣＳ−１部位のすぐ隣に位置する高親和性ヘパリン結
合部位により仲介されることを示唆する。
２７１およびＣＨ２９６においてＧ４１８耐性コロニー
数（したがってウイルスの付着）が増加したことを証明
する。さらにこれは、結合したウイルスの量がこれらの
組換えフラグメントとＦＮ３０／３５との間でほぼ同等
であったことを示す。ただしこの実験ではＣＨ−２７１
フラグメントが最高水準のウイルス結合を示した。これ
ら５種類のＦＮフラグメントすべてに共通して、高親和
性のヘパリン結合部位を含むタイプＩＩＩ反復配列１２
−１４がある（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．，Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５７，ｐｐ３７５−
４１３（１９８８）、およびＫｉｍｉｚｕｋａ，Ｆ．，
Ｙ．Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｏｈｄａｔｅ，Ｙ．Ｋａｗａ
ｓｅ，Ｔ．Ｓｈｉｍｏｊｏ，Ｋ．Ｈａｓｈｉｎｏ，Ｉ．
Ｋａｔｏ，Ｋ．ＳｅｋｉｇｕｃｈｉおよびＫ．Ｔｉｔａ
ｎｉ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１１０，ｐｐ２
８４−２９１（１９９１））。この部位は恐らく反復配
列１３内に位置すると思われる（Ｋｉｍｉｚｕｋａ，
Ｆ．，Ｙ．Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｏｈｄａｔｅ，Ｙ．Ｋ
ａｗａｓｅ，Ｔ．Ｓｈｉｍｏｊｏ，Ｋ．Ｈａｓｈｉｎ
ｏ，Ｉ．Ｋａｔｏ，Ｋ.ＳｅｋｉｇｕｃｈｉおよびＫ．
Ｔｉｔａｎｉ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ.,Ｖｏｌ.１１０，
ｐｐ２８４−２９１（１９９１）)。これは、ウイルス
結合がこの既知の付着部位により起こっていることを示
唆する。これは、４μｇ／ｃｍ 2のＣＨ−２７１でコー
トした皿を、漸増する濃度（１０−１０００μｇ／ｍ
ｌ）のヘパリン硫酸、すなわちヘパリン結合部位への細
胞の結合を阻害することが知られている高度に帯電した
分子と共にプレインキュベートすることにより証明され
た。図９に示すように、ヘパリン硫酸の濃度が増大する
のに伴ってＣＨ−２７１のプレインキュベーションによ
りＧ４１８耐性コロニー数が減少する。これらのデータ
は、ＦＮへのウイルスの結合がＦＮのカルボキシル末端
のＣＳ−１部位のすぐ隣に位置する高親和性ヘパリン結
合部位により仲介されることを示唆する。
【００８５】実施例１０ 組換えフィブロネクチンフラ
グメント上での造血細胞の形質導入 １０．１．実験 ＦＮ３０／３５につき先に記載した造血細胞の形質導入
の増大が組換えＦＮフラグメントを用いた場合にも見ら
れるか否かを分析するために、高増殖性の潜在的コロニ
ー形成性細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）アッセイ法を用いて、
インビトロでの上清感染の形質導入効率を評価した。Ｅ
ＡＬ２ａベクターを使用し、遺伝子導入を指示するもの
としてＧ４１８耐性コロニーの増殖を利用する造血細胞
形質導入に種々の組換えＦＮフラグメントが及ぼす影響
を、ＦＮ３０／３５またはＢＳＡ上での上清感染と比較
した。さらに、既にＦＮフラグメントに付着したウイル
ス粒子（上清ウイルスと対比）が造血細胞に形質導入す
る能力を比較した。０．５−１×１０6個の予備刺激し
た骨髄細胞を３５ｍｍのＦＮコートしたペトリ皿上で、
成長因子および５μｇ／ｍｌのポリブレンを含有するＥ
ＡＬ２ａウイルス含有上清１−２ｍｌ中において、前記
に従ってインキュベートした。ＦＮフラグメントに結合
したウイルスによる造血細胞の形質導入を評価するため
には、ウイルス含有上清と共にインキュベートした３５
ｍｍのＦＮコート皿をそれぞれ２ｍｌのＰＢＳで３回洗
浄した。次いで０．５−１×１０6個の予備刺激した骨
髄細胞を、成長因子およびポリブレンを補充した培地２
ｍｌ中において添加した。２２時間後に細胞を収穫し、
１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する、および含有し
ないＨＰＰ−ＣＦＣアッセイに接種した（Ｂｒａｄｌｅ
ｙ，Ｔ．Ｒ．およびＤ．Ｍｅｔｃａｌｆ，Ａｕｓｔ．
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．４
４，ｐｐ２８７−２９３（１９６６）の記載に従う）。
培養物を７％ＣＯ2中で３３℃において１４日間インキ
ュベートし、Ｇ４１８耐性コロニーの％として遺伝子導
入効率を計算した。
グメント上での造血細胞の形質導入 １０．１．実験 ＦＮ３０／３５につき先に記載した造血細胞の形質導入
の増大が組換えＦＮフラグメントを用いた場合にも見ら
れるか否かを分析するために、高増殖性の潜在的コロニ
ー形成性細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）アッセイ法を用いて、
インビトロでの上清感染の形質導入効率を評価した。Ｅ
ＡＬ２ａベクターを使用し、遺伝子導入を指示するもの
としてＧ４１８耐性コロニーの増殖を利用する造血細胞
形質導入に種々の組換えＦＮフラグメントが及ぼす影響
を、ＦＮ３０／３５またはＢＳＡ上での上清感染と比較
した。さらに、既にＦＮフラグメントに付着したウイル
ス粒子（上清ウイルスと対比）が造血細胞に形質導入す
る能力を比較した。０．５−１×１０6個の予備刺激し
た骨髄細胞を３５ｍｍのＦＮコートしたペトリ皿上で、
成長因子および５μｇ／ｍｌのポリブレンを含有するＥ
ＡＬ２ａウイルス含有上清１−２ｍｌ中において、前記
に従ってインキュベートした。ＦＮフラグメントに結合
したウイルスによる造血細胞の形質導入を評価するため
には、ウイルス含有上清と共にインキュベートした３５
ｍｍのＦＮコート皿をそれぞれ２ｍｌのＰＢＳで３回洗
浄した。次いで０．５−１×１０6個の予備刺激した骨
髄細胞を、成長因子およびポリブレンを補充した培地２
ｍｌ中において添加した。２２時間後に細胞を収穫し、
１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する、および含有し
ないＨＰＰ−ＣＦＣアッセイに接種した（Ｂｒａｄｌｅ
ｙ，Ｔ．Ｒ．およびＤ．Ｍｅｔｃａｌｆ，Ａｕｓｔ．
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．４
４，ｐｐ２８７−２９３（１９６６）の記載に従う）。
培養物を７％ＣＯ2中で３３℃において１４日間インキ
ュベートし、Ｇ４１８耐性コロニーの％として遺伝子導
入効率を計算した。
【００８６】１０．２．結果 上清感染による未発達の造血細胞の形質導入（図１０参
照）は、ヘパリン結合部位（ＨＢＳ）および少なくとも
さらに１つの有効な細胞付着部位を含むすべてのフラグ
メントにつき、ＢＳＡ上での上清感染より有意に高かっ
た（中実の棒）。組換えフラグメントＣＨ−２７１、Ｈ
−２９６、ＣＨ−２９６およびＣ−ＣＳ１の形質導入効
率は、ＦＮ３０／３５、ヘパリン結合部位およびＣＳ−
１部位の両方を含む３フラグメントすべての作用と類似
していた。他のすべての場合、形質導入は著しく低下し
た。これらのデータは、先にＦＮ３０／３５につき示し
た未発達の造血細胞の形質導入増大を組換えＦＮフラグ
メントについて再現しうることを証明する。それはさら
に、フィブロネクチンに直接に結合したウイルスが造血
細胞の遺伝子形質導入を行いうることを証明する。最後
にそれは、ＣＳ−１とヘパリン結合部位の両方が存在す
ることが未発達の造血前駆（幹）細胞の形質導入に有用
であることを確認する。
照）は、ヘパリン結合部位（ＨＢＳ）および少なくとも
さらに１つの有効な細胞付着部位を含むすべてのフラグ
メントにつき、ＢＳＡ上での上清感染より有意に高かっ
た（中実の棒）。組換えフラグメントＣＨ−２７１、Ｈ
−２９６、ＣＨ−２９６およびＣ−ＣＳ１の形質導入効
率は、ＦＮ３０／３５、ヘパリン結合部位およびＣＳ−
１部位の両方を含む３フラグメントすべての作用と類似
していた。他のすべての場合、形質導入は著しく低下し
た。これらのデータは、先にＦＮ３０／３５につき示し
た未発達の造血細胞の形質導入増大を組換えＦＮフラグ
メントについて再現しうることを証明する。それはさら
に、フィブロネクチンに直接に結合したウイルスが造血
細胞の遺伝子形質導入を行いうることを証明する。最後
にそれは、ＣＳ−１とヘパリン結合部位の両方が存在す
ることが未発達の造血前駆（幹）細胞の形質導入に有用
であることを確認する。
【００８７】実施例１１ 組換えフィブロネクチンフラ
グメント上でのネズミドナー細胞の形質導入を利用した
マウスの長期骨髄再構成 １１．１．実験 未発達の造血前駆細胞についての前記のインビトロ実験
（実施例１０から）を、ＢＳＡまたはＦＮ３０／３５ま
たは組換えＦＮフラグメント上での上清感染と同時培養
とを対比しながら、骨髄移植を用いて反復し、造血幹細
胞の再構成に対する影響を分析した。以下に要約する：
致死量照射したマウスに、ヒトＡＤＡｃＤＮＡを含むＥ
ＰＨＡ−５ベクターを形質導入したドナー細胞を注射し
た。１カ月後に末梢血からＡＤＡアイソザイム分析によ
り遺伝子導入効率を分析した。
グメント上でのネズミドナー細胞の形質導入を利用した
マウスの長期骨髄再構成 １１．１．実験 未発達の造血前駆細胞についての前記のインビトロ実験
（実施例１０から）を、ＢＳＡまたはＦＮ３０／３５ま
たは組換えＦＮフラグメント上での上清感染と同時培養
とを対比しながら、骨髄移植を用いて反復し、造血幹細
胞の再構成に対する影響を分析した。以下に要約する：
致死量照射したマウスに、ヒトＡＤＡｃＤＮＡを含むＥ
ＰＨＡ−５ベクターを形質導入したドナー細胞を注射し
た。１カ月後に末梢血からＡＤＡアイソザイム分析によ
り遺伝子導入効率を分析した。
【００８８】１１．２．結果 図１１は、ヘパリン結合部位とＣＳ−１の両方を含むフ
ィブロネクチンフラグメントＨ−２９６がＦＮ３０／３
５および同時培養と類似の結果を与えることを明瞭に示
す。これらの部位を両方を含むものでないフラグメント
は移植可能な造血細胞の形質導入における有効性がより
低い。これらのデータは、未発達の造血／幹細胞と、Ｃ
Ｓ−１およびヘパリン結合部位の両方を含む組換えＦＮ
フラグメントに結合したレトロウイルスとの同時局在に
よって、移植可能な造血細胞が効果的に形質導入される
ことを証明する。
ィブロネクチンフラグメントＨ−２９６がＦＮ３０／３
５および同時培養と類似の結果を与えることを明瞭に示
す。これらの部位を両方を含むものでないフラグメント
は移植可能な造血細胞の形質導入における有効性がより
低い。これらのデータは、未発達の造血／幹細胞と、Ｃ
Ｓ−１およびヘパリン結合部位の両方を含む組換えＦＮ
フラグメントに結合したレトロウイルスとの同時局在に
よって、移植可能な造血細胞が効果的に形質導入される
ことを証明する。
【００８９】以上の記載において本発明を詳細に説明お
よび記述したが、これは説明のためのものであって限定
する性質のものではないと考えるべきであり、好ましい
態様を記載したものであって、本発明の精神に包含され
る変更および修正はすべて保護されることを望むと解す
べきである。
よび記述したが、これは説明のためのものであって限定
する性質のものではないと考えるべきであり、好ましい
態様を記載したものであって、本発明の精神に包含され
る変更および修正はすべて保護されることを望むと解す
べきである。
【００９０】本明細書に引用した刊行物はすべて、それ
らが個々に引用されて完全に提示されたと同様に、それ
らの全体が参考として本明細書に含まれるものとする。
らが個々に引用されて完全に提示されたと同様に、それ
らの全体が参考として本明細書に含まれるものとする。
【図１】図１は、キモトリプチックフラグメントを含む
フィブロネクチン分子の模式図である。
フィブロネクチン分子の模式図である。
【図２】図２は、フィブロネクチンフラグメントの存在
下でＴＫＮＥＯベクターを用いたコミッティッド（ｃｏ
ｍｍｉｔｔｅｄ）ヒト前駆細胞の感染効率を示す；実施
例１に詳細に記載する。
下でＴＫＮＥＯベクターを用いたコミッティッド（ｃｏ
ｍｍｉｔｔｅｄ）ヒト前駆細胞の感染効率を示す；実施
例１に詳細に記載する。
【図３】図３は、フィブロネクチンまたはそのフラグメ
ントの存在下でＴＫＮＥＯベクターを用いた種々のコミ
ッティッドヒト造血前駆細胞の感染効率を示す；実施例
１に詳細に記載する。
ントの存在下でＴＫＮＥＯベクターを用いた種々のコミ
ッティッドヒト造血前駆細胞の感染効率を示す；実施例
１に詳細に記載する。
【図４】図４は、下記の方法で形質導入された骨髄細胞
を移植したマウスにおけるｈＡＤＡの存在を比較する：
（ｉ）同時培養法（２−４列）、（ｉｉ）固定化フィブ
ロネクチンフラグメントの存在下での上清感染（５−７
列）、およびＢＳＡ上での上清感染（８−１０列）；実
施例７に詳細に記載する。ｈＡＤＡに関する対照を１お
よび１２列に、ネズミＡＤＡに関する対照を１１列に示
す。
を移植したマウスにおけるｈＡＤＡの存在を比較する：
（ｉ）同時培養法（２−４列）、（ｉｉ）固定化フィブ
ロネクチンフラグメントの存在下での上清感染（５−７
列）、およびＢＳＡ上での上清感染（８−１０列）；実
施例７に詳細に記載する。ｈＡＤＡに関する対照を１お
よび１２列に、ネズミＡＤＡに関する対照を１１列に示
す。
【図５】図５は、フィブロネクチンフラグメントに対す
るレトロウイルスの結合を示す;実施例８に詳細に記載
する。
るレトロウイルスの結合を示す;実施例８に詳細に記載
する。
【図６】図６は、フィブロネクチンフラグメントに対す
るレトロウイルスの結合が用量依存性であることを示
す；実施例８に詳細に記載する。
るレトロウイルスの結合が用量依存性であることを示
す；実施例８に詳細に記載する。
【図７】図７は、実施例９−１１で用いた種々の組換え
フィブロネクチンフラグメントを示す模式図である。
フィブロネクチンフラグメントを示す模式図である。
【図８】図８は、種々の組換えフィブロネクチンフラグ
メント（幾つかの組換えフラグメントを含む）へのレト
ロウイルスの結合を示す；実施例９に記載する。
メント（幾つかの組換えフラグメントを含む）へのレト
ロウイルスの結合を示す；実施例９に記載する。
【図９】図９は、ヘパリンがフィブロネクチンフラグメ
ントへのレトロウイルスの結合を遮断することを示す；
実施例９に記載する。
ントへのレトロウイルスの結合を遮断することを示す；
実施例９に記載する。
【図１０】図１０は、種々の組換えフィブロネクチンフ
ラグメントの存在下でのネズミ造血細胞のレトロウイル
ス感染効率を示す；実施例１０に詳細に報告する。
ラグメントの存在下でのネズミ造血細胞のレトロウイル
ス感染効率を示す；実施例１０に詳細に報告する。
【図１１】図１１は、下記の方法で形質導入された骨髄
細胞を移植したマウスにおけるｈＡＤＡの存在を比較す
る：（ｉ）同時培養法、（ｉｉ）種々のフィブロネクチ
ンフラグメント上での上清感染、および（ｉｉｉ）ＢＳ
Ａ上での上清感染；実施例１１に記載する。
細胞を移植したマウスにおけるｈＡＤＡの存在を比較す
る：（ｉ）同時培養法、（ｉｉ）種々のフィブロネクチ
ンフラグメント上での上清感染、および（ｉｉｉ）ＢＳ
Ａ上での上清感染；実施例１１に記載する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ０７Ｋ 14/435 Ａ６１Ｋ 37/02 19/00 37/24 (72)発明者 ウィリアムズ，デヴィッド・エイ アメリカ合衆国インディアナ州46278，イ ンディアナポリス，ノース・ムーア・ロー ド 8751 (72)発明者 パテル，ヴィクラム・ピー アメリカ合衆国メリーランド州20876，ジ ャーマンタウン，セプター・リッジ・テラ ス 11117
Claims (10)
- 【請求項１】予め定められた標的細胞へのレトロウイル
ス仲介によるＤＮＡ導入を増強するのに有用な構築体を
形成する方法であって、 標的細胞に特異的に結合するリガンドを選択し；そして
該リガンドを、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩドメ
インがもつレトロウイルス結合活性を示すアミノ酸配列
を含むポリペプチドに共有結合させることを含む方法。 - 【請求項２】リガンドが細胞付着性のタンパク質、ホル
モン、サイトカイン、モノクローナル抗体、炭水化物、
代謝産物、またはフィブロネクチン以外のタンパク質に
由来するポリペプチドである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】標的細胞が悪性細胞であり、かつリガンド
がホルモンである、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】標的細胞が乳がん細胞であり、かつリガン
ドが黄体形成ホルモン放出ホルモン、エストロゲン、プ
ロゲストーゲンまたはアンチプロゲストーゲンである、
請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】レトロウイルスによる生存可能な標的細胞
集団の形質導入頻度を増大させる方法であって、有効な
固定化された量の、レトロウイルスを結合するポリペプ
チドに共有結合した細胞に特異的に結合するリガンドを
有する構築体の存在下で、細胞にレトロウイルスを感染
させることを含み、該ポリペプチドがフィブロネクチン
のヘパリン−ＩＩドメインがもつレトロウイルス結合活
性を示すアミノ酸配列を含むものである方法。 - 【請求項６】リガンドが細胞付着性のタンパク質、ホル
モン、サイトカイン、モノクローナル抗体、炭水化物、
代謝産物、またはフィブロネクチン以外のタンパク質に
由来するポリペプチドである、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】ポリペプチドが下記を有する組換えポリペ
プチドである、請求項５に記載の方法： 次式で表されるアミノ酸配列： 【化１】 またはレトロウイルスの結合能を示すのに十分なほどこ
れと類似するアミノ酸配列。 - 【請求項８】予め定められた標的細胞へのレトロウイル
ス仲介による遺伝子導入を増強するための構築体であっ
て、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩドメインがもつ
レトロウイルス結合活性を示すアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドに共有結合した標的細胞に特異的に結合するリ
ガンドを含む構築体。 - 【請求項９】ポリペプチドが下記を有する組換えポリペ
プチドである、請求項８に記載の構築体： 次式で表されるアミノ酸配列： 【化２】 またはレトロウイルスの結合能を示すのに十分なほどこ
れと類似するアミノ酸配列。 - 【請求項１０】リガンドが細胞付着性のタンパク質、ホ
ルモン、サイトカイン、モノクローナル抗体、炭水化
物、代謝産物、またはフィブロネクチン以外のタンパク
質に由来するポリペプチドである、請求項８に記載の構
築体。
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