TWI230735B - Control of the T7 expression system by heat - Google Patents

Description

1230735 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種以熱誘導控制大腸桿菌中基因表 達載體（expression vector)的方法，更明確的是，本發明 是一種以熱誘導方式來控制T7表達系統的控制方法，此 方法進一步含有區段式進料的饋料批次發酵策略，以達 到大量生產重組蛋白質的目的。 【先前技術】 發明背景 以生物細胞來生產具有商業價值或醫療用途的重組 蛋白質（recombinant proteins)可謂是一項極為重要且〜 具經濟前瞻性的生技產業。大體而言，可用來作為蛋白· 質生產的生物細胞包括微生物、昆蟲、動物和植物細胞 等，其中又以利用微生物細胞來生產重組蛋白質的方法 較具經濟競爭力，其原因在於微生物細胞較易大量培丨 養、生長快速和培養所需營養基質配方簡單且價格低 廉。過去數十年來，由於許多的科學研究均以大腸桿菌 (Escherichia coli)作為核心主題，學術界因此累積了 龐大且詳盡的攸關此菌種之生化相關知識，無疑的，發 展大知桿麵以製造重組蛋白質的生產系統相對的也較使 用其他生物細胞發展的系統更為成功。 為期利用生物細胞達到有效生產蛋白質的目的，基 6 1230735 因表達載體（expression vectors)是一項不可或缺的利 器，在大腸桿菌中有許多針對不同需求而發展出來的基 因表達載體（Markides，Microbiol· Rev·，60:512-538， 1996)，其中最為實驗室普遍使用的首推T7表達系統（T7 expression system)。丁7表達系統包含Τ7 RNA聚合酶 (T7 RNA polymerase)和一個含有能被T7 RNA聚合酶 驅動的T7啟動子（T7 promoter)之質體。T7 RNA聚合 酶是嗔菌體（phage) T7基因1 ( T7 gene 1 )的產物， 相較於大腸桿菌的RNA聚合酶，它對於選殖基因（cloned gene)具有極為優越的轉錄（transcription)能力（Colomb and Chamberlin, J. Biol. Chem_，249:2858-2863, 1974)，再則它對於T7啟動子特具專一性（Tabor and ^ Richardson，Proc. Natl. Acad. Sci· USA, 82:1074-1078，^ 1985)，基於T7 RNA聚合酶的專一選擇性和優越轉錄 能力，Studier 等人（Studier and Moffatt，丄 Mol· Biol· 189:113-130, 1986; Studier et al., U. S. patent 4,952,496，1990)首先據此發展T7表達系統。此系統 包含一株重組菌種BL21(DE3)和一個含有T7啟動子的 基因表達質體，而重組菌種BL21(DE3)的染色體上則含 有一個以lacUV5啟動子控制的T7基因1。 在T7表達系統中，雖然加入化學物質以誘導生產目 標蛋白質的方法極為簡單和容易操作，然而加入的化學 物質價格昂貴，且會污染發酵母液，不利於生產具醫療 !23〇735 功用的蛋白質’而且無法達到均勾誘導每—細胞。 一種習知技術係以化學物質 （|PTG)為誘導物，使菌種可以 ^的重組蛋白f，然而，—個可作為卫業規模生 蛋白貝的基因表達質體需具有幾項要件 發酵時使用簡單且經濟的誘導方式、高基因表達能$ 因此’以丨PTG為誘導方式的T7表達系統顯然 …、2到工業化使用之目的，其原因為⑴丨ptg的價 才。昂貝’（2 ) IPTG不被細菌細胞代謝，而容易造成發酵 液的污染而使得發酵產品純化不易，（3)丨pTG具有潛在 的毒性，因此不適用在生產醫療用的產品（Figgeeta|

Celi，52:713_722, ] 988 ) ’（ 4 )由於丨pTG 需藉由細菌細 胞的lacY蛋白質以主動運輸方式來輸送至細胞内，因此 =用非飽和量的丨PTG來誘導，必導致被誘導的細胞群中 含有已誘導和非誘導的細胞族群，此種非均勻狀態造成 發酵的菌種產生不穩定性，並且難以達到精微調控菌種 的基因表達程度之目的，（5)由於lacUV5啟動子的調 控性不夠嚴謹而導致菌種BL21(DE3)在非誘導情況下即 產生微量的T7 RNA聚合酶，造成選殖在質體上以丁7啟 動子控制表達的目標基因產物因而產生’尤其是目標基 因產物對於宿主細胞具有潛在毒性時，細胞的生長將會 受到抑制’進而使得含目標基因的質體產生不穩定的現 象（Studier et a丨.，Methods in Enzymology，185:60-89， 1230735 测）’這些缺點顯然、限制了 了7表達系、统的工業實用性。 【發明内容】 發明概述 過去的研究發現，重組菌種在其染色體帽含有一 個以lacUV5啟動子控制的T7基因】，在加人|pTG後， 選殖在T7啟動子下的目標基因即可在此重組菌種中誘 導表達❿達到大里生產重組蛋白質的目標。然而加入 ㈣學物質價格昂貴’且會污染發酵母液，不利於生產 /、西療功用的蛋白質’而且無法達到均勻誘導每一細 胞。再則’由於低嚴謹調控性# |acUV5啟動子，使得 重組菌種即便在非誘導狀況下也能合成微量的T7 RNA ‘ =合酶’以致含有潛在毒性基因的f體難以在重組菌種. 中私疋存在，這些缺點顯然限制了 丁7表達系統的工業實 用性，因此本發明特別以熱誘導方式應用在控制丁7表達 ^ ^〜凡丨穴一種以熱誘導方式控 =桿菌中的Τ 7表達系統，以便改善了 7表達系統並 其具有工業實用性。 /本發明的另—目的，係運用熱誘導方式來控制Τ7 達糸統’並進一步以區段式進料發酵策略，以 種大量生產重組蛋白質。 本發明係建構-株能以熱誘導生產丁7嶋聚合 1230735 的重組菌種BL21(G2)，此菌種的染色體上箝含有以 lambda Pl和Pr雙啟動子控制的T7基因1和cl857抑 制基因（repressor gene)。基本上，在高溫狀態下cl857 抑制蛋白質失去活性，導致lambda pL和Pr雙啟動子活 化啟動，使T7基因1產生T7 RNA聚合酶，促使T7啟 動子驅動表達該選殖基因，而產生該重組蛋白質，因此 選殖在T7啟動子下游的目標基因之表達自然為熱誘導 所控制。 在本發明的一種較佳實施例中，以生產 Agrobacterium radiobacter NRRL B11291 的 carbamoylase蛋白質為例，培養溫度在30 °C時， carbamoylase在菌種BL21(G2)中幾乎沒有生成，然而‘ 溫度由30°C提昇至33°C時，菌種BL21(G2)即生產可量、 測到酵素活性的carbamoylase，將溫提昇至39°C時，只 需5-10分鐘菌種BL21(G2)即可生產達20%總細胞蛋白 質量的carbamoylase，這個結果顯示本發明發展的系統 具有工業發酵生產重組蛋白質的潛能。以高細胞密度饋 料批次發酵並施以溫度誘導，菌種BL21(G2)可以生產多 出以搖瓶發酵生產所得蛋白質18 χ 1〇6倍以上的量。 本發明發展的系統具有以下多項優點： (1)可以熱誘導方式來生產重組蛋白質，此種物理誘 導方式兼具簡單和經濟競爭性，不造成發酵液污染，尚 1230735 且可以不同溫度來精微調控菌種的基因表達程度。 (2) 由於選擇使用的噬菌體丨ambda PL和PR雙啟動 子具有較高強度，使得重組菌種對於溫度特具高敏感 性，例如菌種極易為溫度（如33°C )所誘導生產選殖蛋 白質，而以較高溫度（如39t )誘導時則只需數分鐘誘 導時間重組菌種即可累積生產最大量的蛋白質。 (3) 本發明菌種可以維持含carbamoylase基因質體 100%穩定度達60細胞世代（generatj〇ns )，相對的菌種 BL21(DE3)只可維持相同的質體穩定度僅達2〇細胞世代 (Chao et al·，Biotechnol_ pr〇g·，18:394-400,（2002))。 (4) 本發明菌種可以工業級發酵槽放大培養至高細胞 密度，溫度誘導後可產生高出實驗室發酵槽規模900倍 和搖瓶規模1 _8 X 1 〇6倍的重組蛋白質，而發酵終止後的 質體穩定性達96%，由此顯示本發明所建構的菌種 BL21(G2)具有工業實用性。 【實施方式】 發明之詳細說明 本發明以熱誘導方式來控制T7表達系統的控制方 法，包含以下步驟： 11 1230735 建構一株重組菌種，該重組菌種含有一個内含T7啟 動子的質體，且該重組菌種的染色體上箝含有以lambda Pl和PR雙啟動子控制的T7基因1(T7 gene 1 )和cl857 抑制基因（repressor gene); 以饋料批次發酵方法培養該重組菌種，並在進料階段開 始後疋時間内，提供加熱誘導方式，使該重組菌種產 生一重組蛋白質。 本發明的控制方法，進一步地包含：以熱誘導建構 出的重組菌種BL21(G2)，進行異源蛋白質（heterol0gOUS籲 protein)搖瓶規模的生產，而在此處選擇生產異源蛋白 質係作為檢測模式。 以下伴隨著相關圖示並經由圖例說明本發明的原. 理而洋細揭露本發明的其他方面和優點。 t 貝靶例（一）、建構重組菌種BL21(G2) ㈣ίΐ發展以熱誘導方式來控制T7表達线，首先將 ，構—株重組菌種使其染色體上箝含有一個以 C瞭抑=啟因動子難的了7基因1和—個熱敏感性的 A_T7基01的選殖操作·

DH5 a (deoR ()基口選殖使用的菌種和搖瓶培養方式 基因選殖過程中均採用大腸桿菌 12 1230735 endA1 gyr96 hsdR17 supE444 thi △(lacIZYA-argF 169)「ecA1 lacZM15)，液態培養菌種時，首先由固態培 養亚中點取數顆菌落至含營養基值的搖瓶中，在30°C、 每分鐘200轉條件的水浴旋轉培養槽中培養過夜，隔曰 以百倍稀釋的體積取出菌液並接種至含新鮮營養基質的 搖瓶中，依相同培養條件繼續培養。營養基質的成分視 需求而定，在本例中採用Luria-Bertani (LB)營養基在下 培養。而抗生素也視需要而決定是否加入培養基中，在 本例中則加入抗生素安培西林（ampicillin )，使用量為 0_1 mg/mL 〇 (2) T7基因1的選殖 根據T7基因1的發表序列（Grachev and Pletnev，‘ Bioorg· Chem_，10:824_843,1984)，我們設計一組涵蓋 T7基因1編碼區（coding region )但排除啟動子區域的 募 核苷酸 ， 其序列 如下-GAGGATCCTTAACATCGCTAAGAACG 和 TAAGCTTTGGCGTTACGCGAAC，並委由 GENSET Singapore Biotech公司合成。相關選殖技術均參照 Maniatis et al·， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ν·Υ· (1982)—書。以含 T7 基因 1 的質體 pMR-7wt ( Mallet et al.，Gene, 199:149-156，1997)為 13 1230735 DNA樣版（DNA template)，依照一反應條件使用PCR (polymerase chain reaction,聚合酉連鎖反應）反應來 擴增製造2·7 kb的T7基因1 DNA產物，其中此反應 條件係為：50// L反應溶液中包含樣板DNA(10 ng/mL)、 2·5活性單元Pfu聚合酶、一對寡核苷酸（oligonucleotide) (0.5 // Μ)和四種核苦酸（200 // Μ)。首先將反應溶液加熱 至94°C 3分鐘，隨後以底下條件重複28循環：以94 °C加熱1分鐘、55°C4分鐘、72°C 1分鐘，所有循環結束 後再以72°C維持加熱10分鐘。 隨後將PCR產物以核苷酸純化組（NuceloSpin Nucleic Acid Purification Kit，Clontech Lab_，Inc·)純 化，並利用BamHI、HindiII限制酵素切割和再純化，最 後使用T4 DNA枯接酶（T4 DNAIigase)將DNA產物粘 接至質體pBluescript (Strategene，CA)中。接著使用 EcoRI、Xhol限制酵素把含有T7基因1的DNA片段切 下回收，再粘接至質體 pND707(Elvin et al_，Gene，87:123-126,(1990))中得到質體 pND-G1-2。選 殖在質體pND-GI-2上的T7基因1則位於lambda PL和 Pr雙啟動子下游，而接鄰在雙啟動子的上游區則含有 CI857抑制基因。 B·選殖基因片段鑲箝入菌種染色體： (1)嗤菌體P1因子轉移法（P1 transduction) 14 1230735 以内含LB和5 mM氯化鈣營養基的搖瓶培養基因供 給細胞（donor cell)，待細胞生長至OD550 (波長550 nm 吸光度）達0.3時，加入濃度約每毫升108個P1vir噬菌 體分解顆粒（phage lysate)，繼續培養直至細胞完全分 > 解為止，將分解液回收並加入0.1 mL的氣仿，以4500 g 離心10分鐘並回收上層液。另一方面，以内含LB營養 基的搖瓶過夜培養基因接收細胞（recipient cell)，以 15000 g離心十分鐘回收細胞，隨即以2_5 mL濃度為10 mM的硫酸鎂和5 mM氯化鈣重新溶解回收細胞。取出 ® 0.1 m L的菌液放入試管中，並加入等量體積的分解液， 在37°C下反應30分鐘，最後加入0.1 mL濃度為1 Μ的 檸檬酸鈉，由試管中取出0.1 mL的混合液灑養在篩選培‘ 養基上。 · (2)重組菌種建構 為了將選殖基因片段鑲箝入菌種染色體中，隨即由 | 質體pND-G1-2將含有位於lambda PL和Pr啟動子下 游的T7基因1和上游區的CI857抑制基因之DNA片段 以Pst卜Xhol限制酵素切除並回收，最後插接入質體 pBRINT-Km (Baibas et al_，Gene, 172:65-69，1996)所 含的lacZ基因當中得到質體pBRINT-G1。接著把質體 pBRINT-G2轉殖入以氯化飼處理的菌種 JC7623 (recB21 recC22 sbcB15 sbcC201 )(Oden et al., Gene, 15 1230735 96:29-36，1990)中，其質體轉殖程序乃採用氯化鈣製備 升任細胞 （competent cell)法，相關技術主要參照 Maniatis et al·， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，Ν·Υ· (1982)—書。 利用丨acZ同源基因重組（homologous recombination ) 方式將質體上的基因箝入菌種染色體 中，轉植後的菌種隨即灑養在含〇·〇1 mg/mL卡那黴素 (kanamycin)和 0.004% 5-bromo-4-chloro_3-indolyl -β二 D-galacto-pyranoside(X-gal)的洋菜培養基上。其中 一個呈現白色的菌落以搖瓶培養作為嗟菌體p 1因子轉 移法的基因供給細胞’依據B的弟（1)項方法製備分解液 並感染基因接收細胞大腸桿菌B L21，經基因轉移後的細 胞則灑養在含0.01 mg/mL卡那黴和〇 004% X ga丨的洋 采培養基上’選擇一株顯現白色的細胞再利用p C R方法 來檢視其染色體上是否含有T7基因1，如此得到的菌種 便命名為BL21(G2)。 貫施例（二）、以菌種BL21(G2)進行搖瓶規模的檢測模 式 松驗重組囷種BL21 (G2)產生異源重組蛋白質的可 行性’在此我們選擇生產carbamoy|ase為檢測模式。生 產異源蛋白質（heterologous protein)最大的挑戰莫過 16 1230735 於該蛋白質易形成内涵體（inclusion body)和具有毒害 細胞的特性，而carbamoylase來自A. radiobacter是屬 於異源蛋白質，況且極易形成内涵體和潛在毒性，因此 以此蛋白質作為生產模式正足以對本發明建構的系統提 供最嚴苛的檢測方式。 A.培養方法： 與建構重組菌種BL21(G2)中A項培養方法相同，使 用搖瓶來培養菌種。 B· Carbamoylase酵素活性分析：

Carbamoylase酵素活性分析主要依據過去已發表、 的方法（Chao et al·，Biotechnol. Prog., 15:603-607, 1999)，而一個單位酵素活性（U)定義為每分鐘一毫莫 耳產物生成，比酵素活性單位為U/mg乾重細胞，體積酵 素活性則以測得的比酵素活性與獲得的細胞濃度之乘積⑩ 所得，單位為U/mL。 C.蛋白質電泳膠分析： 主要依據過去發表的方法（〇113〇311〇11^〇，丄61〇1· Chem_，269:5122-5126，1994)操作，將離心收集到的 細胞用法式細胞粉碎機（French Press)打破，以15000 g離心5分鐘後回收上層液，使用Bradford分析法 17 1230735 (Bio-Rad)量測蛋白質濃度，將20 mg的蛋白質樣本逐一 置入電泳膠中。 D.熱誘導生產重組蛋白質之特性： 將含有以T7啟動子調控carbamoylase基因表達的 質體 pTAHLI 0 (Chao et al·，Appl· Microbiol. Biotechnol_， 54:348_353 (2000))和含有以T7啟動子調控groELS基 因表達的質體 pT-GroE (Yasukawa et al_，J· Biol. Chem·， 270:25328-25331 (1995))同時轉殖到菌種 BL21(G2)鲁 中，得到重組菌種 BL21(G2)/pTAHL10/pT-GroE。在 30 °C條件下以搖瓶培養重組菌，待細胞生長至〇D550達0.5 時，將培養溫度提昇至33、35、37、39和40°C，隨後、 繼續培養細胞至停滯生長時期，以15000 g離心10分鐘-回收細胞並測定酵素活性，結果整理在表一。 相較於非誘導菌種而言，carbamoylase的生產量隨 著高溫度而增加，而其中以3rc誘導時得到最大可溶性鲁 蛋白質。在非誘導情況下，重組蛋白質的產量幾乎無法 偵測到’但在33°C下即可產生可量測的蛋白質量。這些 結果顯示’本發明發展的系統確可利用熱誘導方式來生 產重組蛋白質，而且頗具溫度敏感性。 由表一中可發現，當溫度過高如超過39°C蛋白質的 產量反而大量減少，經由蛋白質電泳分析判斷，這是因 為多數誘導生產的蛋白質聚集形成不可溶性的内涵體所 18 1230735 致。另一方面，過量生產的carbam〇y|ase足以嚴重抑制 月^的生長，而這個情況也隨著誘導溫度的增加益形嚴 重。顯然低溫可以減緩内涵體的形成，因此若以高溫誘 v生產蛋白貝，熱誘導一段時間後再將溫度降回細胞最 適生長溫度如37。(：，此種所謂「二階段溫度誘導」方式 ，期將有助於生產更大量可溶性蛋白f。基於此，重組 菌種 BL21(G2)/pTAHL1〇/pT-GroE 以搖瓶在 3CTC 條件 下培養，同D項方式將培養溫度提高至39χ：，1〇分鐘 後再將溫度降至37t:，結果可得到酵素比活性達〇.16 # _g乾重細胞的蛋白質量，與單以3rc誘導所得的酵 素活f生比較則增加30%。表二列出在39。〇誘導時間之長 短對於重組蛋白質產量的影響，由此可發現蛋白質最大、 產量發生在誘導時間介於]㈣分鐘之範圍，有趣的是， $僅5分鐘的誘導時間即可生產出相當於70%最大蛋白 質生產量的蛋白質。參考圖—的蛋白質電泳分析，其中 徑1 :蛋白質標準物’·徑2 :未經誘導；徑3 ··熱誘導5 分鐘；徑4:熱誘導10分鐘；徑5:熱誘導2〇分鐘·.鲁 徑6:熱誘導3〇分鐘；徑7:熱誘導45分鐘；徑8 . ’赦 誘導60分鐘。 …、 ， 以蛋白質電泳分析並佐以影像分 · (GAS9000，UVltech，UK)可定量出最大可溶性蛋白質旦 達到總細胞蛋白質量的20%，這些結果顯示本發曰=展 的表達系統具有優越的蛋白質生產效能和短暫熱誘導時 19 1230735 間即可累積生產重組蛋白質之特性。 E·重組菌種質體穩定度測試： 重組菌種 BL21(G2)/PTAHL10/PT_Gr〇E 以 LB 未人 抗生，為營養基質，使用内I 2Q mL基質之搖瓶在:。 C、每分鐘200轉條件下培養過夜，取出〇 2机菌广 接種至另-個含有20 mL新鮮基f之搖瓶，依相同條: 繼續培養至隔日，即完成一個培養循環。在每一培養循 環終止時，取出0J mL樣本並注入含彳mL的無^生= 食鹽水的試管中，如此經過一系列連續稀釋後，取出0J mL樣本灑養在洋菜培養基，於3〇t：下培養16小時後， 再挑選100顆菌落分別點劃在一個洋菜培養基和另一個 含抗生素的洋菜培洋基上，於3(rc下培養16小時後， 估計每一個培養基生成的菌落數，而質體穩定度即定義 成在❺有抗生素的洋菜培洋基上之菌落數狳以在洋菜培 養基形成之菌落數。相同培養循環則依需要持續進行到 終止，而每一培養循環估計約經過1〇個細胞世代。同樣 的’我們將質體pTAHLIO和pT-GroE同時轉殖到過去 發明所發展的菌種BL21(DE3)中得到重組菌 BL21 (DE3)/pTAHL10/pT_Gr〇E，並依照上述方式測試 種BL21(DE3)對於質體的穩定性。 結果顯示，在所測試的營養基質中菌種BL21(G2) 以維持100%的質體穩定度達6〇細胞世代，而菌 20 1230735 BL21(DE3)在相同的情況下只維持彳齡的質體穩定度 達20細胞世代，由此可知本發明發展之菌_ bl2i_ 具有極高的質體穩定性。 貫施例（二）、以熱誘導控制T7表達系統來生產實 驗室發酵槽規模的重組蛋白質。 一個基因表達系統的實雜決定在放大規模時仍具 可行f生基於此，我們以饋料批次發酵法來檢測本發明 發展的菌種之潛在實用性。 A·菌種培養和營養基質配方： 採用5 L實驗室規模的發酵槽（m〇stat，Β·以如门， Germany)作為放大規模菌種的培養。發酵槽操作的條件 又疋在30C ΡΗ?·0、溶氧度為15%的飽和溶氧度。先 期以搖瓶培養300 mL的菌種作為接種菌（實施例（一）Α 2 )而言養基貝的組成份為每升溶液含3 g鱗酸鉀、6卩 磷酸化二鈉、1 g氯化氨、〇 248 g硫酸鎂、〇1 g硫化 鐵、11_1 mg氯化鈣、〇 03 mg維他命B1、2 g酵母萃 取和5g葡萄糖，待細胞培養至〇〇55〇達）時，將所有 ί液接種至含1·5 L營養基的發酵槽中，而發酵槽中培 養基成分為每升溶液含6_25g磷酸鉀、28.75 g磷酸化 钟3·75 g氣化氣、〇·2 g硫酸鎮、〇 1 75 g硫化鐵、 0 09 9氯化鈣、〇_〇65 g維他命B1、5 g酵母萃取和 21 1230735 16 5 _ g葡萄糖。當細胞在批次發酵階段生長進入停滯生 長功，1 L的進料液隨即依據事先決定的進料流量使用幫 =打入發酵槽中，進料流量的預估則採用對數進料法計 # 而來（Korz et al·，J· Biotechnol·，39:59-65 (1995))， =進料液的營養基質成分為每升溶液含60氯化氨、9g ，酸鎂、〇.146g硫化鐵、2〇 g酵母萃取和i5〇g葡 气糖在整個發酵過程中所使用的培養液均排除使用抗 生素。 B_酵素活性測定： 酵素活性分析主要依據過去已發表的方法（chao al·，Biotechnol. prog·，15:6〇3_6〇7, 1999)，而一個單位 酵素活性（U)定義為每分鐘一毫莫耳產物生成，比酵素 活性單位為U/mg乾重細胞，體積酵素活性則以測得的比 酵素活性與獲得的細胞濃度之乘積所得，單位為u/mL。 c·蛋白質電泳膠分析： 主要依據過去發表的方法（Chao and Liao, J. Biol Chem·，269:5122_5126, 1994)操作，將離心收集到的 細胞用法式細胞粉碎機（FrenchPress)打破，以15〇〇〇 g離心5分鐘後回收上層液，使用Bradf〇rd分析法 (Bio-Rad)量測蛋白質濃度，將2〇 mg的蛋白質樣本逐一 置入電泳膠中。 22 1230735 D_高細胞密度發酵生產大量重組蛋白質： 依據A項方式培養重組菌種 B L21 (G2 )/pTA H L10/pT-G ro E ’在進料階段以二階段熱誘 導方式進行誘導，發酵槽培養溫度由逐步上升至 °C，5分鐘後隨即逐步降溫至37χ：，而整個加熱和降溫 過程約計費時15分鐘，如圖二（a)所示，其中圖中箭頭所 示為熱誘導時機，在發酵結束後培養的細胞密度可達 〇D550=9Q，估計約有每升32 4 g乾重細胞生成，而酵 素體積活性達5_83U/mL。另—方面，由蛋白質電泳分析 也顯示誘導後重組蛋白質大量累積，由圖二(b)所示蛋白 質電泳分析圖，其中，徑1 :蛋白質標準物；徑2 : π 誘導時；徑3:熱誘導後3小時；以：熱誘導後6小^ 控5:熱誘導後9小時；整個發酵產生的重

有14,256 U，這個產詈县以妓也士』 〇T 座里疋以搖瓶方式所獲得蛋白質量的 2000么此外纟發酵結束後檢測菌種所含質體 度也達100%。 、 工 實施例（四）、以熱誘導控制Τ7表達系統來 業規模的重組蛋白質。 在工業化量產重組蛋白質時，高 t然的考量’而其成功的關鍵在於1規模發 困種受誘導後能同時獲得高細胞密度 23 1230735

A ·區段式進料法: 饋料批次發酵法是培養高細胞密度最佳的方法，其 基本理論在於利用進料量來控制細胞比生長速率，以使 得菌種無法或是降低製造發酵產物如醋酸等。本發明發 ，的區段式進料法乃將進料區分成丨個區段（丨=，〜门）， 流量 每=進料區段以定流速At分鐘。根據生長率定義 可知程式（1) ’細胞比生長速率定義得到程式（2)，而程式 (1)、（2)可導出程式（3)。程式（3)說明在欲控制的細胞比， 生長速率和生長率條件下，可以計算出每個區段的進料 (1) (2) (3) Y = (Vi Xi - Vi-1 Xi-1)/(F At S) d(Vi Xi)/dt = β (Vi Xi) F = {Vi-1 Xi-1 [exp(//At) - 1]}/(YSAt) F :進料流量（mL/min) S :進料濃度（mg/mL) △t :階段進料時間（min) “：比生長速率（1/min) V :發酵槽體積（mL) 24 1230735 丫 = ΔΧ/AS :生長率（mg/mg ) X :細胞濃度（mg/mL)

Vi-1、Vi :第i區段起始體積和最終體積

Xi-1、Xi :第i區段起始細胞濃度和最終細胞濃度 B.菌種培養和營養基質配方： 採用5000 L工業規模的發酵槽作為放大規模菌種的 培養。發酵槽操作的條件設定在30°C、pH 7.0、溶氧度 15%的飽和溶氧度。先期以搖瓶培養300 mL的菌種作為 接種菌（實例一 A項），待細胞培養至〇D550達1時，將 所有菌液接種至含4 L營養基的發酵槽中，待細胞生長 至〇D550達1時，再接種至含40 L營養基的發酵槽中， 接種過程中使用的營養基質的組成份為每升溶液含3 g 磷酸鉀、6g構酸化二鈉、1g氯化氨、0.248 g硫酸鎂、 〇_1 g硫化鐵、11·1 mg氣化妈、0_03 mg維他命B1、 2g酵母萃取和5g葡萄糖。俟40L發酵的菌種密度達 〇D550為1時，再接種至含2800 L營養基的發酵槽中。 而發酵槽中培養基成分為每升溶液含6.25 g磷酸鉀、 28.75 g構酸化二鉀、3_75 g氯化氨、0_2 g硫酸鎂、 0.175 g硫化鐵、0.09 g氯化鈣、0.065 g維他命B1、 1%酵母萃取和4%葡萄糖。待細胞在批次發酵階段生長 進入停滯生長期，1200 L的進料液隨即依據方程式（3) 決定的進料流量使用幫浦打入發酵槽中，進料流量則以 25 1230735 ^制〇·2 hr 1比生長速率來估算，而進料液的營養基質成 分為每升溶液含6 g氯化氨、9 g硫酸鎂、〇146 g硫 鐵20 g酵母卒取和120 g葡萄糖。在整個發酵過 程中所使用的培養液均排除使用抗生素。 C_酵素活性測定： 酵素活性分析主要依據過去已發表的方法（Cha〇封 乂，Bi〇techno丨· Pr〇g，15:6〇3 6〇7, 1999)，而一個單位 酵素ϋ性（u)定義為每分鐘—毫莫耳產物生成，比酵素 活性單位為U/mg乾重細胞，體積酵素活性則以測得的比 酵素活性與獲得的細胞濃度之乘積所得，單位為山机。 D _高細胞密度發酵生產大量重組蛋白質： 依據B項方式培養重組菌 BL21(G2)/pTAHL1〇/pT_Gr〇E，在進料階段 1 小時或 小時後以加熱方式進行誘導，發酵槽培養溫度由3心 ==至3rc，如圖三⑻(b)所示，其中圖中箭頭所示^ 熱誘W機’在發酵結束後培養的細胞密度分別 〇D55〇=56或65,估計約有每升2〇2或23 4 g乾重知 胞生成’而酵素體積活性分別得到3 2或2請机』 個發酵產生的重組蛋白質總計有1_28X1Q7U，這: 9是〇ΓΓ_Γ方式(實施例(三))所獲得蛋白 疋以搖瓶規模方式所獲得蛋白質量的^ χ 1〇ί 26 1230735 倍。此外發酵結束後檢測_所”體之穩定度也 達96%。這些結果顯示，本發明發展的菌種具有高穩定 性且可放大生產大量的重組蛋白質，具有工業實用價值。 發明功效

么根據本發明所實施以熱誘導方式來控制T7表達系 的技制方法，只需控制溫度高低即可達到誘導生產大 !的重組蛋白質之效能，特具經濟效益。此外，為有效 表用本1明的菌種以達工業量產重組蛋白質之目的，本 ，明發展高細胞密度發酵策略，成功的將重組蛋白質以 規杈大量生產，其產量超出搖瓶規模產量的U X

27 1230735 【圖式簡單說明】 本發明進一步的較佳特徵，係位於申請專利範圍的獨立 項以及其後的實施例說明中，其係參考以下附圖： 圖一、為顯示本發明實施例（二）之蛋白質電泳分析圖。 圖二（a)、為顯示本發明實施例（三）之曲線，係說明重 組菌種BL21(G2)/PTAHL10/PT-GroE依據A項方式培 養’在進料階段以二階段熱誘導方式進行誘導。 σ 圖二（b)、為顯示本發明實施例（三）之蛋白質電泳分析 圖。 圖三（a)、為顯示本發明實施例（四）之曲線，係說明重 組菌種BL21(G2)/pTAHL10/pT-Gr〇E依據B項方式培 養’在進料階段1小時後發酵槽溫度由30°C提升至37 t。 圖二（b)、為顯示本發明實施例（四）之曲線，係說明重 組菌種BL21(G2)/pTAHL10/pT-Gr〇E依據B項方式培 養’在進料階段3小時後發酵槽溫度由30°C提升至37 V。 表一、為不同溫度誘導對於重組蛋白質生產的效應。 表二、為二階段溫度誘導時間對於重組蛋白質生產的效 應。 【主要元件符號說明】 28 表一 溫度（。〇 酵素比活性（U/mg乾重細胞） 30 33 35 37 39 40 無法偵測* 0.018±0.003# 0.070±0.005 0.122±0.007 0.011±0.003 0.011±0.003 1230735 註解：*測得之酵素活性在實驗誤差値範圍內 #實驗數據取自二次獨立的實驗結果 1230735 表二 誘導時間（分鐘） 酵素體積活性（U/mL) 5 0.100±0.007# 10 0.140±0.008 20 0.132±0.005 30 0.082+0.007 45 0.051+0.003 60 0.032+0.003 註解：菌種首先接受39°C誘導，熱誘導時間如表二所列， 隨後將溫度降至37°C直到細胞生長進入停滯生長期。 #實驗數據取自二次獨立的實驗結果

Claims (1)

1. ^30735 的產物即為該重組蛋白質。 7 _ =請ί圍第1項所述之控制方法，其中該細胞所達 到的回您度係每升My g乾重。 8 如申請範圍第1項所述之控制方法，其中在進料階段 所使用的進料方式，係包含區段式進料法。 9 ·如申請範圍第1項所述之控制方法，進一步包含一種 檢测方法，該檢測方法係以小規模提高該重組菌種數 里’以加熱誘導方式產生一異源蛋白質（heterologous Protein) 〇 1 〇 _如申請範圍第9項所述之控制方法，其中該異源蛋 白質易形成内涵體（inclusion body)和具有潛在毒 性’用於檢測該T7表達系統的可行性。

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