TW581682B - Oil adjuvant vaccine - Google Patents

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Α7 Α7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（1 ) 1 ·技術領域 本發明關於一種油性佐劑瘛# ^ θ0 削疫田0更具體言之，本發明 為關於一種具優良佐劑效果另制 果及製劑文定性之w/o/w型油 性佐劑疫苗6 2.背景技術 油性佐劑疫苗長久以來g 求即已知可有效地增強免疫力。 特別是胡氏（Freund，s)佐劑當你用土、工^ 、 w田便用去活化之抗原可以表現 極為優良之免疫增強效果， 炎 果且為動物試驗中廣泛使用之代 表性佐劑。然而，該佐劑因舍如 只J 會5丨起極大之副作用，例如嚴 重之腫脹及肉芽腫，因此只應用在實驗室中。 因此，許多人曾嘗試減少此種副作用以使油性佐劑可 應用於一般用途中。油性佐劑有各種劑型，例如w/0型者 如胡氏佐劑、安全性佳之0/w型及複雜之w/0/w型等。 例如：JP-B-6-81731揭示W/0型油性佐劑，其含無水 甘露醇油酸酯之界面活性劑及液體石蠟之油性成份； WO91/00107(PCT公開之日本專利申請第4_5〇6521號公告） 揭示一種組合可代謝性油脂例如蔬菜油以及不可代謝性油 脂例如礦物油作為油性成份之低黏性W/〇型油性佐劑。 此外，WO90/14837揭示一種含次微米油滴乳液之〇/w 型佐劑之佐劑製劑；另外在EP-A-3 15153揭示0/W型疫苗 佐劑，含有POP-POE嵌段聚合物及醣胜肽作為免疫刺激 劑。 在該種佐劑中，雖然W/0型油性佐劑可表現高免疫增 強效果，但由於製劑之連績油相故易於停留於注射部位。 裝--------訂----1----. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1 311980 581682 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（2 ) 另外亦有不少例子則是為妓 及内兹# 在接種。p位附近發生非感染性腫脹 及肉芽腫，亦有的在接種後 便夹速發生疼痛。因此，此類油 性佐劑作為直接接種在人體 、 遐〈邊樂製劑受到限制。Ο/W型 油性佐劑顯示在注射部位鈿 Π证之輕微局部反應且安全性優良。 然而’由於抗原含於連績相中 只相干因此注射後會在注射部位 快速擴散，而難以發揮完全之效 π王 < 成果，而常需配合特別的免 疫刺激劑。 鑑於上述情形’近年來女客^ .. U千术大夕探纣一種新穎之油性佐劑 W/0/W型油性佐劑。 例如W091/00106揭示一種w/〇/w型複相型乳液，可 在注射入動物體後在體溫下轉變為w/〇型。但此技術仍無 法完全解決一般W/0型油性佐劑所有之問題，如因局部反 應等等問題’其原因是油性佐劑在體内呈w/0型佐劑形 態。 由於W/0/W型油性佐劑為複合型乳液，因此與w/〇 型及0/W型油性佐劑比較，不易維持製劑安定性。因此， 目前期望可以有一種同時具有w/o型展現之優良佐劑性 質以及0/W型之優異安全性之特點的W/0/W型油性佐 劑，但在開發此種可將該兩型特點良好地平衡之油性佐劑 前卻有許多問題點亟待解決。 本發明人等在USP5,814,321揭示一種安全性優良且 製劑安定性佳之W/0型油性佐劑，並將該W/0型疫苗分 散於水相中製備成W/0/W型油性佐劑疫苗。 然而，W/0/W型油性佐劑疫苗在以一般方法製備時因 請 先 閱 讀 背 面 之 注 1½ 填· 寫裝 頁i

I # 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 311980 581682 A7 五、發明說明（3 ) 配方及製備方法，性質將會有極大差異。所產生之問題為 抗原成份有時黏度急速增加，而與w/〇型油性佐劑比較， 較無法安定導入免疫力。 3 ·發明概要； 因此本發明之目的在提供一種可改善製劑之貯存安定 性及注射時部位之局部反應’且具有高免疫力效果的 w/o/w型油性佐劑疫苗。 依據，本發明，提供一種w/0/w型油性佐劑疫苗， 在外水相層含有特定量之具特定分子量聚乙二醇衍生物， 該疫苗具有高製劑安定性、在局部反應等具優異安全性、 及高免疫增強效果。 因此，本發明包括下列各種。 ⑴一種W/〇/W型油性佐劑疫苗，含有由0.5至20重 量％的分子量400至20,000且由下式一 田卜式（I)所不之聚乙二醇衍 生物構成之外水相層， -----------裝 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 訂------U! ch2—ch2- 0·^ 鲈 (I) # 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 式中R1與R2可為相同或不同且各為氫原子或含… 碳原子的烷基及η表示聚合度；及含有生物上 量之抗原内水相層。 男夂 (2)如上述項目（1)之油性佐劑疫苗，其中式（I)所厂、 聚乙二醇衍生物之分子量為1，000至1〇〇〇〇。 所不之 :3)如亡述項目⑴之油性佐劑疫苗，其中外水相層包, 至〇重置％之式（I)所示之聚乙二醇衍生物。 ‘紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格⑽χ 297公爱 311980 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 581682 A7 B7 五、發明說明（4 ) (4) 如上述項目（1)之油性佐劑疫苗，係由室溫下為液態 之油脂成份（A)、乳化劑（B)、及含生物性容許之有效劑量 之抗原之水相成份（C)製成之W/0型乳液分散或乳化於含 乳化劑（D)及水性成份（E)之液體中而製備之W/0/W型油 相佐劑疫茼，其中液體含0.5至20重量％之式（I)所示分子 量為400至20,000的聚乙二醇衍生物。 (5) 如上述項目（1)之油性佐劑疫苗，係由含室溫下為液 態之油脂成份（A)、乳化劑（B)及含生物性容許的有效劑量 之抗原的水相成份（C)製成之W/0型乳液分散或乳化於含 乳化劑（D)及水性成份（E)之液體中，於外水相中再添加式 (I)所示之分子量為400至20,000之聚乙二醇衍生物成〇5 至20重量％濃度而製備之W/0/W型油相佐劑疫苗。 (6) 如上述項目（4)或（5)之油性佐劑疫苗，其中室溫下 為液態之油脂成份（A)含有不少於油相之2 0重量％的脂肪 酸醋及/或三十碳六稀酸。 (7) 如上述（4)或（5)項之油性佐劑疫苗，其中乳化劑（B) 之HLB值低於10。 (8) 如上述（7)項之油性佐劑疫苗，其中乳化劑（b)含有 選自多元醇與脂肪酸部份酯化之酯及含聚氧乙烯鏈之非離 子性界面活性劑之至少一種。 (9) 如上述（4)或（5)之油性佐劑疫苗，其中乳化劑（d)之 HLB值低於1〇。 (10) 如上述（9)項之油性佐劑疫苗，其中乳化劑（〇)含聚 氧乙烯鏈之非離子性界面活性劑。 本紙張尺度過用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 311980 _-----------裝--------訂·--------· (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 581682

五、發明說明（5 4.發明詳細說明 本發明之油性佐劑疫苗係將由室溫下為液態之油脂成 份（A)、乳化劑（B)及包含生物性容許之有效劑量之抗原之 水相成分（C)所製備成的W/0型乳液（步驟u分散或乳化 (步驟2)在含乳化劑（D)及水性成份（E)之液體中，使最終之 W/0/W型油性佐劑疫苗的外水相層中含特定量之特定分 子量聚乙二r醇衍生物。 在室深下為液相之油脂成份（A)構成步驟（1)製備的 W/0乳液之連績相，並構成步驟（2)中形成之w/0/w型油 性佐劑疫苗中形成分散相之油相。本發明中油相意指在本 W/0/W型油性佐劑疫苗中之油相。本說明書中所謂之“室 溫忍指1 5至2 5 C範圍之溫度。在室溫下為液態之油脂 成份（A)，可自一般食品、藥物、化粧品及使用之在室溫下 呈液態之油脂及非油脂油性基質中選擇使用。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 室溫下呈液態之非酯油基劑，可例舉如：烴，如輕質 液體石蠟、三十碳六烯、六甲基廿四烷、聚丁烯等，脂肪 酸，如飽和中鏈脂肪酸（例如：辛酸、癸酸等），長鏈不飽 和脂肪酸（例如油酸、亞油酸、亞麻油酸等），中鏈或長鏈 脂肪醇等。室溫下呈液態之酯油性基劑包括各種由飽和中 鏈脂肪酸，如辛酸及癸酸，或由不飽和長鏈脂肪酸，如油 酸及亞油酸及醇形成之各種脂肪酸酯，以及天然脂肪酸 酯，例如：液態蔬菜油（例如：花生油、橄欖油、紅花油、 葵花油、荷荷葩油等），動物來源之液態油脂，例如：粗橘 油等。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 5 311980 581682 A7 _______ B7__ 五、發明說明（6 ) 油性成份（A)可使用上述例中之一種，亦或用上述例中 之二種或爹種混合使用。該些油性成份中，油脂如脂肪酸 醋 '蔬菜油及三十碳六烯具有相當高之抗氧化性及對人體 之高親和力。因此，本發明油性佐劑疫苗之油性成份較好 選自此些油脂中之一種或多種使用。尤其，由16至22碳 原子構成之順-△ 9-不飽和脂肪酸（亦為生物脂質之構成分） 與1至3碳原子之醇之酯化化合物製成之油性基劑較佳。 此外’於油相中含至少不少於20重量％比例之脂肪酸 脂及/或三十碳六烯，進一步降低最終油性佐劑疫苗之副作 用如局部反應等並可提高安全性。脂肪酸酯若與三十碳六 烯同時使用，則其總量至少不少於油相之2〇重量％。 本發明中，可選擇及使用一般藥劑或食品使用之對人 體具有高安全性之一種或多種界面活性劑作為構成油性佐 劑疫苗中之乳化劑（B)及乳化劑（D)。 乳化劑（B)在步驟i使用以製備由含抗原子之水相成 份（C)與油相成份（A)構成之w/〇型乳液。 考慮最後W/0/W型油性佐劑疫苗之安定性，作為乳 化劑（B)之界面活性劑較好為親脂性。亦即，較好具有相當 低之HLB(親水·親油平衡值），以動低於ι〇者較佳。乳 化劑⑻可用種或由2種或多種配合使用。在本發明中， 乳化劑（B)較好選擇為總hlb低於1〇。 更砰言之，可使用多元醇與脂肪酸酯之部份酯，可例 舉如·山梨聚酶脂肪酸醋（例如：山梨聚酷單油酸醋、山梨 聚醋二油酸梨聚醋倍半油酸醋等）、甘油脂狀西“⑽ 本紙張尺度適用中⑵Q x 297公髮τ 6 311980

請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項遽· 填 | ί裝 頁I I 訂 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 581682 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（7 ) 如：甘油醇單油酸酯等）、聚甘油脂肪酸酯（例如：二甘油 單油酸醋、二甘油醇二油酸醋等）等，分子内含聚氧乙烯鏈 之非離子性界面活性劑，例如：聚氧乙歸山梨聚釀脂肪酸 酯（聚山梨酸酯）[例如：聚氧乙烯（20)山梨聚醣單油酸酯 等]、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚氧乙烯聚氧丙稀 可使用含天然卵磷脂之甘油磷脂質。 其中特別可組合使用分子内含3至1 〇個幾基之多元 醇，例如：山梨聚醣、甘油及聚甘油，與含12至2(^個&碳 原子之脂肪酸之部份酯，及含聚氧乙烯鏈之經基脂肪酸二 甘油醋，如聚氧乙烯氫化蓖麻油，使乳化劑（B)之總hlb 值低於ίο。依此方法可獲得具更優異製劑安定性之w/〇/w 型油性佐劑疫苗。 本說明書中，HLB值係根據w· C· Griffin [ w c Griffin，J. Soc· Cosmetic. Chemists，1，311 (1949)]之公式 計算。 製備本發明之油性佐劑疫苗中，乳化劑成份作為構成 含抗原之W/O乳液的成份，即先將胺基酸或其鹽混合入含 非還原性糖或含其分子内至少含5個羥基之糖醇以及一至 少有3或更多個羥基之多元醇與脂肪酸部份酯（其為室溫 下為液態之非離子性界面活性劑）水溶液中，再加入上述乳 化劑（B)以提高油性佐劑疫苗之效果及製劑安定性。水溶液 態中使用之胺基酸或其鹽，以及糖類或糖醇可選擇一般食 品或醫樂品使用者’例如日本藥局（Japanese Pharmacopoeia) 及曰本常用藥物手冊（japaneSe pharmaceutical Codex 亦 -----------裝 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) ----訂--------- #· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格mo X 297公釐） 7 311980 581682 A7 五、發明說明（8 ) drugs)中所列者。在此使用之抗體溶液只要為液體即可， 可如溶液、浮液等。例如胺基酸或其鹽可為甘胺酸、丙胺 酸、精胺酸鹽酸鹽、組胺酸、苯丙胺酸、天門冬胺酸鈉、 天門冬胺酸鉀、麩酸鈉、麵酸鉀或其水合物，其中糖類及 糖醇較好選自海藻糠、木糖醇、小梨糖醇、甘露糖醇、麥 芽醣醇、乳糖醇等。 上述乳化劑組成物之製備為將含上述胺基酸或其鹽及 上述糖類或糖醇之水溶液與重量比例10:丨至丨：〖（水溶 液：界面活性劑）之上述非離子界面活性劑混合攪拌而成1 溶液。該乳化劑組成物之使用量為含抗原溶液之w/〇乳液 之約1至20重量％為佳，約2至1 〇重量❶/〇更佳。 乳化劑（D)在步驟2中用以分散或乳化上述w/〇乳液 於含乳化劑（D)及水相成份（E)之液體中。 由最後W/0/W型油性佐劑疫苗之安定性觀之，作為 乳化劑（D)之界面活性劑較好為親水性且具相當高之 值，最好不低於10。該乳化劑（D)可單獨使用或依需要組 合使用。此時，該乳化劑（D)最好調整為總hlb值不低於 10 〇 、 詳言之，使用分子内含聚乳乙烯鍵且#则值不低於 之非離子性界面活性劑’例如：聚氧乙稀山梨聚畴脂肪 酸醋、聚氧乙烯氫化葱麻油、聚氧乙烯聚氧丙稀二醇等。 此類界面活性劑可與多元醇與脂肪酸之部份酯，例如.山 梨聚醣脂肪酸醋、甘油脂肪酸醋、蔗糖脂肪酸醋、聚甘油 脂肪酸醋等，及包括天然墙脂質之甘油碟酸醋配合使用: 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 8 311980^ 「裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 訂--------- #· 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 581682 A7 五、發明說明（9 其中’單獨使用聚氧乙浠聚氧丙稀二醇或與其他界面活性 劑配合時，W/0/W型油性佐劑疫苗具有良好之製劑安定 性。 作為乳化劑（B)或乳化劑（D)之甘油攝脂質，可舉例 如：天然鱗脂質，例如自蛋黃及大豆之萃取及純化之磷脂 質及經氫化加成物’以及各種合成之其中醯基部份和鹽基 部份組成經控制的磷脂質及脫脂酸磷脂質。 本發明之W/0/W型油性佐劑疫苗中，水性成份（c)構 成水相，即步驟1中製成之w/0乳液之分散相、及最終 w/o/w型坤性佐劑疫苗中分散相之油相中之内水相層。該 水相成份（C)包括各種抗原。 包含於水相部份（C)之抗原可為多種種類及多種形 癌。具體言之，可使用例如：去活性細胞、去活性之病毒 顆粒，去濟性之一般黴聚苗，及抗病原性感染因子，例如： 吸附蛋白質，包封抗原等製成次單元體疫苗者。其中去活 性細胞可舉：格蘭氏陰性細菌，例如：放線菌（八^^^ 卿Tiifie) ’ 埃氏大腸菌_等等， &蘭氏陽性細菌’例如：緒丹毒丹毒、絲nsine1nthHY rh—)等。去活性之病毒顆粒，包括例如：日本B 型腦炎病毒等。去活性之黴聚菌可例舉如：諸及雞之徽聚 菌。抗病原性感染因子可例舉如：新城雞瘟病毒之F蛋白。 亦可使用含複數抗體之疫苗。 本發明之油性佐劑疫苗中，除抗原外，亦可包含抗原 以外之其他有效成份，例=抗生素。抗生素之例可舉如’:、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 2&公爱-y

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581682 五、發明說明（11 , 為佳’ 1，〇Ρ〇至10 000則更佳，3,〇〇〇至9,〇00又更佳。在 外水相層所含之比例為〇·5至2〇重量％較好，〗至1〇重量 %，以1至5鸯量％更佳。 聚乙P醇衍生物之分子量低於400或其含量少於〇.5 重量％時，則無法達到充份之降低黏度效果。此外，佐劑 之效果亦會降低。聚乙二醇衍生物之分子量超過2 〇,〇〇〇 時，外水相層本身黏度會增加，因此反而會提高油性佐劑 疫田整體之黏度，而無法有充份之降低黏度效果。當含量 超過20重量％時，内水相層及外水相層顯現完全不同之滲 透壓。結果無法獲得安定之w/〇/w型乳液，因此導致無 法得到安定夂油性佐劑疫苗。 本發明中，上述聚乙二醇衍生物之高分子量導致外水 相層黏度較高，結果油性佐劑疫苗有較高之黏度。因此， 最好依照聚乙二醇分子量調整其含量在上述範圍内。 本發明中，分子量在400至20,000範圍之聚乙二醇衍 生物可以單獨或使用不同分子量之二種或多種而配合使 用。 由最終油性佐劑疫苗之製劑安定性及佐劑效果觀之， 聚乙二醇衍生物分子量較好在1〇〇〇至1〇,〇〇〇，且含於外 水相層中之比例為該相之1至10重量％，以1至5重量％ 更佳。 本發明製備之油性佐劑疫苗具有之特徵為優異之佐劑 效果及低黏度，而此均係因其外水相層中存在聚乙二醇衍 生物。一粒之W/0/W型乳液由於内水相層内所含之物質 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格咖X 297公璧）—

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五、發明說明（14 ) 層中之含备種抗原之W/0乳液、混合、及分散於如後述含 乳化劑（D)及水性成份（E)之液體内。或者，可如後述，可 製造任意種抗原的W/0/W型油性佐劑疫苗後混合。 本發明油性佐劑疫苗作為醫藥製劑可含不直接涉及佐 劑活性之务種添加物’例如：緩衝劑、防腐劑、滲透壓控 制劑等等。 本發明油性佐劑疫苗製劑可使用各種可乳化之裝置製 造内水相層中含抗原之W/0乳液（步驟1)，及將該w/〇乳 液分散或乳化於含乳化劑（D)及水性成份（E)之液體内（步 驟2 )，可使用一般之乳化裝置（例如：均質混合機、均質 粉碎機、CLEARMIX (M TECHNIQUE公司製造）等等）、使 用多孔膜之膜乳化裝置、高壓喷射乳化裝置等等。必要時， 構成本發明油性佐劑疫苗之w/0乳液須通過濾網膜以使 粒子大小在一定程度以下。 此外’在製造疫苗時，使用之各成份可事先經過滅菌 處理’視性質而定，如：加熱滅菌及過濾滅菌。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之油性佐劑疫苗若使用於人體，則可經過由適 當路徑投藥，可例舉如：皮下、肌肉内及腹膜内注射，或 經由鼻腔之黏膜及腸腔投藥。投藥之劑量及次數則需係依 據相關領域所用之標準方法測定達到期望之免疫反應所需 之適當量。 以下例中將再詳細說明本發明。但本發明並不限定於 此些例。 下面各例中，使用乙二醇（以下將簡稱為PEG或 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 14 311980 581682 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ^___ 五、發明說明（b )

Macrogol)作為聚乙二醇衍生物。 [油性佐劑疫苗之製造] 以下备例中之油性佐劑疫苗是以。1^入11]^1乂（^]\4-0.8S (M TECHNIQUE)經以下方法製造。乳化操作是在室 溫進行且於要時使用冷水。下述組成物中之各成份經適當 之滅菌方法滅菌。攪拌操作、乳化等均在無菌環境下進行。 各例中所指之“份”意指“重量份”。 下述淹性佐劑疫苗製備中所謂之“外水相層，，意指欲 與製成wyo/w型油性佐劑疫苗之w/〇乳液混合之液體。 <<實施例1 :疫苗1之製造>> 依照表1之W/0-1組成，將抗原懸浮液以外之各成份 稱重後放入燒杯内。另外，使用前先將聚氧乙烯氫化蓖麻 油加熱至C溶解備用。之後將重量比例為丨/丨之麩酸鈉 及山梨糖醇溶液與山梨聚糖倍半油酸鹽一面攪拌一面加入 並混合。其餘之山梨聚糖倍半油酸鹽就此加 入。之後，再 於常溫下’經 CLEARMIX CLM-0.8S(M TECHNIQUE)以 12,000rpm —面攪拌一面加入抗原懸浮液混合5分鐘成 W/0 型乳液（W/0-1)。 依據表3所示之外水相層1之組成，將各成份溶解於 磷酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS，ρΗ7·4)(為外水相層丨）内。再 將上述W/0-l(l份）及外水相層1(1份）秤入燒杯内，經 CLEARMIX CLM-0.8S以9,000rpm攪拌5分鐘混合成油性ι 佐劑疫苗1。以下各實施例及比較例中，除非特別指明， 否則在製造疫苗時w / 〇乳液及外水相層之混合均如實施|

裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 15 311980 581682 A7 __ B7 五、發明說明（16 ) 例1之條件操作。 <<實施例2 :疫苗2之製造》 稱取如實施例1製造之W/0型乳液（W/0-1，i份）及 如表3外水相層2之組成製備之外水相層2(1份），製造成 油性佐劑疫苗2。 «實施例3 :疫苗3之製造》 將表1中所示之W/0-2組成，將除抗原懸浮液以外的 成份稱入燒杯中。另外，使用前先將聚氧乙烯氫化蒗麻油 加熱至50QC溶解備用。日本藥典Macrogol 6000則先均句 地溶解於抗原懸浮液内。再依實施例1之相同條件製造 W/0 型乳液（W/0-2)。 其次？稱取W/0-2(3份）及依照表3所示之外水相層3 組成製造的外水相層3(2份），製造成油性佐劑疫苗3。 <<實施例4 :疫苗4之製造》 依照表3之外水相層4之組成’稱取各成份。各成份 再加熱至約60°C、混合，分散及冷卻至室溫，使用作為外 水相層4。其次，稱取實施例3製造之W/0型乳液（W/0-2， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1份）及外水相層4(3份），製造成油性佐劑疫苗4。 «實施例5 :疫苗5之製造》 依據表1所示W/0-3組成，將抗原溶液以外之各成份 稱入燒杯内。接著依照實施例1相同之方法，逐漸添加抗 原懸浮液,及攪拌混合物，以實施例1相同方式W/0型乳液 (W/0-3) 〇 其次，稱取該W/0型乳液（W/0-3，2份）及外水相層 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 16 311980 581682 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（U ) 2(3份）於燒杯中，製造成油性佐劑疫苗5。 <<實施例6 :疫苗6之製造>> 稱取實施例5製造之W/0型乳液（W/〇-3,2份）及表4 所示之外水相層5之組成製造的外水相層5(2份），再經 CLEARMIX CLM-0.8S ’ 以 9，i)OOrpm 混合 5 分鐘成乳液。 曰本藥典Macrogol 6000則先溶解於PBS中成1〇重量〇/0濃 度’再添加該最終溶液1份。該混合液經輕緩攪拌即成油 性佐劑疫苗6。 <<實施例7 :疫苗7之製造>> 依據表2之W/0-4之組成，稱取除抗原懸浮液以外之 各成份於燒杯中。再以實施例i同法，經CLEARMIX CLM-0.8S ’ 製造成 w/O 型乳液（W/0-4)。 其次’稱取W/0-4(l份）及表3外水相層4之組成製造 之外水相層4，製造成油性佐劑疫苗7。 «實施例8 :疫苗8之製造》 依據表2之W/0-5組成，稱取除抗原懸浮液以外之各 成份於燒杯中。另外，將聚氧乙烯氫化蓖麻油加熱至6〇 溶解備用。接著依照實施例1相同之方法將抗原懸浮液緩 緩加入並攪拌製成W/0型乳液（W/0-5)。 其次，稱取W/0-5(l份）及外水相層2(1份）製造成油 性佐劑疫苗8。 <<實施例9 :疫苗9之製造>> 依據表2之W/0-6之組成，稱取除抗原懸浮液以外之 各成伤於蜂杯中。另外，將蛋黃卵磷脂均勻地溶解於油相 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 17 311980 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 填 f裝 頁i

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581682 五、發明說明（18 ) 中，及聚氧乙烯氫化蓖麻油加熱至60溶解備用。如實施 例1相同之方法，將抗原懸浮液緩緩加入並攪拌，製成 W/0 型乳液（W/0-6)。 其次，稱取W/0-6(3份）及外水相層3(2份），製造油 性佐劑疫苗9。 «比較例1 :疫苗10之製造>> 稱取實施例1中製造之W/0-1(1份）及表4所示之外水 相層5 (1份），製造油性佐劑疫苗1 〇。 <<比較例2 :疫苗11之製造》 稱取實施例1中製造之W/0-1(1份）及表4所示之外水 相層6 (1份），製造油性佐劑疫苗π。 <<比較例3 :疫苗12之製造>> 稱取實施例3中製造之w/0-2(3份）及表4所示之外水 相層7(2份），製造油性佐劑疫苗12。 <<比較例4 :疫苗13之製造>> 稱取實施例5中製造之w/0-3(2份）及表4所示之外水 相層5(3份），製造油性佐劑疫苗13。 <<比較例5:疫苗14之製造>> 稱取實施例7中製造之w/0-4(l份）及表4所示之外水 相層8(1份），製造油性佐劑疫苗1 4。 <<比較例6 :疫苗15之製造>> 稱取實施例8中製造之w/0-5(l份）及表4所示之外水 相層6 (1份）’製造油性佐劑疫苗1 5。 <<比較例7 :綠苗16之製造>> (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ----訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 18 311980 581682 A7 五、發明說明（19 ) 稱取實施例9中製造之W/〇-6(3份）及表4所示之外水 相層7(2你），製造油性佐劑疫苗1 6。 各實施例及比較例中使用之W/0乳液的組成如表1及 表2所示，各外水相層之組成如表3及表1所示，各疫苗 中W/0乳液及外水相層之混合比例則如表5所示。 表1 : W/O乳液_1組成 添加成份 混合比例（重量 化合物 W/0-1 IW/O-2 W/O-3 1由酸乙酯 40 雜 三十碳六烯 - 55 20 純大丑油 _ 雞 15 糖倍半油酸醋 — 10 10 10 烯(2〇)氬化蓖麻油〜 ~ • 麵 5 聚氧乙烯(40)氫化蓖麻油〜 5 3 _ 聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯 2 讀 楚酸鈉及山梨糖醇水溶液12) 5 晒 抗原懸浮液 ~ ........ H 40 29 50 曰本藥典 Macrogol 600013) Wi --1 1 - 100 100 100 *1)括弧内數字表示所含環氧乙烷之平均莫耳數。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 19 311980 1 2)麩酸鈉旱水和物（25 g)及山梨糖醇（1〇 g)溶解於蒸餾水 之溶夜<100mL)。 #3) Macrogol先溶解於抗原懸浮液中。 581682 A7B7 五、發明說明（20 ) 表2 : W/0乳液-2之組成 添加成份 混合比例（重量％) 化合物 W/O-4 W/O-5 W/O-6 油酸油酯 40 - 3 0 三十碳六烯 - 賺 20 十四烧酸異丙酯 - 60 - 純蛋黃磷脂質 - - 2 甘油醇單油酸醋 15 10 8 聚氧乙烯（10)氫化蓖麻油 5 5 聚氧乙烯(60)氫化蓖麻油Μ) - 5 5 抗原懸浮液 40 20 35 總量 100 100 100 *1)括弧内數字表示所含環氧乙烷之平均莫耳數。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表3 :油性佐劑疫苗-1外水相層之組成 添加成份 混合比例（％) 化合物 外水 相層-1 外水 相層-2 外水 相層-3 外水 相層-4 聚氧乙烯(60)氳化蓖麻油Μ) 2 - - 2 聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯# υ - - 2 - 聚氧乙烯(196)聚氧丙烯(67)甘油醇Μ) 1 3 - - 純蛋黃磷脂質 睡 - - 2 Macrogol 1000*2) - - - 1 日本藥典Macrogol 4000 - 4 1 - 曰本藥典Macrogol 6000 3 垂 1 - 磷酸緩衝食鹽水(PBS) 94 93 96 95 總量 100 100 100 100 *1)括弧内數字表示所含環氧乙烷之平均莫耳數。 *2)日本藥抑賦型劑許可物質。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 20 311980

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五、發明說明（21 ) 表4 :油性佐劑疫苗-2外水相層之級成

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

貫施例 疫苗 疫苗 W/0-l(l 份） W/0-l(l 份） 1(1 份) 疫苗 疫苗4 疫苗 疫苗6 疫苗7 疫苗 疫苗9 W/0-2(3 份） W/0-2(l 份） W/0-3(2 份） W/0-3(2 份） W/0-4(l 份） W/0_5(l 份） 2(1 份） 3(2 份） 生主4(3份） ίΐ主2(3 份) 外水相層5(2份） Macrogoi 溶液(1 份)” 外水相層4(1份） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 比較例 疫苗10 疫苗11 疫苗12 疫苗13 疫苗14 疫苗15 疫苗16 W/0-6(3 份） 外水相層2(1份） 外水相層3(2份） 外水相層5(1份） W/0-2(3 份） W/0-3(2 份） W/0-4(l 份） W/0-5(l 份） W/0-6(3 份） 外水相層6(1份） 外水相層7(2份） 外水相層5(3份） 外水相層8(1份） 外水相層6(1份） 外水相層7(2份） 1)詳細之製造方法參考本說明書中實施例6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 21 311980 581682 A7 ________Β7__ 五、發明說明（22 ) [免疫性測定] 油性佐劑疫苗内所含之各種抗原均經免疫性測定。各 實施例中所用疫苗之記號均與上述實施例及比較例中所示 者相同。 «實驗例1 :去活性豬丹毒丹毒絲菌 rhusiopathiae ) (Er)疫苗〉〉 將培養於含5%牛血清及腦心臟灌注培養液（81118)之 培養基内之豬丹毒丹毒絲菌SE-9菌株（美國標準菌株中心） 以福馬林處理去除活性製備成抗原。再以此抗原製造疫苗 1、3、5、7、10、12及14。在製劑時，各疫苗中以磷酸緩 衝生理食鹽水（PBS)調抗原之濃度為5·〇χ l〇8.CFU/m卜各 疫苗並另μ PBS取代抗原製成空白液。各疫苗再以相對之 空白液5传連績稀釋。另外，控制組則包含胡氏不完全佐 劑（IFA);及另一佐劑（IFA_PFG)其中IFA内水相層中添加 内水相層之5%比例的PEG1000、以及含氧化鋁膠體為佐 劑之疫苗。 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 將各疫苗（或稀釋之疫苗）皮下接種（0 25ml/尾）入5週 齡大之無菌飼養老鼠（每群5隻）的内股内。在免疫3週後， 再將Er Fvijisawa株（曰本獸醫生物協會（JAVB))皮下注射 (2·2χ 106qFU/0.1ml/尾）入老鼠之内股内。注射後觀察老鼠 10曰，計算50%老鼠殘存之稀釋倍率，即為。在免疫 2週後，再以未稀釋之疫苗及5倍稀釋之疫苗接種於老鼠 (各配方為10隻），並以觸診測定注射部位形成硬塊程度。 硬塊之程庳分為5等級（0 :無，1 ··輕度-4 :重度），並計

581682 A7 ^---------B7____ 五、發明說明（23 ) 算各配方之平均值。 同時，w/o/w型油性佐劑疫苗製劑另以雷射繞射粒度 分析儀 SALD_2100(SHIMADZU CORPORATION)測定其平 均粒徑。 各效々（PD5G)之測定結果列於表6。 表^豬丹毒-老鼠免疫試驗之結果（實驗例1) 試驗結果（生存老鼠/試驗老鼠） PDso 未稀釋 疫苗 X 5 X 25 X 125 X 625 X 3125 X 15625 (倍） [免疫群] 疫苗1 疫苗3 疫苗5 疫苗7 5/5 5/5 5/5 5/5 4/5 3/5 0/5 2660.4 5/5 5/5 5/5 5/5 3/5 2/5 0/5 1397.5 5/5 5/5 5/5 5/5 4/5 2/5 0/5 1928.2 5/5 5/5 5/5 575 4/5 1/5 0/5 1397.5 [比較免疫群] 疫苗10 疫苗12 疫苗14 IFA IFA-PEG 鋁凝膠 5/5 5/5 5/5 5/5 2/5 0/5 0/5 532.1 5/5 5/5 5/5 3/5 2/5 1/5 0/5 385.7 5/5 5/5 5/5 3/5 2/5 0/5 0/5 卜279.5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 卜3/5 0/5 3670.7 5/5 5/5 5/5 卜5/5 4/5 卜1/5 0/5 1397.1 5/5 「5/5 4/5 广2/5 0/5 0/5 0/5 77.1 表中所不之結果為以各種稀釋疫苗（或未稀釋之疫苗） 接種後殘存老鼠之數目及PD5G值。亦即pd5G值越高代表 使用之疫葙效力越強。其中，免疫群中疫苗1、3、5、7 之接種群PDw值均不低於1300，顯示有較ifa優良之效 力。相對地，對照之免疫群（即以疫苗1 〇、1 2、1 4及鋁凝 膠佐劑之砰）的PD5。值分別為532.1'385.7、279.5及77.1。 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 『裝----I--訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 23 311980 581682 A7 五、發明說明（以） 因此可證明本發明之疫苗製劑具有明顯之高PD5G值。此些 結果顯示本發明疫苗之製劑具有高效力。 其次，另以觸診測定注射部位發生硬塊之程度。 W/0/W型油性佐劑疫苗之粒度及其發生硬塊程度示於表 7 〇 表7 :豬丹毒_老鼠注射部位副反應（實驗例i ) 注射部位副反應 (平均值） 平均粒徑（// m ) [免疫群] 役苗1 0.1 6.8 疫苗3 0.2 8.1 疫苗5 0 7.2 ' 疫苗7 0.2 7.9 [比較免疫群] 疫苗10 0.3 7.5 疫苗12 0.2 8.5 疫苗14 0.8 8.8 IFA 3.8 喊 IFA-PEG 3.2 鋁凝膠 0 注射部位局部反應程度（ο :無，1 ··輕度-4 :重度） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實驗之免疫群顯示在注射部位只有極微之局部反應， 證明在注射時其安全性高，同時其平均粒度亦不超過72 至8.1或20 v m。相對地，對照之免疫群顯示幾乎與w/〇/w 型油性佐劑疫苗有同程度之粒度，而在注射部位之反應除 IFA及IFA-PEG外各對照之免疫群均小。然而IFA及 IFA-PEG注射群老鼠卻在注射部位有嚴重硬塊發生，同時 有3/4或以上接種IFA或IFA-PEG的老鼠呈現不同之變化 步調。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐) 24 311980 581682 A7 五、發明說明（25 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 由上塔結果顯示本發明之油性佐劑疫苗具有優良之效 力’且在注射部位之局部反應不似鋁凝膠疫苗，而極為輕 微。因此，本發明之疫苗極為安全。 «實驗例2 :去活性豬肺枝原體疫苗》 疫苗2、4、6、11及13係以經添加豬血清之BHL培 養基培養再以福馬林去活性之豬肺炎枝原體(Mycoplasma tom^im，a{)92_28株（為分離自農場豬隻之菌株； Juridical Foundation ^ The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute)所製造。在製造時，各疫苗内抗體以磷 酸緩衝食犟水（PBS)稀釋成8·0χ 108ccu/m卜另外，同時以 氧化18凝膠（ALHYDROGEL 85，Superfos，紹轉換量為 9mg/ml)為佐劑製成疫苗（疫苗AL)，又以曰本藥典 Macrogol 4000加入氧化鋁凝膠調成終濃度為4%而含同濃 度抗體的疫苗（疫苗AL-PEG)。 各疫苗（2ml/隻）以間隔2週2次注射於SPF[無特異致 病原（Specific Pathogen Free)]豬（8隻/群，初次免疫時為4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 週齡大）之頸肌肉内。在第2次免疫後一週時，將取自經豬 肺炎枝原韓92-28株（為分離自農場褚隻之菌株，juridicai Foundation, The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute)感染豬隻之肺均質細胞移植在氣管内。在移植經 4週後，即將豬隻犧牲，並觀察形成之肺障礙。測定各發 生之肺障礙程度，並計算相對於無免疫控制組的肺障礙減 少（％)程度。 該結果如表8所示。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 25 311980 五、發明說明（26 ) 表8 · ^ •豬肺枝原體感染-老H免癌Μ驗鮭罢/眚給你I 7\ 免疫群 比較勞t蒋群 IkM 疫苗 疫苗 疫苗 疫苗 疫苗 疫苗 無免疫 4 11 13 AL· AL-PEG 對照組 0 0 0 15.2 — 16.4 ^3.6 50,2 一5.5 — 1.5 2.0 0 0.5 5.5 15:2 16.5 11.8 0.5 9.6 3.6 9.1 22.0 5.5 22.1 14.5 1早礙程度 16.2 30.2 5.8 4.5 4.58 19.6 25.9 32.7 (各個體） 2,6 5.5 18.6 14.2 19.5 56.3 30.6 15.9 兮.2 16.3 2G.6 23.0 23.3 12,4 11,1 40.2 3.5 1.5 9.6 38.6 36.2 28.4 9.1 25.5 19.6 10.5 10.2 10.2 14.4 30 30 45.5 值） 6.6 9.5 8.6 14.4 17.7 23.9 24.4 24.0~ 障礙減少 兔度(°/〇) 72.3 60.5 64.3 39.8 26.0 0.3 -2.0 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 以疫苗2、4及6接種之免疫群可減少60%或更高之 障礙症狀’顯示具有優良之效力。疫苗6為第二次乳化後 添加PEG者，顯示與其他免疫群幾乎有相同之效力。相對 地，以疫茼11及13投藥之比較免疫群之障礙症狀減少程 度各為39·8%及26.0% ’同時，鋁凝膠疫苗顯示無論peg 存在與否均未因疫苗而有減輕該障礙症狀之效力。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 由上述效力顯示本發明油性佐劑疫苗即使以肺枝原體 為抗原亦具有優良之效力。同時，該結果亦顯示無論在第 二次乳化之前或之後，在外水相層中添加PEG均有效果。 [乳液黏度之測定] 製成之W/0/W型油性佐劑疫苗另再測定其黏度。亦 即測定上述實驗例1中製造之豬丹毒丹毒絲菌疫苗（即疫 苗 1、3、5、7、10、12、14)，及分別依疫苗2、4、6、8、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 26 311980 581682 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（27 9、11、1 3、1 5及16之配方以豬丹毒丹毒絲菌為抗原製造 之疫苗，以比較相同配方下之抗原懸浮液。在各疫苗製造 後一週，在25°C下，以E型旋轉黏度計（ToKl SANGYO C0.， LTD·，RE105H型）測定其黏度。結果如表9所示。 表9 :疫苗製劑黏度 疫苗編號 黏度(mPa · s，25°〇 貫施例 疫苗1 33 k苗2 28 疫苗3 42 疫苗4 35 疫苗5 31 ~ 疫苗6 32 疫苗7 38 疫苗8 45 疫苗9 29 比較例 —---------- 疫苗10 153 疫苗11 161 完苗12 206 疫苗13 187 疫苗14 470 疫苗15 ~~396~ — 孑苗16_ 315 如表9所示，各實施例在2yc下之黏度均不超過 50mPa · s。因此，其黏度極低而有利於注射。相對地，j 比較例中疫苗之黏度均不低於15〇mPa.s，因此在注射日 須施加相當之外力且耗時。 —上述之結果亦即意味著本發明之w / 〇 / w型油性佐劑 疫苗内之外水相層内所含之聚·乙二醇衍生物可大幅降低 _其黏度’因此本發明之疫苗在投藥時可減少大量之勞力_ 本紙張尺度適用中_賴平（CNS)A4 ^r(2iG χ 29 )--------- z/ 311980 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 裝---- 訂------- 581682 A7 五、發明說明（28 ) [乳液包容率之測定] 製成之w/o/w型油性佐劑疫苗另再測定其包容率。 亦即測定上述實驗例2内使用之豬肺枝原體疫苗（即疫苗 2、4、6、11、13)，及各依照疫苗 1、3、5、7、8、9、1 〇、 12、14、15及16以上述肺枝原體為抗原製造之疫苗，以 比較相同配方下之抗原懸浮液。製成之疫苗先以PBS稀 釋’再離心使乳液與外水相層分離。再收集而測定外水相 層所含之蛋白質量。為計算包含在内水相層之蛋白質量， 製造W/O乳液時添加之抗原懸浮液（即構成内水相層部份） 所含之蛋自質量再減去該外水相層中之蛋白質量，因此， 包容率可以下列公式計算。 包容率（％) =[(添加之抗原溶液内之蛋白質量）_(外水相層内 之蛋白質量）]/添加之抗原懸浮液内蛋白質量。 疫苗在製造後先存放於4°C下，再於疫苗製造之次日 及三個月後測定其包容率。 包容率之測定結果如表1 〇所示。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺錢財關家標準（cNS)Am^x 297 ^ 28 311980 ^81682 五、發明說明（29 ) 表10 ··綠苗製劑包:容奉

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於實施例及比較例中’製造後次曰及 =〇%以上’顯示其安定性優良。特別是各實施例，同 時在表9中顯示有極低之黏度又有優良之蛋白質包容率。 由上壞結果’顯示本發明之w/〇/w型油性佐劑疫苗 有極低之度且安定性高。 由表$至表10之結果’證明本發明之油性佐劑疫苗在 具有優良效力特性之w/o型油性佐劑及具有優良安全性 特性之0/W型油性佐劑間可維持極佳之平衡。因此，本發 明中w/0/w型油性佐劑疫苗之外水相層中所含之特定聚 乙二醇衍生物，使其不致受内水相層成份影響，製成安定 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

581682 A7 ____B7 五、發明說明（30 且亦因可減低其黏度而在注射於人體時具有容易操作之性 質的有用沛性佐劑疫苗。 因此，本發明w/o/w型油性佐劑疫苗具有高佐劑效 力且製劑安定性佳，局部反應之副作用亦少。 本申請案係根據日本專利申請號3 16121/1999號，其 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------訂--------- 内容亦合併在此供參考。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 30 311980

Claims (1)

1. 第89123 170號專利申請案 申請專利範圍修正本 一種W/0/W型油性佐劑疫苗 之分子量為1，000至10,000 之外水相層， (92年10月14曰） ’包括含有1至10重量〇/0 之下式（I)所示之聚乙二醇 (I) 其中R1與R2各為氫原子，n表聚合度；及含生物上容 許之有效量之抗原之内水相層。 2·如申請專利範圍！ i項之油性佐劑疫苗，係經下述步驟 製造之W/0/W型油性佐劑疫苗：⑷製造含室溫下為液 體且包括比例不少於油相之2〇重量％的脂肪酸醋或三 十碳六烯或脂肪酸醋及三十碳六烯的油性成份（A)、 HLB值不低於1 〇且包括選自多元醇與脂肪酸之部份酯 及含聚氧乙烯鏈非離子性界面活性劑之至少一種的乳 化劑（B)及含生物性容許的有效量之抗原之水相成份（c) 所成的W/0乳液，及 (b)將泫W/0乳液分散或乳化在含乳化劑（D)及液 相成伤（E)之液體内，其中液體内含有1至1〇重量％之 分子量為1，000至10,000之式⑴所示之聚乙二醇。 3·如申請專利範圍第1項之油性佐劑疫苗，係經下述步驟 製造之W/0/W型油相佐劑疫苗：（a)製造含室溫下為液 體且包括比例不少於油相之2 〇重量％的脂肪酸酯或三 1 311980 581682 十碳六烯或脂肪酸酯及三十碳六烯的油性成份（A)、 HL值不低於1 0且包括選自多元醇與脂肪酸之部份酯 及含聚氧乙烯鏈非離子性界面活性劑之至少一種的乳 化劑(B)及含生物性容許的有效量之抗原 < 水相成份⑹ 所成的W/0乳液，及 (b) 將忒W/0乳液分散或乳化在含乳化劑（D)及液 相成份（E)之液體内，及 (c) 在外水相層中加入}至1〇重量％濃度之分子量 1，000至10,000之式⑴所示聚乙二醇。 4· Μ請專利範圍帛2項或第3項之油性佐劑疫苗，其中 乳化劑（D)之HLB值不低於。 5.如申請專利範圍“項之油性佐劑疫苗，其中乳化劑⑼ 包括含聚氧乙烯鏈之非離子性界面活性劑。 2 311980