TW562807B

TW562807B - Novel secretory membrane protein

Info

Publication number: TW562807B
Application number: TW087104857A
Authority: TW
Inventors: Naoki Kimura; Tomoko Toyoshima
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1997-04-01
Filing date: 1998-03-31
Publication date: 2003-11-21
Also published as: JP4135813B2; AU734013B2; KR20010005892A; WO1998043998A1; ATE290019T1; DE69829173T2; AU6521998A; EP0976764A4; EP0976764B1; US20020128435A1; CA2284734A1; US6784284B2; US6271366B1; DE69829173D1; EP0976764A1; US20040152879A1; US7235640B2; IL132112A0

Description

562807 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _____B7____ 五、發明說明（1 ) 技術領域本發明為與骨細胞之分化有關新穎之膜分泌蛋白質，以該蛋白質為編碼之DNA，含該DNA之載體，將有該媒介之寄主細胞，相對於該蛋白質之抗體，利用該蛋白質筛選化合物之方法，及由該筛選方法所分離之化合物等等所有關之事項說明。技術背景由於骨芽細胞產生骨頭再生的現象，也就是說，脊椎動物維持生物體之重要現象。就目前所知，與骨頭形成之有關因子為，在荷爾蒙方面有雌激素(estrogen)、降血舞素 (calcitonin)、副曱狀腺荷爾蒙（PTH)等，在增殖因子則有 BMP (Bone Morphologenic Protein)，其他藥劑方面則如活性維他命D、弼製劑、維他命κ2等。而這些當中雌激素、降血鈣素、活性化維他命D、鈣製劑等目前正被應用於治療骨質疏鬆症之骨質量改善上，但也僅只限於作用於骨吸收抑制機轉，並非如其所說增加骨質量，充其量只是防止骨質量減少之藥物而已，對於真正能促進骨質量之藥物目前為止仍未有開發。另一方面，與骨頭相關疾病中被寄予厚望的新穎治療藥BMP，是唯一具有異形性形成訊號（signal)作用之細胞激素（cytokine)。BMP為在實際發生骨折及骨質流失之際產生修復作用，也就是說，由軟骨性假骨變成新生骨之置換過程的骨形成作用（軟骨内骨化）。（Duprez DM，Coltey、 M, Amthor - H, Brickell > PM, Tickle C (1996) Dev. Biol 174:448-452 Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) inhibits 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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562807 五、發明說明（3 ) 骨芽細胞之分化中指標之一的鹼性磷酸酶活性有增•大現象。此外，由分離所得之蛋白質為與骨細胞分化有關〆事可知利用該蛋白質將可能對與骨頭疾病相關:醫藥品候補化合物進行筛選。也就是說，本發明為利用新穎之膜分泌蛋白質及其基因，該蛋白質專進行醫樂品候補化合物之_選方法有關，具體而言如下·· 、 (1) 一種具有骨細胞之分化誘導活性之蛋白質，其係由序列編號：1或2中所記載之胺基酸序列所得之蛋白質，或這些蛋白質中胺基酸序列之中具有一個或多個胺基酸被置換，缺失（deletion)或附加胺基酸序列。 (2) —種具有骨細胞分化誘導活性之蛋白質，其為與序列編號· 3中圯載之驗基序列構成之雜交的dna 為編碼之蛋白質。 (3) —種以（1)或（2)所記載之蛋白質為編碼之DNA ◊ (4) 一種可插入(3)所記載DNA之載體。 (5) —種可保持(4)所記載之載體的寄主細胞。 (6) —種結合於（1)或(2)所記載之蛋白質的抗體。 (7) —種具有結合於（1)或（2)所記載之蛋白賢的活性化合物的篩選方法，包括下列步驟： (a) 使被檢驗試料與（1)或（2)所記載之蛋白質接觸；以及 (b) 選擇具有結合於（1)或（2)所記載之蛋白質的活性化合物。 (8) —種篩選具有促進或阻礙（1)或（2)所記栽蛋白質之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事頊再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 562807 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（4 ) 骨細胞之分化誘導活性化合物的方法，包括下列步驟： (a) 使被檢驗試料與細胞表面上表現之（1)或（2)所記載之蛋白質接觸； (b) 檢測出（1)或（2)所記載之蛋白質的骨細胞分化誘導(c) 與被檢驗試料不存在的情況下進行檢測而做比較，以選擇具有促進或阻礙⑴或(2)所記栽蛋白質之骨細胞之分化誘導活性化合物。、 (9)-種由⑺所記載之方法分離所得，並或（2)所記載的蛋白質結合之化合物。 ' (i〇)D所記載之方法分離所得，並且可促進或阻礙⑴或⑺所記載的蛋白質之分化鱗導活性的化合物。 ου如⑼或〇〇)所記載的化合物，其中上述化合物係天然存在者。镞 (12) 如⑼或(10)所記載的化合物，其中上述化合物係配位體。(13) 如（9)或（10)所記載的化合物興奮劑（agonist)。(14) 如（9)或（10)所記載的化合物括抗劑（antagonist) 〇 ::明與被認為是平常骨形成相關連之新賴膜分泌蛋白質有關。料發明者所㈣來自小岭之gdna驗基序列之序列編號.3中，該cDNA為Mum之中含訊號胜肽蛋白質胺基酸之序列編號：1中，N末端之訊號胜肽被去除之成熟蛋白質之胺基酸序列編m明白表示。活性其中上述化合物係其中上述化合物係 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) — — — — — — — 訂----!·!-線· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格297公爱· 562807 A7 B7 五、發明說明（5 ) 本發明者將分離之純群以「7F4」命名。本發明中之蛋白質所含之「7F4」蛋白質為具TNF受體次家族（subfamily) 中保存之半胱胺酸豐富的領域，其N末端（訊號序列領域) 及C末端則具富有疏水性之胺基酸領域。此「7F4」蛋白質在資料庫（data base)上並無具有相同性胺基酸序列之蛋白質。因此，「7F4」蛋白質被認為屬TNF受體超級家族 (Beulter. B, and Huffel, C. V. (1994) Science 264:667-668 Unraveling function in the TNF ligand and receptor families) 之新穎蛋白質（參照圖6)。為容易表現「7F4」蛋白質，KUSA細胞（此細胞為正常小白鼠骨髓間質細胞，除具造血清指示能力外，在體内移植中，我們知道他能誘發骨髓引起骨形成。參考文獻「Umezawa，A. Maruyama，T· Segawa，K· Shadduck，R· K· Waheed. A.? and Mata. J. (1992) Multipoint marrow stromal cell line is able to induce hematopoiesis in vivo. J. Cell. Ρ/〇λ^/· 151:197-205」之形態轉換體以PI特殊的磷脂酶C (Pi-specific phospholipase C)來處理則該蛋白質在細胞表面上之存在量有降低情形（實施例7)。由此可知「7F4」蛋白質並不存在細胞内，而藉由GPI-錨狀物之力在細胞表面上有固定之構造。GPI-錨狀物型之膜蛋白質為如CNTF受體等構造。另外，IL-6，IL-11受體之細胞内領域為非常之短，並不具有與配位體結合後之訊號(signal)傳遞相關領域。這些受體共同與配位體結合後與gpl30會合，利用gpl3〇當訊號傳達鎖將訊號傳入細胞内，「7F4」與許多的細胞激素受體相同，或許皆在與gpl30類之訊號傳達鎖會合後藉由本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-丨線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 562807 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（6 ) 機構將訊號傳達入核内。實際上，KUSA細胞之「7F4」蛋白質在飽和表現後與表現數量相關之細胞形態發生變化，細胞增殖速度發生降低傾向（實施例6)，為骨芽細胞之分化之一指標的鹼性磷酸酶活性則大為增加（實施例8)。這些事實說明，「7F4」蛋白質為，特別是與骨細胞之分化訊號有關。因此，「7F4」蛋白質或與這些結合之化合物有如下述之事項，特別是可利用於預防或治療骨相關連疾病。另外，應用於當成骨細胞分化記號(marker)之診斷。骨芽細胞經長期不斷地培養後骨形成記號數量逐漸增加而達自身分化亦已經報導出來。（Matsumoto T，Igarashi C， Takeuchi Y5 Harada S, Kikuchi T, Yamato H, and Ogata E. (1991) Stimulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3 of in vitro mineralization induced by osteoblast-like MC3T3E1 cells. Bone 12:27-32'Sudo H, Kodama HA, Am^ai Y, Yamamoto S3 and Kasai S. (1983) In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria· J Ce// 5b/· 96:191-198)。目前所知 BMP 為誘導骨組織之唯一骨形成因子，經由形成軟骨到引起骨形成之因子，但是，骨芽細胞，尤其是KUSA細胞在骨形成之中並無看到軟骨細胞的出現。由此，這種骨分化機構為 BMP (Wozney，JM，Bosen，V，Celeste，AJ，Mitsock，LM， Whitters，MJ，Kriz，RM，Hewick，RM，and Wang，EA (1988) Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. 242: 1528-1534)之作用來說明，現在，各方更注意這未知之骨形成因子的存在。而「7F4」蛋白本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 562807 A7 _ B7 五、發明說明（7 ) 質正為這骨形成因子之有力候補。另外，本發明為與「7F4」蛋白質相同機能之蛋白質有關，為了分離與「7F4」蛋白質相同機能之蛋白質，業者使用眾所周知的蛋白質差異導入法。例如在此技藝中所使用的部位特異突變誘發法等。（Hashimoto-Gotoh，T， Mizuno, T5 Ogasahara, Y5 and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152:271-275 ' Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100:468_500、Kramer，W，Drutsa，V，Jansen，HW，Kramer，B， Pflugfelder, M, and Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12:9441-9456 ' Kramer W5 and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154:350-367'Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:488-492)。「7F4」蛋白質（序列編號：1或2)令之胺基酸導入適當變異後，「7F4」蛋白質與機能相等之蛋白質就被調配出來了，當然在自然界中亦有胺基酸的變異產生。如此，「7F4」蛋白質之胺基酸序列中有一個或多個之變異胺基酸序列的胺基酸，「7F4」蛋白質的機能相同之蛋白質亦為本發明之蛋白質包含之列。以機能觀點而言，變異胺基酸為通常在30胺基酸以内，15至5胺基酸更佳，最多是 10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

562807 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（8 ) 3個胺基酸以内。此外，在分離相同機能之蛋白質之際，業者亦例舉其他熟知技術如雜交（hybridzation)技術（Sambrook，J·等人， Molecular Cloning，第 2 版，9.47-9.58，Cold Spring Harbor Lab· press，1989)。也就是說，業者以「7F4」蛋白質為編碼之DAN序列（序列編號：3)或其一部分為基礎，分離出與此高度相同之DNA，以該DNA而將與「7F4」蛋白質有相同機能之蛋白質分離亦為希鬆平常。如此一來，與「7F4」蛋白質為編碼之DNA序列或其一小部分所得之 DNA雜交，DNA成蛋白質之編碼，「7F4」蛋白質與相同機能的蛋白質亦為本發明蛋白質包含之列。諸如此類之蛋白質，例如小白鼠以外的哺乳動物的相似性（例如實施例3 之北方點墨法（Northern blotting)所檢出之人類基因之編碼蛋白質）。雜交技術所得之蛋白質，通常具有與「7F4」蛋白質及胺基酸高度相同性。所謂高度相同性為胺基酸序列中有40%以上，甚至60%以上，最高者甚至80%以上相同性。本發明與「7F4」蛋白質具「相同機能」是指，蛋白質與「7F4」蛋白質相同，一樣具有誘發骨細胞，分化之活性。誘發骨細胞分化之活性為分骨細胞之細胞增殖速度減慢而使細胞在形態上產生變化一途，該活性為，例如，以顯微鏡做骨細胞之形態學觀察，或用骨細胞之分化記號做鹼性磷酸酶之活性測定法(N. C. Partrige，D. Alcorn, V. P. Michelangeli, G. Ryan & T. J. Martin (1983) Cancer Res. 43:4308-14. Morphological and biochemical characterization 11 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂_ -----i -線—邊 -n 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 562807 A7 _—___—_______ B7 五、發明說明（9 ) of four clonal osteogenic sarcoma cell lines of rat original. K. Burns & W. A. Peck (1978) Science 199:542-4. Bone cells: a serum-free medium supports proliferation in primary culture) 皆能將之檢出。鹼性磷酸酶之活性測定法為，例如，將細胞以超音波破裂擊碎後，所得之細胞抽出液與為鹼性磷酸酶之基質之對_石肖基苯填酸(p-nitrophenyl phosphate)共同培養(incubate)，之後其分解所產生之對·硝基苯(p_nitrophenol) 的量將可以用分光光度計等方法加以定量。另外，亦可檢出骨約素（osteocalcine)或膠原蛋白型式I (e〇iiageil type I) 等指標性物質。本發明的蛋白質為以業者有所皆知之方法，不論重組過之蛋白質或天然蛋白質皆可做調配。重組蛋白質有如以本發明之蛋白質之膜結合中非必要部份在細胞中出現，令細胞分泌之。接著，此細胞之培養上清液回收並濃縮後，離子交換、逆相、凝膠（gel)過濾等之層析法 (chromatography)，或是以本發明之蛋白質所對應之抗體體固定至分離管柱應用親和力-層析法，或者是以這些分離管柱加以組合應用皆可能加以精製。此外，本發明之蛋白質以榖胱甘肽S轉移酶蛋白質之融合蛋白質，或是·組織胺酸 (histidine)以數個附加重組蛋白質在寄主細胞（例如動物細胞或大腸菌）内出現，將表現之重組蛋白質以榖脱甘肽 (glutathione)分離管柱或鎳（nickel)分離管柱加以精製。其後，因此必要融合蛋白質之中目的蛋白質以外之領域以凝血酶(thrombin)或Fact〇r_Xa等，以切斷、除去等方法就能加以調配。若為天然之蛋白質，例如，表現本發明蛋白質本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公楚） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I 丨 _線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 562807 A7 ___ B7 五、發明說明（10) 之細胞抽出物’以下述本發明之抗體與結合之親和力分離管柱作用後，加以精製分離亦為可行。此外’本發明與上述以本發明蛋白質為編碼之DN A 有關’本發明之DNA為凡以本發明之蛋白質為編碼並不計其形態為何。亦即不論任何以mRNA合成之cDNA或基因組(genome) DNA而來，還是化學合成DNA等。本發明之DNA為，例如，表現本發明蛋白質之細胞而來製作cDNA 庫（library)，本發明之dna序列（例如序列編號：3中所記載之DNA序列）之一部份製成探針(probe)後可以雜交方式進行調配。另外可由表現本發明蛋白質之細胞調製出 DNA，再以本發明之Dna序列（例如序列編號：3中記載之DNA序列）為基礎合成募（oligo)-DNA，將此以為引子 (primer)進行PCR反應，則可能調製以本發明蛋白質為編碼之延展後cDNA。本發明之DNA可當成本發明之蛋白質的重組蛋白質而利用其進行生產，且以本發明蛋白質為編碼之DNA若有缺陷之際，或為反向（antisense)阻礙機能，或正常基因之取代基因治療上之應用皆為考慮之列。其次，本發明與本發明之DNA所插入之載體有關。本發明之載體若以寄主為大腸菌為例，在大腸菌（例JM1〇9, DH5〇:，HB101，XLlBlue)等中大量擴大調整載體後，大腸菌亦增加故從中選擇具「〇ri」且形態改變之基因（例，任何藥劑（安比西林（ampicillin)或四環黴素（tetracycline)、卡那黴素（kanamycin)、氣黴素（chloramphenical))可予以判別之耐藥性基因）其他則無任何設限。例如，M13系載體，puc

系載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script 等等。另外 CDNA 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

562807 A7 B7 五、發明說明（11 ) 之次純群化（subdcming)換言之，除上述之載體外，pGEM_ T、pDIRECT、pT7亦為舉列之林。為生產本發明蛋白質而使用載體之際，表現型載體特有用。以表現型載體而言，例如以表現大腸菌為目的時，載體除具有大腸菌增生後的上述特徵外，寄生若為JM109、DH5a、ΗΒ101、XLlBlue 等大腸菌時’則不可不具備高效率地表現大腸菌之起動子 (promoter^例如，lac，T7等）。此種載體除上述媒介之外 pGEX、pEGEP或是pET (此時寄主為表現T7 RNA聚合酶(polymerase)之 BL21)等等。另外’方目的為表現CHO細胞、COS細胞、NIH3T3 細胞等動物細胞之際。則為了在細胞内之表現，必要的起動子（SV40, MMLV-LTR，EF12, CMV起動子等）是不可缺的，而且最好具有能在細胞中選出形態轉換之基因（例如，能以藥劑（新黴素(neomycin)、G418等）來辨別之耐藥性基因）。具此種特性之載體有如pMAM、pDR2、pBK_RSV、 pBK-CMV、pOPRSV、p〇P13 等等。再者，以在細胞内增加複製（C〇py)數為目的的寄主載體而言，順利產生細胞種株之情形時例舉了，使用具有能互補核酸合成步驟中所缺少CHO細胞之DHFR，基因之載體（例’ pCHOI等）力口上胺甲碟吟(Methotrexate ; MTX)而令其增加之方法，另外若以表現一過性為目的時，例舉了使用在染色體上具有SV40 T·抗原之COS細胞，而擁有SV40 複數機能的載體(pcD等）做形態轉換之方法。另一方面為了在動物體内檢測出本發明之DNA，在本文中亦列舉了一些方法，例如將本發明之DNA與適當本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 562807 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（12 ) 的載體組合之反轉錄病毒（retrovirus)法、微脂（liposome) 法、陽離子微脂（cationic liposome)法、腺病毒（adenovirus) 法等將DNA導入生體中。雖然所使用之載體並無將特別限制，但pAdexlow或pZIPneo卻為不錯之選。以本發明之DNA插入載體的基因操作可以一般常用方法進行（分子純群化（Molecular Cloning)，5·6-5·63)。其次，本發明與本發明之載體所導入之寄主細胞有關。本發明之載體所導入之寄主細胞並無設限，大腸菌或各種的動物細胞皆可能使用之。在大腸菌方面本文列舉了 Jml09、DH5a、ΗΒ101等，動物細胞雖例舉CHO細胞， COS細胞、3T3細胞、Hela細胞等，我們則特別偏愛能大量表現為目的之CHO細胞。再者，為了檢測生體中本發明之DNA所使用之細胞並不受特別限制，各種動物細胞皆在列舉之中，但在以基因治療骨頭相關疾病時，特別是自體内藥取之間葉系細胞、骨芽細胞等細胞為最佳標的細胞。在以載體導入寄主細胞時，我們可以使用磷酸舞法、 DEAE 葡聚糖（dextran)法、電穿孔（electroporation)、脂感染（lipofection)等方法。 - 另外，本發明為與本發明之蛋白質所結合之抗體有關。本發明之抗體形態並無特別限制，除含多株抗體外亦含單株抗體。除此亦包含著以兔子等動物免疫所得之抗灰清，全部之多株及單株抗體，及人類抗體或基因重級法所得之人類型式化抗體。本發明之抗體皆可以下列方法進行調配，就拿多株而言，例如，將本發明之蛋白質種入兔子 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

562807 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 __—______ ____B7 五、發明說明（Π ) 等小動物體内得到免疫血清，再以結合本發明蛋白質之親和力分離管柱區分出本發明之蛋白質，並將此蛋白質以免疫球蛋白G或Μ，以蛋白質A或G之分離管柱加以精製後調配乃屬可能。此外，單株抗體則是本發明之蛋白質令其在小白鼠等小動物體内產生免疫，將此小白鼠之脾臟取出，將之研碎後與小白鼠骨髓腫瘤細胞及聚乙二醇 (polyethylene glyC0l)等試藥融合，如此所得之融合細胞 (hybridoma)中，選出應對於本發明之蛋白質之抗體所產生之純群物（clone)。再來將此融合細胞移植入小白鼠腹腔中，並回收其腹水，所得之單株抗體可以下列，例如，硫酸胺沈叙、蛋白質A、蛋白質〇、分離管柱、DEAE離子交換層析法，本發明蛋白質所結合(c〇upling)之親和力分離管柱等方法加以精製後調製。本發明之抗體為本發明蛋白質之精製檢出時可用外亦可應用於骨相關疾病之抗體治療時使用。在應用於抗體治療時，因為降低免疫原性，此時以人類抗體或人類變抗體為佳。再者，本發明為，利用本發明之蛋白質，與本發明蛋白質結合之化合物之筛選方法及該篩選法所分離之合化物 (例如，配位體，興奮劑及拮抗劑）有關連。 · 此種篩選方法之形態之一為，（a)使被檢驗試料與本發明蛋白質之接觸步驟，（b)具與本發明之蛋白質結合活性化合物之選擇步驟等，皆包含在其中，使用本篩選方法時被檢試料並無特別限制，例如細胞抽出物、細胞培養上清液、蛋白質胜肽(peptide)，合成低分子化合物等。與被檢驗試料接觸之本發明蛋白質為，例如以精製後蛋白質而言，細本紙張尺度適W國國家標準（CNS)A4規格⑵Q χ撕公餐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

t MB ana μ· MB AM I mm μ· β··ιι mm 1 aw · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 562807 . A7 ------- B7 五、發明說明（14) 胞膜上可此表現之形態，或是細胞膜區分，皆可與被檢驗試料與之接觸、被檢驗試料對本發明蛋白質之結合活性，例如，後述本業者所習知之方法皆可使用。另外’其化一的形態為，（a)在細胞表面上表現之本發明蛋白質可被檢驗試料之接觸步驟。（b)本發明蛋白質之骨細胞分化誘導活性的檢出步驟。（c)於被檢驗試料不存在下所做之檢出步驟比較，包含促進或阻礙本發明蛋白質之骨細胞分化誘導活性之化合物的選擇步驟。以檢出本發明蛋白質之細胞而言，以本發明到有與本發明蛋白質所結合配位體之細胞為佳。本發明蛋白質於細胞表面上之表現可以，例如，以本發明蛋白質為編碼之DNA插入適當的載體中，再將之導入細胞内來達成。本發明蛋白質之骨細胞分化誘導活性為，例如以顯微鏡觀察骨細胞之形態學，測定為骨細胞分化記號之鹼性磷酸酶活性之方法等皆可能將之檢測出來（N.C· Partring，D· Alcorn，V· P· Michrlangrli，G. Ryan & T.J.Martin (1983) Cancer Res. 43:4308-14, Morphological and biochemical characteriza-tion of four clonal osteogenic sarcoma cell lines of rat origin、J.K· Burns & W.A· Peck (1978) Science 199:542-4· Bone celts: a serum-free medium supports proliferation in primary culture) 0 對於鹼性磷酸酶活性之測定法為，將細胞以超音波震碎破壞後取得細胞抽出液，將此有鹼性磷酸酶基質之對-硝基苯攝酸(p-nitrophenylphosphate)共同培養(inubate)後。分解所產生之對-硝基苯(p-nitrophenol)的量可以分光光度計加以定量。除此，骨鈣素（osteocalcine)或膠原蛋白型式I為指標 17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

562807 A7 ______ B7 五、發明說明（15) 加以檢測出來。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 — — — — — — — — — — — J- · I I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 具體的方法而言，下列皆為可行。以本發明蛋白質分離其相對之配位體的方法，例表現配位為主之假設細胞（例如，KUSA 細胞、ROS17/2.8 細胞、UMR106-01 細胞、 URM106-06 細胞、MC3T3E1 細胞、MOS-TE85 細胞、MG63 細胞、SaOS2 細胞、UMR206 細胞、RCT1 細胞、C3H10T1/2 細胞等骨芽細胞種株，0P9細胞、基質（stroma)細胞、NTH3T3 細胞等纖維芽細胞等），使用其嗟菌體載子(phagevector載體)Ugtll，ZAP等等）來製作CDNA庫，此以LB-瓊脂糖上發現過濾器（filter)之表現蛋白質加以固定，本發明蛋白質以生物素標識(biotin-label)，或與GST蛋白質所融合之蛋白質為精製後，與上述之過濾器反應，其表現結合蛋白質之溶菌斑（plaque )、可以抗生蛋白鏈菌素（streptoavidin)、或抗GST抗體加以檢測出來，而亦可能以「西方點墨法」 (Skolnik EY，Margolis B，Mohammadi M，Lowenestein E， Fischer R，Drepps A，Ullrich A，and Schlessinger J (1991) Cloning of P13 kinase-associated p85 utilizing a novel method for expression/ cloning of target proteins for receptor tyrosine kinases. Ce// 65:83-90)加以調整。另外，令本發明之蛋白質與SRF結合領域GAL4結合領域融合，在酵母細胞中表現，以表現配位體為假設細胞，製作用以表現VP16 或GAL4轉錄活性化所融合形態之cDNA庫，將上述之酵母細胞導入檢出之陽性純群物（done)中庫由來之cDNA分離後導入大腸菌中令其檢測酵母細胞中若發現與發明蛋白質結合之蛋白質，因二者之結合，報導（reP〇rter)基因被活 18 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 562807 A7 __-_ B7 五、發明說明（Π) 到以該配位體為編碼之dna 。在此，本發明中之配位體乃指在細胞膜上表現，能以與本發明蛋白質結合，而使其機能活性化之蛋白質而言。另外，以本發明之蛋白質分離該蛋白質之興奮劑及拮抗劑的方法，例如令化合物或天然物銀行(bank)或是隨機噬菌體胜肽表現庫與固定之本發明蛋白質作用，篩選結合分子的方法，組合化學（combinatorial chemistry)技術由來的，使用高產量（high throughput)筛選。（Wrighton NC; Farrell FX; Chang R; Kashyap AK; Barbone FP; Mulcahy LS; Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK; Dower WJ, Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (UNITED STATES) Jul. 26, 1996, 273, p.458-64、Verdine GL·，The combinatorial chemistry of nature· Nature (ENGLAND) Nov. 7, 1996, 384, p.ll-13、Hogan、JC Jr.，

Directed combinatorial chemistry. Nature (ENGLAND) Nov. 7，1996, 384, ρ·17·9)。進而分離出本發明蛋白質之興奮劑及拮抗劑的方法是眾所周知的技術。在此本發明中之「興奮劑」是為能夠引起與蛋白質和配位體之結合有個相同j見象（本發明蛋白質之活性化），能夠與本發明之蛋·白質有特殊地結合的分子而言。相反地「拮抗劑」則是指抑制本發明蛋白質之特殊地結合機能的分子。以這些方法所分離出來之配位體、興奮劑、拮抗劑將可以應用於如下所述各項中。例如，由投入配位體、興奮劑、拮抗劑產生骨芽細胞的分化誘導、活性化的弓丨發，對隨年齡增加所伴隨之骨質疏鬆症，或變形關節炎之骨質量 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 562807 A7 丨丨__B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（18 ) 的改善或骨形成之促進，或是利用對骨腫瘍之骨細胞分化的抑制機能進行抗癌治療。圖示之簡單說明圖1為，群純物7F4之含開放譯讀架（open reading frame) cDNA序列及其胺基酸序列圖。上半段為鹼序列，下半段為胺基酸序列。下方畫線者為2個疏水性領域推測分別為N端為訊號序列，C末端為GPI連結子（linker)之置換領域。圖2為，7F4及小白鼠TNFR在細胞外領域之胺基酸序列比較示意圖。上半段為7F4，下半段為小白鼠受體之細胞外領域之胺基酸序列。相同之半胱胺酸以中空體書寫，其餘一致的胺基酸則以畫線表示。圖3為，各種之小白鼠組織之7F4基因的表現，以北方點墨（Northern Blot)解析後之電泳圖。圖4為，各種人類組織之7F4基因的表現，以北方點墨解析後之電泳圖。圖5A為，7F4蛋白質之疏水性示意圖，圖橫軸的左側為7F4蛋白質之N末端側，右側則為c末端側。另外圖之縱軸表示疏水性之程度。圖5B為，KUSA細胞表面上的7F4蛋白質，及令7F4飽和表現之2種群純物其PI特殊的碟脂酶C處理後之細胞表面上之7F4蛋白質檢出圖。圖形之點線為末處理的細胞之結果，實線則是處理後細胞之結果。圖之縱轴為細胞數，橫軸則為細胞之螢光強度表示0 圖6為’ TNF受體屬超級家族分子之構造示意圖。半 21 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 黪裝訂·· % 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 562807 A7 B7 五、發明說明（20 ) 以下列步驟建立之。插入人類全長IL-2受體基因之質體 (plasmid)「pk CR· Tac-2A」（從理研y—>八 > 夕購入）以 EcoRI、Eco47III切取後，得到以Tac全長為編碼之基因片段。另一方面，動物細胞用之表現載體「pCD-SR a -FE」 (Takebe Y，Seiki M，Fujisawa J，Hop P，Yokota K，Yoshida Μ， Arai N，Mol. Cell Biol. 8:466-472 (1988) SR alpha promoter ： an efficient and versatile mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 early promoter and the B-U5 segment of human T-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat)。在本來具有的 Sacl 部位上消除後，以EcoRI切斷之。於是，將上述之Tac之全長為編碼之基因片段插於此，因而建立「pSRa Tac」（此質體因切斷EcoRI、Sacl，故可能除去Tac之訊號序列的領域）。「5’ enriched cDNA library」的製作。首先，將來自 KUSA細胞所調製之mRNA5 /zg以隨機引子法合成第一條cDNA鏈。在其5’的末端，以「終端核苷酸轉移酶 (terminal nucleotidyl transferase)」dC 接於尾部後，用擁有 EcoRI 部位之引子「 5，-GCGGC-CGCGAATTCTGACTAACTGAC-(dG)17 (序列編號：4)」。再依Tag DNA聚合酶合成第二條鏈。將此以超音波震碎後選擇適當長度之片段，並使其末端平滑後，以Sacl連接子Θ末端為「CCGCGAGCTCGATATCAAGCTTGTAC (序列編號：5)」、3’ 末端為 GGCGCTCGAGCTATAGTTC-GAACATGGAG(序列編號：6)」）插入兩端。以此為鑄模，以 2 支引子（「5’-GAGCTACAAGCTTGATATCGAG- 23 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） •丨丨丨丨丨丨丨丨丨ΙΊ ^一 · I I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · · 線丨！經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 562807 A7 B7 五、發明說明（21 ) CTCGCGG-3,(序列編號：7)」、「5，_GCCGCGAATTCTG_ ACTAACTGAC-3，（序列編號：8)」）進行PCR將cDNA片段增補。其後，15%瓊脂糖電泳進行，並於凝膠中切取出約400bp之片段，以EcoRI、SacI切斷之。將這些插入以上述方法製作之表現載體「pSRa-TACII」之EcoRI、SacI 之間。接著，以此cDNA庫作出大腸菌JM109之轉移 (transform)，以49個獨立群純物為1個集合（p0〇l)，製作出許多集合依各集合調製質體利用脂感染胺 (lpofectAMINE)導入C0S-7細胞中。2天後，細胞以0.05% EDTA/PBS進行脫洗，1次抗體之小白鼠抗il-2受體 (Tac)IgG抗體，2次抗體之FIT (標識山羊抗小白鼠igG抗體用以做細胞表面染色，細胞表面之表現細胞之Tac蛋白質用Flowcytometer (ELITE)加以篩選。Tac陽性之集合則再次加以分割，並重覆此步驟一直到得到單一之群純物為止。這結果得到3個具有訊號序列之新穎基因的群純物。其一為基礎膜蛋白質之構成蛋白質之一 entactin中之高相似性）的新穎基因（Entactin2)，其二為將膜實通5到7次型式的膜蛋白質，其三為具有在TNF受體超級-家族中保存系統(system)纏繞主要素之新穎基因（此群純物以下稱之為「7?4」）。在群純物7卩4中僅含約40(^?之片段。【實施例2】全長cDNA之純群化及鹼基序列的決定為分離較長片段，將此片段作探針再以KUSA細胞之 cDNA庫而來，依溶菌斑雜交進行7F4基因之純群化。首

先，「oligo dT priming」之「KUSA cDNA 庫」以 KUSA 細胞所抽出之mRNA，遵循「ZAp_cDNA庫」50萬群純 24 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝·！-----訂丨f---^----線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 562807 A7 B7 五、發明說明（22) 物份之噬菌體廣佈於盤之上，SST法所得之7F4之CDNA 片段之一部份以α32ρ dCTP做標識(label)，將此為探針進行溶菌斑雜交。固定庫之過濾器以雜交緩衝液（50%甲醛、 5X SSPE、5X 丹哈特（Denhardt’s)溶液、〇·ι% SDS、0.1 mg/ml 鯡魚精子DNA)在42°C經6小時左右培養後，換成含探針之同緩衝液(buffer)在42°C下過夜(overnight)培養。之後，以 2X SSC-0.1 % SDS 洗淨數回後，0.1X SSC-0.1 % SDS 在60QC下30分左右洗淨2次，再以自動放射圖譜 (autoradiography)檢測出來。陽性群純物而來，將此以「ExAssist helper phage」（Stratagene 公司製）進行質體 pBluescriptn之切取。所得之質體含啟始編碼約為3kb之 cDNA片段。此cDNA之驗基序列為依循引子步讀（primer walking)之決定法（依 ABI PRISM sequencing kit)決定驗基序列。所決定出之鹼序列而來推測之胺基酸序列為基礎進行相似性檢索，此時相同之基因並無列出，故可了解7F4 為編碼之基因為新穎之物質（圖1)。因深具興趣，純群物 (clone) 7F4在膜上表現之必要訊號序列之外，與TNF受體共同保存3個富含半胱胺酸重覆主要素，故可判定7F4為 TNF受體超級家族所屬之新穎膜蛋白質（圖2)。-【實施例3】北方點墨法對小白鼠使用「Mouse multiple northern(MTN)blot」 (CLONTECH公司製），對人貝ij使用「human MTN blot」 (CLONTECH公司製）之過渡器。含7F4 cDNA之ORF領域 (驗基號碼 120-480)以「multi-prime rebelling」之 CK32p 來標識，將此為探針進行雜交。小白鼠以「EcpressHyb 25 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----I - — — — — 1 · I I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 562807 A7 B7 五、發明說明（23 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Hybridization sol，n」（CLONETECH 公司製）在 68。(：下約 2 小時左右培養，2X SSC-0.1% SDS 數回，〇·1Χ SSCMU% SDS 在60°C下洗淨2回左右。對人而言，「ExpressHyb Hybridization sol’n」（CLONETECH 公司製）在 68°C 下培養 4小時左右，2X SSC-0.05% SDS在42°C下，10分鐘洗淨 2回。之後以「BAS2000」（FUJI公司製）檢測出來。其結果顯示，在小白鼠上，不論任何組織皆有偏高的表現（圖3)，而在人體上雖亦有如此之表現，但以骨骼肌及心臟特別之高，此乃其特徵（圖4)。另外，小白鼠與人皆在約5 kb的位置上檢出帶(band)，此基因之mRNA大小可知約為5 kb 左右。 · 【實施例4】GST融合蛋白質之表現與精製經濟部智慧財產局員工消費合作社印製含 7F4 cDNA 之 ORF 之質體「pBluescript-7F4」為鑄模，以序列編號：9及10中所記載2個引子進行PCR，擴展以7F4基因之細胞外領域為編碼之基因。再以BamHI· EcoRI切斷後，「pGEC-2」（Pharmacia公司製)之GST下段基因插入。以此質體做形態轉換之JM109，添加0·5 mM IPTG後誘導GST融合蛋白質3小時之後再做大腸菌之集菌，並以1 mg/ml溶菌酶(lysozyme)之超音波緩衝·液(25 mM Tris pH 8.0、10 mM EDTA、1 mM PMSF)加以懸浮，其後置於冰中30分鐘再以超音波震碎，接著離心，回收上清液。將此使用「Bulk GST Purification Module」（Pharmacia 公司製）之「Glutathione Sepharose 4G Column」（Pharmacia 公司製），依循步驟將目標之蛋白質溶出後精製。蛋白質以 10% SDS PAGE進行，孔雀藍（CBB)染色。另外，以使用 26 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2〗0 X 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 562807 A7 ------B7 五、發明說明（24) 抗GST抗體之西方點墨法加以確認。【實施例5】抗血清之製作將精製完成之7F4-GST融合蛋白質以PBS緩衝液置換後’在兔子身上進行免疫。免疫於2週内進行，第1次為600 /zg/head’第二次以後為200 //g/head，第3回終了時並將少量血以ELISA進行力價評估。為了判定其結果抗體力價充分上昇，之後進行最終免疫，並以心採血的方式實行全採血工作。【實施例6】7F4基因表現種株之建立，將含有7F4全ORF之基因以序列編號：11及序列編號：12中記載之2個引子進行PCR擴展後以EcoRI_BamHI 切斷之。藥劑選用記號為具有新黴素基因之表現載體「pCOSI」（Sato K，Tsuchiya M，Saldanha J，Koishihsrs Y， Ohsugi Y5 Kishimoto T5 Bendig MM. (1994) Mol Immunol 31:371-381， Humanization of a mouse anti-human interleukin-6 receptor antibody comparing two methods for selecting human framework regions)之 EF1 α 起動子之下段插入此基因之片段，建立「pCOSI-7F4」。此質體25 /z g 以pvul切斷後，KUSA細胞（7xl06 cells)中·以電穿透 (elctroporation)，（1.6 kV、25 /z F、timeconst 0·36)導入含 G418, 480 /zg/ml之培養皿中（IMDM+10% FCS)做數日培養，產生之群純物中選擇十幾個群純物。這些群純物之細胞表面以抗血清（xlOOO)及FITC標識抗一兔IgG(H+L)染色後，再以「Flowcytometer ELITE」（COULTER 公司製）進行分析，與母株細胞比較後選擇7F4基因表現量高者。 27 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

562807 A7 B7 五、發明說明（26) 定的磷脂酶C處理後，所有之細胞種株上的細胞表面上之 7F4蛋白質陽性細胞數有減少現象發生（圖5B)。由此我們可知細胞表面上之7F4分子構造為磷脂醯肌醇-特定的璘脂酶C切斷。由此結果得知，7F4基因與細胞表面上之Gi>I錫狀物結合表現亦即可能為GPI型膜蛋白質。【實施例8】由「7F4」蛋白質之過飽和表現，檢測出細胞之增殖、分化及驗性填酸酶活性之變化 (1) 7F4基因表現細胞種株之建立 7F4基因在EF 12起動子之支配下，其一之表現載體 pCOSI-7F4、25 /z g 以 pvul 切斷後，再以 KUSA (7xl〇6 cells) 或 CHO 細胞中電穿透（electroporation) (1.6 kV、25 /z F、 timeconst 0.36)進行導入，G418 含 480 /zg/ml 之培養皿 (IMDM+10% FCS 或是 α-ΜΕΜ+10% FCS)在數日培養後，得到十數個群純物。這些群純物的細胞表面以7F4抗血清 (xlOOO)及標識FITC抗兔IgG(H+L)染色後，以

Flowcytometer ELITE進行分析，選擇數個較母株或CHO 之7F4基因表現量為高者。由此，導入pcosuj^得到「7F4」蛋白質之弱表現形態轉換體#11。這些形態轉換體注連流培養後，細胞形態發生顯著變化。母株的.KUSA為細長之纖維芽細胞形態，形態轉換體則是細胞中廣佈著細小突起。 (2) 增殖之解析以12個混合良好盤（weiipiate)中5xl〇3細胞/well (KUSA細胞）、lxl〇3細胞/weu (ch〇細胞）進行培養後，連續定時的剝離細胞計算細胞數因，形態轉換體之外來性 29 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 Χ 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝·-------訂ί·---^----線邊經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 562807 A7 ___________ B7 五、發明說明（27) 7F4之表現標識(label)以#11為最高，其次#8、#5為中等， #2為最低。這些與母株之細胞增殖做比較後其外來性之7F4 表現量為相對性的降低（圖7)。這些實驗結果說明7F4基因之高表現乃因KUSA之骨芽細胞所誘導之形態轉換。 (3)鹼性磷酸酶活性的測定在6個well中培養之細胞以PBS洗淨2次後，以700 β 1 之超音波緩衝液（50 mM Tris，pH 7.2, 0.1% Triton X-100) 進行細胞脫洗。輕輕地將此以超音波震碎後，以15000 rpm，15分鐘離心後，用「蛋白質分析套組」（Bio-Rad公司製）測定蛋白質濃度，以相當於2至20 /zg之細胞溶解物為基質，加入等量之含對-硝基苯磷酸緩衝液(0.1 Μ 2-胺基 _2_ 甲基-1·丙醇（2-amino_2-methyl-l-propanol)/HCl pH 10.5,2 111]^]^8〇：12)，在37。€：下培養30分鐘。之後，加\&011 至〇·1 N後停止反應，所產生之對·硝基苯的量再以〇D4()5 比色法定量做。母株KUSA及形態轉換體#2、#1培養後， 80%細胞在融合之際，亦即細胞在增殖期，依細胞調製細胞溶解物，骨芽細胞之分化記號之一，細胞内之鹼性碟酸酶活性加以測定之。其結果亦說明與7F4之表現量相關，鹼性磷酸酶活性亦有上昇現象（圖8)。 · 同樣的實驗在CHO細胞中進行。與KUSA細胞相同地，以pCOSI-7F4導入CHO細胞中，建立了數種類之外來性7F4高表現種株（圖9)。其次，7F4之表現以來這形態轉換體的增殖產生了什麼樣的影響進行解析。與推測相反地，在CHO細胞、7F4基因之高表現事實完全不受細胞增殖所影響（圖9)細胞形態全無改變。 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 0 裝-------I Γ I I ^----線邊經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 562807 A7 B7 五、發明説明（3〇 )

Pro Gly Thr Phe Thr Gly'Lys Asp Asn Gly Leu His Asp Cys Glu Leu 50 55 60

Cys Ser Thr Cys Asp Lys Asp Gin Asn Met Val Ala Asp Cys Ser Ala 65 70 75 80

Thr Ser Asp Arg Lys Cys Glu Cys Gin lie Gly Leu Tyr Tyr Tyr Asp 85 90 95

Pro Lys Phe Pro Glu Ser Cys Arg Pro Cys Thr Lys Cys Pro Gin Gly 100 105 HO lie Pro Val Leu Gin Glu Cys Asn Ser Thr Ala Asn Thr Val Cys Ser 115 120 125

Ser Ser Val Ser Asn Pro Arg Asn Trp Leu Phe Leu Leu Met Leu lie 130 135 140

Val Phe Cys lie 145 序列編號：2 序列的長度：148 拓撲性：直鏈狀序列的種列··蛋白質序列

Ala Met Pro Glu Ser Tyr Ser Phe Asn Cys Pro Asp Gly Glu Tyr Gin 15 10 15

Ser Asn Asp Val Cys Cys Lys Thr Cys Pro Ser Gly Thr Phe Val Lys 20 25 30

Ala Pro Cys Lys lie Pro His Thr Gin Gly Gin Cys Glu Lys Cys His 35 40 45 33 本紙張尺度適用中®固家橾率（CNS ) Α4说格（210Χ 297公？） (請先閱讀背¾之注意事項再填寫‘

、1T 經濟部中央標隼局貝工消资合作社印¾ 562807 經濟部中央標隼局員工消资合作杜印¾ A7 _ B7五、發明説明（3l ) Pro Gly Thr Phe Thr Gly Lys Asp Asn Gly Leu His Asp Cys Glu Leu 50 55 60 Cys Ser Thr Cys Asp Lys Asp Gin Asn Met Val Ala Asp Cys Ser Ala 65 70 75 80 Thr Ser Asp Arg Lys Cys Glu Cys Gin lie Gly Leu Tyr Tyr Tyr Asp 85 90 95 Pro Lys Phe Pro Glu Ser Cys Arg Pro Cys Thr Lys Cys Pro Gin Gly 100 105 110 lie Pro Val Leu Gin Glu Cys Asn Ser Thr Ala Asn Thr Val Cys Ser 115 120 125 Ser Ser Val Ser Asn Pro Arg Asn Trp Leu Phe Leu Leu Met Leu lie 130 135 140 Val Phe Cys lie 145 序列編號：3 序列的長度：1509 鏈數：二股鏈拓撲性：直鏈狀序列的種列：cDNA to mRNA 序列的特徵表示特徵的記號：CDS — 存在位置：12..542 決定特徵的方法：E 表示特徵的記號 34 (請先閲讀t-面之注意事項再填寫本頁) 本纸乐尺度適用中S囷家標準（CNS ) Λ4現格（210X 297公犮} 562807 A7 B7 五、發明说明（32 ) 存在位置：12..95

決定特徵的方法：S

表示特徵的記號：mat peptide 存在位置·· 96..542 決定特徵的方法：S 序列 AGCTCACAGC C ATG GTT ACC TTC AGC CAC GTC TCC AGT CTG AGT CAC 47

Met Val Thr Phe Ser His Val Ser Ser Leu Ser His -28 -25 -20 TGG TTC CTC TTG CTG CTG CTG CTG AAT CTG TTC TTG CCG GTA ΑΤΑ TTT 95

Trp Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Asn Leu Phe Leu Pro Val lie Phe -15 -10 - 5 GCT ATG CCT GAA TCA TAC TCC TTC AAC TGT CCC GAT GGT GAA TAC CAG 143

Ala Met Pro Glu Ser Tyr Ser Phe Asn Cys Pro Asp Gly Glu Tyr Gin 15 10 15 TCT AAT GAT GTC TGT TGC AAG ACC TGT CCC TCA GGT ACA TTT GTC AAG 191

Ser Asn Asp Val Cys Cys Lys Thr Cys Pro Ser Gly Thr Phe Val Lys 20 25 30 經濟部中央標率局貝工消费合作社印裝 GCG CCC TGC AAA ATC CCC CAT ACT CAA GGA CAA TGT GAG AAG TGT CAC 239

Ala Pro Cys Lys He Pro His Thr Gin Gly Gin Cys Glu Lys Cys His 35 4〇 45 CCA GGA ACA TTC ACA GGG AAA GAT AAT GGC CTG CAT GAT TGT GAA CTT 287

Pro Gly Thr Phe Thr Gly Lys Asp Asn Gly Leu His Asp Cys Glu Leu 5〇 55 60 _ 35 本紙張尺度適用中gg家標隼（CNS ) A復格（21〇χ29·7公s ) 562807 A7 A7 B7 五、發明说明（33 ) TGC TCC ACC TGT GAT AAA t；AC CAG AAT ATG GTG GCT GAC TGT TCT GCC 335

Cys Ser Thr Cys Asp Lys Asp Gin Asn Met Val Ala Asp Cys Ser Ala 65 70 75 80 ACC AGT GAC CGG AAA TGC GAG TGC CAA ATA GGT CTT TAC TAC TAT GAC 383

Thr Ser Asp Arg Lys Cys Glu Cys Gin lie Gly Leu Tyr Tyr Tyr Asp 85 90 95 CCA AAA TTT CCG GAA TCA TGC CGC CCA TGT ACC AAG TGT CCC CAA GGA 431

Pro Lys Phe Pro Glu Ser Cys Arg Pro Cys Thr Lys Cys Pro Gin Gly 100 105 110 ATC CCT GTC CTC CAG GAA TGC AAC TCC ACA GCT AAC ACT GTG TGC AGT 479 lie Pro Val Leu Gin Glu Cys Asn Ser Thr Ala Asn Thr Val Cys Ser 115 120 125 TCA TCT GTT TCA AAT CCC AGA AAC TGG CTG TTC CTA CTG ATG CTA ATT 527

Ser Ser Val Ser Asn Pro Arg Asn Trp Leu Phe Leu Leu Met Leu lie 130 135 140 GTC TTC TGT ATC TGAAGAAGAT AAAGGTTCTA CAGATGGTGT CTGTAGCTTC 579

Val Phe Cys lie 145 CTTTTATTGC TGTGAAGAGA AACCATGGAG GCAACTCTTT CATTTTATTT TATTTTTTAA 639 TGTCnGAAC TTGATTTGAA GACCAGGCTG GACTCAAACT CACAGAGATC CGGACTAGGC 699 ACCTCTAATA TAGGAAAACA TTGAATTGGG ACTGGCTTAC AGTTTCAGAA GTTCTGTCCA 759 TGATTATCAT AGTGCGAAGC ATGGAGGCAC GGAGGCACAC ATGGTGCTGG AGAAGAAGCT 819 GAGAGTTCTG CATCTTGATC TGCAAGCAAT AAAAGGAGAC TGTGTGCCAC ACTACACATA 879 GCTTGAACAT AGGAGACCTC AAAGCCTGTC CCCACAGTGA CAAACTTCCT CCAACAAGGT 939 CATACCTCCT AATAATACCA TTTCTTATGA GGCAAGCATT CAAACACATG AGTCTATGAG 999 GGCCAAACCA ATTCAAACCA CCACAGGTTA ACAAHGCCC TCTGCAGCTC TCTGGTGGAG 1059 36 本纸張尺度適用中S國家標準（CNS ) Λ4坭格（2丨〇X 297公# > 請先閲讀背- ιέ 注意- 本項再填-

經濟部中央標率局貝工消资合作社印裝經濟部中央標隼局負工消費合作社印¾ 562807 Α7 Β7 五、發明说明（34) GCCCTCCTTG AGAGTAAGTA AQAATTTAGA TGAAGGCAAG TCCTGGTATC AGGTCCAAAA 1119 GAAACTCAGG ATGAATGGTC CACTGTGGTT CCTATTAACA TACTGAAGAA CATGACCTCA 1179 CCTTAGACTT CTCCACCTCA CTGGCTTCCC TTCCCCTAGC TTCTCATTCC CAGGTAACCC 1239 TGCCATTTTT TGGTAATGTG CCTTCTTGGT TCTTCCTCTC CTTTCCCCCT CTCTTCTGGT 1Z99 CCTTATTTCT CTTCCTCTCC CACTCTCCAC CAGCCGCCTC TTAAGGCCTG AGTCAGTCTG 1359 CAGGCCATGT TTAATCTACT ACTTTCTCTC TGCTCTGGAC TCATCCAGAT GTCTCTGGCT 1419 GAGCTCTCCC TCCTATCTAC AATAAAACCT TCCCCCTAAC CAGAAATGGA ACAGTTTTGT 1479 CCTCACTTTG TACATCTGGT GCCTGAAACC 1509 序列編號：4 序列的長度：43 鏈數：一股鏈拓撲性：直鏈狀序列的種類：其他核酸合成DNA 序列 GCGGCCGCGA ATTCTGACTA ACTGACGGGG GGGGGGGGGG GGG 43 序列編號：5 序列的長度：26 鏈數：一股鏈拓撲性：直鏈狀序列的種類：其他核酸合成DNA 序列 CCGCGAGCTC GATATCAAGC TTGTAC 26 序列編號：6 _ 37 本紙張尺度適用中SS家標隼（CNS ) A4堤格（210x297公ίΓ) """

562807 A7 B7 經濟部中央標準局員工消資合作社印¾ 五、發明説明（35 ) 序列的長度：29 鏈數：一股鏈拓撲性：直鏈狀序列的種類：其他核酸合成DNA 序列 GGCGCTCGAG CTATAGTTCG AACATGGAG 29 序列編號：7 序列的長度：29 鏈數：一股鏈拓撲性：直鏈狀序列的種類：其他核酸合成DNA 序列 GAGGTACAAG CTTGATATCG AGCTCGCGG 29 序列編號：8 序列的長度：23 鏈數：一股鏈拓撲性：直鏈狀序列的糧類··其他核酸合成DNA 序列 GCCGCGAATT CTGACTAACT GAC 23 序列編號：9 序列的長度：24 鏈數：一股鏈 38

本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4坭枋（210X29*7公兑） 562807 Δ1 Α7 Β7 經濟部中央標準局貝工消资合作社印¾ 五、發明説明（36) 拓撲性：直鏈狀序列的種類：其他核酸合成DNA 序列

GGATCCTTCA ACTGTCCCGA TGGT 序列編號：10 序列的長度：26 鏈數：一股鏈拓撲性：直鏈狀序列的種類：其他核酸合成DNA 序列

GAATTCCACA CAGTGTTAGC TGTGGA 序列編號：11 序列的長度：36 鏈數：一股鏈拓撲性：直鏈狀序列的種類：其他核酸合成DNA 序列

CCGAATTCCA CCATGGTTAC CTTCAGCCAC GTCTCC 序列編號：12 序列的長度：35 鏈數：一股鏈拓撲性·直鍵狀

序列的種類：其他核酸合成DNA 39 本紙張尺度適用中gg家標率（CNS ) A4現袼（210X29*7公ft )

A7 562807 B7 五、發明説明（37 ) 序列 CCGGATCCTC AGATACAGAA GACAATTAGC ATCAG 35 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 40 本纸張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Λ4说格（210X29*7公筇）

Claims

562807 弟87104857號由古矣蛮υ π㈤, ---—-- I u尸』m |τ「ιτπι r η 丁 I--二·六、申請專利範圍I争月曰修正1 · 一種小鼠來源且具有對骨; 一日期:92.9.9 .一一{一 v 經濟部智慧財產局員工消賢合作社印製細胞分化誘導活性之蛋白貝、其為（a)[序列編號：1 ]或（b)[序列編號：2]中所記載之胺基酸序列所構成，上述序列如下所示：(a)[序列編號：1 ] het Val Thr Phe Ser His Val Ser Ser Leu Ser His -28 -25 -20 Trp Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Asn Leu Phe Leu Pro Val lie Phe -15 -10 -5 Ala Met Pro Glu Ser Tyr Ser Phe Asn Cys Pro Asp Gly Glu Tyr Gin 1 5 10 15 Ser Asn Asp Val Cys Cys Lys Thr Cys Pro Ser Gly Thr Phe Val Lys 2〇 25 30 Ala Pro Cys Lys lie Pro His Thr Gin Gly Gin Cvs Glu Lys Cys His 35 40 45 Pro Gly Thr Phe Thr Gly Lys 人sp 人sn Gly Leu His 人sp Cys Glu Leu 50 55 60 Cys Ser Thr Cys Asp Lys Asp Gin Asn Met Val Ala Asp Cys Ser Ala 65 70 75 80 Thr Ser 人sp Arg Lys Cys Glu Cys Gin lie Gly Leu Tyr Tyr Tyr Asp 85 90 95 Pro Lys Plie Pro Glu Ser Cys Arg P「〇 Cys Thr Lys Cys Pro Gin Gly 100 105 1 10 1U Pro \，al Leu Gin Glu Cys Asn Ser Thr 人U Asn Thr Yal Cys Ser 41 本紙張尺6適用中舀舀家標準（CNS)A4規格（2】〇x297公犮) (请先閱讀背面之注意事項再填寫訂. -線 562807 B8 C8 DS 經濟部智窆財產局員工消费合作社印製六、申請專利範圍 115 120 125 Ser Ser U Scr /‘3n Pro Arc Asn T「p Leu Phc Leu Leu Met Leu lie 130 135 140 Va 1 Plie C.vs 11c 145 (b」[序列編號：2 ] 人la Met Pro Glu Ser Tyr Ser Phe 人sn C'ys Pro Asp Gly Glu Τ}τ Gin 1 5 10 15 Ser Asn Asp Val Cys Cys Lys Thr Cys Pro Ser Gly Thr Phe Val Lys 20 25 30 Ala Pro Cys Lys lie Pro His Thr Gin Gly Gin Cys Glu Lys Cys His 35 40 45 Pro Gly Thr Phe Thr Gly Lys Asp Asn Gly Leu His Asp Cys Glu Leu 50 55 60 Cys Ser Thr Cys Asp Lys Asp Gin Asn Met Val Ala Asp Cys Ser Ala 65 70 75 80 Th「Ser Asp 人rg Lys Cys Glu Cys Gin lie Gly Leu Tyr Tyr Tyr Asp 85 90 95 Pro Lys Phe Pro Glu Ser Cys Arg Γ「ο Cys Thr Lys Cys Pro Gin Gly 100 105 1 10 lie Pro Yal Leu Gin Glu Cys 人sn Ser Thr Ala 人sn Thr Val Cys Ser 115 120 125 Scr Se「Yal Sc「/‘sn Pro /'rc Trp Leu Phe Leu Leu HeL Leu He 130 135 140 42 (請先fiatt背面之注意事項再填寫裝訂· 綉本紙張尺度述厗中§圉家標準（CNS)A4規格（2]0<297公g ) B8 C8 D8 562807 六、申請專利範圍 Val Phc Cys Π e 145 2· —種小鼠來源且具有骨細胞分化誘導活性之蛋白質’其為[序列編號：3 ]之驗基序列所構成的DNA及其簡併序列所編碼之蛋白質，上述序列如下所示： · [序列編號：3 ] — AGCTCACAGC C ATG GTT ACC TTC AGC CAC GTC TCC AGT CTG ACT CAC 47 Ket Val Thr Phe Ser His Val Ser Ser Leu Ser His -28 -25 -20 TGG TTC CTC TTG CTG CTG CTG CTG AAT CTG TTC TTG CCG GTA ΑΤΑ TTT 95 Trp Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Asn Leu Phe Leu Pro Val lie Phe -15 -10 -5 GCT ATG CCT G人A TCA TAC TCC TTC AAC TGT CCC G人T GGT G人人 TAC C人G M3 Ala Met Pro Glu Ser Tyr Ser Phe Asn Cys Pro Asp Gly Glu Tyr Gin 15 10 15 經濟邡智慧財產局員工消費合作社印^ TCT ΛΑΤ GAT GTC TGT TGC AAG ACC TGT CCC TCA GGT ACA TTT GTC AAG 191 Ser Asn Asp Val Cys Cys Lys Thr Cys Pro Ser Gly Thr Phe Val Lys 20 25 30 GCG CCC TGC AAA ATC CCC CAT ACT CAA GGA CAA TGT GAG UG TGT CAC 239 Ala Pro Cys Lys lie Pro His Thr Gin Gly Gin Glu Lys Cys His 35 40 45 ' 43 本紙法之乏迖圬口 1 g家標準（CNS)A4規格（2]0 x 297公g ) B8 C8 D8 562807 六、申請專利範圍 CCA GGA ACA TTC ACA GGG AAA GAT AAT GGC CTG CAT GAT TGT GAA CTT 287 Pro Gly Thr Phe Thr Gly Lys Asp Asn Gly Leu His Asp Cys Glu Leu 50 55 60 TGC TCC ACC TGT GAT ΛΛΑ GAC CAG AAT ATG GTG GCT GAC TGT TCT GCC 335 Cys Scr Thr Cys Asp Lys Asp Gin Asn Het Val Ala Asp Cys Scr Ala 65 70 75 80 ACC AGT GAC CGG AAA TGC GAG TGC CAA ATA GOT CTT TAC TAC TAT GAC 383 Th「Ser Asp Arg： Lys Cys Glu Cys Gin lie Gly Leu Ty「Tyr Tyr Asp 85 90 .95 CCA AAA TTT CCG GAA TCA TGC CGC CCA TGT ACC AAG TGT CCC CAA GGA 431 Pro Lys Phe Pro Glu Ser Cys Arg Pro Cys Thr Lys Cys Pro Gin Gly 100 105 110_ ATC CCT GTC CTC CAG GAA TGC AAC TCC ACA GCT AAC ACT GTG TGC AGT 479 lie Pro Val Leu Gin Glu Cys Asn Ser Thr Ala Asn Thr Val Cys Ser 115 120 125 TCA TCT GTT TCA kAT CCC AGA AAC TGG CTG TTC CTA CTG ATG CTA ATT 527 Ser Ser Val Ser Asn Pro Arg Asn Trp Leu Phe Leu Leu Het Leu 11 e 130 135 HO CTC TTC TGT ATC TGAAGAAGAT AAAGGTTCTA CAGATGGTGT CTGTAGCTTC 579 Val Phe Cys lie 145 CTTTTATTGC TGTGAAGAGA AACCATGGAG GCAACTCTTT CATTTTATTT TATTTTTTAA 639 TGTCTTGAAC TTGATTTGAA GACCAGGCTG GACTCA/vACT CACAGAGATC CGGACTAGGC 699 ACCTCTAATA TAGGAAAACA TTGAATTGCG ACTGGCTTAC AGTTTCAGAA GTTCTGTCCA 759 TGATTATCAT AGTGCGAAGC ATGGAGGCAC GGAGGCACAC ATGGTGCTGG AGAAGAAGCT 819 44 本圪張尺斥ig厗中圉E家楳準（CNS)A4規格（2]0 - 297 d ) •---III 1 I I I 1 I I . I · (請-is讀背面之注意事項再於寫參 · -線· 經濟部智慧財產局員工消賢合作社印製 B8 C8 D8 562807 六、申請專利範圍 GAGAGTTCTG CATCTTGATC TGCAAGCAAT AAAAGGAGAC TGTGTGCCAC ACTACACATA 879 GCTTGAACAT AGGAGACCTC AAAGCCTGTC CCCACAGTGA CAAACTTCCT CCAACAAGGT 939 CATACCTCCT AATAATACCA TTTCTT人TGA GGCAAGCATT CAAACACATG AGTCTATGAG 999 GGCCAAACCA ATTCAAACCA CCACAGGTTA ACAATTGCCC TCTGCAGCTC TCTGGTGGAG 1059 CCCCTCCTTG AGAGTAAGTA ACAATTTAGA TGAAGGCAAG TCCTGGTATC AGGTCCAAAA 1119 GAAACTCAGG ATGAATGGTC CACTGTGGTT CCTATTAACA TACTGAAGAA CATGACCTCA 1179 CCTTAGACTT CTCCACCTCA CTGGCTTCCC TTCCCCTAGC TTCTCATTCC CAGGTAACCC 1239 TGCCATTTTT TGGTAATGTG CCTTCTTGGT TCTTCCTCTC CTTTCCCCCT CTCTTCTGGT 1299 CCTTATTTCT CTTCCTCTCC CACTCTCCAC CAGCCGCCTC TTAAGGCCTC AGTCAGTCTG 1359 CAGGCCATGT TTAATCTACT ACTTTCTCTC TGCTCTGGAC TCATCCAGAT GTCTCTGGCT 1419 GAGCTCTCCC TCCTATCTAC AATAAAACCT TCCCCCTAAC CAGAAATGGA ACAGTTTTGT 1479 CCTC人CTTTG TACATCTGGT GCCTGAAACC 1509 3. —種DNA，為以申請專利範圍第1或2項所記載之蛋白質為編碼之DNA。 4. 一種抗血清，為結合於申請專利範圍第1或2項所記載之蛋白質的抗血清。經濟部智慧財產局員工消費合作社印ίϊ 45 本纸張H達写中家標準（CNS)A4規柊（2]0<297 1¾ )