KR20010005892A - 신규한 막분비 단백질 - Google Patents

Abstract

막분비 단백질을 코드하는 유전자를 특이적으로 클로닝하는 방법을 사용하여, 골아세포양 세포주로부터 3종류의 막분비 단백질을 코드하는 유전자를 단리하는 것에 성공했다. 그 중 하나의 유전자에 관해서 해석을 진행시킨 결과, 그 유전자가 코드하는 단백질은 세포외 영역만을 갖고, GPI 앵커에 의해 세포막에 결합된 단백질이며, 그 내부에 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 보존되어 있는 시스테인이 풍부한 반복 영역을 갖는 신규한 수용체 단백질인 것을 찾아내었다. 더욱이, 그 단백질을 골아세포양 세포주로 고발현시킴으로써 세포증식이 억제되어, 세포의 형태가 변화되고, 또한 골아세포의 분화 지표의 하나인 알칼리포스파타아제 활성이 증대하는 것을 찾아내었다.

Description

신규한 막분비 단백질 {Novel membrane-secreted protein}

골아세포의 활동으로 뼈가 재생하는 현상, 즉 골형성은 척추동물의 생체유지 등에 중요한 현상이다. 골형성에 관여하는 인자로서, 지금까지 호르몬으로는 에스트로겐, 칼시토닌, 부갑상선 호르몬(PTH)이, 증식인자로는 BMP(Bone Morphologenic protein)가, 기타 약제로는 활성화 비타민 D, 칼슘제제, 비타민 K2 등이 알려져 있다. 이 중 에스트로겐, 칼시토닌, 활성화 비타민 D, 칼슘제제 등이 현재 골조송증 등의 골량개선 치료약으로서 응용되고 있지만, 어떤 것도 골량을 증가시키기 보다는 골흡수 억제를 기전으로 한 골량 감소의 방지약으로 사용되고 있어, 실효성이 있는 골형성 촉진약은 아직 개발되어 있지 않은 상태이다.

한편, 골관련 질환의 신규 치료약으로 기대되고 있는 BMP는 이소성형성 시그널 작용을 갖는 유일한 사이토카인이다. BMP는 실제로 골절이나 골결손 때의 수복반응 시 일어나는, 소위 연골성의 가골(callus)로부터 신생골로 치환되는 것에 따라 일어나는 골형성(연골내골화)에 유용하다고 생각된다 (Duprez DM, Coltey M, Amthor H, Brickell PM, Tickle C(1996) Dev Biol 174 448-452 Bone morphogenetic protein-2(BMP-Z) inhibits muscle development and promotes cartilage formation in chick limb bud cultures, Nakase T, Nomura S, Yoshikawa H, Hashimoto J, Hirota S, Kitamura Y, Oikawa S, Ono K, Takaoka K(1994) J Bone Miner Res 9 651-659 Transient and localized expression of bone morphogenetic protein 4 messenger RNA during fracture healing).

그렇지만 항상적인(constant) 골형성 시, 골흡수와 함께 야기된 골형성에 있어서 BMP가 관여하는 것에 관한 확증적인 보고는 없다. 따라서 BMP도 항상적인 골형성에 필수적인 골아세포의 분화촉진이나 활성화를 이용한 골형성 촉진약으로서 이용할 수 있다고는 말하기 어렵다. 즉, 항상적인 골형성에 관여하는 인자에 관해서는 지금까지 보고된 예가 없는 실정이다.

본 발명은 골세포의 분화에 관여하는 신규한 막분비 단백질, 그 단백질을 코드하는 DNA, 그 DNA를 포함하는 벡터, 그 벡터가 도입된 숙주세포, 그 단백질에 대한 항체, 그 단백질을 이용한 화합물의 스크리닝 방법 및 그 스크리닝 방법에 의해 단리할 수 있는 화합물에 관한 것이다.

도 1은 클론 7F4의 오픈리딩프레임을 포함하는 cDNA 서열과 그 아미노산 서열을 나타내는 도이다. 상단에 염기 서열을, 하단에 아미노산 서열을 적었다. 밑줄은 2개의 소수성 영역을 가리키는 것으로, N 말측이 시그널 서열, C 말측이 UPI 링커와의 치환영역으로 추측된다.

도 2는 7F4와 마우스 TNFR의 세포외 영역에서의 아미노산 서열을 비교한 도이다. 상단이 7F4, 하단이 마우스 TNF 리셉터의 세포외 영역의 아미노산 서열이다. 일치하는 시스테인을 외곽선(boxed letter)으로 하고, 그 이외에 일치하는 아미노산을 밑줄(underline)로 나타내었다.

도 3은 여러가지 마우스 조직에서 7F4 유전자의 발현을 노던블로팅 해석한 전기영동상이다.

도 4는 여러가지 인간 조직에서 7F4 유전자의 발현을 노던블로팅 해석한 전기영동상이다.

도 5A는 7F4 단백질의 소수성을 나타내는 도이다. 도의 가로축 왼쪽은 7F4 단백질의 N 말단측을, 오른쪽은 C 말단측을 나타낸다. 또한 도의 세로축은 소수성 정도를 나타낸다. 도 5B는 KUSA 세포 표면상의 7F4 단백질 및 7F4를 과잉발현시킨 2종의 클론에서 PI 특이적 포스포리파제 C 처리 후 세포 표면상의 7F4 단백질을 검출한 도이다. 도의 점선은 처리하지 않은 세포의 결과이고, 실선은 처리한 세포의 결과를 나타낸다. 또한, 도의 세로축은 세포수를 나타내고, 가로축은 세포의 형광강도를 나타낸다.

도 6은 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 분자의 구조를 나타내는 도이다. 시스테인이 풍부한 반복 서열을 타원으로 나타내었다. 또한 타원중의 가로줄은 시스테인의 위치를 나타낸다.

도 7은 7F4 유전자의 고발현에 의한 KUSA 세포의 증식저해를 나타내는 도이다. 7F4 유전자를 고발현시킨 KUSA 세포의 증식 속도를, 시간에 따라 세포수를 계측하여 조사했다.

도 8은 7F4 유전자의 발현에 의한 알칼리포스파타아제 활성의 변화를 검출한 결과를 나타내는 도이다. KUSA 세포에 7F4 유전자를 고발현시킨 각 형질전환체로부터 세포가 콘플루언트(confluent)되기 전에 세포 용해물을 조제하여 세포내 알칼리포스파타아제 활성을 측정했다.

도 9는 CH0 세포 및 7F4 유전자가 도입된 형질전환체에서 7F4 유전자의 발현을 검출한 결과를 나타내는 도이다. CH0 세포에 7F4 발현벡터를 형질전환하여 얻은 각 클론을 7F4 항혈청으로 염색하고, ELITE에서 그 발현량을 해석하였다.

도 10은 7F4 유전자의 고발현에 의한 COS 세포의 증식 속도 변화를 검출한 결과를 나타내는 도이다. 7F4 유전자를 고발현시킨 COS 세포의 증식 속도를 시간에 따라 세포수를 계측하여 조사했다.

본 발명은 항상적인 골형성에 관여하는 신규한 단백질 및 그 유전자를 제공하는 것을 과제로 한다. 또한 본 발명은 그 유전자가 삽입된 벡터, 그 벡터가 도입된 숙주세포, 그 단백질에 결합하는 항체를 제공하는 것을 과제로 한다. 더욱이 본 발명은 그 단백질을 이용한 리간드 등의 그 단백질에 결합하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자 등은 상기 과제를 해결하도록 예의 연구를 한 결과, 막분비 단백질을 코드하는 유전자를 특이적으로 클로닝하는 방법을 사용해서, 골아세포양 (osteoblast-like) 세포주로부터 3종류의 막분비 단백질을 코드하는 유전자를 단리하는 것에 성공했다. 본 발명자 등은 그 중 하나의 유전자에 관해서 해석을 진행시킨 결과, 그 유전자가 코드하는 단백질은 세포외 영역만을 갖고, GPI 앵커에 의해 세포막에 결합되는 단백질이며, 그 내부에 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 보존되어 있는 시스테인이 풍부한 반복 영역을 갖는 신규한 수용체 단백질인 것을 찾아내었다. 또한, 본 발명자 등은 그 단백질을 골아세포양 세포주로 고발현시킴으로써 세포증식이 억제되고, 세포의 형태가 변화되며, 골아세포의 분화 지표의 하나인 알칼리포스파타아제 활성이 증대하는 것을 찾아내었다. 또한 이와 같이 단리된 단백질이 골세포의 분화에 관여하고 있다는 것에서부터, 그 단백질을 이용하여 골관련 질환에 관한 의약품후보 화합물을 스크리닝할 수 있다는 것을 찾아내었다.

즉, 본 발명은 신규한 막분비 단백질 및 그 유전자, 그 단백질을 이용한 의약품후보 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것으로 보다 구체적으로는,

(1) 서열 번호:1 또는 2에 기재된 아미노산 서열로 된 단백질 또는 이들 단백질 중의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가한 아미노산 서열을 갖고, 골세포의 분화유도 활성을 갖는 단백질,

(2) 서열번호:3에 기재된 염기 서열로 된 DNA와 하이브리다이즈하는 DNA가 코드하는 단백질로서 골세포의 분화유도 활성을 갖는 단백질,

(3) (1) 또는 (2)에 기재된 단백질을 코드하는 DNA,

(4) (3)에 기재된 DNA가 삽입된 벡터,

(5) (4)에 기재된 벡터가 도입된 숙주세포,

(6) (1) 또는 (2)에 기재된 단백질에 결합하는 항체,

(7) (1) 또는 (2)에 기재된 단백질에 결합하는 활성을 갖는 화합물의 스크리닝 방법이고,

(a) (1) 또는 (2)에 기재된 단백질에 피험시료를 접촉시키는 공정,

(b) (1) 또는 (2)에 기재된 단백질에 결합하는 활성을 갖는 화합물을 선택하는 공정을 포함하는 방법,

(8) (1) 또는 (2)에 기재된 단백질의 골세포의 분화유도 활성을 촉진 또는 저해하는 활성을 갖는 화합물의 스크리닝 방법이고,

(a) 세포 표면에 발현된 (1) 또는 (2)에 기재된 단백질에 피험시료를 접촉시키는 공정,

(b) (1) 또는 (2)에 기재된 단백질의 골세포의 분화유도 활성을 검출하는 공정, (c) 피험시료가 없을 때 검출을 한 경우와 비교하여, (1) 또는 (2)에 기재된 단백질의 골세포의 분화유도 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물을 선택하는 공정을 포함하는 방법,

(9) (7)에 기재된 방법에 의해 단리될 수 있는, (1) 또는 (2)에 기재된 단백질에 결합하는 화합물,

(10) (8)에 기재된 방법에 의해 단리할 수 있는, (1) 또는 (2)에 기재된 단백질의 골세포의 분화유도 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물,

(11) 천연 유래인 (9) 또는 (10)에 기재된 화합물,

(12) 리간드인 (9) 또는 (10)에 기재된 화합물,

(13) 아고니스트(agonist)인 (9) 또는 (10)에 기재된 화합물,

(14) 안타고니스트(antagonist)인 (9) 또는 (10)에 기재된 화합물에 관한 것이다.

본 발명은 항상적인 골형성에 관여한다고 생각되는 신규한 막분비 단백질에 관한 것이다. 본 발명자 등에 의해 단리된 마우스 유래의 cDNA의 염기 서열을 서열 번호:3에, 그 cDNA에 의해 코드되는 단백질 중 시그널 펩티드를 포함하는 단백질의 아미노산 서열을 서열번호:1에, N 말단측의 시그널 펩티드가 제거된 성숙 단백질의 아미노산 서열을 서열번호:2에 나타낸다. 본 발명자 등은 단리된 클론을「7F4」라고 명명했다. 본 발명의 단백질에 포함되는「7F4」단백질은 TNF 수용체 서브패밀리에 보존된 시스테인이 풍부한 영역을 갖고, 그 N 말단(시그널서열영역) 및 C 말단에 소수성이 풍부한 아미노산 영역을 갖는다. 이「7F4」단백질은, 데이터베이스 상에 있어서 유의적인 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 찾지 못했다. 따라서,「7F4」단백질은 TNF 수용체 슈퍼패밀리(Beulter.B, and Huffel.C.V(1994) SCIENCE 264, 667-668 Unraveling function in the TNF ligand and receptor families)에 속하는 신규한 단백질이라고 생각된다(도 6참조).

「7F4」단백질을 고발현시킨 KUSA 세포(그 세포는 정상 마우스 골수간질 유래의 세포이고, 조혈지시능을 갖는 것 이외에, 생체(in vivo)내 이식에 의해 골수를 유도하면서 골형성을 야기하는 것으로 알려져 있다. 문헌「Umezawa, A., Maruyama, T., Segawa, K., Shadduck, R.K., Waheed, A., and Hata, J.(1992) Multipotent marrow stromal cell line is able to induce hematopoiesis in vivo.J.Cell.Physiol.151,197-205」참조)의 형질 전환체를 PI 특이적 포스포리파제 C (PI-specific phospholipase C)로 처리하면, 그 단백질의 세포 표면에서의 존재량이 저하했다(실시예 7 ). 이 때문에「7F4」단백질에는 세포내 영역은 존재하지 않고, GPI 앵커를 통해 세포 표면에 고정되는 구조를 갖고 있다고 생각된다. GPI 앵커형 막단백질로서는 CNTF 수용체 등이 알려져 있다. 또한, IL-6, IL-11 수용체의 세포내 영역은 대단히 짧고, 리간드 결합 후의 시그널 전달에 관계하는 영역을 갖고 있지 않다. 이들 수용체가 리간드와 함께 결합하면 gp130과 회합하고, gp130을 시그널 전달쇄로 이용하여, 시그널을 세포 내로 전달한다. 「7F4」도 많은 사이토카인 리셉터와 같이 gp130같은 시그널 전달쇄와 회합하는 기구에 의해 시그널을 핵으로 전달하고 있을 지도 모른다. 실제로 KUSA 세포에「7F4」단백질을 과잉발현시키면, 그 발현량에 상관하여 세포 형태가 변화되고, 세포의 증식 속도가 저하하는 경향을 보이며(실시예 6), 골아세포의 분화 지표의 하나인 알카리 포스파타아제 활성이 증대한다(실시예 8). 이런 사실로부터 「7F4」단백질은 특히 골세포의 분화 시그널에 관여하고 있다고 생각된다. 따라서 「7F4」단백질이나 이것에 결합하는 화합물은 후술하는 것과 같이, 특히 골관련 질환의 예방이나 치료로의 이용이 고려된다. 또한, 골세포분화 마커로서의 진단으로의 응용도 고려된다.

골아세포를 장기간에 걸쳐 계속 배양하면 골형성 마커의 발현이 상승하여, 스스로 분화된다고 보고되고 있다(Matsumoto T, Igarashi C, Takeuchi Y, Harada S, Kikuchi T, Yamato H, and Ogata E.(1991) Stimulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3 of in vitro mineralization induced by osteoblast-like MC3T3-E1 cells. Bone.12, 27-32, Sudo H, Kodama HA, Amagai Y, Yamamoto S, and Kasai S.(1983) In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J Cell Bio1. 96, 191-198). 골조직을 유도하는 유일한 골형성인자이고, 연골형성을 거쳐 골형성을 야기하는 인자로서 BMP가 알려지고 있지만, 골아세포, 특히 KUSA 세포의 골형성에 있어서 연골세포의 출현은 관찰되지 않는다. 따라서, 이 골분화기구는 BMP (Wozney, JM, Rosen, V, Celeste, AJ, Mitsock, LM, Whitters, MJ, Kriz, RW, Hewick, RM, and Wang, EA(1988) Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 242, 1528-1534)의 작용으로는 설명되지 않아, 현재 알려지지 않은 골형성인자의 존재가 유력시 되고 있다. 「7F4」단백질은 이 골형성인자의 유력한 후보이다.

또한, 본 발명은 「7F4」단백질과 기능적으로 동등한 단백질에 관한 것이다.

「7F4」단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 단리하기 위해서 당업자에게 잘 알려져 있었던 방법은, 단백질에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들어, 당업자는 부위특이적 변이 유발법(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxy ribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) 0ligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, and Fritz, HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol.154, 35O-367, Kunkel, TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 82, 488-492) 등을 사용하여,「7F4」단백질(서열번호:1 또는 2)중의 아미노산에 적의 변이을 도입함으로써「7F4」단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 조제할 수 있다. 또한, 아미노산의 변이는 자연계에서도 생길 수 있다. 이와 같이,「7F4」단백질의 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산이 변이된 아미노산 서열을 갖고,「7F4」단백질과 기능적으로 동등한 단백질도, 또한 본 발명의 단백질에 포함된다. 기능적 관점에서 변이하는 아미노산은 보통 30 아미노산 이내이고, 바람직하게는 15 아미노산 이내이며, 더욱 바람직하게는 5 아미노산 이내이고, 더욱더 바람직하게는 3 아미노산 이내이다.

또한, 기능적으로 동등한 단백질을 단리하는, 당업자에게 잘 알려져 있었던 다른 방법은, 하이브리다이제이션 기술(Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2^nded.9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)을 이용한 방법을 들 수 있다. 즉, 당업자는 「7F4」단백질을 코드하는 DNA 서열(서열번호:3) 또는 그 일부를 기초로, 이것과 상동성이 높은 DNA를 단리하여 그 DNA에서「7F4」단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 단리하는 것도 보통할 수 있는 일이다. 이와 같이,「7F4」단백질을 코드하는 DNA 서열 또는 그 일부로 된 DNA와 하이브리다이즈하는 DNA가 코드하는 단백질이고,「7F4」단백질과 기능적으로 동등한 단백질도 또한 본 발명의 단백질에 포함된다. 이러한 단백질로서는 예를 들면, 마우스 이외의 포유동물의 호몰로그(예를 들면, 실시예 3의 노던블로팅에 의해 검출된 인간유전자가 코드하는 단백질)를 들 수 있다. 하이브리다이징 기술에 의해 얻어지는 단백질은, 보통 아미노산 서열에 있어서「7F4」단백질과 높은 상동성을 갖는다. 높은 상동성이란, 아미노산 서열에 있어서 보통 40% 이상의 상동성, 바람직하게는 60% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 말한다.

본 발명에 있어서「7F4」단백질과「기능적으로 동등」하다는 것은, 단백질이「7F4」단백질과 같이 골세포의 분화를 유도하는 활성을 갖는 것을 가리킨다. 골세포의 분화를 유도하는 활성이란, 골세포의 세포증식 속도의 저하를 가져와, 그 세포의 형태를 변화시키는 활성을 가리킨다. 그 활성은, 예를 들면 현미경에 의한 골세포의 형태학적 관찰이나, 골세포의 분화 마커로서 일반적으로 사용되고 있는 알칼리포스파타아제의 활성측정 등의 방법 (N.C.Partrige, D.Alcorn, V. P. Michelangeli, G.Ryan ＆ T.J.Martin (1983) Cancer Res 43 4308-14. Morphological and biochemical characterization of four clonal osteogenic sarcoma cell lines of rat origin, J.K.Burns ＆ W.A.Peck(1978) Science 199 542-4. Bone cells:a serum-free medium supports proliferation in primary culture)에 의해 검출할 수 있다. 알칼리포스파타아제 활성의 측정은, 예를 들면 세포를 초음파 파쇄에 의해 파괴하고, 세포 추출액을 얻어, 이것을 알카리포스파타아제의 기질인 p-니트로페닐포스페이트(p-nitrophenyl phosphate)와 인큐베이트한 후, 분해되어 생성된 p-니트로페놀(p-nitropheno1)의 양을 분광광도계에 의해 정량하는 등의 방법으로 할 수 있다. 또한, 오스테오칼신(Osteocalcine)이나 콜라겐타입 I을 지표로 검출하는 것도 가능하다.

본 발명의 단백질은 당업자의 공지의 방법에 의한 재조합 단백질로서, 또한 천연의 단백질로서 조제할 수 있다. 재조합 단백질이면, 예를 들어 본 발명의 단백질의 막결합에 필요한 영역 이외의 부분을 세포 내에서 발현시켜, 세포에 분비시킨다. 이어서 이 세포의 배양 상청을 회수하여 농축한 후, 이온 교환, 역상, 겔여과 등의 크로마토그래피 또는 본 발명의 단백질에 대한 항체를 컬럼에 고정한 어피니티 크로마토그래피에 거는 것에 의해, 또는 이들 컬럼을 복수조합시켜 정제할 수 있다. 또한 본 발명의 단백질을, 글루타티온 S 트란스페라제 단백질과의 융합단백질로서, 또는 히스티딘를 복수부가시킨 재조합 단백질로서 숙주세포(예를 들면 동물세포나 대장균 등)안에서 발현시키고, 발현시킨 재조합 단백질을 글루타티온 컬럼 또는 니켈 컬럼에 의해 정제한다. 그 후, 필요에 따라 융합 단백질 중 원하는 단백질 이외의 영역을 트롬빈 또는 팩터 Xa 등에 의해 절단하여, 제거하는 방법에 의해 조제할 수 있다. 천연의 단백질이면, 예를 들어 본 발명의 단백질을 발현하고 있는 세포의 추출물에 대하여 후술하는 본 발명의 항체가 결합한 어피니티 컬럼을 작용시켜 정제함으로써 단리할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA에 관한 것이다. 본 발명의 DNA는 본 발명의 단백질을 코드할 수 있는 것이면, 어떠한 형태라도 좋다. 즉, mRNA에서 합성된 cDNA인지, 게놈 DNA인지, 화학합성 DNA인지 등에 구애되지 않는다. 본 발명의 DNA는, 예를 들어 본 발명의 단백질을 발현하고 있는 세포로부터 cDNA 라이브러리를 제작하고, 본 발명의 DNA의 서열(예를 들어 서열번호:3에 기재된 DNA 서열)의 일부를 프로브로 하여 하이브리다이제이션을 함으로써 조제할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질을 발현하고 있는 세포로부터 RNA를 조제하고, 본 발명의 DNA의 서열(예를 들어 서열번호:3에 기재된 DNA 서열)에 따라 올리고 DNA를 합성하고, 이것을 프라이머로서 사용하여 PCR 반응을 하고, 본 발명의 단백질을 코드하는 cDNA를 증폭시킴으로써 조제하는 것도 가능하다. 본 발명의 DNA는 본 발명의 단백질을 재조합 단백질로서 생산하기 위해서 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA에 결함이 있는 경우에는 안티센스에 의한 기능 저해나, 정상인 유전자로 치환한 유전자치료 등으로의 응용도 고려된다.

또한, 본 발명은 본 발명의 DNA가 삽입된 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 벡터로서는, 예를 들어 숙주를 대장균으로 하는 경우에는, 벡터를 대장균(예를 들어 JM109, DH5α, HB101, XL1Blue) 등으로 대량 증폭시켜 대량 조제하기 위해서, 대장균으로 증폭되기 위한「ori」를 갖고, 또한 형질전환된 대장균의 선발 유전자(예를 들면, 어떤 약제(암피실린이나 테트라사이클린, 가나마이신, 클로람페니콜)에 의해 판별할 수 있는 약제내성 유전자)를 갖고 있으면, 특별히 제한하지 않는다. 예를 들어, M13계 벡터, pUC계 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 들 수 있다. 또한 cDNA의 서브클로닝, 추출을 목적으로 한 경우도 상기 벡터 외에 pGEM-T, pDIRECT, pT7 등을 들 수 있다. 본 발명의 단백질을 생산하는 목적으로 벡터를 사용하는 경우에는, 특히 발현벡터가 유용하다. 발현벡터로서는, 예를 들어 대장균에서의 발현을 목적으로 한 경우는 벡터가 대장균으로 증폭되는 상기 특징을 가지는 것 외에, 숙주를 JM109, DH5α, HB101, XL1Blue 등의 대장균으로 한 경우에 있어서, 대장균으로 효율적으로 발현할 수 있는 프로모터 (예를 들면, lac, T7 등)를 가지고 있는 것이 필수적이다. 이러한 벡터로서는, 상기 벡터 외에 pGEX, pEGFP 또는 pET(이 경우, 숙주가 T7 RNA 폴리머라제를 발현하고 있는 BL21) 등을 들 수 있다.

또한 CHO 세포, COS 세포, NIH3T3 세포 등의 동물세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 세포 내에서 발현시키기 위해 필요한 프로모터 (SV40, MMLV-LTR, EF1α, CMV 프로모터 등)를 가지고 있는 것이 필수적이며, 또한 세포에의 형질전환을 선발하기 위한 유전자(예를 들어 약제(네오마이신, G418 등)에 의해 판별할 수 있는 약제내성 유전자)를 갖으면 더욱 바람직하다. 이러한 특성을 갖는 벡터로서는, 예를 들어 pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 등을 들 수 있다.

더욱이, 세포 내의 카피수 증폭을 목적으로 한 숙주 벡터계에서는, 안정산생 세포주의 경우, 핵산 합성경로를 결손한 CHO 세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 갖는 벡터(예를 들면 pCHOI 등)를 사용하여 메토트렉세이트(MTX)에 의해 증폭시키는 방법을 들 수 있고, 또한 일과성의 발현을 목적으로 하는 경우에는, SV40 T 항원을 염색체상에 가지는 COS 세포를 사용하여 SV40의 복제기전을 갖는 벡터(pcD 등)로 형질전환하는 방법을 들 수 있다.

한편, 동물의 생체 내에서 본 발명의 DNA를 발현시키는 방법으로는, 본 발명의 DNA를 적당한 벡터에 삽입하는 레트로바이러스법, 리포솜법, 카티오닉리포솜법, 아데노바이러스법 등에 의해 생체 내에 도입하는 방법 등을 들 수 있다. 사용되는 벡터에 특히 제한은 없지만, pAdexlcw나 pZIPneo 등이 바람직하다. 본 발명의 DNA를 벡터로 삽입하는 일반적인 유전자조작은 일반적인 방법에 따라서 할 수 있다(Molecular Cloning,5.61-5.63).

또한, 본 발명은 본 발명의 벡터가 도입된 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명의 벡터가 도입되는 숙주세포는 특히 제한은 없고, 대장균이나 여러가지의 동물세포 등을 사용할 수 있다. 대장균으로는, 예를 들어 JMl09, DH5α, HBl01 등을 들 수 있고, 동물세포에 있어서는 예를 들면, CHO 세포, COS 세포, 3T3 세포, HeLa 세포 등을 들 수 있다. 동물세포에 있어서, 대량발현을 목적으로 하는 경우에는 특히 CHO 세포가 바람직하다.

한편, 생체 내에서 본 발명의 DNA를 발현시키기 위해서 사용되는 세포로서는, 특히 제한은 없고 여러가지 동물 세포를 들 수 있지만, 골관련 질환의 유전자 치료를 하는 경우에는 특히, 체내에서 채취한 간엽계 세포, 골아세포 등의 세포가 표적세포로서 바람직하다.

숙주세포로의 벡터의 도입은, 예를 들면 인산 칼슘법, DEAE 덱스트란법, 일렉트로포레이션, 리포펙션 등의 방법으로 할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 단백질에 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체의 형태에는 특히 제한은 없고, 폴리클로날 항체 외에 모노클로날 항체도 포함된다. 또한 토끼 등에 본 발명의 단백질을 면역하여 얻은 항혈청, 모든 클래스의 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체, 또한 인간 항체나 유전자 재조합에 의한 인간형화 항체도 포함된다. 본 발명의 항체는 이하의 방법에 의해 조제할 수 있다. 폴리클로날 항체이면, 예를 들어 본 발명의 단백질을 토끼 등의 작은 동물에게 면역하여 혈청을 얻고, 이것을, 본 발명의 단백질을 커플링시킨 어피니티 컬럼에 의해서 본 발명의 단백질만을 인식하는 분획을 얻고, 그 분획으로부터 면역글로블린 G 또는 M을, 프로테인 A 또는 프로테인 G 컬럼에 의해 정제함으로써 조제할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체이면 본 발명의 단백질을 마우스 등의 작은 동물에게 면역을 하고, 같은 마우스로부터 비장을 적출하여, 이것을 갈아 세포로 하고, 마우스 미엘로마 세포와 폴리에틸렌글리콜 등의 시약으로 융합시키고, 이것으로부터 이루어진 융합세포(하이브리도마)로부터, 본 발명의 단백질에 대한 항체를 생성하는 클론을 선택한다. 이어서, 얻어진 하이브리도마를 마우스 복강 내로 이식하고, 같은 마우스로부터 복수를 회수하여 얻어진 모노클로날 항체를, 예를 들어 유안침전, 프로테인 A, 프로테인 G 컬럼, DEAE 이온교환 크로마토그래피, 본 발명의 단백질을 커플링한 어피니티 컬럼 등에 의해 정제함으로써 조제할 수 있다. 본 발명의 항체는 본 발명의 단백질의 정제, 검출에 사용되는 것 외에, 골관련질환의 항체치료로의 응용도 고려된다. 항체치료에 사용하는 경우에는 면역원성을 저하시키기 때문에 인간항체나 인간형 항체가 바람직하다.

또한, 본 발명은 본 발명의 단백질을 이용하였다, 본 발명의 단백질에 결합하는 화합물의 스크리닝 방법 및 그 스크리닝 방법에 의해 단리될 수 있는 화합물(예를 들어, 리간드, 아고니스트 및 안타고니스트)에 관한 것이다.

그 스크리닝 방법 중 하나의 형태는, (a) 본 발명의 단백질에 피험시료를 접촉시키는 공정, (b) 본 발명의 단백질에 결합하는 활성을 갖는 화합물을 선택하는 공정을 포함한다. 이 스크리닝 방법에 사용되는 피험시료로는 특히 제한은 없고, 예를 들면 세포 추출물, 세포배양 상청, 단백질, 펩티드, 합성 저분자 화합물을 들 수 있다. 피험시료를 접촉시키는 본 발명의 단백질은, 예를 들면 정제한 단백질로서, 세포막 위에 발현시킨 형태로서 또는 세포막 분획으로서 피험시료에 접촉시킬 수 있다. 본 발명의 단백질에 대한 피험시료의 결합 활성은, 예를 들면 후술하는 당업자에게 알려진 많은 방법을 사용할 수 있다.

다른 하나의 형태는, (a) 세포 표면에 발현시킨 본 발명의 단백질에 피험시료를 접촉시키는 공정, (b) 본 발명의 단백질의 골세포의 분화유도 활성을 검출하는 공정, (c) 피험시료가 없을 때 검출을 한 경우와 비교하여, 본 발명의 단백질의 골세포의 분화유도 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물을 선택하는 공정을 포함한다. 본 발명의 단백질을 발현시키는 세포로는 본 발명의 단백질에 결합하는 리간드를 발현하지 않는 세포가 바람직하다. 본 발명의 단백질을 세포 표면으로 발현하는 것은, 예를 들면 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA를 적당한 벡터에 삽입하고, 이것을 세포 내로 도입하는 방법이 가능하다. 본 발명의 단백질의 골세포 분화유도 활성은, 예를 들면 현미경에 의한 골세포의 형태학적 관찰이나 골세포의 분화 마커로서 일반적으로 사용하고 있는 알칼리포스파타아제의 활성측정 등의 방법 (N.C.Partrige, D.Alcorn, V.P.Michelangeli, G.Ryan ＆ T.J.Martin(l983) Cancer Res 43 4308-14. Morphological and biochemical characterization of four clonal osteogenic sarcoma cel1 1ines of rat origin, J.K.Burns ＆ W.A.Peck(1978) Science 199 542-4.Bone cells:a serum-free medium supports proliferation in primary culture)에 의해 검출할 수 있다. 알칼리포스파타아제 활성의 측정은, 예를 들면 세포를 초음파 파쇄로 파괴하여 세포 추출액을 얻고, 이것을 알칼리포스파타아제의 기질인 p-니트로페닐포스페이트(p-nitrophenyl phosphate)와 인큐베이트한 후, 분해되어 생성된 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 양을 분광 광도계로 정량하는 등의 방법이 가능하다. 또한, 오스테오칼신(Osteocalcine)이나 콜라겐타입 I을 지표로 검출하는 것도 가능하다.

구체적인 방법으로는, 예를 들면 이하의 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 단백질을 사용하여 그 단백질에 대한 리간드를 단리하는 방법으로는, 예를 들어 리간드를 발현하는 것이 예상되는 세포(예를 들면 KUSA 세포, ROS17/2.8 세포, UMR106-01 세포, UMR106-06 세포, MC3T3E1 세포, HOS-TE85 세포, MG63 세포, SaOS2 세포, UMR206 세포, RCT1 세포, C3Hl0T1/2 세포 등의 골아세포주, OP9 세포, 스트로마 세포, NIH3T3 세포 등의 섬유아세포 등)로부터 파지벡터 (λgt11, ZAP 등)을 사용한 cDNA 라이브러리를 제작하고, 이것을 LB-아가로즈상에 발현시켜 필터에 발현시킨 단백질을 고정하고, 본 발명의 단백질을 비오틴 라벨 또는 GST 단백질과의 융합단백질로 정제하여, 이것을 상기 필터와 반응시키고, 결합하는 단백질을 발현하고 있는 플라크를 스트렙토아비딘 또는 항 GST 항체에 의해 검출되는「웨스트웨스턴블라팅법」(Skolnik EY, Margolis B, Mohammadi M, Lowenstein E, Fischer R, Drepps A, Ullrich A, and Schlessinger J (1991) Cloning of PI3 kinase-associated p85 utilizing a novel method for expression/cloning of target proteins for receptor tyrosine kinases. Cell 65, 83-90)에 의해 조제할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질을 SRF 결합영역 또는 GAL4 결합영역과 융합시켜 효모세포 안에서 발현시키고, 리간드를 발현하고 있는 것으로 예상되는 세포로부터 VP16 또는 GAL4 전사활성화 영역과 융합하는 모양으로 발현하는 cDNA 라이브러리를 제작하여 이것을 상기 효모세포에 도입하고, 검출된 양성 클론에서 라이브러리 유래 cDNA를 단리하고 대장균에 도입하여 발현시키는 것(효모세포 내에서 본 발명의 단백질과 결합하는 단백질이 발현되면, 양자의 결합에 의해 리포터 유전자가 활성화되고, 양성의 클론을 확인할 수 있다) 「two 하이브리드 시스템」 (「MATCHMARKER Two-Hybrid System」,「Mammalian MATCHMAK ER Two-Hybrid Assay Kit」,「MATCHMAKER One-Hybrid System」(어느 것이나 clontech사 제), 「HybriZAP Two-Hybrid Vector System」(stratagene사 제), 문헌「Dalton S, and Treisman R (l992) Characterization of SAP-1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response element. Cell 68, 597-612」)에 따라 조제하는 것도 가능하다. 더욱이, 본 발명의 단백질을, 그 리간드를 발현하지 않는 세포로 발현시키고 나서, 그 세포에 리간드를 발현하고 있는 것이 예상되는 세포로부터 구축한 발현 cDNA 라이브러리를 COS 등의 세포에 도입하여 얻은 배양상청을 첨가하고, 세포의 변화(증식 속도, 형태, 알칼리포스파타아제의 발현 등)을 지표로 리간드를 탐색하는 「다이렉트 발현 클로닝법」(Yokota T, Otsuka T, Mosmann T, Banchereau J, DeFrance T, Blanchard D, De Vries JE, Lee F, and Arai K.(1986) Isolation and characterization of a human interleukin cDNA clone, homologous to mouse B-cell stimulatory factor 1, that expresses B-cell- and T-cell-stimulating activities. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 5894-5898)에 의해 조제하는 것도 가능하다. 더욱이, 본 발명의 단백질을 고정한 어피니티 컬럼에 본 발명의 리간드를 발현하고 있는 것이 예상되는 세포의 배양상청을 올려놓고, 컬럼에 특이적으로 결합하는 단백질을 정제함으로써 조제하는 것도 가능하다. 또한, 얻어진 단백질(리간드)의 아미노산 서열을 분석하고, 그것을 기초로 올리고 DNA를 합성하며, 그 DNA를 프로브로 하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써, 그 리간드를 코드하는 DNA를 얻는 것도 가능하다. 또한, 본 발명에 있어서,「리간드」라는 것은, 세포막에 발현되는 본 발명의 단백질에 결합함으로써, 그 기능을 활성화하는 단백질을 가리킨다.

또한, 본 발명의 단백질을 사용하여 그 단백질에 대한 아고니스트 및 안타고니스트를 단리하는 방법으로는, 예를 들어 고정한 본 발명의 단백질에 화합물 또는 천연물뱅크 또는 랜덤파지 펩티드 디스플레이 라이브러리를 작용시켜 결합하는 분자를 스크리닝하는 방법이나 콤비나토리알 케미스트리 기술에 의한 하이-스루풋(high-throughput)을 사용한 스크리닝(Wrighton NC; Farrell FX; Chang R; Kashyap U; Barbone FP; Mulcahy LS; Johnson DL; Barrett M; Jolliffe LK; Dower WJ., Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 p458-64, Verdine GL. , The combinatorial chemistry of nature. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 p11-13, Hogan JC Jr., Directed combinatorial chemistry. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 p17-9)에 의해 본 발명의 단백질에 대한 아고니스트 또는 안타고니스트를 단리하는 방법이 당업자에게는 주지의 기술이다. 또한, 본 발명에 있어서「아고니스트」라는 것은 본 발명의 단백질과 리간드와의 결합과 같은 현상(본 발명의 단백질의 활성화)을 야기할 수 있는, 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 가리킨다. 또한,「안타고니스트」라는 것은 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합함으로써 그 기능을 억제하는 분자를 가리킨다.

이것에 의해 단리된 리간드, 아고니스트, 안타고니스트에는 다음과 같은 응용이 생각된다. 예를 들면, 리간드, 아고니스트 또는 안타고니스트의 투여에 의해 골아세포의 분화유도, 활성화를 이끌어, 나이에 따라서 동반하는 골조송증, 변형성 관절증에 있어서의 골량의 개선이나 골형성의 촉진 또는 골종양에 대한 골세포 분화의 제어기능을 이용한 항암치료를 하는 것이 생각된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것이 아니다.

실시예 1

7F4 유전자의 클로닝

마우스 골아세포 KUSA가 발현되는 분비, 막단백질을 코드하는 유전자의 클로닝은 기본적으로「signal sequence trap」(SST)법을 따라서 행했다. 구체적으로는 우선 라이브러리의 발현용 벡터로 사용하는 「pSRαTac」를 이하의 순서로 구축했다. 인간의 전장 IL-2 수용체 유전자가 삽입된 플라스미드「pkCR.Tac-2A」(이연 진뱅크에서 구입)를 EcoRI, Eco47III로 잘라내어 Tac 전장을 코드하는 유전자 단편을 얻었다. 한편, 동물세포용 발현벡터「pcD-SRαFE」(Takebe Y, Seiki M, Fujisawa J, Hoy P, Yokota K, Arai K, Yoshida M, AraiN. Mol Cell Bio1 8:466-472(1988) SR alpha promoter:an efficient and versatile mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 early promoter and the R-U5 segment of human T-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat)가 원래 갖고 있던 SacI 부위를 없앤 후, EcoRI로 절단했다. 그리고 이것에 상기 Tac의 전장을 코드하는 유전자 단편을 삽입하여「pSRαTac」를 구축했다(이 플라스미드는 EcoRI, SacI로 절단함으로써 Tac의 시그널 서열 영역을 제거할 수 있다).「5'enriched cDNA library」를 제작하기 위해서, 우선 KUSA 세포로부터 조제한 mRNA 5㎍을 랜덤 프라이머를 사용하여 제1사슬 cDNA를 합성했다. 그 5' 말단에 「terminal nucleotidyl transferase」로 dC 테일링한 후, EcoRI 부위를 갖는 프라이머「5'-GCGGCCGCGAATTCTGACTAACTGAC-(dG)17 (서열번호:4 )」를 사용하여 Taq DNA 폴리머라제에 의해 제2사슬을 합성했다. 이것을 초음파 파쇄하여 적당한 길이의 단편으로 하고, 그 말단을 평활화한 후, SacI 링커 (5' 말단측에 「CCGCGAGCTCGATATCAAGCTTGTAC (서열번호:5)」, 3' 말단측에 「GGCGCTCGAGCTATAGTTCGAACATGGAG (서열번호:6)」)를 양끝에 삽입했다. 이것을 주형으로 하고 2개의 프라이머(「5'-GAGGTACAAGCTTGATATCGAGCTCGCGG-3'(서열번호:7)」,「5'-GCCGCGAATTCTGACTAACTGAC-3'(서열번호:8)」)에 의해 PCR를 하여 cDNA 단편을 증폭시켰다. 그리고 1.5% 아가로즈 전기영동을 하여 약 400bp의 단편을 겔로부터 잘라낸 후, EcoRl, SacI로 절단했다. 이것을 상기 방법으로 제작한 발현벡터「pSRα-TAC Ⅱ」의 EcoRI, SacI 사이에 삽입했다. 이어서, 이 cDNA 라이브러리를 대장균 JM109에 트랜스폼하고, 49개의 독립된 클론을 1 풀로서 몇개의 풀을 제작했다. 각 풀로부터 플라스미드를 조제하고, COS-7세포에 리포펙트아민을 사용하여 도입했다. 2일 후, 세포를 0.05% EDTA/PBS로 벗기고, 일차 항체로서 마우스 항IL-2 수용체(Tac) IgG 항체를, 2차 항체로서 FITC 표지 염소 항마우스 IgG 항체를 사용하여 세포 표면을 염색하고, Tac 단백질을 세포 표면에 발현하고 있는 세포를 플로우사이토미터(ELITE)를 사용하여 스크리닝했다. Tac 양성의 풀에 관해서는, 한층더 그것을 분할하여 단일의 클론이 얻어질 때까지 상기 스텝을 되풀이하였다. 이 결과, 시그널 서열을 갖는 신규 유전자를 3클론 얻었다. 하나는 기저막 단백질을 구성하는 단백질의 하나인 엔탁틴(entactin)과 호몰로지가 높은 신규 유전자(Entactin2)이고, 다른 하나는 막을 5회 내지 7회 관통하는 타입의 막단백질이며, 또다른 하나는 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 보존된 시스테인 반복 모티프를 갖는 신규 유전자 (이 클론을 이하,「7F4」라고 칭한다)였다. 클론 7F4에는 약 400bp의 단편밖에 포함되어있지 않았다.

실시예 2

전장 cDNA의 클로닝과 염기 서열 결정

보다 긴 단편을 단리하기 위해서, 이 단편을 프로브로 하여 두 번째 KUSA 세포의 cDNA 라이브러리로부터 플라크하이브리다이제이션에 의해 7F4유전자를 클로닝했다. 우선「oligo dT priming」의「KUSA cDNA 라이브러리」를, KUSA 세포로부터 추출한 mRNA로부터「ZAP-cDNA Synthesis Kit」(stratagene사 제)을 사용하여 첨부의 프로토콜에 따라서 제작했다. 이「KUSA cDNA 라이브러리」50만 클론분의 파지를 플레이트에 펴고, SST 법으로 얻어진 7F4의 cDNA 단편의 일부를 α³²P dCTP로 라벨하여, 이것을 프로브로 하여 플라크하이브리다이제이션을 행하였다. 라이브러리를 고정한 필터를 하이브리다이제이션 완충액(50% 포름아미드, 5X SSPE, 5X 덴하르트용액, O.1% SDS, 0.1 mg/ml 청어정자 DNA)으로 42℃에서 6시간 동안 인큐베이트한 후, 프로브를 포함하는 같은 버퍼로 바꾸어 42℃에서 밤새 인큐베이트했다. 그 후, 2X SSC-0.1% SDS로 수회 세정한 후, 0.1XSSC-0.1% SDS로 60℃에서 30분 정도 2회 세정하고, 오토 라디오그라피로 검출했다. 양성 클론으로부터 이것을 「ExAssist helper phage」(stratagene사 제)를 사용하여 플라스미드 pBluescriptII로 삽입하였다. 얻어진 플라스미드에는 개시 코돈을 포함하는 약 3kb의 cDNA 단편이 포함되어 있었다. 이 cDNA의 염기 서열은 프라이머 워킹(primer walking)에 의해 다이터미네이션(dyetermination)법 (ABI PRISM sequencing kit 에 의한)을 사용하여 염기 서열을 결정했다. 결정한 염기 서열로부터 추정한 아미노산 서열을 기초로 호몰로지검색을 한 결과, 일치하는 유전자가 찾아지지 않아 7F4가 코드하는 유전자는 신규한 것으로 밝혀졌다(도 1). 흥미롭게도, 클론 7F4는 막으로 발현되는 데 필요한 시그널 서열 다음에, TNF 수용체 슈퍼패밀리에 공통으로 보존되어 있는 시스테인이 풍부한 반복 모티프를 3개 갖고 있어 7F4가 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 신규 막단백질인 것이 밝혀졌다(도 2).

실시예 3

노던 블로팅

마우스에 대해서는「Mouse multiple northern (MTN) blot」(CLONTECH사 제)를, 인간에 대해서는「human MTN blot」(CLONTECH사 제)를 필터로 사용했다. 7F4 cDNA의 ORF를 포함하는 영역(염기번호 120-480)을「multiprime rabelling」에 의해 α³²P로 표지하고, 이것을 프로브로 하여 하이브리다이제이션을 행하였다. 마우스에 대해서는「ExpressHyb Hybridization so1'n」(CLONETECH사 제)으로 68℃에서 2시간 동안 인큐베이트하고, 2X SSC-0.1% SDS로 수회, 0.1X SSC-0.1% SDS로 60℃에서 2회세정했다. 인간에 대해서는「ExpressHyb Hybridization sol' n」(CLONTECH사 제)으로 68℃에서 4시간 동안 인큐베이트하고, 2X SSC-0.05% SDS로 42℃, 10분 동안 2회 세정했다. 그 후,「BAS2000」(FUJI사 제)로 검출했다. 이 결과, 마우스에서는 어떠한 조직에도 편재적인 발현이 인정되었다(도 3). 한편, 인간에도 편재적인 발현이 인정되었지만, 그 중에서도 골격근과 심장에서 특히 발현이 높고, 이 점이 특징적이었다(도 4). 또한 마우스, 인간에도 약 5kb의 위치에 밴드가 검출되어, 이 유전자의 mRNA의 사이즈가 약 5kb인 것을 알았다.

실시예 4

GST 융합단백질의 발현과 정제

7F4 cDNA의 ORF를 포함하는 플라스미드「pBluescript-7F4」를 주형으로, 서열번호:9 및 서열번호:10에 기재된 2개의 프라이머로 PCR를 하여 7F4 유전자의 세포외 영역을 코드하는 유전자를 증폭시켰다. 이것을 BamHI-EcoRI로 절단하고, 「pGEX-2 T」(pharmacia사 제)의 GST 유전자의 하류에 삽입했다. 이 플라스미드에 의해 형질전환시킨 JMl09를, 0.5 mM IPTG 첨가에 의해 GST 융합단백질을 유도시켜 3시간 후에 대장균을 집균하고, 1mg/ml 리조짐(lysozyme)을 포함하는 소니케이션완충액(sonication buffer) (25 mM Tris pH 8.0, 10mM EDTA, 1mM PHSF)에 현탁했다. 얼음 속에서 30분간 방치한 후, 이것을 초음파 파쇄하고 이어서 원심분리하여 상청을 회수했다. 이것을「Bulk GST purification Module」(pharmacia사 제)의「Glutathione Sepharose4G Column」(pharmacia사 제)에 올려놓고, 첨부의 프로토콜에 따라 원하는 단백질을 용출하여 정제했다. 단백질은 10% SDS PAGE를 하고 코마씨 브릴리언트 블루(CBB)로 염색했다. 또한, 항GST 항체를 사용한 웨스턴블로팅에 의해 확인했다.

실시예 5

항혈청의 제작

정제한 7F4-GST 융합단백질을 PBS 버퍼로 치환한 후, 토끼에게 면역했다. 면역은 2주 걸러서 하고 첫번째는 600㎍/head, 두번째 이후는 200㎍/head로 하고, 세번째 종료한 시점에서 소량 채혈하고 ELISA를 행하여 역가를 평가했다. 그 결과 충분한 항체가가 상승하고 있는 것이 판명되었기 때문에, 그 후 최종 면역을 하여 심채혈에 의해 전채혈을 했다.

실시예 6

7F4 유전자 발현세포주의 수립

7F4의 모든 ORF를 포함하는 유전자를 서열번호:11 및 서열번호:12에 기재된 두개의 프라이머에 의해 PCR로 증폭시키고, 이것을 EcoRl-BamHI로 절단했다. 약제선택 마커로서 네오마이신 유전자를 갖는 발현벡터「pCOSI」(Sato K, Tsuchiya M, Saldanha J, Koishihara Y, Ohsugi Y, Kishimoto T, Bendig MM.(l994) Mol Immunol. 31, 371-381, Humanization of a mouse anti-human interleukin-6 receptor antibody comparing two methods for selecting human framework regions)의 EF1α 프로모터 하류에 이 유전자 단편을 삽입하고,「pCOSI-7F4」를 구축했다. 이 플라스미드 25㎍를 pvuI로 절단한 후, KUSA 세포(7X10⁶cells)에 일렉트로포레이션(1.6kv, 25uF, timeconst 0.36)에 의해 도입하고, 480㎍/m1의 G418을 포함하는 배지(IMDM+ 10% FCS)로 수일간 배양하여 생육한 클론을 십수개 선발했다. 이들 클론의 세포 표면을 항혈청(x1000) 및 FITC 표지항-토끼 IgG (H+L)로 염색한 후,「flowcytometer ELITE」(COULTER사 제)로 분석하고, 친주 KUSA 세포와 비교하여 7F4 유전자의 발현량이 높은 것을 몇개 선택했다.

실시예 7

포스파티딜이노시톨 특이적 포스포리파제 C 처리에 의한 세포 표면상의 7F4 단백질 발현의 변화 검출

7F4의 아미노산 조성으로부터 소수성 해석 소프트웨어(DNASIS사 제)에 의해 소수성을 해석해 보면, 시그널 서열을 코드하는 영역인 N 말단측 이외에 C 말단측에도 소수성이 풍부한 영역이 존재하고, ORF가 거기에서 종결하고 있다는 것이 밝혀졌다(도 5A). 이러한 아미노산 구조로부터, 이 분자는 세포내 영역을 가지지 않고, 글리코실 포스파티딜이노시톨(GPI)앵커(Ikezawa H, Yamanegi M, Taguchi R, Miyashita T, and Ohyabu T(1976) Studies on phosphatidylinositol phosphodiesterase (phospholipase C type) of Bacillus cereus. I. purification, properties and phosphatase-releasing activity. Biochim Biophys Acta. 450, 154-164, Low MG, and Finean, JB (1977) Release of alkaline phosphatase from membranes by a phosphatidylinosito1-specific phospholipase C. Biochem. 167, 281-284, Low MG, and Saltiel AR (1988) Structural and functional roles of glycosyl-phosphatidylinositol in membranes. Science 239, 268-275)에 의해 세포막에 결합하고 있는 단백질일 가능성이 추측되었다. 그래서 KUSA 세포 또는 KUSA 세포에 7F4 유전자를 과잉발현시킨 세포주(「KUSA-7F4#2;저발현시킨 것」,「KU8A-7F4#5;고발현시킨 것」)를 수립하고, 포스파티딜이노시톨 특이적 포스포리파제 C로 처리하여, 세포 표면상의 7F4 단백질의 양적 변화를 항혈청으로 염색하고 플로우사이토미터(ELITE)로 해석했다. 세포는 PBS로 세정한 후,「포스파티딜이노시톨 특이적 포스포리파제 C」(2U/ml;프나코시사 제)를 포함하거나 포함하지 않는 버퍼(PBS+ 1% FCS)로 37℃에서 1시간 동안 인큐베이트했다. 그 결과, 포스파티딜이노시톨 특이적 포스포리파제 C로 처리하면, 어느 쪽의 세포주에 있어서도 세포 표면상의 7F4 단백질 양성 세포수가 감소했다(도 5B). 이것으로부터 세포 표면의 7F4분자는 포스파티딜이노시톨 특이적 포스포리파제 C에 의해 절단될 수 있는 구조를 하고 있는 것이 밝혀졌다. 이 결과로부터 7F4 유전자는 세포 표면상에 GPI 앵커에 의해 결합하여 발현되고 있는, 즉 GPI형 막단백질일 가능성이 분명해졌다.

실시예 8

「7F4」단백질의 과잉발현에 의한 세포의 증식·분화의 검출 및 알칼리포스파타아제 활성 변화의 검출

(1)7F4 유전자 발현세포주의 수립

7F4 유전자가 EF1α프로모터의 지배하에 있는 발현 벡터 pCOSI-7F4, 25㎍을 pvuI으로 절단한 후, KUSA(7X10⁶cells) 또는 CHO 세포에 일렉트로포레이션 (1.6Kv, 25uF, time const 0.36)에 의해 도입하고, G418을 480ug/m1 포함하는 배지(IMDM+ 10%FCS 또는 α-MEM+1O% FCS)로 수일간 배양하여 생육한 클론을 수십개 선발했다. 이들 클론의 세포 표면을 7F4항혈청(x1000) 및 FITC 표지 항토끼 IgG(H+L)로 염색한 후, 플로우사이토미터 ELITE에 의한 분석을 하고, 친주 KUSA 또는 CH0와 비교하여 7F4 유전자의 발현량이 높은 것을 몇개 선택했다. 이것에 의해 pCOSI-7F4가 도입된 「7F4」단백질을 약하게 발현한 형질전환체 #2, 강하게 발현한 형질전환체 #11을 얻었다. 이들 형질전환체는 배양을 계속하는 동안 세포의 형태가 현저히 변화되었다. 친주의 KUSA는 가늘고 긴 섬유아세포양의 형태를 보이고 있지만, 형질전환체는 세포 전체가 크게 넓어져 가는 돌기가 불어나고 있었다.

(2) 증식해석

12 웰플레이트에 5X10³세포/웰(KUSA 세포), 1X10³세포/웰(CHO 세포)를 넣어 배양을 하고, 그 후 시간에 따라 세포를 떼어내어 세포수를 세었다. 형질전환체의 외래성의 7F4의 발현 레벨은 #11이 가장 높고, 이어서 #8, #5가 중간정도 그리고 #2가 가장 낮다. 이들 세포의 증식 속도는 친주와 비교하여 외래성 7F4의 발현량과 상관하여 저하되고 있었다(도 6). 이것들의 실험 결과로부터 7F4 유전자의 고발현이 KUSA의 골아세포로서의 형질을 더욱 유도한다는 것이 밝혀졌다.

(3) 알칼리포스파타아제의 활성 측정

6웰로 배양한 세포를 PBS로 2회 세정한 후, 700㎕의 소니케이션 완충액(50mM Tris pH7.2, 0.1% Triton X-100)으로 세포를 떼어냈다. 이것을 가볍게 초음파 파쇄하고, 15000rpm에서 15분간 원심분리한 후, 단백질 농도를「protein assay kit」(bio-rad사 제)를 사용하여 측정했다. 2로부터 20ug 상당의 세포 용해물에 기질 20mM p- 니트로페놀포스페이트를 포함하는 같은 량의 인큐베이션 완충액(0.1M 2-아미노-2-메틸-1-프로판올/HCl pH 10.5, 2mM MgCl₂)을 첨가하고, 30분간 37℃에서 인큐베이트했다. 그리고 O.lN이 되도록 NaOH를 가하여 반응을 정지한 후, 생성된 p-니트로페놀의 양을 0D 405로 비색정량했다. 친주 KUSA 및 형질전환체 #2, #11을 배양하고, 세포가 80% 정도 콘플루언트되었을 때, 즉 증식기의 세포로부터 세포 용해물을 조제하여, 골아세포의 분화 마커의 하나인 세포내 알칼리포스파타아제의 활성을 측정했다. 그 결과, 역시 외인성의 7F4의 발현량과 상관하여 알칼리포스파타아제의 활성도 상승하고 있는 것이 분명해졌다(도 7).

같은 실험을 CH0 세포로 행하였다. KUSA 세포와 같이 CHO 세포에 pCOSI-7F4를 도입하여, 외래성의 7F4를 고발현하는 세포주를 수종류 수립했다(도 8). 그리고 7F4의 고발현에 의해서 이들 형질전환체의 증식에 어떠한 영향을 미치는 가를 해석했다. 예상과 반대로 CH0 세포에서는 7F4 유전자의 고발현은 세포의 증식에 전혀 영향을 미치지 않았다(도 9). 세포 형태도 전혀 변화하지 않았다.

본 발명에 의해, TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하고, 골아세포의 분화 등에 관여하고 있다고 생각되는 신규한 막분비 단백질, 그 단백질을 코드하는 유전자, 그유전자가 삽입된 벡터, 그 벡터가 도입된 숙주세포, 그 단백질에 대한 항체가 제공되었다. 또한 그 단백질을 이용한 의약품후보 화합물의 스크리닝 방법이 제공되었다. 본 발명의 단백질, 유전자, 항체나 스크리닝에 의해 단리된 화합물은 의약품으로 응용할 수 있다고 생각된다. 고령화 사회와 함께 골조송증을 비롯한 골질환 환자의 증가가 예상되고 있다. 본 발명의 단백질은 골형성과정에서 중요한 골아세포의 분화, 활성화에 관여하고 있다고 생각되는 본 발명의 단백질, 이것에 대한 항체 또는 리간드 등이 골질환 치료 등에 공헌한다고 생각된다. 또한 골형성의 메커니즘의 해명에도 공헌한다고 생각된다.

서열표

(1) 출원인의 성명 또는 명칭: 가부시키가이샤 쥬가이분시이가쿠겐큐죠

(2) 발명의 명칭: 신규한 막분비 단백질

(3) 정리번호: C1-806PCT

(4) 출원번호:

(5) 출원일:

(6) 우선권의 기초가 된 출원을 한 국명 및 출원의 번호:

일본국 1997년 특허원 제099653호

(7) 우선일: 1997년 4월 1일

(8) 서열수: 12

서열번호: 1

서열의 길이: 176

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 단백질

서열

Met Val Thr Phe Ser His Val Ser Ser Leu Ser His

-28 -25 -20

Trp Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Asn Leu Phe Leu Pro Val Ile Phe

-15 -10 -5

Ala Met Pro Glu Ser Tyr Ser Phe Asn Cys Pro Asp Gly Glu Tyr Gln

1 5 10 15

Ser Asn Asp Val Cys Cys Lys Thr Cys Pro Ser Gly Thr Phe Val Lys

20 25 30

Ala Pro Cys Lys Ile Pro His Thr Gln Gly Gln Cys Glu Lys Cys His

35 40 45

Pro Gly Thr Phe Thr Gly Lys Asp Asn Gly Leu His Asp Cys Glu Leu

50 55 60

Cys Ser Thr Cys Asp Lys Asp Gln Asn Met Val Ala Asp Cys Ser Ala

65 70 75 80

Thr Ser Asp Arg Lys Cys Glu Cys Gln Ile Gly Leu Tyr Tyr Tyr Asp

85 90 95

Pro Lys Phe Pro Glu Ser Cys Arg Pro Cys Thr Lys Cys Pro Gln Gly

100 105 110

Ile Pro Val Leu Gln Glu Cys Asn Ser Thr Ala Asn Thr Val Cys Ser

115 120 125

Ser Ser Val Ser Asn Pro Arg Asn Trp Leu Phe Leu Leu Met Leu Ile

130 135 140

Val Phe Cys Ile

145

서열번호: 2

서열의 길이: 148

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 단백질

서열

Ala Met Pro Glu Ser Tyr Ser Phe Asn Cys Pro Asp Gly Glu Tyr Gln

1 5 10 15

Ser Asn Asp Val Cys Cys Lys Thr Cys Pro Ser Gly Thr Phe Val Lys

20 25 30

Ala Pro Cys Lys Ile Pro His Thr Gln Gly Gln Cys Glu Lys Cys His

35 40 45

Pro Gly Thr Phe Thr Gly Lys Asp Asn Gly Leu His Asp Cys Glu Leu

50 55 60

Cys Ser Thr Cys Asp Lys Asp Gln Asn Met Val Ala Asp Cys Ser Ala

65 70 75 80

Thr Ser Asp Arg Lys Cys Glu Cys Gln Ile Gly Leu Tyr Tyr Tyr Asp

85 90 95

Pro Lys Phe Pro Glu Ser Cys Arg Pro Cys Thr Lys Cys Pro Gln Gly

100 105 110

Ile Pro Val Leu Gln Glu Cys Asn Ser Thr Ala Asn Thr Val Cys Ser

115 120 125

Ser Ser Val Ser Asn Pro Arg Asn Trp Leu Phe Leu Leu Met Leu Ile

130 135 140

Val Phe Cys Ile

145

서열번호: 3

서열의 길이: 1509

쇄의 수: 2중가닥

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: cDNA to mRNA

서열의 특징:

특징을 나타내는 기호: CDS

존재위치: 12..542

특징을 결정한 방법: E

특징을 나타내는 기호: sig peptide

존재위치: 12..95

특징을 결정한 방법: S

특징을 나타내는 기호: mat peptide

존재위치: 96..542

특징을 결정한 방법: S

서열

AGCTCACAGC C ATG GTT ACC TTC AGC CAC GTC TCC AGT CTG AGT CAC 47

Met Val Thr Phe Ser His Val Ser Ser Leu Ser His

-28 -25 -20

TGG TTC CTC TTG CTG CTG CTG CTG AAT CTG TTC TTG CCG GTA ATA TTT 95

Trp Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Asn Leu Phe Leu Pro Val Ile Phe

-15 -10 -5

GCT ATG CCT GAA TCA TAC TCC TTC AAC TGT CCC GAT GGT GAA TAC CAG 143

Ala Met Pro Glu Ser Tyr Ser Phe Asn Cys Pro Asp Gly Glu Tyr Gln

1 5 10 15

TCT AAT GAT GTC TGT TGC AAG ACC TGT CCC TCA GGT ACA TTT GTC AAG 191

Ser Asn Asp Val Cys Cys Lys Thr Cys Pro Ser Gly Thr Phe Val Lys

20 25 30

GCG CCC TGC AAA ATC CCC CAT ACT CAA GGA CAA TGT GAG AAG TGT CAC 239

Ala Pro Cys Lys Ile Pro His Thr Gln Gly Gln Cys Glu Lys Cys His

35 40 45

CCA GGA ACA TTC ACA GGG AAA GAT AAT GGC CTG CAT GAT TGT GAA CTT 287

Pro Gly Thr Phe Thr Gly Lys Asp Asn Gly Leu His Asp Cys Glu Leu

50 55 60

TGC TCC ACC TGT GAT AAA GAC CAG AAT ATG GTG GCT GAC TGT TCT GCC 335

Cys Ser Thr Cys Asp Lys Asp Gln Asn Met Val Ala Asp Cys Ser Ala

65 70 75 80

ACC AGT GAC CGG AAA TGC GAG TGC CAA ATA GGT CTT TAC TAC TAT GAC 383

Thr Ser Asp Arg Lys Cys Glu Cys Gln Ile Gly Leu Tyr Tyr Tyr Asp

85 90 95

CCA AAA TTT CCG GAA TCA TGC CGC CCA TGT ACC AAG TGT CCC CAA GGA 431

Pro Lys Phe Pro Glu Ser Cys Arg Pro Cys Thr Lys Cys Pro Gln Gly

100 105 110

ATC CCT GTC CTC CAG GAA TGC AAC TCC ACA GCT AAC ACT GTG TGC AGT 479

Ile Pro Val Leu Gln Glu Cys Asn Ser Thr Ala Asn Thr Val Cys Ser

115 120 125

TCA TCT GTT TCA AAT CCC AGA AAC TGG CTG TTC CTA CTG ATG CTA ATT 527

Ser Ser Val Ser Asn Pro Arg Asn Trp Leu Phe Leu Leu Met Leu Ile

130 135 140

GTC TTC TGT ATC TGAAGAAGAT AAAGGTTCTA CAGATGGTGT CTGTAGCTTC 579

Val Phe Cys Ile

145

CTTTTATTGC TGTGAAGAGA AACCATGGAG GCAACTCTTT CATTTTATTT TATTTTTTAA 639

TGTCTTGAAC TTGATTTGAA GACCAGGCTG GACTCAAACT CACAGAGATC CGGACTAGGC 699

ACCTCTAATA TAGGAAAACA TTGAATTGGG ACTGGCTTAC AGTTTCAGAA GTTCTGTCCA 759

TGATTATCAT AGTGCGAAGC ATGGAGGCAC GGAGGCACAC ATGGTGCTGG AGAAGAAGCT 819

GAGAGTTCTG CATCTTGATC TGCAAGCAAT AAAAGGAGAC TGTGTGCCAC ACTACACATA 879

GCTTGAACAT AGGAGACCTC AAAGCCTGTC CCCACAGTGA CAAACTTCCT CCAACAAGGT 939

CATACCTCCT AATAATACCA TTTCTTATGA GGCAAGCATT CAAACACATG AGTCTATGAG 999

GGCCAAACCA ATTCAAACCA CCACAGGTTA ACAATTGCCC TCTGCAGCTC TCTGGTGGAG 1059

GCCCTCCTTG AGAGTAAGTA ACAATTTAGA TGAAGGCAAG TCCTGGTATC AGGTCCAAAA 1119

GAAACTCAGG ATGAATGGTC CACTGTGGTT CCTATTAACA TACTGAAGAA CATGACCTCA 1179

CCTTAGACTT CTCCACCTCA CTGGCTTCCC TTCCCCTAGC TTCTCATTCC CAGGTAACCC 1239

TGCCATTTTT TGGTAATGTG CCTTCTTGGT TCTTCCTCTC CTTTCCCCCT CTCTTCTGGT 1299

CCTTATTTCT CTTCCTCTCC CACTCTCCAC CAGCCGCCTC TTAAGGCCTG AGTCAGTCTG 1359

CAGGCCATGT TTAATCTACT ACTTTCTCTC TGCTCTGGAC TCATCCAGAT GTCTCTGGCT 1419

GAGCTCTCCC TCCTATCTAC AATAAAACCT TCCCCCTAAC CAGAAATGGA ACAGTTTTGT 1479

CCTCACTTTG TACATCTGGT GCCTGAAACC 1509

서열번호: 4

서열의 길이: 43

쇄의 수: 단가닥

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 다른 핵산 합성 DNA

서열

GCGGCCGCGA ATTCTGACTA ACTGACGGGG GGGGGGGGGG GGG 43

서열번호: 5

서열의 길이: 26

쇄의 수: 단가닥

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 다른 핵산 합성 DNA

서열

CCGCGAGCTC GATATCAAGC TTGTAC 26

서열번호: 6

서열의 길이: 29

쇄의 수: 단가닥

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 다른 핵산 합성 DNA

서열

GGCGCTCGAG CTATAGTTCG AACATGGAG 29

서열번호: 7

서열의 길이: 29

쇄의 수: 단가닥

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 다른 핵산 합성 DNA

서열

GAGGTACAAG CTTGATATCG AGCTCGCGG 29

서열번호: 8

서열의 길이: 23

쇄의 수: 단가닥

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 다른 핵산 합성 DNA

서열

GCCGCGAATT CTGACTAACT GAC 23

서열번호: 9

서열의 길이: 24

쇄의 수: 단가닥

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 다른 핵산 합성 DNA

서열

GGATCCTTCA ACTGTCCCGA TGGT 24

서열번호: 10

서열의 길이: 26

쇄의 수: 단가닥

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 다른 핵산 합성 DNA

서열

GAATTCCACA CAGTGTTAGC TGTGGA 26

서열번호: 11

서열의 길이: 36

쇄의 수: 단가닥

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 다른 핵산 합성 DNA

서열

CCGAATTCCA CCATGGTTAC CTTCAGCCAC GTCTCC 36

서열번호: 12

서열의 길이: 35

쇄의 수: 단가닥

토폴로지: 직쇄상

서열의 종류: 다른 핵산 합성 DNA

서열

CCGGATCCTC AGATACAGAA GACAATTAGC ATCAG 35

Claims (14)

1. 서열번호:1 또는 2에 기재된 아미노산 서열로 된 단백질 또는 이들 단백질 중의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 복수의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 갖고, 골세포의 분화유도 활성을 갖는 단백질.
2. 서열번호:3에 기재된 염기 서열로 된 DNA와 하이브리다이즈하는 DNA가 코드하는 단백질로서 골세포의 분화유도 활성을 갖는 단백질.
3. 청구항 1 또는 2에 기재된 단백질을 코드하는 DNA.
4. 청구항 3에 기재된 DNA가 삽입된 벡터.
5. 청구항 4에 기재된 벡터가 도입된 숙주세포.
6. 청구항 1 또는 2에 기재된 단백질에 결합하는 항체.
7. 청구항 1 또는 2에 기재된 단백질에 결합하는 활성을 갖는 화합물의 스크리닝 방법으로서,

   (a) 청구항 1 또는 2에 기재된 단백질에 피험시료를 접촉시키는 공정,

   (b) 청구항 1 또는 2에 기재된 단백질에 결합하는 활성을 갖는 화합물을 선택하는 공정

   을 포함하는 방법.
8. 청구항 1 또는 2에 기재된 단백질의 골세포의 분화유도 활성을 촉진 또는 저해하는 활성을 갖는 화합물의 스크리닝 방법으로서,

   (a) 세포 표면에 발현시킨 청구항 1 또는 2에 기재된 단백질에 피험시료를 접촉시키는 공정,

   (b) 청구항 1 또는 2에 기재된 단백질의 골세포의 분화유도 활성을 검출하는 공정, (c) 피험시료가 없을 때 검출을 한 경우와 비교하여, 청구항 1 또는 2에 기재된 단백질의 골세포의 분화유도 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물을 선택하는 공정

   을 포함하는 방법.
9. 청구항 7에 기재된 방법에 의해 단리할 수 있는, 청구항 1 또는 2에 기재된 단백질에 결합하는 화합물.
10. 청구항 8에 기재된 방법에 의해 단리할 수 있는, 청구항 1 또는 2에 기재된 단백질의 골세포의 분화유도 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물.
11. 천연 유래인 청구항 9 또는 10에 기재된 화합물.
12. 리간드인 청구항 9 또는 10에 기재된 화합물.
13. 아고니스트인 청구항 9 또는 10에 기재된 화합물.
14. 안타고니스트인 청구항 9 또는 10에 기재된 화합물.