WO1998043998A1

WO1998043998A1 - Nouvelle proteine secretee par une membrane

Info

Publication number: WO1998043998A1
Application number: PCT/JP1998/001511
Authority: WO
Inventors: Naoki Kimura; Tomoko Toyoshima
Original assignee: Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc.
Priority date: 1997-04-01
Filing date: 1998-04-01
Publication date: 1998-10-08
Also published as: US6271366B1; DE69829173T2; DE69829173D1; ATE290019T1; KR20010005892A; US20040152879A1; EP0976764B1; AU6521998A; EP0976764A4; AU734013B2; EP0976764A1; CA2284734A1; US20020128435A1; US6784284B2; JP4135813B2; IL132112A0; US7235640B2; TW562807B

Description

明細新規な膜分泌タンパク質技術分野

本発明は骨細胞の分化に関与する新規な膜分泌タンパク質、該タンパク質をコ

—ドする DNA、該 DNAを含むベクタ一、該ベクターを保持する宿主細胞、該タンパク質に対する抗体、該タンパク質を利用した化合物のスクリーニング方法、並びに該スクリーニング方法により単離しうる化合物に関する。背景技術

骨芽細胞の働きで骨が再生する現象、即ち、骨形成は、脊椎動物の生体維持などに重要な現象である。骨形成に関与する因子としては、これまでにホルモンではエストロゲン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（PTH) が、増殖因子では BMP (Bone Morphologenic Protein) が、その他薬剤では活性化ビタミン！)、カルシゥム製剤、ビタミン K2などが知られている。このうちエストロゲン、カルシトニン、活性化ビタミン D、カルシウム製剤などが現在骨粗しょう症などの骨量改善治療薬として応用されているが、いずれも骨量を増加させるというよりは、骨吸収抑制を機序とした骨量減少の防止薬として使用されており、実効性のある骨形成促進薬はいまだ開発されていないのが現状である。

一方、骨関連疾患の新規治療薬として期待されている BMPは、異所性形成シグナルとしての作用を有する唯一のサイトカインである。 BMPは、実際に骨折や骨欠損時の修復反応の際起こる、いわゆる軟骨性の仮骨から新生骨に置換されることによって起こる骨形成（軟骨内骨化）に有用であると考えられている（Duprez DM, Coltey M,Amthor H，Brickell P Jickle C( 1996 )Dev Biol 174 448-452 Bone mo rphogenetic protein - 2( BMP - 2 ) inhibits muscle development and promotes car tilage formation in chick limb bud cultures、 Nakase T, Nomura S,Yoshikawa H, Hashimoto J₅Hirota S,Kitamura Y,0ikawa S,0no K, Takaoka K( 1994)J Bone Miner Res 9 651-659 Transient and localized expression of bone morphogen etic protein 4 messenger RNA during fracture healing) 。

しかしながら、恒常的骨形成の際の骨吸収と共役して引き起こされる骨形成においては、 BMPが関与することについての確証的な報告はない。従って、 BMPも恒常的骨形成に必須とされる骨芽細胞の分化促進や活性化を利用した骨形成促進薬として利用できるとは言い難い。即ち、恒常的骨形成に関与する因子についてはこれまでに報告例がないのが現状である。発明の開示

本発明は、恒常的骨形成に関与する新規なタンパク質およびその遺伝子を提供することを課題とする。また、本発明は、該遺伝子が挿入されたべクタ一、該べクタ一を保持する宿主細胞、該タンパク質に結合する抗体を提供することを課題とする。さらに、本発明は、該タンパク質を利用した、リガンドなどの該タンパク質に結合する化合物をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、膜分泌タンパク質をコードする遺伝子を特異的にクローニングする方法を用いることにより、骨芽細胞様細胞株から 3種類の膜分泌タンパク質をコードする遺伝子を単離することに成功した。本発明者らは、その中の 1つの遺伝子について解析を進めたところ、該遺伝子がコードするタンパク質が、細胞外領域のみを有し GPIアンカ一により細胞膜に結合するタンパク質であり、その内部に TNF受容体スーパ一フアミリーに保存されているシスティンに富む繰り返し領域を有する新規な受容体タンパク質であることを見出した。さらに、本発明者らは、該タンパク質を骨芽細胞様細胞株で高発現させることにより細胞増殖が抑制されて細胞の形態が変化し、また骨芽細胞の分化の指標の一つであるアル力リフォスファタ一ゼ活性が増大することを見出した。また、このように単離したタンパク質が骨細胞の分化に関与していることから、該タンパク質を利用して骨関連疾患に対する医薬品候補化合物をスクリーニングすることができることを見出した。

即ち、本発明は新規な膜分泌タンパク質およびその遺伝子、該タンパク質を利用した医薬品候補化合物のスクリ一ニング方法に関し、より具体的には、

( 1) 配列番号： 1または 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、またはこれらタンパク質中のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列を有し、骨細胞の分化誘導活性を有する夕ンパク質、

( 2 ) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNAとハイプリダイズする DNAがコードするタンパク質であって、骨細胞の分化誘導活性を有するタンパク質、

(3) ( 1) または（2) に記載のタンパク質をコードする DNA、

(4) (3) に記載の DNAが挿入されたべクタ一、

(5) (4) に記載のベクタ一を保持する宿主細胞、

(6) ( 1) または（2) に記載のタンパク質に結合する抗体、

(7) ( 1) または（2) に記載のタンパク質に結合する活性を有する化合物のスクリーニング方法であって、

(a) ( 1) または（2) に記載のタンパク質に被検試料を接触させる工程、

(b) ( 1) または（2) に記載のタンパク質に結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。

(8) ( 1) または（2) に記載のタンパク質の骨細胞の分化誘導活性を促進または阻害する活性を有する化合物のスクリーニング方法であって、

(a) 細胞表面に発現させた（ 1) または（2) に記載のタンパク質に被検試料を接触させる工程、

(b) ( 1) または（2) に記載のタンパク質の骨細胞の分化誘導活性を検出する工程、 (c) 被検試料非存在下において検出を行った場合と比較して、（ 1) または ( 2 ) に記載の夕ンパク質の骨細胞の分化誘導活性を促進または阻害する化合物を選択する工程、

を含む方法、

(9) (7) に記載の方法により単離しうる、（ 1) または（2) に記載の夕ンパク質に結合する化合物、

( 10) (8) に記載の方法により単離しうる、（ 1) または（2) に記載のタンパク質の骨細胞の分化誘導活性を促進または阻害する化合物、

( 1 1) 天然由来である（9) または（ 10) に記載の化合物、

( 12) リガンドである（9) または（ 10) に記載の化合物、

( 13) ァゴニストである（9) または（ 10) に記載の化合物、

( 14) アン夕ゴニストである（9) または（ 10) に記載の化合物、に関する。

本発明は、恒常的骨形成に関与すると考えられる新規な膜分泌タンパク質に関する。本発明者らにより単離されたマウス由来の cDNAの塩基配列を配列番号： 3 に、該 cDNAによりコードされるタンパク質のうちシグナルべプチドを含むタンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 1に、 N末端側のシグナルペプチドが除去された成熟タンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 2に示す。本発明者らは、単離したクローンを「7F4」と命名した。本発明のタンパク質に含まれる「7F4」タンパク質は、 TNF受容体サブファミリーに保存されたシスティンに富む領域を有し、その N末端（シグナル配列領域）および C末端に疎水性に富んだアミノ酸領域を有する。この「7F4」タンパク質は、データーベース上において有意な相同性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質は見出されなかった。従って、「7F4」タンパク質は、 TNF受容体スーパーフアミリー (Beulter.B,and Huffel.C.V(1994)SCIENCE 264,6 67-668 Unraveling function in the TNF ligand and receptor i ami lies; に属する新規なタンパク質であると考えられる（図 6参照）。「7F4」タンパク質を高発現させた KUSA細胞（該細胞は正常マウス骨髄間質由来の細胞であり、造血指示能を有する他、 in vivoでの移植により骨髄を誘導しつつ骨形成を引き起こすことが知られている。文献「Umezawa,A. ,Maruyama，T. , Seg awa,K. , Shadduck,R.K. ,Waheed,A. ,and Hata, J. ( 1992)Multipotent marrow strom al cel l line is able to induce hematopoiesis in vivo. J. Cell . Physiol .151 , 197-205」参照）の形質転換体を PI特異的ホスホリパーゼ C (Pi-specific phosph olipase C) で処理すると、該タンパク質の細胞表面における存在量が低下した (実施例 7 ) 。このため「7F4」タンパク質には細胞内領域は存在せず、 GPIアン力一を介して細胞表面に固定される構造を有していると考えられる。 GPIアンカ一型膜タンパク質としては、 CNTF受容体などが知られている。また、 IL- 6、 IL- 11受容体の細胞内領域は非常に短く、リガンド結合後のシグナル伝達に関わる領域を有していない。これら受容体は共にリガンドが結合すると gpl30と会合し、 gpl30 をシグナル伝達鎖として利用して、シグナルを細胞内へ伝達する。「7F4」もまた、多くのサイトカインレセプ夕一と同様、 gpl30のようなシグナル伝達鎖と会合する機構によりシグナルを核へと伝達しているのかもしれない。実際に、 KUSA細胞において「7F4」タンパク質を過剰発現させると、その発現量に相関して細胞形態が変化し、細胞の増殖速度が低下する傾向を示し（実施例 6 ) 、骨芽細胞の分化の指標の一つであるアルカリフォスファタ一ゼ活性が増大した（実施例 8 ) 。これら事実から、「7F4」タンパク質は、特に、骨細胞の分化シグナルに関与していると考えられる。従って、「7F4」タンパク質やこれに結合する化合物には、後述するように、特に骨関連疾患の予防や治療への利用が考えられる。また、骨細胞分化マ一力一としての診断への応用も考えられる。

骨芽細胞を長期に渡り培養し続けると骨形成マーカーの発現が上昇し、自ら分化に至ることが報告されている（Matsumoto T, Igarashi C, Takeuchi Y， Harad a S, Kikuchi T, Yamato H, and Ogata E. ( 1991 ) Stimulation by 1, 25-dihydro xyvitamin D3 of in vitro mineral ization induced by osteoblast - like MC3T3 - El cells. Bone. 12, 27-32、 Sudo H， Kodama HA, Amagai Y， Yamamoto S, and

Kasai S. ( 1983) In vitro differentiation and calcification in a new clon al osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J Cell Biol

.96, 191-198) 。骨組織を誘導する唯一の骨形成因子であり、軟骨形成を経てから骨形成を引き起こす因子として MPが知られているが、骨芽細胞、特に KUSA細胞における骨形成においては軟骨細胞の出現は観察されない。従って、この骨分化機構は、 BMP (Wozney, JM, Rosen, V， Celeste, AJ， Mitsock, LM, Whitters,MJ,

Kriz, RW, He ick, RM, and Wang, EA( 1988) Novel regulators of bone format ion: molecular clones and activities. Science. 242， 1528-1534) の作用からは説明がつかず、現在、未知の骨形成因子の存在が有力視されている。「7F4」夕ンパク質は、この骨形成因子の有力な候補である。

また、本発明は、「7F4」タンパク質と機能的に同等なタンパク質に関する。

「7F4」タンパク質と機能的に同等なタンパク質を単離するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto- Gotoh, T， Mizuno, T,

Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. ( 1995 ) An oligodeoxyribonucleotide-direc ted dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271 - 275、 Zoller, MJ, and Smith, M. ( 1983) Oligonucleotide - directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol . 100, 468 - 500、 Kra mer,W, Drutsa，V， Jansen，HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, and Fritz, HJ( 1984)

The gapped du lex DNA approach to oligo匿 leotide - directed mutation con struction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、 Kramer W, and Fritz HJ( 198 7) Oligonucleotide - directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol . 154， 350-367、 Kunkel₅ TA( 1985 ) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sc i U S A. 82, 488-492) などを用いて、「7F4」タンパク質（配列番号： 1または 2 ) 中のアミノ酸に適宜変異を導入することにより「7F4」タンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、「7F4」タンパク質のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、「7F4」タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。機能的観点から、変異するアミノ酸は、通常、 30アミノ酸以内であり、好ましくは、 15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは 5アミノ酸以内であり、さらに好ましくは 3アミノ酸以内である。

また、機能的に同等なタンパク質を単離する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダィゼ一シヨン技術 (Sambrook,J et al.， Molecular Cloning 2^{n d} ed.9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989) を利用した方法が挙げられる。即ち、当業者であれば、「7F4」タンパク質をコードする DNA配列

(配列番号： 3 ) もしくはその一部を基に、これと相同性の高い DNAを単離して、該 DNAから「7F4」タンパク質と機能的に同等なタンパク質を単離することも通常行いうることである。このように、「7F4」タンパク質をコードする DNA配列もしくはその一部からなる DNAとハイプリダイズする DNAがコードするタンパク質であつて、「7F4」タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。このようなタンパク質としては、例えば、マウス以外の哺乳動物のホモログ（例えば、実施例 3のノーザンブロッテイングにより検出されたヒト遺伝子がコードするタンパク質）が挙げられる。ハイブリダィズ技術により得られるタンパク質は、通常、「7F4」タンパク質とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸配列において、通常、 40%以上の相同性、好ましくは 60%以上の相同性、さらに好ましくは 80%以上の相同性である。

本発明において「7F4」タンパク質と「機能的に同等」とは、タンパク質が「7 F4」タンパク質と同様に骨細胞の分化を誘導する活性を有することを指す。骨細胞の分化を誘導する活性とは、骨細胞の細胞増殖速度の低下をもたらし、該細胞の形態を変化させる活性を指す。該活性は、例えば、顕微鏡による骨細胞の形態学的観察や、骨細胞の分化マーカーとして一般に用いられているアル力リフォスファターゼの活性測定などの方法 (N. C.Partrige,D. Alcorn, V.P.Michelangel i, G. Ryan & T. J.Martin( 1983) Cancer Res 43 4308-14. Morphological and biochem ical characterization of four clonal osteogenic sarcoma cell lines of ra t origin^ J.K. Burns & .A.Peck( 1978) Science 199 542-4. Bone cel ls : a ser um-free medium supports proliferation in primary culture) により検出することが可能である。アルカリフォスファタ一ゼの活性の測定は、例えば、細胞を超音波破砕により破壊し、細胞抽出液を得て、これをアルカリフォスファタ一ゼの基質である P-ニトロフエニルフォスフェート（p-nitrophenyl phosphate) とィンキュベ一卜したのち、分解されて産生した p-ニトロフエノール（p- nitropheno 1) の量を分光光度計により定量するなどの方法で行うことが可能である。また、ォステオカルシン（Osteocalcine) やコラーゲンタイプ Iを指標に検出することも可能である。

本発明のタンパク質は、当業者に公知の方法により、組み換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することが可能である。組み換えタンパク質であれば、例えば、本発明のタンパク質の膜結合に必要な領域以外の部分を細胞内で発現させ、細胞に分泌させる。次いで、この細胞の培養上清を回収し、濃縮した後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のタンパク質に対する抗体をカラムに固定したァフィ二ティークロマトグラフィ一にかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製することが可能である。また、本発明のタンパク質をグル夕チォン Sトランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えタンパク質として宿主細胞（例えば、動物細胞ゃ大腸菌など）内で発現させ、発現させた組み換えタンパク質をグル夕チオンカラム、あるいはニッケルカラムにより精製する。その後、必要に応じて融合タンパク質のうち目的の夕ンパク質以外の領域を、トロンビンまたはファクタ一 Xaなどにより切断し、除去する方法により調製できる。天然のタンパク質であれば、例えば、本発明のタンパク質を発現している細胞の抽出物に対し、後述する本発明の抗体が結合したァフィ二ティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。

また、本発明は、上記本発明のタンパク質をコードする DNAに関する。本発明の MAは、本発明のタンパク質をコードしうるものであれば、いかなる形態でもよい。即ち、 mRNAから合成された cDNAであるか、ゲノム DNAであるか、化学合成 DNA であるかなどを問わない。本発明の DNAは、例えば、本発明のタンパク質を発現している細胞より cDNAライブラリ一を作製し、本発明の DNAの配列（例えば、配列番号： 3に記載の DNA配列）の一部をプローブにしてハイブリダィゼ一シヨンを行うことにより調製できる。また、本発明のタンパク質を発現している細胞より Aを調製し、本発明の DNAの配列（例えば、配列番号： 3に記載の DNA配列）に基づいてオリゴ DNAを合成し、これをプライマ一として用いて PCR反応を行い、本発明のタンパク質をコードする cDNAを増幅させることにより調製することも可能である。本発明の DNAは、本発明のタンパク質を組み換えタンパク質として生産するために利用することができる。また、本発明のタンパク質をコードする DNAに欠陥がある場合には、アンチセンスによる機能阻害や、正常な遺伝子に置き換える遺伝子治療などへの応用も考えられる。

また、本発明は、本発明の DNAが挿入されたベクターに関する。本発明のベクタ —としては、例えば、宿主を大腸菌とする場合には、ベクタ一を大腸菌（例えば、 JM109、 DH5ひ、 HB101、 XLlBlue) などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフエニコ一ル）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。例えば、 M13系ベクター、 pUC系ベクター、 pBR322、 pBluescriptヽ pCR- Scriptなどが挙げられる。また cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合も上記べクタ一の他に、 pGEM-T、 pDIRECT, pT7などがあげられる。本発明のタンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現べクタ一が有用である。発現べクタ一としては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主を JM109、 DH5 a, HB101、 XLlBlueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター（例えば、 lac，T7など）を持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記べクタ一の他に pGEX、 pEGFP、または pET (この場合、宿主は T7 RNAポリメラ一ゼを発現してる BL21 )などが挙げられる。

また、 CH0細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモ一夕一（SV40,MMLV- LTR，EFl a ,CM Vプロモーターなど）を持っていることが不可欠であり、さらに細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、 G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、 p匪、 pDR2、 pBK-RSV, pBK- CMV、 pOPRSV, ρθ P13などが挙げられる。

さらに、細胞内でのコピー数の増幅を目的とした宿主べクタ一系においては、安定産生細胞株の場合は、核酸合成経路を欠損した CH0細胞にそれを相補する DHF R遺伝子を有するベクター（例えば、 pCHOIなど）を用いメトトレキセ一ト（MTX) により増幅させる方法が挙げられ、また一過性の発現を目的とする場合には、 SV 40 T抗原を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複製機転を持つベクター（pcD など）で形質転換する方法が挙げられる。

一方、動物の生体内で本発明の DNAを発現させる方法としては、本発明の DNAを適当なベクタ一に組み込みレトロウイルス法、リボソーム法、カチォニックリポソ一ム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。用いられるベクタ一に特に制限はないが、 pAdexlcwや pZIPneoなどが好適である。ベクターへの本発明の DNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である (Molecular Cloning , 5.61-5.63) 。

また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞に関する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。大腸菌では、例えば、 JM109、 DH5ひ、 HB101 等が挙げられ、動物細胞においては、例えば、 CH0細胞、 COS細胞、 3T3細胞、 HeL a細胞などが挙げられる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特に CH0細胞が好ましい。

一方、生体内で本発明の DNAを発現させるために用いられる細胞としては、特に制限はなく、種々の動物細胞が挙げられるが、骨関連疾患の遺伝子治療を行う場合には、特に、体内より採取した間葉系細胞、骨芽細胞などの細胞が標的細胞として好適である。

宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、エレクトロボレ一シヨン、リボフヱクシヨンなどの方法で行うことが可能である。

また、本発明は、本発明のタンパク質と結合する抗体に関する。本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、ポリクロ一ナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。また、ゥサギなどに本発明のタンパク質を免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクロ一ナル抗体およびモノクローナル抗体、さらにヒト抗体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。本発明の抗体は、以下の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、本発明のタンパク質をゥサギなどの小動物に免疫し血清を得て、これを本発明のタンパク質をカツプリングさせたァフィ二ティ一カラムにより、本発明のタンパク質のみを認識する画分を得て、さらにこの画分から免疫グロブリン Gあるいは Mを、プロティ、ノあるいはプロティン Gカラムにより精製することにより調製することができる。また、モノクローナル抗体であれば、本発明のタンパク質をマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞にし、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これによりできた融合細胞（ハイプリドーマ）の中から、本発明のタンパク質に対する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイプリド一マをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクロ一ナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィ一、本発明のタンパク質をカツプリングしたァフィ二ティ一カラムなどにより精製することで調製することが可能である。本発明の抗体は、本発明のタンパク質の精製、検出に用いられる他、骨関連疾患の抗体治療への応用も考えられる。抗体治療に用いる場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体ゃヒト型抗体が好ましい。

また、本発明は、本発明のタンパク質を利用した、本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法、並びに該スクリーニング方法により単離しうる化合物（例えば、リガンド、ァゴニスト、およびアン夕ゴニスト）に関する。このスクリーニング方法の一つの態様は、（a ) 本発明のタンパク質に被検試料を接触させる工程、（b ) 本発明のタンパク質に結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む。このスクリーニング方法に用いられる被験試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、タンパク質、ペプチド、合成低分子化合物が挙げられる。被験試料を接触させる本発明のタンパク質は、例えば、精製したタンパク質として、細胞膜上に発現させた形態として、また、細胞膜画分として、被験試料に接触させることができる。被検試料の本発明の夕ンパク質に対する結合活性は、例えば、後述する当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。

また、他の一つの態様は、（a ) 細胞表面に発現させた本発明のタンパク質に被検試料を接触させる工程、（b ) 本発明のタンパク質の骨細胞の分化誘導活性を検出する工程、（C ) 被検試料非存在下において検出を行った場合と比較して、本発明のタンパク質の骨細胞の分化誘導活性を促進または阻害する化合物を選択する工程、を含む。本発明のタンパク質を発現させる細胞としては、本発明の夕ンパク質に結合するリガンドを発現していない細胞が好ましい。本発明のタンパク質の細胞表面への発現は、例えば、本発明のタンパク質をコードする DNAを適当なベクターに挿入し、これを細胞内に導入することにより行うことができる。本発明のタンパク質の骨細胞の分化誘導活性は、例えば、顕微鏡による骨細胞の形態学的観察や、骨細胞の分化マーカーとして一般に用いられているアル力リフォスファ夕一ゼの活性測定などの方法 (N. C.Partrige,D. Alcorn, V.P.Michelangeli, G.Ryan & T.J. Mart in( 1983 ) Cancer Res 43 4308-14. Morphological and bioch emical characterization of four clonal osteogenic sarcoma cell l ines of rat origin J.K. Burns & W.A.Peck( 1978) Science 199 542-4. Bone cells :a s erum-free medium supports proliferation in primary culture) により検出することが可能である。アルカリフォスファタ一ゼの活性の測定は、例えば、細胞を超音波破砕により破壊し、細胞抽出液を得て、これをアルカリフォスファタ一ゼの基質である P-ニトロフエニルフォスフエ一ト（p-nitrophenyl phosphate) とインキュベートしたのち、分解されて産生した p- ニトロフエノール（p- nitroph enol) の量を分光光度計により定量するなどの方法で行うことが可能である。また、ォステオカルシン（Osteocalcine) やコラーゲンタイプ Iを指標に検出することも可能である。

具体的な方法としては、例えば、以下の方法を用いることができる。本発明のタンパク質を用いて、該タンパク質に対するリガンドを単離する方法としては、例えば、リガンドを発現してることが予想される細胞（例えば、 KUSA細胞、 R0S1 7/2.8細胞、 UMR106- 01細胞、 UMR106-06細胞、 MC3T3E1細胞、 H0S-TE85細胞、 MG63 細胞、 SaOS2細胞、 UMR206細胞、 RCT1細胞、 C3H10T1/2細胞などの骨芽細胞株、 0P 9細胞、 Sトロ一マ細胞、 NIH3T3細胞などの繊維芽細胞など）よりファージベクタ ― ( Agtll , ZAPなど）を用いた cMAライブラリ一を作製し、これを LB-ァガ口一ス上で発現させフィル夕一に発現させたタンパク質を固定し、本発明のタンパク質をピオチンラベル、あるいは GSTタンパク質との融合タンパク質として精製し、これを上記フィル夕一と反応させ、結合するタンパク質を発現しているプラークを、ストレプトアビジン、あるいは抗 GST抗体により検出する「ウェストウェス夕ンブロッテイング法」 (Skolnik EY， Margolis B， Mohammad 1 M, Lo enstein E, Fischer R， Drepps A, Ullrich A, and Schlessinger J ( 1991 )Cloning of PI3 kinase - associated p85 util izing a novel method for expression/cloning o f target proteins for receptor tyrosine kinases. Cell 65, 83-90) により調製することが可能である。また、本発明のタンパク質を SRF結合領域または GAL4結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、リガンドを発現していることが予想される細胞より、 VP16または GAL4転写活性化領域と融合する形で発現するような cDNAライブラリ一を作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリ一由来 cDNAを単離して大腸菌に導入して発現させる（酵母細胞内で本発明のタンパク質と結合するタンパク質が発現すると、両者の結合によりレポ一夕一遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）「twoハイブリツドシステム」（「MATCHMARKER Two-Hybrid Systemj ，「Mammalian MATCHMAK ER Two-Hybrid Assay Kit」，「MATCHMAKER One-Hybrid Systemj (いずれも clont ech社製）、「HybriZAP Two-Hybrid Vector Systemj ( stratagene社製）、文献「D alton S, and Treisman R ( 1992)Characterization of SAP - 1, a protein recr uited by serum response factor to the c-fos serum response element. Cel l 68, 597-612」）に従い調製することも可能である。さらに、本発明のタンパク質をそのリガンドを発現していない細胞で発現させ、次いで、該細胞に、リガンドを発現してることが予想される細胞より構築した発現 cMAライブラリーを COSなどの細胞に導入して得た培養上清を添加し、そして細胞のある種の変化（増殖速度、形態、アルカリフォスファタ一ゼの発現など）を指標にリガンドを探索する「ダイレクト発現クロ一ニング法」（Yokota T, Otsuka T， Mosmann T, Bancher eau J, DeF ranee T, Blanchard D， De Vries JE, Lee F， and Arai K. ( 1986) Is olation and characterization of a human interleukin cDNA clone, homo logo us to mouse B - cell stimulatory factor 1， that expresses B-cell- and T-ce 11- stimulating activities. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 5894-5898) により調製することも可能である。さらにまた、本発明のタンパク質を固定したァフィニティ一カラムに本発明のリガンドを発現していることが予想される細胞の培養上清をのせ、カラムに特異的に結合するタンパク質を精製することにより調製することも可能である。なお、得られたタンパク質（リガンド）のアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴ MAを合成し、該 DNAをプローブとして cDNAライブラリ一をスクリーニングすることにより、該リガンドをコ一ドする DNAを得ることも可能である。なお、本発明において、「リガンド」とは、細胞膜に発現する本発明のタンパク質に結合することにより、その機能を活性化するタンパク質を指す。また、本発明のタンパク質を用いて、該タンパク質に対するァゴニスト、およびアン夕ゴニストを単離する方法としては、例えば、固定した本発明のタンパク質に、化合物、または天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドデイスプレイライブラリ一を作用させ、結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリ一技術によるハイスループットを用いたスクリーニング（Wrighton NC; Farrell FX; Chang R; Kashyap AK; Barbone FP ; Mulcah y LS; Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK; Dower WJ. , Smal l peptides as p otent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (UNITED ST ATES) Jul 26 1996， 273 p458- 64、 Verdine GL.， The combinatorial chemistry of nature. Nature (ENGLAND ) Nov 7 1996， 384 pi卜 13、 Hogan JC Jr. , Direct ed combinatorial chemistry. Nature (ENGLAND ) Nov 7 1996， 384 pl7-9) により本発明のタンパク質に対するァゴニストゃアン夕ゴニストを単離する方法が当業者に周知の技術である。なお、本発明において「ァゴ二スト」とは、本発明のタンパク質とリガンドとの結合と同様の現象（本発明のタンパク質の活性化）を引き起こすことができる、本発明のタンパク質に特異的に結合できる分子を指す。また、「アン夕ゴニスト」とは、本発明のタンパク質に特異的に結合することによってその機能を抑制する分子を指す。

これにより単離されたリガンド、ァゴニスト、アン夕ゴニストには、以下のような応用が考えられる。例えば、リガンド、ァゴニスト、もしくはアン夕ゴニストの投与により、骨芽細胞の分化誘導、活性化を導き、加齢にともなう骨粗鬆症、変形性関節症における骨量の改善や骨形成の促進、あるいは骨腫瘍に対する骨細胞分化の制御機能を利用した抗癌治療を行うことが考えられる。図面の簡単な説明

図 1は、クロ一ン 7F4のオープンレーディングフレームを含む cDNA配列とそのァミノ酸配列を示す図である。上段に塩基配列を、下段にアミノ酸配列を記した。下線は二つの疎水性領域を示したもので、 N末側がシグナル配列、 C末側が GPIリンカーとの置換領域と推測される。

図 2は、 7F4とマウス TNFRの細胞外領域でのアミノ酸配列の比較を示す図である c 上段が 7F4、下段がマウス TNFレセプ夕一の細胞外領域のアミノ酸配列である。一致するシスティンを白抜きで、それ以外の一致するアミノ酸をラインで示した図 3は、種々のマウス組織での 7F4遺伝子の発現をノーザンブロット解析した電気泳動像である。

図 4は、種々のヒト組織での 7F4遺伝子の発現をノーザンブロット解析した電気泳動像である。

図 5は、図 5Aは、 7F4タンパク質の疎水性を示す図である。図の横軸の左側が 7 F4タンパク質の N末端側を、右側が C末端側を示す。また、図の縦軸は疎水性の度合いを示す。図 5Bは、 KUSA細胞の表面上の 7F4タンパク質、および 7F4を過剰発現させた 2種のクローンにおける PI特異的ホスホリパ一ゼ C処理後の細胞表面上の 7 F4タンパク質を検出した図である。図の点線は未処理の細胞における結果、実線は処理した細胞における結果を示す。なお、図の縦軸は細胞数を示し、横軸は細胞の蛍光強度を示す。

図 6は、 TNF受容体スーパーファミリーに属する分子の構造を示す図である。システィンに富む繰り返し配列を楕円で示した。なお、楕円中の横線はシスティンの位置を示す。

図 7は、 7F4遺伝子の高発現による KUSA細胞の増殖阻害を示す図である。 7F4遺伝子を高発現させた KUSA細胞の増殖速度を経時的に細胞数を計測して調べた。図 8は、 7F4遺伝子の発現によるアル力リフォスファターゼ活性の変化を検出した結果を示す図である。 KUSA細胞に 7F4遺伝子を高発現させた各形質転換体から細胞がコンフルェントになる前に細胞溶解物を調製し、細胞内アル力リフォスファ夕ーゼ活性を測定した。

図 9は、 CH0細胞および 7F4遺伝子が導入された形質転換体における 7F4遺伝子の発現を検出した結果を示す図である。 CH0細胞に 7F4発現べクタ一を形質転換して得た各クローンを 7F4抗血清で染色し、 EL I TEでその発現量を解析した。

図 1 0は、 7F4遺伝子の高発現による COS細胞の増殖速度の変化を検出した結果を示す図である。 7F4遺伝子を高発現させた COS細胞の増殖速度を経時的に細胞数を計測して調べた。発明を実施する最良の形態

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

[実施例 1 ] 7F4遺伝子のクロ一ニング

マウス骨芽細胞 KUSAの発現する分泌、膜タンパク質をコードする遺伝子のク口 —ニングは、「signal sequence trapj (SST) 法に基本的に従って行った。具体的には、まずライブラリ一の発現用べクタ一として用いる「pSRひ Tac」を以下の手順で構築した。ヒ卜の全長 IL-2受容体遺伝子が挿入されたプラスミド、「pK CR. Tac-2Aj (理研ジーンバンクより購入）を EcoRI、 Eco47I I Iで切り出し、 Tac 全長をコードする遺伝子断片を得た。一方、動物細胞用発現ベクター「pcD- SRa -FEj (Takebe Y，Seiki MJujisawa J, Hoy P,Yokota K,Arai K, Yoshida M,Arai N. Mol Cel l Biol 8:466-472( 1988) SR alpha promoter: an efficient and vers atile mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 e arly promoter and the R-U5 segment of human T - cell leukemia virus type 1 long terminal repeat) が本来有している Sacl部位をなくしたのち、 EcoRIで切断した。そして、これに上記の Tacの全長をコードする遺伝子断片を挿入し「pSR aTac」を構築した（このプラスミドは EcoRI、 Sacl切断することにより Tacのシグナル配列の領域を除去することが可能となっている）。「5' enriched cDNA lib raryj を作製するため、まず KUSA細胞から調製した mRNA 5〃gをランダムブラィマーを用いて第一鎖 cDNAを合成した。その 5，末端に、「terminal nucleotidyl t ransferasej で dCテ一リングした後、 EcoRI部位をもつプライマ一「5，- GCGGCCGC GAATTCTGACTAACTGAC-( dG )17 (配列番号： 4 ) 」を用いて、 Taq DNAポリメラ一ゼにより第二鎖合成を行った。これを超音波破砕して適当な長さの断片にし、その末端を平滑化した後、 Saclリンカ一 (5'末端側に rcCGCGAGCTCGATATCAAGCTTGTAC (配列番号： 5 ) 」、 3'末端側に GGCGCTCGAGCTATAGTTCGAACATGGAG (配列番号： 6 ) 」）を両端に挿入した。これを鍊型にして 2つのプライマー（「5，- GAGGT ACAAGCTTGATATCGAGCTCGCGG-3' (配列番号： 7 ) 」、「5， - GCCGCGMTTCTGACTMCT GAC- 3，（配列番号： 8 ) 」）により PCRを行い cDNA断片を増幅させた。そして、 1. 5%ァガ口ース電気泳動を行いおよそ 400bpの断片をゲルから切り出した後、 EcoR I、 Saclで切断した。これを、上記方法で作製した発現べクタ一「_PSRひ- TAC I I」の EcoRI, Sacl間に挿入した。次いで、この cDNAライブラリ一を大腸菌 JM109にトランスフオームし、 49個の独立したクローンを 1プールとして、いくつかのプールを作製した。各プールよりプラスミドを調製して、 C0S-7細胞にリポフエクトァミンを用いて導入した。 2日後に細胞を 0.05% EDTA/PBSではがし、 1次抗体としてマウス抗 IL- 2受容体 (Tac ) IgG抗体を、二次抗体として FITC標識ャギ抗マウス IgG抗体を用いて細胞表面を染色し、 Tacタンパク質を細胞表面に発現している細胞をフ口一サイトメ一夕一（ELITE)を用いてスクリーニングした。 Tac陽性のプールについてはさらにそれを分割して、単一のクローンが得られるまで上記ステップを繰り返し行った。この結果、シグナル配列を有する新規遺伝子を 3クロ一ン得た。一つは、基底膜タンパク質を構成するタンパク質の一つェン夕クチン（entacti n) にホモロジ一の高い新規遺伝子（Entactin2) であり、他の一つは膜を 5回ないし 7回貫通するタイプの膜タンパク質であり、さらに他の一つは TNF受容体ス一パ一フアミリ一に保存されたシスティン繰り返しモチーフを有する新規遺伝子 (このクロ一ンを以下、「7F4」と称する）であった。クローン 7F4には約 400bpの断片しか含まれていなかった。

[実施例 2 ] 全長 cDNAのクローニングと塩基配列決定

より長い断片を単離するためため、この断片をプローブに再度 KUSA細胞の cDNA ラィブラリ一からプラークハイブリダイゼ一シヨンにより 7F4遺伝子のクロ一ニングを行った。まず、「ol igo dT priming」の「KUSA cDNAライブラリ一」を KUSA細胞より抽出した mRNAから、 ΓΖΑΡ-CDNA Synthesis Kitj (stratagene社製）を用い添付のプロトコールに従って作製した。この「KUSA cDNAライブラリ一」 50 万クローン分のファ一ジをプレートに広げ、 SST法で得られた 7F4の cDNA断片の一部を a ^{3 2}? dCTPでラベルしこれをプローブにしてプラークハイブリダイゼ一シヨンを行った。ライブラリーを固定したフィル夕一をハイプリダイゼ一シヨン緩衝液

(50% ホルムアミド， 5X SSPE, 5X デンハルト溶液， 0. 1% SDS, 0.1mg/ml 二シン精子 DNA) にて 42°Cで 6時間ほどインキュベートした後、プローブを含む同バヅファ一に換え、 42°Cでさらに一晩インキュベートした。その後、 2X SSC-0.1% SDSで数回洗浄後、 0.1X SSC-0.1¾ SDSで 60°Cで 30分程度 2回洗浄し、オートラジオグラフィ一で検出した。陽性クローンから、これを「ExAssist helper phage 」（stratagene社製）を用いてプラスミド pBluescriptl lへ切り出しを行った。得られたプラスミドには開始コドンを含む約 3kbの cDNA断片が含まれていた。この c DNAの塩基配列はプライマ一ウォーキング（primer walking) によりダイ夕一ミネ —シヨン（dyetermination) 法（ABI PRISM sequencing kitによる）を用いて塩基配列を決定した。決定した塩基配列から推定したァミノ酸配列を基にホモロジ一検索を行ったところ一致する遺伝子は見出されず、 7F4がコードする遺伝子が新規なものであることが判明した（図 1) 。興味深いことに、クローン 7F4は膜で発現するのに必要なシグナル配列に続いて、 TNF受容体スーパ一フアミリーに共通に保存されているシスティンに富む繰り返しモチーフを 3つ有しており、 7F4が TN F受容体スーパ一フアミリーに属する新規膜タンパク質であることが判明した（図 2) 。

[実施例 3 ] ノーザンブロッテイング

マウスに対しては「Mouse multiple northern (MTN) blotj (CLONTECH社製）を、ヒトに対しては「human MTN blotj (CLONTECH社製）をフィル夕一に用いた。 7F4 cDNAの 0RFを含む領域（塩基番号 120- 480) を「multiprime rabellingj によりひ^{3 2} Pで標識しこれをプローブにハイプリダイゼーシヨンを行った。マウスに対しては「ExpressHyb Hybridization sol，n」（CL0NETECH社製）で 68°Cで 2時間ほどインキュベートし、 2X SSC-0.1% SDSで数回、 0.1X SSC-0.1% SDSで 60°Cで 2回ほど洗浄した。ヒトに対しては、 rExpressHyb Hybridization sol' nj (CLONTECH 社製）で 68°Cで 4時間ほどインキュベートし、 2X SSC- 0.05% SDSで 42°C、 10分で 2回洗浄した。その後、「BAS2000」（FUJI社製）で検出した。この結果、マウスでは、どの組織でも偏在的な発現が認められた（図 3) 。一方、ヒトでも偏在的な発現が認められるが、その中でも骨格筋と心臓では特に発現が高く、この点が特徴的であった（図 4) 。また、マウス、ヒトとも約 5kbの位置にバンドが検出され、この遺伝子の mRNAのサイズが約 5kbであることが分かつた。

[実施例 4 ] GST融合タンパク質の発現と精製 7F4 cDNAの ORFを含むプラスミド「pBluescript-7F4」を錶型に配列番号： 9および配列番号： 1 0に記載した 2つのプライマーで、 PCRを行い 7F4遺伝子の細胞外領域をコードする遺伝子を増幅させた。これを BamHI- EcoRIで切断し、「pGEX- 2 Tj (Pharmacia社製）の GST遺伝子の下流に挿入した。このプラスミドにより形質転換させた JM109を、 0.5mM IPTG添加により GST融合タンパク質を誘導させ 3時間後に大腸菌を集菌し、 lmg/ml リゾチーム（lysozyme) を含むソニケ一シヨン緩衝液 (sonication buffer) (25mM Tris pH8.0, lOmM EDTA, ImM PMSF) に懸濁した _c 氷中で 30分放置した後これを超音波破砕し、次いで遠心し、上清を回収した。これを ^rBulk GST purification Modulej (pharmacia社製) の ^rGlutathione Sep harose4G Columnj (pharmacia社製）にのせ、添付のプロトコ一ルに従い目的のタンパク質を溶出し精製した。タンパク質は 10% SDS PAGEを行いコマシープリリアントブル一（CBB) で染色した。また、抗 GST抗体を用いたウエスタンブロティングにより確認した。

[実施例 5 ] 抗血清の ί乍製

精製した 7F4- GST融合タンパク質を、 PBSバッファーに置換した後、ゥサギに免疫した。免疫は 2週おきに行い一回目が 600 zg/head、二回目以降は 200〃g/head で行い、 3回終了した時点で少量採血し ELISAを行って力価を評価した。その結果十分抗体価が上昇していることが判明したため、その後最終免疫を行い、心採血により全採血を行った。

[実施例 6 ] 7F4遺伝子発現細胞株の樹立

7F4の全 0RFを含む遺伝子を配列番号： 1 1および配列番号： 1 2に記載の二つのプライマ一により PCRで増幅させ、これを EcoRI- BamHIで切断した。薬剤選択マ —カーとしてネオマイシン遺伝子を有する発現べクタ一「pC0SI」（Sato K, Tsu chiya M, Saldanha J, Koishihara Y, Ohsugi Y， Kishimoto T， Bendig MM. ( 199 4) Mol Immunol . 31 , 371-381 , Human iz at ion of a mouse ant i -human interleu kin - 6 receptor antibody comparing two methods for selecting human framew ork regions) の EF 1ひプロモ一夕一の下流にこの遺伝子断片を挿入し、「pC0SI -7F4j を構築した。このプラスミド 25〃gを pvulで切断した後、 KUSA細胞（7X10⁶ cells) にエレクトロボレ一シヨン（1.6kv, 25uF, timeconst 0.36) により導入し、 G418を 480 /g/mlを含む培地（IMDM+10%FCS) で数日間培養して、生育したクローンを十数個選抜した。これらクローンの細胞表面を抗血清（xlOOO) および F ITC標識抗-ゥサギ IgG (H+L) で染色した後、「flowcytometer ELITE」 (COULTER 社製）による分析を行い、親株 KUSA細胞と比較して 7F4遺伝子の発現量の高いものをいくつか選択した。

[実施例 7 ] ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ C処理による細胞表面上の 7F4タンパク質の発現の変化の検出

7F4のアミノ酸組成から、疎水性解析ソフト（DNASIS社製）により疎水性を解析すると、シグナル配列をコードする領域である N末側の他に、 C末側にも疎水性に富む領域が存在し、 0RFがそこで終結していることが判明した（図 5A) 。このァミノ酸構造から、この分子は細胞内領域を持たず、グリホシルホスファチジルイノシトール（GPI ) アンカ一（Ikezawa H, Yajnanegi M, Taguchi R， Miyashita T， and Ohyabu T( 1976 )Studies on phosphatidyl inositol phosphodiesterase (pho spholipase C type) of Bacil lus cereus. I . purification, properties and p hosphatase-re leasing activity. Biochim Biophys Acta.450， 154 - 164、 Low MG, and Finean, JB ( 1977)Release of alkaline phosphatase from membranes by a phosphatidyl inositol-specific phospholipase C. Biochem. 167， 281-284 、 Low MG, and Saltiel AR ( 1988) Structural and functional roles of glyco sy卜 phosphatidyl inositol in membranes. Science 239， 268-275) により細胞膜に結合しているタンパク質である可能性が推測された。そこで、 KUSA細胞、または KUSA細胞にさらに 7F4遺伝子を過剰発現させた細胞株（「KUSA- 7F4#2 ;低発現させたもの」，「KUSA—7F4#5 ;高発現させたもの」）を樹立し、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ Cで処理し、細胞表面上の 7F4タンパク質の量的変化を、抗血清で染色してフローサイトメ一夕一（ELITE) で解析した。細胞は、 PBSで洗浄後、「ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパ一ゼ C」 (2U/ml；フナコシ社製）を含む、あるいは含まないバッファー（PBS+1%FCS) で 37°C で 1 時間インキュベートした。この結果、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ Cで処理すると、いずれの細胞株においても細胞表面上の 7F4タンパク質陽性細胞数が減少した（図 5B) 。このことから、細胞表面の 7F4分子はホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ Cにより切断されうる構造をしていることが判明した。この結果より、 7F4遺伝子は細胞表面上に GPIアンカ一により結合して発現している、すなわち GPI型膜タンパク質である可能性が明らかとなった。

[実施例 8 ] 「7F4」タンパク質の過剰発現による細胞の増殖 '分化の検出、およびアル力リホスファタ一ゼ活性の変化の検出

( 1 ) 7f 4遺伝子発現細胞株の樹立

7F4遺伝子が EF1ひプロモーターの支配下にある発現べクタ一 pCOSI- 7F4、 25ugを pvulで切断した後、 KUSA(7X10⁶cells )あるいは CH0細胞にエレクトロポレーシヨン ( 1.6Kv, 25uF, time const 0.36) により導入し、 G418を 480ug/ml含む培地 ( IM DM+10%FCSあるいはひ- MEM+10%FCS) で数日間培養して、生育したクローンを十数個拾った。これらクローンの細胞表面を 7F4抗血清（ xlOOO)および FITC標識抗ゥサギ IgG(H+L)で染色した後、フローサイトメ一夕一 ELITEによる分析を行い、親株 K USA. あるいは CH0に比べて 7F4遺伝子の発現量の高いものをいくつか選択した。これにより pCOSI- 7F4が導入され「7F4」タンパク質を弱発現する形質転換体 #2、強発現の形質転換体 #11を得た。これら形質転換体は培養を続けるうちに細胞の形態が顕著に変化した。親株の KUSAは細長く繊維芽細胞様の形態を示しているが、形質転換体は細胞全体が大きく広がり細かい突起が増えていた。

(2)増殖解析

12ゥエルプレートに 5X10³細胞/ゥエル（KUSA細胞）、 1X10³細胞/ゥエル（CH0細胞）でまきこみ培養を行い、その後経時的に細胞をはがして細胞数を数えた。形質転換体の外来性の 7F4の発現レベルは #11が最も高く、ついで #8、 #5が中程度、そして #2がもっとも低い。これら細胞の増殖速度は親株に比べて外来性の 7F4の発現量に相関して低下していた（図 6 )。これらの実験結果から、 7F4遺伝子の高発現が、 K USAの骨芽細胞としての形質をさらに誘導する、ということが判明した。

( 3)アル力リホスファターゼ活性の測定

6ゥエルで培養をした細胞を PBSで 2回洗浄した後、 700ulのソニケ一シヨン緩衝液（50mM Tris pH 7.2， 0.1¾ Triton X-100 )で細胞をはがした。軽くこれを超音波破砕し 15000rpm、 15分遠心した後、蛋白質濃度を「protein assay kitj (bio-ra d社製）を用いて測定した。 2から 20ug相当の細胞溶解物に基質 20mM p-ニトロフエノールフォスフエ一トを含む等量のィンキュベーシヨン緩衝液（0. 1M 2-アミノ- 2 -メチル- 1-プロパノール/ HC1 pH 10.5 , 2mM MgCL ) を添加し 30分間 37°Cでインキュペートした。そして、 0. 1Nになるように NaOHを加え反応を停止した後、産生された P-ニトロフヱノールの量を 0D405で比色定量した。親株 KUSA、および形質転換体 #2、 #11を培養し、細胞が 80%程度コンフルェントのとき、すなわち細胞が増殖期のときに細胞より細胞溶解物を調製し、骨芽細胞の分化マ一カーの一つである細胞内のアルカリホスファターゼの活性を測定した。その結果、やはり外因性の 7F4の発現量に相関してアル力リフォスファタ一ゼの活性も上昇していることが明らかとなつた（図 7 ) 。

同様の実験を CH0細胞で行った。 KUSA細胞と同様に CH0細胞に pCOSI- 7F4を導入し、外来性の 7F4を高発現する細胞株を数種類樹立した（図 8 )。そして、 7F4の高発現によりこれら形質転換体の増殖にどう影響が及ぼされるかを解析した。予想に反して CH0細胞では 7F4遺伝子の高発現は細胞の増殖に全く影響を及ぼさなかった（図 9 )。細胞形態も全く変化しなかった。産業上の利用可能性

本発明により、 TNF受容体スーパ一ファミリーに属し、骨芽細胞の分化などに関与していると考えられる新規な膜分泌タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子が挿入されたべクタ一、該ベクターを保持する宿主細胞、該夕ンパク質に対する抗体が提供された。また、該タンパク質を利用した医薬品候補化合物のスクリーニング方法が提供された。本発明のタンパク質、遺伝子、抗体ゃスクリ一ニングにより単離された化合物には、医薬品としての応用が考えられる。高齢化社会にともない骨粗鬆症を始めとする骨疾患患者の増加が予想されている。本発明のタンパク質は骨形成過程において重要な骨芽細胞の分化、活性化に関与してると考えられ、本発明のタンパク質、これ対する抗体、またはリガンドなどが骨疾患治療などに貢献すると考えられる。また、骨形成のメカニズムの解明にも貢献すると考えられる。

【配列表】

( 1) 出願人の氏名又は名称：株式会社中外分子医学研究所

( 2 ) 発明の名称：新規な膜分泌夕ンパク質

( 3 )整理番号： C I— 806PCT

( 4 ) 出願番号：

(5) 出願日：

(6)優先権のもととなった出願をした国名及び出願の番号

曰本国平成 9年特許願第 099653号

(7)優先日： 1997年 4月 1日

(8)配列の数： 12 配列番号： 1

配列の長さ： 176

トポロジー：直鎖状

配列の種類：タンパク質

配列

Met Val Thr Phe Ser His Val Ser Ser Leu Ser His -28 -25 -20

Trp Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Asn Leu Phe Leu Pro Val lie Phe

-15 -10 -5

Ala Met Pro Glu Ser Tyr Ser Phe Asn Cys Pro Asp Gly Glu Tyr Gin

1 5 10 15

Ser Asn Asp Val Cys Cys Lys Thr Cys Pro Ser Gly Thr Phe Val Lys

20 25 30

Ala Pro Cys Lys lie Pro His Thr Gin Gly Gin Cys Glu Lys Cys His

35 40 45 Pro Gly Thr Phe Thr Gly Lys Asp Asn Gly Leu His Asp Cys Glu Leu

50 55 60

Cys Ser Thr Cys Asp Lys Asp Gin Asn Met Val Ala Asp Cys Ser Ala 65 70 75 80

Thr Ser Asp Arg Lys Cys Glu Cys Gin lie Gly Leu Tyr Tyr Tyr Asp

85 90 95

Pro Lys Phe Pro Glu Ser Cys Arg Pro Cys Thr Lys Cys Pro Gin Gly

100 105 110 l ie Pro Val Leu Gin Glu Cys Asn Ser Thr Ala Asn Thr Val Cys Ser

115 120 125

Ser Ser Val Ser Asn Pro Arg Asn Trp Leu Phe Leu Leu Met Leu lie

130 135 140

Val Phe Cys l ie

145 配列番号： 2

配列の長さ： 148

トポロジー：直鎖状

配列の種類：タンパク質

配列

Ala Met Pro Glu Ser Tyr Ser Phe Asn Cys Pro Asp Gly Glu Tyr Gin

1 5 10 15

Ser Asn Asp Val Cys Cys Lys Thr Cys Pro Ser Gly Thr Phe Val Lys

20 25 30

Ala Pro Cys Lys l ie Pro His Thr Gin Gly Gin Cys Glu Lys Cys His

35 40 45

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96 06 98

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IlSI0/86Jf/X3d 866£ 86 OAV 存在位置： 12. .95

特徴を決定した方法： S 特徴を表す記号： mat peptide

存在位置： 96. .542

特徴を決定した方法： S 配列

AGCTCACAGC C ATG GTT ACC TTC AGC CAC GTC TCC AGT CTG AGT CAC 47

Met Val Thr Phe Ser His Val Ser Ser Leu Ser His -28 -25 -20

TGG TTC CTC TTG CTG CTG CTG CTG AAT CTG TTC TTG CCG GTA ATA TTT 95 Trp Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Asn Leu Phe Leu Pro Val l ie Phe

-15 -10 -5

GCT ATG CCT GAA TCA TAC TCC TTC AAC TGT CCC GAT GGT GAA TAC CAG 143 Ala Met Pro Glu Ser Tyr Ser Phe Asn Cys Pro Asp Gly Glu Tyr Gin

1 5 10 15

TCT AAT GAT GTC TGT TGC AAG ACC TGT CCC TCA GGT ACA TTT GTC AAG 191 Ser Asn Asp Val Cys Cys Lys Thr Cys Pro Ser Gly Thr Phe Val Lys

20 25 30

GCG CCC TGC AAA ATC CCC CAT ACT C GGA C TGT GAG AAG TGT CAC 239 Ala Pro Cys Lys l ie Pro His Thr Gin Gly Gin Cys Glu Lys Cys His

35 40 45

CCA GGA ACA TTC ACA GGG AAA GAT AAT GGC CTG CAT GAT TGT GAA CTT 287 Pro Gly Thr Phe Thr Gly Lys Asp Asn Gly Leu His Asp Cys Glu Leu

50 55 60 6S01 3I39V0DX3I 0039I1W0V VIX9DV3V33 V33VW0XIV VOaVWODOO

666 DV9XVI3IDV 9IVDV0WV0 I1V39W399 VGXVII3XXI VDOVIWXW I33I03VIV3

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6 8 V1V0V0VI3V 0V339X9I0I 3VDV9DW IW39W39I 3XV0II3IV3 DX31X3V9V9

6Ϊ8 I39W0W9V DDI00I39XV 0VDV399V90 3V399V99IV 00W933I9V IV0IVIIV9I

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96 06 98

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GAAACTCAGG ATGAATGGTC CACTGTGGTT CCTATTAACA TACTGAAGAA CATGACCTCA 1179

CCTTAGACTT CTCCACCTCA CTGGCTTCCC TTCCCCTAGC TTCTCATTCC CAGGTAACCC 1239

TGCCATTTTT TGGTAATGTG CCTTCTTGGT TCTTCCTCTC CTTTCCCCCT CTCTTCTGGT 1299

CCTTATTTCT CTTCCTCTCC CACTCTCCAC CAGCCGCCTC TTAAGGCCTG AGTCAGTCTG 1359

CAGGCCATGT TTAATCTACT ACTTTCTCTC TGCTCTGGAC TCATCCAGAT GTCTCTGGCT 1419

GAGCTCTCCC TCCTATCTAC AATAAAACCT TCCCCCTAAC CAGAAATGGA ACAGTTTTGT 1479

CCTCACTTTG TACATCTGGT GCCTGAAACC 1509 配列番号： 4

配列の長さ： 43

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GCGGCCGCGA ATTCTGACTA ACTGACGGGG GGGGGGGGGG GGG 43 配列番号： 5

配列の長さ： 26

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

CCGCGAGCTC GATATCAAGC TTGTAC 26 配列番号： 6 配列の長さ： 29

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GGCGCTCGAG CTATAGTTCG AACATGGAG 29 配列番号： 7

配列の長さ： 29

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GAGGTACAAG CTTGATATCG AGCTCGCGG 29 配列番号： 8

配列の長さ： 23

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GCCGCGAATT CTGACTAACT GAC 23 配列番号： 9

配列の長さ： 4

鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GGATCCTTCA ACTGTCCCGA TGGT 24 配列番号： 10

配列の長さ： 26

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GAATTCCACA CAGTGTTAGC TGTGGA 26 配列番号： 11

配列の長さ： 36

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

CCGAATTCCA CCATGGTTAC CTTCAGCCAC GTCTCC 36 配列番号： 12

配列の長さ： 35

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 MA

S 9V0IV DOVXIWOVO W9V3VIVDV OXDOIVGODO

IISlO/86dT/X3d 866e 86 OAV

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号： 1または 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、またはこれらタンパク質中のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列を有し、骨細胞の分化誘導活性を有する夕ンパク質。

2 . 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNAとハイプリダイズする DNAがコ

—ドするタンパク質であって、骨細胞の分化誘導活性を有するタンパク質。

3 . 請求項 1または 2に記載のタンパク質をコ一ドする DNA。

4 . 請求項 3に記載の DNAが挿入されたべクタ一。

5 . 請求項 4に記載のベクタ一を保持する宿主細胞。

6 . 請求項 1または 2に記載の夕ンパク質に結合する抗体。

7 . 請求項 1または 2に記載の夕ンパク質に結合する活性を有する化合物のスクリ一ニング方法であって、

( a ) 請求項 1または 2に記載のタンパク質に被検試料を接触させる工程、

( b ) 請求項 1または 2に記載のタンパク質に結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。

8 . 請求項 1または 2に記載のタンパク質の骨細胞の分化誘導活性を促進または阻害する活性を有する化合物のスクリーニング方法であって、

( a ) 細胞表面に発現させた請求項 1または 2に記載のタンパク質に被検試料を接触させる工程、

( b ) 請求項 1または 2に記載のタンパク質の骨細胞の分化誘導活性を検出する工程、

( c ) 被検試料非存在下において検出を行った場合と比較して、請求項 1または 2に記載のタンパク質の骨細胞の分化誘導活性を促進または阻害する化合物を選択する工程、を含む方法。

9. 請求項 7に記載の方法により単離しうる、請求項 1または 2に記載のタンパク質に結合する化合物。

10. 請求項 8に記載の方法により単離しうる、請求項 1または 2に記載の夕ンパク質の骨細胞の分化誘導活性を促進または阻害する化合物。

11. 天然由来である請求項 9または 10に記載の化合物。

12. リガンドである請求項 9または 10に記載の化合物。

13. ァゴニストである請求項 9または 10に記載の化合物。

14. アン夕ゴニストである請求項 9または 10に記載の化合物。