KR100245529B1 - Hu-b1.219,신규한 사람 조혈 수용체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Hu-B1.219라 칭하는 조혈성 수용체족의 신규요소에 관계한다. 특히 본 발명은 Hu-B1.219 유전자 생성물을 인코드하는 발현벡터와 뉴클레오티드 서열에 관계한다. Hu-B1.219를 발현하는 일반적으로 조작된 숙주세포는 Hu-B1.219 상호작용과 조절에 관련한 리간드 또는 약물의 평가와 스크린에 이용될 수 있다. Hu-B1.219 발현은 특정 사람 태아조직과 암세포에서 발견되기 때문에 이의 뉴클레오티드 서열로부터 분자프로브는 산전 테스트와 암진단에 유용하다.

Description

Hu-B1.219, 신규한 사람 조혈 수용체
[도면의 간단한 설명]
제 1 도는 HR 족의 요소들에 의해 공유되는 보존지역의 구조도면이다.
제 2a도 - 제 2g도는 Hu-B1.219의 뉴클레오티드 서열과 유추된 아미노산서열이다.
제 3a 도는 Hu-B1.219의 세가지 형태의 3' 단부 뉴클레오티드 서열의 비교이다.
제 3b 도는 Hu-B1.219의 세가지 형태의 3' 단부 아미노산 서열의 비교이다. * 표시는 종료코돈을 나타낸다.
제 4 도는 HR 유전자와 Hu-B1.219 사이에 FN III 도메인의 보존된 아미노산 공간의 비교이다.
제 5 도는 ＆quot;블럭 3＆quot;에 HR 분자와 Hu-B1.219 사이에 보존된 모티프의 비교이다.
제 6 도는 ＆quot;블럭 6＆quot;에 H4 분자와 Hu-B1.219 사이에 보존된 모티프의 비교이다.
[발명의 상세한 설명]
1. 개요
본 발명은 헤마토포이틴(조혈소) 수용체 집단의 신규요소에 관계하고 이하 Hu-B1.219로 칭한다. 특히 본 발명은 Hu-B1.219 유전자 생성물을 인코드하는 뉴클레오티드 서열과 발현벡터에 관계한다. Hu-B1.219 코딩서열을 발현시키는 유전공학적으로 조작된 숙주세포는 Hu-B1.219 상호작용과 조절에 관계되는 리간드 또는 약물을 평가하고 스크린하는데 이용될 수 있다. Hu-B1.219 발현은 특정 사람 태아조직과 암세포에서 감지되기 때문에 태아 검사의 암진단에 이용될 수 있다.
2. 발명의 배경
암, 면역결핍증을 포함한 다양한 질환이 임파-조혈성 시스템내에 기능이상과 관계 있다. 이들 질환중 일부는 프로제니터(progenitor) 세포와 조혈성 시스템의 제어에 의해 경감되거나 또는 치유될 수 있는데 분화를 촉진하였을 때 환자의 결손이 해결될 수 있다. 따라서, 조혈의 개시와 제어 능력이 가장 중요하다(McCune et al., 1988, Science 241:1632).
자체-재생 간세포 소수에 의한 혈액 세포 생성과정은 성숙한 순환 혈액세포를 생산하기 위해 분화와 증식을 실제 실행하는 직계 특이적 프로제니터 세포를 발생시킴으로써 일어나는데 이는 특정 호르몬에 의해 일부 조절되는 것으로 보여진다. 이들 호르몬은 조혈성 성장인자 또는 사이토킨으로 공지된 것이다(Mtecalf, 1985, Science 229:16; Dexter, 1987, J. Cell Sci. 88:1; Golde and Gasson, 1988, Scientific American, July:62; Tabbara and Robinson, 1991, Anti-Cancer Res. 11:81; Ogawa, 1989, Environ. Health Presp. 80:199; Dexter, 1989, Br. Med. Bull. 45:337).
재조합 DNA 기술의 진보로 이들 분자의 상당수를 인코드하는 유전자를 분자적으로 클론시키고 재조합체에서 발현시켰다(Souza et al., 1986, Science 232:61; Gough et al., 1984, Nature 309:763; Yokota et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:1070; Kawasaki et al., 1985, Science 230:291). 이들 사이토킨은 구조, 생물학 그리고 치료요법적 가능성에 대해 연구되었다. 가장 잘 알려진 특징화된 인자의 일부에는 에리트로포에틴(EPO), 간세포인자(SCF), 입상세포 대식 콜로니 촉진인자(GM-CSF), 대식세포 콜로니 촉진인자(M-CSF)와 인터루킨(IL-1-IL-14)을 포함한다.
이들 인자들은 혈액세포 발생동안에 상이한 단계에서 상이한 세포형에 작용하고 약물에서의 이들의 가능성은 혈액숙주, 골수이식, 면역억제성질환수정, 암치료, 상처치유와 면역반응의 활성까지 될 수 있다(Golde and Gasson, 1988, Scientific American, July:62).
조혈성 프로제니터 세포의 증식과 분화와는 별도로 이와 같은 사이토킨들은 성숙한 조혈성 세포의 이동에 영향을 주는 것을 포함하여(Wiebart et al., 1986, J. Immunol. 137:3584) 성숙한 혈액세포의 상당한 기능을 활성화시키는 것으로 보인다(Stanley et al., 1976, J. Exp. Med. 143:631; Schrader et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:323; Moore et al., 1980, J. Immunol. 125:1302; Kurland et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:2326; Handman and Burgess, 1979, J. Immunol. 122:1134; Vadas et al., 1983, Blood 61:1232; Vadas et al., 1983, J. Immunol. 130:795).
사이토킨은 특정세포 표면 수용체에 결합함으로써 표적세포에 이들의 효과를 발휘한다. 상당수의 사이토킨 수용체가 확인되었고 이들을 인코드하는 유전자가 분자적으로 클론되었다. 몇가지 사이토킨 수용체가 최근에 조혈소 수용체(HR)의 상위집단으로 분류되었다. 이들 수용체의 집단화는 세포의 도메인에 중요 아미노산 모티프의 보호여부에 기초한다(Bazan, 1990, Immunology Today 11:350)(제 1 도). HR 족은 이들 수용체의 세포의 도메인에 3개 보존된 모티프에 의해 정의된다. 제 1 은 Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS 박스) 모티프로 매우 보존성이 크고 막통과 도메인의 아미노단부에 위치한다. HR 족의 대부분 요소들은 이 모티프를 포함한다. 4개 보존된 시스테인 잔기로 구성된 제 2 모티프는 세포외부분의 아미노 단부 절반위치에 있다. 제 3 모티프는 WSXWS 박스와 시스테인 사이에 위치한 보존된 피브로넥틴 타입 III(FN III) 도메인이다. HR 족의 요소들은 에리스토포에틴(EPO), 입상세포 콜로니 촉진인자(G-CSF)(Fukunaga, 1990, Cell 61:341), 입상세포-대식인자 콜로니 촉진인자(GM-CSF), 인터루킨-3(IL-3), IL-4, IL-5, IL-6, IL-7과 IL-2(β-서브유닛(Cosman, 1990, TIBS 15:265)과 같은 리간드용 수용체를 포함한다.
HR용 리간드는 혈액세포의 성숙과 분화에 중요하게 연관된다. 예로써 IL-3은 초기 다계 전능성 조혈세포의 증식을 촉진시키고 적세포를 생산하기 위해 EPO와 공조한다. IL-6와 IL-3은 초기 조혈성 전구물질의 증식을 유도하기 위해 공조한다. GM-CSF는 입상세포의 증식과 대식세포기능을 유도한다. IL-7은 미성숙 T와 B 임파세포를 생산하는데 역할을 하는 골수-유도된 사이토킨이다. 따라서 이들 수용체의 요소는 조혈시스템의 제어에 관계한다.
3. 발명의 요약
본 발명은 Hu-B1.219라 칭하는 HR 족의 신규요소에 관계한다. 특히 뉴클레오티드서열, 발현벡터, Hu-B1.219 유전자를 발현하는 숙주세포와 이 서열에 의해 인코드되는 단백질에 관계한다.
본 발명은 사람 태아 cDNA 라이브러리로부터 분리한 cDNA 클론 Hu-B1.219의 출원인 발견에 기초한다. 이 클론의 뉴클레오티드 서열은 다른 HR 유전자와 특정 유사성을 공유하나, 구조상의 독특한 특징 또한 가진다. Hu-B1.219의 세가지 형태가 확인되었는데 이들 서열은 단지 이들의 3' 단부에서만 상이하다. 서열은 특정 사람 태아와 종양세포에서 발현된다. 따라서 암진단, 태아조직표시, Hu-B1.219에 의해 인코드되는 수용체 분자와 결합하는 화합물과 리간드의 스크린을 포함하나 이에 한정시키지 않는 다양한 용도를 본 발명은 포함하고 있다.
본 발명의 목적을 위해 Hu-B1.219는 도면 제 2a도-제 2g도에 완벽한 cDNA 서열을 나타낸다. 또한 Hu-B1.219는 도면 제 2a도-제 2g도의 cDNA 서열내에 부분 코팅서열을 일컫을 수도 있다.
5. 발명의 상세한 설명
5.1. Hu-B1.219 코딩서열
본 발명은 HR 족의 신규한 요소의 핵산과 아미노산 서열에 관계한다. 단락 6에 실시예에서 수용체의 HR 족의 신규요소를 클론하고 특징화시킨다. 신규 수용체의 뉴클레오티드 코딩서열과 유추된 아미노산 서열은 독특하여 수용체는 Hu-B1.219로 칭한다. 본 발명에 따르면 Hu-B1.219 유전자 생성물의 아미노산 서열을 인코드하는 임의 뉴클레오티드 서열이 Hu-B1.219 유전자의 발현에 관계하는 재조합 분자를 반드는데 이용될 수 있다.
Hu-B1.219 서열의 분석으로 HR 족의 FN III 도메인에 상당히 유사하다는 것이 밝혀졌고 이는 수용체의 HR 족의 요소임을 나타내는 것이다. 6.2.에서는 Hu-B1.219와 HR 족의 다른 공지요소 사이에 공유하는 유사성에 대한 논의하고 있다. 그러나, 이 수용체는 또한 아직 보고안된 독특한 뉴클레오티드 서열 부분은 포함하고 있다.
노던 블랏 하이브리드분석에서 Hu-B1.219 mRNA는 조혈성 원점세포에서 많이 발현된다는 것을 나타낸다. 또한, 특정 종양세포에서는 Hu-B1.219 서열이 발현된다.
전체 Hu-B1.219 cDNA를 인코드하는 전체길이 cDNA 서열을 클론시키기 위해 또한 분자의 다양한 형을 클론시키기 위해 여기에서 나타낸 부분적 cDNA의 일부에 상응하는 핵산단면으로부터 만들어진 라벨된 DNA 프로브가 사람 태아간 cDNA 라이브러리를 스크린하는데 이용될 수 있다. 좀더 특이적으로는 부분 cDNA 서열의 5' 또는 3' 단부에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 더 긴 뉴클레오티드 서열을 얻는데 이용될 수 있다. 간략하면 라이브러리는 각 150㎜ 플레이트당 최대 30,000 pfu를 생산하기 위해 도말될 수 있다. 약 40개 플레이트가 스크린될 수 있다. 플레이트는 플락의 직경이 0.25㎜ 또는 서로 접촉을 시작할때까지 (3-8시간) 37℃에서 배양한다. 나일론 필터를 부드러운 상부 아가로즈 위에 얹고 60초후에 필터를 벗겨내고 0.4N 수산화나트륨으로 구성된 DNA 변성용액에 띄운다. 필터는 그다음 1M 트리스 HCl, pH 7.5로 구성된 중화용액에 담군후 공기건조시킨다. 필터는 10% 덱스트란 설페이트, 0.5M NaCl, 50mM 트리스 HCl, pH 7.5, 0.1% 피로포스페이트 나트륨, 1% 카제인, 1% SDS, 0.5㎎/㎖의 변성된 연어정자 DNA를 포함하는 카제인 하이브리드반응 완충액에 60℃에서 6시간동안 미리 하이브리드시킨다. 방사능 라벨된 프로브는 95℃로 2분간 가열시켜 변성시키고 필터를 포함하는 미리 하이브리드된 용액에 첨가한다. 그다음 필터는 1X 세척혼합액(3M NaCl, 0.6M 트리스염, 0.02M EDTA를 포함하는 10X 세척 혼합액)으로 세척하고 각 실온에서 5분간 2회 세척하고 그다음 최종적으로 60℃에서 30분간 0.1% SDS를 포함하는 1X 세척 혼합액으로 세척한다. 필터는 그다음 공기 건조시키고 자가방사 그래프를 위해 x-레이 필름에 노출시킨다. 현상후에 필름은 양성플락을 선택하기 위해 필터와 함께 배열한다. 하나인 경우, 분리된 양성 플락이 수득되지 않고 플럭을 포함하는 아가는 제거하여 0.1M NaCl, 0.01M 황화마그네슘, 0.035M 트리스 HCl, pH 7.5, 0.01% 젤라틴을 포함하는 람다 희석 완충액에 위치시킨다. 그다음 플락을 재플레이트시키고 단일 플락을 얻기 위해 재스크린한다. 양성플락은 분리되고 공지의 cDNA 서열에 기초하여 프라이머를 사용하여 cDNA 클론한다. 이 단계는 완전한 길이의 cDNA가 될 때까지 반복한다.
완전한 길이의 cDNA를 수득하기 위해 상이한 조직으로부터 다중 cDNA 라이브러리를 스크린할 필요도 있다. 완전한 5' 단부 코딩부분을 인코드하는 cDNA 클론을 확인하기가 어려운 경우에 RACE (cDNA 단부의 신속한 증폭)기술이 이용될 수도 있다. RACE는 불완전한 cDNA의 5' 단부를 증폭시키기 위한 공인된 PCR-기초 전략이다. 독특한 고정부를 포함하는 사람 태아간으로부터 합성된 5'-RACE-준비된 cDNA는 상업적으로 이용될 수 있다(Clontech). cDNA의 5' 단부를 수득하기 위해 PCR이 3' 프라이머와 제공된 고정 프라이머를 사용하여 5' RACE-Ready cDNA에서 실시한다. 2차 PCR 반응은 제조업자의 지시에 따라 고정된 프라이머와 네스트된 3' 프라이머를 이용하여 실시한다. 일단 수득되면, 전체길이 cDNA 서열이 아미노산 서열로 해독될 수 있고, 해독개시와 종료부위에 인접한 오픈 리딩 프레임, 시그날서열과 막통과 도메인 그리고 공지 HR 유전자와 전반적으로 구조상 유사한 것 등의 특정표시에 대해 검사할 수 있다.
5.2. Hu-B1.219 서열의 발현
본 발명에 따르면, Hu-B1.219 단백질, Hu-B1.219이 펩티드 단편, Hu-B1.219 융합 단백질 또는 이의 기능적 등가체를 인코드하는 Hu-B1.219 폴리뉴클레오티드 서열이 적정 숙주세포에서 Hu-B1.219 단백질, Hu-B1.219 펩티드단편, 융합단백질 또는 이의 기능적 등가체를 발현시키는 재조합 DNA 분자를 발생시키는데 이용될 수 있다. Hu-B1.219 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 Hu-B1.219 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 상보체의 일부와 선택적으로 하이브리드되는 다른 폴리뉴클레오티드는 핵산 하이브리드 검사, 서든과 노던 블랏분석에서 이용될 수 있다.
유전자 코드의 고유 변화성으로 인하여 실제 동일한 또는 기능적으로 등가의 아미노산 서열을 인코드하는 다른 DNA 서열이 Hu-B1.219 단백질의 클로닝과 발현을 위해 본 발명의 실시예에서 이용될 수 있다. 이와 같은 DNA 서열에는 엄격한 조건하에 사람 Hu-B1.219 서열에 하이브리드할 수 있는 것을 포함한다. 여기에서 사용된 ＆quot;엄격한 조건(Strigent)＆quot;은 (1) 0.015M NaCl/0.0015M 시트레이트 나트륨/0.1% SDS 50℃와 같은 이용하거나; (2) 포름아미드와 같은 변성제를 하이브리드 동안에 이용하는데 예로써 50%(v/v) 포름아미드와 0.1% 소혈청 알부민 /0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐 피롤리딘/50mM 인산나트륨 완충액 pH 6.5 750mM NaCl, 75mM 시트레이트 나트륨 42℃를 이용하거나; 또는 (3) 50% 포름아미드, 5 x SSC(0.75M NaCl, 0.075M 피로포스페이트 나트륨, 5x 덴하르트 용액, 초음파분쇄된 연어정자 DNA(50g/㎖), 0.1% SDS와 10% 덱스트란 설페이트 42℃, 0.2x SSC와 0.1% SDS 등을 이용하는 조건을 말한다.
본 발명에 따라 이용될 수 있는 변형된 DNA 서열은 상이한 뉴클레오티드 위치에 결실, 추가 또는 치환되어 동일한 또는 기능적으로 등가의 유전자 생성물을 인코드하는 서열로 된 것을 말한다. 유전자 생성물 자체는 Hu-B1.219 내에 아미노산 잔기의 결실, 추가 또는 치환을 포함할 수 있고 이로써 기능적으로 등가의 Hu-B1.219 단백질이 되는 침묵변화가 일어난다. 이와 같은 아미노산 치환은 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 또는 관련 잔기의 양쪽성 성질의 유사성에 기초하여 만들어진다. 예로써 음전하 아미노산에는 아스파르트산, 글루타민산을 포함하고; 양전하 아미노산에는 리신, 히스티딘과 아르기닌을 포함하고; 유사한 소수성값을 가지는 하전을 가지지 않은 극성머리기가 있는 아미노산 집단에는 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신; 비극성 머리기의 아미노산에는 알라닌, 발린, 이소루이신, 루이신, 페닐알라닌, 프롤린, 메티오닌, 트립토판을 포함한다.
본 발명의 DNA 서열은 유전자 생성물의 진행과 발현을 수정하는 변화를 포함하여 다양한 목적으로 Hu-B1.219 코딩서열을 변경시키기 위해 조작될 수 있다. 예로써, 돌연변이는 신규 제한효소루위 삽입과 같은 위치-직접 돌연변이, 글리코실화 패턴, 포스포릴화 변경과 같이 공지의 기술을 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, Hu-B1.219 또는 수정된 Hu-B1.219 서열은 융합단백질을 인코드하기 위해 이형서열에 연결될 수 있다. 예로써 Hu-B1.219 활성의 저해제 또는 촉진제용 펩티드 라이브러리를 스크린하기 위해 상업적으로 이용할 수 있는 항체에 의해 인지되는 이형 에피토프를 발현하는 키메라 Hu-B1.219 단백질을 인코드하는 것이 유용하다. 융합단백질은 Hu-B1.219가 이형부분에서 잘려나올 수 있도록 하기 위해 Hu-B1.219 서열과 이형단백질 서열 사이에 절단부위가 위치하도록 조작될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서 Hu-B1.219의 코딩서열은 본 기술에 공지된 화학적 방법을 이용하여 전체 또는 부분에서 합성될 수 있다(Caruthers et al., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-233; Crea and Horn, 180, Nuc. Acids Res. 9(10):2331; Matteucci and Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21:719; and Chow and Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9(12):2807-2819). 또는 단백질 자체가 전체 또는 부분적 Hu-B1.219 아미노산 서열을 합성시키기 위해 화학적 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 예로써, 펩티드는 고형 상분리기술에 의해 합성되고, 수지로부터 절단되고, HPLC에 의해 정제된다(Creighton, 1983, Proteins Structures And Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y. pp. 50-60). 합성 펩티드의 조성물은 아미노산 분석 또는 서열화에 의해 확인할 수 있다(The Edman degradation procedure; see Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y. pp. 34-49).
생물학적 활성 Hu-B1.219를 발현시키기 위해 Hu-B1.219용 뉴클레오티드 서열 또는 기능적 등가체가 적절한 발현벡터 예로써 삽입된 코딩서열의 전사와 해독을 위해 필수적인 요소를 포함하는 벡터가 된다. Hu-B1.219 유전자 생성물과 재조합 Hu-B1.219 발현벡터가 형질전이 또는 형질변환된 세포주가 다양한 목적을 위해 이용될 수 있다. 여기에는 Hu-B1.219의 활성을 경쟁적으로 저해하고 이의 활성을 중화시키는 항체(예로써 단클론 또는 다클론성)의 생성; 세포내 시그날을 전이하기 위해 수용체를 자극하는데 Hu-B1.219 활성을 흉내내는 항체를 만드는 것을 포함하나 이에 한정하지 않는다. 항-Hu-B1.219항체는 세포와 조직에서 Hu-B1.219를 감지하고 발현양의 수준을 확인하는데 이용될 수 있다.
5.3. 발현 시스템
본 기술에 공지된 방법은 Hu-B1.219 코딩서열과 적절한 전사/해독 제어 시그날을 포함하는 발현벡터를 만드는데 이용될 수 있다. 이들 방법에는 재조합 DNA 기술, 합성기술(in vitro), 재조합/유전재 재조합(in vivo)을 포함한다(The techniques described in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning A Loboratory Manual, cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.).
다양한 숙주-발현 벡터 시스템의 Hu-B1.219 코딩서열을 발현시키는데 이용될 수 있다. 여기에는 Hu-B1.219 코딩서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질 전환된 박테리아; Hu-B1.219 코딩서열을 포함하는 재조합 이스트 발현벡터로 형질전환된 이스트와 같은 미생물; Hu-B1.219 코딩서열을 포함하는 재조합 발현벡터(예로써 베큘로 바이러스)로 감염된 곤충세포 시스템; Hu-B1.219 코딩서열을 포함하는 재조합 발현벡터(예로써 꽃양배투 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스 TMV)로 감염된 또는 Hu-B1.219 코딩서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현벡터(Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 포함하나 이에 한정시키지 않는다. 이들 시스템의 발현요소들은 이들의 강도와 특이성에 따라 다양하다. 이용된 숙주/벡트 시스템에 따라 구성과 유도성 프로모터를 포함하여 임의수의 적절한 전자와 해독요소들이 발현벡터에 이용될 수도 있다. 예로써, 박테리아 시스템에 클론될 때 박테리오 파지 λ의 pL, plac, pt게, ptac(ptrp-lac 하이브리드 프로모터)등과 같은 도성 프로모터가 이용될 수 있고; 곤충 세포 시스템에 클론될 때 베큘로 바이러스 폴리헤드론 프로모터와 같은 프로모터가 이용될 수 있고; 식물세포 시스템에 이용될 때, 식물세포의 게놈에서 유도된 프로모터(예로써, 열쇼크 프로모터; RUBISCO의 소단위용 프로모터; 클로로필 α/β 결합 단백질용 프로모터) 또는 식물 바이러스에서 유도된 프로모터(예로써 CaMV의 35S RNA 프로모터; TMV의 코드 단백질 프로모터)가 이용될 수 있고; 포유류 세포 시스템에 이용될 때 포유류 세포의 게놈에서 유도된 프로모터(예로써 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유류 바이러스에서 유도된 프로모터(예로써 아데노바이러스 후자 프로모터; 벡시니아 바리어스 7.5K 프로모터)가 이용될 수 있고, Hu-B1.219 DNA의 다중 복사체를 포함하는 세포주에서 발생될 경우에 SV-40-, BPV-와 EBV- 기초 벡터가 적절한 선택성 표식과 함께 이용될 수 있다.
박테리아 시스템에서 다수의 발현벡터가 발현된 Hu-B1.219 용으로 이용하기에 따라서 선택될 수 있다. 예로써, 상당량의 Hu-B1.219가 항체 생성용으로 만들 경우 또는 펩티드 라이브러리를 스크린하기 위한 경우에 정제된 융합단백질 생성물의 다량의 발현에 관계하는 벡터가 바람직하다. 이와 같은 벡터에는 대장균 발현벡터 pUR278(Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791)을 포함하나 이에 한정하지 않고, 이때 Hu-B1.219 코딩서열은 하이브리드 AS-lac Z 단백질을 생산하기 위해 lac Z 코딩부위와 프레임에서 벡터에 연결될 수 있다. pIn 벡터(Inouye ＆amp; Inouye, 1985, Nucleic acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke ＆amp; Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509)와 유사 경우에도 마찬가지이다. pGEX 벡터는 글루타티온-S-트란스퍼라제(GST)와 융합단백질로써 외부 폴리펩티드를 발현시키기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, 이와 같은 융합단백질이 가용성이고, 용해된 세포로부터 글루타티온-아가로즈 비드에 흡수시키고 자유 글루타티온 존재하에 용출하여 용이하게 정제할 수 있다. pGEX 벡터는 소요의 클론된 폴리펩티드가 GST에서 분리시키기 위해 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단부위를 포함하도록 고안되었다.
이스트의 경우에, 구성 또는 유도성 프로모터를 포함하는 다수 벡터가 이용될 수 있다(Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Asubel et al., Greene Publish. Assoc. ＆amp; Wiley Interscience, Ch. 13; Grant et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Wu ＆amp; Grossman, 1987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp. 516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. Ii, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3; and Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger ＆amp; Kimmel, Acad. Press, N.Y. Vol. 152, pp. 673-683; and The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I와 II).
식물 발현벡터를 이용하는 경웨 Hu-B1.219 코딩서열의 발현은 다수의 프로모터에 의해 유도될 수도 있다. 예로써 CaMV의 35S RNA의 19S RNA(Brisson et al., 1984, Nature 310:511-514) 또는 TMV(Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6:307-311)와 같은 바이러스 프로모터가 이용될 수 있고; 또는 RUBISCO의 작은 소유닛과 같은 식물 프로모터(Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglie et al., 1984, Science 224:838-843); or heat shock promoters, e.g., soybean hsp17.5-E or hsp17.3-B(Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-565)가 이용될 수 있다. 이들 구성이 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접 DNA 형질변환, 마이크로인젝션, 일렉트로포레이션 등을 이용하여 식물세포로 유입될 수 있다(Weissbach ＆amp; Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp. 421-463; and Grierson ＆amp; Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch 7-9).
Hu-B1.219 발현시키기 위해 이용될 수 있는 또다른 발현 시스템이 곤충 시스템이다. 오토그라파 칼리포니카 뉴클리아 폴리히드로 시스 바이러스(AcNPV)와 같은 시스템이 외부유전자를 발현시키기 위해 벡터로써 이용될 수 있다. 바이러스는 스포도프테라 플루지페라다 세포에서 성장한다. Hu-B1.219 코딩서열은 바이러스의 비-필수부위(예로 폴리헤드린 유전자)내로 클론되고 AcNPV 프로모터(예로써 폴리헤드린 프로모터)의 제어하에 위치한다. Hu-B1.219 코딩서열의 성공적인 삽입으로 폴리헤드린 유전자의 비활성화에 싸여지지 않은 재조합 바이러스(예로써 폴리헤드린 유전자에 의해 코드되는 단백질 코드가 부족한 바이러스)가 생산된다. 이들 재조합 바이러스는 삽입된 유전자가 발현되는 스포토프테라 푸루지페르다 세포를 감염시키는데 이용될 수 있다(Smith et al., 1983, J. Viol. 46:584; Smith, U.S. Patent No. 4,215,051).
포유류 숙주세포에서 발현시스템에 기초한 다수의 바이러스가 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현벡터로 이용되는때 Hu-B1.219 코딩서열이 아데노바이러스 전사/해독 조절 복합체 예로써 후자 프로모터와 세부분 리더 서열에 연결된다. 이들 키메라 유전자는 시험관 또는 생체 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈 비-필수지역(E1 또는 E3)에 삽입으로 감염된 숙주에 Hu-B1.219을 발현할 수 있고 살아있을 수 있는 재조합 바이러스가 된다(Logan ＆amp; Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659). 또는 백시니아 7.5K 프로모터가 이용될 수 있다(Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927-4931).
특정 개시 신호는 삽입된 Hu-B1.219 코딩서열의 효과적인 해독에 요구된다. 이들 신호에는 ATG 개시코돈과 인접한 서열이 포함된다. 고유 개시코돈과 인접서열을 포함하는 전체 Hu-B1.219 유전자가 적절한 발현벡터내로 삽입된 경우에 추가적인 해독 제어신호가 필요하지는 않다. 그러나, Hu-B1.219 코딩서열의 일부만이 삽입될 경우에, ATG 개시코돈을 포함하는 외생 해독 조절신호를 제공해야 한다. 또한 개시코돈은 전체 삽입체의 해독을 확실히 하기 위해 Hu-B1.219 코딩서열의 리딩 프레임상에 있어야 한다. 이들 외생 해독 조절신호와 개시코돈은 자연과 합성의 다양한 원점이 될 수 있다. 발현의 효과는 적절한 전사 강화요소, 전사종료자 등의 포함에 의해 강화될 수 있다(Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544).
또한, 숙주세포 균주는 삽입된 서열의 발혈을 조절하거나 또는 특정 방식에서 유전자 생성물을 진행시키도록 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 수정(예로 글로코실화)과 전행(예로 절단)은 단백질의 기능에 중요하다. Hu-B1.219 세포의 도메인에 몇가지 콘센선스 N-글리코실화 부위에 존재는 Hu-B1.219 기능에 중요한 적절한 수정이 있을 수 있게 한다. 상이한 숙주 세포는 해독후 진행과 단백질 수정에 특징적인 기작을 가진다. 적절한 세포주 또는 숙주시스템은 발현될 외부단백질의 정확한 수정과 진행을 확실히하기 위해 선택될 수도 있다. 이 목적을 위해, 1차 전사체, 글리코실화와 유전자 산물의 포스포릴화의 적절한 진행을 위한 세포기작을 소유하는 진행 숙주세포가 이용된다. 이와 같은 포유류 숙주세포에는 CHO, VERO BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38 등을 포함하나 이에 한정시키지 않는다.
장기간 고율의 재조합 단백질을 생산하기 위해서는 안정한 발현이 적절하다. 예로써, Hu-B1.219를 안정하게 발현하는 세포주로 조작되어야 한다. 바이러스 복제원점을 포함하는 발현벡터의 이용보다는 숙주세포를 적절한 발현베어기소(예로써 프로모터, 인헨서, 서열, 전사 종료인자, 폴리아데닐화부위등)와 선택성 표식에 의해 제어되는 Hu-B1.219 DNA로 형질전화될 수도 있다. 외부 DNA 유입후에 조작된 세포는 풍부한 배지에서 1-2일 성장시키고 선택성 배지로 옮긴다. 재조합 플라스미드에 선택성 표식은 선택에 대해 저항성을 부여하고 이들 염색체에 플라스미드가 안정하게 통합되는 것을 허용하고 포커스를 형성하도록 성장하고 이는 다시 클론되어 세포주로 확장된다. 이 방법은 세포표면에 Hu-B1.219를 발현시키는 세포주를 만드는데 유익하게 이용될 수 있다. 이와 같은 조작된 세포주는 특히 Hu-B1.219 기능에 영향을 주는 리간드 또는 약물을 스크린하는데 특히 유용하다.
다수의 선택 시스템이 이용되는데 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(Wigler, et al., 1977, Cell 11:223), 하이포산틴-구아닌 포스포리보실트란스퍼라제(Szybalska ＆amp; Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026)와 아데닌 포스포리보실트란스퍼라제(Lowy) 유전자가 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에 이용되는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항-대사물질 저항성은 dhfr의 선택에 기초하여 이용될 수 있는데 이는 메토트렉세이트에 저항성을 부여하고(Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. ISA 77:3567; O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Sci. USA 78:1527); gpt, which confers resistance to mycophenolic acid (Mulligan ＆amp; Berg, 1981), Proc. Natl. Sci. USA 78:2072); neo, which confers resistance to the aminoglycoside G-418(Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); 그리고 hygro는 히그로마신(Santerre, et al., 1984, Gene 30:147) 유전자에 저항성을 부여한다. 최근에 추가의 선택성 유전자가 설명되는데 즉 trpB는 트립토판 위치에 인돌을 세포가 이용하도록 허용하고; hisD는 히스티딘 위치에서 히스티놀을 세포가 이용하도록 허용하고(Hartman ＆amp; Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047); 그리고 ODC(오르니틴 디카복실라제)는 오르니틴 디카복실라제 저해인자 2-(디플로로메틸)-DL-오르니틴, DFMO(McConlogue L., 1987, In:Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.).
5.4. Hu-B1.219를 발현시키는 세포의 확인
생물학적으로 활성이 있는 유전자 생성물을 발현하고 코딩서열을 포함하는 숙주세포는 적어도 네가지 방법에 의해 확인될 수 있는데; a) DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드화 반응; b) ＆quot;표식＆quot; 유전자 기능의 존재 또는 비존재; c) 숙주세포에서 Hu-B1.219 mRNA의 발현에 의해 측정하였을때 전사의 수준측정; 그리고 d) 면역검사 또는 이의 생물학적 활성에 의해 측정하였을 때 유전자 생성물의 감지. 유전자 발현의 확인전에 숙주세포는 특히 소량의 Hu-B1.219를 생산하는 세포주에서 Hu-B1.219의 발현수준을 증가시키기 위해 돌연변이된다.
제 1 접근방식에서 발현벡터에 삽입된 Hu-B1.219 코딩서열의 존재는 Hu-B1.219 코딩서열 또는 이의 일부 또는 이의 유도체에 유사한 뉴클레오티드 서열로 구성된 프로브를 이용하여 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드에 의해 감지될 수 있다.
제 2 접근방식에서 재조합 발현벡터/숙주시스템이 특정 ＆quot;표식＆quot; 유전자 기능(예로써 항생제에 저항성인 티미딘 카이나제 활성, 메토트렉세이트에 저항성, 형질전환 표현형, 베큘로바이러스에 차단제 형성)의 유무하에 확인되고 선택된다. 예로써 벡터의 표식유전자 서열내에 Hu-B1.219 코딩서열이 삽입되는 경우에 Hu-B1.219 코딩서열을 포함하는 재조합체는 표식유전자 기능없이 확인될 수 있다. 또는 표식유전자는 Hu-B1.219 코딩서열의 발현을 조절하기 위해 사용된 동일 또는 상이한 프로모터의 제어하에 Hu-B1.219 서열과 나란히 위치할 수 있다. 유도 또는 선택에 반응하여 표식의 발현은 Hu-B1.219 코딩서열의 발현을 나타낸다.
제 3 방식에서 Hu-B1.219 코딩부위용 전사활성은 하이브리드 검사에 의해 측정된다. 예로써 RNA는 Hu-B1.219 코딩서열 또는 이의 특정부분에 유사한 프로브를 이용하여 노던 블랏에 의해 분리되고 분석된다. 또는 숙주세포의 총핵산이 추출되고 이와 같은 프로브에 하이브리드를 위해 검사된다.
제 4 방식에서, Hu-B1.219 단백질 산물의 발현은 방사능 면역침전, 효소 연결된 면역검사와 같은 웨스턴블랏, 면역검사에 의해 면역학적으로 추정된다.
5.5. Hu-B1.219 조작된 세포주의 이용
본 발명의 구체예에서 Hu-B1.219 수용체를 발현하는 Hu-B1.219 수용체 그리고/또는 세포주는 Hu-B1.219 수용체의 항체 또는 길항제로써 작용하는 항체, 펩티드, 또는 다른 리간드에 대해 스크린하는데 이용할 수 있다. 예로써 항-Hu-B1.219 항체는 Hu-B1.219 기능을 저해하거나 또는 촉진시키기 위해 이용된다. 또는 재조합적으로 발현된 가용성 Hu-B1.219 단백질 또는 Hu-B1.219 단백질을 발현하는 세포주와 펩티드 라이브러리의 스크린은 Hu-B1.219 생물학적 활성을 저해하거나 또는 촉진하기 위해 분자를 확인하는데 사용된다. 하기에서 상술하는 바와 같이, Hu-B1.219 수용체와 조작된 세포주의 이용은 HR 족의 다른 요소에 동등하게 이용될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, Hu-B1.219 코딩부분 또는 이의 리간드 결합 도메인 또는 이뮤노글로블린 일정부분과 같이 다른 분자에 융합된 이의 리간드 결합 도메인(Hollenbaugh and Aruffo, 1992, Current Protocols in Immunology, Unit 10.19; Aruffo et al., 1990, Cell 61:1303)을 발현하는 조작된 세포주가 길항제와 항길항제의 확인과 선별을 위해 가용성 수용체를 생산하는데 이용될 수 있다. 가용성 Hu-B1.219 단백질 또는 융합 단백질이 결합검사, 친화력 크로마토그래피, 면역침전, 웨스턴블랏등에서 리간드를 확인하는데 사용된다. 또는 Hu-B1.219 리간드 결합 도메인은 상피 성장인자 수용차 막통과와 세포질부분의 코딩서열에 융합될 수 있다. 이 접근방식은 세포내 신호를 촉진시킬 수 있는 방식으로 Hu-B1.219에 결합하는 리간드를 감지하는 수단으로써 상피 성장인자 수용체 신호 전이경로의 이용을 제공한다. 합성 화합물, 천연산물, 그리고 생물학적 활성물질의 다른 원료가 다양한 방법으로 스크린될 수 있다.
고형상 서포트에 부착된 아미노산의 모든 가능한 조합으로 구성된 무작위 펩티드 라이브러리는 카이나제 도메인과 같은 수용체의 다른 기능적 도메인 또는 주어진 수용체의 리간드 결합 부위에 결합할 수 있는 펩티드를 확인하는데 사용될 수 있다(Lam, K.S. et al., 1991, Nature 354: 82-84). 펩티드 라이브러리 스크린은 주어진 수용체와 상호 작용을 통하여 수용체의 생물학적 활성을 촉진하거나 저해하는 제약학적 물질의 발견에 요법적 가치가 있다.
Hu-B1.219에 결합할 수 있는 분자의 확인은 재조합 가용성 Hu-B1.219의 발현과 정제방법을 상술하고 있고, 소요의 기능적 도메인에 따라 Hu-B1.219의 단편 또는 전체길이 Hu-B1.219를 발현시키는데 이용될 수 있다. 예로써, Hu-B1.219의 세포질과 세포의 리간드 결합 도메인이 별도로 발현되고 펩티드 라이브러리를 선별하는데 사용된다.
Hu-B1.219와 상호 작용하고 복합체를 형성하기 위해 펩티드/고형상 서포트를 확인하고 분리하기 위해 Hu-B1.219 분자에 라벨 또는 ＆quot;tag＆quot;를 할 필요가 있다. Hu-B1.219 단백질은 형광 이소티오시아네이트(FITC), 피코에리트린(PE) 또는 로다민을 포함하는 형광라벨과 같은 다른 시약 또는 알칼리 포스포타제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소에 결합될 수 있다. Hu-B1.219에 주어진 라벨의 결합은 공지인 기술을 이용하여 실행될 수 있다. 또는 Hu-B1.219 발현 벡터가 상업적으로 이용할 수 있는 항체가 존재하는 에피토프를 포함하는 키메라 Hu-B1.219 단백질을 발현하기 위해 조작될 수 있다. 에피토프 특이적 항체는 효소, 형광염료 또는 발색 또는 자석 비드와의 라벨링을 포함한 공지의 방법을 이용하여 태그할 수 있다.
＆quot;태그된＆quot; Hu-B1.219 결합체는 라이브러리내 Hu-B1.219와 펩티드종 사이에 복합체를 형성하기 위해 22℃에서 30분-1시간 동안 무작위 펩티드 라이브러리내에 배양된다. 라이브러리는 결합안된 Hu-B1.219 단백질을 제거하기 위해 세척된다. Hu-B1.219가 알칼리 포스포타제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제에 공액된 경우 전체 라이브러리는 5'-브로모-4-클로로-3-인돌포스페이트(BCIP) 또는 3,3'-4,4＆quot;-디아미노벤지딘(DAB)과 같은 알칼리 포스포타제 또는 퍼옥시다제용 기질을 포함하는 배양접시에 붓는다. 몇분동안 배양한후에 펩티드/고형상-Hu-B1.219 복합체는 색이 변하고 미세조정기로 분해 현미경하에 물리적으로 용이하게 확인하고 분리할 수 있다. 형광 태그된 Hu-B1.219 분자가 이용되는 경우 복합체는 형광 활성화된 솔트에 의해 분리될 수 있다. 이형 에피토프를 발현하는 키메라 Hu-B1.219 단백질을 이용하는 경우에 펩티드/Hu-B1.219 복합체 감지는 라벨된 에피토프 특정 항체를 사용하여 이루어질 수 있다. 일단 분리된 다음 고형상 서포트에 부착된 펩티드는 펩티드 서열화에 의해 결정된다.
가용성 Hu-B1.219 분자의 이용에 추가하여 또다른 구체예에서는 고유세포를 이용하여 세포표면 수용체에 결합할 수 있는 펩티드를 감지하는 것도 가능하다. 고유세포의 용도는 세포막의 지질도메인이 기능을 가지도록 요구하는 수용체 또는 라벨 또는 다중-소단위와 수용체와의 이용이 적절하다. Hu-B1.219를 발현하는 세포주의 생성방법은 5.3 단락에서 상술하고 있다. 이 기술에 사용된 세포는 살아있는 또는 고정된 세포이다. 세포는 무작위 펩티드 라이브러리와 배양될 수 있고 표적세포와 관련 고형성 서포트/펩티드 사이에 ＆quot;로제트＆quot; 형성을 위해 라이브러리에 펩티드를 포함하도록 결합될 수 있다. 로제트는 현미경하에 물리적으로 제거하거나 또는 분별 원심분리에 의해 분리될 수 있다.
막결합 수용체 또는 세포막의 지질도메인이 기능을 가지도록 요구하는 수용체에 대한 전체 세포검사의 또다른 예로써 수용체 분자의 라벨 또는 ＆quot;태그＆quot;가 부착될 수 있는 리포좀내로 재구성될 수도 있다.
공지의 다양한 기술이 재조합적으로 생산된 Hu-B1.219 수용체의 에피토프에 대한 항체의 생산에 이용될 수 있다. 이와 같은 항체에는 다클론성, 단클론성, 키메라, 단일사슬, Fab 단편과 Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편들을 포함하나 이에 한정시키지는 않는다. 수용체의 리간드 결합부위와 경쟁하는 항체를 중화시키는 것은 진단과 치료에 특히 중요하다.
Hu-B1.219에 결합하는 단클론 항체는 방사 활성물질로 라벨링시키면 주입후에 신체내에 이들의 위치와 분포를 알 수 있게 한다. 방사능 동위원소 태그된 항체는 종양의 세포 상과 전이에 대한 비-침투성 진단도구로써 이용될 수도 있다.
이뮤노톡신은 신체내에 특정부위에 세포독성물질을 표적으로 하도록 고안될 수도 있다. 예로써, 고친화력의 Hu-B1.219 특이적 단클론 항체는 디프테리아 독소, 아브린 또는 리신과 같은 박테리아 또는 식물독소에 공유적으로 복합될 수도 있다. 항체/하이브리드 분자의 준비방법은 SPDP와 같은 티올-교차결합된 시약의 사용인에 이들은 항체의 1차 아미노기를 공격하고 S-S 다리교환에 의해 항체에 독소가 부착된다. 하이브리드 항체는 Hu-B1.219 발현 종양세포를 특이적으로 제거하는데 이용될 수 있다.
항체의 생산을 위해, 다양한 숙주동물이 Hu-B1.219 단백질의 주사에 의해 면역화될 수 있는데 여기에는 토끼, 쥐, 들쥐 등을 포함하나 이에 한정시키지 않는다. 다양한 어쥬번트가 면역학적 반응을 증가시키기 위해 사용되는데 이들은 숙주종에 따라 선택될 수 있으며, 플루언츠(컴플리트와 인컴플리트), 알루미늄 하이드록시드와 같은 미네랄 겔, 리소레시틴과 같은 표면활성물질, 플루론성 폴리올, 폴리아민, 펩티드, 오일유액, 키홀 림페트 헤모시아닌, 디니트로페놀, BCG(바실리 칼메트-구에린)과 코리네박테리움 파르붐와 같은 사람 어쥬번트를 포함하나 이에 한정하지 않는다.
Hu-B1.219에 대한 단클론성 항체는 세포주의 연속계 대배양에 의해 항체분자의 생성을 위해 제공되는 임의 기술을 이용하여 준비될 수 있다. 여기에는 Kohler과 Milstein에 의해 처음 상술된 하이브리도마 기술(Nature, 1975, 256:495-497); 사람 B-세포 하이브리도마 기술(Kosbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., 80:2026-2030); EBV 하이브리도마 기술(Cloe et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)을 포함하나 이에 한정시키지 않는다. 또한 적절한 생물학적 활성을 가지는 사람 항체 분자로부터 유전자와 적절한 항원 특이성을 가지는 쥐 항체 유전자로부터 유전자를 잘라냄으로써 ＆quot;키메라 항체＆quot;(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454)의 생산에 개발된 기술이 이용될 수도 있다. 또는 단일 사슬 항체(미국특허 4,946,778) 생산에서 상술된 기술이 Hu-B1.219 특이적 단일사슬 항체의 생산에 체택될 수도 있다.
공지의 기술에 의해 Hu-B1.219의 특정 결합부위를 포함하는 항체 단편이 만들어질 수 있다. 예로써 이와 같은 단편에는 항체의 펩신 절단에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편과 F(ab')2 단편의 이황화 결합다리의 환원에 의해 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또는 Fab 발현 라이브러리는 Hu-B1.219에 소요의 특이성을 가지는 단클론 Fab 단편의 신속하고 용이한 확인을 허용하기 위해 구성될 수도 있다.
5.6. Hu-B1.219 폴리뉴클레오티드의 용도
진단과 치료목적으로 Hu-B1.219 폴리뉴클레오티드가 이용될 수도 있다. 진단용으로 Hu-B1.219 폴리뉴클레오티드는 만성 골수성 백혈병과 같은 질병상태에서 Hu-B1.219 유전자 발현을 감지하거나 또는 Hu-B1.219 유전자 발현이상을 감지하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 영역에는 올리고뉴클레오티드 서열이 포함되는에 여기에는 안티센서 RNA와 DNA 분자와 리보자임을 포함하는데 이는 Hu-B1.219의 해독저해기능을 가진다.
5.6.1. Hu-B1.219 폴리뉴클레오티드의 진단용도
Hu-B1.219 폴리뉴클레오티드는 Hu-B1.219 발현이상으로 인한 질병진단에 다양한 용도를 가진다. 예로써 Hu-B1.219 DNA 서열은 하이브리드 검사를 포함하여 서든과 노든 분석과 같은 생검의 하이브리드 검사에 이용될 수도 있다. 이와 같은 기술은 공지이며, 상업적으로 이용할 수 있는 많은 진단키트도 있다.
5.6.2. Hu-B1.219 폴리뉴클레오티드의 치료요법적 용도
Hu-B1.219 폴리뉴클레오티드는 다양한 비정상적 질환의 치료에 유용하다. 세포에 유전자서열을 유입시킴으로써, 유전자 요법은 정상 Hu-B1.219의 발현 미달로 인해 또는 비정상/비활성 Hu-B1.219의 발현에 의해 세포가 정상적인 분화와 증식이 되지 않는 질병의 치료에 이용될 수도 있다. 일부 경우에서 Hu-B1.219를 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 기능적으로 결손의 내생 유전자의 위치에서 작용하거나 대체하는 경향이 있다. 또는 과증식을 특징으로 하는 비정상 상태는 아래에서 상술하는 유전자 치료요법 기술을 이용하여 치료될 수 있다.
비정상 세포증식은 다양한 질병상태에 중요한 요소이다. 바이러스 벡터와 같은 재조합 유전자 요법 벡터는 자연적으로 발생하는 내생 Hu-B1.219의 활성을 저해하기 위해 사용되는 Hu-B1.219의 다양한, 시그날성 비경쟁형을 발현하도록 조작될 수도 있다. 시그날성 비경쟁성 형태는 예로써 시그날 트랜스덕션 도메인의 일부 또는 전부가 부족한 단백질의 절두형을 말한다. 이와 같은 절두형은 기질의 정상적인 결합에는 참여하나 시그날 트랜스덕션 활성이 부족하다. 따라서, 재조합 유전자 요법 벡터가 Hu-B1.219의 발현 또는 활성 이상으로 인한 질병의 치료에 요법적으로 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 Hu-B1.219의 시그날성 비경쟁성형을 인코드하는 DNA 분자를 이동시키는 것으로 구성된 세포에 내생 Hu-B1.219 단백질에 의한 시그날 트랜스덕션의 효과를 저해하는 방법을 제공한다. 이는 세포에서 시그날성 비경쟁성 Hu-B1.219 단백질이 생산되어 내생 Hu-B1.219 단백질에 의해 활성화되는 Hu-B1.219 단백질의 시그날 경로와 경쟁하게 되는 것이다.
레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노-연합 바이러스, 허피스 바이러스 또는 소 파필로마 바이러스와 같은 바이러스에서 유도된 발현벡터는 표적 세포집단내로 재조합 Hu-B1.219를 이동시키는데 이용될 수 있다. 본 기술에 공지인 방법이 Hu-B1.219 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 만드는데 이용될 수 있다(Techniques described in Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.). 또는 재조합 Hu-B1.219 mRNA의 해독을 저해하는 기능을 하는 안티-센스 RNA와 DNA 분자 그리고 리보자임을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 안티-센스 RNA와 DNA 분자는 표적 mRNA에 결합함으로써 mRNA의 해독을 직접적으로 차단시켜 단백질 해독을 방해한다. 안티센스 DNA에 대해서 Hu-B1.219 뉴클레오티드 서열의 -10와 +10 부위의 해독 개시부위로부터 유도된 올리고데옥시리보 뉴클레오티드가 적절하다.
리보자임은 RNA의 특정 절단을 촉매하는 능력을 가진 효소적 RNA 분자이다. 리보자임의 작용기작은 상보적인 표적 RNA에 리보자임 분자의 서열 특정 하이브리드화와 제한효소 절단에 의해 이루어진다. 본 발명의 영역내에는 Hu-B1.219 RNA 서열의 특이적 효과적으로 제한효소 절단을 촉매하기 위한 조작된 망치머리형 모티프 리보자임 분자도 포함된다.
임의 RNA 표적내에 특이적 리보자임 절단부위는 GUA, GUU와 GUC를 포함하는 리보자임 절단부위용 표적분자의 스캐닝에 의해 우선 확인된다. 일단 확인되면, 절단부위를 포함하는 표적유전자 부위에 상응하는 15 내지 20 리보뉴클레오티드의 짧은 RNA 서열이 올리고뉴클레오티드 서열의 부적합성을 부여할 수 있는 2차 구조와 같은 예측된 구조적 특징에 대해 평가된다. 추천된 표적의 적합성은 리보뉴클레아제 보호검사를 이용하여 상보적인 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화 반응에 이들의 근접성을 테스트함으로써 알 수 있다.
본 발명의 안티-센스 RNA와 DNA 그리고 리보자임은 RNA 분자합성에 대한 공지방법에 의해 준비될 수 있다. 여기에는 고형성 포스포라미디트 화학 합성과 같은 공지의 화학적으로 올리고데옥시 리보뉴클레오티드 합성 기술이 포함된다. 또는 RNA 분자가 안티센스 RNA 분자를 인코드하는 DNA서열의 시험관과 생체 전사에 의해 생성될 수도 있다. 이와 같은 DNA 서열은 T7과 SP6 폴리머라제 프로머터와 같은 적절한 RNA 폴리머라제에 결합하는 다양한 벡터내로 들어갈 수 있다. 또는 사용되는 포로모터에 따라서 안티센스 RNA를 구성적으로 또는 유도적으로 합성하는 안티센스 cDNA 구조가 세포주내로 안정하게 유입될 수도 있다.
DNA 분자에 대한 다양한 수정이 세포내 안정성과 반감기의 증가 수단으로써 도입될 수도 있다. 가능한 수정에는 분자의 5' 또는 3'에 리보 또는 데옥시-뉴클레오티드의 서열을 추가하거나 또는 올리고데옥시리보 뉴클레오티드 골격내에 포스포디에스테라제 연결 대신에 포스포로티오에이트 또는 5' 0-메틸의 이용을 포함하나 이에 한정하지 않는다.
이와 같은 세포 또는 조직내로 폴리뉴클레오티드의 유입방법은 조직내로 주사함으로써 벗겨진 폴리뉴클레오티드와 삽입과 같은 시험관내 유입방법, 자가 세포 치료용으로 생체내에 세포에서 Hu-B1.219 폴리뉴클레오티드의 유입, 생체내 또는 외에서 사용할 수 있는 일렉트로포레이션과 같은 기술 또는 바이러스, 레트로바이러스, 파지 또는 플라스미드와 같은 벡터의 이용등이 포함된다.
6. 실시예: 신규 조혈성 수용체 상부 DNA의 분자 클로닝
6.1. 재료와 방법
6.1.1. 노던 블랏 분석
Hu-B1.219 유전자 발현 연구를 위해 다양한 사람조직에서 얻은 RNA를 포함하는 노던 블랏(Clontech, Palo Alto, CA)을 뉴클레오티드 #578-1107(도면 제2a도∼제2g도)에 상응하는 방사능 라벨된 530 bp DNA 프로브에 하이브리드시킨다. 간략하면, 블랏은 5X SSPE, 10X 덴하르트 액, 100㎍/㎖ 새로 변성시킨 연어정자 DNA, 50% 포름아미드(새로 탈이온시킨) 그리고 2% SDS를 포함하는 용액에 3-6시간 42℃에서 미리 하이브리드시킨다. 방사능라벨된 프로브는 열변성시키고 미리 하이브리드시킨 혼합물에 첨가하고 일정하게 흔들면서 18-24 시간동안 42℃에서 하이브리드시킨다. 블랏은 2X SSC, 0.05% SDS로 실온에서 수차례 헹구어내고 0.1X SSC, 0.1% SDS를 포함하는 세척액으로 이동시켜 40분간 50℃에서 교반시킨다. 그다음 블락은 플라스트 랩을 씌우고 왓트만 페이퍼에 얹고 강화스크린을 사용하요 -70℃에서 X-레이 필름에 노출시킨다.
6.1.2. 역전사/중합효소 사슬 반응(RT/PCR)
tRNA는 표준 실험실 기술에 의해 분리시킨다(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY). tRNA 1㎍을 역전사시키고 cDNA는 PCR에 의해 증폭시킨다(Perkin Elmer, Norwalk, CT). PCR 증폭조건은 Hu-B1.219와 Form 1 발현분석과 동일하다. 이는 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초로 총 40회가 된다. 증폭된 산물(Hu-B1.219 224bp와 Form 1 816bp)은 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리하고 에티디움 브로마이드 착색에 의해 볼 수 있다. Hu-B1.219 엠플리머는 GGTTTGCATATGGAAGTC(상측)과 CCTGAACCATCCAGTCTCT(하측)이다. Form 1 특정 엠플리머는 GACTCATTGTGCAGTGTTCAG(상측)와 TACTGGAGGGAGGGTCAGCAG(하측)이다. 상측 엠플리머는 모든 3개형에서 모두 공유하고 반면에 하측 엠플리머는 Form-1 특이성이다.
6.2. 결과
상당수 cDNA 클론이 사람 태아 간 cDNA 라이브러리(Clontech, Palo Alto, CA)로부터 분리하였고 이들 클론 몇 개의 DNA 서열을 결정하였다. 이들 클론(Hu-B1.219 #4, #33, #34, #1, #36, #8, #55, #60, #3, #57, #62)에는 겹치는 서열이 포함되는데 이들은 연속적인 뉴클레오티드 서열에 적용된다. 도면 제 2a도-제 2g도에서 cDNA서열과 cDNA로부터의 예측된 단백질 서열을 나타낸다. cDNA 서열에는 2개의 FN III 도메인이 포함되는데 각각의 ＆quot;WS박스＆quot;가 있고 이는 HR 족의 유전자 특징이다. 그러나 Hu-B1.219 서열이 다른 공지유전자와 동일하지 않았다. 따라서, 이 cDNA는 HR 유전자족 즉 Hu-B1.219로 칭하는 신규의 요소를 나타낸다(표 1).
[표 1] 사이토킨 수용체 유전자 FN III 도메인 크기(bp)
도면 제 2a도-제 2g도에 나타낸 Hu-B1.219 서열에 기초하여 해독 개시 부위는 #97 위치가 된다. 서열은 #2970 뉴클레오티드를 포함하여 오픈 리딩프레임에서부터 인코드한다. 이는 #2614와 #2691 사이의 서열이 막통과 도메인을 인코드하는 것으로 보여진다. 완전한 서열은 958 아미노산의 단백질을 인코드한다.
그러나 제 2a도-제 2g도에서 서열은 Hu-B1.219 cDNA 서열의 한가지 형태만을 나타내고 이를 From 1이라 칭한다. 이는 추가의 람다 클론이 Form 2와 Form 3으로 공지된 것과는 달리 3' 단부부근에 상이한 서열을 포함하는 것을 볼 수 있었다. 이들 세형은 뉴클레오티드 #2770을 포함하여 여기까지 동일한 서열을 포함하고 #2771 이상에서는 다양해지는 것을 볼 수 있다(제 3a 도). #2771에서 종료코돈까지 3' 단부에 상응하는 모든 세 개형의 유추된 아미노산 서열의 배열을 제 3b도에 나타내었다. 원래 람다 클론에서 분리한 2개의 #36와 #8에 각각 Form 1와 Form 2의 3'단부 서열이 포함되어 있다. Hu-B1.219의 이들 세형은 또다른 절단기작에 의해 통상의 전구체 mRNA로부터 다변해지는 것이다.
뉴클레오티드 #2771에서 단부까지 Form 1의 DNA 서열은 사람 레트로트란스포존 서열과 98% 동일하다. 이는 사람 내생 레트로바이러스성 RNA 서열에서 유도된 것으로보인다(Singer, 1982, Cell 28:433; Weiner et al., 1986, Ann. Rev. Biochem. 55:631; Lower et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4480). cDNA의 상이한 형태의 발현을 검사하기 위해 RT/PCR이 몇 개 사람 세포를 이용하여 실행되었다. 표 2의 결과에서 Form 1은 K-562 세포와 사람 태아 간 cDNA 준비에서 RNA로 발현됨을 나타내었다. Hu-B1.219가 사람 태아 간 cDNA 라이브러리에서 클론되었기 때문에 이는 양성 콘트롤로 작용한다. 그러나, 몇 개 다른 사람 세포주에서는 Form 1이 감지되지 않은 반면 Hu-B1.219 발현은 양성이다. 예로써, Form 1은 KGla 세포에서는 발현 안되나 Form 3은 발현되었다. 따라서 Hu-B1.219의 세형은 동일세포에서 동시에 발현되지 않는다. 이들은 특정 세포집단에 특정형태의 선택성 발현이 될 수 있다.
[표 2]
Hu-B1.219 발현의 RT/PCR 분석
* - 노던블랏의 분석
△ - RT/PCR 분석
다양한 사람조직 RNA가 노던블랏 분석용으로 도면 제 2a도-제 2g도에 상술한 #578-#1107의 뉴클레오티드에 상응하는 방사능라벨된 Hu-B1.219 단편과 프로브된다. 2개 상이한 크기의 mRNA가 감지되었다. 이 결과는 또 다른 유사 유전자가 있거나 또는 단일 RNA 전사체가 상이한 절단과정을 거친다는 것을 나타낸다. Hu-B1.219 발현은 사람 태아 조직 특히 간과 폐에서 가장 강력하다. 몇 가지 성인조직에서도 잔류수준이 감지되었다. 흥미로운 것은 만성 골수 백혈병 세포주 K562는 이의 발현에 강한 양성이고 일부 발현은 폐육종 세포주 A549 세포에서도 발현되었다(표 3).
[표 3]
Hu-B1.219 유전자 발현의 노던 블랏 분석 요약
이를 보면 데이터에서는 Hu-B1.219 cDNA 클론은 사람 조혈 수용체 속의 신규요소를 나타냄을 알 수 있다. 이 결론을 뒷받침하는 데이터의 용약은 다음과 같다.
1. Hu-B1.219 DNA 단백질 서열이 상응하는 컴퓨터 데이터 베이스에 있는 공지서열과 충분히 일치하지 않는다.
2. Hu-B1.219는 IL-6R와 IL-4R과 특정 DNA 서열 유사성을 공유한다.
3. 이는 또한 G-CSFR, IL-6R, IL-3R 베타사슬, gp130, IL-12R와 LIFR과 특정 단백질 유사성을 공유한다.
4. FN III 도메인에 보존된 아미노산의 정확한 공간에 ＆quot;WS 박스＆quot; 모티프 2개를 포함한다(제 4 도).
5. FN III 도메인의 3블럭에 양쪽성 서열을 포함한다(제 5 도).
6. FN III 도메인의 6블럭에 반복되는 소수성과 염기성 아미노산이 포함된다(제 6 도).
7. FN III 도메인의 상류에 시스테인 풍부 부위에 보존된 시스테인들을 가진다.
8. 조혈조직, 태아간에서 원래 클론되었다.
9. 특정 태아조직에 의해 발현된다.
7. 미생물 기탁
다음 유기체는 American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852에 기탁되었다.
기탁 균주 기탁번호
HuB1.219, #1 75885
HuB1.219, #4 75886
HuB1.219, #8 75887
HuB1.219, #33 75888
HuB1.219, #34 75889
HuB1.219, #36 75890
HuB1.219, #55 75971
HuB1.219, #60 75973
HuB1.219, #3 75970
HuB1.219, #57 75972
HuB1.219, #62 75974
본 발명은 실시예에 한정하지 않고 실시예는 본 발명의 개별 특징을 설명하는 의도이다. 여기서 공지된 도면과 설명에서 추가하여 다양한 수정이 가능함을 본 기술분야에 숙지된 자는 인지할 것이다. 이와 같은 수정은 다음의 청구범위 영역내에 속한다.
여기에 언급된 모든 공보는 참고문헌으로 결합된다.
서열표 리스트
(1) 일반정보
(i) 출원인; 스노그라스 엠. 알.
치오피, 요셉
쥬파치, 토마스 제이
세피 알란 더블유
(ii) 발명의 명칭; Hu-B1.219 신규한 사람 조혈성 수용체
(iii) 서열의 수; 25개
(iv) 서신 수조
(A) 주소; Pennie ＆amp; Edmonds
(B) 거리; 아메리카 에브뉴 1155
(C) 도시; 뉴욕
(D) 주; 뉴욕
(E) 나라; 미합중국
(F) 우편코드; 10036-2711
(v) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체형태; 플로피디스크
(B) 컴퓨터; IBM 호환성
(C) 작동시스템; Patent Relaease #1.0, Version #1.30
(vi) 현재 출원 자료
(A) 출원번호; US 08/355,888
(B) 출원일; 1994년 12월 12일
(C) 분류
(viii) 대리인 정보
(A) 이름; 포이산트, 브라이언 엠
(B) 등록번호; 28,462
(ix) 통신정보
(A) 전화번호; 212 790 9090
(B) 펙스번호; 212 896 9741/8864
(C) 텔렉스; 66141 PENNIE
(2) 서열 1에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 5 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥;
(D)위상; 모름
(ii) 분자형; 펩티드
(xi)서열 1
[서열 1]
Trp Ser Xaa Trp Ser
1 5
(2) 서열 2에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 18개 b.p.
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 모름
(ii) 분자형; DNA
(xi)서열 2
[서열 2]
GGTTTGCATA TGGAAGTC 18
(2) 서열 3에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 19개 b.p
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 한가닥
(D)위상; 직선
(ii) 분자형; DNA
(xi)서열 3
[서열 3]
CCTGAACCAT CCAGTCTCT 19
(2) 서열 4에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 21개 b.p
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 한가닥
(D)위상; 직선
(ii) 분자형; DNA
(xi)서열 4
[서열 4]
GACTCATTGT GCAGTGTTCA G 21
(2) 서열 5에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 21개 b.p.
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 한가닥
(D)위상; 직선
(ii) 분자형; DNA
(xi)서열 5
[서열 5]
TAGTGGAGGG AGGGTCAGCA G 21
(2) 서열 6에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 2991개 b.p
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 한가닥
(D)위상; 모름
(ii) 분자형; DNA
(ix) 특징
(A)이름/키 ; CDS
(B)위치; 1..2991
(xi)서열 6
[서열 6]
(2) 서열 7에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 29개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(D)위상; 선형
(ii) 분자형; 단백질
(xi)서열 7
[서열 7]
(2) 서열 8에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 960개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(D)위상; 선형
(ii) 분자형; 단백질
(xi)서열 8
[서열 8]
(2) 서열 9에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 6개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(D)위상; 선형
(ii) 분자형; 단백질
(xi)서열 9
[서열 9]
(2) 서열 10에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 241개 b.p
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 모름
(ii) 분자형; cDNA
(ix) 특징
(A) 이름/키; CDS
(B) 위치; 2..241
(xi)서열 10
[서열 10]
(2) 서열 11에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 73개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(D)위상; 선형
(ii) 분자형; 단백질
(xi)서열 11
[서열 11]
(2) 서열 12에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 6개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(D)위상; 선형
(ii) 분자형; 단백질
(xi)서열 12
[서열 12]
(2) 서열 13에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 130개 b.p.
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 모름
(ii) 분자형; cDNA
(xi)서열 13
[서열 13]
(2) 서열 14에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 21개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(D)위상; 선형
(ii) 분자형; 단백질
(xi)서열 14
[서열 14]
(2) 서열 15에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 21개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(D)위상; 선형
(ii) 분자형; 단백질
(xi)서열 15
[서열 15]
(2) 서열 16에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 127개 b.p.
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 모름
(ii) 분자형; cDNA
(ix) 특징
(A)이름/키: CDS
(B)위치: 2..127
(xi)서열 16
[서열 16]
(2) 서열 17에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 11개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(D)위상; 선형
(ii) 분자형; 단백질
(xi)서열 17
[서열 17]
(2) 서열 18에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 21개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(D)위상; 선형
(ii) 분자형; 단백질
(xi)서열 18
[서열 18]
(2) 서열 19에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 5개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(D)위상; 선형
(ii) 분자형; 단백질
(xi)서열 19
[서열 19]
(2) 서열 20에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 13개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥;
(D)위상; 모름
(ii) 분자형; 펩티드
(xi)서열 20
[서열 20]
(2) 서열 21에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 13개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥;
(D)위상; 선형
(ii) 분자형; 펩티드
(xi)서열 21
[서열 21]
(2) 서열 22에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 13개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥;
(D)위상; 모름
(ii) 분자형; 펩티드
(xi)서열 22
[서열 22]
(2) 서열 23에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 13개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥;
(D)위상; 모름
(ii) 분자형; 펩티드
(xi)서열 23
[서열 23]
(2) 서열 24에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 13개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥;
(D)위상; 모름
(ii) 분자형; 펩티드
(xi)서열 24
[서열 24]
(2) 서열 25에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 13개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥;
(D)위상; 모름
(ii) 분자형; 펩티드
(xi)서열 25
[서열 25]
(2) 서열 26에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 15개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥;
(D)위상; 모름
(ii) 분자형; 펩티드
(xi)서열 26
[서열 26]
(2) 서열 27에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 15개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥;
(D)위상; 모름
(ii) 분자형; 펩티드
(xi)서열 27
[서열 27]
(2) 서열 28에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 15개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥;
(D)위상; 모름
(ii) 분자형; 펩티드
(xi)서열 28
[서열 28]
(2) 서열 29에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 15개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥;
(D)위상; 모름
(ii) 분자형; 펩티드
(xi)서열 29
[서열 29]
(2) 서열 30에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 15개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥;
(D)위상; 모름
(ii) 분자형; 펩티드
(xi)서열 30
[서열 30]
(2) 서열 31에 대한 정보
(i) 서열특징
(A)길이; 15개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥;
(D)위상; 모름
(ii) 분자형; 펩티드
(xi)서열 31
[서열 31]

Claims (24)

  1. Hu-B1.219 수용체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 서열 6의 1 내지 2770의 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  2. Hu-B1.219 수용체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 서열 6의 1 내지 2770의 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로 구성되고, 이 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 발생하는 수용체 폴리펩티드를 인코드하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  3. Hu-B1.219 수용체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 서열 6의 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되고, 이 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 발생하는 수용체 폴리펩티드를 인코드하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  4. Hu-B1.219 수용체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 서열 6의 1 내지 2770의 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되고, 이때, 서열의 2751에서 3' 말단까지에 뉴클레오티드 서열은 서열 13의 뉴클레오티드 서열로 대체되고, 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 발생하는 수용체 폴리펩티드를 인코드하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  5. Hu-B1.219 수용체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 서열 6의 1 내지 2770의 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되고, 이때, 서열의 2751에서 3'말단까지에 뉴클레오티드 서열은 서열 16의 뉴클레오티드 서열로 대체되고, 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 발생하는 수용체 폴리펩티드를 인코드하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  6. 서열 8의 3 내지 887의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  7. 제 6 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 서열 6에 나타낸 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  8. 제 6 항에 있어서, 서열 8의 3 내지 887의 아미노산 서열에 바로 이어서 서열 14의 아미노산 서열로 구성된 자연 발생적인 사람 변이 수용체 폴리펩티드를 인코드하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  9. 제 8 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 서열 6에 있는 것으로 단, 서열 6의 2751부터 3'말단까지의 뉴클레오티드 서열은 서열 13의 뉴클레오티드 서열로 대체된 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  10. 제 6 항에 있어서, 서열 8의 3 내지 887의 아미노산 서열에 바로 이어서 서열 17의 아미노산 서열로 구성된 자연 발생적인 사람 변이 수용체 폴리펩티드를 인코드하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  11. 제 10 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 서열 6에 있는 것으로 단, 서열 6의 2751부터 3'말단까지의 뉴클레오티드 서열은 서열 16의 뉴클레오티드 서열로 대체된 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  12. 서열 8에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드의 세포외(extracellular) 도메인을 인코드하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  13. 제 12 항에 있어서, 세포외 도메인은 서열 8의 3부터 841까지의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  14. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 DNA인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  15. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 RNA인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  16. 제1항 내지 제6중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전공학적으로 조작된 숙주 세포에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 조절 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되고, 이때 숙주세포는 원핵세포 또는 진핵세포에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 조작된 숙주 세포.
  17. 제 6 항에 있어서, 서열 8의 3 부터 960까지의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 인코드하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  18. 서열 8의 3부터 893까지의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드 Hu-B1.219.
  19. 서열 8의 3부터 960까지의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드 Hu-B1.219.
  20. 서열 8의 3부터 887까지의 아미노산 서열에 서열 14의 아미노산 서열이 이어진 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드 Hu-B1.219.
  21. 서열 8의 3부터 887까지의 아미노산 서열에 서열 17의 아미노산 서열이 이어진 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드 Hu-B1.219.
  22. 서열 8의 아미노산 서열로 구성된 헤마토포에틴 수용체의 세포외 도메인으로 구성된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  23. 제22항에 있어서, 서열 8의 3부터 841까지의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  24. 제18, 제19, 제20 또는 제21항에 있어서, 이형 폴리펩티드와 융합되고, 이때 이형 폴리펩티드는 서열 30으로 된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
KR1019960702513A 1994-09-14 1995-08-30 Hu-b1.219,신규한 사람 조혈 수용체 KR100245529B1 (ko)

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US08/306,231 US5643748A (en) 1994-09-14 1994-09-14 HU-B1.219, a novel human hematopoietin receptor
US306231 1994-09-14
US08/355,888 US5763211A (en) 1994-09-14 1994-12-14 Isolated nucleic acid encoding Hu-B1.219, a novel human hematopoietin
US355888 1994-12-14
PCT/US1995/010965 WO1996008510A1 (en) 1994-09-14 1995-08-30 Hu-B1.219, A NOVEL HUMAN HEMATOPOIETIN RECEPTOR

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