TW555967B - Continuous format high throughput screening - Google Patents

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TW555967B TW087120533A TW87120533A TW555967B TW 555967 B TW555967 B TW 555967B TW 087120533 A TW087120533 A TW 087120533A TW 87120533 A TW87120533 A TW 87120533A TW 555967 B TW555967 B TW 555967B
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Mark E Schurdak
Martin Voorbach
David J Burns
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Description

555967
555967 _ 案號 87120533
五、發明說明⑵ __ 如阿装 直接、、則ί門公司（AmerSham)之閃燦近似化驗（SPA)之技街 質或=放射標示配體與被固定於含閃爍劑之珠粒之技術 化驗，己體結合性物質之結合。前述實例全部是單步驟 劑之外，…任何其他步;或…被珂，除了添加試 方面’多步驟化驗雷^ 2； /K — /mi-A:::相；’…併二二二;二為 ，以::::順:工c些試 常見之實例勺姑彳卜於士、一為70成其後之步驟所必需）。此 產物之存在：否或二農信ί顯示試劑以間接報告反應 驟為清洗步驟。在化驗又f :夕步驟化驗中之另-常見步 進行其後牛 A 2仞J常須添加過量化驗試劑，但在 景信號下進行。例如，、i其洗除，以使反應能夠在無高背 —標示配體盘社合於因^:放射配體結合化驗中，首先將 小部份配體與；；質-起培育，但僅有 量該結合型放反射活性配3二貝、二。培育後’在精確測 體。該清洗可以各種方半=二，必品洗除過量之未結合配 環，沉澱/相分離，另/達成，包括過濾，清洗/傾析循 先夕 ' 久/或離心。 开夕生物和生化過 在-些方式可以使其他ί =多步驟方法測量。雖然存 驗’但這些過程以多程適用單步驟方法化 及/或可以使用較易取得驗時，成本利用效率較高 方法和套組，如SPA(阿/劑。供單步驟技術用之各種 (Joliey)和其它），時間螢光極化法（喬立 "ii瞧---二--解析螢-光（帕克（Packard)和其它） I ΪΆ----—--- O:\56\56293 ptc 第6頁 555967
(僅為少數例子）為商業上可供應。然而，使用這些種類之 方法總是產生額外花費和時間。對於許多化驗而言，多步 驟法更易於建立且更易於迅速顯色。因此，多步驟法，二 EL 1 SA，濾紙結合法，r I a，螢光素酶細胞化驗法等持續被 廣泛使用。許多這些方法將於下文更詳細敘述。 、 AJ1A_M1TS) 歷年來，製藥工業逐漸依賴化合物庫之HTS以發現藥物 候選物。HTS為一種平行測試許多不相關化合物之方法， 以同時或幾近同時篩選大量受試化合物之生物活性。近 來，最廣泛建立之技術使用96-井孔微量滴定板。在此格 式中，9 6個獨立測試係在包含9 6個反應井孔之單一 8公分 X 12公分塑膠板上同時進行。這些井孔典型上需要5〇至 5 〇 0微升之化驗體積。除了該板外，許多符合廣範圍單步 驟及多步驟化驗之9 6井孔格式之儀器，材料，吸量管，自 動裝置’平板清洗器和平板讀數器可以購得。 直到現在，改良HTS之努力集中於使該井孔更小（小型 化）。因為降低井孔大小，便能夠增加各板上之井孔數， 以提供更多平行測試。此外，藉著降低化驗體積，亦降低 每個測式之試劑成本。而且，因為能夠以較小體積操作更 多平行測試，亦能夠同時地測試更多化合物以發現藥物待 選物。至目前為止，小型化對該96-井孔技術之最極限改 良為提供一種384-井孔（96 X 4)格式。見康利（Comley) et al·， J· Bi omol. Screening vol. 2(3), PP.171-78 (1997)。事實上，甚至已提出更高密度格式， 包括一種9 6 0 0 -井孔格式。然而_，小型化具有固有之成本
O:\56\56293 ptc 第7頁 555967 曰 修正 87120533_年 月 五、發明說明（4) 和複雜性。 =些成本和複雜性直接與將篩選格式小型化 構成要素有關。穿 之—個主要 ^ I百關。第一，必需能夠使測試容器（試瞢^ 孔，凹槽等等）更小。，处 、八，’井 之化驗气令丨八 #、而月匕句精確地將所有需要 …!試劑同時分配至許多孔中而達成）。第：體處=機 夠在鬲密度排列中"讀取”結果。 必需能 f平仃化獨立化驗之必要條件下，各 -種，'斯/ 本效益之難題和限制。例如， 法，成去兩至 飞』此而要種兀王不冋的試劑分配方 次者而要一種具有解析力，—靈敏度以及與該 =化格式相容之建構之讀取儀器。因為降低各井孔之大小 配置，分配較小量試劑及讀取各測試樣品： 更：難’耗時且昂貴。此外，由於分配較小體 口、 ^和測里較弱樣品信號所固有之不正確性，較小 品大小亦增加樣品與樣品間之統計變異性。而且，者： 士小降低超過某一點，諸如蒸發和表面張力之因子甚至 貫現較新之小型化格式增添更大花費和複雜性。 人關於HTS技術中之量子式跳級，工業上渴望，，自由格式化 驗’’或在樣品間無物理障壁之化驗的可能性。雖然設想在 ^任何井孔之格式中測試小滴液，但無任何人真正提出在 標準個別化合物之集合之HTS中使用自由格式化驗。 適選結合庫- 隨著組合化學之出現，百萬個化學個體能夠在固體支撐 體（通常為珠粒）上迅速產生。象然該9 6 —井孔格式係用以
第8頁 555967 ___案號87120533_年月日 修正 五、發明說明（5) 篩選以珠粒為基礎之庫，此格式通常被認定為無效，因為 (1 )各珠粒僅攜帶小量化學個體；（2 )待測試之化合物數目 非常大；且（3 )該珠粒難以操控進入9 6 -井孔微滴定板中。 為了避免以9 6 -井孔格式篩選結合庫之固有問題，已提 出使用被描述為"自由格式’’之單純單步驟化驗。例如，傑 亞威克利米（Jayawickreme) et al ·在 Proc. Nat ’ 1
Acad. Sci. (USA), vo 1 · 1 9 1， pp · 1 6 1 4 - 1 8 ( 1 9 9 4 年3 月） 中提出一種供組合胜肽庫用之單步驟化驗，其中使用色素 細胞（促黑細胞）。根據該作者，他們將細胞置於培養皿之 璦脂糖下’繼而將載有組合化合物之珠粒放置在填脂糖表 面上’然後從珠粒部份釋放該化合物。該活性化合物以呈 現黑色色素區而被見到，因為當化合物向膠體基質内局部 擴散時，活性化合物會導致細胞變色。 另厂個最近的實例為丹尼g凱爾司凱（Daniel Chelsky) 的”筛選組合庫策略：新穎和傳統方法（Strategies Screening Combinatorial Libraries: Novel and
Traditional 之生物分子篩
Approaches)， 脂糖凝膠内部 致該膠體中之 結劑而載有組 部份釋放化合 改變之局部抑 (Molecular ]) 於1995年11月7-10日在費城 iiAJlJ —次年會中提出。凱爾司凱對在瓊 以 之碳系脫水酶 酵素導致膠體 合化合物之珠 物。會抑制酵 制區而被觀察 Ixg r s i t v )第 2 進行單純單步驟酵素化驗 整體變色。其後，將經由光聯 粒置於膠體内部，以及藉訂光 素之化合物藉著呈現顏色較少 到。最後，在分子分站#卷Γ第57-63頁（ 1 996 )中，沙 傑-亞威克立米等人之方法， 蒙（Salmon)等人提出
O:\56\56293 ptc 第9頁 555967
第ίο頁 555967 案號87120533 __年月 日 五、發明說明（7) 質視需要可以含一種或多種化驗成分； (b )使用至少一個基質將一種或多種化驗成分引入該化 驗，其中該基質可以是也可以不是多孔化驗基質；以及 (C) 進行以下步驟， > 1 )清洗化驗中所使用之任何基質以移除過量測 品，化驗成分或其組合物；或 7 1 1 )將該化驗中使用之基質與在整批溶液中或 體形式之額外試劑接觸。 场敌 另一個具體實施例係關於測試樣品之生物或生化活 其將測試樣品引入一多孔化驗基質中或其上，該基 要可以包含-種或多種化驗成分，並使 額=· 質進行化驗。 領外基 再一個具體實施例係關於同時測試96個 的生物或生化活性，其將96個以上之測試樣 化驗基質中或其上’該基質視需要可以 驗成分，並進行化驗。 裡4夕裡化 圖式之簡要說.明 ，1說夕明纟一非多孔基質上之gEL J SA測試#品與含化驗 ΐ: 之一側接觸’其最終與載有另-化驗 忒劑之非多孔基質接觸。 圖2說明移除該gELISA測試樣品基質和多孔凝 =液體或溶液試劑，在非多孔試劑V質上形 孔明二？報信子複合體—基質與含報信子受質之多 孔#膝基貝接觸’使該gELISA化·驗可見化。 O:\56\56293 ptc 第11頁 555967
細胞之濾紙表面反 圖4說明如何將配體基質塗佈於載有 面之遽紙表面上。 圖5說明當將該化驗可見化時，載有細胞之濾紙表面會 產生何種變化。 。 圖6表示VanA化驗之結果，該化驗使用一已知之劑量依 存性抑制劑並改變濃度。 圖7表不EF-3化驗之結果，該化驗使用一已知之抑制劑 並改變其濃度。 圖8說明蛋白質-蛋白質交互作用之gELISA化驗控制實
驗。 圖9說明π抑制π蛋白質-蛋白質交互作用之gELISA結果。 圖1 〇表示被放射性標示之ITAM與固定之LCK之劑量一依 存性結合。 圖11為色像素值對I ΤΑΜ濃度之曲線圖，其顯示一種典型 之受體-配體結合曲線。 圖1 2說明被放射性標示之IL-8配體-細胞交互作用之控 制實驗。 圖13說明IL-8配體-細胞交互作用之”抑制”。
圖1 4說明一種神經胺酸酶抑制劑之化驗。 圖1 5說明1 0，0 8 0個不同化合物·之神經胺酸酶抑制作用的 同時化驗。 發明之詳細說明 CF-HTS背後的中心思想係將測試樣品置於一多孔基質之 環境中。該方法包括將一種或多種化驗成分置於基質之 内，之上或底部，此等基質例如_為凝膠，塑膠紙，濾紙或
O:\56\56293 ptc 第12頁 555967 ' ' 室號> 87120533__年月 日 修正 五、發明^-—--~ 所日=易於刼控之固體支撐體形式。當樣品係被引進多孔基 ^日、，其足夠緩慢地擴散，以致可在測試樣品未流在一起 ，^化驗。因此，該CF —HTS格式係藉擴散而非不可穿透 。卩早將測試樣品分離。倘若讓測試實施太長時間，測試 昉叩和結果最終將流混在一起。然而，當小心控制時間 二CF-HTS容許同時但是獨立地篩選非常高密度之化合 抑’而不需要以溶劑或化驗成分填充個別井孔或反應容 =二此夕—卜，藉由操控載有反應成分之基質，能夠以此袼式 ^ =更複雜之多步驟化驗。操控多步驟化驗之基質係完全 攸J有過的，且使CF —HTS對於筛選大範圍生物或生化過程 之恥力如同96-井孔格式般具彈性。此外，CF_HTS可以達 成小型化之各種預期優點，同時未伴隨其之缺點，而且 具有獨特之優點。 CF-HTS使用廣泛之基質和化驗成分。基質包括但不限於 由瓊脂糖’丙烯醯胺組成之凝膠類，或其它凝膠物質，薄 膜，濾紙，和塑膠。組成基質之物質可為（但不限於）聚笨 ^烯，聚丙烯，其它塑膠，紙纖維，玻璃，玻璃纖維，一 氧化矽，聚碳酸酯，聚酯，聚偏二氯乙烯和聚乙烯。基^ 可為是不可穿透之固體，如濾紙之多孔固體，或凝膠:二 驗成分包括但不限於巨分子，如核酸，蛋白質和其它合成 或天然巨分子；細胞，細胞溶解液，生物萃取物，有機細 胞器，和其它複雜生物個體和混合物；和小分子，如緩$ 劑，鹽類，抑制劑，受質，肽，染料，核苷酸，輔因子^ 離子和溶劑。 -
CF HTS係種測试樣品或化合物藉擴散而非不可穿透之
O:\56\56293 ptc 第13頁 555967
屏障分離之化驗法。關鍵要素係將多個（大於丨個）測試樣 品引入多孔化驗基質或其上，該基質視需要可以包含一種 或多種化驗成分。製備含化驗成分之多孔基質係藉由將成 ^添加，混合，傾倒，>配或浸泡於基質中。製備多孔基 貝亦藉由將化驗成分偶合，塗佈，結合，固定，鍵結，複 合或附著於基質内或其表面±。此外，製備多孔基質亦藉 ，在細胞：酵素或其它固定化驗成分之基底床上形成溶液 或液體之溥膜。當結合該化驗成分時，多孔化驗基質係用 以控制成分添加之次序和/或期間，及混合與擴散之程 度。 CF-HTS亦可以使用非多孔基f。製備該非多孔基質係藉 由將化驗成分或測試樣品偶合，塗佈，結合，固定，鍵 複合或附著於该非多孔基質表面上。在CF - HTS中使用 非多孔基質係空間固定一種或多種化驗成分。 f將化驗成分引進於基質表面上時，該化驗成分係以之 共仏或非共價，特定或非特定交互作用與基質接合，該基 質為非經衍生，經衍生或經預處理以促進化驗成分之附 著。附著後，化驗成分被空間定位，以致被固定以供化 驗。在此情況，不是測試樣品必需能夠擴散通過基質到達 化驗成分，就是化驗成分之亞成分或產物必需能夠擴散通 過基質以到達測試樣品。 在下述任一或多個步驟中，使用至少一個含測試樣口 多孔基質。 7 °° (1 )將多孔基質表面與至少一-個其它（多孔或非多孔）基 質接觸=以致樣品和/或一種或彡種化驗成分能夠擴散通
O:\56\56293 ptc 第14頁 555967 ___& 87j20533__年月日_^__ 五、發明說明（11) 過交界面。 (2 )分離二個或多個基質，以停止成分和/或樣品之交互 作用。 (3 )將二個或多個基質表面接觸，以致化驗成分能夠交 互作用。 (4) 以液體緩衝劑或其它溶劑清洗，沖洗或溶析基質， 以移除未結合和/或非特定結合之化驗成分。 (5) 將/谷液中之化驗成分分配，傾倒，添加或浸泡於基 質上，或經由基質過濾該成分。
(6) 將一種或多種基質上或其中存在之放射性，螢光， 分光光度或電磁信號呈像，讀取，掃描，檢測或以其它方 式可見化。 CF-THS提供許多超越先前技藝之優點。無明顯井孔之存 在可以免除將化驗成分或試劑同時且正確地分配於井孔中 之需要。取而代之地，化驗成分係藉單步驟批式操作而分 配或混合。既然化驗成分係製備成均相批式溶液 (homogenous bulk solution)或基質，因此存在極小之 品對樣品差異。與此相較之下，96—井孔格式中井孔之存 在產生較大之樣品對樣品差異。 此外，CF-CHS提供非常高密度之大量化合物篩 倘若所觀察之標的"流混在一起"僅為有限程产，五 重測位於該標的附近者。因此，倘 ^ ° 僅高 樣品在可見化區附近降至5〇個待恥俑：’ 000個測試 以舊有之96-井孔技術筛選該5(^^物便中能之夠輕易地甚至 物。 u侍選物中之活性化合 555967
案號 87120533 ί、發明說明（12) 藉由將個別化合物以高密集排列方式分配至塑膠 乾燥，然後施行CF-HTS，可以解決所有重要的小型化… 題：為達到小型？，此格式不需要在塑膠或其它材料丄有 所創新，因為僅藉著限制向基質内擴散之樣品量便可 小型化。此格式亦不需要用於分配化驗試劑之微量流 因為整個化驗基本上係在” 一個巨大井孔”中發生，其 劑和溶液係以批式操作。僅測試樣品需要藉微量流體分# 配。此外，在此袼式中之統計差異小許多，因為僅ς 同質基質中尋找異質之局限區，π不需要讀取和比 夕 =同，孔。除了所有小型化之預期優點（成本，通過料夕 量，试劑劑量，測試化合物劑量）外，CF—HTS亦提供令人 意外之優點，如能夠以批式方式操作大部份化驗步γ驟 HTS之中〜觀點係觀察到化驗成分和測試樣品祐 速側向擴散’ |至在基質之交界面亦復“匕。例：、：去二 脂糖凝膠係置於塑膠板上時，在凝膠表面之交界面 ! = ϊ體。#需要凝膠化驗成分和板上化驗成分間：ί 互乍用時（例如在EL I SA實例中），凝膠中之成分A t 膠向外擴散且達到板上相當重要。然而，CF_HTS =要=^ 之側向擴散相當緩慢，所以板上之交互作用 =、：： 係將小體積之各樣品以二ί =潤渡 ----_刀配至表面（例
O:\56\56293 ptc 第16頁 系成分之原始區域附近。將這些相；二於鈇膠 合物之凝膠，滤、紙，或表面(或任何其它原，質=任何結 質-基質交界面。「該擴散行為可以控；基；)可間§之田任何基 有基質交界面」之發現係空前的且與習知之於所 一種將測試樣品或化合物引入基質（例 目反。 555967
如塑膠片表面）上並乾燥，所 或重疊，且各於指定區中。者壬/可二種樣品可以混合 品溶解並擴散入對應於最如=字塑膠片置於基質上時，樣 置。 取初陣列中預定位置之基質内位 一種 多孔基 以樣品 質接觸 將以 將珠粒 片之表 和氣相 後處理 其珠粒 被引進 一種 化合物 物一旦 具有特 佈在表 操作之 將樣品 質諸如 不會在 時，化 珠粒為 不規則 面）上< 酸裂解 該珠粒 原本占 基質中 將個別 非共價 結合在 定之單 面上以 需求。 以陣列方式分、 濾紙上，立中各样#代方法係將樣品分配至 基質中重4。^ $之分配體積足夠小，所 人物#垆珥、田〇另—含更多液體之多孔基 σ物便擴散以起動化驗。 基礎之組合彳卜人从> 或以-定順基質中之較佳方法係 '倘若測試化合= Α太枯蓺# 4物係不女定聯結劑（光裂解 ίϊ, )共價附著於該珠粒，則隨 ^之區祕斷^)測試化合4勿。然後各化合物與 ΐ二域非共價結☆，乾燥之化合物便能夠 或其上。 化合物引入基質中之替代方法係浸泡或將各 結合於珠粒中或其上。使用此法，大量化合 珠粒上，可被混合在一起，在各珠粒上依然 一化合物。然後，珠粒混合物能夠輕易地散 便被引進基吳。此步驟完全免除小體積液體 當被引入CF-HTS筛基質中之樣品之初始排列為高密度 時，將使得特定活性區空間性覆蓋一種以上樣品之初始位 置，則這些樣品之各個便成為所觀察到之活性之潛在來 源。對於較高之初始密度而言，一各區將存在多種候選化合
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555967 皇號 871205M 五、發明說明（15)
Jii任:!能夠與另一分子結合之分子。非限制性例子 ，，白貝，^，核酸，碳水化合物和上述例子之錯合物。 叉體係被固定於幾個可能之基質（受體基質）上，此 包括但不限於塑膠表面（例如培養皿或塑膠板(取自紐：克 (:)) ’具有兩標的結合能力之薄膜或濾紙[Μ如氮纖維 素，尼龍，或PVDF(毫孔（MilliP〇re)，孔寧寇司達 (Corning Costar)，雪利雪蘇爾（Schleicher & 以““ 及拜歐雷德（BioRad)等公司出品]或衍生性膜諸如膜 [W羅未茄（Promega)公司出品]。製備一種多孔配體基質 (例如瓊脂糖凝膠或多孔膜），使得固定受體之配體係分配 於該基質上或其中。測試化合椒或樣品係直接分配於配體 基質上，或者在測試樣品基質（例如聚苯乙烯（泰克拉 (Tekra))，聚亞乙烯（例如，取自道布蘭茲“⑽心抓七）） ^其它彈性塑膠片或薄膜上或其中。將測試基質與配體基 質接觸，並使樣品能夠擴散進入配體基質中。在適當培養 期間後，將配體基質與受體基質接觸，使配體能夠^散 與受體接觸並可能反應（凰1顯示固定受體R與生物素化配 體L ^結合）。在培養期間，配體將與固定受體結合，除非 樣品化合物抑制該配體/受體結合。
O:\56\56293 ptc 第19頁 在適當培養期間後’移除受體基質並以適當緩衝劑清 洗’以移除未結合和非特定結合之配體和樣品。然後將受 體基€ /又泡於含化驗試劑之溶液中，該化驗試劑將與配體 父互作用（其例如為抗體，在生物素化配體之場合，為抗 生物素蛋白或鏈球菌抗生物素蛋白），且具有被直接（例 如，_藉螢光或放射性）或間接(例-如，辣根過氧化酶 555967
CHRP)，鹼性填酸醋酶（AP)，或石半乳檐普酶複合體）檢測 之能力（犯表不一種抗生物素蛋白—HRp複合體，即AHRp， 連接於生物素化配體）。適當培養後，將受體基質從溶液 移除並清洗，以移除未結合和未特定結合之試劑。以直接 信號檢測而言，基質係利用適當方法（例如光譜光度測定 掃描器，CCD照相機，底片，磷呈像劑，或閃爍檢測）呈 像。間接信號（例如HRP或AP)需要額外信號顯像反應，其 係藉由將受質或其它需要之反應成分分配至多孔受質基質 中或其上，並將此基質與報信子基質接觸而達成。铁後將 酵素（例如HRP或AP)與受質反應（凰^。或者，將一^重預期 之文質引入溶液中，而非基質。_在任何可見化方法下，哕 配體/受體區域將產生一種可見反應，而抑制配體/受體= 合之區域將不產生可見反應。 σ 細胞/配體結合 CF-HTS亦能夠用以檢測配體/細胞受體結合。在傳統化 驗中，係將測试化合物，放射標示配體和表現對應受體之 細胞結合於一種如井孔之容器中。然後，提供足夠時間 受體能夠與配體結合（倘若此結合未被測試化合物抑制）。 將任何未結合和非特定結合成分從細胞移除，測量細胞之 放射性含量。發明者已採用CF — HTS法檢測配體與細胞姓人 之抑制。 σ 丨…〜肌〜、、叫❿々、丞貝、細肥岙’貝）上培養或接種 於基質上，該基質例如但不限於凝膠，濾紙或薄膜（例如 Transwell組織培養膜（孔寧寇斯達公司出品）或趨化性（° 經探測（Neuro Probe)公司出品丄〇製備一種多孔基質（例
將表現所 O:\56\56293 ptc 第20頁 555967 ___案號87120533 主 月 日 修正 五、發明說明（17) " ' 4 -- 如瓊脂糖凝膠或多孔薄膜），使得受體之標示配體係分配 於該基質（配體基質）上或其中。測試化合物或樣品係直接 分配於配體或細胞基質上，或於另一基質（例如聚苯乙烯 (泰卡拉公司出品），聚亞乙烯或其它彈性塑膠片或薄膜； 樣品基質）上或其中。將樣品基質與配體基質接觸，因而 使該樣品向配體基質内擴散。在適當培養期間後，將配體 基質與細胞基質接觸，較佳係在基質之無細胞側，使該配 體能夠藉擴散與受體反應（麗i) ^在培養期間，經標示之 配體將與固定細胞結合，除非樣品抑制該配體/細^結 合0 在培養後，將配體基質與細胞基質分離並以適當緩衝劑 2洗，以移除未結合和非特定結合之配體和樣品。使用適 當方法將細胞基質呈像（例如光譜光度測定掃描器，ccd照 相機，底片，磷呈像劑，或閃爍檢測）。（里^說明在底片… 上化驗之顯像）。 一 如以上所示般，CF-HTS達成”自由袼式”化驗可預期之所 有優點，且能夠應用於各種型式之生物或生化化驗，在所 有不同格式型式下，及使用所有不同試劑和設備。由於立 廣泛應用性，由以下實例將其作最佳說明。然而，這些^ 2係說明本發明之較佳具體實施例，而非限制中請^ 2二 ，專利範圍。本技藝一般從業人士將了解對於特^具體實 施例可以在不偏離本發明之範圍和精神下進行變化及修 改。最後，本文所引用之所有文獻均被併入本文以供參 實例
O:\56\56293 ptc 第21頁 案號 87120533
修正 555967 五、發明說明（18) 實例1 : 所產…酸鹽 V二=成萬古黴素抗性之關鍵酵素，其會催化D_丙胺 =者於D-丙胺酸❹-丙胺酸附著於D_乳酸。傳統上此 化驗係藉由當酵素被活化時從所釋放之瑞酸鹽產生 's anA活性將ATP水解為ADP和磷酸鹽）。科學家知道 -^絲胺酸以一種劑量一依存性方式抑制^以，並使用此 P 1劑作為其它潛在抑制劑之陽性對照組。 、、 酵素凝膠藉下法製備：將VanA酵素於45t添加至在5〇 mM HEPES(N-[2-羥乙基]六氫吡』井—『一 [2-乙磺酸])，2〇 ==gCl2&2〇 mM KCl(pH 7.3)中之1%熔融瓊脂糖（高熔融 瓊脂糖，吉比克（Gibco) BRL)内，並使VanA之最終濃度為 2 # Μ。然後將此膠體混合物倒入拜歐雷德凝膠鎢模裝置 中並讓其在2-8 °C固化30分鐘。 . 受質凝臌 受質（substrate)凝膠藉下法製備： 將ATP ’ D-丙胺酸和D-半乳酸添加於熔融之瓊脂糖，並 使各成分之濃度分別為1 ，丨.5 mM，1· 75 mM，然後按 照上述製備酵素凝膠之方法製備受質凝膠。 樣品某質 將一系列1微升份量之以1 : 1乙醇-水稀釋之D —環絲胺酸 系列稀釋液（ 5 0 0 0，20 0 0，1 0 0 0 , 50 0，20 0，100 #M)分 配於聚偏二氯乙烯薄膜（pVDC)上，並讓其乾燥1〇分鐘，其 中έ玄D -環絲胺酸為已知之抑制，被用做對照樣品。
O:\56\56293 ptc 第22頁 555967 年 曰 修正 案號 871205M 五、發明說明（19) 起培育 將酵素凝膠與樣品基質接觸5分鐘。狹 _ 於酵素凝膠上並讓其培育15-20分鐘。；:彳凝膠置 離。在培育期間，預期整個 磷、灸將-因種凝膠分 催化受質之附著，•了D—環絲 因為該酵素 之區域外。 f f虱S文被辰鈿至足以抑制反應 將化驗可乳化
將由新鮮製備之Q 1 q 〇/ t I 濃度ΗΠ中組成之碟酸= = = .4%銦酸銨於U3當量 膠並均句分佈Λ上 Λ尾酒倒於酵素和受質凝 越濃产逐漸揾^ ^ % i廷與磷酸鹽反應並隨著磷酸 產生綠色陰影。讓其顯色5]〇分鐘 宅莫耳）°該綠色凝膠係使用-種史崔_士因 ·5 (Stratagene)魔眼CCD 日3 相機 史二:= 砉钯I >絳$加汽# , 攝衫。如所預期般，抑制區 '、/木=又人所添加抑制劑的濃度有相互關係。 此化驗因此能夠藉排列組合珠粒或分配於任何其它表面上 之化合物㈣VanA之抑制劑，然後將其與凝膠化驗接觸。 此化驗亦說明凝膠綠；s4 π _ ^ „ ^ T k格式可用於多步驟反應。對於該 格式可用於廣範圍之化驗而言，此特點係需要的，因為許 多化驗需要多步驟。因此，VanA化驗係一種酵素活性測 ^ 、’植之”属色之一步驟化驗法。此化驗之單步驟變型不易
第23頁 貫行，因為顯色用之試劑和條件會干擾VanA活性，亦盘 脂凝勝中之輸送不相容。因此，需要此二步驟之空間;時 間分離’即i先具有酵素凝膠化驗，繼之溶液相顯色。 貫例2 ·見.於檢測激發之哞酒酵母諂 555967 案號 87120533 五、發明說明（20) 主月曰 硌》下 (Cerevl^iae)延」^因子3 ATpa_^e活性所產生之碰酸轉之 步驟凝膠化驗 當真菌延伸因子3 (EF-3)與核糖體交互作用時，磷酸酶 活性便被激發。發明者已將CF —HTS應用於此活性之化驗。 製備含EF-3(高溫敏性酵素）及酵母菌核糖體且在EF_3化 驗緩衝劑中之酵素凝膠。亦製備一種在化驗緩衝劑中包含 1 mM ATP之叉質凝膠。在37 °C製備二種在低熔融瓊脂糖 (吉普寇BRL)中且包含2%二甲基亞楓之凝膠，並讓其在4 〇c 固化3 0分釦。將一系列聚l -賴胺酸（一種作為對照樣品之 EF-3抑，劑）之溶液點加於PVDC膜上並乾燥（樣品基質）。_ 然後如貝例1般藉由在樣品基質上將酵素凝膠與抑制劑一 起預培月而進行化驗。然後將酵素凝膠與受質凝膠接觸2 〇 分鐘。如實例1般，以孔雀綠/鉬酸銨顯色雞尾酒染色酵素 和受質凝膠。以CCD照相機將酵素凝膠呈像。該抑制劑斑 點以綠色背景中之較清澈區域呈現。直^說明凝膠上之顯 色’其中抑制劑用量為5微微莫耳濃度至2 〇 〇微微莫耳濃 度。結果顯示抑制劑信號取決於劑量，此表示化合物能夠 在此化驗中被篩選以發現新穎以-3抑制劑。實例2說明即 使細胞器或其它粗製生物混合物或萃取物存在而加入複雜 性’ CF-HTS仍具可用性。 實例3 : 質交互作用抑制劑之gELISA間桩銪多. 檢測 如上所討論般，EL I SA通常係用以檢測配體-受體交互作 用之抑制’其中該受體係被固定於微量滴定井孔中。 ELISA中使用之"配體—受體”配象包括結合性分子（從蛋白
O:\56\56293 ptc 第24頁 555967 修正 87120533 五、發明說明（21) 質或其它巨分子至小分子皆可）之任何配對。這些化驗係 複雜之多步驟化驗，其需要將受體固定，培育受體與配 體’清洗以移除不需要且非特定之保留配體（若未洗除將 導致高信號背景），將可見化試劑（例如，與報信子酵素複 合之配體-特異性抗體）與結合有受體之配體結合，並藉由 提供報信子酵素受質而產生可見信號。EL I SA之複雜性顯 然導致HTS工業認定ELISA不適合採用於自由格式化驗/然 而本發明者已將該CF-HTS格式應用於此複雜之多步驟化 驗，以化驗各種蛋白質_蛋白質，蛋白質-配體，和其它配 體結合之交互作用。 尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化劑（UPA)與其對應之受體 (uPAR)結合。该uPA/uPAR交互作用參與各種型式之癌症轉 移。發明者已將使用純化受體和配體之CF-HTS應用於傳統 之uPA/uPAR ELISA 。 uPAR基質 ·
在pH 7· 4和4 °C以1 5毫升溶於磷酸鹽緩衝鹽（PBS)(紐約 州葛蘭島之生命科技公司）之118 mM純化uPAR塗佈塑膠板 (7 · 5公分X 11 · 5公分；取自伊利諾州拿坡維里之南克公 司）並靜置整。塗佈該塑膠板過夜後，將uPAR溶液傾 倒，添加15毫升含1% (w/v)酪蛋白之PBS以將該塑膠板上 留下之結合位置封阻，並在室溫（RT)培養2小時。封阻 後，將封阻溶液傾倒並以2 0毫升由〇 · 〇 5 % T we e η - 2 0 (聚氧 乙烯山梨糖單月桂酯）於PBS中之清洗緩衝液清洗5次。清 洗該塑膠板後在室溫乾燥1 〇分鐘。此被定時，所以該塑膠 板能隨後立即用於下述化驗中，一以避免基質過乾而導致活
O:\56\56293 ptc 第25頁 555967 ±_3 案號 87120533 五、發明說明（22) 性損失。 石-UPA基質 為了化驗’以生物素（石-uPA)將所使用之upA標示。召 -uPA凝膠係將/3 -uPA浸泡於瓊脂中而製備含$ — uPA之凝 膠，以避免高溫（與實例1和2中倒入熔融瓊脂中相反）。 首先將〇· 1克瓊脂糖（密蘇里州聖路易士之西格瑪（Sigma) 公司出品），與1 〇毫升P B S混合，加熱直到熔融，然後於8 X 7 X 0· 0 75立方公分凝膠裝置（加州赫克勒司之拜歐雷德 公司）中鑄型以製備瓊脂。當固化（在室溫或者4 t )，將凝 膠於4 °C浸泡在15毫升含UPA(約1〇 nM)之化驗用緩衝液 中整仪’該緩衝液由〇 · 〇 5 % T w e e η - 2 0和〇 · 1 %路蛋白（皆取 自密蘇里州聖路易士之西格瑪公司）組成。於使用前在室 溫乾燥2 0分鐘。 樣品基質 在無uPA/uPAR結合之已知小分子抑制劑存在下，使用非 生物素化uPA (Pro-uPA)作為0 -uPA/uPAR結合之抑制劑之 對照樣品。將五微升量之〇，〇 · 〇 3，0 · 1，〇 · 3，1及3 // Μ pro-uPA(在化驗用緩衝液中）分配於PVDC膜（印地安那州印 地安那坡里司之道爾公司）上，並在室溫乾燥2小時。 UPAR輿Pro — uPA#召一 uPA—走已培育 將樣品基質置於/3 — UPA凝膠之一側，將乾燥之pr〇 —uPa 斑點與/3 -uPA凝膠表面接觸。在室溫讓pr〇 —uPA擴散至凝 膠中1 0分鐘。其後，將該召-uPA凝膠之另一側置於塑膠板 中’以讓該/3 - uPA(作為配體）和pro-upA(作為競爭抑制 劑）與uPAR在塑膠板上交互作用^在室溫培育該結合/競爭
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555967 ---------------年月曰 铬正___ 五、發明說明（24)
多倫-珍娜工業公司）照射之光纖漫射板之頂部上。以CCD 照相機（加州拉卓拉市之史崔德吉恩公司之鷹眼系統得到 產生之影像。 對照f驗 ^ 凰^說明實例3之對照實驗。關於里^，將瓊脂糖方塊（1 平方公分）浸泡於各種濃度之冷- uPA溶液中（除了 50 nM溶 液之濃度）係標示於瓊脂糖方塊左邊外，其餘濃度均標示 於方塊下方）。於固定有UPAR之塑膠板上培養瓊脂糖方塊 後，將瓊脂糖方塊移除。然後清洗塑膠板，如上所述般將 發生点-uPA/uPAR結合之基質區域可見化。圖8B表示在〇PD j 顯色期間，在各種時間各方塊之平均色像素值（減去背景） (以N I Η呈像軟體分析來自◦ CD照相機之數位影像而測定） 相對於各瓊脂糖中/3 -uPA濃度之圖形。從瓊脂糖凝膠輪送 之/3-uPA顯示一種典型之受體—配體結合曲線，以及達到 最大結合度一半之濃度（Kd)為約3-5 nM此與測量該變數之 標準EUSA及其它化驗法對該反應所報告之值一致。^說 明由gEL ISA產生之間接比色信號係定量性地取決於配體一 受體交互作用之程度。
Pro-uPA/汐-uPA 競免丄上』、 圖i顯示以Pro-uPA會抑制《ipa/upar結合 圖9 A中之 點指出冷-uPA/uPAR結合香如生+广丄 又抑制之區域。因此，在這些區 域中抗生物素蛋白-HRP未处人 # β 一 丄 ^ 禾、、、口合。於是，該HRP未與0PD凝膠 中之受質反應產生顯色。圖q只技月一 _ + 凰^係顯示這些相同CCD呈像數 八類肉眼看見定量滴定之能力。 實例4 jgA制劑之畫接放射性定
O:\56\56293 ptc 第28頁 據之替代方式，其提高人_内n 555967 ---j號 87120533__年月日_修 五、發明說明（25) 檢測 τ-細胞激活作用是人體免疫反應之構成要素。關於在 T-細胞激活作用期間發生之下游事件，p56ick (LCK，一 種蛋白質）必需與τ —細胞抗原受體之細胞質領域之I ΤΑΜ區 與免疫球蛋白相關之酪胺酸系激活主調區（m〇t丨f)交互作 用。抑制此蛋白質-蛋白質交互作用之化合物為潛在免疫 抑制劑。本發明者已使用CF — HTS化驗此蛋白質-蛋白質交 互作用，其中該LCK係固定於一薄膜。 、 LCK基皙 生物素化LCK ’藉著在室溫以5毫升之3 LCK溶於含5 mM DTT(二硫蘇糖醇）之pBS之溶旅淹沒一 u公分χ 2公分細 長條1 0分鐘以及隨後移除緩衝液，而被固定於生物素捕捉 膜（SAM膜）（懷俄明州麥迪遜市之普羅米加公司）上。此為 定時，所以該SAM膜隨後即刻（數分鐘以内）用於下述化驗 中 0 ITAM$ 某 t 將〇 · 1克璦脂糖與1 0毫升緩衝液混合，加熱至溶融，然 後於8 X 7 X 0 · 0 7 5公分凝膠裝置中鑄型以製備含放射性 標示之I T A Μ肽（I T A M*)之瓊;脂糖凝膠。不是於鑄型前或就 是於固化作用後浸入凝膠前添加該I TAM*，並使最終濃度 為 10 nM。 ' 樣品基質 將欲篩選之測試樣品分配於塑膠表面或PVK上，乾燥以 形成樣品基質。 〜 μ 培養該ΙΤΑΜ*，LCK和測試兔^
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將樣品基質與I ΤΑΜ*凝膠之一側接觸，所以測試樣品能 夠擴散進入該ΙΤΑΜ*凝膠中。接著，將該ιτΑΜ*凝膠之另一 側與其上固定有LCK之SAM膜接觸。培養1 5-45分鐘後，移 除SAM膜，清洗，並以磷呈像劑或底片呈像。itam_lck交 互作用之抑制劑藉與較低信號密度對應之較低放射性區域 指示。 IIAM1Z_LCK結合之對照實驗 將〇· 1克瓊脂糖與10毫升緩衝液混合，加熱至熔融，然 後於8 X 7 X 〇· 0 75公分凝膠裝置中鑄型以製備瓊脂糖凝 膠。固化後，將凝膠壓製出直徑丨公分之圓圈，並在4。〇浸4 泡於40 0微升含〇· 1，〇· 3，1，3，1 〇和2〇 nM經1251標示之 I ΤΑΜ(伊利諾州阿林頓海茲之阿莫夏門公司）之缓衝液中過 仪。將該凝膠圈從溶液中移出並於室溫乾燥2 〇分鐘。然後 將其置於固定有LCK之SAM膜丄並在室溫培養45分鐘。移除 凝膠並以緩衝液清洗薄膜4次。SAM膜乾燥後使用磷呈像劑 呈像。 逼指出在1251標示之ITAM和SAM膜上固定之LCK間之劑 量依存性結合。 、星II表示各125I-ITAM平均色像素值（減去背景）（以取自 分子動力（Molecular Dynamics)之 ImageQuant 軟體分析來 |Γ 自鱗呈像劑之數位化呈像而測定）相對於凝膝圈中 1251-Ι ΤΑΜ濃度之圖形。從凝膠輸送之⑵丨―η —顯示一種典 型之受體-配體結合曲線。 實例5 :复^疑膠/濾紙組合格田胞報信子某因化驗 腎細胞’又被稱為HEK細胞’甬含有融合於蟲螢光素酶
O:\56\56293 ptc 第30頁 555967 案號 87120533 五、發明說明（27) 基！（來自普羅米加之蟲螢光素酶發表基因）之環一 amp反應 :素(CREB)啟動子之質體轉染。當轉染細胞用—…⑴ 處理時，將誘導蟲營光素酶報信子基因之表現。其後，當 包含該蟲螢光素酶受質（取自普羅米加之甲蟲蟲營光素）和 適當輔因子（20 mM Tricine ρΗ 7·8，〇1 浊 EDTA，33 DTT，0·3 mM輔酵素A，〇·5祕苷三磷酸，和丨純
MgC丨2)之生物緩衝液添加於jjek細胞時，產生一種質子發 射，其旎夠以傳統儀器檢測。發明者已將“咄以 於 化驗。 細胞基質 以胰蛋白酶處理培養中之細胞，移入孔寧/寇司特 TRANSWELLTM薄膜（具塑膠支撐環之3微米聚碳酸酯濾紙） 中，並於組織培養介質存在下在37 t，5% C〇2培養過夜。 ^後從附者細胞之薄膜和濾紙移除培養基，空氣乾燥15分 鐘並隨即用於以下步驟中。 誘導劑某f 將12微升之1〇 mM f〇rsk〇lin(溶於乙醇之西格瑪公司貯 ^ f)添加於6耄升之1 %低熔點瓊脂糖凝膠，以製備包含 触螢光素酶表現誘導劑之凝膠。將凝膠在室溫固化並使
Forskolin之最終濃度為2〇 。 樣品基質 將可以阻斷forsko1 in誘導之樣品以高密度分配在PVDC 上之分立位置並予以乾燥。 疫養試劑作用 -
第31頁 —r w卻例興誘導劑凝-膠一起培育。其次，將含 555967 案號 87120533_ 五、發明說明""一"" --- =k〇lin誘導劑之凝膠置於以上所製備細 ^侧上。將這些在37°c㈣叫之條件下-起培養2〇1 二。然产移除f〇rskolin凝膠，並在37。〇及5% 養4小日才以使蟲螢光素酶構築體、
螢光素酶酵素活性（或其抑制作用），將細胞ί G 因子之生物緩衝液浸沒，以產生做為二2 二=號係局限在表現蟲榮光素酶之固定細胞内1 :始誘V步驟之抑制劑將產生較低質子發射之。 / 濾紙CF-HTS --- 尸細=面上之配體/受體結合會引發細胞内之 徑，其最終會導致功能性回應(例如，細胞增 ，質之分泌）。為了調節病態細胞之.生物回應：= ί抑=與細胞表面結合。-種評估配體/細胞受：： =!:細f間結合之能力。此包括將細胞與放射性配： 及抑制齊卜起培養，繼而清洗移除未結合和非特異性^ 之放射性配體，然後測量結合型放射活性之量。、。口 /内白血球素-8 (11^8)係—種藉由與各種型式細 受體結合而參與發炎之趨化性化學増活素。發明者之 一種CF-HTS配體/受體細胞化驗， 者^ 制劑。 — IF用之抑 細胞基質
555967
案號 87120533 五、發明說明（29) 每將ί =百8 ^ f ΗΓ ”（馬利蘭州貝莎達之ATCO以 母一板約2 8百萬個細胞之密度w於7 膜渡紙（麻薩諸塞州坎布里兹之孔办'直m橫井孔薄 在PH 7.2和37°C下，於含10 司）上°讓其 士之西格瑪公司）之緩衝液（取自《丑約S在蘇里州聖路易 公司之RPMI)中附著於薄膜渡紙過夜。在二島之生命^技 後，將介質移除，並以新鮮緩衝液产、，田l附者於濾、，，氏 之細胞。將濾紙之細胞側翻轉向下：呈：f除任何未附著 之介質能編，然後乾燥2。：：並^ =置，使過量 基質隨即被用於下述化驗中。 &為定時，所以細胞 配體基質 — 二^”巧：法製備：將^標示之^以伊利諾州 Λ門公司)浸泡於瓊脂糖凝膠中，該瓊 ^ 脂糖與1(3毫升緩衝劑混合’加熱线 融，；、、、、後於δ X γ x 0.0 75公分凝膠裝置中鑄型而製成。 ΓΪ膠ϋ溫浸泡過夜，一面在轉動平台（新澤西州愛迪 朗ί威科學公司)上緩慢混合。浸泡後，將凝 溫乾燥20分鐘。此為定時，戶斤以細胞基 夤隨即被用於下述化驗中。 a 樣品基質 在，I_L-8/細胞受體結合之已知抑制劑存在下，使用非 放射標不IL-8(麻薩諸塞州坎布里茲之傑恩西米公司）作 對照樣品抑制劑，以觀察125I_IL-8與HEK細胞結合之抑為 制。將1 微升之0，0·03 ’0.1，Ό.3，1，3，10和100 Μ 之IL-8分配於如PVDC之塑膠片上，並在室溫真空乾燥1小
O:\56\56293 ptc 第33頁 555967 _一 案號87120533 年月日 倏正 五、發明說明（30) 時。 培養 將樣品基質置於配體基之一側，以致乾燥之丨L — 8斑點能 夠與凝膠表面接觸。將凝膠翻轉，使另_側能夠在室溫^ 燥1 〇分鐘，並使該”抑制劑•，能夠擴散進入凝膠中。接g广 讓結合反應在室溫培養4 5分鐘。其後，移除凝膠，以緩衝 劑將該薄膜之無細胞側清洗4次。在從其塑膠支撐環移除 前，讓該薄膜完全乾燥。然後以X—光底片或磷呈像劑^'分 子動力，太陽谷（Sunnyvale)，CA)將薄膜呈像。 刀 112表示瓊脂糖凝膠 與表現IL-8a受體之HEK 方公分緩脂糖方塊浸泡 溶液中。接著，將配體 觸。培養後，將方塊從 之無細胞側。使用磷呈 數據指出在此以凝膠為 數係定量性地取決於配 指出結合區域保持清晰 化驗中並非問題。
中之I - I L- 8擴散通過細胞基質市 細胞結合之劑量反應。將幾個1平 於各種濃度（如圖所示）之ns I — IL 一丨 之浸泡方塊如上述般與細胞基質^ 細胞基質移除，以緩衝液清洗薄月 像劑將細胞結合之I251 — IL_8定位。 基礎之細胞化驗中之直接放射性f 體-文體父互作用之程度。圖12亦 之形狀’並確認信號之橫向 星ϋ說明競爭抑制實驗之結果 和ΗΕΚ細胞間
之結合抑制係由光點指示。顯然未標示之ί二:二: 為定1性取決劑量。這些數據指出該 去拷+夕ττ s加-、 丨w 於此例中ΐ 未軚不之IL-8例不），能夠橫貫細胞基質以 和細胞間之結合。 - Μ低 1 1L —
細胞 於細胞 光蛋白 如受體 素乙醯 影響。 胞表現 或數天 如，用 量。再 白質並 子諸如 細胞生 555967 ---87120533 _ 年月日 鉻工 五、發明說明（31) ' ^ 功能改變測量通常係藉由觀察測試化合物或樣品對 内報信系統之作用。其例子包括觀看對於細胞内螢 質（諸如綠色螢光蛋白質（GFP)，細胞外蛋白質（諸 或黏附刀子），或特異性酶（諸如蟲螢光素酶，氯黴 基轉移酶，或/3 -半乳糖苷酶（普羅米加））之合成之 首先，將細胞與測試化合物一起培育。其後，讓細 報信子蛋白質一段適當時間（可為數分鐘，數小時 )。然後以直接方法（例如GFP)或以間接方法（例 膜結合型蛋白質之ELISA技術）測定報信子蛋白質之 者，於酵素之情況，可將細胞裂解以萃取報信子蛋 化驗其活性。其它功能性細胞化驗係測量特異性分 染料或放射性標示之代謝物於回應受體受到刺激或 理諸如膜電位改變時之行為或定位。 測量化合物對細胞間黏附分子之作用之 ELISA化驗能夠如下述使用叮―HTS格式·。將表現KM — 〗之 内皮細胞以約5，〇 〇 〇細胞/平方毫米之密度接種在聚碳酸 酉旨趨化性膜（神經探測（Neuro pr〇i3e)上。將細胞在37艺於 培養基中培養過夜。移除培養基並讓該膜在室溫部份乾燥 1 〇分鐘。將測試I CAM- 1之誘導之樣品或化合物於塑膠片上 乾燥’並與該濕潤膜之非細胞側接觸。使化合物能夠與細 胞在3 7 C於濕氣室中與細胞交互作用，其後將細胞浸在 培養基中並在37 °C培養5小時。 讓細胞合成被誘導之蛋白質後，從該膜移除培養基，將 細胞於含有與螢光異硫氰酸鹽（FITC)或生物素複合或未複 Θ <才几一 1 1抗體（吉恩兹米，系統）之緩衝液中培
O:\56\56293ptc 第35頁 555967 案號 87120533 _月 曰 修正 五、發明說明（32) 養。在室溫培養3 0分鐘後移除緩衝液，並清洗該細胞數次 以移除未結合之抗-ICAM-1。在與FITC複合之抗體之場 合，該膜係使用CCD照相機（史崔德吉恩，呈像研究）以285 毫微米激發和52 0毫微米發射呈像。刺激ICAM-Γ表現之化 合物，由於與FITC-抗-ICAM-1抗體之結合，將造成具增加 螢光之區域。在與生物素複合之抗體之情況，細胞係在室 溫於包含抗生物素蛋白- HRP之緩衝液中培養1〇分鐘。移除 緩衝液並洗除未結合之抗生物素蛋白-HRP。然後將膜浸在 含有沈澱性HRP受質諸如四氯化二胺基苯哄（佩司 (Pierce))之緩衝液中，並觀察細胞被誘導表現πΑΜ — 丨之 區域中之顯色。在抗-ICAM-1抗激未被複合之場合，將一 被複合之第二抗-抗-ICAM-1抗體與細胞反應，繼之而用複 合物之適當受質顯現信號。以CCD照相機捕捉呈像。所有 這些變型（FITC，抗生物素蛋白-HRP，和抗-抗—ICAM-n均 是替代性報信子，其應該得到相同之定量結果-即影響 I CAM-1表現之樣品能夠與信號提高或降低之區域相關連。 注意在此例中該連繽式格式基質為一膜和一塑膠片。不 需要凝膠即可進行CF-HTS。 實例8 :神經氨酸普酶抑制樣品基質中個別化合必y夕 £F-HTS化驗 將5 2 8個不同但結構相關之化合物庫以c F - Η T S測試。使 用派卡多探針（Packard Multiprobe) ΜΡ204 DT將化合物 從玻璃瓶移入9 6 _井孔板中，並將化合物稀釋且轉移至塑 膠片上。最初將化合物從在玻璃瓶中之DMS0中之40 ιήΜ稀 釋為在96 -井孔板中之DM SO中之mM。然後於9 6 -井孔板中
O:\56\56293 ptc 第36頁 555967 _ 案號87120533_年月日__ 五、發明說明（33) 將其從在DMSO中之4 mM稀釋為在50% Et0H/H20中之200 mM。將這些樣品以1微升雙份之方式轉移至8公分X 8公分 塑膠片上，樣品（拜歐雷德cat· # 1 65-2956 )間之平均空 間為5毫米，每片總共有1 9 2種樣品。因此，各1微升點包 含近似2 0 0微微莫耳來自該庫之特定化合物。作為對照組 者，將2,3 -去氫-2 -去氧-N-乙醯基神經胺酸（DANA)(—種 已知之神經胺酶抑制劑（伯林格曼漢（B〇ehringer Mannheim) #528544))之稀釋液系列人工分配至各塑膠片 上該化合物之相鄰位置上。將塑膠片於真空中乾燥，所以 各成分將在其本身在塑膠上之位置中乾燥。 酵素基質 — 在化驗岫’將流行性感冒疫苗神經胺酶酵素稀釋丨5 〇 〇 倍，並從含25%甘油之，磷酸鹽緩衝食鹽水中移至由1%瓊 脂糖，50 -擰檬酸鹽（pH 6.〇)及1〇 _氯化鈣組成之4〇t 液化瓊脂凝膠中。傾倒8公分χ 8公分χ 〇·75毫米之酵素 凝膠，並將溫度降至4 °C以固化。 ’ 受質基質 將合成之流行性感冒疫苗神經胺酶受質，即2, —(I 繳形基（umbel i feryl ))_ α _D_N_ 乙醯土 cat.#M8639 )，從在DMSO中之3 铥越* ^:胺（七瑪 中3。…並以類似上述酵之二二稀之釋么在液化壤脂凝膠 培養並檢測 酵素凝膝之方式傾倒。 將酵素基質置於樣品基質上 侧上。然後將受質基質堆疊“=，化合物被乾燥之 該基質30分鐘。在此期間I頁部。在室溫培養 隱二二觀i先被壓制之螢光受質和酵
O:\56\56293 ptc 第37頁 555967 修正 tJfe 871205^ 五、發明說明（34) 在二凝膠間擴散，該受質被酵素裂肖，使得營光強 ^ t，^此係在340毫微米激發和在450毫微米發射e 。 性之化合物將營光強度之提高降 巧部份區域中螢光強度提高日寺，含有從塑膠片擴 u二τ中之酵素抑制劑之區域可以看到具有較低螢光 批^ /區域1此易於以具有適當濾光器之CCD照相機監 慮光可以控制發射及激發波長。顯示抑制區域之 —-，之身伤係由與该區域對應之抑制劑基質之位置而決 ^ :错由比較DANA對照組和所測試之各抑制劑之已知量之 螢光丄製成各化合物I C5G之定量估計值。 以複製雙份之方式測試庫之全部5 2 8個化合物。所使用 之全部酵素凝膠體積為33毫升，或每次測試·用3ι· 25微 升。此外，全部化合物被同時測試，化驗條件與傳統9 6-井孔化驗相同。此外，如_所說明般，化驗足以敏感至 檢測如1 0 0 # Μ般微弱之抑制劑。活性·化合物之估計丨數 值與相同化合物以較多成本且每個測試需要2〇〇微升之96一 井孔化驗測試所觀察到者相符合。見定量凝膠化驗結果 表。此實例說明化合物之較高排列密度會降低成本和時 ，:例如’即使間隔微量減低2· 5毫米而非5毫米，亦可使 每單位，積可測試之化合物數量提高4倍。在此實驗中， 這將使每個測試化合物之體積降至低於丨〇微升。又試劑係 以整批方式操作’不需要小型化篩選中常用之低體積液體 操作設備。
O:\56\56293 ptc 第38頁 555967 案號 87120533 年 月 曰 修正 五、發明說明（35) 定量凝膠化驗結果 來自96-井孔化驗之估計IC5G(pM) 樣品編號 來自凝膠之近似最大Ki (μΜ) 4567890123456755^9)0 33333344444444445 100 >100 80 >100 80 42 100 >100 100 >100 100 >100 40 32 100 >100 40 50 100 . >100 >200 >100 100 >100 100 >100 10 7.5 100 >100 100 >100 100 —>100 作為說明此極小型化優點之後續實例，以總酵素凝膠體 積為17毫升（每個測試低於2微升）之” —HTS測試1〇, 〇8〇個 不同化合物。使用派卡多重滴管將各種樣品各分配3〇毫微 升並分隔1毫米。將化合物以DMS〇調配成濃度為5 mM，所 以將各近似1 50微微莫耳分配於塑膠上。DANA被再次用做 對照抑制劑。除了化合物陣列外部之常用對照滴定外，在 陣列本身内部亦包括一對照滴定作為盲目測試，當分配於 塑f上時，該對照樣品與該1〇,〇8〇個未知物被相同處理。 如刖所述，將塑膠片乾燥並於用於神經胺酶化驗。以此方 法在1小時内可以同時篩選全部1〇, 〇8〇個化合物。再一 次，除了初始將化合物分配於該塑膠片上外，不需要微量 流體和/或低體積操作。在此化驗中所用之非常高密度並 不干擾抑制劑之檢測。，lf.冰，客宓疮π A i A .
O:\56\56293 ptc 第39頁 555967 _案號 87120533_年月日__ 五、發明說明（36) 確認複雜化，即使當螢光化合物（在凝膠中為較光亮之 點，易於被觀察到）為活性化合物之最近鄰居亦復如此。 見圖1 5。
O:\56\56293 ptc 第40頁

Claims (1)

  1. 年 Λ_a 修正 六、申請專利範圍 1 . 種同 抑制生物過 a )於陣列 體積放置至 分散的分析 心，而且各 b)觀察各 物質於增強 2. 抑制 a) 體積 置為 b) 質接 連於 多孔 c ) 之能3. 抑制 a ) 體積 置為 一種同 生物過 於陣列 放置至 中心， 將該基 觸，使 該平面 基質中 進行分 力0 時測試含不 程之能力之 中將含有不 平面多孔基 試劑，使得 物質之辨別 物質與該分 或抑制該生 時測試含不 程之能力之 中將含有不 平面基質上 而且各物質 質與含有或 得各物質之 基質上該物 ，及 析以決定各 同物質 方法， 同物質 質上， 各不同 可以由 析試劑 物過程 同物質 方法， 同物質 ，使得 之辨別 帶有均 部分以 質原放 之眾多樣 包括： 之超過9 6 該多孔基 物質以其 其放置位 之交互作 之能力。 之眾多樣 包括： 之超過9 6 各不同物 可以由其 勻分散的 各擴散物 置位置的 品以測定其增強或 樣品中 質含有 各自不 置而決 用，進 每一個的小 或帶有均勻 同位置為中 定，及 而關連於該 品以測定其增強或 樣品中 質以其 放置位 分析試 質的特 方式， 每一個的小 各自不同位 置而決定， 劑之多孔基 定位址能關 而擴散至該 擴散物質於增強或抑制該生物過程 一種同時測試含不同物質 生物過程之能力之方法， 於陣列中將含有不同物質 放置至平面基質上，使得 中心，而且各物質之辨別 之眾多樣品以測定其增強或 包括： 之超過9 6樣品中每一個的小 各不同物質以其各自不同位 可以由其放置位置而決定，
    ()、5()、、5(〕2();」川)722 卩tc 第42頁 555967 案號 87120533 曰 修正 六、申請專利範圍 b) 將該平面基質與含有或帶有均勻分散的第一分析試劑 之第一多孔基質接觸，使得各物質之部分以各擴散物質的 特定位址能關連於該平面基質上該物質原放置位置的方 式，而擴散至該多孔基質中， c) 將該第一多孔基質與帶有或含有第二均句分散的分析 試劑之第二基質接觸，使得第二分析試劑擴散至第一多孔 基質中，或使得各物質和第一試劑擴散至第二基質中，於 後者中確定擴散以第二基質中各物質的位址能關連於該平 面基質上該物質原放置位置的方式進行，及 d )評估各物質於增強或抑制該生物過程之能力。
    4. 一種同時測試含不同物質之眾多樣品以測定其增強或 抑制生物過程之能力之方法，包括： a) 於陣列中將含有不同物質之超過9 6樣品中每一個的小 體積放置至第一平面多孔基質上，該第一平面多孔基質含 有或帶有均勻分散的第一分析試劑，使得各不同物質以其 各自不同位置為中心，而且各物質之辨別可以由其放置位 置而決定，
    b) 將該第一多孔基質與帶有或含有第二均勻分散的分析 試劑之第二平面基質接觸，使得第二分析試劑擴散至第一 多孔基質中，或使得各物質和第一試劑擴散至或進入第二 基質，於後者中確定擴散以第二基質中或其上各物質的位 址能關連於該第一多孔基質上該物質原放置位置的方式進 行，及 c )評估各物質於增強或抑制該生物過程之能力。
    0 \56\5629]-910722 ptc 第43頁 555967 案號 87120533 V年Ί月 曰 修正 六、申請專利範圍 5 .根據申請專利範圍第1、2、3或4項之方法，其中該均 勻分散的分析試劑之一為巨分子。 6 .根據申請專利範圍第1、2、3或4項之方法，其中該均 勻分散的分析試劑之一為酵素。 7.根據申請專利範圍第1、2、3或4項之方法，其中該均 勻分散的分析試劑之一為粗製生物萃取物。 8 ·根據申請專利範圍第1、2、3或4項之方法，其中該均 勻分散的分析試劑之一為胞器。 9 .根據申請專利範圍第1、2、3或4項之方法，其中該均 勻分散的分析試劑之一為全細胞。 1 0 .根據申請專利範圍第1、2、3或4項之方法，其中均 > 勻分散的分析試劑為平面多孔基質表面上帶有的全細胞。 1 1 .根據申請專利範圍第1 0項之方法，其中觀察該交互 作用係經由接觸該多孔基質與試劑之溶液或液體懸浮液， 或多孔基質含有試劑，其於任一情況中有助於可見化蛋白 質，而蛋白質於全細胞中的表現即為被評估的生物過程。 1 2 .根據申請專利範圍第4項之方法，其中第一分析試劑 為經標示的配體，第二分析試劑為供該配體之固定的受 體0
    1 3.根據申請專利範圍第1 2項之方法，其中清洗該第二 平面基質以移除擴散至或進入該第二平面基質但未結合於 該固定的受體上之任何經標示的配體。 1 4.根據申請專利範圍第1 3項之方法，其中接觸第二平 面基質與試劑之溶液或液體懸浮液，或多孔基質含有試
    0 \56\56293-910722 ptc 第44頁 555967 _案號 87120533_年 9 月 曰_iMz_ 六、申請專利範圍 劑，其於任一情況中有助於可見化未經由清洗步驟移除之 經標示的配體。 # 馨
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Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1209875A (zh) 1996-01-26 1999-03-03 维科公司 根据人类hiv病毒株的表型药物敏感性控制hiv阳性病人化疗的方法
US6790652B1 (en) * 1998-01-08 2004-09-14 Bioimage A/S Method and apparatus for high density format screening for bioactive molecules
US6410332B1 (en) * 1998-09-08 2002-06-25 Symyx Technologies, Inc. Sampling and analysis of reactions by trapping reaction components on a sorbent
WO2000036405A2 (en) * 1998-12-18 2000-06-22 Symyx Technologies, Inc. Apparatus and method for characterizing libraries of different materials using x-ray scattering
US20040185432A1 (en) * 1999-01-08 2004-09-23 Bioimage A/S Method and apparatus for high density format screening for bioactive molecules
US6690399B1 (en) * 1999-05-07 2004-02-10 Tropix, Inc. Data display software for displaying assay results
US6800437B1 (en) 1999-08-06 2004-10-05 Tibotec Bvba Method of monitoring a biological system by labeling with an apo metal binding protein
US6544480B1 (en) 1999-10-26 2003-04-08 Tibotec Bvba Device and related method for dispensing small volumes of liquid
US20010044112A1 (en) * 2000-03-24 2001-11-22 Lyles Mark B. High throughput screening array containing porous material
US20030031675A1 (en) 2000-06-06 2003-02-13 Mikesell Glen E. B7-related nucleic acids and polypeptides useful for immunomodulation
WO2001096597A2 (en) * 2000-06-13 2001-12-20 Glaxo Group Limited High throughput screening of compounds for biological activity
US7087375B1 (en) 2000-06-23 2006-08-08 Johan Lennerstrand Method for determining the mechanism of HIV RT inhibitors
US7052659B1 (en) * 2000-07-18 2006-05-30 General Electric Company Sequential high throughput screening method and system
US6653124B1 (en) 2000-11-10 2003-11-25 Cytoplex Biosciences Inc. Array-based microenvironment for cell culturing, cell monitoring and drug-target validation
AUPR224600A0 (en) * 2000-12-21 2001-01-25 Polymerat Pty Ltd Novel polymers
US7244232B2 (en) * 2001-03-07 2007-07-17 Biomed Solutions, Llc Process for identifying cancerous and/or metastatic cells of a living organism
US20030060695A1 (en) * 2001-03-07 2003-03-27 Connelly Patrick R. Implantable artificial organ devices
US20020142304A1 (en) * 2001-03-09 2002-10-03 Anderson Daniel G. Uses and methods of making microarrays of polymeric biomaterials
US20080009019A1 (en) * 2001-06-13 2008-01-10 Smithkline Beecham Corporation High throughput method for screening candidate compounds for biological activity
DE10138766A1 (de) * 2001-08-07 2003-02-20 Bayer Cropscience Ag Verfahren zum Identifizieren von makrocyclischen Polyketiden
US20030032198A1 (en) * 2001-08-13 2003-02-13 Symyx Technologies, Inc. High throughput dispensing of fluids
EP1298433A1 (en) * 2001-09-28 2003-04-02 EMC microcollections GmbH Device and method for the generation of arrays of substance mixtures by diffusion
EP1487969A4 (en) * 2001-12-07 2008-07-09 Dyax Corp METHOD AND DEVICE FOR WASHING MAGNETICALLY RESPONSIVE PARTICLES
AU2002359721A1 (en) * 2001-12-19 2003-07-09 Bristol-Myers Squibb Company Pichia pastoris formate dehydrogenase and uses therefor
US20050054118A1 (en) * 2002-02-27 2005-03-10 Lebrun Stewart J. High throughput screening method
US20040063220A1 (en) * 2002-02-27 2004-04-01 Lebrun Stewart J. Substrate chemistry for protein immobilization on a rigid support
US20040072274A1 (en) * 2002-05-09 2004-04-15 Lebrun Stewart J. System and method for visualization and digital analysis of protein and other macromolecule microarrays
EP1534755B1 (en) 2002-05-10 2011-10-12 Bio-Layer Pty Limited Generation of surface coating diversity
EP1365034A3 (en) 2002-05-21 2004-02-18 Bayer HealthCare AG Methods and compositions for the prediction, diagnosis, prognosis, prevention and treatment of malignant neoplasia
US20040028804A1 (en) * 2002-08-07 2004-02-12 Anderson Daniel G. Production of polymeric microarrays
AU2003255253A1 (en) * 2002-08-13 2004-02-25 Discovery Partners International Spotting pattern for placement of compounds in an array
US20040032058A1 (en) * 2002-08-13 2004-02-19 Neeper Robert K. Systems and methods for casting and handling assay matrices
US8557743B2 (en) * 2002-09-05 2013-10-15 Dyax Corp. Display library process
US20040058327A1 (en) * 2002-09-20 2004-03-25 Pan Jeffrey Y Method for using a blank matrix in a continuous format high throughput screening process
WO2004092903A2 (en) * 2003-04-09 2004-10-28 Discovery Partners International Spot finding algorithm using image recognition software
US7025935B2 (en) * 2003-04-11 2006-04-11 Illumina, Inc. Apparatus and methods for reformatting liquid samples
US20070128603A1 (en) * 2003-05-28 2007-06-07 Bayer Healthcare Ag Diagnostic and therapeutics for diseases associated with 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 7 (5-ht7)
JP2005046121A (ja) * 2003-07-31 2005-02-24 Japan Science & Technology Agency オンチップバイオアッセイ方法及びキット
US20050136536A1 (en) * 2003-09-15 2005-06-23 Anderson Daniel G. Embryonic epithelial cells
US20050069949A1 (en) * 2003-09-30 2005-03-31 International Business Machines Corporation Microfabricated Fluidic Structures
US20050069462A1 (en) * 2003-09-30 2005-03-31 International Business Machines Corporation Microfluidics Packaging
EP1892306A3 (en) 2003-10-06 2008-06-11 Bayer HealthCare AG Methods and kits for investigating cancer
US20060127963A1 (en) * 2003-11-21 2006-06-15 Lebrun Stewart J Microarray-based analysis of rheumatoid arthritis markers
EP1694833B1 (en) 2003-12-02 2009-08-26 Basf Se 2-methyl-6-solanylbenzoquinone methyltransferase as target for herbicides
US20050124017A1 (en) * 2003-12-05 2005-06-09 Stewart Lebrun Quantitative alkaline-phosphatase precipitation reagent and methods for visualization of protein microarrays
EP1700244A4 (en) * 2003-12-12 2009-07-08 Bio Layer Pty Ltd PROCESS FOR THE PREPARATION OF SURFACES
WO2005071079A1 (en) * 2004-01-21 2005-08-04 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Inhibitors of mammalian hdac 11 useful for treating hdac 11 mediated disorders
EP1564556A1 (de) * 2004-02-17 2005-08-17 DST Diagnostic Science & Technology GmbH Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung mehrerer Analyten mit simultaner interner Kontrolle
US8105849B2 (en) 2004-02-27 2012-01-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements
US8101431B2 (en) 2004-02-27 2012-01-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements and reagent delivery systems
EP1773866B1 (en) 2004-07-02 2013-06-19 Bio-Layer Pty Limited Use of metal complexes
US20080206855A1 (en) * 2005-05-06 2008-08-28 Kalypsys, Inc. Automated Compound Screening Using Gel-Permeation Matrix and Pin-Based Sample Transfer
US7629115B2 (en) * 2005-05-13 2009-12-08 Honeywell International Inc. Cell-based platform for high throughput screening
CA2610793A1 (en) 2005-05-31 2007-05-10 Labnow, Inc. Methods and compositions related to determination and use of white blood cell counts
ES2389111T3 (es) 2005-12-02 2012-10-23 Sirtris Pharmaceuticals, Inc. Ensayos de espectrometría de masas para la actividad acetiltransferasa/desacetilasa
AU2006332457A1 (en) * 2005-12-30 2007-07-12 Bio-Layer Pty Limited Binding of molecules
ES2529790T3 (es) 2007-04-13 2015-02-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Métodos de tratamiento de cáncer resistente a agentes terapéuticos de ERBB
WO2008154207A1 (en) * 2007-06-08 2008-12-18 The Burnham Institute For Medical Research Methods and compounds for regulating apoptosis
WO2009134768A1 (en) * 2008-05-01 2009-11-05 Massachusetts Institute Of Technology (Mit) Devices and processes for analyzing nucleic acid damage and repair using electrophoresis
CN104583226B (zh) * 2012-07-25 2018-05-04 生物辐射实验室股份有限公司 通过图案化转移片材的试剂靶向递送
US9447135B2 (en) 2012-12-14 2016-09-20 University Of Kentucky Research Foundation Semi-synthetic mithramycin derivatives with anti-cancer activity
GB201318814D0 (en) * 2013-10-24 2013-12-11 Petroleum & Chemical Corp Microfluidic devices and arrangements for supplying such devices with reagents and biological samples
JP6509230B2 (ja) 2013-12-23 2019-05-08 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 昆虫の一過性受容体電位ｖ（ｔｒｐｖ）チャネルの調節因子を決定する方法
EP3658571A4 (en) 2017-07-27 2021-04-28 University of Southern California OTOPETIN PROTON CHANNELS AS TARGETS FOR PHARMACEUTICAL DISCOVERY

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4447526A (en) * 1981-04-20 1984-05-08 Miles Laboratories, Inc. Homogeneous specific binding assay with carrier matrix incorporating specific binding partner
AR231590A1 (es) * 1981-04-29 1984-12-28 Ciba Geigy Ag Dispositivo de analisis inmunologico y procedimiento para obtenerlo
US4591570A (en) * 1983-02-02 1986-05-27 Centocor, Inc. Matrix of antibody-coated spots for determination of antigens
JP2564181B2 (ja) * 1988-11-24 1996-12-18 コニカ株式会社 特定成分の分析方法
DE4208645A1 (de) * 1992-03-18 1993-09-23 Bayer Ag Optischer festphasenbiosensor auf basis fluoreszenzfarbstoffmarkierter polyionischer schichten
WO1994002515A1 (en) * 1992-07-21 1994-02-03 Bunsen Rush Laboratories Inc. Oligomer library formats and methods relating thereto
CA2130947C (en) * 1993-11-12 2001-02-06 Robert E. Emmons Dry elements, test devices, test kits and methods for chemiluminescent detection of analytes using peroxidase-labeled reagents
US5856083A (en) * 1994-05-06 1999-01-05 Pharmacopeia, Inc. Lawn assay for compounds that affect enzyme activity or bind to target molecules
CA2189634A1 (en) * 1994-05-06 1995-11-16 John J. Baldwin Combinatorial dihydrobenzopyran library
AU2986395A (en) * 1994-07-22 1996-02-22 Zeneca Limited Method for screening compound libraries

Also Published As

Publication number Publication date
SK286095B6 (sk) 2008-03-05
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CA2310684A1 (en) 1999-06-17
ATE336001T1 (de) 2006-09-15

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