CZ20002078A3 - Kontinuální úprava vysoce výkonného screeningu - Google Patents

Description

Kontinuální úprava vysoce výkonného screeningu

Oblast techniky

Kontinuální úprava vysoce výkonného screeningu (CF-HTS), používající nejméně jednu poresní matrici, ve farmaceutickému průmyslu umožňuje, aby se prozkoumávalo veliké množství chemických jedinců na široký rozsah biologické nebo biochemické účinnosti současně. CF-HTS je mimo to užitečný při provádění vícestupňových analytických esejů.

Dosavadní stav techniky

Biochemické a biologické analytické eseje jsou určeny k testování aktivity v širokém rozpětí systémů v rozmezí od protein-protein interakcí, enzymové katalýzy, vazeb malých molekul na proteiny až do buněčných funkcí. Při vysoce výkonném screeningu (HTS) se tyto druhy analytických esejů používají k testování velikého množství chemických jedinců, aby se odhalily dříve neznámé biologické nebo biochemické účinnosti chemických entit.

Homogenní versus heterogenní eseje

Všechny různé druhy biologických esejů mohou být rozděleny do dvou větších tříd: homogenních a heterogenních esejů. Při homogenních esejích jsou všechny reagenty přidávány společně a výsledky ze změří nebo interpretují bez jakékoliv dodatečné manipulace. Na příklad, na petri misce mohou být rostoucí buňky vystaveny chemikálii. Jestliže je chemikálie pro buňky toxická, bude při prostém pozorování indikovat toxicitu vyjasňující se zóna. V jiném příkladě se mohou použít buňky, jež exprimují protein, který mění barvu buněk. V případě buněk exprimujících β-galaktosidasu, rostoucích na agaru obsahujícím x-gal, se buňky více nebo méně zabarvují modře v závislosti na tom, kolik β-gal proteinu je exprimováno. Takto se může provést homogenní esej pro jakýkoliv biologický krok, který ovlivňuje expresi reportér genu tak, jako je gen β-galaktosidasy. Ještě jiný příklad homogenního eseje používá substrát, který mění barvu nebo fluorescenci, když se zpracuje enzymem. Konečně technologie jako Amersham-ovy Scintillation Proximity

0 0 0

0 • · *0 ·*··

Assays (SPA) měří přímo vazbu radiačně značkovaného tigandu na protein nebo jakékoliv ligandové substance fixované na perle obsahující zářič. Všechny z předcházejících příkladů jsou homogenními eseji, protože nevyžadují jiné kroky než přidání reagentů před konečnou detekcí, měřením nebo záznamem signálu.

Na druhé straně heterogenní eseje vyžadují nejméně dva kroky, které nemohou být spojeny do kroku jednoho, protože jsou do určitého stupně inherentně nekompatibilní. Mnohé heterogenní eseje vyžadují na příklad přidávání reagentů podle určitého pořádku (např. když by některé reagenty interferovaly s dřívějšími kroky eseje a jsou však požadovány pro splnění kroků pozdějších). Obecné příklady tohoto druhu zahrnují eseje, při kterých se přidávají reagenty signalisující průběh, aby nepřímo poskytovaly údaj o přítomnosti nebo koncentraci reakčního produktu. Jiný obecný krok při heterogenních esejích je vypírací stupeň. Často musí být v počátcích eseje přidáváván nadbytek činidel pro esej a ten je nezbytné před následujícími kroky vymýt, aby reakce mohly probíhat bez vysokého signálu pozadí. Na příklad u eseje vazby s radiačním ligandem je značkovaný ligand nejprve inkubován s proteinem, který je vázán na pevný povrch, avšak ve skutečnosti se pouze malá frakce ligandu váže na omezený počet vazebných míst proteinu. Po inkubaci se musí vymýt přebytek nesvázaného ligandu předem, aby mohlo být provedeno přesné stanovení vázaného radioaktivního ligandu. Vymytí lze dosáhnout různými alternativními metodami, včetně filtrace, opakovaného promývání a dekantace, oddělování precipitátu a fáze a/nebo centrifugace.

Mnohé biologické a biochemické procesy mohou být zkoumány pouze heterogenními metodami. Dále, navzdory existenci cest pro adaptaci jiných biologických a biochemických procesů na homogenní metody, tyto jiné procesy pracují při heterogenních metodách s efektivnějšími náklady a/nebo se snadněji dostupnými reagenty. Komerčně jsou dostupné různé metody a soupravy pro homogenní techniky jako SPA (Amersham), fluorescenční polarisace (Jolley a jiní) a časově rozkládaná fluorescence (Packard a jiní), aby byly vyjmenovány jen některé. Užití těchto druhů metod vždy vyvolává dodatečné náklady a spotřebu času. Heterogenní metody se pro mnoho esejů více osvědčují a jsou snadnější pro rychlé zavedení. Z tohoto důvodu pokračuje rozšiřování heterogenních metod jako je ELISA, vazba na filtrech, RIA, buněčné eseje s luciferásou atd. Některé z těchto metod budou detailněji popsány níže.

• · ·· ft « ft • ♦ «· «···

Vysoce výkonný screening (HTS)

Pro vyhledávání kandidátů na léčiva se farmaceutický průmysl po léta stále více spoléhal na HTS souborů chemických sloučenin. HTS popisuje metodu, kdy se mnohé jednotlivé sloučeniny testují paralelně tak, že se velký počet testovaných sloučenin prozkoumává na biologickou aktivitu simultánně nebo skoro simultánně. Nejrozšířeněji používané techniky běžně využívají mikrotitrační desky s 96 jamkami. V této úpravě se provádí 96 nezávislých testů současně na jednotlivé 8 cm x 12 cm plastové desce, která obsahuje 96 jamek pro reakci. Typicky vyžadují tyto jamky objemy eseje v rozsahu 50 až 500 μΙ. Vedle desek jsou komerčně dostupné mnohé nástroje, materiály, pipetovače, automatické techniky, myčky desek a odečítače desek vhodné pro 96 jamkovou úpravu pro širokou řadu homogenních a heterogenních esejů.

Až dosud byly snahy zlepšovat HTS soustředěny na zmenšování jamek (miniaturisace). Když je zmenšována velikost jamek, může se zvyšovat počet jamek na každé desce pro uskutečnění více paralelních testů. Dále se snižováním objemů eseje se snižují náklady na reagenty pro testování. Kromě toho, protože je možné paralelně provádět testy s menšími objemy eseje, je také možné současně testovat více sloučenin pro vyhledávání kandidátů na léčiva. Až dosud miniaturisace výrazně zlepšila 96-ti jamkovou technologii poskytnutím úpravy s 384 jamkami (96 x 4). Viz Comley a spol., J. Biomol. Screening, sv. 2(3), str. 171-78 (1997). Ve skutečnosti byly publikovány i úpravy s vyšší hustotou, včetně úpravy s 9 600 jamkami. Miniaturisace má však neodmyslitelné náklady a komplikace.

Tyto náklady a komplikace se přímo vztahují na tři primární součásti miniaturisace screeningové úpravy. Za prvé se musí zvládnout udělání menších nádobek pro testování (trubičky, jamky, důlky atd.). Za druhé se musí zvládnout přesné rozdělování všech pro esej potřebných reagentů do více a menších jamek (zpravidla prováděné pomocí automatických zařízení pro kapaliny, která simultánně rozdělují reagenty do mnoha jamek). Za třetí se musí zvládnout přečtení výsledků testů u souboru s vysokou hustotou.

Za daných požadavků na souběžně prováděné nezávislé eseje, každá složka určuje úkoly a omezení nakolik je miniaturisace vhodná nebo efektivní z hlediska nákladů. Na příklad novější zmenšená úprava může vyžadovat úplně odlišnou metodu rozdělování reagentů, nebo vyžaduje čtecí instrument, který má rozlišení, citlivost a technické provedení, které jsou s novější zmenšenou úpravou kompatibilní.

φ * φ φφφ φ φ • * Φ · · φ · Φφ* Φ 4 · • * Φ ·«·· 4 4 4 4 *Φ ΦΦΦΦ φφ 4Β 4« 44

Když se zredukuje velikost každé jamky, stává se způsobilost vyrobit řadu nádobek, rozdělit reagenty po malých kvantech a přečíst každý vzorek testu, také nesnadnější, časově náročnou a nákladnou. Menší velikost vzorku dále také zvyšuje statistické kolísání od vzorku ke vzorku kvůli nepřesnostem tkvícím v rozdělování malých objemů reagentů a v zaznamenávání slabších signálů vzorku. Kromě toho jakmile velikost vzorku klesne za určitý bod, přispějí k větším nákladům a složitosti realisace novější, miniaturisované úpravy i faktory jako je odpařování a povrchové napětí. Pro zásadní pokrok v HTS technologii si průmysl toužebně přeje možnost esejů s volnou úpravou nebo esejů, u nichž nejsou fysikální bariery mezi vzorky. Ve skutečnosti nikdo nepopsal použití volné úpravy při HTS se standardními kolekcemi oddělených sloučenin předpovídané typicky jako testování malých kapiček v úpravě postrádající jakékoliv jamky.

Kombinatorní screeningové soubory - metody gelové p er m e a ce

S nástupem kombinatorní chemie mohou být na pevných podkladech (obvykle perličkách) produkovány miliony chemických entit. Přestože 96-ti jamková úprava byla použita k prozkoumávání souborů na basi perliček, je tato úprava obecně považována jako neefektivní, protože (1) každá perle nese pouze malá množství chemického jedince; (2) počet sloučenin, které mají být testovány je enorme veliký; a (3) s perličkami se nesnadno manipuluje na mikrotitračních deskách s 96 jamkami.

Aby se vyhnuli problémům vlastním při ^eeningu kombinatorních souborů v úpravě s 96 jamkami, uvádějí někteří použití jednoduchých homogenních esejů, které by mohly být popsány jako volná úprava. Jako příklad byl Jayawickremem a spol. v Proč, Nať! Acad. Sci. (USA), sv, 191, str. 1614-18 (březen 1994) publikován esej používající pigmentové buňky (melanocyty) v jednoduchém homogenním eseji pro kombinatorní peptidovou sbírku. Autoři umístili do petri misek buňky pod agarosu, potom na povrch agarosy umístili perle, které nesly kombinatorní sloučeniny a potom sloučeniny z perel částečně uvolnili. Aktivní sloučeniny byly vidět jako oblasti tmavého pigmentu, protože aktivní sloučeniny způsobily, že buňky měnily barvu, jakmile sloučeniny místně difundovaly do matrice gelu.

Jiným recentním příkladem je práce Daniela Chelsky-ho Strategies for Screening Combinatorial Libraries publikovaná na First Annual Conference of The

Society for Biomolecular Screening ve Filadelfii, PA (listopad 7-10 1995). Chelsky • · Β·· • · «« 4444 • 4 4 * • 4 «4 umístil jednoduchý homogenní enzymový esej pro uhličitou anhydrasu dovnitř agarosového gelu tak, aby enzym v gelu způsobil změnu barvy gelu. Na to pak byly dovnitř gelu umístěny perle nesoucí kombinatorní sloučeniny cestou fotocitlivých spojů a sloučeniny byly částečně uvolněny UV-svétlem. Sloučeniny, které inhibovaly enzym byly zaznamenávány jako místní zóny inhibice vykazující menší změnu barvy. Konečně v Molecular Diversity, sv. 2, str. 57-63 (1966) popisuje Saímon a spol. metodu podobnou metodě Jayawickreme-ho a spol., při níž jsou kombinatorní soubory prozkoumávány na sloučeniny, které mají cytotoxícké účinky na rakovinové buňky rostoucí na agaru.

Všechny tri příklady jsou variace dlouhodobých testů gelových esejů pro antibakteriální nebo protirakovinná činidla a jsou také podobné běžným imunologickým esejům, při kterých se v gelu zjišťují interakce antigen / protilátka. I když tyto gelové permeační eseje byly velmi vhodné pro screening kombinatorních souborů na basi perel, nikdo nepublikoval rozšíření této úpravy na heterogenní eseje nebo na soubory, které nejsou na perlách založeny. Konvenční rozumová úvaha odrazovala výzkumníky od testování vzorků v kontinuální úpravě, která by dovolovala smíchávání vzorků. Mezi omezenými druhy publikovaných esejů a záležitostech, kdy vzorky byly společně zkoumány v kontinuální úpravě, byly analyzovány pouze soubory založené na perlách. Díky těmto omezením, výzkumnicí věřili, že 96-ti jamková úprava byla vhodnější pro heterogenní screening souborů a nikoliv screening založený na perlách. Bylo by žádoucí provádět heterogenní eseje v rámci volné úpravy. Bylo by dále žádoucí testovat individuální sloučeniny v rámci volné úpravy.

Podstata vynálezu

Zde popisovaný vynález, kontinuální úprava vysoce výkonného screeningu (CF-HTS), úspěšně uskutečňuje koncept volné úpravy pro každý homogenní nebo heterogenní esej, který muže být prováděn v 96-ti jamkové úpravě. Vedle toho je CFHTS rovněž užitečný k prozkoumávání kombinatorních souborů pomocí heterogenních esejů a nejen esejů homogenních. Navíc dále se mohou při CF-HTS analyzovat individuální sloučeniny bez nákladů a komplikací, které jsou spojeny s miniaturisací. Obavy týkající se možnosti, že reagenty a výsledky testování budou spolu probíhat společně během následujících kroků se ukázaly jako neopodstatněné.

• ·» « · * « · <

• · ··«·««·« « « » • · · 4 » · · V · 4

-, ·· *··· «· ·· ·· *·

Jedno z provedení vynálezu se týká testování vzorků na biologickou nebo biochemickou aktivitu tím způsobem, že (a) se mnohočetné vzorky pro test předloží do nebo na porésní matrici eseje, která obsahuje případně jednu nebo více složek eseje;

(b) se použije nejméně jedna matrice pro předložení jedné nebo více složek eseje, přičemž matrice může anebo nemusí být porésní esejovou matricí a (c) provede se další stupeň (I) promytí každé v eseji používané matrice pro odstraněni přebytečného množství testovaného vzorku, složky eseje nebo jejich směsi; nebo

I) kontaktu každé v eseji používané matrice s dalším činidlem uvnitř roztoku nebo jako kapalinou.

Jiné provedení se týká testování vzorků na biologickou nebo biochemickou aktivitu předložením testovaných vzorků hromadně do nebo na porésní matrici eseje, která obsahuje případně jednu nebo více složek eseje a použití nejméně dvou dalších matric pro provedení eseje.

Ještě další provedení se týká simultánního testování více než 96 testovaných vzorků na biologickou nebo biochemickou aktivitu předložením více než 96 testovaných vzorků do nebo na porésní matrici eseje, která obsahuje případně jednu nebo více složek eseje a provedení eseje.

Detailní popis vynálezu

Ústřední ideou CF-HTS je umístit testované vzorky do kontextu s porésní matricí. Metoda zahrnuje umístění jedné nebo více složek eseje dovnitř, navrch nebo naspod matrice jako je gel, plastová folie, filtr nebo jiné formy snadno manipulovatelného pevného podkladu. Když se do porésní matrice zavedou vzorky, difundují dostatečně pomalu tak, že eseje je možné provádět, aniž by testované vzorky probíhaly spolu. Takto CF-HTS úprava rozděluje testované vzorky difusí, spíše než neprůchodnou barierou. Jestliže se nechají běžet testy příliš dlouho, budou eventuálně testované vzorky a výsledky probíhat společně. Avšak při pečlivém načasování dovoluje CF-HTS simultánní screening velmi vysoké hustoty sloučenin ještě individuálně, bez potřeby plnit jednotlivé jamky nebo reakční jímky rozpouštědly nebo složkami eseje, K tomu navíc, se v této úpravě mohou manipulací s matricemi, které nesou reakční komponenty, provádět i složité heterogenní eseje. Manipulace s • ··· • « ·· *··· matricemi pro heterogenní eseje je zcela bezprece, dentní a činí CF-HTS ve své

V* schopnosti prozkoumávat široký rozsah biologických a biochemických procesů tak flexibilní jako 96-ti jamkovou úpravu. CF-HTS dosahuje dále druhy výhod předpokládaných pro miniaturisaci bez závažných nevýhod a má jedinečné výhody. CF-HTS využívá širokou řadu matric a komponšt pro eseje. Matrice zahrnují, ale neomezují se jen na gely složené z agarosy, akrylamidu nebo jiných želatinosních materiálů, membrány, filtry a plasty. Matrice mohou být složeny z materiálů včetně, ale nejenom, z polystyrenu, polypropylenu, jiných plastů, papírových vláken, skla, skleněných vláken, křemeliny, polykarbonátu, polyesteru, polyvinylídenchloridu a polyethylenu. Matricemi mohou být impermeabilní tuhé látky, poresní tuhé látky jako filtry nebo gely. Složky esejů zahrnují, ale neomezují se jen na makromolekuly jako nukleové kyseliny, proteiny a jiné syntetické nebo přírodní makromolekuly; buňky, lysáty buněk, biologické extrakty, orgáne ly a jiné složité biologické entity a směsi; a malé molekuly jako pufry, soli, inhibitory, substráty, peptidy, barviva, nukleotidy, kofaktory, ionty a rozpouštědla.

CF-HTS esej je esejem, v němž se mnohočetné testované vzorky nebo sloučeniny rozdělují difusí spíše než neprůchodnou barierou. Kritickou složkou je zavedení vícečetných (více než 1) testovacích vzorků dovnitř nebo na poresní matrici eseje, která případně obsahuje jednu nebo více složek eseje. Poresní matrice eseje, obsahující komponentu(y) pro esej, se připravují přidáváním, míšením, litím, rozmísťováním nebo namáčením komponent eseje do matrice. Poresní matrice se připravují také spojováním, natíráním, vazbou, fixováním, napojením, konjugací nebo přichycováním komponent eseje do vnitřku nebo na povrch matrice. Mimo to se poresní matrice připravuje dále také vytvářením tenkého filmu roztoku nebo kapaliny na buněčném podkladu, enzymu nebo jiné imobilisované složce eseje. Póresní matrice pro esej se používají, aby se kontrolovalo pořadí a/nebo doba přidávání komponent a rozsah míšení a difuse, když se komponenty eseje kombinují. CF-HTS může využívat i matrice neporesní. Neporesní matrice pro esej, se připravují spojováním, natíráním, vázáním, fixováním, napojením, konjugací nebo přichycováním komponent nebo testovaných vzorků do vnitřku nebo na povrch matrice. Použití neporesních matric při CF-HTS fixuje prostorově jednu nebo více složek eseje.

Když se složky eseje zavedou na povrch matrice, jsou komponenty eseje připojeny kovalentně nebo nekovalentně, specifickými nebo nespecifickými • « ·· interakcemi s matricemi, které naJerivatisovány, derivatisovány nebo jinak předem upraveny, aby se připojení složek eseje usnadnilo. Složka eseje je po připojení prostorově fixována, takže je pro účely eseje imobilisována. V tomto případě buď musí být testované vz orky schopny difundovat matricí, aby dosáhly na komponenty eseje a/nebo subkomponenty nebo produkty eseje musí být schopny difundovat matricí, aby dosáhly na testované vzorky.

V jednom nebo některém z více následujících kroků se používá nejméně jedna poresní matrice obsahující vzorky testu.

(1) Uvedení povrchu poresní matrice do kontaktu s nejméně jednou jinou (poresní nebo neporesní) matricí tak, že vzorky a/nebo více složek eseje mohou difundovat přes rozhraní.

(1) Oddělení dvou nebo více matric, aby se zastavila interakce mezi komponentami a/nebo vzorky.

(1) Uvedení povrchu dvou ndbo více poresních matric do kontaktu tak, že mohou složky eseje interagovat.

(1) Promytí, propláchnutí nebo eluování matrice kapalnými pufry nebo jinými rozpouštědly, aby se odstranily nenavázané a/nebo nespecificky vázané složky eseje.

(1) Rozdělování, nalévání, přidávání nebo namáčení složek eseje v roztoku na matrici nebo filtrování řečených komponent skrze matrici.

(1) Zobrazení, přečtení, skenování, detegování nebo jiné zviditelnění radiometrických, fluorescenčních, spektrofotometrických nebo elektromagnetických signálů přítomných na nebo v jedné nebo více matricích.

CF-HTS poskytuje proti dřívějšímu způsobu mnohé výhody. Nepřítomnost oddělených jamek eliminuje nutnost současně a přesně rozdělovat do jamek složky eseje nebo reagenty. Místo toho se složky eseje rozdělují a mísí homogenní manipulací dohromady. Vzhledem k tomu, že složky eseje se připravují pohromadě jako homogenní roztok nebo jako matrice, existuje minimální statistické kolísání od vzorku ke vzorku. Pro srovnání přítomnost jamek v 96-ti jamkové úpravě způsobuje velké statistické kolísání od vzorku ke vzorku.

CF-HTS dále zajišťuje pro veliký počet sloučenin screening s mimořádně vysokou četností. Dokonce i když zaznamenávané zásahy probíhají společné v omezeném rozsahu, je zapotřebí pouze znovu otestovat sloučeniny, které jsou »

• 0 ·· • 9 * * * · 0 00 *9· · 9 « • » · » 0 · · 000*

Q ** 9**0 «> ·> 90 »0 umístěny blízko zásahu. Tak jestliže bylo 10 000 testovaných vzorků schopno zredukovat se na 50 kandidátů v okolí zviditelněné oblasti, je pak snadné zredukovat 50 kandidátů na aktivní sloučeninu(y) / pomocí staré technologie s 96-ti jamkami.

Rozdělením a vysušením jednotlivých sloučenin na plastových foliích ve vysoce naplněných souborech a potom jejich aplikováním v CF-HTS, se odstraní všechny kritické problémy miniaturisace. Tato úprava nevyžaduje pro miniaturisaci inovaci co do plastů nebo jiných materiálů, protože miniaturisace je dosaženo jednoduše omezením množství vzorku, který difunduje do matrice. Tato úprava také nevyžaduje mikrofluidika pro rozdělování činidel pro esej, protože celý esej probíhá v podstatě v jedné obří jamce, kde jsou reagenty a roztoky manipulovány ve velkém množství. Rozdělování pomocí mikrofluidik vyžadují pouze testované vzorky. Vedle toho při této úpravě existuje mnohem méně statistických výkyvů, protože je pouze zapotřebí vyhledat lokalisované zóny heterogenity v jinak homogenní matrici. Nemusí se přečítat a srovnávat mnoho rozdílných jamek. Vedle toho ke všem předpokládaným blahodárným stránkám miniaturisace {náklady, výkon, využití reagentů, využití testovaných sloučenin), poskytuje CF-HTS také překvapující výhody jako je schopnost uskutečnit většinu kroků eseje pohromadě.

Ústředním hlediskem CF-HTS je pozorování, že složky eseje a testované vzorky stranově nedifundují rychle ani na rozhraních mezi matricemi. Když se na příklad agarosový gel umístí na plastovou desku, objeví se výrazná kapalina na rozhraní povrchu gelu. Když se vyžaduje interakce mezi složkou eseje v gelu a složkou eseje na desce (jako v příkladu ELISA), je kritické, že komponenta v gelu je schopna difundovat z gelu ven a na desku. Avšak CF-HTS vyžaduje, aby průvodní stranová difuse byla značně pomalejší, takže interakce na desce je lokalisována do blízkosti původního umístění složky z gelu. Tytéž principy se týkají každého rozhraní matrice-matrice mezi gely, filtry nebo povrchy (nebo každé jiné matrice) v jakékoliv kombinaci. Představa, že toto difusni chování je kontrolovatelné, a že je obecně aplikovatelné na rozhraní všech matric, je bezprecedentní a protichůdná konvenčním představám.

Preferovanou metodou zavádění testovaných vzorků nebo sloučenin do matrice (jako gelu nebo navlhčeného filtru) je rozmísťování a sušení malých objemů každého vzorku na povrchu, jako je povrch plastové folie, v takovém uspořádání, že se dva vzorky nemohou smísit nebo překrývat a každý je specificky umístěn. Když se « 9 * · ♦· » · plastová folie umístí na matricí, vzorky se rozpustí a difundují do matrice v místech odpovídajících jejich předem definovaným umístěním v počátečním uspořádání.

Alternativním způsobem rozdělování testovaných vzorků nebo sloučenin do souboru je rozmísťovat vzorky na poresní matrici jako filtr, kde objem každého odděleného vzorku je dostatečně nízký, takže vzorky se uvnitř matrice nepřekrývají. Po kontaktu s jinou poraní matricí, která obsahuje více kapaliny, sloučeniny difundují, aby nastartovaly esej.

Preferovanou metodou zavádění kombinatorních sloučenin na basi perel do matrice je rozmisťování perel náhodně nebo v pravidelném uspořádání na povrch jako je povrch plastové folie. Perle mohou být potom zpracovány tak, aby uvolnily (odštěpily) testované sloučeniny, pokud jsou na perly vázány kovalentně labilním spojem (v praxi je dobře známé fotolytické štěpení a štěpení kyselinou v plynné fázi). Každá sloučenina je pak nekovalentně spojena s oblastí obsazenou její původní perlou a suché sloučeniny pak mohou být zavedeny dovnitř nebo na povrch matrice.

Alternativním způsobem pro zavedení jednotlivých sloučenin do matrice je namáčení nebo jiný způsob nekovalentního připojení každé sloučeniny do nebo na perly. Při použití tohoto způsobu může být velké množství sloučenin najednou smíseno dohromady s perlami tak, že každá perle má na sobě stále jedinou komponentu. Potom může být směs perel snadno rozprostřena na povrch pro zavedení do matrice. Tento postup zcela eliminuje nutnost manipulace s malým objemem kapaliny.

Když počáteční soubor vzorků zavedených do matrice při CF-HTS zkoumání má vysokou hustotu, takže jednotlivé zóny aktivity prostorově pokrývají počáteční umístění více než jednoho vzorku, potom je kažilý z těchto vzorků potenciálním zdrojem pozorované aktivity. Při vyšších počátečních hustotách, podle rozmanitosti sloučenin, které budou v jednotlivých zónách přítomny, bude více sloučenin kandidáty pro každou zónu. Sloučeniny mohou navzájem difundovat, avšak budou mít stále svůj vlastní prostorový gradient a nebudou se kvantitativně mísit v žádném místě. Proto střed zóny bude stále korelovat s přesným umístěním aktivní komponenty v počátečním souboru. V praxi jsou dosti vzácné zásahy, že je běžné opakované testování mnoha vzorků, aby se zaručila identifikace aktivních sloučenin pro každou aktivní zónu.

Alternativním provedením vynálezu je zavedení fysikální bariery (tedy v přísném slova smyslu provedení nekontinuální úpravy) do matric esejů, aby se « «

.......... «· ·· omezila vzdálenost, po kterou by mohly vzorky difundovat. Na příklad každý ze dvou gelů obsahujících enzym respektive substrát může být pokrájen pletivem (kráječ sušenek) tak, že každý gel je dále rozčleněn na mnoho oddělených poloh. Potom se ještě uvedou oba gely do kontaktu tak, aby substrát a enzym mohly spolu difundovat dovnitř každého rozčleněného kousku gelu. Potom se do každého rozčleněného kousku gelu zavedou vzorky tak, aby eseje mohly probíhat zcela nezávisle bez difuse mezi eseji. Toto provedení efektivně eliminuje některé z výhod CF-HTS tím, že zanáší statistické odchylky mezi testovanými vzorky a fixuje objem, a tudíž omezuje signál u souborů o vysoké hustotě. Ale toto provedení bude ještě sklízet dobrodiní heterogenního eseje založeného na matrici, při němž komponenty eseje nepotřebují být rozdělovány do velikého množství paralelních reakčních nádobek a eliminuje částečné míšení vzorků.

g ELISA

Enzymem spojované imunosorpční eseje (ELISA) jsou heterogenní eseje, které detegují vazbu mezi ligandy v roztoku a i mobi lisovaným i receptory. ELISA vyžaduje mnoho kroků míšení reagentů a vypírání, které jsou nesnadno proveditelné v 96-tí jamkové úpravě a je možné představit si i větší nesnáz, když se jamky redukují z 96-ti jamkové úpravy na 384-jamkovou úpravu. Autoři vynálezu aplikovali CF-HTS metodu pro detekci inhibice vazby mezi ligandy a imobilisovanými cílovými receptory (gELISA).

Receptorem je každá molekula, která může vázat jinou molekulu. Neomezujícími příklady jsou proteiny, peptidy, nukleové kyseliny, sacharidy a komplexy předchozích příkladů. Receptor je imobilisován na jedné z několika matric (receptorová matrice) včetně, neomezující se však jen na plastové povrchy [např. petri miska nebo plastová deska (Nunc)j, membrány nebo filtry, které mají vysokou cílovou vazebnou kapacitu [např. nitrocelulosa, nylon nebo PVDF (Milpore, Corning Costar, Schleicher & Schuell, BioRad) nebo derivatisované membrány jako SAM membrány (Promega)]. Poresní ligandová matrice (např. agarosový gel nebo poresní membrána) se připraví tak, že se ligand pro ímobilisovaný receptor rozdělí dovnitř nebo na matrice. Testované sloučeniny nebo vzorky se rozmísťují přímo na ligandovou matrici nebo alternativně na nebo dovnitř matrice pro testované vzorky [např. polystyren (Tekra)j, polyvinyliden (např. od Dow Brands) nebo jiné flexibilní * · • · plastové folie nebo membrány. Testovaná matrice se uvede do styku s ligandovou matricí a vzorky se nechají difundovat do ligandové matrice. Po vhodné inkubační periodě se ligandová matrice uvede do kontaktu s receptorovou matricí a umožňuje se, aby ligand a vzorky přišly do kontaktu a potenciálně difusí reagovaly s receptorem (obrázek 1 ukazuje vazbu imobilisovaného receptoru R na biotinylisovaný ligand Ι_β). Během inkubace se budou ligandy vázat na inwbilisovaný receptor pokud sloučenina vzorku neinhibuje vazbu ligand / receptor.

Po příslušné inkubační periodě se receptorová matrice odstraní a promyje vhodným pufrem, aby se odstranil nenavázaný nebo nespecificky vázaný ligand a vzorky. Receptorová matrice se potom namočí v roztoku obsahujícím reagenty eseje, které budou interagovat s ligandem (např. antilátka, avidin nebo streptavidin v případě biotinylisovaného ligandu) a schopnými být detegovány bud přímo (např. fluorescencí nebo radioaktivitou) nebo nepřímo (např. peroxidasou křenu (HRP), alkalickou fosfatasou (AP) nebo konjugátem β-galaktosidasyj. (Obrázek 2 ukazuje konjugát avidin-HRP, AHRP, připojený na biotinylisované ligandy). Po příslušné inkubační periodě se receptorová matrice odstraní z roztoku a promyje se vhodným pufrem, aby se odstranil nenavázaný nebo nespecificky vázaný reagent. V případě přímé detekce signálu se matrice zobrazí za použití vhodné metody (např, fotometrickými skenery, CCD kamerami, filmem, vyvolávači fosforescence nebo přístroji pro detekci scintilace). Nepřímé signály (např. HRP nebo AP) vyžadují dodatečnou reakci pro vyvinutí signálu, dosahovanou rozdělením substrátů nebo jiných nezbytných reakčních komponent do nebo na poresní substrátovou matrici a umístění této matrice do kontaktu s matricí receptoru. Enzym (např. HRP nebo AP) pak reaguje se substrátem. (Obrázek 3). Alternativně se precipitující substrát zavede do roztoku namísto do matrice. Při každé zobrazovací metodě oblasti vazby ligand / receptor budou vytvářet viditelnou reakci, poněvadž oblasti, v nichž byla vazba ligand / receptor inhibována viditelnou reakci vytvářet nebude.

Vazba buňka / ligand

CF-HTS může být rovněž užíván pro detegováni inhibice vazby ligand / buněčný receptor. Při tradičním eseji se kombinuje testovaná sloučenina, radiačně značkované ligandy a buňky, které exprimují odpovídající receptor v nádobce jako je jamka. Potom se poskytne dostatečná doba, aby se dovolilo receptoru vázat se na ligand, pokud nebyla taková vazba inhibována testovanými sloučeninami. Jakékoliv z

- v v V W · « · · · »· · · I 4 · * · · · · · * « · · v , _Λ · · * V · · t » » · « ·· ···· «· ·· «· «« nenavázaných nebo nespecificky vázaných komponent jsou z buněk odstraněny a měří se množství radioaktivity připadající na buňky. Autoři vynálezu přizpůsobili CFHTS metodu pro detekci inhibice vazby ligandů na buňky. Buňky exprimující žádaný receptor jsou pěstovány nebo navrstveny na matrici (buňková matrice) jako jsou, ale neomezuje se to jen na ně, gely, filtry nebo membrány [např. Trar^ell membrány tkáňových kultur (Corning Costar) nebo chemotaxní membrány (Neuroprobe)]. Poresní matrice (např. agarosový gel nebo poresní membrána) se připraví tak, že se značkovaný ligand pro receptor rozdělí na nebo do matrice (matrice s ligandem). Testované sloučeniny se rozdělí přímo na ligandovou nebo buňkovou matrici nebo alternativně na nebo do jiné matrice [např. polystyren (Tekra), polyvinyliden nebo jinou plastovou folii nebo membránu; membrána se vzorky]. Membrána se vzorky se uvede do kontaktu s ligandovou matricí a takto se umožní vzorku difundovat dovnitř ligandové matrice. Po příslušné inkubační periodě se ligandová matrice uvede do kontaktu s buňkovou matricí, nejlépe na straně matrice bez buněk a umožní se, aby docházelo ke styku ligandu a vzorku a difusí k reakci s receptorem (Obrázek 4). Během inkubace se budou značkované ligandy vázat na imobilisované buňky pokud vzorek neinhibuje vazbu ligand / buňka.

Po inkubaci se buňková matrice oddělí od ligandové matrice a promyje se vhodným pufrem, aby se odstranil nenavázaný nebo nespecificky vázaný ligand a vzorek. Buňková matrice se zobrazí za použití vhodné metody (např. fotometrickými skenery, CCD kamerami, filmem, fosforografy nebo přístroji pro detekci scintilace). (Obrázek 5 ilustruje vyvolání eseje na film).

Jak je shora ukázáno CF-HTS dosahuje všech výhod předpokládaných pro eseje s volnou úpravou a může být aplikován pro všechny různé druhy biologických nebo biochemických esejů, při všech různých typech úprav a se všemi různými reagenty a zařízeními. Vzhledem k široké aplikovatelnosti je nejlépe ilustrován pomocí následujících příkladů. Avšak tyto příklady ilustrují preferovaná provedení předkládaného vynálezu a neomezují patentové nároky a specifikace. Běžný pracovník si snadno uvědomuje, že změny a modifikace specifických provedení mohou být provedeny bez odchýlení se od rozsahu a ducha vynálezu. Na všechny citace se zde nakonec odkazuje.

Přehled obrázků na výkresech « · « 4 • · • 9 9999 • · · · * 9 9 9 9

9·· · 9 9 · *· ·· «· 99

Obrázek 1 ukazuje vzorky gELISA testu na neporesní matricí stýkající se s jednou stranou poresní gelové matrice obsahující reagent eseje, která naopak se stýká s neporesv matricí nesoucí další reagent eseje.

Obrázek 2 ukazuje odstranění matrice vzorků gELISA testu a poresní gelovou matrici, následované promytím a přidáním kapalných reagentů nebo roztoků reagentů pro vytvoření reportního komplexu na neporesní matrici reagentů.

Obrázek 3 ukazuje představu gELISA eseje spojením matrice s reportním komplexem s poresní gelovou matricí obsahující reportní substrát.

Obrázek 4 ukazuje jak je ligandová matrice aplikována na povrch filtru protilehlý tomu povrchu filtru, který nese buňky.

Obrázek 5 ukazuje co se může vytvořit na povrchu filtru nesoucího buňky, když se projeví esej.

Obrázek 6 ukazuje výsledek VanA eseje za použití různých koncentrací známého, na dávce závisejícího inhibitoru.

Obrázek 7 ukazuje výsledek EF-3 eseje za použití různých koncentrací známého inhibitoru.

Obrázek 8 ukazuje kontrolní experiment gELISA eseje pro interakci proteinprotein.

Obrázek 9 ukazuje gELISA výsledek inhibice pro interakci protein-protein.

Obrázek 10 ukazuje na dávce závisející vazbu radiačně značkované ITAM na imobi lisovaném LCK.

Obrázek 11 mapuje hodnoty pixelů proti ITAM koncentraci pro znázornění typické vazebné křivky vazby ligandu.

Obrázek 12 ukazuje kontrolní experiment pro interakci ligand-buňka u radiačně značeného IL-8.

Obrázek 13 ukazuje inhibici interakce ligandu IL-8 s buňkou.

Obrázek 14 ukazuje esej pro inhibitory neuraminidasy.

Obrázek 15 ukazuje simultánní esej 10 080 jednotlivých sloučenin na inhibici neuraminidasy.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 • «

Kolorimetrický dvoustupňový gelový esej pro stanovení fosfátu generovaného resistentním vankomycin enzymem Van A

VanA je klíčovým enzymem při vankomycinové resistenci a katalysuje připojení D-alaninu k D-alaninu nebo D-alaninu k D-laktátu. Tento enzym se obvykle analysuje vyvoláváním barvy z fosfátu, který se uvolňuje, když je enzym aktivní (aktivita VanA způsobuje hydrolýzu ATP na ADP a fosfát). Vědcům je známo, že Dcykloserin inhibuje VanA způsobem závisejícím na dávce, a že se tento inhibitor používá jako positivní kontrola proti jiným potencionálním inhibitorům.

Gel s enzymem

Gel s enzymem byl připraven přidáním enzymu VanA k roztavené 1 % agarose (vysokotající agarosa Gibco BRL) při 45°C v 50 mM HEPES (kyselina N-[2hydroxyethyl]piperazin-N’-[2-ethansulfonová]}, 20 mM MgCh, 20 mM KCI, pH 7,3 do konečné koncentrace VanA 2 μΜ. Tato agarová směs byla potom nalita do BioRad aparátu pro formování gelu a při 2-8°C ponechána 30 minut ztuhnout.

Gel se substátem

Gel se substrátem byl připraven přidáním ATP, D-alaninu a D-laktátu k roztavené agarose tak, aby jednotlivé z komponent měly 1mM, 1,5 mM respektive 1,75 mM a připravením gelu jak bylo popsáno pro gel s enzymem.

Matrice se vzorkem

Řady 1 μΙ alikvotních podílů serie ředění 5000, 2000,1000, 500, 200, 100 μΜ D-cykloserinu, známého inhibitoru použitého jako kontrolní vzorek, v 1 : 1 směsi ethanolu a vody, byly rozdíleny na kousek polyvinylidenchloridového (PVDC) filmu a 10 minut ponechány k usušení.

Inkubace enzymu se substrátem v přítomnosti inhibitoru

Gel s enzymem byl na 5 minut uveden do styku s matricí vzorku. Potom byl navrch gelu enzymem umístěn gel se substrátem a ponechán k inkubaci po 15-20 minut. Poté byly oba gely odstraněny odděleny. Má se za to, že se během inkubace, v » * • · · « · · ·· • · · ·

A · · • · · · • · ♦ « « « • » · · · ·· ·» kdy enzym katalysuje spojení substrátů, vytvoří fosfát v celém gelu s výjimkou těch zón, v nichž byl D-cykloserin v dostatečné koncentraci, aby inhiboval reakci.

Visual isace eseje

Na gely s enzymem a substrátem byla nalita a stejnoměrně rozdělena směs pro detekci fosfátu sestávající z čerstvě připravené ho roztoku 0,15 % Malachitové zeleně a 1,4 % molybdenanu amonného v 1,33 N HCI. Tato činidla reagují s fosfátem a jako funkci zvyšujících se koncentrací fosfátu vyvolávají stoupající měrou tmavnoucí odstíny zelené. Zbarvení se nechalo vyvolávat po 5-10 minut (Obrázek 6 ukazuje vývoj zbarvení gelu, když se množství inhibitoru měnilo od 5 nanomol do 0,5 nanomol). Zeleně zbarvené gely byly fotografovány CCD kamerou StratageneEagle Eye. Stupeň, při němž inhibované zóny byly méně zelené, koreloval podle očekávání s koncentrací přidaného inhibitoru. Proto může být tento esej použit pro zkoumání inhibitorů VanA při řazení kombinatorních perel nebo sloučenin rozdělovaných na jakýkoliv jiný povrch, který je potom uveden do styku s gelem eseje.

Tento esej také ukazuje, že úpravu gelového screeningu lze přizpůsobit vícestupňovým reakcím. Takové provedení je potřebné, aby tato úprava byla užitelná pro širokou radu esejů, protože mnoho esejů více stupňů vyžaduje. V tomto případě VanA esej je dvoustupňovým esejem enzymové aktivity následovaným vyvoláním zbarvení. Homogenní (jednotlivý stupeň) verse tohoto eseje nejsou snadno proveditelné, protože zbarvení vyvolávající reagenty a podmínky interferují s aktivitou VanA a jsou tudíž inkompatibilní s jejich dodáváním do agarového gelu. Proto je tedy žádoucí prostorové a časové oddělení těchto dvou stupňů, obsahující nejprve esej gelu s enzymem, následovaný vyvoláním zbarvení ve fázi roztoku.

Příklad 2

Dvoustupňový esej detekce fosfátu generovaného S. cerevisiae. Elongační faktor aktivity 3 ATPasy stimulovaná vazbou ribosomú

Když s ribosomy interaguje fungální elongační faktor 3 (EF-3) stimuluje se aktivita fosfatasy. Autoři vynálezu aplikovali pro tuto aktivitu CF-HTS. Byl připraven gel s enzymem obsahující EF-3 ( vysoce teplotně citlivý enzym) a kvasinkové • · · • · · • · ί··* • · · · 4 ♦ · ·· ···· ·« *4 • · 4 ·· ribosomy v pufru EF-3 eseje. Připraven byl také gel substrátu obsahující 1 mM ATP v pufru eseje. Oba gely obsahovaly 2 % dimethylsulfoxidu v nízkotající agarose (Gibco BRL) a byly připraveny při 37°C a ponechány 30 minut stát při 4°C. Na PVDC film byly natečkovány a vysušeny (matrice se vzorkem) serie ředěni poly-L-lysinu, inhibitoru EF-3 použitého jako kontrolního vzorku. Potom po předcházející inkubaci gelu enzymu s inhibitory na matrici vzorku, byl jako v příkladě 1 proveden esej. Potom byl gel s enzymem na 20 minut umístěn do styku s gelem se substrátem. Jako v příkladu 1 byly gely s enzymem a substrátem obarvovány barvu vyvolávající směsí Malachitové zeleně s molybdenanem amonným. Gel s enzymem byl potom zobrazen CCD kamerou. Skvrny inhibitoru se objevují jako světlejší zóny v zeleném pozadí. Obrázek 7 ukazuje vývoj zbarvení na gelu, kde se množství inhibitoru měnilo od 5 pikomol do 200 pikomol. Výsledky ukazují na dávce závisející signál inhibitoru, indikující, že při tomto eseji mohou být prozkoumávány sloučeniny, aby se odhalily nové EF-3 inhibitory. Příklad 2 demoSstruje užitečnost CF-HTS spolu s komplikovaností způsobenou přítomností organel nebo jiných surových biologických směsí nebo extraktů.

Příklad 3

Nepřímá gELISA detekce zbarvení inhibitorů interakce protein - protein

Jak bylo diskutováno shora, je ELISA obvykle používán k detekci inhibice ligand - receptor, kdy jsou receptory imobilisovány v mikrotitračních jamkách. Páry ligand - receptor užívané při ELISA mohou obsahovat každý pár vázajících se molekul od proteinů nebo jiných makromolekul až do malých molekul. Tyto eseje jsou komplexními, vícestupňovými eseji, jež vyžadují imobilisování receptoru, inkubování receptoru s ligandem, promytí k odstranění nechtěného nespecificky zadržovaného ligandu, který by jinak mohl způsobovat vysoký signál pozadí, vázání zviditelňujících činidel (např. specifické protilátky ligandu konjugované s reportním enzymem) na ligand vázaný k receptoru a generování viditelného signálu poskytnutím substrátu pro reportní enzym. Je zřejmé, že komplexnost ELISA vedla HTS průmysl k závěru, že ELISA nemůže být adaptován pro eseje s volnou úpravou. Přesto však autoři vynálezu adaptovali tento komplexní, vícestupňový esej na CF-HTS úpravu pro analýzu různých interakcí protein - protein, protein - ligand a vazeb jiných ligandu.

·· ····

Aktivátor plasminogenu urokinasového typu (uPA) se váže na jemu odpovídající receptor (uPAR). Interakce uPA / uPAR byla prokázána při metastázi různých typů rakoviny. Autoři vynálezu adaptovali tradiční uPA / uPAR ELISA na CFHTS za použití vyčištěných receptorů a ligandů.

Matrice uPAR

Plastové desky (7,5 cm x 11,5 cm od Nunc, lne. Naperville, IL) byly přes noc pokryty 15 ml 118 nM vyčištěného uPAR ve fosfátem pufrované solance (PBS) (Life Technologies, Grand Island, NY) při pH 7,4 a 4°C. Po pokrytí plastových desek přes noc byl roztok uPAR dekantován a zbylá vazebná místa na plastové desce byla blokována přidáním 15 ml PBS, obsahujícími 1 % (hm./obj.) kaseinu a inkubována 2 hodiny při teplotě místnosti (RT). Po blokování byl blokační roztok dekantován a plastová deska byla pětkrát promyta 20 ml pracího pufru sestávajícího z 0,05 % Tween 20 (monolaurát polyoxyethensorbitanu) v PBS. Po promytí byla plastová deska sušena 10 minut při RT. Bylo to načasováno tak, že krátce na to mohla být plastová deska použita v eseji popsaném níže, aby se zabránilo přeschnutí matrice, které by mohlo vést ke ztrátě aktivity.

Matrice β-uPA

Pro účely eseje byla používaná uPA označena biotinem (β-uPA). Gely obsahující β-uPA byly připraveny namáčením β-uPA do agaru kvůli vyhnutí se vysokým teplotám (což je opakem lití do roztaveného agaru z příkladů 1 a 2). Agar byl připraven nejprve míšením 0,1 g agarosy (Sigma, St. Louis, MO) s 10 ml PBS, zahřátím dokud neroztála a potom odlitím do přístroje pro gel 8 x 7 x 0,075 cm³ (BioRad, Hercules, CA). Po ztuhnutí (buď při pokojové teplotě nebo 4°C) byly gely při 4°C přes noc namočeny do 15 ml β-uPA (kolem 10nM) v pufru eseje sestávajícím z PBS, 0,05 % Tween-20 a 0,1 % kaseinu (obojí od Sigma, St. Louis, MO). Rovnou před použitím byl gel 20 minut sušen při RT.

Matrice se vzorkem

Jako kontrolní vzorek inhibitoru β-uPA / uPAR vazby byl za nepřítomnosti známého inhibitoru vazby uPA / uPAR o malé molekule, použit nebiotinylovaný uPA (Pro-uPA). Pěti mikrolitrové alikvotní podíly 0, 0,03, 0,1, 0,3, 1 a 3 μΜ pro-uPA v • · «· 9··· « · · ·· ·* *· ·· pufru eseje byly rozmístěny na PVDC film (Dowbrands L. P., Indianopolis, IN) a 2 h sušeny při RT.

Inkubace uPAR s pro-uPA a β-uPA

Matrice se vzorkem byla umístěna na jednu stranu gelu obsahujícího β-uPA se suchými tečkami pro-uPA do styku s povrchem gelu s β-uPA. 10 minut bylo při RT ponecháno, aby pro-uPA do gelu difundoval. Na to potom druhá strana gelu s β-uPA byla umístěna do plastové desky, aby se β-uPA (působící jako ligand) a pro-uPA (působící jako kompetitivní inhibitor) nechaly interagovat s uPAR na povrchu plastové desky. Vazba / kompetitivní reakce byly inkubovány při RT po 20 minut. Po inkubaci byla plastová deska oddělena od gelu a rychle 4 krát promyta 20 ml vypiracího pufru. Roztek konjugátu avidiH-^duXjuctoci kichu ξάνΐϋιιi-nrír') uyi připraven rozředěním avidin-HRP (Sigma, St. Louis, MO) 1 až 25.000 v pufru eseje a přidáním 15 ml k plastové desce. Reakce byla 10 minut inkubována při RT s následujícím dekantováním roztoku avidin-HRP a promytím plastové desky jako nahoře. Plastová deska byla 20 minut sušena.

Avidin se v avidin-HRP váže na biotin specificky tak, že pouze ty oblasti matrice, kde se projeví vazba ligand / receptor, budou eventuálně vykazovat vývoj zbarvení. Ty oblasti matrice, kde je vazba ligand / receptor kompetitivně inhibována účinkem pro-uPA, zbarvení vykazovat nebudou.

Vyvolání zbarvení

Gel pro vyvolání zbarvení obsahující kolorimetrický HRP substrát (OPD gel) byl připraven rozpuštěním dvou tablet hydrochloridu o-fenylendiaminu (OPD) v 7 ml rozpouštědla (oboje z Abbott kit no.6172-30, Abbott Labs., Abbott Park, IL) a spojením tohoto roztoku s roztokem agarosy získaném roztavením 0,1 agarosy v 1 ml vody. 10 ml vzniklé směsí bylo odlito do miniprotein II přístroje pro gel 8 x 7 x 0,075 cm a 15 minut při 4°C ponecháno ztuhnout. Gel byl ze skleněných desek odlévacího stojánku přenesen na PVDC film nebo flexibilní plastovou folii a při RT byl 10 minut ponechán sušit se na vzduchu. Potom byl přenesen na jiný PVDC film nebo flexibilní plastovou folii, aby se 10 minut ponechala sušit druhá strana. Potom byl OPD gel umístěn na plastovou desku k zahájení vývoje zbarvení. Během inkubace OPD, v různých časech, byla plastová deska umístěna navrch filtru propouštějícího

- «V · • · · ♦ • · · · • * · * ·· ·· * ··· « · · « · · ·· »» • · · • fr · · • « v ·· »··· pás 440 nm (Omega Optical, lne., Brattleboro, VT), který střídavě byl navrchu difusní desky s optickými vlákny osvětlované světelným zdrojem Fiber-Lite (oboje od DolanJenner Industries, lne., Lawrence, MA). Vznikající obrázky byly získány CCD kamerou (systém Eagle Eye, Stratagene, La Jolla CA).

Kontrolní pokus

Obrázek 8 ukazuje kontrolní pokus pro příklad 3. V obrázku 8A byly čtverečky agarosy (1 cm²) namočeny do roztoků s různými β-uPA koncentracemi, jak je naznačeno pod každým čtverečkem (s výjimkou 50 nM roztoku, který je označen nalevo od čtverečku agarosy). Poté, když byly čtverečky agarosy inkubovány na plastové desce s imobilisovaným uPAR, byly odstraněny. Plastová deska byla potom omyta a oblasti matrice, kde došlo k β-uPA / uPAR vazbě byly Zviditelněny jak j« shora popsáno. Obrázek 8B ukazuje křivku průměrných hodnot pixelů (bez pozadí) pro každý čtvereček (jak bylo určeno analýzou digitálního obrázku z digitální kamery pomocí software NIH Image Analysis) proti koncentraci β-uPA v každém čtverečku agarosy v různém čase během vyvíjení zbarvení OPD. β-uPA získané z agarosového gelu vykázaly typickou vazebnou křivku receptor - ligand s půlmaximem vazby (Kd) kolem 3-5 nM, což je konsistentní s publikovanými hodnotami pro tuto reakci při standardní ELISA a jiných esejích, které tento parametr měří. Obrázek 8 ukazuje, že nepřímý kolorimetrický signál generovaný při gELISA je kvantitativně závislý na rozsahu interakce ligand-receptor.

Výsledky kompetice pro-u P A Ζβ-u P A

Obrázek 9 ukazuje inhibici β-uPA / uPAR vazby pomocí pro-uPA. Skvrny v obrázku 9A vyznačují oblasti, kde byla inhtbována β-uPA / uPAR vazba. Tudíž se v těchto oblastech avidin- HRP nevázal. V důsledku toho HRP se substráty v OPD gelu na generování vývoje zbarvení nereagoval. Obrázek 9B je alternativní cestou zobrazení dat téhož CCD obrázku, která zvyšuje schopnost lidského oka vidět kvantitativní titraci.

Příklad 4

Přímá radiometrická detekce inhibitorů interakce protein - protein

Aktivace T-buněk je součástí imunitní odezvy těla. Aby nastaly během aktivace T-buněk případy v tomto směru, musí p56lck (LCK protein) interagovat s ITAM oblastí (s ímunoglobulinem související aktivační jednotka na bázi tyrosinu) cytoplasmových domén receptoru antigenu T-buněk. Sloučeniny, které inhibují tuto interakci protein - protein jsou potenciálními imunosupresivy. Autoři vynálezu použili CF-HTS pro analýzu této interakce protein - protein, při níž je LCK imobilisován na membráně.

LCK matrice

Biotinylovaný LCK se imobilísuje na biotin zadržující membráně (SAM membrána) (Promega Corp _; Madison, wi) přelitím proužku 11 cm x 2 cm 5 m! 3 μΜ LCK v PBS obsahujícím 5 mM DTT (dithiothreitol) na 10 minut při RT, po čemž se pufr odstraní. Je to načasováno tak, aby SAM membrána mohla být v níže popsaném eseji použita krátce na to (během minut).

ITAM* matrice

Agarosový gel obsahující radiačně značený ITAM peptid (ITAM*) se připraví smísením 0,1 g agarosy s 10 ml pufru, zahříváním dokud nedojde k roztavení a potom odlitím do přístroje pro gel 8 x 7 x 0,075 cm. ITAM* se do finální koncentrace 10 nM přidává právě před odléváním nebo alternativně namáčením po ztuhnutí gelu.

Matrice se vzorky

Vzorky, které mají být podrobeny screeningu se rozdělí na plastový povrch nebo PVDC a vysuší, aby vznikla matrice se vzorky.

Inkubace a visualisacelTAM*, LCK a testovaných vzorků

Matrice se vzorky se uvede do styku s jednou stranou gelu s ITAM* tak, že testované vzorky mohou difundovat do gelu s ITAM*. Na to se druhá strana gelu s ITAM* uvede do styku se SAM membránou, na které byl imobilisován LCK. Po 15 45 minutové inkubaci se SAM membrána odstraní, promyje a zobrazí fosforografem nebo filmem. Inhibitory interakce ITAM - LCK jsou indikovány zónami nižší radioaktivity, což na zobrazení odpovídá nižší intensitě signálů.

Kontrolní pokus pro vazbu ITAM*/LCK

Agarosové gely se připraví smísením 0,1 g agarosy s 10 ml pufru, zahříváním dokud nedojde k roztavení a potom odlitím do přístroje pro gel 8 x 7 x 0,075 cm. Po ztuhnutí se z gelu vypíchají kolečka o průměru 1 cm a pres noc se při 4°C namočí do 400 μΙ pufru s 0,1, 0,3, 1,3, 10 a 20 nM ITAM značkovaným s ¹²⁵l (Amersham, Arlington Heights, IL). Gelová kolečka se potom z roztoku vyjmou a ponechají po 20 minut při RT k usušení. Potom se umístí na LCK - imobilisovanou SAM membránu a inkubuje 45 minut při RT. Gely se odstraní a membrány se čtyřikrát promyjí pufrem. Po vysušení se SAM membrány zobrazí pomocí fosforografu.

Obrázek 10 naznačuje na dávce závisející vazbu mezi ¹²⁵l - ITAM a imobilisovaným LCK na SAM membráně.

Obrázek 11 ukazuje diagram průměrných hodnot pixelů {bez pozadí) pro každý ¹²⁵l ITAM gel (jak bylo stanoveno analýzou digitalisovaného obrazu z fosforografu pomocí software ImageQuant od Molecular Dynamics) proti ¹²⁵l - ITAM koncentraci v gelovém kolečku. ¹²⁵l - ITAM poskytnutý z gelu do imobilisovaného LCK vykázal typickou vazebnou křivku receptor - ligand.

Příklad 5

Esej reportního genu celých buněk za použití úpravy gel / filtr

Ledvinové buňky, známé jako HEK buňky, byly transfikovány plasmidem, který obsahuje promotor základní složky cyklické AMP odezvy (CREB). spojený s genem luciferasy (reportní gen luciferasy od Promega). Když jsou transfikované buňky podrobeny působení forskolinu, indukuje se exprese reportního genu luciferasy. Potom pak, když se k HEK buňkám přidá biologický pufr, obsahující substrát luciferasy (hmyzí luciferin od Promega) a vhodné kofaktory (20 mM Tricinu pH 7,8, 0,1 mM EDTA, 33 mM koenzymu A, 0,5 mM adenosin trifosfátu a 1 mM MgCb), generuje se emise fotonů, která může být pomocí běžné instrumentace detegována.

Matrice s buňkami

Buňky byly v kultuře podrobeny působení trypsinu, přeneseny do Corning / Costar TRANSWELL™ membrány (3 mikronový polykarbonátový filtr s plastovou • 9

999

9 9

9 9 » 9 9 · · · ♦ · * 9 « « · • 9 MO ·· 99 • k • 9 • 9 ·

prsténcovou podložkou) a přes noc inkubovány při 37°C, 5 % C0₂ v přítomnosti media pro kultivaci tkáně. Potom bylo medium z membrány odstraněno a filtr, k němuž byly buňky přichyceny, byl 15 minut na vzduchu sušen a krátce potom použit v níže uvedených krocích.

Matrice s vyvolávačem

Gel obsahující vyvolávač exprese luciferásy se připraví přidáním 12 μ( 10 mM výtažku forskolinu (Sigma, výtažek v ethanolu) do 6 ml 1 % nízkotajícího agarosového gelu. Gel se při teplotě místnosti ztuží forskolinem na konečnou koncentraci 20 μΜ.

M « * - : ~ ~ - - i, * ivi o i i i υ υ o σ v í. u i r\ y

Vzorky, které by mohly blokovat indukci forskolinem se rozmístí a suší na oddělených místech na PVDC s vysokou hustotou.

Inkubace reagentů a detekce inhibice

Strana PVDC s inhibitorem se inkubuje s gelem obsahujícím vyvolávač. Pak se gel obsahující forskolinový vyvolávač umístí na bezbuněčnou stranu matrice s buňkami připravené jak uvedeno shora. Ty se spolu inkubují při 37°C a 5 % CO₂ 20 minut. Potom se gel s forskolinem odstraní a matrice s buňkami se inkubuje při 37°C a 5 % CO₂ další čtyři hodiny kvůli maximální expresi konstruktu luciferásy. K detekci enzymatické aktivity (nebo její inhibice), se buňková matrice filtru fysicky odstraní od svého podložního prsténce a umístí do petri misky. Petri miska se zaplaví substrátem luciferásy (hmyzí luciferin od Promega) v biologickém pufru s příslušnými kofaktory, aby se vyvolalo světlo jako signál. Protože signál je lokalisován uvnitř imobilisovaných buněk exprimujících luciferasu, výsledkem inhibitorů počátečního indukčního kroku budou zóny s nižší emisí fotonů.

Příklad 6

CF-HTS gel I filtr pro přímé stanovení inhibitorů interakcí ligand - buňka

Vazba ligand - receptor na površích buněk iniciuje v buňkách signální cesty, které na konci vedou k funkčním odezvám (např. proliferace nebo sekrece biologicky • · • · • » *

• · ·« ·· • · · • · · ft • · · •t ··«« • ··· ♦ · · • · · ·· aktivních substancí), Pro regulaci biologických odezev buněk při chorobných stavech se často usiluje o inhibici ligandových \$zeb na povrchu buněk. Obecnou metodou pro vyhodnocení inhibitorů vazby ligand / buněčný receptor je zhodnocení schopnosti inhibitoru redukovat vazbu mezi přírodním, radiačně značeným ligandem a buňkami. To zahrnuje inkubaci buněk s radiačně značeným ligandem a inhibitorem, následovanou odstraněním nenavázaného a nespecificky vázaného, radiačně značeného ligandu promytím a pak změřením množství vázané radioaktivity.

lnterleukin-8 (IL-8) je chemotaktický chemický druh, vyskytující se při zánětech ve vazbě na receptory na různých typech buněk. Autoři vynálezu vyvinuli CF-HTS esej ligand - buněčný receptor pro hodnocení inhibitorů této interakce.

Matrice s buňkami

HEK buňky (ATCC, Bethesda, MD) exprimující IL-8 receptor byly nakladeny na membránový filtr o průměru 75 mm (Corning Costar Corp., Cambridge, MA) s hustotou kolem 20 milionů buněk na desku. Pro přichycení se k membránovému filtru byly ponechány pres noc v pufru (RPMI od Life Technologies, Grand Island, NY) obsahujícím 10 mM Hepes (Sigma, St. Louis, MO) při pH 7,2 a 37°C. Potom, když byly buňky přichyceny na filtr, byla media odstraněna a buňky byly promyty čerstvým pufrem, aby se odstranily jakékoliv nepřichycené buňky. Filtry byly obráceny stranou s buňkami dolů a šikmo natočeny, aby mohl přebytek medií odtéci a pak byly 20 minut sušeny. Bylo to načasováno tak, že matrice s buňkami mohla být bezprostředně použita v níže popisovaném eseji.

Matrice s ligandem

Matrice s ligandem byla připravena nasáknutím IL-8 značeného ¹²⁵l (Amersham, lne., Arlington Heights, IL) do agarosového gelu vytvořeného smísením 0,1 g agarosy s 10 ml pufru, zahříváním dokud nedojde k roztavení a potom odlitím do přístroje pro gel 8 x 7 x 0,075 cm. Gely byly namáčeny přes noc při RT, za pomalého míchání na rotující desce (New Brunswick Scientific Co., lne., Edison, NJ). Po nasáknutí byly gely, právě před použitím, sušeny 20 minut při RT. Bylo to načasováno tak, že gel mohl být bezprostředně použit v eseji.

·· ···♦

Matrice se vzorky

Radiačně neznačený IL-8 (Genzyme Corp., Cambridge, MA) byl za nepřítomnosti známého inhibitoru vazby IL-8 / buněčný receptor použit jako kontrolní vzorek inhibitoru pro sledování inhibice vazby ¹²⁵l-IL-8 na HEK buňky. Na plastovou folii jako PVDC bylo rozděleno po jednom mikrolitru 0, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 a 100 μΜ IL-8 a sušeno bylo 1 h ve vakuu při RT.

Inkubace

Matrice se vzorkem byla umístěna na jednu stranu matrice s ligandem tak, že vysušené tečky s IL-8 přicházejí do styku s povrchem gelu. Gel byl otočen, aby se nechala 10 minut při RT sušit druhá strana, a aby mohl inhibitor difundovat do gelu.

Ma +n nnfnm hvlv naiv iimíotňnv na ti i cfranii msitripa c Kuňkami kdA hiíňkv nnhvlv ’ ** Q--J ----------J---------------------~ -----------1------------7 /Pro reakci vzniku vazby se nechalo inkubovat 45 minut při RT. Potom byly gely odstraněny a strana membrány bez buněk byla 4-krát promyta pufrem. Membrány se nechaly úplně vysušit před tím, než byly odstraněny ze své plastové prsténcové podložky. Potom byly membrány zobrazeny buď X-paprsky na film nebo fosforografem (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

Obrázek 12 ukazuje odezvu dávky pro ¹²⁵l-IL-8 v agarosových gelech difundujících skrze matrici s buňkami a tvořících vazbu s HEK buňkami exprimujícími receptor IL8a. Jak je naznačeno byly některé z agarosových čtverečků o jednom cm² nasáknuty roztoky s různými koncentracemi ¹²⁵l-IL-8. Následně byly ligandem nasáknuté čtverečky uvedeny do styku s matricí s buňkami jak je popsáno shora. Po inkubaci byly čtverečky z matrice s buňkami odstraněny a strana membrány bez buněk byla promyta pufrem. Pro lokalisaci na buňky vázaného ¹²⁵l-IL-8 byl použit fosforograf. Data ukazuji, že přímé radiometrické odečítání při tomto, na gelu založeném eseji s buňkami, je kvantitativně závislé na rozsahu interakce ligand-receptor. Obrázek 12 také naznačuje, že vazebné oblasti zůstávají rozdílné ve tvaru a potvrzuje, že boční difuse signálu není při eseji problémem.

Obrázek 13 ilustruje výsledky pokusu kompetitivní inhibice. Inhibice vazby mezi ¹²⁵lIL-8 a HEK buňkami je vyznačena světlými skvrnkami. Je také hned zřejmé, že inhibice neznačkovaným IL-8 je kvantifikovatelně závislá na dávce. Tato data značí, že inhibitory, v tomto případě představované neznačkovaným IL-8, mohou projít matricí s buňkami a redukovat vazbu mezi ¹²⁵l-lL-8 a buňkami.

« ··· • «

Příklad 1

Esej gel - méně funkční buňky na filtru

Změny buněčných funkcí se často měří sledováním účinků testovaných sloučenin nebo vzorků na reportní systémy vmanipulované do buněk. Příklady zahrnují pozorování účinku na syntézu fluoreskujících intracelulámích proteinů jako zelený fluoreskující protein (GFP), extracelulární proteiny jako receptory nebo adhesní molekuly, nebo specifické enzymy jako luciferasu, chloramfenikolovou acetyltransferasu, nebo β-galaktosidasu (Promega). Nejprve se s buňkami inkubují testované sloučeniny. Potom se buňky ponechají, aby po vhodnou dobu exprimovaly reportní protein (mohou to být minuty, hodiny nebo dny). Potom se přímými metodami (např. GFP) nebo nepřímými metodami (např. ELISA techniky s proteiny vázanými na membránu) analysuje úroveň reportního proteinu. Dále, v případě enzymů, může být buňka rozrušena, aby se mohl extrahovat reportní protein a analyzovat enzymová aktivita. Při jiných esejích funkčních buněk se měří chování nebo lokalisace specifických molekul jako barviv nebo radiačně značených metabolitů při odezvě na stimulaci receptoru nebo změnách fysiologie buněk jako je potenciál membrány.

ELISA esej měření účinku sloučenin na expresi intercelulární adhesní molekuly-1 (ICAM-1) může být pro CF-HTS upraven následovně, Endotelových buněk exprimujících ICAM-1 bylo kolem 5.000 buněk / mm² nakladeno na polykarbonátovou chemotaxní membránu (Neuroprobe). Buňky byly v mediu inkubovány přes noc při 37°C. Medium bylo odstraněno a membrány se nechaly částečně usušit 10 minut při RT. Vzorky nebo sloučeniny, které byly testovány na indukci ICAM-1 byly sušeny na plastových foliích a uvedeny do styku s tou stranou vlhké membrány, kde nebyly buňky. Sloučeniny se ponechaly 1 h při 37°C interagovat s buňkami ve vlhké komoře a potom byly buňky smočeny v mediu a inkubovány 5 h při 37°C.

Po poskytnutí času, v němž buňky indukovaný protein syntetizovaly, bylo medium z membrány odstraněno a buňky byly inkubovány v pufru obsahujícím anti-ICAM-1 protilátku (Genzyme, R&D systémy) buď nekonjugovanou nebo konjugovanou s fluorescein-isothiokyanátem (FITC) nebo biotinem. Po 30 minutách inkubace při RT, byl pufr odstraněn a buňky byly několikrát promyty, aby se odstranil nenavázaný antiICAM-1. V případě konjugované FITC protilátky byla membrána zobrazena za použití • · • · • · * · · • fc · · «· ·· fcfcfc · • · · · · • fcfcfc · fcfc fcfc

CCD kamery (Stratagene, Imaging Research) s excitací při 485 nm a emisi pň 520 nm. Sloučeniny, které stimulovaly expresi ICAM-1 budou resultovat v zóně se zvýšenou fluorescencí díky vázání FITC-anti-ICAM-1 protilátky. V případě protilátky konjugované s biotinem se buňky inkubují při RT 10 minut v pufru obsahujícím avidin-HRP. Pufr se odstraní a nenavázaný avidin-HRP se vymyje. Membrány se potom namočí do pufru obsahujícího substrát precipitující HPR jako tetrachlorid diaminobenzidinu (Pierce) a pozoruje se vývoj zbarvení v místech, kde podložené buňky byly indukovány, aby exprimovaly ICAM-1. V případě nekonjugované antiICAM-1 protilátky se s buňkami nechá reagovat konjugovaná sekundární anti-antiICAM-1 protilátka a pak následuje vyvolání signálu příslušným substrátem pro konjugát. Obrázky se snímají CCD kamerou. Všechny z těchto variací ( FITC, avidinHRP a antí-anti-ICAM-1) jsou alternativními stanoveními, která by měla poskytovat tytéž kvalitativní výsledky - totiž vzorky, které ovlivňují expresi ICAM-1 mohou být korelovány k zónám zvýšeného nebo sníženého signálu.

Je třeba poznamenat, že matrice pro kontinuální úpravu v tomto případě jsou membrána a plastická folie. Pro CF-HTS není gel nezbytný.

Příklad 8

CF-HTS esej jednotlivých sloučenin pro inhibici neuraminidasy

Matrice se vzorkem

Sbírka 528 jednotlivých, strukturně příbuzných sloučenin byla testována pomocí CF-HTS. Pro ředění sloučenin z lahviček do 96-jamkových desek a pro ředění a transfer sloučenin na plastové folie byl použit Packard Multiprobe MP204 DT. Na začátku byly sloučeniny zředěny ze 40 mM v DMSO z lahviček na 4 mM v DMSO do 96-jamkových desek . Potom byly zředěny ze 4 mM v DMSO na 200 μΜ v 50 % EtOH / H₂O v 96-jamkových deskách. Tyto vzorky byly v 1 μΙ duplikátech přeneseny na plastové folie 8 cm x 8 cm, průměrně s 5 mm rozestupy mezi vzorky (Bio-Rad kat. č. 165 - 2965), pro celkem 192 vzorků na folii. Každá 1 μΙ tečka tedy obsahovala přibližně 200 pmol jednotlivé sloučeniny ze sbírky. Jako kontrola byly na každou folii blízko sloučeninám ručně rozděleny serie ředění 2,3-dehydro-2-deoxy-N-acetylneuraminové kyseliny (DANA), známého inhibitoru neuraminidasy (Boehringer • φ « φ φ φ • φ φ* ··· • φ*φ φ * φ • · φ

Mannheim č. 528544). Folie byly vysušeny ve vakuové sušárně tak, že každá sloučenina byla vysušena na svém vlastním místě na folii.

Matrice s enzymem

Před esejem byl enzym chřipkové neuraminidasy 1500 krát naředěn z fosfátem pufrované solanky s25 % glycerolu do zkapalněného agarového gelu sestávajícího z 1 % agarosy, 50 mM citrátu sodného pH 6,0 a 10 mM chloridu vápenatého při 40°C. Byl odlito 8 cm x 8 cm x 0,75 mm enzymového gelu a ztuženo snížením teploty na 4°C.

Matrice se substrátem

CiοιιΚο+rAt nfti «rorviinirJooi/ O¹ fA mathi/h ΓΊ M

VJIHVIIWIXJ WMWWfcIMl WllllJi/nUTV I IVUI Ul I III IIUWU J | u y—r I I IVU IJ IUI I IMVII I VI J ly VA k-F II acetylneuraminová kyselina (Sigma, kat. č. 8636), byl zředěn z 3 mM v DMSO na 30 μΜ do zkapalněného agarového gelu a to bylo odlito podobným způsobem jako je shora popsáno pro gel s enzymem.

Inkubace a detekce

Matrice s enzymem byla umístěna na matrici se vzorkem na tu stranu, kde byly usušeny sloučeniny, o něž se jedná. Potom byla matrice se substrátem naskládána navrch matrice s enzymem. Matrice byly inkubovány 30 minut při RT. Během této doby zhašený fluorescenční substrát a enzym difundovaly spolu mezi dvěma gely, substrát byl enzymem štěpen a způsoboval vzrůst intensity fluorescence. Bylo to monitorováno excitací při 340 nm a emisí při 450 nm. Sloučeniny, které jsou schopny inhibovat aktivitu enzymu, vzrůst intensity fluorescence snižovaly na nejmenší míru. Jak u gelů vzrostla ve většině míst intensita fluorescence, oblasti, které obsahovaly inhibitory enzymu, jež difundovaly do gelu z plastové folie, byly vidět jako tmavější místa s nižší fluorescencí. To se snadno monitorovalo pomocí CCD kamery s vhodnými flitry pro kontrolu vlnových délek emise a excitace. Identita sloučenin vykazujících zóny inhibice byla stanovena podle umístění zón vzhledem k matrici s inhibitorem. Srovnáváním fluorescence DANA kontroly se známými množstvími každého testovaného inhibitoru, bylo pro každou sloučeninu provedeno kvantitativní stanovení IC5029

Všech 528 sloučenin sbírky bylo testováno dvojmo. Celkový objem použitého gelu s enzymem byl 33 ml nebo 31,25 μΙ na test. Dále byly všechny sloučeniny testovány současně a podmínky eseje byly ve srovnání s tradičním 96-jamkovým esejem konstantní. Navíc dále, jak ukazuje obrázek 14, byl esej dostatečně citlivý, aby detegoval inhibitory o síle pouhých 100 μΜ, ICso hodnoty nalezené pro aktivní sloučeniny dobře souhlasí s těmi, které byly zjištěny pro tytéž sloučeniny při nákladnějším 96-jamkovém eseji, který na test vyžadoval 200 μΙ. Viz tabulku Výsledky kvantitativního gelového eseje. Tyto příklady ukazují, že testování sloučenin ve skupinách s vysokou hustotou snižuje náklady a čas. Na příklad i menší redukce rozestupu sloučenin na 2,5 mm namísto 5 mm má za následek čtyřnásobný vzrůst počtu sloučenin testovaných v jednotce objemu. U tohoto pokusu by to na testovanou sloučeninu přineslo sníženi ODjemu pod 10 μι. 8 reagenty se ještě zachází pohromadě, bez nutnosti mít zařízení pro manipulaci s malými objemy kapalin používaných při miniaturisovaném screeningu.

Jako příklad sledovaný pro demonstraci výhod této miniaturisace bylo pomocí CF-HTS testováno 10 080 jednotlivých sloučenin při celkovém objemu enzymového gelu 17 ml (méně než 2 μΙ na test). Pro rozmístění 30 nl každého ze vzorků oddělených po 1 mm byla použita Packard Multipette. Sloučeniny byly rozmísťovány v DMSO při koncentraci 5 mM tak, že přibližně 150 pmol každé sloučeniny bylo naneseno na plast. Jako kontrolní inhibitor byl znovu použit DANA. Vedle obvyklé kontrolní titrace mimo soubor sloučenin, byl uvnitř samotného souboru zahrnut slepý pokus, při kterém byly kontrolní vzorky ošetřeny stejně jako 10 080 neznámých, když byly rozmisťovány na plast. Jako předtím byly folie usušeny a použity v eseji s neuraminidasou. Všech 10 080 vzorků bylo touto metodou současně prozkoumáno za méně než jednu hodinu. Opět nebyla zapotřebí mikrofluidika a/nebo manipulace s malými objemy kromě okamžiku, když byly sloučeniny na počátku rozmísťovány na folii. Extrémně vysoká hustota při tomto eseji neinterferovala s detekcí inhibitoru. Navíc dále vysoká hustota nekomplikovala identifikaci aktivních sloučenin i když fluorescenční sloučeniny (snadno pozorovatelné v gelu jako jasnější skvrny) byly v nejbližším sousedství aktivních sloučenin. Viz obrázek 15.

*9« • 99

9 99« ···· ·

9 9 9 · 9

9 9 9 9

Výsledky kvantitativního gelového eseje

Vzorek č.	Přibližné max. Ki (μΜ) z gelu	ICso (μΜ) zjištěné při 96-jamkovém eseji
34	100	>100
35	80	>100
36	80	42
37	100	>100
38	100	>100
39	100	>100
40	40	32
41	100	>100
42	40	50
43	100	>100
44	>200	>100
45	100	>100
46	100	>100
47	10	7,5
48	100	>100
49	100	>100
50	100	>100

TY Ssxx)-Aftg • · ·· AAAA

Claims (31)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob eseje vzorků testovaných na biologickou nebo aktivitu vyznačený tím, že (a) se mnohočetné vzorky pro test předloží do nebo na porésní matrici eseje, která obsahuje případné jednu nebo více složek eseje;

   (b) se použije nejméně jedna matrice pro předložení jedné nebo více složek eseje, přičemž matrice může anebo nemusí být porésní esejovou matricí a (c) provede se další stupeň (I) promytí každé v eseji používané matrice pro odstranění přebytečného množství testovaného vzorku, složky eseje nebo jwjiwi* uinvwij i iwww (II) kontaktu každé v eseji používané matrice s dalším činidlem uvnitř roztoku nebo jako kapalinou.
2. 2. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že testované vzorky jsou rozmístěny na porésní matrici eseje obsahující ligand, jiná matrice eseje obsahuje imobilisovaný receptor a dalším reagentem je roztok pro visuální znázornění.

   biochemickou
3. 3. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že další činidlo deteguje expresi reportního genu při eseji s buňkou.
4. 4. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že jednou porésní matricí je membrána nesoucí na jednom povrchu celé buňky a další krok zahrnuje přidání celého objemu roztoku obsahujícího sloučeninu, která se konjuguje s reportním proteinem, jenž se tvoří positivní interakcí mezi buňkami a testovanými vzorky.
5. 5. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že dalším činidlem je činidlo pro visuální znázornění.
6. 6. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že prací stupeň odstraňuje přebytek složky eseje, která se používá pro visuální znázornění.

   • « • · · · » ··· • · ····· ··· · · · ·· ···* *· ··
7. 7. Způsob eseje vzorků testovaných na biologickou nebo biochemickou aktivitu vyznačený tím, že (a) se mnohočetné vzorky pro test předloží do nebo na porésní matrici eseje , která obsahuje případně jednu nebo více složek eseje a (b) pro provedení eseje se použijí nejméně dvě další matrice.
8. 8. Způsob eseje jednotlivých vzorků testovaných na biologickou nebo biochemickou aktivitu vyznačený tím, že (a) se předloží více než 96 testovaných vzorků do nebo na porésní matrici eseje , která obsahuje případně jednu nebo více složek eseje, (b) se provede esej.
9. 9. Způsob podle nároku 1, 7 nebo 8 vyznačený tím, že zahrnuje dále krok rozmístění testovaných vzorků na matrici pro testované vzorky.
10. 10. Způsob podle nároku 1,7 nebo 8 vyznačený tím, že poresní matrice eseje obsahuje cílovou makromolekulu.
11. 11. Způsob podle nároku 1, 7 nebo 8 vyznačený tím, že poresní matrice eseje obsahuje enzym.
12. 12. Způsob podle nároku 1, 7 nebo 8 vyznačený tím, že poresní matrice eseje obsahuje surové biologické směsi nebo extrakty.
13. 13. Způsob podle nároku 1,7 nebo 8 vyznačený tím, že poresní matrice eseje obsahuje organely nebo buňky.
14. 14. Způsob podle nároku 1,7 nebo 8 vyznačený tím, že poresní matrice eseje je filtrem nebo membránou.
15. 15. Způsob podle nároku 1,7 nebo 8 vyznačený tím, že poresní matrice eseje je tenkým filmem nebo kapalinou pokrývající imobilisované komponenty eseje.
16. 16. Způsob podle nároku 1, 7 nebo 8 vyznačený tím, že další matrice obsahuje imobilisovanou cílovou makromolekulu.
17. 17. Způsob podle nároku 1, 7 nebo 8 vyznačený tím, že další matrice obsahuje činidlo pro visuální znázornění.
18. 18. Způsob pro simultánní testování velkého množství vzorků různých látek na jejich způsobilost zesilovat nebo inhibovat biologický proces vyznačený tím, ž e zahrnuje (a) uložení řady malých objemů každého z více než 96 vzorků rozdílných látek na planární poresní matrici, obsahující nebo nesoucí rovnoměrně rozptýlené činidlo eseje tak, že každá jednotlivá látka je soustředěna na své vlastní odlišené místo a identita každé látky muže být určena z jejího místa uložení a (b) pozorování interakce každé látky s uvedeným činidlem eseje a její korelování se způsobilostí uvedené látky zesilovat nebo inhibovat uvedený biologický proces.
19. 19. Způsob pro simultánní testování velkého množství vzorků různých látek na jejich způsobilost zesilovat nebo inhibovat biologický proces vyznačený tím, že zahrnuje (a) uložení řady malých objemů každého z více než 96 vzorků rozdílných látek na planární poresní matrici tak, že každá jednotlivá látka je soustředěna na své vlastní odlišené místo a identita každé látky může být určena z jejího místa uložení a (b) uvedení této matrice do styku s poresní matricí obsahující nebo nesoucí rovnoměrně rozptýlené činidlo eseje a umožnění, aby část z každé látky difundovala do uvedené poresní matrice takovým způsobem, že prostorové umístění každé difundované látky může být korelováno s místem na uvedené planární matrici, na kterém byla uvedená látka původně uložena, a (c) provedení eseje pro určení způsobilostí každé difundované látky zesilovat nebo inhibovat biologický proces.

    φφφ» φφφφ φ · · * φφ φφ

    Φ φ φφ φφφφ • * ··» φ φ · φ φ · φ φ φ φ φφ φφ
20. 20. Způsob pro simultánní testováni velkého množství vzorků různých látek na jejich způsobilost zesilovat nebo inhibovat biologický proces vyznačený tím, že zahrnuje (a) uložení řady malých objemů každého z více než 96 vzorků rozdílných látek na planární poresní matrici tak, že každá jednotlivá látka je soustředěna na své vlastní odlišené místo a identita každé látky může být určena z jejího místa uložení, (b) uvedení této planární matrice do styku s první poresní matricí obsahující nebo nesoucí rovnoměrně rozptýlené první činidlo eseje a umožnění, aby část z každé látky difundovala do řečené poresní matrice takovým zDŮsobem. že Drostorové umístění každé difundované látkv může bvt

    I ' I » * korelováno s místem na uvedené planární matrici, na kterém byla uvedená látka původně uložena, (c) uvedení této první poresní matrice do styku s druhou matricí nesoucí nebo obsahující jednotně rozptýlené druhé činidlo eseje a umožnění, aby druhé činidlo eseje difundovalo do první poresní matrice, nebo umožnění, aby každá látka a první činidlo difundovaly do druhé matrice, přičemž se v posledním případě zajistí, že difuse probíhá takovým způsobem, že umístění každé látky na druhé matrici může být korelováno s místem na uvedené planární matrici, na kterém byla uvedená látka původně uložena a (d) zhodnocení způsobilostí každé látky zesilovat nebo inhibovat uvedený biologický proces.
21. 21. Způsob pro simultánní testování velkého množství vzorků různých látek na jejich způsobilost zesilovat nebo inhibovat biologický proces vyznačený tím, že zahrnuje (a) uložení rady malých objemů každého z více než 96 vzorků rozdílných látek na první planární poresní matrici obsahující nebo nesoucí rovnoměrně rozptýlené první činidlo eseje tak, že každá jednotlivá látka je soustředěna na své vlastní odlišené místo a identita každé látky může být určena z jejího místa uložení, (b) uvedení této první poresní matrice do styku s druhou matricí nesoucí nebo obsahující rovnoměrně rozptýlené druhé činidlo eseje a umožnění, aby « » 0 ·· ·· » » ·· ···· « · · ·· ·♦ druhé činidlo eseje difundovalo do první poresní matrice, nebo umožnění, aby každá látka a první činidlo difundovaly do druhé matrice, přičemž se v posledním případě zajistí, že difuse probíhá takovým způsobem, že umístění každé látky na druhé matrici může být korelováno s místem na uvedené planární matrici, na kterém byla uvedená látka původně uložena, a (c) zhodnocení způsobilostí každé látky zesilovat nebo inhibovat uvedený biologický proces.
22. 22. Způsob podle nároku 18 nebo 19 nebo 20 nebo 21 vyznačený tím, že jedním z rovnoměrně rozptýlených činidel eseje je makromolekula.
23. 23. Způsob podle nároku 18 nebo 19 nebo 20 nebo 21 vyznačený tím, že jedním z rovnoměrně rozptýlených činidel eseje je enzym.
24. 24. Způsob podle nároku 18 nebo 19 nebo 20 nebo 21 vyznačený tím, že jedním z rovnoměrně rozptýlených činidel eseje je surový biologický extrakt.
25. 25. Způsob podle nároku 18 nebo 19 nebo 20 nebo 21 vyznačený tím, že jedním z rovnoměrně rozptýlených činidel eseje jsou organely.
26. 26. Způsob podle nároku 18 nebo 19 nebo 20 nebo 21 vyznačený tím, že jedním z rovnoměrně rozptýlených činidel eseje jsou celé buňky.
27. 27. Způsob podle nároku 18 nebo 19 nebo 20 nebo 21 vyznačený tím, že jedním z rovnoměrně rozptýlených činidel eseje jsou celé buňky nesené na povrchu planární poresní matrice.
28. 28. Způsob podle nároku 27 vyznačený tím, že se uvedená interakce zaznamenává stykem uvedené poresní matrice s roztokem nebo kapalnou suspensí činidla nebo s poresní matricí obsahující činidlo, které v jednom i druhém případě napomáhá zviditelnění proteinu, jehož exprese v uvedených celých buňkách je biologickým procesem, který je hodnocen.

    9 * ··· ··· · ♦ · · · · · · 36 ........ ·· ’*
29. 29. Způsob podle nároku 21 vyznačený tím, že prvním činidlem eseje je značkovaný ligand a druhým činidlem eseje je imobilisovaný receptor pro uvedený ligand.
30. 30. Způsob podle nároku 29 vyznačený tím, že se druhá planární matrice vymývá pro odstranění veškerého značkovaného ligandu, který difundoval na nebo do uvedené druhé planární matrice, ale nenavázal se na uvedený imobilisovaný receptor.
31. 31. Způsob podle nároku 30 vyznačený tím, ž e se uvedená druhá planární matrice uvede do styku s roztokem nebo kapalnou suspensí činidla nebo poresní matrice obsahující činidlo, které v jednom i druhém případě napomáhá při visualisaci značkovaného ligandu, neodstraněného ve vymývacím stupni.