SK286095B6 - Spôsob súčasného testovania množstva vzoriek rôznych látok - Google Patents
Spôsob súčasného testovania množstva vzoriek rôznych látok Download PDFInfo
- Publication number
- SK286095B6 SK286095B6 SK836-2000A SK8362000A SK286095B6 SK 286095 B6 SK286095 B6 SK 286095B6 SK 8362000 A SK8362000 A SK 8362000A SK 286095 B6 SK286095 B6 SK 286095B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- matrix
- test
- gel
- substance
- ligand
- Prior art date
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims description 112
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 45
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims description 24
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 152
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 81
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 58
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 42
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 42
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 35
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 16
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 claims description 10
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 claims description 7
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 claims description 6
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 3
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000000151 deposition Methods 0.000 claims description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 2
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 claims 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims 1
- 238000005554 pickling Methods 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 79
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 abstract description 50
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 abstract description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 111
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 79
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 46
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 40
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 38
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 36
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 36
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 30
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 29
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 29
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 27
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 15
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 14
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 14
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 14
- 239000010408 film Substances 0.000 description 14
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 11
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 11
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 11
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000009816 urokinase plasminogen activator receptor activity proteins Human genes 0.000 description 11
- 108040001269 urokinase plasminogen activator receptor activity proteins Proteins 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 description 10
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000005033 polyvinylidene chloride Substances 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- 229920001328 Polyvinylidene chloride Polymers 0.000 description 9
- 108010030694 avidin-horseradish peroxidase complex Proteins 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 9
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 8
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000011049 pearl Substances 0.000 description 8
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 101710088786 Elongation factor 3 Proteins 0.000 description 7
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 7
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 7
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 7
- GNNALEGJVYVIIH-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydrochloride Chemical compound Cl.NC1=CC=CC=C1N GNNALEGJVYVIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- -1 compound compound Chemical class 0.000 description 7
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 7
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 7
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 6
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 5
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 5
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 238000012801 analytical assay Methods 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 229920002457 flexible plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 3
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 3
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 3
- HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N (4S)-2-(6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,2-f][1,3]benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(=N1)c1nc2cc3CCNc3cc2s1 HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-M (R)-lactate Chemical compound C[C@@H](O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-M 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- DYDCUQKUCUHJBH-UWTATZPHSA-N D-Cycloserine Chemical compound N[C@@H]1CONC1=O DYDCUQKUCUHJBH-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- DYDCUQKUCUHJBH-UHFFFAOYSA-N D-Cycloserine Natural products NC1CONC1=O DYDCUQKUCUHJBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 2
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 2
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 description 2
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 description 2
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 2
- 239000006177 biological buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M malachite green Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940107698 malachite green Drugs 0.000 description 2
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 2
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000131 polyvinylidene Polymers 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000002911 sialidase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O vancomycin(1+) Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C([O-])=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)[NH2+]C)[C@H]1C[C@](C)([NH3+])[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JINJZWSZQKHCIP-UFGQHTETSA-N 2-deoxy-2,3-dehydro-N-acetylneuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C=C(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO JINJZWSZQKHCIP-UFGQHTETSA-N 0.000 description 1
- XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n-diethylpyrimidine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(N)=CC(Cl)=N1 XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010018976 Interleukin-8A Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- JINJZWSZQKHCIP-UHFFFAOYSA-N Neu5Ac2en Natural products CC(=O)NC1C(O)C=C(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO JINJZWSZQKHCIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940123424 Neuraminidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPKUGWDQUVWHIC-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine tetrahydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.NNC1=CC=C(C=C1)C1=CC=C(NN)C=C1 GPKUGWDQUVWHIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 108010038083 amyloid fibril protein AS-SAM Proteins 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009833 antibody interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000009831 antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000013626 chemical specie Substances 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 229940042406 direct acting antivirals neuraminidase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 108010038415 interleukin-8 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010681 interleukin-8 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000003541 multi-stage reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013148 permeation assay Methods 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 210000004694 pigment cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000013102 re-test Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000005201 scrubbing Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00277—Apparatus
- B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
- B01J2219/00527—Sheets
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00585—Parallel processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00596—Solid-phase processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
- B01J2219/0061—The surface being organic
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
- B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
- B01J2219/00623—Immobilisation or binding
- B01J2219/0063—Other, e.g. van der Waals forces, hydrogen bonding
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00639—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium
- B01J2219/00641—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium the porous medium being continuous, e.g. porous oxide substrates
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
- B01J2219/00702—Processes involving means for analysing and characterising the products
- B01J2219/00707—Processes involving means for analysing and characterising the products separated from the reactor apparatus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Paper (AREA)
- Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Geophysics And Detection Of Objects (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pyrane Compounds (AREA)
- Image Processing (AREA)
Abstract
Kontinuálna úprava vysokovýkonného skríningu (CF-HTS) využívajúca najmenej jednu poréznu matricu umožňuje vo farmaceutickom priemysle, aby sa súčasnepreskúmavalo veľké množstvo chemických jedincov na široký rozsah biologickej alebo biochemickej účinnosti. CF-HTS je okrem toho užitočný pri uskutočňovaní viacstupňových analytických testov.
Description
Kontinuálna úprava vysokovýkonného skríningu (CF-HTS), používajúca najmenej jednu poréznu matricu, vo farmaceutickom priemysle umožňuje, aby sa skúmalo veľké množstvo chemických entít súčasne na široký rozsah biologickej alebo biochemickej účinnosti. CF-HTS je okrem toho užitočný pri uskutočňovaní viacstupňových analytických testov.
Doterajší stav techniky
Biochemické a biologické analytické testy sú určené na testovanie aktivity v širokom rozpätí systémov v rozmedzí od interakcii proteín-proteín, enzýmovej katalýzy, väzieb malých molekúl na proteíny až do bunkových funkcií. Pri „vysokovýkonnom skríningu“ (HTS) sa tieto druhy analytických testov používajú na testovanie veľkého množstva chemických entít, aby sa zistili predtým neznáme biologické alebo biochemické účinnosti chemických entít.
Homogénne verzus heterogénne testy
Všetky rôzne druhy biologických testov môžu byť rozdelené do dvoch väčších tried: homogénnych a heterogénnych testov. Pri homogénnych testoch sú všetky reagenty pridávané spoločne a výsledky sa zmerajú alebo interpretujú bez akejkoľvek dodatočnej manipulácie. Napríklad na Petriho miske môžu byť rastúce bunky vystavené chemikálii. Ak je chemikália pre bunky toxická, bude pri jednoduchom pozorovaní indikovať toxicitu, vyjasňujúca sa zóna. V inom príklade sa môžu použiť bunky, ktoré exprimujú proteín, ktorý mení farbu buniek. V prípade buniek exprimujúcich β-galaktosidázu, rastúcich na agare obsahujúcom x-gal, sa bunky viac alebo menej zafarbujú modro v závislosti od iných biologických a biochemických procesov na homogénne metódy, tieto iné procesy pracujú pri heterogénnych metódach s efektívnejšími nákladmi a/alebo s ľahšie dostupnými reagentmi. Komerčne sú dostupné rôzne metódy a súpravy na homogénne techniky, ako SPA (Amersham), fluorescenčné polarizácie (Jolley a iní) a časovo rozkladaná fluorescencia (Packard a iní), aby boli vymenované len niektoré. Použitie týchto druhov metód vždy vyvoláva dodatočné náklady a spotrebu času. Heterogénne metódy sa pre mnoho testov viac osvedčujú a sú ľahšie pre rýchle zavedenie. Z týchto dôvodov pokračuje rozširovanie heterogénnych metód, ako je ELISA, väzba na filtroch, RIA, bunkové testy s luciferázou atď. Niektoré z týchto metód budú detailnejšie opísané.
Vysokovýkonný skríning (HTS)
Na vyhľadávanie kandidátov na liečivá sa farmaceutický priemysel po dlhý čas stále viac spoliehal na HTS knižnice chemických zlúčenín. HTS opisuje metódu, kde sa mnohé jednotlivé zlúčeniny testujú paralelne tak, že sa veľký počet testovaných zlúčenín skúma na biologickú aktivitu simultánne alebo skoro simultánne. Najrozšírenejšie používané techniky bežne využívajú mikrotitračné platne s 96 jamkami. V tejto úprave sa vykonáva 96 nezávislých testov súčasne na jednotlivej 8 cm x 12 cm plastovej platni, ktorá obsahuje 96 jamiek na reakciu. Typicky vyžadujú tieto jamky objemy testu v rozsahu 50 až 500 ml. Okrem platní sú komerčne dostupné mnohé nástroje, materiály, pipetovače, automatické techniky, umývačky platní a odpočítače platní vhodné pre 96 jamkovú úpravu pre široký rad homogénnych a heterogénnych testov.
Až dosiaľ boli snahy zlepšovať HTS sústredené na zmenšovanie jamiek (miniaturizácia). Keď je zmenšovaná veľkosť jamiek, môže sa zvyšovať počet jamiek na každej platni na uskutočnenie viac paralelných testov. Ďalej sa znižovaním objemov testu znižujú náklady na reagenty na testovanie. Okrem toho, pretože je možné paralelne vykonávať testy s menšími objemami testu, je tiež možné súčasne testovať viac zlúčenín na vyhľadávanie kandidátov na liečivá. Až dosiaľ miniaturizácia výrazne zlepšila 96 jamkovú technológiu poskytnutím úpravy s 384 jamkami (96 x 4). Pozri Comley a spol., J. Biomol. Screenine. sv. 2(3), str. 171-78 (1997). V skutočnosti boli publikované aj úpravy s vyššou hustotou, vrátane úpravy s 9600 jamkami. Miniaturizácia má však neodmysliteľné náklady a komplikácie.
Tieto náklady a komplikácie sa priamo vzťahujú na tri primáme súčasti miniaturizácie skríningovej úpravy. Po prvé sa musí zvládnuť realizácia menších nádobiek na testovanie (trubičky, jamky atď). Po druhé sa musí zvládnuť presné rozdeľovanie všetkých na test potrebných reagentov do viac a menších jamôk (spravidla uskutočňované pomocou automatických zariadení na kvapaliny, ktoré simultánne rozdeľujú reagenty do mnohých jamiek). Po tretie sa musí zvládnuť „prečítanie“ výsledkov testov v súbore s vysokou hustotou.
Za daných požiadaviek na súbežne uskutočňované nezávislé testy, každá zložka určuje úlohy a obmedzenia, nakoľko je miniaturizácia vhodná alebo efektívna z hľadiska nákladov. Napríklad novšia zmenšená úprava môže vyžadovať úplne odlišnú metódu rozdeľovania reagentov, alebo vyžaduje čítací inštrument, ktorý má rozlíšenie, citlivosť a technické uskutočnenie, ktoré sú s novšou zmenšenou úpravou kompatibilné. Keď sa zredukuje veľkosť každej jamky, stáva sa spôsobilosť vyrobiť rad nádobiek, rozdeliť reagenty po malých kvantách a prečítať každú vzorku testu, tiež problematickou, časovo náročnou a nákladnou. Menšia veľkosť vzorky ďalej tiež zvyšuje štatistické kolísanie od vzorky ku vzorke kvôli nepresnostiam spočívajúcim v rozdeľovaní malých objemov reagentov a v zaznamenávaní slabších signálov vzorky. Okrem toho sotva veľkosť vzorky klesne za určitý bod, prispievajú k väčším nákladom a zložitosti realizácie novšie, miniaturizované úpravy i faktory, ako je odparovanie a povrchové napätie. Na zásadný pokrok v HTS technológii si priemysel vyžaduje možnosť „testov s voľnou úpravou“ alebo testov, v ktorých nie sú fyzikálne bariéry medzi vzorkami. V skutočnosti nikto neopísal použitie voľnej úpravy pri HTS so štandardnými kolekciami oddelených zlúčenín predpovedané typicky ako testovanie malých kvapiek v úprave, v ktorej chýbajú akékoľvek jamky.
Kombinatóme skríningové súbory - metódy gélovej permeácie
S nástupom kombinatómej chémie môžu byť na pevných podkladoch (obvykle perličkách) produkovaných milióny chemických entít. Aj keď 96 jamková úprava bola použitá na preskúmavanie súborov na báze perličiek, je táto úprava všeobecne považovaná ako neefektívna, pretože (1) každá perla nesie iba malé množstvo chemickej entity; (2) počet zlúčenín, ktoré majú byť testované je enormne veľký; a (3) s perličkami sa komplikovane manipuluje na mikrotitračných platnách s 96 jamkami.
Aby sa vyhli problémom vlastným pri skríningu kombinatómych súborov v úprave s 96 jamkami, uvádzajú niektorí použitie jednoduchých homogénnych testov, ktoré by mohli byť opísané ako „voľná úprava“. Ako príklad bol Jayawickremom a spol. v Proc. Naťl Acad. Sci. (USA), sv. 191. str. 1614-18 (marec 1994) publikovaný test používajúci pigmentové bunky (melanocyty) v jednoduchom homogénnom teste pre kombinatómu peptidovú zbierku. Autori umiestnili do petriho misiek bunky pod agarózu, potom na povrch agarózy umiestnili perly, ktoré niesli kombinatóme zlúčeniny a potom zlúčeniny z perál čiastočne uvoľnili. Aktívne zlúčeniny bolo vidieť ako oblasti tmavého pigmentu, pretože aktívne zlúčeniny spôsobili, že bunky menili farbu, len čo zlúčeniny miestne difundovali do matrice gélu.
Iným recentným príkladom je práca Daniela Chelsky-ho „Strategies for Screening Combinatorial Lľbraries“ publikovaná na First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening vo Filadelfii, P A (november 7-10 1995). Chelsky umiestnil jednoduchý homogénny enzýmový test na uhličitú anhydrázu dovnútra agarózového gélu tak, aby enzým v géli spôsobil zmenu farby gélu. Na to potom boli dovnútra gélu umiestnené perly nesúce kombinatóme zlúčeniny cestou fotocitlivých spojov a zlúčeniny boli čiastočne uvoľnené UV-svetlom. Zlúčeniny, ktoré inhibovali enzým, boli zaznamenávané ako miestne zóny inhibície majúce menšiu zmenu farby. Konečne v Molecular Diversity. sv. 2, str. 57-63 (1966) opisuje Salmon a spol. metódu podobnú metóde Jayawickreme-ho a spol., pri ktorej sú kombinatóme súbory skúmané na zlúčeniny, ktoré majú cytotoxické účinky na rakovinové bunky rastúce na agare.
Všetky tri príklady sú variácie dlhodobých gélových testov na antibakteriálne alebo protirakovinové činidlá a sú také podobné bežným imunologickým testom, pri ktorých sa v géli zisťujú interakcie antigén/protilátka. Aj keď tieto gélové permeačné testy boli veľmi vhodné na skríning kombinatómych súborov na báze perál, nikto nepublikoval rozšírenie tejto úpravy na heterogénne testy alebo na súbory, ktoré nie sú na perlách založené. Konvenčná rozumová úvaha odraďovala výskumníkov od testovania vzoriek v kontinuálnej úprave, ktorá by dovoľovala zmiešavame vzoriek. Medzi obmedzenými druhmi publikovaných testov a záležitostiach, kde vzorky boli spoločne skúmané v kontinuálnej úprave, boli analyzované iba súbory založené na perlách. Vďaka týmto obmedzeniam výskumníci verili, že 96 jamková úprava bola vhodnejšia na heterogénny skríning súborov a nie skríning založený na perlách. Bolo by žiaduce vykonávať heterogénne testy v rámci voľnej úpravy. Bolo by ďalej žiaduce testovať individuálne zlúčeniny v rámci voľnej úpravy.
Podstata vynálezu
Tu opisovaný vynález, kontinuálna úprava vysokovýkonného skríningu (CF-HTS), úspešne uskutočňuje koncept voľnej úpravy pre každý homogénny alebo heterogénny test, ktorý môže byť uskutočňovaný v 96 jamkovej úprave. Okrem toho je CF-HTS takisto užitočný na preskúmavanie kombinatómych súborov pomocou heterogénnych testov a nielen testov homogénnych. Navyše ďalej sa môžu pri CF-HTS analyzovať individuálne zlúčeniny bez nákladov a komplikácií, ktoré sú spojené s miniaturizáciou. Obavy týkajúce sa možnosti, že reagenty a výsledky testovania budú spolu prebiehať spoločne počas nasledujúcich krokov, sa ukázali ako neopodstatnené.
Jedno z uskutočnení vynálezu sa týka spôsobu súčasného testovania množstva vzoriek rôznych látok na ich spôsobilosť zosilňovať alebo inhibovať biologický proces, zahŕňajúci (a) uloženie malého objemu každej z viac než 96 vzoriek rozdielnych látok v usporiadaní na matricu tak, že každá jednotlivá látka je sústredená na svoje vlastné odlíšené miesto a identita každej látky môže byť určená z jej miesta uloženia;
(b) uvedenie tejto matrice do styku s prvou poréznou matricou obsahujúcou alebo nesúcou rovnomerne rozptýlené prvé skúšobné činidlo a umožnenie, aby časť z každej látky difundovala do uvedenej poréznej matri ce takým spôsobom, že priestorové umiestnenie každej difundovanej látky môže byť korelované s miestom na uvedenej matrici, na ktorom bola uvedená látka pôvodne uložená, a (c) uskutočnenie testu na stanovenie schopnosti každej difundovanej látky zosiľňovať alebo inhibovať uvedený biologický proces pozorovaním interakcie každej látky s uvedeným skúšobným činidlom, pričom uvedená matrica je planáma matrica.
Iné uskutočnenie sa týka uvedeného spôsobu, ktorý ďalej zahŕňa stupeň (bl) uvedenia uvedenej prvej poréznej matrice do styku s druhou matricou nesúcou alebo obsahujúcou druhé rovnomerne rozptýlené skúšobné činidlo a umožnenia, aby druhé skúšobné činidlo difundovalo do prvej poréznej matrice, alebo umožnenia, aby každá látka a prvé činidlo difundovali do druhej matrice, pričom sa v poslednom uvedenom prípade zaistí, aby difúzia prebiehala tak, že priestorové umiestnenie každej látky v druhej matrici môže byť korelované s miestom na uvedenej planámej matrici, na ktorom bola uvedená látka pôvodne uložená, a (cl) uskutočnenia stupňa (c).
Podrobný opis vynálezu
Ústrednou myšlienkou CF-HTS je umiestniť testované vzorky do kontextu s poréznou matricou. Metóda zahrnuje umiestnenie jednej alebo viacerých zložiek testu dovnútra, navrch alebo naspodok matrice, ako je gél, plastová fólia, filter alebo iné formy ľahko manipulovateľného pevného podkladu. Keď sa do poréznej matrice zavedú vzorky, difundujú dostatočne pomaly tak, že testy je možné vykonávať bez toho, aby testované vzorky prebiehali spolu. Takto CF-HTS úprava rozdeľuje testované vzorky difúziou, skôr než nepriechodnou bariérou. Ak sa nechajú bežať testy príliš dlho, budú eventuálne testované vzorky a výsledky prebiehať spoločne. Ale pri dôkladnom načasovaní dovoľuje CF-HTS simultánny skríning veľmi vysokej hustoty zlúčenín ešte individuálne, bez potreby plniť jednotlivé jamky alebo reakčné nádoby rozpúšťadlami alebo zložkami testu. K tomu navyše sa v tejto úprave môžu manipuláciou s matricami, ktoré nie sú reakčné komponenty, vykonávať aj zložité heterogénne testy. Manipulácia s matricami na heterogénne testy je úplne bezprecedentná a robí CF-HTS vo svojej schopnosti preskúmavať široký rozsah biologických a biochemických procesov tak flexibilný ako 96 jamkovú úpravu. CF-HTS dosahuje ďalej druhy výhod predpokladaných pre miniaturizáciu, bez závažných nevýhod a má jedinečné výhody. CF-HTS využíva široký rad matríc a komponent pre testy. Matrice zahrnujú, ale neobmedzujú sa len na gély zložené z agarózy, akrylamidu alebo iných želatinóznych materiálov, membrány, filtre a plasty. Matrice môžu byť zložené z materiálov vrátane, ale nielen, z polystyrénu, polypropylénu, iných plastov, papierových vlákien, skla, sklenených vlákien, kremeliny, polykarbonátu, polyesteru, polyvinylidénchloridu a polyetylénu. Matricami môžu byť impermeabilné tuhé látky, porézne tuhé látky ako filtre alebo gély. Zložky testov zahrnujú, ale neobmedzujú sa len na makromolekuly ako nukleové kyseliny, proteíny a iné syntetické alebo prírodné makromolekuly; bunky, lyzáty buniek, biologické extrakty, organely a iné zložité biologické entity a zmesi; a malé molekuly ako pufry, soli, inhibítory, substráty, peptidy, farbivá, nukleotidy, kofaktory, ióny a rozpúšťadla.
CF-HTS test je testom, v ktorom sa mnohopočetné testované vzorky alebo zlúčeniny rozdeľujú difúziou skôr než nepriechodnou bariérou. Kritickou zložkou je zavedenie viacpočetných (viac než 1) testovacích vzoriek dovnútra alebo na poréznu matricu testu, ktorá prípadne obsahuje jednu alebo viac zložiek testu. Porézne matrice testu, obsahujúce komponent(y) na test, sa pripravujú pridávaním, miešaním, liatím, rozmiesťovaním alebo namáčaním komponentov testu do matrice. Porézne matrice sa pripravujú tiež spojovaním, natieraním, väzbou, fixovaním, napojením, konjugáciou alebo prichycovaním komponentov testu dovnútra alebo na povrch matrice. Okrem toho sa porézna matrica pripravuje ďalej tiež vytváraním tenkého filmu roztoku alebo kvapaliny na bunkovom podklade, enzýmu alebo inej imobilizovanej zložke testu. Porézne matrice na test sa používajú, aby sa kontrolovalo poradie a/alebo čas pridávania komponentu a rozsah miešania a difúzie, keď sa komponenty testu kombinujú. CF-HTS môže využívať aj matrice neporézne. Neporézne matrice na test sa pripravujú spojovaním, natieraním, viazaním, fixovaním, napojením, konjugáciou alebo prichycovaním komponentov alebo testovaných vzoriek do vnútrajška alebo na povrch matrice. Použitie neporéznych matríc pri CF-HTS fixuje priestorovo jednu alebo viac zložiek testu.
Keď sa zložky testu zavedú na povrch matrice, sú komponenty testu pripojené kovalentne alebo nekovalentne, špecifickými alebo nešpecifickými interakciami s matricami, ktoré sú nederivatizované, derivatizované alebo inak vopred upravené, aby sa pripojenie zložiek testu uľahčilo. Zložka testuje po pripojení priestorovo fixovaná, takže je na účely testu imobilizovaná. V tomto prípade buď musia byť testované vzorky schopné difundovať matricu, aby dosiahli na komponenty testu a/alebo subkomponenty, alebo produkty testu musia byť schopné difundovať matricou, aby dosiahli na testované vzorky.
V jednom alebo niektorom z viac nasledujúcich krokov sa používa najmenej jedna porézna matrica obsahujúca vzorky testu.
(1) Uvedenie povrchu poréznej matrice do kontaktu s najmenej jednou inou (poréznou alebo neporéznou) matricou tak, že vzorky a/alebo viac zložiek testu môžu difundovať cez rozhranie.
(2) Oddelenie dvoch alebo viac matríc, aby sa zastavila interakcia medzi komponentmi a/alebo vzorkami.
(3) Uvedenie povrchu dvoch alebo viac poréznych matríc do kontaktu tak, že môžu zložky testu interagovať.
(4) Premytie, prepláchnutie alebo eluovanie matrice kvapalnými puframi alebo inými rozpúšťadlami, aby sa odstránili nenaviazané a/alebo nešpecifický viazané zložky testu.
(5) Rozdeľovanie, nalievanie, pridávanie alebo namáčanie zložiek testu je v roztoku na matrici alebo filtrovanie uvedených komponentov cez matricu.
(6) Zobrazenie, prečítanie, skenovanie, detegovanie alebo iné zviditeľnenie rádiometrických, fluorescenčných, spektrofotometrických alebo elektromagnetických signálov prítomných na alebo v jednej, alebo viacerých matriciach.
CF-HTS poskytuje proti skoršiemu spôsobu mnohé výhody. Neprítomnosť oddelených jamiek eliminuje nutnosť súčasne a presne rozdeľovať do jamiek zložky testu alebo reagenty. Miesto toho sa zložky testu rozdeľujú a miesia homogénnou manipuláciou dohromady. Vzhľadom na to, že zložky testu sa pripravujú pohromade ako homogénny roztok alebo ako matrica, existuje minimálne štatistické kolísania od vzorky ku vzorke. Na porovnanie, prítomnosť jamiek v 96 jamkovej úprave spôsobuje veľké štatistické kolísanie od vzorky ku vzorke.
CF-HTS ďalej zaisťuje pre veľký počet zlúčenín skríning s mimoriadne vysokou početnosťou. Dokonca aj keď zaznamenávané zásahy „prebiehajú spoločne“ v obmedzenom rozsahu, je potrebné iba znovu otestovať zlúčeniny, ktoré sú umiestnené blízko zásahu. Tak ako bolo 10 000 testovaných vzoriek sa schopných zredukovať na 50 kandidátov v okolí zviditeľnenej oblasti, je potom ľahké zredukovať 50 kandidátov na aktívnu zlúčeninu(y) i pomocou starej technológie s 96 jamkami.
Rozdelením a vysušením jednotlivých zlúčenín na plastových fóliách vo vysoko naplnených súboroch a potom ich aplikovaním v CF-HTS sa odstránia všetky kritické problémy miniaturizácie. Táto úprava nevyžaduje na miniaturizáciu inováciu plastov alebo iných materiálov, pretože miniaturizácia je dosiahnutá jednoducho obmedzením množstva vzorky, ktorá difunduje do matrice. Táto úprava tiež nevyžaduje mikrofluidiká na rozdeľovanie činidiel pre test, pretože celý test prebieha v podstate v .jednej obrej jamke“, kde sú reagenty a roztoky manipulované vo veľkom množstve. Rozdeľovanie pomocou mikrofluidík vyžadujú iba testované vzorky. Okrem toho pri tejto úprave existuje omnoho menej štatistických výkyvov, pretože je iba potrebné vyhľadať lokalizované zóny heterogenity v inak homogénnej matrici. Nemusí sa prečítať a porovnávať mnoho rozdielnych jamiek. Okrem toho ku všetkým predpokladaným blahodarným stránkam miniaturizácie (náklady, výkon, využitie reagentov, využitie testovaných zlúčenín), poskytuje CF-HTS tiež prekvapujúce výhody, ako je schopnosť uskutočniť väčšinu krokov testov pohromade.
Ústredným hľadiskom CF-HTS je pozorovanie, že zložky testu a testované vzorky stranovo nedifundujú rýchlo ani na rozhraniach medzi matricami. Keď sa na príklad agarózový gél umiestni na plastovú platňu, objaví sa výrazná kvapalina na rozhraní povrchu gélu. Keď sa vyžaduje interakcia medzi zložkou testu v géli a zložkou testu na platni (ako v príklade ELISA), je kritické, že komponent v géli je schopný difimdovať z gélu von a na dosku. Ale CF-HTS vyžaduje, aby sprievodná stranová difúzia bola značne pomalšia, takže interakcia na platni je lokalizovaná do blízkosti pôvodného umiestnenia zložky z gélu. Tie isté princípy sa týkajú každého rozhrania matrica-matrica medzi gélmi, filtrami alebo povrchmi (alebo každej inej matrice) v akejkoľvek kombinácii. Predstava, že toto difúzne správanie je kontrolovateľné, a že je všeobecne aplikovateľné na rozhranie všetkých matríc, je bezprecedentná a protichodná konvenčným predstavám.
Preferovanou metódou zavádzania testovaných vzoriek alebo zlúčenín do matrice (ako gélu alebo navlhčeného filtra) je rozmiestňovanie a sušenie malých objemov každej vzorky na povrchu, ako je povrch plastovej fólie, v takom usporiadaní, že sa dve vzorky nemôžu zmiešať alebo prekrývať a každá je špecificky umiestnená. Keď sa plastová fólia umiestni na matricu, vzorky sa rozpustia a difundujú do matrice v miestach zodpovedajúcich ich vopred definovaným umiestneniam v počiatočnom usporiadaní.
Alternatívnym spôsobom rozdeľovania testovaných vzoriek alebo zlúčenín do súboru je rozmiestňovať vzorky na poréznu matricu ako filter, kde objem každej oddelenej vzorky je dostatočne nízky, takže vzorky sa vnútri matrice neprekrývajú. Po kontakte s inou poréznou matricou, ktorá obsahuje viac kvapaliny, zlúčeniny difundujú, aby naštartovali test.
Preferovanou metódou zavádzania kombinatómych zlúčenín na báze perál do matrice je rozmiesťovanie perál náhodne alebo v pravidelnom usporiadaní na povrch, ako je povrch plastovej fólie. Perly môžu byť potom spracované tak, aby uvoľnili (odštiepili) testované zlúčeniny, pokiaľ sú na perly viazané kovalentne labilným spojom (v praxi je dobre známe fotolytické štiepenie a štiepenie kyselinou v plynnej fáze). Každá zlúčenina je potom nekovalentne spojená s oblasťou obsadenou jej pôvodnou perlou a suché zlúčeniny potom môžu byť zavedené dovnútra alebo na povrch matrice.
Alternatívnym spôsobom na zavedenie jednotlivých zlúčenín do matrice je namáčanie alebo iný spôsob nekovalentného pripojenia každej zlúčeniny do alebo na perly. Pri použití tohto spôsobu môže byť veľké množstvo zlúčenín naraz zmiešaných dohromady s perlami tak, že každá perla má na sebe stále jediný komponent. Potom môže byť zmes perál ľahko rozprestrená na povrch na zavedenie do matrice. Tento postup úplne eliminuje nutnosť manipulácie s malým objemom kvapaliny.
Keď počiatočný súbor vzoriek zavedených do matrice pri CF-HTS skúmaní má vysokú hustotu, takže jednotlivé zóny aktivity priestorovo pokrývajú počiatočné umiestnenie viac než jednej vzorky, potom je každá z týchto vzoriek potenciálnym zdrojom pozorovanej aktivity. Pri vyšších počiatočných hustotách, podľa rozmanitosti zlúčenín, ktoré budú v jednotlivých zónach prítomné, bude viac zlúčenín kandidátmi na každú zónu. Zlúčeniny môžu navzájom difundovať, ale budú mať stále svoj vlastný priestorový gradient a nebudú sa kvantitatívne miešať v žiadnom mieste. Preto stred zóny bude stále korelovať s presným umiestnením aktívneho komponentu v počiatočnom súbore. V praxi sú dosť vzácne zásahy, že je bežné opakované testovanie mnohých vzoriek, aby sa zaručila identifikácia aktívnych zlúčenín pre každú aktívnu zónu.
Alternatívnym uskutočnením vynálezu je zavedenie fyzikálnej bariéry (teda v prísnom slova zmysle uskutočnenie nekontinuálnej úpravy) do matríc testov, aby sa obmedzila vzdialenosť, po ktorú by mohli vzorky difundovať. Napríklad každý z dvoch gélov obsahujúcich enzým respektíve substrát môže byť pokrájaný pletivom („krájač sušienok“) tak, že každý gél je ďalej rozčlenený na mnoho oddelených polôh. Potom sa ešte uvedú oba gély do kontaktu tak, aby substrát a enzým mohli spolu difundovať dovnútra každého rozčleneného kúska gélu. Potom sa do každého rozčleneného kúska gélu zavedú vzorky tak, aby testy mohli prebiehať úplne nezávisle bez difúzie medzi testami. Toto uskutočnenie efektívne eliminuje niektoré z výhod CF-HTS tým, že zanáša štatistické odchýlky medzi testovanými vzorkami a fixuje objem, a teda obmedzuje signál pri súboroch s vysokou hustotou. Ale toto uskutočnenie bude ešte znamenať výhodu heterogénneho testu založeného na matrici, pri ktorom komponenty testu nepotrebujú byť rozdeľované do veľkého množstva paralelných reakčných nádobiek a eliminuje čiastočné miešanie vzoriek.
gELISA
Enzýmom spojované imunosorpčné testy (ELISA) sú heterogénne testy, ktoré detegujú väzbu medzi Ugandami v roztoku a imobilizovanými receptormi. ELISA vyžaduje mnoho krokov miešania reagentov a vypieranie, ktoré sú ťažko realizované v 96 jamkovej úprave a je možné predstaviť si aj väčší problém, keď sa jamky redukujú z 96 jamkovej úpravy na 384-jamkovú úpravu. Autori vynálezu aplikovali CF-HTS metódu na detekciu inhibície väzby medzi Ugandami a imobilizovanými cieľovými receptormi (gELISA).
Receptorom je každá molekula, ktorá môže viazať inú molekulu. Neobmedzujúcimi príkladmi sú proteíny, peptidy, nukleové kyseliny, sacharidy a komplexy predchádzajúcich príkladov. Receptor je imobilizovaný na jednej z niekoľkých matríc (receptorová matrica) vrátane, neobmedzujúci sa však len na plastové povrchy [napr. petriho miska alebo plastová platňa (Nunc)J, membrány alebo filtre, ktoré majú vysokú cieľovú väzbovú kapacitu [napr. nitrocelulóza, nylon alebo PVDF (Millipore, Coming Costar, Schleicher & Schuell, BioRad) alebo derivatizované membrány ako SAM membrány (Promega)j. Porézna ligandová matrica (napr. agarózový gél alebo porézna membrána) sa pripraví tak, že sa ligand pre imobilizovaný receptor rozdelí dovnútra alebo na matrici. Testované zlúčeniny alebo vzorky sa rozmiesťujú priamo na ligandovú matricu alebo alternatívne na alebo dovnútra matrice pre testované vzorky [napr. polystyrén (Tekra)j, polyvinylidén (napr. od Dow Brands) alebo iné flexibilné plastové fólie, alebo membrány. Testovaná matrica sa uvedie do styku s ligandovou matricou a vzorky sa nechajú difundovať do ligandovej matrice. Po vhodnej inkubačnej perióde sa ligandová matrica uvedie do kontaktu s receptorovou matricou a umožňuje sa, aby ligand a vzorky prišli do kontaktu a potenciálne difúziou reagovali s receptorom (obrázok 1 ukazuje väzbu imobilizovaného receptora R na biotinylizovaný ligand LP). Počas inkubácie sa budú ligandy viazať na imobilizovaný receptor, pokiaľ zlúčenina vzorky neinhibuje väzbu liganďreceptor.
Po príslušnej inkubačnej perióde sa receptorová matrica odstráni a premyje vhodným pufrom, aby sa odstránil nenaviazaný alebo nešpecifický viazaný ligand a vzorky. Receptorová matrica sa potom namočí v roztoku obsahujúcom reagenty testu, ktoré budú interagovať s ligandom (napr. antilátka, avidín alebo streptavidín v prípade biotinylizovaného ligandu) a schopnými byť detegované buď priamo (napr. fluorescenciou alebo rádioaktivitou), alebo nepriamo [napr. peroxidázou krenu (HRP), alkalickou fosfatázou (AP) alebo konjugátom β-galaktosidázyj. (Obrázok 2 ukazuje konjugát avidín-HRP, AHRP, pripojený na biotinylizované ligandy). Po príslušnej inkubačnej perióde sa receptorová matrica odstráni z roztoku a premyje sa vhodným pufrom, aby sa odstránil nenaviazaný alebo nešpecifický viazaný reagent. V prípade priamej detekcie signálu sa matrica zobrazí s použitím vhodnej metódy (napr. fotometrickými skenermi, CCD kamerami, filmom, vyvolávačmi fosforescencie alebo prístrojmi na detekciu scintilácie). Nepriame signály (napr. HRP alebo AP) vyžadujú dodatočnú reakciu na vyvinutie signálu, dosahovanú rozdelením substrátov alebo iných nevyhnutných reakčných komponentov do alebo na poréznu substrátovú matricu a umiestnenie tejto matrice do kontaktu s matricou receptora. Enzým (napr. HRP alebo AP) potom reaguje so substrátom (obrázok 3). Alternatívne sa precipitujúci substrát zavedie do roztoku namiesto do matrice. Pri každej zobrazovacej metóde oblasti väzby ligand/receptor budú vytvárať viditeľnú reakciu, pretože oblasti, v ktorých bola väzba ligand/receptor inhibovaná, viditeľnú reakciu vytvárať nebudú.
Väzba bunka/ligand
CF-HTS môže byť taktiež používaný na delegovanie inhibície väzby ligand/bunkový receptor. Pri tradičnom teste sa kombinuje testovaná zlúčenina, radiačné značkované ligandy a bunky, ktoré exprímujú zodpovedajúci receptor v nádobke, ako je jamka. Potom sa poskytne dostatočný čas, aby sa dovolilo receptoru viazať sa na ligand, pokiaľ nebola takáto väzba inhibovaná testovanými zlúčeninami. Akékoľvek z nenaviazaných alebo nešpecifický viazaných komponentov sú z buniek odstránené a meria sa množstvo rádioaktivity pripadajúcej na bunky. Autori vynálezu prispôsobili CF-HTS metódu na detekciu inhibície väzby ligandov na bunky. Bunky exprimujúce žiadaný receptor sú pestované alebo navrstvené na matricu (bunková matrica) ako sú, ale neobmedzuje sa to len na ne, gély, filtre alebo membrány [napr. Transwell membrány tkanivových kultúr (Coming Costar) alebo chemotaxné membrány (Neuroprobe)]. Porézne matrice (napr. agarózový gél alebo porézna membrána) sa pripravia tak, že sa značkovaný ligand pre receptor rozdelí na alebo do matrice (matrice s ligandom). Testované zlúčeniny sa rozdelia priamo na ligandovú alebo bunkovú matricu alebo alternatívne na alebo do inej matrice [napr. polystyrén (Tekra), polyvinylidén alebo inú plastovú fóliu alebo membránu; membrána so vzorkami]. Membrána so vzorkami sa uvedie do kontaktu s ligandovou matricou a takto sa umožní vzorke difúndovať dovnútra ligandovej matrice. Po príslušnej inkubačnej perióde sa ligandová matrica uvedie do kontaktu s bunkovou matricou, najlepšie na strane matrice bez buniek a umožní sa, aby dochádzalo ku styku ligandu a vzorky a difúziou k reakcii s receptorom (obrázok 4). Počas inkubácie sa budú značkované ligandy viazať na imobilizované bunky, pokiaľ vzorka neinhibuje väzbu ligand/bunka.
Po inkubácii sa bunková matrica oddelí od ligandovej matrice a premyje sa vhodným pufrom, aby sa odstránil nenaviazaný alebo nešpecifický viazaný ligand a vzorka. Bunková matrica sa zobrazí s použitím vhodnej metódy (napr. fotometrickými skenermi, CCD kamerami, filmom, fosforografmi alebo prístrojmi na detekciu scintilácie). (Obrázok 5 ilustruje vyvolanie testu na film).
Ako je ukázané CF-HTS, dosahuje všetky výhody predpokladané pre testy s „voľnou úpravou“ a môže byť aplikovaný na všetky rôzne druhy biologických alebo biochemických testov, pri všetkých rôznych typoch úprav a so všetkými rôznymi reagentmi a zariadeniami. Vzhľadom na široké aplikovateľnosti je najlepšie ilustrovaný pomocou nasledujúcich príkladov. Ale tieto príklady ilustrujú preferované uskutočnenie predkladaného vynálezu a neobmedzujú patentové nároky a špecifikácie. Bežný pracovník si ľahko uvedomuje, že zmeny a modifikácie špecifických uskutočnení môžu byť uskutočnené bez odchýlenia sa od rozsahu a ducha vynálezu. Na všetky citácie sa tu nakoniec odkazuje.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1 ukazuje vzorky gELISA testu na neporéznej matrici stýkajúcej sa s jednou stranou poréznej gélovej matrice obsahujúcej reagent testu, ktorá naopak sa stýka s neporéznou matricou nesúcou ďalší reagent testu.
Obrázok 2 ukazuje odstránenie matrice vzoriek gELISA testu a poréznu gélovú matricu, nasledované premytím a pridaním kvapalných reagentov alebo roztokov reagentov na vytvorenie reportného komplexu na neporéznej matrici reagentu
Obrázok 3 ukazuje predstavu gELISA testu spojením matrice s reportným komplexom s poréznou gólovou matricou obsahujúcou reportný substrát.
Obrázok 4 ukazuje, ako je ligandová matrica aplikovaná na povrch filtra protiľahlý tomu povrchu filtra, ktorý nesie bunky.
Obrázok 5 ukazuje, čo sa môže vytvoriť na povrchu filtra nesúceho bunky, keď sa prejaví test.
Obrázok 6 ukazuje výsledok VanA testu s použitím rôznych koncentrácií známeho, od dávky závislého inhibítora.
Obrázok 7 ukazuje výsledok EF-3 testu s použitím rôznych koncentrácií známeho inhibítora.
Obrázok 8 ukazuje kontrolný experiment gELISA testu pre interakciu proteín - proteín.
Obrázok 9 ukazuje gELISA výsledok „inhibície“ pre interakciu proteín - proteín.
Obrázok 10 ukazuje od dávky závislú väzbu radiačné značkovanej ITAM na imobilizovanom LCK.
Obrázok 11 mapuje hodnoty pixelov proti ITAM koncentrácii na znázornenie typickej väzbovej krivky väzby ligandu.
Obrázok 12 ukazuje kontrolný experiment pre interakciu ligand-bunka pri radiačné značenom IL-8.
Obrázok 13 ukazuje „inhibíciu“ interakcie ligandu IL-8 s bunkou.
Obrázok 14 ukazuje test pre inhibítory neuraminidázy.
Obrázok 15 ukazuje simultánny test 10 080 jednotlivých zlúčenín na inhibíciu neuraminidázy.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Kolorimetrický dvojstupňový gélový test na stanovenie fosfátu generovaného rezistentným vankomycín enzýmom VanA
VanA je kľúčovým enzýmom pri vankomycínovej rezistencii a katalyzuje pripojenie D-alanínu k D-alaninu alebo D-alanínu k D-laktátu. Tento enzým sa obvykle analyzuje vyvolávaním farby z fosfátu, ktorý sa uvoľňuje, keď je enzým aktívny (aktivita VanA spôsobuje hydrolýzu ATP na ADP a fosfát). Vedcom je známe, že D-cykloserín inhibuje VanA spôsobom závislým od dávky, a že sa tento inhibítor používa ako pozitívna kontrola proti iným potencionálnym inhibítorom.
Gél s enzýmom
Gél s enzýmom bol pripravený pridaním enzýmu VanA k roztavenej 1 % agaróze (vysokotopiaca sa agaróza Gibco BRL) pri 45 °C v 50 mM HEPES (kyselina N-[2-hydroxyetyl]piperazín-N'-[2-etánsulfónováj), 20 mM MgCT, 20 mM KC1, pH 7,3 do konečnej koncentrácie VanA 2 mM. Táto agarová zmes bola potom naliata do BioRad aparátu na formovanie gélu a pri 2 - 8 °C ponechaná 30 minút stuhnúť.
Gél so substrátom
Gél so substrátom bol pripravený pridaním ATP, D-alanínu a D-laktátu k roztavenej agaróze tak, aby jednotlivé komponenty mali 1 mM, 1,5 mM, respektíve 1,75 mM a pripravením gélu ako bolo opísané pre gél s enzýmom.
Matrica so vzorkou
Rady 1 μΐ alikvotných podielov série riedení 5000, 2000, 1000, 500, 200, 100 μΜ D-cykloserínu, známeho inhibítora použitého ako kontrolná vzorka, v 1 : 1 zmesi etanolu a vody, boli rozdelené na kúsok polyvinylidénchloridového (PVDC) filmu a 10 minút ponechané na usušenie.
Inkubácia enzýmu so substrátom v prítomnosti inhibítora
Gél s enzýmom bol na 5 minút uvedený do styku s matricou vzorky. Potom bol navrch gélu enzýmom umiestnený gél so substrátom a ponechaný na inkubáciu počas 15-20 minút. Potom boli oba gély odstránené a oddelené. Počas inkubácie, kde enzým katalyzuje spojenie substrátov, vytvorí fosfát v celom géli s výnimkou tých zón, v ktorých bol D-cykloserín v dostatočnej koncentrácii, aby inhiboval reakciu.
Vizualizácia testu
Na gély s enzýmom a substrátom bola naliata a rovnomerne rozdelená zmes na detekciu fosfátu pozostávajúca z čerstvo pripraveného roztoku 0,15 % Malachitovej zelene a 1,4 % molybdénanu amónneho v 1,33 N HC1. Tieto činidlá reagujú s fosfátom a ako funkciu zvyšujúcich sa koncentrácií fosfátu vyvolávajú stúpajúcou mierou tmavnúce odtiene zelenej. Sfarbenie sa nechalo vyvolávať počas 5-10 minút (obrázok 6 ukazuje vývoj sfarbenia gélu, keď sa množstvo inhibítora menilo od 5 nanomol do 0,5 nanomol). Zeleno sfarbené gély boli fotografované CCD kamerou „Stratagene Eagle Eyc“. Stupeň, pri ktorom inhibované zóny boli menej zelené, koreloval podľa očakávania s koncentráciou pridaného inhibítora. Preto môže byť tento test použitý na skúmanie inhibítorov VanA pri razení kombinatómych perál alebo zlúčenín rozdeľovaných na akýkoľvek iný povrch, ktorý je potom uvedený do styku s gélom testu.
Tento test tiež ukazuje, že úpravu gélového skríningu je možné prispôsobiť viacstupňovým reakciám. Takéto uskutočnenie je potrebné, aby táto úprava bola použiteľná na široký rad testov, pretože mnoho testov viac stupňov vyžaduje. V tomto prípade VanA test je dvojstupňovým testom enzýmovej aktivity nasledovaným vyvolaním sfarbenia. Homogénne (jednotlivý stupeň) verzie tohto testu nie sú ľahko realizovateľné, pretože sfarbenie vyvolávajúce reagenty a podmienky interferujú s aktivitou VanA a sú teda inkompatibilné s ich dodávaním do agarového gélu. Preto je teda žiaduce priestorové a časové oddelenie týchto dvoch stupňov, obsahujúce najprv test gélu s enzýmom, nasledovaný vyvolaním sfarbenia vo fáze roztoku.
Príklad 2
Dvojstupňový test detekcie fosfátu generovaného S. cerevisiae.
Elongačný faktor aktivity 3 ATPázy stimulovanej väzbou ribozómov
Keď s ribozómami interaguje fungálny elongačný faktor 3 (EF-3), stimuluje sa aktivita fosfatázy. Autori vynálezu aplikovali pre túto aktivitu CF-HTS. Bol pripravený gél s enzýmom obsahujúci EF-3 (vysoko teplotné citlivý enzým) a kvasinkové ribozómy v pufre EF-3 testu. Pripravený bol tiež gél substrátu obsahujúci 1 mM ATP v pufre testu. Obidva gély obsahovali 2 % dimetylsulfoxidu v nízkotopiacej sa agaróze (Gibco
BRL) a boli pripravené pri 37 °C a ponechané 30 minút stáť pri 4 °C. Na PVDC film boli nabodkované a vysušené (matrica so vzorkou) série riedení poly-L-lyzínu, inhibítora EF-3 použitého ako kontrolná vzorka. Potom po predchádzajúcej inkubácii gélu enzýmu s inhibítormi na matrici vzorky, bol ako v príklade 1 uskutočnený test. Potom bol gél s enzýmom na 20 minút umiestnený do styku s gélom so substrátom. Ako v príklade 1 boli gély s enzýmom a substrátom odfarbované farbou vyvolávajúcou zmesou Malachitovej zelene s molybdénanom amónnym. Gél s enzýmom bol potom zobrazený CCD kamerou. Škvrny inhibítora sa objavujú ako svetlejšie zóny v zelenom pozadí. Obrázok 7 ukazuje vývoj sfarbenia na géli, kde sa množstvo inhibítora menilo od 5 pikomol do 200 pikomol. Výsledky ukazujú od dávky závislý signál inhibítora, indikujúci, že pri tomto teste môžu byť preskúmavané zlúčeniny, aby sa odhalili nové EF-3 inhibítory. Príklad 2 demonštruje užitočnosť CF-HTS spolu s komplikovanosťou spôsobenou prítomnosťou organel alebo iných surových biologických zmesí alebo extraktov.
Príklad 3
Nepriama gELISA detekcia sfarbenia inhibítorov interakcie proteín - proteín
Ako bolo diskutované, je ELISA obvykle používaná na detekciu inhibície ligand - receptor, kde sú receptory imobilizované v mikrotitračných jamkách. Páry „ligand - receptor“ používané pri ELISA môžu obsahovať každý pár viažucich sa molekúl od proteínov alebo iných makromolekúl až do malých molekúl. Tieto testy sú komplexnými, viacstupňovými testami, ktoré vyžadujú imobilizovanie receptora, inkubovanie receptora s ligandom, premytie na odstránenie nechceného nešpecifický zadržovaného ligandu, ktorý by inak mohol spôsobovať vysoký signál pozadia, viazanie zviditelňujúcich činidiel (napr. špecifické protilátky ligandu konjugované s reportným enzýmom) na ligand viazaný k receptoru a generovanie viditeľného signálu poskytnutím substrátu pre reportný enzým. Je zrejmé, že komplexnosť ELISA viedla HTS priemysel k záveru, že ELISA nemôže byť adaptovaná pre test s voľnou úpravou. Napriek tomu však autori vynálezu adaptovali tento komplexný, viacstupňový test na CF-HTS úpravu na analýzu rôznych interakcií proteín - proteín, proteín - ligand a väzieb iných ligandov.
Aktivátor plazminogénu urokinázového typu (uPA) sa viaže na jemu zodpovedajúci receptor (uPAR). Interakcia uPAAiPAR bola dokázaná pri metastáze rôznych typov rakoviny. Autori vynálezu adaptovali tradičný uPA/uPAR ELISA na CF-HTS s použitím vyčistených receptorov a ligandov.
Matrica uPAR
Plastové platne (7,5 cm x 11,5 cm odNunc, Inc. Naperville, IL) boli cez noc pokryté 15 ml 118 nM vyčisteného uPAR vo fosfátom pufrovanej soľanke (PBS) (Life Technologies, Grand Island, NY) pri pH 7,4 a 4 °C. Po pokrytí plastových platní cez noc bol roztok uPAR dekantovaný a zvyšné väzbové miesta na plastovej platni boli blokované pridaním 15 ml PBS, obsahujúcom 1 % (hmotn./obj.) kazeínu a inkubovaná 2 hodiny pri teplote miestnosti (RT). Po blokovaní bol blokačný roztok dekantovaný a plastová platňa bola päťkrát premytá 20 ml pracieho pufra pozostávajúceho z 0,05 % Tween 20 (monolaurát polyoxyeténsorbitanu) v PBS. Po premytí bola plastová platňa sušená 10 minút pri RT. Bolo to načasované tak, že krátko na to mohla byť plastová platňa použitá v opísanom teste, aby sa zabránilo preschnutiu matrice, ktoré by mohlo viesť ku strate aktivity.
Matrica β-uPA
Na účely testu bola používaná uPA označená biotínom (b-uPA). Gély obsahujúce β-uPA boli pripravené namáčaním β-uPA do agaru kvôli vyhnutiu sa vysokým teplotám (čo je opakom liatia do roztaveného agaru z príkladov 1 a 2). Agar bol pripravený najprv miešaním 0,1 g agarózy (Sigma, St. Louis, MO) s 10 ml PBS, zahriatím dokiaľ sa neroztopila a potom odliatím do prístroja na gél 8 x 7 x 0,075 cm3 (Bio-Rad, Hercules, CA). Po stuhnutí (buď pri izbovej teplote, alebo 4 °C) boli gély pri 4 °C cez noc namočené do 15 ml β-uPA (okolo lOnM) v pufre testu pozostávajúcom z PBS, 0,05 % Tween-20 a 0, 1 % kazeínu (obidvoje od Sigma, St. Louis, MO). Hneď pred použitím bol gél 20 minút sušený pri RT.
Matrica so vzorkou
Ako kontrolná vzorka inhibítora β-uPA/uPAR väzby bol za neprítomnosti známeho inhibítora väzby uPA/uPAR s malou molekulou, použitý nebiotinylovaný uPA (Pre-uPA). Päť mikrolitrové alikvotné podiely 0, 0,03, 0,1, 0,3, 1 a 3 μΜ pro-uPA v pufre testu boli rozmiestnené na PVDC film (Dowbrands L. P, Indianopolis, IN) a 2 h sušené pri RT.
Inkubácia uPAR s pro-uPA a β-uPA
Matrica so vzorkou bola umiestnená na jednu stranu gélu obsahujúceho β-uPA so suchými bodkami pro-uPA do styku s povrchom gélu s β-uPA. 10 minút bolo pri RT ponechané, aby pro-uPA do gélu difundoval. Na to potom druhá strana gélu s β-uPA bola umiestnená na plastovú platňu, aby sa β-uPA (pôsobiaca ako li gand) a pro-uPA (pôsobiaca ako kompetitívny inhibítor) nechali interagovať s uPAR na povrchu plastovej platne. Väzba/kompetitívna reakcia boli inkubované pri RT počas 20 minút. Po inkubácii bola plastová platňa oddelená od gélu a rýchlo 4-krát premytá 20 ml vypicracieho pufra. Roztok konjugátu avidín-peroxidáza krenu (avidín-HRP) bol pripravený rozriedením avidín-HRP (Sigma, St. Louis, MO) 1 až 25 000 v pufre testu a pridaním 15 ml k plastovej platni. Reakcia bola 10 minút inkubovaná pri RT s nasledujúcim dekantovaním roztoku avidín-HRP a premytím plastovej platne ako hore. Plastová platňa bola 20 minút sušená.
Avidín sa v avidín-HRP viaže na biotín špecificky tak, že iba tie oblasti matrice, kde sa prejaví väzba „ligand/receptor“, budú eventuálne vykazovať vývoj sfarbenia. Tie oblasti matrice, kde je väzba „ligand/receptor“ kompetitívne inhibovaná účinkom pro-uPA, sfarbenie vykazovať nebudú.
Vyvolanie sfarbenia
Gél na vyvolanie sfarbenia obsahujúci kolorimetrický HRP substrát (OPD gél) bol pripravený rozpustením dvoch tabliet hydrochloridu o-fenyléndiamínu (OPD) v 7 ml rozpúšťadla (oboje z „Abbott kit no. 6172-30“, Abbott Labs., Abbott Park, IL) a spojením tohto roztoku s roztokom agarózy získanom roztavením 0,1 agarózy v 1 ml vody. 10 ml vzniknutej zmesi bolo odliatych do miniproteín II prístroja pre gél 8 x 7 x 0,075 cm a 15 minút pri 4 °C ponechaných stuhnúť. Gél bol zo sklenených platní odlievacieho stojana prenesený na PVDC film alebo flexibilnú plastovú fóliu a pri RT bol 10 minút ponechaný sušiť sa na vzduchu. Potom bol prenesený na iný PVDC film alebo flexibilnú plastovú fóliu, aby sa 10 minút ponechala sušiť druhá strana. Potom bol OPD gél umiestnený na plastovú platňu na začiatok vývoja sfarbenia. Počas inkubácie OPD, v rôznych časoch, bola plastová platňa umiestnená navrch filtra prepúšťajúceho pás 440 nm (Omega Optical, Inc., Brattleboro, VT), ktorý striedavo bol navrchu difúznej platne s optickými vláknami osvetľovanými svetelným zdrojom Fiber-Lite (oboje od Dolan-Jenner Industries, Inc., Lawrence, MA). Vznikajúce obrázky boli získané CCD kamerou (systém „Eagle Eye“, Stratagene, La Jolla CA).
Kontrolný pokus
Obrázok 8 ukazuje kontrolný pokus pre príklad 3. V obrázku 8A boli štvorčeky agarózy (1 cm2) namočené do roztokov s rôznymi β-uPA koncentráciami, ako je naznačené pod každým štvorčekom (s výnimkou 50 nM roztoku, ktorý je označený naľavo od štvorčeka agarózy). Potom, keď boli štvorčeky agarózy inkubované na plastovej platni s imobilizovaným uPAR, boli odstránené. Plastová platňa bola potom omytá a oblasti matrice, kde došlo k β-uPAAiPAR väzbe boli zviditeľnené, ako je opísané. Obrázok 8B ukazuje krivku priemerných hodnôt pixelov (bez pozadia) pre každý štvorček (ako bolo určené analýzou digitálneho obrázka z digitálnej kamery pomocou softvéru „NIH Image Analysis“) proti koncentrácii β-uPA v každom štvorčeku agarózy v rôznom čase počas vyvíjania sfarbenia OPD. β-uPA získané z agarózového gélu mali typickú väzbovú krivku receptor - ligand s polmaximom väzby (Kd) okolo 3 - 5 nM, čo je konzistentné s publikovanými hodnotami pre túto reakciu pri štandardnej ELISA a iných testoch, ktoré tento parameter merajú. Obrázok 8 ukazuje, že nepriamy kolorimetrický signál generovaný pri gELISA je kvantitatívne závislý od rozsahu interakcie ligand - receptor.
Výsledky kompetície pro-uPA^-uPA
Obrázok 9 ukazuje inhibíciu β-uPA/uPAR väzby pomocou pro-uPA. Škvrny v obrázku 9A vyznačujú oblasti, kde bola inhibovaná β-uPAArPAR väzba. Teda sa v týchto oblastiach avidín-HRP neviazal. V dôsledku toho HRP sa substráty v OPD géli na generovanie vývoja sfarbenia nereagoval. Obrázok 9B je alternatívnou cestou zobrazenia dát toho istého CCD obrázka, ktorá zvyšuje schopnosť ľudského oka vidieť kvantitatívnu titráciu.
Príklad 4
Priama radiometrická detekcia inhibitorov interakcie proteín - proteín
Aktivácia T-buniek je súčasťou imunitnej odozvy tela. Aby nastali v priebehu aktivácie T-buniek prípady v tomto smere, musí p561ck (LCK proteín) interagovať s ITAM oblasťou (s imunoglobulínom súvisejúca aktivačná jednotka na báze tyrozínu) cytoplazmových domén receptora antigénu T-bunick. Zlúčeniny, ktoré inhibujú túto interakciu proteín - proteín, sú potenciálnymi imunosupresívami. Autori vynálezu použili CF-HTS na analýzu tejto interakcie proteín - proteín, pri ktorej je LCK imobilizovaný na membráne.
LCK matrica
Biotinylovaný LCK sa imobilizuje na biotín zadržujúcej membráne (SAM membrána) (Promega Corp., Madison, WI) preliatím prúžku 11 cm x 2 cm 5 ml 3 mM LCK v PBS obsahujúcom 5 mM DTT (ditiotreitol) na 10 minút pri RT, po čom sa pufor odstráni. Je to načasované tak, aby SAM membrána mohla byť v opísanom teste použitá krátko na to (počas minút).
ITAM* matrica
Agarózový gél obsahujúci radiačné značený ITAM peptid (ITAM*) sa pripraví zmiešaním 0,1 g agarózy s 10 ml pufra, zahrievaním dokiaľ nedôjde k roztaveniu a potom odliatím do prístroja na gél 8 x 7 x 0,075 cm. ITAM* sa do finálnej koncentrácie 10 nM pridáva práve pred odlievaním alebo alternatívne namáčaním po stuhnutí gélu.
Matrica so vzorkou
Vzorky, ktoré majú byť podrobené skríningu sa rozdelia na plastový povrch alebo PVDC a vysušia sa, aby vznikla matrica so vzorkami.
Inkubácia a vizualizácia ITAM*, LCK a testovaných vzoriek
Matrica so vzorkami sa uvedie do styku s jednou stranou gélu s ITAM* tak, že testované vzorky môžu difúndovať do gélu s ITAM*. Na to sa druhá strana gélu s ITAM* uvedie do styku so SAM membránou, na ktorej bol imobilizovaný LCK. Po 15 - 45 minútovej inkubácii sa S AM membrána odstráni, premyje a zobrazí fosforografom alebo filmom. Inhibítory interakcie ITAM - LCK sú indikované zónami nižšej rádioaktivity, čo na zobrazení zodpovedá nižšej intenzite signálov.
Kontrolný pokus pre väzbu ITAM*/LCK
Agarózové gély sa pripravia zmiešaním 0,1 g agarózy s 10 ml pufra, zahrievaním dokiaľ nedôjde k roztaveniu a potom odliatím do prístroja na gél 8 x 7 x 0,075 cm. Po stuhnutí sa z gélu vyprchajú koliečka s priemerom 1 cm a cez noc sa pri 4 °C namočí do 400 ml pufra s 0,1, 0,3, 1,3, 10 a 20 nM ITAM značkovaným s l25I (Amersham, Arlington Heights, IL). Gélové koliečka sa potom z roztoku vyberú a ponechajú počas 20 minút pri RT na usušenie. Potom sa umiestni na LCK - imobilizovanú SAM membránu a inkubuje 45 minút pri RT. Gély sa odstránia a membrány sa štyrikrát premyjú pufrom. Po vysušení sa S AM membrány zobrazia pomocou fosforografu.
Obrázok 10 naznačuje na dávke závislej od väzby medzi l25I - ITAM a imobilizovaným LCK na SAM membráne.
Obrázok 11 ukazuje diagram priemerných hodnôt pixelov (bez pozadia) pre každý l25I-ITAM gél (ako bolo stanovené analýzou digitalizovaného obrazu z fosforografú pomocou softvéru ImageQuant od Molecular Dynamics) proti 125I-ITAM koncentrácii v gélovom koliečku. I25I-ITAM poskytnutý z gélu do imobilizovaného LCK mal typickú väzbovú krivku receptor - ligand.
Príklad 5
Test reportného génu celých buniek s použitím úpravy gél/filter
Obličkové bunky, známe ako HEK bunky, boli transfikované plazmidom, ktorý obsahuje promótor základnej zložky cyklickej AMP odozvy (CREB) spojený s génom luciferázy (reportný gén luciferázy od Promega). Keď sú transfikované bunky podrobené pôsobeniu forskolínu, indukuje sa expresia reportného génu luciferázy. Potom, keď sa k HEK bunkám pridá biologický pufor, obsahujúci substrát luciferázy (hmyzí luciferín od Promega) a vhodné kofaktory (20 mM Tricínu pH 7,8, 0,1 mM EDTA, 33 mM koenzýmu A, 0,5 mM adenozín trifosfátu a 1 mM MgCl2), generuje sa emisia fotónov, ktorá môže byť pomocou bežnej inštrumentácie delegovaná.
Matrica s bunkami
Bunky boli v kultúre podrobené pôsobeniu trypsínu, prenesené do Coming/Costar TRANSWELL™ membrány (3 mikrónový polykarbonátový filter s plastovou prstencovou podložkou) a cez noc inkubované pri 37 °C, 5 % CO2 v prítomnosti média na kultiváciu tkaniva. Potom bolo médium z membrány odstránené a filter, ku ktorému boli bunky prichytené, bol 15 minút na vzduchu sušený a krátko potom použitý v uvedených krokoch.
Matrica s vyvolávačom
Gél obsahujúci vyvolávač expresie luciferázy sa pripraví pridaním 12 ml 10 mM výťažku forskolínu (Sigma, výťažok v etanole) do 6 ml 1 % nízkotopiaceho agarózového gélu. Gél sa pri teplote miestnosti stuží forskolínom na konečnú koncentráciu 20 mM.
Matrica so vzorkami
Vzorky, ktoré by mohli blokovať indukciu forskolínom sa rozmiestnia a sušia na oddelených miestach na PVDC s vysokou hustotou.
Inkubácia reagentov a detekcia inhibície
Strana PVDC s inhibítorom sa inkubuje s gélom obsahujúcim vyvolávač. Potom sa gél obsahujúci forskolínový vyvolávač umiestni na bezbunkovú stranu matrice s bunkami pripravenými, ako je uvedené. Tie sa spolu inkubujú pri 37 °C a 5 % CO2 20 minút. Potom sa gél s forskolínom odstráni a matrica s bunkami sa inkubuje pri 37 °C a 5 % CO2 ďalšie štyri hodiny kvôli maximálnej expresii konštruktu luciferázy. Na detekciu enzymatickej aktivity (alebo jej inhibície), sa bunková matrica filtra fyzicky odstráni od svojho podložného prstenca a umiestni do petriho misky. Petriho miska sa zaplaví substrátom luciferázy (hmyzí luciferín od Promega) v biologickom pufre s príslušnými kofaktormi, aby sa vyvolalo svetlo ako signál. Pretože signál je lokalizovaný vnútri imobilizovaných buniek exprimujúcich luciferázu, výsledkom inhibítorov počiatočného indukčného kroku budú zóny s nižšou emisiou fotónov.
Príklad 6
CF-HTS gél/filtcr na priame stanovenie inhibítorov interakcií ligand - bunka
Väzba ligand - receptor na povrchoch buniek iniciuje v bunkách signálne cesty, ktoré na konci vedú k funkčným odozvám (napr. proliferácia alebo sekrécia biologicky aktívnych substancií). Pri regulácii biologických odoziev buniek pri chorobných stavoch sa často usiluje o inhibíciu ligandových väzieb na povrchu buniek. Všeobecnou metódou na vyhodnotenie inhibítorov väzby ligand/bunkový receptor je zhodnotenie schopnosti inhibítora redukovať väzbu medzi prírodným, radiačné značeným ligandom a bunkami. To zahrnuje inkubáciu buniek s radiačné značeným ligandom a inhibítorom, nasledovanou odstránením nenaviazaného a nešpecifický viazaného, radiačné značeného ligandu premytím a potom zmeraním množstva viazanej rádioaktivity.
Interleukín-8 (IL-8) je chemotaktický chemický druh, vyskytujúci sa pri zápaloch vo väzbe na receptory na rôznych typoch buniek. Autori vynálezu vyvinuli CF-HTS test ligand - bunkový receptor na hodnotenie inhibítorov tejto interakcie.
Matrica s bunkami
HEK bunky (ATCC, Bethesda, MD) exprimujúce IL-8 receptor boli nakladené na membránový filter s priemerom 75 mm (Coming Costar Corp., Cambridge, MA) s hustotou okolo 20 miliónov buniek na platňu. Na prichytenie sa k membránovému filtru boli ponechané cez noc v pufre (RPMI od Life Technologies, Grand Island, NY) obsahujúcom 10 mM Hepes (Sigma, St. Louis, MO) pri pH 7,2 a 37 °C. Potom, keď boli bunky prichytené na filter, boli médiá odstránené a bunky boli premyté čerstvým pufrom, aby sa odstránili akékoľvek neprichytené bunky. Filtre boli obrátené stranou s bunkami nadol a šikmo natočené, aby mohol prebytok médií odtekať a potom boli 20 minút sušené. Bolo to načasované tak, že matrica s bunkami mohla byť bezprostredne použitá v opisovanom teste.
Matrica s ligandom
Matrica s ligandom bola pripravená nasiaknutím IL-8 značeného l2íI (Amersham, Inc., Arlington Heights, IL) do agarózového gélu vytvoreného zmiešaním 0,1 g agarózy s 10 ml pufra, zahrievaním dokiaľ nedôjde k roztaveniu a potom odliatím do prístroja na gél 8 x 7 x 0,075 cm. Gély boli namáčané cez noc pri RT, za pomalého miešania na rotujúcej doske (New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, NJ). Po nasiaknutí boli gély, práve pred použitím, sušené 20 minút pri RT. Bolo to načasované tak, že gél mohol byť bezprostredne použitý v teste.
Matrica so vzorkami
Radiačné neznačený IL-8 (Genzyme Corp., Cambridge, MA) bol za neprítomnosti známeho inhibítora väzby IL-8/bunkový receptor použitý ako kontrolná vzorka inhibítora na sledovanie inhibície väzby 125I-IL-8 na HEK bunky. Na plastovú fóliu ako PVDC bolo rozdelených po jednom mikrolitry 0, 0, 03, 0, 1, 0, 3, 1, 3, 10 a 100 μΜ IL-8 a sušené bolo 1 h vo vákuu pri RT.
Inkubácia
Matrica so vzorkou bola umiestnená na jednu stranu matrice s ligandom tak, že vysušené bodky s IL-8 prichádzajú do styku s povrchom gélu. Gél bol otočený, aby sa nechala 10 minút pri RT sušiť druhá strana, a aby mohol „inhibítor“ difundovať do gélu. Na to potom boli gély umiestnené na tú stranu matrice s bunkami, kde bunky neboli. Na reakciu vzniku väzby sa nechalo inkubovať 45 minút pri RT. Potom boli gély odstránené a strana membrány bez buniek bola 4-krát premytá pufrom. Membrány sa nechali úplne vysušiť pred tým, než boli odstránené zo svojej plastovej prstencovej podložky. Potom boli membrány zobrazené buď X-lúčmi na film alebo fosforografom (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Obrázok 12 ukazuje odozvu dávky pre l2’I-IL-8 v agarózových géloch difundujúcich cez matricu s bunkami a tvoriacich väzbu s HEK bunkami exprimujúcimi receptor IL-8a. Ako je naznačené, boli niektoré z agarózových štvorčekov s jedným cm2 nasiaknuté roztokmi s rôznymi koncentráciami 125I-IL-8. Následne boli ligandom nasiaknuté štvorčeky uvedené do styku s matricou s bunkami, ako je opísané. Po inkubácii boli štvorčeky z matrice s bunkami odstránené a strana membrány bez buniek bola premytá pufrom. Na lokalizáciu na bunky viazaného 125I-IL-8 bol použitý fosforograf. Dáta ukazujú, že priame rádiometrické odpočítanie pri tomto, na géli založenom teste s bunkami, je kvantitatívne závislé od rozsahu interakcie ligand-receptor. Obrázok 12 tiež naznačuje, že väzbové oblasti zostávajú rozdielne v tvare a potvrdzuje, že bočná difúzia signálu nie je pri teste problémom.
Obrázok 13 ilustruje výsledky pokusu kompetitívnej inhibície. Inhibícia väzby medzi 125I-IL-8 a HEK bunkami je vyznačená svetlými škvrnkami. Je tiež hneď zrejmé, že inhibícia neznačkovaným IL-8 je kvantifikovateľné závislá od dávky. Tieto dáta znamenajú, že inhibítory, v tomto prípade predstavované neznačkovaným IL-8, môžu prejsť matricou s bunkami a redukovať väzbu medzi 125I-IL-8 a bunkami.
Príklad 7
Test gél - menej funkčné bunky na filtri
Zmeny bunkových funkcií sa často merajú sledovaním účinkov testovaných zlúčenín alebo vzoriek na reportné systémy vmanipulované do buniek. Príklady zahrnujú pozorovanie účinku na syntézu fluoreskujúcich intracelulámych proteínov ako zelený fluoreskujúci proteín (GFP), extraceluláme proteíny ako receptory alebo adhézne molekuly, alebo špecifické enzýmy ako luciferázu, chlóramfenikolovú acetyltransferázu, alebo β-galaktosidázu (Promega). Najprv sa s bunkami inkubujú testované zlúčeniny. Potom sa bunky ponechajú, aby vo vhodnom čase exprimovali reportný proteín (môžu to byť minúty, hodiny alebo dni). Potom sa priamymi metódami (napr. GFP) alebo nepriamymi metódami (napr. ELISA techniky s proteínmi viazanými na membránu) analyzuje úroveň reportného proteínu. Ďalej, v prípade enzýmov, môže byť bunka rozrušená, aby sa mohol extrahovať reportný proteín a analyzovať enzýmová aktivita. Pri iných testoch funkčných buniek sa meria správanie alebo lokalizácia špecifických molekúl ako farbív alebo radiačné značených metabolitov pri odozve na stimuláciu receptora alebo zmenách fyziológie buniek, ako je potenciál membrány.
ELISA test merania účinku zlúčenín na expresiu intercelulámej adhéznej molekuly-1 (ICAM-1) môže byť pre CF-HTS upravený nasledovne. Endotelových buniek exprimujúcich ICAM-1 bolo okolo 5000 buniek/mrrT nakladených na polykarbonátovú chemotaxnú membránu (Neuroprobe). Bunky boli v médiu inkubované cez noc pri 37 °C. Médium bolo odstránené a membrány sa nechali čiastočne usušiť 10 minút pri RT. Vzorky alebo zlúčeniny, ktoré boli testované na indukciu ICAM-1, boli sušené na plastových fóliách a uvedené do styku s tou stranou vlhkej membrány, kde neboli bunky. Zlúčeniny sa ponechali 1 h pri 37 °C interagovať s bunkami vo vlhkej komore a potom boli bunky zmočené v médiu a inkubované 5 h pri 37 °C.
Po poskytnutí času, v ktorom bunky indukovaný proteín syntetizovali, bolo médium z membrány odstránené a bunky boli inkubované v pufre obsahujúcom anti-ICAM-1 protilátku (Genzyme, R&D systémy) buď nekonjugovanú, alebo konjugovanú s fluóresceín-izotiokyanátom (FITC) alebo biotínom. Po 30 minútach inkubácie pri RT bol pufor odstránený a bunky boli niekoľkokrát premyté, aby sa odstránil nenaviazaný anti-ICAM-1. V prípade konjugovanej FITC protilátky bola membrána zobrazená s použitím CCD kamery (Stratagene, Imaging Research) s excitáciou pri 485 nm a emisiou pri 520 nm. Zlúčeniny, ktoré stimulovali expresiu ICAM-1, budú rezultovať v zóne so zvýšenou fluorescenciou vďaka viazaniu FITC-anti-ICAM-1 protilátky. V prípade protilátky konjugovanej s biotínom sa bunky inkubujú pri RT 10 minút v pufre obsahujúcom avidín-HRP. Pufor sa odstráni a nenaviazaný avidín-HRP sa vymyje. Membrány sa potom namočia do pufra obsahujúceho substrát precipitujúci HPR ako tetrachlorid diaminobenzidínu (Pierce) a pozoruje sa vývoj sfarbení v miestach, kde podložené bunky boli indukované, aby či sa exprimovanie ICAM-1. V prípade nekonjugovanej anti-ICAM-1 protilátky sa s bunkami nechá reagovať konjugovaná sekundárna anti-anti-ICAM-1 protilátka a potom nasleduje vyvolanie signálu príslušným substrátom pre konjugát. Obrázky sa snímajú CCD kamerou. Všetky z týchto variácií (FITC, avidín-HRP a anti-anti-ICAM-1) sú alternatívnymi stanoveniami, ktoré by mali poskytovať tie isté kvalitatívne výsledky - totiž vzorky, ktoré ovplyvňujú expresiu ICAM-1 môžu byť korelované k zónam zvýšeného alebo zníženého signálu.
Je treba poznamenať, že matrice na kontinuálnu úpravu v tomto prípade sú membrána a plastická fólia. Pre CF-HTS nie je gél nevyhnutný.
Príklad 8
CF-HTS test jednotlivých zlúčenín na inhibíciu neuraminidázy
Matrica so vzorkou
Zbierka 528 jednotlivých, štruktúrne príbuzných zlúčenín bola testovaná pomocou CF-HTS. Na riedenie zlúčenín z fľaštičiek do 96-jamkových platní a na riedenie a transfer zlúčenín na plastovej fólii bol použitý Packard Multiprobe MP204 DT. Na začiatku boli zlúčeniny zriedené zo 40 mM v DMSO z fľaštičiek na 4 mM v DMSO do 96-jamkových platní. Potom boli zriedené zo 4 mM v DMSO na 200 μΜ v 50 % EtOH/H2O v 96-jamkových platniach. Tieto vzorky boli v 1 μΐ duplikátoch prenesené na plastové fólie 8 cm x 8 cm, priemerne s 5 mm rozostupmi medzi vzorkami (Bio-Rad kat. č. 165 - 2965), pre celkom 192 vzoriek na fólii. Každá 1 μΐ bodka teda obsahovala približne 200 pmol jednotlivej zlúčeniny zo zbierky. Ako kontrola boli na každú fóliu blízko zlúčeninám ručne rozdelené série riedení 2,3-dehydro-2-deoxy-N-acetylneuramínovej kyseliny (DANA), známeho inhibítora neuraminidázy (Boehringer Mannheim č. 528544). Fólie boli vysušené vo vákuovej sušiarni tak, že každá zlúčenina bola vysušená na svojom vlastnom mieste na fólii.
Matrica s enzýmom
Pred testom bol enzým chrípkovej neuraminidázy 1500-krát nariedený z fosfátom pufrovanej soľanky s 25 % glycerolu do skvapalneného agarového gélu pozostávajúceho z 1 % agarózy, 50 mM citrátu sodného pH 6,0 a 10 mM chloridu vápenatého pri 40 °C. Bolo odliatych 8 cm x 8 cm x 0,75 mm enzýmového gélu a stužené znížením teploty na 4 °C.
Matrica so substrátom
Syntetický substrát chrípkovej neuraminidázy, 2'-(4-metylumbeliferyl)-a-D-N-acetylneuramínová kyselina (Sigma, kat. č. 8636), bol zriedený z 3 mM v DMSO na 30 μΜ do skvapalneného agarového gélu a to bolo odliate podobným spôsobom, ako je opísané pre gél s enzýmom.
Inkubácia a detekcia
Matrica s enzýmom bola umiestnená na matrici so vzorkou na tú stranu, kde boli usušené zlúčeniny, o ktoré ide. Potom bola matrica so substrátom naskladaná navrch matrice s enzýmom. Matrice boli inkubované 30 minút pri RT. V tomto čase zhášaný fluorescenčný substrát a enzým difundovali spolu medzi dvoma gélmi, substrát bol enzýmom štiepený a spôsoboval vzrast intenzity fluorescencie. Bolo to monitorované excitáciou pri 340 nm a emisiou pri 450 nm. Zlúčeniny, ktoré sú schopné inhibovať aktivitu enzýmu, vzrast intenzity fluorescencie znižovali na najmenšiu mieru. Ako pri géloch vzrástla vo väčšine miest intenzita fluorescencie, oblasti, ktoré obsahovali inhibítory enzýmu, ktoré difundovali do gélu z plastovej fólie, boli vidieť ako tmavšie miesta s nižšou fluorescenciou. To sa ľahko monitorovalo pomocou CCD kamery s vhodnými filtrami na kontrolu vlnových dĺžok emisie a excitácie. Identita zlúčenín vykazujúcich zóny inhibície bola stanovená podľa umiestnení zón vzhľadom na matricu s inhibítorom. Porovnávaním fluorescencie DANA kontroly so známymi množstvami každého testovaného inhibítora bolo pre každú zlúčeninu uskutočnené kvantitatívne stanovenie IC50.
Všetkých 528 zlúčenín zbierky bolo testovaných dvojmo. Celkový objem použitého gélu s enzýmom bol 33 ml alebo 31,25 μΐ na test. Ďalej boli všetky zlúčeniny testované súčasne a podmienky testu boli v porovnaní s tradičným 96-jamkovým testom konštantné. Navyše ďalej, ako ukazuje obrázok 14, bol test dostatočne citlivý, aby delegoval inhibítory so silou iba 100 μΜ. IC50 hodnoty nájdené pre aktívne zlúčeniny dobre súhlasia s tými, ktoré boli zistené pre tie isté zlúčeniny pri nákladnejšom 96-jamkovom teste, ktorý na test vyžadoval 200 μΐ. Pozri tabuľku „Výsledky kvantitatívneho gélového testu“. Tieto príklady ukazujú, že testovanie zlúčenín v skupinách s vysokou hustotou znižuje náklady a čas. Napríklad aj menšia redukcia rozostupu zlúčenín na 2,5 mm namiesto 5 mm má za následok štvornásobný vzrast počtu zlúčenín testovaných v jednotke objemu. V tomto pokuse by to na testovanú zlúčeninu prinieslo zníženie objemu pod 10 μΐ. S reagentami sa ešte zachádza pohromade, bez nutnosti mať zariadenie na manipuláciu s malými objemami kvapalín používaných pri miniaturizovanom skríningu.
Ako príklad sledovaný na demonštráciu výhod tejto miniaftirizácie bolo pomocou CF-HTS testovaných 10 080 jednotlivých zlúčenín pri celkovom objeme enzýmového gélu 17 ml (menej než 2 μΐ na test). Na rozmiestnenie 30 nl každého zo vzoriek oddelených po 1 mm bola použitá „Packard Multipette“. Zlúčeniny boli rozmiestňované v DMSO pri koncentrácii 5 mM tak, že približne 150 pmol každej zlúčeniny bolo nanesených na plast. Ako kontrolný inhibítor bol znova použitý DANA. Okrem obvyklej kontrolnej titrácie mimo súbor zlúčenín, bol vnútri samotného súboru zahrnutý slepý pokus, pri ktorom boli kontrolné vzorky ošetrené rovnako ako 10 080 neznámych, keď boli rozmiestňované na plast. Ako predtým boli fólie usušené a použité v teste s neuraminidázou. Všetkých 10 080 vzoriek bolo touto metódou súčasne preskúmaných za menej než jednu hodinu. Opäť nebolo potrebné mikrofluidikim a/alebo manipulácia s malými objemami okrem okamihu, keď boli zlúčeniny na počiatku rozmiestňované na fóliu. Extrémne vysoká hustota pri tomto teste neinterferovala s detekciou inhibítora. Navyše ďalej vysoká hustota nekomplikovala identifikáciu aktívnych zlúčenín, aj keď fluorescenčné zlúčeniny (ľahko pozorovateľné v géli ako jasnejšie škvrny) boli v najbližšom susedstve aktívnych zlúčenín. Pozri obrázok 15.
Výsledky kvantitatívneho gélového testu
| Vzorka č. | Približné max, Ki (μΜ) z gélu | ICso (μΜ) zistené pri 96íamkovom teste |
| 34 | 100 | >100 |
| 35 | 80 | >100 |
| 36 | 80 | 42 |
| 37 | 100 | >100 |
| 38 | 100 | >100 |
| 39 | 100 | >100 |
| 40 | 40 | 32 |
| 41 | 100 | >100 |
| 42 | 40 | 50 |
| 43 | 100 | >100 |
| 44 | >200 | >100 |
| 45 | 100 | >100 |
| 46 | 100 | >100 |
| 47 | 10 | 7,5 |
| 48 | 100 | >100 |
| 49 | 100 | >100 |
| 50 | 100 | >100 |
Claims (12)
1. Spôsob súčasného testovania množstva vzoriek rôznych látok na ich spôsobilosť zosilňovať alebo inhibovať biologický proces, zahŕňajúci (a) uloženie malého objemu každej z viac než 96 vzoriek rozdielnych látok v usporiadaní na matricu tak, že každá jednotlivá látka je sústredená na svoje vlastné odlíšené miesto a identita každej látky môže byť určená z jej miesta uloženia;
(b) uvedenie tejto matrice do styku s prvou poréznou matricou obsahujúcou alebo nesúcou rovnomerne rozptýlené prvé skúšobné činidlo a umožnenie, aby časť z každej látky difundovala do uvedenej poréznej matrice takým spôsobom, že priestorové umiestnenie každej difundovanej látky môže byť korelované s miestom na uvedenej matrici, na ktorom bola uvedená látka pôvodne uložená, a (c) uskutočnenie testu na stanovenie schopnosti každej difundovanej látky zosiľňovať alebo inhibovať uvedený biologický proces pozorovaním interakcie každej látky s uvedeným skúšobným činidlom, vyznačujúci sa tým, že uvedená matrica je planáma matica.
2. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že ďalej zahŕňa stupeň (bl) uvedenia uvedenej prvej poréznej matrice do styku s druhou matricou nesúcou alebo obsahujúcou druhé rovnomerne rozptýlené skúšobné činidlo a umožnenia, aby druhé skúšobné činidlo difundovalo do prvej poréznej matrice, alebo umožnenia, aby každá látka a prvé činidlo difundovali do druhej matrice, pričom sa v poslednom uvedenom prípade zaistí, aby difúzia prebiehala tak, že priestorové umiestnenie každej látky v druhej matrici môže byť korelované s miestom na uvedenej planámej matrici, na ktorom bola uvedená látka pôvodne uložená, a (cl) uskutočnenia stupňa (c).
3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, v y z ných skúšobných činidiel je makromolekula.
4. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, v y z ných skúšobných činidiel je enzým.
5. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, v y z ných skúšobných činidiel je surový biologický extrakt.
6. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujú ných skúšobných činidiel sú organely.
7. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2,vyznačuj ú ných skúšobných činidiel sú celé bunky.
8. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci šobným činidlom sú celé bunky nesené na jednom povrchu planámej poréznej matrice.
9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sa uvedená interakcia zaznamenáva stykom uvedenej poréznej matrice s roztokom alebo kvapalnou suspenziou činidla alebo s poréznou matricou obsahujúcou činidlo, čo v jednom aj druhom prípade napomáha zviditeľneniu proteínu, ktorého expresia v uvedených celých bunkách je biologickým procesom, ktorý je hodnotený.
tým tým tým že jedným z rovnomerne rozptýleže jedným z rovnomerne rozptýleže jedným z rovnomerne rozptýleže jedným z rovnomerne rozptýleže jedným z rovnomerne rozptýlet ý m , že rovnomerne rozptýleným skú15
10. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že prvým skúšobným činidlom je značený ligand a druhým skúšobným činidlom je imobilizovaný receptor pre uvedený ligand.
11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa druhá matrica vymýva na odstránenie celého značeného ligandu, ktorý difundoval na alebo do uvedenej druhej matrice, ale nenaviazal sa na
5 uvedený imobilizovaný receptor.
12. Spôsob podľa nároku 11,vyznačujúci sa tým, že sa uvedená druhá matrica uvedie do styku s roztokom alebo kvapalnou suspenziou činidla alebo poréznou matricou obsahujúcou činidlo, čo v jednom i druhom prípade napomáha pri vizualizácii značeného ligandu, neodstráneného vo vymývacom stupni.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/990,168 US5976813A (en) | 1997-12-12 | 1997-12-12 | Continuous format high throughput screening |
| PCT/US1998/026465 WO1999030154A2 (en) | 1997-12-12 | 1998-12-11 | Continuous format high throughput screening |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK8362000A3 SK8362000A3 (en) | 2000-10-09 |
| SK286095B6 true SK286095B6 (sk) | 2008-03-05 |
Family
ID=25535858
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK836-2000A SK286095B6 (sk) | 1997-12-12 | 1998-12-11 | Spôsob súčasného testovania množstva vzoriek rôznych látok |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5976813A (sk) |
| EP (1) | EP1038179B1 (sk) |
| JP (1) | JP4558197B2 (sk) |
| KR (1) | KR100657777B1 (sk) |
| CN (2) | CN1281552A (sk) |
| AT (1) | ATE336001T1 (sk) |
| AU (1) | AU759538B2 (sk) |
| BG (1) | BG65264B1 (sk) |
| BR (1) | BR9815059A (sk) |
| CA (1) | CA2310684C (sk) |
| CY (1) | CY1106220T1 (sk) |
| CZ (1) | CZ299740B6 (sk) |
| DE (1) | DE69835537T2 (sk) |
| DK (1) | DK1038179T3 (sk) |
| ES (1) | ES2270539T3 (sk) |
| HK (1) | HK1032996A1 (sk) |
| HU (1) | HU228578B1 (sk) |
| IL (1) | IL135793A (sk) |
| NO (1) | NO326662B1 (sk) |
| NZ (1) | NZ504112A (sk) |
| PL (1) | PL194813B1 (sk) |
| PT (1) | PT1038179E (sk) |
| SK (1) | SK286095B6 (sk) |
| TR (1) | TR200001647T2 (sk) |
| TW (1) | TW555967B (sk) |
| WO (1) | WO1999030154A2 (sk) |
Families Citing this family (64)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1991365A (zh) | 1996-01-26 | 2007-07-04 | 沃尔科股份有限公司 | 根据人类hiv病毒株的表型药物敏感性控制hiv阳性病人化疗的方法 |
| US6790652B1 (en) * | 1998-01-08 | 2004-09-14 | Bioimage A/S | Method and apparatus for high density format screening for bioactive molecules |
| US6410332B1 (en) * | 1998-09-08 | 2002-06-25 | Symyx Technologies, Inc. | Sampling and analysis of reactions by trapping reaction components on a sorbent |
| EP1149282A2 (en) * | 1998-12-18 | 2001-10-31 | Symyx Technologies, Inc. | Apparatus and method for characterizing libraries of different materials using x-ray scattering |
| US20040185432A1 (en) * | 1999-01-08 | 2004-09-23 | Bioimage A/S | Method and apparatus for high density format screening for bioactive molecules |
| US6690399B1 (en) * | 1999-05-07 | 2004-02-10 | Tropix, Inc. | Data display software for displaying assay results |
| US6800437B1 (en) | 1999-08-06 | 2004-10-05 | Tibotec Bvba | Method of monitoring a biological system by labeling with an apo metal binding protein |
| US6544480B1 (en) | 1999-10-26 | 2003-04-08 | Tibotec Bvba | Device and related method for dispensing small volumes of liquid |
| EP1268052A2 (en) * | 2000-03-24 | 2003-01-02 | Mark B. Lyles | High throughput screening array containing porous material |
| US20030031675A1 (en) | 2000-06-06 | 2003-02-13 | Mikesell Glen E. | B7-related nucleic acids and polypeptides useful for immunomodulation |
| US20030219825A1 (en) * | 2000-06-13 | 2003-11-27 | Haizlip Jill Elaine | High throughput method for screening candidate compounds for biological activity |
| US7087375B1 (en) | 2000-06-23 | 2006-08-08 | Johan Lennerstrand | Method for determining the mechanism of HIV RT inhibitors |
| US7052659B1 (en) * | 2000-07-18 | 2006-05-30 | General Electric Company | Sequential high throughput screening method and system |
| US6653124B1 (en) | 2000-11-10 | 2003-11-25 | Cytoplex Biosciences Inc. | Array-based microenvironment for cell culturing, cell monitoring and drug-target validation |
| AUPR224600A0 (en) * | 2000-12-21 | 2001-01-25 | Polymerat Pty Ltd | Novel polymers |
| US20030060695A1 (en) * | 2001-03-07 | 2003-03-27 | Connelly Patrick R. | Implantable artificial organ devices |
| US7244232B2 (en) * | 2001-03-07 | 2007-07-17 | Biomed Solutions, Llc | Process for identifying cancerous and/or metastatic cells of a living organism |
| US20020142304A1 (en) * | 2001-03-09 | 2002-10-03 | Anderson Daniel G. | Uses and methods of making microarrays of polymeric biomaterials |
| US20080009019A1 (en) * | 2001-06-13 | 2008-01-10 | Smithkline Beecham Corporation | High throughput method for screening candidate compounds for biological activity |
| DE10138766A1 (de) * | 2001-08-07 | 2003-02-20 | Bayer Cropscience Ag | Verfahren zum Identifizieren von makrocyclischen Polyketiden |
| US20030032198A1 (en) * | 2001-08-13 | 2003-02-13 | Symyx Technologies, Inc. | High throughput dispensing of fluids |
| EP1298433A1 (en) * | 2001-09-28 | 2003-04-02 | EMC microcollections GmbH | Device and method for the generation of arrays of substance mixtures by diffusion |
| JP2005511066A (ja) * | 2001-12-07 | 2005-04-28 | ダイアックス、コープ | 磁気応答性粒子を洗浄する方法及び装置 |
| US7087418B2 (en) * | 2001-12-19 | 2006-08-08 | Bristol-Myers Squibb Company | Pichia pastoris formate dehydrogenase and uses therefor |
| US20050054118A1 (en) * | 2002-02-27 | 2005-03-10 | Lebrun Stewart J. | High throughput screening method |
| WO2003072752A2 (en) * | 2002-02-27 | 2003-09-04 | Miragene, Inc. | Improved substrate chemistry for protein immobilization on a rigid support |
| US20040072274A1 (en) * | 2002-05-09 | 2004-04-15 | Lebrun Stewart J. | System and method for visualization and digital analysis of protein and other macromolecule microarrays |
| AU2003222676B2 (en) | 2002-05-10 | 2009-04-23 | Anteo Technologies Pty Ltd | Generation of surface coating diversity |
| EP1900827A3 (en) | 2002-05-21 | 2008-04-16 | Bayer HealthCare AG | Methods and compositions for the prediction, diagnosis, prognosis, prevention and treatment of malignant neoplasia |
| US20040028804A1 (en) * | 2002-08-07 | 2004-02-12 | Anderson Daniel G. | Production of polymeric microarrays |
| AU2003255253A1 (en) * | 2002-08-13 | 2004-02-25 | Discovery Partners International | Spotting pattern for placement of compounds in an array |
| US20040032058A1 (en) * | 2002-08-13 | 2004-02-19 | Neeper Robert K. | Systems and methods for casting and handling assay matrices |
| US8557743B2 (en) | 2002-09-05 | 2013-10-15 | Dyax Corp. | Display library process |
| US20040058327A1 (en) * | 2002-09-20 | 2004-03-25 | Pan Jeffrey Y | Method for using a blank matrix in a continuous format high throughput screening process |
| WO2004092903A2 (en) * | 2003-04-09 | 2004-10-28 | Discovery Partners International | Spot finding algorithm using image recognition software |
| US7025935B2 (en) * | 2003-04-11 | 2006-04-11 | Illumina, Inc. | Apparatus and methods for reformatting liquid samples |
| US20070128603A1 (en) * | 2003-05-28 | 2007-06-07 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostic and therapeutics for diseases associated with 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 7 (5-ht7) |
| JP2005046121A (ja) * | 2003-07-31 | 2005-02-24 | Japan Science & Technology Agency | オンチップバイオアッセイ方法及びキット |
| US20050136536A1 (en) * | 2003-09-15 | 2005-06-23 | Anderson Daniel G. | Embryonic epithelial cells |
| US20050069462A1 (en) * | 2003-09-30 | 2005-03-31 | International Business Machines Corporation | Microfluidics Packaging |
| US20050069949A1 (en) * | 2003-09-30 | 2005-03-31 | International Business Machines Corporation | Microfabricated Fluidic Structures |
| EP1892306A3 (en) | 2003-10-06 | 2008-06-11 | Bayer HealthCare AG | Methods and kits for investigating cancer |
| US20060127963A1 (en) * | 2003-11-21 | 2006-06-15 | Lebrun Stewart J | Microarray-based analysis of rheumatoid arthritis markers |
| CA2545550A1 (en) | 2003-12-02 | 2005-06-16 | Basf Aktiengesellschaft | 2-methyl-6-solanylbenzoquinone methyltransferase as target for herbicides |
| US20050124017A1 (en) * | 2003-12-05 | 2005-06-09 | Stewart Lebrun | Quantitative alkaline-phosphatase precipitation reagent and methods for visualization of protein microarrays |
| US7881871B2 (en) * | 2003-12-12 | 2011-02-01 | Bio-Layer Pty Limited | Method for designing surfaces |
| US20090253769A1 (en) * | 2004-01-21 | 2009-10-08 | Gessica Filocamo | Inhibitors of mammalian hdac 11 useful for treating hdac 11 mediated disorders |
| EP1564556A1 (de) | 2004-02-17 | 2005-08-17 | DST Diagnostic Science & Technology GmbH | Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung mehrerer Analyten mit simultaner interner Kontrolle |
| US8101431B2 (en) | 2004-02-27 | 2012-01-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements and reagent delivery systems |
| US8105849B2 (en) | 2004-02-27 | 2012-01-31 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements |
| US8168445B2 (en) | 2004-07-02 | 2012-05-01 | Bio-Layer Pty Limited | Use of metal complexes |
| US20080206855A1 (en) * | 2005-05-06 | 2008-08-28 | Kalypsys, Inc. | Automated Compound Screening Using Gel-Permeation Matrix and Pin-Based Sample Transfer |
| US7629115B2 (en) * | 2005-05-13 | 2009-12-08 | Honeywell International Inc. | Cell-based platform for high throughput screening |
| WO2007053186A2 (en) | 2005-05-31 | 2007-05-10 | Labnow, Inc. | Methods and compositions related to determination and use of white blood cell counts |
| WO2007064902A2 (en) | 2005-12-02 | 2007-06-07 | Sirtris Pharmaceuticals, Inc. | Mass spectrometry assays for acetyltransferase/deacetylase activity |
| WO2007076580A1 (en) * | 2005-12-30 | 2007-07-12 | Bio-Layer Pty Limited | Binding of molecules |
| US8715665B2 (en) | 2007-04-13 | 2014-05-06 | The General Hospital Corporation | Methods for treating cancer resistant to ErbB therapeutics |
| US20090118135A1 (en) * | 2007-06-08 | 2009-05-07 | The Burnham Institute | Methods and compounds for regulating apoptosis |
| US20090272657A1 (en) * | 2008-05-01 | 2009-11-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Devices and processes for analyzing nucleic acid damage and repair using electrophoresis |
| EP2877483B1 (en) * | 2012-07-25 | 2019-05-15 | Bio-rad Laboratories, Inc. | Targeted delivery of reagents through patterned transfer sheets |
| US9447135B2 (en) | 2012-12-14 | 2016-09-20 | University Of Kentucky Research Foundation | Semi-synthetic mithramycin derivatives with anti-cancer activity |
| GB201318814D0 (en) * | 2013-10-24 | 2013-12-11 | Petroleum & Chemical Corp | Microfluidic devices and arrangements for supplying such devices with reagents and biological samples |
| JP6509230B2 (ja) | 2013-12-23 | 2019-05-08 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ | 昆虫の一過性受容体電位ｖ（ｔｒｐｖ）チャネルの調節因子を決定する方法 |
| US11467168B2 (en) | 2017-07-27 | 2022-10-11 | University Of Southern California | Methods of identifying a moldulator of otopetrin-mediated proton translocation activity |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4447526A (en) * | 1981-04-20 | 1984-05-08 | Miles Laboratories, Inc. | Homogeneous specific binding assay with carrier matrix incorporating specific binding partner |
| AR231590A1 (es) * | 1981-04-29 | 1984-12-28 | Ciba Geigy Ag | Dispositivo de analisis inmunologico y procedimiento para obtenerlo |
| US4591570A (en) * | 1983-02-02 | 1986-05-27 | Centocor, Inc. | Matrix of antibody-coated spots for determination of antigens |
| JP2564181B2 (ja) * | 1988-11-24 | 1996-12-18 | コニカ株式会社 | 特定成分の分析方法 |
| DE4208645A1 (de) * | 1992-03-18 | 1993-09-23 | Bayer Ag | Optischer festphasenbiosensor auf basis fluoreszenzfarbstoffmarkierter polyionischer schichten |
| WO1994002515A1 (en) * | 1992-07-21 | 1994-02-03 | Bunsen Rush Laboratories Inc. | Oligomer library formats and methods relating thereto |
| CA2130947C (en) * | 1993-11-12 | 2001-02-06 | Robert E. Emmons | Dry elements, test devices, test kits and methods for chemiluminescent detection of analytes using peroxidase-labeled reagents |
| US5856083A (en) * | 1994-05-06 | 1999-01-05 | Pharmacopeia, Inc. | Lawn assay for compounds that affect enzyme activity or bind to target molecules |
| AU691296B2 (en) * | 1994-05-06 | 1998-05-14 | Pharmacopeia Drug Discovery, Inc. | Combinatorial dihydrobenzopyran library |
| GB2291708B (en) * | 1994-07-22 | 1997-03-05 | Zeneca Ltd | Process for screening a library of compounds released from a solid phase |
-
1997
- 1997-12-12 US US08/990,168 patent/US5976813A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-12-10 TW TW087120533A patent/TW555967B/zh not_active IP Right Cessation
- 1998-12-11 NZ NZ504112A patent/NZ504112A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-12-11 KR KR1020007006322A patent/KR100657777B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-12-11 BR BRPI9815059-6A patent/BR9815059A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-12-11 IL IL13579398A patent/IL135793A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-12-11 AT AT98963130T patent/ATE336001T1/de active
- 1998-12-11 CZ CZ20002078A patent/CZ299740B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-12-11 PT PT98963130T patent/PT1038179E/pt unknown
- 1998-12-11 DK DK98963130T patent/DK1038179T3/da active
- 1998-12-11 EP EP98963130A patent/EP1038179B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-11 SK SK836-2000A patent/SK286095B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-12-11 CN CN98812079A patent/CN1281552A/zh active Pending
- 1998-12-11 ES ES98963130T patent/ES2270539T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-11 CN CNA2008100817676A patent/CN101256187A/zh active Pending
- 1998-12-11 WO PCT/US1998/026465 patent/WO1999030154A2/en active IP Right Grant
- 1998-12-11 AU AU18216/99A patent/AU759538B2/en not_active Ceased
- 1998-12-11 JP JP2000524662A patent/JP4558197B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-11 PL PL341655A patent/PL194813B1/pl unknown
- 1998-12-11 TR TR2000/01647T patent/TR200001647T2/xx unknown
- 1998-12-11 HU HU0100207A patent/HU228578B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-12-11 CA CA2310684A patent/CA2310684C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-11 DE DE69835537T patent/DE69835537T2/de not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-04-19 NO NO20002079A patent/NO326662B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-06-27 BG BG104564A patent/BG65264B1/bg unknown
-
2001
- 2001-03-14 HK HK01101849A patent/HK1032996A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-10-26 CY CY20061101543T patent/CY1106220T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK286095B6 (sk) | Spôsob súčasného testovania množstva vzoriek rôznych látok | |
| EP1002233B1 (en) | High-throughput assay | |
| US20030166015A1 (en) | Multiplexed analysis of cell-substrate interactions | |
| US20060177877A1 (en) | Methods for identifying combinations of entities as therapeutics | |
| US20080194421A1 (en) | Screening system for identifying drug-drug interactions and methods of use thereof | |
| JP3340715B2 (ja) | 被検体、その相互作用又は反応動力学を定量的又は定性的に測定する方法及びサンプルキャリア | |
| AU2002323317A1 (en) | A screening system for identifying drug-drug interactions and methods of use thereof | |
| EP0774116B1 (en) | Method for screening compound libraries | |
| MXPA00005800A (en) | Continuous format high throughput screening | |
| Groebe et al. | Putting thought to paper: a μARCS protease screen | |
| WO2007024014A1 (ja) | 分子間相互作用測定方法及びこの方法を用いた測定装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC4A | Assignment and transfer of rights |
Owner name: ABBVIE INC., NORTH CHICAGO, IL, US Free format text: FORMER OWNER: ABBOTT LABORATORIES, ABBOTT PARK, IL, US Effective date: 20120801 |
|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees |
Effective date: 20171211 |