HU228578B1 - Continuous format high throughput screening - Google Patents

Continuous format high throughput screening Download PDF

Info

Publication number
HU228578B1
HU228578B1 HU0100207A HUP0100207A HU228578B1 HU 228578 B1 HU228578 B1 HU 228578B1 HU 0100207 A HU0100207 A HU 0100207A HU P0100207 A HUP0100207 A HU P0100207A HU 228578 B1 HU228578 B1 HU 228578B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
matrix
screening
reagent
gel
samples
Prior art date
Application number
HU0100207A
Other languages
English (en)
Inventor
Bruce A Beutel
Mark E Schurdak
Martin J Voorbach
David J Burns
Mary K Joseph
Original Assignee
Abbott Lab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Lab filed Critical Abbott Lab
Publication of HUP0100207A2 publication Critical patent/HUP0100207A2/hu
Publication of HUP0100207A3 publication Critical patent/HUP0100207A3/hu
Publication of HU228578B1 publication Critical patent/HU228578B1/hu

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/00527—Sheets
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00585—Parallel processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00596—Solid-phase processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/0061—The surface being organic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/0063—Other, e.g. van der Waals forces, hydrogen bonding
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00639—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium
    • B01J2219/00641—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium the porous medium being continuous, e.g. porous oxide substrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00702—Processes involving means for analysing and characterising the products
    • B01J2219/00707—Processes involving means for analysing and characterising the products separated from the reactor apparatus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
  • Paper (AREA)
  • Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Geophysics And Detection Of Objects (AREA)
  • Image Processing (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

FOLYAMATOS FORMÁJÚ, .NAGY TELJESÍTMÉNYŰ SZŰRŐVIZSGÁLATI ELJÁRÁS
A lalátoásy tárgyúi képezi eljárás vizsgálati minták biológiai vagy biokémiai akiivitásának szűrővizsgálatára, továbbá nagyszámú minta - adott biológiát folyamatot serkentő vagy gátoló képessége szempos^ából történő - egyidejű: vizsgálatára.
A találmány szerinti, folyamatos formájú, nagy teljesítményű szűrésre (CF-HTS, '‘contiriuous formát hígh i&roughput screening”) alkalmas eljárás legalább egy porózus hordozó anyag (mátrix) alkalmazásával nagy számú kémiai entitás biológiai vagy biokémiai aktivitásának széles körére történő egyidejű szűrővizsgálatát teszi lehetővé a gyógyászati Iparban.
Biokémiai és biológiai szűrővizsgálati: eljárásokat aktivitási vizsgálatok („test”) széles körére terveznek a fehérje-fehérje kölcsönhatásoktól, enzirnkatalizistől, kismolekala-feiiérje kötéstől kezdve a sejtes működésekig. Egy nagy íeljesúméuyű szűrés (HTS; „bigh throughpat sereening”) során ilyen szűrővizsgálati eljárások („assay'’) nagy számú kémiai entitás vizsgálatára alkalmazhatók, hogy a kémiai entitások korábban nem ismert biológiai vagy biokémiai akűvltásait felismerjük.
Homogén és, heterogénx£feöyigsgálatl.el járások
As összes, különböző fajta biológiai szűrővizsgálati eljárás két nagy csoportra osztható: homogén és heterogén szűrővizsgálati, eljárásokra, Homogén szűrővizsgálati eljárásokban az összes reagenst együtt adjuk és az eredményt minden további manipuláció nélkül mérjük vagy értelmezzük. A Petii-csészéa szaporodó sejtek példán! egy kémiai anyaggal hozhatók kapcsolatba. Ha a kémiai anyag toxikus a sejtre, egy egyszerűen megfigyelhető tiszta zóna jelzi a toxfeiiást. figy másik példa szerint sejteket alkalmazunk, amelyek egy olyan fehérjét expresszálnak, amely megváltoztatja a sejt színét. Béía-galaktözidází (β-galj expresszáló sejtek esetében az xg&l-t tartalmazó ugaron szaporodó sejtek erősebben vagy gyengébben lesznek kékek attól foggően, hogy menynyi b-gal-fehérjs expresszálódik. Ily módon homogén szűrővizsgálati eljárás készíthető bármilyen biológiai lépésre, amely egy ripodergéu, például a bélagalakiozioáz-gén expressziójára hat. A homogén szűrővizsgálati eljárás még egy másik példájában olyan, szuhszíráíot alkalmazunk, amely egy enzim aktivitásának követitezíében megváltoztatja a .színéi vagy a fluoreszcenciáját. Végűi' az olyan technológiák, mist például a szeinttilációs közelségi szűrővizsgálati eljárás (SPÁ, Semíiliaíioít Proximíty Assay”) az Amershamtöl közvetlenül méri egy radioaktiván jelölt ligahd kötődését egy fehérjéhez vagy hárnűlyen, szcintiilációs anyagot tartalmazó gyöngyökhöz rögzített ligsndkölő anyaghoz. Az: előzőekben felsorolt példák mind .homogén szűrővizsgálati eljárások, mivel nem igényelnek más lépést, mini: a. reagensek hozzáadását a végső kimutatás, mérés vagy a jel leolvasása előtt.
A heterogén .szűrővizsgálati eljárások viszont legalább kés lépést igényelnek, amelyek mivel lényegüket tekintve bizonyos mértékig összeíérheíetlenek, sem egyeslfoetők egyetlen lépésbe. Például sok heterogén szűrővizsgálati eljárásban egy bizonyos meghatározott sorrendben kell adni: a reagenseket (pl. ha némelyik reagens gátolná a szűrővizsgálati eljárás első lépéseit,, de szükséges a későbbi lépésekhez). Ilyen általánosan Ismeri: példák az olyas szűrővizsgálati eljárások, amelyekben szignáikifejlesztö reagenseket adunk, hogy közvetetten kimutassuk egy reakelőterrnék jelenlétét vagy koncentrációját. A heterogén szűrővizsgálati eljárásokban egy másik általánosan előforduló lépés a mosási: lépés. Szűrővizsgálati eljárások elején gyakran feleslegben kell adni a reagenseket, de a következő lépések előtt ki kell mosni, hogy a reakciók magas háttérszignál néiküi mes-
jenek végbe. Radioakőwn jelölt ilgand esetében példán! a radioakűvan jelöli lígandot először- egy fehérjével inkubáljök, a-Ktdy egy szilárd felülethez vas. kőivé, de a ligend csak egy kis része kötődik aktuálisa» a korlátozott számú fehérjéhelyttoe. ínknháciő után a meg nem kötött ligaadot ki 'kell mosni a megkötött r&dioakrívtin jelöli ligsttd pontos mérése előtt, A mosási lépés többiek módon végrehajtható, például szűréssel, mo•sás/elöntés, kicsapás/bteisszéíválasztás és/vagy cestrifűgáíás ciklusokkal.
Sok biológiai és biokémiai folyamat csak heterogén eljárásokkal mérhető. Továbbá, annak ellenére, hogy van lehetőség más biológiai és biokémiai folyamatokat homogén eljárásokra. adaptálni, ezek -a más· folyamatok heterogén eljárásokkal gazdaságosabban működnek és/vagy könnyebben hozzáiíóthetö reagensekkel. Sokféle eljárás és reagenskésztet kapható kereskedelmi forgatómba» homogén technológiákhoz, mint példán! az SEA-hoz (Arattste»), fluoreszcens polarizációhoz (íol-ley és. mások) és idöfeihontásos (”íbse resolved) fkioreszcenciához (Packard és mások) hogy csak néhányat említsünk. Az ilyen eljárások alkalmazása azonban további költséget von maga alán és több időt igényel. Sok szűrővizsgálati eljáráshoz a heterogén eljárások, jobban kialakultak és ilyeneket könnyebb gyorsait kifejleszteni. Ez okbő! kifolyólag az olyan, heterogén eljárások, mint például az ELÍSA, filterkőtés, R1A, tucifem sejtes szűrővizsgálati eljárás, stb. továbbra is széles körben alkalmazottak. Ezen eljárások közül néhányat az alábbiakban: részletesen tárgyalunk.
A gyógyászati éveken keresztül ipar egvro növekvő mértékben támaszkodik a kémiai vegyületek könyvtárainak nagy·· teljesítményű szűrésére (HTS), hogy hatóanyag, esélyes vegyületeket találjon. A HTS egy olyas eljárás, amelyben sok, különálló vegyidet vizsgálható egymás melleit, így vizsgálati vegyületek biológiai aktivitása nagy számban vizsgálható egyidejűleg. vagy közel egyidejűleg. Mostanában a legszélesebb körben kialakított technológiák 9ö-íyükú míkrotiierlemezeket alkalmaznak. Ebben a formában 96 független vizsgálat végezhető el egyidejűleg.egy 8 cm x 12 cm műanyag lemezen, amely 9ő reakciólyukat tartalmaz. Ezekben a lyukakban a szűrővizsgálati térfogat jellemzően 50 pl és 500 pl között van, A lemezeken kívül sokféle eszköz, anyag, pípet-ázó, automatizált eszközök, femezmosók és lemezleoívasők kaphatók kereskedelmi forgalomban a 9ó-íynkú formához igazodva, homogétt és heterogén, szűrővizsgálati eljárások széles köréhez,.
Jelenleg a HTS továbbfejlesztésére irányaié erőfeszítések a lyukak kisebb méretűvé tételét célozzák meg ímíaíaíűrizálás). Amennyiben csökken a lyuk mérete, növelhető a lyukak száma a lemezen, amely több egymás melletti vizsgálati lehetőséget biztosit, A szűrővizsgálati eljárások térfogatának csökkentésével továbbá csökken az. egy·' vizsgálatra jutó reagens költsége is. Ezen kívül, mivel több egymás melletti vizsgálat végezhető kisebb térfogattal, egyidejűleg több vizsgálati vegyület tesztelhető balóaeyag esélyes vegyületek azonosítása céljából. A miniatürizálás eddig kis mértékben javította a 9ő-!yukű technológiát a 384-iyukű foraa (96 x 4} előállításával, Lásd, Conűey és mtsai., J. Bfomol. Screenmg 2(3), 171-78 í 1997), .Még nagyobb sűrűségű formáról is jelenték meg közlemények, példán! ŰöOO-lynkú formától. .A mimafünsálásnak azonban megvannak a velejáró költségbeli és bonyolultsági vonzatúi.
Ezek a. költségbeli és bonyolultsági tényezők közvetlenül kapcsolatosak a szűrővizsgálati eljárási fonna rniniaülrlzálásának három elsődleges összetevőjéből. Az első az, hogy a vizsgálati edényeket (csöveket, lyukakat, gödröket) kisebbé kel! tenni, A második, hogy az. összes, szükséges szűrővizsgálati reagenst pontosan kell tudni adagolni több és kisebb lyukakba fáhakíbao folyadékadagoló robotokkal végzik, amelyek egyidejűleg adagolják a reagenseket több lyukba), A harmadik, hogy a vizsgálati eredményeket nagy sűrűségű elrendezés3 φ ***· φ «*< · * ♦ ♦ »’ ♦ ♦ * * * *»<
ben („array) le kell tudni olvasni.
Figyelembe véve az egymás melletti, fflggellen szűrővizsgálati. eljárások követelményeit, azok minden összetevője kihívást: jelent és oseghatározza annak korlátáit, hogy a miniatürizálás mennyire megvalósítható és aomjás gazdaságos. Például egy újabb, kisebb forrna a rengessek adagolásának teljesen más módját kívánja, vagy olyas leolvasó készüléket igényei, amelynek leibontása, érzékenysége és működése Összefér az újabb, míníattlrizált formával. Amint csökken a lyukak mérete, bonyolultabbá, időigényesebbé é.s költségesebbé válik a reakcióedények elrendezése, a reagensek kisebb mennyiségekben történő adagolása, és a vizsgálati minták leolvasása. Továbbá, a kisebb nüstssnéretek növelőt: a minták közötti statisztikai variabilitást a reagensek kisebb mennyiségeinek adagolásából és a gyengébb mmtajelek méréséből következő pontatlanságok miatt. Ezenkívül, amint a mítttsiméret egy bizonyos pont alá csökken, az olyan tényezők, min? párolgás vagy felületi feszültség, még nagyobb költséggel és bonyolultsággal terheli az újabb, miniatürizált fonnák megvalósítását.
A lITS-tcohnológíáhan mennyiségi ugrást jelentene, amelyre az iparban na-gry igény: mutatkozik, a “szabad. formájú szűrővizsgálati eljárás vagy a minták közötti fizikai korlát nélkül? szaró vizsgálati eljárás lehetősége. Általában olyan formát képzelnek el, amelyben kis cseppeket vizsgálnak lyukak nélkül, azonban jelenleg senki, sem számok be ííTS^ben szabad formájú szűrővizsgálati eljárás alkalmazásáról hagyonrányos, különálló vegyülstkészletteh
A kombinatorikus kémia beköszöntővel kémiai entitások milliói állíthatók elő gyorsan szilárd hordozókon (általában gyöngyökön). Habár a 96-iysrkas formát alkalmazzák gyöngy alapú könyvtárak szűrővizsgálatára, ezt a formát általában nem tartják hatékonynak, mivel (1) minden gyöngy a kémiai entitás csak kis mennyiségé? iaríalmazza, (2) a vizsgálandó vegyületek száma roodktvül magas, és (3) a gyöngyökkel nehéz dolgozni Üő-íyuká m ikrotiterlemezekbes,
A kombinatorikus könyvtárak 96-lyukú formában történő szűrővizsgálatával járó problémákat elkerülendő. néhányon beszámoltak egyszerű, homogén szűrővizsgálati eljárások alkalmazásáról, amelyek szabad fortttájűként jeliemezhetók. Péidáui Jayawiekreme és munkatársai [Proc. Natl Acad. Sci, (USA) 191,1614-1$ (1994)]: leírtak egy egyszerű, homogén szűrővizsgálati eljárást pigmeolsejtek (melanociták) alkalmazásával ktimbinatoriktis pepíídkönyvlárak vizsgálatára. A szerzők sejteket: helyeztek agaröz alá Peírt-csésaébe, majd a kombinatorikus vegyületeket hordozó gyöngyöket rakták az sgasr felületére, es a gyöngyökből részlegesen felszabadították a vegyületeket. Az aktív vegyületek sötét, pigmentált területtel figyelhetők meg, mivel ahogy a vegyületek lokálisan a gélmátrixba difímtdáhník, az aktív vegyületek a sejteket színváltozásra késztetik.
Egy másik, új példáról Dániel Chelsky számolt be Stottegies for Scroetting Combmatorial Libraries: Növel and Traditfonal Approaehes, First Annoal Coaference of The Society fór Biomolecular Sween&tg, Philadelphia, PA (1995 november 7-10). Chelsky karbon-anhidfoz kimutatására .egy egyszerű, homogén, -enzimes szűrővizsgálati eljárást: agaróz, gélen belülre helyezett oly módon, hogy: a gélben lévő enzim színváltozást okos az egész gélben. Ezek szerint a kombinatorikus vegyületeket egy fotokapcsolón keresztül hordozó gyöngyöket a gélen belülre helyezte és a vegyületeket UV fénnyel részlegesen felszabadította. As enzimei, gátló vegyületek gyengébb színváltozást mutató, helyi, gáiláss zónaként figyelhetők meg. Végül pedig Saltntm é.s munkatársai [Moleeular Diversity 2, 57-Ő3 (1996)3 közöltek egy, jaywiefeeme és munkatársaiéhoz hasonló eljárást, amelyben kombinatorikus könyvtárat vizsgáltak olyan vegyületek után, amelyeknek cúetoxikm; hatásuk vau agaiban növő fokos sejtekre,
Mindhárom példa az andbakteriáks vagy rákellenes hatóanyagok kimutatására szolgáló, bevált gél szSrővízsgáhrti eljárások variációja és hasonló a közismert immunológiai szűrővizsgálat; eljárásokhoz, amelyekben egy andgémm lesanyag kölcsönhatást mérnek a gélben. Ezek a gélpenneáciás· szűrővizsgálati eljárások jól alkalmazhatók .gyöngy alapú kombinatorikus könyvtárak szűrővizsgálatára, azonban essek a formának heterogén szűrővizsgálati eljárássá vagy nem gyöngy alapú könyvtárak szűrővizsgálatára történő kiterjesztéséről nemjelent meg közlemény.
A hagyományos tapasztalat elbátortalanította a kutatókat a minták folyamatos formában történő vizsgálatától, amely a mániák keveredését tenné lehetővé. A korlátozott fajtájú, leírt szűrővizsgálati eljárások közül, többek között a folyamatos formában a minták összefutásától való félelem miatt, csak gyöngy Apó könyvtárakéi vizsgálnak. Ezen korlátoknak köszönhetően a kutatók ágy vélik, begy a %-íy»kú fonna alkalmasabb heterogén és nem gyöngy alapú könyvtár szűrővizsgálatára, Kivánstos lenne heterogén szűrővizsgálati eljárásokat szabad formád felálh'íásban kivitelezni. Továbbá kívánatos lesne különálló vegyüieteket .vzabad formájú felállításban vizsgálni.
A kővetkezőkben röviden összefoglaljuk a találmánytA találmány tárgyát képező folyamatos formájú, nagy teljesítményű szűrővizsgálati eljárás (CF-HTS) sikeresen alkalmazza a szabad formájú elvet bármilyest szűrővizsgálati eljárásra, homogénre vagy heterogénre, amely 96-lyeká formában végrehajtható. A CF-HTS továbbá a&almas kombinatorikus könyvtárak heterogén szűrővizsgálati eljárással történő szűrővizsgálatára, nem pedig csak homogén szűrővizsgálat; eljárásokkal. Á CP--HTS-sel továbbá külőírillő vegyüieteket vizsgálhatók a mirnatürisáeiöval járó költségek és bonyolultság nélkül. A reagenseknek és a vlzsgálsti eredményeknek az -egymás után következő lépések során történő összefutásának lehetőségével kapcsolatos aggodalmak alaptalannak bizonyultok,.
A találmány egyik nsegsmlóstíási módja szerint a találmány tárgyát képezi minták biológiai vagy biokémiai aktivitásának vizsgálata oly mórion, hogy
a) több vizsgálati mintát íéívlszünk egy pofoz» szűrővizsgálati hordozó anyagba (mátrixba) vagy hordozó anyagra (mátrixra), amely adott -esetben egy vagy több szűrővizsgálati komponenst tartalmaz,
b) legalább egy hordozó anyagot (mátrixot} alkalmazunk egy vagy több szűrővizsgálati komponensnek a szűrővizsgálati eljárásba juttatására, ahol a hordozó anyag; (mátrix) lehet pofoz» szűrővizsgálati hordozó anyag (mátrix) vagy nem porózus szűrővizsgálati hordozó anyag (mátrix), es
-c) a következő lépésekéi hajtjuk végre
i) mossuk a szűrővizsgálati eljárásban alkalmazott, bártrélyes hordozó anyagot (mátrixot), hogy eltávolítsák a vizagátotí minta, a szűrővizsgálati komponens vagy ezek kombinációjának felesleges mennyiségét, vagy ii) kapcsolatba hozzuk, a vizsgálatban alkalmazott, bármilyen hordozó anyagot (mátrixot) egy további, egy térfogatban levő („búik”) oldat vág)·' folyadék formában lévő reagenssel.
Másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát képezi ntfoísk biológiai vagy biokémiai aktivitásának vizsgálata oly módon, hogy több vizsgálati mintát félviszűnk egy porózus szűrővizsgálati mátrixba vagy mátrixra, amely adott esetben egy vagy több szűrővizsgálati komponenst tartalmaz, és legalább két, további mátrixot alkalmazónk a szűrővizsgálati eijáfos végrehajtására.
Még egy további megvalósítást mód szerint a találmány tárgyát képezi 96-nál több vizsgálati minta biológiai vagy biokémiai aktivitásának vizsgálata oly módon, hogy 9ő-nál több vizsgálati mintát feivíszürtk egy porózus szűrővizsgálati mátrixba vagy- mátrixra, amely adott esetben egy vagy több szűrővizsgálati komponenst tartalmaz, és végrehajtjuk a szűrővizsgálati eljárást.
A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük.
Az 1, ábrán gELISA vizsgálati mintákat mutatunk be egy nem porózus mátrixon, mely kapcsolatban áll a szűrővizsgálati reagenst tartalmazó, porózus gélmátrix egyik oldalúval, amely viszont egy további szörővizs-gálati reagenst hordozó, «em porózus máüixszal érintkezik,
A 2. ábrán a gEUSA vizsgálatimsuta-snátrix és a porózus gáliaátnx eltávolítását matatja, amelyet tnosás és folyadék vagy oldatban lévő reagensek hozzáadása kövei, hogy kialakuljon a riporterkomplex a oetn porózus reagensmátrixon.
A 3, ábrán a gBLiSA szűrővizsgálati eljárás láthatóvá tételét mutatjuk be ariporterkomplex-mádixnak a riporietsztibsztfátoi tartalmazó porózus gélmátrixszai történő kapcsolatba kerülésével,
A 4. ábrán azt mutatjuk be, hogy hogyan alkalmaztunk egy ligamlmátrixot a filter felületen a sejteket hordozó filterfelületlel ellentétes oldalon.
Az 5, ábrán azt mutatjuk be, hogy milyen a sejteket hordozó főtér felülete, amikor a szűrővizsgálati eljárást láthatóvá tesszük,
A 6, ábrán a VanA szűrővizsgálati eljárás eredményét matatjuk be egy ismert, dözísfbggő inhibitor különböző koncentráciőhrsk alkalmazásával.
A ?, ábrán egy EF-3 szűrővizsgálati eljárás eredményét mutatjuk be egy ismert inhibitor különböző koncentráció inak a Ik al utazásé val,
A ·§, ábrán fölfetje-fehérje kölcsötfestás gELISA szűrővizsgálati eljárásának koniroilkisérietét mutatjuk be,
A 9. ábrán febérje-febérje kölcsönhatás gátlásának gELISA eredményét mutatjuk be.
A 10, ábrán radioáktivan jelölt 1TAM dozisfűggS kötődését mutatjuk be immobiiizálí LCK-boz.
Ali, ábra grafikoajá» a pixolériékeket mulatjuk be az 1TAM konceatrációval szemben, hogy egy jellemző receptor-ligand kötési görbét szemléltessünk.
A 12. ábrán radioaktívan jelölt Π..-3 ligaud-sejt kőlcsönhatásá-iakkoaírolíkisérletét mutatjuk be,
A 13. ábrán az, 1L.-S Ügtard-sejt kölcsönhatás gátlását .mutatjuk be.
A 14. ábráfi neuramimdáz inhibitorok szűrővizsgálati eljárását mutatjuk be.
A 15. ábrán löOSó különálló vegyület nearsműttááz inhibitorok utáni, egyidejű sz&ővízsgálaií eljárását mutatjuk be.
A következőkben részletesen ismertet jók a találmányt.
A CF-HTS alapjául szolgáló központi elv az, hogy a vizsgálati mintákat egy porózus mátrixba ágyazzuk. Az eljárás szerint egy·· vagy több szűrövizxgáteíi komponenst egy mátrix, például gél, műanyag lap, Eltér vagy más, kőnrtysn. marúpuláíbató formájú, szilárd hordozó belsőjébe, tetejére vagy az aljára helyezünk, Amikor a mintákat a porózus mátrixhoz juttatjuk, eléig lassan difíundóinak althoz, hogy a szűrővizsgálati eljárás elvégezhető legyem a vizsgálati minták összefutása nélkül. A CF-HTS lomra tehát s vizsgálati mintákat inkább diffúzióval választja el, mint átjáfbatatlan akadállyal. Ha a vizsgálatokat túl sokáig végezzük a vizsgálati minták és eredmények végöl is össze&teak. Megfelelőképpen időzítve azonban a CP-HTS vegyüietek egyidejű
V 9 szűrővizsgálatát teszi lehetővé nagyon magas sűrűséggel, ás mégis egyedileg anélkül, hogy egyedi lyukakat vagy reakrióedényeket oldószerekkel vagy szűrövizsgábfi kmspwensekkeí «teg kellene tölteni.
Továbbá, a reakriőkomponeaseket tartalmazó mátrixok manipulálásával még összetettebb heterogén szűrővizsgálati eljárások is elvégezhetők ebben a formában. Heterogén szűrővizsgálati eljárásokhoz mátrixok manipulálása teljesen új, és a Cf-HTS-í ugyanolyan rugalmassá teszi, mini a 96-íyukas formát biológiai vagy biokémiai folyamatok széles körének szűrővizsgálatában. A CF-HTS továbbá biztosítja. a miniatürizálással járó előnyöket a velejáró hátrányok nélkül, és vannak sajátos előnyei.
A CF-HTS mátrixok és szűrővizsgálati komponensek széles körét alkalmazza. Mátrixok például de •nem kizárólag agaráéból, akrilamidból vagy más zselatmos artyngokbiSi álló gélek, membránok, filterek. és műanyagok. A mátrixok anyaga például., de nem kizárólag; pnllszíirés!, polipropilén, órás műanyagok, papírrost, üveg, üvegszál kova, poltkarbonáí, poliészter, poiívinliidén-klorid és polietilén. A mátrixok lehetnek átjárhatatlan szilárd .anyagok, porózus szilárd anyagok, roiot például filterek vagy gélek. A szűrővizsgálati komponensek például, de sem. kizárólag arakroroolekulák, mint például nuklelnsavak, fehérjék és más szintetikus vagy tejrnészetes makromolekula sejtek, sejtemésztmények, biológiai kivonatok, sejiszervek és más, összetett biológiai entitás vagy keverék, és kis molekulák, mist például puffeeli, sók, inhibitorok, szahsztrátok, peptidek, festékek, nakleoridok, koísktorok, ionok és oldószerek.
A CF-HTS szűrővizsgálati eljárás olyan szűrővizsgálati eljárás, -amelyben a több vizsgálati minta vagy vegyület inkább diffúzió útján vsa elválasztva, mintsem átjárhatetlan. akarlállyál. A kritikus lépés a több (egysél nagyobb számú) vizsgálati minta felvitele a porózus szűróvszsgálsil mátrixba vagy mátrixra, amely adod esetben egy vagy több szűrővizsgálati komponenst is tartalmaz, A szűrővizsgálati komponenseket tartalmazó porózus szűrővizsgálati mátrixokat a komponenseknek a mátrixhoz történő hozzáadásával, keverésével, öntésével, széiadagoiásával vagy ásatásával készítjük, A porózus mátrixok a szűrővizsgálati komponenseknek a mátrix felületébe vágj' felületére tőrtéaő kapcsolásával, borításává!, kötésével, rögzítésével, csatolásával, egyesítésével Is készíthetők. A porózus mátrix továbbá oldat- vagy folyadékaim formájában is elkészíthető a sejtek, az enzim vagy más ««mobilizált szűrővizsgálati komponens felett. A porózus szűrővizsgálati mátrixot a komponens hozzáadásának rendje és/vagy időíartmna ellenőrzésére, és a szűrővizsgálati komponensek egyesítésekor a keveredés és a diffúzió mértekének ellenőrzésére alkalmazzuk. A CF-HTS sem porózus mátrixokat is alkalmazhat, A sem porózus mátrixot a szűrővizsgálati komponenseknek vagy a vizsgálati vegyieteknek a nem porózus mátrix felületére történő kapcsolásával, borításával, kötésével, rögzítésével, csatolásával vagy egyesilésével készítjük. A CF-HTS»be.n a nem porozás mátrixok térben rögzítések egy vagy több szűrővizsgálati kompetenst.
Amikor a szűrővizsgálati komponenseket egy mátrix felületére visszük, a szűrővizsgálati komponensek kovalensen vagy acm kovalensén, specifikus vagy nent specifikus kőicsőah&l-lsokkal kapcsolódnak a mátrixszal, amelyet szánuazékképezés nélkül vagy származékot képezve vagy más módon előkezelve alkalmazunk a szűrővizsgálati komponensek kapcsolódásának elősegítése céljából A hozzákapcsolás után a szűrővizsgálati komponensek térben rögzítettek, ily mórion, immohllrzáitak a szűrővizsgálati eljárás céljára. Ebben az esetben vagy a vizsgálati mintáknak kell a mátrixon kereszdilditrűndalsi ahhoz, hogy a szűrővizsgálati komponenseket elériék, és/vagy a szűrővizsgálati komponensek alkompttíteosesnek vagy termékeinek keli toriul keresztüídiffimááins a mátrixon, bogy elérjék a vizsgálati mintákat.
< X
Legalább egy, a vizsgálati mintákat tartalmazó porózus mátrixot alkalmaznak a következő lépések bármelyikében vagy többjében:
(1) A porózus mátrix felületét kapcsolatba hozzuk legalább egy másik (porózus vagy nem porózus) mátrixszal ágy, hogy a minták, és/vagy a szörővizsgálati komponensek egyike vagy többje az érintkező felületen keresztül tudjon diüündálni.
(2) Elválasztjuk a két vagy több mátrixot, hogy a komponensek és/vagy a minták kölcsönhatását leállítsuk..
(3) Két vagy több mátrix felületét kapcsolatba hozzák úgy, hogy a szűrővizsgálati kemponensek kölcsönhatásba tudjanak lépni.
(4) Mossuk, öblítjük vagy slaáljuk a mátrixot folyékony pufferekkel vagy más oldószerekkel, hogy a nem kötődött és/vagy nem specifikusa» kötődött szűrővizsgálati komponenseket eltávolítsák, (5) Az oldatban lévő szűrővizsgálati komponenseket hezzáadagoljuk, öntjük, hozzáadjuk a mátrixhoz vagy a mátrixszal áztatjuk vagy a komponenseket keresziülször jük a. mátrixon.
(6) Az egy vagy több mátrixon vagy mátrixban lévő mdiomeíríás, líuoreszxeus, spektrofotometriás vagy elektromagnetikusszignálokat képalkotással, leolvasással, letapogatással, detektálással vagy más mórion láthatóvá tesszük.
A CF-H'í'S-nek sok előnye van a technika eddigi állása szerinti technológiákkal szemben, A különálló lyukak hiánya szükségtelenné teszi: a szűrővizsgálati komponensek vagy reagensek egyidejű és pontos szétosztását a lyukakba. Ehelyett a szűrővizsgálati komponenseket homogén módon, egy térfogaiban kezeljük, osztjuk szét és keverjük. Mivel a szűrővizsgálati komponenseket homogén, egy térfogatban lévő („búik”) oldat vagy mátrix formájában készítjük, minimális a minták közötti statisztikai variáció. Összehasonlításképpen a 96iyukú formában a lyukak jelenléte nagy minták közötti eltérést eredményez.
A CF-ífFS továbbá nagyszámú vegyület különösen nagy sűrűség» szűrővizsgálatát teszt lehetővé. Még ha a megfigyelt találat bizonyos mértékig össze Is tat, csak a találat körül elhelyezkedő vegyületeket keli újra vizsgálni. Ily módon, ha 1090Ü vizsgálati vegyületet sikerül a láthatóvá tett terület körűit Sö esélyes vegyidéire csökkenteni, az 5Θ esélyes vegyidet könnyen tovább csökkenthető az aktív vegyüleí(ek)re akár a régi 96-lyakas technológiával,
A különálló vegyületeknsk egy műanyag lapon, igen szaros elrendezésben történő szétosztásával és szárításává^ majd Cf-HTS-aez alkalmazásával, & miniatürizálás; minden kritikus pontját megcélozzuk. Ez a forma nem kíván újítást á műanyagokban vagy más anyagokban, hogy a miniatürizálást végre lehessen hajlani, mivel a miniatürizálást egyszerűen a mátrixba diífoudáló minta mennyiségének korlátozásával érjük el. Ez a fonna nem kíván mikmfolyadék-adagolókat a szűrővizsgálati reagensek szétosztására, mivel az egész szűrővizsgálati eljárás gyakorlarilsg egyesien óriási lyukban” megy végbe, amelyben a reagsttseket és az oldatokat egyetlen térfogatban kezeljük. Csák a. vizsgálati mintákat kell raikmfolyadék-adagolökksl szétosztani. Továbbá sokkal kevesebb statisztikai eltérés lép fel ennél a formánál, mivel csak helyi heterogenitás! zónákat kell keresni a máskülönben homogén mátrixban. Nem szükséges sok különböző lyukat leolvasni és összehasonlítani. A miniatürizálás előrevetíted összes előnyén tói (költség, teljesítőképesség, reagenshasználat, vizsgálati vegyület alkalmazása), a CE-HTS olyan meglepő előnyöket is biztosít, műd az, hogy a szilróvizsgálsí legtöbb lépése egy» térfogatban kezelhető.
«»«* ♦ ♦♦
A CF-HTS központi elve az a megfigyelés,, miszerint a szűrővizsgálat; komponensek és a vizsgálati minták oldalirányban neszt dtfEsndálnak gyorsan, még a mátrixok közötti érintkező felületeken sem- Például, amikor egy agarőz gélt helyezünk egy snüanyag lemezre, jelentős mennyiségű folyadék található a gél felületén az érintkező felületeknél. Ha a gélben és a lemezeit levő szűrővizsgálati komponens között kölcsönhatás szükséges (mint az ELISA példában), thntíís, hogy a gélben: lévé komponens ki tudjon dlöundáloi a gélből a lemezre. A CF-HTS azonban megköveteli, hogy a kísérő, oldalirányú diffúzió- számottevően lassabb legyen, igy a lemezen Fellépő kölcsönhatás a gél alapú komponens eredeti helyzete köré korlátozódjon. Ugyanezeket az elveket alkalmazzuk gélek, Étterek vagy bármilyen kotnbinácídban lévő felületek (vagy bármilyen más mátrixok) közötti bármilyen mátrix-mátrix érintkező felületekre. Annak a felismerése, hogy ez a diffúziós viselkedés ellenőrizhető és általánosságban minden mátrix határfelületre alkalmazható példa nélkül álló és a hagyományos ismeretekkel ellentétes.
Egy előnyős eljárás a vizsgálati mintáknak vagy vegyületeknek egy mátrixra (példám egy gélre vagy megnedvesített filterre) történő felvitelére minden minta kis mennyiségeinek egy felületen, példát;! egy műanyag lap felületén, történő széisdagolása és szárítása olyan elrendezésben, hogy két minta ne keveredjen vagy ne fedjen át, és mindegyiknek egy meghatározott helye legyen. Amikor a műanyag lapot egy mátrix felületére helyezzük, a minták feloldódnak és a snátrixba diffundálnak az eredeti elrendezés szerint oseghatározott elhelyezkedésnek megfelelően.
Egy más módszer a mintáknak egy elrendezés szerint történő szétosztására az, hogy a ntíntákat egy porózus mátrixra, például filterre szétadagoljuk, ahol a szétadagolt minták mennyisége elég kicsi ahhoz, hogy .ne fedjenek át a mátrixban. Egy másik, több folyadékot tartalmazó porózus mátrixszal történő kapcsolatba kerülés esetén a vegyületek diífendálnak, és megkezdődik a szűrővizsgálati eljárás.
Egy előnyös eljárás gyöngy alapú kombinatorikus vegyületeknek egy mátrixra történő felvitelére oly módon történik, hogy a gyöngyöket véletlenszerűen vagy egy megbatározott sorrendben egy .felületre, például egy műanyag lemez felületére szétadagoljuk. A gyöngyöket azután kezeljük (hasítjuk), hogy a vfzsgáltsti vegyületek felszabadnljatíuk, ha kovalensen vannak kötve s gyöngyökhöz egy instabil kapcsolóval (fotohasitás és gáz: fázisú savas hasítás ismert a technika állása szerint):. Ezután a vegyületek nem kovalensen kapcsolódnak, azzal a. területtel, amelyet a származási gyöngy elfoglalt, és a száraz vegyüfetek azután egy mátrixra vagy mátrixba vihetők.
Egy másik eljárás különálló vegyületeknek egy mátrixba történő juttatására oly módon történik, hogy áztatjuk vagy más. módon ttetn kcsvaleasen kapesolutsk mundért vegyulétet a gyöngyökhöz vagy·' gyöngyökre. Ezzel az eljárással nagy számú: vegyület keverhető egymással amikor a gyöngyökön vaunak úgy, hogy' mindegyik gyöngyön egy egyedi vegyület van. A gyöngykeverék azután könnyen szét teriíheíő egy felületen, egy mátrixba történő felvitel érdekében. Ez az eljárás fellesett szűkségíeletmé teszi kis mennyiségű folyadékok kezelését.
Ha a mátrixba vitt minták eredeti elrendezése egy CF-HTS szűrővizsgálati eljárásban olyan nagy sűrűségű, hogy egy bizonyos aktivitási zóna térben egynél több minta kezdeti helyét, fedi át, akkor ezen minták mindegyikét a megfigyelt aktivitás: forrásának, tartjuk, Nagyobb· kezdeti sűrűségnél több esélyes vegyület jut mindegyik zónára, mivel több vegyület fesz egy bizonyos zónába®. A. vegyületek. egymásba diffundálhatnak, de mindegyiknek megvan a saját térbeli gradíestse, és egyetlen: helyen senx keverednek kvantitativaa, A zóna kö9 zéppooha ezért megteld az aktív vegyület pontos helyének a kezdeti elrendezésben, Gytikotiaíilag a találatok elég ritkák ahhoz, hogy az aktív vegyület azonosítása érdekében mmden egyes aktív zónában több minta újra vizsgálata ue legye» nagy feladat,
A találmány egy suásik megvalósítási módja szerint Erikái akadályokat viszünk egy szűrővizsgálati mátrixba (igy nem· folytonossá alakítjuk a formát a szé szigorú értehnébesj, hogy korlátozzuk a távolságot, amcay· nyire a minták diífusdálhamak. Például egy enzimet és egy szabszfrátot -tartalmazó két gélt egy rácsozattal (süteményrágó) oly utódon felvágunk, hogy mindegyik gélt sok, különálló elhelyezkedésű részre osztjuk. Ezután a két gél kapcsolatba hozható, hogy a szubsztrát és az enzim együtt tudjon diífundáloi xuindss egyes feldarabolt gél részben. A. vizsgálati minták minden feldarabolt gól részbe bepttaíhatók oly módon, hogy a szűrővizsgálatok teljeses függetlenek legyenek, a sz&ővizsgálstok között ne legyen díifeziö. Ez a megvalósítási mód a CFí-lTS előnyei közül néhányat tönkre tesz, mivel minták közötti statisztika; eltéréseket visz be és a térfogatot rögzíti, ezáltal korlátozza a jelet a nagy sűrűségű dremíezéseknél. Ez a megvalósítási mód azonban még 'hordozza a mátrix alapú heterogén szűrővizsgálati eljárások előnyeit, amelyekben a szűrővizsgálati komponenseket nem kell nagyszámú párhuzamos rea&eiőedényekbe szétosztani, és megszűnteti a minták részleges keveredését.
kiySÁ
Az: enzimmel kapcsolt immunológiai kötődéses szűrővizsgálati eljárások (ELISA) heterogén szűrővizsgálati eljárások, amelyek oldatban levő iigandok: és immobiiizálí receptorok közötti kötődést mutatják ki. Az ELISA sok reagenskeverési és mosási lépést kíván, amelyet. 96-lyukas formában nehéz kivitelezni, és el lehet képzelni a stég nagyobb nehézségeket, amelyek a lyukás 9«-lyukas: formájából 384-es formába történő csökkentésénél fellépnek. A GF-HTS eljárást alkalmazzuk Isgandok és smmobihzáh célreceptorok közötti kötődés gátlásának kimutatására (gEElSA),
Receptor bármilyen molekula, amely egy másik molekulát köt. Nem korlátozó példák a fehérjék, a peptidek, a nuklemsavak, a szénhidrátok és az előzőekben említett példák komplexei. A receptort a többféle lehetséges mátrix egyikén immofeílízáljuk (reeeptormáírix) például, de nem kizárólag műanyag felületeken (pl, Petei-csésze vagy műanyag lemez (Nartetóí)), membránokon vagy fehéreken, aurelyeknek nagy·’ célt kötő kapacitása van (pl. rotrocellslós, nylon, vagy PVDF (Mll'dpore, Corning Costar, Sebleteher & Sebnél!, BioRsd) vagy származékos membránok, máit SAM-menibránok (Eromegaíj, Egy porózus lig&sömátrixot készítőnk (pl., agaróz gél vagy porózus membrán) ágy, hogy az immobiiizálí receptor Kgandját kimérjük a mátrixba vagy mátrixon. A vizsgálati vegyűleteket vagy mintákat közvetlenül a kgandmáirixra adagoljuk, vagy egy más módon egy vizsgákitiminta-mátrixotemátrixra (pl., peíisztirén (Tekru), polivindídés (pl., Dow Braaástól) vagy más hajlékony műanyag Lapra vagy membránra visszük, A vizsgálati mátrixot kapcsolatba hozzuk a ligandmátrixszal és a mintákat hagyjuk a ligmídmáírixht; díffnndálni, Megfelelő inkubációs idő után a lignndmátri'xőt kapcsolatba hozzuk a receptormáírixszal, tehetővé tesszük, hogy a ligand: és a mániák kapcsolatba kerüljenek és diffúzió útján lehetőség szerint reagáljanak a receptorral (Az 1, ábra ári matatja,, hogy az únmobilizálí R-íuceptor köti a biotiíhláit: Ι,β-ligsrsdot}.. Az inkubáció alatt a ligandok kötődnek az űntnobilizálí receptorhoz, 'ha egy vizsgálati vegyület nem gátolja a lígasdbeeeptor itősést.
Meglétek; mkubáesős idő után a receptormátrixot eltávolítjuk. és -egy megfelelő pufferrei mossuk' a nem kőtodöh vagy sem specifikusam kötődök ligand és minták eltávolítása érdekében, A recepíormáírixot a szűrő- lő vizsgálati reagenseket tartalmazó oldatba áztatjuk, amely kóiesönbatásba lép a llgsnddaí (pl., egy ellenanyag,, avidía vagy streptavidin hiounilált ligund esetében) és kitnuíaihaíó akár közvetlenül (pl, öaoreszcenciávai vagy radioaktivitással} vagy mdírekt módos |p!:„ forma peroxidAzzaí (RRP), aikalikus-faszfatázza! (AP) vagy béú-gaiaktozidáz korüugátuormalj (A 2. ábra egy avidin-HRP konjugátumoí, AHRF, mutat be a bioíiaiJáit ligáséhoz kötődve,) Megfelelő inkubáció után a rscepíortnátrixoí eltávolítjuk az oldatból és mossuk a nem kötődött és mtn spccihkusas kötődött reagensek eltávolítása céljából. Közvetlen szlgnálkimuístás esetés a mátrixot egy megfelelő eljárással leképezzük (pl.., spekttofötometriás leolvasó, CCD-fcaínera, film, ihszforos képleoívssó vagy szcinílliáclós kimutatási eszközökkel). indirekt szignálok (pl,, HRP vagy AP) további srignálkíféjlesztő reakciót igényeinek, amelyet a szubsattototak vagy más szükséges reakciókemposesseknek egy porózus szubsztráhnstríxba vagy mátrixra történő adagolásával és ennek s mátrixnak, a receptörmáirixszai történő kapcsolatba hozásával hajtunk végre, Aa enzim (pl., HRP vagy AP) reagál a szabszíráítal (3. ábra). Egymás módon egy kicsapó szuhsztráíoí oldatban viszünk be és nem mátrixban. Bármilyen láthatóvá {ételi eljárással a lígand/reeeptor kötődési területek látható reakciót adnak, mig azok s területek, ahol a HgatKFreceptor kötődés gátolva van, nem mutatnak látható reakciót.
SejkUg^lákm<fés
Á CF-HTS ligand-'sejtes receptor kötődése gátlásának kimutatására is alkalmazható. A hagyományos szűrővizsgálati eljárásban a vizsgálati vegyületet, a radioaklivan jelölt lígaadokaí és: a megfelelő receptort expresszáló sejteket egy edényben, például egy lyukban: összekeverjük. Elegendő időt hagyunk a receptornak a ligaad megkötésére, amennyiben a kötődést nem gátolja a vizsgálati vegyüiet. A nem kötődött és sem specifikusan kötődött komponenseket a sejtekből eltávolítjuk, és a sejtekkel kapcsolatos radioaktivitás mennyiségét mérjük. A CF-HTS· eljárást alkalmazzuk Ügandok sejtekhez: történő kötődésének gátlási vizsgálatára is.
A kívánt receptort expresszáló sejteket egy mátrixon (seítnsátríxon) például, de nem kizárólag géleken, filtereken vagy membránokon (pl, Transwc-il szövettenyésztő membránok (Corning Star) vagy kemotaxís membránokon (Neuro Erőbe» szaporítjuk vagy terítjük. Egy porózus mátrixot készítőnk (p.l.„ agaróz gél vagy porózus nteníbrán) oly módon, hogy a receptor jelölt ligandját a mátrixon vagy a mátrixba» eloszlatjuk (iígaridmátrix). A vizsgálati vegyületeket vagy mintákat kőz-vedenüí a ligand- vagy sejimátrixra adagoljuk, vagy egy más módon, egy másik mátrixon vagy mátrixban (pl, polisztirén (Tekra), pokvlmlidén vagy más rugalmas műanyag lapon vagy membránon, nütüamátrixj adagoljuk. Á mmíasiáírixot kapcsolatba hozzuk a ligandmáiríxszal, így lehetővé tesszük, hogy a minták a hgandmátríxba díifundáijanak, Megfelelő inkubációs idő elteltével a ligasámátrixoí kapcsolatba hozzuk a sejtmátrixszai, előnyösen a mátrixnak nem a sejteket tartalmazó oldalán, és hagyjuk a lígandot és a xniatát diffúzió árján a receptorral kapcsolatba lepni és reagálni (4, ábra). Az inkubáció alatt a jelölt lígandok az úmnobilizált sejtekhez kötődnek, hacsak a minta nem gátolja a ligandÁejt: kötődést.
Az inkubációs idő máit a sejimáírixof a iiganároátrixiöl el választ juk és egy megfelelő pufferrel mossuk a nem kötődött vagy nem specifikusan kötődött ligaadok és minták eltávolítása céljából. A sejtmátrixról egy megfelelő eljárással képet alkotunk (pl., spekttofotosnetriás. leolvasó, CCD-kssnsra, fiira, feszíbros képalkotó vagy szcinüllácíé» kimutatási eszköz) (Az 5, ábra a szűrővizsgálati eljárásnak egy filmen történt kifejlesztését szemlélted.)
Mint a lentiekben bemsrtafmk, a CF-HTS beváltja a szabad formájú szűrővizsgálati eljárásokhoz lü- 1:
·*·.·« «« * « 9> Κ 4 zőtt minden előnyt, és biológiai és biokémiai szűrővizsgálati -eljárások összes kal8nbö«ő típusához, az összes különböző fonsattpusboz és az összes különböző reagenssel és felszereléssel alkalmazható. Széleskörű alkalmazhatósága miatt leginkább a kővetkező példákkal tudjuk szemléltetni Ezek a példák azonban a találmány előnyös megvalósítási módjait szemléltetik, és nem korlátozzák a szabadalmi igénypontokat vagy a leírást. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a meghatározott megvalósítási módok változtatásai és módosításai a találmány oltalmi körétől és alapgondolatától való eltérés nélkül elkészíthetők. Végül pedig sz összes hivatkozás a leírás részét képező t, példa
Kédépéscs kolorlnsefríás gél szűrővizsgálati eljárás a van kom kin rezisztens enzim, a VaaA áltel
A VauA a vánkosban rezisztencia tédesfontosságó enzime, -és D-alaninnak D-almtinhoz vagy Dahminnak D-laktáfooz történő kapcsolódását katalizálja. Ezt az enzimet hagyományosan az aktív enzim által felszabadítót: foszfát által kiváltott szín alapján mérik (a VaaA aktivitása az ATP-t ABP-vé és foszfáttá hidrolizáijíí), A kutatók «lód ismeretes, hogy B-cikloszertfi dózísföggöen gátolja a VasA-t, és est az inhibitort alkalmazzák pozitív kontrollkéut más, lehetséges inhibitorokkal szemben;
Enzangél
Egy enzimgélt készítettünk a Van A enzimnek 1%-os agarózhoz (magas olvadásponté agaróz, Glbco SRI.) történő hozzáadásával, 45-C-on 50 mmol HEPES (N-(2-bidroxí-etilj-piperazin-N'-i2-etáoszolfonsav)i, 20 mmol msgséziurö-kland, 20 umml kálium-klorid. pH 7,3 pofíerbsn 2 prool VsnA végkcttcettttációban. Az agsrkeverékd .ŐioRud géSkészítőbe öntöttük és 2-8aC-on. 30 percen keresztül hagytuk rnegszilárdolni.
SzyfeszHátgél
Egy szöbsztrálgé’-f készítettünk ΑΓΡ-nek (1 mmol cégkénéért-rációban), D-alaninnak :'1,5 mmol végkoneeotfáciöbím) és D-laktátríak (1,75 mmol végkoncenttáctóban)· felolvasztott agarózboz történő hozzáadásával, és az euzhngélnél leírtak szeriöt készítettük a gélt.
Miatataátm
Korsirollmhnakété egy isinert inhibitor, a D-eihloszerin sorozattdgításainak (5()00, 2000, 1000, 500, 20Ö, 100 fonói) 1 ps-es mennyiségeit hl etanoi-víz keverékben egy polivisilídéH-kíorid (PVDC) fUmdarabra adagoltok és 10 percig száradni hagytuk.
Az essmtgéh 5 percre kapcsolatba hoztuk a ssmtttmátdxszaf Á szobsztrátgélt ezután helyeztük az eozimgél felületére és 15-20 percen keresztül inkuMStuk.. Ezt kővetően a két gélt szétválasztottuk. Az: inkubáció- alatt várhatóan foszfát képződik a gélben mindenhol, tmwtt az enzim katalizálja a szubsiztráték kapcsolódását, kivéve azokat a területeket, ahol a B-cikloszsrin elegendő koneenőieióbsn van jelet!: ahhoz, bőgj·' gátolja -a reakciót.
Foszfát kimutatásához basznál: oldatot (9,15% fosssen. készített mal&ehitzöld és 1,4% ammóniummobbdeuát 1,33 N sósavban) öntöttünk és egyformán eiosztétttmk: az enzim- és a szubsztrátgéleu. Ezek a reagensek reakcióba lépnek a foszfáttal és a foszfát: növekvő koncentrációinak függvényében egyre sötétebb zöld árnyalatot hoznak létre. A színt 5-10 percig hagytak kifejlődni (A ő. ábra szemléltetitt szia kifejlődését a gélen, ahol az inhibitor nrenrivisége 5 naaomóhőí Ö,5 nanomólsg változóit), A zöld színű géleket Stotogene &sgfe AM? CCD-kamerával fényképeztük. .Az elvárások: szerint az inhibitoros zónák, gyengébben zöld színének mértéke megfeleltethető volt a beadagolt üábhiior koscetoráciőjával. Ez a szűrővizsgálati eljárás tehát VanA inhibitorok szöröviasgálatára alkalmazható, kombinatorikus gyöngyöknek vagy vegyöíetetetek bármilyen. más. felületre történő adagolásával és elrendezésével, anselyet azután kapcsolatba hozunk a gél szűrővizsgálattal.
Ez a szűrővizsgálati eljárás azt bizonyltja, hogy a get szűrővizsgálati fonna megfelelő többszöri reakció* lépések kezelésére. Ez a tolajdosság szükséges ahhoz, hogy ez a forma sokféle szűrővizsgálati eljáráshoz alkalmazható legyen, mivel sok szűrővizsgálati eljárás több lépést igényei. Ebben az. esetben a VanA szütővizsgáiaíi eljárás két lépése* enximaktivitási szűrővizsgálati eljárás, amelyet a szin kifejlesztése követ, Ennek a szürövlz&gáíati eljárásunk homogéu (egy lépéses) változata nem hajtható végre könnyén, mivel a színkítéjlesztő reagensek és körűtaények gátolják a VanA aktivitást, és egy agargélbe történő bevitellel sem fémek össze. Ennek a két lépésnek egy oldalfeisö aziukífejfesztő lépés előtt egy enzimaíikus gél szűrővizsgálati eljárásként történő térbeli és időbeli elválasztása tehát kívánatos.
λ Példa
W^Mdfe&íg<tA33^S^
Amikor a gombaeredetö etosgációs faktor-3 (EE-3) a riboszőmákkal kölcsönhatásba lép, feszfátáz aktivitás iodakálőáik. Á CE-MTS-t ennek az aktivitásnak a szűrővizsgálatára is alkalmazzuk. Egy, az EF-3-at (egy hőmérsékletre erősen érzékeny enzimet) és élesztő rlbosz.ómskat EF-3-puö'erben tartalmazó ensüngélt készítettünk. Egv, 1 mmol ATP-t a szűrővizsgálati púderben tartalmazó szubSzttátgéit is készítettünk. Mindkét gél 2% áimetö-szalfoxldot tartalmazóit alacsony olvadáspontó agarózban. (Gibeo BE I..), és 37öC-on készítettük, maid 3*3 percen keresztül 4eC'*os áta hagytuk. Koatollmitttakéttt az EF-3 egy inhibitorának a poíi-L-ltzinnek sorozatb.ighásaít foltokban PVDC-fjlnue vittük és száradni hagytok (miniamátrix). .A szűrővizsgálati eljárást azután az 1. példában leírtak szerint hajtotok végre, az esrzimgéinek. a ralaiamátrixon lévő Inhibitorokkal történő előiíjkohálásával. Az enzímgéli. ezután 20 percen keresztül kapcsolatba hoztok a szobsztrátgélleí. Mint az 1. példában, az aszún* és a szubsztrátgélt mnldiitzőhEarsmőnfere-moijbdenát szinkriejlesztő oldattal festettek, «tárta az enzimgéhöl CCD*kmaerávaí képet készítettünk. A gátlás! foltok a zöld háttérben- tiszta területekként jelesnek meg, A 7. ábra a szin kifejlődését szemlélteti a gélen, ahol az Inhibitorok mennyisége 5 píkomőltől 20Ö pikcmőlig változott. Az eredmények az inhibitor áözisíhggő jelét mutatják, amely jelzi, hogy ebben a szűrővizsgálati eljárásban yj EF-3 ítoubiforek felismerésére lehet vizsgálni a vegyületeket. A 2. példa a CF-HTS hasznosságát bizonyítja még sejtszervek, vagy más, nyers, biológiai, keverékek vagy kivonatok jelenlétével bevitt komplexitás esetében is.
3, példa
Mint a festfekben megtárgyaltok az ELXSA-t lig&ítd-rsceptor kölcsönhatások gátlásának kimutatására általánosan alkalmazzák,. ahol a receptorok a mikmtxtorfomez lyukaiban. úmnobiíízálva vannak, Az EElSA-nál alkalmazott ligaad-receptor párok bármilyen kőtömofekula-párt tartalmazhatnak a fehérjéktől vagy más makromolekuláktól kezdve a kis íuolekuláktg, Ezek a szörővizsgáfetí eljárások komplexek, több lépéses szűrővizsgálati eljárások, amelyek a receptor inastohíiízálását, a ligandosk a receptorral történő inkubálását, a nem kivánatps, nem specifikusát} megkötött liga-Kiok mosását, mdyek máskülönben, magas szigöálháttetet okoznának, a láthatóvá tételt lehetővé tevő .raagmeksek (pl., egy nporterenzimmaí kapcsolt lígandspeciS.kus ellenanyag) a recepíérbez kötőd bganáboz történő kötését és a riporteranzbn szubsztráljátnak hozzáadásával a látható szignál előállítását kívánják meg. Az EL1SA bortyohsksága a HTS-ipasBan dolgozókat nyilvánvalóan arra a következtetésre vezette, hogy az ELÍSA :aem adaptálható szabad formájú szűrővizsgálati eljárássá. Azonban ezt a komplex, több iépéses szűrővizsgálati eljárást is alkalmazzak Cb-fTÍS formára .különböző fehétje-fehéije, íebétjellgssuf és más líganákíttő kölcsönhatások szűrővizsgálatára.
Az urokisáz típusé pbtzmmogén akdváíor <«PA.) kötődik a receptorához (uPAR), Az uFA/uPAÍikölcsönhatás sokfele rák' stewzíázfsában vesz foszt. A hagyományos uPA''uFAR HISA-t alkalmazzuk CFHTS-re tisztított receptorok és ligaudok alkalmazásával.
Ífl2)dlcmnlríx
Műanyag lemezeket <7,5 cm χ 11,5 etn, Nuec, Inc; Napervflle, IL) borítottunk egy éjszakán, keresztül 118 nmei tisztított «PÁR 15 ml-évei foszfáttal pat&relt sóoláafoau pH 7,4 (PBS) (Life Technologies, Gtand Island,. NY) 4°C-©n. A müasyttg: lemezek egy éjszakán keresztöl történő borítása után sz uPAR-oldaíot leöntöttük és a műanyag lemezen maradt kötőhelyeket 1% (s/tf) kazeint tartalmazó 15 ml PBS hozzáadásával gátoltuk, és szobabőmérsékleten 2 órát! kérésziül inkubáltuk, .A kötőhelyek gátlása után a. gátló oldatot leöntöttük és a műanyag lemezt Ötször moatuk .20 rnl mosó puBertfo, amely 0,0554 Tween-Sö-aí (polioxietiiénszorbbáomonoíanreát) tartalmazó PSS. Mosás alán a műanyag lemezt 10 percen keresztül szobahőmérsékleten szárítottuk. A mátrix túlzott kiszáradását sikerülendő, suti az aktivitás el vesztéséhez vezethet, ezt úgy idöztettük, hogy a műanyag lemez .röviddel ezután az alább leírt szűrővizsgálati eljárásban alkalmazható legyen,
SckEAmfátrix
A szűrővizsgálat céljára az uPA-í biotinnal jelöljük (β-ttPA). A β-aPA-t tartalmazó géleket β-u? Árnak agárral történő áztatásával készítjük, hogy a magas hőmérsékletet elkerüljük (nem javasolt olvad: ugarba kevetni, mint az I. és 2. példákban). Az agart a kővetkezőképpen készítjük, ö, 1 g -agarózt (Sigxna, St. Louls, MO) 10 ml PBS-sel először clkevcröttk, majd olvadásig melegítjük, végül 8 χ) x 0,075 cm*4 géíkészítőbe öntjük (Bio-Rad, Hercules, CA). Megszilárdulás után (akár szobabőnforsékieíen, akár 4%7-on) a géleket egy éjszakán keresztül 4°C-ön 5 5 ml, körülbelül 10 nsnol β-uPA-t tartalmazó szűrővizsgálati púderbe áztatjuk, amely PBS· bőt, 0,0554 T-ween-20-feől: és 0,1% kazeinből áll (mindkettő Sigtna, St. Louis, M.O). A géleket 20 percen keresztül szobahőmérsékleten szárítjuk közvetlettüi felhasználás előtt.
Mífoamáirtx
Az uPA''uPAR-kőtős egy ismert kis molekulájú inhibitorának hiányában nem biotmilálí uPA-t (ProuPA> alkalmaztunk a ,β-uPAfoPAR-kötós inhibitorának kostrollmirtlájaként. A szűrővizsgálati puffetben lévő 0, 0,03, 0,1, 0,3, 1 és 3 p.mol pro-ttPA 5 ni-es mennyiségeit PVTX’-fihnen szétadagoltok (Dowbrands L.P., Indianapolis, ÍN) és 2 órán keresztül szobahőmérsékleten szárítottuk,
AzaHybp^.jWvPA:y<fefeuP.A^történó.fntobágiója
A m.mtamáfiixot a β-nRA-gel egyik oldalára helyeztük úgy, hogy a száraz prooPA foltok kapcsolatba kerüljenek a S-uPA-gél íalszméveí, A pro~uP A-t 1.0 percen keresztül szobahőmérsékleten hagyták a gélbe difíondálm. Ezt követően a β-uPA-géi másik oldalát helyeztük a műanyag: lemezbe, hogy a β-uPA (msu; Iigand) és a pro-uPA (mint kompefiíív inhibitor) kölcsönhatásba lépjen a műanyag lemez felületén lévő -uPAR-ral. A * ♦.
kötésl/kofnpeticiós reakciói 2ö percen keresztül. szsvbabőntérsékleten inkubáltuk. Áz inkubáció után a műanyag lemezt elválasztottuk a géltől és négyszer gyorsan mostok 2ö ml mosó pufierrel. Avidio-tormaperoxidáz (avidireHRP) oldatot készítettünk as ariáin-HRE (Sigtaa, Sí. Lonis, MO) 1:25008 srányö hígításával szűrővizsgálati püffedjen és 15 rnl-t adtonk a műanyag: lemezhez. A reakciót. Ki percen keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk., maid az avtdiu-HRF oldatot leöntöttük és a műanyag lemezt a fentiek szerint mostok. A műanyag lemezt 28- percen keresztül száradni hagytok.
Az avidia-HRE-bea lévő áriáin specifikusan kötődik a híottnhoz, így a mátrixnak csak azok a területei mutatnak adott esetben szinkífejlödésí, amelyekben tígandíreceptor'’ kőtest törtéin. A mátrixnak azon területek ahol a Íigatjd/recepíor” kötést a proosPA kompetitíve®.gátolja nem mutatnak .színt.
%iükífejlödés
A feöleritoeíriás HKP-szübszírátot tamtaaző· színkifejleszíö gélt (ÖPD-gél) 2 darab o-feaíléndi;-;mmlúdrokloriá (QPD) tablettának 7 ml higitósaerbeü (míaókcttő Abbott reagenskészlet, rendelési szám: ól 72-30, Abbott Labs, Abbott Park. TI.) történő teíoidásával ás ennek az. oldatnak egy agaróz oldattal —amelyet 0,1 g agarőzsak 3 ml vízben tőrféob olvasztásával készítettünk — történő egyesítésével készítettünk el. A 18 ml végtérfogatú keveréket § χ ? x 0,075 em O-típnsű mmífehétje gélkészitőbe önfőttök és 4’C-on 15 percen keresztül szilárdulni hagytuk, A gélt a gélkészítö üveglemezéről áthelyeztük akár PVDC-re, akár egy rugalmas műanyag lapra és levegőn 10 percen keresztül. szebahötoéísékleten száradni hagytak. A gélt ezután egy másik PV'DC vagy műanyag lapra helyeztük át, hogy a másik oldala ís száradjon 10 percen keresztül. Ezután az OPD-géít a műanyag. lemezbe helyeztük, hogy elkezdődjön a szín kifejlődése. Az OPD inkubáció alatt különböző Időpontokban a műanyag lemezt egy 440 nm-en sáváteresztö filterre (Omega Optical, Inc,, Brsttleboró, VT) helyeztük, amely viszont egy /%«?·-£#<? íényforrássál megvilágított száloptikás diffúziós lemez tetején volt (mindkettő Oolanrienner íadustries, Inc., twrcn.ee, MA). A képződő képet CCDdsamerával rögzítettük (Eug/e £> rendszer, Sttutngene, La loíla, CA).
teíSlíSnkísédeí
A 8.. ábra szemléltesd a 3, példa egy koairolíkísérfetét, A ŐA ábránál agaróz négyzeteket 0 erró)-áztattunk különböző koncsnírációjó β-uP'A oldatokba, mint ez a négyzetek alatt fel van tüntetve (kivéve az 50 nmól oldatot, amelyet az agaróz négyzet hal oldalán lelökünk). .Az agaróz négyzeteket egy nEAS. tounóbilizált műanyag lemezen történő fokubálásután eltávolitottuk. A műanyag .lemezt ezután mostuk és a fentiek szerint láthatóvá tettük a mátrix azon. területeit, ahol P-üPA/üPAR kötés előfordult. A 88 ábra az átlagos pixel értékek (& háttér levonásával) grafikonját mutatja minden négyzetté (ahogy a €CD-kamerából származó digitális képet a A27/'ó»oge .,feí.dy.«k szoftverrel elemeztük) az agaröz négyzetekben lévő β-uPA koncentrációval szembe» az ÖPD szinféjlődés alatt különböző idöpostokbaa. Áz agaróz gélből származó β-uk A jellemző receptor-ligsad kötési görbét mutatott, & maximális kötés félédéke (Kd.) körülbelül 3-5 tttoot, amely megegyezik az erre a reakcióra közölt értékkel a hagyontásyos ELISA és máz szűrővizsgálati eljárásokban, amelyek ezt a paramétert mérik. A g, ábra bizonyítja, hogy a gHJSA-vai előállított indírekt kolorimettiás szignál kvantitatív módon függ a ligaad-receptor kölcsönhatástól,
A 9, ábra szemlélteti a p-uFA/nPÁR-kötás gátlását Eto-nPA-val. A pontok a 9A ábrás, azokat a helyeket jelölik, ahol.« β-alWaEAR kötés gáőédott Az arirfin-HRE tehát non: kötődött ezekben a területekben, Követ15 kezesképpen a HRP nem reagált a szubsztrátjával a® OED-géiben, hogy kifejlődjön a szín, A 98 ábra egy más módot mutat be ugyanezen OCD képi adatoknak a rfiegjeleniiésáre, amely növeli az emberi szemnek azt a képességét, hogy a kvantitatív bírálási megfigyelje.
BMí^érfekge^nhatá^^
A í'-sejt aktívádé a szervezel immunválaszának egy alkotóeleme. Ahhoz, hogy & T-sejt akrivácíó során az egymást követő események bekövetkezzenek, a pSé-ek-nak (LCK egy fehérje) kölcsönhatásba kell lépnie a T-scji antigén receptor choplamás domsnjéaek ITAbí-szakaszávsi (''inususogíobuku reláted tyrasine baseö aetívatíon tnotifimmunglobulinnal kapcsolatos ürozm alapú aktíváciős minta).. Az olyan vegyaletek, amelyek ezt a fehérje-fehérje kölcsönbalást gátolják feltehetőleg. immuoszuppresszánsok. A CF-ÍHS-t alkalmazzuk ennek a fehérje-fehérje kölcsöabatásnak a szűrővizsgálatára ís, ahol az LCK egy membránon van immobilizálva.
Egy blotmt rögzítő membránon (SAM-xnembrán) (Proruega Cosp,, Madison, WJ) inmiobilizáijuk a feíotínilák LCK-t egy 11 cm s 2 tan csíksak 5 ml, 5 mmol DTT-itdltiotreitohj és 3 pmol EGK tartalmazó P.8Sbe történő áztaíássva! 10 percen kérésziül szobahőmérsékleten, ami után a puffért eliávtsiitínk. Ezt úgy időzítjük, hegy a SAM-membrán közvetlenül ezután (perceken belül) az alább leírt szűrővizsgálati eljárásban alkalmazható legyen.
ÍLáM^máírix
Radioaktívan jelölt ΓΓΑΜ-peptiáet (1ΤΑΚ-Γ) tartalmazó agaróz gélt készítünk 0,1 g agaróznak iö tol pufferrel. történő keverésével, olvadásig történő melegítésével, majd 8 x 7 x 0,075 san gélfcészitöbe történő öntésével. Az HAM -ot közvetlenül & géíkésziíöbe öntés előtt adjuk hozzá, vagy egy más módón a gél megszilárdulása xtíán áztalással juttatjuk be a gélbe 10 nmol végkonecntrációban,
Mmtamárrix
A vizsgálandó mintákat egy műanyag felületes vagy FVDC-m adagoljuk szét és szárítjuk, ezzel készítjük. el a mmtemátríxot.
A mmtamátrixot kapcsolatba hozzuk az ITAM’-géi egyik oldalával oly módon, hogy a vizsgálati minták az ΪΤΑΜ -gélbe diffúndúljanak. Ezt követően az ÍTAM*'-géi másik oldalát hozzuk kapcsolatba a SAMmembránsal, amelyen -az LCK. van immobdizálva. TizeuSt-negyvenöí perces inkubálás után a SAM-membránt eltávolítjuk, mossuk, és feszimos képieolvasoval vagy fűmmel képet készítünk. Az ΠΆΜ-LCK kölcsönhatás inhibitorai alacsonyabb radioíiktivitási zónák jelzik, amelyek a képen alacsonyabb szign&mtenzitásnak felelnektueg,
Agmóz gélt késziteitifek. 8,1 g agarőzuak 10 ml pufferrel történő «keverésével, olvadásig történő melegítésével, majd 8 x 7 x 0,073 cm gélkészítőbe történő öntésével. Megszilárdulás után 1 cm átmérőjű köröket vágtunk ki a gélből és 400 «1, püffedjen lévő· 0,1, 0,3, 1, 3, 10 és 20 nmoi i2f'í-dai jelölt íTAM-ba (Amersham, Átlingtóu Heíghts, IL) áztattuk egy éjszakán keresztül 4öC-on. Á gélkörőket az oldatból kivettük és 2.0 percen keresztül szobahőmérsékleten -száradni hagytuk. Ezek után a gélidarabokat az ímmobilizált ECK-t tartalmazó SÁM-memhránra helyeztük és szobabőínérsékfetea 45 percen keresztül mkubáhnk, A géleket eltávolítottak és
X * lő »κ
X* ♦ ♦ membránokat pufíerreí négyszer mostuk. Száradás után a SAM-tnembrájxoktól foszforos kép-leolvasóval képet alkottunk.
A '10. ábra dözisfűggo kötődést mníst a '‘’f-FF.AM és- a .SAMrmetnbránon lévő- inrntobilizáll. LCK között.
A 11 ábra az átlagos pixel értékek (a hátteret levonva) grafikonját mutatja minden1 ^I-ÍTAM-gélre- {a foszforos képleolvasóbói származó digiüíllsáli képnek Moieeulsr Dynamics fwegeQü&rtt szoftverével történő kiértékeléséből} a gélkSrőkben lévő “Τ-ΠΑΜ konceatíáctóvaj szentben. As immobílízáit LCK-boz kötődött, gélből származó 'mí-ITAM egy jellemző receptor-iigmd kötődési görbét mutat..
HEK-sejíektíek nevezett vesesejteket luciferázgéuhez (laciferáz ripertergétt a Promegátóí) fuzionált ciklikus AMP válaszelem promótcst (CRE.8, -’Cyciíe-Ah®· Respes.se ©lement) tartalmazó· -plazmitidal tmasziékiáiunk. Ha a irasszfefciáh sejteket .forskoiínaa· kezeljük lucifetáz génexpresszió indukálódik. Azaz, ba a luctferáz szubszttótót (éjbogár iactferin a Promegától) és megfelelő fcofttewokat (20 mmol trióin pH 7,8,0,1 mmol EDTA, 33 mmol DTT, 0,3 mmol Koenzim A,. 0,5 mmol. adeuozis-íriföszfái és 1 mmol magnéziumklíirid) adunk a HEK-sojtekbez foton kibocsátás lép fel. amely a hagyományos eszközökkel kimutatható-. A CEI-rrS-t erre a szűrővizsgálati eljárásra is adaptáltak,
Sej^náujx
Tenyészetben lévő sejteket tripszinnel kezelünk, Corrásg/Cosísr TRANSW£LLiM-memfcrá«ta visszük át (3 μ políkarbonét filter egy tananyag segéíigyörüvei) és egy éjszakán- keresztül 3?C--oa, 5% COj-bea -és szőveitenyésztő- tápközegben inkabáljuk, Ezt a tápközeget azután eltávolítjuk a membránról és a filtert, amelyhez a -sejtek körödnek, levegőn IS percen keresztül szántják, majd közvetlenül ezután felhasználjuk az alábbi lépésekben.
Egv; a laciferáz- expresszié úídakálószerét tartalmazó gélt készítünk 10 mmol íbrskolís tőrzsoldat (Sigma törzsoldat -etanoSm) 12 pi-ének 1%-os alacsony olvadásponté agaróz gél δ aal-éhez történő hozzáadásával. A 2Θ pmol forskolm végkeaceatrációjó get szobahőmérsékleten megszilárdul.
Mmtamátrix
A íorskolin indukciót feltehetőleg gátló mintákat szétsdsgoljuk és külörtáltó-elhelyezkedésben, nagy sűrűséggel PVDC-n szárítjuk.
A PVDC inhibitoros oldalát idkubáljuk. az indukáló góllnl, Majd a íorskolin índukálószert tartalmazó gélt helyezzük a festitek szerint elkészíteti sejtmátnxttak »®. s sejteket tartalmazó oldalára. Együtt iakubáljok őket 37X-oa 5% COj-hea 2ű percen keresztül Ezt kővetően a- főrskolin gélt eltávolítjuk és a sejtmátrixot 37°C-on 5% CO;-ben további-4 órás keresztül mkafeáljuk a lociíersz konstrukció maximális expressziója érdekében. A lucíferáz eazlmatóvhásánsk. (vagy ennek gátlásának) kimutatása érdekében a sejimátrix- filtert fizikailag eltávolítjuk a műanyag segédgyfeűjétól és Peirí-esészéhe helyezzük. A Peírí-esészébe töltjük a iucíferáz szabszttótöt (éjbogár Incifma a Pxomegátöl) a megfelelő kofaktotokkal kiegészített biológiai pufferben, hogy szigííáikéat fény indukálódjon. Mivel a szignál a looiferázt expresszáló, ««.mobilizált sejteken belül helyezke17
dik el, a kezdeti indukciós lépes inhibitorai alacsonyabb foton kibocsátási rónákat eredményeznek.
6- példa |GM^CgrBI^A^-^t^^baíás^.:b.Wtnrain&k közvetlen kimutatására
A sejtfelífblsn & lig;md/rs.ceptor kötődés kezdeményezi· a szignál útvonalak elindulását -a sejtekben, amely végűi feukcionális válaszokhoz vezet (pl., sejtosztódás vagy biológiailag akíiv anyagok szekréciója). Betegség állapotában a sejtek biológiai válaszának szabályozása érdekében gyakran a sejtfelbiethez történő ligarsdkötödés gátlását keresik, A iígand/sejles receptor kötődése inhibitorainak kiériékeíésere szolgáló általános eljárások során az inhibitornak azt a képességéi -értékelik, hogy csökkenti a radtoakiívan jelölt, természetes iigand és a sejtek közötti kötődést, Ez a sejteknek a radioahdvan jelölt iíganddal és az inhibitorral förténö iakííbáíiójá't vonja maga alán, amelyet a ne® kötött és ne® speeiSkasan kötött radioaktív iigand mosás ólján történő eltávolítása követ, tusod a kötött radioaktivitás mennyiségének a mérése.
Az .mteríéukm-8 (IL-Sj egy kemotakiikus kentek®, amely gyulladásban vesz részi különböző sejttípusokon lévő receptorokhoz történő kötődéssel, A CF-HTS szűrővizsgálati eljárási kifejlesztettük ligand-reeeptor sejtes, szűrővizsgálati eljárásra is ezeknek a kölcsönhatásoknak a kiértékelésére.
Sejtgsátrix
Az JL-8a receptort expresszáló HEK-sejteket (ATCC, Bethesda, MD) 7S nttn átmérőjű transwelí membránfitere (Corning Cosíar Corp, Cambridge, MA) terítettük lemezenként körülbelül 2Θ millió sejt sűrűséggel. A sejteket egy éjszakán keresztül hagytuk a mernbrásSüerhez kötődni (REMI, Life Technoíogíes-tŐl, Crsnd Island, NY) 1Ö xnmol HEFES-t (Srgma, Sí. Louis, MO) fcartaknsró pH 7,2 pufeerben 3?*C~on. A sejteknek a filterhez történő kötődése után a tápközegei eltávolítóitok, és a sejteket friss pufietrel mostok a .meg aem kötődött sejtek eltávolítása érdekében. A filtereket a sejtes oldalukkal, lefelé fordítottuk és ferdén helyeztük el, hogy a felesleges tápközeg leszivárog®, és 20 percen keresztül szárítottak. Ezt égy időzhettük, hogy a sejtmátríxot rögtön alkalmazni tudjuk as alábbiakban Ismertetett szűrővizsgálati eljárásban,
Ligandptátnx
A ligandmátrixot :~5i~dal jelölt ll.-S-.sak (Amershm, Inc., Arlmgten Helghts, ÍL) agaróz géllel történő áziatásával készítettük, az agaróz gélt pedig OH g agaróznak 10 ml pufferrel történő elkeverésével, olvadásig történő melegítésével, majd 8 x 7 χ ö,:í)7S cm gélkészhőbe tőriéső öntésével készítettük. A gélt egy éjszakás keresztül áztatjuk szofeabömérsékleter! tessó keverés közben rázóasztalon (New Brunswick Scientífic Co., fne, Edison, NJ). .Ártatás után a gélt 20 percen keresztül szobahőmérsékleten szárítjuk közvetlenül felhasználás előtt. Ezt úgy időzítjük, hogy a. gél azonnal atotearóató legyen a. szűrővizsgálati eljárásban.
Mmtamátris.
Az IL-8/sejtes receptor kötődés ismert inhibitorának hiányában: radioaktívan nem jelölt IL-8-at (Gextzyme Corp., Cambridge, MA) alkalmaztunk a gátlás kostrofimintájaként, hogy a :25l-lX-8-nak HEKsejtekhez történő kötődésének gátlását -megfigyeljük. Az lt-8((,0,03,0,1,OH, L 3,10 és Iöö pmol koncentrációinak l ul-es mennyiségeit egy mteyag lapon, például PVDC-n szétadagoltuk, és 1 órán keresztül szobahőmérsékleten vákuum alatt szárítottak.
Intebácló
A místaötétóxot a ijgandmáínx egyik oldalára helyeztük oly módos, hogy a szárított It-8 foltok kerüljenek kapcsolatba a gél felszínével, A gélt megfordítottuk és a másik oldalát is száradni hagytuk 1Ö percen keIS *♦ résziül szobahómérsékieten, és az inhibitort hagytok a gélbe diítündální. Ezt követően a gélt a sejtmáttlxn&k sem a sejteket tartalmazó oldalára helyeztük. A kötést reakció érdekében.45 percen keresztül szobahomérséküeten inkubai tok. A .gélt ezek után eitávolitöttuk, és a membránnak: nem a sejteket tartalmazó oldalát négyszer mostok pufferrel. A stembráuokaí hagytuk teljese» megszáradni, mielőtt ehávolitottuk volna a iwütotyag segédgyűrűből. A jneminátíoteói ezután képet készítettünk röatgentilm vagy fpszforos képleolvasó (Molecular Dynamics,, Stotnyvale, GA) segítségével.
A 12.. ábra motsria a ;*5l-IE~b dózsshaíásat az agaröz gélben egy sejtmáirixen kereszíűklrffnodálva, hogy az ÍL-Sa receptort expresszáló HEK-sejtekhez kötődjön, Több 1 cnri -agarózöégyzetet áztattunk a feh&otetett, különböző !'<:1-1I.-S koncenháclőlú oldatokba. Ezt kővetően a hganddat átjárt tíégyzstekeí kapcsolatba hoztok a sejtmátrixszal a Fentiekben leírtak szerint. Az inkubáció után a. négyzeteket eitávolítottuk a sej ttnátrixból, és a membránnak nem a sejteket t&ríalntazó oldalát pafiémtl mostok, Eosztöros képteolvasót alkalmaztunk a sejthez kötött helyének meghalározására. Az adatok azt mutálják, hogy a őneki radionretriás leolvasás ebben a gélalapü -sejtes szűrővizsgálati eljárásban kvantitatívat) fegg a ligand-receptor kölcsönhatás .mértékétől. A 12. ábra azt is mutatja, hogy a kötési területek alakjukban elkülönültek, és ez bizonyítja, hogy a szignál .oldalirányú dlthiziója nem okoz problémát ebben a szűrővizsgálati eljárásban.
A 13. ábra. mutatja a fcompetitiv inb.ibiclös kísérlet eredményeit, A :z?'ML-S és a HEK-sejtek közötti kötődés gátlását a világos feliok jelzik. Az is nyilvánvaló, hegy a nem jelölt ÍL- S-cal történő gátlás kvarttiisrivtut dózisfUggö, Ezek az adatok azt is jelzik, hogy az inhibitorok, ebben az esetben a nem jelölt IL-S szolgáit például, keresztül tudnak haladni a sejímáitixon, hogy csökkentsék a :2:<I-1L-S és a sejtek közötti kötődést.
Más
A sejtes működésekben történt változások gyakran «térhetők a vizsgálati vegyületeknek vagy mintáknak biotechnológiai. úton a sejtekbe juttatott riporter rendszerekre kifejtett hatásának megfigyelésével. Ilyen például a ilaoreszceíts intraeeiluláris fehérjék, például a zöld iluoreszcess fehérje {GÉP, greert fisoresceat protein), az extraesiluláris fehérjék, például receptor vagy adhéziós molekula, vagy specifikus enzimek, például hiciferáz, ktoram.fta!íkolacetrilranszferáz vagy β-gálaktoziááz (Eromega) szintézisére kifejlett: hatások megfigyelése. Először is a vizsgálati vegyüieteket a sejtekkel inkubáljnk. Ezé követően megfelelő ideig hagyjuk a sejteket a riporterfehétjéí expresszální (lehetnek percek, órák vagy napok). A riporteríehérje szintiét direkt eljárásukkal (pl., GFE) vagy mdirekt eljárásokkal (pk, ELlSA-teohnelőgia membránhoz kötött fehérjékkel) mtbjük. Enzimek esetébe» a sejtek feltárhatók. hogy a ríporterfehétíél kivonjuk és az mzsnaktívítást mérjük. Egy másik Funkcionális szűrővizsgálati eljárás specifikus molekulák, például festékek vagy radioaktívan jelölt anyrgeseretertnékek viselkedését vagy elhelyezkedését móri egy receptor síimulálására vagy a sejt fMológiájá'baa történt változás, például möKíhránjxstencíál-változás hutására,
A vegyületeknek az irtteroeiluiáris adhéziós molekula-1 (ICAM-l) expressziöjára. való hatását mérő ELISA szűtrivizsgálaíi eljárást alakltotümk Cf-IITS-re a kővetkezők szerint. Az ICAM-l-et expresszáló endötéliáits sejteket egy polikarisonát kemot&ris membránra ('rieuro Erőbe) terítjük körülbelül 5öö0 sejrimm* sűrűséggel. A sejteket egy éjszakáit keresztül inkubáljuk 27*C-on tápközeghex:·, A tápkőzeget eltávolitink és a membránokat részlegesen száradni hagyjuk lö percen keresztül szobahőmérsékleten. Az ICAM-l todnkcíójára vizsgálandó mintákat vagy vegyüieteket műanyag lapokra száritjuk és kapcsolatba hozzuk a nedves membrán19 ♦ ♦ nak nem a sej tekéi tartalmazó oldalával· A vegyületeket 1 őfen kérésziül hagyjuk kapcsolatba lépni a sejtekkel 37cC-oa, aeáveskamrában, és ezután a sejteket tápközeghe áztatjuk és 5 étán keresztül 37cC-on inkuháljuk.
Miután elegendő Időt hagytunk a sejteknek, hogy az indukált fehérjét szintetizálják, a tápkőzeget eltávolítjuk a íBf???ihranról és a sejteket ÍCAM-1 ellen termelt ellenanyagot {Genzyme, R&D rendszerek) tartalmazó paífoben inkuháljuk, akár nem konjugált formában, akár Saoresztfoa-izo-tíocfosáttó (E1TC) vagy Mtti koujugálva. Harminc perces, szobahőmérsékleten történő- inkubációi .követőem a paffért eltávolítjuk és a sejteket többször mossuk a nem kötött JCAM-1 ellenanyag eltávolítása céljából. HTC-cci konjugált ellenanyag esetében a membránról OCD-kassera (Stratagene, Imaging. Research) alkalmazásával készítünk képei 485 a® gerjesztéssel és 520 taxi kibocsátással. Az l'CAM-1 expresszlőját sifoulálő vegyületek fokozott fluoreszcenciát mutató területekként jelennek meg a EITC-1CAM- l-elfenauvag kötődésének köszönhetően. A bioiinnai korija-gált ellenanyag esetében a sejteket avidin-HRP-í tartalmazó pulfferben Ínkubáljuk 10 percen keresztül szobahőmérsékleten, A poffori eltávolítjuk és a nem kötött: svidfe-HRF-i kimossuk. A membránokat ezótán egy precipitáló HRP szubsztrátot, például diafonobeuziáís-teirfolorkfo (kierce) tartalmazó pufferbe áztatjuk és megfigyeljük á szfo kifejlődését azokon a területeken, ahol az, alatta lévő sejtekben indukálódott az ICAM-l expressziőja. A nem konjugált 1CAM-1 ellenanyag esetében sgykosjagáh. második, ICÁM-.1-ellenanyag ellen termelt ellenanyagot reagálhatunk a sejtekkel· amelyet, a szignál kifejlesztése követ, a konjugátum megfelelőszabsferaljával. A képei CCD-kamerával készítjük. Mindezek á változatok (FITÜ, aviáin-fSU* és antt-lCÁM-l ellenanyag) aheosauv módozatok, amelyek ngyaoasokst a kvalitatív ereforényeket adják, nevezetesen azok a minták, amelyek hatnak az ICÁM-1 expressziójárs kapcsolatba hozhatók a megnőtt vagy csökkent szlspáílal.
Megjegyezzük, hogy a folyamatos formájú mátrix, ebben sz esetben egy membrán és egy műanyag lap. Gél nem szükséges a CF-HTS-bez.
Különálló vegyületek. nauraminidáz gátlásának -CF-HTS- szórővtasgáiafb
Mhriaraáifo
Otszázltoszoaayoie különálló, szerkezetileg rokon vegyölet könyvtarát vizsgáltuk CF-HTS-sel. Pacfcarö
Muhíproho MP204 DT-t alkalmaztuk a vegyieteknek a csövekből a 96-lyukü lemezekre történő hígítására és a vegyületeknek möanyag lapokra történő hígításához ós átviteléhez. A vegyületeket először a csövekben lévő mmoi fconeenttác tóról (DM'SO-ban) 4 mmolra hígították a Sö-lyokü lemezeken. Majd DMSO-ban lévő 4 mtnokól 209 pmolra hígítottuk 59% etanol- vlz keverékében a 96-iyukú lemezeken. Ezeket a mintákat vittük át két 1 μ'1-es adagban 8 cm x 8 cm műanyag lapokra, a mmták között átlagosan 5 n távolsággal iSio-Rad, katalógus szám: 165-29:50), laposként összesen 192 mintával Mindegyük 1. pl-es folt tehát körülbelül 2öÖ pmott tartalmazott a könyvtár egy bizonyos vegyüietéhől· Kontrollként egy ismert neumtnínidáz Inhibitor, a 2,3áehjásO-2-dsoxi--N-acebbí!euramm»av (DANA) (Bc<efoiuger Msastóm, katalógus szára: .528544) highási sorozatát kézzel vittük a vegyületek mellé minden lapra. A lapokat vákuummáiéban ssárhottok: oly módon, hogy minden vegyület a maga elhelyezkedésében száradjon a műanyag lapra,
EmrimmáttixA szűrővizsgálat előtt mflnenza neuramímdáz enzimet hígítottunk 1.5öö~szorosára 25%-os glicerin, foszfáttal puffereit -sóoldatból az 1% agatózí, 5ö mmoi aátefom-atrátot pH 6,0, 19 mmoi kalciura-íderidot tartalmazó folyékony agargélhe ÓÖ’C'-oa. Egy 8 cm x 8 cm. x: 0,75 mm cnfeísgóh ötstőttimk és Afo-rs hűtve meg20 szilárdítottuk.
Szubszttátmáttiy
Egy szintetikus influenza neurammidaz szubszfrátoí, a 2 -(4-3nett1nni.beiiferii)-alfa~D-N-acetii-»euíaatia~ savat íSigrna, katalógus szám; M-8639) hígítottunk 3 mmolfol DMSO-baa 3ö gmotta a folyékony agargélbe és a fentiekben leírtakhoz hasonló módon öntöttük: az: euzíragéit.
&klÉí=üÍő.cs kimutatás
Az enzimmátrtxot a mmtamáöixrsak arra az, oldalára helyeztük, ahol az érdeklődés tárgyát képező vegyületek száradtak. Ezután a szubszttátmátrixot az enzünmáirfe tetejére raktok. A mátrixokat szobahőmérsékleten 30 percen keresztül ínkubáhnk. Ez idő alatt a kioltott fluoreszcenclás szubszuát és az enzim a két gél között együtt dlffendál, és a szubszttátoí az enzim eíhasrfla, igy a fluoreszcencia intenzitásba» növekedést okoz. Ezt- figyeljük meg 349 nm~en történő gerjesztéssel és 450 um-es kibocsátással. Az enshnakttv hást csökkenteni képes vegyületek minimálisra csökkentik a fluoreszcencia intenzitás növekedését. Mivel a legtöbb helyen növekedett a gél fluoreszcencia intenzitása, a műanyag lapról a gélbe diffundáb enzímisrhibiiorokat tartalmazóterületek kisebb fluoreszcenciával, sötétebit foltokként voltak láthatók. Ez CCD-ksxberávai, megfelelő szűrőkkel kőJötyen megfigyelhető a kibocsátási és a gerjesztő hniláínbosszok szabályozásával. A gátlást zónákat mutató vegyületek azonosítása az inhibitoros mátrixnak megfelelő zóna helyzetével határozható meg. A DANA kontroli fluoreszcenciájának a vizsgált mbibiisr ismert meaoyisegeivel történő összehasonlítása kvantitatív becslést ad az ICjo értekre mindegyik: vegyiflctoél,
A könyvtár mind az .528 vegyüfetét két párhuzamosban vizsgáltuk. A teljes, felhasznált eazasgél menynyiség 33 ml volt, 31,25 gl vizsgálatonként. Továbbá az összes vegyületet egyidejűleg vizsgáltuk, és a szőrövisssgálati eljárás körülményéi azonosuk voltak a hagyományos űő-lyukas szűrővizsgálati eljárással. Mim a 14·. ábrán bemutatjuk, a szűrővizsgálati eljárás elég érzékeny akár 100 pmol koncentrációba® lévő Inhibitorok kimutatására. Áz aktív vegyületekre becsült ICjo értékek jól megegyeznek az ugyanazoknál a vegyületeknél, a sokkal költségesebb, vfesgálatoakéut .209 pl-i igénylő 9ő-lynkó szűrővizsgálati eljárással vizsgáit értékekkel. Lásd a Kvantitatív gél szűrővizsgálati eljárás eredményei' című táblázatot, Ezek a példák bizonyítják, hogy a vegyületek aagyobb sűrűségű elrendezésben: történő vizsgálata csökkenti a költséget és az időt, Például a távolságnak csak egy kis csökkentese, 5 mm helyett 2,5 mm, térfogati egységenként -a vizsgálati vegyületek számának négyszeres növekedését jelenti. Ebben a kísérletben: es a vizsgálati vegyületeakéati térfogatot IÖ pl alá csökkenti. Továbbá, a reagenseket egységes térfogaiban kezeljük, atnely a mimalürizáh szűrővizsgálati eljárásokban a kis mennyiségű folyadékok kezelésére alkalmazott eszközöket feleslegessé teszi.
Kvantitatív gél szűrővizsgálati eljárás eredményei
Minta szám Körülbelüli max Ki (urnol) a gélből Becsült ÍCjo értekek (pmol) a 9ó-!yukas szűrővizsgálatból
34 löt) >100
35 80 >11X1
36 80 42
3? 100 >100
3S WÖ >100
« ♦ » »««» ». ί»., ί » « » .
ί „ · ♦ ♦ »
39 100 >100
40 40 .32
41 100 >100
42 40 50
43 100 >100
44 >200 >100
45 100 >100
46 100 >100
47 10 7,5
48 100 >100
49 100 >100
59 100 >100
A miniatürizálás elönyeiirek bemutatására esy következő lépésként i 0080 különálló vegyületet vizsgáltunk GF-HTS-sel 17 tűi teljes eazmtgél térfosatban (kevesebb, sót 2 μΐ vizsgálatottkénf), Packard Muhípipette-f alkalmaztuk a minták 30 ul-es menrtyáségetnek szétnsérésére egymástól 1 aaa távolságra. A vegyníeteket DMSO-tea ráértük szét 5 mmol koncentrációban, így mindegyikből körülbelül 150 praol mennyiséget mértünk a műanyagra. DANA-f alkalmaztuk ismét kontroli inhibitorként, Á szokásos, a vegyületek: elrendezést során kívüli kontrolltitráláson túl egy kostrolltítrálásí az elrendezést sorban is elhelyeztünk, mintegy vak: próbaként, amelyben a kontrollmmtákat ugyanúgy kezeltük, isin; a lÖOSö ismeretlent, amikor a műanyag lapra vittük fel. Mist korábban, a lapokat szárítottuk és a neuratnsniááz szűrővizsgálati eljárásban alkalmaztok. Mind a 1QÖ8Ö vegyületet egyidejűleg vizsgáltuk kevesebb mint egy óra alatt ezzel az eljárással Még egyszer megjegyezzük, .hogy mikro&iyadék-adagolók és/vagy kis tstetmyi»égék kezelése sem szükséges, kivéve a kiindulási vegyöleteknek a lapra történő szélmérésekor. Az ebben a szűrővizsgálati eljárásban alkalmazott rendkívül nagy sűrűség nem akadályozta az Inhibitorok kimutatását. Továbbá a nagy sűrűség nem bonyolította az aktív vegyületek azonosítását, ntég ha fluoreszcens vegyületek (a gélen világos foltokként könnyen megfigyelhetők) voltak az aktív vegyületek legközelebbi szomszédai, lásd 15, ábra.

Claims (11)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    L Eljárás különhözö anyagok sagyszámú mintáhtak azon képességére történő egyidejű vizsgálatára, hogy egy biológiát íolyaataíot serkentenek vagy gátolnak, azzal fe/femem-v, hogy
    a) as egyes anyagok több mim 96 mmtáiának kis térfogatú mennyiségeit adott elrendezésben íelvisszSk egy sik, porózus mátrixra, amely egy egyenletesen eloszlatott szűrővizsgálati reagenst tartaknaz vagy hordoz oly módom hogy' minden egyes anyagot a saját, különálló helyének közepére helyesünk el és biztosítjuk, hogy minden egyes anyag azonosítható legyen elrendezési helye alapján, és a felvitt mintáknak a planáris, porózus mátrixba» lassú dlfióztóiát tesszük lehetővé, ntiákal szűrővizsgálatot végezhetőnk a minták összefolyása nélkül, fe) megfigyeljük az egyes anyagok és a szörövlzsgálati reagens közötti kölcsönhatási és megfeleltetjük aa anyag azon képességének, hogy serkenti vagy gátolja a biológiai folyamatot.
  2. 2. Az I. igénypont szerinti eljárás, -azzaljfettemezva, hogy az aj lépésben, további intézkedésként
    í) az egyes anyagok több mint 96 mintájának kis térfogai® mennyiségeit az adott elrendezésben sík mátrixra visszük fel oly módos, hogy minden egyes anyagot s stgát, különálló helyének közepére heiyezaaak el és biztosítják, hogy tntsden egyes anyag azonosítható legyen elrendezési helye alapján, és il) kapcsolatba hozzuk a sík mátrixot a porózus mátrixszal, amely egy egyenletesen eiosziatött szűrővizsgálati reagenst tartalmaz vagy hordoz, és az anyagok legalább egy részét hagyjuk a porózus mátrixba diffundálni oly utódon, hogy biztesiljok, hogy mindegyik diffunéált anyag téibeii helyzete megfeleltethető legyen tr sík mátrixon lévő helyével, ahová az anyagot eredetileg eiheiyezifik, és iü) végrehaj-unk a b) lépést.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, asza? jettemazve, hogy az a) lépésben, további intézkedésként
    i) az egyes különálló assyagok több mint 96 mintájának kis térfogatú mennyiségeit adott elrendezésben sík mátrixra visszük fel oly módon, hogy minden egyes anyagot a saját, különálló helyének közepére helyezünk el, és biztosítjuk, hogy minden egyes anyag azonosítható legyen elrendezési helye alapján, és ii) kapcsolatba hozzuk a sík tsáírixoí az első porózus mátrixszal amely az egyenletesen eloszlatott első szűrővizsgálati reagenst tartalmazza vagy hordozza, és az anyagok legalább egy részét hagyjuk a porózus mátrixba diöundáhti oly módon, hogy biztosítjuk hogy mindegysk diffujidált anyag térbeli helyzete megfeleltethető legyen a sik mátrixon lévő helyével, ahová az anyagot eredetileg elhelyeztük, th) kapcsolatba hozzuk az első porózus mátrixot egy második mátrixszal, amely egy második egyenletesen eloszlatott szűrővizsgálati reagenst tartalmaz vagy hordoz, és a második szűrővizsgálati reagenst hagyjuk az első porózus mátrixba difftmdálni, vagy az egyes anyagokat és az első reagenst hagyjuk a második mátrixba ditfundáhti, ez utóbbi esetben biztosítva, hogy a diffúzió során ««Hegyik anyag második mátrixban lévő helyzete megfeleltethető tegyen a sík mátrixon iévó helyével, ahová az anyagot eredetileg elhelyeztük, és tv) végrehajtunk a fe) lépést.
  4. 4. Az 1. Igénypont szerinti eljárás, uzzuf /<?;femezve, hogy az a) lépésben, további intézkedésként
    i) az egyes anyagok több mint 96 mintájának a kis- térfogatú mennyiségeit az adott elrendezésben egy első, sik, porózus mátrixra, visszük fel, amely egy egyformán eloszlatott, első szűrővizsgálati: reagenst taríalmaz '23 gt vagy hordoz oly mááoa, hogy minden egyes különálló anyagot a saját, külöxtáiió helyének közepére helyez&ok el. és biztosítjuk, hogy minden egyes* anyag azonosítható legyen elrendezési helye alapján, bj kapcsolatba hozzuk az első porózus mátrixot egy második, sík mátrixszal, amely egy második, egyenletesen eloszlatott szűrővizsgálati reagenst tartalmaz vagy hordoz, és a második szűrővizsgálati reagenst hagyjak az első porózus mátrixba diffundáloi, vagy az egyes anyagokat és -az első reagenst hagyjuk a második mátrixba vagy mátrixra diífandálni, ez utóbbi esetheti biztosítva, hogy a diffúzió során mindegyik anyag második mátrixba® vagy mátrixon levő helyzete megfeleltethető legyen az első porózus mátrixon lévő helyével, ahová az anyagot eredenleg elhelyeztük, és hl) végrehajtunk: a b) lépést.
  5. 5, Áz L vagy 2, vagy 3, vagy 4, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal /eUemtsve, hogy az· egyenletesen eloszlatott szűrővizsgálati reagensek egyike snskromolektíla,
    ő. Az 1. vagy 2. vagy 3. vagy 4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal /e/fe/seaw, hogy az egyenletesen eloszlatott szűrővizsgálati reagensek egyike enzim, ?, Az 1. vagy 2, vagy 3. vagy 4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás,, azzal ye/teezve, hogy az egyenletesen eloszlatott szűrővizsgálati reagensek egyike nyers biológiai kivonat;.
    S. Az 1. vagy 2. vagy 3. vagy 4. igénypontok bármelyike szerinti, eljárás, azzal jellemezve, hogy az egy enletesen eloszlatott szűrővizsgálati reagensek egyike sejtszerveket, tartalmaz.
  6. 9. Az 1. vagy 2. vagy 3. vagy 4. igénypontok bármelyike szerisfo eljárás, uzzui jeífeseeve, hogy az egyenletesen eloszlatott szűrővizsgálati reagensek egyike egész sejteket tartalmaz.
  7. 10. Az I. vagy 2. vagy 3, vagy 4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyformán eloszlatott szűrővizsgálati reagensként egy sik, porózus mátrix egyik felületén, lévő egész sejteket alkalmazunk.
  8. 11. A lö. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben a kölcsönhatást a porózus mátrixnak egy reagens oldatával vagy folyékony szuszpenziójával, vagy agy reagenst tartalmazó- porózus mátrixszal történő érintkeztetése során figyeljük: meg, amely reagens- bármelyik esetben egy fehérje láthatóvá tétólét segít! elő, és ahol biológiai folyamatként a fehérjének az egész sejtheti történő expresszióját értékeljük ki.
  9. 12. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve. bog)* első szűrővizsgálati reagensként jelölt iigandot és második szűrővizsgálati reagensként a hgand egy ínanobíiízált receptorát alkalmazzak.
  10. 13. A 12. igénypont szerinti eljutás, azzaljallamazvg, hegy a második, sík mátrixot mossuk, miáltal eltávolítunk minden jelölt ligandot, amely a. második, sík mátrixra vagy mátrixba diiSmdált, de nem kötődött sz inunsbílizáU receptorhoz,
  11. 14. A. 13. igénypont szerinti eljárás, <«»/jedfemerve, hogy a második, sik: mátrixot egy reagens oldatával vagy folysáékszuszpeoziójávak vagy egy reagenst tartalmazó porózus mátrixszal éríníkeztotjük, amely reagens bármely esetben a mosási. lépéssel el nem. távolított, jelölt lígand láthatóvá tételét segítí aló,
    A meghatalmazott:
HU0100207A 1997-12-12 1998-12-11 Continuous format high throughput screening HU228578B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/990,168 US5976813A (en) 1997-12-12 1997-12-12 Continuous format high throughput screening
PCT/US1998/026465 WO1999030154A2 (en) 1997-12-12 1998-12-11 Continuous format high throughput screening

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0100207A2 HUP0100207A2 (hu) 2001-06-28
HUP0100207A3 HUP0100207A3 (en) 2003-08-28
HU228578B1 true HU228578B1 (en) 2013-04-29

Family

ID=25535858

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0100207A HU228578B1 (en) 1997-12-12 1998-12-11 Continuous format high throughput screening

Country Status (26)

Country Link
US (1) US5976813A (hu)
EP (1) EP1038179B1 (hu)
JP (1) JP4558197B2 (hu)
KR (1) KR100657777B1 (hu)
CN (2) CN1281552A (hu)
AT (1) ATE336001T1 (hu)
AU (1) AU759538B2 (hu)
BG (1) BG65264B1 (hu)
BR (1) BR9815059A (hu)
CA (1) CA2310684C (hu)
CY (1) CY1106220T1 (hu)
CZ (1) CZ299740B6 (hu)
DE (1) DE69835537T2 (hu)
DK (1) DK1038179T3 (hu)
ES (1) ES2270539T3 (hu)
HK (1) HK1032996A1 (hu)
HU (1) HU228578B1 (hu)
IL (1) IL135793A (hu)
NO (1) NO326662B1 (hu)
NZ (1) NZ504112A (hu)
PL (1) PL194813B1 (hu)
PT (1) PT1038179E (hu)
SK (1) SK286095B6 (hu)
TR (1) TR200001647T2 (hu)
TW (1) TW555967B (hu)
WO (1) WO1999030154A2 (hu)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0877937B1 (en) 1996-01-26 2002-05-22 Virco N.V. Method of assessing the chemotherapy of hiv-positive patients based on the phenotypic drug sensitivity of the patient's hiv strains
US6790652B1 (en) * 1998-01-08 2004-09-14 Bioimage A/S Method and apparatus for high density format screening for bioactive molecules
US6410332B1 (en) * 1998-09-08 2002-06-25 Symyx Technologies, Inc. Sampling and analysis of reactions by trapping reaction components on a sorbent
RU2225985C2 (ru) * 1998-09-08 2004-03-20 Тиботек Н.В. Способ быстрого скрининга анализируемых проб
AU2368900A (en) * 1998-12-18 2000-07-03 Symyx Technologies, Inc. Apparatus and method for characterizing libraries of different materials using x-ray scattering
US20040185432A1 (en) * 1999-01-08 2004-09-23 Bioimage A/S Method and apparatus for high density format screening for bioactive molecules
US6690399B1 (en) * 1999-05-07 2004-02-10 Tropix, Inc. Data display software for displaying assay results
US6800437B1 (en) 1999-08-06 2004-10-05 Tibotec Bvba Method of monitoring a biological system by labeling with an apo metal binding protein
US6544480B1 (en) 1999-10-26 2003-04-08 Tibotec Bvba Device and related method for dispensing small volumes of liquid
US20010044112A1 (en) * 2000-03-24 2001-11-22 Lyles Mark B. High throughput screening array containing porous material
US20030031675A1 (en) 2000-06-06 2003-02-13 Mikesell Glen E. B7-related nucleic acids and polypeptides useful for immunomodulation
US20030219825A1 (en) * 2000-06-13 2003-11-27 Haizlip Jill Elaine High throughput method for screening candidate compounds for biological activity
US7087375B1 (en) 2000-06-23 2006-08-08 Johan Lennerstrand Method for determining the mechanism of HIV RT inhibitors
US7052659B1 (en) * 2000-07-18 2006-05-30 General Electric Company Sequential high throughput screening method and system
US6653124B1 (en) 2000-11-10 2003-11-25 Cytoplex Biosciences Inc. Array-based microenvironment for cell culturing, cell monitoring and drug-target validation
AUPR224600A0 (en) * 2000-12-21 2001-01-25 Polymerat Pty Ltd Novel polymers
US20030060695A1 (en) * 2001-03-07 2003-03-27 Connelly Patrick R. Implantable artificial organ devices
US7244232B2 (en) * 2001-03-07 2007-07-17 Biomed Solutions, Llc Process for identifying cancerous and/or metastatic cells of a living organism
US20020142304A1 (en) * 2001-03-09 2002-10-03 Anderson Daniel G. Uses and methods of making microarrays of polymeric biomaterials
US20080009019A1 (en) * 2001-06-13 2008-01-10 Smithkline Beecham Corporation High throughput method for screening candidate compounds for biological activity
DE10138766A1 (de) * 2001-08-07 2003-02-20 Bayer Cropscience Ag Verfahren zum Identifizieren von makrocyclischen Polyketiden
US20030032198A1 (en) * 2001-08-13 2003-02-13 Symyx Technologies, Inc. High throughput dispensing of fluids
EP1298433A1 (en) * 2001-09-28 2003-04-02 EMC microcollections GmbH Device and method for the generation of arrays of substance mixtures by diffusion
EP1487969A4 (en) * 2001-12-07 2008-07-09 Dyax Corp METHOD AND DEVICE FOR WASHING MAGNETICALLY RESPONSIVE PARTICLES
WO2003054155A2 (en) * 2001-12-19 2003-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Pichia pastoris formate dehydrogenase and uses therefor
US20050054118A1 (en) * 2002-02-27 2005-03-10 Lebrun Stewart J. High throughput screening method
AU2003212471A1 (en) * 2002-02-27 2003-09-09 Miragene, Inc. Improved substrate chemistry for protein immobilization on a rigid support
US20040072274A1 (en) * 2002-05-09 2004-04-15 Lebrun Stewart J. System and method for visualization and digital analysis of protein and other macromolecule microarrays
WO2003095494A1 (en) 2002-05-10 2003-11-20 Bio-Layer Pty Limited Generation of surface coating diversity
EP1365034A3 (en) 2002-05-21 2004-02-18 Bayer HealthCare AG Methods and compositions for the prediction, diagnosis, prognosis, prevention and treatment of malignant neoplasia
US20040028804A1 (en) * 2002-08-07 2004-02-12 Anderson Daniel G. Production of polymeric microarrays
US20040032058A1 (en) * 2002-08-13 2004-02-19 Neeper Robert K. Systems and methods for casting and handling assay matrices
US20040091941A1 (en) * 2002-08-13 2004-05-13 Ewing William R. Spotting pattern for placement of compounds in an array
US8557743B2 (en) 2002-09-05 2013-10-15 Dyax Corp. Display library process
US20040058327A1 (en) * 2002-09-20 2004-03-25 Pan Jeffrey Y Method for using a blank matrix in a continuous format high throughput screening process
WO2004092903A2 (en) * 2003-04-09 2004-10-28 Discovery Partners International Spot finding algorithm using image recognition software
US7025935B2 (en) * 2003-04-11 2006-04-11 Illumina, Inc. Apparatus and methods for reformatting liquid samples
EP1634081A2 (en) * 2003-05-28 2006-03-15 Bayer HealthCare AG Diagnostics and therapeutics for diseases associated with 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 7 (5-ht7)
JP2005046121A (ja) * 2003-07-31 2005-02-24 Japan Science & Technology Agency オンチップバイオアッセイ方法及びキット
US20050136536A1 (en) * 2003-09-15 2005-06-23 Anderson Daniel G. Embryonic epithelial cells
US20050069949A1 (en) * 2003-09-30 2005-03-31 International Business Machines Corporation Microfabricated Fluidic Structures
US20050069462A1 (en) * 2003-09-30 2005-03-31 International Business Machines Corporation Microfluidics Packaging
EP1522594A3 (en) 2003-10-06 2005-06-22 Bayer HealthCare AG Methods and kits for investigating cancer
US20060127963A1 (en) * 2003-11-21 2006-06-15 Lebrun Stewart J Microarray-based analysis of rheumatoid arthritis markers
DE602004022857D1 (de) 2003-12-02 2009-10-08 Basf Se 2-methyl-6-solanylbenzochinon-methyltransferase als ziel für herbizide
US20050124017A1 (en) * 2003-12-05 2005-06-09 Stewart Lebrun Quantitative alkaline-phosphatase precipitation reagent and methods for visualization of protein microarrays
AU2004296412B2 (en) * 2003-12-12 2011-03-10 Anteo Technologies Pty Ltd A method for designing surfaces
CA2553468A1 (en) * 2004-01-21 2005-08-04 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti Spa Inhibitors of mammalian hdac 11 useful for treating hdac 11 mediated disorders
EP1564556A1 (de) * 2004-02-17 2005-08-17 DST Diagnostic Science &amp; Technology GmbH Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung mehrerer Analyten mit simultaner interner Kontrolle
US8105849B2 (en) 2004-02-27 2012-01-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements
US8101431B2 (en) 2004-02-27 2012-01-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements and reagent delivery systems
EP1773866B1 (en) 2004-07-02 2013-06-19 Bio-Layer Pty Limited Use of metal complexes
US20080206855A1 (en) * 2005-05-06 2008-08-28 Kalypsys, Inc. Automated Compound Screening Using Gel-Permeation Matrix and Pin-Based Sample Transfer
US7629115B2 (en) * 2005-05-13 2009-12-08 Honeywell International Inc. Cell-based platform for high throughput screening
US8377398B2 (en) 2005-05-31 2013-02-19 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions related to determination and use of white blood cell counts
ES2389111T3 (es) 2005-12-02 2012-10-23 Sirtris Pharmaceuticals, Inc. Ensayos de espectrometría de masas para la actividad acetiltransferasa/desacetilasa
WO2007076580A1 (en) * 2005-12-30 2007-07-12 Bio-Layer Pty Limited Binding of molecules
US8715665B2 (en) 2007-04-13 2014-05-06 The General Hospital Corporation Methods for treating cancer resistant to ErbB therapeutics
WO2008154207A1 (en) * 2007-06-08 2008-12-18 The Burnham Institute For Medical Research Methods and compounds for regulating apoptosis
US20090272657A1 (en) * 2008-05-01 2009-11-05 Massachusetts Institute Of Technology Devices and processes for analyzing nucleic acid damage and repair using electrophoresis
EP2877483B1 (en) * 2012-07-25 2019-05-15 Bio-rad Laboratories, Inc. Targeted delivery of reagents through patterned transfer sheets
US9447135B2 (en) 2012-12-14 2016-09-20 University Of Kentucky Research Foundation Semi-synthetic mithramycin derivatives with anti-cancer activity
GB201318814D0 (en) * 2013-10-24 2013-12-11 Petroleum & Chemical Corp Microfluidic devices and arrangements for supplying such devices with reagents and biological samples
EP3087391B1 (en) 2013-12-23 2021-05-19 Basf Se Methods for determining modulators of insect transient receptor potential v (trpv) channel
JP7227568B2 (ja) 2017-07-27 2023-02-22 ユニバーシティー オブ サウザン カリフォルニア 医薬品開発のための標的としてのオトペトリンプロトンチャネル

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4447526A (en) * 1981-04-20 1984-05-08 Miles Laboratories, Inc. Homogeneous specific binding assay with carrier matrix incorporating specific binding partner
AR231590A1 (es) * 1981-04-29 1984-12-28 Ciba Geigy Ag Dispositivo de analisis inmunologico y procedimiento para obtenerlo
US4591570A (en) * 1983-02-02 1986-05-27 Centocor, Inc. Matrix of antibody-coated spots for determination of antigens
JP2564181B2 (ja) * 1988-11-24 1996-12-18 コニカ株式会社 特定成分の分析方法
DE4208645A1 (de) * 1992-03-18 1993-09-23 Bayer Ag Optischer festphasenbiosensor auf basis fluoreszenzfarbstoffmarkierter polyionischer schichten
AU4779493A (en) * 1992-07-21 1994-02-14 Bunsen Rush Laboratories Inc. Oligomer library formats and methods relating thereto
CA2130947C (en) * 1993-11-12 2001-02-06 Robert E. Emmons Dry elements, test devices, test kits and methods for chemiluminescent detection of analytes using peroxidase-labeled reagents
AU691296B2 (en) * 1994-05-06 1998-05-14 Pharmacopeia Drug Discovery, Inc. Combinatorial dihydrobenzopyran library
US5856083A (en) * 1994-05-06 1999-01-05 Pharmacopeia, Inc. Lawn assay for compounds that affect enzyme activity or bind to target molecules
ES2139225T3 (es) * 1994-07-22 2000-02-01 Zeneca Ltd Metodo para escrutar bancos de compuestos.

Also Published As

Publication number Publication date
DE69835537D1 (de) 2006-09-21
TW555967B (en) 2003-10-01
US5976813A (en) 1999-11-02
PT1038179E (pt) 2006-12-29
DE69835537T2 (de) 2007-08-09
CA2310684C (en) 2011-05-10
CN101256187A (zh) 2008-09-03
JP2001526390A (ja) 2001-12-18
WO1999030154A3 (en) 1999-08-12
WO1999030154A2 (en) 1999-06-17
TR200001647T2 (tr) 2001-06-21
SK286095B6 (sk) 2008-03-05
KR20010024709A (ko) 2001-03-26
HK1032996A1 (en) 2001-08-10
CZ20002078A3 (cs) 2000-09-13
NO326662B1 (no) 2009-01-26
ATE336001T1 (de) 2006-09-15
NZ504112A (en) 2002-11-26
DK1038179T3 (da) 2006-11-20
EP1038179A2 (en) 2000-09-27
AU759538B2 (en) 2003-04-17
PL194813B1 (pl) 2007-07-31
CZ299740B6 (cs) 2008-11-05
CA2310684A1 (en) 1999-06-17
EP1038179B1 (en) 2006-08-09
SK8362000A3 (en) 2000-10-09
IL135793A0 (en) 2001-05-20
NO20002079D0 (no) 2000-04-19
BR9815059A (pt) 2007-05-22
HUP0100207A2 (hu) 2001-06-28
NO20002079L (no) 2000-06-09
CN1281552A (zh) 2001-01-24
IL135793A (en) 2005-09-25
JP4558197B2 (ja) 2010-10-06
HUP0100207A3 (en) 2003-08-28
PL341655A1 (en) 2001-04-23
BG65264B1 (bg) 2007-10-31
BG104564A (en) 2001-04-30
CY1106220T1 (el) 2011-06-08
ES2270539T3 (es) 2007-04-01
AU1821699A (en) 1999-06-28
KR100657777B1 (ko) 2006-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU228578B1 (en) Continuous format high throughput screening
CA2603684C (en) In vitro method for the simultaneous detection and identification of antibiotics of different classes and corresponding diagnostic kit
CA2114627A1 (en) Kit for liquid phase quantitative analysis of oligonucleotides and method of use thereof
CN103575894B (zh) 一种可视化生物芯片的检测方法
US5677197A (en) Biochemical assay plate and method for making the same
JPH06341992A (ja) 非洗浄型ディップスティック免疫学的検査装置の改良
CN101438163A (zh) 利用磁场检测样品中的靶分子
CN104364649B (zh) 用于鉴定具有基因毒性的化合物的蛋白表达分析
US20040043398A1 (en) Use of the multipin platform as anchor device
JP2005502049A (ja) 薬物−薬物相互作用を同定するスクリーニングシステムおよびそれらの使用方法
CN103543274B (zh) 一种可视化的生物芯片
CN102388312A (zh) 分析方法、样品分析用具、防止样品液逆流的方法和防止背景上升的方法
JP6076500B2 (ja) 標的物質の検出方法
MXPA00005800A (en) Continuous format high throughput screening
AU5339399A (en) Agarose format for mammalian cell based reporter assays
US20040005627A1 (en) Microvolume detecting method and device
JP2004177321A (ja) 微量検出方法及び装置
Warwick An assessment of the suitability of using streptavidin coated microspheres on the test line of a lateral flow immunoassay with a hydrophilic membrane
EP3978619A1 (en) Automated silver enhancement system
GB2423581A (en) Particulate sets carrying a unique identifier for assays

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: ABBVIE INC., US

Free format text: FORMER OWNER(S): ABBOTT LABORATORIES, US

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees