ES2270539T3 - El escrutinio de alto rendimiento en formato continuo utilizando al menos una matriz porosa. - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para ensayar simultáneamente una multitud de muestras de diferentes sustancias, por su capacidad para intensificar o inhibir un proceso biológico, comprendiendo: a) depositar en un array un pequeño volumen de cada una de más de 96 muestras de sustancias diferentes sobre una matriz, de manera que cada sustancia diferente esté centrada en su propio sitio diferente, y se pueda determinar la identidad de cada sustancia a partir de su sitio de deposición, b) poner en contacto dicha matriz con una primera matriz porosa conteniendo, o llevando, un primer reactivo de ensayo uniformemente dispersado, y dejar que algo de cada sustancia se difunda dentro de dicha matriz porosa de manera que la ubicación espacial de cada sustancia difundida pueda ser correlacionada con el sitio en dicha matriz en el que dicha sustancia fue originalmente depositada, y c) conducir un ensayo para determinar la capacidad de cada sustancia difundida para intensificar o inhibir dicho proceso biológico, observando la interacción de cada sustancia con dicho reactivo de ensayo, caracterizado por que dicha matriz es una matriz planar.

Description

El escrutinio de alto rendimiento en formato continuo utilizando al menos una matriz porosa.
Campo técnico de la invención
El escrutinio de alto rendimiento en formato continuo (CF-HTS), utilizando al menos una matriz porosa, permite a la industria farmacéutica escrutar simultáneamente grandes números de entidades químicas para una amplia gama de actividades biológicas o bioquímicas. Además, el CF-HTS es útil para realizar ensayos multietapas.
Antecedentes de la invención
Los ensayos bioquímicos y biológicos están diseñados para comprobar la actividad en una amplia gama de sistemas que varían desde interacciones proteína-proteína, catálisis enzimática, unión proteína-moléculas pequeñas, hasta funciones celulares. En un "Escrutinio de Alto Rendimiento (HTS)", uno utiliza estas clases de ensayos para comprobar un gran número de entidades químicas y descubrir actividades biológicas o bioquímicas anteriormente desconocidas de las entidades químicas.
Ensayos Homogéneos frente a Heterogéneos
Todas las clases distintas de ensayos biológicos pueden ser divididas en dos clases principales: ensayos homogéneos y ensayos heterogéneos. En los ensayos homogéneos, todos los reactivos son añadidos juntos y los resultados se miden o interpretan sin ninguna manipulación adicional. Por ejemplo, el crecimiento celular en una placa Petri puede ser expuesto a un producto químico. Si el producto químico es tóxico para las células, una zona despejada indicará toxicidad mediante una simple observación. Para otro ejemplo, se puede utilizar células que expresen una proteína que cambia el color de las células. En el caso de células que expresen beta-galactosidasa (\beta-gal), creciendo en agar conteniendo x-gal, las células se vuelven más o menos azules dependiendo de cuanta proteína \beta-gal se exprese. De este modo, uno puede construir un ensayo homogéneo para cualquier etapa biológica que afecte a la expresión de un gen informador, tal como el gen de la beta-galactosidasa. Todavía, otro ejemplo de un ensayo homogéneo utiliza un sustrato que cambia de color o fluorescencia cuando es procesado por una enzima. Finalmente, tecnologías tales como los Ensayos de Proximidad por Centelleo (SPA) de Amersham miden directamente la unión de un ligando radiomarcado a una proteína o a cualquier sustancia de unión de ligando fijada a cuentas que contengan cintilante. Todos los ejemplos anteriores son ensayos homogéneos debido a que no necesitan etapas que no sean la adición de reactivos antes de la detección, medición, o lectura final de la señal.
Por otra parte, los ensayos heterogéneos necesitan al menos dos etapas que, debido a que son inherentemente incompatibles hasta un cierto punto, no se pueden combinar en una etapa. Por ejemplo, muchos ensayos heterogéneos requieren el añadir los reactivos en un cierto orden (por ejemplo, cuando algunos reactivos interfieran con etapas tempranas del ensayo pero que sean necesarias para completar etapas posteriores). Ejemplos comunes de estos incluyen ensayos en los que se añaden reactivos de desarrollo de la señal para informar indirectamente de la presencia o concentración de un producto de reacción. Otra etapa frecuente en los ensayos heterogéneos es una etapa de lavado. A menudo, en un ensayo se tiene que añadir tempranamente un exceso de reactivos de ensayo, pero se necesita se que sean quitados por lavado antes de las etapas posteriores a fin de que la reacción pueda proceder sin una alta señal de fondo. Por ejemplo, en un ensayo de unión de radioligando, un ligando marcado es primero incubado con una proteína que está unida a una superficie sólida, pero únicamente una pequeña fracción del ligando se une realmente al número limitado de sitios de la proteína. Después de la incubación, el exceso de ligando no unido tiene que ser quitado mediante lavado antes de que se pueda hacer una medición exacta del ligando radiactivo unido. El lavado se puede conseguir mediante una diversidad de métodos alternativos, incluyendo filtración, ciclos de lavado/decantación, precipitación/separación de fases, y/o centrifugación.
Muchos procesos biológicos y bioquímicos pueden ser medidos únicamente por métodos heterogéneos. Además, a pesar de la existencia de maneras para adaptar otros procesos biológicos y bioquímicos a métodos homogéneos, estos otros procesos funcionan más rentablemente y/o con reactivos más fácilmente disponibles mediante métodos heterogéneos. Por nombrar unos pocos, están disponibles comercialmente una variedad de métodos y juegos para técnicas homogéneas tales como SPA (Amersham), Polarización por Fluorescencia (Jolley y otros), Fluorescencia Sincrónica (Packard y otros). Sin embargo, utilizando estas clases de métodos siempre se incurre en coste y tiempo adicionales. Para muchos ensayos, los métodos heterogéneos están más comprobados y son más fáciles de desarrollar rápidamente. Por esta razón, el empleo de métodos heterogéneos tales como ensayos ELISA, de unión en filtro, RIA, de luciferasa en células, etc., continúan estando muy difundidos. Algunos de estos métodos serán descritos más detalladamente a continuación.
Se conoce, por ejemplo, a partir de WO 97 16569, un método para ensayar bibliotecas de compuestos, basadas en soportes sólidos, en bibliotecas con base concreta, para una actividad biológica o bioquímica. Las cuentas son introducidas en una matriz porosa, puestas en contacto con uno o más componentes del ensayo, e identificada su interacción preferentemente vía revelación visual directa o utilizando un marcador químico.
\newpage
Conforme a una forma de realización adicional en esta referencia, las cuentas que llevan los compuestos de ensayo pueden ser dispuestas en una disposición ordenada sobre una plantilla rígida que tenga orificios cónicos que permitan que una única cuenta se asiente dentro de ellos, a fin de espaciar las cuentas.
WO 94 02515 A revela métodos similares que utilizan múltiples copias, basadas en cuentas, de moléculas oligómeras sencillas. La identidad de una molécula activa en el ensayo es determinada visualmente, como en la referencia anterior, después de la difusión en un sustrato, combinada con una señal.
EP-A-0 063 810 revela un método para escrutar hibridomas fabricando anticuerpos monoclonales, donde los antígenos o las inmunoglobulinas están unidos a un soporte como una matriz de puntos. Su interacción en el ensayo genera una señal basada en una reacción coloreada que es inspeccionada visualmente para su análisis.
La revelación o examen visual de un array de alta densidad combinada con marcadores químicos, como en las referencias anteriores, haría sumamente difícil determinar la identidad de las sustancias individuales en tales arrays.
Escrutinio de Alto Rendimiento (HTS)
Durante años, la industria farmacéutica ha confiado cada vez más en el HTS de bibliotecas de compuestos químicos para encontrar candidatos a fármaco. El HTS describe un método donde muchos compuestos discretos son ensayados en paralelo, a fin de que un gran número de compuestos de ensayo sean escrutados por su actividad biológica, simultáneamente o casi simultáneamente. Actualmente, las técnicas más ampliamente demostradas utilizan placas de microtitulación de 96 pocillos. En este formato, se realizan simultáneamente 96 ensayos independientes en una única placa de plástico de 8x12 cm, que contiene 96 pocillos de reacción. Estos pocillos necesitan, típicamente, volúmenes de ensayo que oscilan desde 50 a 500 \mul. Además de las placas, estás disponibles comercialmente muchos instrumentos, materiales, pipetores, robótica, lavadores de placas y lectores de placas para adaptar el formato de 96 pocillos a una amplia gama de ensayos homogéneos y heterogéneos.
Hasta la fecha, los esfuerzos para mejorar el HTS se han enfocado en fabricar los pocillos más pequeños (miniaturización). A medida que se reduce el tamaño del pocillo, se puede aumentar el número de pocillos en cada placa para proporcionar más pruebas paralelas. Además, disminuyendo los volúmenes de ensayo, también disminuye el coste de los reactivos por ensayo. Además, debido a que se pueden aplicar más ensayos paralelos con menores volúmenes de ensayo, también se pueden comprobar simultáneamente más compuestos para descubrir candidatos a fármaco. Hasta aquí, la miniaturización ha mejorado marginalmente la tecnología con 96 pocillos, proporcionando un formato de 384 pocillos (96x4). Ver Comley y col., J. Biomol. Screening, vol. 2(3), págs. 171-78 (1997). De hecho, incluso se ha informado de formatos de mayor densidad, incluyendo un formato de 9.600 pocillos. Sin embargo, la miniaturización tiene costes y complejidades inherentes.
Estos costes y complejidades tienen que ver directamente con los tres componentes principales para miniaturizar un formato de escrutinio. En primer lugar, se tiene que ser capaz de fabricar los recipientes de ensayo más pequeños (tubos, pocillos, hoyos, etc.). Segundo, se tiene que ser capaz de dispensar exactamente todos los reactivos de ensayo necesarios dentro de más y menores pocillos (por lo general llevado a cabo mediante robots para manejar líquidos, que dispensen simultáneamente los reactivos dentro de muchos pocillos). Tercero, se tiene que ser capaz de "leer" los resultados de los ensayos en el array de alta densidad.
Dados los requerimientos de los ensayos independientes en paralelo, cada componente proporciona desafíos y limita cuanta miniaturización es factible o rentable. Por ejemplo, un formato menor más reciente puede necesitar un método completamente diferente para dispersar los reactivos, o necesitar un instrumento de lectura que tenga la resolución, sensibilidad e ingeniería que sea compatible con el reciente formato miniaturizado. A medida que se reduce el tamaño de cada pocillo, se tiene que ser capaz de fabricar el array de recipientes, dispensar los reactivos en cantidades menores, y leer cada muestra de ensayo también llega a ser más difícil, consume más tiempo, y costoso. Además, un tamaño de muestra menor también aumenta la variabilidad estadística de muestra a muestra, debido a las inherentes inexactitudes al dispensar menores volúmenes de reactivos y al medir señales más débiles de las muestras. Además, a medida que el tamaño de la muestra disminuye más allá de un cierto punto, factores como la evaporación y la tensión superficial añaden incluso un mayor coste y complejidad para implementar los más recientes formatos miniaturizados. Para un salto cuántico en la tecnología HTS, la industria suspira tristemente por la posibilidad de "ensayos de formato libre" o ensayos que no tengan barrera física entre las muestras. Típicamente imaginado como pequeñas gotitas de ensayo en un formato desprovisto de pocillos, nadie ha informado actualmente del empleo de un ensayo de formato libre en HTS, con colecciones de compuestos discretos estándar.
Bibliotecas Combinatorias de Escrutinio – Métodos de Permeación en Gel
Con el advenimiento de la química combinatoria, se pueden producir rápidamente millones de entidades químicas en soportes sólidos (generalmente cuentas). Aunque el formato de 96 pocillos está siendo utilizado para escrutar bibliotecas basadas en cuentas, este formato es considerado ineficaz en general debido a (1) cada cuenta transporta únicamente unas cantidades pequeñas de una entidad química; (2) el número de compuestos a ensayar es sumamente grande; y (3) las cuentas son difíciles de manipular en placas de microtitulación de 96 pocillos.
\newpage
Para evitar los problemas inherentes al escrutar bibliotecas combinatorias mediante el formato de 96 pocillos, algunos han informado del empleo de ensayos homogéneos sencillos que podrían ser descritos como "formato libre". Como ejemplo, se informó por Jayawickreme y col., en Proc Nat'l Acad. Sci (USA), vol. 191, págs. 1.614-18 (marzo de 1994), de un ensayo que utiliza células pigmentadas (melanocitos) en un ensayo homogéneo sencillo para bibliotecas combinatorias de péptidos. Según los autores, pusieron células bajo agarosa en placas Petri, después pusieron en la superficie de la agarosa cuentas que llevaban compuestos combinatorios, y luego liberaron parcialmente los compuestos de las cuentas. Se visualizaron los compuestos activos como áreas pigmentadas oscuras debido a que, como los compuestos se difunden localmente dentro de la matriz de gel, los compuestos activos originaron que las células cambiasen de color.
Otro ejemplo reciente es "Strategies for Screening Combinatorial Libraries: Novel and Traditional Approaches" de Daniel Chelsky, reportado en el First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening en Filadelfia, PA (7-10 de noviembre de 1995). Chelsky puso un ensayo enzimático homogéneo sencillo, para anhidrasa carbónica, dentro de un gel de agarosa de manera que la enzima en el gel originase un cambio de color por todo el gel. Después de esto, cuentas portando compuestos combinatorios vía un fotoacoplador, fueron puestas dentro del gel y los compuestos fueron parcialmente liberados mediante luz UV. Los compuestos que inhibieron la enzima fueron observados como zonas locales de inhibición teniendo menos cambio de color. Finalmente, en Molecular Diversity, vol. 2, págs. 57-63 (1996), Salmon y col. informaron de un método similar al de Jayawickreme y col., en donde las bibliotecas combinatorias fueron escrutadas para compuestos que tuvieran efectos citotóxicos en células cancerígenas creciendo en agar.
Los tres ejemplos son variaciones de los ensayos en gel, sometidos a prueba con el tiempo, para agentes antibacterianos o anticancerígenos, y son también similares a los ensayos inmunológicos familiares en los que se mide una interacción antígeno/anticuerpo en un gel. Si bien estos ensayos de permeación en gel eran apropiados para escrutar bibliotecas combinatorias basadas en cuentas, nadie ha informado de la extensión de este formato a ensayos heterogéneos o bibliotecas no basadas en cuentas.
El saber convencional desalentó a los investigadores de ensayar las muestras en un formato continuo que pudiera permitir que se mezclasen las muestras. Entre la clase limitada de ensayos reportados y las preocupaciones acerca de que las muestras se aplicasen juntas en un formato continuo, únicamente se han ensayado bibliotecas basadas en cuentas. Debido a estas limitaciones, los investigadores creyeron que el formato de 96 pocillos era el más indicado para el escrutinio de bibliotecas heterogéneas y no basadas en cuentas. Sería conveniente conducir los ensayos heterogéneos en un marco de formato libre. Además, sería conveniente ensayar compuestos discretos en un marco de formato
libre.
Breve resumen de la invención
La invención descrita aquí, Escrutinio de Alto Rendimiento en Formato Continuo (CF-HTS), implementa con éxito el concepto de formato libre para cualquier ensayo, homogéneo o heterogéneo, que se puede llevar a cabo en el formato de 96 pocillos. Además, el CF-HTS es también útil para escrutar bibliotecas combinatorias con ensayos heterogéneos, no ensayos homogéneos. Además, el CF-HTS puede ensayar compuestos discretos sin los costes y complejidades asociados con la miniaturización. Los asuntos relativos al potencial, que los reactivos y resultados de ensayo producen, seguirán conjuntamente durante las etapas posteriores probadas para no ser descubiertos.
Una forma de realización de la invención tiene que ver con un procedimiento para ensayar simultáneamente una multitud de muestras de sustancias diferentes, por su capacidad para intensificar o inhibir un proceso biológico, comprendiendo:
a) depositar en un array un pequeño volumen de cada una de las 96 muestras de sustancias distintas sobre una matriz, de manera que cada sustancia diferente esté centrada en su propio sitio diferente y se pueda determinar la identidad de cada sustancia a partir de su sitio de deposición;
b) poner dicha matriz en contacto con una primera matriz porosa conteniendo o portando un primer reactivo de ensayo uniformemente disperso, y permitir que algo de cada sustancia se difunda dentro de dicha matriz porosa de manera que la ubicación espacial de cada sustancia difundida pueda ser correlacionada con el sitio en dicha matriz en el que dicha sustancia fue originalmente depositada; y
c) conducir un ensayo para determinar la capacidad de cada sustancia difundida para intensificar o inhibir dicho proceso biológico, observando la interacción de cada sustancia con dicho reactivo de ensayo;
caracterizado porque dicha matriz es una matriz planar.
Otra forma de realización se refiere a un procedimiento, como se mencionó antes, comprendiendo la etapa adicional de
b1) poner en contacto dicha matriz porosa con una segunda matriz portando o conteniendo un segundo reactivo de ensayo uniformemente disperso, y permitir que el segundo reactivo de ensayo se difunda dentro de la primera matriz porosa o permitir que cada sustancia y el primer reactivo se difundan dentro de la segunda matriz, garantizando en el segundo caso que la difusión suceda de manera tal que la ubicación de cada sustancia en la segunda matriz pueda ser correlacionada con el sitio en dicha matriz planar en el que dicha sustancia fue originalmente depositada; y
c1) conducir dicha etapa (c).
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra muestras de ensayo gELISA en una matriz no porosa contactando por una cara con una matriz de gel porosa conteniendo reactivo de ensayo, la cual, a su vez, está en contacto con una matriz no porosa portando un reactivo de ensayo adicional.
La Figura 2 ilustra la separación de la matriz de muestras de ensayo gELISA y la matriz de gel porosa, seguido por el lavado y adición de reactivos líquidos o en solución para formar el complejo informador en la matriz no porosa de reactivo.
La Figura 3 ilustra el visualizar el ensayo gELISA, poniendo en contacto la matriz de complejo informador con una matriz de gel porosa conteniendo el sustrato informador.
La Figura 4 ilustra cómo se aplica una matriz de ligando sobre la superficie del filtro opuesta a la superficie del filtro que porta células.
La Figura 5 ilustra qué superficie del filtro portando células se puede producir cuando se visualice el ensayo.
La Figura 6 muestra el resultado de un ensayo VanA utilizando diversas concentraciones de un conocido inhibidor dependiente de la dosis.
La Figura 7 muestra el resultado de un ensayo EF3 utilizando concentraciones diversas de un inhibidor conocido.
La Figura 8 ilustra un experimento de control para el ensayo gELISA para la interacción proteína-proteína.
La Figura 9 ilustra el resultado del gELISA de "inhibición" de la interacción proteína-proteína.
La Figura 10 muestra la unión, dependiente de la dosis, de ITAM radiomarcados a LCK inmovilizado.
La Figura 11 registra los valores de píxeles frente a la concentración de ITAM, para mostrar una típica curva receptor-ligando.
La Figura 12 ilustra un experimento de control para la interacción ligando-célula de IL-8 radiomarcada.
La Figura 13 ilustra la "inhibición" de la interacción ligando-célula de IL-8.
La Figura 14 ilustra un ensayo para inhibidores de neuraminidasa.
La Figura 15 ilustra un ensayo simultáneo de 10.080 compuestos discretos para la inhibición de la neuraminidasa.
Descripción detallada de la invención
La idea central detrás del CF-HTS es poner muestras de ensayo en el contexto de una matriz porosa. El método comprende el poner uno o más componentes del ensayo dentro, encima de, o en el fondo de una matriz tal como un gel, una lámina de plástico, un filtro u otras formas de soporte sólido fácilmente manipulado. Cuando las muestras son introducidas en la matriz porosa, se difunden lo suficientemente lento de manera que los ensayos se puedan realizar sin que las muestras de ensayo se apliquen a la vez. De este modo, el formato CF-HTS separa las muestras de ensayo por difusión antes que por una barrera impenetrable. Si se permite que los ensayos se apliquen durante demasiado tiempo, las muestras de ensayo y los resultados se darán caza a la larga. Sin embargo, cuando se regula cuidadosamente, el CF-HTS permite una densidad muy alta de compuestos a escrutar simultáneamente, aún individualmente, sin la necesidad de llenar por separado pocillos o recipientes de reacción con disolventes o componentes del ensayo. Además, manipulando matrices que porten los componentes de reacción, uno puede realizar incluso ensayos heterogéneos complejos en este formato. La manipulación de matrices para ensayos heterogéneos es completamente inaudita y hace al CF-HTS tan flexible como que el formato de 96 pocillos está capacitado para escrutar una amplia gama de procesos biológicos o bioquímicos. Además, el CF-HTS logra las clases de ventajas anticipadas por la miniaturización sin las desventajas concomitantes, y tiene ventajas únicas.
El CF-HTS emplea una amplia gama de matrices y componentes del ensayo. Las matrices abarcan, pero no se limitan a, geles compuestos de agarosa, acrilamida u otros materiales gelatinosos, membranas, filtros, y plásticos. Las matrices pueden estar compuestas de materiales que incluyen, pero no se limitan a, poliestireno, polipropileno, otros plásticos, fibra de papel, vidrio, fibra de vidrio, sílice, policarbonato, poliéster, cloruro de polivinilideno y polietileno. Las matrices pueden ser sólidos impermeables, sólidos porosos tales como filtros, o geles. Los componentes del ensayo abarcan, pero no se limitan a, macromoléculas tales como ácidos nucleicos, proteínas, y otras macromoléculas sintéticas o naturales; células, lisados celulares, extractos biológicos, orgánulos, y otras entidades y mezclas biológicas complejas; y moléculas pequeñas tales como tampones, sales, inhibidores, sustratos, péptidos, colorantes, nucleótidos, cofactores, iones, y disolventes.
Un ensayo CF-HTS es un ensayo en donde múltiples muestras de ensayo son separadas por difusión antes que por barreras impenetrables. El componente crítico es la introducción de múltiples (más de 1) muestras de ensayo dentro de, o sobre, una matriz de ensayo porosa que contiene, opcionalmente, uno o más componentes del ensayo. Las matrices de ensayo porosas, conteniendo el componente(s) de ensayo, son preparadas añadiendo, mezclando, vertiendo, dispensando, o empapando los componentes en la matriz. Las matrices porosas también son preparadas acoplando, recubriendo, uniendo, fijando, conectando, conjugando o ligando los componentes del ensayo dentro de, o sobre, una superficie de la matriz. Además, una matriz porosa también es preparada formando una película delgada de solución o líquido sobre una cuenta de células, enzima u otro componente de ensayo inmovilizado. Las matrices de ensayo porosas son utilizadas para controlar el orden y/o la duración de la adición de componentes, y la extensión del mezclado y difusión cuando se combinan los componentes del ensayo. El CF-HTS también puede utilizar matrices no porosas. Las matrices no porosas son preparadas acoplando, recubriendo, uniendo, fijando, conectando, conjugando o ligando los componentes del ensayo, o muestras de ensayo, sobre una superficie de la matriz no porosa. El empleo de matrices no porosas en el CF-HTS fija espacialmente uno o más de los componentes del ensayo.
Cuando los componentes del ensayo son introducidos sobre la superficie de una matriz, los componentes del ensayo se unen mediante interacciones covalentes o no covalentes, específicas o no específicas, con las matrices que están no derivatizadas, derivatizadas, o pretratadas de otra manera para facilitar la unión de los componentes del ensayo. Después de la unión, el componente de ensayo es espacialmente fijado a fin de que esté inmovilizado por lo que concierne al ensayo. En este caso, cualquiera de las muestras de ensayo tiene que ser capaz de difundirse a través de una matriz para alcanzar los componentes del ensayo, y/o los subcomponentes o productos de los componentes del ensayo tienen que ser capaces de difundirse a través de una matriz para alcanzar las muestras de ensayo.
En alguna o más de las etapas siguientes se utiliza, por lo menos, una matriz porosa conteniendo las muestras de ensayo.
(1) Poner la superficie de la matriz porosa en contacto con al menos otra matriz (porosa o no porosa), de manera que las muestras y/o uno o más de los componentes del ensayo puedan difundirse a través de la superficie de contacto.
(2) Separar dos o más matrices para detener la interacción de componentes y/o muestras.
(3) Poner en contacto la superficie de dos o más matrices, de forma que los componentes del ensayo puedan interaccionar.
(4) Lavar, aclarar, o elucionar una matriz con tampones líquidos u otros disolventes para separar los componentes del ensayo no unidos y/o unidos no específicamente.
(5) Dispensar, verter, añadir, o empapar los componentes del ensayo en solución sobre una matriz, o filtrar dichos componentes a través de una matriz.
(6) Revelar, leer, escanear, detectar, o visualizar de otra manera las señales radiométricas, fluorescentes, espectrofotométricas o electromagnéticas presentes en una o más matrices.
El CF-HTS proporciona muchas ventajas sobre la técnica anterior. La ausencia de pocillos diferentes elimina la necesidad de dispensar simultánea y exactamente los componentes del ensayo o reactivos dentro de los pocillos. En lugar de eso, los componentes del ensayo son dispensados y mezclados mediante una manipulación a granel homogénea. Puesto que los componentes del ensayo se preparan como una solución a granel homogénea o matriz, existe una variación estadística mínima muestra a muestra. Por comparación, la presencia de pocillos en el formato de 96 pocillos crea grandes variaciones muestra a muestra.
Además, el CF-HTS proporciona un escrutinio, de sumamente alta densidad, de gran número de compuestos. Incluso si los aciertos observados "siguen conjuntamente" hasta un punto limitado, uno necesita únicamente volver a ensayar los compuestos que estén ubicados cerca del acierto. De este modo, si uno fuera capaz de reducir 10.000 muestras de ensayo a 50 candidatas alrededor de un área visualizada, uno podría reducir fácilmente las 50 candidatas a compuesto(s) activo con, incluso, la vieja tecnología de los 96 pocillos.
Dispensando y desecando compuestos discretos sobre láminas de plástico en arrays sumamente rellenos, aplicándolos después al CF-HTS, se estudian todas las cuestiones críticas de la miniaturización. Este formato no requiere innovaciones en plásticos u otros materiales para lograr la miniaturización, debido a que la miniaturización se logra simplemente limitando la cantidad de muestra que se difunde dentro de la matriz. Este formato tampoco requiere microfluídica para dispensar los reactivos de ensayo debido a que el ensayo completo tiene lugar, esencialmente, en un "pocillo gigante" donde los reactivos y soluciones son manipulados a granel. Únicamente se necesita dispensar las muestras de ensayo mediante microfluídica. Además, en este formato existe mucha menos variación estadística porque solamente se necesita buscar zonas de heterogeneidad localizadas en la, por otra parte, matriz homogénea. No se necesita leer y comparar muchos pocillos distintos. Además de todos los beneficios anticipados de la miniaturización (coste, rendimiento, uso de reactivos, uso de compuestos de ensayo), el CF-HTS también proporciona sorprendentes beneficios tales como la capacidad de manejar a granel la mayor parte de las etapas del ensayo.
Un aspecto central del CF-HTS es la observación de que los componentes del ensayo y las muestras de ensayo no se difunden lateralmente rápidamente, incluso en la superficies de contacto entre las matrices. Por ejemplo, cuando se pone un gel de agarosa en una placa de plástico, hay un líquido significativo en la superficie de contacto de la superficie del gel. Cuando se requiere una interacción entre un componente del ensayo en el gel y un componente del ensayo en la placa (como en el ejemplo del ELISA), es crítico que el componente en el gel sea capaz de difundirse fuera del gel y sobre la placa. Sin embargo, el CF-HTS necesita que la difusión lateral concomitante sea considerablemente más lenta, a fin de que la interacción en la placa esté localizada cerca de la ubicación original del componente basado en el gel. Estos mismos principios se aplican a cualquier superficie de contacto matriz-matriz entre geles, filtros, o superficies (o cualquier otra matriz) en cualquier combinación. La realización de que este comportamiento de difusión sea controlable y sea generalmente aplicable a todas las superficies de contacto de matrices es inaudita y contraria al saber convencional.
Un método preferido para introducir muestras o compuestos de ensayo dentro de la matriz (tal como un gel o filtro humedecido) es dispensar y desecar pequeños volúmenes de cada muestra sobre una superficie, tal como la superficie de una lámina de plástico en un array, para que dos muestras no se puedan mezclar o solapar y cada una esté en una posición específica. Cuando la lámina de plástico se pone sobre una matriz, las muestras se disuelven y difunden dentro de la matriz, en ubicaciones correspondientes a sus posiciones predefinidas en el array inicial.
Un método alternativo para dispensar muestras dentro de un array es dispensar las muestras sobre una matriz porosa, tal como un filtro, en donde el volumen de cada muestra dispensada es lo suficientemente bajo para que las muestras no se solapen dentro de la matriz. Al contactar con otra matriz porosa que contenga más líquido, los compuestos se difunden para iniciar el ensayo.
Cuando el array inicial de muestras introducidas dentro de una matriz en el escrutinio CF-HTS es de alta densidad, de manera que una zona concreta de actividad cubra espacialmente la ubicación inicial de más de una muestra, entonces cada una de estas muestras es, potencialmente, la fuente de actividad observada. Para densidades iniciales mayores, habrá más compuestos candidatos para cada zona ya que estarán presentes múltiples compuestos en una zona concreta. Los compuestos pueden difundirse juntos, pero cada uno tendrá todavía su propio gradiente espacial y no estarán cuantitativamente mezclados en ninguna posición. Por lo tanto, el centro de la zona se correlacionará aún con la posición precisa del compuesto activo en el array inicial. En la práctica, los aciertos son bastante raros, lo que es trivial el reensayar múltiples muestras para asegurar la identificación de compuestos activos para cada zona
activa.
Una forma de realización alternativa de la invención es introducir barreras físicas (haciendo así el formato no continuo en el riguroso empleo de la palabra) dentro de las matrices de un ensayo para limitar la distancia que puedan difundirse las muestras. Por ejemplo, dos geles conteniendo una enzima y sustrato, respectivamente, pueden ser cortados cada uno con una trama ("molde para galletas") de manera que cada gel sea subdividido en muchas ubicaciones discretas. Después, todavía se pueden poner en contacto los dos geles para que el sustrato y la enzima puedan difundirse juntos dentro de cada pieza de gel subdividido. Después, las muestras de ensayo podrían ser introducidas en cada pieza de gel subdividido a fin de que los ensayos sean completamente independientes, sin ninguna difusión entre los ensayos. Esta forma de realización elimina eficazmente algunas de las ventajas del CF-HTS, introduciendo desviaciones estadísticas entre las muestras de ensayo al fijar el volumen y, de ese modo, limitando la señal para arrays de alta densidad. Pero esta forma de realización recogería aun el beneficio de los ensayos heterogéneos basados en matrices, en los que los componentes del ensayo no necesitan ser dispensados dentro de un gran número de recipientes de reacción paralelos, y elimina el mezclado parcial de las muestras.
gELISA
Los ensayos de inmunoabsorción por unión enzimática (ELISA) son ensayos heterogéneos que detectan la unión entre ligandos en solución y receptores inmovilizados. El ELISA requiere muchas etapas de mezclado de reactivos y de lavado que son difíciles de realizar en el formato de 96 pocillos, y se podría imaginar mayor dificultad incluso cuando los pocillos sean reducidos desde el formato de 96 pocillos al formato de 384 pocillos. Los inventores han aplicado el método CF-HTS para detectar la inhibición de la unión entre ligandos y receptores diana inmovilizados (gELISA).
Un receptor es cualquier molécula que se puede unir a otra molécula. Ejemplos no limitantes son las proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos y complejos de los ejemplos anteriores. El receptor es inmovilizado en una de varias posibles matrices (la matriz de receptores) que abarcan, pero no se limitan a, superficies de plástico [por ejemplo, placa Petri o placa de plástico (de Nunc)], membranas o filtros que tienen una alta capacidad de unión a las dianas [por ejemplo, nitrocelulosa, nilón, o PVDF (Millipore, Corning Costar, Schleicher & Schuell, BioRad) o membranas derivatizadas tales como membranas SAM (Promega)]. Se prepara una matriz de ligando porosa (por ejemplo, gel de agarosa o membrana porosa) para que el ligando para el receptor inmovilizado esté dispensado sobre o dentro de la matriz. Los compuestos o muestras de ensayo se dispensan directamente sobre la matriz de ligando o, alternativamente, sobre o dentro de una matriz de muestras de ensayo [por ejemplo, poliestireno (Tekra), polivinilideno (por ejemplo, de Dow Brands)] u otra lámina o matriz de plástico flexible. La matriz de ensayo es puesta en contacto con la matriz de ligando, y se deja que las muestras se difundan dentro de la matriz de ligando. Después de un periodo de incubación apropiado, la matriz de ligando es puesta en contacto con la matriz de receptor, permitiendo que el ligando y las muestras entren en contacto y reaccionen potencialmente con el receptor mediante difusión (la Figura 1 muestra la unión del inmovilizado receptor R al ligando L\beta biotinilado). Durante la incubación, los ligandos se unirán al receptor inmovilizado a menos que un compuesto de muestra inhiba la unión ligando/receptor.
Después de un periodo de incubación apropiado, se extrae la matriz de receptor y se lava con un tampón adecuado para eliminar el ligando no unido y unido no específicamente y muestras. Después, la matriz de receptor se remoja en una solución conteniendo reactivos de ensayo que interaccionarán con el ligando (por ejemplo, un anticuerpo, avidina o estreptavidina en el caso de un ligando biotinilado), y tiene la capacidad de ser detectado directamente (por ejemplo, mediante fluorescencia o radiactividad) o indirectamente [por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (FA), o conjugado de betagalactosidasa] (la Figura 2 muestra un conjugado de avidina-HRP, AHRP, unido a los ligandos biotinilados). Después de una incubación apropiada, se extrae la matriz de receptor de la solución y se lava para eliminar el reactivo no unido y el unido no específicamente. En el caso de detección directa de la señal, la matriz es revelada utilizando un método adecuado (por ejemplo, escáneres espectrofotométricos, cámaras CCD, película, Phosphorimagers, o dispositivos de detección por centelleo). Las señales indirectas (por ejemplo, HRP o FA) requieren una reacción de desarrollo de señales adicional, conseguida dispensando sustratos u otros componentes de reacción necesarios en, o sobre, una matriz de sustrato porosa, y poniendo en contacto esta matriz con la matriz de receptor. La enzima (por ejemplo, HRP o FA) reacciona luego con el sustrato (Figura 3). Alternativamente, se introduce un sustrato precipitante en solución, en lugar de una matriz. Bajo cualquier método de visualización, las áreas de unión receptor/ligando producirán una reacción visible, mientras que las áreas donde fue inhibida la unión receptor/ligado no producirán una reacción visible.
Unión Célula/Ligando
El CF-HTS también se puede utilizar para detectar la inhibición de la unión ligando/receptor celular. En el ensayo tradicional, se combina un compuesto de ensayo, ligandos radiomarcados y células que expresan el correspondiente receptor, en un recipiente tal como un pocillo. Después, se proporciona tiempo suficiente para permitir que el receptor se una al ligando si tal unión no ha sido inhibida por el compuesto de ensayo. De las células se elimina cualquier componente no unido o unido no específicamente, y se mide la cantidad de radiactividad asociada con las células. Los inventores han adoptado el método CF-HTS para detectar la inhibición de la unión de ligandos a células. Las células que expresen el receptor deseado son cultivadas o plaqueadas en una matriz (matriz de células) tal como, pero no se limita a, geles, filtros, o membranas [por ejemplo, membranas de cultivo tisular Transwell (Corning Costar) o membranas para quimiotaxis (Neuro Probe)]. Se prepara una matriz porosa (por ejemplo gel de agarosa o membrana porosa) de manera que el ligando marcado para el receptor sea dispensado en o dentro de la matriz (matriz de ligando). Los compuestos o muestras de ensayo son dispensados directamente sobre la matriz de ligando o de células, o alternativamente sobre o dentro de otra matriz [por ejemplo, poliestireno (Tekra), polivinilideno u otra lámina de plástico o membrana; matriz de muestras]. La matriz de muestras es puesta en contacto con la matriz de ligando, permitiendo de ese modo que la muestra se difunda dentro de la matriz de ligando. Después de un periodo de incubación apropiado, se pone la matriz de ligando en contacto con la matriz de células, preferentemente en la cara sin células de la matriz, y permitiendo que el ligando y la muestra contacten y reaccionen con el receptor por difusión (Figura 4). Durante la incubación, los ligandos marcados se unirán a las células inmovilizadas a menos que una muestra inhiba la unión ligando/célula.
Después de la incubación, la matriz de células es separada de la matriz de ligando y lavada con un tampón adecuado para eliminar los ligandos no unidos y unidos no específicamente y muestras. La matriz de células es revelada utilizando el método apropiado (por ejemplo, escáneres espectrofotométricos,
Cámaras CCD, película, Phosphorimagers, o dispositivos de detección por centelleo) (la Figura 5 ilustra el desarrollo del ensayo sobre una película).
Como se mostró antes, el CF-HTS consigue todas las ventajas imaginadas para los ensayos "de formato libre", y puede ser aplicado a todos los tipos diferentes de ensayos biológicos o bioquímicos, bajo diferentes tipos de formato, y con distintos reactivos y equipo. Debido a su amplia aplicabilidad, es mejor ilustrado por los ejemplos siguientes. Sin embargo, estos ejemplos ilustran la forma de realización preferida de la presente invención, y no limitan las reivindicaciones o la especificación. El artesano ordinario apreciará fácilmente que se pueden hacer cambios y modificaciones a las formas de realización especificadas, sin apartarse del campo de aplicación de la invención.
Ejemplos
Ejemplo de Referencia 1
Un ensayo colorimétrico en gel de dos etapas para detectar fosfato generado por la enzima VanA resistente a vancomicina
La VanA es una enzima clave en resistencia a vancomicina, y cataliza la unión de D-alanina a D-alanina o D-alanina a D-lactato. Tradicionalmente, esta enzima es ensayada generando color a partir del fosfato que se libera cuando la enzima es activa (la actividad de la VanA hidroliza el ATP a ADP y fosfato). Los científicos saben que la D-cicloserina inhibe la VanA de una manera dependiente de la dosis, y emplean este inhibidor como control positivo frente a otros potenciales inhibidores.
Gel Enzimático
Se preparó un gel enzimático añadiendo enzima VanA a agarosa al 1% fundida (agarosa de alto punto de fusión, Gibco BRL) a 45ºC en HEPES 50 mM [N-[2-hidroxietil]piperazina-N'-[ácido 2-etanosulfónico]], Cl_{2}Mg 20 mM, ClK 20 mM, pH 7'3, hasta una concentración final en VanA de 2 \muM. Esta mezcla de agar fue vertida después en un aparato para moldear geles BioRad, y dejada solidificar a 2-8ºC durante 30 minutos.
Gel Sustrato
Se preparó un gel sustrato añadiendo ATP, D-alanina y D-lactato a agarosa fundida, para llevar cada componente a 1 mM, 1'5 mM y 1'75 mM respectivamente, y preparando el gel como se describió para el gel enzimático.
Matriz de Muestras
Se dispensó una serie de alícuotas de 1 ml de diluciones en serie de 5.000, 2.000, 1.000, 500, 200, 100 \mum de D-cicloserina, un conocido inhibidor utilizado como muestra de control, en etanol-agua 1:1, sobre una pedazo de película de cloruro de polivinilideno (PVDC), y se dejó secar durante 10 minutos.
Incubando la Enzima con el Sustrato en Presencia de Inhibidor
Se puso en contacto el gel enzimático con la matriz de muestras durante 5 minutos. Después, se puso el gel sustrato en la parte superior del gel enzimático y se dejó incubar durante 15-20 minutos. Posteriormente, se separaron los dos geles. Durante la incubación, se espera que se produzca fosfato por todo el gel a medida que la enzima cataliza la unión de los sustratos, con la excepción de las zonas donde se concentró bastante D-cicloserina para inhibir la reacción.
Visualizando el Ensayo
Un combinado de detección de fosfato, constando de verde malaquita al 0'15% recién preparado y molibdato amónico al 1'4% en ClH 1'33N, fue vertido y distribuido uniformemente sobre los geles enzimático y sustrato. Estos reactivos reaccionan con el fosfato y generan sombras verdes cada vez más oscuras, en función de las concentraciones crecientes de fosfato. Se dejó que el color se desarrollase durante 5-10 minutos (la Figura 6 ilustra el desarrollo de color en el gel, donde las cantidades de inhibidor variaron desde 5 nanomoles a 0'5 nanomoles). Los geles coloreados de verde fueron fotografiados utilizando una cámara CCD Eagle Eye de Stratagene. Como se esperaba, el grado que las zonas inhibitorias parecían menos verdes se correlacionó con la concentración de inhibidor añadido. Este ensayo puede ser utilizado, por lo tanto, para escrutar inhibidores de VanA, ordenando cuentas o compuestos combinatorios dispensados sobre cualquier otra superficie, que luego es puesta en contacto con el ensayo en gel.
Este ensayo también demuestra que el formato de escrutinio en gel es flexible para reacciones con múltiples etapas. Esta característica es necesaria para que este formato sea útil con una amplia gama de ensayos, debido a que muchos ensayos requieren múltiples etapas. En este caso, el ensayo VanA es un ensayo de dos etapas de la actividad enzimática, seguido por el desarrollo de color. Las versiones homogéneas (etapa única) de este ensayo no son fácilmente factibles debido a que los reactivos y condiciones para el desarrollo de color interfieren con la actividad de VanA, y también son incompatibles con la liberación en un gel de agar. Por lo tanto, es conveniente la separación espacial y temporal de estas dos etapas, teniendo en primer lugar un ensayo enzimático en gel seguido por una etapa de desarrollo de color en fase de solución.
Ejemplo de Referencia 2
Un ensayo en gel de dos etapas para detectar el fosfato generado por la actividad ATPasa del factor de elongación 3 en S. cerevisiae estimulada mediante unión a ribosomas
Cuando el factor de elongación 3 fúngico (EF3) interacciona con ribosomas, se estimula la actividad fosfatasa. Los inventores han aplicado el CF-HTS al ensayo para esta actividad.
Se preparó un gel enzimático conteniendo EF3 (una enzima muy sensible a la temperatura) y ribosomas de levaduras en un tampón de ensayo para EF-3. También se preparó un gel sustrato conteniendo ATP 1 mM en tampón de ensayo. Ambos geles contenían 2% de dimetilsulfóxido en agarosa de bajo punto de fusión (Gibco BRL), y se prepararon a 37ºC y se dejaron solidificar durante 30 minutos a 4ºC. Se salpicaron diluciones en serie de poli-L-lisina, un inhibidor del EF3 utilizado como muestra de control, sobre una película de PVDC y se desecaron (matriz de muestras). Después, el ensayo fue conducido como en el Ejemplo 1, preincubando el gel enzimático con los inhibidores en la matriz de muestras. Luego, se puso el gel enzimático en contacto con el gel sustrato durante 20 minutos. Como en el Ejemplo 1, los geles enzimático y sustrato fueron teñidos con el combinado verde malaquita/molibdato amónico para el desarrollo de color. Después, el gel enzimático fue revelado con una cámara CCD. Las manchas de inhibidor aparecieron como zonas más claras en un fondo verde. La Figura 7 ilustra el desarrollo de color en el gel, donde las cantidades de inhibidor variaron desde 5 picomoles hasta 200 picomoles. Los resultados muestran la señal dependiente de la dosis del inhibidor, indicando que se pueden escrutar compuestos en este ensayo para descubrir nuevos inhibidores del EF3. El Ejemplo 2 demuestra la utilidad del CF-HTS incluso con la complejidad introducida por la presencia de orgánulos u otras mezclas o extractos biológicos brutos.
Ejemplo de Referencia 3
Detección indirecta colorimétrica gELISA de los inhibidores de la interacción proteína-proteína
Como se discutió antes, el ELISA es frecuentemente utilizado para detectar la inhibición de las interacciones ligando-receptor, donde los receptores están inmovilizados en pocillos de microtitulación. Las parejas "ligando-receptor" utilizadas en el ELISA pueden constar de cualquier pareja de moléculas de unión a partir de proteínas u otras macromoléculas hasta moléculas pequeñas. Estos ensayos son complejos, ensayos de múltiples etapas que requieren inmovilizar el receptor, incubar el receptor con ligando, lavar para eliminar el ligando no retenido específicamente, no deseado, que pudiera de otra manera causar una alta señal de fondo, unir los reactivos visualizadores (por ejemplo, un anticuerpo, específico para el ligando, conjugado a una enzima informadora) al ligando unido al receptor, y generar una señal visible proporcionando sustratos a la enzima informadora. Es evidente que la complejidad del ELISA ha conducido a la industria de los HTS a concluir que el ELISA no puede ser adaptado a un ensayo de formato libre. No obstante, los inventores han adaptado este ensayo complejo de múltiples etapas al formato CF-HTS para ensayar una diversidad de interacciones proteína-proteína, proteína-ligando, y otras uniones de ligando.
El activador de plasminógeno tipo uroquinasa (uPA) se une a su correspondiente receptor (uPAR). La interacción uPA/uPAR ha sido implicada en la metástasis de varios tipos de cáncer. Los inventores han adaptado un tradicional ELISA uPA/uPAR al CF-HTS, utilizando receptores y ligandos purificados.
Matriz de uPAR
Las placas de plástico (7'5x11'5 cm; de Nunc, Inc. Naperville, IL) fueron recubiertas durante la noche con 15 ml de uPAR purificado 118 nM en salino tamponado con fosfato (PBS) (Life Technologies, Grand Island, NY) a pH 7'4 y 4ºC. Después de recubrir la placa de plástico durante la noche, se decantó la solución uPAR, y los sitios de unión que quedaban en la placa de plástico fueron bloqueados añadiendo 15 ml de PBS conteniendo 1% (p/v) de caseína e incubando durante 2 horas a temperatura ambiente (TA). Después de bloquear, se decantó la solución bloqueadora y la placa de plástico fue lavada cinco veces con 20 ml de tampón de lavado constando de 0'05% de Tween-20 (monolaurato de polioxietilensorbitán) en PBS. Después de lavar la placa de plástico fue desecada durante 10 minutos a TA. Esto fue regulado para que la placa de plástico pudiera ser utilizada en breve, después de eso, en el ensayo descrito a continuación y evitar sobredesecar la matriz, lo que puede conducir a la pérdida de actividad.
Matriz de \beta-uPA
A propósito del ensayo, el uPA utilizado está marcado con biotina (\beta-uPA). Se prepararon geles conteniendo \beta-uPA, remojando \beta-uPA en agar para evitar las altas temperaturas (en comparación a vertiéndolo en agar fundido en los Ejemplos 1 y 2). El agar fue preparado mezclando en primer lugar 0'1 g de agarosa (Sigma, St. Louis, MO) con 10 ml de PBS, calentando hasta fundir, y después moldeando en un aparato para geles de 8x7x0'075 cm^{3} (Bio-Rad, Hércules, CA). En la solidificación (a temperatura ambiente o a 4ºC), los geles fueron remojados, durante la noche a 4ºC, en 15 ml de \beta-uPA (aproximadamente 10 nM) en tampón de ensayo constando de PBS, 0'05% de Tween-20 y 0'1% de caseína (ambos de Sigma, St. Louis, MO). El gel fue secado durante 20 minutos a TA justo antes de su
uso.
Matriz de Muestras
En ausencia de una conocida inhibidor de molécula pequeña para la unión uPA/uPAR, se utilizó un uPA no biotinilado (Pro-uPA) como inhibidor de las muestra de control de la unión \beta-uPA/uPAR. Sobre una película de PVDC (Dowbrands L.P., Indianápolis, IN) se dispensaron alícuotas de cinco microlitros de Pro-uPA 0, 0'03, 0'1, 0'3, 1, y 3 \muM en tampón de ensayo, y se secaron durante 2 horas a TA.
Incubando el uPAR con Pro-uPA y \beta-uPA
La matriz de muestras fue colocada en una cara del gel de \beta-uPA, con las motas de Pro-uPA secas en contacto con la superficie del gel de \beta-uPA. Se dejó que el Pro-uPA se difundiese dentro del gel durante 10 minutos a TA. Posteriormente, la otra cara del gel de \beta-uPA fue puesta en la placa de plástico para permitir que el \beta-uPA (actuando como ligando) y el Pro-uPA (actuando como inhibidor competitivo) interaccionen con el uPAR sobre la superficie de la placa de plástico. La reacción de unión/competición fue incubada durante 20 minutos a TA. Después de la incubación, se separó la placa de plástico del gel, y se lavó rápidamente 4 veces con 20 ml de tampón de lavado. Se preparó una solución de conjugado avidina-peroxidasa de rábano picante (avidina-HRP) diluyendo avidina-HRP (Sigma, St. Louis, MO) 1 a 25.000 en tampón de ensayo, y añadiendo 15 ml a la placa de plástico. La reacción fue incubada durante 10 minutos a TA, seguido por decantación de la solución de avidina-HRP y lavado de la placa de plástico como antes. Se dejó secar la placa de plástico durante 20 minutos.
\newpage
La avidina en el avidina-HRP se une específicamente a biotina, de manera que únicamente las áreas de la matriz que manifiesten unión "ligando/receptor" exhibirán finalmente desarrollo de color. No exhibirán color las áreas de la matriz donde la unión "ligando/receptor" esté inhibida competitivamente por el Pro-uPA.
Desarrollo de Color
Se preparó el gel desarrollador de color, conteniendo un sustrato colorimétrico de HRP (gel de OFD), disolviendo 2 tabletas de o-fenilendiamina HCl (OFD) en 7 ml de diluyente (ambos del juego de Abbott nº 6172-30, Abbott Labs., Abbott Park, IL) y combinando esta solución con una solución de agarosa fabricada fundiendo 0'1 g de agarosa en 3 ml de agua. La mezcla final de 10 ml fue moldeada en un aparato para geles Mini-protein II de 8x7x0'075 cm, y se dejó solidificar a 4ºC durante 15 minutos. El gel fue transferido desde las placas de vidrio del soporte moldeador de geles a una lámina de PVDC o de plástico flexible, y dejado secar al aire durante 10 minutos a TA. Después, el gel fue transferido a otra lámina de PVDC o de plástico para permitir que se secase la otra cara durante 10 minutos. Luego, el gel de OFD fue puesto en la placa de plástico para empezar el desarrollo de color. En diversos momentos durante la incubación del OFD, la placa de plástico fue colocada en la parte superior de un filtro de paso de banda de 440 nm (Omega Optical Inc., Brattleboro, VT) que, a su vez, estaba en la parte superior de una placa de difusión de fibra óptica iluminada mediante una fuente de luz Fiber-Lite (ambas de Dolan-Jenner Industries Inc., Lawrence, MA). Las imágenes resultantes fueron conseguidas con una cámara CCD (sistema Eagle Eye, Stratagene, La Jolla, CA).
Experimento de Control
La Figura 8 ilustra un experimento de control para el Ejemplo 3. Para la Figura 8A, los cuadrados de agarosa
(1 cm^{2}) fueron remojados en soluciones de concentraciones diversas de \beta-uPA, como se indica debajo de cada cuadrado (excepto para la solución 50 mM que está marcada a la izquierda del cuadrado de agarosa).
Después de que los cuadrados de agarosa fuesen incubados en una placa de plástico con uPAR inmovilizado, fueron extraídos. Entonces, la placa de plástico fue lavada, y las áreas de la matriz donde ocurrió la unión \beta-uPA/uPAR fueron visualizadas como se describió antes. La Figura 8B muestra un diagrama del valor medio de píxeles (menos el fondo) para cada cuadrado (como se determinó analizando la imagen digital de la cámara CCD con un software de Análisis de Imágenes NIH) frente a la concentración de \beta-uPA en cada cuadrado de agarosa, a diversos tiempos durante el desarrollo de color de la OFD. El \beta-uPA liberado del gel de agarosa mostró una típica curva de unión receptor-ligando con una unión semimáxima (Kd) alrededor de 3-5 nM, que es coherente con los valores reportados para esta reacción en el ELISA estándar y otros ensayos que miden este parámetro. La Figura 8 demuestra que la señal colorimétrica indirecta generada mediante el gELISA depende cuantitativamente del alcance de la interacción ligando-receptor.
Resultados de la Competición Pro-uPA/\beta-uPA
La Figura 9 demuestra la inhibición de la unión \beta-uPA/uPAR por Pro-uPA. Las manchas en la Figura 9A indican áreas donde se inhibió la unión \beta-uPA/uPAR. De acuerdo con esto, la avidina-HRP no se unió en estás áreas. Por consiguiente, la HRP no reaccionó con los sustratos en el gel de OFD para generar desarrollo de color. La Figura 9B es una manera alternativa de mostrar estos mismos datos de la imagen CCD, que mejora la capacidad del ojo humano para ver la titulación cuantitativa.
Ejemplo de Referencia 4
Detección radiométrica directa de inhibidores de las interacciones proteína-proteína
La activación de células T es un componente de la respuesta inmunológica del cuerpo. Para sucesos corriente abajo que ocurran durante la activación de células T, la p56lck (LCK, una proteína) tiene que interaccionar con la región ITAM (motivo de activación, basado en tirosina, relacionado con inmunoglobulinas) de los dominios citoplasmáticos del receptor de antígeno de las células T. Los compuestos que inhiben esta interacción proteína-proteína son inmunosupresores potenciales. Los inventores han utilizado el CF-HTS para ensayar esta interacción proteína-proteína, donde la LCK está inmovilizada en una membrana.
Matriz de LCK
La LCK biotinilada es inmovilizada en una membrana de captura de biotina (membrana SAM) (Promega Corp., Madison, WI) inundando una tira de 11x2 cm con 5 ml de LCK 3 \muM en PBS conteniendo DTT (ditiotreitol) 5 mM, durante 10 minutos a TA, después de lo cual se elimina el tampón. Esto está regulado para que la membrana SAM pueda ser utilizada en breve, después de eso (en minutos), en el ensayo descrito a continuación.
Matriz ITAM*
Se prepara un gel de agarosa, conteniendo péptido ITAM radiomarcado (ITAM*), mezclando 0'1 g de agarosa con 10 ml de tampón, calentando hasta fusión, y moldeando después en un aparato para geles de 8x7x0'075 cm. El ITAM* es añadido justo antes del moldeo o, alternativamente, remojado en el gel después de la solidificación hasta una concentración final de 10 nM.
Matriz de Muestras
Las muestras de ensayo a escrutar son dispensadas sobre una superficie de plástico o PVDC, y desecadas para formar la matriz de muestras.
Incubando el ITAM*, LCK y las Muestras de Ensayo, y Visualización
La matriz de muestras es puesta en contacto con una cara del gel ITAM*, a fin de que las muestras de ensayo puedan difundirse dentro del gel ITAM*. Posteriormente, la otra cara del gel ITAM* es puesta en contacto con la membrana SAM en la que se ha inmovilizado la LCK. Después de incubar durante 15-45 minutos, se saca la membrana SAM, se lava, y se revela con un Phosphorimager o película. Los inhibidores de la interacción ITAM-LCK están indicados por zonas de menor radiactividad que corresponden a una menor intensidad de señal en la imagen.
Experimento de Control para la Unión ITAM*/LCK
Se prepararon geles de agarosa mezclando 0'1 g de agarosa con 10 ml de tampón, calentando hasta fusión, y moldeando después en un aparato para geles de 8x7x0'075 cm. Después de la solidificación, se taladraron en el gel círculos de 1 cm de diámetro y se remojaron en 400 \mul de ITAM 0'1, 0'3, 1, 3, 10 y 20 nM, marcado con ^{125}I (Amersham, Arlington Heights IL), en tampón durante la noche a 4ºC. Se extrajeron los círculos de gel de la solución y se dejaron secar durante 20 minutos a TA. Después, fueron puestos en la membrana SAM con LCK inmovilizada, e incubados durante 45 minutos a TA. Se extrajeron los geles y se lavaron las membranas 4 veces con tampón. Después de secar las membranas SAM, fueron reveladas utilizando un Phosphorimager.
La Figura 10 indica una unión dependiente de la dosis entre ^{125}I-ITAM y LCK inmovilizada en la membrana SAM.
La Figura 11 muestra un diagrama del valor promedio de píxeles (menos el fondo) para cada gel de ^{125}I-ITAM (como se determinó analizando la imagen digitalizada por el Phosphorimager, con software ImageQuant de Molecular Dynamics) frente a la concentración de ^{125}I-ITAM en el círculo de gel. El ^{125}I-ITAM liberado por el gel para inmovilizar la LCK mostró una típica curva de unión receptor-ligando.
Ejemplo de Referencia 5
Ensayo con genes informadores de células enteras utilizando un formato de combinación gel/filtro
Células de riñón, conocidas como células HEK, son transfectadas con un plásmido que contiene un elemento promotor de respuesta a AMP cíclica (CREB), fusionado a un gen de la luciferasa (gen informador de la luciferasa, de Promega). Cuando las células transfectadas son tratadas con forscolina, se induce la expresión del gen informador de la luciferasa. Después de eso, cuando a las células HEK se añade un tampón biológico conteniendo el sustrato de luciferasa (luciferina de escarabajo de Promega) y cofactores apropiados (tricina 20 mM pH 7'8, EDTA 0'1 mM, DTT 33 mM, coenzima A 0'3 mM, adenosina trifosfato 0'5 mM, y Cl_{2}Mg 1 mM), se genera una emisión de fotones que puede ser detectada por instrumentación convencional. Los inventores han adaptado este ensayo al CF-HTS.
Matriz de Células
Células en cultivo son tratadas con tripsina, transferidas dentro de una membrana TRASWELL^{TM} de Corning/
Costar (filtro de policarbonato de 3 micrones, con un aro soporte de plástico) e incubadas durante la noche a 37ºC, 5% de CO_{2}, en presencia de medio de cultivo tisular. Después, se elimina el medio de la membrana, y el filtro al que están unidas las células fue secado al aire durante 15 minutos y utilizado poco después en las etapas de abajo.
Matriz de inductor
Se prepara un gel conteniendo el inductor de la expresión de luciferasa, añadiendo 12 \mul de una solución madre 10 mM de forscolina (solución madre en etanol, de Sigma) en 6 ml de un gel de agarosa al 1% de bajo punto de fusión. El gel es solidificado a temperatura ambiente con forscolina a una concentración final de 20 \muM.
Matriz de Muestras
En ubicaciones discretas sobre PVDC se dispensan y desecan muestras, a alta densidad, que puedan bloquear la inducción de forscolina.
Incubando los Reactivos y Detectando la Inhibición
La cara del PVDC con inhibidor es incubada con el gel de inductor. A continuación, el gel conteniendo el inductor forscolina es colocado en la cara sin células de la matriz de células preparada anteriormente.
Estos son incubados juntos a 37ºC, en 5% de CO_{2}, durante 20 minutos. Después se extrae el gel de forscolina y la matriz de células se incuba a 37ºC, en 5% de CO_{2}, durante cuatro horas adicionales, para la máxima expresión de la construcción de luciferasa. Para detectar la actividad enzimática de la luciferasa (o inhibición de la misma), el filtro de la matriz de células es físicamente extraído de su aro soporte de plástico y colocado dentro de una placa Petri. La placa Petri es inundada con el sustrato de luciferasa (luciferina de escarabajo, de Promega) en un tampón biológico con cofactores apropiados, para generar luz como señal. Debido a que la señal está localizada dentro de células inmovilizadas que expresan luciferasa, los inhibidores de la etapa de inducción inicial producen zonas de menor emisión de fotones.
Ejemplo de Referencia 6
CF-HTS en Gel/Filtro para detectar directamente inhibidores de interacciones ligando-célula
La unión ligando/receptor en superficies celulares inicia rutas de señales en células que conducen por último a respuestas funcionales (por ejemplo, proliferación celular o secreción de sustancias biológicamente activas). Para regular la respuesta biológica de las células en estados de enfermedad, se busca frecuentemente inhibir la unión del ligando a las superficies celulares. Un método común para evaluar los inhibidores de la unión ligando/receptor celular es evaluar la capacidad del inhibidor para reducir la unión entre el ligando natural radiomarcado y las células. Esto implica la incubación de las células con radioligando e inhibidor, seguido por la eliminación mediante lavado del radioligando no unido y el unido no específicamente, midiendo después la cantidad de radiactividad unida.
La interleuquina-8 (IL-8) es una quimioquina quimiotáctica implicada en la inflamación al unirse a receptores en diversos tipos de células. Los inventores han desarrollado un ensayo celular ligando-receptor por CF-HTS, para evaluar los inhibidores de esta interacción.
Matriz de Células
Se plaquearon células HEK (ATCC, Bethesda, MD), expresando el receptor IL-8a, en un filtro de membrana Transwell de 75 mm de diámetro (Corning Costar Corp., Cambridge, MA) a una densidad de aproximadamente 20 millones de células por placa. Se dejó que se unieran al filtro de membrana, durante la noche, en tampón (RPMI de Life Technologies, Grand Island, NY) conteniendo Hepes 10 mM (Sigma, St. Louis, MO) a pH 7'2 y 37ºC. Después de que las células se uniesen al filtro, se eliminó el medio y se lavaron las células con tampón reciente para eliminar cualquier célula sin unir. Los filtros fueron invertidos hacia abajo por el lado de las células y colocados en ángulo para permitir que drenase el exceso de medio, y después se secaron durante 20 minutos. Esto fue regulado a fin de la matriz de células fuese utilizada inmediatamente en el ensayo descrito a continuación.
Matriz de Ligando
Se preparó la matriz de ligando remojando IL-8 marcada con ^{125}I (Amersham Inc., Arlington Heights, IL) en un gel de agarosa fabricado mezclando 0'1 g de agarosa con 10 ml de tampón, calentando hasta fusión, y moldeando después en un aparato para geles de 8x7x0'075 cm. Los geles fueron remojados durante la noche a TA, mientras se mezclaba lentamente en una plataforma rotativa (New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, NJ). Después de remojar, se secaron los geles durante 20 minutos a TA, justo antes de su uso. Esto fue regulado a fin de que el gel pudiera ser utilizado inmediatamente en el ensayo.
Matriz de Muestras
En ausencia de un inhibidor conocido de la unión IL-8/receptor celular, se utilizó IL-8 no radiomarcada (Genzyme Corp., Cambridge, MA) como inhibidor de la muestra de control para observar la inhibición de la unión ^{125}I-IL-8 a células HEK. En una lámina de plástico, tal como PVDC, se dispensó un microlitro de IL-8 0, 0'03, 0'1, 0'3, 1, 3, 10 y 100 \muM, y se secó durante una hora a vacío y TA.
Incubación
La matriz de muestras fue colocada en una cara de la matriz de ligando para que las motas de IL-8 secas entrasen en contacto con la superficie del gel. Se invirtió el gel para permitir que la otra cara se secase durante 10 minutos a TA, y para permitir que el "inhibidor" se difundiese en el gel. Posteriormente, los geles fueron puestos en la cara sin células de la matriz de células. Se dejó que la reacción de unión incubase durante 45 minutos a TA. Después de eso, se quitaron los geles, y la cara sin células de la membrana fue lavada 4 veces con tampón. Se dejó que las membranas secaran completamente antes de que fuesen extraídas de su aro soporte de plástico. Después, las membranas fueron reveladas con película para rayos X o con un Phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
La Figura 12 muestra una respuesta a la dosis para ^{125}I-IL-8 en geles de agarosa, difundiéndose a través de una matriz de células para unirse a células HEK que expresan el receptor IL-8a. Se remojaron varios cuadrados de agarosa de un cm^{2} en soluciones de concentraciones diversas de ^{125}I-IL-8 como se indicó. Posteriormente, los cuadrados remojados en ligando fueron puestos en contacto con la matriz de células como se describió antes. Después de la incubación, se quitaron los cuadrados de la matriz de células, y se lavó con tampón la cara sin células de la membrana. Se utilizó un Phosphorimager para localizar la ^{125}I-IL-8 unida a células. Los datos indican que una lectura radiométrica de salida, en este ensayo de células basado en gel, es cuantitativamente dependiente de la extensión de la interacción ligando-receptor. La Figura 12 también indica que las áreas de unión permanecen diferentes de forma, y confirma que la difusión lateral de la señal no es un problema en el ensayo.
La Figura 13 ilustra los resultados del experimento de inhibición competitiva. La inhibición de la unión entre la ^{125}I-IL-8 y las células HEK está acusada por las manchas luminosas. También es fácilmente evidente que la inhibición mediante IL-8 no marcada es cuantificablemente dependiente de la dosis. Aquellos datos indican que los inhibidores, ejemplificados por la IL-8 no marcada en este caso, pueden atravesar la matriz de células para reducir la unión entre la ^{125}I-IL-8 y las células.
Ejemplo de Referencia 7
Ensayo de células funcional sin gel, basado en filtro
Los cambios en la función celular son a menudo medidos observando el efecto de compuestos o muestras de ensayo en sistemas informadores tramados en células. Los ejemplos incluyen mirar el efecto en la síntesis de proteínas intracelulares fluorescentes tales como la proteína fluorescente verde (PFV), proteínas extracelulares tales como una molécula receptora o de adhesión, o enzimas específicas tales como luciferasa, cloranfenicol acetiltransferasa, o \beta-galactosidasa (Promega). En primer lugar, los compuestos de ensayo son incubados con las células. Después de eso, se deja que las células expresen la proteína informadora durante un periodo de tiempo apropiado (podrían ser minutos, horas o días). Después, se ensaya el nivel de la proteína receptora mediante métodos directos (por ejemplo, PFV) o mediante métodos indirectos (por ejemplo, técnicas de ELISA con proteínas unidas a membranas). Además, en el caso de enzimas, la célula puede ser rota para extraer la proteína informadora y ensayar la actividad enzimática. Otros ensayos de células funcionales miden el comportamiento o localización de moléculas específicas, tales como colorantes o metabolitos radiomarcados, en respuesta a la estimulación de un receptor o cambios en la fisiología celular tales como el potencial de membrana. Un ensayo ELISA, que mide el efecto de compuestos en la expresión de la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1), puede ser formateado para el CT-HTS como sigue. Se plaquean células endoteliales, expresando ICAM-1, en una membrana de policarbonato para quimiotaxis (Neuro Probe), a aproximadamente 5.000 células/mm^{2}. Las células son incubadas durante la noche a 37ºC en medio. Se elimina el medio y se deja que las membranas se sequen parcialmente durante 10 minutos a TA. Las muestras o compuestos a ensayar para la inducción de ICAM-1 son secados sobre láminas de plástico y colocados en contacto con la cara sin células de la membrana húmeda. Se deja que los compuestos interactúen con las células durante 1 hora a 37ºC en una cámara húmeda, y después de eso, las células son bañadas en medio e incubadas durante 5 horas a 37ºC.
Después de dejar tiempo para que la célula sintetice la proteína inducida, se elimina el medio de la membrana y se incuban las células en tampón conteniendo anticuerpo anti-ICAM-1 (Genzyme, R&D Systems) no conjugado o conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o biotina. Después de una incubación de 30 minutos a TA, se quita el tampón y se lavan las células varias veces para eliminar el anti-ICAM-1 no unido. En el caso de anticuerpo conjugado a FITC, se revela la membrana utilizando una cámara CCD (Stratagene, Imaging Research) con 485 nm de excitación y 520 nm de emisión. Los compuestos que estimularon la expresión de ICAM-1 producirán una zona con fluorescencia incrementada debido a la unión del anticuerpo anti-ICAM-1-FITC. En el caso de anticuerpo conjugado a biotina, las células son incubadas en tampón conteniendo avidina-HRP, durante 10 minutos a TA. Se quita el tampón y la avidina-HRP no unida es eliminada por lavado. Después, las membranas se bañan en tampón conteniendo un sustrato de HRP precipitante, tal como tetracloruro de diaminobencidina (Pierce), y se observa el desarrollo de color en áreas donde las células subyacentes fueron inducidas para expresar ICAM-1. En el caso del anticuerpo anti-ICAM-1 no conjugado, se hace reaccionar un anticuerpo anti-anti-ICAM-1 conjugado secundario con las células, seguido por el desarrollo de la señal con el sustrato apropiado para el conjugado. Se capturan imágenes mediante una cámara CCD. Todas estas variaciones (FITC, avidina-HRP, y anti-anti-ICAM-1) son informadores alternativos que deberían dar los mismos resultados cualitativos, esto es, las muestras que afecten a la expresión de ICAM-1 pueden ser correlacionadas con zonas de señal incrementada o disminuida.
Observad que, en este caso, las matrices para formato continuo son una membrana y una lámina de plástico. No es necesario un gel para el CF-HTS.
Ejemplo 8
Ensayo CF-HTS de compuestos discretos para la inhibición de la neuraminidasa Matriz de Muestras
Se ensayó, mediante CF-HTS, una biblioteca de 528 compuestos discretos, relacionados estructuralmente. Se utilizó un Packard Multiprobe MP204 DT para diluir los compuestos desde viales hacia placas de 96 pocillos, y para diluir y transferir los compuestos sobre láminas de plástico. Los compuestos fueron diluidos inicialmente desde 40 mM en DMSO en viales hasta 4 mM en DMSO en placas de 96 pocillos. Después, fueron diluidos desde 4 mM en DMSO hasta 200 \muM en EtOH/H_{2}O al 50% en placas de 96 pocillos. Estas muestras fueron transferidas, en duplicados de 1 \mul, sobre láminas de plástico de 8x8 cm, con un espaciamiento promediando 5 mm entre muestras (Bio-Rad nº cat. 165-2956) para un total de 192 muestras por lámina. Cada mancha de 1 \mul, por lo tanto, contenía aproximadamente 200 pmoles de un compuesto concreto de la biblioteca. Como control, se dispensó manualmente, próximo a los compuestos en cada lámina, una serie de diluciones de ácido 2,3-deshidro-2-desoxi-N-acetilneuramínico (DANA), un conocido inhibidor de la neuraminidasa (Boehringer Mannheim, nº 528544). Las láminas fueron secadas en un horno de vacío para que cada compuesto estuviera desecado en su propia ubicación sobre el plástico.
Matriz Enzimática
Antes del ensayo, la enzima neuraminidasa del virus influenza fue diluida 1.500 veces en glicerol al 25% en salino tamponado con fosfato, dentro de gel de agar licuado constando de 1% de agarosa, citrato sódico 50 mM pH 6'0, y cloruro cálcico 10 mM, a 40ºC. Se vertió y solidificó un gel enzimático de 8 cm x 8 cm x 0'75 mm, reduciendo la temperatura a 4ºC.
Matriz de sustrato
Un sustrato de neuraminidasa sintética para influenza, ácido 2'-(4-metilumbeliferil)-alfa-D-N-acetilneuramínico (Sigma nº de cat. M-8639), fue diluido desde 3 mM en DMSO hasta 30 \muM en gel de agar licuado, y vertido de una manera similar al gel enzimático descrito antes.
Incubación y Detección
La matriz enzimática fue colocada sobre la matriz de muestras, en la cara donde fueron desecados los compuestos de interés. Después, la matriz de sustrato fue apilada en la parte superior de la matriz enzimática. Las matrices fueron incubadas a TA durante 30 minutos. Durante este tiempo, el sustrato fluorescente apagado y la enzima se difundieron juntos entre los dos geles, y el sustrato fue surcado por la enzima para producir un aumento en la intensidad de la fluorescencia.
Esto fue monitorizado mediante excitación a 340 nm y emisión a 450 nm. Los compuestos que son capaces de inhibir la actividad enzimática minimizaron el aumento en la intensidad de la fluorescencia. A medida que los geles aumentaban en intensidad de fluorescencia en la mayor parte de las ubicaciones, las áreas que contenían inhibidores de la enzima, que se difundieron en el gel a partir de la lámina de plástico, eran visibles como áreas más oscuras teniendo menor fluorescencia. Esto fue fácilmente monitorizado mediante una cámara CCD con filtros adecuados para controlar las longitudes de onda de emisión y excitación. La identidad de los compuestos que mostraban zonas inhibitorias fue determinada por la posición de la zona con respecto a la matriz de inhibidores. Comparando la fluorescencia del control de DANA con las cantidades conocidas de cada inhibidor ensayado, se hizo un cálculo cuantitativo de la IC_{50} para cada compuesto.
Se ensayaron por duplicado los 528 compuestos de una biblioteca. El volumen total de gel enzimático utilizado fue 33 ml, ó 31'25 \mul por ensayo. Además, todos los compuestos se ensayaron simultáneamente, y las condiciones del ensayo fueron constantes comparadas con el ensayo tradicional de 96 pocillos. Además, como se ilustra por la Figura 14, el ensayo fue bastante sensible para detectar inhibidores tan débiles como 100 \muM. Los valores estimados de IC_{50} para los compuestos activos se correspondían con los observados para los mismos compuestos ensayados por el más costoso ensayo con 96 pocillos, el cual necesitó 200 \mul por ensayo. Ver la Tabla de Resultados Cuantitativos del Ensayo en Gel. Estos ejemplos demuestran que ensayar arrays de alta densidad de compuestos reduce el coste y el tiempo. Por ejemplo, incluso una menor reducción en el espaciamiento, a 2'5 mm en lugar de 5 mm, produce un aumento de cuatro veces en el número de compuestos ensayados por unidad de volumen. En este experimento, se habría bajado el volumen por compuesto ensayado por debajo de 10 \mul. Todavía los reactivos son manejados a granel, sin la necesidad del equipo para manipulación de líquidos de pequeño volumen, frecuentemente utilizado en el escrutinio miniaturizado.
Resultados Cuantitativos del Ensayo en Gel
Nº de muestra Ki máx. (\muM) aproximado a partir del gel IC_{50} (\muM) estimado a partir del ensayo en 96 pocillos
34 100 >100
35 80 >100
36 80 42
37 100 >100
38 100 >100
39 100 >100
40 40 32
41 100 >100
42 40 50
43 100 >100
44 >200 >100
45 100 >100
46 100 >100
47 10 7'5
48 100 >100
49 100 >100
50 100 >100
Como ejemplo de seguimiento para demostrar los beneficios de esta miniaturización, se ensayaron 10.080 compuestos mediante CF-HTS, en un volumen total de gel enzimático de 17 ml (menos de 2 \mul por ensayo). Se utilizó un Multipette Packard para dispensar un volumen de 30 nl de cada muestra, separadas 1 mm. Los compuestos fueron dispensados en DMSO a una concentración de 5 mM, a fin de que se dispensara aproximadamente 150 pmoles de cada uno sobre el plástico. Se utilizó nuevamente DANA como inhibidor de control. Además de la titulación de control habitual fuera del array de compuestos, se incluyó una titulación de control dentro del mismo array como ensayo ciego, en el que las muestras de control fueron tratadas igual que las 10.080 desconocidas cuando fueron dispensadas sobre el plástico. Como antes, las láminas fueron secadas y utilizadas en un ensayo de neuraminidasa. Todos los 10.080 fueron escrutados simultáneamente en menos de una hora mediante este método. Una vez más, no se necesitó microfluídica y/o manipulación de pequeños volúmenes, excepto cuando se dispensaron los compuestos iniciales sobre la lámina. La densidad sumamente alta utilizada en este ensayo no interfirió con la detección de inhibidores. Además, la alta densidad no complicó la identificación de los compuestos activos incluso cuando los compuestos fluorescentes (fácilmente observados como manchas más brillantes en el gel) eran los vecinos más cercanos de los compuestos activos. Ver la Figura 15.

Claims (12)

1. Un procedimiento para ensayar simultáneamente una multitud de muestras de diferentes sustancias, por su capacidad para intensificar o inhibir un proceso biológico, comprendiendo:
a) depositar en un array un pequeño volumen de cada una de más de 96 muestras de sustancias diferentes sobre una matriz, de manera que cada sustancia diferente esté centrada en su propio sitio diferente, y se pueda determinar la identidad de cada sustancia a partir de su sitio de deposición,
b) poner en contacto dicha matriz con una primera matriz porosa conteniendo, o llevando, un primer reactivo de ensayo uniformemente dispersado, y dejar que algo de cada sustancia se difunda dentro de dicha matriz porosa de manera que la ubicación espacial de cada sustancia difundida pueda ser correlacionada con el sitio en dicha matriz en el que dicha sustancia fue originalmente depositada, y
c) conducir un ensayo para determinar la capacidad de cada sustancia difundida para intensificar o inhibir dicho proceso biológico, observando la interacción de cada sustancia con dicho reactivo de ensayo,
caracterizado porque dicha matriz es una matriz planar.
2. Un procedimiento conforme a la reivindicación 1, comprendiendo la etapa adicional de
b1) poner en contacto dicha primera matriz porosa con una segunda matriz que lleva, o contiene, un segundo reactivo de ensayo uniformemente dispersado, y dejar que el segundo reactivo de ensayo se difunda dentro de la primera matriz porosa, o dejar que cada sustancia y el primer reactivo se difundan dentro de la segunda matriz, asegurando en el último caso que la difusión ocurra de manera tal que la ubicación de cada sustancia en la segunda matriz pueda ser correlacionada con el sitio, en dicha matriz planar, en el que dicha sustancia fue originalmente depositada, y
c1) conducir dicha etapa (c).
3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en donde uno de los reactivos de ensayo uniformemente dispersados es una macromolécula.
4. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en donde uno de los reactivos de ensayo uniformemente dispersados es una enzima.
5. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en donde uno de los reactivos de ensayo uniformemente dispersados es un extracto biológico bruto.
6. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en donde uno de los reactivos de ensayo uniformemente dispersados son orgánulos.
7. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en donde uno de los reactivos de ensayo uniformemente dispersados son células enteras.
8. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en donde un reactivo de ensayo uniformemente dispersado es son células enteras transportadas sobre una superficie de una matriz porosa planar.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en donde dicha interacción es observada poniendo en contacto dicha matriz porosa con una solución o suspensión líquida de un reactivo, o matriz porosa conteniendo un reactivo, que, en cualquier caso, ayuda a la visualización de una proteína cuya expresión en dichas células enteras es el proceso biológico a evaluar.
10. El procedimiento de la reivindicación 2, en donde el primer reactivo de ensayo es un ligando marcado y el segundo reactivo de ensayo es un receptor inmovilizado para dicho ligando.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en donde se lava la segunda matriz para eliminar cualquier ligando marcado que se difundió sobre, o dentro de, dicha segunda matriz pero no se llegó a unir a dicho receptor inmovilizado.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en donde dicha segunda matriz es puesta en contacto con una solución o suspensión líquida de un reactivo, o una matriz porosa conteniendo un reactivo, que, en cualquier caso, ayuda a la visualización del ligando marcado no eliminado por la etapa de lavado.
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