KR20010024709A

KR20010024709A - 연속 포맷 고처리량 스크리닝

Info

Publication number: KR20010024709A
Application number: KR1020007006322A
Authority: KR
Inventors: 뷰텔브루스에이; 슐덱마크이; 부어배치마틴제이; 번즈데이비드제이; 조지프메리케이
Original assignee: 스티븐 에프. 웨인스톡; 아보트 러보러터리즈
Priority date: 1997-12-12
Filing date: 1998-12-11
Publication date: 2001-03-26
Also published as: DE69835537D1; TW555967B; US5976813A; PT1038179E; DE69835537T2; CA2310684C; CN101256187A; JP2001526390A; WO1999030154A3; WO1999030154A2; TR200001647T2; SK286095B6; HK1032996A1; CZ20002078A3; NO326662B1; ATE336001T1; NZ504112A; DK1038179T3; EP1038179A2; AU759538B2

Abstract

약제 산업에서 하나 이상의 다공성 매트릭스를 사용하는 연속 포맷 고처리량 스크리닝(CF-HTS)에 의해 다수의 화학적 물질을 광범위한 생물학적 활성 또는 생화학적 활성에 대해 동시에 스크리닝할 수 있다. 또한, CF-HTS는 다단계 검정을 수행하는데 유용하다.

Description

연속 포맷 고처리량 스크리닝{Continuous format high throughput screening}

생화학적 검정 및 생물학적 검정은 단백질-단백질 상호작용, 효소 촉매작용, 소형 분자-단백질 결합으로부터 세포의 기능에까지 이르는 광범위한 시스템내에서의 활성에 대해 시험하기 위한 것이다. "고처리량 스크리닝(HTS)"에서는, 화학적 물질의 이전에 미확인된 생물학적 활성 또는 생화학적 활성을 발견하기 위해 다수의 화학적 물질을 시험하는 상기 종류의 검정을 사용한다.

균일계 검정 대 불균일계 검정

모든 상이한 종류의 생물학적 검정은 2가지 대부류, 즉 균일계 검정 및 불균일계 검정으로 분류할 수 있다. 균일계 검정에서는, 모든 시약을 함께 첨가하고 결과는 추가 조작없이 평가하거나 해석한다. 예를 들어, 페트리 디쉬 상에서 성장하는 세포를 화학물질에 노출시킬 수 있다. 화학물질이 세포에 독성일 경우, 투명 영역은 단순 관찰에 의해 독성을 나타낼 것이다. 또 다른 예로서, 세포의 색을 변화시키는 단백질을 발현시키는 세포를 사용할 수 있다. x-gal을 함유하는 한천에서 성장하는 세포를 발현시키는 베타-갈락토시다제(β-gal)의 경우, 세포는 β-gal 단백질의 발현 정도에 따라 다소 청색으로 변한다. 이와 같이, 베타-갈락토시다제 유전자와 같은 리포터 유전자(reporter gene)의 발현에 영향을 미치는 생물학적 단계에 대해 균일계 검정을 작제할 수 있다. 균일계 검정의 또 다른 예는 효소로 처리할 경우에 색상 또는 형광성이 변화하는 기질을 이용한다. 마지막으로, 신틸레이션 프록시미티 검정(Scintillation Proximity Assay: SPA; 공급원: Amersham)과 같은 기술은 방사선표지된 리간드가 신틸런트(scintillant)를 함유하는 비드에 고착되어 있는 단백질 또는 리간드 결합 물질에 결합하는 것을 직접 측정한다. 상기한 모든 예는 시그널의 최종 검출, 측정 또는 해독 이전에 시약 첨가 이외에는 어떠한 단계도 필요로 하지 않기 때문에, 이들은 균일계 검정이다.

반면, 불균일계 검정은 본질적으로 특정 단계와 양립할 수 없기 때문에, 1단계로 합할 수 없는 2단계 이상을 필요로 한다. 예를 들어, 다수의 불균일계 검정은 (예를 들어, 특정 시약이 검정의 초기 단계에 방해가 되나, 후기 단계를 완결하기 위해 필요한 경우) 특정 순서로 시약을 첨가함을 필요로 한다. 이의 통상적인 예는 시그널 발현 시약을 가하여 반응 생성물의 존재 또는 농도를 간접 보고하는 검정을 포함한다. 불균일계 검정에서 또 다른 통상적인 단계는 세척 단계이다. 과량의 검정 시약을 종종 검정 초기에 가해야만 하나, 반응이 높은 백그라운드 시그널의 부재하에 진행될 수 있도록 후속 단계 이전에 씻어낼 필요가 있다. 예를 들어, 방사성 리간드 결합 검정에서는, 표지된 리간드를 먼저 고체 표면에 결합되어 있는 단백질과 함께 배양하나, 실질적으로 단지 리간드의 소량 분획만이 한정된 수의 단백질 부위에 결합한다. 배양 후, 과잉의 미결합 리간드는 결합된 방사성 리간드에 대해 정확하게 측정할 수 있도록 씻어내야만 한다. 세척은 여과, 세척/경사의 반복, 침전/상 분리, 및/또는 원심분리를 포함한 다양한 선택적인 방법에 의해 달성할 수 있다.

다수의 생물학적 공정 및 생화학적 공정은 단지 불균일계 방법에 의해서만 측정할 수 있다. 또한, 기타 생물학적 공정 및 생화학적 공정을 균일계 방법에 적합하게 하는 수단이 존재함에도 불구하고, 이러한 기타 공정은 불균일계 방법에 의해 보다 효율적인 비용으로 및/또는 보다 용이하게 입수가능한 시약의 사용으로 진행된다. 단지 몇개에만 명명된 SPA(Amersham), 형광 분극 기술(Fluorescence Polarization; Jolley 등) 및 시간 분할 형광 기술(Time Resolve Fluorescence; Packard 등)과 같은 균일계 기술에 대한 방법 및 키트가 시판되고 있다. 그러나, 상기 종류의 방법을 사용할 경우 추가 비용 및 시간이 소요된다. 다수의 검정에 대해, 불균일계 방법이 보다 더 확립되어 있고 신속하게 개발하기가 쉽다. 이러한 이유로, 불균일계 방법, 예를 들어, ELISA, 필터 결합, RIA, 루시페라제 세포 검정 등이 계속적으로 널리 사용되고 있다. 몇몇 상기 방법을 이후 보다 상세하게 기술할 것이다.

고처리량 스크리닝(HTS)

여러 해에 걸쳐, 약제 산업은 약물 후보물을 발견하기 위해 화학적 합성물의 라이브러리의 HTS에 점점 더 의존하게 되었다. HTS는, 다수의 별개의 화합물을 병행 시험하여, 다수의 시험 화합물을 생물학적 활성에 대해 동시에 또는 거의 동시에 스크리닝하는 방법을 나타낸다. 일반적으로, 가장 널리 확립되어 있는 기술은 96-웰 미세역가 플레이트를 이용한다. 이 포맷에서는, 96회의 독립적인 시험을 96개의 반응 웰을 함유하는 단일 8cm x 12cm 플라스틱 플레이트 상에서 동시에 수행한다. 상기 웰은 전형적으로 50㎕ 내지 500㎕에 이르는 검정 용적을 필요로 한다. 플레이트 이외에, 96-웰 포맷을 광범위한 균일계 및 불균일계 검정에 적합하게 하기 위해 다수의 계기, 기구, 피펫터, 로봇, 플레이트 세척기 및 플레이트 판독기가 상업적으로 이용가능하다.

지금까지, HTS를 개선시키고자 하는 노력으로 웰을 보다 작게(소형화) 하려는데 초점을 맞추어 왔다. 웰 크기를 감소시킴으로써, 각각의 플레이트 상의 웰의 수를 증가시켜 보다 더 많은 병행 시험을 제공할 수 있다. 또한, 웰 용적을 감소시킴으로써, 각 시험에 대한 비용도 절감된다. 더욱이, 보다 적은 검정 용량으로 보다 더 많은 병행 시험을 수행할 수 있기 때문에, 약물 후보물을 발견하기 위해 보다 많은 화합물을 동시에 시험할 수도 있다. 지금까지, 소형화는 384-웰(96 x 4) 포맷을 제공함으로써 96-웰은 불충분하게 개선되었다[참조: Comley et al., J. Biomol. Screening, vol. 2(3), pp. 171-78(1997)]. 사실상, 9600-웰 포맷을 포함한, 밀도가 보다 높은 포맷이 보고되어 있다. 그러나, 소형화는 본질적으로 비용이 들고 복잡하다.

이러한 비용 및 복잡성은 스크리닝 포맷을 소형화시키는 3가지 주요 구성요소와 직접적으로 관련된다. 첫째, 시험 용기(튜브, 웰, 딤플 등)를 보다 소형으로 만들 수 있어야만 한다. 둘째, 모든 필수 검정 시약을 보다 많고 보다 소형인 웰로 정확하게 분배(통상적으로 시약을 다수의 웰로 동시에 분배하는 액체 처리용 로봇에 의해 달성됨)할 수 있어야만 한다. 세째, 고밀도 배열구조내의 시험 결과를 "판독"할 수 있어야만 한다.

병행화된 독립적인 검정의 필요조건이 주어질 경우, 각각의 구성요소는 얼마나 많은 소형화가 실현가능한지 또는 비용이 효율적으로 드는지에 대한 난문 및 제한을 제공한다. 예를 들어, 보다 새롭고, 보다 소형인 포맷은 시약을 분배하는 완전하게 상이한 방법을 필요로 하거나, 보다 새로운 소형화된 포맷에 적합한 해상도, 감도 및 조작성을 갖는 판독 기기를 필요로 한다. 각각의 웰의 크기를 감소시킬수록, 또한 용기 배열구조를 조립하는 성능, 시약을 보다 적은 양으로 분배하는 성능 및 각각의 시험 샘플을 판독하는 성능은 보다 불량해지고, 시간 소모적이며, 비용이 많이 든다. 또한, 보다 작은 샘플 크기는, 보다 적은 용량의 시약의 분배 및 보다 약한 샘플 시그널의 측정에 있어서의 고유한 부정확성으로 인해 샘플간의 통계학적 분산도를 증가시키기도 한다. 더우기, 샘플 크기가 특정한 정도에 미치지 않을 정도로 감소함에 따라, 증발 및 표면 장력과 같은 인자는 보다 새로운 소형화된 포맷을 제공하는데 있어서 보다 많은 비용 및 복잡성을 가중시킨다.

HTS 기술에서의 획기적인 도약에 대해, 산업계는 "프리 포맷(free format) 검정" 또는 샘플간에 물리적 격벽이 전혀 없는 검정의 실현을 갈망한다. 웰이 전혀 없는 포맷에서 소적을 시험하는 것을 일반적으로 구상하였음에도 불구하고, 아무도 표준 분리된-화합물 컬렉션을 갖는 HTS에서의 프리 포맷 검정의 사용을 보고한 적이 없다.

스크리닝 조합 라이브러리 - 겔 투과 방법

조합 화학의 출현으로, 수백만 화학적 물질을 고체 지지체(일반적으로 비드) 상에서 신속하게 생성시킬 수 있다. 96-웰 포맷이 비드-기재 라이브러리를 스크리닝하는데 사용되더라도, 이러한 포맷은 일반적으로 다음 3가지 이유, 즉, (1) 각각의 비드가 소량의 화학적 물질만을 운반하고; (2) 시험할 화합물의 수가 대단히 많고; (3) 비드를 96-웰 미세역가 플레이트내에서 처리하기에 힘들기 때문에 비효율적인 것으로 간주된다.

조합 라이브러리를 96-웰 포맷으로 스크리닝하는데 있어서 본질적인 문제를 피하기 위해, 몇몇이 "프리 포맷"으로 기술할 수 있는 단순 균일계 검정의 사용을 보고하였다. 예로서, 조합 펩타이드 라이브러리에 대한 단순 균일계 검정에서 색소 세포(흑혈구)를 사용한 검정은 문헌[참조: Jayawickreme et al. Proc. Nat'l Acad. Sci.(USA), vol. 191, pp. 1614-18(March 1994)]에 보고되어 있다. 상기 문헌에 따르면, 세포를 페트리 디쉬내의 아가로스 아래에 둔 다음, 조합 화합물을 담지하고 있는 비드를 아가로스 표면 상에 둔 후, 화합물을 비드로부터 부분적으로 떼어낸다. 화합물이 겔 매트릭스내로 국부적으로 확산됨에 따라, 활성 화합물로 인해 세포의 색상이 변하기 때문에, 활성 화합물은 어둡게 착색된 영역으로서 가시화된다.

또 다른 최근의 예는 펜실베니아주 필라델피아에서 개최된 퍼스트 애뉴얼 컨퍼런스 오브 더 소사이어티 포 바이오몰레큘라 스크리닝(First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening)에서 보고된 다니엘 킬스키(Daniel Chelsky)의 "조합 라이브러리를 스크리닝하기 위한 방책: 신규한 접근법 및 종래의 접근법(Strategies for Screening Combinatorial Libraries: Novel and Traditional Approaches)"이다. 킬스키는 탄산 탈수효소용 단순 균일계 효소 검정을 아가로스 겔내에 배치하여, 겔내의 효소가 겔 전체에 걸쳐 색상 변화를 야기시키도록 한다. 이후, 포토링커를 매개로 조합 화합물을 담지하고 있는 비드를 겔내에 둔 다음, 화합물을 자외선에 의해 부분적으로 떼어낸다. 효소를 억제한 화합물은 보다 적은 색상 변화를 갖는 억제의 국부 영역으로서 관찰된다. 마지막으로, 조합 라이브러리를 한천내에세 성장하는 암 세포에 독성 효과를 미치는 화합물에 대해 스크리닝하는, 자야윅크림(Jayawickreme) 등의 방법과 유사한 방법이 문헌[참조: Molecular Diversity, v. 2, pp. 57-63(1996), Salmon, et al.]에 보고되어 있다.

상기한 3가지 예는 모두 항균제 또는 항암제에 대한 시간-시험된 겔 검정의 변형이며, 또한 항원/항체 상호반응이 겔내에서 측정되는 통상의 면역 검정과 유사하다. 이러한 겔 투과 검정이 비드-기재 조합 라이브러리를 스크리닝하는데 충분히 적합함에도 불구하고, 아무도 이러한 포맷의 불균일계 검정 또는 비-비드-기재 라이브러리에의 확대를 보고한 적은 없다. 통상의 지식은 연구자들이 샘플 혼합이 일어날 수 있는 연속 포맷으로 샘플을 시험하는 것을 단념시켰다. 보고된 한정된 종류의 검정 및 연속 포맷내에서 샘플이 섞이는 것에 관한 염려로 인해, 단지 비드-기재 라이브러리만이 검정되었다. 상기 제한으로 인해, 연구자들은 96-웰 포맷이 불균일계 및 비-비드-기재 라이브러리 스크리닝에 보다 더 적합한 것으로 생각하였다. 불균일계 검정은 프리 포맷 셋팅내에서 수행하는 것이 바람직할 것이다. 또한, 별개의 화합물은 프리 포맷 셋팅내에서 시험하는 것이 바람직할 것이다.

발명의 요약

본 발명은 96-웰 포맷에서 수행할 수 있는, 균일계 또는 불균일계 검정에 대한 프리 포맷 구상을 성공적으로 이행하는, 연속 포맷 고처리량 스크리닝(CF-HTS)을 본원에 기술한다. 또한, CF-HTS는 단지 균일계 검정뿐만이 아니라 불균일계 검정으로 조합 라이브러리를 스크리닝하는데 유용하기도 하다. 더욱이, CF-HTS는 소형화와 관련된 비용 및 복잡성이 없이 별개의 화합물을 검정할 수 있다. 시약 및 시험 결과가 후속적인 단계 동안 섞이게 될 것이라는 가능성에 대한 염려는 근거없는 것으로 입증되었다.

본 발명의 한 양태는

a) 다수의 시험 샘플을 하나 이상의 검정 성분을 임의로 함유하는 다공성 검정 매트릭스내에 또는 매트릭스 상에 유입하고;

b) 다공성 검정 매트릭스이거나 아닐 수 있는 하나 이상의 매트릭스를 사용하여 하나 이상의 검정 성분을 검정물에 도입하고;

c) 검정시 사용되는 매트릭스를 세척하여 과량의 시험 샘플, 검정 성분 또는 이의 배합물을 제거하는 단계(i) 또는 검정시 사용되는 매트릭스를 벌크 용액 또는 액체로서의 추가 시약과 접촉시키는 단계(ii)를 수행함으로써, 샘플의 화학적 활성을 시험하는 것에 관한 것이다.

또 다른 양태는 다수의 시험 화합물을 하나 이상의 검정 성분을 임의로 함유하는 다공성 검정 매트릭스내에 또는 매트릭스 상에 유입하고, 2개 이상의 추가 매트릭스를 사용하여 검정을 수행함으로써, 샘플의 생물학적 활성 또는 생화학적 활성을 시험하는 것에 관한 것이다.

또한, 또 다른 양태는 96개 이상의 시험 샘플을 하나 이상의 검정 성분을 임의로 함유하는 다공성 검정 매트릭스내에 또는 매트릭스 상에 유입하여 검정을 수행함으로써, 상기 96개 이상의 시험 샘플을 동시에 시험하는 것에 관한 것이다.

약제 산업에서 하나 이상의 다공성 매트릭스를 사용하는 연속 포맷 고처리량 스크리닝(Continuous format high throughput screening: CF-HTS)에 의해 다수의 화학적 물질을 광범위한 생물학적 활성 또는 생화학적 활성에 대해 동시에 스크리닝할 수 있다. 또한, CF-HTS는 다단계 검정을 수행하는데 유용하다.

도 1은 검정 시약을 함유하는 다공성 겔 매트릭스의 한쪽면과 접촉하고 있고, 교대로 추가 검정 시약을 함유하는 비-다공성 매트릭스와 접촉하고 있는 비-다공성 매트릭스 상의 gELISA 시험 샘플을 도시한다.

도 2는 gELISA 시험 샘플 매트릭스 및 다공성 겔 매트릭스를 제거한 다음, 세척하고 액체 또는 용액 시약을 첨가하여, 비-다공성 시약 매트릭스 상에 리포터 착체를 형성시킴을 도시한다.

도 3은 리포터 착체 매트릭스를 리포터 기질을 함유하는 다공성 겔 매트릭스와 접촉시킴으로써 gELISA 검정물을 가시화시킴을 도시한다.

도 4는 리간드 매트릭스가 세포를 담지하고 있는 필터 표면의 반대쪽 필터 표면과 얼마나 접촉하고 있는가를 도시한다.

도 5는 검정물을 가시화시킬 경우 세포를 담지하고 있는 필터 표면이 무엇을 생성시킬 수 있는가를 도시한다.

도 6은 다양한 농도의 공지된 용량-의존성 억제제의 다양한 농도를 사용한 VanA 검정 결과를 제시한다.

도 7은 다양한 농도의 공지된 억제제를 사용한 EF-3 검정 결과를 제시한다.

도 8은 단백질-단백질 상호작용의 gELISA 검정에 대한 대조 실험을 도시한다.

도 9는 단백질-단백질 상호작용 "억제"의 gELISA 결과를 도시한다.

도 10은 방사선표지된 ITAM의 고정화 LCK에의 용량-의존성 결합을 제시한다.

도 11은 전형적인 수용체-리간드 결합 곡선을 나타내는 ITAM 농도에 대한 픽셀치를 그래프로 제시한다.

도 12는 방사선표지된 IL-8의 리간드-세포 상호작용에 대한 대조 실험을 도시한다.

도 13은 IL-8 리간드-세포 상호작용의 "억제"를 도시한다.

도 14는 뉴라미니다제의 억제에 대한 검정을 도시한다.

도 15는 뉴라미니다제 억제에 대한 별개의 10,080개 화합물의 동시 검정을 도시한다.

CF-HTS의 이면에 있는 중심적인 아이디어는 시험 화합물을 다공성 매트릭스의 상태하에 위치시키는 것이다. 당해 방법은 하나 이상의 검정 성분을 겔, 플라스틱 시트, 필터 또는 다른 형태의 용이하게 처리된 고체 지지체와 같은 매트릭스의 상부 또는 하부에 위치시킴을 포함한다. 샘플을 다공성 매트릭스로 유입할 경우, 이들은 시험 샘플이 섞이지 않으면서 검정을 수행할 정도로 충분히 천천히 확산된다. 이와 같이, CF-HTS 포맷은 시험 샘플을 불투과성 격벽에 의해서가 아니라 확산에 의해 분리한다. 시험을 너무 오랫동안 진행시킬 경우, 시험 샘플 및 결과가 결국 섞이게 될 것이다. 그러나, 신중하게 시간을 조절할 경우, CF-HTS는 매우 높은 밀도의 화합물을, 각각의 웰 또는 반응 용기를 용매 또는 검정 성분으로 충전시킬 필요없이, 동시에, 그러나 개별적으로 스크리닝할 수 있도록 한다. 또한, 반응 성분을 담지하고 있는 매트릭스를 처리함으로써, 복잡한 불균일계 검정이라도 상기 포맷으로 수행할 수 있다. 불균일계 검정용 매트릭스의 처리는 전적으로 전례가 없으며, CF-HTS를 광범위한 생물학적 활성 또는 생화학적 활성을 스크리닝하는 이의 성능이 96-웰 포맷만큼 탄력적이도록 만든다. 또한, CF-HTS는 관련된 불편없이 소형화에 의해 예상된 부류의 이점을 달성하며, 유례없는 이점을 갖는다.

CF-HTS는 광범위한 매트릭스 및 검정 성분을 사용한다. 매트릭스는 아가로스, 아크릴아미드 또는 기타 젤라틴성 물질로 구성된 겔, 막, 필터 및 플라스틱을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 매트릭스는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 기타 플라스틱, 종이 섬유, 유리, 유리 섬유, 실리카, 폴리카보네이트, 폴리에스테르, 폴리비닐리덴 클로라이드 및 폴리에틸렌을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 물질로 구성될 수 있다. 매트릭스는 불투과성 고체, 다공성 고체, 예를 들어, 필터 또는 겔일 수 있다. 검정 성분은 거대분자, 예를 들어, 핵산, 단백질, 및 기타 합성 또는 천연 거대분자; 세포, 세포 용해물, 생물학적 추출물, 세포소기관, 및 기타 복합의 생물학적 물질 및 혼합물; 및 소형 분자, 예를 들어, 완충제, 염, 억제제, 기질, 펩타이드, 염료, 뉴클레오티드, 보조인자, 이온 및 용매를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

CF-HTS 검정은 다수의 시험 샘플 또는 화합물이 불투과성 격벽에 의해서라기보다는 확산에 의해 분리되는 검정이다. 중요한 구성요소는 다수(하나 이상)의 시험 화합물을 하나 이상의 검정 성분을 임의로 함유하는 다공성 검정 매트릭스내에 또는 매트릭스 상에 유입하는 것이다. 검정 성분을 함유하는 다공성 검정 매트릭스는 성분들을 매트릭스내로 첨가, 혼합, 주입, 분배 또는 침지시킴으로써 제조한다. 다공성 매트릭스는 또한 검정 성분을 매트릭스의 표면내로 또는 표면 상에 검정 성분을 커플링, 코팅, 결합, 고착, 연결, 공액결합 또는 부착시킴으로써 제조하기도 한다. 더욱이, 다공성 매트릭스는 용액 또는 액체의 박막을 세포, 효소 또는 기타 고정화 검정 성분의 상 위에 형성시킴으로써 제조하기도 한다. 다공성 검정 매트릭스를 사용하여 성분 첨가의 순서 및/또는 기간, 및 검정 성분을 혼합할 경우 혼합 및 확산 범위를 조정한다.

CF-HTS는 비-다공성 매트릭스를 사용할 수도 있다. 비-다공성 매트릭스는 검정 성분 또는 시험 샘플을 비-다공성 매트릭스의 표면 상에 커플링, 코팅, 결합, 고착, 연결, 공액결합 또는 부착시킴으로써 제조한다. CF-HTS에서의 비-다공성 매트릭스의 사용은 하나 이상의 검정 성분을 공간적으로 고착시킨다.

검정 성분을 매트릭스의 표면 상에 유입할 경우, 검정 성분은 유도체화되지 않거나, 유도체화되거나, 검정 성분의 부착을 촉진시키기 위해 다른 방법으로 전처리된 매트릭스와의 공유 또는 비공유, 특이적 또는 비특이적 상호작용에 의해 부착시킨다. 부착 후, 검정 성분을 공간적으로 고착시켜, 검정을 위해 고정화시킨다. 이 경우, 시험 샘플이 매트릭스를 통과하여 확산되어 검정 성분에 도달할 수 있어야만 하고/하거나, 2차 성분, 또는 검정 성분의 생성물이 매트릭스를 통과하여 확산되어 시험 샘플에 도달할 수 있어야만 한다.

시험 샘플을 함유하는 하나 이상의 다공성 매트릭스는 하나 이상의 다음 단계에서 사용한다.

(1) 샘플 및/또는 하나 이상의 검정 성분이 계면을 가로질러 확산될 수 있도록 다공성 매트릭스의 표면을 하나 이상의 또 다른 (다공성 또는 비-다공성) 매트릭스와 접촉시키는 단계.

(2) 2개 이상의 매트릭스를 분리하여, 성분 및/또는 샘플의 상호작용을 중지시키는 단계.

(3) 검정 성분이 상호작용할 수 있도록 2개 이상의 매트릭스의 표면을 접촉시키는 단계.

(4) 완충액 또는 기타 용매를 사용하여 매트릭스를 세척, 세정 또는 용출시켜, 결합되지 않고/않거나 비특이적으로 결합된 결합 성분을 제거하는 단계.

(5) 용액 중의 검정 성분을 매트릭스 상에 분배, 주입, 첨가 또는 침지시키거나, 상기 성분을 매트릭스를 통해 여과시키는 단계.

(6) 하나 이상의 매트릭스 상에 또는 매트릭스내에 존재하는 방사계, 형광성, 분광광도계 또는 전자기 시그널을 영상화, 판독, 스캐닝, 검출 또는 다른 방법으로 가시화시키는 단계.

CF-HTS는 선행 기술보다 유리한 다수의 이점을 제공한다. 별개의 웰이 존재하지 않을 경우, 검정 성분 또는 시약을 동시에 또는 정확하게 분배할 필요가 없어진다. 대신, 검정 성분은 균질 벌크 처리에 의해 분배하여 혼합한다. 검정 성분은 균질한 벌크 용액 또는 매트릭스로서 제조되기 때문에, 최소한의 통계학적 샘플간 분산도가 존재한다. 비교할 경우, 96-웰 포맷에서 웰의 존재는 샘플간 분산도를 크게 한다.

또한, CF-HTS는 다수의 화합물의 극도로 높은 밀도의 스크리닝을 제공한다. 관찰된 적중부가 한정된 범위로 "섞이게" 되더라도, 단지 적중부 가까이에 위치한 화합물을 재시험하기만 하면 된다. 따라서, 10,000개의 시험 샘플을 가시 영역 부근의 50개의 후보물로 축소시킬 수 있을 경우, 50개의 후보물을 종래의 96-웰 기술을 사용하여서도 활성 화합물로 용이하게 축소시킬 수 있다.

별개의 화합물을 고도로 팩킹된 배열구조로 플라스틱 시트 상에서 분배하여 건조시킨 다음, 이들을 CF-HTS에 적용시킴으로써, 모든 중요한 소형화 문제에 본격적으로 착수한다. 이러한 포맷에서는 소형화가 단순히 매트릭스내로 확산되는 샘플의 양을 제한함으로써 달성되기 때문에, 소형화를 달성하기 위해 플라스틱 또는 기타 물질에서 변경을 꾀할 필요가 전혀 없다. 이러한 포맷은 또한 전체 검정이 특히 시약 및 용액을 벌크 처리하는 "단일 거대 웰"에서 수행되기 때문에 검정 시약을 분배하는 유체소자를 필요로 하지 않는다. 시험 샘플만을 유체소자에 의해 분배할 필요가 있다. 더욱이, 이러한 포맷에서는 이외의 균질 매트릭스에서 불균일계의 국재화 영역을 찾기만 하면 되기 때문에 통계학적 분산도가 보다 작다. 다수의 상이한 웰을 판독하여 비교할 필요가 없다. 모든 예상되는 소형화의 이점(비용, 처리량, 시약 사용량, 시험 화합물 사용량) 이외에, CF-HTS는 또한 검정의 대부분의 단계를 벌크 처리하는 성능과 같은 놀라운 이점을 제공한다.

CF-HTS의 중심적인 측면은 검정 성분 및 시험 샘플이 매트릭스 사이의 계면에서 측면으로 균일하게 신속 확산되지는 않는다는 관찰이다. 예를 들어, 아가로스 겔을 플라스틱 플레이트 상에 위치시킬 경우, 겔 표면 상의 계면에 상당한 양의 액체가 존재한다. 겔내의 검정 성분과 플레이트 상의 검정 성분간의 상호작용이 필요할 경우(ELISA 예에서와 같이), 겔내의 성분을 겔 밖으로 및 플레이트 상으로 확산시킬 수 있는 것이 중요하다. 그러나, CF-HTS에서는 동시 측면 확산이 상당히 늦어지게 되어, 플레이트 상의 상호작용이 겔-기재 성분의 원위치 근처에 위치한다. 이러한 동일한 원리를 겔, 필터 또는 표면(또는 임의의 다른 매트릭스)의 조합간의 매트릭스-매트릭스-계면에 적용시킨다. 이러한 확산 거동은 조절가능하고 일반적으로 모든 매트릭스 계면에 적용가능하다는 인식은 전례없는 것이며 통상의 지식에 대립된다.

시험 샘플 또는 화합물을 매트릭스(예를 들어, 겔 또는 젖은 필터)내로 유입하는 바람직한 방법은 각각의 무수 소량 샘플을 플라스틱 시트의 표면과 같은 표면 상에 2개의 샘플이 섞이거나 중첩되지 않을 수 있고 각각이 특정 위치에 위치하는 배열구조로 분배하는 것이다. 플라스틱 시트를 매트릭스 상에 위치시킬 경우, 샘플은 초기 배열구조에서 지정된 위치에 상응하는 위치에서 매트릭스내로 용해되거나 확산된다.

샘플을 배열구조내로 분배하는 또 다른 방법은 샘플을, 분배된 각각의 샘플의 용량이 샘플이 매트릭스내에서 중첩되지 않을 만큼 적은 필터와 같은 다공성 매트릭스 상에 분배하는 것이다. 보다 많은 양의 액체를 함유하는 또 다른 다공성 매트릭스와 접촉시킬 경우, 화합물은 확산되어 검정을 개시한다.

비드-기재 조합 화합물을 매트릭스내로 유입하는 바람직한 방법은 비드를 플라스틱 시트의 표면과 같은 표면 상에 불균일하게 또는 정연한 배열구조로 분배하는 것이다. 다음, 비드를 처리하여, 시험 화합물이 불안정한 링커에 의해 비드에 공유 결합되어 있을 경우에, 시험 화합물을 방출(분해)할 수 있다(광분해 및 기체상 산 분해가 당해 분야에 익히 공지되어 있다). 다음, 각각의 화합물을 기원인 이의 비드에 의해 점유된 영역과 비공유 결합시킨 후, 무수 화합물을 매트릭스내로 또는 매트릭스 상에 유입한다.

별개의 화합물을 매트릭스내로 유입하는 또 다른 방법은 침지시키거나, 달리는 각각의 화합물을 비드내에 또는 비드 상에 비공유 결합시키는 것이다. 이러한 방법을 사용하여, 다수의 화합물을 비드 상에서 한번에 혼합하여, 각각의 비드가 여전히 이들 위에 유일한 화합물을 갖도록 만들 수 있다. 다음, 비드 혼합물을 매트릭스에 유입하기 위해 표면 상에 용이하게 도포할 수 있다. 이러한 공정은 소량의 액체 처리에 대한 필요를 완전히 제거한다.

CF-HTS 스크린내에서 매트릭스내로 도입된 샘플의 초기 배열구조가 활성의 특정 영역이 하나 이상의 샘플의 초기 위치를 공간적으로 덮고 있을 정도로 고밀도일 경우, 잠재적으로 상기 샘플 각각이 관찰된 활성의 근원이다. 보다 높은 초기 밀도의 경우, 다수의 화합물이 특정 영역내에 존재할 것이기 있기 때문에 각각의 영역에 대해 보다 많은 후보 화합물이 존재할 것이다. 화합물은 함께 확산될 수 있으나, 이들은 여전히 이들 자체의 공간적 구배를 가질 것이며, 특정 위치에서 정량적으로 혼합되지 않을 것이다. 따라서, 영역의 중심은 여전히 초기 배열구조내의 활성 화합물의 정확한 위치와 상관 관계가 있을 것이다. 실제, 각각의 활성 영역에 대한 활성 화합물의 동정을 확증하기 위해 재시험한 다수의 샘플이 흔히 있을 정도로 적중부는 드물다.

본 발명의 또 다른 양태는 물리적 격벽(이와 같이 단어의 엄격한 사용으로 비연속 포맷을 제조함)을 검정의 매트릭스내로 유입하여, 샘플이 확산될 수 있는 거리를 제한하는 것이다. 예를 들어, 효소 및 기질을 각각 함유하는 2개의 겔을 각각 메쉬("쿠키-커터")를 사용하여 절단하여, 각각의 겔을 다수의 별개의 위치로 세분할 수 있다. 다음, 2개의 겔을 여전히 접촉시켜, 기질 및 효소를 각각의 세분된 겔 단편내에 함께 확산시킬 수 있다. 다음, 검정 사이에 확산이 전혀 일어나지 않으면서 검정이 완전히 독립적이도록 시험 샘플을 각각의 세분된 겔 단편에 유입할 수 있다. 당해 양태는 시험 샘플간의 통계학적 편차를 도입하고, 용적을 고정시켜 고밀도 배열구조에 대한 시그널을 제한함으로써, CF-HTS 이점 중 몇몇을 효과적으로 배제한다. 그러나, 당해 양태는 검정 성분을 다수의 병렬식 반응 용기내에 분배할 필요가 없는 매트릭스-기재 불균일계 검정의 이익을 여전히 수득할 수 있고, 이는 샘플의 부분 혼합을 제거한다.

gELISA

효소 결합 면역흡착 검정(Enzyme linked immunosorption assay: ELISA)은 용액 중의 리간드와 고정화 수용체 사이의 결합을 검출하는 불균일계 검정이다. ELISA는 96-웰 포맷에서는 수행하기 곤란한 다수의 시약 혼합 및 세척 단계를 필요로 하며, 웰이 96-웰 포맷으로부터 384-웰 포맷으로 축소될 경우, 보다 어려울 것으로 고려될 수 있다. 본 발명자들은 리간드와 고정화 수용체 표적과의 결합 억제를 검출하는 CF-HTS 방법(gELISA)을 적용하였다.

수용체는 또 다른 분자를 결합시킬 수 있는 분자이다. 비제한적인 예로는 단백질, 펩타이드, 핵산, 탄수화물, 및 상기 예들의 혼합물이 있다. 수용체는 플라스틱 표면(예: 페트리 디쉬 또는 플라스틱 플레이트(공급원: Nunc)), 높은 표적 결합 용적을 갖는 막 또는 필터(예: 니트로셀룰로스, 나일론 또는 PVDF(공급원: Millipore, Corning Costar, Schleicher ＆ Schuell, BioRad) 또는 유도체화 막, 예를 들어, SAM 막(공급원: Promega))를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다수의 가능한 매트릭스(수용체 매트릭스) 중 하나 위에 고정화된다. 다공성 리간드 매트릭스(예: 아가로스 겔 또는 다공성 막)은 고정화 수용체에 대한 리간드가 매트릭스 상에 또는 매트릭스내에 분배되도록 제조한다. 시험 화합물 또는 샘플은 리간드 매트릭스 상에, 또는 달리 시험 샘플 매트릭스(예: 폴리스티렌(공급원: Tekra), 폴리비닐리덴(예를 들어, 공급원: Dow Brands) 또는 기타 가요성 플라스틱 시트 또는 막) 상에 또는 매트릭스내에 직접 분배한다. 시험 매트릭스는 리간드 매트릭스와 접촉시키고, 샘플은 리간드 매트릭스내로 확산시킨다. 적합한 배양 기간 후, 리간드와 샘플을 수용체와 접촉시키고, 잠재적으로 확산에 의해 반응시키면서, 리간드 매트릭스를 수용체 매트릭스와 접촉시킨다(도 1은 비오티닐화 리간드 Lβ에 결합하고 있는 고정화 수용체 R을 도시한다). 배양 동안, 리간드는 샘플 화합물이 리간드/수용체 결합을 억제하지 않는 한 고정화 수용체에 결합할 것이다.

적합한 배양 기간 후, 수용체 매트릭스를 제거하고, 적합한 완충액을 사용하여 결합되지 않거나 비특이적으로 결합된 리간드 및 샘플을 제거한다. 다음, 수용체 매트릭스를 리간드(예: 항체, 아비딘 또는 비오티닐화 리간드일 경우 스트렙트아비딘)와 상호작용할 검정 시약을 함유하는 용액에 침지시키는데, 이는 직접적으로(예를 들어, 형광성 또는 방사성) 또는 간접적으로(예를 들어, 고추냉이 퍼옥시다제(HPR), 알칼리성 포스파타제(AP) 또는 베타갈락토시다제 공액체)에 의해 검출되는 성능을 갖는다(도 2는 비오티닐화 리간드에 부착되어 있는 아비딘-HRP 공액체, AHRP를 도시한다). 적합한 배양 후, 수용체 매트릭스를 용액으로부터 제거하고, 세척하여 결합되지 않거나 비특이적으로 결합된 시약을 제거한다. 직접 시그널 검출의 경우, 매트릭스를 적합한 방법(예: 분광광도계 스캐너, CCD 카메라, 필름, 인 영상기(phosphorimager) 또는 신틸레이션 검출 장치)을 사용하여 영상화시킨다. 간접 시그널(예: HRP 또는 AP)은 기질 또는 이외의 필수 반응 성분을 다공성 기질 매트릭스내에 또는 매트릭스 상에 분배하고, 상기 매트릭스를 수용체 매트릭스와 접촉하도록 위치시킴으로써 달성되는, 추가의 시그널 발현 반응을 필요로 한다. 다음, 효소(예: HRP 또는 AP)를 기질과 반응시킨다(도 3). 또한, 침전 기질을 매트릭스 대신에 용액에 유입한다. 가시화 방법하에, 리간드/수용체 결합 영역은 가시 반응을 생성시키는 반면, 리간드/수용체 결합이 억제된 영역은 가시 반응을 생성시키지 않을 것이다.

세포/리간드 결합

CF-HTS를 사용하여 리간드/세포의 수용체 결합의 억제를 검출할 수도 있다. 종래 검정에서는, 시험 화합물, 방사선표지된 리간드, 및 상응하는 수용체를 웰과 같은 용기내에서 발현시키는 세포를 합한다. 다음, 리간드의 수용체에의 결합이 시험 화합물에 의해 억제되지 않을 경우, 리간드가 수용체에 결합하기에 충분한 시간을 제공한다. 결합되지 않거나 비특이적으로 결합된 성분을 세포로부터 제거한 다음, 세포와 결합된 방사능의 양을 측정한다. 본 발명자들은 CF-HTS 방법을 세포에의 리간드 결합의 억제를 검출하는데 채용하였다.

목적하는 수용체를 발현시키는 세포를, 매트릭스(세포 매트릭스), 예를 들어, 비제한적인 겔, 필터 또는 막(예: 트랜스웰(Transwell) 조직 배양 막(공급원: Corning Costar) 또는 화학주성 막(공급원: Neuro Probe)) 상에서 성장시키거나 플레이팅시킨다. 다공성 매트릭스(예: 아가로스 겔 또는 다공성 막)는, 수용체에 대한 표지된 리간드가 매트릭스(리간드 매트릭스) 상에 또는 매트릭스내로 분배되도록 제조한다. 시험 화합물 또는 샘플을 리간드 또는 세포 매트릭스 상에, 또는 달리 또 다른 매트릭스(예: 폴리스티렌(공급원: Tekra), 폴리비닐리덴 또는 기타 가요성 플라스틱 시트 또는 막; 샘플 매트릭스) 상에 또는 내에 직접적으로 분배한다. 샘플 매트릭스를 리간드 매트릭스와 접촉시켜, 샘플을 리간드 매트릭스내에 확산되도록 한다. 적합한 배양 기간 후, 리간드를 매트릭스, 바람직하게는 매트릭스의 비-세포면과 접촉시켜, 리간드 및 샘플이 확산에 의해 수용체와 접촉하여 반응하도록 한다(도 4). 배양 동안, 샘플이 리간드/세포 결합을 억제하지 않는 한, 표지된 리간드는 고정화 세포에 결합할 것이다.

배양 후, 세포 매트릭스를 리간드 매트릭스로부터 분리하고, 적합한 완충제로 세척하여, 결합되지 않거나 비특이적으로 결합된 리간드 및 샘플을 제거한다. 세포 매트릭스를 적합한 방법(예: 분광광도계 스캐너, CCD 카메라, 필름, 인 영상기 또는 신틸레이션 검출 장치)을 사용하여 영상화시킨다(도 5는 검정의 필름 상에서의 발현을 도시한다).

위에서 제시한 바와 같이, CF-HTS는 "프리 포맷" 검정에 대해 고려되는 이점을 모두 달성하며, 모든 상이한 유형의 포맷하에 모든 상이한 시약 및 설비를 사용하여 모든 상이한 유형의 생물학적 검정 또는 생화학적 검정에 적용시킬 수 있다. 이의 광범위한 적용성으로 인해, 하기 실시예에 의해 가장 잘 예시된다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 예시하는 것이지, 청구의 범위 및 명세서를 한정하지 않는다. 통상의 숙련가는 본 발명의 범위 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 명시된 양태를 변화 및 변형시킬 수 있음을 쉽게 인식할 것이다. 마지막으로, 본원의 모든 인용문헌은 참조로 포함된 것이다.

실시예 1: 반코마이신 내성 효소 VanA에 의해 생성된 인산염 검출용 2단계 색도계 겔 검정

VanA는 반코마이신 내성에서 주요 효소이며, D-알라닌의 D-알라닌에의 결합 또는 D-알라닌의 D-락테이트에의 결합을 촉매한다. 통상적으로, 이들 효소는 효소가 활성일 경우에 방출되는 인산염으로부터 색을 생성시킴으로써 검정된다(VanA 활성은 ATP를 ADP 및 인산염으로 가수분해시킨다). 숙련자들은 D-사이클로세린이 용량-의존성 방식으로 VanA를 억제함을 인지하고, 이들 억제제를 다른 잠재성 억제제에 대한 포지티브 억제제로서 사용한다.

효소 겔

효소 겔은 VanA 효소를 VanA의 최종 농도가 2μM이 되도록 50mM HEPES(N-[2-하이드록시에틸]피페라진-N'-[2-에탄설폰산]), 20mM MgCl₂, 20mM KCl, pH 7.3 중의 용융된 1% 아가로스(고융점 아가로스, Gibco BRL)에 45℃에서 가함으로써 제조한다. 다음, 상기 한천 혼합물을 BioRad 겔 캐스팅 장치에 주입하여, 2 내지 8℃에서 30분 동안 응고시킨다.

기질 겔

기질 겔은 ATP, D-알라닌 및 D-락테이트를 용융된 아가로스에 가하여 각각의 성분을 1mM, 1.5mM 및 1.75mM로 각각 만들고, 효소 겔에 대해 기술한 바와 같이 겔을 제조함으로써 제조한다.

샘플 매트릭스

대조 샘플로서 사용되는 공지된 억제제인 D-사이클로세린의 1:1 에탄올-물 중의 5000, 2000, 1000, 500, 200, 100μM 계열 희석액의 일련의 1㎕ 분취액을 1편의 폴리비닐리덴 클로라이드 필름(PVDC) 상에 분배하여 10분 동안 건조시킨다.

억제제의 존재하에 효소의 기질과의 배양

효소 겔을 샘플 매트릭스와 5분 동안 접촉시킨다. 다음, 기질 겔을 효소 겔의 표면 상에 위치시켜, 15 내지 20분 동안 배양한다. 후속적으로, 2개의 겔을 분리한다. 배양 동안, 인산염이 기질의 결합을 촉매하는 효소로서 D-사이클로세린이 반응을 억제하기에 충분히 농축된 영역을 제외한 겔 전체에 생성될 것으로 예상된다.

검정의 가시화

1.33N HCl 중의 갓 제조한 0.15% 말라카이트녹 및 1.4% 몰리브덴산암모늄으로 이루어진 인산염 검출 칵테일을 효소 및 기질 겔 상에 붓고 균일하게 도포한다. 상기 시약은 인산염과 반응하여, 인산염의 농도를 증가시키는 함수로서 녹색의 음색을 점점 더 생성시킨다. 5 내지 10분 동안 발색시킨다(도 6은 억제제의 양이 5 내지 0.5nmol로 변화하는 겔 상의 발색을 도시한다). 녹색을 띤 겔을 스트라젠 이글 아이(Stratagene Eagle Eye) CCD 카메라로 촬영한다. 예상한 바와 같이, 억제 영역이 보다 덜 녹색으로 보이는 정도는 가해진 억제제의 농도와 상관 관계가 있다. 따라서, 이러한 검정을 사용하여 다른 표면 상에 분배된 조합 비드 또는 화합물을 배치한 다음, 이를 겔 검정과 접촉시킴으로써 VanA의 억제제에 대해 스크리닝할 수 있다.

또한, 상기 검정은 겔 스크리닝 포맷이 다단계 반응에 적합함을 입증한다. 다수의 검정이 다단계를 필요로 하기 때문에, 이러한 특성은 상기 포맷이 광범위하게 유용한 검정이 되는데 필수적이다. 이 경우에, VanA 검정은 발색이 수반되는 효소 활성의 2단계 검정이다. 이러한 검정의 균일계(단일 단계) 변형은, 발색 시약 및 조건이 VanA 활성을 방해하기 때문에 용이하게 실행할 수 없으며, 한천 겔내서의 전달과 양립할 수도 없다. 따라서, 상기 2단계를 효소 겔 검정 단계 후, 용액-상 발색 단계로 공간 및 시간적으로 분리시키는 것이 바람직하다.

실시예 2: 리보솜 결합에 의해 자극된 에스. 세레비지애(S. Cerevisiae) 연신 인자 3 ATPase 활성에 의해 생성된 인산염 검출용 2단계 겔 검정

진균의 연신 인자 3(EF-3)을 리보솜과 상호작용시킬 경우, 인산염 활성은 자극된다. 본 발명자들은 CF-HTS를 이러한 활성에 대한 검정에 적용시켰다.

EF-3 검정 완충액 중에 EF-3(고감온성 효소) 및 효소 리보솜을 함유하는 효소 겔을 제조한다. 검정 완충액 중에 1mM ATP를 함유하는 기질 겔을 제조한다. 양쪽 겔 모두 저융점 아가로스(Gibco BRL)내에 2% 디메틸 설폭사이드를 함유하며, 37℃에서 제조하여, 4℃에서 30분 동안 응고시킨다. 대조 샘플로서 사용되는 EF-3의 억제제인 폴리-L-라이신의 계열 희석액을 PVDC 필름 상에 스폿팅하여 건조시킨다(샘플 매트릭스). 다음, 실시예 1에서와 같이 효소 겔을 샘플 매트릭스 상의 억제제와 예비배양함으로써 검정을 수행한다. 다음, 효소 겔을 20분 동안 기질 겔과 접촉시켜 놓는다. 실시예 1에서와 같이, 효소 및 기질 겔을 말라카이트녹/몰리브덴산암모늄 발색 칵테일로 착색시킨다. 다음, 효소 겔을 CCD 카메라로 영상화시킨다. 억제제 스폿은 녹색 배경에서 보다 투명한 영역으로 보인다. 도 7은 억제제의 양이 5pmol 내지 200pmol로 변화하는 겔 상에서의 발색을 도시한다. 결과는 화합물이 신규한 EF-3 억제제를 발견하기 위한 상기 검종에서 스크리닝될 수 있음을 나타내는 용량-의존성 시그널을 제시한다. 실시예 2는 세포소기관, 또는 다른 조 생물학적 혼합물 또는 추출물의 존재에 의해 도입되는 복잡성에도 불구하고 CF-HTS의 유용성을 입증한다.

실시예 3: 단백질-단백질 상호작용 억제제의 gELISA 간접 색 검출

위에서 논의한 바와 같이, ELISA는 통상적으로 수용체가 미세역가 웰내에 고정화되어 있는 리간드-수용체 상호작용의 억제를 검출하는데 사용된다. ELISA에서 사용되는 "리간드-수용체" 짝은 단백질 또는 기타 거대분자에서부터 소형 분자에 이르는 분자를 결합하는 짝을 포함할 수 있다. 상기 검정은 수용체를 고정화시키고, 수용체를 리간드와 함께 배양하고, 세척하지 않을 경우에 높은 시그널 백그라운드를 야기시킬 수 있는 목적하지 않는 비특이적으로 보유된 리간드를 제거하기 위해 세척하고, 가시화 시약(예: 리포터 효소에 공액결합되어 있는 리간드 특이적 항체)을 수용체-결합된 리간드에 결합시키고, 기질을 리포터 효소에 제공하여 가시 시그널을 발생시킴을 필요로 하는 복잡한 다단계 검정이다. ELISA의 복잡성은 HTS 산업이 ELISA를 프리 포맷 검정으로 적합시킬 수 없다고 결론짓도록 유도하였음이 명백하다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 이러한 복잡한 다단계 검정을 CF-HTS 포맷에 적합시켜, 다양한 단백질-단백질, 단백질-리간드, 및 기타 리간드 결합 상호작용을 검정하였다.

유로키나제형 플라스미노겐 활성화제(uPA)는 이의 상응하는 수용체(uPAR)에 결합한다. uPA/uPAR 상호작용은 각종 유형의 암의 전이와 관련되어 있다. 본 발명자들은 정제된 수용체 및 리간드를 사용하여 종래의 uPA/uPAR ELISA를 CF-HTS에 적합시켰다.

uPAR 매트릭스

플라스틱 플레이트(7.5cm x 11.5cm; 공급원: Nunc, Inc.; 일리노이주 네이퍼빌 소재)를 pH 7.4 및 4℃에서 인산염 완충 염수(PBS)(공급원: Life Technologies; 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재) 중의 118nM 정제된 uPAR 15ml로 밤새 피복한다. 플라스틱 플레이트를 밤새 피복한 후, uPAR 용액을 따라낸 다음, 플라스틱 플레이트 상에 잔류하는 결합 부위를 1% 카제인(w/v)을 함유하는 PBS 15ml를 가하여 실온(RT)에서 2시간 동안 배양함으로써 블록킹시킨다. 블록킹시킨 후, 블록킹 용액을 따라내고 플라스틱 플레이트를 PBS 중의 0.05% Tween-20(폴리옥시에틸렌솔비탄 모노라우레이트)으로 구성된 세척 완충액 20ml로 5회 세척한다. 세척 후, 플라스틱 플레이트를 RT에서 10분 동안 건조시킨다. 플라스틱 플레이트를 아래에 기술하는 검정에서 이후 바로 사용하여, 활성의 손실을 유발할 수 있는 매트릭스의 과도한 건조를 피할 수 있도록 시간을 조절한다.

β-uPA 매트릭스

검정의 목적으로, 사용되는 uPA를 비오틴으로 표지시킨다(β-uPA). β-uPA를 함유하는 겔은 (실시예 1 및 2에서 용융된 한천에 주입하는 것과는 대조되는 바와 같이) 고온을 방지하기 위해 β-uPA를 한천으로 침지시킴으로써 제조한다. 한천은, 먼저 아가로스(공급원: Sigma; 미주리주 세인트 루이스 소재) 0.1g을 10ml PBS와 혼합하고, 용융될 때까지 가열한 다음, 8 x 7 x 0.075㎤ 겔 장치(공급원: Bio-Rad; 캘리포니아주 헤르쿨레스 소재)로 캐스팅시킴으로써 제조한다. (실온 또는 4℃에서) 응고되면, 겔을 PBS, 0.05% Tween-20 및 0.1% 카제인(Tween-20 및 카제인 둘다의 공급원: Sigma; 미주리주 세인트 루이스 소재)로 구성된 검정 완충액 중의 β-uPA(약 10nM) 15ml 중에 4℃에서 밤새 침지시킨다. 상기 겔을 사용 직전에 RT에서 20분 동안 건조시킨다.

샘플 매트릭스

uPA/uPAR 결합에 대해 공지된 소형 분자 억제제의 부재하에, 비-비오티닐화 uPA(프로-uPA)를 β-uPA/uPAR 결합의 대조 샘플 억제제로서 사용한다. 검정 완충액 중의 0, 0.03, 0.1, 0.3, 1 및 3μM 프로-uPA의 5㎕ 분취액을 PVDC 필름(공급원: Dowbrands L.P.; 인디아나주 인디아나폴리스 소재) 상에 분배하여 RT에서 2시간 동안 건조시킨다.

uPAR과 프로-uPA 및 μ-uPA와의 배양

샘플 매트릭스를 무수 프로-uPA 스폿과 함께 β-uPA 겔 표면과 접촉시키면서 β-uPA 겔의 한쪽면에 위치시킨다. 프로-uPA를 RT에서 10분 동안 겔내에 확산시킨다. 후속적으로, β-uPA 겔의 다른쪽 면을 플라스틱 플레이트내에 위치시켜, β-uPA(리간드로서 작용) 및 프로-uPA(경쟁적 억제제로서 작용)를 플라스틱 플레이트의 표면 상에서 uPAR과 상호작용시킨다. 결합/경쟁 반응물을 RT에서 20분 동안 배양한다. 배양 후, 플라스틱 플레이트를 겔로부터 분리하여, 세척 완충액 20ml로 신속하게 4회 세척한다. 아비딘-HRP(공급원: Sigam; 미주리주 세인트 루이스 소재)를 검정 완충액으로 1 내지 25,000배 희석시킨 다음, 15ml를 플라스틱 플레이트에 가함으로써, 아비딘-고추냉이-퍼옥시다제(아비딘-HPR) 공액체 용액을 제조한다. 반응물을 RT에서 10분 동안 배양한 다음, 아비딘-HPR 용액을 따라내고, 플라스틱 플레이트를 상기한 바와 같이 세척한다. 플라스틱 플레이트를 20분 동안 건조시킨다.

아비딘-HPR 중의 아비딘이 비오틴에 특이적으로 결합하여, "리간드/수용체" 결합을 나타내는 매트릭스의 영역만이 결국 발색된다. "리간드/수용체" 결합이 프로-uPA에 의해 경쟁적으로 억제되는 매트릭스의 영역은 발색되지 않는다.

발색

비색계 HRP 기질을 함유하는 발색 겔(OPD 겔)은 2개의 o-페닐렌디아민 HCl(OPD) 정제를 희석제(정제와 희석제 둘다의 공급원: Abbott kit no. 6172-30, Abbott Labs; 일리노이주 애보트 파크 소재) 7ml에 용해시키고 상기 용액을 0.1g 아가로스를 물 3ml에 용해시킴으로써 제조된 아가로스 용액과 합함으로써 제조한다. 최종 10ml 혼합물을 8 x 7 x 0.075cm 미니-단백질 II 겔 장치로 캐스팅시켜, 4℃에서 15분 동안 응고시킨다. 겔을 겔 캐스팅 스탠드의 유리 플레이트로부터 PVDC 또는 가요성 플라스틱 시트에 이동시켜, RT에서 10분 동안 공기 건조시킨다. 다음, 겔을 또 다른 PVDC 또는 플라스틱 시트로 이동시켜, 다른 한쪽면을 10분 동안 건조시킨다. 다음, OPD 겔을 플라스틱 플레이트에 두면 발색되기 시작한다. OPD 배양 동안 여러 시간에, 플라스틱 플레이트를 Fiber-Lite 광원에 의해 조명된 섬유 광학소자 확산 플레이트(둘다의 공급원: Dolan-Jenner Industries, Inc.; 마이애미주 로렌스 소재)의 표면에 차례로 존재하는 440nm 밴드 통과 필터(공급원: Omega Optical, Inc.; 버몬트주 브래틀보로 소재)의 상부에 위치시킨다. 생성된 상은 CCD 카메라(공급원: Eagle Eye system, Stratagene; 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 사용하여 포착한다.

대조 실험

도 8은 실시예 3의 대조 실험을 도시한다. 도 8A에 대해서는, 아가로스 스퀘어(1㎠)를 각각의 스퀘어 아래에 지시된 바와 같은 여러 β-uPA 농도의 용액에 침지시킨다(아가로스 스퀘어의 왼편에 표지된 50nM 용액은 제외). 아가로스 스퀘어를 uPAR 고정화 플라스틱 플레이트 상에서 배양한 후, 이들을 제거한다. 다음, 플라스틱 플레이트를 세척하여, β-uPA/uPAR 결합이 발생된 매트릭스의 영역을 상기한 바와 같이 가시화시킨다. 도 8B는 OPD 발색 동안 여러 시간에서 각각의 아가로스 스퀘어내의 β-uPA의 농도에 대한 각각의 스퀘어에 대한 평균 픽셀치(마이너스 백그라운드)(NIH 영상 분석(Image Analysis) 소프트웨어를 사용하는 CCD 카메라로부터 디지털 영상을 분석함으로써 측정함)의 플롯을 제시한다. 아가로스 스퀘어로부터 방출된 β-uPA는 표준 ELISA 및 상기 파라미터를 측정하는 다른 검정에서 상기 반응에 대해 기록된 값과 일치하는 3 내지 5nM 정도에서 반-최대 결합(Kd)을 갖는 전형적인 수용체-리간드 결합 곡선을 보여준다. 도 8은 gELISA에 의해 발생된 간접 색도계 시그널이 리간드-수용체 상호작용의 범위에 정량적으로 의존한다는 사실을 입증한다.

프로-uPA/β0-uPA 경쟁의 결과

도 9는 프로-uPA에 의한 β-uPA/uPAR 결합의 억제를 입증한다. 도 9A에서의 스폿은 β-uPA/uPAR 결합이 억제되는 영역을 제시한다. 따라서, 아비딘-HRP는 상기 부위에서 결합되지 않는다. 결과적으로, HRP는 OPD 겔내의 기질과 반응하여 발색시키지 않는다. 도 9B는 정량적 적정을 확인하는 사람의 시력을 증강시키는 이들 동일한 CCD 영상 데이터를 나타내는 또 다른 방식이다.

실시예 4: 단백질-단백질 상호작용의 억제제의 직접 방사계 검출

T-세포 활성화는 신체의 면역 반응의 구성요소이다. T-세포 활성화 동안 발생하는 다운스트림 이벤트의 경우, p56lck(LCK, 단백질)는 T-세포 항원 수용체의 세포질 도메인의 ITAM 영역(면역글로불린 관련된 티로신계 활성화 모티프)과 상호작용하여야만 한다. 이러한 단백질-단백질 상호작용을 억제하는 화합물은 잠재적인 면역억제제이다. 본 발명자들은 CF-HTS를 사용하여, LCK가 막에 고정화되는 상기 단백질-단백질 상호작용을 검정하였다.

LCK 매트릭스

비오티닐화 LCK는 11cm x 2cm 스트립을 5mM DTT(디티오트레이톨)를 함유하는 PBS 중의 3μM LCK 5ml를 사용하여 비오틴 포획 막(SAM 막)(공급원: Promega Corp.; 위스콘신주 매디슨 소재) 상에 고정화시킨 후, 완충액을 제거한다. SAM 막을 아래에 기술하는 검정에서 이후 바로 사용할 수 있도록 시간을 조절한다.

ITAM^*매트릭스

0.1g 아가로스 겔과 10ml 완충액과 혼합하고, 용융될 때까지 가열한 다음, 8 x 7 x 0.075cm 겔 장치로 캐스팅시킴으로써, 방사선표지된 ITAM 펩타이드(ITAM^*)를 함유하는 아가로스 겔을 제조한다. 최종 농도 10nM으로 응고시킨 후, ITAM^*을 캐스팅 또는 달리 겔내에 침지시키기 직전에 가한다.

샘플 매트릭스

스크리닝시킬 시험 샘플을 플라스틱 표면 또는 PVDC 상에 분배하여, 건조시킴으로써 샘플 매트릭스를 형성시킨다.

ITAM^*, LCK 및 시험 샘플의 배양, 및 가시화

샘플 매트릭스를 시험 샘플이 ITAM^*겔내에 확산될 수 있도록 ITAM^*겔의 한쪽면과 접촉시킨다. 후속적으로, ITAM^*겔의 다른 한쪽면을 LCK가 고정화되어 있는 SAM 막과 접촉시킨다. 15 내지 45분 동안 배양한 후, SAM 막을 제거하고, 세척하고, 인 영상기 또는 필름을 사용하여 영상화시킨다. ITAM-LCK 상호작용의 억제제는 영상 상의 보다 낮은 시그널 강도에 해당하는 보다 낮은 방사능의 영역에 의해 나타난다.

ITAM^*/LCK 결합에 대한 대조 실험

0.1g 아가로스 겔과 10ml 완충액과 혼합하고, 용융될 때까지 가열한 다음, 8 x 7 x 0.075cm 겔 장치로 캐스팅시킴으로써, 아가로스 겔을 제조한다. 응고 후, 1cm 직경의 환판을 겔로부터 뚫어내어, 완충액 중의 0.1, 0.3, 1, 3, 10 및 20nM¹²⁵I 표지된 ITAM(공급원: Amersham; 일리노이주 아를링턴 하이츠 소재) 400㎕에 4℃에서 밤새 침지시킨다. 겔 환판을 용액으로부터 제거한 다음, RT에서 20분 동안 건조시킨다. 다음, 이들을 LCK-고정화 SAM 막 상에 위치시키고, RT에서 45분 동안 배양한다. 겔을 제거하고, 막을 완충액으로 4회 세척한다. 건조 후, SAM 막을 인 영상기를 사용하여 영상화시킨다.

도 10은¹²⁵I-ITAM과 SAM 막에 고정화 LCK 사이의 용량 의존성 결합을 나타낸다.

도 11은 겔 환판내에서의¹²⁵I-ITAM에 대한 각각의¹²⁵I-ITAM 겔에 대한 평균 픽셀치(마이너스 백그라운드)(몰레큘러 다이나믹스(Molecular Dynamics)로부터의 이미지퀀트(ImageQuant) 소프트웨어를 사용하는 인 영상기로부터의 디지털화된 이미지를 분석함으로써 측정함)의 플롯을 제시한다. 겔로부터 고정화 LCK로 방출된¹²⁵I-ITAM은 전형적인 수용체-리간드 결합 곡선을 보여준다.

실시예 5: 조합 겔/필터 포맷을 사용한 전세포 리포터 유전자 검정

HEK 세포로 알려져 있는 신장 세포를 루시페라제 유전자(루시페라제 리포터 유전자; 공급원: Promega)에 융합되어 있는 사이클릭-AMP 반응 요소(CREB) 프로모터를 함유하는 플라스미드로 형질감염시킨다. 형질감염된 세포를 포르스콜린으로 처리할 경우, 루시페라제 리포터 유전자 발현이 유도된다. 이후, 루시페라제 기질(딱정벌레 루시페린; 공급원: Promega) 및 적합한 보조인자(20mM 트리신 pH 7.8, 0.1mM EDTA, 33mM DTT, 0.3mM 코엔자임 A, 0.5mM 아데노신 3인산염 및 1mM MgCl₂)를 함유하는 생물학적 완충액을 HEK 세포에 가할 경우, 종래의 기계를 사용하여 검출할 수 있는 광자 방출이 발생한다. 본 발명자들은 이러한 검정을 CF-HTS에 적합시켰다.

세포 매트릭스

배양액 중의 세포를 트립신으로 처리하고, 코닝/코스타(Corning/Costar) TRANSWELL™ 막(플라스틱 지지체 환을 보유한 3마이크론 폴리카보네이트 필터)으로 이동시켜, 조직 배양 배지의 존재하에 37℃, 5% CO₂에서 밤새 배양한다. 다음, 배지를 막으로부터 제거하고, 세포가 부착되어 있는 필터를 15분 동안 공기 건조시켜, 이후 단계에서 곧 바로 사용한다.

유도제 매트릭스

포르스콜린의 10mM 모액(에탄올 중의 Simgma 모액) 12㎕를 저융점 아가로스 겔 6ml에 가함으로써, 루시페라제 발현의 유도제를 함유하는 겔을 제조한다. 포르스콜린의 최종 농도를 20μM로 만들어, 겔을 실온에서 응고시킨다.

샘플 매트릭스

포르스콜린 유도를 차단하는 샘플을 고밀도로 PVDC 상의 별개의 위치에 분배하여 건조시킨다.

시약 배양 및 억제 검출

PVDC의 억제제 면을 유도제 겔과 함께 배양한다. 다음, 포르스콜린 유도제를 함유하는 겔을 위에서 제조한 세포 매트릭스의 비-세포면 상에 위치시킨다. 이들을 함께 37℃, 5% CO₂에서 20분 동안 배양한다. 다음, 포르스콜린 겔을 제거하고, 세포 매트릭스를 37℃, 5% CO₂에서 루시페라제 작제물의 최대 발현을 위해 추가 4시간 동안 배양한다. 루시페라제 효소 활성(또는 이의 억제도)을 검출하기 위해, 세포 매트릭스 필터를 이의 플라스틱 지지체 환으로부터 물리적으로 제거하여, 페트리 디쉬에 위치시킨다. 페트리 디쉬를 적합한 보조인자를 함유하는 생물학적 완충액 중의 루시페라제 기질(딱정벌레 루시페린; 공급원: Promega)로 플러딩시켜 시그널로서 빛을 발생시킨다. 시그널은 루시페라제를 발현시키는 고정화 세포내에 위치하기 때문에, 초기 유도 단계의 억제제는 보다 낮은 광자 방출 영역을 야기시킨다.

실시예 6: 리간드-세포 상호작용의 억제제를 직접적으로 검출하기 위한 겔/필터 CF-HTS

세포 표면 상에서의 리간드/수용체 결합은 궁극적으로 기능성 반응(예: 세포 증식 또는 생물학적 활성 물질의 분비)을 유도하는 세포내에서 시그널 경로를 개시한다. 질환 상태에서 세포의 생물학적 반응을 조절하기 위해, 종종 세포 표면에의 리간드 결합을 억제하고자 한다. 리간드/세포의 수용체 결합의 억제제를 평가하는 통상의 방법은 방사선 표지된 천연 리간드와 세포 사이의 결합을 감소시키는 억제제의 성능을 평가하는 것이다. 이는 세포를 방사성 리간드 및 억제제와 함께 배양하여, 결합되지 않거나 비특이적으로 결합된 방사성 리간드를 세척하여 제거한 다음, 결합된 방사능의 양을 측정함을 포함한다.

인터류킨-8(IL-8)은 각종 유형의 세포 상의 수용체에의 결합에 의한 염증과 관련된 화학주성 케모킨이다. 본 발명자들은 CF-HTS 리간드-수용체 세포 검정을 상기 상호작용의 억제제를 평가하기 위해 개발하였다.

세포 매트릭스

IL-8a 수용체를 발현시키는 HEK 세포(ATCC, 미들랜드주 베데스다 소재)를 75mm 직경 트랜스웰 막 필터(공급원: Corning Costar Corp.; 마이애미주 캠브리지 소재) 상에 플레이트당 약 20 x 10⁶개 세포의 밀도로 플레이팅시킨다. 이들을 pH 7.2 및 37℃에서 10nM Hepes(공급원: Sigma; 미주리주 세인트 루이스 소재)를 함유하는 완충액(RPMI; 공급원: Life Technologies; 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재) 중의 막 필터에 부착시킨다. 세포를 필터에 부착시킨 후, 배지를 제거한 다음, 세포를 새로운 완충액으로 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거한다. 필터를 세포면이 아래로 가도록 뒤집고 과량의 배지가 배출될 수 있는 각도로 배치시킨 다음, 20분 동안 건조시킨다. 세포 매트릭스를 아래에 기술하는 검정에서 바로 사용할 수 있도록 시간을 조절한다.

리간드 매트릭스

¹²⁵I 표지된 IL-8(공급원: Amersham; 일리노이주 아를링턴 하이츠 소재)을, 0.1g 아가로스를 10ml 완충액과 혼합하고, 용융될 때까지 가열한 다음, 8 x 7 x 0.075cm 겔 장치로 캐스팅시킴으로써 제조된 아가로스 겔에 침지시킴으로써, 리간드 매트릭스를 제조한다. 겔을 회전 플랫폼(공급원: New Brunswick Scientific Co., Inc.; 뉴저지주 에디슨 소재) 상에서 천천히 혼합하면서 RT에서 밤새 침지시킨다. 침지 후, 겔은 사용 직전에 RT에서 20분 동안 건조시킨다. 겔을 검정에서 바로 사용할 수 있도록 시간을 조절한다.

샘플 매트릭스

IL-8/세포 수용체 결합의 공지된 억제제의 부재하에, 비-방사선표지된 IL-8(공급원: Genzyme; 마이애미주 캠브리지 소재)을 대조 샘플 억제제로서 사용하여, HEK 세포에의¹²⁵I-IL-8 결합의 억제를 관찰한다. 0, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 및 100μM IL-8의 1㎕를 PVDC와 같은 플라스틱 시트 상에 분배하여, 진공하에 RT에서 1시간 동안 건조시킨다.

배양

샘플 매트릭스를 리간드 매트릭스의 한쪽면에 위치시켜, 건조된 IL-8 스폿을 겔 표면과 접촉시킨다. 겔을 뒤집어, 다른 한쪽면을 RT에서 10분 동안 건조시키고, "억제제"가 겔로 확산되도록 한다. 후속적으로, 겔을 세포 매트릭스의 비-세표면 상에 위치시킨다. 결합 반응물을 RT에서 45분 동안 배양한다. 이후, 겔을 제거하고, 막의 비-세포면을 완충액으로 4회 세척한다. 막을 이의 플라스틱 지지체 환으로부터 제거하기 전에, 이를 완전히 건조시킨다. 다음, 막을 X선 필름 또는 인 영상기(공급원: Molecular Dynamics; 캘리포니아주 써니베일 소재)를 사용하여 영상화시킨다.

도 12는 IL-8a 수용체를 발현시키는 HEK 세포를 결합시키는 세포 매트릭스 전체에 확산된 아가로스 겔내의¹²⁵I-IL-8에 대한 용량 반응을 제시한다. 몇 개의 1㎠ 아가로스 스퀘어를 지시한 바와 같은 여러¹²⁵I-IL-8 농도의 용액에 침지시킨다. 후속적으로, 리간드 침지된 스퀘어를 상기한 바와 같은 세포 매트릭스와 접촉시킨다. 배양 후, 스퀘어를 세포 매트릭스로부터 제거한 다음, 막의 비-세포면을 완충액으로 세척한다. 인 영상기를 사용하여, 세포 결합된¹²⁵I-IL-8의 위치를 결정한다. 데이터는 상기 겔-기재 세포 검정에서의 직접 방사계 판독이 리간드-수용체 상호작용의 범위에 정량적으로 의존함을 나타낸다. 도 12는 또한 결합 부위가 상이한 형태로 존재함을 나타내고, 시그널의 측면 확산이 검정에서는 문제가 되지 않음을 입증한다.

도 13은 경쟁적 억제 실험의 결과를 도시한다.¹²⁵I-IL-8과 HEK 세포간의 결합 억제는 광 스폿에 의해 나타난다. 또한, 비-표지된 IL-8의 억제는 정량적으로 용량-의존성임을 용이하게 식별가능하다. 이들 데이터는 이 경우에 비-표지된 IL-8로 예시된 억제제가 세포 매트릭스를 횡단하여,¹²⁵I-IL-8과 세포간의 결합을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.

실시예 7: 필터-기재, 겔-감소 기능성 세포 검정

세포 기능에서의 변화는 종종 시험 화합물 또는 샘플이 세포내로 처리된 리포터 시스템에 미치는 영향을 관찰함으로써 측정한다. 구체적인 예는 형광성 세포내 단백질, 예를 들어, 녹색 형광성 단백질(GFP), 세포외 단백질, 예를 들어, 수용체 또는 유착 분자, 또는 특이 효소, 예를 들어, 루시페라제, 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제 또는 β-갈락토시다제(공급원: Promega)의 합성에 미치는 영향을 관찰함을 포함한다. 먼저, 시험 화합물을 세포와 함께 배양한다. 이후, 세포가 리포터 단백질을 적합한 기간(분, 시 또는 일일 수 있다) 동안 발현시키도록 한다. 다음, 리포터 단백질의 수준을 직접 방법(예: GFP) 또는 간접 방법(예: 막 결합 단백질을 사용하는 ELISA 기술)에 의해 검정한다. 또한, 효소의 경우, 세포를 파괴한 다음, 리포터 단백질을 추출하여, 효소 활성에 대해 검정할 수 있다. 기타 기능성 세포 검정은 수용체의 자극 또는 막 전위와 같은 세포 생리에서의 변화에 대해 반응한 특이 분자, 예를 들어, 염료 또는 방사선표지된 대사물질의 거동 또는 위치를 측정한다.

화합물이 세포내 유착 분자-1(Intercellular Adhension Molecule-1: ICAM-1)의 발현에 미치는 영향을 측정하는 ELISA 검정을 다음과 같이 CF-HTS에 대해 포맷을 만들 수 있다. ICAM-1을 발현시키는 내피 세포를 폴리카보네이트 화학주성 막(공급원: Neuro Probe) 상에 약 5,000개 세포/㎟으로 플레이팅시킨다. 세포를 배지내에서 37℃에서 밤새 배양한다. 배지를 제거한 다음, 막을 RT에서 10분 동안 부분적으로 건조시킨다. ICAM-1의 유도에 대해 시험할 샘플 또는 화합물을 플라스틱 시트 상에서 건조시키고, 습윤성 막의 비-세포면과 접촉하도록 위치시킨다. 화합물을 습윤실에서 37℃에서 1시간 동안 세포와 상호작용시킨 다음, 세포를 배지내에 담궈 37℃에서 5시간 동안 배양한다.

세포가 유도된 단백질을 합성하도록 시간을 조절한 다음, 배지를 막으로부터 제거하고, 세포를 플루오레스세인 이소티오시아네이트(FITC) 또는 비오틴과 공액결합되지 않거나 공액결합된 항-ICAM-1 항체(공급원: Genzyme, R＆D systems)를 함유하는 완충액내에서 배양한다. RT에서 30분 동안 배양한 후, 완충액을 제거하고, 세포를 수회 세척하여 결합되지 않은 항-ICAM-1을 제거한다. FITC 공액결합된 항체의 경우, 485nm 여기 및 520nm 방출을 갖는 CCD 카메라(공급원: Stratagene, Imaging Research)를 사용하여 막을 영상화시킨다. ICAM-1 발현을 자극하는 화합물은 FITC-항-ICAM-1 항체의 결합으로 인해 증가된 형광성을 갖는 영역을 발생시킬 것이다. 비오틴 공액결합된 항체의 경우, 세포를 아비딘-HRP를 함유하는 완충액 중에서 RT에서 10분 동안 배양한다. 완충액을 제거한 다음, 결합되지 않은 아비딘-HRP를 세척 제거한다. 다음, 막을 침전 HRP 기질, 예를 들어, 사염화디아미노벤지딘(공급원: Pierce)을 함유하는 완충액내에 담궈 내재하는 세포가 ICAM-1의 발현을 유도하는 영역에서의 발색을 관찰한다. 비공액결합된 항-ICAM-1 항체의 경우, 공액결합된 2차 항-항-ICAM-1 항체가 세포와 반응한 다음, 공액체에 대한 적합한 기질을 갖는 시그널이 발현된다. 영상을 CCD 카메라에 의해 포착한다. 상기 변이체(FITC, 아비딘-HRP 및 항-항-ICAM-1) 모두는 동일한 정량적 결과를 제공할 수 있는 대체 리포터이다 - 즉, ICAM-1 발현에 영향을 미치는 샘플은 증가되거나 감소된 시그널의 영역과 상관 관계가 있을 수 있다.

이 경우에 연속 포맷 매트릭스는 막 및 플라스틱 시트라는 것을 주목한다. 겔은 CF-HTS에 필요하지 않다.

실시예 8: 뉴라아미니다제 억제에 대한 별개의 화합물의 CF-HTS 검정

샘플 매트릭스

구조적으로 관련된 별개의 528개 화합물의 라이브러리를 CF-HTS에 의해 시험한다. 팩카드 멀티프로브(Packard Multiprobe) MP204 DT를 사용하여, 바이알로부터의 화합물을 96-웰 플레이트내로 희석시키고, 상기 화합물을 희석시켜 플라스틱 시트 상에 이동시킨다. 상기 화합물은 처음에 바이알내의 DMSO 중의 40mM로부터 96-웰 플레이트내의 DMSO 중의 4mM로 희석시킨다. 다음, 이를 96-웰 플레이트내에서 DMSO 중의 4mM로부터 50% EtOH/H₂O 중의 200μM로 희석시킨다. 상기 샘플을 시트당 총 192개 샘플로 샘플간 평균 간격이 5mm인 8cm x 8cm 플라스틱 시트(공급원: Bio-Rad cat.#165-2956) 상에 1㎕ 2개씩 이동시킨다. 따라서, 각각의 1㎕ 스폿은 라이브러리로부터의 특정 화합물을 약 200pmol 함유한다. 대조군으로서, 공지된 뉴라미니다제 억제제인 2,3-데하이드로-2-데옥시-N-아세틸뉴로아민산(DANA)(공급원: Boehringer Manheim #5285244)의 계열 희석액을 각각의 시트 상의 화합물과 나란히 수동 분배한다. 시트를 진공 오븐으로 건조시켜, 각각의 화합물이 플라스틱 상의 자기 위치에서 건조되도록 한다.

효소 매트릭스

검정 전에, 인플루엔자 뉴라미니다제 효소를 25% 글리세롤, 인산염 완충 염수로부터 1% 아가로스, 50mM 시트르산나트륨 pH 6.0, 10mM 염화칼슘으로 구성된 액화 한천 겔내로 40℃에서 1500배 희석시킨다. 8cm x 8cm x 0.75mm 효소 겔을 주입하고, 온도를 4℃로 낮춤으로써 응고시킨다.

기질 매트릭스

합성 인플루엔자 뉴라미니다제 기질, 2'-(4-메틸움베리페릴)-알파-D-N-아세틸뉴라민산(Sigma cat.#M-8639)을 DMSO 중의 3mM로부터 액화 한천 겔내로 30μM로 희석시킨 다음, 상기한 효소 겔과 유사한 방법으로 주입한다.

배양 및 검출

효소 매트릭스를 대상 화합물이 건조된 면 위의 샘플 매트릭스 상에 위치시킨다. 다음, 기질 매트릭스를 효소 매트릭스의 표면에 올려놓는다. 매트릭스를 RT에서 30분 동안 배양한다. 이 시간 동안, 2개의 겔과 기질 사이에 함께 확산되어 있는 급냉된-형광성 기질 및 효소를 효소에 의해 분리하여, 형광 강도를 증가시킨다. 이를 340nm에서 여기시키고 450nm에서 방출시킴으로써 모니터링한다. 효소 활성을 억제할 수 있는 화합물은 형광 강도를 최소화시킨다. 겔이 대부분 위치에서 형광 강도가 증가됨에 따라, 플라스틱 시트로부터 겔내로 확산되어 있는 효소 억제제를 함유하는 영역이 보다 낮은 형광성을 갖는 보다 어두운 영역으로서 가시화된다. 이는 적합한 필터를 사용하는 CCD 카메라에 의해 용이하게 모니터링하여, 방출 및 여기 파장을 조절한다. 억제 영역을 나타내는 화합물을 억제제 매트릭스에 대한 영역의 위치에 의해 확인한다. DANA 대조군의 형광성을 시험된 각각의 억제제의 공지된 양과 비교함으로써, 각각의 화합물에 대해 IC₅₀을 정량적으로 평가한다.

라이브러리의 모든 528개 화합물은 이중 반복 시험한다. 사용되는 전체 효소 겔 용적은 33ml 또는 시험당 31.25㎕이다. 또한, 모든 화합물은 동시에 시험하며, 검정 조건은 종래 96-웰 검정과 비교하여 일정하다. 또한, 도 14에 의해 도시한 바와 같이, 검정은 100μM만큼 약한 억제제를 검출가능할 정도로 민감성이다. 활성 화합물에 대해 추정된 IC₅₀값은 시험당 200㎕을 필요로 하는 보다 비용이 많이 드는 96-웰 검정에 의해 시험된 동일한 화합물에 대해 관찰된 값과 상당히 일치한다[참조: Quantitative Gel Assay Results Table]. 본 실시예는 화합물의 보다 높은 밀도 배열구조를 시험하는 것이 비용 및 시간을 감소시킨다는 사실을 입증한다. 예를 들어, 5mm 대신에 2.5mm 간격으로 적은 범위로 감소시키더라도 단위 용적당 시험되는 화합물의 수는 4배 증가한다. 본 실험에서는 시험되는 화합물당 용적을 10㎕ 미만으로 감소시켰다. 게다가, 시약을 소형화 스크리닝에서 통상적으로 사용된 소량 액체 처리용 장치에 대한 필요없이 벌크 형태로 처리한다.

정량적 겔 검정 결과

샘플 번호	겔로부터의 근사 최대 Ki(μM)	96-웰 검정으로부터 추정된 IC₅₀(μM)
34	100	＞100
35	80	＞100
36	80	42
37	100	＞100
38	100	＞100
39	100	＞100
40	40	32
41	100	＞100
42	40	50
43	100	＞100
44	＞200	＞100
45	100	＞100
46	100	＞100
47	10	7.5
48	100	＞100
49	100	＞100
50	100	＞100

이러한 소형화의 이점을 입증하는 추가 실시예로서, 10,080개의 별개의 화합물을 17ml의 총 효소 겔 용적(시험당 2㎕ 미만)으로 CF-HTS에 의해 시험한다. 팩카드 멀티펫(Packard Multipette)을 사용하여, 30nl 용적의 각각의 샘플을 1mm 간격으로 분리 분배한다. 화합물을 5mM의 농도로 DMSO내에 분배한 다음, 각각 약 150pmol씩 플라스틱 상에 분배한다. DANA를 다시 한번 대조군 억제제로서 사용한다. 화합물 배열구조의 외부에서의 통상의 대조 적정 이외에, 대조 적정은 대조 샘플을 플라스틱 상에 분배할 경우에 10,080개의 미지물과 동일하게 처리하는 블라인드 시험으로서 배열구조 내부 자체에 포함된다. 이전과 같이, 시트를 건조시켜, 뉴라미니다제 검정에서 사용한다. 10,080개 모두를 상기 방법에 의해 1시간 미만내에 스크리닝한다. 다시는, 초기 화합물을 시트 상에 분배하는 경우를 제외하고는 유체소자 및/또는 소량 처리를 필요로 하지 않는다. 본 검정에서 사용되는 극도로 높은 밀도는 억제제의 검출을 방해하지 않는다. 또한, 고밀도는 형광성 화합물(겔내에서 보다 밝은 스폿으로 용이하게 관찰됨)이 활성 화합물의 가장 가까이에 있을 경우에도 활성 화합물의 동정을 곤란하게 하지 않는다(도 15 참조).

Claims

a) 다수의 시험 샘플을 하나 이상의 검정 성분을 임의로 함유하는 다공성 검정 매트릭스내에 또는 매트릭스 상에 유입하고;

b) 다공성 검정 매트릭스이거나 아닐 수 있는 하나 이상의 매트릭스를 사용하여 하나 이상의 검정 성분을 검정물에 도입하고;

c) 검정시 사용되는 매트릭스를 세척하여 과량의 시험 샘플, 검정 성분 또는 이의 배합물을 제거하는 단계(i) 또는 검정시 사용되는 매트릭스를 벌크 용액 또는 액체로서의 추가 시약과 접촉시키는 단계(ii)의 추가 단계를 수행함을 포함하여, 시험 샘플의 생물학적 활성 또는 생화학적 활성을 검정하는 방법.
제1항에 있어서, 시험 샘플이 리간드 함유 다공성 검정 매트릭스 상에 분배되고, 또 다른 검정 매트릭스가 고정화 수용체를 함유하고, 추가 시약이 가시화 용액인 방법.
제1항에 있어서, 추가 시약이 세포 검정시 리포터 유전자(reporter gene)의 발현을 검출하는 방법.
제1항에 있어서, 하나의 다공성 검정 매트릭스가 한쪽 표면 상에 전세포를 담지하는 막이고, 추가 단계가, 세포와 시험 샘플간의 포지티브한 상호작용에 의해 형성되는 리포터 단백질과 공액결합된 화합물을 함유하는 벌크 용액을 가함을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 추가 시약이 가시화제인 방법.
제1항에 있어서, 세척 단계가 검정물을 가시화하는데 사용되는 과량의 검정 성분을 제거하는 방법.
a) 다수의 시험 샘플을 하나 이상의 검정 성분을 임의로 함유하는 다공성 검정 매트릭스내에 또는 매트릭스 상에 유입하고;

b) 2개 이상의 추가 매트릭스를 사용하여 검정을 수행함을 포함하여, 시험 샘플의 생물학적 활성 또는 생화학적 활성을 검정하는 방법.
a) 96개 이상의 시험 샘플을 하나 이상의 검정 성분을 임의로 함유하는 다공성 검정 매트릭스내에 또는 매트릭스 상에 유입하고;

b) 검정을 수행함을 포함하여, 별개의 시험 샘플의 생물학적 활성 또는 생화학적 활성을 검정하는 방법.
제1항, 제7항 및 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 시험 샘플을 시험 샘플 매트릭스 상에 분배하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항, 제7항 및 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 다공성 검정 매트릭스가 표적 거대분자를 함유하는 방법.
제1항, 제7항 및 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 다공성 검정 매트릭스가 효소를 함유하는 방법.
제1항, 제7항 및 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 다공성 검정 매트릭스가 조 생물학적 혼합물 또는 추출물인 방법.
제1항, 제7항 및 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 다공성 검정 매트릭스가 세포소기관 또는 세포인 방법.
제1항, 제7항 및 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 다공성 검정 매트릭스가 필터 또는 막인 방법.
제1항, 제7항 및 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 다공성 검정 매트릭스가 고정화 검정 성분을 덮고 있는 액체 박막인 방법.
제1항, 제7항 및 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 추가 매트릭스가 고정화 거대분자 표적을 함유하는 방법.
제1항, 제7항 및 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 추가 매트릭스가 가시화제를 함유하는 방법.
a) 각각의 별개의 물질을 별개의 특정 위치의 중심에 두어 각각의 물질을 이의 착상 위치로부터 확인할 수 있도록, 별개의 물질로 이루어진 96개 이상의 소량 샘플을 각각 균일하게 분산된 검정 시약을 함유하거나 담지하고 있는 평면 다공성 매트릭스 상에 배열하여 착상시키고,

b) 각각의 물질과 상기 검정 시약과의 상호작용을 관찰하고, 이를 상기 생물학적 공정을 증강시키거나 억제하는 상기 물질의 성능과 상관시킴을 포함하여, 상이한 물질로 이루어진 다수의 샘플을 생물학적 공정을 증강시키거나 억제하는 성능에 대해 동시에 시험하는 방법.
a) 각각의 별개의 물질을 별개의 특정 위치의 중심에 두어 각각의 물질을 이의 착상 위치로부터 확인할 수 있도록, 별개의 물질로 이루어진 96개 이상의 소량 샘플을 각각 평면 매트릭스 상에 배열하여 착상시키고,

b) 상기 매트릭스를 균일하게 분산된 검정 시약을 함유하거나 담지하고 있는 다공성 매트릭스와 접촉시키고, 특정의 각각의 물질을, 각각의 확산된 물질의 특정 위치가 당해 물질이 최초로 착상된 상기 평면 매트릭스 상의 위치와 상관될 수 있는 방식으로, 상기 다공성 매트릭스내로 확산시키고,

c) 검정을 수행하여, 상기 생물학적 공정을 증강시키거나 억제하는 각각의 확산된 물질의 성능을 측정함을 포함하여, 상이한 물질로 이루어진 다수의 샘플을 생물학적 공정을 증강시키거나 억제하는 성능에 대해 동시에 시험하는 방법.
a) 각각의 별개의 물질을 별개의 특정 위치의 중심에 두어 각각의 물질을 이의 착상 위치로부터 확인할 수 있도록, 별개의 물질로 이루어진 96개 이상의 소량 샘플을 각각 평면 매트릭스 상에 배열하여 착상시키고,

b) 상기 평면 매트릭스를 균일하게 분산된 제1 검정 시약을 함유하거나 담지하고 있는 제1 다공성 매트릭스와 접촉시키고, 특정의 각각의 물질을, 각각의 확산된 물질의 특정 위치가 당해 물질이 최초로 착상된 상기 평면 매트릭스 상의 위치와 상관될 수 있는 방식으로, 상기 다공성 매트릭스내로 확산시키고,

c) 상기 제1 다공성 매트릭스를 균일하게 분산된 제2 검정 시약을 함유하거나 담지하고 있는 제2 매트릭스와 접촉시키고, 제2 검정 시약을 제1 다공성 매트릭스내로 확산시키거나, 각각의 물질 및 제1 시약을, 제2 매트릭스내의 각각의 물질의 위치가 당해 물질이 최초로 착상된 상기 평면 매트릭스 상의 위치와 상관될 수 있는 방식으로, 제2 매트릭스내로 확실하게 확산시키고,

d) 상기 생물학적 공정을 증강시키거나 억제하는 각각의 물질의 성능을 평가함을 포함하여, 상이한 물질로 이루어진 다수의 샘플을 생물학적 공정을 증강시키거나 억제하는 성능에 대해 동시에 시험하는 방법.
a) 각각의 별개의 물질을 별개의 특정 위치의 중심에 두어 각각의 물질을 이의 착상 위치로부터 확인할 수 있도록, 별개의 물질로 이루어진 96개 이상의 소량 샘플을 각각 균일하게 분산된 제1 검정 시약을 함유하거나 담지하고 있는 제1 평면 다공성 매트릭스 상에 배열하여 착상시키고,

b) 상기 제1 다공성 매트릭스를 균일하게 분산된 제2 검정 시약을 함유하거나 담지하고 있는 제2 평면 매트릭스와 접촉시키고, 제2 검정 시약을 제1 다공성 매트릭스내로 확산시키거나, 각각의 물질 및 제1 시약을, 제2 매트릭스내 또는 매트릭스 상의 각각의 물질의 위치가 당해 물질이 최초로 착상된 상기 제1 다공성 매트릭스 상의 위치와 상관될 수 있는 방식으로, 제2 매트릭스내로 또는 매트릭스 상에 확실하게 확산시키고,

c) 상기 생물학적 공정을 증강시키거나 억제하는 각각의 물질의 성능을 평가함을 포함하여, 상이한 물질로 이루어진 다수의 샘플을 생물학적 공정을 증강시키거나 억제하는 성능에 대해 동시에 시험하는 방법.
제18항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 균일하게 분산된 검정 시약 중의 하나가 거대분자인 방법.
제18항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 균일하게 분산된 검정 시약 중의 하나가 효소인 방법.
제18항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 균일하게 분산된 검정 시약 중의 하나가 조 생물학적 추출물인 방법.
제18항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 균일하게 분산된 검정 시약 중의 하나가 세포소기관인 방법.
제18항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 균일하게 분산된 검정 시약 중의 하나가 전세포인 방법.
제18항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 균일하게 분산된 검정 시약 중의 하나가 평면 다공성 매트릭스의 한쪽면 상에 담지되어 있는 전세포인 방법.
제27항에 있어서, 상호작용이, 상기 다공성 매트릭스를, 전세포내에서의 발현이 평가되는 생물학적 공정인 단백질의 가시화를 촉진시키는 시약의 용액 또는 현탁액 또는 상기 시약을 함유하는 다공성 매트릭스와 접촉시킴으로써, 관찰되는 방법.
제21항에 있어서, 제1 검정 시약이 표지된 리간드이고, 제2 검정 시약이 상기 리간드에 대한 고정화 수용체인 방법.
제29항에 있어서, 제2 평면 매트릭스가 세척되어, 제2 평면 매트릭스 상에 또는 매트릭스내에 확산되어 있으나 고정화 수용체에 결합되어 있지는 않은 표지된 리간드를 제거하는 방법.
제30항에 있어서, 제2 평면 매트릭스가, 세척 단계에 의해 제거되지 않은 표지된 리간드의 가시화를 촉진시키는 시약의 용액 또는 현탁액 또는 상기 시약을 함유하는 다공성 매트릭스와 접촉되는 방법.