TW464656B - Interferon-gamma production inducing polypeptide monoclonal antibody, and agent for interferon-gamma susceptive disease - Google Patents

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464656 A7 B7 五、發明説明（1 ) 發明背蒉 請 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項 再, 1' 本 頁 本發明是有關新穎的多肽’其可誘導免疫勝任細胞產 製r —干擾素，（下文縮寫成I F N — r )，一種與多肽具 特異性之單株抗體，及用於敏感疾病之作用物’其中含多 肽爲有效組份》 先前技藝 I F N — r是一種蛋白質，其具抗病毒，抗致癌及免 疫調控活性，且由經抗原或突變原刺激之免疫勝任細胞所 產製。由於逭些生物活性，預期IFN—r在發現之初可 充作抗腫瘤劑，並在臨床試驗上致力研究充作惡性腫瘤之 治療劑，一般而言包括腦部腫瘤。目前已商品化之I F N |- r ‘.i‘可粗略地分類成2大類，即由免疫勝任細胞所產生 之天然I FN—γ s ，及由可編碼天然I FN_r S之大 腸桿菌D N A S引入微生物而製備之轉形細胞所產製之重 經濟部中央標準局—工消費合作社印製 組體I F N - r r s任一者均可 在這些I F 常是在添加有可 養培養基中培養 I F N — r s <* 響I F N — 7·之 產物之安全性。 Con A )， s »於上一臨床嘗試中，此種IFN — 充作"外源I FN_r 〃而投予至患者。 N — 7 s中，天然I FN—T" s之產製通 誘導I FN—γ s產製之I FN—r之營 已發展之免疫勝任細胞，並純化所產生之 已知，I卩1^-7誘導劑之型式大大地影 產率，I FN- r純化之簡易化，及最終 一般而言，可使用之突樊原如刀豆素（ Lens culinaris, phytolacca a.merica- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4规格（210X297公釐） -4 - 46465 6 jA7 ___._B7_ 五、發明説明（2 ) na，內毒素及脂多醣。然而這些突變原依據其來源及純化 方法有其分子及品質多樣性之問題，且在欲求劑量及固定 I FN — r誘導能力上有生產上的困難。此外，這些突變 厚大部份投予至活體時會誘生不佳的副作用，且其中某些 甚至會顯出毒性。因此，此種突變厚直接投予至活體實質 上難以誘導IFN—r之產製。 本發明者在老鼠肝中發現一種可誘導IFN-7產製 之物質，此係經由在由晡乳動物產生之細胞動素上研究而 得*其利用各種純化方法分離物質，包括以管柱層析爲主 要技術，研究特色及特點，並顯示其實際上是一種具下列 物化特性之蛋白質 (1 )分子量： 在硫酸十二酯鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳上（SDS-PAGE)呈現19，000±5，000道耳吞之分子 量： (2 )等電點（p I ) 在色譜聚焦上呈現4. 8±1. 0之等電點； 經濟部中央標準局貝工消費合作社印f (請先閲讀背面之注意事項再1寫本頁) (3 )部份胺基酸序列 具有SEQ ID No. 4及5所示之部份胺基酸 序列；及 (4 )生物活性 可誘導免疫勝任細胞產製I FN — r » 可結論道，其實際上是一種新穎的物質，因爲目前尙 知具有這些物化特性之蛋自質。本發明者繼續在老鼠肝細 本紙張尺度逋用中國國家標率（CNS ) A4规格（ 210X297公釐) ~~~~~~~~ -5 - 464656 A/B7 五、發明説明（3 ) ~ ~ 胞上研究，並發現itb物質之DNA由471__對_ 成*且編碼SEQ id N〇3所示之胺基酸序列。 SEQ ID N0:3： AAC TTT GGC CGA CTT CAC TGT ACA ACC GCA GTA ATA CGG AAT ΑΤΑ AAT 4S Asm Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val 工le Arg Asri lie Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC GTT GAC AAA AGA CAG CCT GTG TTC GAG GAT ATG 96 Asp Gin Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gin Pro Val Phe Glu Asp Met 20- 25 30 ACT GAT ATT GAT CAA AGT GCC AGT GAA CCC CAG ACC AGA CTG ATA ATA 144 Thr Asp He Asp Gin Ser Ala Ser Glu Pro Gin Thr Arg Leu lie lie 35 * 40 45 TAC ATG TAG AAA GAC AGT GAA GTA AGA GGA CTG GCT GTG ACC CTC TCT 192 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 GTG AAG GAT AGT AAA AYG TCT ACC CTC TCC TGT AAG AAC AAG ATC ATT 240 Val Lys Asp Ser Lys Xaa Sei Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys lie· lie 65 70 75 80 TCC TTT GAG GAA ATG GAT CCA. CCT GAA AAT ATT GAT GAT ATA CAA AGT 288 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn lie Asp Asp lie Gin Ser 85 90 95 GAT CTC ATA TTC TTT CAG AAA CGT GTT CCA GGA CAC AAC AAG ATG GAG 336 Asp Leu He Phe Phe Gin Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu . 100 105 110 TTT GAA TCT TCA CTG ΤΛΤ GAA GGA CAC TTT CTT GCT TGC CAA AAG GAA 384 Phe Glu Ser Ser Leu Tyr.Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gin Lys Glu 115 、 L2Q 125 GAT 'GAT GCT TTC-AAA-GTC ATT CTG AAA-AAA—AAG GAT GAA AAT GGG GAT 432 Asp Asp Ala Phe Lys Leu lie heu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 AAA TCT GTA ATG TTC ACT CTC ACT AAC TTA CAT CAA AGT 471· Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gin Ser 145 150 155 經濟部中央標準局另工消费合作社印製 依據道些發現，本發明者進一步在人類肝細胞上研究 ’且彳f1到一種編碼另一新穎物質之DN A，此物質可誘導 免疫勝任細胞產製I FN- γ。其顯示此事實上是—種多 肽 > 且解碼與DNA發其具有SEQ ID No 不之胺基酸序列。 - 1所

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46465 6 A7 B7 五、發明説明（4 ) SEQ ID N0:1 ., Tyr Phe Gly Lvs Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val He Arg Asn Leu Asn 1 >5 l〇 15 Asp Gin Val Leu .Phe lie Asp Gin Gly Asn. Arg Pro Leu Phe Glu Aisp 20 25 30 > . Met Thr Asp Ser Asp Gys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr lie Phei lie 35 40 45 工le Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gin Pro Arg Gly Met A1红 Val Thr lie 50. 55 60 Ser Val Lys Cys Glu Lys lie Ser Xaa Leu Ser Cys Glu Asn Lys lie 65 70 75 80 lie Ser Phe Lys.Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn 工le Lys Asp Thr Lys 85 90、.. . . 95 Ser Asd He He Phe Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys e 100 105 . Ϊ10 : Met Gin Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu .115 120 125 1 Lvs Glu ΑΓ9 ASP Leu Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys Glu Asp Glu-Leu 13。 135 140 1 Gly Asd Arg Ser He Met Phe Thr Val Gin Ash G.lu Asp 145 '' 15〇 155 ·-> (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 其將D N A引入大腸桿菌中以表現多肽，.並可在培養 基中以相當高產率產製之。 如所述，多肽具有誘導免疫勝任細胞產製I FN - r 之特性，且預期可應用於各種領域上以爲I F N- y之誘 導劑，抗病毒劑，抗腫瘤劑，抗菌劑，免疫調控劑，及血 小板加強劑。一般而言’當欲將多肽納入藥物中’發展出 可將生物活性多肽有效地純化成具相當高純度者之方法， 以及同時分析許多樣品是不可避免的。雖然使這些純化及 分析可行之最適合的物質是單株抗體’但尙未獲得與多肽 訂 具特異性者。 近來，已發展出含有細胞動素爲有效組份之某些藥物 ，如α —干擾素’卢一千擾素’ a_I FN，TNF —彡 ，間白素2及間白素12 ’以及I F N_r，其他的則對 本紙张尺度適用中國國€票準（<;：奶）八4说格_(210乂297公釐> 464656 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（5 ) 其確實用法尙在開發中。這些藥物可充作抗腫瘤劑，抗病 毒劑，抗菌劑，及免疫調控劑，及若必要時可配合其他的 藥物。 和化學合成藥物不同的，上述藥物可長期地且容易地 投予至患者而不致誘生不良的副作用，此也爲最大特色， 但缺點是治療效果通常很低，若單獨使用時無法實質上緩 和或治癒疾病，此點和疾病型式及接受治療之症狀大大有 關。因此，此種藥物目前已知，可在治療如惡性腫瘤之嚴 重疾病時充作化學合成劑之添加劑，或充作延長病患壽命 之方法》 發明要點 基於上述，本發明目的是提出一種新穎的多肽，其可 誘導免疫勝任細胞產製I FN— r。 本發明另一目的是提出可編碼此多肽之DNA。 本發明進一步目的是提出一種可複製的重組體D NA ，含有DNA及自我複製的載體。 本發明又一目的是提出一種轉形細胞，由重組體 DNA引入適合的宿主而得。 本發明另一目的是提出利用轉形細胞製備多肽之方法 〇 本發明另一目的是提出與多肽具特異性之單株抗體。 本發明另一目的是提出可產製單株抗體之融合瘤。 本發明進一步目的是提出製備單株抗體之方法。 本紙张尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（2〗0X297公釐） ---l· I-^----^ 裝-- (請先閲讀背面之注意事項再44.寫本頁) -訂. -8 - 464656 A7 ___B7 _ 五、發明説明（6 ) 又另一目的是提出利用單株抗體純化多肽之純化方法 〇 (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明另一目的是提出利用單株抗體分析多肽之偵測 方法。 本發明另一目的是提出針對I F N_ T敏感疾病之藥 物。 本發明的第一個目的可由多肽達成，其具有S E Q ID No. 1之胺基酸序列或其同源的胺基酸序列。 本發明第二目的由編碼多肽之DNA達成》 本發明第三目的由可複製的重組體DNA達成》其含 有DNA及自我複製之載體。 本發明第四目的由轉形細胞可達成，轉形細胞得自可 複製的重組體DNA引入適合的宿主而成。 本發明的第五目的由蛋白質之製法可達成，其中包括 將重組體DNA引入宿主中，於營養培養基中培養轉形細 胞，並自生成之培養基中收集所形成之蛋白質。 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 本發明的第六個目的由與多肽具特異性之單株抗體可 達成，此多肽具有SEQ I D No. 1中之胺基酸序 列或與之同源之胺基酸序列，且其可誘導免疫勝任細胞產 製 I F N - r。 本發明的第七個目的由可產生單株抗體之融合瘤可達 成。 本發明的第八個目的可由製備單株抗體之方法而達到 ’此方法包括在試管內培養可產製抗體之融合瘤，即於營 本紙ifc尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -9 _ 464656 經濟·部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（7 ) 養培養基中，或於活體內即於動物體內，並自生成之培養 物或體液中收集抗體。 本發明的第九個目的由多肽之純化方法達成，此方法 包括將單株抗體與包括有多肽及供多肽吸附之雜質之混合 物接觸，並吸附抗體中之多肽。 本發明第十個目的可由多肽之偵測方法達成，此方法 包括樣品與單株抗體接觸，以免疫學上與之反應。 本發明的第十一個目的由藥學作用物可達成，其中含 有多肽爲有效組份。 附圖說明 第1圖爲肽片段之HP L C溶離型式^其由衍自老鼠 之蛋白質經胰蛋白酶化而得。 第2圖爲本重組體DNA PHI GIF之辩構圖。 第3圖爲本重組體DNA PKGFHH2之結構圖 〇 第4圖爲西方墨點圖’其中顯示本純化的多肽及人類 間白素12與本單株抗體Η—1mAb之反應性。 Η I G I F cDNA:編碼本多肽之cDNA， KGFHH2 cDNA :編碼本多肽之cDNA， Ptac:tac啓動基因’ r rnBTlT2 :核糖體RNA操縱子之絡結基因 G S T :穀胱甘肽5轉移酶基因 AmR:氨笮青黴素抗受基因 本紙珉尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（2丨OX297公楚） ——^---^----II C (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -10 - 4 6 4 6 5 6 A7 B7 真、發明説明（8 ) pBR322ori :大腸桿菌之複製起始點 發明說明 如上文所討論的，依據本發明之多肽具有異於傳統多 肽之胺基酸序列，且當單獨或加上輔因子作用在免疫勝任 細胞時可誘導I FN — τ之產製。 依據本發明之D NA可表現本多肽之產製，即將 DNA引入可自我複製之載體中以形成重組體DNA，且 通常是將重組體D N A引入可無困難增殖但無法產製多肽 之宿主中。 一般而言，依據本發明之可複製的重組體DN A可表 現本多肽之產製，即將其引入可無困難增殖但無法產製多 肽之宿主中。 轉形細胞當培養時可產製本多肽。 本多肽可以欲求之量容易地獲得，即依本發明方法培 養轉形細胞。 經濟部中夬標準局員工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明以新穎多肽之發現爲基礎，其可誘導免疫勝任 細胞產製I FN_r。在研究由哺乳動物產生之細胞動素 中，本發明者發現，在老鼠的肝中存在有可誘導I FN — 7產製之新穎的蛋白質。其利用二種以上的純化方法 分離控制，包括主要的管柱層析，並決定部份胺基酸序列 。依據序列，其利用分離自老鼠肝細胞的mRNA爲模板 ，化學合成引子，並在引子存在下以轉錄作用一聚合酶鏈 反應（RT — P CR)處理蛋白質，以收集編碼部份蛋白 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -11 - 46465 6 A7 B7 五、發明説明（9 ) 質之DNA片段。利用此DNA片段爲探針，其致力研究 另外製備自mRNA的一個c DNA庫，並得到由4 7 1 個鹼基對所組成之DNA片段，且有SEQ ID No. 3之鹼基序列。鹸基序列之解碼顯示，分離自老鼠 肝之蛋白質由1 5 7個胺基酸所組成，且具有S E Q ID No. 3之胺基酸序列，在此符號^Xaa" 表 示^甲硫胺酸"或 >蘇胺酸# 。 依據這些發現*本發明者進一步研究衍自人類肝細細 胞之mRNA，且發現此存在有一個新基因，其編碼的多 肽可誘導免疫勝任細胞產製I F N - r。此基因含有如 S E Q I D N 〇 . 2所示之鹼基序列，且其解碼顯示 其編碼的多肽具有如SEQ ID No.1所示之胺基 酸序列，在此符號^Xa a"表示’異白胺酸"或t蘇胺 酸，。 (满先閱讀背面之注$項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 SEQ ID N0:2: ；TACTTTGGCA AGCTTGAATC TAAATTATCA GTCATAAGAA ATTTGAATGA CCAAGTTCTC 60 TTCATTGACC AAGGAAATCG GCCTCTATTT GAAGATATGA CTGATTCTGA CTGTAGAGAT 120 AATGCACCCC GGACCATATT TATTATAAGT ATGTATAAAG ATAGCCAGCC TAGAGGTATG 180 GCTGTAACTA TCTCTGTGAA GTGTGAGAAA ATTTCAAYTC TCTCCTGTGA GAACAAAATT 240 ATTTCCTTTA aggaaatgaa tcctcctgat aacatcaagg atacaaaaag TGACATCATA 300 TTCTTTCAGA GAAGTGTCCC AGGACATGAT AATAAGATGC AATTTGAATC TTCATCATAC 360 GAAGGATACT TTCTAGCTTG TGAAAAAGAG AGAGACCTTT TTAAACTCAT TTTGAAAAAA 420 GAGGATGAAT TGGGGGATAG ATCTATAATG TTCACTGTTC AAAACGAAGA C 471 用來解析SEQ ID No.1及2中胺基酸序列 及鹼基酸序列之技術綜合於下： (1 ) 自老鼠肝細胞中分離出可誘導免疫勝任細胞產製 I F N~ r之蛋白質，並混合傳統化方法以高度純化之， 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） -12 - 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 4 6465 6 A7 _B7___ 五、發明説明（10) 方法中以層析法爲主要技術； (2 ) 所生成之經純化的蛋白質以胰蛋白酶水解，並自 生成之混合物中分離出2個多肽片段，並決定胺基酸序列 4 (3 ) 自老鼠肝細胞中，收集mRNA並充作逆轉錄作 用一聚合酶鏈反應（RT — P CR)之模板，並在以上述 部份胺基酸序列爲基礎化學合成之寡核苷酸爲引子存在下 得D N A片段。利用以道些部份胺基酸序列爲基礎化學合 成之寡核替酸爲探針來篩選片段，之後收集可編碼部份蛋 白質之DNA片段； (4) cDNA庫予以標記，並與在mRNA爲模板製 備之生成的c D NA庫雜交，再篩選出可呈現強雜交作用 之轉形細胞； (5 ) 自轉形細胞中分離c DNA.，其鹼基序列決定並 解碼之。經解碼的胺基酸序列與部份胺基酸序列比較顯示 ，蛋白質具有SEQ ID No. 3之胺基酸序列，且 於老鼠中，SEQ I D N 〇 . 3之鹼基序列可編碼胺 基酸序列； (6) 製備具SEQ ID No. 3鹼基序列之 DNA片段，標記之並以DNA庫雜交之，後者是利用衍 自人類肝細胞之mRNA爲模板而數備，之後選出可呈現 強裂雜交作用之轉形細胞；及

(7) 自轉形細胞中製備cDNA，決定鹼基序列並解 碼之，結果顯示本多肽是一種人類多肽，包括具S E Q 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（2丨0><297公瘦）

4 6 4 6 5 S 經濟部中央標年局員工消费合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（11) iD No. 2鹼基序列所編碼之SEQ ID No. 1胺基酸序列者。 ' 經由長期研究，本發明者發現，本多肽可誘導免疫勝 任細胞產製IFN — r，且由SEQ ID No. 1可 證知其與傳統已知之多肽不同》本多肽包括天然的及重組 體多肽’只要其具有SEQ ID No.1之胺基酸序 列或與之同質者。以不改變本多肽固有的生物活性之其他 胺基酸置換SEQ ID N 〇 . 1中一個以上的胺基酸 ，可得與SEQ ID No.1胺基酸序列同質之變型 。依據DNA欲引入之宿主（即使使用的是相同的DNA )，及用於含有DMA之轉形細胞之培養溫度及pH條件 及組份，也可形成變型，其中其在SEQ ID No. 1近N —及/或C -末端處缺乏一個以上的胺基酸，或在 SEQ ID No.1近N-末端處經由DNA表現後 宿主內部酵素之修飾含有額外的一個以上的胺基酸，但仍 可保持多肽之固有生物特性。本多肽包括此镡塵型.，只要 其，可誘導免疫勝任細胞產製I FN — r。 本多肽之製備可在培養基中培養含編碼多肽之D N A 之轉形細胞，再自生成之培養基中收集所產製之多肽》本 發明中可使用之轉形細胞，其可由如具SEQ ID No. 2鹼基序列之DNA，與之同質之鹼基序列，及與 鹼基序列互補者引入宿主中而得。利用遺傳密碼之簡併性 ，可以其他鹼基置換這些鹼基序列中的—個以上的鹼基， 而不改變本多肽之胺基酸序列。爲表現宿主中經由使用此 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

tr -14 - 46465 6 A7 B7 五、發明説明（12 ) DNA之多肽之產製，編碼本多肽或其變型之鹼基序列， 其中一個以上的鹼基可爲其他鹼基置換。 任何DNA均可應由於本發明中，只要其具有這些鹼 基序列之一，不論其來源爲何，即來自天然來源或人工合 成。天然來源包括如人類肝細胞，由此可得到含有具 SEQ ID No. 6鹼基序列之DNA之基因。 IJ-------- \ J (请先閲绩背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局貞工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Α4規格（210X297公釐） -15 - 4 b 4 6 5 6 A7 B7 五、發明説明（13) SEQ ID NO:6: - GCCTGGACAG TCAGCAAGGA ATTGTCTCCC AGTGCATTTT GCCCTCCTGG CTGCCAACTC TGGCTGCTAA AGCGGCTGCC ACCTGCTGCA GTCTACACAG CTTCGGGAAG AGGAAAGGAA CCTCAGACCT TCCAGATCGC TTCCTCTCGC AACAAACTAT TTGTCGCAGG AATAAAG ATG GCT GCT GAA CCA GTA GAA GAC AAT TGC ATC AAC TTT GTG GCA ATG Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys lie Asn Phe Val Ala Met 1 5 10 . 15 AAA TTT ATT GAC ΑΛΤ ACG CTT TAC TTT ATA GCT GAA GAT GAT GAA AAC Lys Phe lie Asp Asn Thr Leu Tyr Phe lie Ala Glu Asp Asp Glu Asn 20 25 30 CTG GAA TCA GAT TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val lie 35 40 45 AGA AAT TTG AAT GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG CCT Arg Asn Leu hsn Asp Gin Val Leu Phe lie Asp Gin Gly Asn Arg Pro 0 0 7 5 6121722 73 2 321 9 6 3 / · · · (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝---- 經濟部中央標準局負工消费合作社印製

50 55 60 CTA TTT GAA GAT ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GAT AAT GCA CCC CGG Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg 65 70 75 BO ACC ATA TTT ATT ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC CAG CCT AGA GGT ATG Thr lie Phe lie lie Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gin Pro Arg GXy Met 85 90 95 GCT GTA ACT ATC TCT GTG AAG TGT GAG AAA ATT TCA AYT CTC TCC TGT Ala Val Thr lie Ser Val Lys Cys Glu Lys lie Ser Xaa Leu Ser Cys 100 105 110 GAG AAC AAA ATT ATT TCC TTT AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC GXu Asn Lys lie lie Ser Phe Lys Glu Met: Asn Pro Pro Asp Asn lie 115 120 125 AAG GAT ACA ΛΛΛ AGT GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA Lys Asp Thr Lys Ser Asp lie lie Phe Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly 130 135 140 CAT GAT ΑΛΤ AAG ATG CAA ΤΊΤ GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT His Asp Asn Lys Met Gin Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu GXy Tyr Phe 145 150 155 160 CTA GCT TGT GAA ΑΛΑ GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA AAA Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys 165 170 175 GAG GAT GAA TTG GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT CAA AAC GAA Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser He Met Phe Thr Val Gin Asn Glu 180 185 190 GAC TAGCTA TTAAAATTTC ATGCCGGGCG CAGTGGCTCA CGCCTGTAAT CCCAGCCCTT Asp TGGGAGGCTG AGGCGGGCAG ATCACCAGAG GTCAGGTGTT CAAGACCAGC CTGACCAACA TGGTGAAACC TCATCTCTAC TAAAAATACT AAAAATTAGC TGAGTGTAGT GACGCATGCC CTCAATCCCA GCTACTCAAG AGGCTGAGGC AGGAGAATCA CTTGCACTCC GGAGGTAGAG gttgtggtga gccgagattg caccattgcg ctctagcctg ggcaacaaca gcaaaactcc ATCTCAAAAA ΑΤΑΑΑΑΤΛΑΑ TAAATAAACA AATAAAAAAT TCATAATGTG AAAAAAAAAA AAAAAAAA 7 41 5 6 4 5 5 3 1 1 6 60 57 705' 753 2 1 θ 222220 7 3 9 5 12 8 9 9 0 11 111 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 4〇4656 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A7 __B7 五、發明説明（14 ) 製備步驟如下：在蔗糖梯度緩衝溶液上將商品化之人 類肝mRNA並添加ρ ο 1 y (A)分級分離，以分離山 終純化的mRNA »令逆轉錄_及聚合酶作用在充作模板 之mRNA上，以形成雙股c DNA .，將c DNA引入適 合的可自我複製載體內，再將生成的重組體DNA引入適 合的宿主內，如大腸桿菌》於營養培養基中培養生成之轉 形細胞，以集落雜交方法收集經增殖之轉形細胞，其中含 有可編碼本多肽之DNA »依據本發明之DNA，可由傳 統方法處理轉形細胞而得。如，爲人工產製本DNA，其 製備可在以SEQ ID No. 2之鹼基序列爲基礎下 化學合成，或將編碼SEQ ID No. 1胺基酸序列 之DNA引入適合的載體中以形成重組體DNA，重組體 D NA引入適合的宿主內，於營養培養基中培養生成之轉 形細胞，自培養物中分離增殖的細胞，並自細胞中收集含 有主題DNA之質體》 —般而言，DNA以重組體DNA型式引入宿主中。 此種重組體D Ν Α逋常含有D ΝΑ及自我可複製的載體。 具其一般可以重組體D Ν Α技術容易地製備，此指若只有 D NA時。此種自我可複製之載體實例有質體載體，，如 PKK223 — 2，PGEX-2T，pRL-r， P B T r p 2 DNA，pUBll〇，YEpl3，

Ti質體，Ri質體及pBI121»在這些載體中， PKK223-2，PGEX-2T，pRL-λ， P B T r ρ 2 DNA，pUBl l〇 及 YEpl3 適用 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-17 - 6 46 5 6 A7 B7 五、發明説明（15) 於當本DNA於原核細胞中表現時，如酵母及其他如大腸 桿菌及枯草桿菌微生物，而在質體* R i質體及 pBI121適用於在動物及植物細胞中表現。 爲將本DNA引入這些載體中，可任意使用本領域中 所使用之傳統方法：含有本DNA及可自我複製載體之基 因以限制酶及/或超音波解離，再連接生成之D N A片段 及載體片段。爲解離基因及載體，可特異作用在核笹酸上 之限制酶，更特別的是I I型限制酶，如 S a u 3AI，Eco R I » H i n d III，Bam HI，Sal I » X b a I，Sac I 及 Pst I ，有助於DNA片段及載體片段之連接。爲連接DNA 片段及載體片段，其於必要時先回冷，再以D ΝΑ連接酶 於活體內或於試管內處理。如此得到的重組體DNA可容 易地引入適合的宿主中，且此經由轉形細胞之培養便 DNA可無限制地複製。 經濟部中央標隼局負工消费合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再卷寫本頁) 本發明中可使用的重組體D N A可引入適合的宿主中 ，如酵母及其他如大腸桿菌及枯草桿菌之微生物中：當以 大腸桿菌微生物爲宿主時，其可在重組體D NA及鈣離子 存在下培養，而當以枯草桿菌爲宿主時*可採用勝任細胞 方法及原生質體方法。爲選殖主題轉形細胞，其可由集落 雜交法選擇，或在營養培養基中培養所有的轉形細胞，再 篩選出所產生之多肽可誘導免疫勝任細胞產製I F n - r 者。 如此得到的轉形細胞，當在營養培養基中培養時，可 本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -18 - 4 6 4 6 5 6 A7 —_B7__ 五、發明説明（16 ) , 於細胞內或細胞外產生本多肽。此種營養培養基之實例有 一般呈液態型式者，其中含碳源，氮源，及礦物質，以及 胺基酸及/或維生素爲微量營養物。可用於本發明之碳源 包括糖類，如澱粉，澱粉水解產物，葡萄糖*果糖及蔗糖 。可用於本發明之氮源包括含氮之有機及無機化合物，如 氨及其鹽類，尿素，硝酸鹽，蛋白臃，酵母浸膏，脫脂大 豆，玉米浸漬液及牛肉浸眘。轉形細胞接種至營養培養基 中，並在25-6 5 °C及pH5 — 8下培育約1 — 10天 ，且在需氧條件下以攪動一需氣方法等進行，以得含本多 肽之培養物。雖然培養物可完整地充作I F N - r誘導物 ，但其若必要時可接受超音波震盪及/或細胞溶解酵素以 瓦解細胞，再過濾或離心生成之懸浮液以移去完整的細胞 及細胞雜屑，並進一步純化生成的含有本多肽之上清液。 可用於本發明之純化方法，如通常用於純化具生物活性物 質領域者，即濃縮，鹽析，透析，分離沈降，凝膠過濾層 析，離子交換層析，疏水性層析，親和力層析，色譜聚焦 ，凝膠電泳，及等電電永，及若必要時二種以上可混合使 經濟部中央標準局負工消费合作社印袋 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 用。所生成的含有本多肽之純化溶液可濃縮及/或冷凍乾 燥成液體或固體，以符合最終用途。 如上述，本多肽具有誘導免疫勝任細胞產製I F N- r之活性。因爲此，本多肽可任意充作治療及/或預防劑 ，如用於病毒疾病如A I D S及性病濕疣；惡性腫瘤如腎 癌，肉芽腫，蕈樣真菌病及腦部腫瘤；及免疫失調症，如 風濕性關節炎及過敏症。 冢紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4规格（210X297公釐) -19 - 4 6 4 6 5 6 A7 B7 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 五、發明説明（ 17) 本 多肽 可 在 營 養 培 養 基 中 共 存 > 以 誘 導 免 疫 勝 任 細 胞 產 製 I F N — r » 或 可 直 接 投 予 至 晡 乳 動物 中 以 治 療 及 / 或預 防 I F N — r 敏 感 性疾病 〇 在 刖 者 > 分 離 白 哺乳動 物 周 邊 血 液 之 白 血 球 或 已 開 發 之 免疫 勝 任 伽 細 胞 如 Η Β L — 3 8 細 胞 > Μ 0 細 胞 9 Ju rkat 細胞 Η ι 1 T 7 8細胞 1 E L 4 細 胞 及 L 1 2 — R 4 細 胞 可 懸 浮於 營 養 培 養 基 中 » 其 內 含 有 每 毫 升 約 0 1 毫 微 克 至 約 1 微克 _好約 1 — 1 0 0 毫 微克 本 多肽 以 誘 導 I F N — r 之 產 製 Ρ 若 必 要 時 此 種 營 養 培 養 基 中 可 添 加 Τ — 細 胞刺激 物 * 如 突 變 原 * 間 白 素 — 2 及抗 — C D 3 抗 體 > 且 細 胞在約 3 0 1 4 0 °c 及 P Η 約 5 一 8 下 培 養 約 1 — 1 0 0 小 時 同 時培 養 基 再 以 新 ff\K 鮮 的 更 換 之 σ I F N _ r 可 以 般 用 於 純 化 具 生 物 活 性 物 質 之 種 以 上 的 傳 統 方 法 白 生 成 之 培 養 物 中 得 到 1 如 濃 縮 鹽 析 透 析 分 離 沉 澱 作 用 凝 膠 過 濾 層 析 離 子 交 Γ.Α» 換 層 析 色 譜 聚 焦 法 凝 膠 電 泳 及 等 電 電 泳 0 爲 治 療 及 / 或 預 防 I F N r 敏 感 疾 病 本 I F Ν — 7 誘 導 劑 可 直 接 投 予 至 哺 乳 動 物 如 » I F N — 7 誘 導 劑 於 調 和 成 適 合 型 式 後 可 P 服 至 哺 乳 動 物 或 皮 內 皮 下 肌 內 靜 脈 內 或 腹 膜 內 注 入 晡乳 動 物 中 0 可 以 本 多肽 投 予 之 哺乳動 物 並 不 限 於 人 類 也 包 括 其 他 動 物 如 老 鼠 > 大 鼠 > 倉 鼠 i 兔 子 狗 貓 牛 馬 » 山 羊 綿 羊 豬 及 猴 子 〇 由 於 本 多肽 具 有 強 的 I F N — r 可 誘 導 力 及 極 低 的 毒 性 僅 以 少 量 即 可 容 易 地 誘 導 I F N — r 產 製 而 以 相 當 高 劑 量 投 予 至 哺 乳 動 物 時 也 不 會 造 成 嚴 重 的 副 作 用 0 因 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -20 - 464656 A7 B7 五、發明説明（18 ) 此，本多肽可有益地平穩誘導欲求量之I F N-r，而勿 需嚴格控制劑量水平。勿庸多言*本多肽達到藥物所需求 的安全性。 依據本發明之單株抗體可特異地與具特異胺基酸序列 之多肽反應。 依據本發明之融合瘤當於試管內培養時可產生單株抗 體。 (132. 依據本發明單株抗體之製備，可促進抗體以欲求劑量 產製。 本發明多肽之純化方法，可自含有多肽及雜質之混合 物中以相當高品質型式有效率地回收。 在本發明的一個偵測方法中，僅多肽可與樣品免疫上 反應。當以適當的技術偵測免疫反應水平時，多肽可定性 或定量地分析。 依據本發明之單株抗體包括與具有s EQ ID N 〇 . 1胺基酸序列或與之同質之多肽特異者，而與其來 經濟部中央標準局負工消费合作社印掣 (請先閲讀背面之注意事項再卷寫本頁} 源，源頭及種類無關。同質之胺基酸包含以其他胺基酸置 換SEQ ID No. 1中一個以上的胺基酸而得者， 將一個以上的胺基酸加入SEQ ID No. 1胺基酸 N —及/或C —未端者，或在SEQ ID No. 1胺 基酸序列之N_及或C-末端中喪失一個以上胺基酸者， 而實質上並末喪失免疫勝任細胞之I FN — r產製誘導活 性。 依據本發明之單株抗體，可利用多肽或其抗原片段而 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -21 - 464656 A7 ___B7__ 五、發明説明（19 ) 得：如，利用可無限增殖之哺乳動物細胞及收集自以片段 免疫之哺乳動物之抗體一產製細胞可製備融合瘤而得抗體 ，選出可產生單株抗體之融合瘤純系，並於活體內或試管 內培養純系。 充作抗原之多肽可由培養轉彤細胞而得，此中已引入 可編碼SEQ ID No.1胺基酸序列之DNA及其 同質者，且通常其可完整地或以部份純化製式被使用。抗 原片段可以化學方法製備，或由完全或部份純化之多肽經 酵素水解而得，或在SEQ ID No.1胺基酸序列 爲基礎下以肽成法合成之。 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 (谙先閲讀背面之注意事項#,填寫本頁) 本發明中可使用之免疫接種方法包括有傳統的，如抗 原單獨的或配合適量的估劑，靜脈內，皮內，皮下，或腹 膜內注入哺乳動物，並在預先期間中給予。任何的哺乳動 物均可應用於本發明中並無特殊限制，只要可得到欲求的 抗體產製細胞即可，和動物種類，體重及性別無關。一般 而言，齧齒類如大鼠，老鼠及倉鼠均可使用，且由此可選 擇最適合的動物，同時評估與上述可無限增殖晡乳動物之 相容性。依據所使用動物之種類及體重，抗原之總劑量通 常在每雙動物約5 — 5 0 0微克範團，並以1 一 2週之間 隔投予2 _ 5次。於最後一次投藥後3 — 5天，取出動物 之脾臟並分散或脾細胞懸浮爲抗體一產製細胞。 在上述中所得之抗體產製細胞及哺乳動物細胞，經融 合成爲含有主題融合瘤之細胞融合混合物》可無限增殖之 哺乳動物細胞包括來自老鼠骨髓瘤之細胞株，如P 3 — _承紙浪尺度適用;國國家標準（CNS ) A4规格（210Χ297ϋ -22 - 46465 6 A7 B7 五、發明説明（20) NSl— Ag4 — 1 細胞（ATCC TIB18)， P3-X63-Ag8 細胞（ATCC TIB9)，

SP2/〇-Agl4 細胞（ATCC CRL 1581)，及其空變株。本發明中可使用之細胞融合方 法包括利用電脈衝及細胞融合—促進劑之傳統方法，如聚 乙二醇及仙台（Sendai)病毒（Η V J ):如抗體一產 製細胞及此種晡乳動物細胞’以約1:1至1:1〇之比 例懸浮於含有融合促進劑之融合介質中，並在約3 0 -4 0°C下培育約1 - 5分鐘》傳統的介質，如最低營養要 求培養基（MEM) ，RPM1 640培養基’及 Iscove’s經修飾的 Dulbecco’ s培養基（Ϊ MDM) .» 可 有益地充作融合培養基而勿需添加如牛血清一類之血清。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 爲選擇主題融合瘤，生成的細胞融合混合物轉移至篩 選培養基中，如HAT培養基，並在約3 0 — 4 0°C下培 育約3天至3週使融合瘤以外的細胞死亡。融合瘤以一般 方式培養，再分析分泌於培養基中之抗體與多肽之反應活 性》此種分析法實例爲傳統偵測抗體之方法，如酵素免疫 分析法，放射免疫分析法，及生物分析法。如”Tan-Clone-Kotai-Jikken-Manual (Experimental Manual for Monoclonal Antibody)11，由 Sakuji TOYAMA 及 Tamie ANDO 編輯，由 Kodansha Scienti. fic，Ltd.，Tokyo， Japan出版，pp. i〇5 —152(1991)，此中描述各種方法。融 合瘤其產生與多肽具特異性之抗體，可利用有限稀釋法容 易地選殖得到依據本發明之融合瘤》 _本1氏张尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） -23 - 經濟部中央標準局貝工消费合作杜印製 4 6 465 6 a? B7 ； 五、發明説明（21) 依據本發明之單株抗體，可經由活體內即動物內’或 試管內培養融合瘤而得β培養時可採用培養哺乳動物細胞 之傳統方法，如：若在活體內培養時’可自動物之腹水及 /或血液中收集單株抗體。下文所述之融合瘤Η— 1及Η _2具有加強單株抗體產製之能力’且具有可在活體內及 試管內容易地培養之特色。用來純化抗體的傳統方法’一 般可用於自培養物，動物腹水及血液中收集單株抗體之用 。此種實例包括：鹽析，透析，過濾，濃縮，離心’分離 沈降，凝膠過濾層析*離子交換層析，親和力層析，髙性 能液相層析（HPLC)，凝膠電泳，及等電電泳，且若 必要時可二種以上組合使用。所生成之絡純化的單株抗體 可濃縮或乾燥成液體或固體產物型式以符合其最終用途。 本發明之單株抗體即可用於在免疫親和力層析上純化 本多肽。此一純化技術包括將單株抗體與含有多肽及雜質 如多肽以外之蛋白質之混合物接觸，以將多肽吸附在抗體 上，並自抗體解吸附多肽。這些步驟通常在水性介質中進 行。單株抗體使用時通常呈在凝膠水不溶性載劑上之固化 型式，其再充填於圓柱管柱內。轉形細胞之培養物或其部 份純化產物充填至管柱，以將多肽實質地吸附在單株抗體 上》改變抗體周圍的ρ Η值可將多肽容易地自抗體上解析 。如，於使用I gG類單株抗體之例子時，經吸附之多肽 可解析空在酸性p Η下自管柱中溶離，通常是p Η 2 — 3 ，而於使用I gM類單株抗體時，多肽在鹼性ΡΗ下解析 並自管柱中溶雜，此通常爲ρΗΙΟ—1 1。 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X29*7公襲） 一 24 _ 一j---^----/Λ^.-- '·.. - (請先閲讀背面之注$項1氣寫本頁) 訂

4 6 4 6 5 6 A7 _B7_ "X、發明説明（22 ) 依據本發明之純化方法，可使多肽達到相當髙的純化 水平，但僅最少的勞力費用及時間。如上述，多肽具有誘 導免疫勝任細胞產製I f N— r之活性，且經純化之多肽 可充作細胞培養中之I FN— r誘導劑以產生I FN — r ，並用於治療及/或預防病毒疾病，如A I D S及性病濕 疣，惡性腫瘤如腎癌，肉芽腫，葷樣真菌病，及腦腫瘤， 以及免疫疾病如風濕性關節炎及過敏。若多肽具有加強殺 手細胞細胞毒性之活性時，其可配合間白素2及/或腫瘤 壞死因子使用以改善治療作用，並減少在惡性腫瘤過繼性 免疫療法中之副_作用，此中之惡生腫瘤包括固體腫瘤如肺 癌，腎癌，及乳癌。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 依據本發明之單株抗體在各種領域中有相當廣的應用 性，此指在需多肽偵測之領域。當用於經標記之免疫分析 法時，如放射免疫分析法，酵素免疫分析，及螢光免疫分 析，單株抗體可立即且正確地定性及定量偵測樣品中之多 肽。在此分析中，單株抗體以放射性同位素，酵素及/或 螢光物質在使用前予以槺記之。抗體可與多肽特異地反應 ，以呈現免疫反應，並由偵測對這些經標記物質之免疫反 應水平可正確地偵測樣品中少量的多肽。與生物分析比較 ，經標記之免疫分析法有下列特色：其可周時分析許多樣 品，減少分析時間及勞力花費，並以柑當高之正確性提供 數據。因此，本偵測方法可用於控制多肽之產製步驟及對 終產物進行品質管制。雖然本發明並未詳述本身和此發明 無關之標記單株抗體之技術或標記分析法，這些技術則詳 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210Χ297公釐） -25 - 經濟部中央標準局負工消费合作杜印製 464656 A7 ____B7___ 五、發明説明（23 ) 述於"Enzymeol Immunoassay"由 P.Tijssen,編輯，Eiji ISHIKAWA 翻譯，Tokyo-Kagaku-Dojin出版，pp. 196-348( 1989) ° 本用於敏感疾病之作用物，當投予至人體時可誘導免 疫勝任細胞產製IFN - 7，並對I FN— r敏感疾病展 現治療及/或預防作用。當多肽具有加強殺手細胞胞毒性 之活性或誘導殺手細胞形成時，其可在治療嚴重疾病上展 現強的作用，包括惡性腫瘤。 用於本發明之多肽具有SEQ ID No. 1之胺 基酸序列（此中a#符號代表'具白胺酸^或^蘇 胺酸〃）或其同質的胺基酸序列，且可誘導免疫勝任細胞 產製I F N - r。此種同質的胺基酸序列實例包括相當於 SEQ ID No. 1胺基酸序列，其中一個以上的胺· 基酸以其他的胺基酸序替換，及其中一個以上胺基酸加至 N —及/或C—未端者，以及其中一個以上在N -及/或 C 一末端中的胺基酸是缺失者。任何的多肽，如以細胞培 養分離自天然來源者及以重組體D N A技術及肽合成法人 工合成者，均可用於本發明中，只要其具有這些胺基酸序 列及特性中性一者。 就經濟觀點而言，重組體DNA技術可有益地應用於 本發明中：依據技術，編碼這些胺基酸序列之DNA，可 引入衍自微生物及動物之適合的宿主中以得轉形細胞，其 再以一般方式培養於營養培養基中，且生成之培養物純化 細胞動素之傳統技術純化，以得主題多肽》 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS > A4规格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再Ί寫本頁)

- 26 _ 464656 A7 _____B7_ 五、發明説明（24 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 如上述，多肽具有誘導免疫勝任細胞產製I F N — 7* 之特性。當投多至動物，本作用物對於敏感性疾病可誘導 體內免疫勝任細胞產製I FN— γ，且在I FN — r敏感 疾病上展現令人滿意的治療及/或預防作用。具有S E Q ID No. 1胺基酸序列之多肽具有加強殺手細胞胞毒 性之特性，如NK細胞，LAK細胞（淋巴激素一活化之 殺手細胞），胞毒T一細胞，及可誘導殺手細胞之形成， 以及具有誘導免疫勝任細胞產製IFN-r之特性，如此 殺手細胞可治療及/或預防多肽一敏感性疾病。因此"敏 感性疾病"一語在本發明書中表示疾病一般包括I F N-r敏感性疾病，且可爲I F N — r S及/或殺手細胞 所直接或間接處理及/或預防者，如：病毒疾病如肝炎， 疱疹症候群，濕疣，及AIDS，細菌性疾病，如念珠菌 病及瘧疾；固態惡性腫瘤如腎癌，覃樣真菌病，及慢性肉 芽腫病*血液細胞惡性腫瘤如成人T細胞白血病，慢性骨 髓性白血病，及惡性白血病；及免疫疾病如過敏及關節炎 。當多肽配合間白素3使用*其可在白血病及骨髓瘤，以 及治療惡性腫瘤時因照射及化學治療劑誘導之白血球減少 症及白栓減少之治療或舒緩上展現強烈作用。 本作用物可廣泛用於治療及/或預防上述敏感性疾病 ，而充作抗腫瘤劑，抗病毒劑，抗菌劑，免疫治療劑，血 小板增加劑，及白血球增加劑。雖然其依據用於此目的下 之作用劑型式及欲治療之敏感性疾病而大大地變化，本作 用物通常加工成液體，糊狀或固體型式，其中含有 本紙悵尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） '~~ -27 - 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 464656 A7 B7 " ........ I ----- -- ----- - -- _ _________ 五、發明説明（Μ ) 〇. 000001 — lOOw/w%，較好 〇. 0001 0 . lw/w%的肽，按乾固體基礎計（d. s. b. )° 本作用物可完整使用，或加工或組成物型式，即混合 以生理上可接受之載劑，佐劑，賦形劑，稀釋劑及/或穩 定劑如血清白蛋白，明膠，醣包括麥芽糖及海藻糖等，且 若必要時進一步混合以一種以上其他的生物活性物質，如 干擾素一a，干擾素一沒，間白素2 ，間白素3 ，間白素 1 2，TNF — α，TNF_yS，卡巴醌，環磷醯胺， aclarubicin，瞎暱哌（thiotepa)，馬利蘭（busulfan) ，ancitabine ，阿糖胞替，5 —氟尿嘧啶，5 —氣一 1 一（四氫一2 —呋喃基）尿嘧啶，胺甲碟呤，放線菌素D ，色霉素A3，紅比霉素，強力霉素，博來霉素，絲烈徽 菌C，長春新鹼，長春鹼，L_門冬醯胺酶，放射性金膠 體，Krestin®，Picibanil，香薛糖，及 Maruyama 疫苗。 在這些組合中，由多肽及間白素2組成者尤其有用，因爲 當多肽誘導免疫勝任細胞產製I FN- r時，間白素2可 充作多肽之輔因子》多肽及天然或重組人類間白素2之組 合使用可誘導I F Ν - γ產製之規定水平，即使當多肽並 不實質上誘導免疫勝任細胞產製IFN—r時。 多肽及間白素1 2之組合使用，可使I F N - r產製 力達到更大水平，此由其單獨使用是無法容易地達成的。 用於敏感性疾病之本作用物包括呈單位劑型者，其表 示是一種適合投藥之物理上分開及已成型之藥物，且含有 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ~ ~ 28 - „-------厂.<装-- (請先閱讀背面之注意事項再^寫本頁) 訂 Γ A7 B7 464656 五、發明説明（26 ) 呈每天劑量之多肽，或爲每天劑量的1/ 4 0至數倍（可 高達4倍）之劑量。此種藥物之實例有：注射劑，液劑， 散劑，顆粒劑，錠劑，膠襄劑，舌下錠劑，眼用溶液劑， 鼻用滴劑，及栓劑》 本作用物可口服或腸外投予至病人，如下文所述，可 於試管內用來活化抗腫瘤細胞。在二種投藥中，作用物在 治療及/或預防敏感疾病上展現令人滿意的作用。雖然其 依敏感疾病及其症狀型式而定，本作用物可口服至患者或 腸外投予至患者之皮內組織，皮下組織，肌肉，及靜脈， 劑量範圍在約0.1—50毫克/劑，較好約/微克/劑 至/毫克/劑，1-4次/天或1一5次/週，共歷1天 至1年= 依據本發明之作用物也可用於所謂的抗腫瘤免疫療 法中'，利用間白素2進行》—般而言，抗瘤免疫療法大 略分類成（i )直接投予間白素2至有惡性腫瘤之患者體 內，及（i i )引入經試管內由間白素2活化之抗腫瘤細 胞（過繼性免疫療法）。當配合多肽投藥時，免疫治療作 用可顯著地加強。在方法（i )中，多肽以約0，1微克 /劑/成人至1毫克/劑/成人之量，1一10以同時或 在間白素2之前投予。間白素2之劑量通常定在約 10，000至10，000，〇〇〇單位/劑/成人之 範圍，然依惡性腫瘤，病人的症狀，及多肽劑量而大地變 化。而於方法（i i )中*將收集自有惡性腫瘤之患者之 單核細胞及淋巴細胞，在間白素2及每1 X 1 〇β這些血 本紙浓尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210><297公釐） ： -29 - (請先閲讀背面之注#Wu項再氣寫本頁) -*tr- 經濟部中央標率局負工消费合作社印製 經濟部中央標準局員工消费合作社印策 464656 A7 B7 五、發明説明（27) 液細胞約1毫微克至1毫克多肽存在下培養。經培養一段 預定時間後，白培養物中收集NK細胞及LAK細胞’再 引入病人體內。可以本抗腫瘤免疫療法治療之疾病，如固 體惡性腫瘤，如結腸癌’直腸癌，胃癌’甲狀腺癌，舌頭 的癌症，膀胱癌，絨毛膜癌，肝癌’前列腺癌，子宫癌， 喉癌，肺癌，乳癌，惡性黑色素瘤，卡波西氏肉瘤，腦瘤 ，神經母細胞瘤，卵巢之腫瘤，睪丸腫瘤，骨肉瘤，胰臟 之癌症，腎癌，腎上腺樣瘤，血管內皮瘤，及血液細胞惡 性腫瘤如白血病及惡性淋巴瘤β 以下實例解釋本發明，且此中所用的重組體DNA技 術是本身爲技藝中傳統上已知的：如，此種技術揭示於 J. Surabrook et a 1. in "Molecular Cloning, A Labor-a tor y Manua 1 _’，2nd ed i t i on ( 1 9 89 )，由 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA出版，及 Mas-ami MUR AM ATSU in BRabo-Manual for Genetic Technol-ogy" (1988)，由 Maruzen Co.，Ltd·, Tokyo, Japan 出版 實例A — 1 純多肽之製備 對6 0 0母的CD— 1老鼠，8週大於腹膜內注入1 毫克/老鼠死的小棒桿菌（Corynebacterium parvum ( ATCC 11827))，其已先預熱至6 0 °C歷1小時，老鼠再 本紙悵尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

-30 - 464656 A7 B7 五、發明説明（28 ) 以一般方式餵食7天，並以來自大腸桿菌經純化的脂多醣 以1微克/老鼠靜脈內注射。靜脈內注射後1 一 2小時， 老鼠犠牲以收集其血液，移去肝之後，以勻漿器瓦解肝， 其係在8倍體積之50mM磷酸鹽緩衝溶液（PH7. 3 )中，並萃取生成的懸浮液。生成的萃取物在約 8，OOOrpm下離心20分鐘，且約9升上清液摻合 飽和的硫酸銨於50mM磷酸鹽緩衝溶液（PH7. 3) 使飽和度達4 5w/v% *令生成的溶液在4 °C下靜置 1 8小時，以約8000 r pm離心30分鐘以得約1 9 升含有本多肽之上清液。

上清液填加至充填有約4 . 6升PHENYL SEPHAROSE (一種 Pharmacia LKB Biotechnology AB， Uppsala Sweden的產品）之管柱內，其中已用含有1M硫酸銨之 50mM磷酸鹽緩衝溶液（pH7. 3)平衡，且管柱以 相同緩衝溶液之新鮮製劑洗滌，再以SV (空間速率） 0. 57以1M至〇. 2M硫酸銨於50mM磷酸鹽緩衝 溶液（pH7. 3)之線性梯度緩衝溶液充填。含有本多 肽之流份在0. 8M硫酸銨處溶離，將之收集並匯集成約 4 . 8升溶液，其再以膜濾器濃縮，以2 OmM磷酸鹽緩 衝溶液（PH6. 5)在4 °C下透析18小時，並充填至 裝填有約2 5 0毫升""DEAE-SEPHAR0SE#之管柱（此爲 Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsa 1 a, Sweden之產 物）。管柱以相同緩衝溶液之新鮮製劑洗滌，在 SV1. 2下以由OM至〇. 2M氯化鈉於20mM磷酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210><297公釐） 請 閲

面 之 注

费 "31 ™ 464656 A7 B7 五、發明説明（29 ) 鹽緩衝溶液（PH6. 5)之直線梯度緩衝溶液充填以溶 離及收集約2 6 0毫升含有本多肽之流份，其在約 〇· 13M氯化鈉濃度下溶離。 收集含有本多肽之流份，匯集，濃縮再以2 5mM B i s— Tr i s緩衝溶液（pH7. 1)在4°C下透析 1 8小時♦經透析的溶液填加至管柱中，其內已充填約 2 4毫升，^401^0-? 種 Pharmacia LKB Biot- e c h η ο 1 o g y A B, U p p s a 1 a，S w e d e η 產品），並以 1 0 v / v % polybuffer 74 (pH 4.0)溶離，同時pH值由7降至 4以得約2 3毫升含有本多肽之溶離液。溶離液濃縮。填 加至管柱中其內已充填有、SUPER — DEX75"( —種 Pharmacia LKB Biotechnology AB， Uppsala, Sweden, 之產品 ）， 其並已用含 7mM磷酸氫二鈉， 3xnM 磷酸二氫鈉，及1 3 9mM氯化鈉之混合溶液（pH 7. 2)平衡，再接受凝膠過濾層析以溶離會有本多肽在 約1 9，0 0 0道耳吞處之流份，此利用相同溶液之新鮮 請 先 聞 之 注 $ 項 再/ f 本 頁 裝 訂 Φ 經濟部中央標隼局負工消费合作社印製 製劑進行。流份匯集及濃縮以用於實例A 產率爲約0. 6微克/老鼠。 2。本多肽之 窗例A — 2 多肽之部份胺基酸序列 含有實例A- 1經純化多肽之部份水溶液，濃縮至約 50微升體積，其再與含有3w/v% S D S > 6 0 v 本紙依尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -32 - 4 6 4 6 5 6 A7 B7 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（ 30 ) / V % 甘 油 及 6 0 毫 克 / 毫 升 二 硫 異 赤 弱藻醇 2 5微 升溶 液 摻 和 〇 · 生 成 的 混 Ώ 物 在 5 0 X 下 培 育 3 0分 鐘，定 點在 1 5 W / V % 聚 炳烯 醯 胺 凝 膠 上 » 並 以 一般方 式電泳 。生 成 的 凝 膠 浸 在 1 0 V / V % 醋酸 水 溶 液 及5 0 V / V %含 0 1 W / W % 考馬 斯亮 藍 R 2 5 0 之 甲醇水 溶液之 混合 溶 液 中 以 染 色 t 再 以 1 2 V / V % 甲 醇 水溶液 及7 v / V % 醋 酸水 溶 液 之 混 合 溶 液 重 覆 洗 滌 凝 膠 ，及浸 泡在蒸 餾水 中 歴 1 8 小 時 而 脫 染 色 之 0 以 考 馬 斯 亮 藍染的 含有本 多肽 的 部 份 凝 切 出 來 再 真 空 冷凍乾燥 之 〇 經 冷 凍乾 燥 之 凝 膠 浸 於 0 * 6 毫 升 由1 0 0 m Μ 碳酸 氫 鈉 ( 其 中 含 有 2 微 克 / 毫 升 TPCK TRYPSIN ")， 0 5 m Μ 氯 化 鈣 及 0 0 2 V / V % Tween 2 0 水 溶 液組 成 之 溶 液 中 再 於 3 7 °C 下培育 1 8小 時以 將 蛋 白 質 胰 蛋 白 酶 化 〇 離 心 生 成 物 以 得 上清液 ，而生 成之 沉 澱 物 浸 於 1 毫 升 含有 0 0 0 1 V / v 96 T wee η 2 0 之 1 V / V % 氟 醋 酸 Pm TSrr 水 溶 液 中 ，在環 境溫度 下震 盪 4 小 時 並 離 心 得 上 清 液 Ο 新 形 成 的 沉澱物 以7 ◦ V / V 二 氟 醋 酸 豳 Tmi 水 溶 液 ( 含 0 0 0 1 % V / V T W e e η 2 0 ) 及 5 0 V / V % 乙 腈水溶 液類似 上示 般 相 繼 處 理 〇 生 成 之 上 清 液 及 上 述 已 得 之上清 液匯集 並濃 縮 至 2 5 0 微 升 » 其 再 離 心 過 濾 含有肽片 段 之 生 成 的 水 溶 液 填 加 至 "HPLC ODS-120T 中 ( 此 爲 購 白 To s oh Co rpo r a t i on > Tokyo, Japan ，之 HPLC 管柱） ， 其已先用0 . -\ r /' T三 三氟醋酸鹽水溶液 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 請 先 閲 讀 背 之 注 拳 項 再 填: 寫 本 頁 -33 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 /,64656 A 7 B7 /五、發明説明（31) 預先平衡，管柱再以0.lv/v三氟醋酸鹽水溶液洗滌 ，以0. 5毫升/分流速填加0.lv/v%三氟醋酸鹽 而乙腈水溶液之濃度由0 v/v增加至7 〇 v/v%，溶 離液中之肽濃度則以分光光度計在2 1 4毫微米及2 8 0 毫米波長下追踪。開始溶離後分別收集約7 5分鐘及約 5 5分鐘處之流份（下文命名爲 '肽片段A"及'肽片段 ） 》溶離型式示於第1圖中。 肽片段A及B在、MODEL 473A"上分析， 此爲購自 P e r k i η - E 1 m e r C 〇 r p. I n s t r u m e n t D i v，N o r w a-lk, USA之蛋白質定序儀，並顯示其具有S E Q ID N o . 4及5之胺基酸序列。 實例A - 3 編磘蛋白質之D N A鹸某序列及多肽之胺某酸序列 實例A - 3 - 1 完整R N A之製備 3克濕的老鼠肝細胞，類似實例A_1方法製備，予 以稱重，浸於2 0毫升含有6M異硫氰酸胍，1 OmM檸 檬酸鈉，及0. 5v/v SDS之混合溶液中，再以均 漿機瓦解之。35毫升之離心管柱入25毫升含有5. 7 Μ氯化絶之 〇· 1Μ E D T A ( ρ Η 7 . 5)，且 10 毫升經勻漿化之細胞懸浮平覆在管內溶液的上半部份，再 以25，OOOrpm離心20小時以收集RNA流份。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ——.1----------^-- C; (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 tf ~ 34 " 經濟部中央標準局Μ工消费合作杜印製 4 6 4 6 5 6 A7 B7 五、發明説明（32) 流份匯集，分配於1 5毫升離心管中*並與等體積的氯仿 及異丁醇（ = 4 = 1按體積計）混合液混合。試管振洫5 分鐘，並在4 °C下以10，〇〇〇 r pm離心10分鐘， 再收集所形成的水層，匯集，混合以2. 5倍體積的乙醇 ，令其在—2 0 ΐ下靜置2小時以沉澱完整的RNAs * 收集沉澱物，匯集，以7 5 v/v%乙醇水溶液洗滌，並 溶於0. 5毫升蒸餾的無菌水以用於實例A — 3 — 2中》 RNAs之產率爲約4毫克，d. s. b.。 甯例A - 3 - 2 製備部份編碼多肽之D NA片段 實例A— 3-1中1微克的完整RNAs ，混合以4 微升25mM氯化鎂，2微升由10XPCR緩衝溶液， 1 0 0 m M Tr i s— HC 文緩衝溶液（ρΗ8. 3) 及5 0 OmM氯化鉀組成之溶液，8微升/mM dNTP混合液，1微升含1單位/微升 RNase抑 制劑之溶液，1微升含2. 5單位/微升反轉錄酶溶液， 及1微升2. 5 Am任意的六聚體，並進一步與水混合以 生成總體積20微升。混合溶液置於0. 5毫升反應管中 ，並以一般方式，相繼培育於2 5eC下1 0分鐘，4 2°C 下30分鐘，99 °C下5分鐘，及5 °C 5分鐘成反轉錄酶 溶液，再回收含有第一股c RNA之水溶液。 對2 0微升水溶液中加入4微升2 5mM氯化鎂，8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---^---.---"1,裝— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -35 - A7 B7 464656 五、發明説明（33 ) 微升10XPCR緩衝溶液，〇. 5微升含有2. 5單位 /微升Amplitoq DNA聚合酶之溶液（此購自？6〇1^11-E1 m e r C 〇 r p ，I n t r u m e n t D i v ·，N 〇 r w a 1 k，U S K )，及各

1微微莫耳的引子1及2，其充作有意義引子或抗一有意 義引子。混合溶液以無菌蒸餾水加至1 0 0微升，並以一 般方式相繼培育，在94 °C下1分鐘，45 °C下2分鐘* 及7 2 °C下3分鐘，以循環方式歷4 0循環以擴大DMA 片段，其部份編碼本多肽，此中則以第一股c DNA爲模 扳。引子1及2爲寡核苷酸，其依據SEQ ID

No. 4 及 5 中之 Pro — Glu — Asn

I 1 e 及 Phe—Glu— Asp A sp — I 1 e胺基酸序列化學合成，具有5 TCRTCDATRTTYTCN TYGARGAYATGACNG 基序列。 成的Ρ CR產物取一部份在2w/ ，移轉至耐綸膜上，以0. 4N氫 SC洗滌，風乾，浸泡於含有5X 氏溶液，0. 5w/w%SDS及 性的鮭魚精子D N A之預雜交溶液 3小時。依據SEQ ID No —G1 u— Me t— Asp — Pr 鹼基序列：5一一 TTYGARGARATGG —3 —之寡核苷酸爲探針1，再以〔r—3SP〕 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） 請 先 閲 Sr 面 之 注 意 事 項 再 填: 寫 本 頁 經濟部中央標準局員工消费合作社印製

A s ρ — T h r — -A T R 5 > — T 3 —之鹼 所生 膠上電泳 以2 x S 5 X登哈 毫升經變 °c下培育 ~ G 1 u 合成具有 A Y c C

Me t w %瓊脂糖凝 氧化鈉固定’ S S Ρ E > 1 0 0微克/ 中，並在6 5 .4 之 P h e 〇胺基酸序列 -36 - 經濟部中央標準局—工消费合作社印製 46465 6 A7 _^_ B7 五、發明説明（34 ) A T P及T 4聚核Μ酸激酶檩記之。 卜 SEQ ID H0：4: ,. 工le lie Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn lie Asp Asp lie ^ 5 10 15

Ser Asp Leu Xle Plie Phe Gin Lys 20 25 耐綸膜浸於含有1微微莫耳探針1，5XSSPE， 5X登哈氏溶液，0. 5w/v%SDS，及100微克 /毫升經變性的鮭魚精子DN A之溶液中，並在4 5 °C下 培育2 4小時以達成雜交作用。生成之耐綸膜以6 X S S C洗滌，再以一般方式放射自顯，且顯示P CR產物 含有主題DNA片段。 留下的PCR產物與50毫微克，pT7 BLUE ' T 〃混合（此爲一種購自 Takara Shuzo Co.，Ltd.，

Tokyo，Japan ，質體載體），並加上適量的T 4連接酶 ，並進一步混合以1 0 OmM ATP使濃使爲/mM， 再於1 6 °C下培育1 8小時以將DNA片段嵌入質體載體 中。重組體DNA如此得到後引入大腸桿菌Ν ο V a Blue 株中，此種一種購自 Pharmc i a LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden 之大腸桿菌微生物， 以得到 轉形細胞，其再接種至含有1 0克/升細菌蛋白腩， 2. 5克/升氯化鈉，15克/升細菌瓊脂，100毫克 /升氨苄青徽素，40毫克/升X — Ga 1及23. 8毫 克/升異丙基-— D_硫半乳糖一吡喃糖苷（下文縮寫 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公嫠) '> (請先聞讀背面之注意事項再壤寫本頁)

-37 - 4 6 4 6 5 6 A7 B7 五、發明説明（35 ) 或*IPTG# )之培養盤內，並在37Ϊ下培育24小 時以形成集落。耐綸膜以一般方式平覆在培養盤上，並令 其靜置約3 0秒以將集落粘附其上。再掀去盤上的耐綸膜 ，並在含有0. 5N氫氧化鈉及1- 5M氯化鈉之溶液中 浸泡7分鐘以達成細胞溶解。之後，耐綸膜進一步在 0 5MTris— HCj?緩衝溶液（pH7. 2)中浸 沲3分鐘，其中含有1. 5M氯化鈉，以2XSSC洗滌 ，浸於0. 4N氫氧化鈉中20分鐘以固定DNA，以5 XSSC洗滌，風乾，浸於含有5XSSPE，5X登哈 氏溶液，0. 5w/v%SDS及100微克/毫升變性 鮭魚精子DNA之預雜交溶液中，並在6 5 °C培育3小時 «在耐綸膜上形成之集落以一般方式以探針1雜交，以6 X s S C洗滌，並如上述地放射自顯之，再選擇轉形細胞 ，其可與探針1強烈雜交》 轉形細胞在L 一肉汁（PH7. 2)中培育，其中含 有1 0 0微克/毫升氨苄青黴菌，並在3 7 ΐ下培育1 8 小時，再收集培養物中之細胞，並以傳統的鹼- SD S方 法收集重組體DNA。以二戋氧法分析顯示重組體DNA 含有一個DNA片段，其中含有的鹸基序列相當於S E Q ID No. 3中由85至281之鹼基位置》 眚例A — 3 — 3 R N A之魁備 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公釐） 請 先 閎 背 之 注 意 事 項 頁 經濟部中央摞準局員工消费合作社印製 -38 - 46465 6 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A7 __________B7_五、發明説明（36 ) 〇 05毫升含有實例A—3—1完整RNAs之水 溶液置試管中，.接合〇. 5毫升含有ImM EDTA及 0 lw/v%SDS 之 l〇mM Tris-HC 芡緩 衝溶液（PH7. 5)，再以無菌蒸餾水加至1毫升。在 此混合物中加入1毫升、0LIGOTEX_dT30， SUPER”及〇1卜 go-d(T)3。乳液（購自 Nippon Roche K.K.，Tokyo, Japea-n,再於6 5 °C下培育5分鐘以使RNAs變性，之後在 冰冷卻浴中冷卻3分鐘。生成之混合物摻合〇 2毫升5 Μ氯化鈉，在3 7t：下培育1 0分鐘，再於2 5°C下以 1 0 ’ 000 r pm離心1 〇分鐘。呈團塊之沉澱物懸浮 於〇_ 5毫升無菌蒸餾水中，並在6 5 °C下培育5分鐘以 自oligo-d(T)3〇乳液中萃取m R N A。m R N A之產率 爲約5微克。 實例A - 3 - 4 製備c D N A康 cDNA庫製備自實例A — 3 — 3之mRNA，係利 用'"cDNA SYNTHESIZING SYSTEM PLUS，一極 c D N A 選 殖套組購自 Amersham Corp·，Div·, Amersham International, Arlington Heights, USA。 步.驟如下：在 1 . 5 毫升的反應管中相繼加入4微升合成第一股c DNA之溶 液，1微升焦磷酸鹽緩衝溶液’1微升人類胎盤核糖核酸 酶抑制劑，2微升去氧核苷三磷酸混合液，及1微升 請 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 裝 頁 訂 Φ 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐} -39 464656 A7 〜_B7 _ 五、發明説明（37) oligo-d(T)le引子。生成的混合物混合2微升實例A — 3 —3之mRNA，以無菌蒸餾水加至1 9微升，混合以1 微升含有2 0單位反轉錄酶之溶液，並在4 2 °C下培育 4 0分鐘以得含有第一股c DNA之反應混合物。 如此得到之混合物，混合37. 5微升合成第二股

cDNA之溶液，〇. 8單位衍自大腸桿菌之核糖核酸酶 Η，2 3單位DNA聚合酶，及以無菌蒸餾水加至1 〇 〇 微升。生成之混合物相繼培育，在1 2°C下6 0分鐘及 2 2°C下6 0分鐘，混合以二單位T4DNA聚合酶，並 在3 7°C下培育1 〇分鐘以得含有第二股c DNA之反應 混合物。在反應混合物中加入4微升0. 25M EDTA(pH8. 0)以懸浮反應，且生成的混合物以 —般方式酶及氯仿萃取，並以乙醇處理以沉澱主題 cDNA，再且收沉澱物· 在如此得到之c DNA中加入2微升L/K緩衝溶液 ，250微微莫耳EcoRI承接子，及2. 5單位T4 DNA連接酶，（此此次序加入），且生成的溶液以無 菌蒸餾水加至2 0微升，再於1 5 °C下培育1 6小時以連 接E c 〇 R I承接子於c DNA二端。反應混合物與2微 升0. 25M EDTA混合以滅活剩下的酵素，並接受 分子篩層析以移去完整的E c 〇 R I承接子。在生成物中 加入4 0微升L/K緩衝溶液，8 0單位T 4聚核苷酸激 酶，且混合物以無菌蒸餾水加至4 0 0微升，再於3 7 °C 下培育3 0分鐘以甲基化E c 0 R I解離位置生成的混 本紙悵尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再 頁 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 -40 - 4 6 465 6 A? B7 五、發明説明（38) 合物以酚及氯仿萃取’並以乙醇處理以沉澱主題DN A， 之後回吸DNA。在DNA中加入1 . 5微升L/K緩衝 溶液，其中含適量的入g t 1 〇臂’及2. 5單位T4 DNA連接酶，且生成的溶液以無菌蒸餾水加至1 5微升 ，在1 5 °C下培育1 6小時以達成連接作用，再接受傳統 的試管內包裝法以得含有重組體入D NA之噬菌體。 眚 Μ A — 3 — 5 重鉗體DNA之選殖 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 大腸桿菌NM514株之種子培養物以一般方式以實 例A - 3 - 4之噬菌體感染，經感染的細胞接種至瓊脂盤 上（pH7. 0)，其中含有10克/升細菌一蛋白腩， 5克/升細菌酵母等取物，1〇克/升氯化鈉及15克/ 升細菌瓊脂，並在3 7 °C下培育1 6小時以形成噬菌斑。 瓊脂盤上覆以耐綸膜，並令其靜置約3 0秒以將噬菌斑粘 附其上。耐綸膜自盤中掀去，再相繼浸於含有0. 5M氫 氧化鈉及1. 5M氯化鈉之水溶液中歷7分鐘，及於 0 . 5 M Tris— HC 义緩衝溶液（ρΗ7·0)( 其中含有1. 5Μ氯化鈉）歷3分鐘。耐綸膜以2Χ SSC洗滌，風乾，浸於0· 4Ν氫氧化鈉中20分鐘， 以5XSSC洗滌，風乾，浸於含有5XSSPE，5Χ 登哈氏溶液，0. 5w/v%SDS及100微克/毫升 變性的鮭魚精子DNA之溶液中，並在6 5 °C下培育3小 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 41 一 (請先閎讀背面之注意事項再輿寫本頁) 46465 6 A7 _B7____ 五、發明説明（39 ) (請先閱讀背面之注意事項再#寫本頁) 時》之後，生成的耐綸膜在含有下列之溶液中培育：充作 探針2之得自實例A — 3 - 2之適量的DNA片段，並以 * READY PRIME DNA LABELLING SYSTEM，（―種購自 Am-ersham Corp. ,D i v, Amersham International, Ar1i ngt-on Heights，USA之D N八標_記套組）標記，5 X SSPE，5X登哈氏溶液，0. 5w/v%SDS，及 1 0 0微克/毫升經變性的鲑魚精子DNA，且混合物在 6 0°C下培育2 0小時以達成雜交作用。生成物接受類似 上述之放射自顯術•以選出可與探針2強烈雜交之噬菌體 D N A純系。 以傳統技術，純系在大腸桿菌中擴大，再自細胞中萃 取重組體D NA。重組體DNA以E c 〇 R I限制酶解離 。質體載體PUC19 (ATCC 37254)以相同 的限制酶解離，且生成的經解離的DNA片段及質體片段 以DNA連接酶連接以得重組體DNA，其再以傳統勝任 細胞方法引入大腸桿菌JM109株（ATCC 53323)，以得轉形細胞* 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 實例A — 3 - fi &定D N A之鹼某序列及多肽之胺基酸序列

實例A—3—5之轉形細胞接種至L一肉汁（PH 7 2)中，並在37 °C下培養18小時，利用震盪條件 進行。生成的增殖細胞收集，再以傳統的鹼一 S D S方法 本忒张尺度適用中國國家;^準（CNS ) Α4规格（2丨0Χ297公釐) -42 - 464656 A7 B7 五、發明説明（40 ) 處理，以得含有依據本發明DNA之重組體DNA。利用 螢光光度計在自動定序儀上分析，結果顯示重組體D NA 含有SEQ ID No. 3之鹼基序列。鹼基序列解碼 顯示，其編碼SEQ ID No. 3之胺基酸序列。胺 基酸序列含有SEQ ID No. 4及5之部份胺基酸 序列（相當於SEQ ID N 〇 ； 3中由79至103 位及由2 6至4 3位置之胺基酸，且此表示於老鼠中具有 SEQ ID No. 3胺基酸序列之多肽也可爲SEQ ID No. 3中之DNA所編碼，其中符號'Xaa '表示"甲硫胺酸'或^蘇胺酸# - SEQ ID NO:5: 請 先 閱 面 之 注 意 事 項 再 赉

Gin

Pro Gin

Val Phe Glu Asp Met Thr Asp lie Asp Gin Ser Ala Ser Glu 5 10 15 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 於下列實例A — 4至A — 7中，編碼另外多肽之 cDNA，其可誘導免疫勝任細胞產製I FN_r，可利 用SEQ ID No. 3中之鹼基序列DNA片段爲探 針製備自人類肝mRNA» cDNA分析其鹼基序列並解 碼以決定多肽之胺基酸序列。令c DNA在大腸桿菌中表 現’再研究所形成多肽之特色及特性。 實例A - Λ 鐘·碼多肽D Ν Α鹼某序列及多肽之胺某酸序列 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS.) A4規格（210X297公釐） -43 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 464656 A7 _B7 五、發明説明（41) 音例A — 4 _ 1 c D N A之製備 cDNA庫製備自添加有*POLY A〃之人類肝 R N A，此爲 c 1 ο n a 1; e c - B I 0 S 0 F T，P a r i s C e d e X，F r a n c e 之產品，利用、cDNA SYNTHESIZING SYSTEM PLUS〃進行 S，此爲一種c D N A選殖套組，購+自Amersham Corp., D i v. , Amersham International, Arlington Heights, USA。步驟如下：在1. 5毫升反應試管中相繼加入10 微升合成第一股cDNA之溶液，2. 5微升/mM焦磷 酸鈉，2 . 5微升含有1微克/升人類胎盤核糖核酸酶抑 制劑之溶液，5微升含有微克/升去氧核糖核苷三磷酸混 合物之溶液，2· 5微升溶液（含有1微克/升〇lig〇- dT引子），5微升人類肝R N A添加有poIy(A)，再以 無菌蒸餾水加至4 5微升。之後，生成的混合物與5微升 溶液混合，其中含有1 〇 〇單位反轉錄酶，並在4 2 °C下 培育4 0分，以得含有第一股c DNA之反應混合物。 對反應混合物中加入9 3 . 5微升合成第二股 c DNA之溶液，4單位衍自大腸桿菌之核糖核酸酶Η， 1 1 5單位DNA聚合酶，並以無菌蒸餾水加至2 5 0微 升。生成的混合物相繼培育，在1 2°C下6 0分鐘，2 2 °<：下6 0分鐘，及7 〇°(：下1 0分鐘，混合以1 0單位 T4聚合酶，再於3 7 °C下培育1 0分鐘》對反應混合物 中加入10微升〇· 25M EDTA(pH8. 0)以 懸浮反應’且生成的混合物·以—般方式以酚及氯仿萃取， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -44 - 锖 間 面 之 注

裝 i 訂 4 ^465 6 A7 B7 五、發明説明（42) 並以乙醇處理以沉澱主題之第二股c DNA ’再回收沉澱 jf.lt , 物》 對所得的第二股c DNA中加入2微升L/K緩衝溶 液（pH8 - 0) ，250微微莫耳EcoRI承接子， 及2. 5單位T4 DNA連接酶，且生成的溶液以無菌 蒸餾水加至2 0微升，並在1 5 eC下培育1 6小時以將 E c 〇R I承接子連接至cDNA二端。生成的混合物再 與2微升0. 25M EDTA混合以懸浮溶液，並接受 分子篩層析以移去完整的E c 〇 R I承接子。對生成物中 加入4CT微升L/K緩衝溶液（pH8. 0)及80單位 的T 4聚镔苷酸激酶，且混合物以無菌蒸餾水加至4. 0 0 微升，再於3 7°C下培育3 0分鐘以甲基化E c oR I解 離位置。生成的混合物以酚及氯仿萃取，並以乙醇處理以 沉澱主題cDNA，再回收cDNA。在cDNA中加入 1 5微升L / K緩衝溶液（p Η 8 · 0)，其中含有適 量的又gt10臂，及2. 5單位T4 DNA連接酶， 且生成的溶液以無菌蒸餾水加至1 5微升，在1 5 X：下培 育1 6小時以達成連接作用，並接受傳統的試管內包裝方 法以得含有重組體入D N A之噬菌體。 實例A - 4 - 2 重組體DNA之撰殖 大腸桿菌NM5 1 4株之種子培養物，以—般方式以 實例A - 4 — 1之職菌體感染，且經感染的細胞接種於瓊 本紙iMJL適用中國國家標準（CNS ) A4规格（2丨0 X 297公釐）„ 45 _ 請 先 閲 背 面 之 注 項 再， 填 寫 本 頁 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製 4 6 4 6 5 6 A? _ B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（43) 脂盤上（PH7. 0)，其中含有10克/升細菌蛋白膝 ’ 5克/升細菌—酵母浸膏，1〇克/升氯化鈉，及15 克/升細菌瓚脂，並在3 7 °C可培育6小時以形成噬菌斑 °依據傳統方法，瓊脂盤覆以耐綸膜，並令其靜置約3 0 秒以將噬菌斑粘附其上。之後，耐綸膜自盤上掀去，並相 繼浸於含有0 · 5 N氫氧化鈉及1 . 5 Μ氯化鈉之水溶液 中歷7分鐘，及0. 5Μ含有1. 5Μ氯化鈉之Tris 一 HCi?緩衝溶液（PH7. 0)中3分鐘。耐綸膜以 2 X S S C洗滌，風乾，浸於〇. 4N氫氧化鈉中2 ◦分 ，再以5XSSC洗滌，風乾，浸於含有5XSSPE， 5X登哈瓦溶液，〇. 5w/v%SDS及受性的鮭魚精 子DNA之溶液中，再於6 5 °C下培育3小時。爲選殖主 題重組體DNA，具有SEQ ID No. 3鹼基序列 之 D N A 片段，以 $ READY PRIME DNA LABELLING SYSTEM ’（一種購自 Amer sham Corp.，D iv·，Amer sham International, Arlington Heights, USA 的 DNA 標記 套組） 標以32P，以得探針3。此步驟如下：將2 5毫微克製備 自實例A — 3 — 5方法之DNA片段置於1. 5毫升反應 管中，並以4 5微升無菌的蒸餾水加至4 5微升，在9 5 °C下培育3分鐘，再轉至另一反應試管中。加5微升〔α —32P〕dCTP溶液至反應試管中，再於37°C下培育 30分鐘標記之》之後，生成的含有經標記DNA片段之 產物接受傳統的分子篩層析以移去完整的〔α_32Ρ〕。 上述耐綸膜浸於含有5_x S S Ρ Ε，5 X登哈氏溶液 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注$項一ΐ'填r本頁)

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4 6465 6 A7 B7 五、發明説明（44 ) ，0· 5w/v%SDS及1〇〇微克/毫升變性鮭魚精 子DNA之混合物溶液中，且混合物在6 0°C下培育2 0 小時以達成雜交作用β再於環境溫度下於6 X S S C中培 育2 0分鐘及2XSS C 2 0分鐘。生成物洗滌並接受 類似上述之放射自顯術，以選出可與探針3強烈雜交之噬 菌體DNA純系*以傳統技術，DNA純系在大腸桿菌中 擴大，再萃|取出細胞內之重組體DNA。重組體DNA以 EcoRI解離。質體載體pUC19 (ATCC 3 7 2 5 4)以相同的限制酶解離，且經解離之DNA片 段及質體片段以DNA連接酶連接，以得重組體DNA ’ 其再以傳統的勝任細胞方法引入大腸桿菌J Μ 1 0 9株 內（ATCC 5 3 3 2 3 )，以得到含有本DNA之轉 形細胞。 啻例Α — 4 — 3 讲宙务肽之鹼某序列及胺基酸序列

實例A — 4 — 2之轉形細胞接種至含有5 0微克/毫 升氨苄青黴素之L 一肉汁（PH7. 2)中’並在37°C 下以震盪條件培養1 8小時。經增殖之細胞以離心收集’ 並以傅統的鹸一SDS方法處理以萃取重組體DNA。鹼 基序列在自動定序儀上利用螢光光度計分析’結果顯示重 組體DNA含有SEQ ID No. 6之鹼基序列。估 計自鹼基序列之胺基酸序列也示於SE<3 1 D No. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210 X 297公釐）_ 47 _ "

Hr *^1 ΙΓ ^^1 I 1 ·( /一 - If 厂}' (請先閲讀背面之注意事頃再填k本頁) -訂-

經濟部中央標準局貝工消費合作社印掣 A7 B7 464656 五、發明説明（45 ) 6，且此顯示本多肽具有胺基酸序列如SEQ ID No.1中所示，且多肽中SEQ ID No. 2鹼基 序列之DNA所編碼。所SEQ ID No. 6中，以 ιχ a a 〃表示之胺基酸表示"^異白胺酸'或^蘇胺酸〃 實例A - 5 製備可複製之重細體D ΝΑ及轉形細胞 對0. 5毫升反應試管中加入8微升25mM氯化鎂 ，：L 0微升1 0XPCR緩衝溶液，8微升ImM dNTP混合物，〇. 5微升含有2. 5單位/微升

AmpliTaq.DNA聚合酸之溶液，及1毫微克實例A — 4 — 2之重組體DNA。生成的混合物混以適量的2寡梭苷酸 ，充作序列引子或抗一有意義引子，其具有由5 / — C G AGGGATCCTACTTTGGCAAGCTTG-3 '及 5 - -CAAGGAATTCCTAGTCTTC GTTTTG—3 >代表之鹼基序列，後者係依據近 SEQ ID No. 1中N_及C_末端鹼基序列而化 學合成，並以無菌蒸餾水加至1 0 0微升。生成的混合物 以一般方式相繼培育，在9 4 °C下1分鐘，6 0°C下2分 鐘，及7 2 °C之3分鐘，且此培育循環重覆4 0次以得 PCR產物，其再以BamHI及EcoRI解離可得到一段 Bam-HI- EcoRI DNA 片段生成的 BamHI- EcoRI MA 片段混 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） K--------r---^/-.裝-- (請先聞讀背面之注意事項#,.续&本頁) 訂 經濟部中央標準局舅工消費合作社印製 —48 - 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 46465 6 A7 _____B7 五、發明説明（46 ) 合以適量的無菌蒸餾水。溶液與1 0毫微克"pGEX -2 T 〃質體載體混合，其購自Pharmacia LKB Biotechnology AB， Uppsala, Sweden， 先前已用 限制酶 BamHI 及 EcoRI解離，1 0微升1 0 X連接緩衝溶液及適量的1 〇 m M ATP，以得ImM終濃度，再於1 6°C下培育 1 8小時以得可複製之重複體DNA Ρ Η I G I F 〇 重組體DNA PHI GIF引入大腸桿菌ρΗ5α 株中 * 其購自 Τ 〇 y 〇 b 〇 C 〇.，L t d. , Τ 〇 k y 〇，J a p a η，且生成 之轉彤細胞"Η I G I F"接種至含有5 0微克/毫升氨 苄青黴素之L—肉汁中（pH7. 2)，於37 °C下培育 1 8小時（.震盪條件生成之培養物離心得經增殖之轉 形細胞，其再接受傳統的鹼-SD S方法以萃取重組體 D N A PHI G I F。重組體PHIG I F在二去氧方 法上分析顯示，如圖2 ，HIGI F cDNA〃或 SEQ ID No. 2之cDNA連接至Tac啓動基 因及穀胱甘肽S -轉移酶之基因下游位置》 實例A — 6 自轉形細朐中齑製多狀 實例A - 5中之轉形細胞HIGIF，接種至含有 50微克/毫升氨苄青黴素之T肉汁中（pH7. 2)， 並在3 7 °C下培育1 8小時，在震盪條件下可得種子培 養物。18升一份新鮮的T —肉汁製劑（pH7 - 2)置 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（2丨0X297公釐> _ _ (y: (請先閲讀背面之注意事項#,--填k本頁) 訂· Φ

—T A7 B7 4 6 4 6 5 6 五、發明説明（47 ) 請 先 閲 背 © 之 注 意 事 項 再 f 本 頁 於3 0升醱酵釭中，接種以1 v/v%種子培養物，並在 3 7 °C霉氣一攪動條件下培養。在培養中，培養物採樣並 在6 5 0毫微米波長下追踪吸光度，且當吸光度達到約 1. 5時，力卩IDTG至培養物中使達〇. ImM。之後 ，培養物進一步再培育5小時，並離心以分離培養物中之 細胞。細胞懸浮於含有1 3 氯化鈉，7mM磷酸氫 二鈉，及3mM磷酸二氫鈉之混合溶液中（pH7. 2) ，以一般方式以超音波處理，並離心以得上清液。 上清液填加至管柱中，其內充填有^GLUTATHIONE SEPHAROSE 4B^ ，一種購自 Pharmac i a LKB B i otechno 1 ogy AB，Uppsala，Sweden之產品，其先前用含有1 3 9 mM氯化鈉，7mM磷酸氫二鈉及3mM磷酸二氫鈉之混 合物（PH7. 2)平衡。管柱以相同混合溶液之新鮮製 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 劑洗滌，並在每1毫升凝膠中加入1 〇 〇 U凝血酶以達成 酵素解離反應，同時令管柱在環境溫度下靜置1 6小時。 管柱充填以相同混合溶液之新鮮製劑溶離反應產物，且溶 離液填加至充填有'"SUPERDEX 75〃，一種Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden產品之管柱中 ’再收集相當於近1 8，5 0 0道耳吞之流份。匯集流份 ，濃縮並冷凍乾燥以得含有本多肽之固體產物，產率爲每 1升培養物有約80微克。 啻例A — 7 多肽之物化特性 一 50 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 6 465 6 A7 ______ B7 五、發明説明（48) 實例A — 7 — 1 分子最 依據 U · K. L a e m m 1 i 於 N a t u r e，V ο 1. 2 2 7，p p. 6 8 0 - 6 8 5 (1970)，所報告之方法，以實例A - 6方法所製備之經純 化的多肽在無還原劑之硫酸十二酯鈉（S D S )聚丙烯醯 胺凝膠上電泳，以主要顯示出具有I F N - r誘導力之單 一蛋白質帶，其位置相當於約18，500±3 ，000 道耳吞。此實驗所使用之檩幟蛋白質爲牛血清白蛋白（ MW=6 7 ，〇〇〇道耳吞），卵白蛋白/MW = 545，000道耳吞），大豆胰蛋白酶抑制劑 20 ，000道耳），及r 一乳白蛋白（MW = 1 4，4 0 0道耳吞）。 實例A - 7 — 2 等電點 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實例A - 6之經純化的多肽經色譜聚焦顯示等電點爲 約 4 . 9 ± 1 . 0 。 眚例A - 7 - 3 含有N —未端之胺某酸序列 實例A-6中經純化的多肽在，MODEL 473 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -51 - 46465 6 at B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（49) A，上分析，此爲購自 Perkin-Elmer Corp.t Instrume-nt Div.，Norwalk，USA之蛋白質定序儀’且顯不其具有 結構其中肽’ — Ser_'，偶合至SEQ ID No. 7中N—末端胺基酸序列之酪胺基酸殘基/ 此係加入穀胱甘肽S -轉移酶’及以凝血酶解離。 ! SEQ ID N0：7： ' . I Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser I 1 5 10 I : 會例 A— 7 — 4 (a) 生物活性 自母的C 3 Η/He J老鼠（8週大）中萃取其脾臟 ，再懸浮於無血清之RPMI 1 6 40培養基中（pH 7. 4)，且生成的細胞以相同培養基之新鮮製劑洗滌’ , 並浸於Gey溶液（dH8· 0)中以達成溶血。生成的 脾細胞懸浮於RPMI 1640培養基中（ΡΗ7· 4 )，其內添加ΙΟν/ν%牛血清，使細胞密度爲lx 1 0 7細胞/毫升。每份1 0毫升之細胞懸液分佈於塑膠 巴氏血中，其直徑爲9公分，再於37°C，5v/v% C 〇2培育箱中培育3 7 aC。以收集浮在培養物上之細胞 ，並以添加1 〇v/v%牛血清之RPMI 1 6 40培 養基（PH7. 4)洗滌，以用於IFN — r誘導作用之 下列試驗中。 老鼠脾細胞懸浮於RP+MI 1 640培養基中（ ----„------L裝— ·- y. (請先閲讀背面之注意事項再魂寫本頁) 、1T- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐} 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 4 6 465 6 A7 B7 五、發明説明（so) p Η 7 . 4)，其中添加有ΙΟν/ν牛血清以使細胞密 度達lxl 07細胞/毫升，且其每份〇· 15毫升注入 96孔涧微滴定盤中，再於各孔洞中加入〇. 05毫升以 相同培養基新鮮製劑稀釋之經純化多肽溶液，並在加或不 加0. 05毫升，2. 5微克/毫升刀豆球蛋白A或50 單位/毫升間白素2下培育細胞，生成物再於3 7 °C，5 v/v COs，培養箱中培育2 4小時。培養完全後 > 生 成之上清液於各孔洞中採樣0·1毫升，以利用酵素免疫 分析法分析所形成I FN— r之活性。至於對照組，類以 上一系統提出後如上述類似地處理，但此中例外處在於不 使用經純化的多肽，刀豆球蛋白A及間白素2。至於 I F N — y 標準品，使用得自 National Institutes of Health, USA之老鼠 I F N — 7"製劑，G g ο 2 — G ο 1 —5 3 3，且活性以國際單位（I V)表示。結果示於表 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐）

-53 - 46465 6 A7 B7 五、發明説明（Μ ) 表1 樣品 若鼠脾細胞產製之I FN— y ( I U/蕞升、 濃度 (微京/毫升） 樣品 樣品加 刀豆球蛋白A 樣品加 間白素？. 10. 00 12 138 118 3.33 6 8 55 1.11 5 56 16 0. 37 5 21 12 0.12 5 12 10 0.04 5 11 7 0 窗例A — 7 — 0 4 ( b ·) 4 1 白人類淋巴細胞誘導I F N — r產製 {請先Μ讀背面之注意事項再填 貧本頁) 」裝· -訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 利用有肝素之注射器，收集健康供者之血液，其再以 無血清之RPMI 1640培養基（pH7. 4)稀釋 2倍，並平覆在fi coll上*生成物以2，0 0 0 r pm離 心20分以得淋巴細胞，其再以RPMI 1640培養 基（ρΗ7· 4)洗滌，其中添加有ΙΟν/ν%牛血清 ，懸浮於相同培養基之新鮮製劑上以生成5 X 1 0β細胞 /毫升之細胞密度，再類似實例Α — 7 — 4 (a)般處理 ，除了使用人鈕I FN— r準標品，Gg23-90 1-5 3 0 之外，此得自 National Institutes of Health, 本紙張尺灰適用中國國家標準（CNsj八4規格（210X297公釐） " -54 - 4 6465 6 A7 B7 五、發明説明（52 ) USA，充作I FN— r標準品〇結果於表2 表2 樣品 若鼠脾細胞產製之I FN— r ( I U /亳升：） 濃度 樣品 樣品加 樣品加 毫升\_刀豆球蛋ήΑ 簡ή寧？ί 10· 00 191 479 1,182 3.00 169 576 1,419 1.11 168 426 1,106 0. 37 150 296 739 0. 12 74 193 390 0.04 36 137 324 0 1 11 24 表1及表2之結果可證知’本多肽具有誘導哺乳動物 免疫勝任細胞產製I F Ν — r之活性，包括在人類及老鼠 中。在對照組中，未見任何顯著的I FN— r產製，而有 以多肽進行之系統中則可觀察到顯著的I F N - r產製。 當配合刀豆球蛋白A或間白素2爲輔因子使用時，多肽之 活性可強烈地廣大。 實例 A —7 — 4 (c) 以命疮勝仟細朐產製I F N_ ?· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 請 先 閱 讀 背 ώ 之 注 意 事 項 再 寫 本 頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -55 - 46465 6 A7 B7 五、發明説明（53) 以經肝素化之注射器收集健康供者之新鮮血液，並以 無血清之RPMI 1640培養基（PH7. 4)稀釋 2倍。經稀釋之血液覆在Ficoll上，並離心以得淋巴細 胞，其再以添加有1 〇 v/v%胚牛血清之RPM I .1 6 4 0培養基（p Η 7 . 4 )洗滌，並懸浮於相同培養 基之新鮮製劑中，使細胞密度達5 X 1 0β細胞/毫升。 細胞懸浮以0 . 1 5毫升/孔洞之量分配至9 6孔洞之微 滴定盤中" 以實例Β - 1 — 2方法所得之多肽經稀釋以得添加有 1 0 ν/ν%胚牛血清之適當濃度之RPMI 16 4 0 培養基（ΡΗ7. 4)，經稀釋之溶液再以0. 0 5毫升 /孔洞之量分佈於微滴定盤中，再將0. 05毫升/孔洞 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 相同培養基之新鮮製劑加入，其中並添加有或無2 . .5微· 克/毫升刀豆球蛋白Α或5 0單位/毫升重組人類間白素 2，微滴定盤再於37°C，5v/vC02條件之培育箱 中培育24小時。培育後，採出各孔洞0.1毫升的培養 物上清液，再以傳統的酵素免疫分析法分析I FN_T含 量。至於對照組，提供無多肽之系統，並如上類似地處理 。結果示於表3中。在表中*利用Gg 2 3 — 90 1 — 530估IFN— r，此爲千擾素之國際標準，人類（ H u I F N — 7 )，得自 National Ins.titute of Health ，Bethesda，MD，USA,並以國際單位（I U )表示。 本紙ί艮尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 56 - 46 465 6 A7 B7 五、發明説明（54) 樣品 表3 老鼠脾細朐產製之I FN——y ( I U /毫升_)_ 濃度 樣品 (微克/毫升） 樣品加 樣品加 0 0 0 0 1.6 1 ± 2 92± 32 184 土 12 8. 0 3± 1 220 ± 21 3 9 7 ± 31 40. 0 6± 4 380 ± 34 52 6 ± 28 20 0.0 1 4土 fi 5 4 9 ± 1 0 5 R 3 7 ± 9 9 K----„---r---c,-i-- (請先閲婧背面之注意事項再'填k本頁) 表3之結果顯示，淋巴細胞當有多肽作用其上時可充 作產製IFN-r之免疫勝任細胞。由結果證知，組合多 肽及充作輔因子之間白素2或刀豆球蛋白A使用可加強 I F N - y之產製。 啻例 A— 7 - 4 (d) N K細朐所加強之胞毒性 以經肝素化之主射器，自健康志願者中收集新鮮血液 ，並以1 OmM含有1 4 OmM氯化鈉之磷酸鹽緩衝溶液 (p Η 7 . 4 )稀釋2倍。血液平覆在Percoll上，且生 成物離心，再接受PERCOLL梯度離心以得高密度淋 巴細胞。

淋巴細胞懸浮於含有微克/毫升康黴素，5 X 訂 經濟部中央標率局員工消费合作社印袋 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） -57 - 464656 A7 B7 經濟部中央標準局—工消費合作社印製 五、發明説明（55) 1 〇_5M2 —锍基乙醇，及1 0 v/ν%胚牛血清之 RPM±1640培養基（PH7. 2)中，以生成lx 1 Οβ細胞/毫升之細胞密度，懸浮液分佈於1 2孔洞之 微滴定盤中，0. 5毫升/孔洞。以實例Β — 1 — 2方法 所得之多肽以相同培養基之新鮮製劑適當地稀釋，且經稀 釋之溶液以1. 5毫升/孔洞之量分佈於微滴定盤上，再 以相同培養基新鮮製劑加或不加有5 0單位/毫升重組體 人類間白素2，0 . 5毫升/孔洞之量分佈盤中，微滴定 盤在37°C，5v/v%C02條件之培育箱中培育24 小時，以含有1 4 OmM氯化鈉之1 OmM磷酸鹽緩衝溶 液（PH7. 4)洗滌微滴定盤，可得含有NK細胞爲效 應細胞之培養的淋巴中細胞。充作NK —細胞一敏感性標 的細胞之衍自人類慢性骨髓性白血病之K - 5 6 2細胞（ ATCC CCL243)，以一般方式以S1/Cr標記 之，並分佈在9 6孔洞盤中生成1 X 1 04細胞/孔洞， 且效應細胞加至各孔洞中，其中（效應細胞）：（標的細 胞）之比率爲2. 5 = 1，5 = 1或10 = 1 ，並在37 °C，5v/v%C02條件下培育4小時。依據傳統方法 ，各孔洞中上清液之放射活性偵測出以計數死之標的細胞 。在各系統中，估計死的標的細胞對標的細胞之百分率（ %)以決定胞毒水平。結果示於表4 » - ί! I —»'- - n 1 Τ ·\ ( (請先閲讀背面之注意事項#,填窝本頁) 訂_

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -58 - 4 6 465 6 五、發明説明（5e) 多肽之 濃度（pM*) A7 B7 表4 間白素2 濃度（單位/毫升） 胞毒性（％) 效應細胞：標的細胞 0 0 22 35 65 0 10 30 48 73 0.5 0 23 36 66 0.5 10 32 50 75 5 0 25 39 68 5 10 35 52 .78 50 0 29 47 73 50 10 41 59 85 500 0 37 50 83

經濟部中央標準局員工消费合作社印$L 表4之結果顯示多肽具有加強Ν Κ細胞胞毒性之活性 。如表4所示，間白素2之共存可更加強胞毒性。 眘 ΜΑ — 7 - 4 (e) p導LAK細胞之形成 依據傳統方式，衍自人類布氏（Burkite)淋巴瘤充 作標的細胞對Ν K細胞非敏感性之經5 1 C r -標記之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_阳- 500 註 於表中'PM 〃符號表示1 0 Μ 46465 6 A7 B7 經 濟 部 中 A 標 準 局 員 X. 消 費 合 作 社 五、發明説明（57) * Ra j i 細胞（A T C C C C L 8 6 )，置於9 6 孔洞微量 滴定盤中，使細胞達到 1X1 0 4細胞/孔洞，並培養 7 2小時。經培養的淋巴細胞 ，含有LAK細胞爲效應細 胞且類似實例A 一 7 — 4 ( d )製備，及標的細胞加至微 滴定盤中，其比率爲5 ：1， 10 :1 或 2 0 : 1 ，且微 滴定盤在3 7 6C ，5 ν / V % C 0 2條件之培育箱中培育 4小時。之後， 偵測各孔洞中各上清液中之放射活性，且 類似實例A - 7 —4 ( d )般估計胞毒性（％ ) 。結果示 於表5中。 表5 多肽之 間白素2 胞毒性（％) 濃度（ρίΤ) 濃度（單位/毫升） 效應細胞： 標的細胞 5=1 in: 1 20:1 0 0 11 21 34 0 10 15 28 38 0.5 0 13 22 35 0. 5 10 17 31 43 5 0 15 23 39 5 10 19 34 48 50 0 20 2 5 44 50 10 2 3 42 54 500 0 27 34 57 5JL0 1 0 3 1 fU 67 註：*表中符號 ^ ρ Μ ^ 表7K 1 0 - 12M = 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） -60 -

面 之 注

訂

464656 A7 B7 經濟部中央標準局—工消費合作社印掣 五、發明説明（58) 表5之結果顯示多肽具有誘導LAK細胞形成之活性 。如結果所示，間白素2之共存可更加強誘導作用。 甯例 A — 7 — 4 ( f ) 急性中毒試驗 依據傳統方式，以實例B - 1 一 2方法所得之經純化 多肽，以穿皮，口服或腹膜內方式投予至8週大老鼠中。 結果，經純化的多肽其L D 5。爲約1毫克/公斤以上， 投藥路徑無關。此證知多肽可安全地納入藥物中以供投 至人體。 如熟知的，I FN - r和經由拮抗細菌之感染性保 作用之人類生體防衛性，對於惡性腫瘤之生長抑制活性 及免疫調控活性深切有關。如上述，IFN_>發展成 於人類敏感疾病之作用物，並實質地研究主題疾病，劑 ，投藥路徑，及安全性。如在tCytokines in Cancer T h e r a p y # 由 F r a n c e s R · B a 1 k w i 11，編輯，Y o s h i h i k ο tfATANABE(1991)翻譯，Tokyo-lUgaku-Dojin，Tokyo， Japan出版中所述，當利用如NK細胞及LAK細胞之 手細胞作用在各樣人類疾病包括抗腫瘤免疫療法時，幾 可得令人滿意的結果。近來，已注意到在治療作用及殺 細胞之誘導或利用細胞動素加強殺手細胞胞毒性之間已 相互關係。如，T. Fujioka 於 ^British Journal of i紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐) ~ — hi 一 請 it 聞 背 面 之 注

I Μ 和 予 護 > 用 量 殺 乎 手 有 46465 6 A7 B7 五、發明説明（別）

Urology，，V〇l. 73，No.l pp2 3-3 1 ( 1 994 )中所報告的’在 利用LA K細胞及間白素2之抗腫瘤免疫療法中，間白素 2可強烈地誘導L A K細胞之形成，並在人類癌症上可展 現顯著的癌症轉移一抑制作用i而不致誘生嚴重的副作用 〇 因此其顯示，I FN— r S及殺手細胞與各樣人類疾 病之治療及/或預防深切有關，且大大地造成其完整的治 療或緩解。在這些狀況中，以及由實例A— 7 — 4 (C) 反A — 7 — 4 ( f )之結果證知，多肽可誘導免疫勝任細 胞產製IFN_r，且加強NK細胞之胞毒生或誘導 L A K細胞之形成，而不致引起嚴重的副作用。這些事實 顯示，本多肽可重覆地投予至人體而不致誘導嚴重的副作 用，並可在治療及/或預防和I F N - r及殺手細胞緊密 相關之疾病上展現令人滿意的作用。 實例B -] 融合癖Η - 1夕製備 實例Β — 1 — 1 轉形細朐KGFHH2之製備

在0.5毫升反應試管中加入8微升的25mM氯化 鎂，10微升10XPCR緩衝溶液，1微升25mM dNTP混合液，1微升2. 5單位/微升Ampl itacT DNA聚合酶，1毫微克重組韹DNA，其中含有製備自噬 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4规格（210X297公釐） 二 (請先閲讀背面之注意事項再填k本頁) /裝·

-*1T 經濟部中央標準局員工消资合作社印製 464656 A7 __________B7 五、發明説明（ 60) 菌體DNA純系之SEQ ID No. 8鹸基序列，且 含有編碼SEQ ID No.1多肽之DNA，及適量 的由 5 /—ATAGAATTCAAATGTACTTT GGCAAGCTTGAATC — 3 一 （此依據 SEQ ID No· 1近N及C末端之胺基酸序列爲基礎而化學 合成），及 5 / — ATAAAGCTTCTAGTCTT CGTTTTGAAC — 3 —代表之意識引子及抗意識引 子，且混合物溶液以蒸餾水加至總體積達1 〇 〇微升。混 合物溶液以一般方式相繼培育，9 4°C下1分鐘，_4 3°C 下1分鐘，及7 2°C下1分鐘，且此依序培育重覆3次》 生成的混合物進一步相繼培育，在9 4 °C下1分鐘，6 0 °匚下1分鐘，及7 2°C下1分鐘，且此相繼培育重覆4 0 次以達成PCR反應。 生成的PC R反應混合物及tpCR-Script SK( + )〃 ， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 一種購自 Stratagene Cloning systems, California, USA,之質體載體，以D ΝΑ連接酶連接以得重組體 D N A，其再以勝任細胞引入’ E s c h e r i c h i a c ο 1 i X L - 1 B 1 ueMRF’ Kan# 中，一種購自 Stratagene C 1 on i ng Syst e ms, California，USA之微生物，以轉形微生物。如此得到 的轉形細胞接種至含有5 0微克/毫升氨苄青微素之L肉 汁中（pH7. 2)，再於37°C震盪條件下培育18小 時，再將生成的培育物離心以收集經增殖之轉形細胞’再 以傳統的鹼- SDS方法分離重組體DNA »提供部份重 組體DNA，二去氧方法分_析，結果顯示其含有一段 本纸烺尺度適用中國國家擦準（CNS ) A4规格（210X297公釐） -63 - 4 6 465 6 A7 B7 五、發明説明（ei) DNA，其在SEQ ID No. 8之及3'—末 端處有EcoRI及Hi nd ΙΠ解離位置，一個啓動多 肽合成之甲硫胺酸密碼子及在相當於SEQ ID No ,8 N及C -末端前及後位置之所在，以及可終止多肽合 成之TAG密碼子。 SEQ ID N0:8: TAC TTT G.GC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGA AAT TTG AAT 43

Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val lie Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAG CAA GGA AAT CGG CCT CTA TTT GAA GAT 96

Asp Gin Val Leu Phe lie Asp Gin Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GAT AAT GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT 144

Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr lie Phe lie 35 40 45 ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGO CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC 192 lie Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gin Pro Arg Gly Met Ala Val Thr lie 50 55 60 TCT GTG AAG TGT GAG AAA ATT TCA AYT CTC TCC TGT GAG AAC AAA ATT 240

Sar Val Lys Cys Glu Lys lie Ser Xaa Leu Ser Cys Glu Asn Lys He 65 70 75 80 ATT TCC TTT AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA 238 lie Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn lie Lys Asp Thr Lys 85 90 95 AGT GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AAT AAG 336

Ser Asp lie lie Phe Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTA GCT TGT GAA 384

Met Gin Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA AAA GAG GAT GAA TTG 432

Lys Glu Arg Asp Leu Pha Lys Leu 工le Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT CAA AAC GAA GAC 471

Gly Asp Arg Ser lie Met Phe Thr Val Gin Asn Glu Asp

經濟部中央標準局貝工消费合作社印I (請先聞讀背面之注意事項再/填k本頁) 145 X50 155

留下的重組體DNAs ，以限制酶EcoRI及 H i n dm 解離，且 0 . 1 微克以，DNA LIGATION KIT V e r s i ο η 2 *種購自 T a k a r a S h u z o C ο.，L t d,， Tokyo, Japan之DN A連接套組）所得之生成的 EcoRi— Hi ndmDNA片段，及10毫微克a 本紙ί艮尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 64 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 6 4 6 5 6 .η _Β7_ 五、發明説明（62) ρΚΚ233 — 3# (—種 hno logy AB，Uppsdla Sweden之質體載體）’其先前已用 上述限制酶解離，將其在1 6 °C下培育3 0分鐘以連接而 得可複製之重組體DNA tpKGFHH2"。利用勝任 細胞法，大腸桿菌Y 1090株（ATCC. 3 7 19 7 )以可複製的重組體DNA PKGFHH2轉形，所形 成的轉形細胞"VKGFHH2"接種至含有50微克/毫 升氨苄青徽素之L肉汁中（pH7_ 2) ’並在37°C及 震盪條件下培育1 8小時。生成的培養物離心以收集經增 殖之轉形細胞，且取其一部份以傳統的s D S -鹼·方法處 理以萃取重組體DNA PKGFHH2。如3所示，以 二去氧方法分析顯示，在重組體DNA PKGFHH2 中，含有SEQ ID No. 8中鹼基序列之* KGFHH2 c DNA連接至Ta c啓動子之下游。 窨例B - 1 - 2 白鑪形細朐K G F Η Η 2中產製多肽 含有5 0微克/毫升氨苄青徽素之L肉汁（pH 7. 2)以真空壓熱法滅菌，冷卻至37ΐ，以實例B— 1 一 1之轉形細胞KGFHH 2接種，並在相同溫度下培 育1 8小時，於震璗條件下得種子培養物。1 8升的相同 培養基新鮮製劑置於2 0升醱酵槽中’如上述般滅菌’冷 卻至3 7°C，以1 ν/ν赂種子培養物接種，再於相同溫 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210Χ297公釐）—65 - {請先閲讀背面之注意事項再 /填寫本貫) :裝· 訂_ 464656 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（63) 度下培養8小時，在需氣及攪動條件下進行°生成的培養 物離心以收集細胞，其再懸浮於由1 5 0 m Μ氯化納’ 1 6 mM磷酸氫二鈉，及4 mM磷酸二氫鈉組成之混合溶 液中（pH7 . 3 )，以超音波瓦解，再離心移去細胞殘 屑得上清液。 加硫酸銨至上清液，使濃度可高達4 Ow/ν%並溶 解至勻質狀，溶液再離心得上清液。上清液先混合以含有 1 . 5M硫酸銨之1 5 OmM磷酸鹽緩衝溶液（pH 6. 6)，再填加至充填有"PHENYL SEPHAROSE" 之管 柱中，此爲 Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala ,Sweden之產品，其先用含有1. 5M硫酸銨之10 mM磷酸鹽緩衝溶液平衡，再以相同緩衝溶液之新鮮製劑 洗管柱，管柱中再填加由1. 5M至0M於10mM磷酸 鹽緩衝溶液之硫酸銨緩衝溶液梯度（PH6. 6)。 匯集在約1. 0M硫酸銨處溶離之流份，以膜過濾， 對lOmM磷酸鹽緩衝溶液（pH6. 5)在4°C下透析 18小時，並填加至充填有""DEAE 5PW〃 之管 柱中，此爲 T 〇 s 〇 h C 〇 r ρ 〇 r a t i ο η，T 〇 k y 〇, J a p a η 之產品， 其先前已用lOmM磷酸鹽緩衝溶液（pH6. 5)平衡 ，再以相同緩衝溶液之新鮮製劑洗滌管柱，並以〇M至 0 . 2M氯化銨於1 OmM磷酸鹽緩衝溶液（p H 6 . 5 )之緩衝溶液直線梯度填加，同時收集在〇. 05氯化鈉 處溶離之流份。 之後，流份以膜濃縮’再填加至充填有、S U P E R 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐）~1 eo (請先閲讀背面之注意事項#填k本頁)

裝· A7 B7 464656 五、發明説明（64 ) DEX 75夕之管柱中，此爲 Pharmacia LKB Βίο.ΐ-ε c h η ο 1 o g y A B ， U p p s a 1 a, S w e d e η 之產品 ，其 以碟 酸鹽緩 衝之食鹽水（下文以^PBS"縮寫之）平衡，再以 P B S之新鮮製劑填加至管柱以收集相當於約 18，500道耳吞之流份。因此，可得含有約5. 2毫 克絡純化蛋白質之水溶液。整個純化中之總產率爲約1 0 分析經純化的蛋白質，且發.現其具有以下物化特性： 當在還原條件下於S D S —聚丙烯醯胺凝膠上電泳經純 化的蛋白質呈主蛋白質帶型式，具有I FN-r誘導力及 位於相當於18，500±3，000道耳吞之位置，同 時pi值爲4. 9±1. 0(在色譜聚焦上）。含有經純 化蛋白質N —末端之胺基酸序列，具有SEQ ID No.9中之胺基酸序列，相當於在SEQ ID No. 1中，且其中甲硫胺酸偶合至其N —末端。 | SEQ ID N0:9:

Met Tyr Phe Gly Lyg Leu Glu Ser Lya Leu Ser 1 5 l〇 - * I · · 實例B — 1 — 3 融合瘤H — ：!之製備 1 0週大的BAL B/c老鼠，腹膜內注入2 0微克 /老鼠的經純化多肽，此得自實例B — 1 — 2 ’並加上完 全的Freund’s佐劑。老鼠進一步以相同劑量在2週間隔 下注射，並於最後一次注射後一週靜脈內注入相同劑量， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ -- —-: I HI I I IJ\ / ^ 1^1I V/. (請先閱讀背面之注意事項年考歸本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 ' 46465 6 A? B7 五、發明説明（65 ) 萃取其脾臟再懸浮以得細胞懸液* 脾細胞及來自老鼠骨髓瘤之S P 2/0 — A g 1 4細 胞（ATCC CRL1581)懸浮於RPMI 1640培養基（pH7. 2)，其分別在3x10 4細 胞/毫升及1 X 1 04細胞/毫升細胞密度下預加熱至3 7 °c，並離心以收集沈積物。再以1分鐘在沈積物上逐滴加 入含有50W/V聚乙二醇（平均分子量1，5 0 0道耳 吞）之1毫升無血清RPMI 1640培養基（pH 7 . 2)，且混合物在37 °C下培育1分鐘，再將無血清 之RPMI 1 640培養基逐滴加入混合物中（pH 7. 2)使達50毫升總體積，離心混合物，再收集所形 成之沈積物。如此得到的沈積物懸浮於H A T培養基中， 分佈至9 6孔涧微滴定盤中每孔洞2 0 0微升，並在3 7 eC下培育1週，再選擇融合瘤。 經濟部中央標準局貞工消費合作社印製 (諳先閱讀背面之注意事項再/,.¾本頁) ' 在各孔洞中之上清液中分泌出之抗體含量，在酵素免 疫分析法上進行分析，其以抗體及實例B - 1 _ 2方法所 得之經純化多肽之免疫反應爲基礎，再選出可與經純化多 肽強烈反應之融合瘤。可產製本單株抗體之經選殖的融合 瘤Η - 1細胞，以一般方式獲得，係以有限的稀釋重覆處 理這些融合瘤而成。 眚例B — 2 鄹備翬株抗體Η— 1 mA b，並在西方墨點枝術上分析 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）„ 68 464656 A7 B7 五、發明説明（66 ) 實例B - 2 - 1 製備單秩杭體Η -·I mAb 以實例B - 1 ™ 3方法所得之融合瘤Η— 1細胞，懸 浮於添加有5ν/ν牛血清之RPMI 1640培養基 中（ΡΗ7. 2)，使細胞密度達到約1Χΐ0β細胞/ 毫升，再於3 7°C，5 v/v C〇2條件之培養箱中培育 ，同時擴大培養物。當培養物之細胞密度達到預定水平， 增殖之融合瘤Η— 1細胞以I X 1 07細胞/老鼠腹膜內 注入8週大的BACB/C老鼠中，其則在先前已經’腹膜 內注射入0. 5毫升，再以一般方法餵養老鼠一週* 自老鼠中收集腹水，以P B S稀釋劑3倍’與硫酸銨 混合使達5 Ow/ν%飽和度，令其在4°C下靜置2 4小 時，並離心收集沈積物。沈積物以2 OmM磷酸二氫鉀（ pH 6. 7)在4 °C下透析一夜。填加至羥磷灰石管柱內 ;其則已先用相同水溶液之新解製劑平衡，再將由2 0 mM至3 0 OmM磷酸二氫鉀緩衝溶液（PH6 7 )之 線性梯度填加至管柱，以得含有本單株抗體Η—ImAb 之水溶液。產率爲每隻老鼠約5毫克。傳統的分析顯示’ 抗體屬於IgGl類型* 啻例B — 2 — 2 在西方黑點上分析 以實例B _ 1 — 2方法所得之1微克的經純化多肽， (諳先聞讀背面之注意事項号4為本頁) .裝· 訂' Γ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 69 - 464656 A7 ____B7_ 五、發明説明（6了） 加至由100毫克二硫異赤弱藻醇，〇. 5毫升10w./ v%S D S水溶液，及1毫升甘油組成之混合溶液中，且 混合物在3 7°C下培育1小時，並在S D S —聚丙烯醯胺 凝膠上電泳。生成之凝膠以一般方式轉移至硝化纖維膜上 ’其再浸於融合瘤H_1細胞之培養物上清液中1小時， 並以含有0. 05v/v%tween20之50mM Tris—HCJ?緩衝溶液（pH7. 5)洗滌，以移去 過量的抗體。膜進一步在含有抗-老鼠Ig抗體（製備自 兔子）之P B S中浸一小時以達成免疫反應，以含有. 0. 0 5 y / v % % tween 20 之 50mM Tris-HCS緩衝溶液（PH7. 5)洗滌，並戾於 含有0.005v/v%過氧化氫及0· 3毫克/毫升3 ，3-—二胺基聯苯胺之50mM Tris— HCj?緩 衝溶液（pH7. 5)以達成著色反應。 至於對照組，提出利用重組人類間白素1 2取代純化 多肽之系統，並如上類似地處理。以牛血清白蛋白1 MW =67，000道耳吞），卵白蛋白1MW= 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再本頁) 45，000道耳吞），碳酸酐酶（MW=30，〇〇〇 道耳吞），胰蛋白酶抑制劑（MW=20，10〇道耳吞 )，及L-乳清蛋白（1MW=14，400道耳吞）爲 標幟蛋白質。這些結果於第4圖中。 由圖4中證知，皐株抗體H_ lmAb可與以實例B 一 1 一 2方法所得之經純化的多肽（1列）特異地反應， 但不與人類間白素1 2 ( 2列）反應。此可證知本單株抗 本紙張尺度適财國國家標準（CNS)A4祕（21〇x297公釐〉 : 經濟部中央標準爲員工消費合作社印製 464656 A 7 __B7 _ 五、發明説明（68 ) 體可與具有特殊胺基酸序列之.多肽特異地反應。 眚例B — 3 製備融合瘤H — 2及單株抗體H— 2mAb 以實例B - 2 - 1之方法可類以地製備單株抗體一融 合瘤H-2，除了使用P3— X63— Ag8細胞（ ATCC TIB9)替代SP/O—14Ag細胞之外 實例B - 3 製備單株杭體H — 2mA b 融合瘤Η - 2實例B _ 3 — 1中得到後，類似實例B 2 — 1般培養，且純化培養物以得每BAL B/c老鼠 約5· 6毫克的單株抗體H~2mAb。經傳統分析顯示 ’單株抗體屬於IgM型式，且當類似實例B — 2 — 2般 在西方墨點上分析時，以實例B — 1 方法所得之經純 化之多肽可與其特異地反應。 實例B — 4 在免疫親和力匾析上純化多肽 實例B — 4 — 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注f項lv-為本頁) "裝· 訂 -71 - ^46465 6 A7 B7 五、發明説明（69 ) 製備用於免疫親和力層析之凝膠 (請先聞讀背面之注意事項幕/..%本頁) 以實例B _ 2 — 1方法所得之8 0毫克單株抗體H — ImAb，稱重再以含有0· 5M氯化鈉之0. 1M硼酸 鹽緩衝溶液（PH8. 5)在4 °C下透析一夜。令4克1" 經 C N B r —活化之 Sepharose 4B〃 ，一種購自 ΡΙ^ηϋ-α c i a L K B B i ο ΐ e c h η ο 1 o g y A B ， U p p s a 1 a ， S w e d e η 之 水不溶 性載劑，以1 m M氯酸水溶液泡脹，再以相同緩衝溶液之 新鮮製劑及0. 1Μ硼酸鹽緩衝溶液（ρΗ8. 5)(其 中含有0 . 5 Μ氯化鈉）相繼洗滌，摻合以約1 0毫升以 上述方法所得之單株抗體水溶液’並相繼培育在環境溫度 及4 °C下一夜，在緩和攪拌條件下進行。之後，生成的凝 膠以1M乙醇胺溶液（ρΗ8· 0) ，0. 1Μ硼酸鹽緩 衝溶液（ΡΗ8. 5)(其中含有0· 5Μ氯化鈉），及 0. 1Μ醋酸鹽緩衝溶液（ΡΗ4. 0)相繼洗滌，這些 洗滌步驟並重覆5次/最後，凝膠以P B S洗滌以得可用 於免疫親和力層析之凝膠。傳統的分析顯示，約6毫克單 株抗體H — ImAb可連接至1毫升凝膠上。 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 實例B — 4 - 2 在兔疮親和力層析上純化多肽 實例B—4—1中用於免疫親和力層析之10毫升凝 膠，填加至塑膠圓筒型管柱中，以P B S洗滌，再充填以 10毫升含有約0. 1毫克/毫升以實例B— 1 — 2方法 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐）_ _ 4 6465 6 A7 _B7_____ 五、發明説明（7〇 ) 所得之多肽之苯基Sepharose溶離流份β管柱以P B S 之新鮮製劑洗滌，再充填以含有1M氯化鈉之0· 1M# (請先聞讀背面之注意事項再〆.％本頁) 胺酸—HCj?緩衝溶液，以收集有I 誘導活性之 流份。流份匯集，以P B S在4°C下透析一夜’濃縮’並 分析I FN— r誘導活性及蛋白質含量，且結果顯示此純 化步驟可生成純度爲9 5w/w%以上的純化多肽，產率 爲約1 0 0 %。 啻例B — 5 亦酶素奋疮分析上偵測多肽 經濟部中央標準局負工消費合作社印繁 兔手以一般方式以實例B - 1 — 2方法所得之純化多 肽免疫接種，並收集其血液。自血中分離免疫球蛋白G抗 體，並溶於FB S中使濃度達2 0微克/毫升，且溶液分 佈至9 6孔洞微滴定盤中，含量爲每孔洞1 0 〇微升。微 滴定盤在環境溫度下培育3小時，再移去含有I g G之溶 液，加入含有w/v%牛血清白蛋白之P B S，含量爲每 孔洞2 0 0微升，並令其靜置4 °C下一夜。 移出微量滴定盤上經磷酸鹽緩衝之食鹽水，其再以含 有 0. 0 5v/v%twe e η20 之 PBS 洗滌，並注 入每孔洞1 00微升實例B_l — 2方法所得之經純化多 肽，其則以含有0· 5w/v%牛血清白蛋白之PBS適 當稀釋製成溶液，再於環境溫度及震盪條件下反應混合物 溶液歷2小時。微滴定盤以含有0. 05ν/ν% 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Α4規格（2i〇X297公釐} _ 73 _— ' 464656 A7 ___^_B7___ 五、發明説明（Ή)

twe e η20之PBS洗滌，並注入每孔洞1 〇〇微升 含有單株抗體Η- 1 mA b並經生物素標記之溶液，反應 溶液在環境溫度下反應2小時（震盪條件下），以含有 0. 05v/v%tween 20之PBS洗滌微滴定 盤，注入每孔洞1 0 0微升含有辣根過氧化物酶及鏈抗生 物素蛋白複合物之溶液，生成的混合物在環境溫度及震盪 條件下進一步反應2小時》之後，以含有0. 05V/V %tw_e e η 2 0之PB S洗條微滴定盤，並在4 9 2毫 微米波長下偵測辣根過氧化物酶連接至經純化多肽之活性 ，此中利用鄰近一苯二胺爲受質。結果示於表6中》 表6 (請先閱讀背面之注意事項再ν^·本頁)

訂 經濟部中夾揉準局員工消費合作社印f. 多肽濃度 (微微克/毫升） 492毫微米* 下之吸光度 相對誤差 (%、 ί，00 0 1. 51± 0. 05 3.3 500 0. 93± 0. 05 5.4 250 0. 55± 0. 03 5.5 100 0. 25 ± 0.02 8.0 50 0. 137± 0. 007 5. 1 25 0. 08 0 ± 0.007 8.8 0 0. 024 ± 0. H07 一 註：*表示三次之統計值 Λ> 由表6結果證知，依據本發明之偵測方法，可正確地 巧張纽適用中國國家標隼（CNS ) Α4规格（210X297公釐）_ μ _ — Π 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 464656 A7 _B7__ 五、發明説明（72 ). 分析約50-1，000微微克/毫升範圍之多肽。 實例B — 6 於放射诺瘅分析h倌湖丨多舦 兔子以一般方式以實例B — 1 - 2方法所得之經純化 多肽免疫，共收集其血液，再分離IgG抗體。抗體以一 般方式吸附在聚苯乙烯珠粒上以行放射免疫分析，並令其 靜置在含有牛血清白蛋白之P B S中，於’4 °C 下一夜以得經回化之抗體》 試管中置入一個珠粒，浸於0. 2毫升由實例B-1 一2方法所得之經純化多肽以含有0. 5w/v%牛血清 白蛋白之P B S稀釋製備之溶液，並令其在4 eC下靜置4 小時。之後，珠粒以含有0. 〇5v/v%twe e η 20及0. 5w/v%牛血清白蛋白之PBS洗滌，浸於 0. 2毫升（1X10 5c pm)含有實例B-3 — 2方 法所得之單株抗體H-2mAb並標以1251之溶液，再 令其於4 °C下靜置一夜。移去過量經125 I —標記之抗體 後，珠粒以含有0· 05v/v%tween20及 0. 5w/v%牛血清白蛋白之PBS洗滌，再於r —計 數器上計數珠粒之放射活性。結果示於表7中》 (請先閱讀背面之注意事項^-^%本||) 訂 Γ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -75 -

4 6465 S A7 B7 多肽濃度 Γ微微宽/毫升） 計數$ (ΓΡΜ) 相對誤差 (¾) ι,οοο.ο 6, 900 ± 200 2.9 5 0 0.0 4, 1 00 ± 20 0.5 250.0 2, 39 0 ± 50 2.1 125.0 1· 5 9 0 ± 70 4.4 62.5 880 ± 10 1.1 fi 700 ± 20 - ------„--------- (請先聞讀背面之注意事項再〆..%本貫) 註：* 符號表示三次之統計數值。 由表7之結果證知，本偵測法可正確地分析約1 〇 0 一 1 ，〇〇〇微微克/毫升範圍中之多肽。 窗例c 一 溶液劑 以實例B _ 1 — 2方法所得之多肽，溶於含有1 W/ V%人類血清白蛋白爲穩定劑之生理食鹽水中，以得1毫 克/毫升多肽溶液，其以膜過濾滅菌以得溶液劑。 多肽具有令人滿意的穩定性，可充作注射劑，眼用溶 液劑，及灌鼻藥，以治療及/或預防敏感疾病如惡性腫瘤 ，病毒疾病，細菌傳染性疾病，及免疫疾病。 本紙張尺度適用中國國家標本（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐）_ 76 _ 、1Τ 經濟部中央橾準局員工消費合作杜印製 4 6465 6 A7 B7_________ 五、發明説明（74 ) 實例C — 2 (請先閲讀背面之注意事項-)5--<為本頁) 乾式注射劑 以實例B — 1 一 2方法所得之多肽，溶於1 〇 〇毫升 含有lw/v%經純化明膠爲穩定劑之生理食鹽水中，且 溶液以一般方式以膜過濾滅菌。一份1毫升的經滅菌溶液 分裝於小瓶中，冷凍乾燥再加蓋熔封。 產物具令人滿意的穩定性，可充作乾式注射劑以治療 及/或預防敏感疾病，如惡性腫瘤，病毒疾病’細菌性疾 病，及免疫疫病。 實例C — 3 油膏 'HI-BIS-WAKO 104# ，一種購自 ffako Pure Chemic- als，Tokyo，Japan之駿.乙稀基聚合物，及經純化的海藻 糖溶於蒸餾水使濃度分別爲1. 4w/w%及2. Ow/ 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 w%，且以實例B - 1 _2方法所得之多肽溶於溶液中使 達均質，再將生成的溶液調至PH7. 2，以得含有約1 毫克/克多肽之糊劑。 產物有令人滿意的散而性及穩定性，可充作油膏以治 療及/或預防敏感性疾病，如惡性腫瘤，病毒疾病，細菌 傳染性疾病，及免疫疾病。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）^ _ 77 — 4 6 4 6 5 6 A7 B7_ 五、發明説明（75 ) 眚例C _ 4 錠劑 以實例B — 1 _2方法所得之多肽，及LUM I N即 〔雙一4~(1—乙基喹啉〕〔r_4，一（1—乙基喹 啉〕五甲硫胺酸喹啉藍，充作細胞活化劑’與"FINETOS-E® 〃，一種購自 Hayashibara Co.，Ltd. ’Okayama，Japan 之無 水晶狀 r_ 麥芽糖 ，混合至均質’ 且混合物以一 般方式利用製錠機製錠，以得各約2 0 0毫克之錠劑，其 中含有各約1毫克之多肽及LUMI N。 產物具有令人滿意的容服力，穩定性及細胞活化活性 ，且可充作治療及/或預防敏感性疾病之錠劑，如惡性腫 瘤病毒性疾病，細菌傳染性疾病，及免疫疾病。 會例C — 5 .摘繼件免疫治療劑 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再本頁) 自有惡性淋巴癌之病人周邊血液中分離單核細胞，懸 浮於添加有1 0 V/V%人類AB血清之RPM I 1640培養基（PH7. 2)，並預熱至37 °C使細胞 密度達約1x10 e細胞/毫升，再與約1. 0微克/毫 升多肽（以實例B — 1 — 2方法獲得）及約1 0 0單位/ 毫升重組人類間白素2混合，再將生成物培育於5 v/v %C ◦ 2及3 7 °C之培育箱中一週，並離心生成培養物以 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A*)規格（210父29?公釐)~ -78 - 經濟部十央標準局員工消費合作社印製 4 b 4 6 5 6 A7 _____B7_ 五、發明説明（76 ) 收集L· A K細胞。 如此得到的L A K細胞當引入供者病患體內時，可在 淋巴瘤細胞上呈現強的胞毒性，且較利用間白素2單獨於 過繼性免疫療法所得的可呈現更高之胞毒性。將入病人腫 瘤組織之淋巴細胞類似地處理而得之胞毒T細胞，替代上 述的淋巴細胞注入供者病人體內，可造成與由LAK細胞 所得之相似作用。過繼性免疫治療劑可任意使用以治療固 體惡性腫瘤，如腎癌，惡性黑色素瘤，結腸癌，直腸癌， 及肺癌。 本發明是以新穎多肽之發現爲基礎，其可誘導免疫勝 任細胞產製I FN- r。多肽是一種物質，有部份或完全 顯示之胺基酸序列，且穩定的誘導免疫勝任細胞產製 I F N _ ?·之活性。 多肽具有強的I F N - r誘導性，如此僅以少量即可 誘生欲求含量之I F N_ r產生。多肽不會造成嚴重的副 作用，即使當以相當高劑量投予時，因爲其具極低毒性。 因此，本多肽具有可立即誘導欲求量I FN— r產生之優 點，而勿需嚴格控制劑量。 本單株抗體可與多肽特異地反應，且可廣泛用於純化 及多肽之偵測。抗體利用融合瘤製備可達欲求含量。 用於敏感疾病之本作用物在治療及/或預防敏感疾病 上展現令人滿意的作用，如惡性腫瘤，病毒疾病，細菌傳 染性疾病，及免疫疾病。再者，作用物具有加強殺手細胞 胞毒性之活性，或誘導殺手細胞形成之活性，並在治療嚴 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）~~~ -iy - {請先聞讀背面之注意事項—/'為本頁)

訂 4 6 4 6 5 6 a? B7 五、發明説明（打） 重疾病如惡性腫瘤上展現令人滿意的作用。 因此，本發明是一個重要的發明，其有顯著的作用並 對此領域有重大貢獻。 雖然此中已描述何者本發明較佳之具體實例，但仍要 了解此中仍可有各樣的變化，且全部涵蓋在所附之申請 專利範圍中，只要其落在本發明真實精神及範圍之內》 (請先閱讀背面之注意事項再/,%本頁) 訂- m 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2I〇X297公釐） 一 80 _

Claims (1)

1. 第84110504號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國90年7月修正 1 . 一種誘導免疫勝任細胞產製I FN- r之多肽， 其具有SEQ ID No.1所示之胺基酸序列（其中 符號，Xa a，表示"異白胺酸，或’蘇胺酸”），且在 硫酸十二酯鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（SD S_PAGE) 上具有18，500±3 ’ 000道耳吞之分子量’在色 譜聚焦上具有4. 9±1. 0之等電點’ SEQ ID N0;1: Tyr Phd Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val lie Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 Asp Gin Val Leu Phe lie Asp Gin Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr lie Phe lie 35 40 45 工le Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gin Pro Arg Gly Met Ala Val Thr lie 50 55 60 Ser Val Lys Cys Glu Lys lie Ser Xaa Leu Ser Cys Glu Asn Lys lie 65 70 75 80 工le Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn lie Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp lie 工le Phe Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met: Gin Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser lie Met Phe Thr Val Gin Asn Glu Asp. 145 150 155 、 2. —種編碼申請專利範圍第1項之多肽的DNA ’ 及其簡併序列，其中該簡併序列係編碼SEQ ID N ◦ : 1所示的胺基酸序列。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS>A4規格（210 X 297公釐> -1 - -!<f .^1 1ΙΙΙΪΙΙΙ —^- I — (請先閱讀背面之注$項再填寫本頁> 一 訂 ί I 1 I I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印3Ϊ 4 6465 6 A8 F18 C8 D8 六、申請專利範圍 3 如申請專利範圍第2項之DNA，其具有SEQ I D NO : 2所示之核苷酸序列， ；TACTTTGGCA AGCTTGAATC TAAATTATCA GTCATAAGAA ATTTGAATGA CCAAGTTCTC 60 XTCATTGACC AAGGAAATCG GCCTCTATTT GAAGATATGA CTGATTCTGA CTGTAGAGAT 120 AATGCACCCC GGACCATATT TATTATAAGT ATGTATAAAG ATAGCCACiCC TAGAGGTATG 180 GCTGTAACTA TCTCTGTGAA GTGTGAGAAA ATTTCAAYTC TCTCCTGT.GA GAACAAAATT 240 ATTTCCTTTA AGGAAATGAA TCCTCCTGAT AACATCAAGG ATACAAAAAG TGACATCATA 300 TTCTTTCAGA GAAGTGTCCC AGGACA.TGAT PlATAAGATGC AATTTGAATC TTCATCATAC 360 GAAGGATACT TTCTAGCTTG TGAAAAAGAG AGAGACCTTT TTAAACTCAT TTTGAAAAaX 420 GAGGATGAAT TGGGGGATAG ATCTATAATG TTCACTGTTC AAAACGAAGA C 471 4.如申請專利範圍第2項之DNA’其具有SEQ ID No· 6所示之核苷酸序列（其中符號、Xaa ，表示"異白胺酸#或，蘇胺酸# ): (請先閱讀背面之注意事項再填寓本頁) .—.—,—']111.1· II ^1- ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙ^Λ«— — — 111— - HI — — — — — — 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 V 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x 297公釐）-2- 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製 464656 I D8 六、申請專利範圍 SSQ ID N0:6: GCCTGGACAG TCAGCAAGGA ATTGTCTCCC AGTGCATTTT GCCCTCCTGG CTGCCAACTC 60 TGGCTGCTAA AGCGGCTGCC ACCTGCTGCA GTCTACACAG CTTCGGGAAG ACGAAAGGAA 120 CCTCAGACCT TCCAGATCGC TTCCTCTCGC AACAAACTAT TTGTCGCAGG AATAAAG 177 ATG GCT GCT GAA CCA GTA GAA GAC AAT TGC ATC AAC TTT GTG CCA ATG 22S Mer Ala Ala Glu Pr3 Val Glu Asp Asn Cys 工le Asn Phe Val Ala Μβτ 1 5 10 15 AAA TTT ATT 'GAC AAT ACG CTT TAC TTT AT A GCT GAA GAT GAT GAA AAC 273 Lys Phe lie Asd Asn, Thr Leu Tyr Phe lie Ala Glu Asp Asp Glu Asn 20' 25 30 CTG GAA TCA GAT TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA 321 Leu Glu Ssr Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val lie 35 40 45 AGA AAT TTG AAT GXC CXA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGX AAT CGG CCT 3S9 Arg Asn Leu Asn Asp Gin Val Leu Pha lie Asp Gin Gly Asn Arg Pro 50 55 60 CTA TTT GAA- GAT ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GXT AAT GCA CCC CGG 417 Leu Phe Glu Asp Mst Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asrv Ala Pro Xrg 65 70 75 SO ACC ATA TTT ATT ATA AGT ATG TAT XAA GAT AGC CAG CCT AGA GGT ATG 465 Thr lie Phe lie 工le Ser Mer Tyr Lys Asp.Ser Gin Pro Arg Gly Mar .S5 90 95 GCT GTA ACT ATC TCT GTG AAG TGT GAG AAA ATT TCA AYT CTC TCC TGT 513 乂 la Val Thr. lie Ser Vai· Lys. Cys Glu Lys lie Ser Xaa Leu Ser Cys 100 105 110 GAG AAC AAA ATT ATT TCC TTT XAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC 561 Glu Asn Lvs lie lie Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn lie 115 120 125 AAG GAT ACA AAA AGT GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT (3TC CCA GGA 609 Lys Asp Thr Lys Ser Asp .I1& 工le Phe Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly 130 135 140 CAT GAT AAT AAG ATG CAA .-TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA. GGA TAC TTT 657 His Asp Asn Lys Mer Gin Phe Giu Ser Set. Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe 145 150 155 160 CTA GCT TGT GAA AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG ΑλΑ ΑΛΑ 705 Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Aso Leu Phe Lvs Leu lie Leu Lys Lys 165 17Q 175 GAG GAT jSAA TTG GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT CAA AAC GAA 753 Glu Asp blu Leu Gly Asp Arg Sar lie Mec Phe Thr Val Gin Asn Glu ISO 185 190 GXC TAGCTA TTAAAATTTC XTGCCGGGCG CAGTGGCTCA CGCCTCTAAT CCCAGCCCTT 812 Asp .TCGGAGGCTC AGGCGGGCAG ATCACCAGAG CTCAGGTGTT CAAGACCAGC CTG^CCAACA 672 TGGTGAAACC TCATCTCTAC TAAAAATACT*AAAAATTAGC TGAGTGTAGT GACCCATGCC 932 CTCXATCCCA GCTACTCAAG AGGCTGAGGC AGGAQAATCA CTTGCACTCC GGAGGTACAG 992 GTTGTGGTGA GCCGAGATTG CACCATTGCG CTCTAGCCTG GGCAACAACA GCAAAACTCC 1052 ATCTCAAAAA ATAAAATAAA TAAATAAACA AATAAAAAAT TCATAATGTG ΑΑΑΑΑΑΛΑΑΑ 1112 AAAAAAAA 1120 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x297公釐）-3 - (請先閱讀背面之注意事項再填窝本頁) 袭 訂--------線/ 4 6 4 6 5 6 Λ8 F；8 C；8 DS 六、申請專利範圍 5.如申請專利範圍第2項之DNA·其係衍自人類 〇 6 . —種用於抗腫瘤免疫療法之藥學組成物，其包括 有效劑量之作爲活性組份的申請專利範圍第1項之多肽， 及/或其藥學上可接受之載劑。 7. 如申請專利範圍第6項之藥學組成物，其中該多 肽可加強殺手細胞之胞毒性及/或誘導殺手細胞之形成。 8. 如申請專利範圍第6項之藥學組成物，其中該殺 手細胞爲選自下列之成員包括NK細胞，LAK細胞（淋 巴激素活化之殺手細胞）及胞毒性T一細胞。 9. 如申請專利範圍第6項之藥學組成物，其額外地 含有一個以上選自下列之成員，包括間白素2，間白素 1 2及力豆球蛋白A » 10. 如申請専利範圍第6項之藥學組成物，其含有 作爲穩定劑的選自下列一種以上之成員，包括血清白蛋白 ，明膠，麥芽糖及海藻糖。 1 1 .如申請專利範圍第6項之藥學組成物，其含有 按乾固計爲0. 000001-100w/w%的多肽。 中國國家標準（CNS)A4規格（210^ 297公釐〉-4 - (請先閱讀背面之注意事項再春寫本頁) ----ί — 訂 i! 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製