TW406130B - Methods of in vitro predicting a patient's susceptibility to increase periodontal disease severity and the kits therefor - Google Patents

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Description

經濟部中央揉準局負工消费合作社印装 406130 A7 ______B7五、發明説明（丄） 發明背景 技術領域 本發明傜關於一種檢_ 一牙周病之簌重性的潛在因素 之方法。 技術背景 牙周病傺一種支持牙齒之堅硬及柔軟組織的疾病，且 由口腔細菌所引起。齒齦炎為牙周病之先期，該處齒齦可 能變红、浮腫且易於出血。齒齦炎通常不痛，且如不治療 可進化為齒周膜炎，其可藉由組織破壞之大小而分類為輕 徹、中度或駸重。齒離炎主要為一成人之疾病，且通常不 會在35歲前檢出。 存在於齒菌班上之細菌引發牙周病。該細菌於齒菌班 産生之毒素激發了身體之發炎及其他免疫機制，其最後造 成支持牙齒之骨骼及齒齦組織的破壞。隨著該疾病演變， 齒齦自牙齒拉離並形成齒周袋，其提供該細_ 一受保護之 環境*藉此使該循環繼續。然而有些部位不會持缠為活潑 的。美國專利第5 , 328,829號掲示一種用於藉由於該部位 測量間白素IL-1 ;3而決定口腔内活潑之牙周病部位的方法 。吸煙已被與齒周膜炎增加之普及性及嚴重性聯想。然而 ，顯著數量的患齒周膜炎値體從未吸煙：· 在過去15年，有證據指出某些感染年輕兒童及十幾歲 青少年之齒周膜炎型態被以遣傳學方法決定。這些在族群 中普及性極低之疾病，在青春期前的一些個體及其他介於 — I 111 I. I I I 11 J— 訂一^ 11 ，線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4见格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 406130 經濟部中央揉準局貝工消費合作社印製 A7 B7_五、發明説明（2 ) 青春期至18歲間的個體上産生駸重之齒周膜炎。在那些病 例中所鑑定出之遣傳因子涉及極似先置多種建康問題於該 値體的極明顯之生物機制。至今，在成人型齒周膜炎中尋 找該同型遣傳因子之努力仍未成功。 雖有以上之失敗，自1990年起新証據顯現自同卵雙胞 胎的研究，其指出遣傳在成人型齒周膜炎之疾病臨床表現 上扮演一顯著角色（Michalowicz, etai.，1991)。當該 雙胞胎研究指出存在有一遣傳成份時，其未被鑑定出。將 易感病於駸重成人齒周膜炎之患者檢定出來將會是有用的 〇 一旦檢測出該基因，對於與一至二値基因相關或由其 所造成之疾病的遣傳測試（參見美國專利第4,582,788及 5,110,920號），以決定帶有該疾病之一持定基因的傾人 之危險性（參見美國專利第4,801，531、4,666,828及 5,268,267號）是現今可行的。 當有任何感染時，一旦引發，身體之發炎及其他免疫 機制發E卩加入戰局（參見美國專利第5 , 328,829號第1欄以 為一回顧）。一般而言，發炎標記上之研究在鑑別齒周膜 炎疾病嚴重性上具有非常有限之成功，且朝向牙周病之發 炎反應的遣傳層面之努力是有限及不成功的：在绖擇出之 帶有免疫反應的疾病中，控制該發炎及其他免疫反應之多 値位點（1 oc ί )上的遣傳變化己為一決定疾病之感病性或其 簌重性的因子。因此，本發明之一目的傜決定相關於發炎 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 406130 b7_ 五、發明説明（j ) 及其他免疫反應之遣傳因子，若其亦相關於牙周病之嚴重 性。如此一來，鑑定出該遣傳因子將是有用的，並藉此鑑 定出易感病於嚴重型成人型牙周病之患者。 發明簡介 依據本發明，一種用於預測增加之牙周病嚴重性的方 法被掲示。該方法包括將來自一患者之DN A予以分離及编 碼IL-Ια及IL-1/3之基因的DN A多形性型態予以決定的步 驟。將該經鑑定之型態與已知疾病駸重性之對照組予以比 較，藉此鑑定出表現一相闊於增加之牙周病嚴重性之遣傳 多形性型態的患者。 鑑定出之患者可接著在牙周病之先期予以更積極地 治療以防止駸重疾病之發生。 本發明進一步掲示一種用於一與增加之牙周病嚴重性 相關的患者之遣傳多形性型態的鑑定之撿測套組。該檢测 套組包含括DNA樣品收集裝置及用於決定一遣傳多形性型 態之裝置，其接著與對照樣品比較以決定一患者對嚴重性 牙周病之感病性。 較佳實施例之詳述 經濟部中夬標準局貝工消費合作社印製 依據本發明，藉由檢測位於間白素IL-1 c(及IL-1 /3之 基因序列的DNA多形性之存在，具或不具明顯疾病之患者 被鑑定出為具有一駸重性牙周病之遣傳潛在因素。嚴重性 牙周病依以下實例所述予以界定。簡言之，駸重性疾病被 界定為患者呈現一 2 10傾測量為S 7 mm之郯間部位，並有 83. 3.10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央梯準局貝工消費合作社印製 A7_406130_!Z_五、發明説明（4 ) £ 7 mm之袋深（PD)發生於至少八顆牙齒上的病歴。此外， 測量為2 5 mm之臨床附箸（CAL )可見於2 11個部位上。該 界定進一步需要至少三年内拍攝之全口腔放射線照片顯示 在放射線照片上有S 7個部位具2 50%骨骼缺損，並具一大 於30%之全口腔平均骨骼損耗。 相關於嚴重性疾病之對偶基因被鑑定為IL-1A對偶基 因2及IL-1B (TaqI)對偶基因2。已證實在不吸煙者中，帶 有至少一複本之IL-1A對偶基因2及IL-1B (TaqI)對偶基因 2的患者，對嚴重性齒周膜炎之不均等比（0R)為4.3。在一 吸煙者及不吸煙者之族群中，一吸煙者或帶有至少一複本 之IL-1A對偶基因2及IL-1B (TaqI)對偶基因2的患者的0R 為10.06具嚴重性疾病。 再者》依據本發明，一種用於一舆增加之牙周病嚴重 性相關的遣傳多形性型態之鑑定的檢測套組被掲示。該檢 測套組包括DNA樣品收集裝置及用於決定一 IL-1A及IL-1B 的遣傳多形性型態之裝置，該型態繼而與對照樣品比較以 決定一患者對嚴重性牙周病之感病性。 該DNA樣品得自血液或組織樣品。在一較佳實施例中 ，該DNA將從得自於一患者之手指刺戳與收集在吸水紙上 之血液的血液細胞中獲得。在一更佳實施例中，該血液將 被收集在一&11^1丨〇3「(^上（雪菲爾大學，Department of Medicine and Pharmacology, Royal Ha 11amshire , Sheffield, England S10 2JF):該 DNA 接著從該乾燥之 」---r-----------ITI.^-----^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張又度逋用中國國家標準（CNS ) A4说格（210X297公釐〉 83. 3.10,000 經濟部中央梯準局貝工消費合作社印製 A7 ---d〇4ia^--- 五、發明説明（5) 血漬分離出來，並繼而使用聚合酶連鎖反應（PCR)增量目 標序列。將標的所欲基因内之特定的多形性DNA區域之寡 核苷酸DNA引子予以製備，以逹成在PCR反應中該目標序列 之擴增。此實施例具有僅需少量血液及避免靜脈穿刺或一 活組織撿視之必要性的擾點。然而，亦可使用如已知於此 技藝中之其他用於收集DNA及決定多型性型態的裝置。 接著將來自模版DN A的經增量之DNA序列使用限制酶予 以分析，以決定存在於該經增量之序列的遣傳多形性，並 藉此提供一該患者之遣傳多形性輪廓。 一些疾病具有顳著之發炎及其他免疫成份。一發炎及 其他免疫反應的初期成份為細胞激素之産生。細胞激素係 為由經活化之免疫細胞，包括源自胸腺之T淋巴球、B淋巴 球及單核白血球/巨噬細胞所産生之胜肽/蛋白質免疫調 控子。細胞激素包括間白素（IL-1至IL-15)、用於粒細 朐及/或巨噬細胞（CSF-G, CSF-M，CSF-GM)之集落刺激因 子（CSFs)、腫瘤壞死因子（TNFs α及>S)及干擾素（IFN α、/9及7 ) 。IL-1之基本活性包括IL-1 a、IL-1;S及 IL-1受體之拮抗子（IL-lra)的組合活性（為回顧，參見 Duff, 1993;及Basic and Clinical Immunology, 8th Ed., 1994，編者為 Stites, Terr & Parslow，第 9章，第 105-123頁）。美國專利第5,328,829號在牙周病之活潑部 位發現IL-1 Θ，但未報導任何與疾病狀態的相關性—單 一細咆激素之多形性與疾病狀態之關聯己被發現於諸如糸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4C格（210X297公釐） 83· 3. !0,〇〇〇 ---„-------裝------.打--------線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央梂準局負工消费合作社印製 406130_B7_ 五、發明説明（6 ) 統性红斑狼瘡、潰瘍性結腸炎及幼年風濕性關節炎中 (Mansfield et al., 1994； Verjans et al., 1992； Blakemore et al., 1994； McGuire et al., 1994； McDowell et a 1., 1995)° 在編碼細胞激素IL-1 α及IL-1 之DNA序列内的特定 多形性被發現與嚴重性牙周病相關。該多形性如下： IL-1A ：(染色體 2 ;位於 2ql2-14) 藉由使用限制酶之對偶基因專一性消化，而鑑定出位 於-889之一單鹼基變異（C/T)之一雙對偶多形性的對偶基 因。該基因被指名為IL-1A，而其産物（細胞激素）被指 名為IL-la。在鹼基-889處，對偶基因1為C且對偶基因 2為T。藉由用一經修飾之引子序列在PCR反應中所造成之 突變，引入一部分址而産生完整之限制酶辨識址。該址藉 由該多形性之其中一對偶基因的序列而完成。在該PCR反 應之産物的限制酶消化後，依大小將該DMA予以電泳分離 〇 從此膠體（或一値由一放射性之内在DNA序列所探測 的其南方轉漬）中鑑定出該多形性之對偶基因。該未切開 之片段為在北歐族群中之較稀有的對厲基因。 IL-1B :(染色體 2 ;位於 2<ι12-14) 兩値雙對偶基因多形性可藉由在該對禺基因内之自然 生成址使用對偶基因專一性切割，而被分類為兩個不同的 PCR産物。對偶基因之鑑定偽在限制酶消化及在一瓊脂凝 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4说格（210X 297公釐） 83. 3.10,000 ---^-------裝------> 訂丨：----線 <請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央揉準局負工消费合作社印策 A7 406130 b7__ 五、發明説明（7 ) 膠内分離之後依片段之大小而定。該基因被指名為IL-1B ，而其産物（細胞激素）被指名為IL-1 /3。該址係位於 -511 (指名為 IL-1B (Aval))及+3953 (指名為 IL-1B (Taq I))之單鹸基變異（C/T.)，且藉由使用限制酶之對偶 基因專一性消化而鑑定出來。對於任一多形性·對偶基 因1為C且對偶基因2為T。 患者之細胞激素的多形性蛩（亦即對偶基因之分佈） 接著與對照組比較。該對照組傜來自牙周健康之患者及來 自成人型非簌重性齒周膜炎之患者及成人型駸重性齒周膜 炎之患者。也就是說，將該患者之型依據一致的臨床要件 ，與健康者及帶有不同駸重性之牙周病的患者相比較*且 相配者決定對牙周病之潛在因素。 一不均等比（近似相對危險性）被衍生出來，以測試 位於這些待定位點之對偶基因多形性型（基因型）與疾病 及/或其駸重性的發展之間的相關性。此提供了將被用於 牙周病之臨床管理的預測資訊。 上述之討論提供了 一個用於與增加之牙周病嚴重性相 關的患者之遣傳多形性型之鑑定的一種檢測套組的實際根 據。對處於危險下的那些人之駸重性疾病的鑑定允許了在 疾病肇端前開始預防性測量。更進一步，那些具有吸煙及 易感病基因型兩個危險因子的人可被特別地監視，因為他 們對駸重性疾病的危險性極端地高。本發明所用之方法及 應用可由下列之實例展示出來： -10 - 本紙張尺度適用中國國家揉準(CNS ) A4規格（210 X 297公着) 83. 3.10,000 ---^------‘裝------，訂I^-----線 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央揉準局貝工消費合作社印装 A7 ^06130_b7_ 五、發明説明（3 ) 多形性之決定及疾病之相關性 滴用方法 除非説明，否則涉及DNA技術之反應及操作以在此納 入作為參考的Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning： A Laboratory Manual , Cold Spring Habor Laboratory Press内所述者來實施。如所述於美國專利第 4,666,328、4,801，531 及 5,272,057 號，以及 McDowell et al. 1995内的方法亦被使用，除非說明。 被使用在PCR的酶傜來自GIBCO BRL，熱循環器為 Perkin-Elmer1或Biometra牌的。限制酶Hcol及TaqI偽來自 PromegafUS)。限制酶 Aval 及 Bsu36ni；來自 NEB(US) ° 患者 > 禊摆好疾病分類 與成人之牙周病相關的遣傳多形性藉由使用McDowe 11 et a 1 . (1995)之流程來決定。因為吸煙之遮蔽效應，與 駸重性疾病相關的遣傳因子在非吸煙者中決定。一組在其 他方面健康的成人在牙科門診針對牙周病之存在被篩選。 該研究主要包括北歐後裔的艏體。毎一患者針對疾病之不 存在，或若該疾病存在，分別針對其在四値参數中的程度 被篩選。該四個所欲之變因傜臨床附著損耗（CAL )、袋深 、齒齦炎及鄰間骨骼損耗。取一血液樣品，將DN A予以分 離並決定在IL-1A及IL-1B遣傳位點之遣傳多形性。另外， 獲取每一患者之牙科病歷包括在糖尿病、心血管疾病或早 期牙齒脱落之家族史中的持定問題，以及他們是否為吸煙 -11 - 本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4说格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 K---r------ -^------tr------^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標率局貝工消费合作社印製 A7 406130 B7 五、發明説明（9 ) 者。 為決定牙周病之狀況，每一患者接受一包括一袋深 (PD)之全口腔測量、齒齦退縮（R)、齒菌斑（P I)及針探時 出血（BOP)的測驗。臨床附箸損耗（CAL)傜從袋深及齒麵退 縮予以估算。由放射線照片得骨骼損耗。欣據這些測量， 患者被依健康、輕微至中度牙周病或駸重性牙周病予以分 類。 對毎一齒上之六個表面（遠頰側、煩側、内頰側、内 舌側、舌側、遠舌側）計算所有的變因.，直到計算168傾 部位。對每一齒上之兩個表面計算所有的放射性照片之變 因，直到計算65値部位。 疾病嚴重性之分類如下： 牙周健康:患者顯示所有之袋深$4 ram、無數之面部 CAL、S2 mm之鄰間CAL及<15%之放射線照片的骨骼損耗 。無數之齒菌斑及齒_發炎及齒齦退縮可能存在。 輕激革中庶夕齒固膜炎：在35歲前無疾病發生之歷史 。患者顯示具有不起過二顆之脱落牙齒、為齒科整形而拔 除牙齒（除了第三臼齒）以及因口腔外部創傷之結果所造 成之牙齒脱落。患者亦顔示在五至九値郯間部位具有一 PD 2 6mm 至少兩個合格之鄰間部位必須發生於不同象限中 。齒齦發炎（藉由針探時出血為例）存在於至少兩個象限 。全口腔之放射線照片必須掲示少於四屆具有S 50¾骨骼 損耗之鄰間部位。放射線照片之金口腔平均骨骼損耗需小 -12 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4说格（210X297公釐） 83.3. 10,000 ---------裝------訂—^-----银 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 406130 經濟部中央揉準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（10 ) 於25¾。在此分類中無對CAL之詳述。 蘇重袢齒固曄炎:患者顯示具有2 1 〇傾測量為2 7 mm 的鄰間部位及2 7 mm之PD發生在至少八顆牙齒上。在三年 内拍攝之全口腔放射線照片顯示在放射線照片上具有2 50% 骨骼損耗之δ 7値鄰間部位及一大於30¾之全口腔平均骨骼 損耗。 統計塵ί 分析 使用X2分析。不均等比以如wo〇lf，1995所述之一 2X2列聯表予以計算。 PCR擴增历眤制酿切割 用於經摆摆：> 對涯ί甚因的窨驗步_ .驟 IL.-1A 位於IL-1A鹼基-889之單鹼基變異（C/T)的多形性被鑑 定如下： 篩選：基因組之模版的PCR擴增。若位於-889的C可用，將 一錯配（mismatch)嵌入一引子以完成一Ncol址。引子：依據該基因組之序列（Furutani et al·, 1986; GEHBANK x,03833)，在一 ABJ DNA合成儀内生成下列引子。5' TGT TCT ACC ACC TGA ACT AGG C 3' (-967/-945) (SEQ ID No：l)5f TTA CAT ATG AGC CTT CCA TG 3， (-888/-869) (SEQ ID No：2) PCR之條件： 13 ---„------▲------_訂 I-^-----^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家棣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 經濟部中夬標準局貝工消费合作社印裝 A7 406130_b7_ 五、發明説明（η ) [96°C (1分鐘）]1循環； [94°C (1 分鐘）、46°C (1 分鐘）、72°C (1 分鐘）]40 循環； [72°C (4分鐘）]1循環。 限制酶切割：消化傜用Nco I，在37 T下歷時8小時。藉由 8¾ PAGE或2¾瓊脂凝膠來決定大小。 來自切割的預期結果： 對偶基因1 (Π ：對偶基因1之PCR産物的Hcol消化將産生 83及16鹼基對（bp)之片段。 對偶基因2 (T)：對偶基因2之PCR産物的Ncol消化將是不 有效的且産生一99鹼基對（bp)之産物。 II.-1R (Av^T) 位於IL-1B鹼基-551之單鹼基變異（C/T)的多形性被鑑 定如下： 篩選：基因組之模版的PCR擴增。該單鹼基變異完成一 Ncol址在對偶基因1 (C)上及一 Bsu36I址在對偶基因2 (Τ) 上。 引子：依據該基因組之序列（Clark et a 1.，1986; GENBANK x04500)，在一 ABI DNA合成儀内生成下列引子。 5' TGG CAT TGA TCT GGA TCA TC 3' (-702/-682) (SEQ ID No:3) 5' GTT TAG GAA TCT TCC CAC TT 3' (-417/-397) (SEQ ID No:4) - 14 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐） 83.3.10 000 ---1------—裝-------訂-----線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央橾準局員工消费合作社印裝 A7 _406130_B7__ 五、發明説明（l2) PCR之條件： [95°C (1分鐘）]1循環； [95，C (1 分鐘）、535C (1 分鐘）、74SC (1 分鐘 >]35 循環； [74Y (4分鐘）]1循環。 限制酶切割：消化偽在37。C下歷時8小時。藉由M PAGE來 決定大小。 來自切割的預期結果： 對涯；甚RM (T):對偶基因1之PCR産物的Aval消化將産生 190及114 bp之片段。對偶基因1之PCR産物的Bsu36I消化 將是不有效的且産生一 304 bp之産物。 對涯ί某因2 ίΤ> :對偶基因2之PCR産物的Aval消化將是不 有效的且産生一 304 bp之産物。對偶基因2之PCR産物的 Bsu36I消化將産生190及114 bp之片段。 II.-tR (TaaT) 位於IL-1B鹼基+3953之單鹼基變異（C/T)的多形性被 鑑定如下： 篩選：基因組之模販的PCR擴增。將一錯配嵌入一引子以 完成一 Taq I址作為一正對照組。多形性之Taq I址是天然的 〇 引子：依據該基因組之序列（Clark et al·，1986; GENBAM x04500 )，在一 ABI DNA合成儀内生成下列引子.: 5' CTC AGG TGT CCT CGA AGA AAT CAA A 3' -15 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83.3. 10,000 ---------—裝-------訂丨：----線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央梯準局負工消费合作社印装 __406130_B7_ 五、發明説明（13 ) (+3844/+3868) (SEQ ID No：5) 5' GCT TTT TTG CTG TGA GTC CCG 3' (+4017/+4037) (SEQ ID No：6) PCR之條件： [95T (1分鐘）]1循環； [95°C (1 分鐘）、67.5°C (1 分鐘）、74T (1 分鐘）] 38循環； [72°C (4分鐘）]1循環。 限制酶切割：切割傜在60°C下歷時8小時。藉由《 PAGE來 決定大小。 來自切割的預期结果： 對涯ί某因1 (C)：對偶基因1之PCR産物的TaqI消化將産生 12、85及97 bp之片段。 對涯ί甚W? (T):對偶基因2之PCR産物的TaqI消化將産生 12及182 bp之片段。
MJI 使用一如上述之一致的臨床要件’將成人（吸煙者及 非吸煙者）依牙周病之簌重性予以篩選。該數據列於表1 〇 表1 ~ 16 ~ ^紙張尺度適國家標準（CNS)A4規格（210x297公兼^ 83.3.1〇，_ ---------d------β I"^-----0 (请先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 406130 B? 五、發明説明（14 ) 表1 組. R ι Μ S 樣本 49 42 42 平均 平均 S*D. 平均 S.D. ΒΛΡ * 10.44 7.77 20.Θ4 10.91 26.37 13.63 m 2·β4 0·49 3·85 0.3 4.31 0.46 αα 2·6β 0.Θ9 4.31 0.5 1.33 #>49% 0 0 0·4β 0,67 14.8 7,6 Ibl 11. θ 2 22*4 2.6 41»β 6.3 用在表中之縮寫：PD (袋深）、BOP (針探時出血）、CAL (臨床附著損耗）、tt>4« (骨骼損耗大於49%之部位的數 目）、U丨（骨骼損耗百分比）、S · D .(標準偏差）；H = 健康，Μ輕微/中度，S嚴重，*代表顯著（至少在95¾信心 水準下）。 在表2中，該臨床數據被展示且在吸煙者及非吸煙者 間作比較。注意在吸煙者及非吸煙者之間的總臨床疾病狀 況有一顯著之差異。 --^-------赛------tr—·----.^- (請先閲讀背面之注^^項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消费合作杜印製 表2 不..吸煙 吸煙 P 樣本 100 3β 平均 S*D. 平均 S.t>. BOP 17.4 11.9 22.fiS 0.14 0.Q42 會 PD 3*42 0*62 3.97 0*7β 4E-04 ** CAL 3.98 1·€1 S.7 2.08 IE-04 ** Μ 9Θ 35 *>49% 2.43 S.82 11. S9 9,68 1S-04 ** I «bl 20.53 10.83 36.76 13.04 IB-04 •it -17 - 本紙掁尺度適用中國國家標準（CNS ) A*4洗格（210X297公釐） 83. 3.10,000 經濟部中央揉準局貝工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明（货)6130 縮寫如表1。 表3對IL-U對偶基因1及2之臨床發現予以概述及比 較。對厲基因之基因型以配對之數字予以表示，亦即1/1 表示對偶基因之純合性，1/2表示對偶基因1及2之雜合性 等。對偶基因2的基因型處$示至少有一對偶基因之複本 存在。該分析以非吸煙者完成。如表2中之數據表示，該 作為一組的吸煙者具有駸重性疾病，他們未被包括在此對 基因潛在因素的分析中。在表3中的資料顯示IL-1A之攜. 帶者與駸重性臨床疾病有一顯著之相闋性，特別對骨骼損 *毛百分比、CAL及PD。該經分析之族群包括非吸煙者之所 ::ΐ疾病組。 表3 IL_1A 11 12 or 22 I 樣本 44 S4 平均 S.O. 平均 S‘D. P BOF 16.7 12.7 18 U.6 0*S9S PD 3.28 0*65 3.36 Q.5B 0.59 ΟΛ 3.62 1.4Θ 4.3 1*56 0.036 * #>49% 1.4S 4.Θ3 3.2 6.4S 0.133 %bl 17,41 8.77 23.19 11.36 0.006 縮寫如表1。 在表4'，該相同的分析被實施在IL-1B (TaqI)對偶基 -18 - 本紙張XJt適用中國國家標準（CNS ) A4見格（210 X 297公釐） 83. 3.10,000 ----------^------，訂-----^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A7_400130_五、發明説明（I6 ) 表4 IL-1B (Tart) 11 12 er 22 η 樣本 51 47 .平均 S.D. 平均 P BOP 18.3 12.1 1Θ.6 12 0.341 PD 3.35 0.56 3.5 0.S7 0.234 CAL 3.82 1.44 4.IS 1.79 0.278 #>49% 1*73 β,07 3.18 s.s 0.21a %bl 18 9.14 22.32 11.9 0.12^ 縮寫如表1。 在表5，該相同的分析被顯示在對具有（ + )，即基因 型IL-1A對偶基因2加上IL-1B (TaqI)對偶基因2的患者， 相對於那些不具有者（-)。詳言之，該-基因型係IL-1A (1/1)加上 IL-1B (TaqI) ( 1/1 或 1/2或 2/2)，或 IL-1A (1/2 或 2/2)加上 IL-lB(Taql) (1/1)。該 +基因型傜 IL-1AU/2 或 2/2)加上 IL-1B (TaqI) (1/2 或 2/2)。 表5 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 基因_型 • + 樣本 63 35 平均 丰均 S.0, Ρ _ BOF 16,2 12.0 19.S 11.9 0*194 FD 3.32 0.59 3,62 0·64 0.023 * 3.7 1.41 4.52 1.83 0.026 貧 #>49« 1.43 4*60 4·22 0.044 夤 %bl· 18.13 8.74 25.03 12.3 0*005 負霣 縮寫如表1。 依據患者之疾病駸重性的IL-1A及IL-1B之對偶基因分 -19" 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4说格（210X297公釐） 83. 3.10,000 --------—装------：訂丨^----•線 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)
五、發明説明（I7 佈被決定並顯示在表6 表6 戸片有受視ij者· 患者之基因型 疾病鲮重性分佈* 17 ~^ IL-1A IL-lfl (ragl) :健康 輕‘φ度疾病 巖重性疾病| 1/1 1/1,1/2, 2/2 30 61.2¾ 16 38.1% 13 I 44.2% 1 1/2, 2/2 1/1 c Θ 16.3% 10 23.8% 8 18.6% 1/2, 2/2 1/2, 2/2 11 22.4% 16 38.1% 15 35.7% 49 100% 42 100% 42 100% ^i·^— ^11^1 IV ^^^^1 mf flflff^· ^^^^1 n I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 以在毎一項目之患者數目及該疾病項目之患者百分 比的形式提供分佈。 在表7中顯示針對非吸煙者的IL-1A及IL-1B (TaqI) 之結果。帶嚴重性疾病之患者的64.7%具有一 IL-1 A 1/2或 2/2及IL-1B (TaqI) 1/2或2/2的基因型，其指出該對偶基 因之存在，無論在一雜合性的或純合性的基因型，均引起 駸重性疾病的感病性。 經濟部中央標準局貞工消費合作社印製 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4洗格（210X297公釐） 83. 3.10,000 406130_^五、發明説明（18 ) 表7 患者之基因型 # ® @ #疾病嚴重性分佈 IL-1A IL-1B Cragl) 健康 輕中度疾病 嚴重性疾病 1/1 1/1，1/2, 2/2 27 61.4% 13 35.2% 4 23.5% 1/2, 3/2 1/1 7 15.9% 10 27-0% 2 11.8% 1/2, 2/2 1/2, 2/2 10 22.7% 14 / 37.8% 11 '64·7% 44 100% 37 100% 100¾ \ 針對在IL-1A對偶基因2及Ιί-IB (TaqH對偶基因2與 疾病之發展及/或其嚴重性之間的相關性，一不均等比 (近似相對危險性）被衍生出來。該不均等比藉由使用一 如於表8.所示的列聯表予以計算。下列方程式： (A X D)/(C X B)被用於計算該不均等比（Woolf, 1955) 表8 樣品列聯表 II I I — 裝— I I I-訂— I I — .線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消费合作社印裝 有興趣之. 表現型1 表現型2 1 ί因型- Β 存在 Λ Β 1不存在 C D 1 如表9所示，為吸煙者或具有基因型IL-1A對偶基因2 加IL-1B (TaqI)對禺基因2(+基因型）的患者比那些不具 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 表9 在所有受測者中之不均等比 406130 377 五、發明説明（19 ) 有此基因型者更像具有駸重性疾病；他們具有一 10.06:1 的不均等比。在僅有非吸煙者當中（表10)，對於那些帶 有基因型IL-1A對偶基因2加上IL-1B (Taql)對偶基因2的 患者，該不均等比為4.3 :1。 --J------1^-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 表10 在非吸煙者中之不均等比 基因型為： IL-1A對偶基因2加卜 IL-1B (TaqI)對厲基因2 駸重疾病 .. 健康或 ’ · 輕中度疾病 存在._ IX 24 不存在 6 57 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 OR ® 4.3 Xa = 7,53 <p*0.006) 對於吸煙者或IL-U對偶基因2加上'IL-IB (TaqI)對偶 基因2 ( +基因型）的目標基因型之臨床數據顯示在表11 22 吸煙者或棊因型為： IL-1A對偶基因2加_± IL-1B (TaqI)對偶基因2 駸重疾病 健康或 輕中度疾病 存在. 34 不存在. 6 57 OR «= 10.0$ (3.84-26.35) %Z ** 26.9S (ρ<0.0001)' 本紙張尺度適用申國國家標準（CNS ) A4说格（210X297公釐） 83. 3.10,000 406130 A7 B7五、發明説明（20 ) 表11 樣本 63 70 I 平均 8.D. 平均 S.D. π BOP 16*24 12.01 21,01 12·9Θ 0*0617 ** I fD θ*32 0.59 3.79 0,73 0.0008 金會 CAL 3·7 1.41 5.12 2.05 0.0001 賨脅 #>49% 1.43 4.6 7.as 9.24 0.00001 % bl 18.13 Β.74 30.32 13.68 0.00001 嘸， 縮寫如表1。 非吸煙者（N = l〇〇)對於IL-1A及IL-1B (Aval)之對偶基 因分佈被決定並顯示在表12 °帶簌重性疾病之患者的 64.7%具有一几-1^1/2或2/2及几-18(/^31)1/2或2/2的 基因型。 表12 經濟部中央標準局貞工消費合作社印装 患者之基因型 疾病駸重性分佈 ggssss· I _ · |™.iSassaa~~aailfc«^^gag^aegtee«gagss^saggsaagscasaaa^ggaaa XL-1A ΙΙ»-1Β (Aval) 健康- 輕中度疾病 嚴重性疾病 1/1 1/1,1/2, 2/2 27 61.4% 13 35.2% 21.1% 1/2, 2/2 1/1 XI 25.0% 10 27.0% 8 42.1% 1/2, 2/2 1/2, 2/2 β 13.6% Χ4 37.8% 7 36.8% 44 100% 37 100% 19 100% 在僅有非吸煙者當中，對於那些帶有基因型IL-1A對 偶基因2加上IL -1B (A v a I)對偶基因2的患者之不均等比為 0.85 (表13 )。此遣傳組合顯示與牙周病無相關性： -23 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4说格（210X297公釐） 83. 3.10,000 --：------丨^------訂 ------d. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央梂準扃貝工消费合作社印裝 406130 at B7 五、發明説明（21 ) 表13 非吸煙者之不均等比 I基因型為： IL-1A對偶基因2斑上 IL-1B丨Aval_)對偶基因2 嚴重疾病 健康或 輕中度疾病 存在 10 46 不存在 9 35 所示之數據顯示帶有嚴重性疾病的那些受測者之 86.0%係目前的吸煙者或具有目標基因型IL-1A對偶基因2 加上IL-1B (TaqI)對偶基因2。不是目前之吸煙者亦不具 有該目標基因型的受測者之90.5¾不具有駸重性疾病。是 目前之吸煙者或具有該目標基因型的受测者之52.1%具有 不相關於任何其他危險因子的嚴重性疾病。 因此本發明提供了 一種用於鑑定出對簌重性牙周病處 在危險狀況的患者之方法，以容許早期治療。 此申請案從頭到尾提及了許多文獻及患者。未被包括 於上之經參考的文獻及患者之所有引用者被列舉在後：·這 些文獻完整的揭示藉此以參考資料納入於本申請案中，以 完全地闡述與本發明有關之此技藝的狀況： 本發明被以一種舉例的方式所闌述，且應被了解該所 用之專有名詞被意欲作為言詞本質之描述而非其限制。 明顯地，依據以上教示所作的本發明之許多修飾及變 化是可行的。因此，應了解在所附之申請專利範圍的範疇 内，本發明可被實施除非另有持定説明： -24 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4C格（210X297公釐） 83. 3. !〇·〇〇〇 --；-----—裝------^訂-----丨線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 406130 A7 B7 五、發明説明（22 ) 參考文獻
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Hilson et al.( (,Single base polymorphism in the human Tumor Kectosis Factor alpha (TNPe) gene detectable by jrcol restriction of PCR product" HlunaJl Molecular Genetics 1, No. 5:353 (1992). Woolf, B·, f,Estimating the relationship between blood groups and disaasen Anjials of HLunan G&netlcs 19:251-253 (1955). I裝------·訂-----—^ I (請先閱讀背面之注意事項再填窝本頁) 鋰濟部中央標率局貝工消费合作社印装 本纸诛财㈣料準（CNS ) A4^ ( 21Qx297公羞〉 26 83.3.10,000 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 A7406130_B7_ 五、發明説明（24 ) 序列表 (Γ)一般資料： (i )申請人：Kornraan, Kenneth S. Duff, Gordon W. (ii )發明名稱：檢測罹患牙周病之基因潛在因素 (Mi )序列數目：6 (iv )相關住址·· (A) 收信人：A q u i 1 i η 〇 & W e 1 s h (B) 街名：2121 Crystal Drive, Suite 503 (C) 市名：Ar 1 i ngton (D) 州名：雒吉尼亞 (E) 國名：美國 (F) 郵遞區號：22202 (v .)電腦可讀取自： (A) 媒體種類：軟碟 (B) 電腦：可相容於IBM PC者 (C) 操作条統：PC-D0S/MS-D0S (D) 軟體：Patentln Release# 1.0，Version 关 1 · 30 (vi )最近申請資料： (幻申請案號： (B) 申請日期： (C) 分類： -27 - I I I I”1T線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4現格（210Χ297公釐） 83.3.10,000 經濟部中央標準局貝工消費合作社印装 406130 ^ B7五、發明説明（25 ) (vii )律師/事務所資料： (A) 姓名：Welsh, John L. (B) 登記號碼：33,621 (C) 參考/標籤號碼：MSS~002 (通）通訊資料： U)電話：（703) 920-1122 (Β)傳真：（703) 920-3399 (2) 序列辨識編號第1號之資料： (i )序列待徵： (A) 長度：22鹼基對 (B) 種類：核酸 (C) 股型：單股 (D) 形態：直鏈 (ii )序列敘述：序列辨識編號第1號 TGT TCT ACC ACC TGA ACT AGG C (3) 序列辨識編號第2號之資料： (i )序列特戲： (A) 長度：2 0驗基對 (B) 種類：核酸 (C) 股型：單股 (D) 形態：直鍵 (ii )序列敍述：序列辨識編號第2號 TTA CAT ATG AGC CTT CCA TG -2 8 ' —裝------％1T------線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 83. 3.10,000 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A7 _抑___五、發明説明（π ) (4) 序列辨識編號第3號之資料： (i )序列特徵： (A) 長度：20鹼基對 (B) 種類：核酸 (C) 股型：單股 (D) 形態：直鏈 (ii )序列欽述：序列辨識编號第3號 TGG CAT TGA TCT GGA TCA TC (5) 序列辨識编號第4號之資料： (i )序列待激： (A) 長度：20鹼基對 (B) 種類：核酸 (C) 股型：單股 (D) 形態：直鏈 (ii )序列敘述：序列辨識編號第4號 GTT TAG GAA TCT TCC CAC TT (6) 序列辨識編號第5號之資料： (i )序列特徽： (A) 長度：25鹼基對 (B) 種類：核酸 (C) 股型：單股 (D) 形態：直鍵 (ii )序列敍述：序列辨識编號第5號 -29 - 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4C格（210X297公釐） 83. 3.10,000 •--1---^-----裝------訂------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) »406130 A7 B7
五、發明説明（27 ) CTC AGG TGT CCT CGA AGA AAT CAA A (7)序列辨識編號第6號之資料： (i )序列特徵： (A) 長度：21鹼基對 (B) 種類：核酸 (C) 股型：單股 (D) 形態：直鐽 (ii )序列敘述：序列辨識編號第6號 GCT TTT TTG CTG TGA GTC CCG I ^ •訂-----.-^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS )六4说格（210X297公釐） 30 83. 3.10,000

Claims (2)

  1. A8 B8 -GS-ι
    六、申請專利範圍 第85109393號專利再審查案申請專利範圍修正本 修正曰期：89年6月 1. 一種活體外檢測一病人是否會有增高的牙周病嚴重性 的傾向之方法，其包含下列步驟： (a) 分離出源自於一病人的基因組DNA ; (b) 決定出一有關於該基因組DNA内之il-IA及IL-lB(Taq 1)的遺傳多形性型態； (e)將該遺傳多形性型態與一對照組樣品作比較，其 中該對照組樣品包含有一個IL-1A對偶基因2加上 lL-lB(Taq 1)對偶基因2，以及其中該遺傳多形性 形態相對於對照組的相似性顯示出增高的牙周病 嚴重性之傾向。 2 ·如申請專利範園第1項之方法，其中該對照組樣品係 為已知的疾病嚴重性之一個人種學上相配對照組樣 品。 3.如申請專利範圍第1項之方法，其中該用以決定位在 該DNA中之IL-1A及IL-1B的遺傳多形性型態之步驟包 括使用聚合酶連鎮反應（PCR)來擴增標的DNA序列，其 中所使用之PCR引子為： 5’TGT TCT ACC ACC TGA ACT AGG C 3， 5' TTA CAT ATG AGC CIT CCA TG 3' 5’TGG CAT TGA TCT GGA TCA TC 3， 5' GIT TAG GAA TCT TCC CAC TT 3' CrCAGGTGTCCrCGAAGAAATCAAA3'(序列辨鄉織第5號）以及 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------------^--------訂---^--.J---線· {請先閱讀嘴面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (序列辨1_號第l號) (序列辨1_號第2號) (序列纖編麟3號) (序列辨識編號第4號） 406130 C8 D8 六 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 申請專利範圍 5' GCT ΤΓΤ TTG CTGIXoA GTC CCG 3' (序列辨識編號第 6 號）。 4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該用以決定該DNA 中之IL-1A及IL-1B的遺傳多形性型態之步驟包括使用 限制酶Ncol、TaqI、Aval及Bsu36I之限制酶消化。 5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該等已知為與該 增高的疾病嚴重性有關的對偶基因包含有IL-1A對偶基 因2加上IL-1B (TaqI)對偶基因2。 6. —種活想外檢測一病人是否會有嚴重的牙周病的傾向 之方法，其包含下列步驟： '(a)分離出源自於一病人的基因組DNA ; (b)決定一有關於該基因組DNA之IL-1A及IL-lB(Taq 1)的對偶基因形式； 其中該選自於下列之對偶基因形式顯示出增高的 嚴重的牙周病傾向： 至少一份的IL-1A對偶基因2 ; 至少一份of IL-1B (TaqI)對偶基因2， 至少一份的IL-1A對偶基因2加上至少一份的 IL-1B (TaqI)對偶基因 2。 7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該用以決定該DNA 中之IL-1A及IL-1B的對偶基因形式之步驟，包括使用 聚合酶連鎖反應（PCR)來擴增標DNA序列，其中所使用 之PCR引子為： 5' TGT TCT ACC ACC TGA ACT AGG C 3' (序列號第 1 號） 5, ΤΓΑ CAT ATG AGC CIT CCA TG 3， （序列辨識編號第 2 號） -2 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS>A4規格（210 X 297公釐〉 請 先 閲 讀 .背 面 之 注 項 再 填 寫 本 頁 A8 B8 C8 D8 406130 六、申請專利範圍 5' TGG CAT TGA TCT GGA TCA TC 3' (序蝴織編絲 3 號） 5丨GTT TAG GAA TCT TCC CAC ΊΤ 3丨 （序列辨織編號第4號）
  2. 5,CTCAGGTGTCCTCGAAGAAATCAAA3,(序列辨識編號第5號）以^ 5，GCTTmTGCTGTGAGTCCCG3， （序列纖編號第 6 號）。 8. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該用以決定對偶基 因型式之步驟包括使用至少一個選自於限制酶Ncol、 TaqI、Aval及Bsu36I所構成的群中的限制酶消化》 9. 一種檢測一病人是否會有嚴重的牙周病傾向之套組， 該套組包含： (a) —個DNA樣品收集裝置；以及 (b) —種用於決定一有關於IL-1A及IL-lB(Taq 1)之遺 傳多形性型態的裝置，其中該裝置包含一組聚合 酶連鎖反應（PCR)之引子，該等引子由下列所構 成： 5' TGT TCT ACC ACC TGA ACT AGG C 3' (序列辨識編號第 1 號） 5' TTA CAT ATG AGC CIT CCA TG 3' (序列辨識^號第 2 號） 5' TGG CAT TGA TCT GGA ΊΧ：Α TC 3' (序列辨識編號第 3 號） 5' GIT TAG GAA TCT TCC CAC ΊΤ 3' (序列辨識編號第 4 號） 5’CTCAGGTGTCCTCGAAGAAATCAAA3'(序列辨識編號第 5號）以及 5’ GCT TIT TTG CTG TGA GTC CCG 3· (序列辨識编號第 β 號）；及 (c) 一種包含有IL-1A對偶基因2加上lL-lB(Taq 1)對 偶基因2的對照組樣品。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I I I L___J______^---- (請先閱讀臂面之注意事項再填寫本頁) 訂 icrln!線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
    n 由本局填註） _咖號 f曰月 %T(bLBcl) sAjdtiL·
    —、發明 名稱 發明 A4 T14 公告本 專利説明書1¾ 修正曰細相月 40Q130 文1寧外預測一病人是否會有嚴重的牙周病的傾向之方法及供之所用 的套組 英文 姓 名 國藉 Methods of in vitro predicting a patient's susceptibility to increase periodontal disease severity and the kits therefor ⑴美國⑵英國 装 訂 輕濟部中央榡隼局員工消費合作枉印复 中請人 姓名 (名稱） 國籍 住、居所 (事務所） 美商♦S學技術条统股份有限公司 美國 美國加州纽波特海濱麥克阿瑟大道440◦號 代表人 姓 名保羅J.懷特
    CNS ) A4規洛（公廣' 線
    四、中文發明摘要（發曰月^^稱有嚴重的牙周病的傾向 本案掲示一種用於鑑定與一病人$增加之牙周病嚴重 性相關的遣傳多形性型態的方法及檢測套組。該檢測套組 包括DMA樣品收集裝置及用於決定一遣傳多形性型態之裝 置，繼而將該遺傳多形性型態與對照組樣品作比較，俥以 決定一患者對嚴重性牙周病之感病性。 -----------¢1 (請先閲讀背面之注意事項*.填寫本頁各欄) 英文發明摘要（發明之名稱：Methods of /n Wao predicting a patient's susceptibility to increase periodontal disease severity and the kits therefor 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 λ method and kit for the identification of a' patients genetic polymorphism pattern associated with increased periodontal disease severity is disclosed. The kit includes ΟΜΛ sample collecting means mentis for determining a. genetio pelymorphism pattern which is then compared to control samples to determine a I patient's susceptibility to severe periodontal disease. 本紙伕尺度通用中國國家揉率（CNS ) A4規格（210X297公釐） 線 A8 B8 -GS-ι
    六、申請專利範圍 第85109393號專利再審查案申請專利範圍修正本 修正曰期：89年6月 1. 一種活體外檢測一病人是否會有增高的牙周病嚴重性 的傾向之方法，其包含下列步驟： (a) 分離出源自於一病人的基因組DNA ; (b) 決定出一有關於該基因組DNA内之il-IA及IL-lB(Taq 1)的遺傳多形性型態； (e)將該遺傳多形性型態與一對照組樣品作比較，其 中該對照組樣品包含有一個IL-1A對偶基因2加上 lL-lB(Taq 1)對偶基因2，以及其中該遺傳多形性 形態相對於對照組的相似性顯示出增高的牙周病 嚴重性之傾向。 2 ·如申請專利範園第1項之方法，其中該對照組樣品係 為已知的疾病嚴重性之一個人種學上相配對照組樣 品。 3.如申請專利範圍第1項之方法，其中該用以決定位在 該DNA中之IL-1A及IL-1B的遺傳多形性型態之步驟包 括使用聚合酶連鎮反應（PCR)來擴增標的DNA序列，其 中所使用之PCR引子為： 5’TGT TCT ACC ACC TGA ACT AGG C 3， 5' TTA CAT ATG AGC CIT CCA TG 3' 5’TGG CAT TGA TCT GGA TCA TC 3， 5' GIT TAG GAA TCT TCC CAC TT 3' CrCAGGTGTCCrCGAAGAAATCAAA3'(序列辨鄉織第5號）以及 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------------^--------訂---^--.J---線· {請先閱讀嘴面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (序列辨1_號第l號) (序列辨1_號第2號) (序列纖編麟3號) (序列辨識編號第4號）
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