KR19990036067A - 치주 질환에 대한 유전적 소인을 검출하는 방법 - Google Patents

치주 질환에 대한 유전적 소인을 검출하는 방법 Download PDF

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에스. 코른만 케니스
더블유. 더프 고르돈
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폴 제이. 화이트
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Abstract

본 발명은 증가된 치주 질환의 경중과 관련된 환자의 유전적 다형현상 패턴을 동정하기 위한 방법 및 키트를 개시하고 있다. 키트는 DNA 시료 수거 수단; 및 유전적 다형 현상 패턴을 측정하고 이어서 중증 치주 질환에 대한 환자의 감수성을 결정하기 위해서 대조군과 상기 패턴을 비교하는 수단을 포함한다.

Description

치주 질환에 대한 유전적 소인을 검출하는 방법
치주 질환은 치아를 지지하는 경조직 및 연조직의 질환이며, 구강 박테리아에 의해서 개시된다. 치은염은 치주 질환의 초기 단계로서 잇몸이 붉어지고, 팽창하며 쉽게 출혈이 생길 수 있다. 치은염은 일반적으로 통증이 없고, 치료하지 않으면 치주 질환으로 진행되며, 조직 파괴도에 따라 경증, 보통, 중증으로 분류한다. 치주염은 주로 성인 질환이며, 일반적으로 35세 이전에는 검출되지 않는다.
치아 플라크에 존재하는 박테리아가 치주 질환을 개시한다. 플라크내에 박테리아에 의해 생성된 독소는 궁극적으로 치아를 지지하는 뼈 및 잇몸 조직을 파괴시키는 기타 면역 메카니즘 및 인체의 염증을 활성화시킨다. 질병이 진행되면, 잇몸이 치아를 밀어내어 박테리아를 위한 공간을 제공하는 치주 포켓이 형성되고, 이로 인하여 상기 주기가 계속 반복된다. 그러나, 일부 부위는 연속하여 활성화되지 않는다. 미국 특허 5,328,829 호는 구강 내의 활성 치주 질환 부위에서 인터루킨 IL-1β를 측정하므로서 상기 부위를 결정하기 위한 방법을 개시하고 있다. 흡연은 치주 질환의 보급 증가 및 경중과 관련이 있다. 그러나, 치주 질환이 있는 개체의 상당수는 흡연하지 않았다.
지난 15년간, 어린이 및 10대 들에게 영향을 주는 치주염의 특정 형태를 유전학적으로 조사하였다. 개체군에서 극도로 낮은 우세를 나타낸 이들 질환은 일부 개체에서는 사춘기전에 중증 치주염을 나타내었으며, 또 다른 개체에서는 사춘기 및 18세 사이에 중증 치주염을 나타낸다. 이들 경우에 확인되는 유전 인자는 개체에게 다수의 건강 문제를 유발하는 가장 큰 원인이 될 것 같은 매우 명백한 생물학적 메카니즘을 포함한다. 지금까지, 성인 치주 질환 형태에서 동일한 형태의 유전 인자를 발견하려는 노력은 성공을 거두지 못하였다.
상기 실패에도 불구하고, 일란성 쌍둥이의 연구로부터 1990년에 시작되어 나타난 새로운 증거는 유전자가 성인 치주염 형태로 존재하는 질환의 임상적 증거에 중요한 역할을 한다는 것을 제시하고 있다(Michalowicz 등, 1991). 쌍둥이 연구로부터 이것이 유전 성분이었다는 것을 알 수 있었으나, 확인되지 않았다. 이는 중증 성인 치주 질환에 감수성이 있는 환자를 결정하는데 유용하다.
1 내지 2 개의 유전자와 관련된 또는 이 유전자에 의해 유발되는 질환에 대한 유전 시험이 현재 가능하며(참고: 미국 특허 4,582,788 및 5,110,920), 일단 유전자가 동정되면 상기 질환에 대한 유전자를 보유하는 사람의 위험율을 결정한다(참고: 예를 들어, 미국 특허 4,801,531, 4,666,828 및 5,268,267).
임의의 감염을 갖는 경우, 일단 개시되면 신체의 염증 및 기타 면역 기작이 진행된다(참고: 미국 특허 5,328,829, 칼럼 1). 일반적으로, 염증 표지에 대한 연구는 치주 질환의 경중을 구별하는데 제한적으로 성공하였고, 치주 질환의 염증 반응의 유전적 측면에 관한 노력은 제한되어 왔으며 성공하지 못하였다. 염증 성분을 갖는 선택된 질환에서 염증 및 기타 면역 응답을 조절하는 다수의 장소에서의 유전적 변이는 질환에 대한 감수성 또는 경중을 결정하는 요인이다. 따라서, 본 발명의 목적은 염증 및 기타 면역 응답과 관련된 유전적 인자가 치주 질환의 경중과 관련이 있는지를 결정하는 것이다. 만약 관련이 있다면, 유전 인자를 확인하고, 이에 의해 성인 치주 질환의 중증형태에 감수성이 있는 환자를 확인하는데 이용한다.
본 발명은 치주 질환의 경중에 대한 소인을 검출하는 방법에 관한 것이다.
발명의 개요
본 발명은 증가된 치주 질환의 경중을 예상할 수 있는 방법을 개시하고 있다. 본 방법은 환자로부터 DNA를 분리하는 단계 및 IL-1α 및 IL-β를 암호하는 유전자의 DNA 다형 현상 패턴을 결정하는 단계를 포함한다. 동정된 패턴을 공지된 경중 질환의 대조군과 비교하므로서, 증가된 치주 질환의 경중과 관련된 유전적 다형 현상을 발현하는 환자를 확인할 수 있다. 이렇게 확인된 환자는 중증 질환의 발생을 예방하기 위해서 치주 질환의 초기 단계에서 더 집중적으로 치료할 수 있다.
본 발명은 증가된 치주 질환의 경중과 관련된 환자의 유전적 다형현상 패턴을 확인하기 위한 키트를 추가로 개시하고 있다. 이 키트는 DNA 시료 수거 수단; 및 유전자 다형 현상을 패턴을 결정하고 이어서 대조군 시료와 비교하여 중증 치주 질환에 대한 환자의 감수성을 결정하기 위한 수단을 포함한다.
바람직한 일양태의 상세한 설명
본 발명에 따라서, 명백한 질환을 갖는 또는 갖지 않는 환자가 인터루킨 IL-1α 및 IL-1β에 대한 유전자 서열에서 DNA 다형 현상의 존재를 감지하므로서 중증 치주 질환의 유전자적 소인을 갖는지의 여부를 확인한다. 중증 치주 질환은 하기 실시예에서 설명하는 바와 같이 규정된다. 간단히, 중증 질환은 ≥7mm로 측정되는 ≥10 인접면 부위의 병력을 갖는 환자로 정의되며, 8개 이상의 치아에서 ≥7mm의 포켓 심도(PD)가 발생한다. 또한, ≥11 부위상에 ≥5mm로 측정되는 임상적 부착물(CAL)이 나타난다. 중증의 경우 추가로 지난 3년 내에 찍은 전 구강 방사선 사진은 총 구강 평균 뼈 손실이 30% 이상인 방사선 사진에서 ≥50% 뼈 손실을 갖는 ≥7 인접면 부위를 나타내야 한다.
중증 질환과 관련된 대립 유전자는 IL-1B(TaqI) 대립 유전자 2와 함께 IL-1A 대립 유전자 2로 확인되었다. 중증 치주염에 대한 차이율(Odds Ratio(OR))은 비흡연자 중에서 하나 이상의 IL-1A 대립 유전자 2 및 IL-1B(TaqI) 대립 유전자 2의 사본을 보유하는 환자의 경우 4.3이다. 흡연자 및 비흡연자의 개체군에서, 흡연자 또는 IL-1A 대립 유전자 2 및 IL-1B(TaqI) 대립 유전자 2의 하나 이상의 사본을 보유하는 환자에 대한 OR은 중증 질환의 경우 10.06이다.
또한 본 발명에 따라서, 증가된 중증 치주 질환과 관련된 환자의 유전적 다형 현상 패턴을 확인하기 위한 키트를 개시하고 있다. 키트는 DNA 시료를 수거하는 수단; 및 IL-1A 및 IL-1B에 대한 유전적 다형 현상 패턴을 결정하고 이어서 중증 치주 질환에 대한 환자의 감수성을 결정하기 위해서 상기 패턴을 대조 시료와 비교하는 수단을 포함한다.
DNA 시료는 혈액 또는 조직 시료로부터 수득한다. 바람직한 일양태에서, 환자의 손가락을 찔러 흡수지에 수거하여 얻은 혈구로부터 DNA를 수득할 수 있다. 또한 바람직한 일양태에서, 혈액은 AmpliCardTM(University of Sheffield, Department of Medicine and Pharmacology, Royal Hallamshire Hospital, Sheffield, England S10 2JF)에 수거할 수 있다. 이어서, DNA를 건조된 혈액 스폿으로부터 분리한 후 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 표적 서열을 증폭하였다. 대상 유전자 내의 특정 다형 현상 DNA 영역을 표적하는 올리고뉴클레오티드 DNA 프라이머를 제조하므로서 PCR 반응으로 표적 서열을 증폭시킨다. 상기 일양태는 단지 소량의 혈액만이 필요하다는 장점이 있으며 정맥 청자 또는 조직 생검에 대한 요구를 피할 수 있다. 그러나, DNA를 수거하고 당업계에 공지된 다형 현상 패턴을 결정하는 기타 수단을 사용할 수 있다.
이어서 주형 DNA로 부터 증폭된 DNA 서열을 제한 효소를 사용하여 분석하므로서 증폭된 서열에 존재하는 유전적 다형 현상을 결정하고, 따라서 환자의 유전적 다형 현상 프로파일을 제공할 수 있다.
일부 질환은 현저한 염증 및 기타 면역 성분을 갖는다. 염증성 및 기타 면역 응답의 주성분은 시토킨 생성물이다. 시토킨은 흉선-유도된 T 림프구(T-세포), B-림프구 및 단핵구/대식 세포를 비롯한 활성화된 면역 세포에 의해 생성되는 펩티드/단백질 면역 조절인자이다. 시토킨은 인터루킨(IL-1 내지 IL-15), 과립 백혈구 및/또는 대식 세포에 대한 콜로니 자극 인자(CSFs)(CSF-G, CSF-M, CSF-GM), 종양 괴사인자(TNFs α 및 β), 및 인터페론(IFN α, β 및 γ)를 포함한다. IL-1의 기본 활성은 IL-1α, IL-β 및 IL-1 수용체 길항 물질(IL-1ra)의 조합된 활성을 포함한다. (참고, Duff, 1993; and Basic and Clinical Immunology, 8th, Ed., 1994, Stites, Terr 및 Parslow, editors, Chapter 9, p 105-123). 미국 특허 5,328,829는 치주 질환의 활성 부위에서 IL-1β를 발견하였으나, 질병 상태와의 상호 관계는 보고하지 않았다. 단일 시토킨과 관련된 다형 현상 및 질병 상태는 예를 들어 전신성 홍반성 루프스, 궤양성 대장염 및 유년기 루마티스 관절염에서 발견된다(Mansfield 등, 1994; Verjans 등, 1992; Blakemore 등, 1994; McGuire 등, 1994; McDowell 등, 1995).
시토킨 IL-α 및 IL-β를 암호하는 DNA 서열에서 특정 다형 현상은 중증 치주 질환과 연관이 있는 것으로 밝혀졌다. 다형 현상은 하기와 같다:
IL-1A:(2q12-14에서 염색체 2)
-889에서 단일 염기 변이(C/T)의 이중-대립 유전적 다형 현상의 대립 유전자를 제한 효소를 사용한 대립 유전자-특이 분열에 의해 확인한다. 유전자를 IL-1A로 명명하는 반면 생성물(시토킨)은 IL-1α로 명명한다. 염기 -889에서 대립 유전자 1은 C이고 대립 유전자 2는 T이다. 완전 제한 효소 인식 부위는 변형된 프라이머 서열을 사용한 PCR 반응에서 변이에 의해 부분적 부위를 도입하므로서 형성된다. 상기 부위는 다형 현상의 대립 유전자 중 하나의 서열에 의해서 완결된다. PCR 반응의 생성물의 제한 효소 분해 후에, DNA를 크기별로 전기 영동에 의해서 분리한다.
겔로부터(또는 방사선 내부 DNA 서열로 프로된 것의 서던 블롯), 다형 현상 대립 유전자를 동정하였다. 비절단 단편(거대)은 북유럽 개체군에서 더 희박한 대립 유전자이다.
IL-1B:(염색체 2; 2q12-14)
2개의 이중-대립 유전자의 다형 현상은 대립 유전자내에 자연적으로 발생하는 부위에서 대립 유전자 특이 분열을 사용하여 2개의 상이한 PCR 생성물의 형을 결정할 수 있다. 대립 유전자는 제한 분해 및 아가로스 겔에서의 분리 후에 단편의 크기에 의해 확인된다. 유전자는 IL-1B로 명명하는 반면 생성물(시토킨)은 IL-β로 명명한다. 부위는 -511(IL-1B(AvaI)로 명명) 및 +3953(IL-1B(TaqI)으로 명명)에서 단일 염기 변이체이며, 제한 효소를 사용하여 대립 유전자-특이 분열에 의해 확인한다. 각 다형 현상의 경우 대립 유전자 1은 C이고 대립 유전자 2는 T이다.
이어서, 환자의 시토킨 다형 현상 프로파일, 즉 대립 유전자 분포를 대조군과 비교한다. 대조군은 치주가 건강한 환자로부터 수득한 것과 성인 비중증 치주염 환자 및 성인 중증 치주 환자로부터 수득한 것이다. 즉, 건강한 사람 및 공통 임상적 기준에 따라 병의 경중이 상이한 치주 질환이 있는 환자와 프로파일을 비교하고, 이 대응으로 치주 질환에 대한 소인을 결정한다. 일양태에서, 아군내에 유전적 변이를 도모하기 위해서 종족학적으로 대응시킨 대조군을 제공한다.
이들 특정 장소에서 대립 유전자 다형 현상 패턴(유전자형)사이의 관련 및 질병의 진행 및/또는 심화를 시험하기 위해서 차이율(대략적인 상대 위험율)을 유도한다. 이는 치주 질환의 임상적 관리에 사용되는 예상 정보를 제공한다.
상기 토의는 증가된 중증 치주 질환과 연관된 환자의 유전적 다형 현상 패턴의 확인용 키트를 위한 실제적인 근거를 제공한다. 중증 질환에 대한 위험에서 이를 확인하면 질병의 시작전에 예방적 대책을 개시한다. 또한 2개의 위험 인자, 즉 흡연 및 감수성 유전형을 갖는 환자는 질병의 악화 위험이 극도로 높기 때문에 특별히 모니터할 수 있다. 본 발명이 사용된 방법 및 본 발명의 유용성은 하기의 실시예에 의해 나타낼 수 있다.
다형 현상 결정 및 관련 질환
일반적인 방법
기타의 언급이 없으면, DNA 기술을 포함하는 반응 및 조작은 참고로 인용한 Sambrook 등의 문헌[Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)]에 개시된 바와 같이 수행하였다. 또한 기타의 언급이 없으면 미국 특허 4,666,828; 4,801,531; 및 5,272,057과 McDowell 등의 문헌(1995)에 개시된 방법론을 사용하였다.
PCR에 사용된 효소는 GIBCO BRL로부터 수득하였으며, 열순환기는 퍼킨-엘머 또는 바이오메트라를 사용하였다. 제한 효소 NcoI 및 TaqI는 프로메가(미국)로부터 수득하였다. 제한 효소 AvaI 및 Bau36I는 NEB(미국)로부터 수득하였다.
환자 선별 및 질병 분류
성인의 치주 질환과 관련된 유전적 다형 현상은 McDowell 등의 계획안(1995)을 사용하여 측정하였다. 흡연의 차단 효과 때문에, 중증 질환과 연관된 유전적 인자는 비흡연자에서 측정한다. 치주 질환의 존재를 위한 치과 진료소에서 그 외에는 건강한 성인의 군을 선별하였다. 연구는 주로 북유럽 가계의 개체를 포함하였다. 질병의 부재에 대하여 각 환자를 선별하거나, 또는 질병이 존재하는 경우 4개의 변수 각각에서 정도에 따라 환자를 선별하였다. 4가지 대상 변수는 임상적 부착물 손실(CAL), 포켓 심도, 치은염 및 인접면 사이의 뼈 손실이다. 혈액 시료를 취하고, DNA를 분리하고 IL-1A 및 IL-1B 유전 장소에서 유전적 다형 현상을 측정한다. 또한, 흡연의 여부 뿐만 아니라 당뇨병, 심혈관 질환 또는 초기 치아 손실의 가계 병력상에 특정 문제를 비롯하여 각 환자의 치과적 병력을 수득하였다.
치주 질환 상태를 측정하기 위해서, 전 구강내에 포켓 심도(PD) 측정, 퇴측(R), 플라크(Pl) 및 검사시의 출혈(BOD)을 포함한 실험을 각 환자에게 시행하였다. 임상적 부착물(CAL)은 포켓 심도 및 퇴축으로부터 추정한다. 방사선사진으로 뼈 손실을 평가한다. 이들 측정을 기준으로 하여, 환자를 건강, 경증 내지 보통 치주염 또는 중증 치주염으로 분류한다.
모든 임상적인 변수는 168 부위 이하의 각 치아(3번째 구치는 제외)에서 6개의 표면(단부 협측, 협측, 근심 협측, 근심 설, 설 및 단부 설)상에서 계산한다. 모든 방사선 사진의 변수는 56부위 이하의 각 치아상의 2개의 표면에서 계산한다.
질환의 경중 분류는 하기와 같다:
치주가 건강: 환자는 ≤4mm의 모든 포켓 심도, 비제한된 안면 CAL, ≤2mm의 인접면 사이의 CAL 및 <15% 방사선 사진 뼈 손실을 나타낸다. 비제한된 플라크 및 치은염 염증 및 퇴축이 나타날 수도 있다.
경증 내지 보통 치주염: 35세 이전에는 질환의 개시 병력이 없다. 환자는 2개 이하의 결손 치아, 기타 3번째 구치, 치과 교정 치료를 위해 뽑은 치아 및 구강외 외상의 결과로서의 치아 손실을 나타낸다. 환자는 또한 5 내지 9의 인접면 부위에서 PD≥6mm를 나타낸다. 제한된 인접면 부위의 2 이상은 상이한 4분원에서 발생해야 한다. 치은염 염증(검사시의 출혈에 의해 입증됨)은 2/4 이상에서 존재하였다. 총 구강 방사선 사진은 ≥50% 뼈 손실을 갖는 4개 미만의 인접면 부위을 개시하고 있다. 방사선 사진의 총 구강 평균 뼈 손실은 25% 미만이여야 한다. 상기 분류에서는 CAL에 대한 특징은 없다.
중증 치주염: 환자는 ≥7mm로 측정된 ≥10의 인접면 부위를 나타내며, 8개 이상의 치아에서 ≥7mm의 PD가 발생하였다. CAL은 ≥11 부위에서 ≥5mm로 측정되었다. 지난 3년 동안 찍은 전 구강 방사선 사진은 30% 이상의 총 구강 평균 뼈 손실을 갖는 방사선 사진에서 ≥50% 뼈 손실을 갖는 ≥7의 인접면 부위를 보여준다.
통계적 분석
χ2분석을 사용하였다. 차이율(Odds Ratio)(상대적인 위험율)은 Woolf(1955)에 의해 기술된 2×2 분할표로부터 계산하였다.
선택된 대립 유전자를 위한 PCR 증폭 및 제한 효소 분해 프로토콜
IL-1A
IL-1A 염기 -889에서 단일 염기 변이(C/T) 다형 현상을 하기와 같이 확인하였다:
스크리닝: 게놈 주형의 PCR 증폭. C가 -889에서 이용 가능한 경우 NcoI 부위를 완결하기 위해서 하나의 잘못된 쌍을 프라이머내로 삽입한다.
프라이머: 하기 프라이머는 게놈 서열을 기초로한 ABI DNA 합성자에서 생성하였다(Furutani 등, 1986; 진뱅크 XO3833).
5' TGT TCT ACC ACC TGA ACT AGG C 3'
(-967/-945) (서열 번호 1)
5' TTA CAT ATG AGC CTT CCA TG 3'
(-888/-869) (서열 번호 2)
PCR 조건:
[96℃(1분)] 1 사이클;
[94℃(1분), 46℃(1분), 72℃(1분)] 40 사이클;
[72℃(4분)] 1 사이클.
제한 효소 분해: 37℃에서 8시간 동안 NcoI로 분해하였다. 8% PAGE 또는 2% 아가로스 겔에 의해 크기순으로 배열하였다.
분해로부터 예상되는 결과;
대립 유전자 1 (C) 대립 유전자 1의 PCR 생성물의 NcoI 분해는 83 및 15 염기쌍(bp) 단편을 생성할 것이다.
대립 유전자 2 (T) 대립 유전자 2의 PCR 생성물의 NcoI 분해는 효과가 없으며 99 염기쌍(bp) 생성물을 생성할 것이다.
IL-1B(AvaI)
IL-1B 염기 -511에서의 단일 염기 변이(C/T) 다형 현상을 하기와 같이 확인하였다:
스크리닝: 게놈 주형의 PCR 증폭. 단일 염기 변이는 대립 유전자 1(C)상의 AvaI 부위, 대립 유전자 2(T)상의 Bau36I 부위를 완결시킨다.
프라이머: 하기 프라이머는 게놈 서열을 기초로한 ABI DNA 합성자에서 생성하였다(Clark 등, 1986; 진뱅크 XO4500).
5' TGG CAT TGA TCT GGT TCA TC 3'
(-702/-682) (서열 번호 3)
5' GTT TAG GAA TCT TCC CAC TT 3'
(-417/-397) (서열 번호 4)
PCR 조건:
[95℃(2분)] 1 사이클;
[95℃(1분), 53℃(1분), 74℃(1분)] 35 사이클;
[74℃(4분)] 1 사이클.
제한 효소 분해: 37℃에서 8시간 동안 NcoI로 분해하였다. 8% PAGE에 의해 크기순으로 배열하였다.
분해로부터 예상되는 결과;
대립 유전자 1 (C) 대립 유전자 1의 PCR 생성물의 AvaI 분해는 190 및 114 bp 단편을 생성할 것이다. 대립 유전자 1의 PCR 생성물의 Bau36I 분해는 효과가 없으며 304 bp 생성물을 생성할 것이다.
대립 유전자 2 (T) 대립 유전자 2의 PCR 생성물의 AvaI 분해는 효과가 없으며, 304 bp 생성물을 생성할 것이다. 대립 유전자 2의 PCR 생성물의 Bau36I 분해는 190 및 114bp 단편을 생성할 것이다.
IL-1B (TaqI)
IL-1B 염기 +3953에서 단일 염기 변이(C/T) 다형 현상을 하기와 같이 확인하였다:
스크리닝: 게놈 주형의 PCR 증폭. 하나의 부적절한 쌍을 양성 대조군으로 TaqI 부위를 완결시키도록 프라이머내에 삽입하였다. 다형 현상의 TaqI 부위는 선천적인 것이다.
프라이머: 하기 프라이머는 게놈 서열을 기초로한 ABI DNA 합성자에서 생성하였다(Clark 등, 1986; 진뱅크 XO4500).
5' CTC AGG TGT CCT CGA AGA AAT CAA A 3'
(+3844/+3868) (서열 번호 5)
5' GCT TTT TTG CTG TGA GTC CCG 3'
(+4017/+4037) (서열 번호 6)
PCR 조건:
[95℃(2분)] 1 사이클;
[95℃(1분), 67.5℃(1분), 74℃(1분)] 38 사이클;
[72℃(8분)] 1 사이클.
제한 효소 분해 : 60℃에서 8시간 동안 분해시킨다. 8% PAGE로 크기순으로 배열하였다.
분해로부터 예상되는 결과 :
대립유전자 1(C) 대립유전자 1의 PCR 생성물의 TaqI 분해는 12, 85 및 97 bp 단편을 생성할 것이다.
대립유전자 2(T) 대립유전자 2의 PCR 생성물의 TaqI 분해는 12 및 182 bp 단편을 생성할 것이다.
결과
성인 흡연자 및 비흡연자를, 전술한 바와 같은 공통 임상적 기준을 사용하여 치주 질환의 경중에 관하여 분류하였다. 그 데이터는 하기 표 1에 수록하였다.
그룹 H M S
N 49 42 42
평균 S.D. 평균 S.D. 평균 S.D.
BOP* 10.44 7.77 20.84 10.91 26.37 13.63
PD 2.84 0.49 3.85 0.3 4.31 0.46
CAL 2.68 0.89 4.31 0.5 8.66 1.33
#>49% 0 0 0.48 0.67 14.8 7.6
%bl 11.8 2 22.4 2.6 41.8 8.3
표에 사용된 약어는 다음과 같다 : PD(포켓 심도), BOP(검사시의 출혈), CAL(임상적인 부착물 손실), #>49%(뼈의 손실이 49% 이상인 부위의 수), %bl(뼈의 손실%), S.D.(표준편차); H = 건강함, M=경증/보통, S = 중증임.
*는 적어도 95% 신뢰도에서의 유의수준을 나타냄.
표 2에서는 임상적 데이터를 보여주며 흡연자와 비흡연자를 비교하였다. 흡연자와 비흡연자간에는 전체적인 임상적 질환에서 상당한 차이가 있었다.
흡연여부 비흡연자 흡연자 P
N 100 36
평균 S.D. 평균 S.D.
BOP 17.4 11.9 22.85 0.14 0.042 *
PD 3.42 0.62 3.97 0.78 4E-04 **
CAL 3.98 1.61 5.7 2.08 1E-04 **
N 98 35
#>49% 2.43 5.82 11.59 9.88 1E-04 **
%bl 20.53 10.83 36.76 13.04 1E-04 **
약어는 표 1의 것과 동일함.
표 3은 IL-1A 대립 유전자 1 및 2에 대한 임상적 발견을 요약하고 비교한 것이다. 각각의 유전자에 대한 대립유전자형은 쌍을 이룬 숫자에 의해 표시되는 데, 즉 l/1은 대립 유전자 1의 동종 접합체이고, 1/2는 대립 유전자 1 및 2에 대하여 이형 접합체라는 것을 나타낸다. 여기서 유전자형은 대립 유전자 2로서 주어지는 데 이는 대립유전자의 하나 이상의 복제물이 존재한다는 것을 나타낸다. 상기분석은 비흡연자들에게 실시한 것이다. 표 2의 데이터를 통해 한 그룹의 흡연자들이 유전자 소인에 대한 분석값내에 포함되지 않을 정도의 심각한 질환을 갖고 있다는 것을 나타낸다. 표 3에서의 데이터는 IL-IA 대립유전자 2의 담체에 대한 심각한 임상적인 질환이 특히 뼈 손실%, CAL 및 PD에 대하여 연관이 있다는 것을 보여준다. 분석된 개체군은 비흡연자에 대한 모든 질환 그룹을 포함한다.
IL-lA 11 12 또는 22
N 44 54
평균 S.D. 평균 S.D. P
BOP 16.7 12.7 18 11.6 0.598
PD 3.28 0.65 3.36 0.58 0.58
CAL 3.62 1.48 4.3 1.56 0.036 *
#>49% 1.48 4.83 3.2 6.45 0.133
%bl 17.41 8.77 23.19 11.36 0.006 **
약어는 표 1의 것과 동일함.
표 4에서는 IL-1B(TaqI)대립 유전자 1 및 2에 대하여 동일한 분석을 수행하였다.
IL-lB(TaqI) 11 12 또는 22
N 51 47
평균 S.D. 평균 S.D. p
BOP 18.3 12.1 18.6 12 0.341
PD 3.35 0.56 3.5 0.67 0.234
CAL 3.82 1.44 4.18 1.79 0.278
#>49% 1.73 6.07 3.18 6.5 0.218
%bl 18 9.14 22.32 11.9 0.123
약어는 표 1의 것과 동일함.
표 5에서는, (+) 유전자형 IL-1A 대립유전자 2 + IL-1B(TaqI) 대립유전자 2를 갖는 환자 : (-) 유전자형 IL-1A 대립유전자 2 + IL-1B(TaqI) 대립유전자 2를 갖지 않는 환자에 대한 동일한 분석을 하였다. 더욱 구체적으로, 상기 - 유전자는 IL-1A(1/1) + IL-1B(TaqI)(1/1 또는 1/2 또는 2/2) 또는 IL-1A(1/2 또는 2/2) + IL-1B(TaqI)(1/1)이다. + 유전자형은 IL-1A(1/2 또는 2/2) + IL-1B(TaqI)(1/2 또는 2/2)이다.
유전자형 - +
N 63 35
평균 S.D. 평균 S.D. P
BOP 16.2 12.0 19.5 11.9 0.194
PD 3.32 0.59 3.62 0.64 0.023 *
CAL 3.7 1.41 4.52 1.83 0.026 *
#>49% 1.43 4.60 4.22 7.26 0.044 *
% b1 18.13 8.74 25.03 12.3 0.005 **
표 1에서와 같은 약어
환자의 질환 심화도에 따른 IL-1A 및 IL-1B(TaqI)에 대한 대립 유전자 분포를 측정하고 그 결과는 표 6에 나타나있다.
모든 검체
환자의 유전자형 질환의 경중 분포
IL-1A IL-1B(TaqI) 건강 경증-보통 질환 중증
1/1 1/1, 1/2, 2/2 3061.2% 1638.1% 1944.2%
1/2, 2/2 1/1 816.3% 1023.8% 818.6%
1/2, 2/2 1/2, 2/2 1122.4% 1638.1% 1535.7%
49100% 42100% 42100%
* 분포는 각 종류에서 환자의 수 및 질병 종류에 대한 환자의 백분율로 주어진다.
표 7에서, IL-1A 및 IL-1B(TaqI)를 위한 비흡연자에 대한 결과가 나타나있다. 중증 질환을 갖는 환자중에서, 64.7%는 이종 접합 또는 동종 접합 유전자형에서 대립 유전자 2의 존재로 중증 질환 감수성을 나타내는 IL-1A 1/2 또는 2/2 및 IL-1B(TaqI) 1/2 또는 2/2의 유전자형을 갖는다.
비흡연자
환자의 유전자형 질환의 경중 분포
IL-1A IL-1B(TaqI) 건강 경증-보통 질환 중증 질환
1/1 1/1, 1/2, 2/2 2761.4% 1335.2% 423.5%
1/2, 2/2 1/1 715.9% 1027.0% 211.8%
1/2, 2/2 1/2, 2/2 1022.7% 1437.8% 1164.7%
44100% 37100% 17100%
차이율(대략 상대적인 위험율)은 IL-1A 대립 유전자 2 및 IL-1B(TaqI) 대립 유전자 2에서의 대립 유전자의 다형 현상 패턴(유전자형) 및 질병의 진행 및/또는 이의 심화사이의 관계로부터 유도되었다. 차이율은 표 8에 나타낸 분할표를 사용하여 계산하였다. 하기의 수학식1을 사용하여 차이율을 계산하였다(Woolf, 1995).
(A×D)/(C×B)
단순 분할표
대상의 유전자형 표현형 1 표현형 2
존재 A B
부재 C D
표 9에 나타난 바와 같이, 흡연자 또는 유전자 형 IL-1A 대립 유전자2 + IL-1B(TaqI) 대립 유전자 2(+유전자형)을 갖는 환자는 이 유전자 형을 갖지 않는 환자에서보다 더 중증 질환을 나타낼 것 같다; 10.06:1의 차이율. 비 흡연자들 사이에서(표 10), 차이율은 유전자형 IL-1A 대립 유전자 2 + IL-1B(TaqI) 대립 유전자 2를 갖는 환자의 경우 4:3:1이다.
모든 검체의 차이율
흡연자 OR 유전자형:IL-1A 대립 유전자 2 + IL-1B(TaqI) 대립 유전자 2 중증 질환 건강 또는 경증-보통 질환
존재 36 34
부재 6 57
OR = 10.06 (3.84-26.35)χ2= 26.95 (p<0.0001)
비흡연자의 차이율
유전자형:IL-1A 대립 유전자 2 + IL-1B(TaqI) 대립 유전자 2 중증 질환 건강 또는 경증-보통 질환
존재 11 24
부재 6 57
OR = 4.3χ2= 7.53 (p<0.006)
흡연자 또는 IL-1A 대립 유전자 2 + IL-1B(TaqI) 대립 유전자 2(+유전자형)의 표적 유전자형이 표 11에 나타나있다.
IL-1A 및 IL-1B(AvaI)에 대한 대립 유전자의 분포를 비흡연자(n=100)에 대하여 측정하여, 표 12에 나타내었다. 중증 환자중에서, 36.8%는 IL-1A 1/2 또는 2/2 및 IL-1B(AvaI) 1/2 또는 2/2의 유전자형을 갖는다.
N 63 70
평균 S.D. 평균 S.D.
BOP 16.24 12.01 21.01 12.98 0.0617 **
PD 8.32 0.59 3.79 0.73 0.0008 **
CAL 3.7 1.41 5.12 2.05 0.0001 **
#>49% 1.43 4.6 7.86 9.24 0.00001 **
%b1 18.13 8.74 30.32 13.68 0.00001 **
표 1에서와 같은 약어
비흡연자
환자의 유전자형 질환의 심화도 분포
IL-1A IL-1B(TaqI) 건강 경증-보통 질환 중증 질환
1/1 1/1, 1/2, 2/2 2761.4% 1335.2% 421.1%
1/2, 2/2 1/1 1125.0% 1027.0% 842.1%
1/2, 2/2 1/2, 2/2 613.6% 1437.8% 736.8%
44100% 37100% 19100%
비흡연자 중에서, 차이율은 유전자형 IL-1A 대립 유전자 2 + IL-1B(AvaI) 대립 유전자 2를 갖는 환자의 경우 0.85이다(표 13). 이 유전적 조합은 치주 질환의 경중과 관련이 없는 것으로 보인다.
유전자형:IL-1A 대립 유전자 2 + IL-1B(AvaI) 대립 유전자 2 중증 질환 건강 또는 경증-보통 질환
존재 10 46
부재 9 35
나타난 자료는 경증 질환을 갖는 검체중 86.0%가 현재 흡연자이거나 또는 표적 유전자형 IL-1A 대립 유전자 2 + IL-1B(TaqI) 대립 유전자 2를 갖는다는 것을 보여준다. 현재 비흡연자이거나 또는 표적 유전자형을 갖지 않는 검체중에서, 90.5%가 중증 질환을 갖지 않았다. 현재 흡연자이거나 또는 표적 유전자형을 갖는 검체 중에서, 52.1%가 임의의 기타 위험 요소와 무관하게 중증 질환을 갖고 있었다.
따라서 본 발명은 초기 치료를 위하여 중증 치주 질환의 위험에 있는 환자를 확인하는 방법을 제공한다.
본 출원은 각종 간행물 및 특허를 참고하고 있다. 참고한 간행물 및 특허에 대한 인용문은 하기에 목록화된 것을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 간행물 전체의 개시물은 본 발명과 관련된 업계의 상태를 더 완전히 기술할 수 있도록 본원에서 참고로 인용하였다.
본 발명은 예시적인 방법으로 기술하였으며, 사용된 용어는 한정하기 위한 것 보다는 설명적 특성을 갖는 단어로 나타내려는 의도였음을 인지해야 한다.
명백하게, 본 발명의 다수의 변형 및 변화가 상기 기술의 견지에서 가능하다. 따라서, 첨부된 청구항의 범위내에서 특별히 명기하지 않고 본 발명을 실시할 수 있다는 것을 인지해야 한다.
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Woolf, B., "Estimating the relationship between blood groups and disease" Annals of Human Genetics 19: 251-253 (1955).
(1) 일반 정보 :
(i) 출원인 :
(A) 성명 : 케니스 에스. 코른만; 고르돈 더블유. 더프
(ii) 발명의 명칭 : 치주 질환에 대한 유전적 소인을 검출하는 방법
(iii) 서열의 수 : 6
(iv) 서신 주소:
(A) 수신인 : 아퀼리노 & 웰시
(B) 스트리트 : 슈트 503, 크리스탈 드라이브 2121
(C) 도시 : 애링톤
(D) 주 : 버지니아
(E) 국가 : 미국
(F) ZIP : 22202
(v) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 겸용식
(C) 작동 체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.30
(vi) 선행 출원 자료 :
(A) 출원 번호 :
(B) 출원 일자 :
(C) 분류 기호:
(viii) 대리인 정보 :
(A) 성명 : 존 엘. 웰시
(B) 등록번호 : 33,621
(C) 참조번호 : MSS-002
(ix) 통신 정보 :
(A) 전화 : (703) 920-1122
(B) 팩스 : (703) 920-3399
(2) 서열 번호 1 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 22 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(xi) 서열 : 서열 번호 1:
(2) 서열 번호 2 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 20 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(xi) 서열 : 서열 번호 2:
(2) 서열 번호 3 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 20 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(xi) 서열 : 서열 번호 3:
(2) 서열 번호 4 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 20 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(xi) 서열 : 서열 번호 4:
(2) 서열 번호 5 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 25 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(xi) 서열 : 서열 번호 5:
(2) 서열 번호 6 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 21 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(xi) 서열 : 서열 번호 6:

Claims (11)

  1. DNA 시료를 수거하는 수단, 및
    유전적 다형 현상 패턴을 결정하고 치주 질환의 경중에 대한 환자의 감수성을 결정하기 위해서 공지된 경중 질환의 대조 시료와 상기 패턴을 비교하기 위한 수단을 포함하는, 증가된 치주 질환의 경중과 관련된 IL-1A 및 IL-1B에서 환자의 유전적 다형 현상 패턴을 확인하기 위한 키트
  2. 제 1 항에 있어서, 대조 시료가 공지된 경중 질환의 대조 시료에 종족학적으로 대응되는 키트.
  3. 제 1 항에 있어서, 유전적 다형 현상 패턴을 결정하기 위한 수단이 하기 서열 1 내지 6의 PCR 프라이머를 사용한 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 DNA 표적 서열의 증폭을 포함하는 키트:
    5' TGT TCT ACC ACC TGA ACT AGG C 3' (서열 번호 1);
    5' TTA CAT ATG AGC CTT CCA TG 3' (서열 번호 2);
    5' TGG CAT TGA TCT GGT TCA TC 3' (서열 번호 3);
    5' GTT TAG GAA TCT TCC CAC TT 3' (서열 번호 4);
    5' CTC AGG TGT CCT CGA AGA AAT CAA A 3' (서열 번호 5); 및
    5' GCT TTT TTG CTG TGA GTC CCG 3' (서열 번호 6).
  4. 제 1 항에 있어서, 유전적 다형 현상 패턴 결정하기 위한 수단이 제한 효소 NcoI, TaqI, AvaI 및 Bau36I을 사용한 제한 효소 분해를 포함하는 키트.
  5. 환자로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    환자로부터 분리된 게놈 DNA에서 인터루킨 IL-1α 및 IL-1β를 위한 유전적 다형 현상 패턴을 확인하는 단계;
    확인된 패턴을 공지된 경중 질환을 갖는 대조군의 패턴과 비교하는 단게; 및
    증가된 치주 질환의 경중과 관련된 유전적 다형 현상 패턴을 발현하는 환자를 확인하는 단계를 포함하여 증가된 치주 질환의 경중을 예측하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 대조 시료가 공지된 경중 질환의 대조 시료와 종족학적으로 대응되는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, DNA에서 IL-1A 및 IL-1B에 대한 유전적 다형 현상 패턴을 확인하기 위한 상기 단계가 하기 서열 1 내지 6의 PCR 프라이머를 사용한 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 표적 DNA 서열의 증폭을 포함하는 방법:
    5' TGT TCT ACC ACC TGA ACT AGG C 3' (서열 번호 1);
    5' TTA CAT ATG AGC CTT CCA TG 3' (서열 번호 2);
    5' TGG CAT TGA TCT GGT TCA TC 3' (서열 번호 3);
    5' GTT TAG GAA TCT TCC CAC TT 3' (서열 번호 4);
    5' CTC AGG TGT CCT CGA AGA AAT CAA A 3' (서열 번호 5); 및
    5' GCT TTT TTG CTG TGA GTC CCG 3' (서열 번호 6).
  8. 제 5 항에 있어서, DNA에서 IL-1A 및 IL-1B에 대한 유전적 다형 현상 패턴을 확인하기 위한 상기 단계가 제한 효소 NcoI, TaqI, AvaI 및 Bau36I을 사용한 제한 효소 분해를 포함하는 방법.
  9. 제 5 항에 있어서, 질환의 경중과 관련된 DNA 유전적 다형 현상 패턴이 IL-1A 대립 유전자 2 + IL-1B(TaqI) 대립 유전자 2인 방법.
  10. 제 5 항에 있어서, 질환의 경중과 관련된 DNA 유전적 다형 현상 패턴이 IL-1A 대립 유전자 2의 하나 이상의 복제의 존재인 방법.
  11. 환자로부터 분리된 게놈 DNA에서 인터루킨 IL-1α 및 IL-1β에 대한 유전적 다형 현상 패턴을 확인하는 단계;
    확인된 패턴을 공지된 경중 질환을 갖는 대조군 패턴과 비교하는 단계;
    증가된 치주 질환의 경중과 관련된 유전적 다형 현상 패턴을 발현하는 환자를 확인하는 단계; 및
    증가된 치주 질환의 경중과 관련된 유전적 다형 현상 패턴을 발현하는 환자를 식별하는 레포트를 동정하고 제조하는 단계에 의해 생성된 증가된 치주 질환의 경중과 관련된 인터루킨 IL-1α 및 IL-1β에 대한 유전적 다형 현상 패턴의 결정을 기본으로하여 치주 질환의 경중 레포트의 형태로 존재하는 생성물.
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