JP4042811B2 - 歯周疾患の遺伝的素質の検出 - Google Patents
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Description
発明の背景
技術分野
本発明は重度な歯周疾患（periodontal disease）の素質を検出する方法に関する。
背景技術
歯周疾患は歯を支える硬質及び軟質組織の疾患であり、口内細菌によって開始される。歯肉炎は、歯肉が赤色になり、膨潤し、出血し易くなる歯周疾患の初期段階である。歯肉炎は通常無痛であり、治療されない場合には、組織破壊の大きさによって軽度、中等度又は重度と分類されることができる歯周炎にまで進行する可能性がある。歯周炎は主として成人の疾患であり、通常は３５歳過ぎまで検出不能である。
歯垢中に存在する細菌は歯周疾患を開始する。歯垢中の細菌によって産生される毒素は身体の炎症性機構及びその他の免疫機構を活性化して、結局は歯を支える骨及び歯肉組織の破壊をもたらす。この疾患が進行すると、歯肉は歯から離れて、ペリオドンタル・ポケットが形成され、これは細菌に保護環境を与え、それによってこの周期(cycle)を連続させる。しかし、幾つかの部位は活性であり続けない。米国特許第５，３２８，８２９号は、部位におけるインターロイキンＩＬ−１βを測定することによる口腔内の活性な歯周疾患部位の判定方法を開示する。喫煙は歯周炎の頻度と重症度との増強に関連づけられている。しかし、歯周炎を有するかなりの数の個人が喫煙していない。
この１５年間に、小さい子供とティーンエージャーを冒す特定の形の歯周炎が遺伝的に決定されることが立証されている。人口において極めて低い頻度であるこれらの疾患は、思春期の年齢前の一部の個人と思春期から１８歳までの他の個人とにおいて重度な歯周炎を生じる。このようなケースにおいて同定される遺伝的因子は、個人を多重な健康問題に非常に罹り易くすると思われる非常に明白な生物学的機構に関与している。現在までに、成人型の歯周炎に同じ遺伝的因子を見いだす試みは成功していない。
上記失敗にも拘わらず、成人型の歯周炎の疾患の臨床的発現に遺伝学が重要な役割を果たすことを実証した同じ双子の研究から、新しい証拠が１９９０年の始めに出現した（Ｍｉｃｈａｌｏｗｉｃｚ等，１９９１）。この双子研究は遺伝的要素が存在することを実証したが、これは同定されなかった。重度な成人型歯周炎に罹り易い患者を決定することは有用であると考えられる。
１〜２種類の遺伝子に関連した又は１〜２種類の遺伝子によって惹起される疾患に関する遺伝的試験が現在可能であり（米国特許第４，５８２，７８８号と第５，１１０，９２０号を参照のこと）、これらの遺伝子がひと度同定されたならば、疾患に対する特定の遺伝子を有するヒトの危険性を知ることが現在可能である（例えば、米国特許第４，８０１，５３１号、第４，６６６，８２８号及び第５，２６８，２６７号を参照のこと）。
任意の感染に関して、ひと度感染が開始したならば、身体の炎症性及びその他の免疫機構が役割を開始する（総説としては、米国特許第５，３２８，８２９号，第１欄を参照のこと）。一般に、炎症性マーカーに関する研究は歯周炎疾患の重症度を識別することにごく限られた成功を有しているにすぎず、歯周疾患の炎症性反応の遺伝的面(genetic aspect)に関しては限定された、不成功に終わった努力がなされていた。炎症性要素を有する選択された疾患における炎症性及びその他の免疫反応を抑制する、多重の遺伝子座の遺伝的変化は、疾患の罹患性又は重症度を決定する上での因子であった。それ故、炎症性及びその他の免疫機構に関連する遺伝的因子が歯周疾患の重症度に相関するかどうかを決定することが、本発明の目的であった。もしそうであるならば、これらの遺伝的因子を同定することによって、重度な形の成人型歯周疾患に罹り易い患者を同定することが有用であると考えられる。
発明の概要
本発明によると、歯周疾患の重症度の増強を予測する方法を開示する。この方法は患者からＤＮＡを単離する工程と、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βをコードする遺伝子のＤＮＡ多型パターンを決定する工程とを包含する。同定されたパターンを既知の疾患重症度の対照と比較することによって、歯周疾患重症度の増強に関連した遺伝的多型パターンを発現する患者を同定する。次に、重度な疾患の発生を予防するために、このように同定された患者を歯周疾患の早期段階においてさらに侵襲的に治療することができる。
本発明はさらに、歯周疾患重症度の増強に関連した患者の遺伝的多型パターンを同定するためのキットを開示する。このキットはＤＮＡサンプル採取手段と、遺伝的多型パターンを決定して、次にこれを対照サンプルと比較して、重度な歯周疾患への患者の罹患性を判定するための手段とを包含する。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明によると、明白な疾患を有する患者も、有さない患者も、インターロイキンＩＬ−１α及びＩＬ−１βの遺伝子配列におけるＤＮＡ多型の存在を検出することによって、重度な歯周疾患の遺伝的素質を有すると同定される。重度な歯周疾患は以下の本明細書の実施例において述べるように定義される。簡単に述べると、重度な疾患は、≧７ｍｍのサイズである≧１０個の隣接面間部位の病歴(histry)を有し、少なくとも８本の歯に≧７ｍｍのポケット深さ（ＰＤ）が生じている患者の状態として定義される。さらに、≧１１個の部位に≧５ｍｍのサイズである臨床的アッタチメント(clinical attachment)（ＣＡＬ）が見られる。この定義はさらに、最近３年間以内に撮影された完全口腔ラジオグラフがラジオグラフ上で≧５０％骨損失を有する≧７個の隣接面間部位を示し、総口腔平均骨損失が３０％より大きいことを必要とする。
重度な疾患に関連した対立遺伝子は、ＩＬ−１Ａ対立遺伝子２およびＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）対立遺伝子２として同定された。重度な歯周炎のＯｄｄ Ｒａｔｉｏ（ＯＲ）が非喫煙者では少なくとも１コピーのＩＬ−１Ａ対立遺伝子２とＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）対立遺伝子２を有する患者に関して４．３であることが判明した。喫煙者と非喫煙者との集団では、喫煙者又は少なくとも１コピーのＩＬ−１Ａ対立遺伝子２とＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）対立遺伝子２を有する患者のＯＲは重度な疾患を有するに関して１０．０６である。
さらに、本発明によると、歯周疾患重症度の増強に関連した患者の遺伝的多型パターンを同定するためのキットも開示する。このキットは、ＤＮＡサンプル採取手段と、ＩＬ−１ＡとＩＬ−１Ｂとの遺伝的多型パターンを決定して、次にこれを対照サンプルと比較して、重度な歯周疾患への患者の罹患性を判定するための手段とを包含する。
ＤＮＡサンプルは血液又は組織サンプルから得る。好ましい実施態様では、患者の指の刺し傷から、吸収性ペーパー上に血液を採取して得た血液細胞からＤＮＡを得る。さらに好ましい実施態様では、血液をＡｍｐｌｉＣａｒｄTM（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ大学，医学薬学部，Ｒｏｙａｌ Ｈａｌｌａｍｓｈｉｒｅ病院，Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ Ｓ１０ ２ＪＦ）上に採取する。次に、ＤＮＡを乾燥血液スポットから単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてターゲット配列を増幅する。問題の遺伝子内の特定の多型ＤＮＡ領域をターゲットするオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを調製して、ターゲット配列のＰＣＲ反応増幅が達成されるようにする。この実施態様は極少量の血液を必要にするに過ぎないという利点を有し、静脈注射又は組織バイオプシーの必要性を回避する。しかし、当該技術分野で公知であるような、ＤＮＡを採取して、多型パターンを決定するための他の手段も使用可能である。
鋳型ＤＮＡからの増幅ＤＮＡ配列を次に制限酵素を用いて分析して、増幅配列中に存在する遺伝的多型を決定することによって、患者の遺伝的多型プロフィルを得る。
幾つかの疾患は顕著な炎症性及びその他の免疫要素を有する。炎症性及びその他の免疫反応の主要な要素の１つはサイトカイン産生である。サイトカインは、胸腺誘導Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、Ｂリンパ球及び単球／マクロファージを包含する活性化免疫細胞によって産生されるペプチド／タンパク質モデュレーターである。サイトカインはインターロイキン（ＩＬ−１からＩＬ−１５まで）、顆粒球及び／又はマクロファージのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）（ＣＳＦ−Ｇ、ＣＳＦ−Ｍ、ＣＳＦ−ＧＭ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦαとβ）、及びインターフェロン（ＩＦＮα、β及びγ）を包含する。ＩＬ−１の基本的活性はＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）の複合活性を包含する［総説として、Ｄｕｆｆ，１９９３；及びＢａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第８版，１９９４，Ｓｔｉｔｅｓ，Ｔｅｒｒ及びＰａｒｓｌｏｗ編集，９章，１０５〜１２３頁を参照のこと）。米国特許第５，３２８，８２９号は歯周疾患の活性部位においてＩＬ−１βを発見したが、疾患状態との相互関係を報告しなかった。単一サイトカイン多型と疾患状態との関連は、例えば、Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ、Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ Ｃｏｌｉｔｉｓ ａｎｄ Ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ等，１９９４；Ｖｅｒｊａｎｓ等、１９９２；Ｂｌａｋｅｍｏｒｅ等、１９９４；ＭｃＧｕｉｒｅ等、１９９４；ＭｃＤｏｗｅｌｌ等，１９９５）におけるように発見されている。
サイトカインＩＬ−１αとＩＬ−１βをコードするＤＮＡ配列における特定の多型が重度歯周疾患に関係することが判明した。この多型は次の通りである：
ＩＬ−１Ａ：（２ｑ１２−１４における染色体２）
−８８９における単一塩基変異（Ｃ／Ｔ）の二対立遺伝子多型(bi-alleic polymorphism)の対立遺伝子は、制限酵素を用いた対立遺伝子−特異性切断によって同定される。この遺伝子はＩＬ−１Ａと名付けられ、生成物（サイトカイン）はＩＬ−１αと呼ばれる。塩基−８８９において対立遺伝子１はＣであり、対立遺伝子２はＴである。修飾プライマー配列によるＰＣＲ反応における突然変異によって部分的部位を導入することによって、完全制限酵素認識部位が形成される。この部位は多型の対立遺伝子の一方の配列によって完成する。ＰＣＲ反応の生成物の制限酵素消化後に、ＤＮＡを電気泳動的にサイズによって分離する。
このゲル（又は放射性内部ＤＮＡ配列によってプローブされたそのサザンブロット）から、多型の対立遺伝子が同定される。非切断フラグメント（より大きい）は北ヨーロッパ人口において稀な対立遺伝子である。
１Ｌ−１Ｂ：（染色体２；２ｑ１２−１４）
２つの二対立遺伝子多型は、対立遺伝子中の天然生成部位における対立遺伝子−特異性切断を用いて２種類の異なるＰＣＲ生成物に類別することができる。対立遺伝子同定は、アガロースゲルにおける制限酵素消化と分離後にフラグメントのサイズによっておこなわれる。この遺伝子はＩＬ−１Ｂと名付けられ、生成物（サイトカイン）はＩＬ−１βと呼ばれる。部位は−５１１（ＩＬ−１Ｂ（ＡｖａＩ）と呼ばれる）と＋３９５３（ＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）と呼ばれる）とにおける単一塩基変異（Ｃ／Ｔ）であり、制限酵素を用いた対立遺伝子−特異性切断によって同定される。各多型に関して、対立遺伝子１はＣであり、対立遺伝子２はＴである。
次に、患者のサイトカイン多型プロフィル、即ち、対立遺伝子分布を対照と比較する。対照は、歯周的に健康である患者と、成人型非重度歯周炎患者及び成人型重度歯周炎患者とからである。即ち、患者のプロフィルを健康な人々及び重症度の異なる歯周疾患の患者と、共通臨床基準(consensus clinical criteria)に従って比較して、適合(match)が歯周疾患の素質を決定する。１実施態様では、亜集団(subpopulation)内の遺伝的変異に対応するために民族的に適合する対照を用意する。
これらの特定遺伝子座における対立遺伝子多型パターン（遺伝子型）と疾患の発現及び／又はその重症度との間の関連を試験するために、Ｏｄｄ Ｒａｔｉｏ（大体の相対的危険性）が導出される。これは、歯周疾患の臨床的治療に用いられる予測情報を提供する。
上記考察は、歯周疾患重症度の増強に関連した患者の遺伝的多型パターンを同定するためのキットの事実に基づく根拠を与える。重度の疾患の危険を有する人の同定は、疾患が発現する前に予防手段を開始することを可能にする。さらに、２つの危険因子（喫煙と罹り易い遺伝子型）を有するような患者を、かれらの重度疾患危険性が極めて高いので、特別にモニターすることができる。本発明によって用いられる方法と、本発明の有用性は下記実施例によって示すことができる。
実施例
多型決定と疾患の関連
一般的方法
ＤＮＡ方法を包含する反応と操作は、他に指示しないかぎり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（本明細書に援用される）に記載されている通りにおこなう。米国特許第４，６６６，８２８号、第４，８０１，５３１号及び第５，２７２，０５７号と、ＭｃＤｏｗｅｌｌ等，１９９５とに記載される方法も、他に指示しない限り、用いる。
ＰＣＲに用いる酵素はＧＩＢＣＯ ＢＲＬからであり、サーモサイクラー(thermocycler)はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ又はＢｉｏｍｅｔｒａのいずれかであった。制限酵素ＮｃｏＩとＴａｑＩはＰｒｏｍｅｇａ（ＵＳ）からであった。制限酵素ＡｖａＩとＢｓｕ３６ＩはＮＥＢ（ＵＳ）からであった。
患者の選択と疾患の分類
成人における歯周疾患に関連した遺伝的多型をＭｃＤｏｗｅｌｌ等（１９９５）のプロトコールを用いて決定した。喫煙の遮蔽効果(masking effect)のために、重度疾患に関連した遺伝的因子は非喫煙者において検出した。他の点では健康な成人のグループを歯科クリニックにおいて歯周疾患の存在に関してスクリーニングした。この研究は主として北ヨーロッパ系の個人を包含した。各患者を疾患の不存在又は、疾患が存在する場合には、４パラメータの各々におけるその程度に関してスクリーニングした。問題の４変数は臨床的アタッチメント損失（ＣＡＬ）、ポケット深さ、歯肉炎及び隣接面間骨損失である。血液サンプルを採取し、ＤＮＡを単離し、ＩＬ−１Ａ及びＩＬ−１Ｂ遺伝子座における遺伝的多型を決定した。さらに、糖尿病、心血管系疾患又は早期歯欠損(early tooth loss)の家族歴並びに喫煙者であるか否かに関する特定の質問を包含した、各患者のデンタルヒストリー(dental histry)を入手した。
歯周疾患の状態を判定するために、各患者はポケット深さ（ＰＤ）、陥没(recession)（Ｒ）、歯垢（Ｐｌ）及びプローブ診査(probing)時の出血（ＢＯＰ）の完全口腔測定を包含する検査を受けた。臨床的アタッチメント損失（ＣＡＬ）はポケット深さと陥没から算出する。ラジオグラフが骨損失を評価する。これらの測定に基づいて、患者を健康、軽度〜中等度歯周炎又は重度歯周炎として分類した。
臨床的変数の全ては、各歯（第３臼歯を除く）の６表面（遠心頬側、頬側、近心頬側、近心舌側、舌側及び遠心舌側）上の１６８部位までに関して算出した。全てのラジオグラフ変数は各歯の２表面上の５６部位までに関して算出した。
疾患の重症度分類は次の通りである：
歯周的健康：患者は、全てのポケット深さ≦４ｍｍ、限定されないフェイシアル(facial)ＣＡＬ、≦２ｍｍの隣接面間ＣＡＬ及び＜１５％ラジオグラフ骨欠損を提示した。限定されない歯垢及び歯肉炎症と陥没も存在することができる。
軽度〜中等度歯周炎：３５歳までに疾患発現の病歴なし。患者は、第３臼歯、矯正治療のために抜いた歯及び口腔外の外傷の結果として欠損した歯以外には、僅か２個以下の喪失歯を提示した。患者はまた、５〜９隣接面間部位においてＰＤ≧６ｍｍをも提示した。条件を満たす(qualifying)隣接面間部位の少なくとも２つは、異なる四分円(quadrant)に存在しなければならない。歯肉炎症（プローブ診査時の出血によって例示）が少なくとも２つの四分円に存在した。完全な口腔ラジオグラフは≧５０％骨欠損を有する４箇所未満の隣接面間部位を示さなければならない。ラジオグラフによる総口腔平均骨欠損が２５％未満でなければならない。この分類には、ＣＡＬの規定は存在しない。
重度な歯周炎：≧７ｍｍのサイズである≧１０隣接面間部位と、少なくとも８本の歯に生じた≧７ｍｍのＰＤを提示した患者。ＣＡＬは≧１１部位において≧５ｍｍのサイズであった。最近３年間内に撮影された完全口腔ラジオグラフは、ラジオグラフ上で≧５０％骨欠損を有する≧７隣接面間部位と、３０％より大きい総口腔平均骨欠損を示した。
統計分析
ｘ2分析を用いた。Ｏｄｄ Ｒａｔｉｏ（相対的危険性）はＷｏｏｌｆ，１９５５が記載しているような２ｘ２偶然表から算出した。
選択した対立遺伝子に関する、ＰＣＲ増幅と制限酵素消化プロトコール
ＩＬ−１Ａ
ＩＬ−１Ａ塩基−８８９における単一塩基変異（Ｃ／Ｔ）多型は次のように同定した：
スクリーニング：ゲノム鋳型のＰＣＲ増幅。Ｃが−８９９において利用可能である場合には、１つのミスマッチをプライマーに挿入して、ＮｃｏＩ部位を完成した。
プライマー：ゲノム配列に基づいて、ＡＢＩ ＤＮＡ合成機において下記プライマーを作製した（Ｆｕｒｕｔａｎｉ等，１９８６；ＧＥＮＢＡＮＫ Ｘ０３８３３）。
ＰＣＲ条件：
［９６℃（１分間）］１サイクル；
［９４℃（１分間）、４６℃（１分間）、７２℃（１分間）］４０サイクル；
［７２℃（４分間）］１サイクル。
制限酵素消化：消化は３７℃においてＮｃｏＩによって８時間おこなった。サイジイング(sizing)は８％ＰＡＧＥ又は２％アガロースゲルによっておこなった。
消化から予測された結果：
対立遺伝子１（Ｃ） 対立遺伝子１のＰＣＲ生成物のＮｃｏＩ消化は８３塩基対（ｂｐ）と１６塩基対フラグメントを生じる。
対立遺伝子２（Ｔ） 対立遺伝子２のＰＣＲ生成物のＮｃｏＩ消化は無効であり、９９塩基対（ｂｐ）生成物を生じる。
ＩＬ−１Ｂ（ＡｖａＩ）
ＩＬ−１Ｂ塩基−５１１における単一塩基変異（Ｃ／Ｔ）多型は次のように同定した：
スクリーニング：ゲノム鋳型のＰＣＲ増幅。この単一塩基変異は対立遺伝子１（Ｃ）におけるＡｖａＩ部位、対立遺伝子２（Ｔ）におけるＢｓｕ３６Ｉ部位を完成する。
プライマー：ゲノム配列に基づいて、ＡＢＩ ＤＮＡ合成機において下記プライマーを作製した（Ｃｌａｒｋ等，１９８６；ＧＥＮＢＡＮＫ Ｘ０４５００）。
ＰＣＲ条件：
［９５℃（２分間）］１サイクル；
［９５℃（１分間）、５３℃（１分間）、７４℃（１分間）］３５サイクル；
［７４℃（４分間）］１サイクル。
制限酵素消化：消化は３７℃において８時間おこなった。サイジイングは８％ＰＡＧＥによっておこなった。
消化から予測された結果：
対立遺伝子１（Ｃ） 対立遺伝子１のＰＣＲ生成物のＡｖａＩ消化は１９０ｂｐと１１４ｂｐフラグメントを生じる。対立遺伝子１のＰＣＲ生成物のＢｓｕ３６Ｉ消化は無効であり、３０４ｂｐ生成物を生じる。
対立遺伝子２（Ｔ） 対立遺伝子２のＰＣＲ生成物のＡｖａＩ消化は無効であり、３０４ｂｐ生成物を生じる。対立遺伝子２のＰＣＲ生成物のＢｓｕ３６Ｉ消化は１９０ｂｐと１１４ｂｐフラグメントを生じる。
ＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）
ＩＬ−１Ｂ塩基＋３９５３における単一塩基変異（Ｃ／Ｔ）多型は次のように同定した：
スクリーニング：ゲノム鋳型のＰＣＲ増幅。１つのミスマッチをプライマーに挿入して、陽性対照としてＴａｑＩ部位を完成した。多型ＴａｑＩ部位はネイティブである。
プライマー：ゲノム配列に基づいて、ＡＢＩ ＤＮＡ合成機において下記プライマーを作製した（Ｃｌａｒｋ等，１９８６；ＧＥＮＢＡＮＫ Ｘ０４５００）。
ＰＣＲ条件：
［９５℃（２分間）］１サイクル；
［９５℃（１分間）、６７．５℃（１分間）、７４℃（１分間）］３８サイクル；
［７２℃（８分間）］１サイクル。
制限酵素消化：消化は６０℃において８時間おこなった。サイジイングは８％ＰＡＧＥによっておこなった。
消化から予測された結果：
対立遺伝子１（Ｃ） 対立遺伝子１のＰＣＲ生成物のＴａｑＩ消化は１２、８５及び９７ｂｐフラグメントを生じる。
対立遺伝子２（Ｔ） 対立遺伝子２のＰＣＲ生成物のＴａｑＩ消化は１２と１８２ｂｐフラグメントを生じる。
結果
成人、喫煙者及び非喫煙者を歯周疾患重症度に関して本明細書で上述したような共通臨床基準を用いてスクリーニングした。データは表１に示す。
表に用いる略号：ＰＤ（ポケット深さ）、ＢＯＰ（プローブ診査時の出血）、ＣＡＬ（臨床アタッチメント損失）、＃＞４９％（骨欠損が４９％より大きい部位の数）、％ｂｌ（％骨損失）、Ｓ．Ｄ．（標準偏差）；Ｈ＝健康、Ｍ＝軽度／中等度、Ｓ＝重度、
★少なくとも９５％信頼レベルにおける有意性を意味する。
表２には、臨床データを示し、喫煙者と非喫煙者を比較する。喫煙者と非喫煙者との間には総合臨床疾患状態において有意差が存在することに注目のこと。
略号は表１と同様。
表３はＩＬ−１Ａ対立遺伝子１と２に関する臨床所見を要約し、比較する。各遺伝子の対立遺伝子の遺伝子型は組合せた数字によって表示する、即ち、１／１は対立遺伝子１のホモ接合性を意味し、１／２は対立遺伝子１と２のヘテロ接合性を示す、等。遺伝子型が対立遺伝子２として表される場合には、これはこの対立遺伝子の少なくとも１つのコピーが存在することを意味する。非喫煙者に関して分析をおこなう。表２のデータが示すように、グループとしての喫煙者は遺伝的素質の分析に包含されないほど、重度な疾患を有した。表３のデータは特に％骨損失、ＣＡＬ及びＰＤに関し、ＩＬ−１Ａ対立遺伝子２のキャリヤーには、重度臨床疾患の有意な関連性が存在することを実証する。分析した集団は非喫煙者の全ての疾患グループを包含した。
略号は表１と同様。
表４では、同じ分析をＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）対立遺伝子１と２に関しておこなう。
略号は表１と同様。
表５では、遺伝子型ＩＬ−１Ａ対立遺伝子２プラスＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）対立遺伝子２を有する患者（＋）と有さない患者（−）とに対する同じ分析を示す。さらに詳しくは、−遺伝子型はＩＬ−１Ａ（１／１）プラスＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）（１／１若しくは１／２若しくは２／２）又はＩＬ−１Ａ（１／２若しくは２／２）プラスＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）（１／１）である。＋遺伝子型はＩＬ−１Ａ（１／２若しくは２／２）プラスＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）（１／２若しくは２／２）である。
略号は表１と同様。
患者の疾患重症度によるＩＬ−１ＡとＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）の対立遺伝子分布を判定して、表６に示す。
＊分布は各カテゴリーにおける患者数とその疾患カテゴリーの患者の％の両方で記載する。
表７では、ＩＬ−１ＡとＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）に関する非喫煙者の結果を示す。重度疾患を有する患者のうちで、６４．７％はＩＬ−１Ａ１／２若しくは２／２とＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）１／２若しくは２／２の遺伝子型を有し、ヘテロ接合性又はホモ接合性のいずれであっても対立遺伝子２の存在が重度疾患の罹患性をもたらすことを実証した。
ＩＬ−１Ａ対立遺伝子２とＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）対立遺伝子２における対立遺伝子多型パターン（遺伝子型）と、疾患の発現及び／又はその重症度との間の関連に関して、Ｏｄｄ Ｒａｔｉｏ（大体の相対的危険性）を導出した。Ｏｄｄ Ｒａｔｉｏは表８に示すような偶然表を用いて算出する。下記式：（ＡｘＤ）／（ＣｘＢ）を用いて、Ｏｄｄ Ｒａｔｉｏを算出する（Ｗｏｏｌｆ，１９５５）。
表９に示すように、喫煙者である又は遺伝子型ＩＬ−１Ａ対立遺伝子２プラスＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）対立遺伝子２（＋遺伝子型）を有する患者は、この遺伝子型を有さない患者よりも重度疾患に罹り易く；かれらは１０．０６：１のＯｄｄ Ｒａｔｉｏを有する。非喫煙者のみのうちでは（表１０）、遺伝子型ＩＬ−１Ａ対立遺伝子２プラスＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）対立遺伝子２（＋遺伝子型）を有する患者のＯｄｄ Ｒａｔｉｏは４．３：１である。
喫煙者又はターゲット遺伝子型ＩＬ−１Ａ対立遺伝子２プラスＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）対立遺伝子２（＋遺伝子型）に関する臨床データを表１１に示す。
非喫煙者（ｎ＝１００）のＩＬ−１ＡとＩＬ−１Ｂ（ＡｖａＩ）の対立遺伝子分布を判定して、表１２に示す。重度疾患を有する患者のうち、３６．８％はＩＬ−１Ａ１／２若しくは２／２とＩＬ−１Ｂ（ＡｖａＩ）１／２若しくは２／２の遺伝子型を有した。
略号は表１と同様。
非喫煙者のみのなかでは、遺伝子型ＩＬ−１Ａ対立遺伝子２プラスＩＬ−１Ｂ（ＡｖａＩ）対立遺伝子２を有する患者のＯｄｄ Ｒａｔｉｏは０．８５である（表１３）。この遺伝子組合せは歯周疾患重症度との関連がないことを示す。
示したデータは、重度疾患を有する被検者のうちで、８６．０％が現在喫煙者であるか又はターゲット遺伝子型ＩＬ−１Ａ対立遺伝子２プラスＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）対立遺伝子２を有することを実証する。現在喫煙者ではなく、ターゲット遺伝子型も有さない被検者のうちでは、９０．５％が重度疾患を有さなかった。現在喫煙者であるか又はターゲット遺伝子型を有する被検者のうちでは、５２．１％が、他の危険性因子に関係なく、重度疾患を有した。
それ故、本発明は、早期治療を可能にするために、重度歯周疾患の危険状態にある患者を同定する方法を提供する。
この出願を通して、種々な刊行物と特許とを参考にする。本明細書で上記に含まれない参考にした刊行物と特許は以下に列挙する。これらの刊行物の開示はそれらの全体において、本発明が属する技術分野の先行技術をより詳しく説明するために、本明細書に援用される。
本発明を例示的に説明したが、用いた用語が限定の表現の本質ではなく説明の表現の本質であるように意図されることを理解すべきである。
上記教示を考慮するならば、明らかに、本発明の多くの改変及び変更が可能である。それ故、添付請求の範囲内で、本発明が特に述べた以外の方法で実施されうることを理解すべきである。
参考文献
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Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第８版，Ｓｔｉｔｅｓ，Ｔｅｒｒ及びＰａｒｓｌｏｗ，９章，１０５〜１２３頁。
Ｖｅｒｊａｎｓ等，「疾患に関連した腫瘍壊死因子領域の多型：概観」，Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．１８：１７７〜１８６頁（１９９２）。
Ｗｉｌｓｏｎ等，「ＰＣＲ生成物のＮｃｏＩ制限によって検出可能なヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）における単一塩基変異」，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １，５号：３５３（１９９２）。
Ｗｏｏｌｆ，Ｂ．，「血液型群と疾患との関係の推定」，Ａｎａｌｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９：２５１〜２５３（１９５５）。
配列表
（２）配列番号：１の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列番号：１
（２）配列番号：２の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列番号：２
（２）配列番号：３の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列番号：３
（２）配列番号：４の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列番号：４
（２）配列番号：５の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列番号：５
（２）配列番号：６の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列番号：６
技術分野
本発明は重度な歯周疾患（periodontal disease）の素質を検出する方法に関する。
背景技術
歯周疾患は歯を支える硬質及び軟質組織の疾患であり、口内細菌によって開始される。歯肉炎は、歯肉が赤色になり、膨潤し、出血し易くなる歯周疾患の初期段階である。歯肉炎は通常無痛であり、治療されない場合には、組織破壊の大きさによって軽度、中等度又は重度と分類されることができる歯周炎にまで進行する可能性がある。歯周炎は主として成人の疾患であり、通常は３５歳過ぎまで検出不能である。
歯垢中に存在する細菌は歯周疾患を開始する。歯垢中の細菌によって産生される毒素は身体の炎症性機構及びその他の免疫機構を活性化して、結局は歯を支える骨及び歯肉組織の破壊をもたらす。この疾患が進行すると、歯肉は歯から離れて、ペリオドンタル・ポケットが形成され、これは細菌に保護環境を与え、それによってこの周期(cycle)を連続させる。しかし、幾つかの部位は活性であり続けない。米国特許第５，３２８，８２９号は、部位におけるインターロイキンＩＬ−１βを測定することによる口腔内の活性な歯周疾患部位の判定方法を開示する。喫煙は歯周炎の頻度と重症度との増強に関連づけられている。しかし、歯周炎を有するかなりの数の個人が喫煙していない。
この１５年間に、小さい子供とティーンエージャーを冒す特定の形の歯周炎が遺伝的に決定されることが立証されている。人口において極めて低い頻度であるこれらの疾患は、思春期の年齢前の一部の個人と思春期から１８歳までの他の個人とにおいて重度な歯周炎を生じる。このようなケースにおいて同定される遺伝的因子は、個人を多重な健康問題に非常に罹り易くすると思われる非常に明白な生物学的機構に関与している。現在までに、成人型の歯周炎に同じ遺伝的因子を見いだす試みは成功していない。
上記失敗にも拘わらず、成人型の歯周炎の疾患の臨床的発現に遺伝学が重要な役割を果たすことを実証した同じ双子の研究から、新しい証拠が１９９０年の始めに出現した（Ｍｉｃｈａｌｏｗｉｃｚ等，１９９１）。この双子研究は遺伝的要素が存在することを実証したが、これは同定されなかった。重度な成人型歯周炎に罹り易い患者を決定することは有用であると考えられる。
１〜２種類の遺伝子に関連した又は１〜２種類の遺伝子によって惹起される疾患に関する遺伝的試験が現在可能であり（米国特許第４，５８２，７８８号と第５，１１０，９２０号を参照のこと）、これらの遺伝子がひと度同定されたならば、疾患に対する特定の遺伝子を有するヒトの危険性を知ることが現在可能である（例えば、米国特許第４，８０１，５３１号、第４，６６６，８２８号及び第５，２６８，２６７号を参照のこと）。
任意の感染に関して、ひと度感染が開始したならば、身体の炎症性及びその他の免疫機構が役割を開始する（総説としては、米国特許第５，３２８，８２９号，第１欄を参照のこと）。一般に、炎症性マーカーに関する研究は歯周炎疾患の重症度を識別することにごく限られた成功を有しているにすぎず、歯周疾患の炎症性反応の遺伝的面(genetic aspect)に関しては限定された、不成功に終わった努力がなされていた。炎症性要素を有する選択された疾患における炎症性及びその他の免疫反応を抑制する、多重の遺伝子座の遺伝的変化は、疾患の罹患性又は重症度を決定する上での因子であった。それ故、炎症性及びその他の免疫機構に関連する遺伝的因子が歯周疾患の重症度に相関するかどうかを決定することが、本発明の目的であった。もしそうであるならば、これらの遺伝的因子を同定することによって、重度な形の成人型歯周疾患に罹り易い患者を同定することが有用であると考えられる。
発明の概要
本発明によると、歯周疾患の重症度の増強を予測する方法を開示する。この方法は患者からＤＮＡを単離する工程と、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βをコードする遺伝子のＤＮＡ多型パターンを決定する工程とを包含する。同定されたパターンを既知の疾患重症度の対照と比較することによって、歯周疾患重症度の増強に関連した遺伝的多型パターンを発現する患者を同定する。次に、重度な疾患の発生を予防するために、このように同定された患者を歯周疾患の早期段階においてさらに侵襲的に治療することができる。
本発明はさらに、歯周疾患重症度の増強に関連した患者の遺伝的多型パターンを同定するためのキットを開示する。このキットはＤＮＡサンプル採取手段と、遺伝的多型パターンを決定して、次にこれを対照サンプルと比較して、重度な歯周疾患への患者の罹患性を判定するための手段とを包含する。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明によると、明白な疾患を有する患者も、有さない患者も、インターロイキンＩＬ−１α及びＩＬ−１βの遺伝子配列におけるＤＮＡ多型の存在を検出することによって、重度な歯周疾患の遺伝的素質を有すると同定される。重度な歯周疾患は以下の本明細書の実施例において述べるように定義される。簡単に述べると、重度な疾患は、≧７ｍｍのサイズである≧１０個の隣接面間部位の病歴(histry)を有し、少なくとも８本の歯に≧７ｍｍのポケット深さ（ＰＤ）が生じている患者の状態として定義される。さらに、≧１１個の部位に≧５ｍｍのサイズである臨床的アッタチメント(clinical attachment)（ＣＡＬ）が見られる。この定義はさらに、最近３年間以内に撮影された完全口腔ラジオグラフがラジオグラフ上で≧５０％骨損失を有する≧７個の隣接面間部位を示し、総口腔平均骨損失が３０％より大きいことを必要とする。
重度な疾患に関連した対立遺伝子は、ＩＬ−１Ａ対立遺伝子２およびＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）対立遺伝子２として同定された。重度な歯周炎のＯｄｄ Ｒａｔｉｏ（ＯＲ）が非喫煙者では少なくとも１コピーのＩＬ−１Ａ対立遺伝子２とＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）対立遺伝子２を有する患者に関して４．３であることが判明した。喫煙者と非喫煙者との集団では、喫煙者又は少なくとも１コピーのＩＬ−１Ａ対立遺伝子２とＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）対立遺伝子２を有する患者のＯＲは重度な疾患を有するに関して１０．０６である。
さらに、本発明によると、歯周疾患重症度の増強に関連した患者の遺伝的多型パターンを同定するためのキットも開示する。このキットは、ＤＮＡサンプル採取手段と、ＩＬ−１ＡとＩＬ−１Ｂとの遺伝的多型パターンを決定して、次にこれを対照サンプルと比較して、重度な歯周疾患への患者の罹患性を判定するための手段とを包含する。
ＤＮＡサンプルは血液又は組織サンプルから得る。好ましい実施態様では、患者の指の刺し傷から、吸収性ペーパー上に血液を採取して得た血液細胞からＤＮＡを得る。さらに好ましい実施態様では、血液をＡｍｐｌｉＣａｒｄTM（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ大学，医学薬学部，Ｒｏｙａｌ Ｈａｌｌａｍｓｈｉｒｅ病院，Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ Ｓ１０ ２ＪＦ）上に採取する。次に、ＤＮＡを乾燥血液スポットから単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてターゲット配列を増幅する。問題の遺伝子内の特定の多型ＤＮＡ領域をターゲットするオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを調製して、ターゲット配列のＰＣＲ反応増幅が達成されるようにする。この実施態様は極少量の血液を必要にするに過ぎないという利点を有し、静脈注射又は組織バイオプシーの必要性を回避する。しかし、当該技術分野で公知であるような、ＤＮＡを採取して、多型パターンを決定するための他の手段も使用可能である。
鋳型ＤＮＡからの増幅ＤＮＡ配列を次に制限酵素を用いて分析して、増幅配列中に存在する遺伝的多型を決定することによって、患者の遺伝的多型プロフィルを得る。
幾つかの疾患は顕著な炎症性及びその他の免疫要素を有する。炎症性及びその他の免疫反応の主要な要素の１つはサイトカイン産生である。サイトカインは、胸腺誘導Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、Ｂリンパ球及び単球／マクロファージを包含する活性化免疫細胞によって産生されるペプチド／タンパク質モデュレーターである。サイトカインはインターロイキン（ＩＬ−１からＩＬ−１５まで）、顆粒球及び／又はマクロファージのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）（ＣＳＦ−Ｇ、ＣＳＦ−Ｍ、ＣＳＦ−ＧＭ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦαとβ）、及びインターフェロン（ＩＦＮα、β及びγ）を包含する。ＩＬ−１の基本的活性はＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）の複合活性を包含する［総説として、Ｄｕｆｆ，１９９３；及びＢａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第８版，１９９４，Ｓｔｉｔｅｓ，Ｔｅｒｒ及びＰａｒｓｌｏｗ編集，９章，１０５〜１２３頁を参照のこと）。米国特許第５，３２８，８２９号は歯周疾患の活性部位においてＩＬ−１βを発見したが、疾患状態との相互関係を報告しなかった。単一サイトカイン多型と疾患状態との関連は、例えば、Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ、Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ Ｃｏｌｉｔｉｓ ａｎｄ Ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ等，１９９４；Ｖｅｒｊａｎｓ等、１９９２；Ｂｌａｋｅｍｏｒｅ等、１９９４；ＭｃＧｕｉｒｅ等、１９９４；ＭｃＤｏｗｅｌｌ等，１９９５）におけるように発見されている。
サイトカインＩＬ−１αとＩＬ−１βをコードするＤＮＡ配列における特定の多型が重度歯周疾患に関係することが判明した。この多型は次の通りである：
ＩＬ−１Ａ：（２ｑ１２−１４における染色体２）
−８８９における単一塩基変異（Ｃ／Ｔ）の二対立遺伝子多型(bi-alleic polymorphism)の対立遺伝子は、制限酵素を用いた対立遺伝子−特異性切断によって同定される。この遺伝子はＩＬ−１Ａと名付けられ、生成物（サイトカイン）はＩＬ−１αと呼ばれる。塩基−８８９において対立遺伝子１はＣであり、対立遺伝子２はＴである。修飾プライマー配列によるＰＣＲ反応における突然変異によって部分的部位を導入することによって、完全制限酵素認識部位が形成される。この部位は多型の対立遺伝子の一方の配列によって完成する。ＰＣＲ反応の生成物の制限酵素消化後に、ＤＮＡを電気泳動的にサイズによって分離する。
このゲル（又は放射性内部ＤＮＡ配列によってプローブされたそのサザンブロット）から、多型の対立遺伝子が同定される。非切断フラグメント（より大きい）は北ヨーロッパ人口において稀な対立遺伝子である。
１Ｌ−１Ｂ：（染色体２；２ｑ１２−１４）
２つの二対立遺伝子多型は、対立遺伝子中の天然生成部位における対立遺伝子−特異性切断を用いて２種類の異なるＰＣＲ生成物に類別することができる。対立遺伝子同定は、アガロースゲルにおける制限酵素消化と分離後にフラグメントのサイズによっておこなわれる。この遺伝子はＩＬ−１Ｂと名付けられ、生成物（サイトカイン）はＩＬ−１βと呼ばれる。部位は−５１１（ＩＬ−１Ｂ（ＡｖａＩ）と呼ばれる）と＋３９５３（ＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）と呼ばれる）とにおける単一塩基変異（Ｃ／Ｔ）であり、制限酵素を用いた対立遺伝子−特異性切断によって同定される。各多型に関して、対立遺伝子１はＣであり、対立遺伝子２はＴである。
次に、患者のサイトカイン多型プロフィル、即ち、対立遺伝子分布を対照と比較する。対照は、歯周的に健康である患者と、成人型非重度歯周炎患者及び成人型重度歯周炎患者とからである。即ち、患者のプロフィルを健康な人々及び重症度の異なる歯周疾患の患者と、共通臨床基準(consensus clinical criteria)に従って比較して、適合(match)が歯周疾患の素質を決定する。１実施態様では、亜集団(subpopulation)内の遺伝的変異に対応するために民族的に適合する対照を用意する。
これらの特定遺伝子座における対立遺伝子多型パターン（遺伝子型）と疾患の発現及び／又はその重症度との間の関連を試験するために、Ｏｄｄ Ｒａｔｉｏ（大体の相対的危険性）が導出される。これは、歯周疾患の臨床的治療に用いられる予測情報を提供する。
上記考察は、歯周疾患重症度の増強に関連した患者の遺伝的多型パターンを同定するためのキットの事実に基づく根拠を与える。重度の疾患の危険を有する人の同定は、疾患が発現する前に予防手段を開始することを可能にする。さらに、２つの危険因子（喫煙と罹り易い遺伝子型）を有するような患者を、かれらの重度疾患危険性が極めて高いので、特別にモニターすることができる。本発明によって用いられる方法と、本発明の有用性は下記実施例によって示すことができる。
実施例
多型決定と疾患の関連
一般的方法
ＤＮＡ方法を包含する反応と操作は、他に指示しないかぎり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（本明細書に援用される）に記載されている通りにおこなう。米国特許第４，６６６，８２８号、第４，８０１，５３１号及び第５，２７２，０５７号と、ＭｃＤｏｗｅｌｌ等，１９９５とに記載される方法も、他に指示しない限り、用いる。
ＰＣＲに用いる酵素はＧＩＢＣＯ ＢＲＬからであり、サーモサイクラー(thermocycler)はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ又はＢｉｏｍｅｔｒａのいずれかであった。制限酵素ＮｃｏＩとＴａｑＩはＰｒｏｍｅｇａ（ＵＳ）からであった。制限酵素ＡｖａＩとＢｓｕ３６ＩはＮＥＢ（ＵＳ）からであった。
患者の選択と疾患の分類
成人における歯周疾患に関連した遺伝的多型をＭｃＤｏｗｅｌｌ等（１９９５）のプロトコールを用いて決定した。喫煙の遮蔽効果(masking effect)のために、重度疾患に関連した遺伝的因子は非喫煙者において検出した。他の点では健康な成人のグループを歯科クリニックにおいて歯周疾患の存在に関してスクリーニングした。この研究は主として北ヨーロッパ系の個人を包含した。各患者を疾患の不存在又は、疾患が存在する場合には、４パラメータの各々におけるその程度に関してスクリーニングした。問題の４変数は臨床的アタッチメント損失（ＣＡＬ）、ポケット深さ、歯肉炎及び隣接面間骨損失である。血液サンプルを採取し、ＤＮＡを単離し、ＩＬ−１Ａ及びＩＬ−１Ｂ遺伝子座における遺伝的多型を決定した。さらに、糖尿病、心血管系疾患又は早期歯欠損(early tooth loss)の家族歴並びに喫煙者であるか否かに関する特定の質問を包含した、各患者のデンタルヒストリー(dental histry)を入手した。
歯周疾患の状態を判定するために、各患者はポケット深さ（ＰＤ）、陥没(recession)（Ｒ）、歯垢（Ｐｌ）及びプローブ診査(probing)時の出血（ＢＯＰ）の完全口腔測定を包含する検査を受けた。臨床的アタッチメント損失（ＣＡＬ）はポケット深さと陥没から算出する。ラジオグラフが骨損失を評価する。これらの測定に基づいて、患者を健康、軽度〜中等度歯周炎又は重度歯周炎として分類した。
臨床的変数の全ては、各歯（第３臼歯を除く）の６表面（遠心頬側、頬側、近心頬側、近心舌側、舌側及び遠心舌側）上の１６８部位までに関して算出した。全てのラジオグラフ変数は各歯の２表面上の５６部位までに関して算出した。
疾患の重症度分類は次の通りである：
歯周的健康：患者は、全てのポケット深さ≦４ｍｍ、限定されないフェイシアル(facial)ＣＡＬ、≦２ｍｍの隣接面間ＣＡＬ及び＜１５％ラジオグラフ骨欠損を提示した。限定されない歯垢及び歯肉炎症と陥没も存在することができる。
軽度〜中等度歯周炎：３５歳までに疾患発現の病歴なし。患者は、第３臼歯、矯正治療のために抜いた歯及び口腔外の外傷の結果として欠損した歯以外には、僅か２個以下の喪失歯を提示した。患者はまた、５〜９隣接面間部位においてＰＤ≧６ｍｍをも提示した。条件を満たす(qualifying)隣接面間部位の少なくとも２つは、異なる四分円(quadrant)に存在しなければならない。歯肉炎症（プローブ診査時の出血によって例示）が少なくとも２つの四分円に存在した。完全な口腔ラジオグラフは≧５０％骨欠損を有する４箇所未満の隣接面間部位を示さなければならない。ラジオグラフによる総口腔平均骨欠損が２５％未満でなければならない。この分類には、ＣＡＬの規定は存在しない。
重度な歯周炎：≧７ｍｍのサイズである≧１０隣接面間部位と、少なくとも８本の歯に生じた≧７ｍｍのＰＤを提示した患者。ＣＡＬは≧１１部位において≧５ｍｍのサイズであった。最近３年間内に撮影された完全口腔ラジオグラフは、ラジオグラフ上で≧５０％骨欠損を有する≧７隣接面間部位と、３０％より大きい総口腔平均骨欠損を示した。
統計分析
ｘ2分析を用いた。Ｏｄｄ Ｒａｔｉｏ（相対的危険性）はＷｏｏｌｆ，１９５５が記載しているような２ｘ２偶然表から算出した。
選択した対立遺伝子に関する、ＰＣＲ増幅と制限酵素消化プロトコール
ＩＬ−１Ａ
ＩＬ−１Ａ塩基−８８９における単一塩基変異（Ｃ／Ｔ）多型は次のように同定した：
スクリーニング：ゲノム鋳型のＰＣＲ増幅。Ｃが−８９９において利用可能である場合には、１つのミスマッチをプライマーに挿入して、ＮｃｏＩ部位を完成した。
プライマー：ゲノム配列に基づいて、ＡＢＩ ＤＮＡ合成機において下記プライマーを作製した（Ｆｕｒｕｔａｎｉ等，１９８６；ＧＥＮＢＡＮＫ Ｘ０３８３３）。
［９６℃（１分間）］１サイクル；
［９４℃（１分間）、４６℃（１分間）、７２℃（１分間）］４０サイクル；
［７２℃（４分間）］１サイクル。
制限酵素消化：消化は３７℃においてＮｃｏＩによって８時間おこなった。サイジイング(sizing)は８％ＰＡＧＥ又は２％アガロースゲルによっておこなった。
消化から予測された結果：
対立遺伝子１（Ｃ） 対立遺伝子１のＰＣＲ生成物のＮｃｏＩ消化は８３塩基対（ｂｐ）と１６塩基対フラグメントを生じる。
対立遺伝子２（Ｔ） 対立遺伝子２のＰＣＲ生成物のＮｃｏＩ消化は無効であり、９９塩基対（ｂｐ）生成物を生じる。
ＩＬ−１Ｂ（ＡｖａＩ）
ＩＬ−１Ｂ塩基−５１１における単一塩基変異（Ｃ／Ｔ）多型は次のように同定した：
スクリーニング：ゲノム鋳型のＰＣＲ増幅。この単一塩基変異は対立遺伝子１（Ｃ）におけるＡｖａＩ部位、対立遺伝子２（Ｔ）におけるＢｓｕ３６Ｉ部位を完成する。
プライマー：ゲノム配列に基づいて、ＡＢＩ ＤＮＡ合成機において下記プライマーを作製した（Ｃｌａｒｋ等，１９８６；ＧＥＮＢＡＮＫ Ｘ０４５００）。
［９５℃（２分間）］１サイクル；
［９５℃（１分間）、５３℃（１分間）、７４℃（１分間）］３５サイクル；
［７４℃（４分間）］１サイクル。
制限酵素消化：消化は３７℃において８時間おこなった。サイジイングは８％ＰＡＧＥによっておこなった。
消化から予測された結果：
対立遺伝子１（Ｃ） 対立遺伝子１のＰＣＲ生成物のＡｖａＩ消化は１９０ｂｐと１１４ｂｐフラグメントを生じる。対立遺伝子１のＰＣＲ生成物のＢｓｕ３６Ｉ消化は無効であり、３０４ｂｐ生成物を生じる。
対立遺伝子２（Ｔ） 対立遺伝子２のＰＣＲ生成物のＡｖａＩ消化は無効であり、３０４ｂｐ生成物を生じる。対立遺伝子２のＰＣＲ生成物のＢｓｕ３６Ｉ消化は１９０ｂｐと１１４ｂｐフラグメントを生じる。
ＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）
ＩＬ−１Ｂ塩基＋３９５３における単一塩基変異（Ｃ／Ｔ）多型は次のように同定した：
スクリーニング：ゲノム鋳型のＰＣＲ増幅。１つのミスマッチをプライマーに挿入して、陽性対照としてＴａｑＩ部位を完成した。多型ＴａｑＩ部位はネイティブである。
プライマー：ゲノム配列に基づいて、ＡＢＩ ＤＮＡ合成機において下記プライマーを作製した（Ｃｌａｒｋ等，１９８６；ＧＥＮＢＡＮＫ Ｘ０４５００）。
［９５℃（２分間）］１サイクル；
［９５℃（１分間）、６７．５℃（１分間）、７４℃（１分間）］３８サイクル；
［７２℃（８分間）］１サイクル。
制限酵素消化：消化は６０℃において８時間おこなった。サイジイングは８％ＰＡＧＥによっておこなった。
消化から予測された結果：
対立遺伝子１（Ｃ） 対立遺伝子１のＰＣＲ生成物のＴａｑＩ消化は１２、８５及び９７ｂｐフラグメントを生じる。
対立遺伝子２（Ｔ） 対立遺伝子２のＰＣＲ生成物のＴａｑＩ消化は１２と１８２ｂｐフラグメントを生じる。
結果
成人、喫煙者及び非喫煙者を歯周疾患重症度に関して本明細書で上述したような共通臨床基準を用いてスクリーニングした。データは表１に示す。
★少なくとも９５％信頼レベルにおける有意性を意味する。
表２には、臨床データを示し、喫煙者と非喫煙者を比較する。喫煙者と非喫煙者との間には総合臨床疾患状態において有意差が存在することに注目のこと。
表３はＩＬ−１Ａ対立遺伝子１と２に関する臨床所見を要約し、比較する。各遺伝子の対立遺伝子の遺伝子型は組合せた数字によって表示する、即ち、１／１は対立遺伝子１のホモ接合性を意味し、１／２は対立遺伝子１と２のヘテロ接合性を示す、等。遺伝子型が対立遺伝子２として表される場合には、これはこの対立遺伝子の少なくとも１つのコピーが存在することを意味する。非喫煙者に関して分析をおこなう。表２のデータが示すように、グループとしての喫煙者は遺伝的素質の分析に包含されないほど、重度な疾患を有した。表３のデータは特に％骨損失、ＣＡＬ及びＰＤに関し、ＩＬ−１Ａ対立遺伝子２のキャリヤーには、重度臨床疾患の有意な関連性が存在することを実証する。分析した集団は非喫煙者の全ての疾患グループを包含した。
表４では、同じ分析をＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）対立遺伝子１と２に関しておこなう。
表５では、遺伝子型ＩＬ−１Ａ対立遺伝子２プラスＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）対立遺伝子２を有する患者（＋）と有さない患者（−）とに対する同じ分析を示す。さらに詳しくは、−遺伝子型はＩＬ−１Ａ（１／１）プラスＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）（１／１若しくは１／２若しくは２／２）又はＩＬ−１Ａ（１／２若しくは２／２）プラスＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）（１／１）である。＋遺伝子型はＩＬ−１Ａ（１／２若しくは２／２）プラスＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）（１／２若しくは２／２）である。
患者の疾患重症度によるＩＬ−１ＡとＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）の対立遺伝子分布を判定して、表６に示す。
表７では、ＩＬ−１ＡとＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）に関する非喫煙者の結果を示す。重度疾患を有する患者のうちで、６４．７％はＩＬ−１Ａ１／２若しくは２／２とＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）１／２若しくは２／２の遺伝子型を有し、ヘテロ接合性又はホモ接合性のいずれであっても対立遺伝子２の存在が重度疾患の罹患性をもたらすことを実証した。
非喫煙者（ｎ＝１００）のＩＬ−１ＡとＩＬ−１Ｂ（ＡｖａＩ）の対立遺伝子分布を判定して、表１２に示す。重度疾患を有する患者のうち、３６．８％はＩＬ−１Ａ１／２若しくは２／２とＩＬ−１Ｂ（ＡｖａＩ）１／２若しくは２／２の遺伝子型を有した。
それ故、本発明は、早期治療を可能にするために、重度歯周疾患の危険状態にある患者を同定する方法を提供する。
この出願を通して、種々な刊行物と特許とを参考にする。本明細書で上記に含まれない参考にした刊行物と特許は以下に列挙する。これらの刊行物の開示はそれらの全体において、本発明が属する技術分野の先行技術をより詳しく説明するために、本明細書に援用される。
本発明を例示的に説明したが、用いた用語が限定の表現の本質ではなく説明の表現の本質であるように意図されることを理解すべきである。
上記教示を考慮するならば、明らかに、本発明の多くの改変及び変更が可能である。それ故、添付請求の範囲内で、本発明が特に述べた以外の方法で実施されうることを理解すべきである。
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配列表
（２）配列番号：１の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列番号：１
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列番号：２
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列番号：３
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列番号：４
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列番号：５
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列番号：６
Claims (6)
- 増加した歯周疾患重症度に対する患者の感受性を予測する方法であって、
（ａ）患者から単離されたゲノムＤＮＡ中のＩＬ−１Ａ及びＩＬ−１Ｂの遺伝的多型パターンを決定し；そして
（ｂ）遺伝的多型パターンを対照サンプルと比較する、ここにおいて、前記対照サンプルは、−８８９番目の塩基がＴであるＩＬ−１Ａ遺伝子及び＋３９５３番目の塩基がＴであるＩＬ−１Ｂ遺伝子を含み、そして、患者から単離されたゲノムＤＮＡが、対照サンプルと同一の遺伝子多型パターンを有することが、増加した歯周疾患重症度に対する患者の感受性を示唆する
工程を含む方法。 - 対照サンプルが既知疾患重症度の人種的に適合した対照サンプルである、請求項１記載の方法。
- ＩＬ−１Ａ及びＩＬ−１Ｂの遺伝的多型パターンを決定する前記工程が、ＰＣＲプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用したターゲットＤＮＡ配列の増幅を包含し、ここにおいて、ＰＣＲプライマーは、
からなるグループから選択される、請求項１記載の方法。 - ＤＮＡ中でＩＬ−１Ａ及びＩＬ−１Ｂの遺伝的多型パターンを同定する前記工程が、ＮｃｏＩ、ＴａｑＩ、ＡｖａＩ及びＢｓｕ３６Ｉからなるグループから選択される、少なくとも１の制限酵素による制限酵素消化を包含する、請求項１記載の方法。
- 増加した疾患重症度に関連することが知られた対立遺伝子が、−８８９番目の塩基がＴであるＩＬ−１Ａ遺伝子及び＋３９５３番目の塩基がＴであるＩＬ−１Ｂ遺伝子を含む、請求項１記載の方法。
- 重症歯周疾患に対する患者の感受性を予測するためのキットであって、
（ａ）ＤＮＡサンプル回収手段；
（ｂ）ＩＬ−１Ａ及びＩＬ−１Ｂの遺伝的多型パターンを決定するための手段、ここにおいて、前記手段はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーのセットを含み、当該プライマーは、
からなる；並びに
（ｃ）−８８９番目の塩基がＴであるＩＬ−１Ａ遺伝子及び＋３９５３番目の塩基がＴであるＩＬ−１Ｂ遺伝子を含む、対照サンプル
を含む、前記キット。
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