TW202342762A

TW202342762A - 桿狀病毒表現系統

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Publication number: TW202342762A
Application number: TW112103132A
Authority: TW
Inventors: 克利斯多福該隱萊姆尼古言; 傑佛瑞莫利史萊克; 恩伍亞曼達烏杜瑪艾伯; 彼得史萊德; 萊恩喬瑟夫尼斯特勒
Original assignee: 美商航海家醫療公司
Priority date: 2022-01-25
Filing date: 2023-01-30
Publication date: 2023-11-01
Also published as: WO2023147374A2

Abstract

本發明提供變異型病毒基因體，例如變異型桿狀病毒基因體，及變異型基因體之表現構築體，以及以上各者之製備方法。該等變異型病毒基因體，例如變異型桿狀病毒基因體，可用於例如產生重組腺相關病毒(AAV)粒子。

Description

桿狀病毒表現系統

本發明描述病毒表現構築體(例如，桿狀病毒表現構築體)，其包括變異型病毒基因體(例如，變異型桿狀病毒基因體)，以及用於製備變異型病毒基因體之方法。病毒表現構築體可用於例如產生大量所關注的多肽或核酸。病毒表現構築體(例如，桿狀病毒表現構築體)亦可用作腺相關病毒(AAV)產生系統之組分。

桿狀病毒表現載體系統(BEVS)廣泛用於在經培養之昆蟲細胞中產生大量重組蛋白質。藉由在處於經過表現之polh或p10啟動子控制下的重組BEV中表現所關注的基因(GOI)來實現此大量產生。polh及p10啟動子可分別占經感染之昆蟲細胞中的總mRNA轉錄物之24%及7.5% (Chen等人, J Virol2013;87:6391-405)。最通常藉由昆蟲細胞中之同源重組(例如，FlashBac ^®)或藉由細菌中之Tn7輔助及/或經口感染因子轉位(例如，Bac-to-Bac ^®)來將外源GOI插入重組BEV中之單獨位置中。後一種BEV類型需要桿狀病毒基因體中包含細菌人工染色體。已成功地使用BEVS產生治療劑，諸如疫苗，例如Cervarix ^TM(針對子宮頸癌之HPV疫苗)、FluBlok® (流感次單位疫苗)及Covovax ^TM(SARS-CoV-2疫苗)。習知BEVS保持桿狀病毒基因體呈基本上完整的野生型形式。已嘗試藉由刪除某些基因，諸如病毒組織蛋白酶(v-cath)及殼質酶(chiA)來改良重組蛋白質之產量(例如，Gilbert等人, PloS One2018;13:e0207414)。此等基因係與毛蟲中之桿狀病毒病理學有關之輔助基因且並非經培養之昆蟲細胞中的外源蛋白質之BEV產生所需的。輔助基因之其他實例包括egt及ctx，其在桿狀病毒感染期間調節毛蟲之生理學。另一組桿狀病毒基因係經口感染因子基因，其與環境中的毛蟲之間的桿狀病毒之經口傳播有關。經口感染因子基因包括p74、p10、polh及PIF。對於產生重組蛋白質培養之昆蟲細胞，需要將經口感染因子及輔助基因不活化或刪除以改良BEV之安全性及效率。鑒於桿狀病毒基因體之大型尺寸(例如對於AcMNPV，約130 kb)以及輔助及經口感染因子基因之分散位置，難以藉由習知重組DNA技術來實現最佳化BEV效率及安全性所需的對基因體之許多操作。因此，仍需要經改良之桿狀病毒表現系統及方法，其可實現大型桿狀病毒基因體之有效、靶向性及多基因座修飾。

本文中提供包含變異型病毒基因體(例如，變異型桿狀病毒基因體)之病毒表現構築體(例如，桿狀病毒表現構築體)，以及其有效製備方法。此類病毒表現構築體(例如，桿狀病毒表現構築體)可用於例如產生大量所關注的多肽或核酸，以及用於在AAV產生系統中產生重組腺相關病毒(AAV)粒子。本文中所描述之病毒表現構築體(例如，桿狀病毒表現構築體)及製備方法優於現有系統，此係尤其因為其實現了現有系統無法實現的大型基因體(＞130 kb)之有效合成及單一核苷酸水平修飾。

在一個態樣中，本文中提供桿狀病毒表現構築體，其包含至少兩個次基因體區域，其中各次基因體區域包含：(i)第一獨有接合區及第二獨有接合區，其中第一獨有接合區位於次基因體區域之5'端，且第二獨有接合區位於次基因體區域之3'端；及(ii)變異型桿狀病毒核苷酸序列，其所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少5個。在一些實施例中，功能性限制酶位點包含II型限制酶位點，例如IIS型限制酶位點。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體係複製勝任型。在一些實施例中，次基因體區域不含一或多個所選擇之IIS型限制酶(例如，BsaI及/或BsmBI)之識別位點。在一些實施例中，次基因體區域不含一或多個所選擇之II型限制酶(例如，AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI或任何前述酶之同裂酶(isoschizomer))之識別位點。在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係選自以下之桿狀病毒之基因體：苜蓿銀紋夜蛾( Autographa californica)多核多角體病毒(AcMNPV)(例如，AcMNPV病毒株E2、C6或HR3)、家蠶( Bombyx mori)核多角體病毒(BmNPV)、黎豆夜蛾( Anticarsia gemmatalis)核多角體病毒(AgMNPV)、花旗松毒蛾( Orgyia pseudotsugata)核多角體病毒(OpMNPV)、弧金翅夜蛾( Thysanoplusia orichalcea)核多角體病毒(ThorMNPV)或其變異體。

在一個態樣中，本文中提供包含至少兩個次基因體區域之桿狀病毒表現構築體，其中各次基因體區域包含：(i)第一獨有接合區及第二獨有接合區，其中第一獨有接合區位於次基因體區域之5'端，且第二獨有接合區位於次基因體區域之3'端；及(ii)變異型桿狀病毒核苷酸序列，其所包含之功能性IIS型限制酶位點比野生型桿狀病毒基因體之核苷酸序列少至少5個；其中桿狀病毒表現構築體係複製勝任型。在一些實施例中，次基因體區域不包含一或多個所選擇的IIS型限制酶(例如，BsaI及/或BsmBI)之功能性識別位點。

在另一態樣中，本文提供複數個片段，例如次基因體片段或次片段，其中各片段包含：(i)獨有的5'突出物及獨有的3'突出物；(ii)變異型桿狀病毒核苷酸序列，其所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少5個。在一些實施例中，功能性限制酶位點包含II型限制酶位點，例如IIS型限制酶位點。在一些實施例中，獨有的5'及3'突出物之長度係2-6個核苷酸。在一些實施例中，除用於產生獨有的5'及3'突出物之識別位點以外，片段不含一或多個所選擇的IIS型限制酶(例如，BsaI及/或BsmBI)之識別位點。在一些實施例中，片段不含一或多個所選擇的II型限制酶(例如，AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI或其同裂酶)之識別位點。

在另一態樣中，本文中提供複數個片段，例如次基因體片段或次片段，其中各片段包含：(i)獨有的5'突出物及獨有的3'突出物；(ii)變異型桿狀病毒核苷酸序列，其所包含之功能性IIS型限制酶位點比野生型桿狀病毒基因體之核苷酸序列少至少5個。在一些實施例中，獨有的5'及3'突出物之長度係2-6個核苷酸。在一些實施例中，除用於產生獨有的5'及3'突出物之識別位點以外，片段不含一或多個所選擇的IIS型限制酶(例如，BsaI及/或BsmBI)之識別位點。

在另一態樣中，本文中提供變異型桿狀病毒基因體，其所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體，例如野生型桿狀病毒基因體少至少5個。在一些實施例中，功能性限制酶位點包含II型限制酶位點，例如IIS型限制酶位點。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體係複製勝任型。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體不含一或多個所選擇的IIS型限制酶(例如，BsaI及/或BsmBI)之識別位點。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體不含一或多個所選擇的II型限制酶(例如，AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI或其同裂酶)之識別位點。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體之尺寸係50-200 kb (例如，100-180、120-160或130-140 kb)。

在另一態樣中，本文中提供變異型桿狀病毒基因體，其所包含之功能性IIS型限制酶位點比野生型桿狀病毒基因體之核苷酸序列少至少5個，其中該桿狀病毒表現構築體係複製勝任型。

在另一態樣中，本文中提供一種載體，其包含本文中所描述之桿狀病毒表現構築體或本文中所描述之複數個片段。在一些實施例中，該複數個片段係複數個次基因體片段。在一些實施例中，該複數個次基因體片段中之各者位於第一承載載體中。在一些實施例中，該複數個片段係複數個次片段。在一些實施例中，該複數個次片段中之各者位於第二承載載體中。在一些實施例中，產生次片段之獨有的5'及3'突出物之限制酶(例如，IIS型限制酶)係與用於產生次基因體片段之獨有的5'及3'突出物之限制酶不同的限制酶(例如，IIS型限制酶)。在一些實施例中，產生次片段(例如，藉由消化包含次片段之承載載體而產生之次片段)之限制酶係與用於產生次基因體片段(例如，藉由消化包含次基因體片段之承載載體而產生之次基因體片段)之限制酶不同的限制酶。在一些實施例中，用於產生次片段之獨有的5'及3'突出物之限制酶係BsaI，且用於產生次基因體片段之獨有的5'及3'突出物之限制酶係BsmBI，或反之亦然。

在另一態樣中，本文中提供細菌人工染色體(BAC)，例如小型F複製子，其所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)比參考BAC，例如野生型BAC少至少5個。在一些實施例中，功能性限制酶位點包含II型限制酶位點，例如IIS型限制酶位點。

在另一態樣中，本文中提供包含桿狀病毒基因體或其變異體之載體，其中該載體係BAC，且其中該BAC中所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)比參考BAC，例如野生型BAC少至少5個。在一些實施例中，功能性限制酶位點包含II型限制酶位點，例如IIS型限制酶位點。

在另一態樣中，本文中提供一種細胞(例如，宿主細胞，諸如昆蟲細胞)，其包含本文中所描述之桿狀病毒表現構築體。該細胞可為例如細菌細胞(例如，大腸桿菌( E. coli))、哺乳動物細胞(例如，HEK293)或昆蟲細胞(例如，Sf9、Sf21)。

在另一態樣中，本文中提供用於產生變異型桿狀病毒基因體之方法，其包含：(i)提供複數個片段，例如次基因體片段或次片段，其中各片段包含：(a)獨有的5'突出物及3'突出物；(b)變異型桿狀病毒核苷酸序列，其所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之功能性位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少5個；(ii)將修飾(例如，插入、取代或缺失)，例如一或多個修飾引入一或多個包含變異型桿狀病毒核苷酸序列之片段中；及(iii)在適合於形成變異型桿狀病毒基因體之條件下培育該複數個片段；藉此產生變異型桿狀病毒基因體。在一些實施例中，功能性限制酶位點包含II型限制酶位點，例如IIS型限制酶位點。

在另一態樣中，本文中提供用於產生變異型桿狀病毒基因體之方法，其包含：(i)提供複數個片段，例如次基因體片段或，其中各片段包含：(a)獨有的5'突出物及3'突出物；(b)變異型桿狀病毒核苷酸序列，其所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少5個；其中該複數個片段中之一或多者包含變異型桿狀病毒核苷酸序列中之修飾(例如，插入、取代或缺失)，例如一或多個修飾；及(iii)在適合於形成變異型桿狀病毒基因體之條件下培育該複數個片段；藉此產生變異型桿狀病毒基因體。在一些實施例中，功能性限制酶位點包含II型限制酶位點，例如IIS型限制酶位點。

在另一態樣中，本文中提供用於產生複數個能夠組裝至變異型桿狀病毒基因體中之次基因體片段之方法以及由該方法產生之複數個次基因體片段，該方法包含：(i)提供參考(例如親本)桿狀病毒基因體；(ii)視情況鑑別參考桿狀病毒基因體中之由限制酶識別之一或多個位點，例如所有識別位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)，(iii)修飾該一或多個識別位點，使得桿狀病毒基因體中所包含之功能性限制酶位點比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少5個，藉此產生變異型桿狀病毒基因體，(iv)初代模板分成複數個次基因體片段，其中該複數個次基因體片段中之各者包含獨有的5'突出物及獨有的3'突出物，且其中該等次基因體片段能夠基於一個次基因體片段中之5'突出物與另一次基因體片段中之3'突出物之互補性而有序地組裝；藉此產生複數個次基因體片段。在一些實施例中，功能性限制酶位點包含II型限制酶位點，例如IIS型限制酶位點。

在另一態樣中，本文中提供用於產生變異型桿狀病毒基因體之方法，以及由該方法製備之變異型桿狀病毒基因體及包含該變異型桿狀病毒基因體之桿狀病毒構築體，該方法包含：(i)提供複數個次基因體片段，(ii)將複數個次基因體片段組裝至變異型桿狀病毒基因體中，及(iii)視情況將變異型桿狀病毒基因體插入桿狀病毒表現構築體中。

在另一態樣中，本文中提供用於修飾變異型桿狀病毒基因體之方法，其包含：(i)提供本文中所描述之複數個次基因體片段，(ii)鑑別桿狀病毒基因體中之一或多個需要一或多個修飾(例如，取代、插入或缺失)之位置，(iii)選擇相應的次基因體片段，其含有一或多個將引入一或多個修飾之基因座，(iv)將一或多個修飾引入次基因體片段中，藉此產生一或多個經修飾之次基因體片段；(v)在適合於藉由有序地組裝複數個次基因體片段來形成變異型桿狀病毒基因體之條件下培育該複數個片段，其中一或多個經修飾之次基因體片段置換該複數個次基因體片段中之一或多者之未經修飾之版本，藉此獲得經修飾之變異型桿狀病毒基因體。

在另一態樣中，本文中提供包含本文中所描述之AAV表現構築體及/或AAV有效負載構築體之桿狀病毒表現構築體或變異型桿狀病毒基因體，以及包含其之AAV病毒產生系統。

在另一態樣中，本文中提供用於在AAV病毒產生細胞中產生重組AAV (rAAV)粒子之方法，以及使用該方法產生之rAAV粒子，其中該方法包含：(i)提供本文中所描述之AAV病毒產生系統，其中桿狀病毒表現構築體或變異型桿狀病毒基因體包含AAV表現構築體，該AAV表現構築體包含一或多個VP編碼區，該一或多個VP編碼區包含一或多個編碼VP1、VP2及VP3衣殼蛋白質之核苷酸序列；(ii)將AAV病毒產生系統及/或包含AAV有效負載構築體之桿狀病毒表現構築體或變異型桿狀病毒基因體轉染至AAV病毒產生細胞中，該AAV有效負載構築體包含編碼有效負載之核苷酸序列；(iii)將AAV病毒產生細胞暴露於允許AAV病毒產生細胞將AAV表現構築體及AAV有效負載構築體處理成rAAV粒子之條件；及視情況地，(iv)收集來自AAV病毒產生細胞，例如昆蟲細胞，諸如Sf9細胞或Sf21細胞之rAAV粒子。

在一些實施例中，本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體、桿狀病毒表現載體及BAC包含編碼AAV Rep蛋白質，例如Rep40、Rep52、Rep68、Rep78或其組合之核苷酸序列。在一些實施例中，本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體包含編碼AAV衣殼蛋白質，例如VP1蛋白質、VP2蛋白質、VP3蛋白質或其組合之核苷酸序列。在一些實施例中，本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體包含編碼AAV1衣殼蛋白質、AAV2衣殼蛋白質、AAV3衣殼蛋白質、AAV4衣殼蛋白質、AAV5衣殼蛋白質、AAV6衣殼蛋白質、AAV8衣殼蛋白質、AAV9衣殼蛋白質、AAVrh10衣殼蛋白質或其變異體之核苷酸序列。

在另一態樣中，本文中提供桿狀病毒表現載體或變異型桿狀病毒基因體，其包含AAV表現構築體，該AAV表現構築體包含(i)至少兩個Rep編碼區，其各自包含編碼獨立地選自Rep52、Rep40、Rep68或Rep78蛋白質之Rep蛋白質(例如Rep52蛋白質及Rep78蛋白質)之核苷酸序列；及(ii)VP編碼區，其包含編碼至少一個、兩個或三個選自VP1蛋白質、VP2蛋白質、VP3蛋白質或其組合之VP蛋白質之核苷酸序列，其中該至少兩個Rep編碼區各自包含不同的核苷酸序列及/或位於不同位置；其中桿狀病毒表現構築體包含桿狀病毒基因體，例如變異型桿狀病毒基因體之至少一部分，該部分包含至少兩個非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)之破壞，其中該至少兩個非必需基因係獨立地選自egt、p74 (PIF0)、p26、SOD、ChiA、v-cath、p10、多角體蛋白、ctx、odv-e56、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94；視情況其中將AAV表現構築體在宿主細胞(例如，昆蟲細胞)中穩定地維持至少5-10代，例如至少5、6、7、8、9或10代。在一些實施例中，VP編碼區包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內。在一些實施例中，AAV表現構築體包含第二VP編碼區。在一些實施例中，第二VP編碼區包含相對於VP2蛋白質或VP3蛋白質主要編碼VP1蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的VP1蛋白質(例如，但不編碼VP2或VP3蛋白質)之核苷酸序列。在一些實施例中，第二VP編碼區可操作地連接至ctx啟動子。在一些實施例中，AAV表現構築體包含經修飾之Kozak序列。在一些實施例中，經修飾之Kozak序列位於VP編碼區之5'端。

在另一態樣中，本文中提供包含AAV表現構築體之桿狀病毒表現構築體或變異型桿狀病毒基因體，該AAV表現構築體包含：(i)Rep編碼區，其包含編碼選自Rep52、Rep40、Rep68、Rep78蛋白質或其組合之Rep蛋白質(例如，Rep52蛋白質及/或Rep78蛋白質)之核苷酸序列；及(ii)VP編碼區，其包含編碼至少一個、兩個或三個選自VP1蛋白質、VP2蛋白質、VP3蛋白質或其組合之VP蛋白質之核苷酸序列，其中桿狀病毒表現構築體包含桿狀病毒基因體，例如變異型桿狀病毒基因體之至少一部分，該部分包含至少兩個非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)之破壞，其中該至少兩個非必需基因係獨立地選自egt、p74 (PIF0)、p26、SOD、ChiA、v-cath、p10、多角體蛋白、ctx、odv-e56、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94；且其中Rep編碼區可操作地連接至第一啟動子(例如桿狀病毒早期啟動子或桿狀病毒早期-晚期啟動子(例如，gp64啟動子))及視情況選用之第二啟動子，例如桿狀病毒晚期或桿狀病毒極晚期啟動子(例如，polh啟動子)，視情況地，其中：(a)第一啟動子引起VP編碼區之轉錄之前的Rep編碼區之轉錄；(b)Rep編碼區位於同源重複序列區hr5之下游；及/或(c)VP編碼區位於SOD基因座中。在一些實施例中，Rep編碼區包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之核苷酸序列，其中編碼Rep52蛋白質之核苷酸序列包含於編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列內。在一些實施例中，Rep編碼區包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之單一多順反子ORF。在一些實施例中，Rep編碼區可操作地連接至第一啟動子及/或第二啟動子，例如桿狀病毒早期啟動子、桿狀病毒晚期啟動子、桿狀病毒早期-晚期啟動子或桿狀病毒極晚期啟動子。在一些實施例中，第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子。在一些實施例中，第一啟動子係gp64啟動子且第二啟動子係polh啟動子。在一些實施例中，Rep編碼區位於p74基因座中。在一些實施例中，以5'至3'順序，AAV表現載體包含：第一啟動子(例如，桿狀病毒早期-晚期啟動子，諸如gp64啟動子)、第二啟動子(桿狀病毒極晚期啟動子，諸如polh啟動子)及Rep編碼區，其包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之核苷酸序列。

在一些實施例中，本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體包含編碼以下之核苷酸序列：有效負載，例如治療性蛋白質或其功能性變異體；抗體或抗體片段；酶；基因編輯系統之組分；RNAi試劑(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)；或其組合。

在另一態樣中，本文中提供使用本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體、本文中所描述之桿狀病毒表現構築體、本文中所描述之複數個片段、本文中所描述之載體、本文中所描述之BAC及本文中所描述之細胞產生之桿狀病毒。

在另一態樣中，本文中提供組合物(例如，醫藥組合物)及套組，其包含本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體、本文中所描述之桿狀病毒表現構築體、本文中所描述之複數個片段、本文中所描述之載體、本文中所描述之BAC或本文中所描述之AAV粒子。

熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗確定本文中所描述之本發明之特定實施例之許多等效物。此類等效物意欲由以下列舉之實施例涵蓋。 列舉之實施例E1. 一種桿狀病毒表現構築體，其包含至少兩個次基因體區域，其中各次基因體區域包含： (i) 第一獨有接合區及第二獨有接合區，其中第一獨有接合區位於次基因體區域之5'端，且第二獨有接合區位於次基因體區域之3'端；及 (ii) 變異型桿狀病毒核苷酸序列，其所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少5個；視情況地，其中該桿狀病毒表現構築體係複製勝任型。 E2. 如實施例E1之桿狀病毒表現構築體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列中所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個。 E3. 如實施例E1或E2之桿狀病毒表現構築體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列中所包含之： (i) II型限制酶，例如所選擇的II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個；或 (ii) 兩個或更多個(例如，2-5個、2個、3個、4個或5個)所選擇的II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個。 E4. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列中所包含之功能性IIS型限制酶位點(例如，天然存在之功能性IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個。 E5. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列中所包含之： (i) 所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個；或 (ii) 兩個或更多個(例如，2-5個、2個、3個、4個或5個)所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個。 E6. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不包含： (i) 兩個或更多個(例如，2個、3個、4個或5個)所選擇的II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)； (ii) 所選擇的II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)；或 (iii) II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。 E7. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不包含所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點。 E8. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不包含兩個或更多個(例如，2個、3個、4個或5個)所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點。 E9. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不包含功能性IIS型限制酶位點。 E10. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不含： (i) 所選擇的II型限制酶之識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)； (ii) 1-5個(例如，1-4個、1-3個、1-2個、1個、2個、3個、4個或5個)所選擇的II型限制酶之識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)；或 (iii) II型限制酶之識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。 E11. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不含所選擇的IIS型限制酶之識別位點。 E12. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不含兩個或更多個(例如，2-5個、2個、3個、4個或5個)所選擇的IIS型限制酶之識別位點。 E13. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不含IIS型限制酶位點。 E14. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中限制酶位點係由在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物之限制酶識別。 E15. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對。 E16. 如實施例E1-E13中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中限制酶位點係由在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物之限制酶識別。 E17. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中限制酶位點係由可熱不活化之限制酶識別。 E18. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中限制酶位點係由限制酶識別，該限制酶識別具有至少4-8個鹼基對，例如至少4個鹼基對、至少5個鹼基對、至少6個鹼基對、至少7個鹼基對或至少8個鹼基對(例如，8個鹼基對)之延伸部分。 E19. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶位點係II型限制酶位點。 E20. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中限制酶位點係由能夠用於Gibson Assembly™選殖及接合方法(例如，Gibson等人, 「Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases」, Nat. Methods, 2009, 6(5):343-5中所描述之方法；其內容以全文引用之方式併入本文中)之限制酶，例如吉布森組裝相容酶(Gibson Assembly compatible enzyme)識別。 E21. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E22. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶位點係IIS型限制酶位點。 E23. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中IIS型限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E24. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該IIS型限制酶位點係BsmBI限制酶位點、BsaI限制酶位點、PaqCI限制酶位點或其組合。 E25. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該IIS型限制酶位點係BsmBI限制酶位點。 E26. 如實施例E1-E22、E24或E25中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E27. 如實施例E26之桿狀病毒表現構築體，其中限制酶位點係由以下識別：AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E28. 如實施例E26或E27之桿狀病毒表現構築體，其中限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E29. 如實施例E27之桿狀病毒表現構築體，其中限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E30. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中減少的至少5個功能性IIS型限制酶位點中之至少一個、兩個、三個、四個或更多個係不同的IIS型限制酶位點，例如第一IIS型限制酶位點及第二IIS型限制酶位點，視情況其中： (i) 該第一IIS型限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶；及 (ii) 該第二IIS型限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E31. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其包含2-20個次基因體區域(例如，16個次基因體區域)。 E32. 如前述實施例中任一項之表現構築體，其包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個次基因體區域(例如，16個次基因體區域)。 E33. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該等次基因體區域中之一或多者之長度係約100-25000 bp (例如長度係約100-1000 bp、約100-10000 bp、約100-20000 bp、約100-25000 bp、約1000-10000 bp、約1000-8000 bp、約1000-5000 bp、約1000-2500 bp、約2500-25000 bp、約2500-20000 bp、約2500-15000 bp、約2500-10000 bp、約2500-5000 bp、約5000-25000 bp、約5000-20000 bp、約5000-15000 bp、約5000-10000 bp、約7500-25000 bp、約7500-20000、約7500-15000 bp、約7500-10000 bp、約10000-25000 bp、約10000-20000 bp、約10000-15000 bp、約15000-25000 bp、約15000-20000 bp、約20000-25000 bp、約7000-9000 bp或約8000 bp)。 E34. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中第一獨有接合區及第二獨有接合區之長度獨立地包含至少1-50個核苷酸，例如2-5個核苷酸(例如，4個核苷酸)。 E35. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中至少兩個次基因體區域係由第一次基因體片段及第二次基因體片段形成。 E36. 如實施例E35之桿狀病毒表現構築體，其中第一次基因體片段及第二次基因體片段中之各者包含獨有的5'突出物及獨有的3'突出物。 E37. 如實施例E31-E36中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中2-20個次基因體區域係由2-20個次基因體片段，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個次基因體片段形成。 E38. 如實施例E31-E37中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該2-20個次基因體片段中之各者包含獨有的5'突出物及獨有的3'突出物。 E39. 如實施例E39之桿狀病毒表現構築體，其中該2-20個次基因體片段中之各者相對於其他次基因體片段包含不同的5'突出物及/或不同的3'突出物。 E40. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中第一獨有接合區包含第一次基因體片段之獨有的5'突出物及第二次基因體片段之獨有的3'突出物，其中第一次基因體片段之獨有的5'突出物與第二次基因體片段之獨有的3'突出物互補(例如，部分互補或完全互補)。 E41. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該2-20個次基因體片段中之各者在5'端處包含與另一次基因體片段之3'端處的核苷酸序列重疊(例如，同源)之核苷酸序列，其中重疊區域係一對次基因體片段所獨有的。 E42. 如實施例E36-E41中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係由限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)進行之次基因體片段之裂解產生。 E43. 如實施例E36-E42中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中使用相同的限制酶，例如相同的II型限制酶(例如，相同的IIS型限制酶)產生各次基因體片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物。 E44. 如實施例E36-E43之桿狀病毒表現構築體，其中次基因體片段之獨有的5'突出物及/或獨有的3'突出物之長度獨立地包含至少1-6個核苷酸，例如2-5個核苷酸(例如，4個核苷酸)。 E45. 如實施例E36-E44之桿狀病毒表現構築體，其中次基因體片段之獨有的5'突出物及/或獨有的3'突出物獨立地包含4個核苷酸。 E46. 如實施例E36-E45之桿狀病毒表現構築體，其中次基因體片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物包含黏性端部。 E47. 如實施例E35-E46之桿狀病毒表現構築體，其中次基因體片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係各自獨立地選自：ACAA、GGTC、GACC、CCAG、CTGG、CCTT、AAGG、TCAT、ATGA、TCGC、GCGA、AGAG、CTCT、AACT、AGTT、CGGT、ACCG、ATAC、GTAT、GAGT、ACTC、TTCC、GGAA、ATTA、TAAT、TCCT、AGGA、TCTA、TAGA、TGTA、TACA、GATG、CATC或TTGT，其中次基因體片段中之獨有的5'突出物及3'突出物之序列係不同的。 E48. 如實施例E35-E47中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該2-20個次基因體片段中之一或多者位於第一承載載體中。 E49. 如實施例E35-E47中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該2-20個次基因體片段中之各者位於分開的第一承載載體中。 E50. 如實施例E35-E48中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該2-20個次基因體片段中之各者係使用相同的限制酶，例如相同的II型限制酶，例如相同的IIS型限制酶由第一承載載體或分開的第一承載載體產生。 E51. 如實施例E50之桿狀病毒表現構築體，其中限制酶在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物。 E52. 如實施例E50或E51之桿狀病毒表現構築體，其中由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對。 E53. 如實施例E50之桿狀病毒表現構築體，其中限制酶在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物。 E54. 如實施例E50-E53中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中限制酶係可熱不活化的。 E55. 如實施例E50-E54中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中限制酶識別具有至少4-8個鹼基對，例如至少4個鹼基對、至少5個鹼基對、至少6個鹼基對、至少7個鹼基對或至少8個鹼基對(例如，8個鹼基對)之延伸部分。 E56. 如實施例E50-E55中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶係II型限制酶。 E57. 如實施例E50-E56中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶係能夠用於Gibson Assembly™選殖及接合方法(例如，Gibson等人, 「Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases」, Nat. Methods, 2009, 6(5):343-5中所描述之方法；其內容以全文引用之方式併入本文中)之限制酶，例如吉布森組裝相容酶。 E58. 如實施例E50-E57中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E59. 如實施例E50-E58中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶係IIS型限制酶。 E60. 如實施例E50-E59中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該IIS型限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E61. 如實施例E50-E60中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該IIS型限制酶係BsaI限制酶、PaqCI限制酶、BsmBI限制酶或其組合。 E62. 如實施例E50-E61中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該IIS型限制酶位點係BsmBI限制酶。 E63. 如實施例E50-E62中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶係選自：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E64. 如E50-E63中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E65. 如實施例E50-E64中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E66. 如實施例E50-E64中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶係AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E67. 如實施例E31-E66中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該2-20個次基因體片段中之一或多者包含來自變異型桿狀病毒核苷酸序列之異源核苷酸序列。 E68. 如實施例E67之桿狀病毒表現構築體，其中該異源核苷酸序列包含所關注的序列(例如，編碼Rep編碼區、一或多種Rep蛋白質、VP編碼區、一或多種VP蛋白質及/或有效負載之核苷酸序列)。 E69. 如實施例E68之桿狀病毒表現構築體，其中該所關注的序列可操作地連接至第一啟動子(例如，桿狀病毒早期啟動子或桿狀病毒早期-晚期啟動子)及/或第二啟動子(例如，桿狀病毒晚期啟動子或桿狀病毒極晚期啟動子)。 E70. 如實施例E67或E68之桿狀病毒表現構築體，其中該所關注的序列可操作地連接至第一啟動子(例如，桿狀病毒早期啟動子或桿狀病毒早期-晚期啟動子)及第二啟動子(例如，桿狀病毒晚期啟動子或桿狀病毒極晚期啟動子)。 E71. 如實施例E69或E70之桿狀病毒表現構築體，其中第一及/或第二啟動子係選自桿狀病毒啟動子、病毒啟動子、昆蟲病毒啟動子、非昆蟲病毒啟動子、脊椎動物病毒啟動子、來自一或多個物種之包括病毒及非病毒元件之嵌合啟動子、合成啟動子或其變異體。 E72. 如實施例E69-E71中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中第一及/或第二啟動子係選自polh啟動子、p10啟動子、ctx啟動子、gp64啟動子、IE啟動子、IE-1啟動子、p6.9啟動子、Dmhsp70啟動子、Hsp70啟動子、p5啟動子、p19啟動子、p35啟動子、p40啟動子或其變異體，例如功能性片段。 E73. 如實施例E69-E72中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中第一及/或第二啟動子係選自桿狀病毒早期啟動子、桿狀病毒晚期啟動子、桿狀病毒早期-晚期啟動子或桿狀病毒極晚期啟動子。 E74. 如實施例E69-E73中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中第一及/或第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子、桿狀病毒晚期啟動子或桿狀病毒早期-晚期啟動子。 E75. 如實施例E69-E74中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中第一及/或第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子(例如，gp64啟動子)。 E76. 如實施例E69-E75中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中第一或第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子(例如，polh啟動子)。 E77. 如實施例E69-E76中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中： (a) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子， (b) 該第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子， (c) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子， (d) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (e) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子， (f) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (g) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子， (h) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子， (i) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子， (j) 該第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子， (k) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子， (l) 該第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (m) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (n) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子，或 (o) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子。 E78. 如實施例E69-E77中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子(例如，gp64啟動子)且第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子(例如，polh啟動子)。 E79. 如實施例E69-E78中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子。 E80. 如實施例E69-E79中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中 (a) 該桿狀病毒早期啟動子係選自：lef3啟動子、dbp啟動子、p35啟動子、orf82啟動子、get啟動子、orf81啟動子、orf122啟動子、pk-2啟動子、orf55啟動子、etl啟動子、hcf-1啟動子、etm啟動子、lef-2啟動子、lef-6啟動子、orf84啟動子、orf118啟動子或orf111啟動子， (b) 該桿狀病毒早期-晚期啟動子係選自：lef2啟動子、orf13啟動子、orf23啟動子、pkip啟動子、v-fgf啟動子、pp31啟動子、odv-e66啟動子、orf74啟動子、orf79啟動子、orf82啟動子、p15啟動子、cg30啟動子、解螺旋酶啟動子、he65啟動子、orf114啟動子、pk-2啟動子、gp64啟動子、gp16啟動子、alk-exo啟動子、p35啟動子、me53啟動子或ie0啟動子， (c) 該桿狀病毒晚期啟動子係選自：ptpase啟動子、Ac-bro啟動子、ctx啟動子、orf5啟動子、orf19啟動子、orf20啟動子、sod啟動子、HisP啟動子、orf34啟動子、v-ubi啟動子、orf38啟動子、orf43啟動子、orf44啟動子、orf56啟動子、orf59啟動子、orf60啟動子或fp-25k啟動子，及/或 (d) 該桿狀病毒極晚期啟動子係選自p10啟動子或polh啟動子。 E81. 如實施例E69-E80中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中第一及/或第二啟動子包含TATA盒模體及/或CAGT模體。 E82. 如實施例E69-E81中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中第一及/或第二啟動子包含TAAG模體(例如，ATAAG核苷酸序列)。 E83. 如實施例E69-E82中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中第一及/或第二啟動子包含TATA盒模體及TAAG模體。 E84. 如實施例E69-E83中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中第一或第二啟動子包含VLF-1之結合位點。 E85. 如實施例E69-E84中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中第一或第二啟動子係gp64啟動子(例如，OpMNPV gp64啟動子)。 E86. 如實施例E69-E85中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中第一或第二啟動子係polh啟動子(例如，OpMNPV polh啟動子或AcMNPV polh啟動子)。 E87. 如實施例E69-E86中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中第一啟動子係gp64啟動子且第二啟動子係polh啟動子，或其中第一啟動子係polh啟動子且第二啟動子係gp64啟動子。 E88. 如實施例E69-E87中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中Rep編碼區可操作地連接至第一啟動子(其係桿狀病毒早期-晚期啟動子)及第二啟動子(其係桿狀病毒極晚期啟動子)，例如gp64啟動子及polh啟動子，視情況其中該Rep編碼區位於同源重複序列區hr5之下游。 E89. 如實施例E69-E88中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中第一啟動子係gp64啟動子且第二啟動子係polh啟動子。 E90. 如實施例E69-E77或E80-E86之桿狀病毒表現構築體，其中第一啟動子及第二啟動子係相同的。 E91. 如實施例E69-E89之桿狀病毒表現構築體，其中第一啟動子及第二啟動子係不同的。 E92. 如實施例E90之桿狀病毒表現構築體，第一啟動子及第二啟動子各自為polh啟動子。 E93. 如實施例E72-E91之桿狀病毒表現構築體，其中gp64啟動子包含SEQ ID NO:217之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E94. 如實施例E72-E92之桿狀病毒表現構築體，其中polh啟動子包含SEQ ID NO:167或220之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:167或220包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:167或220包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E95. 如實施例E72-E91中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中第一啟動子及第二啟動子包含SEQ ID NO:221之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:221包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:221包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E96. 如實施例E68-E95中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中所關注的序列係編碼所關注的多肽之核苷酸序列或所關注的核苷酸序列。 E97. 如實施例E68-E96中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該所關注的序列編碼治療性蛋白質或其功能性變異體、抗體或抗體片段；酶；基因編輯系統之組分；RNAi試劑(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)；或其組合。 E98. 如實施例E68-E97中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該異源核苷酸序列，例如所關注的序列包含一或多個腺相關病毒(AAV)基因編碼區域及/或有效負載。 E99. 如實施例E68-E98中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該異源核苷酸序列係化學合成、非模板化核苷酸序列(例如，非模板化片段)或藉由基於PCR之方法產生。 E100. 如實施例E35-E99中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該等次基因體片段，例如該2-20個次基因體片段能夠基於一個次基因體片段中之5'突出物與另一次基因體片段中之3'突出物之互補性而有序地組裝，從而產生變異型桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體。 E101. 如實施例E35-E100中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該等次基因體片段，例如該2-20個次基因體片段能夠基於一個次基因體片段之5'端處的核苷酸序列與另一次基因體片段之3'端處的核苷酸序列之重疊而有序地組裝，從而產生變異型桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體。 E102. 如實施例E100或E101之桿狀病毒表現構築體，其中各次基因體片段之間的核苷酸序列之重疊係4-50個(例如，4-45個、4-40個、4-35個、4-30個、4-25個、4-20個、4-15個、4-10個、10-50個、10-45個、10-40個、10-35個、10-30個、10-25個、10-20個、10-15個、15-50個、15-45個、15-40個、15-35個、15-30個、15-25個、15-20個、20-50個、20-45個、20-40個、20-35個、20-30個、20-25個、25-50個、25-45個、25-40個、25-35個、25-30個、30-50個、30-45個、30-40個、30-35個、35-50個、35-45個、35-40個、40-50個、40-45)相鄰鹼基對。 E103. 如實施例E100-E102中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中5'核酸外切酶產生對應於次基因體片段之間的重疊核苷酸序列之單股互補區，從而產生能夠彼此黏接之次基因體片段。 E104. 如實施例E100-E103中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中經黏接之次基因體片段之間的任何空位係由DNA聚合酶填充。 E105. 如實施例E35-E104中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中至少兩個次基因體片段共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly或Gibson Assembly™，使得形成至少兩個次基因體區域及/或產生變異型桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體，視情況其中該等次基因體片段在單步驟中接合以產生變異型桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體。 E106. 如實施例E37-E105中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該2-20個次基因體片段共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly或Gibson Assembly™，使得形成2-20個次基因體區域及/或產生變異型桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體，視情況其中該等次基因體片段(例如，16個次基因體片段)在單步驟中接合以產生變異型桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體。 E107. 如實施例E35-E106中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中至少兩個次基因體片段包含一或多個次片段。 E108. 如實施例E37-E107中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該2-20個次基因體片段包含一或多個次片段。 E109. 如實施例E37-E108之桿狀病毒表現構築體，其中該2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個次基因體區域(例如，16個次基因體區域)包含一或多個次片段。 E110. 如實施例E35-E109中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中各次基因體片段包含至少1-20個，例如10-20個、12-18個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19或20個(例如，16個)次片段。 E111. 如實施例E37-E110中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該2-20個次基因體片段包含2-300個，例如2-250個、2-200個、2-150個、2-100個、2-50個、2-20個、2-10個、10-300個、10-250個、10-200個、10-150個、10-100個、10-50個、10-20個、15-300個、15-250個、15-200個、15-150個、15-100個、15-50個、15-20個、25-300個、25-250個、25-200個、25-150個、25-100個、25-50個、50-300個、50-250個、50-200個、50-150個、50-100個、100-300個、100-250個、100-200個、100-150個、150-300個、150-250個、150-200個、200-300個、200-250個或250-300個(例如，10-50個、20-40個、32個、200-300個、220-280個、240-260個、256個)次片段。 E112. 如實施例E107-E111之桿狀病毒表現構築體，其中該一或多個次片段中之各者包含獨有的5'突出物及獨有的3'突出物。 E113. 如實施例E112之桿狀病毒表現構築體，其中該一或多個次片段中之各者相對於其他次片段包含不同的5'突出物及/或不同的3'突出物。 E114. 如實施例E107-E113中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該一或多個次片段之長度係約50-1000 bp，例如約50-900、50-800、50-700、50-600、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、100-900、100-800、100-700、100-600、100-500、100-400、100-300、100-200、200-1000、200-900、200-800、200-700、200-600、200-500、200-400、200-300、400-1000、400-900、400-800、400-700、400-600、400-500、600-1000、600-900、600-800、600-700、800-1000、800-900、900-1000 bp (例如，100-800 bp、約250-750 bp、約400-600 bp或約500 bp)。 E115. 如實施例E112-E114中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中第一次片段之獨有的5'突出物與第二次片段之獨有的3'突出物互補(例如，部分互補或完全互補)。 E116. 如實施例E112-E115中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中次片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係由限制酶，例如IIS型限制酶進行之次片段之裂解產生。 E117. 如實施例E116中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶，例如IIS型限制酶與用於產生次基因體片段之限制酶不同。 E118. 如實施例E117中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中使用相同的限制酶，例如相同的IIS型限制酶產生各次片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物，其中該相同限制酶與用於產生次基因體片段之限制酶不同。 E119. 如實施例E112-E118中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中次片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物之長度獨立地包含至少1-6個核苷酸，例如2-5個核苷酸(例如，4個核苷酸)。 E120. 如實施例E112-E119中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中次片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物獨立地包含4個核苷酸。 E121. 如實施例E112-E120中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中次片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物包含黏性端部。 E122. 如實施例E112-E121中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中次片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係各自獨立地選自：ACAA、GGTC、GACC、CCAG、CTGG、CCTT、AAGG、TCAT、ATGA、TCGC、GCGA、AGAG、CTCT、AACT、AGTT、CGGT、ACCG、ATAC、GTAT、GAGT、ACTC、TTCC、GGAA、ATTA、TAAT、TCCT、AGGA、TCTA、TAGA、TGTA、TACA、GATG、CATC或TTGT，其中次片段中之獨有的5'突出物及3'突出物之序列係不同的。 E123. 如實施例E107-E122中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該一或多個次片段中之各者包含5'端處的核苷酸序列與該一或多個次片段中之另一者之3'端處的核苷酸序列之重疊區域。 E124. 如實施例E123之桿狀病毒表現構築體，其中各次片段之間的核苷酸序列之重疊係4-50個(例如，4-45個、4-40個、4-35個、4-30個、4-25個、4-20個、4-15個、4-10個、10-50個、10-45個、10-40個、10-35個、10-30個、10-25個、10-20個、10-15個、15-50個、15-45個、15-40個、15-35個、15-30個、15-25個、15-20個、20-50個、20-45個、20-40個、20-35個、20-30個、20-25個、25-50個、25-45個、25-40個、25-35個、25-30個、30-50個、30-45個、30-40個、30-35個、35-50個、35-45個、35-40個、40-50個、40-45個)相鄰鹼基對。 E125. 如實施例E107-E124中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中一或多個次片段位於第二承載載體中。 E126. 如實施例E107-E125中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該一或多個次片段中之各者位於分開的第二承載載體中。 E127. 如實施例E107-E126中任一實施例之桿狀病毒表現構築體，其中該一或多個次片段中之各者係使用相同的限制酶，例如相同的II型限制酶，例如相同的IIS型限制酶由第二承載載體或分開的第二承載載體產生，其中該相同的限制酶與用於產生次基因體片段之限制酶不同。 E128. 如實施例E127之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶具有以下特性中之一者、兩者、三者、四者或全部： (i) 在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物； (ii) 由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對； (iii) 在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物； (iv) 可熱不活化； (v) 識別具有至少4-8個鹼基對，例如至少4個鹼基對、至少5個鹼基對、至少6個鹼基對、至少7個鹼基對或至少8個鹼基對(例如，8個鹼基對)之延伸部分。 E129. 如實施例E127或E128之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶係II型限制酶。 E130. 如實施例E127-E129中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶係能夠用於Gibson Assembly™選殖及接合方法(例如，Gibson等人, 「Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases」, Nat. Methods, 2009, 6(5):343-5中所描述之方法；其內容以全文引用之方式併入本文中)之限制酶，例如吉布森組裝相容酶。 E131. 如實施例E127-E130中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E132. 如實施例E127-E131中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶係IIS型限制酶。 E133. 如實施例E127-E132中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該IIS型限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E134. 如實施例E127-E133中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該IIS型限制酶係BsaI限制酶、BsmBI限制酶、PaqCI限制酶或其組合。 E135. 如實施例E127-E134中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該IIS型限制酶係BsaI限制酶。 E136. 如實施例E127-E135中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶係選自：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E137. 如實施例E127-E136中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E138. 如實施例E127-E137中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶係選自：AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E139. 如實施例E127-E138中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶係選自：AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E140. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該限制酶不為EcoRI或其中該限制酶位點不為EcoRI。 E141. 如實施例E107-E140中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中一或多個次片段包含來自變異型桿狀病毒核苷酸序列之異源核苷酸序列。 E142. 如實施例E141之桿狀病毒表現構築體，其中該異源核苷酸序列包含所關注的序列。 E143. 如實施例E142之桿狀病毒表現構築體，其中該所關注的序列係編碼所關注的多肽之核苷酸序列或所關注的核苷酸序列。 E144. 如實施例E141或E142之桿狀病毒表現構築體，其中該所關注的序列編碼治療性蛋白質或其功能性變異體、抗體或抗體片段；酶；基因編輯系統之組分；RNAi試劑(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)；或其組合。 E145. 如實施例E141-E144中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該異源核苷酸序列，例如所關注的序列包含一或多個腺相關病毒(AAV)基因編碼區域及/或有效負載。 E146. 如實施例E141-E145中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該異源核苷酸序列係化學合成、非模板化核苷酸序列(例如，非模板化片段)或藉由基於PCR之方法產生。 E147. 如實施例E107-E146中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中一或多個次片段能夠基於一個次片段中之5'突出物與另一次片段中之3'突出物之互補性而有序地組裝，從而產生次基因體片段及/或桿狀病毒表現構築體。 E148. 如實施例E107-E147中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中次片段能夠基於一個次片段之5'端處的核苷酸序列與另一次片段之3'端處的核苷酸序列之重疊而有序地組裝，從而產生次基因體片段及/或桿狀病毒表現構築體。 E149. 如實施例E148之桿狀病毒表現構築體，其中各次片段之間的核苷酸序列之重疊係4-50個(例如，4-45個、4-40個、4-35個、4-30個、4-25個、4-20個、4-15個、4-10個、10-50個、10-45個、10-40個、10-35個、10-30個、10-25個、10-20個、10-15個、15-50個、15-45個、15-40個、15-35個、15-30個、15-25個、15-20個、20-50個、20-45個、20-40個、20-35個、20-30個、20-25個、25-50個、25-45個、25-40個、25-35個、25-30個、30-50個、30-45個、30-40個、30-35個、35-50個、35-45個、35-40個、40-50個、40-45個)相鄰鹼基對。 E150. 如實施例E148或E149之桿狀病毒表現構築體，其中5'核酸外切酶產生對應於次片段之間的重疊序列之單股互補區，從而產生能夠彼此黏接之次片段。 E151. 如實施例E150之桿狀病毒表現構築體，其中經黏接之次片段之間的任何空位係由DNA聚合酶填充。 E152. 如實施例E107-E151中任一實施例之桿狀病毒表現構築體，其中一或多個次片段共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly或Gibson組裝，由此形成一或多個次基因體區域及/或產生桿狀病毒表現構築體，視情況其中該等次片段在單步驟中接合以產生一或多個次基因體片段(或次基因體區域)、變異型桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體。 E153. 如實施例E107-E152中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中一或多個次片段包含變異型桿狀病毒核苷酸序列，該核苷酸序列中所包含之功能性IIS型限制酶位點比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個。 E154. 如實施例E35-E153中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中一或多個次基因體片段之變異型桿狀病毒核苷酸序列包含修飾，例如插入、缺失或取代。 E155. 如實施例E35-E154中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中一或多個次片段之變異型桿狀病毒核苷酸序列包含修飾，例如插入、缺失或取代。 E156. 如實施例E154或E155之桿狀病毒表現構築體，其中該修飾，例如插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變)位於非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)或非必需基因之調節區中(例如，啟動子修飾)。 E157. 如實施例E156之桿狀病毒表現構築體，其中該非必需基因係選自以下中之一者、兩者、三者或更多者(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21者)：egt、p74 (PIF0)、p26、SOD、ChiA、v-cath、p10、多角體蛋白、ctx、odv-e56、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94。 E158. 如實施例E157之桿狀病毒表現構築體，其包含以下中之修飾，例如插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變)： (i) v-cath及egt； (ii) v-cath、egt及SOD； (iii) chiA、v-cath、egt、p26、p10及p74； (iv) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74及SOD；或 (v) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74、SOD、AcORF-91及AcORF-108。 E159. 如實施例E154-E158中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該修飾包含chiA基因、v-cath基因、p26基因、p10基因及/或p74基因或其一部分之缺失。 E160. 如實施例E156-E159中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該修飾包含非必需基因或相鄰區域中之異源序列之插入。 E161. 如實施例E156-E160中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該修飾包含非必需基因或相鄰區域中之一或多個突變。 E162. 如實施例E156-E161中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該等非必需基因位於同源重複序列區5 (hr5)附近(例如，下游或上游)。 E163. 如實施例E154-E162中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該修飾，例如插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變)引起非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)或非必需基因之調節區之不活化(例如，啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入)。 E164. 如實施例E35-E163中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中一或多個次基因體片段之變異型桿狀病毒核苷酸序列包含非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)或非必需基因之調節區之破壞，例如突變(例如，框移突變)、缺失、插入或不活化(例如，啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入)。 E165. 如實施例E107至163中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中一或多個次片段之變異型桿狀病毒核苷酸序列包含非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)或非必需基因之調節區之破壞，例如突變(例如，框移突變)、缺失、插入(例如，與非必需基因相鄰之異源DNA之插入)或不活化(例如，啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入)。 E166. 如實施例E154-E165中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中藉由化學合成或PCR，例如基於PCR之定點突變誘發來引入修飾。 E167. 如實施例E1-E106中任一項之桿狀病毒表現構築體，其包含桿狀病毒基因體或其一部分。 E168. 如實施例E167之桿狀病毒表現構築體，其中該桿狀病毒基因體或其一部分之長度係至少10 kb-140 kb，例如至少10 kb、20 kb、30 kb、40 kb、50 kb、60 kb、70 kb、80 kb、90 kb、100 kb、110 kb、120 kb、130 kb或140 kb。 E169. 如實施例E167或E168之桿狀病毒表現構築體，其中該桿狀病毒基因體包含來自選自以下之桿狀病毒基因體之核苷酸序列或其一部分：苜蓿銀紋夜蛾多核多角體病毒(AcMNPV) (例如，AcMNPV病毒株E2、C6或HR3)、家蠶核多角體病毒(BmNPV)、黎豆夜蛾核多角體病毒(AgMNPV)、花旗松毒蛾核多角體病毒(OpMNPV)、弧金翅夜蛾核多角體病毒(ThorMNPV)或其變異體。 E170. 如實施例E167-E169中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中桿狀病毒基因體係野生型桿狀病毒基因體或經修飾之桿狀病毒基因體，例如具有至少一個非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)之缺失，例如具有多角體蛋白(polh)基因座之缺失之桿狀病毒基因體。 E171. 如實施例E167-E170中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該桿狀病毒基因體係bMON14272桿狀病毒基因體。 E172. 如實施例E35-E171中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中一或多個次基因體片段編碼AAV Rep蛋白質，例如Rep40、Rep52、Rep68、Rep78或其組合。 E173. 如實施例E107-E172中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中一或多個次片段編碼AAV Rep蛋白質，例如Rep40、Rep52、Rep68、Rep78或其組合。 E174. 如實施例E35-E173中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中一或多個次基因體片段或次片段編碼Rep78蛋白質及/或Rep52蛋白質。 E175. 如實施例E35-E174中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中一或多個次基因體片段或次片段編碼AAV衣殼蛋白質，例如VP1蛋白質、VP2蛋白質、VP3蛋白質或其組合。 E176. 如實施例E35-E175中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中一或多個次基因體片段或次片段編碼AAV1衣殼蛋白質、AAV2衣殼蛋白質、AAV3衣殼蛋白質、AAV4衣殼蛋白質、AAV5衣殼蛋白質、AAV6衣殼蛋白質、AAV8衣殼蛋白質、AAV9衣殼蛋白質、AAVrh10衣殼蛋白質或其變異體。 E177. 如實施例E35-E176中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中一或多個次基因體片段或次片段編碼AAV5衣殼蛋白質或其變異體，或AAV9衣殼蛋白質或其變異體。 E178. 如實施例E35-E177中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中一或多個次基因體片段或次片段編碼有效負載。 E179. 如實施例E178中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中經編碼之有效負載係選自治療性蛋白質或其功能性變異體；抗體或抗體片段；酶；基因編輯系統之組分；RNAi試劑(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)；或其組合。 E180. 如實施例E1-E179中任一項之桿狀病毒表現構築體，其能夠產生至少70% (例如，至少80%、至少90%、至少100%、至少110%、至少120%、70-200%、70-150%、70-100%、80-200%、80-150%、80-100%、90-200%、90-150%、90-100%、100-200%、100-150%、100-125%、100-110%、125-200%、150-200%或175-200%)之由參考桿狀病毒基因體(例如，野生型桿狀病毒基因體)產生之桿狀病毒。 E181. 一種複數個片段，例如次基因體片段或次片段，其中各片段包含： (i) 獨有的5'突出物及獨有的3'突出物；及 (ii) 變異型桿狀病毒核苷酸序列，其所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少5個，其中除獨有的5'突出物及獨有的3'突出物處係單股以外，各片段係雙股的。 E182. 如實施例E181之複數個片段，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列中所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個或60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個。 E183. 如實施例E181或E182之複數個片段，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列中所包含之： (i) II型限制酶，例如所選擇的II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個；或 (ii) 兩個或更多個(例如，2-5個、2個、3個、4個或5個)所選擇的II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個。 E184. 如實施例E181-E183中任一項之複數個片段，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列中所包含之功能性IIS型限制酶位點(例如，天然存在之功能性IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個。 E185. 如實施例E181-E184中任一項之複數個片段，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列中所包含之： (i) 所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個；或 (ii) 兩個或更多個(例如，2-5個、2個、3個、4個或5個)所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個。 E186. 如實施例E181-E185中任一項之複數個片段，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不包含： (i) 兩個或更多個(例如，2個、3個、4個或5個)所選擇的II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)； (ii) 所選擇的II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)；或 (iii) II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。 E187. 如實施例E181-E186中任一項之複數個片段，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不包含所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。 E188. 如實施例E181-E187中任一項之複數個片段，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不包含兩個或更多個(例如，2個、3個、4個或5個)所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。 E189. 如實施例E181-E188中任一項之複數個片段，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不包含IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。 E190. 如實施例E181-E189中任一項之複數個片段，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不含： (i) 所選擇的II型限制酶之識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)； (ii) 1-5個(例如，1-4個、1-3個、1-2個、1個、2個、3個、4個或5個)所選擇的II型限制酶之識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)；或 (iii) II型限制酶之識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。 E191. 如實施例E181-E190中任一項之複數個片段，其中該等IIS型限制酶位點係所選擇的IIS型限制酶之識別位點。 E192. 如實施例E181-E191中任一項之複數個片段，其中該等IIS型限制酶位點係兩個或更多個(例如，2個、3個、4個或5個)所選擇的IIS型限制酶之識別位點。 E193. 如實施例E181-E192中任一項之複數個片段，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不含所選擇的IIS型限制酶之識別位點。 E194. 如實施例E181-E193中任一項之複數個片段，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不含兩個或更多個(例如，2-5個、2個、3個、4個或5個)所選擇的IIS型限制酶之識別位點。 E195. 如實施例E181-E194中任一項之複數個片段，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不含IIS型限制酶位點。 E196. 如實施例E181-E195中任一項之複數個片段，其中限制酶位點係由具有以下特性中之一者、兩者、三者、四者或全部之限制酶識別： (i) 在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物； (ii) 由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對； (iii) 在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物； (iv) 可熱不活化；及/或 (v) 識別具有至少4-8個鹼基對，例如至少4個鹼基對、至少5個鹼基對、至少6個鹼基對、至少7個鹼基對或至少8個鹼基對(例如，8個鹼基對)之延伸部分。 E197. 如實施例E181-E196中任一項之複數個片段，其中該限制酶位點係II型限制酶位點。 E198. 如實施例E181-E197中任一項之複數個片段，其中該限制酶位點限制酶係由能夠用於Gibson Assembly™選殖及接合方法(例如，Gibson等人, 「Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases」, Nat. Methods, 2009, 6(5):343-5中所描述之方法；其內容以全文引用之方式併入本文中)之限制酶，例如吉布森組裝相容酶識別。 E199. 如實施例E181-E198中任一項之複數個片段，其中該限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E200. 如實施例E181-E199中任一項之複數個片段，其中該限制酶位點係IIS型限制酶位點。 E201. 如實施例E181-E200中任一項之複數個片段，其中該IIS型限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E202. 如實施例E181-E201中任一項之複數個片段，其中該IIS型限制酶位點係BsmBI限制酶位點、BsaI限制酶位點、PaqCI限制酶位點或其組合。 E203. 如實施例E181-E202中任一項之複數個片段，其中該IIS型限制酶位點係BsmBI限制酶位點。 E204. 如實施例E181-E203中任一項之複數個片段，其中該限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E205. 如實施例E181-E204中任一項之複數個片段，其中限制酶位點係由以下識別：AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E206. 如實施例E181-E205中任一項之複數個片段，其中該限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E207. 如實施例E181-E205中任一項之複數個片段，其中該限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E208. 如實施例E181-E207中任一項之複數個片段，其中減少的至少5個功能性IIS型限制酶位點中之至少一個、兩個、三個、四個或更多個係不同的IIS型限制酶位點，例如第一IIS型限制酶位點及第二IIS型限制酶位點，視情況其中： (i) 該第一IIS型限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶；及 (ii) 該第二IIS型限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E209. 如實施例E181-E208中任一項之複數個片段，其中各片段相對於該複數個片段中之其他片段包含不同的5'突出物及/或3'突出物。 E210. 如實施例E181-E209中任一項之複數個片段，其中各片段能夠基於一個片段中之獨有的5'突出物與另一片段中之獨有的3'突出物之互補性而有序地組裝。 E211. 如實施例E181-E210中任一項之複數個片段，其中該複數個片段中之一者之獨有的5'突出物與該複數個片段中之另一者之獨有的3'突出物互補。 E212. 如實施例E181-E211中任一項之複數個片段，其中該獨有的5'突出物與該獨有的3'突出物部分互補或完全互補。 E213. 如實施例E181-E212中任一項之複數個片段，其中該複數個片段中之各者在5'端處包含核苷酸序列，其與該複數個片段中之另一者之3'端處的核苷酸序列重疊(例如，同源)，其中重疊區域係一對片段獨有的。 E214. 如實施例E181-E213中任一項之複數個片段，其中該複數個片段能夠基於一個片段(例如，次基因體片段或次片段)之5'端處的核苷酸序列與另一片段(例如，次基因體片段或次片段)之3'端處的核苷酸序列之重疊而有序地組裝，以產生變異型桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體。 E215. 如實施例E181-E214中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該等片段之間的核苷酸序列之重疊係4-50個(例如，4-45個、4-40個、4-35個、4-30個、4-25個、4-20個、4-15個、4-10個、10-50個、10-45個、10-40個、10-35個、10-30個、10-25個、10-20個、10-15個、15-50個、15-45個、15-40個、15-35個、15-30個、15-25個、15-20個、20-50個、20-45個、20-40個、20-35個、20-30個、20-25個、25-50個、25-45個、25-40個、25-35個、25-30個、30-50個、30-45個、30-40個、30-35個、35-50個、35-45個、35-40個、40-50個、40-45個)相鄰鹼基對。 E216. 如實施例E181-E215中任一項之複數個片段，其中獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係由限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)進行之片段之裂解產生。 E217. 如實施例E181-E216中任一項之複數個片段，其中獨有的5'及3'突出物之長度各自獨立地包含1-6個核苷酸，例如2-5個核苷酸(例如，4個核苷酸)。 E218. 如實施例E181-E217中任一項之複數個片段，其中獨有的5'及3'突出物各自獨立地包含4個核苷酸。 E219. 如實施例E181-E218中任一項之複數個片段，其中片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係各自獨立地選自：ACAA、GGTC、GACC、CCAG、CTGG、CCTT、AAGG、TCAT、ATGA、TCGC、GCGA、AGAG、CTCT、AACT、AGTT、CGGT、ACCG、ATAC、GTAT、GAGT、ACTC、TTCC、GGAA、ATTA、TAAT、TCCT、AGGA、TCTA、TAGA、TGTA、TACA、GATG、CATC或TTGT，其中片段中之獨有的5'突出物及3'突出物之序列係不同的。 E220. 如實施例E181-E219中任一項之複數個片段，其中： (i) 該等次基因體片段係由第一限制酶，例如第一II型限制酶(例如，第一IIS型限制酶)進行之裂解產生；及/或 (ii) 該等次片段係由第二限制酶，例如第二II型限制酶(例如，第二IIS型限制酶)進行之裂解產生；其中該第一限制酶，例如第一II型限制酶(例如，第一IIS型限制酶)與該第二限制酶，例如第二II型限制酶(例如，第二IIS型限制酶)不同。 E221. 如實施例E181-E220中任一項之複數個片段，其中該複數個片段中之各者，例如次片段之長度在50-1000 bp之間，例如約50-900、50-800、50-700、50-600、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、100-900、100-800、100-700、100-600、100-500、100-400、100-300、100-200、200-1000、200-900、200-800、200-700、200-600、200-500、200-400、200-300、400-1000、400-900、400-800、400-700、400-600、400-500、600-1000、600-900、600-800、600-700、800-1000、800-900或900-1000 bp (例如，100-800 bp、約250-750 bp、約400-600 bp或約500 bp)。 E222. 如實施例E181-E221中任一項之複數個片段，其中該複數個片段中之各者，例如次基因體片段之長度在100-25000 bp之間(例如，長度係約100-1000 bp、約100-10000 bp、約100-20000 bp、約100-25000 bp、約1000-10000 bp、約1000-8000 bp、約1000-5000 bp、約1000-2500 bp、約2500-25000 bp、約2500-20000 bp、約2500-15000 bp、約2500-10000 bp、約2500-5000 bp、約5000-25000 bp、約5000-20000 bp、約5000-15000 bp、約5000-10000 bp、約7500-25000 bp、約7500-20000、約7500-15000 bp、約7500-10000 bp、約10000-25000 bp、約10000-20000 bp、約10000-15000 bp、約15000-25000 bp、約15000-20000 bp、約20000-25000 bp、約7000-9000 bp或約8000 bp)。 E223. 如實施例E181-E222中任一項之複數個片段，其中該複數個片段中之一或多者(例如，次基因體片段)位於第一承載載體中。 E224. 如實施例E223之複數個片段，其中該一或多個片段(例如，次基因體片段)中之各者位於分開的第一承載載體中。 E225. 如實施例E181-E222中任一項之複數個片段，其中該複數個片段中之一或多者(例如，次片段)位於第二承載載體中。 E226. 如實施例E225之複數個片段，其中該一或多個片段(例如，次片段)中之各者位於分開的第二承載載體中。 E227. 如實施例E223或E224之複數個片段，其中該一或多個片段(例如，次基因體片段)中之各者係使用相同的限制酶，例如相同的II型限制酶(例如，IIS型限制酶)由第一承載載體或分開的第一承載載體產生。 E228. 如實施例E225或E226之複數個片段，其中該一或多個片段(例如，次片段)中之各者係使用相同的限制酶，例如相同的II型限制酶(例如，相同的IIS型限制酶)由第二承載載體或分開的第二承載載體產生，其中該相同的限制酶與用於由第一承載載體或分開的第一承載載體產生片段之限制酶不同。 E229. 如實施例E220-E228中任一項之複數個片段，其中該限制酶、該第一限制酶及/或該第二限制酶中之一者、兩者、三者或全部包含以下特性中之一者、兩者、三者、四者或全部： (i) 在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物； (ii) 由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對； (iii) 在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物； (iv) 可熱不活化；及/或 (v) 識別具有至少4-8個鹼基對，例如至少4個鹼基對、至少5個鹼基對、至少6個鹼基對、至少7個鹼基對或至少8個鹼基對(例如，8個鹼基對)之延伸部分。 E230. 如實施例E220-E229中任一項之複數個片段，其中該限制酶、該第一限制酶及/或該第二限制酶係II型限制酶。 E231. 如實施例E220-E230中任一項之複數個片段，其中該限制酶、該第一限制酶及/或該第二限制酶係能夠用於Gibson Assembly™選殖及接合方法(例如，Gibson等人, 「Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases」, Nat. Methods, 2009, 6(5):343-5中所描述之方法；其內容以全文引用之方式併入本文中)之限制酶，例如吉布森組裝相容酶。 E232. 如實施例E220-E231中任一項之複數個片段，其中該限制酶、該第一限制酶及/或該第二限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E233. 如實施例E220-E232中任一項之複數個片段，其中該限制酶、該第一限制酶及/或該第二限制酶係IIS型限制酶。 E234. 如實施例E233之複數個片段，其中該IIS型限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E235. 如實施例E233或E234之複數個片段，其中該IIS型限制酶係BsaI限制酶、BsmBI限制酶、PaqCI限制酶或其組合。 E236. 如實施例E220-E235中任一項之複數個片段，其中： (i) 該第一限制酶係BsmBI且該第二限制酶係BsaI；或 (ii) 該第一限制酶係BsaI且該第二限制酶係BsmBI。 E237. 如實施例E220-E236中任一項之複數個片段，其中該限制酶、該第一限制酶及/或該第二限制酶係選自：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E238. 如實施例E220-E237中任一項之複數個片段，其中該限制酶、該第一限制酶及/或該第二限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E239. 如實施例E220-E238中任一項之複數個片段，其中該限制酶、該第一限制酶及/或該第二限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E240. 如實施例E220-E239中任一項之複數個片段，其中該限制酶、該第一限制酶及/或該第二限制酶係AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E241. 如實施例E181-E240中任一項之複數個片段，其中該複數個片段中之一或多者之變異型桿狀病毒核苷酸序列包含修飾，例如插入、缺失或取代。 E242. 如實施例E241之複數個片段，其中該修飾，例如插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變)位於非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)或非必需基因之調節區中(例如，啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入)。 E243. 如實施例E242之複數個片段，其中該非必需基因係選自以下中之一者、兩者、三者或更多者(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21者)：egt、p74 (PIF0)、p26、SOD、ChiA、v-cath、p10、多角體蛋白、ctx、odv-e56、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94。 E244. 如實施例E243之複數個片段，其包含以下中之修飾，例如插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變)： (i) v-cath及egt； (ii) v-cath、egt及SOD； (iii) chiA、v-cath、egt、p26、p10及p74； (iv) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74及SOD；或 (v) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74、SOD、AcORF-91及AcORF-108。 E245. 如實施例E241-E244中任一項之複數個片段，其中該修飾包含chiA基因、v-cath基因、p26基因、p10基因及/或p74基因或其一部分之缺失。 E246. 如實施例E242-E245中任一項之複數個片段，其中該修飾包含非必需基因或相鄰區域中之異源序列之插入。 E247. 如實施例E242-E246中任一項之複數個片段，其中該修飾包含非必需基因或相鄰區域中之一或多個突變。 E248. 如實施例E242-E247中任一項之複數個片段，其中該等非必需基因位於同源重複序列區5 (hr5)附近(例如，下游或上游)。 E249. 如實施例E241-E248中任一項之複數個片段，其中該修飾，例如插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變)引起非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)或非必需基因之調節區之不活化(例如，啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入)。 E250. 如實施例E181-E249之複數個片段，其中該複數個片段中之一或多者之變異型桿狀病毒核苷酸序列包含非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)或非必需基因之調節區之破壞，例如突變(例如，框移突變)、缺失、插入或不活化(例如，啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入)。 E251. 如實施例E241-E250中任一項之複數個片段，其中藉由化學合成或PCR，例如基於PCR之定點突變誘發來引入修飾。 E252. 如實施例E181-E251中任一項之複數個片段，其中該複數個片段中之一或多者包含異源核苷酸序列。 E253. 如實施例E252之複數個片段，其中該異源核苷酸序列包含所關注的序列(例如，編碼Rep編碼區、一或多個Rep蛋白質、VP編碼區、一或多個VP蛋白質及/或有效負載之核苷酸序列)。 E254. 如實施例E253之複數個片段，其中該所關注的序列係編碼所關注的多肽之核苷酸序列或所關注的核苷酸序列。 E255. 如實施例E253或E254之複數個片段，其中該所關注的序列可操作地連接至第一啟動子(例如，桿狀病毒早期啟動子或桿狀病毒早期-晚期啟動子)及/或第二啟動子(例如，桿狀病毒晚期啟動子或桿狀病毒極晚期啟動子)。 E256. 如實施例E253-E255之複數個片段，其中該所關注的序列可操作地連接至第一啟動子(例如，桿狀病毒早期啟動子或桿狀病毒早期-晚期啟動子)及/或第二啟動子(例如，桿狀病毒晚期啟動子或桿狀病毒極晚期啟動子)。 E257. 如實施例E255或E256之複數個片段，其中第一及/或第二啟動子係選自桿狀病毒啟動子、病毒啟動子、昆蟲病毒啟動子、非昆蟲病毒啟動子、脊椎動物病毒啟動子、來自一或多個物種之包括病毒及非病毒元件之嵌合啟動子、合成啟動子或其變異體。 E258. 如實施例E255-E257中任一項之複數個片段，其中第一及/或第二啟動子係選自polh啟動子、p10啟動子、ctx啟動子、gp64啟動子、IE啟動子、IE-1啟動子、p6.9啟動子、Dmhsp70啟動子、Hsp70啟動子、p5啟動子、p19啟動子、p35啟動子、p40啟動子或其變異體，例如功能性片段。 E259. 如實施例E255-E258中任一項之複數個片段，其中第一及/或第二啟動子係選自桿狀病毒早期啟動子、桿狀病毒晚期啟動子、桿狀病毒早期-晚期啟動子或桿狀病毒極晚期啟動子。 E260. 如實施例E255-E259中任一項之複數個片段，其中第一及/或第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子、桿狀病毒晚期啟動子或桿狀病毒早期-晚期啟動子。 E261. 如實施例E255-E260中任一項之複數個片段，其中第一及/或第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子(例如，gp64啟動子)。 E262. 如實施例E255-E261中任一項之複數個片段，其中第一或第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子(例如，polh啟動子)。 E263. 如實施例E255-E262中任一項之複數個片段，其中： (a) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子， (b) 該第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子， (c) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子， (d) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (e) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子， (f) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (g) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子， (h) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子， (i) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子， (j) 該第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子， (k) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子， (l) 該第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (m) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (n) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子，或 (o) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子。 E264. 如實施例E255-E263中任一項之複數個片段，其中第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子(例如，gp64啟動子)且第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子(例如，polh啟動子)。 E265. 如實施例E255-E264中任一項之複數個片段，其中第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子。 E266. 如實施例E255-E265中任一項之複數個片段，其中 (a) 該桿狀病毒早期啟動子係選自：lef3啟動子、dbp啟動子、p35啟動子、orf82啟動子、get啟動子、orf81啟動子、orf122啟動子、pk-2啟動子、orf55啟動子、etl啟動子、hcf-1啟動子、etm啟動子、lef-2啟動子、lef-6啟動子、orf84啟動子、orf118啟動子或orf111啟動子， (b) 該桿狀病毒早期-晚期啟動子係選自：lef2啟動子、orf13啟動子、orf23啟動子、pkip啟動子、v-fgf啟動子、pp31啟動子、odv-e66啟動子、orf74啟動子、orf79啟動子、orf82啟動子、p15啟動子、cg30啟動子、解螺旋酶啟動子、he65啟動子、orf114啟動子、pk-2啟動子、gp64啟動子、gp16啟動子、alk-exo啟動子、p35啟動子、me53啟動子或ie0啟動子， (c) 該桿狀病毒晚期啟動子係選自：ptpase啟動子、Ac-bro啟動子、ctx啟動子、orf5啟動子、orf19啟動子、orf20啟動子、sod啟動子、HisP啟動子、orf34啟動子、v-ubi啟動子、orf38啟動子、orf43啟動子、orf44啟動子、orf56啟動子、orf59啟動子、orf60啟動子或fp-25k啟動子，及/或 (d) 該桿狀病毒極晚期啟動子係選自p10啟動子或polh啟動子。 E267. 如實施例E255-E266中任一項之複數個片段，其中第一及/或第二啟動子包含TATA盒模體及/或CAGT模體。 E268. 如實施例E255-E267中任一項之複數個片段，其中第一及/或第二啟動子包含TAAG模體(例如，ATAAG核苷酸序列)。 E269. 如實施例E255-E268中任一項之複數個片段，其中第一及/或第二啟動子包含TATA盒模體及TAAG模體。 E270. 如實施例E255-E269中任一項之複數個片段，其中第一或第二啟動子包含VLF-1之結合位點。 E271. 如實施例E255-E270中任一項之複數個片段，其中第一或第二啟動子係gp64啟動子(例如，OpMNPV gp64啟動子)。 E272. 如實施例E255-E271中任一項之複數個片段，其中第一或第二啟動子係polh啟動子(例如，OpMNPV polh啟動子或AcMNPV polh啟動子)。 E273. 如實施例E255-E272中任一項之複數個片段，其中第一啟動子係gp64啟動子且第二啟動子係polh啟動子，或其中第一啟動子係polh啟動子且第二啟動子係gp64啟動子。 E274. 如實施例E255-E273中任一項之複數個片段，其中Rep編碼區可操作地連接至第一啟動子(其係桿狀病毒早期-晚期啟動子)及第二啟動子(其係桿狀病毒極晚期啟動子)，例如gp64啟動子及polh啟動子，視情況其中Rep編碼區位於同源重複序列區hr5之下游。 E275. 如實施例E255-E274中任一項之複數個片段，其中第一啟動子係gp64啟動子且第二啟動子係polh啟動子。 E276. 如實施例E255-E263或E266-E272之複數個片段，其中第一啟動子及第二啟動子係相同的。 E277. 如實施例E255-E275之複數個片段，其中第一啟動子及第二啟動子係不同的。 E278. 如實施例E277之複數個片段，第一啟動子及第二啟動子各自為polh啟動子。 E279. 如實施例E258-E277之複數個片段，其中gp64啟動子包含SEQ ID NO:217之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E280. 如實施例E258-E278之複數個片段，其中polh啟動子包含SEQ ID NO:167或220之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:167或220包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:167或220包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E281. 如實施例E258-E277中任一項之複數個片段，其中第一啟動子及第二啟動子包含SEQ ID NO:221之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:221包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:221包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E282. 如實施例E253-E282中任一項之複數個片段，其中該所關注的序列編碼治療性蛋白質或其功能性變異體、抗體或抗體片段；酶；基因編輯系統之組分；RNAi試劑(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)；或其組合。 E283. 如實施例E181-E282中任一項之複數個片段，其中該複數個片段中之一或多者(例如，次基因體片段或次片段)編碼一或多個AAV蛋白質。 E284. 如實施例E181-E283中任一項之複數個片段，其中該複數個片段中之一或多者(例如，次基因體片段或次片段)編碼AAV Rep蛋白質，例如Rep40、Rep52、Rep68、Rep78或其組合。 E285. 如實施例E181-E284中任一項之複數個片段，其中該複數個片段中之一或多者(例如，次基因體片段或次片段)編碼Rep78蛋白質及/或Rep52蛋白質。 E286. 如實施例E181-E285中任一項之複數個片段，其中該複數個片段中之一或多者(例如，次基因體片段或次片段)編碼AAV衣殼蛋白質，例如VP1蛋白質、VP2蛋白質、VP3蛋白質或其組合。 E287. 如實施例E181-E286中任一項之複數個片段，其中該複數個片段中之一或多者(次基因體片段或次片段)編碼AAV1衣殼蛋白質、AAV2衣殼蛋白質、AAV3衣殼蛋白質、AAV4衣殼蛋白質、AAV5衣殼蛋白質、AAV6衣殼蛋白質、AAV8衣殼蛋白質、AAV9衣殼蛋白質、AAVrh10衣殼蛋白質或其變異體。 E288. 如實施例E181-E287中任一項之複數個片段，其中該複數個片段中之一或多者(例如，次基因體片段或次片段)編碼AAV5衣殼蛋白質或其變異體，或AAV9衣殼蛋白質或其變異體。 E289. 如實施例E181-E288中任一項之複數個片段，其中該複數個片段中之一或多者(例如，次基因體片段或次片段)編碼有效負載。 E290. 如實施例E289之複數個片段，其中經編碼之有效負載係選自治療性蛋白質或其功能性變異體；抗體或抗體片段；酶；基因編輯系統之組分；RNAi試劑(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)；或其組合。 E291. 如實施例E181-E290中任一項之複數個片段，其中該複數個片段中之一或多者(例如，次基因體區域或次片段)係化學合成的或係非模板化片段。 E292. 一種變異型桿狀病毒基因體，其所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體，例如野生型桿狀病毒基因體少至少5個，視情況其中該桿狀病毒表現構築體係複製勝任型。 E293. 如實施例E292之變異型桿狀病毒基因體，其所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個。 E294. 如實施例E292或E293之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列中所包含之： (i) II型限制酶，例如所選擇的II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個；或 (ii) 兩個或更多個(例如，2-5個、2個、3個、4個或5個)所選擇的II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個。 E295. 如實施例E292-E294中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列中所包含之功能性IIS型限制酶位點(例如，天然存在之功能性IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個。 E296. 如實施例E292-E295中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列中所包含之： (i) 所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個；或 (ii) 兩個或更多個(例如，2-5個、2個、3個、4個或5個)所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個。 E297. 如實施例E292-E296中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不包含： (i) 兩個或更多個(例如，2個、3個、4個或5個)所選擇的II型限制酶，例如所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)； (ii) 所選擇的II型限制酶，例如所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)；或 (iii) II型限制酶，例如所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。 E298. 如實施例E292-E297中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不含： (i) 所選擇的II型限制酶之識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)； (ii) 1-5個(例如，1-4個、1-3個、1-2個、1個、2個、3個、4個或5個)所選擇的II型限制酶之識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)；或 (iii) II型限制酶之識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。 E299. 如實施例E292-E298之變異型桿狀病毒基因體，其中該等限制酶位點係所選擇的IIS型限制酶之識別位點。 E300. 如實施例E292-E299中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該等IIS型限制酶位點係兩個或更多個(例如，2個、3個、4個或5個)所選擇的IIS型限制酶之識別位點。 E301. 如實施例E292-E300中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不含所選擇的IIS型限制酶之識別位點。 E302. 如實施例E292-E301中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不含兩個或更多個(例如，2-5個、2個、3個、4個或5個)所選擇的IIS型限制酶之識別位點。 E303. 如實施例E292-E302中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不含IIS型限制酶位點。 E304. 如實施例E292-E303中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中限制酶位點係由具有以下特性中之一者、兩者、三者、四者或全部之限制酶識別： (i) 在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物； (ii) 由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對； (iii) 在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物； (iv) 可熱不活化； (v) 識別具有至少4-8個鹼基對，例如至少4個鹼基對、至少5個鹼基對、至少6個鹼基對、至少7個鹼基對或至少8個鹼基對(例如，8個鹼基對)之延伸部分。 E305. 如E292-E304中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該限制酶位點係II型限制酶位點。 E306. 如實施例E292-E305中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該限制酶位點係由能夠用於Gibson Assembly™選殖及接合方法(例如，Gibson等人, 「Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases」, Nat. Methods, 2009, 6(5):343-5中所描述之方法；其內容以全文引用之方式併入本文中)之限制酶，例如吉布森組裝相容酶識別。 E307. 如實施例E292-E306中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E308. 如實施例E292-E307中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該限制酶位點係IIS型限制酶位點。 E309. 如實施例E292-E308中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該IIS型限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E310. 如實施例E292-E309中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該IIS型限制酶位點係BsmBI限制酶位點、BsaI限制酶位點、PaqCI限制酶位點或其組合。 E311. 如實施例E292-E310中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該IIS型限制酶位點係BsmBI限制酶位點。 E312. 如實施例E292-E311中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E313. 如實施例E202-E312中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該限制酶位點係由以下識別：AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E314. 如實施例E292-E313中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E315. 如實施例E292-E313中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E316. 如實施例E292-E315中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中減少的至少5個功能性IIS型限制酶位點中之至少一個、兩個、三個、四個或更多個係不同的IIS型限制酶位點，例如第一IIS型限制酶位點及第二IIS型限制酶位點，視情況其中： (i) 該第一IIS型限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶；及 (ii) 該第二IIS型限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E317. 如實施例E292-E316中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中減少的至少5個功能性IIS型限制酶位點係相同的IIS型限制酶位點，例如第一IIS型限制酶位點。 E318. 如實施例E292-E317中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中減少的至少5個功能性IIS型限制酶位點中之至少一個、兩個、三個、四個或更多個係不同的IIS型限制酶位點，例如第一IIS型限制酶位點及第二IIS型限制酶位點。 E319. 如實施例E292-E318中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒基因體中所包含之功能性第一II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點，例如BsaI II型限制酶位點)比第二II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點，例如BsmBI II型限制酶位點)少至少3、4或5倍。 E320. 如實施例E292-E319中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒基因體中所包含之功能性第二II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點，例如BsmBI II型限制酶位點)比第一II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點，例如BsaI II型限制酶位點)多至少3、4或5倍。 E321. 如實施例E292-E320中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒基因體中所包含之： (i) 功能性BsaI II型限制酶位點少至少10-15個(例如，10-12個、10-13個、10-14個、11-15個、11-15個、11-13個、12-15個、12-14個、10個、11個、12個、13個、14個或15個)；及/或 (ii) 功能性BsmBI II型限制酶位點少至少40-50個(例如，40-45個、41-50個、41-45個、42-50個、42-45個、43-50個、43-45個、44-50個、45-50個、46-50個、47-50個、48-50個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個或50個)。 E322. 如實施例E292-E321中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒基因體中所包含之功能性BsaI II型限制酶位點減少11個及/或功能性BsmBI II型限制酶位點減少45個。 E323. 如實施例E292-E322中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該限制位點，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)包含使得該位點不活化或不能由相應限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)識別之修飾，例如插入、缺失或取代。 E324. 如實施例E292-E323中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該限制位點，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)相對於相應功能性限制位點，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個修飾，例如插入、缺失或取代。 E325. 如實施例E292-E324中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該限制位點，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)包含修飾，例如取代，其中該修飾包含來自不同的天然存在之桿狀病毒基因體序列(例如，相同屬的不同桿狀病毒物種)之核苷酸。 E326. 如實施例E292-E325中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該限制位點，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)相對於相應功能性限制位點，例如II型限制酶位點，(例如，IIS型限制酶位點)包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個不同核苷酸。 E327. 如實施例E292-E326中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該限制位點，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)相對於相應功能性限制位點，例如II型限制酶位點，(例如，IIS型限制酶位點)包含不同核苷酸，其中該不同核苷酸係來自不同的天然存在之桿狀病毒基因體序列。 E328. 如實施例E292-E327中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒基因體包含來自選自以下之桿狀病毒基因體之核苷酸序列或其一部分：苜蓿銀紋夜蛾多核多角體病毒(AcMNPV) (例如，AcMNPV病毒株E2、C6或HR3)、家蠶核多角體病毒(BmNPV)、黎豆夜蛾核多角體病毒(AgMNPV)、花旗松毒蛾核多角體病毒(OpMNPV)或弧金翅夜蛾核多角體病毒(ThorMNPV)。 E329. 如實施例E292-E38中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒基因體包含來自AcMNPV (例如，AcMNPV E2)桿狀病毒基因體之核苷酸序列或其一部分。 E330. 如實施例E292-E329中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該不同的天然存在之桿狀病毒基因體序列包含來自BmNPV桿狀病毒基因體或ThorMNPV桿狀病毒基因體之核苷酸序列或其一部分。 E331. 如實施例E292-E330中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該IIS型限制酶位點係不存在或缺失的。 E332. 如實施例E292-E331中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該參考桿狀病毒基因體係野生型桿狀病毒基因體或經修飾之桿狀病毒基因體，例如具有至少一個非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)之缺失，例如具有多角體蛋白(polh)基因座之缺失之桿狀病毒基因體。 E333. 如實施例E292-E332中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該參考桿狀病毒基因體係bMON14272桿狀病毒基因體。 E334. 如實施例E292-E333中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中藉由化學合成或PCR，例如基於PCR之定點突變誘發來引入修飾。 E335. 如實施例E292-E334中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸基因體包含非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)或非必需基因之調節區之破壞，例如插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變) (例如，啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入)。 E336. 如實施例E292-E335中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒基因體包含至少1、2、3、4、5、10、15或20個非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)之破壞，例如突變(例如，框移突變)、缺失、插入或不活化。 E337. 如實施例E335或E336之變異型桿狀病毒基因體，其中該非必需基因係選自以下中之一者、兩者、三者或更多者(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21者)：egt、p74 (PIF0)、p26、SOD、ChiA、v-cath、p10、多角體蛋白、ctx、odv-e56、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94。 E338. 如實施例E337之變異型桿狀病毒基因體，其包含以下中之修飾，例如插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變)： (i) v-cath及egt； (ii) v-cath、egt及SOD； (iii) chiA、v-cath、egt、p26、p10及p74； (iv) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74及SOD；或 (v) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74、SOD、AcORF-91及AcORF-108。 E339. 如實施例E332-E338中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該修飾chiA基因、v-cath基因、p26基因、p10基因及/或p74基因或其一部分之缺失。 E340. 如實施例E332-E339中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該修飾包含非必需基因或相鄰區域中之異源序列之插入。 E341. 如實施例E332-E340中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該修飾包含非必需基因或相鄰區域中之一或多個突變。 E342. 如實施例E332-E341中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該等非必需基因位於同源重複序列區5 (hr5)附近(例如，下游或上游)。 E343. 如實施例E335-E342中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該破壞，例如突變(例如，框移突變)、缺失、插入或不活化引起非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)或非必需基因之調節區之不活化(例如，啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入)。 E344. 如實施例E335-E343中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中藉由化學合成或PCR，例如基於PCR之定點突變誘發來引入破壞。 E345. 如實施例E292-E344中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中變異型桿狀病毒基因體包含異源核苷酸。 E346. 如實施例E345之變異型桿狀病毒基因體，其中該異源核苷酸序列包含所關注的序列。 E347. 如實施例E346之變異型桿狀病毒基因體，其中該所關注的序列係編碼所關注的多肽之核苷酸序列或所關注的核苷酸序列。 E348. 如實施例E345或E346之變異型桿狀病毒基因體，其中該所關注的序列編碼治療性蛋白質或其功能性變異體、抗體或抗體片段；酶；基因編輯系統之組分；RNAi試劑(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)；或其組合。 E349. 如實施例E292-E348中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒基因體編碼一或多種AAV蛋白質。 E350. 如實施例E292-E349中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒基因體編碼AAV Rep蛋白質，例如Rep40、Rep52、Rep68、Rep78或其組合。 E351. 如實施例E292-E350中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒基因體編碼Rep78蛋白質及/或Rep52蛋白質。 E352. 如實施例E292-E351中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒基因體編碼AAV衣殼蛋白質，例如VP1蛋白質、VP2蛋白質、VP3蛋白質或其組合。 E353. 如實施例E292-E352中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒基因體編碼AAV1衣殼蛋白質、AAV2衣殼蛋白質、AAV3衣殼蛋白質、AAV4衣殼蛋白質、AAV5衣殼蛋白質、AAV6衣殼蛋白質、AAV8衣殼蛋白質、AAV9衣殼蛋白質、AAVrh10衣殼蛋白質或其變異體。 E354. 如實施例E292-E353中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒基因體編碼AAV5衣殼蛋白質或其變異體，或AAV9衣殼蛋白質或其變異體。 E355. 如實施例E292-E354中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒基因體編碼有效負載。 E356. 如實施例E355之變異型桿狀病毒基因體，其中該經編碼之有效負載係選自治療性蛋白質或其功能性變異體；抗體或抗體片段；酶；基因編輯系統之組分；RNAi試劑(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)；或其組合。 E357. 如實施例E292-E357中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其進一步包含AAV表現構築體。 E358. 如實施例E357之變異型桿狀病毒基因體，其中該AAV表現構築體包含： (i) 至少兩個Rep編碼區，其各自包含編碼獨立地選自以下之Rep蛋白質之核苷酸序列：Rep52、Rep40、Rep68或Rep78蛋白質，例如Rep52蛋白質及Rep78蛋白質；及/或 (ii) VP編碼區，其包含編碼至少一個、兩個或三個選自以下之VP蛋白質之核苷酸序列：VP1蛋白質、VP2蛋白質、VP3蛋白質或其組合，視情況地，其中該至少兩個Rep編碼區各自包含不同的核苷酸序列及/或位於不同位置。 E359. 如實施例E357之變異型桿狀病毒基因體，其中該AAV表現構築體包含： (i) Rep編碼區，其包含編碼選自以下之Rep蛋白質之核苷酸序列：Rep52、Rep40、Rep68、Rep78蛋白質或其組合，例如Rep52蛋白質及/或Rep78蛋白質；及 (ii) VP編碼區，其包含編碼至少一個、兩個或三個選自以下之VP蛋白質之核苷酸序列：VP1蛋白質、VP2蛋白質、VP3蛋白質或其組合，其中該AAV表現構築體包含桿狀病毒基因體，例如變異型桿狀病毒基因體之至少一部分，該部分包含至少兩個非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)之破壞，其中該至少兩個非必需基因係獨立地選自egt、p74 (PIF0)、p26、SOD、ChiA、v-cath、p10、多角體蛋白、ctx、odv-e56、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94；及其中Rep編碼區可操作地連接至第一啟動子(例如桿狀病毒早期啟動子或桿狀病毒早期-晚期啟動子，例如gp64啟動子)及視情況選用之第二啟動子(例如桿狀病毒晚期或桿狀病毒極晚期啟動子，例如polh啟動子)，視情況其中： (a) 第一啟動子引起VP編碼區之轉錄之前的Rep編碼區之轉錄； (b) Rep編碼區位於同源重複序列區hr5之下游；及/或 (c) VP編碼區位於SOD基因座中。 E360. 如實施例E358或E359之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內。 E361. 如實施例E358或E360之變異型桿狀病毒基因體，其中該至少兩個Rep編碼區各自包含不同的核苷酸序列及位於變異型桿狀病毒基因體中之不同位置。 E362. 如實施例E358、E360或E361中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該至少兩個Rep編碼區包含第一Rep編碼區及第二Rep編碼區。 E363. 如實施例E362之變異型桿狀病毒基因體，其中第一Rep編碼區包含第一個第一開放閱讀框架(ORF)，其包含起始密碼子及編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列，且第二Rep編碼區包含第二ORF，其包含起始密碼子及編碼Rep52蛋白質之核苷酸序列。 E364. 如實施例E362或E363之變異型桿狀病毒基因體，其中第一Rep編碼區、第二Rep編碼區或其兩者包含ATG起始密碼子(例如，典型起始密碼子)。 E365. 如實施例E362或E363之變異型桿狀病毒基因體，其中第一Rep編碼區、第二Rep編碼區或其兩者包含ACG起始密碼子、CTG起始密碼子、TTG起始密碼子或GTG起始密碼子(例如，非典型起始密碼子)。 E366. 如實施例E359或E360中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區包含ATG起始密碼子。 E367. 如實施例E359、E360或E366中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區包含非典型起始密碼子。 E368. 如實施例E359、E360、E366或E367中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區包含ACG起始密碼子、CTG起始密碼子、TTG起始密碼子或GTG起始密碼子。 E369. 如實施例E359、E360或E366-E368中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區包含CTG起始密碼子。 E370. 如實施例E359、E360或E366-E369中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區包含ACG起始密碼子。 E371. 如實施例E359、E360或E366-E370中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區包含TTG起始密碼子。 E372. 如實施例E359、E360或E366-E371中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區包含GTG起始密碼子。 E373. 如實施例E359、E360或E366-E372中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中 (i) 編碼Rep78蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子且編碼Rep52蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子； (ii) 編碼Rep78蛋白質之ORF包含CTG起始密碼子且編碼Rep52蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子； (iii) 編碼Rep78蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子且編碼Rep52蛋白質之ORF包含CTG起始密碼子；或 (iv) 編碼Rep78蛋白質之ORF包含CTG起始密碼子且編碼Rep52蛋白質之ORF包含CTG起始密碼子。 E374. 如實施例E362-E365中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一Rep編碼區包含編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列。 E375. 如實施例E362-E365或E374中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一Rep編碼區包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質之核苷酸序列。 E376. 如實施例E362-E365、E374或E375中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一Rep編碼區包含僅編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列。 E377. 如實施例E362-E365或E374中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一Rep編碼區包含編碼Rep78蛋白質但不編碼Rep52蛋白質之核苷酸序列。 E378. 如實施例E362-E365或E374-E377中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二Rep編碼包含編碼Rep52蛋白質之核苷酸序列。 E379. 如實施例E362-E365或E374-E378中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二Rep編碼包含相對於Rep78蛋白質主要編碼Rep52蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep52蛋白質之核苷酸序列。 E380. 如實施例E362-E365或E374-E379中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二Rep編碼包含僅編碼Rep52蛋白質之核苷酸序列。 E381. 如實施例E362-E365或E374-E380中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二Rep編碼包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列。 E382. 如實施例E362-E365或E374-E381中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該第一Rep編碼區包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列；及 (ii) 該第二Rep編碼區包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列。 E383. 如實施例E359、E360或E366-E373中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區包含滿足以下條件之核苷酸序列： (i) 編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質； (ii) 相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質； (iii) 僅編碼Rep78蛋白質； (iv) 編碼Rep78蛋白質，但不編碼Rep52蛋白質； (v) 僅編碼Rep52蛋白質；或 (vi) 編碼Rep52蛋白質，但不編碼Rep78蛋白質。 E384. 如實施例E359、E360、E366-E373或E383中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之核苷酸序列，其中編碼Rep52蛋白質之核苷酸序列包含於編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列內。 E385. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383或E384中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之單一多順反子ORF。 E386. 如實施例E362-E365或E374-E382中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一Rep編碼區包含SEQ ID NO:201之核苷酸序列，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:201具有至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400或450個，但不超過500個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:201具有至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400或450個，但不超過500個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E387. 如實施例E362-E365、E374-E381或E386中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一Rep編碼區編碼SEQ ID NO:202之胺基酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列；相對於SEQ ID NO:202包含至少1、2、3、4、5、10、15或20個，但不超過30個不同胺基酸之胺基酸序列；或相對於SEQ ID NO:202之胺基酸序列包含至少1、2、3、4、5、10、15或20個，但不超過30個修飾(例如，取代(例如，保守性取代)、插入或缺失)之胺基酸序列。 E388. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386或E387中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二Rep編碼區包含SEQ ID NO:203之核苷酸序列，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:203具有至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400或450個，但不超過500個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:203具有至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400或450個，但不超過500個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E389. 如實施例E362-E365、E374-E381或E386-E388中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二Rep編碼區編碼SEQ ID NO:204之胺基酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列；相對於SEQ ID NO:204包含至少1、2、3、4、5、10、15或20個，但不超過30個不同胺基酸之胺基酸序列；或相對於SEQ ID NO:204包含至少1、2、3、4、5、10、15或20個，但不超過30個修飾(例如，取代(例如，保守性取代)、插入或缺失)之胺基酸序列。 E390. 如實施例E362-E365、E374-E381或E386-E389中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一Rep編碼區、第二Rep編碼區或其兩者之核苷酸序列針對昆蟲細胞，視情況地，草地黏蟲( Spodoptera frugiperda)昆蟲細胞(例如，Sf9昆蟲細胞)而經密碼子最佳化。 E391. 如實施例E359、E360、E366-E373或E383-E385中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區包含SEQ ID NO:201之核苷酸序列，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:201具有至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400或450個，但不超過500個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:201具有至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400或450個，但不超過500個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E392. 如實施例E359、E360、E366-E373或E383-E385中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區編碼SEQ ID NO:202之胺基酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列；相對於SEQ ID NO:202包含至少1、2、3、4、5、10、15或20個，但不超過30個不同胺基酸之胺基酸序列；或相對於SEQ ID NO:202之胺基酸序列包含至少1、2、3、4、5、10、15或20個，但不超過30個修飾(例如，取代(例如，保守性取代)、插入或缺失)之胺基酸序列。 E393. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391或E392中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區可操作地連接至第一啟動子及第二啟動子。 E394. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385或E391-E393中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一及/或第二啟動子係選自桿狀病毒啟動子、病毒啟動子、昆蟲病毒啟動子、非昆蟲病毒啟動子、脊椎動物病毒啟動子、來自一或多個物種之包括病毒及非病毒元件之嵌合啟動子、合成啟動子或其變異體。 E395. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385或E391-E394中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一及/或第二啟動子係選自polh啟動子、p10啟動子、ctx啟動子、gp64啟動子、IE啟動子、IE-1啟動子、p6.9啟動子、Dmhsp70啟動子、Hsp70啟動子、p5啟動子、p19啟動子、p35啟動子、p40啟動子或其變異體，例如功能性片段。 E396. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385或E391-E395中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一及/或第二啟動子係選自桿狀病毒早期啟動子、桿狀病毒晚期啟動子、桿狀病毒早期-晚期啟動子或桿狀病毒極晚期啟動子。 E397. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385或E391-E396中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一及/或第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子、桿狀病毒晚期啟動子或桿狀病毒早期-晚期啟動子。 E398. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385或E391-E397中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一及/或第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子(例如，gp64啟動子)。 E399. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385或E391-E399中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一或第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子(例如，polh啟動子)。 E400. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385或E391-E400中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (a) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子， (b) 該第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子， (c) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子， (d) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (e) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子， (f) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (g) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子， (h) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子， (i) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子， (j) 該第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子， (k) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子， (l) 該第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (m) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (n) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子，或 (o) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子。 E401. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385或E391-E401中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子(例如，gp64啟動子)且第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子(例如，polh啟動子)。 E402. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385或E391-E402中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子。 E403. 如實施例E396-E402中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中 (a) 該桿狀病毒早期啟動子係選自：lef3啟動子、dbp啟動子、p35啟動子、orf82啟動子、get啟動子、orf81啟動子、orf122啟動子、pk-2啟動子、orf55啟動子、etl啟動子、hcf-1啟動子、etm啟動子、lef-2啟動子、lef-6啟動子、orf84啟動子、orf118啟動子或orf111啟動子， (b) 該桿狀病毒早期-晚期啟動子係選自：lef2啟動子、orf13啟動子、orf23啟動子、pkip啟動子、v-fgf啟動子、pp31啟動子、odv-e66啟動子、orf74啟動子、orf79啟動子、orf82啟動子、p15啟動子、cg30啟動子、解螺旋酶啟動子、he65啟動子、orf114啟動子、pk-2啟動子、gp64啟動子、gp16啟動子、alk-exo啟動子、p35啟動子、me53啟動子或ie0啟動子， (c) 該桿狀病毒晚期啟動子係選自：ptpase啟動子、Ac-bro啟動子、ctx啟動子、orf5啟動子、orf19啟動子、orf20啟動子、sod啟動子、HisP啟動子、orf34啟動子、v-ubi啟動子、orf38啟動子、orf43啟動子、orf44啟動子、orf56啟動子、orf59啟動子、orf60啟動子或fp-25k啟動子，及/或 (d) 該桿狀病毒極晚期啟動子係選自p10啟動子或polh啟動子。 E404. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385或E391-E403中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一及/或第二啟動子包含TATA盒模體及/或CAGT模體。 E405. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385或E391-E404中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一及/或第二啟動子包含TAAG模體(例如，ATAAG核苷酸序列)。 E406. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385或E391-E405中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一及/或第二啟動子包含TATA盒模體及TAAG模體。 E407. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385或E391-E406中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一或第二啟動子包含VLF-1之結合位點。 E408. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385或E391-E407中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一或第二啟動子係gp64啟動子(例如，OpMNPV gp64啟動子)。 E409. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385或E391-E408中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一或第二啟動子係polh啟動子(例如，OpMNPV polh啟動子或AcMNPV polh啟動子)。 E410. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385或E391-E409中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一啟動子係gp64啟動子且第二啟動子係polh啟動子，或其中第一啟動子係polh啟動子且第二啟動子係gp64啟動子。 E411. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385或E391-E410中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區可操作地連接至第一啟動子(其係桿狀病毒早期-晚期啟動子)及第二啟動子(其係桿狀病毒極晚期啟動子)，例如gp64啟動子及polh啟動子，視情況其中該Rep編碼區位於同源重複序列區hr5之下游。 E412. 如實施例E362-E365、E374-E381或E386-E390中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一Rep編碼區之核苷酸序列可操作地連接至第一啟動子。 E413. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390或E412中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二Rep編碼區之核苷酸序列可操作地連接至第二啟動子。 E414. 如實施例E412或E413之變異型桿狀病毒基因體，其中該第一啟動子、該第二啟動子或該第一啟動子及該第二啟動子兩者係桿狀病毒主要晚期啟動子、桿狀病毒早期-晚期啟動子、桿狀病毒極晚期啟動子、病毒啟動子、昆蟲病毒啟動子、非昆蟲病毒啟動子、脊椎動物病毒啟動子、來自一或多個物種之包括病毒及非病毒元件之嵌合啟動子、合成啟動子或其變異體。 E415. 如實施例E412-E414中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該第一啟動子、該第二啟動子或該第一啟動子及該第二啟動子兩者係選自多角體蛋白(polh)啟動子、p10啟動子、芋螺毒素(ctx)啟動子、gp64啟動子、IE啟動子、IE-1啟動子、p6.9啟動子、Dmhsp70啟動子、Hsp70啟動子、p5啟動子、p19啟動子、p35啟動子、p40啟動子或其變異體，例如功能性片段。 E416. 如實施例E412-E415之變異型桿狀病毒基因體，其中第一啟動子及第二啟動子係相同的。 E417. 如實施例E412-E415之變異型桿狀病毒基因體，其中第一啟動子及第二啟動子係不同的。 E418. 如實施例E412-E417之變異型桿狀病毒基因體，第一啟動子及第二啟動子各自為polh啟動子。 E419. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385或E391-E411中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一啟動子係gp64啟動子且第二啟動子係polh啟動子。 E420. 如實施例E419之變異型桿狀病毒基因體，其中gp64啟動子包含SEQ ID NO:217之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E421. 如實施例E418-E420之變異型桿狀病毒基因體，其中polh啟動子包含SEQ ID NO:167或220之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:167或220包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:167或220包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E422. 如實施例E417或E419-E421中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一啟動子及第二啟動子包含SEQ ID NO:221之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:221包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:221包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E423. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390或E412-418中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一Rep編碼區或第二Rep編碼區包含減少第一Rep編碼區之轉錄起始之表現修飾物序列。 E424. 如實施例E423之變異型桿狀病毒基因體，其中表現修飾物序列包含小型順反子序列。 E425. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423或E424中任一項之變異型桿狀病毒基因體，第一Rep編碼區包含小型順反子序列，視情況其中該小型順反子序列位於第一Rep編碼區之5'端。 E426. 如實施例E423-E425中任一項之變異型桿狀病毒基因體，第一Rep編碼區包含表現修飾物序列與第一ORF之起始密碼子之間的3-100個核苷酸；視情況地，表現修飾物序列與第一ORF之起始密碼子之間的3-25個核苷酸，3-10個核苷酸或3個核苷酸。 E427. 如實施例E423至E426中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中小型順反子序列係來自桿狀病毒基因；視情況來自桿狀病毒gp64基因。 E428. 如實施例E423-E427中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中小型順反子序列包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10；與SEQ ID NO:9或10至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:9或10包含一個、兩個或三個修飾(例如，取代)，但不超過四個修飾(例如，取代)之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:9或10包含一個、兩個或三個，但不超過四個不同核苷酸之核苷酸序列。 E429. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418或E423-E428中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：polh啟動子、小型順反子序列及第一Rep編碼區，該第一Rep編碼區包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列。 E430. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418或E423-E429中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：polh啟動子及第一Rep編碼區，該第一Rep編碼區包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列。 E431. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418或E423-E430中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：polh啟動子及第二Rep編碼區，該第二Rep編碼區包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列。 E432. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418或E423-E431中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其包含： (i) 以5'至3'順序：polh啟動子、小型順反子序列及第一Rep編碼區，該第一Rep編碼區包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列；及 (ii) 以5'至3'順序：polh啟動子及第二Rep編碼區，該第二Rep編碼區包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列。 E433. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E432中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 以5'至3'順序：polh啟動子及第一Rep編碼區，該第一Rep編碼區包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列；及 (ii) 以5'至3'順序：polh啟動子及第二Rep編碼區，該第二Rep編碼區包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列。 E434. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385或E391-E422中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：第一啟動子、第二啟動子及Rep編碼區，個Rep編碼區包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之核苷酸序列。 E435. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E422或E434中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：桿狀病毒早期-晚期啟動子、桿狀病毒極晚期啟動子及Rep編碼區，該Rep編碼區包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之核苷酸序列。 E436. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E422、E434或E435中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：g64啟動子、polh啟動子及Rep編碼區，該Rep編碼區包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之核苷酸序列。 E437. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418或E423-E433中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該第一Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體中之第一位置，該變異型桿狀病毒基因體係選自ChiA、v-cath、p10、egt、多角體蛋白、SOD、ctx、p26、odv-e56、p74 (PIF0)、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94；及 (ii) 該第二Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體中之第二位置，該變異型桿狀病毒基因體係選自ChiA、v-cath、p10、egt、多角體蛋白、SOD、ctx、p26、odv-e56、p74 (PIF0)、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94；其中該第一基因座及該第二基因座係不同的。 E438. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433或E437之變異型桿狀病毒基因體，其中第一Rep編碼區位於v-cath基因座中且第二Rep編碼區位於egt基因座中。 E439. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437或E438之變異型桿狀病毒基因體，其中第一Rep編碼區位於Tn7/polh基因座中且第二Rep編碼區位於egt基因座中。 E440. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437或E438中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第一Rep編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且可操作地連接至polh啟動子，且第二Rep編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中且可操作地連接至polh啟動子。 E441. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437或E440中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該第一Rep編碼區包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列，其中該第一Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中；及 (ii) 該第二Rep編碼區包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列，其中該第二Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中。 E442. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437、E440或E441中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該第一Rep編碼區包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列，其中該第一Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且可操作地連接至polh啟動子；及 (ii) 該第二Rep編碼區包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列，其中該第二Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中且可操作地連接至polh啟動子。 E443. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437或E440-E442中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其包含： (i) 以5'至3'順序：polh啟動子、小型順反子序列及第一Rep編碼區，該第一Rep編碼區包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列，其中該第一Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中；及 (ii) 以5'至3'順序：polh啟動子及第二Rep編碼區，該第二Rep編碼區包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列，其中該第二Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中。 E444. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437或E440-E443中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其包含： (i) 以5'至3'順序：polh啟動子及第一Rep編碼區，該第一Rep編碼區包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列，其中該第一Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中；及 (ii) 以5'至3'順序：polh啟動子及第二Rep編碼區，該第二Rep編碼區包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列，其中該第二Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中。 E445. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E422或E434-E436中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中：Rep編碼區位於選自以下之變異型桿狀病毒基因體中之位置：chiA、v-cath、p10、egt、多角體蛋白、SOD、ctx、p26、odv-e56、p74 (PIF0)、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94。 E446. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E422、E434-E436或E445中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中。 E447. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E422、E434-E436、E445或E446中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區位於同源重複序列區hr5之下游。 E448. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E422、E434-E436或E445-E447中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中且位於同源重複序列區hr5之下游。 E449. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E422、E434-E436或E445-E448中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中，且可操作地連接至gp64啟動子及polh啟動子。 E450. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E422、E434-E436或E445-E449中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中且其中Rep編碼區包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之單一多順反子ORF。 E451. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E422、E434-E436或E445-E450中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中且其中Rep編碼區包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之核苷酸序列，其中編碼Rep52蛋白質之核苷酸序列包含於編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列內。 E452. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E422、E434-E436或E445-E451中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中且其中Rep編碼區包含： (i) 編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之核苷酸序列，其中編碼Rep52蛋白質之核苷酸序列包含於編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列內；及 (ii) 可操作地連接至gp64啟動子及polh啟動子，視情況其中： (a) gp64啟動子包含SEQ ID NO:217之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列；及/或 (b) polh啟動子包含SEQ ID NO:167或220之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:167或220包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:167或220包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E453. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E422、E434-E436或E445-E452中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中Rep編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中且其中Rep編碼區包含： (i) 編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之單一多順反子ORF，其中編碼Rep78蛋白質之ORF包含ATG或CTG起始密碼子；及 (ii) 可操作地連接至gp64啟動子及polh啟動子，視情況其中： (a) gp64啟動子包含SEQ ID NO:217之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列；及/或 (b) polh啟動子包含SEQ ID NO:167或220之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:167或220包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:167或220包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E454. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E422、E434-E436或E445-E453中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：gp64啟動子、polh啟動子及Rep編碼區，該Rep編碼區包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之核苷酸序列，其中編碼Rep52蛋白質之核苷酸序列包含於編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列內，其中Rep編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中，視情況其中Rep編碼區位於同源重複序列區hr5之下游。 E455. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E422、E434-E436或E445-E454中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：gp64啟動子、polh啟動子及Rep編碼區，該Rep編碼區包含有包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之單一多順反子ORF之核苷酸序列，其中編碼Rep78蛋白質之ORF包含ATG或CTG起始密碼子，其中Rep編碼區位於p74基因座中，視情況其中Rep編碼區位於同源重複序列區hr5之下游。 E456. 如實施例E292-E455中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區包含滿足以下條件之核苷酸序列： (i) 相對於VP2蛋白質及/或VP3蛋白質主要編碼VP1蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的VP1蛋白質； (ii) 僅編碼VP1蛋白質； (iii) 編碼VP1蛋白質，但不編碼VP2蛋白質或VP3蛋白質； (iv) 相對於VP1蛋白質及/或VP3蛋白質主要編碼VP2蛋白質，例如至少約50%、60%、70%、80%、90%或更多的VP2蛋白質； (v) 僅編碼VP2蛋白質； (vi) 編碼VP2蛋白質，但不編碼VP1蛋白質或VP3蛋白質； (vii) 僅編碼VP3蛋白質； (viii) 編碼VP3蛋白質，但不編碼VP1蛋白質或VP2蛋白質； (ix) 編碼VP1蛋白質及VP2蛋白質，但不編碼VP3蛋白質； (x) 編碼VP1蛋白質及VP3蛋白質，但不編碼VP2蛋白質； (xi) 編碼VP2蛋白質及VP3蛋白質，但不編碼VP1蛋白質； (xii) 編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質。 E457. 如實施例E292-E456中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內。 E458. 如實施例E292-E457中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之單一多順反子ORF。 E459. 如實施例E292-E458中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中編碼VP1蛋白質之ORF包含ACG起始密碼子，編碼VP2蛋白質之ORF包含ACG起始密碼子，且編碼VP3蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子。 E460. 如實施例E292-E459中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中編碼VP1蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子，編碼VP2蛋白質之ORF包含ACG起始密碼子，且編碼VP3蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子。 E461. 如實施例E292-E460中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區編碼AAV1衣殼蛋白質、AAV2衣殼蛋白質、AAV3衣殼蛋白質、AAV4衣殼蛋白質、AAV5衣殼蛋白質、AAV6衣殼蛋白質、AAV8衣殼蛋白質、AAV9衣殼蛋白質、AAVrh10衣殼蛋白質或任何前述衣殼蛋白質之變異體。 E462. 如實施例E292-E461中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區編碼AAV5衣殼蛋白質或其變異體，或AAV9衣殼蛋白質或其變異體。 E463. 如實施例E292-E462中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區編碼包含以下之VP1蛋白質：SEQ ID NO:46、47、71或168中之任一者之胺基酸序列或與任何前述胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。 E464. 如實施例E292-E463中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區編碼VP2蛋白質，例如SEQ ID NO:46、47、71或168中之任一者或與任何前述胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列之片段或一部分，視情況其中該VP2蛋白質包含胺基酸138-736或SEQ ID NO:46、47或71，或SEQ ID NO:168之胺基酸137-724。 E465. 如實施例E292-E464中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區編碼VP3蛋白質，例如SEQ ID NO:46、47、71中之任一者或168或與任何前述胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列之片段或一部分，視情況其中該VP3蛋白質包含SEQ ID NO:46、47或71之胺基酸203-736，或SEQ ID NO:168之胺基酸193-724。 E466. 如實施例E292-E465中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區包含SEQ ID NO:43-45、72、169、205、212或213中之任一者之核苷酸序列，或與任何前述核苷酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。 E467. 如實施例E292-E466中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區包含編碼VP2蛋白質之核苷酸序列，例如SEQ ID NO:43-45、72、169、205、212或213中之任一者或與任何前述核苷酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列之片段或一部分，視情況其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO:43-45、72、205或212之核苷酸412-2211，或SEQ ID NO:169或213之核苷酸409-2175。 E468. 如實施例E292-E467中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區包含編碼VP3蛋白質之核苷酸序列，例如SEQ ID NO:43-45、72、169、205、212或213中之任一者或與任何前述核苷酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列之片段或一部分，視情況其中該編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO:43-45、72、205或212之核苷酸607-2211，或SEQ ID NO:169或213之核苷酸577-2175。 E469. 如實施例E292-E468中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區之核苷酸序列針對昆蟲細胞，視情況草地黏蟲昆蟲細胞(例如，Sf9昆蟲細胞)經密碼子最佳化。 E470. 如實施例E292-E469中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區之核苷酸序列可操作地連接至啟動子。 E471. 如實施例E470之變異型桿狀病毒基因體，其中該啟動子係桿狀病毒主要晚期啟動子、病毒啟動子、昆蟲病毒啟動子、非昆蟲病毒啟動子、脊椎動物病毒啟動子、來自一或多個物種之包括病毒及非病毒元件之嵌合啟動子、合成啟動子或其變異體。 E472. 如實施例E470或E471之變異型桿狀病毒基因體，其中該啟動子係選自polh啟動子、p10啟動子、ctx啟動子、gp64啟動子、IE啟動子、IE-1啟動子、p6.9啟動子、Dmhsp70啟動子、Hsp70啟動子、p5啟動子、p19啟動子、p35啟動子、p40啟動子或其變異體，例如功能性片段。 E473. 如實施例E470-E472中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中啟動子係p10啟動子。 E474. 如實施例E473之變異型桿狀病毒基因體，其中p10啟動子包含SEQ ID NO:200之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:200包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:200包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E475. 如實施例E292-E474中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：p10啟動子及VP編碼區，該VP編碼區包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內。 E476. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437、E440-E444或E456-E475中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體中之與第一Rep編碼區、第二Rep編碼區或其兩者之位置不同的位置。 E477. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437、E440-E444或E456-E475中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體中之與第一Rep編碼區相同的位置。 E478. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437、E440-E444、E456-E475或E477中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區相對於第一Rep編碼區以反向定向。 E479. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437、E440-E444、E456-E475、E477或E478中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體中之與第一Rep編碼區相同的位置且相對於第一Rep編碼區以反向定向。 E480. 如實施例E292-E479中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體中之選自以下之位置：ChiA、v-cath、p10、egt、多角體蛋白、SOD、ctx、p26、odv-e56、p74 (PIF0)、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94。 E481. 如實施例E292-E480中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中。 E482. 如實施例E292-E480中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之Tn7/polh基因座中。 E483. 如實施例E292-E480中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中。 E484. 如實施例E292-E481中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且其中VP編碼區可操作地連接至p10啟動子。 E485. 如實施例E292-E480或E483中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且其中VP編碼區可操作地連接至p10啟動子。 E486. 如實施例E292-E481或E484中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且其中VP編碼區包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之單一多順反子ORF。 E487. 如實施例E292-E480、E483或E485中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且其中VP編碼區包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之單一多順反子ORF。 E488. 如實施例E292-E481、E484或E486中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且其中VP編碼區包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內。 E489. 如實施例E292-E480、E483、E485或E487中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且其中VP編碼區包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內。 E490. 如實施例E292-E481、E484、E486或E488中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且其中VP編碼區： (i) 包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內；及 (ii) 可操作地連接至p10啟動子。 E491. 如實施例E292-E480、E483、E485、E487或E489中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且其中VP編碼區： (i) 包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內；及 (ii) 可操作地連接至p10啟動子。 E492. 如實施例E292-E481、E484、E486、E488或E490中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：p10啟動子及VP編碼區，該VP編碼區包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中。 E493. 如實施例E292-E480、E483、E485、E487、E489或E491中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：p10啟動子及VP編碼區，該VP編碼區包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中。 E494. 如實施例E292-E481、E484、E486、E488、E490或E492中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且其中VP編碼區： (i) 包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之單一多順反子ORF，其中編碼VP1蛋白質之ORF包含ACG起始密碼子，編碼VP2蛋白質之ORF包含ACG起始密碼子，且編碼VP3蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子；及 (ii) 可操作地連接至p10啟動子。 E495. 如實施例E292-E480、E483、E485、E487、E489、E491或E493中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且其中VP編碼區： (i) 包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之單一多順反子ORF，其中編碼VP1蛋白質之ORF包含ACG起始密碼子，編碼VP2蛋白質之ORF包含ACG起始密碼子，且編碼VP3蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子；及 (ii) 可操作地連接至p10啟動子。 E496. 如實施例E292-E481、E484、E486、E488、E490、E492或E494中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且其中VP編碼區： (i) 包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之單一多順反子ORF，其中編碼VP1蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子，編碼VP2蛋白質之ORF包含ACG起始密碼子，且編碼VP3蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子；及 (ii) 可操作地連接至p10啟動子。 E497. 如實施例E292-E480、E483、E485、E487、E489、E491、E493或E495中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且其中VP編碼區： (i) 包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之單一多順反子ORF，其中編碼VP1蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子，編碼VP2蛋白質之ORF包含ACG起始密碼子，且編碼VP3蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子；及 (ii) 可操作地連接至p10啟動子。 E498. 如實施例E292-E481、E484、E486、E488、E490、E492、E494或E496中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：p10啟動子；及VP編碼區，其包含有包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之單一多順反子ORF之核苷酸序列，其中編碼VP1蛋白質之ORF包含ACG起始密碼子，編碼VP2蛋白質之ORF包含ACG起始密碼子，且編碼VP3蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中。 E499. 如實施例E292-E480、E483、E485、E487、E489、E491、E493、E495或E497中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：p10啟動子；及VP編碼區，其包含有包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之單一多順反子ORF之核苷酸序列，其中編碼VP1蛋白質之ORF包含ACG起始密碼子，編碼VP2蛋白質之ORF包含ACG起始密碼子，且編碼VP3蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中。 E500. 如實施例E292-E481、E484、E486、E488、E490、E492、E494、E496或E498中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：p10啟動子；及VP編碼區，其包含有包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之單一多順反子ORF之核苷酸序列，其中編碼VP1蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子，編碼VP2蛋白質之ORF包含ACG起始密碼子，且編碼VP3蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中。 E501. 如實施例E292-E480、E483、E485、E487、E489、E491、E493、E495、E497或E499中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：p10啟動子；及VP編碼區，其包含有包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之單一多順反子ORF之核苷酸序列，其中編碼VP1蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子，編碼VP2蛋白質之ORF包含ACG起始密碼子，且編碼VP3蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中。 E502. 如實施例E292-E501中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其進一步包含第二VP編碼區。 E503. 如實施例E502之變異型桿狀病毒基因體，其中第二VP編碼區包含編碼VP1蛋白質之核苷酸序列。 E504. 如實施例E502或E503之變異型桿狀病毒基因體，其中第二VP編碼區包含相對於VP2蛋白質及/或VP3蛋白質主要編碼VP1蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的VP1蛋白質之核苷酸序列。 E505. 如實施例E502-E504中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二VP編碼區包含僅編碼VP1蛋白質之核苷酸序列。 E506. 如實施例E502或E503之變異型桿狀病毒基因體，其中第二VP編碼區包含編碼VP1蛋白質，但不編碼VP2蛋白質或VP3蛋白質之核苷酸序列。 E507. 如實施例E502-E505中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二VP編碼區包含單一ORF，其包含起始密碼子及相對於VP2蛋白質及/或VP3蛋白質主要編碼VP1蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的VP1蛋白質之核苷酸序列。 E508. 如實施例E502-E505或E507之變異型桿狀病毒基因體，其中第二VP編碼區包含單一ORF，其包含起始密碼子及編碼VP1蛋白質之核苷酸序列。 E509. 如實施例E502、E503或E505之變異型桿狀病毒基因體，其中第二VP編碼區包含單一ORF，其包含起始密碼子及編碼VP1蛋白質，但不編碼VP2蛋白質或VP3蛋白質之核苷酸序列。 E510. 如實施例E507-E509之變異型桿狀病毒基因體，其中ORF包含ATG起始密碼子(例如，典型起始密碼子)。 E511. 如實施例E507-E509之變異型桿狀病毒基因體，其中ORF包含ACG起始密碼子、CTG起始密碼子、TTG起始密碼子或GTG起始密碼子(例如，非典型起始密碼子)。 E512. 如實施例E502-E511中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二VP編碼區編碼AAV1衣殼蛋白質、AAV2衣殼蛋白質、AAV3衣殼蛋白質、AAV4衣殼蛋白質、AAV5衣殼蛋白質、AAV6衣殼蛋白質、AAV8衣殼蛋白質、AAV9衣殼蛋白質、AAVrh10衣殼蛋白質或任何前述衣殼蛋白質之變異體。 E513. 如實施例E502-E512中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二VP編碼區編碼AAV5衣殼蛋白質或其變異體，或AAV9衣殼蛋白質或其變異體。 E514. 如實施例E502-E513中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二VP編碼區編碼包含以下之VP1蛋白質：SEQ ID NO:46、47、71或168中之任一者之胺基酸序列，或與任何前述胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。 E515. 如實施例E502-E514之變異型桿狀病毒基因體，其中第二VP編碼區包含SEQ ID NO:43-45、72、169、205、212或213之核苷酸序列，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:43-45、72、169、205、212或213具有至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400或450個，但不超過500個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:43-45、72、169、205、212或213具有至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400或450個，但不超過500個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E516. 如實施例E502-E515中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二VP編碼區之核苷酸序列針對昆蟲細胞，視情況草地黏蟲昆蟲細胞(例如，Sf9昆蟲細胞)經密碼子最佳化。 E517. 如實施例E502-E516中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二VP編碼區之核苷酸序列可操作地連接至啟動子。 E518. 如實施例E517之變異型桿狀病毒基因體，其中該啟動子係桿狀病毒主要晚期啟動子、病毒啟動子、昆蟲病毒啟動子、非昆蟲病毒啟動子、脊椎動物病毒啟動子、來自一或多個物種之包括病毒及非病毒元件之嵌合啟動子、合成啟動子或其變異體。 E519. 如實施例E517或E518之變異型桿狀病毒基因體，其中該啟動子係選自polh啟動子、p10啟動子、ctx啟動子、gp64啟動子、IE啟動子、IE-1啟動子、p6.9啟動子、Dmhsp70啟動子、Hsp70啟動子、p5啟動子、p19啟動子、p35啟動子、p40啟動子或其變異體，例如功能性片段。 E520. 如實施例E517-E519中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中啟動子係ctx啟動子。 E521. 如實施例E519或E520之變異型桿狀病毒基因體，其中ctx啟動子包含ctx基因之啟動子區域(例如，AcORF3)及ctx基因之5' UTR。 E522. 如實施例E519-E521之變異型桿狀病毒基因體，其中ctx啟動子包含SEQ ID NO:164-166之核苷酸序列，或與SEQ ID NO:164-166中之任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:164-166中之任一者包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:164-166中之任一者包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E523. 如實施例E519-E522之變異型桿狀病毒基因體，其中ctx啟動子包含SEQ ID NO:164之核苷酸序列，或與SEQ ID NO:164至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:164包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:164包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E524. 如實施例E519-E523中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：ctx啟動子及第二VP編碼區，該第二VP編碼區包含相對於VP2蛋白質及VP3蛋白質主要編碼VP1蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的VP1蛋白質(例如，但不編碼VP2蛋白質或VP3蛋白質)之核苷酸序列。 E525. 如實施例E519-E524中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：ctx啟動子及第二VP編碼區，該第二VP編碼區包含僅編碼VP1蛋白質之核苷酸序列. E526. 如實施例E519-E525中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：ctx啟動子及第二VP編碼區，該第二VP編碼區包含編碼VP1蛋白質，但不編碼VP2蛋白質或VP3蛋白質之核苷酸序列。 E527. 如實施例E519-E526中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體中之與第一Rep編碼區、第二Rep編碼區或VP編碼區中之一者、兩者或全部不同的位置。 E528. 如實施例E519-E527中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體中之選自以下之位置：chiA、v-cath、p10、egt、多角體蛋白、SOD、ctx、p26、odv-e56、p74 (PIF0)、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94。 E529. 如實施例E519-E528中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中。 E530. 如實施例E519-E529中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且可操作地連接至ctx啟動子，視情況其中該ctx啟動子包含SEQ ID NO:164之核苷酸序列；與SEQ ID NO:164至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:164包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:164包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E531. 如實施例E519-E530中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且包含相對於VP2蛋白質或VP3蛋白質主要編碼VP1蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的VP1蛋白質(例如，但不編碼VP2或VP3蛋白質)之核苷酸序列。 E532. 如實施例E519-E531中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中第二VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且其中第二VP編碼區： (i) 包含相對於VP2蛋白質或VP3蛋白質主要編碼VP1蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的VP1蛋白質(例如，但不編碼VP2或VP3蛋白質)之核苷酸序列；及 (ii) 可操作地連接至ctx啟動子，視情況其中該ctx啟動子包含SEQ ID NO:164之核苷酸序列；與SEQ ID NO:164至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:164包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:164包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E533. 如實施例E519-E532中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：ctx啟動子；及第二VP編碼區，其包含相對於VP2蛋白質或VP3蛋白質主要編碼VP1蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的VP1蛋白質(例如，但不編碼VP2或VP3蛋白質)之核苷酸序列；其中第二VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中。 E534. 如實施例E519-E533中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：ctx啟動子；及單一ORF，其包含起始密碼子及相對於VP2蛋白質或VP3蛋白質主要編碼VP1蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的VP1蛋白質(例如，但不編碼VP2或VP3蛋白質)之核苷酸序列；其中第二VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中。 E535. 如實施例E519-E534中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其進一步包含經修飾之Kozak序列。 E536. 如實施例E535之變異型桿狀病毒基因體，其中該經修飾之Kozak序列能夠調節由基因編碼之蛋白質之表現，例如增加表現，該基因位於該經修飾之Kozak序列之下游且與其相鄰。 E537. 如實施例E535或E536之變異型桿狀病毒基因體，其中該經修飾之Kozak序列包含用於由基因編碼之蛋白質的轉譯之起始密碼子，該基因位於該經修飾之Kozak序列之下游且與其相鄰。 E538. 如實施例E535-E537中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該經修飾之Kozak包含SEQ ID NO:32-42中之任一者之序列之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:32-42包含不超過一個、兩個或三個不同的核苷酸之核苷酸序列。 E539. 如實施例E535-E538中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中編碼經修飾之Kozak之核苷酸序列包含SEQ ID NO:21-31、222及223中之任一者之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:21-31、222及223包含不超過一個、兩個或三個不同的核苷酸之核苷酸序列。 E540. 如實施例E535-E537中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該經修飾之Kozak序列包含SEQ ID NO:118-162中之任一者之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:118-162包含不超過一個、兩個或三個不同的核苷酸之核苷酸序列。 E541. 如實施例E535-E537或E540中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中編碼經修飾之Kozak序列之核苷酸序列包含SEQ ID NO:73-117中之任一者之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:73-117包含不超過一個、兩個或三個不同的核苷酸之核苷酸序列。 E542. 如實施例E535-E539中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該經修飾之Kozak序列包含SEQ ID NO:33之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:33包含不超過一個、兩個或三個不同的核苷酸之核苷酸序列。 E543. 如實施例E535-E539或E542中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中編碼經修飾之Kozak序列之核苷酸序列包含SEQ ID NO:22之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:22包含不超過一個、兩個或三個不同的核苷酸之核苷酸序列。 E544. 如實施例E535-E539中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該經修飾之Kozak序列包含SEQ ID NO:32之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:32包含不超過一個、兩個或三個不同的核苷酸之核苷酸序列。 E545. 如實施例E535-E539或E544中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中編碼經修飾之Kozak序列之核苷酸序列包含SEQ ID NO:21之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:21包含不超過一個、兩個或三個不同的核苷酸之核苷酸序列。 E546. 如實施例E535-E545中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該經修飾之Kozak序列位於VP編碼區之5'端，例如位於編碼VP1蛋白質之VP編碼區(例如，編碼VP1蛋白質之ORF)之起始處。 E547. 如實施例E535-E546中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該經修飾之Kozak序列包含編碼VP1蛋白質之ORF之起始密碼子。 E548. 如實施例E535-E547中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該起始密碼子包含ATG。 E549. 如實施例E535-E539或E542-E548中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該經修飾之Kozak序列及該VP編碼區包含SEQ ID NO:44或45之核苷酸序列，或與前述序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。 E550. 如實施例E535-E539、E542、E543或E546-E549中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中包含經修飾之Kozak序列之VP編碼區編碼包含以下之VP1蛋白質：SEQ ID NO:46、47、71或168之胺基酸序列，或與前述序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。 E551. 如實施例E535-E539或E544-E548中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中包含經修飾之Kozak序列之VP編碼區編碼包含以下之VP1蛋白質：SEQ ID NO:46、47、71或168之胺基酸序列，或與前述序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。 E552. 如實施例E535-E551中任一項之變異型桿狀病毒基因體，以5'至3'順序，其包含：p10啟動子及VP編碼區，該VP編碼區包含經修飾之Kozak序列及編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內；其中該經修飾之Kozak序列位於VP編碼區之5'端，例如位於編碼VP1蛋白質之VP編碼區(例如，編碼VP1蛋白質之ORF)之起始處；視情況其中該經修飾之Kozak序列包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33包含不超過一個、兩個或三個不同的核苷酸之核苷酸序列。 E553. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437、E440-E444或E456-E552中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該第一Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中； (ii) 該第二Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中；及 (iii) 該VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中。 E554. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E411、E419-E422、E434-E436、E445-E475、E480、E483、E485、E487、E489、E491、E493、E495、E497、E499或E501-E552中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中；及 (ii) 該VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中。 E555. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437、E440-E444或E456-E553中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該第一Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列； (ii) 該第二Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中且包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列；及 (iii) 該VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內。 E556. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E411、E419-E422、E434-E436、E445-E475、E480、E483、E485、E487、E489、E491、E493、E495、E497、E499、E501-E552或E554中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中且包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之核苷酸序列，其中編碼Rep52蛋白質之核苷酸序列包含於編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列內；及 (ii) 該VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內。 E557. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437、E440-E444、E456-E553或E555中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該第一Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且可操作地連接至polh啟動子； (ii) 該第二Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中且可操作地連接至polh啟動子；及 (iii) 該VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且可操作地連接至p10啟動子。 E558. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E411、E419-E422、E434-E436、E445-E475、E480、E483、E485、E487、E489、E491、E493、E495、E497、E499、E501-E552、E554或E556中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中且可操作地連接至gp64啟動子及polh啟動子；及 (iii) 該VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且可操作地連接至p10啟動子。 E559. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437、E440-E444、E456-E553、E555或E557中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該第一Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列，其中該第一Rep編碼區可操作地連接至polh啟動子； (ii) 該第二Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中且包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列，其中該第二Rep編碼區可操作地連接至polh啟動子；及 (iii) 該VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內，且其中該VP編碼區可操作地連接至p10啟動子；視情況其中該VP編碼區相對於第一Rep編碼區以反向定向。 E560. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E411、E419-E422、E434-E436、E445-E475、E480、E483、E485、E487、E489、E491、E493、E495、E497、E499、E501-E552、E554、E556或E558中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中且包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之核苷酸序列，其中編碼Rep52蛋白質之核苷酸序列包含於編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列內，其中該第一Rep編碼區可操作地連接至polh啟動子；及 (ii) 該VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內，且其中該VP編碼區可操作地連接至p10啟動子；視情況其中該VP編碼區相對於Rep編碼區以反向定向。 E561. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437、E440-E444、E456-E553、E555、E557或E559中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該第一Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中； (ii) 該第二Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中； (iii) 該VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中；及 (iv) 該第二VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中。 E562. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437、E440-E444、E456-E553、E555、E557、E559或E561中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該第一Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列； (ii) 該第二Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中且包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列； (iii) 該VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內；及 (iv) 該第二VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且包含相對於VP2蛋白質或VP3蛋白質，主要編碼VP1蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的VP1蛋白質(例如，但不編碼VP2或VP3蛋白質)之核苷酸序列。 E563. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437、E440-E444、E456-E553、E555、E557、E559、E561或E562中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該第一Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且可操作地連接至polh啟動子； (ii) 該第二Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中且可操作地連接至polh啟動子； (iii) 該VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且可操作地連接至p10啟動子；及 (iv) 該第二VP編碼區位於變異體之SOD基因座中且可操作地連接至ctx啟動子。 E564. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437、E440-E444、E456-E553、E555、E557、E559或E561-E563中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該第一Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列，且其中該第一Rep編碼區可操作地連接至polh啟動子； (ii) 該第二Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中且包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列，其中該第二Rep編碼區可操作地連接至polh啟動子； (iii) 該VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內，且其中該VP編碼區可操作地連接至p10啟動子；及 (iv) 該第二VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且包含相對於VP2蛋白質或VP3蛋白質主要編碼VP1蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的VP1蛋白質(例如，但不編碼VP2或VP3蛋白質)之核苷酸序列，且其中該第二VP編碼區可操作地連接至ctx啟動子；視情況其中該VP編碼區相對於該第一Rep編碼區以反向定向。 E565. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437、E440-E444、E456-E553、E555、E557或E559中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該第一Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列； (ii) 該第二Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中且包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列；及 (iii) 該VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中，其中該VP編碼區包含經修飾之Kozak序列，視情況其中該經修飾之Kozak序列包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33包含不超過一個、兩個或三個不同的核苷酸之核苷酸序列。 E566. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E411、E419-E422、E434-E436、E445-E475、E480、E483、E485、E487、E489、E491、E493、E495、E497、E499、E501-E552、E554、E556、E558或E560中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中且包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之核苷酸序列，其中編碼Rep52蛋白質之核苷酸序列包含於編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列內；及 (ii) 該編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中，其中該VP編碼區包含經修飾之Kozak序列，視情況其中該經修飾之Kozak序列包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33包含不超過一個、兩個或三個不同的核苷酸之核苷酸序列。 E567. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437、E440-E444、E456-E553、E555、E557、E559或E565中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該第一Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列； (ii) 該第二Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中且包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列；及 (iii) 該VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中，其中該VP編碼區包含經修飾之Kozak序列，其位於該VP編碼區之5'端，例如位於編碼VP1蛋白質之VP編碼區(例如，編碼該VP1蛋白質之ORF)之起始處，視情況其中該經修飾之Kozak序列包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33包含不超過一個、兩個或三個不同的核苷酸之核苷酸序列。 E568. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E411、E419-E422、E434-E436、E445-E475、E480、E483、E485、E487、E489、E491、E493、E495、E497、E499、E501-E552、E554、E556、E558、E560或E566中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中且包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之核苷酸序列；及 (ii) 該VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中，其中該VP編碼區包含經修飾之Kozak序列，其位於VP編碼區之5'端，例如位於編碼VP1蛋白質之VP編碼區(例如，編碼VP1蛋白質之ORF)之起始處，視情況其中該經修飾之Kozak序列包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33包含不超過一個、兩個或三個不同的核苷酸之核苷酸序列。 E569. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437、E440-E444、E456-E553、E555、E557、E559、E565或E567中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該第一Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列，且其中該第一Rep編碼區可操作地連接至polh啟動子； (ii) 該第二Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中且包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列，其中該第二Rep編碼區可操作地連接至polh啟動子； (iii) 該VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且可操作地連接至p10啟動子，其中該VP區域包含： (a) 經修飾之Kozak序列(例如，包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33包含不超過一個、兩個或三個不同的核苷酸之核苷酸序列)，其位於VP編碼區之5'端(例如，位於VP編碼區之起始處)；及 (b) 編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內。 E570. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E411、E419-E422、E434-E436、E445-E475、E480、E483、E485、E487、E489、E491、E493、E495、E497、E499、E501-E552、E554、E556、E558、E560、E566或E568中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中且包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之核苷酸序列，且其中該第一Rep編碼區可操作地連接至gp64啟動子及polh啟動子；及 (ii) 該VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且可操作地連接至p10啟動子，其中該VP編碼區包含： (a) 經修飾之Kozak序列(例如，包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33包含不超過一個、兩個或三個不同的核苷酸之核苷酸序列)，其位於VP編碼區之5'端(例如，位於VP編碼區之起始處)；及 (b) 編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內。 E571. 如實施例E362-E365、E374-E381、E386-E390、E412-418、E423-E433、E437、E440-E444、E456-E553、E555、E557、E559、E565、E567或E569中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該第一Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列，且其中該第一Rep編碼區可操作地連接至polh啟動子； (ii) 該第二Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中且包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列，其中該第二Rep編碼區可操作地連接至polh啟動子； (iii) 該VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且可操作地連接至p10啟動子，其中以5'至3'順序，該VP區域包含： (a) 經修飾之Kozak序列，其視情況包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33包含不超過一個、兩個或三個不同的核苷酸之核苷酸序列；及 (b) 編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內。 E572. 如實施例E359、E360、E366-E373、E383-E385、E391-E411、E419-E422、E434-E436、E445-E475、E480、E483、E485、E487、E489、E491、E493、E495、E497、E499、E501-E552、E554、E556、E558、E560、E566、E568或E570中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中： (i) 該Rep編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中且包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之核苷酸序列，其中編碼Rep52蛋白質之核苷酸序列包含於編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列內，且其中該第一Rep編碼區可操作地連接至gp64啟動子及polh啟動子；及 (ii) 該VP編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且可操作地連接至p10啟動子，其中以5'至3'順序，該VP區域包含： (a) 經修飾之Kozak序列，其視情況包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33包含不超過一個、兩個或三個不同的核苷酸之核苷酸序列；及 (b) 編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內。 E573. 一種包含AAV表現構築體之變異型桿狀病毒基因體，該AAV表現構築體包含： (i) 第一Rep編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中； (ii) 第二Rep編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中；及 (iii) VP編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中。 E574. 一種包含AAV表現構築體之變異型桿狀病毒基因體，該AAV表現構築體包含： (i) 第一Rep編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且可操作地連接至polh啟動子； (ii) 第二Rep編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中且可操作地連接至polh啟動子；及 (iii) VP編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且可操作地連接至p10啟動子。 E575. 一種包含AAV表現構築體之變異型桿狀病毒基因體，該AAV表現構築體包含： (i) 第一Rep編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列； (ii) 第二Rep編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中且包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列；及 (iii) VP編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內。 E576. 一種包含AAV表現構築體之變異型桿狀病毒基因體，該AAV表現構築體包含： (i) 第一Rep編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列，其中該第一Rep編碼區可操作地連接至polh啟動子； (ii) 第二Rep編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中且包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列，其中該第二Rep編碼區可操作地連接至polh啟動子；及 (iii) VP編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內，且其中該VP編碼區可操作地連接至p10啟動子；視情況其中該VP編碼區相對於第一Rep編碼區以反向定向。 E577. 一種包含AAV表現構築體之變異型桿狀病毒基因體，該AAV表現構築體包含： (i) 第一Rep編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中； (ii) 第二Rep編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中； (iii) VP編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中；及 (iv) 第二VP編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中。 E578. 一種包含AAV表現構築體之變異型桿狀病毒基因體，該AAV表現構築體包含： (i) 第一Rep編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列； (ii) 第二Rep編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中且包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列； (iii) VP編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內；及 (iv) 第二VP編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且包含相對於VP2蛋白質或VP3蛋白質主要編碼VP1蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的VP1蛋白質(例如，但不編碼VP2或VP3蛋白質)之核苷酸序列。 E579. 一種包含AAV表現構築體之變異型桿狀病毒基因體，該AAV表現構築體包含： (i) 第一Rep編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列，其中該第一Rep編碼區可操作地連接至polh啟動子； (ii) 第二Rep編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中且包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列，且其中該第二Rep編碼區可操作地連接至polh啟動子； (iii) VP編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內，且其中該VP編碼區可操作地連接至p10啟動子；及 (iv) 第二VP編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且包含相對於VP2蛋白質或VP3蛋白質主要編碼VP1蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的VP1蛋白質(例如，但不編碼VP2或VP3蛋白質)之核苷酸序列，且其中該第二VP編碼區可操作地連接至ctx啟動子；視情況其中該VP編碼區相對於該第一Rep編碼區以反向定向。 E580. 一種包含AAV表現構築體之變異型桿狀病毒基因體，該AAV表現構築體包含： (i) 第一Rep編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質(例如，但不編碼Rep52蛋白質)之核苷酸序列，且其中該第一Rep編碼區可操作地連接至polh啟動子； (ii) 第二Rep編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之egt基因座中且包含編碼Rep52蛋白質但不編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列，且其中該第二Rep編碼區可操作地連接至polh啟動子；及 (iii) VP編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且可操作地連接至p10啟動子，其中該VP區域包含： (a) 經修飾之Kozak序列，其位於該VP編碼區之5'端(例如，位於該VP編碼區之起始處)，視情況其中該經修飾之Kozak序列包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33包含不超過一個、兩個或三個不同的核苷酸之核苷酸序列；及 (b) 編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內。 E581. 如實施例E196-E471中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其進一步包含編碼組裝活化蛋白質(AAP)之核苷酸序列。 E582. 如實施例E581之變異型桿狀病毒基因體，其中該經編碼之AAP蛋白質係AAV2 AAP蛋白質。 E583. 如實施例E581或E582之變異型桿狀病毒基因體，其中該經編碼之AAP蛋白質包含SEQ ID NO:218之胺基酸序列；與SEQ ID NO:218包含至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列；相對於SEQ ID NO:218包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過30、20或10個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之胺基酸序列；或相對於SEQ ID NO:218包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過30、20或10個不同胺基酸之胺基酸序列。 E584. 如實施例E581-E583中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該編碼AAP蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO:219之核苷酸序列；與SEQ ID NO:219包含至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:219包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過30、20或10個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:219包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過30、20或10個不同核苷酸之核苷酸序列。 E585. 如實施例E581-E584中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該編碼AAP蛋白質之核苷酸序列可操作地連接至啟動子。 E586. 如實施例E585之變異型桿狀病毒基因體，其中該啟動子係桿狀病毒主要晚期啟動子、病毒啟動子、昆蟲病毒啟動子、非昆蟲病毒啟動子、脊椎動物病毒啟動子、來自一或多個物種之包括病毒及非病毒元件之嵌合啟動子、合成啟動子或其變異體。 E587. 如實施例E585或E586之變異型桿狀病毒基因體，其中該啟動子係選自polh啟動子、p10啟動子、ctx啟動子、gp64啟動子、IE啟動子、IE-1啟動子、p6.9啟動子、Dmhsp70啟動子、Hsp70啟動子、p5啟動子、p19啟動子、p35啟動子、p40啟動子或其變異體，例如功能性片段。 E588. 如實施例E585-E587中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該啟動子係gp64啟動子，視情況其中該啟動子係來自OpMNPV桿狀病毒基因體之gp64啟動子。 E589. 如實施例E587或E588之變異型桿狀病毒基因體，其中該gp64啟動子包含SEQ ID NO:217之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E590. 如實施例E581-E589中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該編碼AAP蛋白質之核苷酸序列位於該變異型桿狀病毒基因體中之選自以下之位置：ChiA、v-cath、p10、egt、多角體蛋白、SOD、ctx、p26、odv-e56、p74 (PIF0)、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94。 E591. 如實施例E581-E590中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該編碼AAP蛋白質之核苷酸序列位於p26、p10及p74基因座中。 E592. 如實施例E581-E591中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該編碼AAP蛋白質之核苷酸序列位於p26、p10及p74基因座中，且可操作地連接至gp64啟動子。 E593. 如實施例E581-E592中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其進一步包含有效負載編碼區，該編碼區包含編碼有效負載之核苷酸序列。 E594. 一種包含AAV表現構築體之變異型桿狀病毒基因體，該AAV表現構築體包含： (i) Rep編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中，視情況其中該Rep編碼區可操作地連接至gp64啟動子及polh啟動子； (ii) VP編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中，視情況其中該VP編碼區可操作地連接至p10啟動子；及 (iii) 有效負載編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中；視情況其中該VP編碼區相對於Rep編碼區以反向定向。 E595. 一種包含AAV表現構築體之變異型桿狀病毒基因體，該AAV表現構築體包含： (i) Rep編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中且包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之核苷酸序列，其中編碼Rep52蛋白質之核苷酸序列包含於編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列內，且其中該第一Rep編碼區可操作地連接至gp64啟動子及polh啟動子； (ii) VP編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內；視情況其中該VP編碼區可操作地連接至p10啟動子；及 (iii) 有效負載編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含編碼有效負載之核苷酸序列；視情況其中該VP編碼區相對於Rep編碼區以反向定向。 E596. 一種包含AAV表現構築體之變異型桿狀病毒基因體，該AAV表現構築體包含： (i) Rep編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中且包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之核苷酸序列，其中編碼Rep52蛋白質之核苷酸序列包含於編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列內，且其中該第一Rep編碼區可操作地連接至gp64啟動子及polh啟動子； (ii) VP編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且可操作地連接至p10啟動子，其中該VP區域包含： (a) 經修飾之Kozak序列，其位於該VP編碼區之5'端(例如，位於該VP編碼區之起始處)，視情況其中該經修飾之Kozak序列包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33包含不超過一個、兩個或三個不同的核苷酸之核苷酸序列；及 (b) 編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內； (iii) 有效負載編碼區，其位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中且包含編碼有效負載之核苷酸序列；視情況其中該VP編碼區相對於該Rep編碼區以反向定向。 E597. 如實施例E292-E596中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其進一步包含AAV有效負載構築體。 E598. 一種變異型桿狀病毒基因體，其包含有包含有效負載編碼區之AAV有效負載構築體，其中該變異型桿狀病毒基因體包含至少兩個非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)之破壞，其中該至少兩個非必需基因係獨立地選自egt、p74 (PIF0)、p26、SOD、ChiA、v-cath、p10、多角體蛋白、ctx、odv-e56、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94。 E599. 如實施例E597或E598之變異型桿狀病毒基因體，其中該有效負載編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體中之選自以下之位置：ChiA、v-cath、p10、egt、多角體蛋白、SOD、ctx、p26、odv-e56、p74 (PIF0)、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94。 E600. 如實施例E593-E599中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該有效負載編碼區包含起始密碼子及編碼有效負載之核苷酸序列。 E601. 如實施例E593-E600中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該有效負載編碼區位於該變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座中。 E602. 如實施例E593-E601中任一項之變異型桿狀病毒基因體，或如實施例E434-E438中任一項之AAV有效負載構築體，其中該經編碼之有效負載包含治療性蛋白質或其功能性變異體；抗體或抗體片段；酶；基因編輯系統之組分；RNAi試劑(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)；或其組合。 E603. 一種變異型桿狀病毒基因體，其包含如實施例E292-E602中任一項之AAV表現構築體，及如實施例E597-E602中任一項之AAV有效負載構築體，其中該AAV表現構築體及該AAV有效負載構築體位於單一變異型桿狀病毒基因體中。 E604. 如實施例E292-E603中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該基因體序列係以電腦模擬方式產生(例如，設計)。 E605. 如實施例E292-E604中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其能夠產生至少70% (例如，至少80%、至少90%、至少100%、至少110%、至少120%、70-200%、70-150%、70-100%、80-200%、80-150%、80-100%、90-200%、90-150%、90-100%、100-200%、100-150%、100-125%、100-110%、125-200%、150-200%或175-200%)之由參考桿狀病毒基因體(例如，野生型桿狀病毒基因體)產生之桿狀病毒。 E606. 如實施例E292-E605中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒基因體之長度係至少10 kb-200 kb，例如長度係至少10 kb、20 kb、30 kb、40 kb、50 kb、60 kb、70 kb、80 kb、90 kb、100 kb、110 kb、120 kb、130 kb或140 kb，或10-175 kb、10-150 kb、10-125 kb、10-100 kb、10-75 kb、10-50 kb、10-25 kb、25-200 kb、25-175 kb、25-150 kb、15-125 kb、25-100 kb、25-75 kb、25-50 kb、50-200 kb、50-175 kb、50-150 kb、50-125 kb、50-100 kb、50-75 kb、75-200 kb、75-175 kb、75-150 kb、75-125 kb、75-100 kb、100-200 kb、100-175 kb、100-150 kb、100-125 kb、125-200 kb、125-175 kb、125-150 kb、150-200 kb、150-175 kb或175-200 kb。 E607. 如實施例E1-E180中任一項之桿狀病毒表現構築體，或如實施例E292-E606中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其包含至少一個非天然存在，例如經工程改造之功能性限制酶位點(例如，II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點))。 E608. 如實施例E607之桿狀病毒表現構築體，或如實施例E607之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列包含一或多個(例如，至少約1-4個、1-3個、1-2個、1個、2個、3個、4個或5個)所選擇的II型限制酶之1-20個，例如1-10、1-8、1-6、1-4、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個非天然存在，例如經工程改造之限制酶位點。 E609. 如實施例E607或E608之桿狀病毒表現構築體，或如實施例E607或E608之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不含一或多個(例如，約1-4個、1-3個、1-2個、1個、2個、3個、4個或5個)所選擇的II型限制酶之天然存在之位點，且包含一或多個所選擇的II型限制酶之至少約1-20個，例如至少約1-10、1-8、1-6、1-4、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個非天然存在之，例如經工程改造之限制酶位點。 E610. 如實施例E607-E609中任一項之桿狀病毒表現構築體，或如實施例E607-E609中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中與野生型桿狀病毒基因體相比，該非天然存在之限制酶位點位於不同位置。 E611. 如前述實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體、變異型桿狀病毒基因體或複數個片段，其中變異型桿狀病毒核苷酸序列係化學合成的及/或非模板化核苷酸序列(例如，非模板化片段)。 E612. 一種載體，其包含如實施例中任一項之桿狀病毒表現構築體E1-E180、如實施例E181-E291中任一項之複數個片段或如實施例E292-E611中任一項之變異型桿狀病毒基因體。 E613. 如實施例E612之載體，其係細菌人工染色體(BAC)。 E614. 一種細菌人工染色體(BAC)，其所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考BAC，例如野生型BAC少至少5個。 E615. 一種細菌人工染色體(BAC)，其所包含之一或多個(例如，1-4個、1-3個、1-2個、1個、2個、3個、4個或5個)所選擇的限制酶(例如，II型限制酶(例如，IIS型限制酶))之功能性限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考BAC，例如野生型BAC少至少5個。 E616. 一種載體，其包含桿狀病毒基因體或其變異體，其中該載體係BAC，且其中該BAC所包含之限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點))比參考BAC，例如野生型BAC少至少5個。 E617. 如實施例E612、E613或E616之載體，或如實施例E614或E615之BAC，其中該BAC不含II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)。 E618. 如實施例E612、E613、E616或E617之載體，或如實施例E614-E617中任一項之BAC，其中該BAC不含所選擇的限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)之識別位點。 E619. 如實施例E612、E613或E616-E618中任一項之載體，或如實施例E614-E618中任一項之BAC，其中該BAC不含兩個或更多個所選擇的限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)之識別位點。 E620. 一種細胞，其包含如實施例E1-E180或E607-E611中任一項之桿狀病毒表現構築體、如實施例E181-E291或E612中任一項之複數個片段、如實施例E292-E612中任一項之變異型桿狀病毒基因體、如實施例E612、E613或E616-E619之載體或如實施例E614-E619中任一項之BAC。 E621. 如實施例E620之細胞，其係昆蟲細胞(例如，Sf9細胞或Sf21)、哺乳動物細胞(例如，HEK293細胞)或細菌細胞(例如，大腸桿菌)。 E622. 一種組合物，其包含如實施例E1-E180或E607-E611中任一項之桿狀病毒表現構築體、如實施例E181-E291或E612中任一項之複數個片段，如實施例E292-E612中任一項之變異型桿狀病毒基因體，如實施例E612、E613或E616-E619之載體或如實施例E614-E619中任一項之BAC，及載劑。 E623. 一種套組，其包含如實施例E1-E180或E607-E611中任一項之桿狀病毒表現構築體、如實施例E181-E291或E612中任一項之複數個片段、如實施例E292-E612中任一項之變異型桿狀病毒基因體、如實施例E612、E613或E616-E619之載體或如實施例E614-E619中任一項之BAC，及使用說明書。 E624. 如實施例E623之套組，其進一步包含一或多個限制酶(例如，II型限制酶(例如，IIS型限制酶))。 E625. 一種AAV病毒產生系統，其包含有包含如實施例E292-E612中任一項之AAV表現構築體之變異型桿狀病毒基因體及包含如實施例E597-E602中任一項之AAV有效負載構築體之變異型桿狀病毒基因體。 E626. 一種AAV病毒產生系統，其包含如實施例E603之變異型桿狀病毒基因體。 E627. 如實施例E625或E626之AAV病毒產生系統，其包含AAV病毒產生細胞，該細胞包含有包含AAV表現構築體之變異型桿狀病毒基因體及包含AAV有效負載構築體之變異型桿狀病毒基因體。 E628. 如實施例E627之AAV病毒產生系統，其中該AAV病毒產生細胞係昆蟲細胞，視情況係Sf9細胞或Sf21細胞。 E629. 一種用於在AAV病毒產生細胞中產生重組腺相關病毒(rAAV)粒子之方法，該方法包含：(i)提供如實施例E626-E628中任一項之AAV病毒產生系統，其中AAV表現構築體包含一或多個VP編碼區，該一或多個VP編碼區包含一或多個編碼VP1、VP2及VP3衣殼蛋白質之核苷酸序列；(ii)將AAV病毒產生系統轉染至AAV病毒產生細胞中；(iii)將該AAV病毒產生細胞暴露於允許該AAV病毒產生細胞將該AAV表現構築體及該AAV有效負載構築體處理成rAAV粒子之條件；及視情況地，(iv)自該AAV病毒產生細胞，例如昆蟲細胞，諸如Sf9細胞或Sf21細胞收集該等rAAV粒子。 E630. 一種重組腺相關病毒(rAAV)粒子，其係藉由如實施例E629之方法產生。 E631. 一種用於產生AAV粒子之方法，該方法包含： (i) 提供包含如實施例E292-E612中任一項之變異型桿狀病毒基因體之細胞，或包含如實施例E625-E628中任一項之AAV產生系統之細胞； (ii) 在適合於產生該AAV粒子之條件下培育該細胞；藉此產生該AAV粒子。 E632. 一種重組腺相關病毒(rAAV)粒子，其係藉由如實施例E631之方法產生。 E633. 一種醫藥組合物，其包含如實施例E630或E632之rAAV粒子及醫藥學上可接受之賦形劑。 E634. 一種用於產生變異型桿狀病毒基因體之方法，其包含： (i) 提供複數個片段，例如次基因體片段或次片段，其中各片段包含： (a) 獨有的5'突出物及3'突出物，或5'端處之與另一片段之3'端處的核苷酸序列重疊(例如，同源)之核苷酸序列，其中重疊區域中之序列係一對片段所獨有的； (b) 變異型桿狀病毒核苷酸序列，其所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少5個； (ii) 將修飾(例如，插入、取代或缺失)，例如一或多個修飾引入一或多個包含該變異型桿狀病毒核苷酸序列之片段中；及 (iii) 在適合於形成變異型桿狀病毒基因體之條件下培育該複數個片段；藉此產生該變異型桿狀病毒基因體。 E635. 一種用於產生變異型桿狀病毒基因體之方法，其包含： (i) 提供複數個片段，例如次基因體片段或次片段，其中各片段包含： (a) 獨有的5'突出物及3'突出物，或5'端處之與另一片段之3'端處的核苷酸序列重疊(例如，同源)之核苷酸序列，其中重疊區域中之序列係一對片段所獨有的； (b) 變異型桿狀病毒核苷酸序列，其所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個；其中該複數個片段中之一或多者包含變異型桿狀病毒核苷酸序列中之修飾(例如，插入、取代或缺失)，例如一或多個修飾；及 (ii) 在適合於形成變異型桿狀病毒基因體之條件下培育該複數個片段；藉此產生該變異型桿狀病毒基因體。 E636. 如實施例E634或E635之方法，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60個，例如少15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-60、20-50、20-40、20-30、30-60、30-50、30-40、40-60、40-50或50-60個。 E637. 如實施例E634-E636中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列中所包含之： (i) II型限制酶，例如所選擇的II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個；或 (ii) 兩個或更多個(例如，2-5個、2個、3個、4個或5個)所選擇的II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個。 E638. 如實施例E634-E637中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列所包含之功能性IIS型限制酶位點(例如，天然存在之功能性IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個。 E639. 如實施例E634-E638中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列中所包含之： (i) 所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個；或 (ii) 兩個或更多個(例如，2-5個、2個、3個、4個或5個)所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個。 E640. 如實施例E634-E639中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不包含： (i) 兩個或更多個(例如，2個、3個、4個或5個)所選擇的II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)； (ii) 所選擇的II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)；或 (iii) II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。 E641. 如實施例E634-E640中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不包含所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。 E642. 如實施例E634-E641中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不包含兩個或更多個(例如，2個、3個、4個或5個)所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。 E643. 如實施例E634-E642中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不包含IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。 E644. 如實施例E634-E643中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不含： (i) 所選擇的II型限制酶之識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)； (ii) 1-5個(例如，1-4個、1-3個、1-2個、1個、2個、3個、4個或5個)所選擇的II型限制酶之識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)；或 (iii) II型限制酶之識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。 E645. 如實施例E634-E644中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不含IIS型限制酶位點。 E646. 如實施例E634-E645中任一項之方法，其中該等IIS型限制酶位點係所選擇的IIS型限制酶之識別位點。 E647. 如實施例E634-E646中任一項之方法，其中該等IIS型限制酶位點係兩個或更多個(例如，2個、3個、4個或5個)所選擇的IIS型限制酶之識別位點。 E648. 如實施例E634-E647中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不含IIS型限制酶位點。 E649. 如實施例E634-E648中任一項之方法，其中該限制酶位點係由具有以下特性中之一者、兩者、三者、四者或全部之限制酶識別： (i) 在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物； (ii) 由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對； (iii) 在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物； (iv) 可熱不活化；及/或 (v) 識別具有至少4-8個鹼基對，例如至少4個鹼基對、至少5個鹼基對、至少6個鹼基對、至少7個鹼基對或至少8個鹼基對(例如，8個鹼基對)之延伸部分。 E650. 如實施例E634-E649中任一項之方法，其中該限制酶位點係II型限制酶位點。 E651. 如實施例E634-E650中任一項之方法，其中該限制酶位點係由能夠用於Gibson Assembly™選殖及接合方法(例如，Gibson等人, 「Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases」, Nat. Methods, 2009, 6(5):343-5中所描述之方法；其內容以全文引用之方式併入本文中)之限制酶，例如Gibson Assembly™相容酶識別。 E652. 如實施例E634-E651中任一項之方法，其中該限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E653. 如實施例E634-E652中任一項之方法，其中該限制酶位點係IIS型限制酶位點。 E654. 如實施例E634-E653中任一項之方法，其中該IIS型限制酶位點係由選自以下之限制酶識別；AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E655. 如實施例E634-E654中任一項之方法，其中該IIS型限制酶位點係BsmBI限制酶位點、BsaI限制酶位點、PaqCI限制酶位點或其組合。 E656. 如實施例E634-E655中任一項之方法，其中該IIS型限制酶位點係BsmBI限制酶位點。 E657. 如實施例E634-E656中任一項之方法，其中該限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E658. 如實施例E634-E657中任一項之方法，其中該限制酶位點係由以下識別：AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E659. 如實施例E634-E658中任一項之方法，其中該限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E660. 如實施例E634-E658中任一項之方法，其中該限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E661. 如實施例E634-E660中任一項之方法，其中該減少的至少5個功能性IIS型限制酶位點中之至少一個、兩個、三個、四個或更多個係不同的IIS型限制酶位點，例如第一IIS型限制酶位點及第二IIS型限制酶位點，視情況其中： (i) 該第一IIS型限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶；及 (ii) 該第二IIS型限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E662. 如實施例E634-E661中任一項之方法，其中各片段相對於該複數個片段中之其他片段包含不同的5'突出物及/或3'突出物。 E663. 如實施例E634-E662中任一項之方法，其中各片段能夠基於一個片段中之獨有的5'突出物與另一片段中之獨有的3'突出物之互補性而有序地組裝。 E664. 如實施例E634-E663中任一項之方法，其中該複數個片段中之一者之獨有的5'突出物與該複數個片段中之另一者之獨有的3'突出物互補。 E665. 如實施例E634-E664中任一項之方法，其中該獨有的5'突出物與該獨有的3'突出物部分互補或完全互補。 E666. 如實施例E634-E665中任一項之方法，其中該複數個片段中之各者包含5'端處的與該複數個片段中之另一者之3'端處的核苷酸序列重疊(例如，同源)之核苷酸序列，其中重疊區域係一對片段所獨有的。 E667. 如實施例E634-E666中任一項之方法，其中該複數個片段能夠基於一個片段(例如，次基因體片段或次片段)之5'端處的核苷酸序列與另一片段(例如，次基因體片段或次片段)之3'端處的核苷酸序列之重疊而有序地組裝，以產生變異型桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體。 E668. 如實施例E666或E667之方法，其中該等片段之間的核苷酸序列之重疊係4-50個(例如，4-45個、4-40個、4-35個、4-30個、4-25個、4-20個、4-15個、4-10個、10-50個、10-45個、10-40個、10-35個、10-30個、10-25個、10-20個、10-15個、15-50個、15-45個、15-40個、15-35個、15-30個、15-25個、15-20個、20-50個、20-45個、20-40個、20-35個、20-30個、20-25個、25-50個、25-45個、25-40個、25-35個、25-30個、30-50個、30-45個、30-40個、30-35個、35-50個、35-45個、35-40個、40-50個、40-45個)相鄰鹼基對。 E669. 如實施例E634-E668中任一項之方法，其中該獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係由限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)進行之片段之裂解產生。 E670. 如實施例E634-E669中任一項之方法，其中該5'及3'突出物之長度各自獨立地包含1-6個核苷酸，例如2-5個核苷酸(例如，4個核苷酸)。 E671. 如實施例E634-E670中任一項之方法，其中該獨有的5'及3'突出物各自獨立地包含4個核苷酸。 E672. 如實施例E634-E671中任一項之方法，其中該等片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係各自獨立地選自ACAA、GGTC、GACC、CCAG、CTGG、CCTT、AAGG、TCAT、ATGA、TCGC、GCGA、AGAG、CTCT、AACT、AGTT、CGGT、ACCG、ATAC、GTAT、GAGT、ACTC、TTCC、GGAA、ATTA、TAAT、TCCT、AGGA、TCTA、TAGA、TGTA、TACA、GATG、CATC或TTGT，其中片段中之該獨有的5'突出物及3'突出物之序列係不同的。 E673. 如實施例E634-E672中任一項之方法，其中該限制酶位點係BsaI限制酶位點或BsmBI限制酶位點。 E674. 如實施例E634-E673中任一項之方法，其中： (i) 該等次基因體片段係由第一限制酶，例如第一II型限制酶(例如，第一IIS型限制酶)進行之裂解產生；及/或 (ii) 該等次片段係由第二限制酶，例如第二II型限制酶(例如，第二IIS型限制酶)進行之裂解產生；其中該第一限制酶，例如第一II型限制酶(例如，第一IIS型限制酶)與該第二限制酶，例如第二II型限制酶(例如，第二IIS型限制酶)不同。 E675. 如實施例E634-E674中任一項之方法，其中該複數個片段中之一或多者能夠基於該複數個片段中之一者(例如，次基因體片段或次片段)中之獨有的5'突出物與該複數個片段中之另一者(例如，次基因體片段或次片段)中之獨有的3'突出物之互補性而有序地組裝，以產生變異型桿狀病毒基因體。 E676. 如實施例E674或E675之方法，其中該限制酶、該第一限制酶及/或該第二限制酶包含以下特性中之一者、兩者、三者、四者或全部： (i) 在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物； (ii) 由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對； (iii) 在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物； (iv) 可熱不活化；及/或 (v) 識別具有至少4-8個鹼基對，例如至少4個鹼基對、至少5個鹼基對、至少6個鹼基對、至少7個鹼基對或至少8個鹼基對(例如，8個鹼基對)之延伸部分。 E677. 如實施例E674-E676中任一項之方法，其中該第一限制酶及/或第二限制酶係II型限制酶。 E678. 如實施例E674-E677中任一項之方法，其中該限制酶、該第一限制酶及/或該第二限制酶係能夠用於Gibson Assembly™選殖及接合方法(例如，Gibson等人, 「Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases」, Nat. Methods, 2009, 6(5):343-5中所描述之方法；其內容以全文引用之方式併入本文中)之限制酶，例如Gibson Assembly™相容酶。 E679. 如實施例E674-E678中任一項之方法，其中該限制酶、該第一限制酶及/或該第二限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E680. 如實施例E674-E679中任一項之方法，其中該限制酶、該第一限制酶及/或該第二限制酶係IIS型限制酶。 E681. 如實施例E680之方法，其中該IIS型限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E682. 如實施例E680或E681之方法，其中該IIS型限制酶係BsaI限制酶、BsmBI限制酶、PaqCI限制酶或其組合。 E683. 如實施例E674-E682中任一項之方法，其中： (i) 該第一限制酶係BsmBI且該第二限制酶係BsaI；或 (ii) 該第一限制酶係BsaI且該第二限制酶係BsmBI。 E684. 如實施例E674-E683中任一項之方法，其中該限制酶、該第一限制酶及/或第二限制酶係選自：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E685. 如實施例E674-E684中任一項之方法，其中該限制酶、該第一限制酶及/或該第二限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E686. 如實施例E674-E685中任一項之方法，其中該限制酶、該第一限制酶及/或該第二限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E687. 如實施例E674-E685中任一項之方法，其中該限制酶、該第一限制酶及/或該第二限制酶係AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E688. 如實施例E674-E687中任一項之方法，其中該複數個片段中之一或多者能夠基於該複數個片段中之一者之5'端處的核苷酸序列與另一片段之3'端處的核苷酸序列之重疊而有序地組裝，以產生變異型桿狀病毒基因體。 E689. 如實施例E688之方法，其中該等片段之間的核苷酸序列之重疊係4-50個(例如，4-45個、4-40個、4-35個、4-30個、4-25個、4-20個、4-15個、4-10個、10-50個、10-45個、10-40個、10-35個、10-30個、10-25個、10-20個、10-15個、15-50個、15-45個、15-40個、15-35個、15-30個、15-25個、15-20個、20-50個、20-45個、20-40個、20-35個、20-30個、20-25個、25-50個、25-45個、25-40個、25-35個、25-30個、30-50個、30-45個、30-40個、30-35個、35-50個、35-45個、35-40個、40-50個、40-45個)相鄰鹼基對。 E690. 如實施例E689之方法，其中5'核酸外切酶產生對應於片段之間的重疊序列之單股互補區，從而產生能夠彼此黏接之片段。 E691. 如實施例E690之方法，其中經黏接之片段之間的任何空位係由DNA聚合酶填充。 E692. 如實施例E634-E691中任一項之方法，其中該複數個片段中之一或多者係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly或Gibson Assembly™，從而形成變異型桿狀病毒基因體，視情況其中該複數個片段係在單步驟中接合以形成變異型桿狀病毒基因體。 E693. 如實施例E634-E692中任一項之方法，其中複數個次片段中之各者之長度在50-1000 bp之間，例如約50-900、50-800、50-700、50-600、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、100-900、100-800、100-700、100-600、100-500、100-400、100-300、100-200、200-1000、200-900、200-800、200-700、200-600、200-500、200-400、200-300、400-1000、400-900、400-800、400-700、400-600、400-500、600-1000、600-900、600-800、600-700、800-1000、800-900或900-1000 bp (例如，100-800 bp、約250-750 bp、約400-600 bp或約500 bp)。 E694. 如實施例E634-E693中任一項之方法，其中複數個次基因體片段中之各者之長度在100-25000 bp之間(例如，長度係約100-1000 bp、約100-10000 bp、約100-20000 bp、約100-25000 bp、約1000-10000 bp、約1000-8000 bp、約1000-5000 bp、約1000-2500 bp、約2500-25000 bp、約2500-20000 bp、約2500-15000 bp、約2500-10000 bp、約2500-5000 bp、約5000-25000 bp、約5000-20000 bp、約5000-15000 bp、約5000-10000 bp、約7500-25000 bp、約7500-20000、約7500-15000 bp、約7500-10000 bp、約10000-25000 bp、約10000-20000 bp、約10000-15000 bp、約15000-25000 bp、約15000-20000 bp、約20000-25000 bp、約7000-9000 bp或約8000 bp)。 E695. 如實施例E634-E694中任一項之方法，其中該複數個片段中之一或多者之變異型桿狀病毒核苷酸序列包含修飾，例如插入、缺失或取代。 E696. 如實施例E695之方法，其中該修飾，例如插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變)位於非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)或非必需基因之調節區中(例如，啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入)。 E697. 如實施例E696之方法，其中該非必需基因係選自以下中之一者、兩者、三者或更多者(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21者)：egt、p74 (PIF0)、p26、SOD、ChiA、v-cath、p10、多角體蛋白、ctx、odv-e56、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94。 E698. 如實施例E695-E697中任一項之方法，其包含以下中之修飾，例如插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變)： (i) v-cath及egt； (ii) v-cath、egt及SOD； (iii) chiA、v-cath、egt、p26、p10及p74； (iv) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74及SOD；或 (v) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74、SOD、AcORF-91及AcORF-108。 E699. 如實施例E695-E698中任一項之方法，其中該修飾包含chiA基因、v-cath基因、p26基因、p10基因及/或p74基因或其一部分之缺失。 E700. 如實施例E695-E699中任一項之方法，其中該修飾包含該非必需基因或相鄰區域中之異源序列之插入。 E701. 如實施例E695-E700中任一項之方法，其中該修飾包含該非必需基因或相鄰區域中之一或多個突變。 E702. 如實施例E695-E701中任一項之方法，其中該非必需基因位於同源重複序列區5 (hr5)附近(例如，下游或上游)。 E703. 如實施例E695-E702中任一項之方法，其中該修飾，例如插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變)引起非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)或非必需基因之調節區之不活化(例如，啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入)。 E704. 如實施例E695-E703中任一項之方法，其中該複數個片段中之一或多者之變異型桿狀病毒核苷酸序列包含非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)或非必需基因之調節區之破壞，例如突變(例如，框移突變)、缺失、插入或不活化(例如，啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入)。 E705. 如實施例E695-E704中任一項之方法，其中藉由化學合成或PCR，例如基於PCR之定點突變誘發來引入該修飾。 E706. 如實施例E695-E705中任一項之方法，其中該複數個片段中之一或多者包含異源核苷酸序列。 E707. 如實施例E706之方法，其中該異源核苷酸序列包含所關注的序列(例如，編碼Rep編碼區、一或多個Rep蛋白質、VP編碼區、一或多個VP蛋白質及/或有效負載之核苷酸序列)。 E708. 如實施例E707之方法，其中該所關注的序列係編碼所關注的多肽之核苷酸序列或所關注的核苷酸序列。 E709. 如實施例E707或E708之方法，其中該所關注的序列可操作地連接至第一啟動子(例如，桿狀病毒早期啟動子或桿狀病毒早期-晚期啟動子)及/或第二啟動子(例如，桿狀病毒晚期啟動子或桿狀病毒極晚期啟動子)。 E710. 如實施例E707-E709中任一項之方法，其中該所關注的序列可操作地連接至第一啟動子(例如，桿狀病毒早期啟動子或桿狀病毒早期-晚期啟動子)及第二啟動子(例如，桿狀病毒晚期啟動子或桿狀病毒極晚期啟動子)。 E711. 如實施例E709或E710之方法，其中該第一及/或第二啟動子係選自桿狀病毒啟動子、病毒啟動子、昆蟲病毒啟動子、非昆蟲病毒啟動子、脊椎動物病毒啟動子、來自一或多個物種之包括病毒及非病毒元件之嵌合啟動子、合成啟動子或其變異體。 E712. 如實施例E709-E711中任一項之方法，其中該第一及/或第二啟動子係選自polh啟動子、p10啟動子、ctx啟動子、gp64啟動子、IE啟動子、IE-1啟動子、p6.9啟動子、Dmhsp70啟動子、Hsp70啟動子、p5啟動子、p19啟動子、p35啟動子、p40啟動子或其變異體，例如功能性片段。 E713. 如實施例E709-E712中任一項之方法，其中該第一及/或第二啟動子係選自桿狀病毒早期啟動子、桿狀病毒晚期啟動子、桿狀病毒早期-晚期啟動子或桿狀病毒極晚期啟動子。 E714. 如實施例E709-E713中任一項之方法，其中第一及/或第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子、桿狀病毒晚期啟動子或桿狀病毒早期-晚期啟動子。 E715. 如實施例E709-E714中任一項之方法，其中第一及/或第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子(例如，gp64啟動子)。 E716. 如實施例E709-E715中任一項之方法，其中該第一或第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子(例如，polh啟動子)。 E717. 如實施例E709-E716中任一項之方法，其中： (a) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子， (b) 該第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子， (c) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子， (d) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (e) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子， (f) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (g) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子， (h) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子， (i) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子， (j) 該第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子， (k) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子， (l) 該第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (m) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (n) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子，或 (o) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子。 E718. 如實施例E709-E717中任一項之方法，其中該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子(例如，gp64啟動子)且該第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子(例如，polh啟動子)。 E719. 如實施例E709-E718中任一項之方法，其中該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子。 E720. 如實施例E709-E719中任一項之方法，其中 (a) 該桿狀病毒早期啟動子係選自：lef3啟動子、dbp啟動子、p35啟動子、orf82啟動子、get啟動子、orf81啟動子、orf122啟動子、pk-2啟動子、orf55啟動子、etl啟動子、hcf-1啟動子、etm啟動子、lef-2啟動子、lef-6啟動子、orf84啟動子、orf118啟動子或orf111啟動子， (b) 該桿狀病毒早期-晚期啟動子係選自：lef2啟動子、orf13啟動子、orf23啟動子、pkip啟動子、v-fgf啟動子、pp31啟動子、odv-e66啟動子、orf74啟動子、orf79啟動子、orf82啟動子、p15啟動子、cg30啟動子、解螺旋酶啟動子、he65啟動子、orf114啟動子、pk-2啟動子、gp64啟動子、gp16啟動子、alk-exo啟動子、p35啟動子、me53啟動子或ie0啟動子， (c) 該桿狀病毒晚期啟動子係選自：ptpase啟動子、Ac-bro啟動子、ctx啟動子、orf5啟動子、orf19啟動子、orf20啟動子、sod啟動子、HisP啟動子、orf34啟動子、v-ubi啟動子、orf38啟動子、orf43啟動子、orf44啟動子、orf56啟動子、orf59啟動子、orf60啟動子或fp-25k啟動子，及/或 (d) 該桿狀病毒極晚期啟動子係選自p10啟動子或polh啟動子。 E721. 如實施例E709-E720中任一項之方法，其中該第一及/或第二啟動子包含TATA盒模體及/或CAGT模體。 E722. 如實施例E709-E721中任一項之方法，其中該第一及/或第二啟動子包含TAAG模體(例如，ATAAG核苷酸序列)。 E723. 如實施例E709-E722中任一項之方法，其中該第一及/或第二啟動子包含TATA盒模體及TAAG模體。 E724. 如實施例E709-E723中任一項之方法，其中該第一或第二啟動子包含VLF-1之結合位點。 E725. 如實施例E709-E724中任一項之方法，其中該第一或第二啟動子係gp64啟動子(例如，OpMNPV gp64啟動子)。 E726. 如實施例E709-E725中任一項之方法，其中該第一或第二啟動子係polh啟動子(例如，OpMNPV polh啟動子或AcMNPV polh啟動子)。 E727. 如實施例中任一項之方法E709-E72669，其中該第一啟動子係gp64啟動子且該第二啟動子係polh啟動子，或其中該第一啟動子係polh啟動子且該第二啟動子係gp64啟動子。 E728. 如實施例E709-E727中任一項之方法，其中該Rep編碼區可操作地連接至第一啟動子(其係桿狀病毒早期-晚期啟動子)及第二啟動子(其係桿狀病毒極晚期啟動子)，例如gp64啟動子及polh啟動子，視情況其中該Rep編碼區位於同源重複序列區hr5之下游。 E729. 如實施例E709-E728中任一項之方法，其中該第一啟動子係gp64啟動子且該第二啟動子係polh啟動子。 E730. 如實施例E709-E717或E720-E726之方法，其中該第一啟動子及該第二啟動子係相同的。 E731. 如實施例E709-E730之方法，其中該第一啟動子及該第二啟動子係不同的。 E732. 如實施例E730之方法，該第一啟動子及該第二啟動子各自為polh啟動子。 E733. 如實施例E712-E731之方法，其中該gp64啟動子包含SEQ ID NO:217之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E734. 如實施例E712-E732之方法，其中該polh啟動子包含SEQ ID NO:167或220之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:167或220包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:167或220包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E735. 如實施例E712-E732中任一項之方法，其中該第一啟動子及該第二啟動子包含SEQ ID NO:221之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:221包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:221包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E736. 如實施例E707-E735中任一項之方法，其中該所關注的序列編碼治療性蛋白質或其功能性變異體、抗體或抗體片段；酶；基因編輯系統之組分；RNAi試劑(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)；或其組合。 E737. 如實施例E634-E736中任一項之方法，其中該複數個片段中之一或多者(例如，次基因體片段或次片段)編碼一或多個AAV蛋白質。 E738. 如實施例E634-E737中任一項之方法，其中該複數個片段中之一或多者(例如，次基因體片段或次片段)編碼AAV Rep蛋白質，例如Rep40、Rep52、Rep68、Rep78或其組合。 E739. 如實施例E634-E738中任一項之方法，其中該複數個片段中之一或多者(例如，次基因體片段或次片段)編碼Rep78蛋白質及/或Rep52蛋白質。 E740. 如實施例E634-E739中任一項之方法，其中該複數個片段中之一或多者(例如，次基因體片段或次片段)編碼AAV衣殼蛋白質，例如VP1蛋白質、VP2蛋白質、VP3蛋白質或其組合。 E741. 如實施例E634-E740中任一項之方法，其中該複數個片段中之一或多者(次基因體片段或次片段)編碼AAV1衣殼蛋白質、AAV2衣殼蛋白質、AAV3衣殼蛋白質、AAV4衣殼蛋白質、AAV5衣殼蛋白質、AAV6衣殼蛋白質、AAV8衣殼蛋白質、AAV9衣殼蛋白質、AAVrh10衣殼蛋白質或其變異體。 E742. 如實施例E634-E741中任一項之方法，其中該複數個片段中之一或多者(例如，次基因體片段或次片段)編碼AAV5衣殼蛋白質或其變異體，或AAV9衣殼蛋白質或其變異體。 E743. 如實施例E634-E742中任一項之方法，其中該複數個片段中之一或多者(例如，次基因體片段或次片段)編碼有效負載。 E744. 如實施例E743之方法，其中該經編碼之有效負載係選自治療性蛋白質或其功能性變異體；抗體或抗體片段；酶；基因編輯系統之組分；RNAi試劑(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)；或其組合。 E745. 如實施例E634-E744中任一項之方法，其中該複數個片段中之一或多者(例如，次基因體區域或次片段)係化學合成的或非模板化片段。 E746. 如實施例E634-E745中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒基因體能夠產生至少70% (例如，至少80%、至少90%、至少100%、至少110%、至少120%、70-200%、70-150%、70-100%、80-200%、80-150%、80-100%、90-200%、90-150%、90-100%、100-200%、100-150%、100-125%、100-110%、125-200%、150-200%或175-200%)之由參考桿狀病毒基因體(例如，野生型桿狀病毒基因體)產生之量的桿狀病毒，例如藉由病毒效價(例如，使用qPCR)評估。 E747. 如實施例E634-E746中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒基因體之長度係10 kb-200 kb，例如長度係至少10 kb、20 kb、30 kb、40 kb、50 kb、60 kb、70 kb、80 kb、90 kb、100 kb、110 kb、120 kb、130 kb或140 kb，或10-175 kb、10-150 kb、10-125 kb、10-100 kb、10-75 kb、10-50 kb、10-25 kb、25-200 kb、25-175 kb、25-150 kb、15-125 kb、25-100 kb、25-75 kb、25-50 kb、50-200 kb、50-175 kb、50-150 kb、50-125 kb、50-100 kb、50-75 kb、75-200 kb、75-175 kb、75-150 kb、75-125 kb、75-100 kb、100-200 kb、100-175 kb、100-150 kb、100-125 kb、125-200 kb、125-175 kb、125-150 kb、150-200 kb、150-175 kb或175-200 kb。 E748. 一種用於產生能夠組裝至變異型桿狀病毒基因體中的複數個次基因體片段之方法，其包含： (i) 提供參考，例如親本桿狀病毒基因體； (ii) 視情況地，鑑別該參考桿狀病毒基因體中之由限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)識別之一或多個位點，例如所有識別位點， (iii) 修飾該一或多個識別位點，使得該桿狀病毒基因體所包含之功能性限制酶位點，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少5個，藉此產生變異型桿狀病毒基因體， (iv) 將初代模板分成複數個次基因體片段，其中該複數個次基因體片段中之各者包含(a)獨有的5'突出物及獨有的3'突出物，且其中該等次基因體片段能夠基於一個次基因體片段中之5'突出物與另一次基因體片段中之3'突出物之互補性而有序地組裝，或(b)5'端處之核苷酸序列，其與另一片段之3'端處的核苷酸序列重疊(例如，同源)，其中重疊區域中之序列係一對片段所獨有的；藉此產生複數個次基因體片段。 E749. 如實施例E748之方法，其中該參考桿狀病毒基因體係選自以下之桿狀病毒之基因體：苜蓿銀紋夜蛾多核多角體病毒(AcMNPV) (例如，AcMNPV病毒株E2、C6或HR3)、家蠶核多角體病毒(BmNPV)、黎豆夜蛾核多角體病毒(AgMNPV)、花旗松毒蛾核多角體病毒(OpMNPV)、弧金翅夜蛾核多角體病毒(ThorMNPV)或其變異體。 E750. 如實施例E748或E749之方法，其中該變異型桿狀病毒基因體所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60個，例如少15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-60、20-50、20-40、20-30、30-60、30-50、30-40、40-60、40-50或50-60個。 E751. 如實施例E748-E750中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒基因體中所包含之： (i) II型限制酶，例如所選擇的II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個；或 (ii) 兩個或更多個(例如，2-5個、2個、3個、4個或5個)所選擇的II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個。 E752. 如實施例E748-E751中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒基因體所包含之功能性IIS型限制酶位點(例如，天然存在之功能性IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個。 E753. 如實施例E748-E752中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒基因體中所包含之： (i) 所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個；或 (ii) 兩個或更多個(例如，2-5個、2個、3個、4個或5個)所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列，例如野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個，例如少15-60個、15-50個、15-40個、15-30個、15-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個。 E754. 如實施例E748-E753中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒基因體不包含： (i) 兩個或更多個(例如，2個、3個、4個或5個)所選擇的II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)； (ii) 所選擇的II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)；或 (iii) II型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。 E755. 如實施例E748-E754中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒基因體不包含所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。 E756. 如實施例E748-E755中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒基因體不包含兩個或更多個(例如，2個、3個、4個或5個)所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。 E757. 如實施例E748-E756中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒基因體不包含IIS型限制酶之功能性識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。 E758. 如實施例E748-E757中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒基因體不含： (i) 所選擇的II型限制酶之識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)； (ii) 1-5個(例如，1-4個、1-3個、1-2個、1個、2個、3個、4個或5個)所選擇的II型限制酶之識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)；或 (iii) II型限制酶之識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。 E759. 如實施例E748-E758中任一項之方法，其中該變異型桿狀病毒基因體不含IIS型限制酶位點。 E760. 如實施例E748-E759中任一項之方法，其中變異型桿狀病毒基因體不含所選擇的IIS型限制酶之識別位點。 E761. 如實施例E748-E760中任一項之方法，其中變異型桿狀病毒基因體不含兩個或更多個(例如，2個、3個、4個或5個)所選擇的IIS型限制酶之識別位點。 E762. 如實施例E748-E761中任一項之複數個片段，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列不含IIS型限制酶位點。 E763. 如實施例E748-E762中任一項之方法，其中該限制酶位點係由具有以下特性中之一者、兩者、三者、四者或全部之限制酶識別： (i) 在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物； (ii) 由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對； (iii) 在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物； (iv) 可熱不活化；及/或 (v) 識別具有至少4-8個鹼基對，例如至少4個鹼基對、至少5個鹼基對、至少6個鹼基對、至少7個鹼基對或至少8個鹼基對(例如，8個鹼基對)之延伸部分。 E764. 如實施例E748-E763中任一項之方法，其中該限制酶位點係II型限制酶位點。 E765. 如實施例E748-E764中任一項之方法，其中該限制酶位點係由能夠用於Gibson Assembly™選殖及接合方法(例如，Gibson等人, 「Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases」, Nat. Methods, 2009, 6(5):343-5中所描述之方法；其內容以全文引用之方式併入本文中)之限制酶，例如Gibson Assembly™相容酶識別。 E766. 如實施例E748-E765中任一項之方法，其中該限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E767. 如實施例E748-E766中任一項之方法，其中該限制酶位點係IIS型限制酶位點。 E768. 如實施例E748-E767中任一項之方法，其中該IIS型限制酶位點係由選自以下之限制酶識別；AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E769. 如實施例E748-E768中任一項之方法，其中該IIS型限制酶位點係BsmBI限制酶位點、BsaI限制酶位點、PaqCI限制酶位點或其組合。 E770. 如實施例E748-E769中任一項之方法，其中該IIS型限制酶位點係BsmBI限制酶位點。 E771. 如實施例E748-E770中任一項之方法，其中該限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E772. 如實施例E748-E771中任一項之方法，其中該限制酶位點係由以下識別：AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E773. 如實施例E748-E772中任一項之方法，其中該限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E774. 如實施例E748-E772中任一項之方法，其中該限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E775. 如實施例E748-E774中任一項之方法，其中該減少的至少5個功能性IIS型限制酶位點中之至少一個、兩個、三個、四個或更多個係不同的IIS型限制酶位點，例如第一IIS型限制酶位點及第二IIS型限制酶位點，視情況其中： (i) 該第一IIS型限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶；及 (ii) 該第二IIS型限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E776. 如實施例E748-E775中任一項之方法，其中各片段相對於該複數個片段中之其他片段包含不同的5'突出物及/或3'突出物。 E777. 如實施例E748-E776中任一項之方法，其中一個次基因體片段之獨有的5'突出物與另一次基因體片段之獨有的3'突出物部分互補或完全互補。 E778. 如實施例E748-E777中任一項之方法，其中該複數個次基因體片段中之各者包含5'端處的核苷酸序列，其與該複數個次基因體片段中之另一者之3'端處的核苷酸序列重疊，其中重疊區域係一對次基因體片段所獨有的。 E779. 如實施例E748-E778中任一項之方法，其中該複數個次基因體片段能夠基於一個次基因體片段之5'端處的核苷酸序列與另一次基因體片段之3'端處的核苷酸序列之重疊而有序地組裝，以產生變異型桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體。 E780. 如實施例E778或E779之方法，其中該等次基因體片段之間的核苷酸序列之重疊係4-50個(例如，4-45個、4-40個、4-35個、4-30個、4-25個、4-20個、4-15個、4-10個、10-50個、10-45個、10-40個、10-35個、10-30個、10-25個、10-20個、10-15個、15-50個、15-45個、15-40個、15-35個、15-30個、15-25個、15-20個、20-50個、20-45個、20-40個、20-35個、20-30個、20-25個、25-50個、25-45個、25-40個、25-35個、25-30個、30-50個、30-45個、30-40個、30-35個、35-50個、35-45個、35-40個、40-50個、40-45個)相鄰鹼基對。 E781. 如實施例E748-E780中任一項之方法，其中次基因體片段中之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係由IIS型限制酶進行之片段之裂解產生。 E782. 如實施例E748-E781中任一項之方法，其中該5'及3'突出物之長度各自獨立地包含1-6個核苷酸，例如2-5個核苷酸(例如，4個核苷酸)。 E783. 如實施例E748-E782中任一項之方法，其中該等片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係各自獨立地選自：ACAA、GGTC、GACC、CCAG、CTGG、CCTT、AAGG、TCAT、ATGA、TCGC、GCGA、AGAG、CTCT、AACT、AGTT、CGGT、ACCG、ATAC、GTAT、GAGT、ACTC、TTCC、GGAA、ATTA、TAAT、TCCT、AGGA、TCTA、TAGA、TGTA、TACA、GATG、CATC或TTGT，其中片段中之該獨有的5'突出物及3'突出物之序列係不同的。 E784. 如實施例E748-E783中任一項之方法，其中該IIS型限制酶位點係BsaI限制酶位點或BsmBI限制酶位點。 E785. 如實施例E748-E784中任一項之方法，其中經組裝之次基因體片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly或Gibson Assembly™，從而形成變異型桿狀病毒基因體，視情況其中該等次基因體片段係在單步驟中接合以產生變異型桿狀病毒基因體。 E786. 如實施例E748-E785中任一項之方法，其中將該參考桿狀病毒基因體分成2-20個次基因體片段(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個次基因體片段)。 E787. 如實施例E748-E786中任一項之方法，其中各次基因體片段之長度係約100-25000 bp (例如，長度係約100-1000 bp、約100-10000、約100-20000、約100-25000、約1000-10000 bp、約1000-8000 bp、約1000-5000 bp、約1000-2500 bp、約2500-25000 bp、約2500-20000 bp、約2500-15000 bp、約2500-10000 bp、約2500-5000 bp、約5000-25000 bp、約5000-20000 bp、約5000-15000 bp、約5000-10000 bp、約7500-25000 bp、約7500-20000、約7500-15000 bp、約7500-10000 bp、約10000-25000 bp、約10000-20000 bp、約10000-15000 bp、約15000-25000 bp、約15000-20000 bp、約20000-25000 bp、約7000-9000 bp或約8000 bp)、100-10000 bp (例如，長度係約100-1000 bp、約1000-10000 bp、約5000-10000 bp或約7000-9000 bp)。 E788. 如實施例E748-E787中任一項之方法，其中該等次基因體片段中之一或多者位於第一承載載體中。 E789. 如實施例中任一項之方法E788，其中該等次基因體片段中之一或多者中之各者位於分開的第一承載載體中。 E790. 如實施例E748-E789中任一項之方法，其中各次基因體片段進一步分成2-20個次片段(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個次片段)，其中各次片段具有獨有的5'突出物及獨有的3'突出物，或各次片段具有一個次片段之5'端處的核苷酸序列，其與另一次片段之3'端處的核苷酸序列重疊(例如，同源)，其中重疊區域中之核苷酸序列係一對片段所獨有的。 E791. 如實施例E790之方法，其中各次片段之長度係約50-1000 bp，例如約50-900、50-800、50-700、50-600、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、100-900、100-800、100-700、100-600、100-500、100-400、100-300、100-200、200-1000、200-900、200-800、200-700、200-600、200-500、200-400、200-300、400-1000、400-900、400-800、400-700、400-600、400-500、600-1000、600-900、600-800、600-700、800-1000、800-900、900-1000 bp (例如，100-800 bp、約250-750 bp、約400-600 bp或約500 bp)。 E792. 如實施例E790或E791之方法，其中第一次片段之獨有的5'突出物與第二次片段之獨有的3'突出物互補(例如，部分互補或完全互補)，及/或第一次片段之獨有的3'突出物與第二次片段之獨有的5'突出物互補(例如，部分互補或完全互補)。 E793. 如實施例E790-E792中任一項之方法，其中次片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係由限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)進行之裂解產生。 E794. 如實施例E790-E793中任一項之方法，其中該限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)與用於產生該等次基因體片段之限制酶不同。 E795. 如實施例E790-E794中任一項之方法，其中該限制酶具有以下特性中之一者、兩者、三者、四者或全部： (i) 在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物； (ii) 由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對； (iii) 在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物； (iv) 可熱不活化； (v) 識別具有至少4-8個鹼基對，例如至少4個鹼基對、至少5個鹼基對、至少6個鹼基對、至少7個鹼基對或至少8個鹼基對(例如，8個鹼基對)之延伸部分。 E796. 如實施例E790-E795中任一項之方法，其中該限制酶係II型限制酶。 E797. 如實施例E790-E796中任一項之方法，其中該限制酶位點係能夠用於Gibson Assembly™選殖及接合方法(例如，Gibson等人, 「Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases」, Nat. Methods, 2009, 6(5):343-5中所描述之方法；其內容以全文引用之方式併入本文中)之限制酶，例如Gibson Assembly™相容酶。 E798. 如實施例E790-E797中任一項之方法，其中該限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E799. 如實施例E790-E798中任一項之方法，其中該限制酶係IIS型限制酶。 E800. 如實施例E790-E799中任一項之方法，其中該IIS型限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E801. 如實施例E790-E800中任一項之方法，其中該IIS型限制酶係BsaI限制酶、BsmBI限制酶、PaqCI限制酶或其組合。 E802. 如實施例E790-E801中任一項之方法，其中該IIS型限制酶係BsaI限制酶。 E803. 如實施例E790-E802中任一項之方法，其中該限制酶係選自：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E804. 如實施例E790-E803中任一項之方法，其中該限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E805. 如實施例E790-E804中任一項之方法，其中該限制酶係選自：AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E806. 如實施例E790-E804中任一項之方法，其中該限制酶係選自：AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。 E807. 如前述實施例中任一項之方法，其中該限制酶不為EcoRI或其中該限制酶位點不為EcoRI。 E808. 如實施例E790-E807中任一項之方法，其中一或多個次片段能夠基於一個次片段中之5'突出物與另一次片段中之3'突出物或一個次片段中之3'突出物與另一次片段中之5'突出物之互補性而有序地組裝，以產生次基因體片段及/或桿狀病毒表現構築體。 E809. 如實施例E790-E808中任一項之方法，其中該一或多個次片段能夠基於一個次片段中之5'端處的核苷酸序列與另一次片段之3'端處的核苷酸序列之重疊(例如，同源性)而有序地組裝，以產生次基因體片段及/或桿狀病毒表現構築體。 E810. 如實施例E790-E809中任一項之方法，其中該等次片段能夠基於一個次片段之5'端處的核苷酸序列與另一次片段之3'端處的核苷酸序列之重疊而有序地組裝，以產生次基因體片段及/或桿狀病毒表現構築體。 E811. 如實施例E809或E810之方法，其中該等次片段之間的核苷酸序列之重疊係4-50個(例如，4-45個、4-40個、4-35個、4-30個、4-25個、4-20個、4-15個、4-10個、10-50個、10-45個、10-40個、10-35個、10-30個、10-25個、10-20個、10-15個、15-50個、15-45個、15-40個、15-35個、15-30個、15-25個、15-20個、20-50個、20-45個、20-40個、20-35個、20-30個、20-25個、25-50個、25-45個、25-40個、25-35個、25-30個、30-50個、30-45個、30-40個、30-35個、35-50個、35-45個、35-40個、40-50個、40-45個)相鄰鹼基對。 E812. 如實施例E809-E811中任一項之方法，其中5'核酸外切酶產生對應於次片段之間的重疊序列之單股互補區，從而產生能夠彼此黏接之次片段。 E813. 如實施例E812之方法，其中經黏接之次片段之間的任何空位係由DNA聚合酶填充。 E814. 如實施例E790-E813中任一項之方法，其中該複數個片段中之一或多者(例如，次片段)位於第二承載載體中。 E815. 如實施例E808-E814中任一項之方法，其中一或多個片段(例如，次片段)中之各者位於分開的第二承載載體中。 E816. 如實施例E748-E815中任一項之方法，其中一或多個次基因體片段或次片段包含修飾，例如插入、缺失或取代。 E817. 如實施例E786-E816中任一項之方法，其中該等次基因體片段或次片段中之一或多者包含修飾，例如插入、缺失或取代。 E818. 如實施例E816或E817之方法，其中該修飾，例如插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變)位於非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)或非必需基因之調節區中(例如，啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入)。 E819. 如實施例E818之方法，其中該非必需基因係選自以下中之一者、兩者、三者或更多者(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21者)：egt、p74 (PIF0)、p26、SOD、ChiA、v-cath、p10、多角體蛋白、ctx、odv-e56、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94。 E820. 如實施例E819之方法，其包含以下中之修飾，例如插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變)： (i) v-cath及egt； (ii) v-cath、egt及SOD； (iii) chiA、v-cath、egt、p26、p10及p74； (iv) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74及SOD；或 (v) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74、SOD、AcORF-91及AcORF-108。 E821. 如實施例E816-E820中任一項之方法，其中該修飾包含chiA基因、v-cath基因、p26基因、p10基因及/或p74基因或其一部分之缺失。 E822. 如實施例E816-E821中任一項之方法，其中該修飾包含該非必需基因或相鄰區域中之異源序列之插入。 E823. 如實施例E816-E822中任一項之方法，其中該修飾包含該非必需基因或相鄰區域中之一或多個突變，視情況其中該等非必需基因位於同源重複序列區5 (hr5)附近(例如，下游或上游)。 E824. 如實施例E816-E823中任一項之方法，其中該修飾，例如插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變)引起非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)或非必需基因之調節區之不活化(例如，啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入)。 E825. 如實施例E816-E824中任一項之方法，其中藉由化學合成或PCR，例如基於PCR之定點突變誘發來引入該修飾。 E826. 如實施例E816-E825中任一項之方法，其中該等次基因體片段中之一或多者或該等次片段中之一或多者包含異源核苷酸序列。 E827. 如實施例E826之方法，其中該異源核苷酸序列包含所關注的序列(例如，編碼Rep編碼區、一或多個Rep蛋白質、VP編碼區、一或多個VP蛋白質及/或有效負載之核苷酸序列)。 E828. 如實施例E827之方法，其中該所關注的序列係編碼所關注的多肽之核苷酸序列或所關注的核苷酸序列。 E829. 如實施例E827或E828之方法，其中該所關注的序列可操作地連接至第一啟動子(例如，桿狀病毒早期啟動子或桿狀病毒早期-晚期啟動子)及/或第二啟動子(例如，桿狀病毒晚期啟動子或桿狀病毒極晚期啟動子)。 E830. 如實施例E827-E829中任一項之方法，其中該所關注的序列可操作地連接至第一啟動子(例如，桿狀病毒早期啟動子或桿狀病毒早期-晚期啟動子)及第二啟動子(例如，桿狀病毒晚期啟動子或桿狀病毒極晚期啟動子)。 E831. 如實施例E829或E830之方法，其中該第一及/或第二啟動子係選自桿狀病毒啟動子、病毒啟動子、昆蟲病毒啟動子、非昆蟲病毒啟動子、脊椎動物病毒啟動子、來自一或多個物種之包括病毒及非病毒元件之嵌合啟動子、合成啟動子或其變異體。 E832. 如實施例E829-E831中任一項之方法，其中該第一及/或第二啟動子係選自polh啟動子、p10啟動子、ctx啟動子、gp64啟動子、IE啟動子、IE-1啟動子、p6.9啟動子、Dmhsp70啟動子、Hsp70啟動子、p5啟動子、p19啟動子、p35啟動子、p40啟動子或其變異體，例如功能性片段。 E833. 如實施例E829-E832中任一項之方法，其中該第一及/或第二啟動子係選自桿狀病毒早期啟動子、桿狀病毒晚期啟動子、桿狀病毒早期-晚期啟動子或桿狀病毒極晚期啟動子。 E834. 如實施例E829-E833中任一項之方法，其中第一及/或第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子、桿狀病毒晚期啟動子或桿狀病毒早期-晚期啟動子。 E835. 如實施例E829-E834中任一項之方法，其中第一及/或第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子(例如，gp64啟動子)。 E836. 如實施例E829-E835中任一項之方法，其中該第一或第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子(例如，polh啟動子)。 E837. 如實施例E829-E836中任一項之方法，其中： (a) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子， (b) 該第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子， (c) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子， (d) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (e) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子， (f) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (g) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子， (h) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子， (i) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子， (j) 該第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子， (k) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子， (l) 該第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (m) 該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子， (n) 該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子，或 (o) 該第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子。 E838. 如實施例E829-E837中任一項之方法，其中該第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子(例如，gp64啟動子)且該第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子(例如，polh啟動子)。 E839. 如實施例E829-E838中任一項之方法，其中該第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且該第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子。 E840. 如實施例E829-E839中任一項之方法，其中 (a) 該桿狀病毒早期啟動子係選自：lef3啟動子、dbp啟動子、p35啟動子、orf82啟動子、get啟動子、orf81啟動子、orf122啟動子、pk-2啟動子、orf55啟動子、etl啟動子、hcf-1啟動子、etm啟動子、lef-2啟動子、lef-6啟動子、orf84啟動子、orf118啟動子或orf111啟動子， (b) 該桿狀病毒早期-晚期啟動子係選自：lef2啟動子、orf13啟動子、orf23啟動子、pkip啟動子、v-fgf啟動子、pp31啟動子、odv-e66啟動子、orf74啟動子、orf79啟動子、orf82啟動子、p15啟動子、cg30啟動子、解螺旋酶啟動子、he65啟動子、orf114啟動子、pk-2啟動子、gp64啟動子、gp16啟動子、alk-exo啟動子、p35啟動子、me53啟動子或ie0啟動子， (c) 該桿狀病毒晚期啟動子係選自：ptpase啟動子、Ac-bro啟動子、ctx啟動子、orf5啟動子、orf19啟動子、orf20啟動子、sod啟動子、HisP啟動子、orf34啟動子、v-ubi啟動子、orf38啟動子、orf43啟動子、orf44啟動子、orf56啟動子、orf59啟動子、orf60啟動子或fp-25k啟動子，及/或 (d) 該桿狀病毒極晚期啟動子係選自p10啟動子或polh啟動子。 E841. 如實施例E829-E840中任一項之方法，其中該第一及/或第二啟動子包含TATA盒模體及/或CAGT模體。 E842. 如實施例E829-E841中任一項之方法，其中該第一及/或第二啟動子包含TAAG模體(例如，ATAAG核苷酸序列)。 E843. 如實施例E829-E842中任一項之方法，其中該第一及/或第二啟動子包含TATA盒模體及TAAG模體。 E844. 如實施例E829-E843中任一項之方法，其中該第一或第二啟動子包含VLF-1之結合位點。 E845. 如實施例E829-E844中任一項之方法，其中該第一或第二啟動子係gp64啟動子(例如，OpMNPV gp64啟動子)。 E846. 如實施例E829-E845中任一項之方法，其中該第一或第二啟動子係polh啟動子(例如，OpMNPV polh啟動子或AcMNPV polh啟動子)。 E847. 如實施例E829-E846中任一項之方法，其中該第一啟動子係gp64啟動子且該第二啟動子係polh啟動子，或其中該第一啟動子係polh啟動子且該第二啟動子係gp64啟動子。 E848. 如實施例E829-E847中任一項之方法，其中該Rep編碼區可操作地連接至第一啟動子(其係桿狀病毒早期-晚期啟動子)及第二啟動子(其係桿狀病毒極晚期啟動子)，例如gp64啟動子及polh啟動子，視情況其中該Rep編碼區位於同源重複序列區hr5之下游。 E849. 如實施例E829-E848中任一項之方法，其中該第一啟動子係gp64啟動子且該第二啟動子係polh啟動子。 E850. 如實施例E829-E837或E840-E846中任一項之方法，其中該第一啟動子及該第二啟動子係相同的。 E851. 如實施例E829-E850之方法，其中該第一啟動子及該第二啟動子係不同的。 E852. 如實施例E850之方法，該第一啟動子及該第二啟動子各自為polh啟動子。 E853. 如實施例E832-E851之方法，其中該gp64啟動子包含SEQ ID NO:217之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E854. 如實施例E832-E852之方法，其中該polh啟動子包含SEQ ID NO:167或220之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:167或220包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:167或220包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E855. 如實施例E832-E851中任一項之方法，其中該第一啟動子及該第二啟動子包含SEQ ID NO:221之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:221包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:221包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 E856. 如實施例E827或E828之方法，其中該所關注的序列編碼治療性蛋白質或其功能性變異體、抗體或抗體片段；酶；基因編輯系統之組分；RNAi試劑(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)；或其組合。 E857. 如實施例E748-E856中任一項之方法，其中該等次基因體片段中之一或多者或該等次片段中之一或多者編碼一或多個AAV蛋白質。 E858. 如實施例E748-E857中任一項之方法，其中該等次基因體片段中之一或多者或該等次片段中之一或多者編碼AAV Rep蛋白質，例如Rep40、Rep52、Rep68、Rep78或其組合。 E859. 如實施例E748-E858中任一項之方法，其中該等次基因體片段中之一或多者或該等次片段中之一或多者編碼Rep78蛋白質及/或Rep52蛋白質。 E860. 如實施例E748-E859中任一項之方法，其中該等次基因體片段中之一或多者或該等次片段中之一或多者編碼AAV衣殼蛋白質，例如VP1蛋白質、VP2蛋白質、VP3蛋白質或其組合。 E861. 如實施例E748-E860中任一項之方法，其中該等次基因體片段中之一或多者或該等次片段中之一或多者編碼AAV1衣殼蛋白質、AAV2衣殼蛋白質、AAV3衣殼蛋白質、AAV4衣殼蛋白質、AAV5衣殼蛋白質、AAV6衣殼蛋白質、AAV8衣殼蛋白質、AAV9衣殼蛋白質、AAVrh10衣殼蛋白質或其變異體。 E862. 如實施例E748-E861中任一項之方法，其中該等次基因體片段中之一或多者或該等次片段中之一或多者編碼AAV5衣殼蛋白質或其變異體，或AAV9衣殼蛋白質或其變異體。 E863. 如實施例E748-E862中任一項之方法，其中該等次基因體片段中之一或多者或該等次片段中之一或多者編碼有效負載。 E864. 如實施例E863之方法，其中該經編碼之有效負載係選自治療性蛋白質或其功能性變異體；抗體或抗體片段；酶；基因編輯系統之組分；RNAi試劑(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)；或其組合。 E865. 如實施例E748-E864中任一項之方法，其中該等次基因體片段中之一或多者或該等次片段中之一或多者係化學合成的或係非模板化片段。 E866. 一種複數個次基因體片段，其係根據如實施例E748-E865中任一項之方法製備。 E867. 一種用於製備變異型桿狀病毒基因體之方法，其包含： (i) 提供如實施例E866之複數個次基因體片段， (ii) 將該複數個次基因體片段組裝至變異型桿狀病毒基因體中，及 (iii) 視情況將該變異型桿狀病毒基因體插入桿狀病毒表現構築體中。 E868. 一種變異型桿狀病毒基因體，其係根據如實施例E867之方法製備。 E869. 一種桿狀病毒表現構築體，其包含如實施例E868之變異型桿狀病毒基因體。 E870. 一種組合物，其包含如實施例E868之變異型桿狀病毒基因體或如E869實施例之桿狀病毒表現構築體，及載劑。 E871. 一種用於製備變異型病毒基因體之套組，其包含如實施例E866之複數個次基因體片段，及使用說明書。 E872. 一種桿狀病毒，其係使用如實施例E869之桿狀病毒表現構築體製備。 E873. 一種組合物，其包含如實施例E1-E180或E607-E611中任一項之桿狀病毒表現構築體，及載劑。 E874. 一種用於修飾變異型桿狀病毒基因體之方法，其包含： (i) 提供如實施例E866之複數個次基因體片段， (ii) 鑑別該桿狀病毒基因體中之需要一或多個修飾(例如，取代、插入或缺失)之一或多個位置， (iii) 選擇相應的次基因體片段，其含有一或多個將引入一或多個修飾之基因座， (iv) 將該一或多個修飾引入該次基因體片段中，藉此產生一或多個經修飾之次基因體片段； (v) 在適合於藉由有序地組裝該複數個次基因體片段來形成變異型桿狀病毒基因體之條件下培育該複數個片段，其中該一或多個經修飾之次基因體片段置換該複數個次基因體片段中之一或多者之未經修飾之版本，藉此獲得經修飾之變異型桿狀病毒基因體。 E875. 如實施例E874之方法，其中一或多個次基因體片段經修飾以引入來自該變異型桿狀病毒核苷酸序列之異源核苷酸序列。 E876. 如實施例E875之方法，其中該異源核苷酸序列包含所關注的序列。 E877. 如實施例E876之方法，其中該所關注的序列係編碼所關注的多肽之核苷酸序列或所關注的核苷酸序列。 E878. 如實施例E876或E877之方法，其中該所關注的序列編碼治療性蛋白質或其功能性變異體、抗體或抗體片段；酶；基因編輯系統之組分；RNAi試劑(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)；或其組合。 E879. 如實施例E876-E878中任一項之方法，其中該異源核苷酸序列，例如所關注的序列包含一或多個腺相關病毒(AAV)基因編碼區域及/或有效負載。 E880. 如實施例E876-E879中任一項之方法，其中該異源核苷酸序列係化學合成的、非模板化核苷酸序列(例如，非模板化片段)或藉由基於PCR之分析法產生。 E881. 如實施例E876-E880中任一項之方法，其中該一或多個修飾(例如，插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變))位於非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)或非必需基因之調節區中(例如，啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入)。 E882. 如實施例E881之方法，其中該非必需基因係選自以下中之一者、兩者、三者或更多者(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21者)：egt、p74 (PIF0)、p26、SOD、ChiA、v-cath、p10、多角體蛋白、ctx、odv-e56、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94。 E883. 如實施例E882之方法，其包含以下中之修飾，例如插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變)： (i) v-cath及egt； (ii) v-cath、egt及SOD； (iii) chiA、v-cath、egt、p26、p10及p74； (iv) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74及SOD；或 (v) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74、SOD、AcORF-91及AcORF-108。 E884. 如實施例E881-E883中任一項之方法，其中該修飾包含chiA基因、v-cath基因、p26基因、p10基因及/或p74基因或其一部分之缺失。 E885. 如實施例E881-E884中任一項之方法，其中該修飾包含該非必需基因或相鄰區域中之異源序列之插入。 E886. 如實施例E881-E885中任一項之方法，其中該修飾包含該非必需基因或相鄰區域中之一或多個突變。 E887. 如實施例E881-E886中任一項之方法，其中該非必需基因位於同源重複序列區5 (hr5)附近(例如，下游或上游)。 E888. 如實施例E875-E887中任一項之方法，其中該一或多個修飾(例如，插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變))引起非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)或非必需基因之調節區之不活化(例如，啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入)。 E889. 如實施例E875-E888中任一項之方法，其中該等次基因體片段中之一或多者包含非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)或非必需基因之調節區之破壞，例如突變(例如，框移突變)、缺失、插入或不活化(例如，啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入)。 E890. 如實施例E875-E889中任一項之方法，其中藉由化學合成或PCR，例如基於PCR之定點突變誘發來引入該一或多個修飾。 E891. 如實施例E875-E890中任一項之方法，其中該等次基因體片段中之一或多者經修飾以引入編碼AAV Rep蛋白質(例如Rep40、Rep52、Rep68、Rep78或其組合)之核苷酸序列。 E892. 如實施例E875-E891中任一項之方法，其中該等次基因體片段中之一或多者編碼Rep78蛋白質及/或Rep52蛋白質。 E893. 如實施例E875-E892中任一項之方法，其中該等次基因體片段中之一或多者經修飾以引入編碼AAV衣殼蛋白質(例如，VP1蛋白質、VP2蛋白質、VP3蛋白質或其組合)之核苷酸序列。 E894. 如實施例E875-E893中任一項之方法，其中該等次基因體片段中之一或多者經修飾以引入編碼AAV1衣殼蛋白質、AAV2衣殼蛋白質、AAV3衣殼蛋白質、AAV4衣殼蛋白質、AAV5衣殼蛋白質、AAV6衣殼蛋白質、AAV8衣殼蛋白質、AAV9衣殼蛋白質、AAVrh10衣殼蛋白質或其變異體之核苷酸序列。 E895. 如實施例E875-E894中任一項之方法，其中該等次基因體片段中之一或多者經修飾以引入編碼AAV5衣殼蛋白質或其變異體或AAV9衣殼蛋白質或其變異體之核苷酸序列。 E896. 如實施例E875-E895中任一項之方法，其中該等次基因體片段中之一或多者經修飾以引入編碼有效負載之核苷酸序列。 E897. 如實施例E896之方法，其中該經編碼之有效負載係選自治療性蛋白質或其功能性變異體；抗體或抗體片段；酶；基因編輯系統之組分；RNAi試劑(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)；或其組合。 E898. 一種變異型桿狀病毒基因體，其係藉由如實施例E875-E890中任一項之方法產生。 E899. 一種變異型桿狀病毒基因體，其係藉由如實施例E891-E895中任一項之方法產生。 E900. 一種變異型桿狀病毒基因體，其係藉由如實施例E896或E897之方法產生。 E901. 一種AAV病毒產生系統，其包含有包含如實施例E899之AAV表現構築體之變異型桿狀病毒基因體及包含AAV有效負載構築體之變異型桿狀病毒基因體，視情況其中該變異型桿狀病毒基因體係如實施例E900之變異型桿狀病毒基因體。 E902. 如實施例E901之AAV病毒產生系統，其包含AAV病毒產生細胞，該細胞包含AAV表現構築體及AAV有效負載構築體，視情況其中該AAV病毒產生細胞係昆蟲細胞，視情況係Sf9細胞或Sf21細胞。 E903. 一種用於在AAV病毒產生細胞中產生重組腺相關病毒(rAAV)粒子之方法，該方法包含：(i)提供如實施例E901或E902之AAV病毒產生系統，其中AAV表現構築體包含一或多個VP編碼區，該一或多個VP編碼區包含一或多個編碼VP1、VP2及VP3衣殼蛋白質之核苷酸序列；(ii)將該AAV病毒產生系統轉染至AAV病毒產生細胞中；(iii)將該AAV病毒產生細胞暴露於允許該AAV病毒產生細胞將該AAV表現構築體及AAV有效負載構築體處理成rAAV粒子之條件；及視情況地，(iv)自該AAV病毒產生細胞收集該等rAAV粒子。 E904. 如實施例E903之方法，其中該AAV病毒產生細胞係昆蟲細胞，視情況係Sf9細胞或Sf21細胞。 E905. 一種重組腺相關病毒(rAAV)粒子，其係藉由如實施例E903或E904之方法產生。 E906. 一種醫藥組合物，其包含如實施例E905之rAAV粒子及醫藥學上可接受之賦形劑。

相關申請案

本申請案主張2022年1月25日提交的美國臨時申請案第63/302,874號及2022年9月8日提交的美國臨時申請案第63/404,879號之優先權，其全部內容各自以全文引用之方式併入本文中。概述

桿狀病毒表現系統係重組蛋白質產生中廣泛使用之工具。其高度可縮放性及生產力已進一步擴展至生產重組腺相關病毒(rAAV)。然而，基於桿狀病毒之rAAV生產受到若干因素之阻礙，該等因素包括繼代穩定性、複雜性及支持rAAV複製所需的蛋白質產物之數目，以及用於修飾大型病毒基因體之技術之一般低通量及訂製性質。

本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體及製備方法與當前桿狀病毒表現載體系統相比，藉由提供前所未有的合成大型基因體(＞130 kb)及/或在單一核苷酸層級下修飾大型基因體之能力，從而達成例如用於生物製品製備及研發之高效桿狀病毒載體之有效設計及產生而提供若干優點。變異型桿狀病毒基因體係以模組化方式形成，該方式係基於可實現有效及快速的變異型桿狀病毒載體研發之策略。藉由將參考桿狀病毒基因體(例如，AcMNPV基因體)分成多個次基因體區域或片段(或甚至將各次基因體區域或次片段進一步分成多個次區域或次片段)，可對大型桿狀病毒基因體內之任何基因座進行修飾。在引入所需修飾(例如，插入、缺失或取代)之後，桿狀病毒基因體之各種次基因體片段，包括置換野生型對應物之經修飾之次基因體片段，經歷基於各次基因體片段中之獨有的5'及3'突出物而進行之有序組裝，從而產生變異型桿狀病毒基因體。在整個基因體中移除一或多個在識別位點外部進行切割之限制酶(例如，II型限制酶，諸如IIS型限制酶)之識別位點可實現獨有的5'及3'突出物，從而有助於設計以所需順序組裝次基因體片段。如實例中所示，變異型桿狀病毒基因體與其野生型對應物相比，未展示桿狀病毒生長動力學或rAAV產生之顯著差異，表明設計或組裝方法未損害桿狀病毒複製或極晚期基因表現。不希望受理論約束，咸信在一些實施例中，本文中所描述之組合物及方法能夠實現若干模組之重新組合，以產生經修飾之變異型桿狀病毒而不受先前桿狀病毒設計限制。

在一些實施例中，使用Golden Gate Assembly，例如使用IIS型限制酶(諸如(但不限於) BsaI、BsmBI、AarI、PaqC1及其同裂酶，其皆係可商購的)組裝變異型桿狀病毒基因體。BsaI及BsmBI之酶識別位點之長度係6個鹼基對且PaqC1之識別位點之長度係7個鹼基對。不希望受理論約束，Golden Gate Assembly實現多個片段之高保真組裝，從而產生變異型桿狀病毒基因體。

在其他實施例中，使用Gibson Assembly™，例如使用具有8個鹼基對或更長的識別位點之酶，例如PacI、AscI、SrfI、PspXI或AgeI來組裝變異型桿狀病毒。 病毒表現構築體、片段及基因體

本文中提供完整病毒基因體(例如，重組變異型病毒基因體，諸如變異型桿狀病毒基因體)之一部分及包含其之構築體(例如，表現構築體，諸如桿狀病毒質體)，其可藉由有序地組裝部分或完全構成參考病毒基因體(例如，野生型桿狀病毒基因體)之核苷酸序列的複數個片段(例如，次基因體片段及/或次片段)來產生，以及製備、改變及使用其之方法。在一些實施例中，參考病毒基因體不為冠狀病毒基因體(例如，SARS冠狀病毒基因體，諸如SARS-CoV-2基因體)。病毒表現構築體

本文中所描述之病毒表現構築體可包含兩個或更多個包含獨有的接合區之次基因體區域及變異型病毒核苷酸序列(例如，變異型桿狀病毒核苷酸序列)，該變異型病毒核苷酸序列所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制位點)少於參考病毒基因體(例如，參考桿狀病毒基因體)。在一些實施例中，病毒表現構築體係桿狀病毒表現構築體。 A. 次基因體區域及次區域

桿狀病毒表現構築體之兩個或更多個次基因體區域可例如對應於完整桿狀病毒基因體(例如，野生型或變異型桿狀病毒基因體)或其一或多個部分(例如，具有一或多個修飾，諸如一或多個非必需基因，諸如輔助及/或經口感染因子基因之缺失之變異型桿狀病毒基因體)。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個次基因體區域。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、2-30、2-25、2-20、2-15、2-10、2-5、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-30、10-25、10-20、10-15、15-30、15-25、15-20、20-30、20-25或25-30個次基因體區域。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含10-20、14-18、15-17或16個次基因體區域。

在一些實施例中，次基因體區域之長度係約100-25000 bp，例如長度係約100-20000、100-15000、100-10000、100-9000、100-8000、100-7000、100-6000、100-5000、100-4000、100-3000、100-2000、100-1000、100-500、100-300、100-200、100-150、250-25000、250-20000、250-15000、250-10000、250-9000、250-8000、250-7000、250-6000、250-5000、250-4000、250-3000、250-2000、250-1000、250-500、500-25000、500-20000、500-15000、500-10000、500-9000、500-8000、500-7000、500-6000、500-5000、500-4000、500-3000、500-2000、500-1000、750-25000、750-20000、750-15000、750-10000、750-9000、750-8000、750-7000、750-6000、750-5000、750-4000、750-3000、750-2000、750-1000、1000-25000、1000-20000、1000-15000、1000-10000、1000-9000、1000-8000、1000-7000、1000-6000、1000-5000、1000-4000、1000-3000、1000-2000、2500-25000、2500-20000、2500-15000、2500-10000、2500-9000、2500-8000、2500-7000、2500-6000、2500-5000、2500-4000、2500-3000、2500-2000、5000-25000、5000-20000、5000-15000、5000-10000、5000-9000、5000-8000、5000-7000、5000-6000、6000-25000、6000-20000、6000-15000、6000-10000、6000-9000、6000-8000、6000-7000、7000-25000、7000-20000、7000-15000、7000-10000、7000-9000、7000-8000、8000-25000、8000-20000、8000-15000、8000-10000、8000-9000、9000-25000、9000-20000、9000-15000、9000-10000、10000-25000、10000-20000、10000-15000、10000-12500、12500-25000、12500-20000、12500-15000、15000-25000、15000-20000、17500-25000、17500-20000、20000-25000或22500-25000。在一些實施例中，次基因體區域之長度係約100、約150、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約550、約600、約650、約700、約750、約800、約850、約900、約950、約1000、約1500、約2000、約2500、約3000、約3500、約4000、約4500、約5000、約5500、約6000、約6500、約7000、約7500、約8000、約8500、約9000、約9500、約10000、約12000、約14000、約16000、約18000、約20000、約22000、約24000、約26000、約28000或約30000 bp。在一些實施例中，次基因體區域之長度係約100-1000 bp、約250-750 bp、約500 bp、約1000-10000 bp、約5000-10000 bp、約7000-9000 bp或約8000 bp。在一些實施例中，次基因體區域之長度係約500 bp。在一些實施例中，次基因體區域之長度係約8000 bp。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體之次基因體區域對應於參考桿狀病毒基因體之次基因體區域，或參考桿狀病毒基因體之次基因體區域之變異型版本，其中參考桿狀病毒基因體已分成(例如，電腦模擬)複數個次基因體區域(例如，至少兩個次基因體區域)。在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體序列包含複數個具有大致相同尺寸之次基因體區域。作為實例，在一些實施例中，128千鹼基(kb)之參考桿狀病毒基因體可分成16個各約8000 bp之次基因體區域，且桿狀病毒表現構築體之次基因體區域可具有此等16個次基因體區域中之一者之核苷酸序列或其變異型核苷酸序列。因此，在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體之一或多個次基因體區域對應於或包含經分割之參考桿狀病毒基因體之一或多個次基因體區域(或次基因體區域之變異型版本)。

然而，參考桿狀病毒基因體序列無需分成具有大致相同尺寸之次基因體區域，例如一或多個次基因體區域可比其餘次基因體區域小或大5-80%，例如5-60%、5-30%、10-80%、10-60%、10-30%、30-80%、30-60%、50-80%或60-80%，其中該等其餘次基因體區域具有相同或大致相同尺寸。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體之各次基因體區域包含兩個獨有的接合位點，其中第一獨有接合區位於次基因體區域之5'端且第二獨有接合區位於次基因體區域之3'端。

在一些實施例中，次基因體區域之第一獨有接合區及第二獨有接合區之長度獨立地包含1-50、4-50、10-50、20-50、30-50、40-50、1-45、4-45、10-45、15-45、20-45、30-45、35-45、40-45、1-40、4-40、10-40、20-40、30-40、1-35、4-35、10-35、20-35、30-35、1-30、4-30、10-30、20-30、1-25、4-25、10-25、15-25、20-25、1-20、4-20、10-20、15-20、1-15、40-25、10-15、1-10、2-10、3-10、4-10、5-10、6-10、7-10、8-10、9-10、1-8、2-8、3-8、4-8、5-8、6-8、7-8、1-6、2-6、3-6、4-6、5-6、1-5、2-5、3-5、4-5、1-4、2-4、3-4、1-3、2-3、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸，例如2-5個核苷酸(例如，4個核苷酸)。在一些實施例中，次基因體區域之第一獨有接合區及第二獨有接合區之長度獨立地為4個核苷酸。在一些實施例中，獨有接合區表示在將次基因體片段有序地組裝至桿狀病毒核苷酸序列(例如，桿狀病毒基因體)中期間，由一個次基因體片段之5'突出物與緊鄰的次基因體片段之3'突出物或一個次基因體片段之3'突出物與緊鄰的次基因體片段之5'突出物之間的互補性形成之接合區。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2-20、5-20、10-20、15-20、2-18、5-18、10-18、14-18、15-18、2-16、5-16、10-16、13-16、14-16、2-14、5-14、10-14、2-12、5-12、10-12、2-10、5-10或2-5個獨有接合區。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含5-25、10-20、12-20、14-18、15-17、15、16或17個獨有接合區。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含17個獨有的接合區。在一些實施例中，該17個獨有的接合區中之2個係在最外部次基因體區域與桿狀病毒表現構築體之主鏈之間的界面處形成，例如在一個次基因體片段之獨有的5'突出物與桿狀病毒表現構築體主鏈之獨有的3'突出物之間形成的獨有接合區，及在另一次基因體片段之獨有的3'突出物與桿狀病毒表現構築體主鏈之獨有的5'突出物之間形成的獨有接合區。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含次基因體區域之間的獨有接合區，例如當使用Gibson Assembly™或Golden Gate Assembly產生時，其依賴於一個次基因體片段之5'端處的核苷酸序列(例如，桿狀病毒基因體序列)與另一次基因體片段之3'端處的核苷酸序列(例如，桿狀病毒基因體序列)之重疊來進行有序組裝，其中重疊區域係一對次基因體片段所獨有的。

在一些實施例中，一或多個次基因體區域分成兩個或更多個次區域。在一些實施例中，次基因體區域分成2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、1-30、1-20、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、5-20、10-20、14-18或15-17個次區域(例如，16個次區域)。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體之各次基因體區域分成次區域，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、2-30、2-20、2-10、2-5、2-4、2-3、5-20、10-20、14-18或15-17個次區域(例如，16個次區域)。

在一些實施例中，次基因體區域之各次區域包含兩個獨有的接合位點，其中第一獨有接合區位於次區域之5'端且第二獨有接合區位於次區域之3'端。

在一些實施例中，次區域之第一獨有接合區及第二獨有接合區之長度獨立地包含1-10、2-10、3-10、4-10、5-10、6-10、7-10、8-10、9-10、1-8、2-8、3-8、4-8、5-8、6-8、7-8、1-6、2-6、3-6、4-6、5-6、1-5、2-5、3-5、4-5、1-4、2-4、3-4、1-3、2-3、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸，例如2-5個核苷酸(例如，4個核苷酸)。在一些實施例中，次區域之第一獨有接合區及第二獨有接合區之長度獨立地為4個核苷酸。在一些實施例中，獨有的接合區表示在將次區域有序地組裝至次基因體片段中期間，由一個次區域之5'突出物與緊鄰的次區域之3'突出物或一個次區域之3'突出物與緊鄰的次區域之5'突出物之間的互補性形成之接合區。

在一些實施例中，次基因體區域之次區域包含獨有的接合區，例如當使用Gibson Assembly™或Golden Gate Assembly產生包含次區域之次基因體區域時。在此類實施例中，一個次區域之5'端處的核苷酸序列(例如，桿狀病毒基因體序列)與另一次區域之3'端處的核苷酸序列(例如，桿狀病毒基因體序列)之重疊可有助於有序地組裝至次基因體區域中，其中重疊區域係一對次片段所獨有的。

在一些實施例中，次基因體區域包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2-20、5-20、10-20、15-20、2-18、5-18、10-18、14-18、15-18、2-16、5-16、10-16、13-16、14-16、2-14、5-14、10-14、2-12、5-12、10-12、2-10、5-10或2-5個獨有的接合區。在一些實施例中，次基因體區域包含5-25、10-20、12-20、14-18、15-17、15、16或17個獨有的接合區。在一些實施例中，次基因體區域包含17個獨有的接合區。在一些實施例中，次基因體區域中之17個獨有的接合區中之2個係在次基因體區域之最外部次區域與緊鄰的次基因體區域之5'突出物或3'突出物或桿狀病毒表現構築體之主鏈之間的界面處形成。 B. 獨有的突出物及接合區

在一些實施例中，本文中所描述之片段(例如，次基因體片段或次片段)之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物獨立地包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。在一些實施例中，片段(例如，次基因體片段或次片段)之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物獨立地包含1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9或9-10個核苷酸。在一些實施例中，片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物包含黏性端部(例如，交錯端部)。在一些實施例中，一個片段(例如，次基因體片段或次片段)之5'突出物與另一片段(例如，次基因體片段或次片段)之3'突出物之共價連接引起形成獨有的接合區。

「獨有的接合區」係由一個片段之獨有的5'突出物與另一片段之獨有的3'突出物之共價鍵聯形成。在一些實施例中，由兩個片段形成之獨有的接合區之核苷酸序列(例如，4個核苷酸)的獨特之處在於其序列與任何其他由兩個片段或片段及目的載體(例如，承載載體、桿狀病毒表現構築體或BAC)之主鏈形成之接合區之序列不同。在一些實施例中，若使用多種水平之片段，例如若基因體已分成次基因體片段(一種水平)且次基因體片段進一步分成次片段(另一種水平)，則獨有的接合區僅需為一種水平內所獨有的，限制條件為使用不同的限制酶(例如，IIS型限制酶)產生不同水平之片段之獨有的5'及3'突出物。

在一些實施例中，獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係由限制酶進行之片段(例如，次基因體片段或次片段)之裂解產生。在一些實施例中，限制酶係II型限制酶。在一些實施例中，限制酶能夠用於Gibson Assembly™選殖及接合方法(例如，Gibson等人, 「Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases」, Nat. Methods, 2009, 6(5):343-5中所描述之方法；其內容以全文引用之方式併入本文中)，例如Gibson Assembly相容酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，由限制酶進行之消化產生變性黏性突出物。在一些實施例中，限制酶使其識別位點外部發生裂解。在一些實施例中，限制酶產生交錯端部(例如，具有2-4、2、3或4個鹼基之交錯端部)。在一些實施例中，限制酶識別不對稱DNA序列。在一些實施例中，限制酶產生獨特的黏性突出物。在一些實施例中，限制酶係IIS型限制酶。在一些實施例中，IIS型限制酶係選自(但不限於) AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，IIS型限制酶係BsaI。在一些實施例中，IIS型限制酶係BsmBI。其他適用的非限制性限制酶(例如，IIS型限制酶)包括例如AasI、Acc36I、AccB7I、AceIII、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlfI、AloI、Alw26I、AlwNI、AlwXI、AmaCSI、ApaBI、ApyPI、AquII、AquIII、AquIV、ArsI、Asp10HII、BasI、Bbr7I、BbvI、BbvII、Bbv16II、Bce4I、Bce83I、BceCI、BcgI、Bco5I、Bco116I、BcoKI、BflI、BfuAI、BglI、Bli736I、Bme585I、BpiI、BplI、BpmI、BpuAI、BpuJI、BpuSI、BsAJI、Bsc4I、Bsc91I、Bsc107I、BscAI、Bse3DI、BseGI、BseKI、BseLI、BseMI、BseMII、BseXI、BseZI、BsgI、BsiYI、BslI、BslFI、Bso31I、BsoMAI、Bsp24I、Bsp423I、BspBS31I、BspCNI、BspD6I、BsplS4I、BspKT5I、BspLU11III、BspMI、BspST5I、BspTNI、BspTS514I、BspWI、Bst6I、Bst12I、Bst19I、Bst71I、BstAPI、BstBS32I、BstFZ438I、BstGZ53I、BstHZ55I、BstlZ316I、BstMAI、BstMWI、BstOZ616I、BstPZ418I、BstTS5I、BstV1I、BstV2I、BstXI、CaiI、CjeI、CjePI、CspCI、CstMI、DraIII、DrdI、DseDI、Eam1104I、Eco31I、Eco5TI、EcoA4I、Eco57MI、EcoO44I、EcoP15I、Esp3I、Esp1396I、GsuI、HaeIV、Hin4I、Hpy178III、Hpy188III、HpyF10VI、LweI、MmeI、MwoI、PfiBI、PfiMI、PhaI、PpiI、PsrI、RleAI、SdiI、SfiI、SmuI、Sth132I、StsI、TaqII、TspDTI、Tsp8EI、TspGWI、Tth111II、Van91I或VpaK11AI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶識別非連續位點，例如AasI、AccB7I、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlwNI、ApaBI、ArsI、Asp10HII、BaeI、BasI、Bce4I、BceCI、BcgI、BfiI、BglI、Bsc4I、Bsc107I、BseLI、BsiYI、BslI、BspWI、BstAPI、BstH255I、BstlZ316I、BstMWI、BstXI、CaiI、BraIII、DrdI、DseDI、HpyF10VI、PflBI、PflMI、SdiI、SfiI、Tsp8EI或Van91I，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物。在一些實施例中，由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物。在一些實施例中，限制酶可熱不活化。在一些實施例中，限制酶識別具有4-8個鹼基對，例如4個鹼基對、5個鹼基對、6個鹼基對、7個鹼基對或8個鹼基對之延伸部分。在一些實施例中，限制酶不為EcoRI。

在一些實施例中，獨有的5'突出物及獨有的3'突出物之長度係4個核苷酸(例如，由IIS型限制酶，諸如BsaI或BsmBI進行之消化產生之突出物)。在一些實施例中，可使用4個核苷酸之任何組合作為獨有的5'或獨有的3'突出物，只要該4個核苷酸不會引入用於產生獨有的5'及3'突出物之限制酶(例如，IIS型限制酶)之新的識別位點即可。在一些實施例中，本文中所描述之片段(例如，次基因體片段或次片段)之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係獨立地選自AAAA、AAAC、AAAG、AAAT、AACA、AACC、AACG、AACT、AAGA、AAGC、AAGG、AAGT、AATA、AATC、AATG、AATT、ACAA、ACAC、ACAG、ACAT、ACCA、ACCC、ACCG、ACCT、ACGA、ACGC、ACGG、ACGT、ACTA、ACTC、ACTG、ACTT、AGAA、AGAC、AGAG、AGAT、AGCA、AGCC、AGCG、AGCT、AGGA、AGGC、AGGG、AGGT、AGTA、AGTC、AGTG、AGTT、ATAA、ATAC、ATAG、ATAT、ATCA、ATCC、ATCG、ATCT、ATGA、ATGC、ATGG、ATGT、ATTA、ATTC、ATTG、ATTT、CAAA、CAAC、CAAG、CAAT、CACA、CACC、CACG、CACT、CAGA、CAGC、CAGG、CAGT、CATA、CATC、CATG、CATT、CCAA、CCAC、CCAG、CCAT、CCCA、CCCC、CCCG、CCCT、CCGA、CCGC、CCGG、CCGT、CCTA、CCTC、CCTG、CCTT、CGAA、CGAC、CGAG、CGAT、CGCA、CGCC、CGCG、CGCT、CGGA、CGGC、CGGG、CGGT、CGTA、CGTC、CGTG、CGTT、CTAA、CTAC、CTAG、CTAT、CTCA、CTCC、CTCG、CTCT、CTGA、CTGC、CTGG、CTGT、CTTA、CTTC、CTTG、CTTT、GAAA、GAAC、GAAG、GAAT、GACA、GACC、GACG、GACT、GAGA、GAGC、GAGG、GAGT、GATA、GATC、GATG、GATT、GCAA、GCAC、GCAG、GCAT、GCCA、GCCC、GCCG、GCCT、GCGA、GCGC、GCGG、GCGT、GCTA、GCTC、GCTG、GCTT、GGAA、GGAC、GGAG、GGAT、GGCA、GGCC、GGCG、GGCT、GGGA、GGGC、GGGG、GGGT、GGTA、GGTC、GGTG、GGTT、GTAA、GTAC、GTAG、GTAT、GTCA、GTCC、GTCG、GTCT、GTGA、GTGC、GTGG、GTGT、GTTA、GTTC、GTTG、GTTT、TAAA、TAAC、TAAG、TAAT、TACA、TACC、TACG、TACT、TAGA、TAGC、TAGG、TAGT、TATA、TATC、TATG、TATT、TCAA、TCAC、TCAG、TCAT、TCCA、TCCC、TCCG、TCCT、TCGA、TCGC、TCGG、TCGT、TCTA、TCTC、TCTG、TCTT、TGAA、TGAC、TGAG、TGAT、TGCA、TGCC、TGCG、TGCT、TGGA、TGGC、TGGG、TGGT、TGTA、TGTC、TGTG、TGTT、TTAA、TTAC、TTAG、TTAT、TTCA、TTCC、TTCG、TTCT、TTGA、TTGC、TTGG、TTGT、TTTA、TTTC、TTTG或TTTT，其中片段中之5'突出物及3'突出物不為相同序列。在一些實施例中，本文中所描述之片段(例如，次基因體片段或片段)之5'端及3'端處的獨有的突出物係各自獨立地選自ACAA、GGTC、GACC、CCAG、CTGG、CCTT、AAGG、TCAT、ATGA、TCGC、GCGA、AGAG、CTCT、AACT、AGTT、CGGT、ACCG、ATAC、GTAT、GAGT、ACTC、TTCC、GGAA、ATTA、TAAT、TCCT、AGGA、TCTA、TAGA、TGTA、TACA、GATG、CATC或TTGT，其中片段中之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物不為相同序列。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含兩個或更多個片段(例如，2-50、2-40或2-30個次片段或2-50、2-40或2-30個次片段)，其係以所需順序組裝(例如，重複參考桿狀病毒基因體之一部分或整個參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列之順序，或改變參考病毒基因體中之核苷酸序列之順序)。在一些實施例中，可藉由第一片段之獨有的3'突出物與第二片段之獨有的5'突出物之互補性來實現所需的片段組裝順序，其中第一片段之獨有的3'突出物之核苷酸序列與第二片段之獨有的5'突出物之核苷酸序列彼此互補且形成第一獨有接合區。在一些實施例中，第三片段包含獨有的5'突出物，其與前一個片段(例如，第二片段)之獨有的3'突出物互補以形成第二獨有接合區。在一些實施例中，第一片段之獨有的5'突出物與桿狀病毒表現構築體主鏈之獨有的3'突出物互補且形成獨有的接合區，其中例如桿狀病毒表現構築體主鏈已由用於產生片段之相同限制酶消化。在一些實施例中，最後一個片段(亦即，複數個片段之順序中的最後一個)之獨有的3'突出物與桿狀病毒表現構築體主鏈之獨有的5'突出物互補且形成獨有的接合區，其中桿狀病毒表現構築體主鏈已由用於產生片段之相同限制酶消化。在一些實施例中，由次基因體片段之獨有的5'突出物及另一次基因體片段之3'突出物形成之接合區的係序列中所獨有的，且具有相同核苷酸序列之桿狀病毒表現構築體內的兩個次基因體片段之間不形成其他接合區，藉此實現次基因體片段之有序組裝，例如組裝至本文中所描述之桿狀病毒基因體中。在一些實施例中，由次片段之獨有的5'突出物及另一次片段之3'突出物形成之接合區係次基因體片段內之序列中所獨有的，且具有相同核苷酸序列之次基因體片段內的兩個次片段之間的不形成其他接合區，藉此實現次片段有序地組裝至次基因體片段中。

作為實例，表 1提供形成桿狀病毒基因體之複數個(16個)次基因體片段中之各次基因體片段中的獨有的5'及3'突出物之非限制性清單，其中所需連續組裝順序係自1號次基因體片段開始且在16號次基因體片段結束。在一些實施例中，片段具有選自表 1中列舉之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物。表1. 複數個(16個)次基因體片段中之例示性4-鹼基獨有5'及3'突出物組合

次基因體片段	獨有的 5 ' 突出物 (5 ' 至 3 ' )	獨有的 3 ' 突出物 (5 ' 至 3 ' )
1	ACAA ¹	GGTC
2	GACC	CCAG
3	CTGG	CCTT
4	AAGG	TCAT
5	ATGA	TCGC
6	GCGA	AGAG
7	CTCT	AACT
8	AGTT	CGGT
9	ACCG	ATAC
10	GTAT	GAGT
11	ACTC	TTCC
12	GGAA	ATTA
13	TAAT	TCCT
14	AGGA	TCTA
15	TAGA	TGTA
16	TACA	GATG ²
主鏈	獨有的 5 ' 突出物 (5 ' 至 3 ' )	獨有的 3 ' 突出物 (5 ' 至 3 ' )
17	CATC	TTGT

¹與桿狀病毒表現構築體主鏈之獨有的3'突出物形成獨有的接合區，該主鏈由用於產生次基因體片段之相同酶消化 ²與桿狀病毒表現構築體主鏈之獨有的5'突出物形成獨有的接合區，該主鏈由用於產生次基因體片段之相同酶消化。 C. 次基因體片段

在一些實施例中，桿狀病毒表現載體包含至少2個次基因體區域，其係至少由第一次基因體片段及第二次基因體片段形成。在一些實施例中，次基因體片段之長度與次基因體區域相同。在一些實施例中，第一次基因體片段及第二次基因體片段中之各者包含獨有的5'突出物及獨有的3'突出物。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體中之次基因體片段重組整個桿狀病毒基因體(例如，變異型桿狀病毒基因體)。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體中之次基因體片段重組桿狀病毒基因體(例如，具有一或多個修飾，諸如一或多個非必需基因，諸如輔助及/或經口感染因子基因之缺失之變異型桿狀病毒基因體)之一部分。

在一些實施例中，桿狀病毒表現載體包含至少2個，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、2-30、2-25、2-20、2-15、2-10、2-5、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-30、10-25、10-20、10-15、15-30、15-25、15-20、20-30、20-25或25-30個次基因體片段。在一些實施例中，桿狀病毒表現載體包含16個次片段。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含10-20、14-18、15-17或16個次基因體片段。在一些實施例中，2-20個次基因體片段中之各者相對於其他次基因體片段包含不同的5'突出物及/或不同的3'突出物。

在一些實施例中，次基因體片段之長度係約100-25000 bp，例如長度係約100-20000、100-15000、100-10000、100-9000、100-8000、100-7000、100-6000、100-5000、100-4000、100-3000、100-2000、100-1000、100-500、100-300、100-200、100-150、250-25000、250-20000、250-15000、250-10000、250-9000、250-8000、250-7000、250-6000、250-5000、250-4000、250-3000、250-2000、250-1000、250-500、500-25000、500-20000、500-15000、500-10000、500-9000、500-8000、500-7000、500-6000、500-5000、500-4000、500-3000、500-2000、500-1000、750-25000、750-20000、750-15000、750-10000、750-9000、750-8000、750-7000、750-6000、750-5000、750-4000、750-3000、750-2000、750-1000、1000-25000、1000-20000、1000-15000、1000-10000、1000-9000、1000-8000、1000-7000、1000-6000、1000-5000、1000-4000、1000-3000、1000-2000、2500-25000、2500-20000、2500-15000、2500-10000、2500-9000、2500-8000、2500-7000、2500-6000、2500-5000、2500-4000、2500-3000、2500-2000、5000-25000、5000-20000、5000-15000、5000-10000、5000-9000、5000-8000、5000-7000、5000-6000、6000-25000、6000-20000、6000-15000、6000-10000、6000-9000、6000-8000、6000-7000、7000-25000、7000-20000、7000-15000、7000-10000、7000-9000、7000-8000、8000-25000、8000-20000、8000-15000、8000-10000、8000-9000、9000-25000、9000-20000、9000-15000、9000-10000、10000-25000、10000-20000、10000-15000、10000-12500、12500-25000、12500-20000、12500-15000、15000-25000、15000-20000、17500-25000、17500-20000、20000-25000或22500-25000。在一些實施例中，次基因體片段之長度係約100、約150、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約550、約600、約650、約700、約750、約800、約850、約900、約950、約1000、約1500、約2000、約2500、約3000、約3500、約4000、約4500、約5000、約5500、約6000、約6500、約7000、約7500、約8000、約8500、約9000、約9500、約10000、約12000、約14000、約16000、約18000、約20000、約22000、約24000、約26000、約28000或約30000 bp。在一些實施例中，次基因體片段之長度係約100-1000 bp、約250-750 bp、約500 bp、約1000-10000 bp、約5000-10000 bp、約7000-9000 bp或約8000 bp。在一些實施例中，次基因體片段之長度係約8000 bp。

在一些實施例中，該2-20個次基因體片段中之各者包含5'端處的核苷酸序列，其與另一次基因體片段之3'端處的核苷酸序列重疊(例如，同源)，其中重疊區域係一對次基因體片段所獨有的。

在一些實施例中，各次基因體片段包含獨有的5'突出物及獨有的3'突出物，例如本文中所描述之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含10-20個(例如，12-18、14-18或16個)次基因體片段。在一些實施例中，該10-20個(例如，12-18、14-18或16個)次基因體片段中之各者包含獨有的5'突出物及獨有的3'突出物。

在一些實施例中，次基因體片段之獨有的5'突出物及/或獨有的3'突出物獨立地包含4個核苷酸。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體中之至少兩個次基因體區域之第一獨有接合區包含第一次基因體片段之獨有的5'突出物及第二次基因體片段之獨有的3'突出物，其中第一次基因體片段之獨有的5'突出物與第二次基因體片段之獨有的3'突出物互補。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體中之至少兩個次基因體區域之第一獨有接合區包含第一次基因體片段之獨有的3'突出物及第二次基因體片段之獨有的5'突出物，其中第一次基因體片段之獨有的3'突出物與第二次基因體片段之獨有的5'突出物互補。在一些實施例中，第一次基因體片段之獨有的5'突出物與第二次基因體片段之獨有的3'突出物部分互補。在一些實施例中，第一次基因體片段之獨有的5'突出物與第二次基因體片段之獨有的3'突出物完全互補。在一些實施例中，第一次基因體片段之獨有的3'突出物與第二次基因體片段之獨有的5'突出物部分互補。在一些實施例中，第一次基因體片段之獨有的3'突出物與第二次基因體片段之獨有的5'突出物完全互補。

在一些實施例中，如上文所描述，次基因體片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係由限制酶，例如IIS型限制酶產生。在一些實施例中，使用BsaI產生次基因體片段中之獨有的突出物。在一些實施例中，使用BsmBI產生次基因體片段中之獨有的突出物。

在一些實施例中，次基因體片段包含5'端處之核苷酸序列(例如，第一桿狀病毒基因體序列)，其與另一次基因體片段之3'端處的核苷酸序列(例如，第一桿狀病毒基因體序列)重疊(例如，同源)，從而產生一對次基因體片段所獨有的重疊核苷酸序列區域。次基因體片段之3'端處的核苷酸序列(例如，第二桿狀病毒基因體序列)可與另一不同次基因體片段之5'端處的核苷酸序列(例如，第二桿狀病毒基因體序列)重疊，產生一對次基因體片段所獨有的另一重疊核苷酸序列區域。此等重疊核苷酸序列區域允許經由例如Gibson Assembly™反應或Golden Gate Assembly反應將次基因體片段有序地組裝至變異型桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體中。

在一些實施例中，次基因體片段位於承載載體，例如「第一」承載載體(相對於本文中所描述之包含次片段之「第二」承載載體)中。在一些實施例中，一或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、2-30、2-25、2-20、2-15、2-10、2-5、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-30、10-25、10-20、10-15、15-30、15-25、15-20、20-30、20-25或25-30個)次基因體片段位於第一承載載體中。在一些實施例中，第一承載載體包含10-20個(例如，12-18、14-18或16個)次基因體片段。在一些實施例中，第一承載載體包含16個次基因體片段。

在一些實施例中，各次基因體片段位於獨立的承載載體中。

在一些實施例中，桿狀病毒表現載體包含至少2個，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、2-30、2-25、2-20、2-15、2-10、2-5、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-30、10-25、10-20、10-15、15-30、15-25、15-20、20-30、20-25或25-30個由相同數目之次基因體片段形成之次基因體區域，其中各次基因體片段位於獨立的承載載體中。舉例而言，在一些實施例中，2-20個(例如，5-20、10-20、12-18、14-18或16個)次基因體片段形成次基因體區域，其中各次基因體片段位於獨立的承載載體中(例如，總共10-20個(例如，12-18、14-18或16個)承載載體)。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含由16個次基因體片段之16個次基因體區域，其中該16個次基因體片段中之各者位於獨立的承載載體中(亦即，總共16個承載載體)。

任何適用於選殖及維持次基因體片段之載體(例如，可商購的載體)皆適用作承載載體。在一些實施例中，用作承載載體的載體之主鏈不含用於產生次基因體片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物的限制酶(例如，IIS型限制酶)之識別位點。在一些實施例中，用作承載載體的載體之主鏈不含用於釋放次基因體片段之限制酶之識別位點，該等次基因體片段係用於例如後續Gibson Assembly™或Golden Gate Assembly。此避免例如在載體內進行切割及在藉由限制酶(例如，II型限制酶，例如IIS型限制酶)自承載載體或獨立的承載載體釋放一或多個次基因體片段時產生不合需要的片段。在一些實施例中，若載體包含用於產生次基因體區域之獨有的5'及3'突出物的限制酶之識別位點，則可使用習知選殖技術，例如定點突變誘發來改變(例如，馴化)載體以使得識別位點不具有功能性。

在一些實施例中，承載載體包含提供針對一或多種抗生素之抗性之核苷酸序列。在一些實施例中，承載載體包含一或多個(例如，1-3、1-2、1、2或3個)抗生素抗性基因卡匣，其提供針對一或多種(例如，1-3、1-2、1、2或3種)選自以下之抗生素之抗性：卡那黴素(kanamycin)、安比西林(ampicillin)、壯觀黴素(spectinomycin)、鏈黴素(streptomycin)、卡比西林(carbenecillin)、博萊黴素(bleomycin)、紅黴素(erythromycin)、多黏菌素B (polymyxin B)、四環素或氯黴素(chloramphenicol)。

在一些實施例中，次基因體片段係使用相同的限制酶(例如，II型限制酶，例如IIS型限制酶)由第一承載載體或獨立的承載載體產生。在一些實施例中，限制酶係選自(但不限於)以下之II型限制酶：Eco31I、BsaI Bso31I、BspTNI、Esp3I、BpiI、Alw26I、BsmAI、BstMAI、BmsI、BhaI、BscAI、BscUI、BsmNI、BspST5I、Bst19I、CjeP338II、LweI、Mva1312II、PhaI、SfaNI、LguI、BspQI、PsiSI、SapI、Alw44I、ApaLI、VneI、BamHI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlpI、Bsp1720I、CeIII、Bsp119I、AsuII、Bpu14I、BspT104I、BstBI、Csp45I、NspV、SfuI、Bsp120I、PspOMI、Bsu15I、BanIII、Bsa29I、BseCI、BshVI、BspDI、BspXI、BsuTUI、ClaI、Cfr10I、Bse118I、BsrFI、BssAI、Cfr13I、AspS9I、BmgT120I、PspPI、Sau96I、Csp6I、AfaI、CviQI、RsaNI、Eam1104I、Bst6I、EarI、EcoO109I、DraII、EcoRI、Eco47I、AvaII、Bme18I、SinI、VpaK11BI、Eco52I、BseX3I、BstZI、EagI、EclXI、Eco81I、AxyI、Bse21I、Bsu36I、Eco88I、Ama87I、AvaI、BmeT110I、BsiHKCI、BsoBlm、Eco91I、BstEII、BstPI、EcoO65I、PspEI、Eco130I、BssT1I、EcoT14I、ErhI、StyI、Hin1I、AcyI、BsaHI、BssNI、BstACI、Hsp92I、AspLEI、BstHHI、CfoI、HinP1I、HspAI、HindIII、HpaII、BsiSI、HapII、Kpn2I、AccIII、Aor13HI、BseAI、Bsp13I、BspEI、MroI、MspI、BsiSI、HapII、MvaI、AjnI、BseBI、Bst2UI、BstNI、BstOI、Psp6I、PspGI、MluI、NcoI、Bsp19I、NdeI、FauNDI、NotI、CciNI、SalI、TaqI、XbaI、XhoI、BclI、CpoI、CspI、Rsr2I、RsrII、MunI、MfeI、Psp5II、PpuMI、PspPPI、Bsp143I、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Aim、HinfI、MboI、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Alm、BspTI、AfIII、BfrI、Bst98I、BstAFI、MspCI、Vha464I、Pfl23II、BsiWI、PspLI、Acc65I、Asp718I、VspI、AseI、PshBI、Bsp1407I、BsrGI、BstAUI、Psp1406I、AclI、NheI、AsuNHI、BmtI、Tru1I、MseI、Tru9I、BshNI、AccB1I、BanI、BspT107I、BseDI、BsaJI、BssECI、BfmI、BstSFI、SfcI、Bpu10I、BcuI、AhII、SpeI、PagI、CciI、BspHI、RcaI、TatI、XagI、BstENI、EcoNI、PsyI、AspI、PflFI、Tth111I、TasI、Sse9I、Tsp509I、TspEI、XapI、AcsI、ApoI、Bme1390I、BmrFI、BssKI、BstSCI、MspR9I、ScrFI、StyD4I、BseXI、BbvI、BstV1I、BshTI、AgeI、AsiGI、CspAI、PinAI、XmiI、AccI、FbII、NmuCI、Tsp45I、PsuI、BstX2I、BstYI、MfII、XhoII、XmaJI、AspA2I、AvrII、BinI、SatI、Fnu4HI、Fsp4HI、ItaI、BveI、Acc36I、BfuAI、BspMI、PfoI、FspBI、BfaI、MaeI、XspI、PfeI、TfiI、SsiI、AciI、BspACI、FaqI、BsiFI、BsmFI、HpyF3I、BstDEI、DdeI、SgsI、AscI、PalAI、CseI、HgaI、Lsp1109I、BbvI、BstV1I、CsiI、MabI、SexAI、PteI、BsePlm、BssHII、FokI、BstF5I、BtsCI、KflI、Sse1825I、SanDI、SaqAI、MseI、Tru1I或Tru9I，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，次基因體片段係藉由用相同IIS型限制酶，例如選自(但不限於)以下之IIS型限制酶消化承載載體或獨立的承載載體而由第一承載載體或獨立的承載載體產生：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，IIS型限制酶係BsaI。在一些實施例中，IIS型限制酶係BsmBI。其他適用的非限制性限制酶(例如，IIS型限制酶)包括例如AasI、Acc36I、AccB7I、AceIII、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlfI、AloI、Alw26I、AlwNI、AlwXI、AmaCSI、ApaBI、ApyPI、AquII、AquIII、AquIV、ArsI、Asp10HII、BasI、Bbr7I、BbvI、BbvII、Bbv16II、Bce4I、Bce83I、BceCI、BcgI、Bco5I、Bco116I、BcoKI、BflI、BfuAI、BglI、Bli736I、Bme585I、BpiI、BplI、BpmI、BpuAI、BpuJI、BpuSI、BsAJI、Bsc4I、Bsc91I、Bsc107I、BscAI、Bse3DI、BseGI、BseKI、BseLI、BseMI、BseMII、BseXI、BseZI、BsgI、BsiYI、BslI、BslFI、Bso31I、BsoMAI、Bsp24I、Bsp423I、BspBS31I、BspCNI、BspD6I、BsplS4I、BspKT5I、BspLU11III、BspMI、BspST5I、BspTNI、BspTS514I、BspWI、Bst6I、Bst12I、Bst19I、Bst71I、BstAPI、BstBS32I、BstFZ438I、BstGZ53I、BstHZ55I、BstlZ316I、BstMAI、BstMWI、BstOZ616I、BstPZ418I、BstTS5I、BstV1I、BstV2I、BstXI、CaiI、CjeI、CjePI、CspCI、CstMI、DraIII、DrdI、DseDI、Eam1104I、Eco31I、Eco5TI、EcoA4I、Eco57MI、EcoO44I、EcoP15I、Esp3I、Esp1396I、GsuI、HaeIV、Hin4I、Hpy178III、Hpy188III、HpyF10VI、LweI、MmeI、MwoI、PfiBI、PfiMI、PhaI、PpiI、PsrI、RleAI、SdiI、SfiI、SmuI、Sth132I、StsI、TaqII、TspDTI、Tsp8EI、TspGWI、Tth111II、Van91I或VpaK11AI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶識別非連續位點且係選自(但不限於)：AasI、AccB7I、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlwNI、ApaBI、ArsI、Asp10HII、BaeI、BasI、Bce4I、BceCI、BcgI、BfiI、BglI、Bsc4I、Bsc107I、BseLI、BsiYI、BslI、BspWI、BstAPI、BstH255I、BstlZ316I、BstMWI、BstXI、CaiI、BraIII、DrdI、DseDI、HpyF10VI、PflBI、PflMI、SdiI、SfiI、Tsp8EI或Van91I，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物。在一些實施例中，由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物。在一些實施例中，限制酶可熱不活化。在一些實施例中，限制酶識別具有4-8個鹼基對，例如4個鹼基對、5個鹼基對、6個鹼基對、7個鹼基對或8個鹼基對之延伸部分。在一些實施例中，限制酶不為EcoRI。

在一些實施例中，次基因體片段，例如2-20、2-16、2-12、2-8、2-4、5-20、5-16、5-12、5-8、10-20、10-16、10-12、15-20、15-18、15-16、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個次基因體片段(例如，5-20、10-20、12-18、14-18或16個次基因體片段)能夠基於一個次基因體片段中之5'突出物與另一次基因體片段中之3'突出物之互補性而有序地組裝，以產生桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體。

在一些實施例中，次基因體片段，例如2-20、2-16、2-12、2-8、2-4、5-20、5-16、5-12、5-8、10-20、10-16、10-12、15-20、15-18、15-16、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個次基因體片段(例如，5-20、10-20、12-18、14-18或16個次基因體片段)能夠基於一個次基因體片段之5'端處的核苷酸序列與另一次基因體片段之3'端處的核苷酸序列之重疊而有序地組裝，以產生變異型桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體。在一些實施例中，兩個次基因體片段之間的核苷酸序列之重疊係4-50個(例如，4-45個、4-40個、4-35個、4-30個、4-25個、4-20個、4-15個、4-10個、10-50個、10-45個、10-40個、10-35個、10-30個、10-25個、10-20個、10-15個、15-50個、15-45個、15-40個、15-35個、15-30個、15-25個、15-20個、20-50個、20-45個、20-40個、20-35個、20-30個、20-25個、25-50個、25-45個、25-40個、25-35個、25-30個、30-50個、30-45個、30-40個、30-35個、35-50個、35-45個、35-40個、40-50個、40-45個)鹼基對，例如相鄰鹼基對。在一些實施例中，在由本文中所揭示之所選擇的II型限制酶裂解之後，5'核酸外切酶產生對應於次基因體片段之間的重疊核苷酸序列之單股互補區，從而產生能夠彼此黏接之次基因體片段。在一些實施例中，經黏接之次基因體片段之間的空位係由DNA聚合酶填充。

在一些實施例中，至少兩個次基因體片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly，使得形成至少兩個次基因體區域。在一些實施例中，至少兩個次基因體片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly，以產生變異型桿狀病毒基因體。在一些實施例中，至少兩個次基因體片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly，以產生桿狀病毒表現構築體。在一些實施例中，次基因體片段係在單步驟中接合以產生變異型桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體。Golden Gate Assembly方法係此項技術中熟知的(參見例如Engler等人, PLoS ONE2008;3:e3647；Engler等人, PLoS ONE2009;4:e5553；Weber等人, PLoS ONE2011;6:e16765)。在一些實施例中，使用Gibson Assembly™共價連接至少兩個次基因體片段以形成至少兩個次基因體區域、產生變異型桿狀病毒基因體或產生桿狀病毒表現構築體。

在一些實施例中，2-20、2-16、2-12、2-8、2-4、5-20、5-16、5-12、5-8、10-20、10-16、10-12、15-20、15-18、15-16、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個次基因體片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly或Gibson Assembly™，使得形成至少兩個次基因體區域。在一些實施例中，2-20、2-16、2-12、2-8、2-4、5-20、5-16、5-12、5-8、10-20、10-16、10-12、15-20、15-18、15-16、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個次基因體片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly或Gibson Assembly™，以產生變異型桿狀病毒基因體。在一些實施例中，2-20、2-16、2-12、2-8、2-4、5-20、5-16、5-12、5-8、10-20、10-16、10-12、15-20、15-18、15-16、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個次基因體片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly或Gibson Assembly™，以產生桿狀病毒表現構築體。在一些實施例中，14-18、14、15、16、17或18個次基因體片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly或Gibson Assembly™，使得形成至少兩個次基因體區域。在一些實施例中，14-18、14、15、16、17或18個次基因體片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly或Gibson Assembly™，以產生變異型桿狀病毒基因體。在一些實施例中，14-18、14、15、16、17或18個次基因體片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly或Gibson Assembly™，以產生桿狀病毒表現構築體。在一些實施例中，次基因體片段(例如，16個次基因體片段)係在單步驟中接合以產生變異型桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體。

在一些實施例中，共價連接之次基因體片段或變異型桿狀病毒基因體係線性的(例如，線性DNA)。在一些實施例中，共價連接之次片段或變異型桿狀病毒基因體係圓形(例如，圓形DNA)，例如當位於第一承載載體或目的載體(例如，BAC)中時。

在一些實施例中，共價連接之次基因體片段位於(或選殖至)主鏈目的載體(例如，桿狀病毒質體)中。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體位於主鏈目的載體(例如，桿狀病毒質體)中。在一些實施例中，主鏈目的載體包含填充核苷酸序列，其藉由用於產生次基因體片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物的限制酶(例如，IIS型限制酶)之識別位點在5'端及3'端處側接。在一些實施例中，主鏈目的載體包含核苷酸序列，其編碼藉由用於產生次基因體片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物的限制酶(例如，IIS型限制酶)之識別位點在5'端及3'端處側接之報導基因。在一些實施例中，主鏈目的載體包含填充核苷酸序列，其藉由所選擇的限制酶，例如所選擇的II型限制酶(例如，所選擇的IIS型限制酶)之識別位點在5'端及3'端處側接。在一些實施例中，主鏈目的載體包含核苷酸序列，其編碼藉由所選擇的限制酶，例如所選擇的II型限制酶(例如，所選擇的IIS型限制酶)之識別位點在5'端及3'端處側接之報導基因。在一些實施例中，該等識別位點與用於產生次基因體片段之識別位點不同，例如當由承載載體釋放次基因體片段時。在一些實施例中，報導基因係實現目標載體之篩選(例如，藉由藍白斑篩選)之報導子，該等目標載體包含共價連接之次基因體片段或變異型桿狀病毒基因體。在一些實施例中，報導基因係lacZa。在一些實施例中，主鏈目的載體包含用於產生次基因體片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物的限制酶(例如，IIS型限制酶)之兩個識別位點。在一些實施例中，目的載體由用於產生次基因體片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物之限制酶消化，以形成插入共價連接之次基因體片段或變異型桿狀病毒基因體之區域。在一些實施例中，主鏈目的載體包含所選擇的限制酶，例如所選擇的II型限制酶(例如，所選擇的IIS型限制酶)之識別位點，例如與用於產生次基因體片段之識別位點不同的識別位點，例如當由承載載體釋放次基因體片段時。在一些實施例中，由所選擇的限制酶，例如所選擇的II型限制酶(例如，所選擇的IIS型限制酶)消化主鏈目的載體，該限制酶可與用於產生次基因體片段(例如，當由承載載體釋放次基因體片段時)不同，以形成插入共價連接之次基因體片段或變異型桿狀病毒基因體之區域，例如經由Gibson Assembly™。

可使用各種習知的選殖或合成方法產生次基因體片段之核苷酸序列。舉例而言，可使用化學合成產生全部或一部分片段(例如，次片段或次基因體片段)。在一些實施例中，使用基於PCR之方法產生全部或一部分次基因體片段。在一些實施例中，使用基於限制酶之方法產生全部或一部分次基因體片段，例如藉由自源核苷酸序列(例如，包含所關注的序列之載體)「切割出」所關注的序列來獲得一部分或全部次基因體片段。在一些實施例中，可使用前述方法(或此項技術中已知的任何其他適合的方法)中之一或多者之組合來產生次基因體片段。在一些實施例中，次基因體片段係非模板化片段。用於化學合成核酸及PCR之方法係此項技術中熟知的。

在一些實施例中，一或多個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、1-30、1-20、1-10、1-5、1-3或1-2個次基因體片段包含對於變異型桿狀病毒核苷酸序列而言係外源或異源之核苷酸序列。在一些實施例中，異源核苷酸序列包含所關注的序列。在一些實施例中，異源核苷酸序列編碼所關注的多肽或所關注的核酸。在一些實施例中，所關注的多肽或核酸係治療性多肽(例如，治療性蛋白質)或治療性核苷酸序列(例如，治療性RNAi)。在一些實施例中，所關注的多肽係可偵測標記基因，諸如綠色螢光蛋白質(GFP)或分泌型胚胎鹼性磷酸酶(SEAP)。在一些實施例中，異源核苷酸序列，例如所關注的序列包含一或多個腺相關病毒(AAV)基因編碼區域及/或有效負載。在一些實施例中，異源序列之核苷酸序列經修飾以移除用於產生次基因體片段之限制酶，例如所選擇的II型限制酶(例如，所選擇的IIS型限制酶)之一或多個或所有識別位點。在一些實施例中，異源核苷酸序列係化學合成的。在一些實施例中，藉由基於PCR之方法產生異源核苷酸序列。在一些實施例中，藉由化學合成與基於PCR之方法之組合產生異源核苷酸序列。在一些實施例中，異源核苷酸序列係非模板化核苷酸序列(例如，非模板化片段)。在一些實施例中，使用可用的限制酶位點將異源核苷酸序列插入次基因體片段中。在一些實施例中，使用Gibson Assembly™(參見例如Gibson等人, Nat Methods2009;6:343-5；Gibson等人, Science2010;329:52-6；其內容各自以全文引用之方式併入本文中)將異源核苷酸序列插入次基因體片段中。 D. 次片段

在一些實施例中，將次基因體片段進一步分成次片段。在一些實施例中，次基因體片段包含一或多個次片段。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體中之至少兩個(例如，2-20、5-20、10-20、12-18、14-18或16個)次基因體區域包含一或多個次片段(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、1-30、1-20、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、5-20、10-20、14-18或15-17個次片段)，例如16個次片段。在一些實施例中，各次基因體片段包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、1-30、1-20、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、5-20、10-20、14-18或15-17個次片段(例如，16個次片段)。在一些實施例中，桿狀病毒表現載體包含2-30個次基因體片段，其包含2-600個次片段，例如2-550、2-500、2-450、2-400、2-350、2-300、2-250、2-200、2-150、2-100、2-50、2-25、2-20、2-18、2-16、2-14、2-12、2-10、2-8、2-6、2-4、4-600、4-550、4-500、4-450、4-400、4-350、4-300、4-250、4-200、4-150、4-100、4-50、4-25、4-20、4-18、4-16、4-14、4-12、4-10、4-8、4-6、6-600、6-550、6-500、6-450、6-400、6-350、6-300、6-250、6-200、6-150、6-100、6-50、6-25、6-20、6-18、6-16、6-14、6-12、6-10、6-8、8-600、8-550、8-500、8-450、8-400、8-350、8-300、8-250、8-200、8-150、8-100、8-50、8-25、8-20、8-18、8-16、8-14、8-12、8-10、10-600、10-550、10-500、10-450、10-400、10-350、10-300、10-250、10-200、10-150、10-100、10-50、10-25、10-20、10-18、10-16、10-14、10-12、12-600、12-550、12-500、12-450、12-400、12-350、12-300、12-250、12-200、12-150、12-100、12-50、12-25、12-20、12-18、12-16、12-14、14-600、14-550、14-500、14-450、14-400、14-350、14-300、14-250、14-200、14-150、14-100、14-50、14-25、14-20、14-18、14-16、16-600、16-550、16-500、16-450、16-400、16-350、16-300、16-250、16-200、16-150、16-100、16-50、16-25、16-20、16-18、18-600、18-550、18-500、18-450、18-400、18-350、18-300、18-250、18-200、18-150、18-100、18-50、18-25、18-20、20-600、20-550、20-500、20-450、20-400、20-350、20-300、20-250、20-200、20-150、20-100、20-50、20-25、25-600、25-550、25-500、25-450、25-400、25-350、25-300、25-250、25-200、25-150、25-100、25-50、50-600、50-550、50-500、50-450、50-400、50-350、50-300、50-250、50-200、50-150、50-100、100-600、100-550、100-500、100-450、100-400、100-350、100-300、100-250、100-200、100-150、150-550、150-600、150-500、150-450、150-400、150-350、150-300、150-250、150-200、200-600、200-550、200-500、200-450、200-400、200-350、200-300、200-250、250-600、250-550、250-500、250-450、250-400、250-350、250-300、300-600、300-550、300-500、300-450、300-400、300-350、350-600、350-550、350-500、350-450、350-400、400-600、400-550、400-500、400-450、450-600、450-550、450-500、500-600、500-550或550-600個次片段。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含12-20個(例如，14-18、15-17、15、16或17個)次基因體片段，其包含12-400個(例如，12-350、50-400、50-350、100-400、100-350、100-300、150-400、150-350、150-300、200-400、200-300、250-300、250-275或250-260個)次片段。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含16個次基因體片段，其包含256個次片段。

在一些實施例中，次片段之長度係約25-2500 bp，例如25-2000、25-1500、25-1000、25-750、25-500、25-250、25-200、25-150、25-100、25-75、25-50、50-2500、50-2000、50-1500、50-1000、50-750、50-500、50-250、50-200、50-150、50-100、50-75、75-2500、75-2000、75-1500、75-1000、75-750、75-500、75-250、75-200、75-150、75-100、100-2500、100-2000、100-1500、100-1000、100-750、100-500、100-250、100-200、100-150、150-2500、150-2000、150-1500、150-1000、150-750、150-500、150-250、150-200、200-2500、200-2000、200-1500、200-1000、200-750、200-500、200-250、250-2500、250-2000、250-1500、250-1000、250-750、250-500、500-2500、500-2000、500-1500、500-1000、500-750、750-2500、750-2000、750-1500、750-1000、1000-2500、1000-2000、1000-1500、1500-2500、1500-2000或2000-2500 bp。在一些實施例中，次片段之長度係約25、約50、約75、約100、約150、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約550、約600、約650、約700、約750、約800、約850、約900、約950、約1000、約1250、約1500、約1750、約2000、約2250或約2500 bp。在一些實施例中，次片段之長度係約100-1000 bp、約250-750 bp或約500 bp。

在一些實施例中，次片段包含獨有的5'突出物及獨有的3'突出物，例如本文中所描述之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物。

在一些實施例中，次基因體片段或桿狀病毒表現構築體內之至少兩個次區域之獨有的接合區包含第一次片段之獨有的5'突出物及第二次片段之獨有的3'突出物，其中第一次片段之獨有的5'突出物與第二次片段之獨有的3'突出物互補。在一些實施例中，次基因體片段或桿狀病毒表現構築體內之至少兩個次區域之第一獨有接合區包含第一次片段之獨有的3'突出物及第二次片段之獨有的5'突出物，其中第一次片段之獨有的3'突出物與第二次片段之獨有的5'突出物互補。在一些實施例中，第一次片段之獨有的5'突出物與第二次片段之獨有的3'突出物部分互補。在一些實施例中，第一次片段之獨有的5'突出物與第二次片段之獨有的3'突出物完全互補。在一些實施例中，第一次片段之獨有的3'突出物與第二次片段之獨有的5'突出物部分互補。在一些實施例中，第一次片段之獨有的3'突出物與第二次片段之獨有的5'突出物完全互補。

在一些實施例中，次片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係由限制酶進行之次片段之裂解產生。在一些實施例中，用於產生次片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物之限制酶，例如IIS型限制酶與用於產生次基因體片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物之限制酶不同。

在一些實施例中，使用相同的限制酶(例如，IIS型限制酶)產生各次片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物。在一些實施例中，藉由例如上文所描述之IIS型限制酶產生各次基因體片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物。在一些實施例中，用於產生各次片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物之相同的限制酶，例如相同的IIS型限制酶與用於產生次基因體片段之獨有的5'及3'突出物之限制酶不同。舉例而言，在一些實施例中，使用BsaI產生次片段中之獨有的突出物，且使用BsmBI產生次基因體片段中之獨有的突出物。在一些實施例中，使用BsmBI產生次片段中之獨有的突出物，且使用BsaI產生次基因體片段中之獨有的突出物。

在一些實施例中，次片段包含5'端處之核苷酸序列(例如，第一桿狀病毒基因體序列)，其與另一次片段之3'端處的核苷酸序列(例如，第一桿狀病毒基因體序列)重疊，產生一對次片段所獨有的重疊核苷酸序列區域。次片段之3'端處的核苷酸序列(例如，第二桿狀病毒基因體序列)可與另一不同次片段之5'端處的核苷酸序列(例如，第二桿狀病毒基因體序列)重疊，產生一對次片段所獨有的另一重疊核苷酸序列區域。此等重疊核苷酸序列區域允許經由例如Gibson Assembly™反應將次片段有序地組裝至次基因體片段、變異型桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體中。

在一些實施例中，次基因體片段位於承載載體，例如「第二」承載載體(相對於本文中所描述之包含次基因體片段之「第一」承載載體)中。在一些實施例中，一或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、2-30、2-25、2-20、2-15、2-10、2-5、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-30、10-25、10-20、10-15、15-30、15-25、15-20、20-30、20-25或25-30個)次片段位於第二承載載體中。在一些實施例中，第二承載載體包含10-20個(例如，12-18、14-18或16個)次片段。在一些實施例中，第二承載載體包含16個次片段。

在一些實施例中，該一或多個次片段(例如，2-20、12-18、14-18或16個次片段)中之各者位於分開的第二承載載體(例如，2-20、12-18、14-18或16個第二承載載體)中。作為實例，在一個實施例中，桿狀病毒表現構築體包含由16個次基因體片段形成之16個次基因體區域，其中各次基因體片段係由16個次片段形成。在此實施例中，該16個次基因體片段中之各者係維持在分開的第一承載載體中(亦即，總共16個第一承載載體)，且形成次基因體片段之16個次片段中之各者係維持在分開的第二承載載體中(亦即，總共16個第二承載載體)。

任何適用於選殖及維持次片段之載體(例如，可商購的載體)皆適用作第二承載載體。在一些實施例中，用作第二承載載體的載體之主鏈不含用於產生次片段之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物的限制酶之識別位點。在一些實施例中，用作第二承載載體的載體之主鏈不含用於釋放用於後續Gibson Assembly™的次片段之限制酶之識別位點。此避免例如在載體內進行切割及在藉由限制酶(例如，II型限制酶，例如IIS型限制酶)自第二承載載體或分開的第二承載載體釋放一或多個次片段時產生不合需要的片段。在一些實施例中，若載體包含用於產生次基因體區域之獨有的5'及3'突出物的限制酶之識別位點，則可使用習知選殖技術，例如定點突變誘發來改變(例如，馴化)載體以使得一或多個識別位點不具有功能性。

在一些實施例中，第二承載載體包含提供針對一或多種抗生素之抗性之核苷酸序列。在一些實施例中，第二承載載體包含一或多個(例如，1-3、1-2、1、2或3個)抗生素抗性基因卡匣，其提供針對一或多種(例如，1-3、1-2、1、2或3種)選自以下之抗生素之抗性：卡那黴素、安比西林、壯觀黴素、鏈黴素、卡比西林、博萊黴素、紅黴素、多黏菌素B、四環素或氯黴素。在一些實施例中，第二承載載體提供針對抗生素之抗性，該抗性未由包含次基因體片段之第一承載載體提供。在一些實施例中，用於次基因體片段之第一承載載體提供針對卡那黴素之抗性，且用於次片段之第二承載載體提供針對安比西林之抗性。在一些實施例中，用於次基因體片段之第一承載載體提供針對安比西林之抗性，且用於次片段之第二承載載體提供針對卡那黴素之抗性。

在一些實施例中，次片段係使用相同的限制酶(例如，II型限制酶，例如IIS型限制酶)由第二承載載體或分開的第二承載載體產生。在一些實施例中，限制酶係選自(但不限於)以下之II型限制酶：Eco31I、BsaI Bso31I、BspTNI、Esp3I、BpiI、Alw26I、BsmAI、BstMAI、BmsI、BhaI、BscAI、BscUI、BsmNI、BspST5I、Bst19I、CjeP338II、LweI、Mva1312II、PhaI、SfaNI、LguI、BspQI、PsiSI、SapI、Alw44I、ApaLI、VneI、BamHI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlpI、Bsp1720I、CeIII、Bsp119I、AsuII、Bpu14I、BspT104I、BstBI、Csp45I、NspV、SfuI、Bsp120I、PspOMI、Bsu15I、BanIII、Bsa29I、BseCI、BshVI、BspDI、BspXI、BsuTUI、ClaI、Cfr10I、Bse118I、BsrFI、BssAI、Cfr13I、AspS9I、BmgT120I、PspPI、Sau96I、Csp6I、AfaI、CviQI、RsaNI、Eam1104I、Bst6I、EarI、EcoO109I、DraII、EcoRI、Eco47I、AvaII、Bme18I、SinI、VpaK11BI、Eco52I、BseX3I、BstZI、EagI、EclXI、Eco81I、AxyI、Bse21I、Bsu36I、Eco88I、Ama87I、AvaI、BmeT110I、BsiHKCI、BsoBlm、Eco91I、BstEII、BstPI、EcoO65I、PspEI、Eco130I、BssT1I、EcoT14I、ErhI、StyI、Hin1I、AcyI、BsaHI、BssNI、BstACI、Hsp92I、AspLEI、BstHHI、CfoI、HinP1I、HspAI、HindIII、HpaII、BsiSI、HapII、Kpn2I、AccIII、Aor13HI、BseAI、Bsp13I、BspEI、MroI、MspI、BsiSI、HapII、MvaI、AjnI、BseBI、Bst2UI、BstNI、BstOI、Psp6I、PspGI、MluI、NcoI、Bsp19I、NdeI、FauNDI、NotI、CciNI、SalI、TaqI、XbaI、XhoI、BclI、CpoI、CspI、Rsr2I、RsrII、MunI、MfeI、Psp5II、PpuMI、PspPPI、Bsp143I、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Aim、HinfI、MboI、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Alm、BspTI、AfIII、BfrI、Bst98I、BstAFI、MspCI、Vha464I、Pfl23II、BsiWI、PspLI、Acc65I、Asp718I、VspI、AseI、PshBI、Bsp1407I、BsrGI、BstAUI、Psp1406I、AclI、NheI、AsuNHI、BmtI、Tru1I、MseI、Tru9I、BshNI、AccB1I、BanI、BspT107I、BseDI、BsaJI、BssECI、BfmI、BstSFI、SfcI、Bpu10I、BcuI、AhII、SpeI、PagI、CciI、BspHI、RcaI、TatI、XagI、BstENI、EcoNI、PsyI、AspI、PflFI、Tth111I、TasI、Sse9I、Tsp509I、TspEI、XapI、AcsI、ApoI、Bme1390I、BmrFI、BssKI、BstSCI、MspR9I、ScrFI、StyD4I、BseXI、BbvI、BstV1I、BshTI、AgeI、AsiGI、CspAI、PinAI、XmiI、AccI、FbII、NmuCI、Tsp45I、PsuI、BstX2I、BstYI、MfII、XhoII、XmaJI、AspA2I、AvrII、BinI、SatI、Fnu4HI、Fsp4HI、ItaI、BveI、Acc36I、BfuAI、BspMI、PfoI、FspBI、BfaI、MaeI、XspI、PfeI、TfiI、SsiI、AciI、BspACI、FaqI、BsiFI、BsmFI、HpyF3I、BstDEI、DdeI、SgsI、AscI、PalAI、CseI、HgaI、Lsp1109I、BbvI、BstV1I、CsiI、MabI、SexAI、PteI、BsePlm、BssHII、FokI、BstF5I、BtsCI、KflI、Sse1825I、SanDI、SaqAI、MseI、Tru1I或Tru9I，o或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，次片段係藉由用相同IIS型限制酶，例如選自(但不限於)以下之IIS型限制酶消化第二承載載體或分開的第二承載載體而由第二承載載體或分開的第二承載載體產生：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，IIS型限制酶係BsaI。在一些實施例中，IIS型限制酶係BsmBI。其他適用的非限制性酶(例如，IIS型限制酶)包括例如AasI、Acc36I、AccB7I、AceIII、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlfI、AloI、Alw26I、AlwNI、AlwXI、AmaCSI、ApaBI、ApyPI、AquII、AquIII、AquIV、ArsI、Asp10HII、BasI、Bbr7I、BbvI、BbvII、Bbv16II、Bce4I、Bce83I、BceCI、BcgI、Bco5I、Bco116I、BcoKI、BflI、BfuAI、BglI、Bli736I、Bme585I、BpiI、BplI、BpmI、BpuAI、BpuJI、BpuSI、BsAJI、Bsc4I、Bsc91I、Bsc107I、BscAI、Bse3DI、BseGI、BseKI、BseLI、BseMI、BseMII、BseXI、BseZI、BsgI、BsiYI、BslI、BslFI、Bso31I、BsoMAI、Bsp24I、Bsp423I、BspBS31I、BspCNI、BspD6I、BsplS4I、BspKT5I、BspLU11III、BspMI、BspST5I、BspTNI、BspTS514I、BspWI、Bst6I、Bst12I、Bst19I、Bst71I、BstAPI、BstBS32I、BstFZ438I、BstGZ53I、BstHZ55I、BstlZ316I、BstMAI、BstMWI、BstOZ616I、BstPZ418I、BstTS5I、BstV1I、BstV2I、BstXI、CaiI、CjeI、CjePI、CspCI、CstMI、DraIII、DrdI、DseDI、Eam1104I、Eco31I、Eco5TI、EcoA4I、Eco57MI、EcoO44I、EcoP15I、Esp3I、Esp1396I、GsuI、HaeIV、Hin4I、Hpy178III、Hpy188III、HpyF10VI、LweI、MmeI、MwoI、PfiBI、PfiMI、PhaI、PpiI、PsrI、RleAI、SdiI、SfiI、SmuI、Sth132I、StsI、TaqII、TspDTI、Tsp8EI、TspGWI、Tth111II、Van91I或VpaK11AI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶識別非連續位點，例如AasI、AccB7I、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlwNI、ApaBI、ArsI、Asp10HII、BaeI、BasI、Bce4I、BceCI、BcgI、BfiI、BglI、Bsc4I、Bsc107I、BseLI、BsiYI、BslI、BspWI、BstAPI、BstH255I、BstlZ316I、BstMWI、BstXI、CaiI、BraIII、DrdI、DseDI、HpyF10VI、PflBI、PflMI、SdiI、SfiI、Tsp8EI或Van91I，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物。在一些實施例中，由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物。在一些實施例中，限制酶可熱不活化。在一些實施例中，限制酶識別具有4-8個鹼基對，例如4個鹼基對、5個鹼基對、6個鹼基對、7個鹼基對或8個鹼基對之延伸部分。在一些實施例中，限制酶不為EcoRI。

在一些實施例中，用於自第二承載載體或分開的第二承載載體產生一或多個次片段之相同限制酶與用於產生次基因體片段之酶不同。在一些實施例中，IIS型限制酶係BsaI。在一些實施例中，IIS型限制酶係BsmBI。在一些實施例中，用於產生次片段之II型限制酶係BsaI，且用於產生次基因體片段之IIS型限制酶係BsmBI。在一些實施例中，用於產生次片段之II型限制酶係BsmBI，且用於產生次基因體片段之IIS型限制酶係BsaI。本發明亦涵蓋用於產生次片段及次基因體片段之IIS型限制酶之其他組合。

在一些實施例中，次片段(例如，2-20、2-16、2-12、2-8、2-4、5-20、5-16、5-12、5-8、10-20、10-16、10-12、15-20、15-18、15-16、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個次基因體片段)能夠基於一個次片段中之5'突出物與另一次片段中之3'突出物之互補性而有序地組裝，以產生次基因體片段及/或桿狀病毒表現構築體。

在一些實施例中，次片段，例如2-20、2-16、2-12、2-8、2-4、5-20、5-16、5-12、5-8、10-20、10-16、10-12、15-20、15-18、15-16、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個次片段(例如，5-20、10-20、12-18、14-18或16個次片段)能夠基於一個次片段之5'端處的核苷酸序列(例如，桿狀病毒基因體序列)與另一次片段之3'端處的核苷酸序列(例如，桿狀病毒基因體序列)之重疊而有序地組裝，以產生次基因體片段、變異型桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體。在一些實施例中，兩個次片段之間的核苷酸序列之重疊係4-50個(例如，4-45個、4-40個、4-35個、4-30個、4-25個、4-20個、4-15個、4-10個、10-50個、10-45個、10-40個、10-35個、10-30個、10-25個、10-20個、10-15個、15-50個、15-45個、15-40個、15-35個、15-30個、15-25個、15-20個、20-50個、20-45個、20-40個、20-35個、20-30個、20-25個、25-50個、25-45個、25-40個、25-35個、25-30個、30-50個、30-45個、30-40個、30-35個、35-50個、35-45個、35-40個、40-50個、40-45個)鹼基對，例如相鄰鹼基對。在一些實施例中，在由本文中所揭示之所選擇的II型限制酶裂解之後，5'核酸外切酶產生對應於次片段之間的重疊核苷酸序列之單股互補區，從而產生能夠彼此黏接之次片段。在一些實施例中，經黏接之次片段之間的空位係由DNA聚合酶填充。

在一些實施例中，至少兩個次片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly，使得形成一或多個次基因體區域或次基因體片段。在一些實施例中，兩個或更多個次片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly，以產生變異型桿狀病毒基因體。在一些實施例中，兩個或更多個次片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly，以產生桿狀病毒表現構築體。在一些實施例中，次片段係在單步驟中接合以產生一或多個次基因體片段、變異型桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體。在一些實施例中，使用Gibson Assembly™共價連接至少兩個次片段以形成至少兩個次基因體區域，從而產生變異型桿狀病毒基因體或產生桿狀病毒表現構築體。

在一些實施例中，2-20、2-16、2-12、2-8、2-4、5-20、5-16、5-12、5-8、10-20、10-16、10-12、15-20、15-18、15-16、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個次片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly或Gibson Assembly™，使得形成一或多個次基因體區域或次基因體片段。在一些實施例中，2-20、2-16、2-12、2-8、2-4、5-20、5-16、5-12、5-8、10-20、10-16、10-12、15-20、15-18、15-16、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個次片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly或Gibson Assembly™，以產生變異型桿狀病毒基因體。在一些實施例中，2-20、2-16、2-12、2-8、2-4、5-20、5-16、5-12、5-8、10-20、10-16、10-12、15-20、15-18、15-16、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個次片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly或Gibson Assembly™，以產生桿狀病毒表現構築體。在一些實施例中，14-18、14、15、16、17或18個次片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly或Gibson Assembly™，使得形成一或多個次基因體區域或次基因體片段。在一些實施例中，14-18、14、15、16、17或18個次片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly或Gibson Assembly™，以產生變異型桿狀病毒基因體。在一些實施例中，14-18、14、15、16、17或18個次片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly或Gibson Assembly™，以產生桿狀病毒表現構築體。在一些實施例中，次片段(例如，16個次片段)係在單步驟中接合以產生一或多個次基因體片段、變異型桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體。

在一些實施例中，共價連接之次片段係線性的(例如，線性DNA)。在一些實施例中，共價連接之次片段係圓形的(例如，圓形DNA)，例如當位於第二承載載體、第一承載載體或目的載體(例如，BAC)中時。

可使用各種習知的選殖或合成方法產生次片段之核苷酸序列。舉例而言，可使用化學合成產生全部或一部分片段(例如，次片段或次基因體片段)。在一些實施例中，使用基於PCR之方法產生全部或一部分次片段。在一些實施例中，次片段係非模板化片段。在一些實施例中，使用基於限制酶之方法產生全部或一部分次片段，例如藉由自源核苷酸序列(例如，包含所關注的序列之載體)「切割出」所關注的序列來獲得一部分或全部次片段。在一些實施例中，可使用前述方法(或此項技術中已知的任何其他適合的方法)中之一或多者之組合來產生次片段。

在一些實施例中，一或多個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、1-30、1-20、1-10、1-5、1-3或1-2個次片段包含對於變異型桿狀病毒核苷酸序列而言係外源或異源之核苷酸序列。在一些實施例中，異源核苷酸序列包含所關注的序列。在一些實施例中，異源核苷酸序列編碼所關注的多肽或所關注的核酸。在一些實施例中，所關注的多肽或核酸係治療性多肽(例如，治療性蛋白質)或治療性核苷酸序列(例如，治療性RNAi)。在一些實施例中，所關注的多肽係可偵測標記基因，諸如綠色螢光蛋白質(GFP)或分泌型胚胎鹼性磷酸酶(SEAP)。在一些實施例中，異源核苷酸序列，例如所關注的序列包含一或多個腺相關病毒(AAV)基因編碼區域及/或有效負載。在一些實施例中，異源序列之核苷酸序列經修飾以移除用於產生次片段之限制酶(例如，所選擇的IIS型限制酶)之一或多個或所有識別位點。在一些實施例中，異源核苷酸序列係化學合成的。在一些實施例中，藉由基於PCR之方法產生異源核苷酸序列。在一些實施例中，藉由化學合成與基於PCR之方法之組合產生異源核苷酸序列。在一些實施例中，異源核苷酸序列係非模板化核苷酸序列(例如，非模板化片段)。在一些實施例中，使用可用的限制酶位點將異源核苷酸序列插入次片段中。在一些實施例中，使用Gibson Assembly™將異源核苷酸序列插入次片段中。

在一些實施例中，次片段可進一步再分成一或多個其他片段。在一些實施例中，該一或多個其他片段係維持在第三承載載體上。在一些實施例中，該一或多個其他片段係使用相同的限制酶，例如相同的II型限制酶(例如，相同的IIS型限制酶)由第三承載載體或分開的第三承載載體產生，其中該相同的限制酶與用於產生次基因體片段之限制酶及用於產生次片段之限制酶不同。在一些實施例中，該一或多個其他片段能夠基於一個其他片段中之5'突出物與另一其他片段之3'突出物之互補性(部分或完全互補)而有序地組裝，以產生次片段。在一些實施例中，該一或多個其他片段能夠基於一個其他片段之5'端處的核苷酸序列與另一其他片段之3'端處的核苷酸序列之重疊而有序地組裝，以產生次片段，例如經由Gibson Assembly ^TM。 E. 變異型核苷酸序列

在一些實施例中，本文中所描述之桿狀病毒表現構築體包含相對於參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列之變異型核苷酸序列。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含參考桿狀病毒基因體之核苷酸序列或其一部分。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含野生型桿狀病毒基因體(例如，參考桿狀病毒基因體)。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含相對於參考桿狀病毒基因體經修飾之桿狀病毒基因體。

可引入相對於參考病毒基因體(例如，參考桿狀病毒基因體)中之核苷酸序列之修飾以產生變異型病毒核苷酸序列(例如，變異型桿狀病毒核苷酸序列)。例示性修飾包括(但不限於)一或多個核苷酸之取代、添加或缺失；一或多個轉殖基因之引入；一或多個酶識別位點之引入；一或多個酶識別位點之缺失；及一或多個核苷酸區域(例如，非必需區域，諸如非必需基因編碼區域或非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)編碼區域之調節區)之缺失。在一些實施例中，非必需基因區域(例如，基因編碼區域或調節區)經修飾，例如藉由缺失、插入或突變，以減少或消除基因產物。例示性修飾包括框移突變、啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入。

可充當參考桿狀病毒基因體之野生型桿狀病毒基因體係此項技術中熟知的(參見例如www.talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_online_report/dsdna-viruses/w/baculoviridae，其內容以全文引用之方式併入本文中)。

在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係α-桿狀病毒基因體。在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係β-桿狀病毒基因體。在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係δ-桿狀病毒基因體。在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係γ-桿狀病毒基因體。在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係選自以下之α-桿狀病毒之基因體：茶小卷葉蛾( Adoxophyes honmai)核多角體病毒(NPV)、小地老虎( Agrotis ipsilon)多核多角體病毒(MNPV)、黃地老虎( Agrotis segetum) NPVA、黃地老虎NPVB、柞蠶蛾( Antheraea pernyi) NPV、黎豆夜蛾MNPV、苜蓿銀紋夜蛾MNPV (AcMNPV)、家蠶NPV (BmNPV)、油桐尺蛾( Buzura suppressaria) NPV、遷飛粉蝶( Catopsilia pomona) NPV、雲杉卷葉蛾( Choristoneura fumiferana) DEF MNPV、雲杉卷葉蛾MNPV、紫色卷蛾( Choristoneura murinana) NPV、薔薇斜條卷葉蛾( Choristoneura rosaceana) NPV、錁紋夜蛾( Chrysodeixis chalcites) NPV、大豆尺蛾( Chrysodeixis includens) NPV、豆天蛾( Clanis bilineata) NPV、竹織葉蛾( Condylorrhiza vestigialis) NPV、荔枝蛾( Cryptophlebia peltastica) NPV、波紋雜毛蟲( Cyclophragma undans) NPV、茶尺蠖( Ectropis obliqua) NPV、蘋果褐卷蛾( Epiphyas postvittana) NPV、茶毛蟲( Euproctis pseudoconspersa) NPV、番茄夜蛾( Helicoverpa armigera) NPV、新天蠶蛾屬( Hemileucaspecies) NPV、美國白蛾( Hyphantria cunea) NPV、柑桔尺蛾( Hyposidra talaca) NPV、鐵杉尺蠖( Lambdina fiscellaria) NPV、黏蟲( Leucania separata) NPV、巴西天蠶蛾( Lonomia obliqua) NPV、舞毒蛾( Lymantria dispar) MNPV、黑角舞蛾( Lymantria xylina) NPV、甘藍夜蛾( Mamestra brassicae) MNPV、蓓帶夜蛾( Mamestra configurata) NPV A、蓓帶夜蛾NPVB、豆莢螟( Maruca vitrata) NPV、一點黏蟲( Mythimna unipuncta) NPV A、一點黏蟲NPVB、冬尺蛾( Operophtera brumata) NPV、白斑毒蛾( Orgyia leucostigma) NPV、花旗松毒蛾( Orgyia pseudotsugata) MNPV、斜紋刺蛾( Oxyplax ochracea) NPV、豆雜角夜蛾( Peridroma saucia) NPV、天蛾( Perigonia lusca) NPV、亞熱帶黏蟲( Spodoptera eridania) NPV、莎草黏蟲( Spodoptera exempta) NPV、甜菜夜蛾( Spodoptera exigua)多NPV A、甜菜夜蛾多NPV B、草地黏蟲MNPV、灰翅夜蛾( Spodoptera littoralis) NPV、斜紋夜蛾( Spodoptera litura) NPV、棗尺蠖( Sucra jujuba) NPV、弧金翅夜蛾NPV (ThorNPV)、粉紋夜蛾( Trichoplusia ni) SNPV、豆卷葉蝶( Urbanus proteus) NPV、蝙蝠蛾( Wiseana signata) NPV或任何前述α-桿狀病毒之變異體(例如，變異型病毒株)。

在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係選自以下之β-桿狀病毒之基因體：茶姬捲葉蛾( Adoxophyes orana)顆粒病毒(GV)、黃地老虎GV、雲杉卷葉蛾GV、楊扇舟蛾( Clostera anachoreta) GV、分月扇舟蛾( Clostera anastomosis) GV A、分月扇舟蛾GV B、瘤野螟( Cnaphalocrocis medinalis) GV、蘋果異形小卷蛾( Cryptophlebia leucotreta) GV、蘋果蠹蛾( Cydia pomonella) GV、小蔗螟( Diatraea saccharalis) GV、斜紋夜蛾( Epinotia aporema) GV、木薯天蛾( Erinnyis ello) GV、葡萄葉斑蛾( Harrisina brillians) GV、毛脛夜蛾( Mocis latipes) GV、一點黏蟲GV A、一點黏蟲GV B 、馬鈴薯塊莖蛾( Phthorimaea operculella) GV、印度穀螟( Plodia interpunctella) GV、小菜蛾( Plutella xylostella) GV、草地黏蟲GV、斜紋夜蛾GV、粉紋夜蛾GV、八字地老虎( Xestia c-nigrum) GV或任何前述β-桿狀病毒之變異體(例如，變異型病毒株)。

在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係δ-桿狀病毒黑腳庫蚊( Culex nigripalpus) NPV或變異體(例如，變異型病毒株)之基因體。

在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係選自以下之γ-桿狀病毒之基因體：紅頭新松葉蜂( Neodiprion lecontei) NPV、松黃葉蜂( Neodiprion sertifer) NPV或其變異體(例如，變異型病毒株)。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含bMON14272、vAce25ko或vAclef11KO桿狀病毒基因體。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含變異型bMON14272桿狀病毒基因體。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含相對於參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列包含較少限制酶位點(例如，較少功能性限制酶位點)之變異型核苷酸序列(例如，次片段、次基因體區域、次基因體片段或基因體)。在一些實施例中，變異型核苷酸序列係次基因體區域內之變異型次區域(例如，經分割之次基因體區域內之區域)。在一些實施例中，變異型核苷酸序列係變異型次片段。在一些實施例中，變異型核苷酸序列係變異型次基因體區域。在一些實施例中，變異型核苷酸序列係變異型次基因體片段。在一些實施例中，變異型核苷酸序列係變異型桿狀病毒基因體序列。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含變異型核苷酸序列(例如，次片段、次基因體區域、次基因體片段或基因體)，其所包含之限制酶位點(例如，天然存在之功能性識別位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)及/或一或多個所選擇的II型限制酶(例如，IIS型限制酶)之識別位點比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少56個、至少57個、至少58個、至少59個或至少60個。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含變異型核苷酸序列，其所包含之限制酶位點(例如，天然存在之功能性識別位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少1-60個、2-60個、4-60個、6-60個、8-60個、10-60個、15-60個、20-60個、25-60個、30-60個、35-60個、40-60個、45-60個、50-60個、55-60個、1-50個、2-50個、4-50個、6-50個、8-50個、10-50個、15-50個、20-50個、25-50個、30-50個、35-50個、40-50個、45-50個、1-40個、2-40個、4-40個、6-40個、8-40個、10-40個、15-40個、20-40個、25-40個、30-40個、35-40個、1-30個、2-30個、4-30個、6-30個、8-30個、10-30個、15-30個、20-30個、25-30個、1-20個、2-20個、4-20個、6-20個、8-20個、10-20個、15-20個、1-10個、2-10個、4-10個、6-10個或8-10個。在一些實施例中，限制酶位點係選自(但不限於)以下之II型限制酶之識別位點：Eco31I、BsaI Bso31I、BspTNI、Esp3I、BpiI、Alw26I、BsmAI、BstMAI、BmsI、BhaI、BscAI、BscUI、BsmNI、BspST5I、Bst19I、CjeP338II、LweI、Mva1312II、PhaI、SfaNI、LguI、BspQI、PsiSI、SapI、Alw44I、ApaLI、VneI、BamHI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlpI、Bsp1720I、CeIII、Bsp119I、AsuII、Bpu14I、BspT104I、BstBI、Csp45I、NspV、SfuI、Bsp120I、PspOMI、Bsu15I、BanIII、Bsa29I、BseCI、BshVI、BspDI、BspXI、BsuTUI、ClaI、Cfr10I、Bse118I、BsrFI、BssAI、Cfr13I、AspS9I、BmgT120I、PspPI、Sau96I、Csp6I、AfaI、CviQI、RsaNI、Eam1104I、Bst6I、EarI、EcoO109I、DraII、EcoRI、Eco47I、AvaII、Bme18I、SinI、VpaK11BI、Eco52I、BseX3I、BstZI、EagI、EclXI、Eco81I、AxyI、Bse21I、Bsu36I、Eco88I、Ama87I、AvaI、BmeT110I、BsiHKCI、BsoBlm、Eco91I、BstEII、BstPI、EcoO65I、PspEI、Eco130I、BssT1I、EcoT14I、ErhI、StyI、Hin1I、AcyI、BsaHI、BssNI、BstACI、Hsp92I、AspLEI、BstHHI、CfoI、HinP1I、HspAI、HindIII、HpaII、BsiSI、HapII、Kpn2I、AccIII、Aor13HI、BseAI、Bsp13I、BspEI、MroI、MspI、BsiSI、HapII、MvaI、AjnI、BseBI、Bst2UI、BstNI、BstOI、Psp6I、PspGI、MluI、NcoI、Bsp19I、NdeI、FauNDI、NotI、CciNI、SalI、TaqI、XbaI、XhoI、BclI、CpoI、CspI、Rsr2I、RsrII、MunI、MfeI、Psp5II、PpuMI、PspPPI、Bsp143I、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Aim、HinfI、MboI、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Alm、BspTI、AfIII、BfrI、Bst98I、BstAFI、MspCI、Vha464I、Pfl23II、BsiWI、PspLI、Acc65I、Asp718I、VspI、AseI、PshBI、Bsp1407I、BsrGI、BstAUI、Psp1406I、AclI、NheI、AsuNHI、BmtI、Tru1I、MseI、Tru9I、BshNI、AccB1I、BanI、BspT107I、BseDI、BsaJI、BssECI、BfmI、BstSFI、SfcI、Bpu10I、BcuI、AhII、SpeI、PagI、CciI、BspHI、RcaI、TatI、XagI、BstENI、EcoNI、PsyI、AspI、PflFI、Tth111I、TasI、Sse9I、Tsp509I、TspEI、XapI、AcsI、ApoI、Bme1390I、BmrFI、BssKI、BstSCI、MspR9I、ScrFI、StyD4I、BseXI、BbvI、BstV1I、BshTI、AgeI、AsiGI、CspAI、PinAI、XmiI、AccI、FbII、NmuCI、Tsp45I、PsuI、BstX2I、BstYI、MfII、XhoII、XmaJI、AspA2I、AvrII、BinI、SatI、Fnu4HI、Fsp4HI、ItaI、BveI、Acc36I、BfuAI、BspMI、PfoI、FspBI、BfaI、MaeI、XspI、PfeI、TfiI、SsiI、AciI、BspACI、FaqI、BsiFI、BsmFI、HpyF3I、BstDEI、DdeI、SgsI、AscI、PalAI、CseI、HgaI、Lsp1109I、BbvI、BstV1I、CsiI、MabI、SexAI、PteI、BsePlm、BssHII、FokI、BstF5I、BtsCI、KflI、Sse1825I、SanDI、SaqAI、MseI、Tru1I或Tru9I，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係產生變性黏性突出物之限制酶。在一些實施例中，限制酶使其識別位點外部發生裂解。在一些實施例中，限制酶產生交錯末端(例如，具有2-4個鹼基之交錯末端)。在一些實施例中，限制酶識別不對稱DNA序列。在一些實施例中，限制酶產生獨特的黏性突出物。在一些實施例中，限制酶具有超過一個識別位點(例如，BstXI)。在一些實施例中，限制酶係IIS型限制酶。在一些實施例中，限制酶係選自(但不限於) AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，IIS型限制酶係BsaI、BsmBI或其組合。在一些實施例中，變異型桿狀病毒核苷酸序列不含IIS型限制位點。其他適用的非限制性限制酶(例如，IIS型限制酶)包括例如AasI、Acc36I、AccB7I、AceIII、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlfI、AloI、Alw26I、AlwNI、AlwXI、AmaCSI、ApaBI、ApyPI、AquII、AquIII、AquIV、ArsI、Asp10HII、BasI、Bbr7I、BbvI、BbvII、Bbv16II、Bce4I、Bce83I、BceCI、BcgI、Bco5I、Bco116I、BcoKI、BflI、BfuAI、BglI、Bli736I、Bme585I、BpiI、BplI、BpmI、BpuAI、BpuJI、BpuSI、BsAJI、Bsc4I、Bsc91I、Bsc107I、BscAI、Bse3DI、BseGI、BseKI、BseLI、BseMI、BseMII、BseXI、BseZI、BsgI、BsiYI、BslI、BslFI、Bso31I、BsoMAI、Bsp24I、Bsp423I、BspBS31I、BspCNI、BspD6I、BsplS4I、BspKT5I、BspLU11III、BspMI、BspST5I、BspTNI、BspTS514I、BspWI、Bst6I、Bst12I、Bst19I、Bst71I、BstAPI、BstBS32I、BstFZ438I、BstGZ53I、BstHZ55I、BstlZ316I、BstMAI、BstMWI、BstOZ616I、BstPZ418I、BstTS5I、BstV1I、BstV2I、BstXI、CaiI、CjeI、CjePI、CspCI、CstMI、DraIII、DrdI、DseDI、Eam1104I、Eco31I、Eco5TI、EcoA4I、Eco57MI、EcoO44I、EcoP15I、Esp3I、Esp1396I、GsuI、HaeIV、Hin4I、Hpy178III、Hpy188III、HpyF10VI、LweI、MmeI、MwoI、PfiBI、PfiMI、PhaI、PpiI、PsrI、RleAI、SdiI、SfiI、SmuI、Sth132I、StsI、TaqII、TspDTI、Tsp8EI、TspGWI、Tth111II、Van91I或VpaK11AI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶識別非連續位點，例如AasI、AccB7I、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlwNI、ApaBI、ArsI、Asp10HII、BaeI、BasI、Bce4I、BceCI、BcgI、BfiI、BglI、Bsc4I、Bsc107I、BseLI、BsiYI、BslI、BspWI、BstAPI、BstH255I、BstlZ316I、BstMWI、BstXI、CaiI、BraIII、DrdI、DseDI、HpyF10VI、PflBI、PflMI、SdiI、SfiI、Tsp8EI或Van91I，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物。在一些實施例中，由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物。在一些實施例中，限制酶可熱不活化。在一些實施例中，限制酶識別具有4-8個鹼基對，例如4個鹼基對、5個鹼基對、6個鹼基對、7個鹼基對或8個鹼基對之延伸部分。在一些實施例中，限制酶不為EcoRI。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含變異型核苷酸序列(例如，次片段、次基因體區域、次基因體片段或基因體)，其所包含之所選擇的II型限制酶(例如，所選擇的IIS型限制酶)或一或多個所選擇的II型限制酶(例如，一或多個所選擇的IIS型限制酶)之識別位點比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少1個，例如至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個或至少90個。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含變異型核苷酸序列(例如，次片段、次基因體區域、次基因體片段或基因體)，其所包含之所選擇的II型限制酶(例如，所選擇的IIS型限制酶)或一或多個所選擇的II型限制酶(例如，一或多個所選擇的IIS型限制酶)之識別位點比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少1-90個、2-90個、4-90個、6-90個、8-90個、10-90個、15-90個、20-90個、25-90個、30-90個、35-90個、40-90個、45-90個、50-90個、55-90個、60-90個、65-90個、70-90個、75-90個、80-90個、85-90個、1-80個、2-80個、4-80個、6-80個、8-80個、10-80個、15-80個、20-80個、25-80個、30-80個、35-80個、40-80個、45-80個、50-80個、55-80個、60-80個、65-80個、70-80個、75-80個、1-70個、2-70個、4-70個、6-70個、8-70個、10-70個、15-70個、20-70個、25-70個、30-70個、35-70個、40-70個、45-70個、50-70個、55-70個、60-70個、65-70個、70-80個、75-80個、1-60個、2-60個、4-60個、6-60個、8-60個、10-60個、15-60個、20-60個、25-60個、30-60個、35-60個、40-60個、45-60個、50-60個、55-60個、1-50個、2-50個、4-50個、6-50個、8-50個、10-50個、15-50個、20-50個、25-50個、30-50個、35-50個、40-50個、45-50個、1-40個、2-40個、4-40個、6-40個、8-40個、10-40個、15-40個、20-40個、25-40個、30-40個、35-40個、1-30個、2-30個、4-30個、6-30個、8-30個、10-30個、15-30個、20-30個、25-30個、1-20個、2-20個、4-20個、6-20個、8-20個、10-20個、15-20個、1-10個、2-10個、4-10個、6-10或8-10個。在一些實施例中，變異型桿狀病毒核苷酸序列不含所選擇的II型限制酶(例如，所選擇的IIS型限制酶)之識別位點。在一些實施例中，變異型桿狀病毒核苷酸序列不含兩個或更多個(例如，2-12、2-8、2-4、4-12、4-8、6-12、8-12、2、3、4、5、6、8、7、9、10個或更多個)所選擇的II型限制酶(例如，所選擇的IIS型限制酶)之識別位點。在一些實施例中，限制酶係選自(但不限於)以下之II型限制酶：Eco31I、BsaI Bso31I、BspTNI、Esp3I、BpiI、Alw26I、BsmAI、BstMAI、BmsI、BhaI、BscAI、BscUI、BsmNI、BspST5I、Bst19I、CjeP338II、LweI、Mva1312II、PhaI、SfaNI、LguI、BspQI、PsiSI、SapI、Alw44I、ApaLI、VneI、BamHI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlpI、Bsp1720I、CeIII、Bsp119I、AsuII、Bpu14I、BspT104I、BstBI、Csp45I、NspV、SfuI、Bsp120I、PspOMI、Bsu15I、BanIII、Bsa29I、BseCI、BshVI、BspDI、BspXI、BsuTUI、ClaI、Cfr10I、Bse118I、BsrFI、BssAI、Cfr13I、AspS9I、BmgT120I、PspPI、Sau96I、Csp6I、AfaI、CviQI、RsaNI、Eam1104I、Bst6I、EarI、EcoO109I、DraII、EcoRI、Eco47I、AvaII、Bme18I、SinI、VpaK11BI、Eco52I、BseX3I、BstZI、EagI、EclXI、Eco81I、AxyI、Bse21I、Bsu36I、Eco88I、Ama87I、AvaI、BmeT110I、BsiHKCI、BsoBlm、Eco91I、BstEII、BstPI、EcoO65I、PspEI、Eco130I、BssT1I、EcoT14I、ErhI、StyI、Hin1I、AcyI、BsaHI、BssNI、BstACI、Hsp92I、AspLEI、BstHHI、CfoI、HinP1I、HspAI、HindIII、HpaII、BsiSI、HapII、Kpn2I、AccIII、Aor13HI、BseAI、Bsp13I、BspEI、MroI、MspI、BsiSI、HapII、MvaI、AjnI、BseBI、Bst2UI、BstNI、BstOI、Psp6I、PspGI、MluI、NcoI、Bsp19I、NdeI、FauNDI、NotI、CciNI、SalI、TaqI、XbaI、XhoI、BclI、CpoI、CspI、Rsr2I、RsrII、MunI、MfeI、Psp5II、PpuMI、PspPPI、Bsp143I、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Aim、HinfI、MboI、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Alm、BspTI、AfIII、BfrI、Bst98I、BstAFI、MspCI、Vha464I、Pfl23II、BsiWI、PspLI、Acc65I、Asp718I、VspI、AseI、PshBI、Bsp1407I、BsrGI、BstAUI、Psp1406I、AclI、NheI、AsuNHI、BmtI、Tru1I、MseI、Tru9I、BshNI、AccB1I、BanI、BspT107I、BseDI、BsaJI、BssECI、BfmI、BstSFI、SfcI、Bpu10I、BcuI、AhII、SpeI、PagI、CciI、BspHI、RcaI、TatI、XagI、BstENI、EcoNI、PsyI、AspI、PflFI、Tth111I、TasI、Sse9I、Tsp509I、TspEI、XapI、AcsI、ApoI、Bme1390I、BmrFI、BssKI、BstSCI、MspR9I、ScrFI、StyD4I、BseXI、BbvI、BstV1I、BshTI、AgeI、AsiGI、CspAI、PinAI、XmiI、AccI、FbII、NmuCI、Tsp45I、PsuI、BstX2I、BstYI、MfII、XhoII、XmaJI、AspA2I、AvrII、BinI、SatI、Fnu4HI、Fsp4HI、ItaI、BveI、Acc36I、BfuAI、BspMI、PfoI、FspBI、BfaI、MaeI、XspI、PfeI、TfiI、SsiI、AciI、BspACI、FaqI、BsiFI、BsmFI、HpyF3I、BstDEI、DdeI、SgsI、AscI、PalAI、CseI、HgaI、Lsp1109I、BbvI、BstV1I、CsiI、MabI、SexAI、PteI、BsePlm、BssHII、FokI、BstF5I、BtsCI、KflI、Sse1825I、SanDI、SaqAI、MseI、Tru1I或Tru9I，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，IIS型限制酶係一或多個選自(但不限於)以下之IIS型限制酶：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，IIS型限制酶係BsaI、BsmBI或其組合。在一些實施例中，限制酶(例如，IIS型限制酶)亦可選自(但不限於)以下中之一或多者：AasI、Acc36I、AccB7I、AceIII、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlfI、AloI、Alw26I、AlwNI、AlwXI、AmaCSI、ApaBI、ApyPI、AquII、AquIII、AquIV、ArsI、Asp10HII、BasI、Bbr7I、BbvI、BbvII、Bbv16II、Bce4I、Bce83I、BceCI、BcgI、Bco5I、Bco116I、BcoKI、BflI、BfuAI、BglI、Bli736I、Bme585I、BpiI、BplI、BpmI、BpuAI、BpuJI、BpuSI、BsAJI、Bsc4I、Bsc91I、Bsc107I、BscAI、Bse3DI、BseGI、BseKI、BseLI、BseMI、BseMII、BseXI、BseZI、BsgI、BsiYI、BslI、BslFI、Bso31I、BsoMAI、Bsp24I、Bsp423I、BspBS31I、BspCNI、BspD6I、BsplS4I、BspKT5I、BspLU11III、BspMI、BspST5I、BspTNI、BspTS514I、BspWI、Bst6I、Bst12I、Bst19I、Bst71I、BstAPI、BstBS32I、BstFZ438I、BstGZ53I、BstHZ55I、BstlZ316I、BstMAI、BstMWI、BstOZ616I、BstPZ418I、BstTS5I、BstV1I、BstV2I、BstXI、CaiI、CjeI、CjePI、CspCI、CstMI、DraIII、DrdI、DseDI、Eam1104I、Eco31I、Eco5TI、EcoA4I、Eco57MI、EcoO44I、EcoP15I、Esp3I、Esp1396I、GsuI、HaeIV、Hin4I、Hpy178III、Hpy188III、HpyF10VI、LweI、MmeI、MwoI、PfiBI、PfiMI、PhaI、PpiI、PsrI、RleAI、SdiI、SfiI、SmuI、Sth132I、StsI、TaqII、TspDTI、Tsp8EI、TspGWI、Tth111II、Van91I或VpaK11AI，或任何前述限制酶之同裂酶。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含變異型核苷酸序列(例如，次片段、次基因體區域、次基因體片段或基因體)，其所包含之：(a) 第一所選擇的II型限制酶(例如，IIS型限制酶)，例如本文中所描述之II型限制酶，例如選自以下之IIS型限制酶之識別位點(例如，功能性識別位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少1個，例如至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14 ,15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個或90個，或識別位點少1-90個、1-70個、1-50個、1-30個、1-10個、10-90個、10-70個、10-50個、10-30個、20-90個、20-70個、20-50個、20-30個、30-90個、30-70個、30-50個、40-90個、40-70個、40-50個、50-90個、50-70個、60-90個、60-70個或70-90個：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶，及(b) 第二所選擇的II型限制酶(例如，所選擇的IIS型限制酶)，例如選自例如以下之IIS型限制酶之識別位點(例如，功能性識別位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少1個，例如至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14 ,15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個或90 個，或識別位點少1-90個、1-70個、1-50個、1-30個、1-10個、10-90個、10-70個、10-50個、10-30個、20-90個、20-70個、20-50個、20-30個、30-90個、30-70個、30-50個、40-90個、40-70個、40-50個、50-90個、50-70個、60-90個、60-70個或70-90個：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶，其中第一及第二所選擇的II型限制酶(例如，第一及第二所選擇的IIS型限制酶)係不同的限制酶。在一些實施例中，第一所選擇的IIS型限制酶係BsaI，且第二所選擇的IIS型限制酶係BsmBI。在一些實施例中，變異型核苷酸序列亦相對於參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列包含更少的第三、第四、第五或更大編號之所選擇的IIS型限制酶之識別位點。在一些實施例中，變異型核苷酸序列亦包含更少的一或多個(例如，1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)所選擇的II型限制酶之識別位點(例如，天然存在之功能性識別位點)。在一些實施例中，變異型核苷酸序列不含所選擇的第一及第二或更大編號(例如，第三、第四、第五或更多所選擇的IIS型限制酶)之II型限制酶(例如，IIS型限制酶)，例如本文中所描述之II型限制酶之識別位點。其他非限制性酶(例如，IIS型限制酶)包括例如AasI、Acc36I、AccB7I、AceIII、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlfI、AloI、Alw26I、AlwNI、AlwXI、AmaCSI、ApaBI、ApyPI、AquII、AquIII、AquIV、ArsI、Asp10HII、BasI、Bbr7I、BbvI、BbvII、Bbv16II、Bce4I、Bce83I、BceCI、BcgI、Bco5I、Bco116I、BcoKI、BflI、BfuAI、BglI、Bli736I、Bme585I、BpiI、BplI、BpmI、BpuAI、BpuJI、BpuSI、BsAJI、Bsc4I、Bsc91I、Bsc107I、BscAI、Bse3DI、BseGI、BseKI、BseLI、BseMI、BseMII、BseXI、BseZI、BsgI、BsiYI、BslI、BslFI、Bso31I、BsoMAI、Bsp24I、Bsp423I、BspBS31I、BspCNI、BspD6I、BsplS4I、BspKT5I、BspLU11III、BspMI、BspST5I、BspTNI、BspTS514I、BspWI、Bst6I、Bst12I、Bst19I、Bst71I、BstAPI、BstBS32I、BstFZ438I、BstGZ53I、BstHZ55I、BstlZ316I、BstMAI、BstMWI、BstOZ616I、BstPZ418I、BstTS5I、BstV1I、BstV2I、BstXI、CaiI、CjeI、CjePI、CspCI、CstMI、DraIII、DrdI、DseDI、Eam1104I、Eco31I、Eco5TI、EcoA4I、Eco57MI、EcoO44I、EcoP15I、Esp3I、Esp1396I、GsuI、HaeIV、Hin4I、Hpy178III、Hpy188III、HpyF10VI、LweI、MmeI、MwoI、PfiBI、PfiMI、PhaI、PpiI、PsrI、RleAI、SdiI、SfiI、SmuI、Sth132I、StsI、TaqII、TspDTI、Tsp8EI、TspGWI、Tth111II、Van91I或VpaK11AI，或任何前述限制酶之同裂酶。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含變異型核苷酸序列(例如，次片段、次基因體區域、次基因體片段或基因體)，其所包含之BsaI之識別位點比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少1個，例如至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14 ,15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個或90個，或識別位點少1-90個、1-70個、1-50個、1-30個、1-10個、10-90個、10-70個、10-50個、10-30個、20-90個、20-70個、20-50個、20-30個、30-90個、30-70個、30-50個、40-90個、40-70個、40-50個、50-90個、50-70個、60-90個、60-70個或70-90個。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含變異型核苷酸序列(例如，次片段、次基因體區域、次基因體片段或基因體)，其所包含之BsmBI之識別位點比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少1個，例如至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14 ,15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個或90個，或識別位點少1-90個、1-70個、1-50個、1-30個、1-10個、10-90個、10-70個、10-50個、10-30個、20-90個、20-70個、20-50個、20-30個、30-90個、30-70個、30-50個、40-90個、40-70個、40-50個、50-90個、50-70個、60-90個、60-70個或70-90個。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含變異型核苷酸序列(例如，次片段、次基因體區域、次基因體片段或基因體)，其所包含之BsmBI及BsaI中之各者或BsmBI與BsaI之組合之識別位點比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少1個，例如至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14 ,15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個或90個，或識別位點少1-90個、1-70個、1-50個、1-30個、1-10個、10-90個、10-70個、10-50個、10-30個、20-90個、20-70個、20-50個、20-30個、30-90個、30-70個、30-50個、40-90個、40-70個、40-50個、50-90個、50-70個、60-90個、60-70個或70-90個。

在一些實施例中，與參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列相比，變異型桿狀病毒基因體不含BsmBI、BsaI或BsmBI與BsaI之組合之識別位點。

在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體不含一或多個IIS型限制酶(例如，BsmBI及/或BsaI)之識別位點，且包含一或多個(例如，1-4個、1-3個、1-2個、1個、2個、3個、4個或5個)本文中所描述之所選擇的II型限制酶(例如，AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI或任何前述限制酶之同裂酶)之至多1-20個例如，1-10個、1-8個、1-6個、1-4個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個或20個識別位點(例如，經工程改造之及/或天然存在之位點)。在一些實施例中，將一或多個選擇II型限制酶之一或多個識別位點引入變異型桿狀病毒基因體內之所關注的基因座中(例如，藉由識別位點之插入或用於產生識別位點之現有序列之取代)，例如引入本文中所描述之非必需基因或非必需基因之調節區中，視情況其中變異型桿狀病毒基因體不含一或多個所選擇的II型限制酶之天然存在之識別位點。

在一些實施例中，變異型核苷酸序列包含至少一個非天然存在之，例如經工程改造之功能性限制酶位點(例如，II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點))。在一些實施例中，變異型桿狀病毒核苷酸序列包含一或多個(例如，至少約1-4個、1-3個、1-2個、1個、2個、3個、4個或5個)所選擇的II型限制酶(例如，所選擇的IIS型限制酶)之1-20個，例如1-10個、1-8個、1-6個、1-4個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個或20個非天然存在之，例如經工程改造之限制酶位點。在一些實施例中，變異型桿狀病毒核苷酸序列不含一或多個(例如，約1-4個、1-3個、1-2個、1個、2個、3個、4個或5個)所選擇的II型限制酶(例如，所選擇的IIS型限制酶)之天然存在之位點，且包含一或多個所選擇的II型限制酶(例如，所選擇的IIS型限制酶)之至少約1-20個，例如至少約1-10個、1-8個、1-6個、1-4個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個或20個非天然存在之，例如經工程改造之限制酶位點。在一些實施例中，與野生型桿狀病毒基因體相比，非天然存在之限制酶位點位於不同位置。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含核苷酸序列(例如，次片段、次基因體區域、次基因體片段或基因體)，其與參考桿狀病毒基因體之對應核苷酸序列至少30%一致，例如至少40%一致、至少50%一致、至少60%一致、至少70%一致、至少80%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致，或30-99%、30-95%、30-90%、30-85%、30-80%、30-75%、30-70%、30-65%、30-60%、30-55%、30-50%、30-45%、30-40%、30-35%、40-99%、40-95%、40-90%、40-85%、40-80%、40-75%、40-70%、40-65%、40-60%、40-55%、40-50%、40-45%、50-99%、50-95%、50-90%、50-85%、50-80%、50-75%、50-70%、50-65%、50-60%、50-55%、60-99%、60-95%、60-90%、60-85%、60-80%、60-75%、60-70%、60-65%、70-99%、70-95%、70-90%、70-85%、70-80%、70-75%、80-99%、80-95%、80-90%、80-85%、90-99%、90-95%或95-99%一致。

本文中亦提供變異型桿狀病毒基因體。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體之尺寸(例如，在鹼基對中量測)比參考病毒基因體大至少1%，例如大至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少150%、至少200%、至少250%、至少300%、至少350%、至少400%、至少450%或至少500%。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體之尺寸比參考病毒基因體大1-500%，例如大1-450%、1-400%、1-350%、1-300%、1-250%、1-200%、1-150%、1-100%、1-50%、1-25%、1-10%、1-5%、5-500%、5-450%、5-400%、5-350%、5-300%、5-250%、5-200%、5-150%、5-100%、5-50%、5-25%、5-10%、10-500%、10-450%、10-400%、10-350%、10-300%、10-250%、10-200%、10-150%、10-100%、10-50%、10-25%、10-20%、20-500%、20-450%、20-400%、20-350%、20-300%、20-250%、20-200%、20-150%、20-100%、20-50%、20-25%、30-500%、30-450%、30-400%、30-350%、30-300%、30-250%、30-200%、30-150%、30-100%、30-50%、40-500%、40-450%、40-400%、40-350%、40-300%、40-250%、40-200%、40-150%、40-100%、40-50%、50-500%、50-450%、50-400%、50-350%、50-300%、50-250%、50-200%、50-150%、50-100%、100-500%、100-450%、100-400%、100-350%、100-300%、100-250%、100-200%、100-150%、200-500%、200-450%、200-400%、200-350%、200-300%、200-250%、300-500%、300-450%、300-400%或300-350%。

在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體之尺寸(例如，在鹼基對中量測)比參考病毒基因體小至少1%，例如小至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體之尺寸比參考病毒基因體小1-90%、1-80%、1-70%、1-60%、1-50%、1-40%、1-30%、1-20%、1-10%、10-90%、10-80%、10-70%、10-60%、10-50%、10-40%、10-30%、10-20%、20-90%、20-80%、20-70%、20-60%、20-50%、20-40%、20-30%、30-90%、30-80%、30-70%、30-60%、30-50%、30-40%、40-90%、40-80%、40-70%、40-60%、40-50%、50-90%、50-80%、50-70%、50-60%、60-90%、60-80%、60-70%、70-90%、70-80%或80-90%。

在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體之尺寸與參考病毒基因體(例如，桿狀病毒基因體)相同或大致相同(例如，±5-10%)。

在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體之尺寸係至少10千鹼基(kb)，例如至少15 kb、至少20 kb、至少25 kb、至少30 kb、至少35 kb、至少40 kb、至少50 kb、至少55 kb、至少60 kb、至少65 kb、至少70 kb、至少75 kb、至少80 kb、至少85 kb、至少90 kb、至少95 kb、至少100 kb、至少120 kb、至少140 kb、至少160 kb、至少180 kb、至少200 kb、至少250 kb、至少300 kb、至少350 kb或至少400 kb。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體之尺寸係1-500 kb，例如1-450 kb、1-400 kb、1-350 kb、1-300 kb、1-250 kb、1-200 kb、1-150 kb、1-100 kb、1-50 kb、50-500 kb、50-450 kb、50-400 kb、50-350 kb、50-300 kb、50-250 kb、50-200 kb、50-150 kb、50-100 kb、100-500 kb、100-450 kb、100-400 kb、100-350 kb、100-300 kb、100-250 kb、100-200 kb、100-150 kb、150-500 kb、150-450 kb、150-400 kb、150-350 kb、150-300 kb、150-250 kb、150-200 kb、200-500 kb、200-450 kb、200-400 kb、200-350 kb、200-300 kb、200-250 kb、250-500 kb、250-450 kb、250-400 kb、250-350 kb、250-300 kb、300-500 kb、300-450 kb、300-400 kb、300-350 kb、350-500 kb、350-450 kb、350-400 kb、400-500 kb、400-450 kb或450-500 kb。

在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體相對於參考病毒基因體序列具有1-1000個(例如，1-950、1-900、1-850、1-800、1-750、1-700、1-650、1-600、1-550、1-500、1-450、1-300、1-250、1-200、1-150、1-100、1-50、1-25、1-10、或1-5個)核苷酸差異(例如，核苷酸序列之取代、缺失及/或插入)。在一些實施例中，當位於桿狀病毒基因之編碼區內時，變異型桿狀病毒基因體與參考病毒基因體序列之間的核苷酸差異係緘默差異(例如，緘默突變)。因此，在一些實施例中，一或多個或所有基因座處的變異型桿狀病毒基因體與參考基因體序列之間的核苷酸序列之差異引起變異型桿狀病毒基因體及參考病毒基因體中的經編碼之基因之間的相同胺基酸序列。在一些實施例中，一或多個基因座處之變異型桿狀病毒基因體與參考基因體序列之間的核苷酸序列之差異引起保守性胺基酸差異(例如，保守性取代)，預期其對經編碼之蛋白質之表現及/或功能的影響小於非保守性胺基酸差異。

在一些實施例中，基於具有與參考桿狀病毒基因體相同之屬的桿狀病毒基因體之對應核苷酸序列來選擇用於移除變異型桿狀病毒基因體中之限制酶(例如，IIS型限制酶)之一或多個識別位點的修飾。作為實例，在一些實施例中，若AcMNPV係用於產生變異型桿狀病毒基因體之參考桿狀病毒基因體，則可參考另一α-桿狀病毒(例如，BmNPV、ThorNPV)之核苷酸序列以確定當在變異型桿狀病毒基因體中之一或多個所關注的位置處引入時，哪一或多種取代可具有最小影響。不受理論約束，預期若所關注的位置處之核苷酸序列在參考桿狀病毒與相同屬之不同桿狀病毒(例如，相同屬中之不同桿狀病毒物種)之基因體之間不具有保守性，則預期反映不同桿狀病毒之基因體中的核苷酸序列之取代將對變異型桿狀病毒基因體具有最小功能性影響。

在一些實施例中，所關注的桿狀病毒基因之變異序列可置換參考病毒基因體中之所關注的基因之相應野生型序列。在一些實施例中，可藉由在基因體之相關部分之化學合成期間(例如，在次基因體片段或次片段之化學合成期間)將所需一或多種變化(例如，取代、插入及/或缺失)直接引入核苷酸序列中來產生所關注的桿狀病毒基因之變異型序列。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體與參考桿狀病毒基因體的不同之處可在於一或多個桿狀病毒基因編碼序列或一或多個調節序列(例如，強化子、啟動子、內含子、5'UTR或3'UTR)。

在一些實施例中，變異型核酸序列(例如，次片段、次基因體區域、次基因體片段或基因體)與參考病毒基因體的不同之處在於引入(例如一或多種酶之)一或多個識別位點。在一些實施例中，變異型核酸序列(例如，次片段、次基因體區域、次基因體片段或基因體)與參考病毒基因體的不同之處可在於引入一或多個限制酶位點。在一些實施例中，引入一或多個限制酶位點以促進所關注的核苷酸序列之引入或缺失(例如，異源核苷酸序列，諸如轉殖基因之引入；非必需桿狀病毒基因，諸如輔助或經口感染因子桿狀病毒基因之缺失；或參考病毒基因體中之一或多個非必需區域(例如，調節區)之缺失)。

在一些實施例中，變異型核酸序列(例如，次片段、次基因體區域、次基因體片段或基因體)與參考病毒基因體的不同之處在於引入一或多個外源或異源核苷酸序列。舉例而言，在一些實施例中，變異型核酸序列可包含編碼一或多個AAV基因及/或有效負載以促進如本文中所描述之AAV粒子之產生之核苷酸。在一些實施例中，變異型核酸序列可包含編碼所關注的多肽或核酸(例如，治療性多肽或治療性核酸)之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼所關注的多肽或核酸之核苷酸序列可操作地連接至調節序列，諸如一或多個強化子及/或一或多個啟動子。

在一些實施例中，變異型核酸序列(例如，次片段、次基因體區域、次基因體片段或基因體)與參考病毒基因體的不同之處在於一或多個核苷酸之缺失或核苷酸之延伸部分。

在一些實施例中，變異型核酸序列(例如，次片段、次基因體區域、次基因體片段或基因體)包含非必需桿狀病毒基因座，例如非必需桿狀病毒基因(例如，輔助或經口感染因子基因)及/或非必需桿狀病毒基因之調節區中之修飾，諸如插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變)。舉例而言，在一些實施例中，合成病毒基因體與參考病毒基因體的不同之處在於一或多個非必需基因或區域之修飾，例如插入、缺失或取代，例如在國際專利公開案第WO2014/122629號中所揭示之一或多個非必需基因或區域中，其內容以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，非必需區域或基因之修飾不會顯著影響桿狀病毒之產生或桿狀病毒複製或感染細胞之能力。在一些實施例中，修飾，例如插入、缺失或取代引起非必需桿狀病毒基因(例如，輔助或經口感染因子基因)及/或非必需桿狀病毒基因之調節區之不活化。在一些實施例中，一或多個次基因體片段或次片段之變異型桿狀病毒核苷酸序列包含非必需基因及/或非必需基因(例如，輔助或經口感染因子基因)之調節區之破壞，例如突變(例如，框移突變)、缺失、插入或不活化。在一些實施例中，該修飾係引起基因產物之減少或消除之變化，例如缺失、插入、突變(例如，框移突變)、啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入。在一些實施例中，藉由化學合成或PCR，例如基於PCR之定點突變誘發來引入修飾。在一些實施例中，非必需桿狀病毒基因係選自以下中之1-64、1-60、1-55、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、2-64、2-60、2-55、2-50、2-45、2-40、2-35、2-30、2-25、2-20、2-15、2-10、2-5、2-4、2-3、3-64、3-60、3-55、3-50、3-45、3-40、3-35、3-30、3-25、3-20、3-15、3-10、3-5、3-4、4-64、4-60、4-55、4-50、4-45、4-40、4-35、4-30、4-25、4-20、4-15、4-10、4-5、5-64、5-60、5-55、5-50、5-45、5-40、5-35、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-64、10-60、10-55、10-50、10-45、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20、10-15、15-64、15-60、15-55、15-50、15-45、15-40、15-35、15-30、15-25、15-20、20-64、20-60、20-55、20-50、20-45、20-40、20-35、20-30、20-25、25-64、25-60、25-55、25-50、25-45、25-40、25-35、25-30、30-64、30-60、30-55、30-50、30-45、30-40、30-35、35-64、35-60、35-55、35-50、35-45、35-40、40-64、40-60、40-55、40-50、40-45、45-64、45-60、45-55、45-50、50-64、50-60、50-55、55-64、55-60、60-64、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、62者或全部：Ptp、Bro、Ctx、orf603、多角體蛋白、Get、bv/odv-e26、ac18、pif-2、env-prot、iap-1、Sod、Fgf、v-ubi、p43、odv-e66、gp37、odv-nc42、ac69、iap-2、pnk/pnl、ac91、odv-e28、pif-4、pif-3、pif-1、pk-2、chiA、v-cath、pp34、94K、p26、p10、p74、ac145、odv-e56、ac150、ac11、ac30、Gta、ac63、15k、ac97、ac121、ac140、ac146、ac149、hispP、ac44、ac47、ac84、ac112/113 Nt、ac112/113Ct、ac118、ac122、ie-01、ac152、Pcna、ac56、hcf-1、ac85、cg30、ac116及ac117。在一些實施例中，非必需桿狀病毒基因係選自以下中之1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21者：egt、p74 (PIF0)、p26、SOD、ChiA、v-cath、p10、多角體蛋白、ctx、odv-e56、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94。在一些實施例中，非必需基因係v-cath。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含經修飾之桿狀病毒基因體，例如具有至少一個非必需基因之缺失，例如具有多角體蛋白(pohH)基因座之缺失之經修飾之桿狀病毒基因體。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體或變異型桿狀病毒基因體包含以下變異型桿狀病毒基因體之基因座中之修飾，例如插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變)：(i) v-cath及egt，(ii) v-cath、egt及SOD1，(iii) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74及SOD，(iv) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74及SOD，或(v) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74、SOD、AcORF-91及AcORF-108。在一些實施例中，修飾包含chiA基因、v-cath基因、p26基因、p10基因及/或p74基因或其一部分之缺失。在一些實施例中，修飾包含非必需基因或相鄰區域中之異源序列之插入。在一些實施例中，修飾包含非必需基因或相鄰區域中之一或多個突變。在一些實施例中，非必需基因位於同源重複序列區5 (hr5)附近(例如，下游或上游)。

在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體中之所關注的桿狀病毒基因之位置可相對於參考病毒基因體而變化。在一些實施例中，改變變異型桿狀病毒基因體中之所關注的桿狀病毒基因之位置，使得所關注的桿狀病毒基因置換非必需桿狀病毒基因(例如，輔助或經口感染因子基因)或非必需區域(例如，非必需基因之調節區)之基因座。所關注的桿狀病毒基因之位置之調換可例如藉由改變包含編碼所關注的桿狀病毒基因之核苷酸序列的次基因體片段或次片段之組裝順序來實現，該順序之改變係藉由設計該等次基因體片段或次片段之獨有的5'及3'突出物，使得其與最接近(例如，相鄰)所關注的桿狀病毒基因之所需目標的次基因體片段或次片段之獨有的5'及3'突出物互補(部分或完全互補)來實現。

在一些實施例中，至少一部分變異型桿狀病毒核苷酸序列(例如，次片段、次基因體區域、次基因體片段或基因體)係化學合成的，例如使用此項技術中公認的方法。在一些實施例中，至少10%，例如至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、20-100%、30-100%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、90-100%、95-100%、20-80%、40-80%、60-80%、40-80%、60-80%、20-60%、40-60%、20-40%或25-50%之變異型桿狀病毒核苷酸序列(例如，次片段、次基因體區域、次基因體片段或基因體)係化學合成的。在一些實施例中，整個變異型桿狀病毒基因體序列(亦即，100%)係化學合成的，例如由完全化學合成之次基因體片段或次片段組裝。在一些實施例中，次片段、次基因體片段或基因體係非模板化的。

在一些實施例中，本文中所描述之包含變異型桿狀病毒核苷酸序列(例如，次片段、次基因體區域、次基因體片段或基因體)之桿狀病毒表現構築體係複製勝任型。在一些實施例中，包含變異型桿狀病毒核苷酸序列之桿狀病毒表現構築體能夠產生功能性桿狀病毒。在一些實施例中，本文中所描述之包含變異型桿狀病毒核苷酸序列之桿狀病毒表現構築體能夠產生至少50% (例如，至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少150%、至少200%、50-200%、50-150%、50-100%、75-200%、75-150%、75-100%、100-200%、100-150%或150-200%)之由參考病毒基因體產生之桿狀病毒。在一些實施例中，本文中所描述之包含變異型桿狀病毒核苷酸序列之桿狀病毒能夠產生80-120% (例如，85-115%、90-110%、95-105%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、101%、102%、103%、104%、105%)之由參考病毒基因體產生之桿狀病毒。在一些實施例中，藉由量測病毒效價(例如，TCID50)來測定所產生之桿狀病毒之量，例如使用qPCR測定。複數個片段

本文中亦提供複數個片段，例如本文中所描述之複數個次基因體片段或本文中所描述之複數個次片段。

在一些實施例中，該複數個片段中之各者包含獨有的5'突出物及獨有的3'突出物以及變異型桿狀病毒核苷酸序列。在一些實施例中，該複數個片段中之一或多者包含變異型桿狀病毒核苷酸序列。

在一些實施例中，該複數個片段中之各者(例如，本文中所描述之次片段或次基因體片段)所包含之限制酶位點，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比本文中所描述之參考桿狀病毒基因體(例如，野生型桿狀病毒基因體)中之核苷酸序列少至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少56個、至少57個、至少58個、至少59個或至少60個。在一些實施例中，該複數個片段中之各片段包含之變異型核苷酸序列，其所包含之限制酶位點，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少1-60個、2-60個、4-60個、6-60個、8-60個、10-60個、15-60個、20-60個、25-60個、30-60個、35-60個、40-60個、45-60個、50-60個、55-60個、1-50個、2-50個、4-50個、6-50個、8-50個、10-50個、15-50個、20-50個、25-50個、30-50個、35-50個、40-50個、45-50個、1-40個、2-40個、4-40個、6-40個、8-40個、10-40個、15-40個、20-40個、25-40個、30-40個、35-40個、1-30個、2-30個、4-30個、6-30個、8-30個、10-30個、15-30個、20-30個、25-30個、1-20個、2-20個、4-20個、6-20個、8-20個、10-20個、15-20個、1-10個、2-10個、4-10個、6-10個或8-10個。在一些實施例中，限制酶位點係選自(但不限於)以下之II型限制酶之識別位點：Eco31I、BsaI Bso31I、BspTNI、Esp3I、BpiI、Alw26I、BsmAI、BstMAI、BmsI、BhaI、BscAI、BscUI、BsmNI、BspST5I、Bst19I、CjeP338II、LweI、Mva1312II、PhaI、SfaNI、LguI、BspQI、PsiSI、SapI、Alw44I、ApaLI、VneI、BamHI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlpI、Bsp1720I、CeIII、Bsp119I、AsuII、Bpu14I、BspT104I、BstBI、Csp45I、NspV、SfuI、Bsp120I、PspOMI、Bsu15I、BanIII、Bsa29I、BseCI、BshVI、BspDI、BspXI、BsuTUI、ClaI、Cfr10I、Bse118I、BsrFI、BssAI、Cfr13I、AspS9I、BmgT120I、PspPI、Sau96I、Csp6I、AfaI、CviQI、RsaNI、Eam1104I、Bst6I、EarI、EcoO109I、DraII、EcoRI、Eco47I、AvaII、Bme18I、SinI、VpaK11BI、Eco52I、BseX3I、BstZI、EagI、EclXI、Eco81I、AxyI、Bse21I、Bsu36I、Eco88I、Ama87I、AvaI、BmeT110I、BsiHKCI、BsoBlm、Eco91I、BstEII、BstPI、EcoO65I、PspEI、Eco130I、BssT1I、EcoT14I、ErhI、StyI、Hin1I、AcyI、BsaHI、BssNI、BstACI、Hsp92I、AspLEI、BstHHI、CfoI、HinP1I、HspAI、HindIII、HpaII、BsiSI、HapII、Kpn2I、AccIII、Aor13HI、BseAI、Bsp13I、BspEI、MroI、MspI、BsiSI、HapII、MvaI、AjnI、BseBI、Bst2UI、BstNI、BstOI、Psp6I、PspGI、MluI、NcoI、Bsp19I、NdeI、FauNDI、NotI、CciNI、SalI、TaqI、XbaI、XhoI、BclI、CpoI、CspI、Rsr2I、RsrII、MunI、MfeI、Psp5II、PpuMI、PspPPI、Bsp143I、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Aim、HinfI、MboI、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Alm、BspTI、AfIII、BfrI、Bst98I、BstAFI、MspCI、Vha464I、Pfl23II、BsiWI、PspLI、Acc65I、Asp718I、VspI、AseI、PshBI、Bsp1407I、BsrGI、BstAUI、Psp1406I、AclI、NheI、AsuNHI、BmtI、Tru1I、MseI、Tru9I、BshNI、AccB1I、BanI、BspT107I、BseDI、BsaJI、BssECI、BfmI、BstSFI、SfcI、Bpu10I、BcuI、AhII、SpeI、PagI、CciI、BspHI、RcaI、TatI、XagI、BstENI、EcoNI、PsyI、AspI、PflFI、Tth111I、TasI、Sse9I、Tsp509I、TspEI、XapI、AcsI、ApoI、Bme1390I、BmrFI、BssKI、BstSCI、MspR9I、ScrFI、StyD4I、BseXI、BbvI、BstV1I、BshTI、AgeI、AsiGI、CspAI、PinAI、XmiI、AccI、FbII、NmuCI、Tsp45I、PsuI、BstX2I、BstYI、MfII、XhoII、XmaJI、AspA2I、AvrII、BinI、SatI、Fnu4HI、Fsp4HI、ItaI、BveI、Acc36I、BfuAI、BspMI、PfoI、FspBI、BfaI、MaeI、XspI、PfeI、TfiI、SsiI、AciI、BspACI、FaqI、BsiFI、BsmFI、HpyF3I、BstDEI、DdeI、SgsI、AscI、PalAI、CseI、HgaI、Lsp1109I、BbvI、BstV1I、CsiI、MabI、SexAI、PteI、BsePlm、BssHII、FokI、BstF5I、BtsCI、KflI、Sse1825I、SanDI、SaqAI、MseI、Tru1I或Tru9I，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶位點係IIS型限制酶之識別位點。在一些實施例中，IIS型限制酶係選自(但不限於) AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、Sap或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，該複數個片段中之各者不含IIS型限制酶之識別位點。在一些實施例中，該複數個片段中之各片段不含所選擇的IIS型限制酶之識別位點。在一些實施例中，該複數個片段中之各者不含兩個或更多個所選擇的IIS型限制酶之識別位點。其他非限制性酶(例如，IIS型限制酶)包括例如AasI、Acc36I、AccB7I、AceIII、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlfI、AloI、Alw26I、AlwNI、AlwXI、AmaCSI、ApaBI、ApyPI、AquII、AquIII、AquIV、ArsI、Asp10HII、BasI、Bbr7I、BbvI、BbvII、Bbv16II、Bce4I、Bce83I、BceCI、BcgI、Bco5I、Bco116I、BcoKI、BflI、BfuAI、BglI、Bli736I、Bme585I、BpiI、BplI、BpmI、BpuAI、BpuJI、BpuSI、BsAJI、Bsc4I、Bsc91I、Bsc107I、BscAI、Bse3DI、BseGI、BseKI、BseLI、BseMI、BseMII、BseXI、BseZI、BsgI、BsiYI、BslI、BslFI、Bso31I、BsoMAI、Bsp24I、Bsp423I、BspBS31I、BspCNI、BspD6I、BsplS4I、BspKT5I、BspLU11III、BspMI、BspST5I、BspTNI、BspTS514I、BspWI、Bst6I、Bst12I、Bst19I、Bst71I、BstAPI、BstBS32I、BstFZ438I、BstGZ53I、BstHZ55I、BstlZ316I、BstMAI、BstMWI、BstOZ616I、BstPZ418I、BstTS5I、BstV1I、BstV2I、BstXI、CaiI、CjeI、CjePI、CspCI、CstMI、DraIII、DrdI、DseDI、Eam1104I、Eco31I、Eco5TI、EcoA4I、Eco57MI、EcoO44I、EcoP15I、Esp3I、Esp1396I、GsuI、HaeIV、Hin4I、Hpy178III、Hpy188III、HpyF10VI、LweI、MmeI、MwoI、PfiBI、PfiMI、PhaI、PpiI、PsrI、RleAI、SdiI、SfiI、SmuI、Sth132I、StsI、TaqII、TspDTI、Tsp8EI、TspGWI、Tth111II、Van91I或VpaK11AI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物。在一些實施例中，由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物。在一些實施例中，限制酶可熱不活化。在一些實施例中，限制酶識別具有4-8個鹼基對，例如4個鹼基對、5個鹼基對、6個鹼基對、7個鹼基對或8個鹼基對之延伸部分。在一些實施例中，限制酶不為EcoRI。

在一些實施例中，基於該複數個片段中之一者中之獨有的5'突出物與該複數個片段中之另一者中之獨有的3'突出物或該複數個片段中之一者中之獨有的3'突出物與該複數個片段中之另一者中之獨有的5'突出物之互補性，該複數個片段中之各者能夠與該複數個片段中之另一者有序地組裝在一起。在一些實施例中，該複數個片段中之一者之獨有的5'突出物與該複數個片段中之另一者之獨有的3'突出物互補。在一些實施例中，該複數個片段中之一者之獨有的3'突出物與該複數個片段中之另一者之獨有的5'突出物互補。在一些實施例中，該複數個片段中之一者之獨有的5'突出物與該複數個片段中之另一者之獨有的3'突出物部分互補在一些實施例中，該複數個片段中之一者之獨有的5'突出物與該複數個片段中之另一者之獨有的3'突出物完全互補。在一些實施例中，該複數個片段中之一者之獨有的3'突出物與該複數個片段中之另一者之獨有的5'突出物部分互補。在一些實施例中，該複數個片段中之一者之獨有的3'突出物與該複數個片段中之另一者之獨有的5'突出物完全互補。

在一些實施例中，該複數個片段中之各者之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係由限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)進行之片段之裂解產生。在一些實施例中，限制酶係選自(但不限於)以下之II型限制酶：Eco31I、BsaI Bso31I、BspTNI、Esp3I、BpiI、Alw26I、BsmAI、BstMAI、BmsI、BhaI、BscAI、BscUI、BsmNI、BspST5I、Bst19I、CjeP338II、LweI、Mva1312II、PhaI、SfaNI、LguI、BspQI、PsiSI、SapI、Alw44I、ApaLI、VneI、BamHI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlpI、Bsp1720I、CeIII、Bsp119I、AsuII、Bpu14I、BspT104I、BstBI、Csp45I、NspV、SfuI、Bsp120I、PspOMI、Bsu15I、BanIII、Bsa29I、BseCI、BshVI、BspDI、BspXI、BsuTUI、ClaI、Cfr10I、Bse118I、BsrFI、BssAI、Cfr13I、AspS9I、BmgT120I、PspPI、Sau96I、Csp6I、AfaI、CviQI、RsaNI、Eam1104I、Bst6I、EarI、EcoO109I、DraII、EcoRI、Eco47I、AvaII、Bme18I、SinI、VpaK11BI、Eco52I、BseX3I、BstZI、EagI、EclXI、Eco81I、AxyI、Bse21I、Bsu36I、Eco88I、Ama87I、AvaI、BmeT110I、BsiHKCI、BsoBlm、Eco91I、BstEII、BstPI、EcoO65I、PspEI、Eco130I、BssT1I、EcoT14I、ErhI、StyI、Hin1I、AcyI、BsaHI、BssNI、BstACI、Hsp92I、AspLEI、BstHHI、CfoI、HinP1I、HspAI、HindIII、HpaII、BsiSI、HapII、Kpn2I、AccIII、Aor13HI、BseAI、Bsp13I、BspEI、MroI、MspI、BsiSI、HapII、MvaI、AjnI、BseBI、Bst2UI、BstNI、BstOI、Psp6I、PspGI、MluI、NcoI、Bsp19I、NdeI、FauNDI、NotI、CciNI、SalI、TaqI、XbaI、XhoI、BclI、CpoI、CspI、Rsr2I、RsrII、MunI、MfeI、Psp5II、PpuMI、PspPPI、Bsp143I、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Aim、HinfI、MboI、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Alm、BspTI、AfIII、BfrI、Bst98I、BstAFI、MspCI、Vha464I、Pfl23II、BsiWI、PspLI、Acc65I、Asp718I、VspI、AseI、PshBI、Bsp1407I、BsrGI、BstAUI、Psp1406I、AclI、NheI、AsuNHI、BmtI、Tru1I、MseI、Tru9I、BshNI、AccB1I、BanI、BspT107I、BseDI、BsaJI、BssECI、BfmI、BstSFI、SfcI、Bpu10I、BcuI、AhII、SpeI、PagI、CciI、BspHI、RcaI、TatI、XagI、BstENI、EcoNI、PsyI、AspI、PflFI、Tth111I、TasI、Sse9I、Tsp509I、TspEI、XapI、AcsI、ApoI、Bme1390I、BmrFI、BssKI、BstSCI、MspR9I、ScrFI、StyD4I、BseXI、BbvI、BstV1I、BshTI、AgeI、AsiGI、CspAI、PinAI、XmiI、AccI、FbII、NmuCI、Tsp45I、PsuI、BstX2I、BstYI、MfII、XhoII、XmaJI、AspA2I、AvrII、BinI、SatI、Fnu4HI、Fsp4HI、ItaI、BveI、Acc36I、BfuAI、BspMI、PfoI、FspBI、BfaI、MaeI、XspI、PfeI、TfiI、SsiI、AciI、BspACI、FaqI、BsiFI、BsmFI、HpyF3I、BstDEI、DdeI、SgsI、AscI、PalAI、CseI、HgaI、Lsp1109I、BbvI、BstV1I、CsiI、MabI、SexAI、PteI、BsePlm、BssHII、FokI、BstF5I、BtsCI、KflI、Sse1825I、SanDI、SaqAI、MseI、Tru1I或Tru9I，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，該複數個片段中之各者之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係由所選擇的IIS型限制酶進行之片段之裂解產生。在一些實施例中，IIS型限制酶係選自(但不限於) AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，IIS型限制酶係BsaI。在一些實施例中，IIS型限制酶係BsmBI。其他適用的非限制性酶(例如，IIS型限制酶)包括例如AasI、Acc36I、AccB7I、AceIII、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlfI、AloI、Alw26I、AlwNI、AlwXI、AmaCSI、ApaBI、ApyPI、AquII、AquIII、AquIV、ArsI、Asp10HII、BasI、Bbr7I、BbvI、BbvII、Bbv16II、Bce4I、Bce83I、BceCI、BcgI、Bco5I、Bco116I、BcoKI、BflI、BfuAI、BglI、Bli736I、Bme585I、BpiI、BplI、BpmI、BpuAI、BpuJI、BpuSI、BsAJI、Bsc4I、Bsc91I、Bsc107I、BscAI、Bse3DI、BseGI、BseKI、BseLI、BseMI、BseMII、BseXI、BseZI、BsgI、BsiYI、BslI、BslFI、Bso31I、BsoMAI、Bsp24I、Bsp423I、BspBS31I、BspCNI、BspD6I、BsplS4I、BspKT5I、BspLU11III、BspMI、BspST5I、BspTNI、BspTS514I、BspWI、Bst6I、Bst12I、Bst19I、Bst71I、BstAPI、BstBS32I、BstFZ438I、BstGZ53I、BstHZ55I、BstlZ316I、BstMAI、BstMWI、BstOZ616I、BstPZ418I、BstTS5I、BstV1I、BstV2I、BstXI、CaiI、CjeI、CjePI、CspCI、CstMI、DraIII、DrdI、DseDI、Eam1104I、Eco31I、Eco5TI、EcoA4I、Eco57MI、EcoO44I、EcoP15I、Esp3I、Esp1396I、GsuI、HaeIV、Hin4I、Hpy178III、Hpy188III、HpyF10VI、LweI、MmeI、MwoI、PfiBI、PfiMI、PhaI、PpiI、PsrI、RleAI、SdiI、SfiI、SmuI、Sth132I、StsI、TaqII、TspDTI、Tsp8EI、TspGWI、Tth111II、Van91I或VpaK11AI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶識別非連續位點，例如AasI、AccB7I、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlwNI、ApaBI、ArsI、Asp10HII、BaeI、BasI、Bce4I、BceCI、BcgI、BfiI、BglI、Bsc4I、Bsc107I、BseLI、BsiYI、BslI、BspWI、BstAPI、BstH255I、BstlZ316I、BstMWI、BstXI、CaiI、BraIII、DrdI、DseDI、HpyF10VI、PflBI、PflMI、SdiI、SfiI、Tsp8EI或Van91I，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物。在一些實施例中，由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物。在一些實施例中，限制酶可熱不活化。在一些實施例中，限制酶識別具有4-8個鹼基對，例如4個鹼基對、5個鹼基對、6個鹼基對、7個鹼基對或8個鹼基對之延伸部分。在一些實施例中，限制酶不為EcoRI。

在一些實施例中，該複數個次基因體片段中之片段係由第一限制酶，例如所選擇的第一IIS型限制酶進行之裂解產生；及/或(b)該複數個次片段中之片段係由第二限制酶，例如所選擇的第二IIS型限制酶進行之裂解產生，其中第一限制酶，例如所選擇的第一IIS型限制酶與第二限制酶，例如所選擇的第二IIS型限制酶不同。在一些實施例中，第一限制酶係BsaI，且第二限制酶係BsmBI。在一些實施例中，第一限制酶係BsmBI，且第二限制酶係BsaI。

在一些實施例中，該複數個片段中之各者(例如，本文中所描述之次基因體片段或次片段)包含獨有的5'突出物及獨有的3'突出物，例如本文中所描述之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物。

在一些實施例中，基於一個片段之5'端處的核苷酸序列(例如，桿狀病毒基因體序列)與另一片段之3'端處的核苷酸序列(例如，桿狀病毒基因體序列)之重疊，該複數個片段中之各者能夠與該複數個片段中之另一者有序地組裝在一起。在一些實施例中，兩個片段之間的核苷酸序列之重疊係4-50個(例如，4-45個、4-40個、4-35個、4-30個、4-25個、4-20個、4-15個、4-10個、10-50個、10-45個、10-40個、10-35個、10-30個、10-25個、10-20個、10-15個、15-50個、15-45個、15-40個、15-35個、15-30個、15-25個、15-20個、20-50個、20-45個、20-40個、20-35個、20-30個、20-25個、25-50個、25-45個、25-40個、25-35個、25-30個、30-50個、30-45個、30-40個、30-35個、35-50個、35-45個、35-40個、40-50個、40-45個)鹼基對，例如相鄰鹼基對。在一些實施例中，在由本文中所揭示之所選擇的II型限制酶裂解之後，5'核酸外切酶產生對應於片段之間的重疊核苷酸序列之單股互補區，從而產生能夠彼此黏接之片段。在一些實施例中，經黏接之片段之間的空位係由DNA聚合酶填充。

在一些實施例中，該複數個片段係本文中所描述之複數個次片段。在一些實施例中，該複數個片段係本文中所描述之複數個次基因體片段。

在一些實施例中，該複數個次基因體片段中之各片段位於分開的第一承載載體中。在一些實施例中，該複數個次片段中之各片段位於分開的第二承載載體中。在一些實施例中，該等分開的第一承載載體中之各者係彼此單獨地維持(例如，儲存)。在一些實施例中，該等分開的第二承載載體中之各者係彼此單獨地維持(例如，儲存)。

在一些實施例中，複數個次片段構成一個次基因體片段之核苷酸序列。在一些實施例中，複數個次片段構成兩個或更多個次基因體片段(例如，2-20、5-20、10-20、12-20、14-18、14、15、16、17或18個次基因體片段)之核苷酸序列。

在一些實施例中，複數個次基因體片段(例如，2-20、5-20、10-20、12-20、14-18、14、15、16、17或18個次基因體片段)構成本文中所描述之桿狀病毒基因體(例如，變異型桿狀病毒基因體)或桿狀病毒表現構築體之核苷酸序列。

在一些實施例中，該複數個片段中之一或多者包含所關注的核苷酸序列。在一些實施例中，該所關注的序列編碼所關注的多肽或所關注的核酸。在一些實施例中，所關注的多肽或核酸係治療性多肽(例如，治療性蛋白質)或治療性核苷酸序列(例如，治療性RNAi)。在一些實施例中，所關注的多肽係可偵測標記基因，諸如綠色螢光蛋白質(GFP)或分泌型胚胎鹼性磷酸酶(SEAP)。在一些實施例中，所關注的序列包含一或多個腺相關病毒(AAV)基因編碼區域及/或有效負載。在一些實施例中，所關注的序列經修飾以移除用於產生複數個片段(例如，次基因體片段或次片段)之限制酶，例如所選擇的II型限制酶(例如，所選擇的IIS型限制酶)之一或多個或所有識別位點。在一些實施例中，所關注的核苷酸序列係化學合成的。在一些實施例中，所關注的核苷酸序列係由基於PCR之方法產生。在一些實施例中，所關注的序列之核苷酸序列係由化學合成與基於PCR之方法之組合產生。在一些實施例中，所關注的核苷酸序列係所關注的非模板化核苷酸序列(例如，非模板化片段)。在一些實施例中，使用可用的限制酶位點將所關注的核苷酸序列插入該複數個片段中之一或多者中。在一些實施例中，使用Gibson Assembly™將所關注的核苷酸序列插入該複數個片段中之一或多者中。

可使用各種習知的選殖或合成方法產生該複數個片段之核苷酸序列。舉例而言，可使用化學合成產生全部或一部分片段(例如，次片段或次基因體片段)。在一些實施例中，使用基於PCR之方法產生全部或一部分片段。在一些實施例中，片段係非模板化片段。在一些實施例中，使用基於限制酶之方法產生全部或一部分片段，例如藉由自源核苷酸序列(例如，包含所關注的序列之載體)「切割出」所關注的序列來獲得一部分或全部片段。在一些實施例中，可使用前述方法(或此項技術中已知的任何其他適合的方法)中之一或多者之組合來產生片段。桿狀病毒基因體及載體

本文中提供桿狀病毒基因體，例如變異型桿狀病毒基因體，及包含其之載體(例如，目標載體，諸如細菌人工染色體(BAC))，其與本文中所描述之參考桿狀病毒基因體，例如本文中所描述之野生型桿狀病毒基因體相比包含較少限制酶位點。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體與參考桿狀病毒基因體相比包含較少的IIS型限制酶之識別位點。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體與參考桿狀病毒基因體，例如野生型桿狀病毒基因體相比包含較少的所選擇的II型限制酶(例如，所選擇的IIS型限制酶)之識別位點。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體與參考桿狀病毒基因體，例如野生型桿狀病毒基因體相比包含較少的兩個或更多個(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)所選擇的II型限制酶，例如所選擇的IIS型限制酶之識別位點。

在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體所包含之限制酶位點(例如，天然存在之功能性限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少56個、至少57個、至少58個、至少59個或至少60個。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體所包含之限制酶位點(天然存在之功能性限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少1-60個、2-60個、4-60個、6-60個、8-60個、10-60個、15-60個、20-60個、25-60個、30-60個、35-60個、40-60個、45-60個、50-60個、55-60個、1-50個、2-50個、4-50個、6-50個、8-50個、10-50個、15-50個、20-50個、25-50個、30-50個、35-50個、40-50個、45-50個、1-40個、2-40個、4-40個、6-40個、8-40個、10-40個、15-40個、20-40個、25-40個、30-40個、35-40個、1-30個、2-30個、4-30個、6-30個、8-30個、10-30個、15-30個、20-30個、25-30個、1-20個、2-20個、4-20個、6-20個、8-20個、10-20個、15-20個、1-10個、2-10個、4-10個、6-10個或8-10個。

在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體不含所選擇的限制酶之識別位點。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體不含兩個或更多個所選擇的限制酶之識別位點。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體不含所選擇的II型限制酶之識別位點(例如，天然存在之識別位點)。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體不含兩個或更多個所選擇的II型限制酶之識別位點(例如，天然存在之識別位點)。在一些實施例中，限制酶係選自(但不限於)以下之II型限制酶：Eco31I、BsaI Bso31I、BspTNI、Esp3I、BpiI、Alw26I、BsmAI、BstMAI、BmsI、BhaI、BscAI、BscUI、BsmNI、BspST5I、Bst19I、CjeP338II、LweI、Mva1312II、PhaI、SfaNI、LguI、BspQI、PsiSI、SapI、Alw44I、ApaLI、VneI、BamHI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlpI、Bsp1720I、CeIII、Bsp119I、AsuII、Bpu14I、BspT104I、BstBI、Csp45I、NspV、SfuI、Bsp120I、PspOMI、Bsu15I、BanIII、Bsa29I、BseCI、BshVI、BspDI、BspXI、BsuTUI、ClaI、Cfr10I、Bse118I、BsrFI、BssAI、Cfr13I、AspS9I、BmgT120I、PspPI、Sau96I、Csp6I、AfaI、CviQI、RsaNI、Eam1104I、Bst6I、EarI、EcoO109I、DraII、EcoRI、Eco47I、AvaII、Bme18I、SinI、VpaK11BI、Eco52I、BseX3I、BstZI、EagI、EclXI、Eco81I、AxyI、Bse21I、Bsu36I、Eco88I、Ama87I、AvaI、BmeT110I、BsiHKCI、BsoBlm、Eco91I、BstEII、BstPI、EcoO65I、PspEI、Eco130I、BssT1I、EcoT14I、ErhI、StyI、Hin1I、AcyI、BsaHI、BssNI、BstACI、Hsp92I、AspLEI、BstHHI、CfoI、HinP1I、HspAI、HindIII、HpaII、BsiSI、HapII、Kpn2I、AccIII、Aor13HI、BseAI、Bsp13I、BspEI、MroI、MspI、BsiSI、HapII、MvaI、AjnI、BseBI、Bst2UI、BstNI、BstOI、Psp6I、PspGI、MluI、NcoI、Bsp19I、NdeI、FauNDI、NotI、CciNI、SalI、TaqI、XbaI、XhoI、BclI、CpoI、CspI、Rsr2I、RsrII、MunI、MfeI、Psp5II、PpuMI、PspPPI、Bsp143I、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Aim、HinfI、MboI、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Alm、BspTI、AfIII、BfrI、Bst98I、BstAFI、MspCI、Vha464I、Pfl23II、BsiWI、PspLI、Acc65I、Asp718I、VspI、AseI、PshBI、Bsp1407I、BsrGI、BstAUI、Psp1406I、AclI、NheI、AsuNHI、BmtI、Tru1I、MseI、Tru9I、BshNI、AccB1I、BanI、BspT107I、BseDI、BsaJI、BssECI、BfmI、BstSFI、SfcI、Bpu10I、BcuI、AhII、SpeI、PagI、CciI、BspHI、RcaI、TatI、XagI、BstENI、EcoNI、PsyI、AspI、PflFI、Tth111I、TasI、Sse9I、Tsp509I、TspEI、XapI、AcsI、ApoI、Bme1390I、BmrFI、BssKI、BstSCI、MspR9I、ScrFI、StyD4I、BseXI、BbvI、BstV1I、BshTI、AgeI、AsiGI、CspAI、PinAI、XmiI、AccI、FbII、NmuCI、Tsp45I、PsuI、BstX2I、BstYI、MfII、XhoII、XmaJI、AspA2I、AvrII、BinI、SatI、Fnu4HI、Fsp4HI、ItaI、BveI、Acc36I、BfuAI、BspMI、PfoI、FspBI、BfaI、MaeI、XspI、PfeI、TfiI、SsiI、AciI、BspACI、FaqI、BsiFI、BsmFI、HpyF3I、BstDEI、DdeI、SgsI、AscI、PalAI、CseI、HgaI、Lsp1109I、BbvI、BstV1I、CsiI、MabI、SexAI、PteI、BsePlm、BssHII、FokI、BstF5I、BtsCI、KflI、Sse1825I、SanDI、SaqAI、MseI、Tru1I或Tru9I，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體不含所選擇的IIS型限制酶之識別位點。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體不含兩個或更多個所選擇的IIS型限制酶之識別位點。在一些實施例中，IIS型限制酶或兩個或更多個IIS型限制酶係選自(但不限於) AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，IIS型限制酶位點係BsaI限制酶位點。在一些實施例中，IIS型限制酶位點係BsmBI限制酶位點。在一些實施例中，IIS型限制酶位點係BsaI限制酶位點。在一些實施例中，IIS型限制酶位點係BsaI及BsmBI限制酶位點之組合。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體不包含功能性IIS型限制酶位點。其他非限制性限制酶(例如，IIS型限制酶)包括例如AasI、Acc36I、AccB7I、AceIII、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlfI、AloI、Alw26I、AlwNI、AlwXI、AmaCSI、ApaBI、ApyPI、AquII、AquIII、AquIV、ArsI、Asp10HII、BasI、Bbr7I、BbvI、BbvII、Bbv16II、Bce4I、Bce83I、BceCI、BcgI、Bco5I、Bco116I、BcoKI、BflI、BfuAI、BglI、Bli736I、Bme585I、BpiI、BplI、BpmI、BpuAI、BpuJI、BpuSI、BsAJI、Bsc4I、Bsc91I、Bsc107I、BscAI、Bse3DI、BseGI、BseKI、BseLI、BseMI、BseMII、BseXI、BseZI、BsgI、BsiYI、BslI、BslFI、Bso31I、BsoMAI、Bsp24I、Bsp423I、BspBS31I、BspCNI、BspD6I、BsplS4I、BspKT5I、BspLU11III、BspMI、BspST5I、BspTNI、BspTS514I、BspWI、Bst6I、Bst12I、Bst19I、Bst71I、BstAPI、BstBS32I、BstFZ438I、BstGZ53I、BstHZ55I、BstlZ316I、BstMAI、BstMWI、BstOZ616I、BstPZ418I、BstTS5I、BstV1I、BstV2I、BstXI、CaiI、CjeI、CjePI、CspCI、CstMI、DraIII、DrdI、DseDI、Eam1104I、Eco31I、Eco5TI、EcoA4I、Eco57MI、EcoO44I、EcoP15I、Esp3I、Esp1396I、GsuI、HaeIV、Hin4I、Hpy178III、Hpy188III、HpyF10VI、LweI、MmeI、MwoI、PfiBI、PfiMI、PhaI、PpiI、PsrI、RleAI、SdiI、SfiI、SmuI、Sth132I、StsI、TaqII、TspDTI、Tsp8EI、TspGWI、Tth111II、Van91I或VpaK11AI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物。在一些實施例中，由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物。在一些實施例中，限制酶可熱不活化。在一些實施例中，限制酶識別具有4-8個鹼基對，例如4個鹼基對、5個鹼基對、6個鹼基對、7個鹼基對或8個鹼基對之延伸部分。在一些實施例中，限制酶不為EcoRI。

在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體中之比參考桿狀病毒基因體少的(例如，少至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少56個、至少57個、至少58個、至少59個或至少60個、1-60個、2-60個、4-60個、6-60個、8-60個、10-60個、15-60個、20-60個、25-60個、30-60個、35-60個、40-60個、45-60個、50-60個、55-60個、1-50個、2-50個、4-50個、6-50個、8-50個、10-50個、15-50個、20-50個、25-50個、30-50個、35-50個、40-50個、45-50個、1-40個、2-40個、4-40個、6-40個、8-40個、10-40個、15-40個、20-40個、25-40個、30-40個、35-40個、1-30個、2-30個、4-30個、6-30個、8-30個、10-30個、15-30個、20-30個、25-30個、1-20個、2-20個、4-20個、6-20個、8-20個、10-20個、15-20個、1-10個、2-10個、4-10個、6-10或8-10個)功能性II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)係相同的II型限制酶位點(例如，相同的IIS型限制酶位點)。

在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體中之比參考桿狀病毒基因體少的(例如，少至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少56個、至少57個、至少58個、至少59個或至少60個、1-60個、2-60個、4-60個、6-60個、8-60個、10-60個、15-60個、20-60個、25-60個、30-60個、35-60個、40-60個、45-60個、50-60個、55-60個、1-50個、2-50個、4-50個、6-50個、8-50個、10-50個、15-50個、20-50個、25-50個、30-50個、35-50個、40-50個、45-50個、1-40個、2-40個、4-40個、6-40個、8-40個、10-40個、15-40個、20-40個、25-40個、30-40個、35-40個、1-30個、2-30個、4-30個、6-30個、8-30個、10-30個、15-30個、20-30個、25-30個、1-20個、2-20個、4-20個、6-20個、8-20個、10-20個、15-20個、1-10個、2-10個、4-10個、6-10或8-10個)功能性II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)係不同的IIS型限制酶位點，例如第一II型限制酶位點與第二II型限制酶位點之組合(例如，第一IIS型限制酶位點與第二IIS型限制酶位點之組合)。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體中之比參考桿狀病毒基因體少的功能性II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)係2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多II型限制酶(例如，IIS型限制酶)之限制酶位點。

在一些實施例中，(i)第一IIS型限制酶位點係選自本文中所描述之II型限制酶位點，及(ii)第二IIS型限制酶位點係選自本文中所描述之II型限制酶位點，其中第一所選擇的II型限制酶位點及第二所選擇的II型限制酶位點係不同的。

在一些實施例中，(i)第一IIS型限制酶位點係選自AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI限制酶位點，或任何前述酶之同裂酶之限制酶位點；及(ii)第二IIS型限制酶位點係選自AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI限制酶位點，或任何前述酶之同裂酶之限制酶位點；其中第一IIS型限制酶位點及第二IIS型限制酶位點係不同的。在一些實施例中，第一IIS型限制酶位點係BsaI限制酶位點且第二IIS型限制酶位點係BsmBI限制酶位點。其他非限制性限制酶(例如，IIS型限制酶)包括例如AasI、Acc36I、AccB7I、AceIII、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlfI、AloI、Alw26I、AlwNI、AlwXI、AmaCSI、ApaBI、ApyPI、AquII、AquIII、AquIV、ArsI、Asp10HII、BasI、Bbr7I、BbvI、BbvII、Bbv16II、Bce4I、Bce83I、BceCI、BcgI、Bco5I、Bco116I、BcoKI、BflI、BfuAI、BglI、Bli736I、Bme585I、BpiI、BplI、BpmI、BpuAI、BpuJI、BpuSI、BsAJI、Bsc4I、Bsc91I、Bsc107I、BscAI、Bse3DI、BseGI、BseKI、BseLI、BseMI、BseMII、BseXI、BseZI、BsgI、BsiYI、BslI、BslFI、Bso31I、BsoMAI、Bsp24I、Bsp423I、BspBS31I、BspCNI、BspD6I、BsplS4I、BspKT5I、BspLU11III、BspMI、BspST5I、BspTNI、BspTS514I、BspWI、Bst6I、Bst12I、Bst19I、Bst71I、BstAPI、BstBS32I、BstFZ438I、BstGZ53I、BstHZ55I、BstlZ316I、BstMAI、BstMWI、BstOZ616I、BstPZ418I、BstTS5I、BstV1I、BstV2I、BstXI、CaiI、CjeI、CjePI、CspCI、CstMI、DraIII、DrdI、DseDI、Eam1104I、Eco31I、Eco5TI、EcoA4I、Eco57MI、EcoO44I、EcoP15I、Esp3I、Esp1396I、GsuI、HaeIV、Hin4I、Hpy178III、Hpy188III、HpyF10VI、LweI、MmeI、MwoI、PfiBI、PfiMI、PhaI、PpiI、PsrI、RleAI、SdiI、SfiI、SmuI、Sth132I、StsI、TaqII、TspDTI、Tsp8EI、TspGWI、Tth111II、Van91I或VpaK11AI，或任何前述限制酶之同裂酶。

在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體所包含之功能性第一IIS型限制酶位點(例如，BsaI限制酶位點)比第二IIS型限制酶位點(例如，BsmBI限制酶位點)少至少3、4或5倍。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體所包含之功能性第二IIS型限制酶位點(例如，BsmBI II型限制酶位點)比第一IIS型限制酶位點(例如，BsaI II型限制酶位點)多至少3、4或5倍。

在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體所包含之：(i)功能性BsaI II型限制酶位點比參考桿狀病毒基因體(例如，AcMNPV基因體)少至少5-15個(例如，5-12、5-13、5-14、5-15、5-10、10-12、10-13、10-14、11-15、11-15、11-13、12-15、12-14、10、11、12、13、14或15個)；及/或(ii)功能性BsmBI II型限制酶位點比參考桿狀病毒基因體(例如，AcMNPV基因體)少至少40-50個(例如，40-45、41-50、41-45、42-50、42-45、43-50、43-45、44-50、45-50、46-50、47-50、48-50、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個)。

在一些實施例中，與參考桿狀病毒基因體(例如，AcMNPV基因體)相比，變異型桿狀病毒基因體所包含之功能性BsaI II型限制酶位點少11個及/或功能性BsmBI II型限制酶位點少45個。

在一些實施例中，II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)包含使位點不活化或不能由相應的II型限制酶(例如，IIS型限制酶)識別之修飾，例如插入、缺失或取代。在一些實施例中，II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)與相應的功能性II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)相比包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個修飾，例如插入、缺失或取代。在一些實施例中，II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)與相應的功能性II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)相比包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個不同核苷酸。在一些實施例中，II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)係不存在或缺失的。

在一些實施例中，II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)包含修飾，例如取代，其中該修飾包含不同天然存在之桿狀病毒基因體序列(例如，相同屬之參考桿狀病毒基因體)之核苷酸。在一些實施例中，II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)與相應的功能性IIS型限制酶位點相比包含不同的核苷酸，其中該不同的核苷酸係來自不同的天然存在之桿狀病毒基因體序列。

在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係α-桿狀病毒、β-桿狀病毒、δ-桿狀病毒或γ-桿狀病毒之基因體。在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係α-桿狀病毒基因體。在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係β-桿狀病毒基因體。在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係δ-桿狀病毒基因體。在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係γ-桿狀病毒基因體。在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係選自以下之α-桿狀病毒之基因體：茶小卷葉蛾核多角體病毒(NPV)、小地老虎多核多角體病毒(MNPV)、黃地老虎NPVA、黃地老虎NPVB、柞蠶蛾NPV、黎豆夜蛾MNPV、苜蓿銀紋夜蛾MNPV (AcMNPV)、家蠶NPV (BmNPV)、油桐尺蛾NPV、遷飛粉蝶NPV、雲杉卷葉蛾DEF MNPV、雲杉卷葉蛾MNPV、紫色卷蛾NPV、薔薇斜條卷葉蛾NPV、錁紋夜蛾NPV、大豆尺蛾NPV、豆天蛾NPV、竹織葉蛾NPV、荔枝蛾NPV、波紋雜毛蟲NPV、茶尺蠖NPV、蘋果褐卷蛾NPV、茶毛蟲NPV、番茄夜蛾NPV、新天蠶蛾屬NPV、美國白蛾NPV、柑桔尺蛾NPV、鐵杉尺蠖NPV、黏蟲NPV、巴西天蠶蛾NPV、舞毒蛾MNPV、黑角舞蛾NPV、甘藍夜蛾MNPV、蓓帶夜蛾NPV A、蓓帶夜蛾NPVB、豆莢螟NPV、一點黏蟲NPV A、一點黏蟲NPVB、冬尺蛾NPV、白斑毒蛾NPV、花旗松毒蛾MNPV、斜紋刺蛾NPV、豆雜角夜蛾NPV、天蛾NPV、亞熱帶黏蟲NPV、莎草黏蟲NPV、甜菜夜蛾多NPV A、甜菜夜蛾多NPV B、草地黏蟲MNPV、灰翅夜蛾NPV、斜紋夜蛾NPV、棗尺蠖NPV、弧金翅夜蛾NPV (ThorNPV)、粉紋夜蛾單一NPV、豆卷葉蝶NPV、蝙蝠蛾NPV或任何前述α-桿狀病毒之變異型病毒株。

在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係選自以下之β-桿狀病毒之基因體：茶姬捲葉蛾顆粒病毒(GV)、黃地老虎GV、雲杉卷葉蛾GV、楊扇舟蛾GV、分月扇舟蛾GV A、分月扇舟蛾GV B、瘤野螟GV、蘋果異形小卷蛾GV、蘋果蠹蛾GV、小蔗螟GV、斜紋夜蛾GV、木薯天蛾GV、葡萄葉斑蛾GV、毛脛夜蛾GV、一點黏蟲GV A、一點黏蟲GV B 、馬鈴薯塊莖蛾GV、印度穀螟GV、小菜蛾GV、草地黏蟲GV、斜紋夜蛾GV、粉紋夜蛾GV、八字地老虎GV或任何前述β-桿狀病毒之變異型病毒株。

在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係δ-桿狀病毒黑腳庫蚊NPV或其變異型病毒株之基因體。

在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係選自以下之γ-桿狀病毒之基因體：紅頭新松葉蜂NPV、松黃葉蜂NPV或其變異型病毒株。

在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體包含來自選自以下之參考桿狀病毒基因體之核苷酸序列或其一部分：AcMNPV (例如，AcMNPV病毒株E2、C6或HR3)、BmNPV、AgMNPV、OpMNPV或ThorMNPV。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體包含來自AcMNPV (例如，AcMNPV病毒株E2、C6或HR3)桿狀病毒基因體之核苷酸序列或其一部分。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體包含來自BmNPV桿狀病毒基因體之核苷酸序列或其一部分。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體包含來自ThorMNPV桿狀病毒基因體之核苷酸序列或其一部分。

在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係本文中所描述之野生型桿狀病毒基因體或本文中所描述之經修飾之桿狀病毒基因體，例如具有一或多個非必需基因(例如，輔助或經口感染因子基因)或一或多個非必需基因之調節區之缺失之桿狀病毒基因體，例如具有多角體蛋白(polH)基因座之缺失之桿狀病毒基因體。在一些實施例中，對一或多個非必需基因之修飾係引起基因產物之減少或消除之變化，例如缺失、插入、突變(例如，框移突變)、啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入。

在一些實施例中，參考桿狀病毒基因體係bMON14272、vAce25ko或vAclef11KO桿狀病毒基因體。

在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體包含一或多個破壞，例如一或多個本文中所描述之非必需基因(例如，輔助或經口感染因子基因)之一或多個突變(例如，框移突變)、一或多個缺失、一或多個插入或不活化。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體包含非必需基因之破壞，例如突變、缺失、插入或不活化。

在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或1-64、1-60、1-55、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、2-64、2-60、2-55、2-50、2-45、2-40、2-35、2-30、2-25、2-20、2-15、2-10、2-5、2-4、2-3、3-64、3-60、3-55、3-50、3-45、3-40、3-35、3-30、3-25、3-20、3-15、3-10、3-5、3-4、4-64、4-60、4-55、4-50、4-45、4-40、4-35、4-30、4-25、4-20、4-15、4-10、4-5、5-64、5-60、5-55、5-50、5-45、5-40、5-35、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-64、10-60、10-55、10-50、10-45、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20、10-15、15-64、15-60、15-55、15-50、15-45、15-40、15-35、15-30、15-25、15-20、20-64、20-60、20-55、20-50、20-45、20-40、20-35、20-30、20-25、25-64、25-60、25-55、25-50、25-45、25-40、25-35、25-30、30-64、30-60、30-55、30-50、30-45、30-40、30-35、35-64、35-60、35-55、35-50、35-45、35-40、40-64、40-60、40-55、40-50、40-45、45-64、45-60、45-55、45-50、50-64、50-60、50-55、55-64、55-60、60-64、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、62或64個非必需基因之破壞，例如突變(例如，框移突變)、缺失、插入或不活化。在一些實施例中，非必需基因係選自Ptp、Bro、Ctx、orf603、多角體蛋白、egt、bv/odv-e26、ac18、pif-2、env-prot、iap-1、Sod、Fgf、v-ubi、p43、odv-e66、gp37、odv-nc42、ac69、iap-2、pnk/pnl、ac91、odv-e28、pif-4、pif-3、pif-1、pk-2、chiA、v-cath、pp34、94K、p26、p10、p74、ac145、odv-e56、ac150、ac11、ac30、Gta、ac63、15k、ac97、ac121、ac140、ac146、ac149、hispP、ac44、ac47、ac84、ac112/113 Nt、ac112/113Ct、ac118、ac122、ie-01、ac152、Pcna、ac56、hcf-1、ac85、cg30、ac116及ac117。在一些實施例中，非必需基因係選自以下中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21者：egt、p74 (PIF0)、p26、SOD、ChiA、v-cath、p10、多角體蛋白、ctx、odv-e56、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體包含v-cath基因座之缺失。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體包含多角體蛋白(pohH)基因座之缺失。

在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體包含所關注的異源或外源核苷酸序列。在一些實施例中，該所關注的序列編碼所關注的多肽或所關注的核酸。在一些實施例中，所關注的多肽或核酸係治療性多肽(例如，治療性蛋白質)或治療性核苷酸序列(例如，治療性RNAi)。在一些實施例中，所關注的多肽係可偵測標記基因，諸如綠色螢光蛋白質(GFP)或分泌型胚胎鹼性磷酸酶(SEAP)。在一些實施例中，所關注的序列包含一或多個腺相關病毒(AAV)基因編碼區域及/或有效負載。在一些實施例中，所關注的序列經修飾以移除用於產生本文中所描述之片段(例如，次基因體片段及/或次片段)之限制酶(例如，所選擇的IIS型限制酶)之一或多個或所有識別位點。在一些實施例中，所關注的核苷酸序列係化學合成的。在一些實施例中，所關注的核苷酸序列係由基於PCR之方法產生。在一些實施例中，所關注的序列之核苷酸序列係由化學合成與基於PCR之方法之組合產生。在一些實施例中，所關注的核苷酸序列係所關注的非模板化核苷酸序列(例如，非模板化片段)。在一些實施例中，使用可用的限制酶位點將所關注的核苷酸序列插入變異型桿狀病毒基因體中。在一些實施例中，使用Gibson Assembly™將所關注的核苷酸序列插入變異型桿狀病毒基因體中。

在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體之長度係至少10千鹼基(kb)，例如至少15 kb、至少20 kb、至少25 kb、至少30 kb、至少35 kb、至少40 kb、至少50 kb、至少55 kb、至少60 kb、至少65 kb、至少70 kb、至少75 kb、至少80 kb、至少85 kb、至少90 kb、至少95 kb、至少100 kb、至少120 kb、至少140 kb、至少160 kb、至少180 kb、至少200 kb、至少250 kb、至少300 kb、至少350 kb或至少400 kb。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體之長度係1-500 kb，例如1-450 kb、1-400 kb、1-350 kb、1-300 kb、1-250 kb、1-200 kb、1-150 kb、1-100 kb、1-50 kb、50-500 kb、50-450 kb、50-400 kb、50-350 kb、50-300 kb、50-250 kb、50-200 kb、50-150 kb、50-100 kb、100-500 kb、100-450 kb、100-400 kb、100-350 kb、100-300 kb、100-250 kb、100-200 kb、100-150 kb、150-500 kb、150-450 kb、150-400 kb、150-350 kb、150-300 kb、150-250 kb、150-200 kb、200-500 kb、200-450 kb、200-400 kb、200-350 kb、200-300 kb、200-250 kb、250-500 kb、250-450 kb、250-400 kb、250-350 kb、250-300 kb、300-500 kb、300-450 kb、300-400 kb、300-350 kb、350-500 kb、350-450 kb、350-400 kb、400-500 kb、400-450 kb或450-500 kb。

在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體係活體外產生的。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體係以電腦模擬方式產生的。在一些實施例中，變異型桿狀病毒基因體係以電腦模擬方式設計的。

在一些實施例中，本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體位於載體，諸如細菌人工染色體(BAC)中。因此，本文中提供桿狀病毒表現構築體，其包含本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體。在一些實施例中，插入本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體之主鏈載體(例如，BAC)經修飾以使得其所具有之限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比主鏈載體之野生型版本少一或多個(例如，至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、1-60個、1-50個、1-40個、1-30個、1-20個、1-10個、1-5個、10-60個、10-50個、10-40個、10-30個、10-20個、20-60個、20-50個、20-40個、20-30個、30-60個、30-50個、30-40個、40-60個、40-50個或50-60個)。

在一些實施例中，除插入本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體的所選擇的限制酶(例如，所選擇的II型限制酶(例如，IIS型限制酶))之兩個識別位點以外，主鏈載體(例如，BAC)不含所選擇的限制酶(例如，所選擇的II型限制酶(例如，IIS型限制酶))之識別位點。在一些實施例中，除插入本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體的所選擇的II型限制酶(例如，IIS型限制酶)之兩個識別位點以外，主鏈載體(例如，BAC)不含所選擇的II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)之識別位點。在一些實施例中，該所選擇的II型限制酶(例如，IIS型限制酶)與用於產生次基因體片段之所選擇的II型限制酶(例如，IIS型限制酶)相同。在一些實施例中，所選擇的IIS型限制酶係BsaI。在一些實施例中，所選擇的IIS型限制酶係BsmBI。在一些實施例中，所選擇的II型限制酶(例如，IIS型限制酶)與用於產生次基因體片段之所選擇的II型限制酶相同。

在一些實施例中，本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體及/或本文中所描述之桿狀病毒表現構築體係複製勝任型。在一些實施例中，本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體及/或本文中所描述之桿狀病毒表現構築體能夠產生功能性桿狀病毒。在一些實施例中，本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體及/或本文中所描述之桿狀病毒表現構築體能夠產生至少50% (例如，至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少150%、至少200%、50-200%、50-150%、50-100%、75-200%、75-150%、75-100%、100-200%、100-150%或150-200%)之由參考病毒基因體產生之桿狀病毒。在一些實施例中，本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體及/或本文中所描述之桿狀病毒表現構築體能夠產生80-120% (例如，85-115%、90-110%、95-105%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、101%、102%、103%、104%、105%)之由參考病毒基因體產生之桿狀病毒。在一些實施例中，藉由量測病毒效價(例如，TCID50)來測定所產生之桿狀病毒之量，例如使用qPCR測定。 產生變異型桿狀病毒基因體之方法

本文中提供用於產生本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體之方法。

在一些實施例中，用於產生變異型桿狀病毒基因體(例如，本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體)之方法包含：(i)提供複數個片段(例如，本文中所描述之複數個片段)，例如次基因體片段或次片段(例如，本文中所描述之次基因體片段或次片段)，其中各片段包含：(a)獨有的5'突出物及獨有的3'突出物(例如，本文中所描述之獨有的5'及3'突出物)；(b)變異型桿狀病毒核苷酸序列(例如，本文中所描述之變異型桿狀病毒核苷酸序列)，其所包含之功能性II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列(例如，野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列)少(例如，功能性II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)少至少5個，例如少至少20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、1-20、1-15、1-10、1-5、5-20、5-15、5-10、10-20或10-15個)；(ii)將修飾(例如，插入、取代或缺失)，例如一或多個修飾引入一或多個包含變異型桿狀病毒核苷酸序列之片段中；及(iii)在適合於形成變異型桿狀病毒基因體之條件下培育該複數個片段，藉此產生桿狀病毒基因體。

在一些實施例中，用於產生變異型桿狀病毒基因體(例如，本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體)之方法包含：(i)提供複數個片段(例如，如本文中所描述之複數個片段)，例如次基因體片段或次片段(例如，本文中所描述之次基因體片段或次片段)，其中各片段包含：(a)獨有的5'突出物及獨有的3'突出物(例如，本文中所描述之獨有的5'及3'突出物)；(b)變異型桿狀病毒核苷酸序列(例如，本文中所描述之變異型桿狀病毒核苷酸序列)，其所包含之功能性II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列(例如，野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列)少(例如，功能性II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)少至少5個，例如少至少20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、1-20、1-15、1-10、1-5、5-20、5-15、5-10、10-20或10-15個)；其中該複數個片段中之一或多者包含變異型桿狀病毒核苷酸序列中之修飾(例如，插入、取代或缺失)，例如一或多個修飾；及(iii)在適合於形成變異型桿狀病毒基因體之條件下培育該複數個片段，藉此產生桿狀病毒基因體。

在一些實施例中，該複數個片段中之一或多者(例如，次片段或次基因體片段)所包含之限制酶位點(例如，天然存在之限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比本文中所描述之參考桿狀病毒基因體(例如，野生型桿狀病毒基因體)中之核苷酸序列少至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少56個、至少57個、至少58個、至少59個或至少60個。在一些實施例中，該複數個片段中之一或多個片段包含變異型核苷酸序列，其所包含之限制酶位點(例如，天然存在之限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少1-60個、2-60個、4-60個、6-60個、8-60個、10-60個、15-60個、20-60個、25-60個、30-60個、35-60個、40-60個、45-60個、50-60個、55-60個、1-50個、2-50個、4-50個、6-50個、8-50個、10-50個、15-50個、20-50個、25-50個、30-50個、35-50個、40-50個、45-50個、1-40個、2-40個、4-40個、6-40個、8-40個、10-40個、15-40個、20-40個、25-40個、30-40個、35-40個、1-30個、2-30個、4-30個、6-30個、8-30個、10-30個、15-30個、20-30個、25-30個、1-20個、2-20個、4-20個、6-20個、8-20個、10-20個、15-20個、1-10個、2-10個、4-10個、6-10個或8-10個。在一些實施例中，限制酶位點係選自(但不限於)以下之II型限制酶之識別位點：Eco31I、BsaI Bso31I、BspTNI、Esp3I、BpiI、Alw26I、BsmAI、BstMAI、BmsI、BhaI、BscAI、BscUI、BsmNI、BspST5I、Bst19I、CjeP338II、LweI、Mva1312II、PhaI、SfaNI、LguI、BspQI、PsiSI、SapI、Alw44I、ApaLI、VneI、BamHI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlpI、Bsp1720I、CeIII、Bsp119I、AsuII、Bpu14I、BspT104I、BstBI、Csp45I、NspV、SfuI、Bsp120I、PspOMI、Bsu15I、BanIII、Bsa29I、BseCI、BshVI、BspDI、BspXI、BsuTUI、ClaI、Cfr10I、Bse118I、BsrFI、BssAI、Cfr13I、AspS9I、BmgT120I、PspPI、Sau96I、Csp6I、AfaI、CviQI、RsaNI、Eam1104I、Bst6I、EarI、EcoO109I、DraII、EcoRI、Eco47I、AvaII、Bme18I、SinI、VpaK11BI、Eco52I、BseX3I、BstZI、EagI、EclXI、Eco81I、AxyI、Bse21I、Bsu36I、Eco88I、Ama87I、AvaI、BmeT110I、BsiHKCI、BsoBlm、Eco91I、BstEII、BstPI、EcoO65I、PspEI、Eco130I、BssT1I、EcoT14I、ErhI、StyI、Hin1I、AcyI、BsaHI、BssNI、BstACI、Hsp92I、AspLEI、BstHHI、CfoI、HinP1I、HspAI、HindIII、HpaII、BsiSI、HapII、Kpn2I、AccIII、Aor13HI、BseAI、Bsp13I、BspEI、MroI、MspI、BsiSI、HapII、MvaI、AjnI、BseBI、Bst2UI、BstNI、BstOI、Psp6I、PspGI、MluI、NcoI、Bsp19I、NdeI、FauNDI、NotI、CciNI、SalI、TaqI、XbaI、XhoI、BclI、CpoI、CspI、Rsr2I、RsrII、MunI、MfeI、Psp5II、PpuMI、PspPPI、Bsp143I、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Aim、HinfI、MboI、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Alm、BspTI、AfIII、BfrI、Bst98I、BstAFI、MspCI、Vha464I、Pfl23II、BsiWI、PspLI、Acc65I、Asp718I、VspI、AseI、PshBI、Bsp1407I、BsrGI、BstAUI、Psp1406I、AclI、NheI、AsuNHI、BmtI、Tru1I、MseI、Tru9I、BshNI、AccB1I、BanI、BspT107I、BseDI、BsaJI、BssECI、BfmI、BstSFI、SfcI、Bpu10I、BcuI、AhII、SpeI、PagI、CciI、BspHI、RcaI、TatI、XagI、BstENI、EcoNI、PsyI、AspI、PflFI、Tth111I、TasI、Sse9I、Tsp509I、TspEI、XapI、AcsI、ApoI、Bme1390I、BmrFI、BssKI、BstSCI、MspR9I、ScrFI、StyD4I、BseXI、BbvI、BstV1I、BshTI、AgeI、AsiGI、CspAI、PinAI、XmiI、AccI、FbII、NmuCI、Tsp45I、PsuI、BstX2I、BstYI、MfII、XhoII、XmaJI、AspA2I、AvrII、BinI、SatI、Fnu4HI、Fsp4HI、ItaI、BveI、Acc36I、BfuAI、BspMI、PfoI、FspBI、BfaI、MaeI、XspI、PfeI、TfiI、SsiI、AciI、BspACI、FaqI、BsiFI、BsmFI、HpyF3I、BstDEI、DdeI、SgsI、AscI、PalAI、CseI、HgaI、Lsp1109I、BbvI、BstV1I、CsiI、MabI、SexAI、PteI、BsePlm、BssHII、FokI、BstF5I、BtsCI、KflI、Sse1825I、SanDI、SaqAI、MseI、Tru1I、or Tru9I，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶位點係IIS型限制酶之識別位點。在一些實施例中，IIS型限制酶係選自(但不限於) AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，該複數個片段中之各者不含所選擇的IIS型限制酶之識別位點。在一些實施例中，該複數個片段中之各者不含兩個或更多個所選擇的IIS型限制酶之識別位點。在一些實施例中，所選擇的IIS型限制酶係BsaI、BsmBI，或BsaI與BsmBI之組合。其他非限制性酶(例如，IIS型限制酶)包括例如AasI、Acc36I、AccB7I、AceIII、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlfI、AloI、Alw26I、AlwNI、AlwXI、AmaCSI、ApaBI、ApyPI、AquII、AquIII、AquIV、ArsI、Asp10HII、BasI、Bbr7I、BbvI、BbvII、Bbv16II、Bce4I、Bce83I、BceCI、BcgI、Bco5I、Bco116I、BcoKI、BflI、BfuAI、BglI、Bli736I、Bme585I、BpiI、BplI、BpmI、BpuAI、BpuJI、BpuSI、BsAJI、Bsc4I、Bsc91I、Bsc107I、BscAI、Bse3DI、BseGI、BseKI、BseLI、BseMI、BseMII、BseXI、BseZI、BsgI、BsiYI、BslI、BslFI、Bso31I、BsoMAI、Bsp24I、Bsp423I、BspBS31I、BspCNI、BspD6I、BsplS4I、BspKT5I、BspLU11III、BspMI、BspST5I、BspTNI、BspTS514I、BspWI、Bst6I、Bst12I、Bst19I、Bst71I、BstAPI、BstBS32I、BstFZ438I、BstGZ53I、BstHZ55I、BstlZ316I、BstMAI、BstMWI、BstOZ616I、BstPZ418I、BstTS5I、BstV1I、BstV2I、BstXI、CaiI、CjeI、CjePI、CspCI、CstMI、DraIII、DrdI、DseDI、Eam1104I、Eco31I、Eco5TI、EcoA4I、Eco57MI、EcoO44I、EcoP15I、Esp3I、Esp1396I、GsuI、HaeIV、Hin4I、Hpy178III、Hpy188III、HpyF10VI、LweI、MmeI、MwoI、PfiBI、PfiMI、PhaI、PpiI、PsrI、RleAI、SdiI、SfiI、SmuI、Sth132I、StsI、TaqII、TspDTI、Tsp8EI、TspGWI、Tth111II、Van91I或VpaK11AI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物。在一些實施例中，由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物。在一些實施例中，限制酶可熱不活化。在一些實施例中，限制酶識別具有4-8個鹼基對，例如4個鹼基對、5個鹼基對、6個鹼基對、7個鹼基對或8個鹼基對之延伸部分。在一些實施例中，限制酶不為EcoRI。

在一些實施例中，該複數個片段中之一或多者包含變異型桿狀病毒核苷酸序列中之修飾(例如，插入、取代或缺失)，例如一或多個修飾。在一些實施例中，該複數個片段中之一或多者包含對一或多個基因編碼序列或一或多個調節序列(例如，強化子、啟動子、內含子、5'UTR或3'UTR)之修飾(例如，插入、取代或缺失)，例如一或多個修飾。在一些實施例中，可藉由在變異型桿狀病毒基因體之相關部分(例如，次基因體片段或次片段)之化學合成期間將所需一或多種變化(例如，取代、插入及/或缺失)直接引入核苷酸序列中來產生所關注的基因之變異型序列。在一些實施例中，該複數個片段中之一或多者包含修飾，例如一或多個修飾，其引入例如一或多個酶(例如，限制酶)之一或多個識別位點。在一些實施例中，該複數個片段中之一或多者包含修飾，例如一或多個修飾，其引入一或多個編碼一或多個所關注的核苷酸序列之核苷酸序列(例如，編碼多肽(諸如治療性多肽)、所關注的核酸(諸如RNAi試劑)或AAV基因編碼區域及/或有效負載之核苷酸)。在一些實施例中，該複數個片段中之一或多者包含修飾，例如一或多個修飾，其刪除一或多個核苷酸或核苷酸之延伸部分。在一些實施例中，該複數個片段中之一或多者包含一或多個非必需桿狀病毒基因座，例如非必需桿狀病毒基因(例如，輔助或經口感染因子基因)及/或非必需桿狀病毒基因之調節區中之修飾，例如一或多個修飾，諸如插入、缺失或取代。在一些實施例中，對編碼選自以下之基因的一或多個或所有非必需桿狀病毒基因座進行修飾，例如一或多個修飾，諸如插入、缺失或取代：Ptp、Bro、Ctx、orf603、多角體蛋白、Get、bv/odv-e26、ac18、pif-2、env-prot、iap-1、Sod、Fgf、v-ubi、p43、odv-e66、gp37、odv-nc42、ac69、iap-2、pnk/pnl、ac91、odv-e28、pif-4、pif-3、pif-1、pk-2、chiA、v-cath、pp34、94K、p26、p10、p74、ac145、odv-e56、ac150、ac11、ac30、Gta、ac63、15k、ac97、ac121、ac140、ac146、ac149、hispP、ac44、ac47、ac84、ac112/113 Nt、ac112/113Ct、ac118、ac122、ie-01、ac152、Pcna、ac56、hcf-1、ac85、cg30、ac116及ac117。在一些實施例中，對編碼選自以下中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21者之基因的非必需桿狀病毒基因座進行修飾，例如一或多個修飾，諸如插入、缺失或取代：egt、p74 (PIF0)、p26、SOD、ChiA、v-cath、p10、多角體蛋白、ctx、odv-e56、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94。

在一些實施例中，該複數個片段中之一或多者包含變異型桿狀病毒基因體之以下基因座中之修飾，例如插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變)：(i) v-cath及egt，(ii) v-cath、egt及SOD1，(iii) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74及SOD，(iv) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74及SOD，或(v) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74、SOD、AcORF-91及AcORF-108。在一些實施例中，修飾包含chiA基因、v-cath基因、p26基因、p10基因及/或p74基因或其一部分之缺失。在一些實施例中，修飾包含非必需基因或相鄰區域中之異源序列之插入。在一些實施例中，修飾包含非必需基因或相鄰區域中之一或多個突變。在一些實施例中，非必需基因位於同源重複序列區5 (hr5)附近(例如，下游或上游)。

在一些實施例中，本文中所描述之複數個次片段中之一或多個片段係共價連接的，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly或Gibson Assembly™，使得形成一或多個次基因體區域、一或多個次基因體片段、一或多個較大的次片段、桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體。在一些實施例中，共價連接之片段係線性的(例如，線性DNA)。在一些實施例中，共價連接之片段係圓形的(例如，圓形DNA)，例如當位於載體(例如，BAC)中時。在一些實施例中，複數個片段係在單步驟中接合以產生一或多個次基因體片段、變異型桿狀病毒基因體或桿狀病毒表現構築體。 產生複數個次基因體片段或次片段之方法

本文中亦提供用於產生能夠組裝至變異型桿狀病毒基因體中的複數個次基因體片段之方法，其包含：(i)提供參考，例如親本桿狀病毒基因體(例如，本文中所描述之參考桿狀病毒基因體)；(ii)視情況地，鑑別參考桿狀病毒基因體中之由限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)識別之一或多個位點，例如所有識別位點；(iii)修飾該一或多個識別位點，使得桿狀病毒基因體所包含之功能性限制酶位點(例如，天然存在之限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比本文中所描述之參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列(例如，野生型桿狀病毒基因體中之核苷酸序列)少至少10個，藉此產生初代模板，(iv)將初代模板分成複數個次基因體片段，其中該複數個次基因體片段中之各者包含獨有的5'突出物及獨有的3'突出物，且其中該等次基因體片段能夠基於一個次基因體片段中之5'突出物與另一次基因體片段中之3'突出物之互補性而有序地組裝；藉此產生複數個次基因體片段。

在一些實施例中，使用電腦軟體以電腦模擬方式鑑別參考桿狀病毒基因體中之由限制酶(例如，II型限制酶(例如，IIS型限制酶))識別之一或多個位點，例如所有識別位點。任何允許鑑別較大核苷酸序列內的核苷酸序列之特定延伸部分之程式皆適用於鑑別限制酶(例如，所選擇的II型限制酶(例如，IIS型限制酶))之識別位點之數目及位置。

在一些實施例中，修飾所鑑別之識別位點，使得產生初代模板(例如，變異型桿狀病毒基因體)，其所具有之限制酶位點，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比本文中所描述之參考桿狀病毒基因體(例如，野生型桿狀病毒基因體)中之核苷酸序列少至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少56個、至少57個、至少58個、至少59個或至少60個。在一些實施例中，初代模板包含變異型核苷酸序列，其所包含之限制酶位點(例如，天然存在之限制酶位點)，例如II型限制酶位點(例如，IIS型限制酶位點)比參考桿狀病毒基因體中之核苷酸序列少1-60個、2-60個、4-60個、6-60個、8-60個、10-60個、15-60個、20-60個、25-60個、30-60個、35-60個、40-60個、45-60個、50-60個、55-60個、1-50個、2-50個、4-50個、6-50個、8-50個、10-50個、15-50個、20-50個、25-50個、30-50個、35-50個、40-50個、45-50個、1-40個、2-40個、4-40個、6-40個、8-40個、10-40個、15-40個、20-40個、25-40個、30-40個、35-40個、1-30個、2-30個、4-30個、6-30個、8-30個、10-30個、15-30個、20-30個、25-30個、1-20個、2-20個、4-20個、6-20個、8-20個、10-20個、15-20個、1-10個、2-10個、4-10個、6-10個或8-10個。在一些實施例中，限制酶位點係選自(但不限於)以下之II型限制酶之識別位點：Eco31I、BsaI Bso31I、BspTNI、Esp3I、BpiI、Alw26I、BsmAI、BstMAI、BmsI、BhaI、BscAI、BscUI、BsmNI、BspST5I、Bst19I、CjeP338II、LweI、Mva1312II、PhaI、SfaNI、LguI、BspQI、PsiSI、SapI、Alw44I、ApaLI、VneI、BamHI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlpI、Bsp1720I、CeIII、Bsp119I、AsuII、Bpu14I、BspT104I、BstBI、Csp45I、NspV、SfuI、Bsp120I、PspOMI、Bsu15I、BanIII、Bsa29I、BseCI、BshVI、BspDI、BspXI、BsuTUI、ClaI、Cfr10I、Bse118I、BsrFI、BssAI、Cfr13I、AspS9I、BmgT120I、PspPI、Sau96I、Csp6I、AfaI、CviQI、RsaNI、Eam1104I、Bst6I、EarI、EcoO109I、DraII、EcoRI、Eco47I、AvaII、Bme18I、SinI、VpaK11BI、Eco52I、BseX3I、BstZI、EagI、EclXI、Eco81I、AxyI、Bse21I、Bsu36I、Eco88I、Ama87I、AvaI、BmeT110I、BsiHKCI、BsoBlm、Eco91I、BstEII、BstPI、EcoO65I、PspEI、Eco130I、BssT1I、EcoT14I、ErhI、StyI、Hin1I、AcyI、BsaHI、BssNI、BstACI、Hsp92I、AspLEI、BstHHI、CfoI、HinP1I、HspAI、HindIII、HpaII、BsiSI、HapII、Kpn2I、AccIII、Aor13HI、BseAI、Bsp13I、BspEI、MroI、MspI、BsiSI、HapII、MvaI、AjnI、BseBI、Bst2UI、BstNI、BstOI、Psp6I、PspGI、MluI、NcoI、Bsp19I、NdeI、FauNDI、NotI、CciNI、SalI、TaqI、XbaI、XhoI、BclI、CpoI、CspI、Rsr2I、RsrII、MunI、MfeI、Psp5II、PpuMI、PspPPI、Bsp143I、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Aim、HinfI、MboI、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Alm、BspTI、AfIII、BfrI、Bst98I、BstAFI、MspCI、Vha464I、Pfl23II、BsiWI、PspLI、Acc65I、Asp718I、VspI、AseI、PshBI、Bsp1407I、BsrGI、BstAUI、Psp1406I、AclI、NheI、AsuNHI、BmtI、Tru1I、MseI、Tru9I、BshNI、AccB1I、BanI、BspT107I、BseDI、BsaJI、BssECI、BfmI、BstSFI、SfcI、Bpu10I、BcuI、AhII、SpeI、PagI、CciI、BspHI、RcaI、TatI、XagI、BstENI、EcoNI、PsyI、AspI、PflFI、Tth111I、TasI、Sse9I、Tsp509I、TspEI、XapI、AcsI、ApoI、Bme1390I、BmrFI、BssKI、BstSCI、MspR9I、ScrFI、StyD4I、BseXI、BbvI、BstV1I、BshTI、AgeI、AsiGI、CspAI、PinAI、XmiI、AccI、FbII、NmuCI、Tsp45I、PsuI、BstX2I、BstYI、MfII、XhoII、XmaJI、AspA2I、AvrII、BinI、SatI、Fnu4HI、Fsp4HI、ItaI、BveI、Acc36I、BfuAI、BspMI、PfoI、FspBI、BfaI、MaeI、XspI、PfeI、TfiI、SsiI、AciI、BspACI、FaqI、BsiFI、BsmFI、HpyF3I、BstDEI、DdeI、SgsI、AscI、PalAI、CseI、HgaI、Lsp1109I、BbvI、BstV1I、CsiI、MabI、SexAI、PteI、BsePlm、BssHII、FokI、BstF5I、BtsCI、KflI、Sse1825I、SanDI、SaqAI、MseI、Tru1I或Tru9I，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶位點係IIS型限制酶之識別位點。在一些實施例中，IIS型限制酶係選自(但不限於) AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，初代模板不含所選擇的IIS型限制酶之識別位點。在一些實施例中，初代模板不含兩個或更多個所選擇的IIS型限制酶之識別位點。在一些實施例中，所選擇的IIS型限制酶係BsaI、BsmBI，或BsaI與BsmBI之組合。其他非限制性酶(例如，IIS型限制酶)包括例如AasI、Acc36I、AccB7I、AceIII、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlfI、AloI、Alw26I、AlwNI、AlwXI、AmaCSI、ApaBI、ApyPI、AquII、AquIII、AquIV、ArsI、Asp10HII、BasI、Bbr7I、BbvI、BbvII、Bbv16II、Bce4I、Bce83I、BceCI、BcgI、Bco5I、Bco116I、BcoKI、BflI、BfuAI、BglI、Bli736I、Bme585I、BpiI、BplI、BpmI、BpuAI、BpuJI、BpuSI、BsAJI、Bsc4I、Bsc91I、Bsc107I、BscAI、Bse3DI、BseGI、BseKI、BseLI、BseMI、BseMII、BseXI、BseZI、BsgI、BsiYI、BslI、BslFI、Bso31I、BsoMAI、Bsp24I、Bsp423I、BspBS31I、BspCNI、BspD6I、BsplS4I、BspKT5I、BspLU11III、BspMI、BspST5I、BspTNI、BspTS514I、BspWI、Bst6I、Bst12I、Bst19I、Bst71I、BstAPI、BstBS32I、BstFZ438I、BstGZ53I、BstHZ55I、BstlZ316I、BstMAI、BstMWI、BstOZ616I、BstPZ418I、BstTS5I、BstV1I、BstV2I、BstXI、CaiI、CjeI、CjePI、CspCI、CstMI、DraIII、DrdI、DseDI、Eam1104I、Eco31I、Eco5TI、EcoA4I、Eco57MI、EcoO44I、EcoP15I、Esp3I、Esp1396I、GsuI、HaeIV、Hin4I、Hpy178III、Hpy188III、HpyF10VI、LweI、MmeI、MwoI、PfiBI、PfiMI、PhaI、PpiI、PsrI、RleAI、SdiI、SfiI、SmuI、Sth132I、StsI、TaqII、TspDTI、Tsp8EI、TspGWI、Tth111II、Van91I或VpaK11AI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物。在一些實施例中，由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物。在一些實施例中，限制酶可熱不活化。在一些實施例中，限制酶識別具有4-8個鹼基對，例如4個鹼基對、5個鹼基對、6個鹼基對、7個鹼基對或8個鹼基對之延伸部分。在一些實施例中，限制酶不為EcoRI。

在一些實施例中，將初代模板分成複數個次基因體片段(例如，本文中所描述之複數個次基因體片段)，其中該複數個次基因體片段中之各者包含獨有的5'突出物及獨有的3'突出物(例如，本文中所描述之獨有的5'及3'突出物)，且其中該等次基因體片段能夠基於一個次基因體片段中之5'突出物與另一次基因體片段中之3'突出物或一個次基因體片段中之3'突出物與另一次基因體片段中之5'突出物之互補性而有序地組裝，如上文所描述。

在一些實施例中，該複數個次基因體片段中之各者之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係由限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)進行之片段之裂解產生。在一些實施例中，限制酶係選自(但不限於)以下之II型限制酶：Eco31I、BsaI Bso31I、BspTNI、Esp3I、BpiI、Alw26I、BsmAI、BstMAI、BmsI、BhaI、BscAI、BscUI、BsmNI、BspST5I、Bst19I、CjeP338II、LweI、Mva1312II、PhaI、SfaNI、LguI、BspQI、PsiSI、SapI、Alw44I、ApaLI、VneI、BamHI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlpI、Bsp1720I、CeIII、Bsp119I、AsuII、Bpu14I、BspT104I、BstBI、Csp45I、NspV、SfuI、Bsp120I、PspOMI、Bsu15I、BanIII、Bsa29I、BseCI、BshVI、BspDI、BspXI、BsuTUI、ClaI、Cfr10I、Bse118I、BsrFI、BssAI、Cfr13I、AspS9I、BmgT120I、PspPI、Sau96I、Csp6I、AfaI、CviQI、RsaNI、Eam1104I、Bst6I、EarI、EcoO109I、DraII、EcoRI、Eco47I、AvaII、Bme18I、SinI、VpaK11BI、Eco52I、BseX3I、BstZI、EagI、EclXI、Eco81I、AxyI、Bse21I、Bsu36I、Eco88I、Ama87I、AvaI、BmeT110I、BsiHKCI、BsoBlm、Eco91I、BstEII、BstPI、EcoO65I、PspEI、Eco130I、BssT1I、EcoT14I、ErhI、StyI、Hin1I、AcyI、BsaHI、BssNI、BstACI、Hsp92I、AspLEI、BstHHI、CfoI、HinP1I、HspAI、HindIII、HpaII、BsiSI、HapII、Kpn2I、AccIII、Aor13HI、BseAI、Bsp13I、BspEI、MroI、MspI、BsiSI、HapII、MvaI、AjnI、BseBI、Bst2UI、BstNI、BstOI、Psp6I、PspGI、MluI、NcoI、Bsp19I、NdeI、FauNDI、NotI、CciNI、SalI、TaqI、XbaI、XhoI、BclI、CpoI、CspI、Rsr2I、RsrII、MunI、MfeI、Psp5II、PpuMI、PspPPI、Bsp143I、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Aim、HinfI、MboI、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Alm、BspTI、AfIII、BfrI、Bst98I、BstAFI、MspCI、Vha464I、Pfl23II、BsiWI、PspLI、Acc65I、Asp718I、VspI、AseI、PshBI、Bsp1407I、BsrGI、BstAUI、Psp1406I、AclI、NheI、AsuNHI、BmtI、Tru1I、MseI、Tru9I、BshNI、AccB1I、BanI、BspT107I、BseDI、BsaJI、BssECI、BfmI、BstSFI、SfcI、Bpu10I、BcuI、AhII、SpeI、PagI、CciI、BspHI、RcaI、TatI、XagI、BstENI、EcoNI、PsyI、AspI、PflFI、Tth111I、TasI、Sse9I、Tsp509I、TspEI、XapI、AcsI、ApoI、Bme1390I、BmrFI、BssKI、BstSCI、MspR9I、ScrFI、StyD4I、BseXI、BbvI、BstV1I、BshTI、AgeI、AsiGI、CspAI、PinAI、XmiI、AccI、FbII、NmuCI、Tsp45I、PsuI、BstX2I、BstYI、MfII、XhoII、XmaJI、AspA2I、AvrII、BinI、SatI、Fnu4HI、Fsp4HI、ItaI、BveI、Acc36I、BfuAI、BspMI、PfoI、FspBI、BfaI、MaeI、XspI、PfeI、TfiI、SsiI、AciI、BspACI、FaqI、BsiFI、BsmFI、HpyF3I、BstDEI、DdeI、SgsI、AscI、PalAI、CseI、HgaI、Lsp1109I、BbvI、BstV1I、CsiI、MabI、SexAI、PteI、BsePlm、BssHII、FokI、BstF5I、BtsCI、KflI、Sse1825I、SanDI、SaqAI、MseI、Tru1I或Tru9I，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，該複數個片段中之各者之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係由所選擇的IIS型限制酶進行之片段之裂解產生。在一些實施例中，IIS型限制酶係選自(但不限於) AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，IIS型限制酶係BsaI。在一些實施例中，IIS型限制酶係BsmBI。其他適用的非限制性限制酶(例如，IIS型限制酶)包括例如AasI、Acc36I、AccB7I、AceIII、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlfI、AloI、Alw26I、AlwNI、AlwXI、AmaCSI、ApaBI、ApyPI、AquII、AquIII、AquIV、ArsI、Asp10HII、BasI、Bbr7I、BbvI、BbvII、Bbv16II、Bce4I、Bce83I、BceCI、BcgI、Bco5I、Bco116I、BcoKI、BflI、BfuAI、BglI、Bli736I、Bme585I、BpiI、BplI、BpmI、BpuAI、BpuJI、BpuSI、BsAJI、Bsc4I、Bsc91I、Bsc107I、BscAI、Bse3DI、BseGI、BseKI、BseLI、BseMI、BseMII、BseXI、BseZI、BsgI、BsiYI、BslI、BslFI、Bso31I、BsoMAI、Bsp24I、Bsp423I、BspBS31I、BspCNI、BspD6I、BsplS4I、BspKT5I、BspLU11III、BspMI、BspST5I、BspTNI、BspTS514I、BspWI、Bst6I、Bst12I、Bst19I、Bst71I、BstAPI、BstBS32I、BstFZ438I、BstGZ53I、BstHZ55I、BstlZ316I、BstMAI、BstMWI、BstOZ616I、BstPZ418I、BstTS5I、BstV1I、BstV2I、BstXI、CaiI、CjeI、CjePI、CspCI、CstMI、DraIII、DrdI、DseDI、Eam1104I、Eco31I、Eco5TI、EcoA4I、Eco57MI、EcoO44I、EcoP15I、Esp3I、Esp1396I、GsuI、HaeIV、Hin4I、Hpy178III、Hpy188III、HpyF10VI、LweI、MmeI、MwoI、PfiBI、PfiMI、PhaI、PpiI、PsrI、RleAI、SdiI、SfiI、SmuI、Sth132I、StsI、TaqII、TspDTI、Tsp8EI、TspGWI、Tth111II、Van91I或VpaK11AI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶識別非連續位點，例如AasI、AccB7I、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlwNI、ApaBI、ArsI、Asp10HII、BaeI、BasI、Bce4I、BceCI、BcgI、BfiI、BglI、Bsc4I、Bsc107I、BseLI、BsiYI、BslI、BspWI、BstAPI、BstH255I、BstlZ316I、BstMWI、BstXI、CaiI、BraIII、DrdI、DseDI、HpyF10VI、PflBI、PflMI、SdiI、SfiI、Tsp8EI或Van91I，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物。在一些實施例中，由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物。在一些實施例中，限制酶可熱不活化。在一些實施例中，限制酶識別具有4-8個鹼基對，例如4個鹼基對、5個鹼基對、6個鹼基對、7個鹼基對或8個鹼基對之延伸部分。在一些實施例中，限制酶不為EcoRI。

在一些實施例中，將初代模板分成複數個次基因體片段(例如，本文中所描述之複數個次基因體片段)，其中該複數個次基因體片段中之各者能夠基於一個次基因體片段之5'端處的核苷酸序列(例如，桿狀病毒基因體序列)與另一次基因體片段之3'端處的核苷酸序列(例如，桿狀病毒基因體序列)之重疊而與該複數個次基因體片段中之另一者有序地組裝。在一些實施例中，兩個次基因體片段之間的核苷酸序列之重疊係4-50個(例如，4-45個、4-40個、4-35個、4-30個、4-25個、4-20個、4-15個、4-10個、10-50個、10-45個、10-40個、10-35個、10-30個、10-25個、10-20個、10-15個、15-50個、15-45個、15-40個、15-35個、15-30個、15-25個、15-20個、20-50個、20-45個、20-40個、20-35個、20-30個、20-25個、25-50個、25-45個、25-40個、25-35個、25-30個、30-50個、30-45個、30-40個、30-35個、35-50個、35-45個、35-40個、40-50個、40-45個)鹼基對，例如相鄰鹼基對。在一些實施例中，在由本文中所揭示之II型限制酶裂解之後，5'核酸外切酶產生對應於次基因體片段之間的重疊核苷酸序列之單股互補區，從而產生能夠彼此黏接之次基因體片段。在一些實施例中，經黏接之次基因體片段之間的空位係由DNA聚合酶填充。

在一些實施例中，各次基因體片段係維持在承載載體(例如，第一承載載體)中。在一些實施例中，空承載載體不具有所選擇的限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)之識別位點。在一些實施例中，次基因體片段係化學合成的。在一些實施例中，化學合成次基因體片段以在次基因體片段之5'端及3'端處皆包括所選擇的限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)之識別位點。在一些實施例中，次基因體片段係非模板化次基因體片段。在一些實施例中，各次基因體片段係鈍端接合至承載載體中。可使用任何將次基因體片段引入承載載體中之方法，只要當承載載體由所選擇的限制酶(例如，IIS型限制酶)消化時釋放具有獨有的5'突出物及獨有的3'突出物之次基因體片段，或當承載載體由所選擇的II型限制酶消化時釋放在5'及3'端具有5'突出物之次基因體片段即可。

在一些實施例中，藉由將次基因體片段進一步分成較小次片段(例如，本文中所描述之次片段)來產生能夠組裝至次基因體片段中之複數個次片段(例如，本文中所描述之複數個次片段)。

在一些實施例中，如本文中所描述，複數個次片段中之形成次基因體片段之各片段包含獨有的5'突出物及獨有的3'突出物(例如，本文中所描述之獨有的5'及3'突出物)，其中次片段能夠基於一個次片段中之5'突出物與另一次片段中之3'突出物之互補性而有序地組裝。

在一些實施例中，該複數個次片段中之各者之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係由限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)進行之片段之裂解產生。在一些實施例中，限制酶係選自(但不限於)以下之II型限制酶：Eco31I、BsaI Bso31I、BspTNI、Esp3I、BpiI、Alw26I、BsmAI、BstMAI、BmsI、BhaI、BscAI、BscUI、BsmNI、BspST5I、Bst19I、CjeP338II、LweI、Mva1312II、PhaI、SfaNI、LguI、BspQI、PsiSI、SapI、Alw44I、ApaLI、VneI、BamHI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlpI、Bsp1720I、CeIII、Bsp119I、AsuII、Bpu14I、BspT104I、BstBI、Csp45I、NspV、SfuI、Bsp120I、PspOMI、Bsu15I、BanIII、Bsa29I、BseCI、BshVI、BspDI、BspXI、BsuTUI、ClaI、Cfr10I、Bse118I、BsrFI、BssAI、Cfr13I、AspS9I、BmgT120I、PspPI、Sau96I、Csp6I、AfaI、CviQI、RsaNI、Eam1104I、Bst6I、EarI、EcoO109I、DraII、EcoRI、Eco47I、AvaII、Bme18I、SinI、VpaK11BI、Eco52I、BseX3I、BstZI、EagI、EclXI、Eco81I、AxyI、Bse21I、Bsu36I、Eco88I、Ama87I、AvaI、BmeT110I、BsiHKCI、BsoBlm、Eco91I、BstEII、BstPI、EcoO65I、PspEI、Eco130I、BssT1I、EcoT14I、ErhI、StyI、Hin1I、AcyI、BsaHI、BssNI、BstACI、Hsp92I、AspLEI、BstHHI、CfoI、HinP1I、HspAI、HindIII、HpaII、BsiSI、HapII、Kpn2I、AccIII、Aor13HI、BseAI、Bsp13I、BspEI、MroI、MspI、BsiSI、HapII、MvaI、AjnI、BseBI、Bst2UI、BstNI、BstOI、Psp6I、PspGI、MluI、NcoI、Bsp19I、NdeI、FauNDI、NotI、CciNI、SalI、TaqI、XbaI、XhoI、BclI、CpoI、CspI、Rsr2I、RsrII、MunI、MfeI、Psp5II、PpuMI、PspPPI、Bsp143I、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Aim、HinfI、MboI、BfuCI、BssMI、BstKTI、BstMBI、DpnII、Kzo9I、NdeII、Sau3Alm、BspTI、AfIII、BfrI、Bst98I、BstAFI、MspCI、Vha464I、Pfl23II、BsiWI、PspLI、Acc65I、Asp718I、VspI、AseI、PshBI、Bsp1407I、BsrGI、BstAUI、Psp1406I、AclI、NheI、AsuNHI、BmtI、Tru1I、MseI、Tru9I、BshNI、AccB1I、BanI、BspT107I、BseDI、BsaJI、BssECI、BfmI、BstSFI、SfcI、Bpu10I、BcuI、AhII、SpeI、PagI、CciI、BspHI、RcaI、TatI、XagI、BstENI、EcoNI、PsyI、AspI、PflFI、Tth111I、TasI、Sse9I、Tsp509I、TspEI、XapI、AcsI、ApoI、Bme1390I、BmrFI、BssKI、BstSCI、MspR9I、ScrFI、StyD4I、BseXI、BbvI、BstV1I、BshTI、AgeI、AsiGI、CspAI、PinAI、XmiI、AccI、FbII、NmuCI、Tsp45I、PsuI、BstX2I、BstYI、MfII、XhoII、XmaJI、AspA2I、AvrII、BinI、SatI、Fnu4HI、Fsp4HI、ItaI、BveI、Acc36I、BfuAI、BspMI、PfoI、FspBI、BfaI、MaeI、XspI、PfeI、TfiI、SsiI、AciI、BspACI、FaqI、BsiFI、BsmFI、HpyF3I、BstDEI、DdeI、SgsI、AscI、PalAI、CseI、HgaI、Lsp1109I、BbvI、BstV1I、CsiI、MabI、SexAI、PteI、BsePlm、BssHII、FokI、BstF5I、BtsCI、KflI、Sse1825I、SanDI、SaqAI、MseI、Tru1I或Tru9I，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI、SfaNI、AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係選自：AbsI、Acc65I、AgeI、AgsI、ArsI、AscI、AsiGI、AsiSI、Asp718I、AspA2I、AsuNHI、AvrII、Alw44I、AxyI、BamHI、BclI、BcnI、BglII、Bpu1102I、BlnI、BmtI、BsaI、Bse21I、BshTI、BsmBI、Bso31I、BspOI、BspTNI、BstENI、Bsp119I、Bsp120I、Bsu15I、Bsu36I、CciNI、Cfr13I、Csp6I、Cfr9I、CspAI、Ecl136II、Eco31I、Eco53kI、Eco81I、Eco91I、Eco52I、EcoICRI、EcoNI、EcoRI、Esp3I、FseI、Hin6I、HindIII、HpaII、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、KpnI、Kpn2I、LmnI、LpnPI、MauBI、MspI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PalAI、PI-PspI、PI-SceI、PinAI、Psp124BI、RgaI、RigI、SacI、SalI、SbfI、SdaI、SfaAI、SgfI、SgsI、SmaI、SrfI、Sse8387I、SstI、TaqI、TspMI、XagI、XbaI、XhoI、XmaI、XmaCI、XmaJI、MunI、HinfI、BspTI、Pfl23II、VspI、Bsp1407I、Psp1406I、Tru1I、Bpu10I、BcuI、PagI、BshTI、XmaJI、PfoI、SgsI、PteI、KflI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI、AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AgeI、AvrII、BamHI、NheI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶係AscI、NotI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，該複數個次片段中之各者之獨有的5'突出物及獨有的3'突出物係由所選擇的IIS型限制酶進行之片段之裂解產生。在一些實施例中，IIS型限制酶係選自(但不限於) AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，用於產生次片段之限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)與用於產生次基因體片段之限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)不同。在一些實施例中，用於產生次基因體片段及次片段之限制酶係IIS型限制酶。在一些實施例中，用於產生次片段之IIS型限制酶係BsaI或BsmBI，且用於產生次片段之IIS型限制酶係BsaI或BsmBI，其中用於產生次片段及次基因體片段之IIS型限制酶係不同的。其他適用的非限制性限制酶(例如，IIS型限制酶)包括例如AasI、Acc36I、AccB7I、AceIII、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlfI、AloI、Alw26I、AlwNI、AlwXI、AmaCSI、ApaBI、ApyPI、AquII、AquIII、AquIV、ArsI、Asp10HII、BasI、Bbr7I、BbvI、BbvII、Bbv16II、Bce4I、Bce83I、BceCI、BcgI、Bco5I、Bco116I、BcoKI、BflI、BfuAI、BglI、Bli736I、Bme585I、BpiI、BplI、BpmI、BpuAI、BpuJI、BpuSI、BsAJI、Bsc4I、Bsc91I、Bsc107I、BscAI、Bse3DI、BseGI、BseKI、BseLI、BseMI、BseMII、BseXI、BseZI、BsgI、BsiYI、BslI、BslFI、Bso31I、BsoMAI、Bsp24I、Bsp423I、BspBS31I、BspCNI、BspD6I、BsplS4I、BspKT5I、BspLU11III、BspMI、BspST5I、BspTNI、BspTS514I、BspWI、Bst6I、Bst12I、Bst19I、Bst71I、BstAPI、BstBS32I、BstFZ438I、BstGZ53I、BstHZ55I、BstlZ316I、BstMAI、BstMWI、BstOZ616I、BstPZ418I、BstTS5I、BstV1I、BstV2I、BstXI、CaiI、CjeI、CjePI、CspCI、CstMI、DraIII、DrdI、DseDI、Eam1104I、Eco31I、Eco5TI、EcoA4I、Eco57MI、EcoO44I、EcoP15I、Esp3I、Esp1396I、GsuI、HaeIV、Hin4I、Hpy178III、Hpy188III、HpyF10VI、LweI、MmeI、MwoI、PfiBI、PfiMI、PhaI、PpiI、PsrI、RleAI、SdiI、SfiI、SmuI、Sth132I、StsI、TaqII、TspDTI、Tsp8EI、TspGWI、Tth111II、Van91I或VpaK11AI，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶識別非連續位點，例如AasI、AccB7I、AcpII、AdeI、AfiI、AjuI、AlwNI、ApaBI、ArsI、Asp10HII、BaeI、BasI、Bce4I、BceCI、BcgI、BfiI、BglI、Bsc4I、Bsc107I、BseLI、BsiYI、BslI、BspWI、BstAPI、BstH255I、BstlZ316I、BstMWI、BstXI、CaiI、BraIII、DrdI、DseDI、HpyF10VI、PflBI、PflMI、SdiI、SfiI、Tsp8EI或Van91I，或任何前述限制酶之同裂酶。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生5'突出物。在一些實施例中，由限制酶進行之裂解在其識別位點中之5'突出物外部產生至少一個或至少兩個(例如，一個或兩個)鹼基對。在一些實施例中，限制酶在由限制酶裂解時能夠產生3'突出物。在一些實施例中，限制酶可熱不活化。在一些實施例中，限制酶識別具有4-8個鹼基對，例如4個鹼基對、5個鹼基對、6個鹼基對、7個鹼基對或8個鹼基對之延伸部分。在一些實施例中，限制酶不為EcoRI。

在一些實施例中，複數個次片段中之形成次基因體片段之各片段包含5'端處之核苷酸序列(例如，桿狀病毒基因體序列)，其與該複數個次片段中之另一者之3'端處的核苷酸序列(例如，桿狀病毒基因體序列)重疊(例如，同源)，其中重疊區域中之核苷酸序列係一對次片段所獨有的，其中該等次片段能夠藉由例如Gibson Assembly™而有序地組裝，如本文中所描述。在一些實施例中，兩個片段之間的核苷酸序列之重疊係4-50個(例如，4-45個、4-40個、4-35個、4-30個、4-25個、4-20個、4-15個、4-10個、10-50個、10-45個、10-40個、10-35個、10-30個、10-25個、10-20個、10-15個、15-50個、15-45個、15-40個、15-35個、15-30個、15-25個、15-20個、20-50個、20-45個、20-40個、20-35個、20-30個、20-25個、25-50個、25-45個、25-40個、25-35個、25-30個、30-50個、30-45個、30-40個、30-35個、35-50個、35-45個、35-40個、40-50個、40-45個)鹼基對，例如相鄰鹼基對。在一些實施例中，在由本文中所揭示之II型限制酶裂解之後，5'核酸外切酶產生對應於片段之間的重疊核苷酸序列之單股互補區，從而產生能夠彼此黏接之片段。在一些實施例中，經黏接之片段之間的空位係由DNA聚合酶填充。

在一些實施例中，各次片段係維持在第二承載載體中。在一些實施例中，空第二承載載體不具有用於產生次片段之所選擇的限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)之識別位點。在一些實施例中，次片段係化學合成的。在一些實施例中，化學合成次片段以在次片段之5'端及3'端處皆包括所選擇的限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)之識別位點。在一些實施例中，次片段係非模板化次片段。在一些實施例中，各次片段係鈍端接合至第二承載載體中。可使用任何將次片段引入第二承載載體中之方法，只要當第二承載載體由所選擇的限制酶，例如II型限制酶(例如，IIS型限制酶)消化時釋放具有獨有的5'及3'突出物之次片段即可。

在一些實施例中，第二承載載體提供針對抗生素之抗性，該抗性未由用於次基因體片段之第一承載載體提供。在一些實施例中，用於次基因體片段之第一承載載體提供針對卡那黴素之抗性，且用於次片段之第二承載載體提供針對安比西林之抗性。在一些實施例中，用於次基因體片段之第一承載載體提供針對安比西林之抗性，且用於次片段之第二承載載體提供針對卡那黴素之抗性。細胞

本文中亦提供細胞，其包含本文中所描述之一或多個次片段、一或多個次基因體片段、一或多個次基因體區域、變異型桿狀病毒基因體、桿狀病毒表現構築體及/或BAC或其變異體。在一些實施例中，細胞係昆蟲細胞。在一些實施例中，細胞係哺乳動物細胞。在一些實施例中，細胞係細菌細胞。

在一些實施例中，包含本文中所描述之一或多個次片段、一或多個次基因體片段、一或多個次基因體區域、變異型桿狀病毒基因體、桿狀病毒表現構築體及/或BAC或其變異體之昆蟲細胞係草地黏蟲細胞，諸如Sf9細胞或Sf21細胞。在一些實施例中，昆蟲細胞係粉紋夜蛾細胞。

在一些實施例中，包含本文中所描述之一或多個次片段、一或多個次基因體片段、一或多個次基因體區域、變異型桿狀病毒基因體、桿狀病毒表現構築體及/或BAC或其變異體之哺乳動物細胞係選自A549、WEH1、3T3、10T1/2、BHK、KB、MDCK、COS 1、COS 7、C127、CHO、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、HEK293、HEK293T (293T)、Saos、C2C12、L細胞、HT1080、HepG2、3T3細胞或其變異型品系。在一些實施例中，包含本文中所描述之一或多個次片段、一或多個次基因體片段、一或多個次基因體區域、變異型桿狀病毒基因體、桿狀病毒表現構築體及/或BAC或其變異體之哺乳動物細胞係衍生自哺乳動物之初代纖維母細胞、肝細胞及肌纖維母細胞。

在一些實施例中，包含本文中所描述之一或多個次片段、一或多個次基因體片段、一或多個次基因體區域、變異型桿狀病毒基因體、桿狀病毒表現構築體及/或BAC或其變異體之細菌細胞係選自埃希氏桿菌屬( Escherichia)、芽孢桿菌屬( Bacillus)、假單胞菌屬( Pseudomonas)或沙門氏菌屬( Salmonella)之細菌物種。在一些實施例中，細菌物種係大腸桿菌。組合物

本文中提供組合物，其包含本文中所描述之一或多個次片段、複數個次片段、一或多個次基因體片段、複數個次基因體片段、變異型桿狀病毒基因體、桿狀病毒表現構築體及/或細菌人工染色體以及載劑。在一些實施例中，組合物包含適合的儲存緩衝液，例如基於磷酸鹽之緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)，或基於Tris之緩衝液，諸如TE緩衝液(Tris-EDTA緩衝液)。

在一些實施例中，組合物包含一或多種桿狀病毒，其包含本文中所描述之一或多個次片段、複數個次片段、一或多個次基因體片段、複數個次基因體片段、變異型桿狀病毒基因體、桿狀病毒表現構築體及/或細菌人工染色體以及載劑。在一些實施例中，桿狀病毒儲存於昆蟲細胞培養基，諸如Sf-900 ^TMII SFM中。套組

本文中提供套組，其包含本文中所描述之一或多個次片段、複數個次片段、一或多個次基因體片段、複數個次基因體片段、變異型桿狀病毒基因體、桿狀病毒表現構築體及/或細菌人工染色體以及使用說明書。在一些實施例中，套組包含複數個承載載體，其包含本文中所描述之複數個次基因體片段。在一些實施例中，套組進一步包含複數個第二承載載體，其包含本文中所描述之複數個次片段。在一些實施例中，套組包含一或多個(例如，1、2、3、4、5、1-5、1-4、1-3、1-2、2-5、2-4、2-3、3-5或4-5個)限制酶，例如II型限制酶，例如IIS型限制酶。

在一些實施例中，套組包含空第一承載載體(例如，插入共價連接之次片段或用於維持次基因體片段之空第一承載載體)。在一些實施例中，套組包含空第二承載載體(例如，可插入次片段，例如用於維持次片段之空第二承載載體)。在一些實施例中，套組包含空目的載體(例如，插入共價連接之次基因體片段之空目的載體，諸如BAC)。

使用說明書可例如提供關於基於本文中所描述之方法來修飾桿狀病毒基因體之指導。

本文中所提供之套組亦可包含桿狀病毒及使用說明書，該桿狀病毒包含本文中所描述之一或多個次片段、複數個次片段、一或多個次基因體片段、複數個次基因體片段、變異型桿狀病毒基因體、桿狀病毒表現構築體及/或BAC。 腺相關病毒

本文中所描述之桿狀病毒表現構築體(例如，包含變異型桿狀病毒基因體之桿狀病毒表現構築體)或桿狀病毒表現構築體之組合可用於例如產生腺相關病毒(AAV)粒子。

腺相關病毒(AAV)為細小病毒科(Parvoviridae family)之小型無包膜二十面體衣殼病毒，其特徵在於單股DNA病毒基因體。細小病毒科病毒由兩個亞科組成：感染脊椎動物之細小病毒亞科(Parvovirinae)，及感染無脊椎動物之濃核病毒亞科(Densovirinae)。細小病毒科包括能夠在脊椎動物宿主中複製之依賴病毒屬(Dependovirus genus)，包括AAV，該等宿主包括(但不限於)人類、靈長類動物、牛、犬、馬及綿羊物種。

細小病毒及細小病毒科中之其他成員通常描述於Kenneth I. Berns, 「Parvoviridae: The Viruses and Their Replication」, 第69章, Fields Virology (第3版, 1996)中，其內容以全文引用之方式併入本文中。

已證實AAV由於其相對簡單的結構、其在不整合至宿主基因體中及不複製之情況下感染廣泛細胞(包括靜止及分裂細胞)之能力及其相對良性的免疫原性概況而適用作生物學工具。病毒之基因體可經操作以含有用於組裝功能性重組病毒或病毒粒子之最少組分，該功能性重組病毒或病毒粒子負載有所需有效負載或經工程改造以靶向特定組織且表現或遞送所需有效負載。

在一些實施例中，本文中所描述之次基因體片段或次片段、本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體及/或本文中所描述之桿狀病毒表現構築體中之一或多者包含編碼一或多種腺相關病毒(AAV)基因之核苷酸序列。

在一些實施例中，在本文中所描述之次基因體片段或次片段、本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體及/或本文中所描述之桿狀病毒表現構築體中之一或多者中提供產生AAV粒子所需的AAV基因。舉例而言，在一些實施例中，編碼一或多個Rep蛋白質之核酸序列可存在於一或多個本文中所描述之桿狀病毒表現構築體中，且編碼VP衣殼蛋白質及有效負載之核酸序列可存在於一或多個本文中所描述之獨立的桿狀病毒表現構築體中。

在一些實施例中，本文中所描述之次基因體片段或次片段、本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體及/或本文中所描述之桿狀病毒表現構築體中之一或多者編碼AAV Rep蛋白質。在一些實施例中，本文中所描述之次基因體片段或次片段、本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體及/或本文中所描述之桿狀病毒表現構築體中之一或多者編碼Rep40、Rep52、Rep68、Rep78或其組合。在一些實施例中，本文中所描述之次基因體片段或次片段、本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體及/或本文中所描述之桿狀病毒表現構築體中之一或多者編碼Rep52蛋白質及/或Rep78蛋白質。

在一些實施例中，本文中所描述之次基因體片段或次片段、本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體及/或本文中所描述之桿狀病毒表現構築體中之一或多者編碼AAV衣殼蛋白質，例如VP1蛋白質、VP2蛋白質、VP3蛋白質或其組合。

在一些實施例中，本文中所描述之次基因體片段或次片段、本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體及/或本文中所描述之桿狀病毒表現構築體中之一或多者編碼AAV1衣殼蛋白質、AAV2衣殼、AAV3衣殼蛋白質、AAV4衣殼蛋白質、AAV5衣殼蛋白質、AAV6衣殼蛋白質、AAV8衣殼蛋白質、AAV9衣殼蛋白質、AAVrh10衣殼蛋白質或其變異體。在一些實施例中，本文中所描述之次基因體片段或次片段、本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體及/或本文中所描述之桿狀病毒表現構築體中之一或多者編碼AAV5衣殼蛋白質或其變異體，或AAV9衣殼蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之次基因體片段或次片段、本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體及/或本文中所描述之桿狀病毒表現構築體中之一或多者編碼有效負載。在一些實施例中，經編碼之有效負載係選自治療性蛋白質或其功能性變異體；抗體或抗體片段；酶；基因編輯系統之組分；RNAi試劑(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)；或其組合。

因此本文中亦提供桿狀病毒表現構築體或變異型桿狀病毒基因體，其包含本文中所描述之AAV表現構築體及/或AAV有效負載構築體。AAV表現構築體及/或AAV有效負載構築體可形成AAV病毒產生系統之一部分。在一些實施例中，AAV病毒產生系統包含AAV病毒產生細胞，諸如昆蟲細胞(例如，Sf9、Sf21)。

在一些實施例中，使用本文中所描述之桿狀病毒表現構築體或桿狀病毒表現構築體之組合產生之桿狀病毒產生能夠感染細胞(例如，昆蟲細胞，諸如Sf9)之AAV粒子。

本文中亦提供用於在AAV病毒產生細胞中產生重組AAV (rAAV)粒子之方法，該方法包含：(i)提供包含桿狀病毒表現構築體或變異型桿狀病毒基因體之AAV病毒產生系統，該桿狀病毒表現構築體或變異型桿狀病毒基因體包含本文中所描述之AAV表現構築體及有效負載構築體，其中AAV表現構築體包含一或多個VP編碼區，該一或多個VP編碼區包含一或多個編碼VP1、VP2及VP3衣殼蛋白質之核苷酸序列；(ii)將AAV病毒產生系統轉染至AAV病毒產生細胞中；(iii)將AAV病毒產生細胞暴露於允許AAV病毒產生細胞將AAV表現構築體及AAV有效負載構築體處理成rAAV粒子之條件；及視情況地，(iv)收集來自AAV病毒產生細胞，例如昆蟲細胞，諸如Sf9細胞或Sf21細胞之rAAV粒子。亦提供藉由該方法產生之rAAV粒子，以及包含該等rAAV粒子及醫藥學上可接受之載劑或醫藥學上可接受之賦形劑之醫藥組合物。

在一些實施例中，包含例如本文中所描述之AAV表現構築體及AAV有效負載構築體的桿狀病毒表現構築體或桿狀病毒表現構築體之組合所產生之AAV粒子之效價係由參考桿狀病毒構築體或參考桿狀病毒構築體之組合(例如，與本文中所描述之桿狀病毒表現構築體之組合相比，在相同位置(例如，桿狀病毒基因體之相同或類似基因座)包含AAV基因編碼區域之參考桿狀病毒構築體或參考桿狀病毒構築體之組合)產生之AAV粒子之效價之至少80% (例如，至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少105%、至少110%、80-120%、80-110%、80-100%、80-90%、90-120%、90-110%、90-100%、100-120%、100-110%或110-120%)。在一些實施例中，使用qPCR測定AAV效價，例如實例中所描述。

其他與使用本文中所描述之桿狀病毒表現構築體或桿狀病毒表現構築體之組合產生之AAV粒子相關之實施例提供於以下章節中。 AAV 血清型及衣殼

在一些實施例中，使用本文中所描述之桿狀病毒表現構築體或桿狀病毒表現構築體之組合產生之AAV粒子包含來自任何天然或重組AAV血清型之衣殼多肽或其變異體。AAV血清型之不同之處可在於諸如(但不限於)封裝、向性、轉導及免疫原性概況之特徵。不希望受理論約束，咸信AAV衣殼蛋白質可調節，例如引導AAV粒子針對特定組織之向性。

在一些實施例中，AAV衣殼多肽在靜脈內投藥之後實現血腦障壁滲透。在一些實施例中，AAV衣殼多肽在聚焦式超音波(FUS) (例如，與微泡之靜脈內投藥聯合(FUS-MB))或MRI引導之FUS聯合靜脈內投藥之後實現血腦障壁滲透。在一些實施例中，AAV衣殼多肽實現對大腦區域、脊髓區域或肌肉區域之分佈增加。在一些實施例中，用於AAV VP1衣殼蛋白質之轉譯之起始密碼子係CTG、TTG或GTG，如美國專利案第US8163543號中所描述，其內容以全文引用之方式併入本文中。

本發明係關於由衣殼(Cap)基因編碼之結構性衣殼蛋白質(包括VP1、VP2及VP3)。此等衣殼蛋白質形成病毒載體，諸如AAV之外部蛋白質結構性外殼(例如，衣殼)。由Cap聚核苷酸合成之VP衣殼蛋白質通常包括甲硫胺酸作為肽序列中之第一胺基酸(Met1)，其與相應的Cap核苷酸序列中之起始密碼子(AUG或ATG)相關聯。然而，通常使第一甲硫胺酸(Met1)殘基或大體上任何第一胺基酸(AA1)在多肽合成之後或期間藉由諸如Met-胺基肽酶之蛋白質處理酶裂解。此「Met/AA-削減」過程通常與多肽序列中之第二胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸等)之相應乙醯化相關。Met-削減通常藉由VP1及VP3衣殼蛋白質進行，但亦可藉由VP2衣殼蛋白質進行。

在Met/AA-削減不完全之情況下，可產生包含病毒性衣殼之一或多種(一種、兩種或三種) VP衣殼蛋白質之混合物，其中一些可包括Met1/AA1胺基酸(Met+/AA+)，且其中一些可由於Met/AA-削減而不具有Met1/AA1胺基酸(Met-/AA-)。關於衣殼蛋白質中之Met/AA-削減之進一步論述，參見Jin等人, Direct Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Analysis for Complete Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus Capsid Proteins. Hum Gene Ther Methods. 2017年10月, 28(5):255-267；Hwang等人, N-Terminal Acetylation of Cellular Proteins Creates Specific Degradation Signals. Science. 2010年2月19日. 327(5968): 973-977；其內容各自以全文引用之方式併入本文中。

根據本發明，所提及之衣殼蛋白質不限於經削減的(Met-/AA-)或未經削減的(Met+/AA+)，且在上下文中可指獨立的衣殼蛋白質、包含病毒性衣殼之衣殼蛋白質之混合物及/或編碼、描述、生產或產生本發明之衣殼蛋白質之聚核苷酸序列(或其片段)。直接提及之衣殼蛋白質或衣殼多肽(諸如VP1、VP2或VP2)亦可包含包括Met1/AA1胺基酸(Met+/AA+)之VP衣殼蛋白質，以及由於Met/AA-削減而不具有Met1/AA1胺基酸(Met-/AA-)之相應的VP衣殼蛋白質。

此外根據本發明，對分別包含或編碼一或多種包括Met1/AA1胺基酸(Met+/AA+)之衣殼蛋白質之特異性SEQ ID NO (無論蛋白質或核酸)之參考應理解為教示不具有Met1/AA1胺基酸之VP衣殼蛋白質，如在評述序列時，易於顯而易見任何僅不具有第一個所列舉之胺基酸(無論Met1/AA1)之序列。

作為非限制性實例，對長度為736個胺基酸且包括由AUG/ATG起始密碼子編碼之「Met1」胺基酸(Met+)的VP1多肽序列之參考亦可理解為教示長度為735個胺基酸且不包括736胺基酸型Met+序列之「Met1」胺基酸(Met-)之VP1多肽序列。作為第二非限制性實例，對長度為736個胺基酸且包括由任何NNN起始密碼子編碼之「AA1」胺基酸(AA1+)的VP1多肽序列之參考亦可理解為教示長度為735個胺基酸且不包括736胺基酸型AA1+序列之「AA1」胺基酸(AA1-)之VP1多肽序列。

對由VP衣殼蛋白質形成之病毒性衣殼之參考(諸如對特異性AAV衣殼血清型之參考)可合併有包括Met1/AA1胺基酸(Met+/AA1+)之VP衣殼蛋白質、由於Met/AA1-削減而不具有Met1/AA1胺基酸(Met-/AA1-)之相應的VP衣殼蛋白質以及其組合(Met+/AA1+及Met-/AA1-)。

作為非限制性實例，AAV衣殼血清型可包括VP1 (Met+/AA1+)、VP1 (Met-/AA1-)或VP1 (Met+/AA1+)及VP1 (Met-/AA1-)之組合。AAV衣殼血清型亦可包括VP3 (Met+/AA1+)、VP3 (Met-/AA1-)或VP3 (Met+/AA1+)及VP3 (Met-/AA1-)之組合；且亦可包括類似的視情況選用之VP2 (Met+/AA1)及VP2 (Met-/AA1-)之組合。 AAV 粒子之病毒基因體

野生型AAV病毒基因體係長度為約5,000個核苷酸(nt)的線性、單股DNA (ssDNA)分子。反向末端重複序列(ITR)傳統上在5'及3'端處對病毒基因體加帽，提供病毒基因體之複製起點。儘管不希望受理論約束，但AAV病毒基因體通常包含兩個ITR序列。此等ITR在ssDNA之5'及3'端處具有由自互補區(145 nt於野生型AAV中)定義之特徵性T形髮夾結構，形成能量上穩定的雙股區。雙股髮夾結構包含多種功能，包含(但不限於)藉由充當宿主病毒複製細胞之內源DNA聚合酶複合物之引子來充當DNA複製之起點。

野生型AAV病毒基因體進一步包含用於兩個開放閱讀框架之核苷酸序列，一個用於四種非結構性Rep蛋白質(Rep78、Rep68、Rep52、Rep40，由Rep基因編碼)，且一個用於三種衣殼或結構性蛋白質(VP1、VP2、VP3，由衣殼基因或Cap基因編碼)。Rep蛋白質對於複製及封裝而言係重要的，而衣殼蛋白質經組裝以產生AAV之蛋白質外殼，或AAV衣殼。替代性剪接及替代性起始密碼子及啟動子引起自單一開放閱讀框架產生四種不同Rep蛋白質及自單一開放閱讀框架產生三種衣殼蛋白質。儘管其根據AAV血清型變化，但作為非限制性實例，對於AAV9/hu.14 (US 7,906,111之SEQ ID NO:123，其關於AAV9/hu.14之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突)，VP1係指胺基酸1-736，VP2係指胺基酸138-736，以及VP3係指胺基酸203-736。換言之，VP1為全長衣殼序列，而VP2及VP3為整體之較短組分。因此，VP3區中之序列的變化亦為VP1及VP2之變化，然而，VP3相比於親本序列之差異百分比將最大，因為其為三者中之最短序列。儘管本文中關於胺基酸序列進行描述，但可類似地描述編碼此等蛋白質之核酸序列。三種衣殼蛋白質組裝在一起以產生AAV衣殼蛋白質。儘管不希望受理論約束，但AAV衣殼蛋白質通常包含莫耳比為1:1:10之VP1:VP2:VP3。如本文中所使用，「AAV血清型」主要由AAV衣殼定義。在一些情況下，ITR亦由AAV血清型(例如AAV2/9)特定地描述。

在一些實施例中，野生型AAV病毒基因體可經修飾以用包含具有至少一個ITR區域之有效負載區域之核酸序列置換rep/cap序列。通常，在重組AAV病毒基因體中，存在兩個ITR區域。在一些實施例中，在產生期間以反式提供rep/cap序列以產生AAV粒子。

除經編碼之異源有效負載以外，在一些實施例中，AAV載體可包含任何天然存在及/或重組AAV血清型核苷酸序列或變異體之全部或一部分病毒基因體。AAV變異體可在核酸(基因體或衣殼)及胺基酸層面(衣殼)具有顯著同源序列，以產生在實體及功能上大體等效的構築體，該等構築體藉由類似機制複製且藉由類似機制組裝。參見Chiorini等人, J. Vir. 71: 6823-33(1997)；Srivastava等人, J. Vir. 45:555-64 (1983)； Chiorini等人, J. Vir. 73:1309-1319 (1999)；Rutledge等人, J. Vir. 72:309-319 (1998)；及Wu等人, J. Vir. 74: 8635-47 (2000)，其與AAV變異體及等效物相關之內容各自以全文引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，本發明之AAV粒子、AAV基因體及/或有效負載以及其使用方法可如WO2017189963中所描述，該文獻關於AAV粒子、病毒基因體及/或有效負載之內容以全文引用之方式併入本文中。

本發明之AAV粒子可在包含熟習此項技術者顯而易見的此類調配物之任何變化形式之本發明的任何基因療法調配物中調配。本申請案中提及的「AAV粒子」、「AAV粒子調配物」及「經調配之AAV粒子」係指可經調配之AAV粒子及經調配之AAV粒子(均不受限制)。

在一些實施例中，AAV粒子係複製缺陷型重組AAV (rAAV)病毒粒子，其病毒基因體內不具有編碼功能性Rep及Cap蛋白質之序列。此等缺陷型AAV粒子可能不具有大部分或所有親本編碼序列，且基本上僅攜有一個或兩個用於遞送至細胞、組織、器官或生物體之AAV ITR序列及所關注的核酸(亦即，有效負載)。

在一些實施例中，AAV粒子之病毒基因體包含至少一個控制元件，其實現其中所編碼之編碼序列之複製、轉錄及轉譯。並非所有控制元件皆需要始終存在，只要編碼序列能夠在適合的宿主細胞中進行複製、轉錄及/或轉譯即可。表現控制元件之非限制性實例包含用於轉錄起始及/或終止之序列、啟動子及/或強化子序列、有效RNA處理信號(諸如剪接及多腺苷酸化信號)、使細胞質mRNA穩定之序列、增強轉譯功效之序列(例如Kozak共有序列)、增強蛋白質穩定性之序列，及/或增強蛋白質處理及/或分泌之序列。

在一些實施例中，用於治療劑及/或診斷學之AAV粒子包含已提取或減少至所關注的核酸有效負載或負荷之轉導所必需的最小組分之病毒。以此方式，AAV粒子經工程改造成為用於特異性遞送，同時不具有在野生型病毒中發現之有害複製及/或整合特性之運載工具。

在一些實施例中，AAV粒子可以重組方式且可基於腺相關病毒(AAV)親本或參考序列而產生。

除單股AAV病毒基因體(例如，ssAAV)以外，本發明亦提供自互補AAV (scAAV)病毒基因體。scAAV病毒基因體含有黏接在一起以形成雙股DNA之DNA股。藉由跳過第二股合成，scAAV細胞中實現快速表現。

在一些實施例中，本發明之AAV病毒基因體係scAAV。在一些實施例中，本發明之AAV病毒基因體係ssAAV。

用於產生及/或修飾AAV粒子之方法揭示於此項技術中，諸如假模式化AAV粒子(PCT專利公開案第WO200028004號；第WO200123001號；第WO2004112727號；第WO 2005005610號及第WO 2005072364號，其關於產生及/或修飾AAV粒子之內容各自以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突)。

在一些實施例中，AAV粒子經修飾以增強遞送效率。此類經修飾之AAV粒子可有效封裝且用於在高頻率及最小毒性下成功地感染目標細胞。在一些實施例中，根據美國公開案第US 20130195801號中所描述之方法來工程改造AAV粒子之衣殼，該公開案之與修飾AAV粒子以增強遞送效率之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。

在一些實施例中，AAV粒子包含編碼本發明之多肽或蛋白質且可引入哺乳動物細胞中之有效負載構築體及/或區域。在一些實施例中，AAV粒子包含編碼本發明之多肽或蛋白質且可引入昆蟲細胞中之有效負載構築體及/或區域。

在一些實施例中，使用AAV粒子將病毒基因體遞送至組織。在一些實施例中，使用包含AAV衣殼多肽之AAV粒子將病毒基因體遞送至組織或細胞。在一些實施例中，AAV粒子係重組AAV粒子。在一些實施例中，AAV粒子係經分離之AAV粒子。

在一些實施例中，病毒基因體編碼有效負載，諸如(但不限於)多肽(例如，治療性多肽)、抗體、酶、RNAi試劑及/或基因編輯系統之組分。在一個實施例中，使用本文中所描述之AAV粒子將有效負載遞送至CNS細胞。在另一實施例中，使用本文中所描述之AAV粒子將有效負載遞送至DRG細胞。在一些實施例中，使用本文中所描述之AAV粒子將有效負載遞送至肌肉，例如心臟肌肉之細胞。

在一些實施例中，包含AAV衣殼多肽之AAV粒子之病毒基因體包含核酸，其包含編碼有效負載之轉殖基因。在一些實施例中，病毒基因體包含反向末端重複序列(ITR)序列。在一些實施例中，病毒基因體包含兩個ITR序列，例如一個位於病毒基因體之5'端(例如，相對於經編碼之有效負載之5')且一個位於病毒基因體之3'端(例如，相對於經編碼之有效負載之3')。在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子之病毒基因體可包含調節元件(例如，啟動子)、非轉譯區(UTR)、miR結合位點、多腺苷酸化序列(polyA)、填充物或填充序列、內含子及/或連接子序列，例如用於增強轉殖基因表現。

在一些實施例中，選擇及/或工程改造病毒基因體組分以用於目標組織中之有效負載之表現。 病毒基因體組分 ： 反向末端重複序列 (ITR)

在一些實施例中，包含AAV衣殼多肽之AAV粒子包含病毒基因體，其包含ITR及編碼有效負載之轉殖基因。在一些實施例中，病毒基因體具有兩個ITR。在一些實施例中，兩個ITR在5'及3'端處側接編碼有效負載之核苷酸序列。在一些實施例中，ITR充當包含用於複製之識別位點之複製起點。在一些實施例中，ITR包含可互補及對稱地配置之序列區域。在一些實施例中，如本文中所描述之併入病毒基因體中之ITR可包含天然存在之聚核苷酸序列或以重組方式衍生之聚核苷酸序列。

在一些實施例中，ITR可與選自任何已知的血清型(例如，AAV2、AAV5、AAV9或其變異體)之衣殼多肽具有相同的血清型。在一些實施例中，ITR具有與衣殼不同的血清型。在一個實施例中，病毒基因體包含兩個ITR序列區域，其中ITR彼此具有相同血清型。在另一實施例中，病毒基因體包含兩個ITR序列區域，其中ITR具有不同血清型。非限制性實例包括零個、一個或兩個具有與衣殼相同之血清型的ITR。在一個實施例中，AAV粒子之病毒基因體之兩個ITR皆係AAV2 ITR。

獨立地，各ITR之長度可為約100至約150個核苷酸。ITR之長度可為約100-105個核苷酸、106-110個核苷酸、111-115個核苷酸、116-120個核苷酸、121-125個核苷酸、126-130個核苷酸、131-135個核苷酸、136-140個核苷酸、141-145個核苷酸或146-150個核苷酸。在一個實施例中，ITR之長度係140-142個核苷酸。ITR長度之非限制性實例係長度為102、105、130、140、141、142、145個核苷酸。 病毒基因體組分 ： 啟動子

在一個實施例中，病毒基因體之有效負載區域包含至少一個用於增強有效負載目標特異性及表現之元件(參見例如Powell等人, Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015；其內容以全文引用之方式併入本文中)。用於增強有效負載目標特異性及表現之元件之非限制性實例包括啟動子、內源miRNA、轉錄後調節元件(PRE)、多腺苷酸化(PolyA)信號序列及上游強化子(USE)、CMV強化子及內含子。

在一些實施例中，包含AAV衣殼蛋白質之AAV粒子包含病毒基因體，其包含有包含編碼有效負載之轉殖基因之核酸，其中轉殖基因可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，啟動子係物種特異性啟動子、誘導型啟動子、組織特異性或細胞週期特異性(Parr等人, Nat. Med.3:1145-9 (1997)；其內容以全文引用之方式併入本文中)。

在一些實施例中，啟動子可為天然存在或非天然存在的。啟動子之非限制性實例包括來自病毒、植物、哺乳動物或人類之啟動子。在一些實施例中，啟動子可為來自人類細胞或系統之啟動子。在一些實施例中，啟動子可為截短型或突變型，例如啟動子變異體。

在一些實施例中，啟動子係廣泛啟動子，例如能夠實現多個組織中之表現。在一些實施例中，啟動子係人類延長因子1α-子單元(EF1α)啟動子、巨細胞病毒(CMV)即刻早期強化子及/或啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子及其衍生物CAG、β葡糖苷酸酶(GUSB)啟動子或泛蛋白C (UBC)啟動子。在一些實施例中，啟動子係細胞或組織特異性啟動子，例如能夠實現中樞或周邊神經系統之組織或細胞、其中之區域(例如，額葉皮質)及/或其中之細胞子集(例如，興奮性神經元)中之表現。在一些實施例中，啟動子係細胞類型特異性啟動子，其能夠實現興奮性神經元(例如，麩胺酸能)、抑制性神經元(例如，GABA-ergic)、交感性或副交感性神經系統之神經元、感官神經元、背根節神經元、運動神經元或神經系統之支持細胞(諸如小神經膠質細胞、星狀細胞、寡樹突細胞及/或許旺細胞(Schwann cell))中之有效負載之表現。

在一些實施例中，啟動子係肝臟啟動子(例如，hAAT、TBG)、骨骼肌特異性啟動子(例如，肌間線蛋白、MCK、C512)、B細胞啟動子、單核球啟動子、白血球啟動子、巨噬細胞啟動子、胰臟腺泡細胞啟動子、內皮細胞啟動子、肺組織啟動子及/或心臟或心血管啟動子(例如，αMHC、cTnT及CMV-MLC2k)。

在一些實施例中，啟動子係用於中樞神經系統之細胞或組織中之有效負載表現之組織特異性啟動子。在一些實施例中，啟動子係突觸蛋白(Syn)啟動子、麩胺酸囊泡轉運體(VGLUT)啟動子、囊泡GABA轉運體(VGAT)啟動子、小白蛋白(PV)啟動子、鈉通道Na _v1.8啟動子、酪胺酸羥化酶(TH)啟動子、膽鹼乙醯基轉移酶(ChaT)啟動子、甲基-CpG結合蛋白質2 (MeCP2)啟動子、Ca ²⁺/鈣調蛋白依賴性蛋白質激酶II (CaMKII)啟動子、代謝型麩胺酸受體2 (mGluR2)啟動子、神經纖毛輕(NFL)或重(NFH)啟動子、神經元特異性烯醇酶(NSE)啟動子、β-血球蛋白袖珍基因nβ2啟動子、前腦啡肽原(PPE)啟動子、腦啡肽(Enk)啟動子及興奮性胺基酸運輸蛋白2 (EAAT2)啟動子。在一些實施例中，啟動子係能夠實現星狀細胞中之表現之細胞類型特異性啟動子，例如膠質原纖維酸性蛋白質(GFAP)啟動子及EAAT2啟動子。在一些實施例中，啟動子係能夠實現寡樹突神經膠細胞中之表現之細胞類型特異性啟動子，例如髓磷脂鹼性蛋白(MBP)啟動子。

在一些實施例中，啟動子係GFAP啟動子。在一些實施例中，啟動子係突觸蛋白(syn或syn1)啟動子或其片段。

在一些實施例中，啟動子包含胰島素啟動子或其片段。

在一些實施例中，本文中所描述之病毒基因體之啟動子(例如，包含於本文中所描述之包含AAV衣殼變異體之AAV粒子內)包含EF-1α啟動子或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之次基因體區域、次區域、次基因體片段、次片段、複數個片段、AAV表現構築體、變異型桿狀病毒基因體及桿狀病毒表現構築體包含異源核苷酸序列，例如所關注的序列(例如，編碼Rep編碼區、一或多個Rep蛋白質、VP編碼區、一或多個VP蛋白質及/或有效負載之核苷酸序列)，其可操作地連接至一或多個啟動子。在一些實施例中，異源核苷酸序列可操作地連接至第一啟動子(例如，桿狀病毒早期啟動子或桿狀病毒早期-晚期啟動子)及/或第二啟動子(例如，桿狀病毒晚期啟動子或桿狀病毒極晚期啟動子)。在一些實施例中，異源核苷酸序列可操作地連接至第一啟動子及第二啟動子。在一些實施例中，第一及/或第二啟動子係選自桿狀病毒啟動子、病毒啟動子、昆蟲病毒啟動子、非昆蟲病毒啟動子、脊椎動物病毒啟動子、來自一或多個物種之包括病毒及非病毒元件之嵌合啟動子、合成啟動子或其變異體。在一些實施例中，第一及/或第二啟動子係選自polh啟動子、p10啟動子、ctx啟動子、gp64啟動子、IE啟動子、IE-1啟動子、p6.9啟動子、Dmhsp70啟動子、Hsp70啟動子、p5啟動子、p19啟動子、p35啟動子、p40啟動子或其變異體，例如功能性片段。

在一些實施例中，第一及/或第二啟動子係選自桿狀病毒早期啟動子、桿狀病毒晚期啟動子、桿狀病毒早期-晚期啟動子或桿狀病毒極晚期啟動子。

在一些實施例中，第一及/或第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子(例如，gp64啟動子)。在一些實施例中，第一或第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子(例如，polh啟動子)。在一些實施例中，(a)第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子，(b)第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子，(c)第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子，(d)第一啟動子係桿狀病毒早期至晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子，(e)第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子，(f)第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子，(g)第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子，(h)第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子，(i)第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子，(j)第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子，(k)第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子，(l)第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子，(m)第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子，(n)第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子，或(o)第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子。在一些實施例中，第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子(例如，gp64啟動子)且第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子(例如，polh啟動子)。在一些實施例中，第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子。

在一些實施例中，(a)桿狀病毒早期啟動子係選自：lef3啟動子、dbp啟動子、p35啟動子、orf82啟動子、get啟動子、orf81啟動子、orf122啟動子、pk-2啟動子、orf55啟動子、etl啟動子、hcf-1啟動子、etm啟動子、lef-2啟動子、lef-6啟動子、orf84啟動子、orf118啟動子或orf111啟動子，(b)桿狀病毒早期-晚期啟動子係選自：lef2啟動子、orf13啟動子、orf23啟動子、pkip啟動子、v-fgf啟動子、pp31啟動子、odv-e66啟動子、orf74啟動子、orf79啟動子、orf82啟動子、p15啟動子、cg30啟動子、解螺旋酶啟動子、he65啟動子、orf114啟動子、pk-2啟動子、gp64啟動子、gp16啟動子、alk-exo啟動子、p35啟動子、me53啟動子或ie0啟動子，(c)桿狀病毒晚期啟動子係選自：ptpase啟動子、Ac-bro啟動子、ctx啟動子、orf5啟動子、orf19啟動子、orf20啟動子、sod啟動子、HisP啟動子、orf34啟動子、v-ubi啟動子、orf38啟動子、orf43啟動子、orf44啟動子、orf56啟動子、orf59啟動子、orf60啟動子或fp-25k啟動子，及/或(d)桿狀病毒極晚期啟動子係選自p10啟動子或polh啟動子。

在一些實施例中，第一及/或第二啟動子包含TATA盒模體及/或CAGT模體。在一些實施例中，第一及/或第二啟動子包含TAAG模體(例如，ATAAG核苷酸序列)。在一些實施例中，第一及/或第二啟動子包含TATA盒模體及TAAG模體。在一些實施例中，第一或第二啟動子包含VLF-1之結合位點。

在一些實施例中，第一或第二啟動子係gp64啟動子(例如，OpMNPV gp64啟動子)。在一些實施例中，第一或第二啟動子係polh啟動子(例如，OpMNPV polh啟動子或AcMNPV polh啟動子)。在一些實施例中，第一啟動子係gp64啟動子且第二啟動子係polh啟動子。在一些實施例中，第一啟動子係polh啟動子且第二啟動子係gp64啟動子。在一些實施例中，所關注的序列可操作地連接至第一啟動子(其係桿狀病毒早期-晚期啟動子)及第二啟動子(其係桿狀病毒極晚期啟動子)，例如gp64啟動子及polh啟動子，視情況其中該Rep編碼區位於同源重複序列區hr5之下游。

在一些實施例中，第一啟動子及第二啟動子係相同的。在一些實施例中，第一啟動子及第二啟動子係不同的。在一些實施例中，第一啟動子及第二啟動子各自為polh啟動子。

在一些實施例中，所關注的序列可操作地連接至gp64啟動子，該啟動子包含SEQ ID NO:217之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。

在一些實施例中，所關注的序列可操作地連接至polh啟動子，該啟動子包含之核苷酸序列SEQ ID NO:167或220之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:167或220包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:167或220包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。

在一些實施例中，所關注的序列可操作地連接至第一啟動子及第二啟動子，該第一啟動子及第二啟動子包含SEQ ID NO:221之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:221包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:221包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。 病毒基因體組分 ： 非轉譯區 (UTR)

在一些實施例中，基因之野生型非轉譯區(UTR)經轉錄，但不經轉譯。通常，5' UTR起始於轉錄起始位點且結束於起始密碼子，且3' UTR緊隨終止密碼子之後起始且持續直至轉錄終止信號為止。

通常存在於特定目標器官(例如CNS組織、肌肉或DRG)之經充分表現之基因中之構件可經工程改造至UTR中以增強穩定性及蛋白質產生。作為非限制性實例，通常表現於腦中之來自mRNA之5' UTR (例如杭丁頓蛋白(huntingtin))可用於本文中所描述之AAV粒子之病毒基因體中以增強神經元細胞或中樞神經系統之其他細胞中的表現。

雖然不希望受理論束縛，野生型5'非轉譯區(UTR)包括在轉譯起始中起作用之特徵。Kozak序列通常包括於5' UTR中，通常已知Kozak序列與核糖體用於起始多種基因之轉譯之過程相關。Kozak序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG，其中R為起始密碼子上游之嘌呤(腺嘌呤或鳥嘌呤)三鹼基(ATG)，繼之為另一個『G』。

在一個實施例中，病毒基因體中之5'UTR包括Kozak序列。

在一個實施例中，病毒基因體中之5'UTR不包括Kozak序列。

儘管不希望受理論約束，但已知野生型3' UTR中嵌有腺苷及尿苷之延伸部分。此等富含AU之標記在具有高轉化率之基因中尤其普遍。富含AU之元件(ARE)基於其序列特徵及功能特性可分成三類(Chen等人, 1995，其內容以全文引用之方式併入本文中)：I類ARE，諸如(但不限於) c-Myc及MyoD，在富含U之區域內含有若干個分散之AUUUA模體之複本。II類ARE，諸如(但不限於) GM-CSF及TNF-a，具有兩個或更多個重疊的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚體。III類ARES，諸如(但不限於) c-Jun及成肌素，定義不太明確。此等富含U之區域不含AUUUA模體。已知大部分結合於ARE之蛋白質使信使去穩定化，而已證實ELAV家族成員(最顯著地，HuR)可提高mRNA之穩定性。HuR與所有三種類別之ARE結合。將HuR特異性結合位點工程改造至核酸分子之3' UTR中將引起HuR結合，且因此引起活體內訊息之穩定。

3' UTR富含AU之元件(ARE)之引入、移除或修飾可用於調節聚核苷酸之穩定性。在工程改造特異性聚核苷酸(例如，病毒基因體之有效負載區域)時，可引入ARE之一或多個複本以降低聚核苷酸之穩定性，且藉此減少所得蛋白質之轉譯且降低其產量。類似地，可鑑別ARE且將其移除或使其突變以提高細胞內穩定性，且因此增加所得蛋白質之轉譯及產生。

在一個實施例中，病毒基因體之3' UTR可包括用於模板化添加poly-A尾區之寡(dT)序列。

在一個實施例中，病毒基因體可包括至少一個miRNA種子、結合位點或完全序列。微型RNA (或miRNA或miR)為19-25核苷酸型非編碼RNA，其結合於核酸目標之位點且藉由降低核酸分子穩定性或藉由抑制轉譯來下調基因表現。在一些實施例中，微型RNA序列包含種子區域，例如成熟微型RNA之位置2-8之區域中之序列，其與核酸之miRNA目標序列具有沃森-克里克序列(Watson-Crick sequence)完全或部分互補性。

在一個實施例中，病毒基因體可經工程改造以包括、改變或移除至少一個miRNA結合位點、完全序列或種子區域。

來自此項技術中已知之任何基因的任何UTR可併入AAV粒子之病毒基因體中。此等UTR或其一部分可以與基因中相同之定向置放，其中該等UTR係選自該基因，或其定向或位置可變化。在一個實施例中，用於AAV粒子之病毒基因體中之UTR可經倒轉、縮短、延長或製成具有此項技術中已知的一或多個其他5' UTR或3' UTR。如本文中所使用，在與UTR相關時，術語「變化」意謂UTR相對於參考序列已以某種方式改變。舉例而言，3'或5' UTR可如上文所教示藉由定向或位置的變化而相對於野生型或原生UTR發生改變，或可藉由包含其他核苷酸、核苷酸之缺失、核苷酸之調換或轉位而發生改變。

在一個實施例中，AAV粒子之病毒基因體包含至少一個人工UTR，其不為野生型UTR之變異體。

在一個實施例中，AAV粒子之病毒基因體包含已選自轉錄物家族的UTR，該等轉錄物的蛋白質具有共同的功能、結構、特點或特性。 病毒基因體組分：多腺苷酸化序列

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子(例如，包含AAV衣殼多肽之AAV粒子)之病毒基因體包含多腺苷酸化序列。在一些實施例中，AAV粒子(例如，包含AAV衣殼多肽之AAV粒子)之病毒基因體包含編碼有效負載之核苷酸序列之3'端與3'ITR之5'端之間的多腺苷酸化序列。 病毒基因體組分 ： 內含子

在一些實施例中，如本文中所描述之AAV粒子(例如，包含AAV衣殼多肽之AAV粒子)之病毒基因體包含用於增強有效負載目標特異性及表現之元件(參見例如Powell等人, Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, Discov. Med, 2015, 19(102): 49-57；其內容以全文引用之方式併入本文中)，諸如內含子。內含子之非限制性實例包括MVM (67-97 bp)、F.IX截短型內含子1 (300 bp)、β-血球蛋白SD/免疫球蛋白重鏈剪接受體(250 bp)、腺病毒剪接供體/免疫球蛋白剪接受體(500 bp)、SV40晚期剪接供體/剪接受體(19S/16S) (180 bp)及雜交腺病毒剪接供體/IgG剪接受體(230 bp)。 病毒基因體組分 ： 填充序列

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子(例如，包含AAV衣殼多肽之AAV粒子)之病毒基因體包含用於改良封裝效率及表現之元件，諸如填充物或填充序列。填充序列之非限制性實例包括白蛋白及/或α-1抗胰蛋白酶。可操縱任何已知的病毒、哺乳動物或植物序列以用作填充序列。

在一個實施例中，填充物或填充序列之長度可為約100-3500個核苷酸。填充序列之長度可為約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900或3000個核苷酸。 病毒基因體組分 ： miRNA

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子(例如，包含AAV衣殼多肽之AAV粒子)之病毒基因體包含編碼miRNA以減少有效負載在組織或細胞，例如DRG (背根節)或其他神經節之神經元，諸如交感性或副交感性神經系統之神經元中之表現之序列。在一些實施例中，例如miR183、miR182及/或miR96之miRNA可在病毒基因體中經編碼以調節，例如減少病毒基因體在DRG神經元中之表現。作為另一非限制性實例，miR-122 miRNA可在病毒基因體中經編碼以調節，例如減少病毒基因體在肝臟中之表現。在一些實施例中，例如miR-142-3p之miRNA可在病毒基因體中經編碼以調節，例如減少病毒基因體在包括例如免疫細胞(例如抗原呈現細胞或APC，包括樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞及B淋巴球)之造血譜系之細胞或組織中的表現。在一些實施例中，miRNA，例如miR-1可在病毒基因體中經編碼以調節，例如減少病毒基因體在心臟之細胞或組織中之表現。 病毒基因體組分 ： miR 結合位點

本文中所揭示之AAV病毒粒子之組織或細胞特異性表現可藉由引入組織或細胞特異性調節序列，例如啟動子、強化子、微型RNA結合位點(例如去靶向位點)來增強。不希望受理論約束，咸信經編碼之miR結合位點可基於對應內源性微型RNA (miRNA)或對應受控外源性miRNA在組織或細胞，例如非靶向細胞或組織中之表現來調節，例如防止、遏制或另外抑制所關注的基因在本文中所揭示之病毒基因體上的表現。在一些實施例中，miR結合位點調節，例如減少由本文中所描述之AAV粒子之病毒基因體編碼之有效負載在表現相應的mRNA之細胞或組織中的表現。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子之病毒基因體包含編碼微型RNA結合位點，例如去靶向位點之核苷酸序列。在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子之病毒基因體包含編碼miR結合位點、微型RNA結合位點系列(miR BS)或其反向補體之核苷酸序列。

在一些實施例中，編碼miR結合位點系列或miR結合位點之核苷酸序列位於病毒基因體之3'-UTR區域(例如，相對於編碼有效負載之核苷酸序列之3'，例如位於polyA序列之前)、位於病毒基因體之5'-UTR區域(例如，相對於編碼有效負載之核苷酸序列之5')，或其兩者。

在一些實施例中，經編碼之miR結合位點系列包含miR結合位點(miR BS)之至少1-5個複本，例如至少1-3、2-4、3-5、1、2、3、4、5個或更多個複本。在一些實施例中，所有複本係相同的，例如包含相同的miR結合位點。在一些實施例中，經編碼之miR結合位點系列內之miR結合位點為連續的且不由間隔子隔開。在一些實施例中，經編碼之miR結合位點系列內之miR結合位點係由間隔子，例如非編碼序列隔開。在一些實施例中，以核苷酸計，間隔子之長度係約1至6個核苷酸或約5至10個核苷酸，例如約7-8個核苷酸在一些實施例中，間隔子編碼序列或其反向補體包含以下中之一或多者：(i) GGAT；(ii) CACGTG；(iii) GCATGC，或(i)-(iii)中之一或多者之重複序列。在一些實施例中，間隔子包含GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之核苷酸序列，或具有GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之至少一個、兩個或三個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過四個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列。

在一些實施例中，經編碼之miR結合位點系列包含miR結合位點(miR BS)之至少1-5個複本，例如至少1-3、2-4、3-5、1、2、3、4、5個或更多個複本。在一些實施例中，至少1、2、3、4、5個或所有複本係不同，例如包含不同的miR結合位點。在一些實施例中，經編碼之miR結合位點系列內之miR結合位點為連續的且不由間隔子隔開。在一些實施例中，經編碼之miR結合位點系列內之miR結合位點係由間隔子，例如非編碼序列隔開。在一些實施例中，間隔子之長度係約1至6個核苷酸或約5至10個核苷酸，例如約7-8個核苷酸在一些實施例中，間隔子包含以下中之一或多者：(i) GGAT；(ii) CACGTG；(iii) GCATGC，或(i)-(iii)中之一或多者之重複序列。在一些實施例中，間隔子包含GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之核苷酸序列，或具有GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之至少一個、兩個或三個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過四個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列。

在一些實施例中，經編碼之miR結合位點與宿主細胞中之miR係實質上一致的(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)。在一些實施例中，經編碼之miR結合位點相對於宿主細胞中之miR包含至少1、2、3、4或5個錯配或不超過6、7、8、9或10個錯配。在一些實施例中，錯配核苷酸係相鄰的。在一些實施例中，錯配核苷酸係不相鄰的。在一些實施例中，錯配核苷酸存在於miR結合位點之種子區域結合序列之外部，諸如存在於miR結合位點之一端或兩端。在一些實施例中，miR結合位點與宿主細胞中之miR係100%一致。

在一些實施例中，編碼miR結合位點之核苷酸序列與宿主細胞中之miR係實質上互補的(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%互補)。在一些實施例中，編碼miR結合位點之核苷酸序列之互補序列相對於宿主細胞中之miR包含至少1、2、3、4或5個錯配，或不超過6、7、8、9或10個錯配。在一些實施例中，錯配核苷酸係相鄰的。在一些實施例中，錯配核苷酸係不相鄰的。在一些實施例中，錯配核苷酸存在於miR結合位點之種子區域結合序列之外部，諸如存在於miR結合位點之一端或兩端。在一些實施例中，經編碼之miR結合位點與宿主細胞中之miR係100%互補的。

在一些實施例中，經編碼之miR結合位點或序列區域之長度係至少約10至約125個核苷酸，例如長度係至少約10至50個核苷酸、10至100個核苷酸、50至100個核苷酸、50至125個核苷酸或100至125個核苷酸。在一些實施例中，經編碼之miR結合位點或序列區之長度係至少約7至約28個核苷酸，例如長度係至少約8-28個核苷酸、7-28個核苷酸、8-18個核苷酸、12-28個核苷酸、20-26個核苷酸、22個核苷酸、24個核苷酸或26個核苷酸，且視情況包含至少一個與miRNA (例如，miR122、miR142、miR183或miR1)之種子序列互補(例如，完全或部分互補)之連續區域(例如，7或8個核苷酸)。

在一些實施例中，經編碼之miR結合位點與肝臟或肝細胞中之miR，諸如miR122互補(例如，完全或部分互補)。在一些實施例中，經編碼之miR結合位點或經編碼之miR結合位點系列包含miR122結合位點序列。在一些實施例中，經編碼之miR122結合位點包含ACAAACACCATTGTCACACTCCA (SEQ ID NO:2)之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:2至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性或具有至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過十個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列，例如其中修飾可引起經編碼之miR結合位點與相應的miRNA之間的錯配。在一些實施例中，病毒基因體包含經編碼之miR122結合位點，例如經編碼之miR122結合位點系列之至少2、3、4或5個複本，視情況其中經編碼之miR122結合位點系列包含以下之核苷酸序列：ACAAACACCATTGTCACACTCCACACAAACACCATTGTCACACTCCACACAAACACCATTGTCACACTCCA (SEQ ID NO:3)，或相對於SEQ ID NO:3具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性，或具有至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過十個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列，例如其中修飾可引起經編碼之miR結合位點與相應的miRNA之間的錯配。在一些實施例中，至少兩個經編碼之miR122結合位點係直接連接，例如在不存在間隔子之情況下。在其他實施例中，至少兩個經編碼之miR122結合位點係由長度為例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸之間隔子隔開，該間隔子位於兩個或更多個連續的經編碼之miR122結合位點序列之間。在實施例中，間隔子之長度係約1至6個核苷酸或約5至10個核苷酸，例如約7-8個。在一些實施例中，間隔子編碼序列或其反向補體包含以下中之一或多者：(i) GGAT；(ii) CACGTG；(iii) GCATGC，或(i)-(iii)中之一或多者之重複序列。在一些實施例中，在存在或不存在間隔子之情況下，經編碼之miR結合位點系列包含miR122結合位點之至少3-5個複本(例如，4個複本)，其中間隔子之長度係約1至6個核苷酸或約5至10個核苷酸，例如約7-8個核苷酸或約8個核苷酸。在一些實施例中，間隔子包含GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之核苷酸序列，或具有GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之至少一個、兩個或三個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過四個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列。

在一些實施例中，經編碼之miR結合位點與表現於心臟中之miR互補(例如，完全或部分互補)。在實施例中，經編碼之miR結合位點或經編碼之miR結合位點系列包含miR-1結合位點。在一些實施例中，經編碼之miR-1結合位點包含ATACATACTTCTTTACATTCCA (SEQ ID NO:4)之核苷酸序列、相對於SEQ ID NO:4具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性或具有至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過十個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列，例如其中修飾可引起經編碼之miR結合位點與相應的miRNA之間的錯配。在一些實施例中，病毒基因體包含經編碼之miR-1結合位點，例如經編碼之miR-1結合位點系列之至少2、3、4或5個複本。在一些實施例中，經編碼之miR-1結合位點之至少2、3、4或5個複本(例如，2或3個複本)係連續的(例如，不由間隔子隔開)或由間隔子隔開。在一些實施例中，間隔子之長度係約1至6個核苷酸或約5至10個核苷酸，例如約7-8個核苷酸或約8個核苷酸。在一些實施例中，間隔序列包含以下中之一或多者：(i) GGAT；(ii) CACGTG；(iii) GCATGC，或(i)-(iii)中之一或多者之重複序列。在一些實施例中，間隔子包含GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之核苷酸序列，或具有GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之至少一個、兩個或三個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過四個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列。

在一些實施例中，經編碼之miR結合位點與表現於造血譜系，包括免疫細胞(例如，抗原呈現細胞或APC，包括樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞及B-淋巴球)中之miR互補(例如，完全或部分互補)。在一些實施例中，與表現於造血譜系中之miR互補的經編碼之miR結合位點包含例如US 2018/0066279中所揭示之核苷酸序列，其內容以全文引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，經編碼之miR結合位點或經編碼之miR結合位點系列包含miR-142-3p結合位點序列。在一些實施例中，經編碼之miR-142-3p結合位點包含TCCATAAAGTAGGAAACACTACA (SEQ ID NO:5)之核苷酸序列、相對於SEQ ID NO:5具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性或具有至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過十個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列，例如其中修飾可引起經編碼之miR結合位點與相應的miRNA之間的錯配。在一些實施例中，病毒基因體包含經編碼之miR-142-3p結合位點，例如經編碼之miR-142-3p結合位點系列之至少2、3、4或5個複本。在一些實施例中，經編碼之miR-142-3p結合位點之至少2、3、4或5個複本(例如，2或3個複本)係連續的(例如，不由間隔子隔開)或由間隔子隔開。在一些實施例中，間隔子之長度係約1至6個核苷酸或約5至10個核苷酸，例如約7-8個核苷酸或約8個核苷酸。在一些實施例中，間隔序列包含以下中之一或多者：(i) GGAT；(ii) CACGTG；(iii) GCATGC，或(i)-(iii)中之一或多者之重複序列。在一些實施例中，間隔子包含GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之核苷酸序列，或具有GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之至少一個、兩個或三個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過四個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列。

在一些實施例中，經編碼之miR結合位點與表現於DRG (背根節)神經元中之miR，例如miR183、miR182及/或miR96結合位點互補(例如，完全互補或部分互補)。在一些實施例中，與表現於DRG神經元中之miR互補的miR結合位點包含例如WO2020/132455中所揭示之核苷酸序列，其內容以全文引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，經編碼之miR結合位點或經編碼之miR結合位點系列包含miR183結合位點序列。在一些實施例中，經編碼之miR183結合位點包含AGTGAATTCTACCA GTGCCATA (SEQ ID NO:6)之核苷酸序列，或相對於SEQ ID NO:6具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性或具有至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過十個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列，例如其中修飾可引起經編碼之miR結合位點與相應的miRNA之間的錯配。在一些實施例中，與種子序列互補之序列對應於經編碼之miR-183結合位點序列中之加雙下劃線的部分。在一些實施例中，病毒基因體包含經編碼之miR183結合位點，例如經編碼之miR183結合位點之至少2、3、4或5個複本(例如，至少2或3個複本)。在一些實施例中，經編碼之miR183結合位點之至少2、3、4或5個複本(例如，2或3個複本)係連續的(例如，不由間隔子隔開)或由間隔子隔開。在一些實施例中，間隔子之長度係約1至6個核苷酸或約5至10個核苷酸，例如約7-8個核苷酸或約8個核苷酸。在一些實施例中，間隔子包含GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之核苷酸序列，或具有GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之至少一個、兩個或三個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過四個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列。在一些實施例中，間隔序列包含以下中之一或多者：(i) GGAT；(ii) CACGTG；(iii) GCATGC，或(i)-(iii)中之一或多者之重複序列。

在一些實施例中，經編碼之miR結合位點或經編碼之miR結合位點系列包含miR182結合位點序列。在一些實施例中，經編碼之miR182結合位點包含AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA (SEQ ID NO:7)之核苷酸序列、相對於SEQ ID NO:7具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性或具有至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過十個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列，例如其中修飾可引起經編碼之miR結合位點與相應的miRNA之間的錯配。在一些實施例中，病毒基因體包含經編碼之miR182結合位點，例如經編碼之miR182結合位點系列之至少2、3、4或5個複本。在一些實施例中，經編碼之miR182結合位點之至少2、3、4或5個複本(例如，2或3個複本)係連續的(例如，不由間隔子隔開)或由間隔子隔開。在一些實施例中，間隔子之長度係約1至6個核苷酸或約5至10個核苷酸，例如約7-8個核苷酸或約8個核苷酸。在一些實施例中，間隔子包含GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之核苷酸序列，或具有GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之至少一個、兩個或三個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過四個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列。在一些實施例中，間隔序列包含以下中之一或多者：(i) GGAT；(ii) CACGTG；(iii) GCATGC，或(i)-(iii)中之一或多者之重複序列。

在一些實施例中，經編碼之miR結合位點或經編碼之miR結合位點系列包含miR96結合位點序列。在一些實施例中，經編碼之miR96結合位點包含AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA (SEQ ID NO:8)之核苷酸序列、相對於SEQ ID NO:8具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性或具有至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過十個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列，例如其中修飾可引起經編碼之miR結合位點與相應的miRNA之間的錯配。在一些實施例中，病毒基因體包含經編碼之miR96結合位點，例如經編碼之miR96結合位點系列之至少2、3、4或5個複本。在一些實施例中，經編碼之miR96結合位點之至少2、3、4或5個複本(例如，2或3個複本)係連續的(例如，不由間隔子隔開)或由間隔子隔開。在一些實施例中，間隔子之長度係約1至6個核苷酸或約5至10個核苷酸，例如約7-8個核苷酸或約8個核苷酸。在一些實施例中，間隔子包含GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之核苷酸序列，或具有GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之至少一個、兩個或三個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過四個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列。在一些實施例中，間隔序列包含以下中之一或多者：(i) GGAT；(ii) CACGTG；(iii) GCATGC，或(i)-(iii)中之一或多者之重複序列。

在一些實施例中，經編碼之miR結合位點系列包含miR122結合位點、miR-1、miR142結合位點、miR183結合位點、miR182結合位點、miR 96結合位點或其組合。在一些實施例中，經編碼之miR結合位點系列包含miR122結合位點、miR142結合位點、miR183結合位點、miR182結合位點、miR 96結合位點或其組合之至少2、3、4或5個複本。在一些實施例中，至少兩個經編碼之miR結合位點係直接連接，例如在不存在間隔子之情況下。在其他實施例中，至少兩個經編碼之miR結合位點係由長度為例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸之間隔子隔開，該間隔子位於兩個或更多個連續的經編碼之miR結合位點序列之間。在實施例中，間隔子之長度係至少約5至10個核苷酸，例如約7-8個核苷酸或約8個核苷酸。在一些實施例中，間隔子編碼序列或其反向補體包含以下中之一或多者：(i) GGAT；(ii) CACGTG；(iii) GCATGC，或(i)-(iii)中之一或多者之重複序列。在一些實施例中，間隔子包含GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之核苷酸序列，或具有GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之至少一個、兩個或三個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過四個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列。

在一些實施例中，經編碼之miR結合位點系列包含miR-1、miR122結合位點、miR142結合位點、miR183結合位點、miR182結合位點、miR96結合位點中之至少兩者、三者、四者、五者或全部之組合的至少2-5個複本(例如，2或3個複本)，其中該系列內之各miR結合位點係連續的(例如，不由間隔子隔開)或由間隔子隔開。在一些實施例中，間隔子之長度係約1至6個核苷酸或約5至10個核苷酸，例如約7-8個核苷酸或約8個核苷酸。在一些實施例中，間隔序列包含以下中之一或多者：(i) GGAT；(ii) CACGTG；(iii) GCATGC，或(i)-(iii)中之一或多者之重複序列。在一些實施例中，間隔子包含GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之核苷酸序列，或具有GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之至少一個、兩個或三個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過四個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列。

在一些實施例中，經編碼之miR結合位點系列miR-122結合位點及miR-1結合位點之組合之至少2-5個複本(例如，2或3個複本)，其中該系列內之各miR結合位點係連續的(例如，不由間隔子隔開)或由間隔子隔開。在一些實施例中，間隔子之長度係約1至6個核苷酸或約5至10個核苷酸，例如約7-8個核苷酸或約8個核苷酸。在一些實施例中，間隔序列包含以下中之一或多者：(i) GGAT；(ii) CACGTG；(iii) GCATGC，或(i)-(iii)中之一或多者之重複序列。在一些實施例中，間隔子包含GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之核苷酸序列，或具有GATAGTTA (SEQ ID NO:1)之至少一個、兩個或三個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過四個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列。 基因體尺寸

在一個實施例中，本文中所描述之AAV粒子(例如，包含AAV衣殼多肽之AAV粒子)可包含單股或雙股病毒基因體。病毒基因體之尺寸可為小型、中等、大型或最大尺寸。如上文所描述，病毒基因體可包含啟動子及polyA尾區。

在一個實施例中，病毒基因體係小型單股病毒基因體。小型單股病毒基因體之尺寸可為2.1至3.5 kb，諸如(但不限於)尺寸係約2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4及3.5 kb。

在一個實施例中，病毒基因體可為小型雙股病毒基因體。小型雙股病毒基因體之尺寸可為1.3至1.7 kb，諸如(但不限於)尺寸係約1.3、1.4、1.5、1.6及1.7 kb。

在一個實施例中，病毒基因體可為中型單股病毒基因體。中型單股病毒基因體之尺寸可為3.6至4.3 kb，諸如(但不限於)尺寸係約3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2及4.3 kb。

在一個實施例中，病毒基因體可為中型雙股病毒基因體。中型雙股病毒基因體之尺寸可為1.8至2.1 kb，諸如(但不限於)尺寸係約1.8、1.9、2.0及2.1 kb。

在一個實施例中，病毒基因體可為大型單股病毒基因體。大型單股病毒基因體之尺寸可為4.4至6.0 kb，諸如(但不限於)尺寸係約4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9及6.0 kb。

在一個實施例中，病毒基因體可為大型雙股病毒基因體。大型雙股病毒基因體之尺寸可為2.2至3.0 kb，諸如(但不限於)尺寸係約2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9及3.0 kb。 有效負載

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子(例如，包含AAV衣殼多肽之AAV粒子)包含病毒基因體，其包含編碼有效負載之核酸。在一些實施例中，經編碼之有效負載係RNAi試劑或多肽。本發明之有效負載可為(但不限於)肽、多肽、蛋白質、抗體、RNAi試劑等。

在一些實施例中，編碼有效負載之核苷酸序列可包含編碼及非編碼核酸序列之組合。在一些實施例中，編碼有效負載之核苷酸序列可編碼一個編碼或非編碼RNA。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如包含AAV衣殼多肽(例如AAV衣殼變異體)之AAV粒子包含編碼有效負載之核酸。在一些實施例中，經編碼之有效負載包含治療性蛋白質、抗體、酶、基因體編輯系統之一或多種組分及/或RNAi試劑(例如dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)。在一些實施例中，經編碼之有效負載調節，例如增加或減少例如細胞或組織中之基因、mRNA、蛋白質或其組合之存在、含量及/或活性。多肽

在一些實施例中，包含本文中所描述之AAV衣殼多肽之AAV粒子的經編碼之有效負載包含多肽、蛋白質或肽，例如本文中所描述之多肽、蛋白質或肽。編碼有效負載之核酸可編碼任何已知的基因及/或其重組版本之產物。在一些實施例中，編碼有效負載之核酸可編碼脂蛋白元E (APOE)之至少一個對偶基因，諸如(但不限於) ApoE2、ApoE3及/或ApoE4。在一個實施例中，編碼有效負載之核酸編碼ApoE2 (cys112、cys158)蛋白質或其片段或變異體。在一個實施例中，編碼有效負載之核酸編碼ApoE3 (cys112、arg158)蛋白質或其片段或變異體。在一個實施例中，編碼有效負載之核酸編碼ApoE4 (arg112、arg158)。作為另一非限制性實例經編碼之有效負載包含芳族L-胺基酸脫羧酶(AADC)蛋白質。作為另一非限制性實例，經編碼之有效負載包含抗體或其片段。作為另一非限制性實例，經編碼之有效負載包含人類運動神經元存活因子(SMN) 1或SMN2蛋白質，或其片段或變體。作為另一非限制性實例，經編碼之有效負載區域包含葡糖腦苷脂酶(GBA1)蛋白質或其片段或變異體。作為另一非限制性實例，經編碼之有效負載包含顆粒蛋白前驅體或顆粒蛋白前體(progranulin；GRN)蛋白質或其片段或變異體。作為另一非限制性實例，經編碼之有效負載包含天冬醯轉移酶(ASPA)蛋白質或其片段或變異體。作為另一非限制性實例，經編碼之有效負載包含三肽基肽酶I (CLN2)蛋白質或其片段或變異體。作為另一非限制性實例，經編碼之有效負載包含β-半乳糖苷酶(GLB1)蛋白質或其片段或變異體。作為另一非限制性實例，經編碼之有效負載包含N-磺基葡萄胺糖磺基水解酶(SGSH)蛋白質或其片段或變異體。作為另一非限制性實例，經編碼之有效負載包含N-乙醯基-α-胺基葡糖苷酶(NAGLU)蛋白質或其片段或變異體。作為另一非限制性實例，經編碼之有效負載包含艾杜糖醛(iduronate) 2-硫酸酯酶(IDS)蛋白質或其片段或變異體。作為另一非限制性實例，經編碼之有效負載包含細胞內膽固醇轉運體(NPC1)蛋白質或其片段或變異體。作為另一非限制性實例，經編碼之有效負載包含巨軸突蛋白(GAN)蛋白質或其片段或變異體。本文中所描述之編碼多肽之AAV病毒基因體可適用於人類疾病、病毒、感染、獸醫學應用之領域及多種活體內及活體外環境。

由本文中所描述之病毒基因體編碼之有效負載多肽之胺基酸序列可以整個多肽、複數個多肽或多肽之片段形式轉譯，該等多肽或片段可獨立地由一或多個核酸、核酸之片段或前述中之任一者之變異體編碼。 抗體及抗體結合片段

在一些實施例中，本文中所描述之包含AAV衣殼變異型之AAV粒子之經編碼之有效負載包含抗體或抗體結合片段。在一些實施例中，抗體可為完全抗體、片段或其任何功能性變異體。作為非限制性實例，抗體可為原生抗體(例如具有兩個重鏈及兩個輕鏈)、重鏈可變區、輕鏈可變區、重鏈恆定區、輕鏈恆定區、Fab、Fab'、F(ab') ₂、Fv或scFv片段、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體、多特異性抗體、胞內抗體、一或多個重鏈互補決定區(CDR)、一或多個輕鏈CDR、雙特異性抗體、單株抗體、多株抗體、人源化抗體、抗體模擬物、抗體變異體、微型化抗體、單功能抗體、最大抗體及/或嵌合抗原受體。經編碼之抗體或抗體結合片段可適用於治療神經疾病、神經退化性病症、肌肉疾病、肌神經病症、神經腫瘤病症或任何與中樞及/或周邊神經系統相關之病症。

在一些實施例中，AAV粒子(例如，包含AAV衣殼多肽之AAV粒子)之病毒基因體可包含經工程改造以實現或增強抗體或其抗體結合片段之表現之核酸。

在一些實施例中，本文中所描述之包含AAV衣殼變異型之AAV粒子的有效負載之經編碼之抗體包含至少一個免疫球蛋白可變域序列。抗體可包括例如全長、成熟抗體及抗體之抗原結合片段。舉例而言，抗體可包括重(H)鏈可變域序列(VH)及輕(L)鏈可變域序列(VL)。在另一實例中，抗體包括兩個重(H)鏈可變域序列及兩個輕(L)鏈可變域序列，從而形成兩個抗原結合位點，諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fc、Fd、Fd'、Fv、單鏈抗體(例如scFv)、單可變域抗體、雙功能抗體(Dab) (二價及雙特異性)及嵌合(例如人源化)抗體，其可藉由修飾完全抗體或使用重組型DNA技術重新合成之抗體產生。此等功能性抗體片段，例如抗體結合片段保留與其各別抗原或受體選擇性結合之能力。

在一些實施例中，抗體結合片段包含完整抗體或其重組變異體之至少一部分，且係指足以使抗體片段識別且特異性結合諸如抗原之目標的抗原結合域，例如完整抗體之抗原決定可變區。抗原結合片段之實例包括：(i) Fab片段，一種由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii) F(ab')2片段，一種包含兩個由鉸鏈區處的二硫橋鍵連接之Fab片段之二價片段；(iii) Fd片段，其由VH及CH1域組成；(iv) Fv片段，其由抗體之單臂之VL及VH域組成；(v)雙功能抗體(dAb)片段，其由VH域組成；(vi)駱駝或駱駝化可變域；(vii)單鏈Fv (scFv)，參見例如Bird等人, (1988) Science 242:423-426；及Huston等人, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；(viii)單域抗體。此等抗體片段係使用熟習此項技術者已知的習知技術獲得，且以與完整抗體相同之方式針對效用來篩選該等片段。抗體片段亦可併入單域抗體、最大抗體、微型抗體、奈米抗體、胞內抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR及雙-scFv中(參見例如Hollinger及Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005)。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子之有效負載的經編碼之抗體包含多特異性抗體，例如其包含複數個免疫球蛋白可變域序列，其中該複數個免疫球蛋白可變域序列中之第一免疫球蛋白可變域序列對第一抗原決定基具有結合特異性，且該複數個免疫球蛋白可變域序列中之第二免疫球蛋白可變域序列對第二抗原決定基具有結合特異性。在一些實施例中，第一及第二抗原決定基係在同一抗原，例如同一蛋白質(或多聚體蛋白之子單元)上。在一些實施例中，第一及第二抗原決定基重疊。在一些實施例中，第一及第二抗原決定基不重疊。在一些實施例中，第一及第二抗原決定基係在不同抗原，例如不同蛋白質(或多聚體蛋白之不同子單元)上。在一些實施例中，多特異性抗體包含第三、第四或第五免疫球蛋白可變域。在一些實施例中，多特異性抗體係雙特異性抗體、三特異性抗體或四特異性抗體。

在一些實施例中，本文所描述之AAV粒子之有效負載的經編碼之多特異性抗體係經編碼之雙特異性抗體。雙特異性抗體對不超過兩種抗原具有特異性。雙特異性抗體之特徵在於對第一抗原決定基具有結合特異性之第一免疫球蛋白可變域序列及對第二抗原決定基具有結合特異性之第二免疫球蛋白可變域序列。在一些實施例中，第一及第二抗原決定基係在同一抗原，例如同一蛋白質(或多聚體蛋白之子單元)上。在一些實施例中，第一及第二抗原決定基重疊。在一些實施例中，第一及第二抗原決定基不重疊。在一些實施例中，第一及第二抗原決定基係在不同抗原，例如不同蛋白質(或多聚體蛋白之不同子單元)上。

由本文中所描述之AAV粒子之病毒基因體編碼之抗體或抗體結合片段可為(但不限於)與β-類澱粉蛋白、APOE、tau、SOD1、TDP-43、杭丁頓蛋白及/或突觸核蛋白結合之抗體或抗體片段。在一些實施例中，經編碼之有效負載包含結合於神經腫瘤相關目標，例如HER2、EGFR (例如，EGFRvIII)之抗體或抗體片段。在一些實施例中，經編碼之有效負載包含結合於HER2/neu之抗體。在一些實施例中，經編碼之有效負載包含結合於β-類澱粉蛋白之抗體。在一些實施例中，經編碼之有效負載包含結合於tau之抗體。 基因編輯系統

在一些實施例中，本文中所描述之包含AAV衣殼變異體之AAV粒子的經編碼之有效負載包含基因編輯系統或其一或多個組分。在一些實施例中，基因編輯系統包含編碼蛋白質之核酸序列，該等蛋白質具有酶活性以：(i)在DNA或RNA序列中選擇性誘導雙股或單股斷裂，或(ii)在DNA或RNA中在不存在雙股或單股斷裂之情況下取代、插入或刪除DNA或RNA序列之特定鹼基或鹼基集合。在一些實施例中，基因編輯系統包括(但不限於) CRISPR-Cas系統(包括不同Cas或Cas相關核酸酶)、鋅指核酸酶、巨核酸酶、TALEN或鹼基編輯器。在一些實施例中，基因編輯系統包含例如在不存在外源性核酸酶或酶實體之情況下藉由細小病毒載體引入之轉殖基因之染色體整合。 RNAi 試劑

在一些實施例中，本文中所描述之包含AAV衣殼多肽之AAV粒子的經編碼之有效負載包含RNAi試劑，例如本文中所描述之RNAi試劑。在一些實施例中，本文中所描述之包含AAV衣殼變異體之AAV粒子的病毒基因體之經編碼之有效負載包含RNAi試劑，該RNAi係諸如(但不限於) dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA。在一些實施例中，經編碼之有效負載包含用於抑制以下之表現之RNAi試劑：SOD1、MAPT、APOE、HTT、C9ORF72、TDP-43、APP、BACE、SNCA、ATXN1、ATXN3、ATXN7、SCN1A-SCN5A或SCN8A-SCN11A基因、蛋白質及/或mRNA。在一些實施例中，由本文中所描述之病毒基因體編碼之RNAi試劑抑制SOD1、MAPT、APOE、HTT、C9ORF72、TDP-43、APP、BACE、SNCA、ATXN1、ATXN3、ATXN7、SCN1A-SCN5A或SCN8A-SCN11A。

本文中所描述之包含AAV衣殼變異體之AAV粒子可包含編碼RNAi試劑之病毒基因體，該RNAi試劑靶向基因之mRNA以調節，例如干擾基因表現及/或蛋白質產生。

在一些實施例中，RNAi試劑可靶向基因之核苷酸序列內的單核苷酸多形現象(SNP)位置處之基因或變異體。

RNAi試劑可為siRNA雙螺旋體，其中siRNA雙螺旋體含有雜交在一起以形成雙螺旋結構之反義股(導引股)及有義股(隨從股)，其中反義股與目標基因之核酸序列互補，且其中有義股與目標基因之核酸序列同源。在一些態樣中，反義股之5'端具有5'磷酸酯基，且有義股之3'端含有3'羥基。在其他態樣中，在各股之3'端處不存在、存在一個或2個核苷酸突出物。

靶向所關注的基因之siRNA雙螺旋體之各股的長度可為約19至25、19至24或19至21個核苷酸，較佳長度係約19個核苷酸、20個核苷酸、21個核苷酸、22個核苷酸、23個核苷酸、24個核苷酸或25個核苷酸。

在一個實施例中，siRNA或dsRNA包括至少兩個彼此互補的序列。dsRNA包括具有第一序列之有義股及具有第二序列之反義股。反義股包括與編碼目標基因之mRNA之至少一部分基本上互補之核苷酸序列，且互補區之長度係30個或更少的核苷酸且係至少15個核苷酸。通常，dsRNA之長度係19至25、19至24或19至21個核苷酸。在一些實施例中，dsRNA之長度係約15至約25個核苷酸，且在其他實施例中，dsRNA之長度係約25至約30個核苷酸。在一些實施例中，dsRNA之長度為約15個核苷酸，長度為約16個核苷酸，長度為約17個核苷酸，長度為約18個核苷酸，長度為約19個核苷酸、20個核苷酸、21個核苷酸、22個核苷酸、23個核苷酸、24個核苷酸，長度為約25個核苷酸，長度為約26個核苷酸，長度為約27個核苷酸，長度為約28個核苷酸，長度為約29個核苷酸或長度為約30個核苷酸。

在一些實施例中，經編碼之RNAi試劑係siRNA。

在一些實施例中，RNAi試劑，例如本文中所描述之RNAi試劑抑制基因、mRNA及/或蛋白質之表現達至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%或更多，諸如當藉由此項技術中已知的方法分析時。在一些實施例中，RNAi試劑抑制基因、mRNA及蛋白質之表現達50-100%，例如達30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%。

在一些實施例中，向有需要之個體投與本文中所描述之AAV粒子以治療及/或改善疾病，例如任何與中樞或周邊神經系統相關之疾病之神經病症，該AAV粒子包含編碼靶向所關注的基因之RNAi試劑之病毒基因體。 siRNA 之設計

本文中所描述之AAV粒子(例如，本文中所描述之包含AAV衣殼多肽之AAV粒子)可包含編碼siRNA分子(例如，siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA)之病毒基因體，該siRNA分子靶向所關注的基因且抑制目標基因表現、mRNA表現及蛋白質產生。在一些態樣中，設計siRNA分子且用於剔除細胞中之目標基因變異體，例如在神經疾病中鑑別之轉錄物。在一些態樣中，設計siRNA分子且用於減弱細胞中之目標基因變異體。

已在此項技術中提出一些用於設計siRNA (用於插入本文中所描述之AAV粒子之病毒基因體中)之指南。此等指南通常建議產生靶向待緘默基因中之區域的19-核苷酸雙螺旋區域、對稱的2-3核苷酸3'突出端、5-磷酸酯基及3-羥基。可管控siRNA序列偏好之其他規則包括(但不限於)：(i)在反義股之5'端存在A/U；(ii)在有義股之5'端存在G/C；(iii)在反義股之5'端三分之一處存在至少五個A/U殘基；及(iv)不存在長度超過9個核苷酸之任何GC延伸部分。根據此類考慮因素以及目標基因之特定序列，可容易地設計抑制哺乳動物目標基因表現所必需之高效siRNA分子。

在一個實施例中，有義股及/或反義股係基於歐洲專利公開案第EP1752536號中所概述之方法及規則來設計，其內容以全文引用之方式併入本文中。作為非限制性實例，序列之3'端鹼基為腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。作為非限制性實例，序列之5' 鹼基為鳥嘌呤或胞嘧啶。作為非限制性實例，3' 端序列包含七個鹼基，其富含腺嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶中之一或多種鹼基。

在一個實施例中，siRNA分子包含有義股及互補反義股，其中兩個股雜交在一起以形成雙螺旋結構。反義股與目標mRNA序列具有足夠互補性以引導目標特異性RNAi，例如siRNA分子具有足以藉由RNAi機制或過程觸發對目標mRNA之破壞的序列。

在一些實施例中，反義股與目標mRNA序列具有100%互補性。反義股可與目標mRNA序列之任何部分互補。有義序列之一致性或反義序列之同源性皆不需要與目標100%互補。

在其他實施例中，反義股及目標mRNA序列包含至少一個錯配。作為非限制性實例，反義股及目標mRNA序列具有至少50-90%、50-95%、50-99%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-99%、70-80%、70-90%、70-95%、70-99%、80-90%、80-95%、80-99%、90-95%、90-99%或95-99%互補性。

siRNA分子之長度可為約10-50個或更多個核苷酸，例如各股包含10-50個核苷酸(或核苷酸類似物)。較佳地，siRNA分子之長度為各股中具有約15-30個，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸，其中一個股與目標區域充分互補。在一個實施例中，siRNA分子之長度為約19至25、19至24或19至21個核苷酸。

在一些實施例中，siRNA分子可為包含約19個核苷酸至約25個核苷酸及3'端處之兩個突出核苷酸的合成RNA雙螺旋體。

siRNA分子可包含反義序列及有義序列或其片段或變異體。作為非限制性實例，反義序列及有義序列具有至少50-90%、50-95%、50-99%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-99%、70-80%、70-90%、70-95%、70-99%、80-90%、80-95%、80-99%、90-95%、90-99%或95-99%互補性。

有義序列及反義序列可貫穿其長度之實質性部分完全互補。在其他實施例中，有義序列及反義序列可獨立地在股長度之至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%上達到至少70%、80%、90%、95%或99%互補。

在一些實施例中，siRNA雙螺旋體之有義股及反義股係藉由短間隔序列連接，從而引起稱為短髮夾RNA (shRNA)之莖環結構之表現。髮夾係由切丁酶識別及裂解，由此產生成熟siRNA分子。

在一些實施例中，在設計siRNA分子以及相關間隔子及/或側接區域後，其可由本文中所描述之AAV粒子之病毒基因體編碼以遞送至細胞。 分子支架

在一些實施例中，siRNA分子可於亦包含分子支架的調節性聚核苷酸中編碼。

在一些實施例中，包含有效負載(例如，本文中所描述之siRNA、miRNA或其他RNAi試劑)之調節性聚核苷酸包括分子支架，其包含5'側接序列、環形區域及/或3'側接區域。在一些實施例中，5'或3'側接區域可具有任何長度且可為野生型微型RNA序列或其一部分，或可為完全人工的。3'側接序列之尺寸及起點可與5'側接序列成鏡像。任一側接序列可不存在。在一個實施例中，5'及3'側接序列皆不存在。3'側接序列可視情況含有一或多個CNNC模體，其中「N」表示任何核苷酸。在一些實施例中，環包含至少一個UGUG模體。在一些實施例中，UGUG模體位於環之5'端。在一些實施例中，5'及3'側接序列為相同序列。在一些實施例中，當相互比對時，其相差2%、3%、4%、5%、10%、20%或大於30%。

在一些實施例中，調節性聚核苷酸包含莖環結構。在一些實施例中，以5'至3'順序，調節性聚核苷酸包含：5'側接序列、引導股序列、環形區域、隨從股序列及3'側接序列。在一些實施例中，以5'至3'順序，調節性聚核苷酸包含：5'側接序列、隨從股序列、環形區域、引導股序列及3'側接序列。

在一個實施例中，分子支架包含雙重功能靶向調節性聚核苷酸。

在一個實施例中，分子支架可包含一或多個此項技術中已知之連接子。連接子可使各區域隔開或使一個分子支架與另一分子支架隔開。作為非限制性實例，分子支架可為多順反子。

在一個實施例中，使用以下特性中之至少一者設計調節性聚核苷酸：環變異體、種子錯配/凸出/擺動變異體、莖錯配、環變異體及基礎莖錯配變異體、種子錯配及基礎莖錯配變異體、莖錯配及基礎莖錯配變異體、種子擺動及基礎莖擺動變異體或莖序列變異體。 AAV 產生

本文中所揭示之病毒產生描述用於產生製備AAV粒子(具有經增強、改良及/或增加之針對目標組織之向性)之過程及方法。

在一些實施例中，本文中揭示用於製備本發明之AAV粒子，例如包含AAV衣殼多肽之AAV粒子之方法，該方法包含：(i)提供包含本文中所描述之桿狀病毒表現構築體之宿主細胞，該桿狀病毒表現構築體包含本文中所描述之病毒基因體，及(ii)在適於將病毒基因體封裝於AAV衣殼多肽中之條件下培育宿主細胞，藉此產生AAV粒子。在一些實施例中，在步驟(i)之前，該方法包含將包含病毒基因體之第一桿狀病毒表現構築體引入細胞中。在一些實施例中，宿主細胞包含本文中所描述之編碼AAV衣殼多肽之第二桿狀病毒表現構築體。在一些實施例中，在第一桿狀病毒表現構築體之前、同時或之後將第二桿狀病毒表現構築體引入宿主細胞中。在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子係經分離之AAV粒子。在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子係重組AAV粒子。

此項技術中已知之任何方法皆可用於製備AAV粒子。在一些實施例中，AAV粒子係在哺乳動物細胞(例如，HEK293)中產生。在另一實施例中，AAV粒子係在昆蟲細胞(例如，Sf9)中產生。

製備AAV粒子之方法為此項技術中熟知的，且描述於例如以下中：美國專利案第US6204059號、第US5756283號、第US6258595號、第US6261551號、第US6270996號、第US6281010號、第US6365394號、第US6475769號、第US6482634號、第US6485966號、第US6943019號、第US6953690號、第US7022519號、第US7238526號、第US7291498號及第US7491508號、第US5064764號、第US6194191號、第US6566118號、第US8137948號；或國際公開案第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353號及第WO2001023597號；Methods In Molecular Biology, Richard編, Humana Press, NJ (1995)；O'Reilly等人, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press (1994)；Samulski等人, J. Vir.63:3822-8 (1989)；Kajigaya等人, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA88: 4646-50 (1991)；Ruffing等人, J. Vir.66:6922-30 (1992)；Kimbauer等人, Vir., 219:37-44 (1996)；Zhao等人, Vir.272:382-93 (2000)；其內容各自以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，使用國際專利公開案WO2015191508中所描述之方法製備AAV粒子，其內容以全文引用之方式併入本文中。 病毒表現構築體

本文中所描述之AAV產生系統包含一或多個桿狀病毒表現構築體，該一或多個桿狀病毒表現構築體包含可轉染/轉導至病毒產生細胞(例如，Sf9)中之AAV表現構築體。在某些實施例中，本文中所描述之桿狀病毒表現構築體(例如，BAC)包含AAV表現構築體及/或有效負載表現構築體。在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可為桿狀病毒表現載體(BEV)。在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可為包括BEV之BIIC。在一些實施例中，表現Bac係指本文中所描述之桿狀病毒表現構築體，其包含病毒表現構築體(例如，AAV表現構築體)及/或病毒表現區域。病毒生產細胞(例如，Sf9細胞)可用表現Bac及/或用包含表現Bac之BIIC轉染。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體或變異型桿狀病毒基因體包含如例如PCT/US2022/018687中所描述之AAV表現構築體，其內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體或變異型桿狀病毒基因體包含如例如PCT/US2022/018787中所描述之AAV表現構築體，其內容以全文引用之方式併入本文中。可使用如PCT/US2022/018687之實例1-8中所描述的類似方案產生桿狀病毒表現構築體，其內容以全文引用之方式併入本文中。可使用如PCT/US2022/018787之實例1-5中所描述的類似方案產生桿狀病毒表現構築體，其內容以全文引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，可使用一種、兩種、三種、四種、五種、六種或更多種AAV表現構築體在病毒產生細胞中產生AAV粒子。舉例而言，五種AAV表現構築體可個別地編碼AAV VP1、AAV VP2、AAV VP3、Rep52、Rep78以及隨附有效負載構築體，其包含有效負載聚核苷酸及至少一個AAV ITR。在另一實施例中，本文中所描述之AAV表現構築體可用於表現例如Rep52及Rep40，或Rep78及Rep 68，或Rep78及Rep52。表現構築體可包含VP1、VP2、VP3、Rep52/Rep40、Rep78/Rep52及Rep78/Rep68編碼序列之任何組合。

在一些實施例中，本文中所描述之桿狀病毒表現構築體或變異型桿狀病毒基因體包含有包含VP編碼區之AAV表現構築體。在一些實施例中，AAV表現構築體可包含VP編碼區；VP編碼區係包含編碼VP1、VP2、VP3或其組合之VP核苷酸序列之核苷酸序列。在一些實施例中，VP編碼區可例如針對哺乳動物細胞或昆蟲細胞而經密碼子最佳化。在一些實施例中，VP編碼區或核苷酸序列可針對昆蟲細胞，例如草地黏蟲細胞，諸如Sf9或Sf21而經密碼子最佳化。在一些實施例中，病毒表現構築體包含第一VP-編碼區，其包含編碼一或多種選自VP1、VP2及VP3之AAV衣殼蛋白質的核苷酸序列；及第二VP編碼區，其包含編碼一或多種選自VP1、VP2及VP3之AAV衣殼蛋白質的核苷酸序列。

在一些實施例中，第一VP編碼區編碼AAV血清型，例如AAV2、AAV9或AAVPHPN之AAV衣殼蛋白質。在一些實施例中，第二VP編碼區編碼AAV血清型，例如AAV2、AAV9或AAVPHPN之AAV衣殼蛋白質。在一些實施例中，第一VP編碼區之AAV血清型與第二VP編碼區之AAV血清型相同。在一些實施例中，第一編碼區之AAV血清型與第二VP編碼區之AAV血清型不同。

病毒表現構築體之結構性VP蛋白質，即VP1、VP2及VP3可在利用替代性剪接受體及非典型轉譯起始密碼子來調節之單一開放閱讀框架中編碼。VP1、VP2及VP3可轉錄及轉譯自單一轉錄物，其中框內及/或框外起始密碼子皆經工程改造以控制由核苷酸轉錄物產生之VP1:VP2:VP3之比率。

在一些實施例中，VP編碼區包含滿足以下條件之核苷酸序列：(i)相對於VP2蛋白質及/或VP3蛋白質主要編碼VP1蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的VP1蛋白質；(ii)僅編碼VP1蛋白質；(iii)編碼VP1蛋白質，但不編碼VP2蛋白質或VP3蛋白質；(iv)相對於VP1蛋白質及/或VP3蛋白質主要編碼VP2蛋白質，例如至少約50%、60%、70%、80%、90%或更多的VP2蛋白質；(v)僅編碼VP2蛋白質；(vi)編碼VP2蛋白質，但不編碼VP1蛋白質或VP3蛋白質；(vii)僅編碼VP3蛋白質；(viii)編碼VP3蛋白質，但不編碼VP1蛋白質或VP2蛋白質；(ix)編碼VP1蛋白質及VP2蛋白質，但不編碼VP3蛋白質；(x)編碼VP1蛋白質及VP3蛋白質，但不編碼VP2蛋白質；(xi)編碼VP2蛋白質及VP3蛋白質，但不編碼VP1蛋白質；(xii)編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質。

在一些實施例中，VP編碼區包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內。在一些實施例中，VP編碼區包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之單一多順反子ORF。在一些實施例中，編碼VP1蛋白質之ORF包含ACG起始密碼子，編碼VP2蛋白質之ORF包含ACG起始密碼子，且編碼VP3蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子。在一些實施例中，編碼VP1蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子，編碼VP2蛋白質之ORF包含ACG起始密碼子，且編碼VP3蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子。

在一些實施例中，VP編碼區編碼AAV1衣殼蛋白質、AAV2衣殼蛋白質、AAV3衣殼蛋白質、AAV4衣殼蛋白質、AAV5衣殼蛋白質、AAV6衣殼蛋白質、AAV8衣殼蛋白質、AAV9衣殼蛋白質、AAVrh10衣殼蛋白質或任何前述衣殼蛋白質之變異體。在一些實施例中，VP編碼區編碼AAV5衣殼蛋白質或其變異體，或AAV9衣殼蛋白質或其變異體。在一些實施例中，VP編碼區編碼WO2021230987、WO2019028306、WO2019222329、WO2020077165、WO2020028751、WO2020223280、WO2019222444、WO2019222441、PCT/US2022/018687或WO2017100671所提供之衣殼蛋白質，其內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，VP編碼區編碼衣殼蛋白質，該衣殼蛋白質係由以下編碼或包含以下：表2中提供之序列，或與任何前述序列實質上一致(例如，具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%或99%序列一致性)之序列。

在一些實施例中，VP編碼對包含以下之VP1蛋白質進行編碼：SEQ ID NO:46、47、71或168中之任一者之胺基酸序列，或與任何前述胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VP編碼區包含SEQ ID NO:43-45、72、169、205、212或213中之任一者之核苷酸序列，或與任何前述核苷酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。

在一些實施例中，VP編碼區編碼VP2蛋白質，例如SEQ ID NO:46、47、71或168中之任一者或與任何前述胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列之片段或一部分。在一些實施例中，VP2蛋白質包含胺基酸138-736或SEQ ID NO:46、47或71；或SEQ ID NO:168之胺基酸137-724。在一些實施例中，VP編碼區包含編碼VP2蛋白質之核苷酸序列，例如SEQ ID NO:43-45、72、169、205、212或213中之任一者或與任何前述核苷酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列之片段或一部分。在一些實施例中，編碼VP2蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO:43-45、72、205或212之核苷酸412-2211；或SEQ ID NO:169或213之核苷酸409-2175。在一些實施例中，編碼VP2蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO:44及45之核苷酸418-2211。

在一些實施例中，VP編碼區編碼VP3蛋白質，例如SEQ ID NO:46、47、71或168中之任一者或與任何前述胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列之片段或一部分。在一些實施例中，VP3蛋白質包含SEQ ID NO:46、47或71之胺基酸203-736；或SEQ ID NO:168之胺基酸193-724。在一些實施例中，VP編碼區包含編碼VP3蛋白質之核苷酸序列，例如SEQ ID NO:43-45、72、169、205、212或213中之任一者或與任何前述核苷酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列之片段或一部分。在一些實施例中，編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO:43-45、72、205或212之核苷酸607-2211；或SEQ ID NO:169或213之核苷酸577-2175。在一些實施例中，編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO:44及45之核苷酸613-2211。

在一些實施例中，VP編碼區之核苷酸序列針對昆蟲細胞，視情況草地黏蟲昆蟲細胞(例如，Sf9昆蟲細胞)而經密碼子最佳化。表2：例示性全長衣殼序列

說明	SEQ ID NO:	序列
AAV9 (DNA v1)	43	ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTTAGTGAAGGAATTCGCGAGTGGTGGGCTTTGAAACCTGGAGCCCCTCAACCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGACAACGCTCGAGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACCTTGGACCCGGCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCGGTCAACGCAGCAGACGCGGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAGGCCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCCGAGTTCCAGGAGCGGCTCAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGGCTTCTTGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGCGGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCTGTAGAGCAGTCTCCTCAGGAACCGGACTCCTCCGCGGGTATTGGCAAATCGGGTGCACAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCAGACCCTCAACCAATCGGAGAACCTCCCGCAGCCCCCTCAGGTGTGGGATCTCTTACAATGGCTTCAGGTGGTGGCGCACCAGTGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAATCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACAGCACATCTGGAGGATCTTCAAATGACAACGCCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCTAAGCGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATTCAGGTCAAAGAGGTTACGGACAACAATGGAGTCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTCCAGGTCTTCACGGACTCAGACTATCAGCTCCCGTACGTGCTCGGGTCGGCTCACGAGGGCTGCCTCCCGCCGTTCCCAGCGGACGTTTTCATGATTCCTCAGTACGGGTATCTGACGCTTAATGATGGAAGCCAGGCCGTGGGTCGTTCGTCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCGTCGCAAATGCTAAGAACGGGTAACAACTTCCAGTTCAGCTACGAGTTTGAGAACGTACCTTTCCATAGCAGCTACGCTCACAGCCAAAGCCTGGACCGACTAATGAATCCACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCAAAGACTATTAACGGTTCTGGACAGAATCAACAAACGCTAAAATTCAGTGTGGCCGGACCCAGCAACATGGCTGTCCAGGGAAGAAACTACATACCTGGACCCAGCTACCGACAACAACGTGTCTCAACCACTGTGACTCAAAACAACAACAGCGAATTTGCTTGGCCTGGAGCTTCTTCTTGGGCTCTCAATGGACGTAATAGCTTGATGAATCCTGGACCTGCTATGGCCAGCCACAAAGAAGGAGAGGACCGTTTCTTTCCTTTGTCTGGATCTTTAATTTTTGGCAAACAAGGAACTGGAAGAGACAACGTGGATGCGGACAAAGTCATGATAACCAACGAAGAAGAAATTAAAACTACTAACCCGGTAGCAACGGAGTCCTATGGACAAGTGGCCACAAACCACCAGAGTGCCCAAGCACAGGCGCAGACCGGCTGGGTTCAAAACCAAGGAATACTTCCGGGTATGGTTTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTGCAAGGACCCATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCTTCTCCGCTGATGGGAGGGTTTGGAATGAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACACCTGTACCTGCGGATCCTCCAACGGCCTTCAACAAGGACAAGCTGAACTCTTTCATCACCCAGTATTCTACTGGCCAAGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCGGAGATCCAGTACACTTCCAACTATTACAAGTCTAATAATGTTGAATTTGCTGTTAATACTGAAGGTGTATATAGTGAACCCCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA
AAV9 (DNA v2)	205	ACGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTCGAGGACAACCTTAGTGAAGGAATTCGCGAGTGGTGGGCTTTGAAACCTGGAGCCCCTCAACCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGACAACGCTCGAGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACCTTGGACCCGGCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCGGTCAACGCAGCAGACGCGGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAGGCCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCCGAGTTCCAGGAGCGGCTCAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGGCTTCTTGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGCGGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCTGTAGAGCAGTCTCCTCAGGAACCGGACTCCTCCGCGGGTATTGGCAAATCGGGTGCACAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCAGACCCTCAACCAATCGGAGAACCTCCCGCAGCCCCCTCAGGTGTGGGATCTCTTACAATGGCTTCAGGTGGTGGCGCACCAGTGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAATCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACAGCACATCTGGAGGATCTTCAAATGACAACGCCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCTAAGCGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATTCAGGTCAAAGAGGTTACGGACAACAATGGAGTCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTCCAGGTCTTCACGGACTCAGACTATCAGCTCCCGTACGTGCTCGGGTCGGCTCACGAGGGCTGCCTCCCGCCGTTCCCAGCGGACGTTTTCATGATTCCTCAGTACGGGTATCTGACGCTTAATGATGGAAGCCAGGCCGTGGGTCGTTCGTCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCGTCGCAAATGCTAAGAACGGGTAACAACTTCCAGTTCAGCTACGAGTTTGAGAACGTACCTTTCCATAGCAGCTACGCTCACAGCCAAAGCCTGGACCGACTAATGAATCCACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCAAAGACTATTAACGGTTCTGGACAGAATCAACAAACGCTAAAATTCAGTGTGGCCGGACCCAGCAACATGGCTGTCCAGGGAAGAAACTACATACCTGGACCCAGCTACCGACAACAACGTGTCTCAACCACTGTGACTCAAAACAACAACAGCGAATTTGCTTGGCCTGGAGCTTCTTCTTGGGCTCTCAATGGACGTAATAGCTTGATGAATCCTGGACCTGCTATGGCCAGCCACAAAGAAGGAGAGGACCGTTTCTTTCCTTTGTCTGGATCTTTAATTTTTGGCAAACAAGGAACTGGAAGAGACAACGTGGATGCGGACAAAGTCATGATAACCAACGAAGAAGAAATTAAAACTACTAACCCGGTAGCAACGGAGTCCTATGGACAAGTGGCCACAAACCACCAGAGTGCCCAAGCACAGGCGCAGACCGGCTGGGTTCAAAACCAAGGAATACTTCCGGGTATGGTTTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTGCAAGGACCCATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCTTCTCCGCTGATGGGAGGGTTTGGAATGAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACACCTGTACCTGCGGATCCTCCAACGGCCTTCAACAAGGACAAGCTGAACTCTTTCATCACCCAGTATTCTACTGGCCAAGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCGGAGATCCAGTACACTTCCAACTATTACAAGTCTAATAATGTTGAATTTGCTGTTAATACTGAAGGTGTATATAGTGAACCCCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA
AAV9 (DNA，其中經VP1aug13修飾之Kozak加下劃線)	44	cggtgtatggc TGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTCGAGGACAACCTTAGTGAAGGAATTCGCGAGTGGTGGGCTTTGAAACCTGGAGCCCCTCAACCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGACAACGCTCGAGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACCTTGGACCCGGCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCGGTCAACGCAGCAGACGCGGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAGGCCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCCGAGTTCCAGGAGCGGCTCAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGGCTTCTTGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGCGGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCTGTAGAGCAGTCTCCTCAGGAACCGGACTCCTCCGCGGGTATTGGCAAATCGGGTGCACAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCAGACCCTCAACCAATCGGAGAACCTCCCGCAGCCCCCTCAGGTGTGGGATCTCTTACAATGGCTTCAGGTGGTGGCGCACCAGTGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAATCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACAGCACATCTGGAGGATCTTCAAATGACAACGCCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCTAAGCGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATTCAGGTCAAAGAGGTTACGGACAACAATGGAGTCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTCCAGGTCTTCACGGACTCAGACTATCAGCTCCCGTACGTGCTCGGGTCGGCTCACGAGGGCTGCCTCCCGCCGTTCCCAGCGGACGTTTTCATGATTCCTCAGTACGGGTATCTGACGCTTAATGATGGAAGCCAGGCCGTGGGTCGTTCGTCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCGTCGCAAATGCTAAGAACGGGTAACAACTTCCAGTTCAGCTACGAGTTTGAGAACGTACCTTTCCATAGCAGCTACGCTCACAGCCAAAGCCTGGACCGACTAATGAATCCACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCAAAGACTATTAACGGTTCTGGACAGAATCAACAAACGCTAAAATTCAGTGTGGCCGGACCCAGCAACATGGCTGTCCAGGGAAGAAACTACATACCTGGACCCAGCTACCGACAACAACGTGTCTCAACCACTGTGACTCAAAACAACAACAGCGAATTTGCTTGGCCTGGAGCTTCTTCTTGGGCTCTCAATGGACGTAATAGCTTGATGAATCCTGGACCTGCTATGGCCAGCCACAAAGAAGGAGAGGACCGTTTCTTTCCTTTGTCTGGATCTTTAATTTTTGGCAAACAAGGAACTGGAAGAGACAACGTGGATGCGGACAAAGTCATGATAACCAACGAAGAAGAAATTAAAACTACTAACCCGGTAGCAACGGAGTCCTATGGACAAGTGGCCACAAACCACCAGAGTGCCCAAGCACAGGCGCAGACCGGCTGGGTTCAAAACCAAGGAATACTTCCGGGTATGGTTTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTGCAAGGACCCATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCTTCTCCGCTGATGGGAGGGTTTGGAATGAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACACCTGTACCTGCGGATCCTCCAACGGCCTTCAACAAGGACAAGCTGAACTCTTTCATCACCCAGTATTCTACTGGCCAAGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCGGAGATCCAGTACACTTCCAACTATTACAAGTCTAATAATGTTGAATTTGCTGTTAATACTGAAGGTGTATATAGTGAACCCCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA
AAV9 (DNA，其中經VP1aug14修飾之Kozak加下劃線)	45	cggtgtatgag TGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTCGAGGACAACCTTAGTGAAGGAATTCGCGAGTGGTGGGCTTTGAAACCTGGAGCCCCTCAACCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGACAACGCTCGAGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACCTTGGACCCGGCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCGGTCAACGCAGCAGACGCGGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAGGCCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCCGAGTTCCAGGAGCGGCTCAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGGCTTCTTGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGCGGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCTGTAGAGCAGTCTCCTCAGGAACCGGACTCCTCCGCGGGTATTGGCAAATCGGGTGCACAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCAGACCCTCAACCAATCGGAGAACCTCCCGCAGCCCCCTCAGGTGTGGGATCTCTTACAATGGCTTCAGGTGGTGGCGCACCAGTGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAATCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACAGCACATCTGGAGGATCTTCAAATGACAACGCCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCTAAGCGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATTCAGGTCAAAGAGGTTACGGACAACAATGGAGTCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTCCAGGTCTTCACGGACTCAGACTATCAGCTCCCGTACGTGCTCGGGTCGGCTCACGAGGGCTGCCTCCCGCCGTTCCCAGCGGACGTTTTCATGATTCCTCAGTACGGGTATCTGACGCTTAATGATGGAAGCCAGGCCGTGGGTCGTTCGTCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCGTCGCAAATGCTAAGAACGGGTAACAACTTCCAGTTCAGCTACGAGTTTGAGAACGTACCTTTCCATAGCAGCTACGCTCACAGCCAAAGCCTGGACCGACTAATGAATCCACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCAAAGACTATTAACGGTTCTGGACAGAATCAACAAACGCTAAAATTCAGTGTGGCCGGACCCAGCAACATGGCTGTCCAGGGAAGAAACTACATACCTGGACCCAGCTACCGACAACAACGTGTCTCAACCACTGTGACTCAAAACAACAACAGCGAATTTGCTTGGCCTGGAGCTTCTTCTTGGGCTCTCAATGGACGTAATAGCTTGATGAATCCTGGACCTGCTATGGCCAGCCACAAAGAAGGAGAGGACCGTTTCTTTCCTTTGTCTGGATCTTTAATTTTTGGCAAACAAGGAACTGGAAGAGACAACGTGGATGCGGACAAAGTCATGATAACCAACGAAGAAGAAATTAAAACTACTAACCCGGTAGCAACGGAGTCCTATGGACAAGTGGCCACAAACCACCAGAGTGCCCAAGCACAGGCGCAGACCGGCTGGGTTCAAAACCAAGGAATACTTCCGGGTATGGTTTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTGCAAGGACCCATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCTTCTCCGCTGATGGGAGGGTTTGGAATGAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACACCTGTACCTGCGGATCCTCCAACGGCCTTCAACAAGGACAAGCTGAACTCTTTCATCACCCAGTATTCTACTGGCCAAGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCGGAGATCCAGTACACTTCCAACTATTACAAGTCTAATAATGTTGAATTTGCTGTTAATACTGAAGGTGTATATAGTGAACCCCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA
AAV9 (胺基酸)	46	MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
AAV9 (胺基酸)	47	MSADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
AAV1 (DNA v1)	72	atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaacctctctgagggcattcgcgagtggtgggacttgaaacctggagccccgaagcccaaagccaaccagcaaaagcaggacgacggccggggtctggtgcttcctggctacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggggagcccgtcaacgcggcggacgcagcggccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctcaaagcgggtgacaatccgtacctgcggtataaccacgccgacgccgagtttcaggagcgtctgcaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaagaagcgggttctcgaacctctcggtctggttgaggaaggcgctaagacggctcctggaaagaaacgtccggtagagcagtcgccacaagagccagactcctcctcgggcatcggcaagacaggccagcagcccgctaaaaagagactcaattttggtcagactggcgactcagagtcagtccccgatccacaacctctcggagaacctccagcaacccccgctgctgtgggacctactacaatggcttcaggcggtggcgcaccaatggcagacaataacgaaggcgccgacggagtgggtaatgcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgcacctgggccttgcccacctacaataaccacctctacaagcaaatctccagtgcttcaacgggggccagcaacgacaaccactacttcggctacagcaccccctgggggtattttgatttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaattggggattccggcccaagagactcaacttcaaactcttcaacatccaagtcaaggaggtcacgacgaatgatggcgtcacaaccatcgctaataaccttaccagcacggttcaagtcttctcggactcggagtaccagcttccgtacgtcctcggctctgcgcaccagggctgcctccctccgttcccggcggacgtgttcatgattccgcaatacggctacctgacgctcaacaatggcagccaagccgtgggacgttcatccttttactgcctggaatatttcccttctcagatgctgagaacgggcaacaactttaccttcagctacacctttgaggaagtgcctttccacagcagctacgcgcacagccagagcctggaccggctgatgaatcctctcatcgaccaatacctgtattacctgaacagaactcaaaatcagtccggaagtgcccaaaacaaggacttgctgtttagccgtgggtctccagctggcatgtctgttcagcccaaaaactggctacctggaccctgttatcggcagcagcgcgtttctaaaacaaaaacagacaacaacaacagcaattttacctggactggtgcttcaaaatataacctcaatgggcgtgaatccatcatcaaccctggcactgctatggcctcacacaaagacgacgaagacaagttctttcccatgagcggtgtcatgatttttggaaaagagagcgccggagcttcaaacactgcattggacaatgtcatgattacagacgaagaggaaattaaagccactaaccctgtggccaccgaaagatttgggaccgtggcagtcaatttccagagcagcagcacagaccctgcgaccggagatgtgcatgctatgggagcattacctggcatggtgtggcaagatagagacgtgtacctgcagggtcccatttgggccaaaattcctcacacagatggacactttcacccgtctcctcttatgggcggctttggactcaagaacccgcctcctcagatcctcatcaaaaacacgcctgttcctgcgaatcctccggcggagttttcagctacaaagtttgcttcattcatcacccaatactccacaggacaagtgagtgtggaaattgaatgggagctgcagaaagaaaacagcaagcgctggaatcccgaagtgcagtacacatccaattatgcaaaatctgccaacgttgattttactgtggacaacaatggactttatactgagcctcgccccattggcacccgttaccttacccgtcccctgtaa
AAV1 (DNA v2)	212	ACGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGACTTGAAACCTGGAGCCCCGAAGCCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAACGTCCGGTAGAGCAGTCGCCACAAGAGCCAGACTCCTCCTCGGGCATCGGCAAGACAGGCCAGCAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTTGGTCAGACTGGCGACTCAGAGTCAGTCCCCGATCCACAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAACCCCCGCTGCTGTGGGACCTACTACAATGGCTTCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAATGCCTCAGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGCACCTGGGCCTTGCCCACCTACAATAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAGTGCTTCAACGGGGGCCAGCAACGACAACCACTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGATTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAATTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAACTTCAAACTCTTCAACATCCAAGTCAAGGAGGTCACGACGAATGATGGCGTCACAACCATCGCTAATAACCTTACCAGCACGGTTCAAGTCTTCTCGGACTCGGAGTACCAGCTTCCGTACGTCCTCGGCTCTGCGCACCAGGGCTGCCTCCCTCCGTTCCCGGCGGACGTGTTCATGATTCCGCAATACGGCTACCTGACGCTCAACAATGGCAGCCAAGCCGTGGGACGTTCATCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCTTCTCAGATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTACCTTCAGCTACACCTTTGAGGAAGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAGAGCCTGGACCGGCTGATGAATCCTCTCATCGACCAATACCTGTATTACCTGAACAGAACTCAAAATCAGTCCGGAAGTGCCCAAAACAAGGACTTGCTGTTTAGCCGTGGGTCTCCAGCTGGCATGTCTGTTCAGCCCAAAAACTGGCTACCTGGACCCTGTTATCGGCAGCAGCGCGTTTCTAAAACAAAAACAGACAACAACAACAGCAATTTTACCTGGACTGGTGCTTCAAAATATAACCTCAATGGGCGTGAATCCATCATCAACCCTGGCACTGCTATGGCCTCACACAAAGACGACGAAGACAAGTTCTTTCCCATGAGCGGTGTCATGATTTTTGGAAAAGAGAGCGCCGGAGCTTCAAACACTGCATTGGACAATGTCATGATTACAGACGAAGAGGAAATTAAAGCCACTAACCCTGTGGCCACCGAAAGATTTGGGACCGTGGCAGTCAATTTCCAGAGCAGCAGCACAGACCCTGCGACCGGAGATGTGCATGCTATGGGAGCATTACCTGGCATGGTGTGGCAAGATAGAGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATTTGGGCCAAAATTCCTCACACAGATGGACACTTTCACCCGTCTCCTCTTATGGGCGGCTTTGGACTCAAGAACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACGCCTGTTCCTGCGAATCCTCCGGCGGAGTTTTCAGCTACAAAGTTTGCTTCATTCATCACCCAATACTCCACAGGACAAGTGAGTGTGGAAATTGAATGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAGCGCTGGAATCCCGAAGTGCAGTACACATCCAATTATGCAAAATCTGCCAACGTTGATTTTACTGTGGACAACAATGGACTTTATACTGAGCCTCGCCCCATTGGCACCCGTTACCTTACCCGTCCCCTGTAA
AAV1 (胺基酸)	71	MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEEVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDEDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNFQSSSTDPATGDVHAMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL
AAV5 (DNA v1)	169	atgtcttttgttgatcaccctccagattggttggaagaagttggtgaaggtcttcgcgagtttttgggccttgaagcgggcccaccgaaaccaaaacccaatcagcagcatcaagatcaagcccgtggtcttgtgctgcctggttataactatctcggacccggaaacggtctcgatcgaggagagcctgtcaacagggcagacgaggtcgcgcgagagcacgacatctcgtacaacgagcagcttgaggcgggagacaacccctacctcaagtacaaccacgcggacgccgagtttcaggagaagctcgccgacgacacatccttcgggggaaacctcggaaaggcagtctttcaggccaagaaaagggttctcgaaccttttggcctggttgaagagggtgctaagacggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaagaaggctcggaccgaagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatcccagcagctgcaaatcccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgacaataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatgggggacagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagatcaaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtactttgactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggcttcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccaccaccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctacgtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacggttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagtactttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttccactccagcttcgctcccagtcagaacctgttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtaccgcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacacctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgcgccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgcagccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaacagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagcgagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctcTACTACTGCCCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAGGAAATCGTGCCCGGCAGCGTGTGGATGGAGAGGGACGTGTACCTCCAAGGACCCATCTGGGCCAAGATCCCAGAGACGGGGGCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCCATGGGCGGATTCGGACTCAAACACCCACCGCCCATGATGCTCATCAAGAACACGCCTGTGCCCGGAAATATCACCAGCTTCTCGGACGTGCCCGTCAGCAGCTTCATCACCCAGTACAGCACCGGGCAGGTCACCGTGGAGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAAAACTCCAAGAGGTGGAACCCAGAGATCCAGTACACAAACAACTACAACGACCCCCAGTTTGTGGACTTTGCCCCGGACAGCACCGGGGAATACAGAACCACCAGACCTATCGGAACCCGATACCTTACCCGACCCCTTTAA
AAV5 (DNA v2)	213	AcGagTTTTGTTGATCACCCaCCcGATTGGTTGGAAGAAGTTGGTGAAGGTCTTCGCGAGTTTTTGGGCCTTGAAGCGGGCCCACCGAAACCAAAACCCAATCAGCAGCATCAAGATCAAGCCCGTGGTCTTGTGCTGCCTGGTTATAACTATCTCGGACCCGGAAACGGTCTCGATCGAGGAGAGCCTGTCAACAGGGCAGACGAGGTCGCGCGAGAGCACGACATCTCGTACAACGAGCAGCTTGAGGCGGGAGACAACCCCTACCTCAAGTACAACCACGCGGACGCCGAGTTTCAGGAGAAGCTCGCCGACGACACATCCTTCGGGGGAAACCTCGGAAAGGCAGTCTTTCAGGCCAAGAAAAGGGTTCTCGAACCTTTTGGCCTGGTTGAAGAGGGTGCTAAGACGGCCCCTACCGGAAAGCGGATAGACGACCACTTTCCAAAAAGAAAGAAGGCCCGGACCGAAGAGGACTCCAAGCCTTCCACCTCGTCAGACGCCGAAGCTGGACCCAGCGGATCCCAGCAGCTGCAAATCCCAGCCCAACCAGCCTCAAGTTTGGGAGCTGATACAATGTCTGCGGGAGGTGGCGGCCCATTGGGCGACAATAACCAAGGTGCCGATGGAGTGGGCAATGCCTCGGGAGATTGGCATTGCGATTCCACGTGGATGGGGGACAGAGTCGTCACCAAGTCCACCCGAACCTGGGTGCTGCCCAGCTACAACAACCACCAGTACCGAGAGATCAAAAGCGGCTCCGTCGACGGAAGCAACGCCAACGCCTACTTTGGATACAGCACCCCCTGGGGGTACTTTGACTTTAACCGCTTCCACAGCCACTGGAGCCCCCGAGACTGGCAAAGACTCATCAACAACTACTGGGGCTTCAGACCCCGGTCCCTCAGAGTCAAAATCTTCAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGGTGCAGGACTCCACCACCACCATCGCCAACAACCTCACCTCCACCGTCCAAGTGTTTACGGACGACGACTACCAGCTGCCCTACGTCGTCGGCAACGGGACCGAGGGATGCCTGCCGGCCTTCCCTCCGCAGGTCTTTACGCTGCCGCAGTACGGTTACGCGACGCTGAACCGCGACAACACAGAAAATCCCACCGAGAGGAGCAGCTTCTTCTGCCTAGAGTACTTTCCCAGCAAGATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTGAGTTTACCTACAACTTTGAGGAGGTGCCCTTCCACTCCAGCTTCGCTCCCAGTCAGAACCTCTTCAAGCTGGCCAACCCGCTGGTGGACCAGTACTTGTACCGCTTCGTGAGCACAAATAACACTGGCGGAGTCCAGTTCAACAAGAACCTGGCCGGGAGATACGCCAACACCTACAAAAACTGGTTCCCGGGGCCCATGGGCCGAACCCAGGGCTGGAACCTGGGCTCCGGGGTCAACCGCGCCAGTGTCAGCGCCTTCGCCACGACCAATAGGATGGAGCTCGAGGGCGCGAGTTACCAGGTGCCCCCGCAGCCGAACGGCATGACCAACAACCTCCAGGGCAGCAACACCTATGCCCTGGAGAACACTATGATCTTCAACAGCCAGCCGGCGAACCCGGGCACCACCGCCACGTACCTCGAGGGCAACATGCTCATCACCAGCGAGAGCGAGACGCAGCCGGTGAACCGCGTGGCGTACAACGTCGGCGGGCAGATGGCCACCAACAACCAGAGCTCCACCACTGCCCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAGGAAATCGTGCCCGGCAGCGTGTGGATGGAGAGGGACGTGTACCTCCAAGGACCCATCTGGGCCAAGATCCCAGAGACGGGGGCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCCATGGGCGGATTCGGACTCAAACACCCACCGCCCATGATGCTCATCAAGAACACGCCTGTGCCCGGAAATATCACCAGCTTCTCGGACGTGCCCGTCAGCAGCTTCATCACCCAGTACAGCACCGGGCAGGTCACCGTGGAGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAAAACTCCAAGAGGTGGAACCCAGAGATCCAGTACACAAACAACTACAACGACCCCCAGTTTGTGGACTTTGCCCCGGACAGCACCGGGGAATACAGAACCACCAGACCTATCGGAACCCGATACCTTACCCGACCCCTTTAA
AAV5 (胺基酸)	168	MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL

在一些實施例中，VP編碼區可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，啟動子係桿狀病毒主要晚期啟動子、病毒啟動子、昆蟲病毒啟動子、非昆蟲病毒啟動子、脊椎動物病毒啟動子、來自一或多個物種之包括病毒及非病毒元件之嵌合啟動子、合成啟動子或其變異體。在一些實施例中，啟動子係選自polh啟動子、p10啟動子、Ctx啟動子、gp64啟動子、IE啟動子、IE-1啟動子、p6.9啟動子、Dmhsp70啟動子、Hsp70啟動子、p5啟動子、p19啟動子、p35啟動子、p40啟動子或其變異體，例如功能性片段。在一些實施例中，啟動子係p10啟動子。在一些實施例中，啟動子包含表3中提供之核苷酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，啟動子包含SEQ ID NO:200之核苷酸序列，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，啟動子係p10啟動子且包含SEQ ID NO:200之核苷酸序列，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，啟動子係ctx啟動子。在一些實施例中，CTX啟動子包含表3中提供之序列，或與其實質上一致(例如，具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%或99%序列一致性)之序列。

在一些實施例中，VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且可操作地連接至p10啟動子。在一些實施例中，VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之單一多順反子ORF。在一些實施例中，VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內。

在一些實施例中，以5'至3'順序，病毒(例如，AAV)表現構築體包含：p10啟動子及VP編碼區，該VP編碼區包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之核苷酸序列，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內，其中VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中。

在一些實施例中，VP編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座中且包含編碼VP1蛋白質、VP2蛋白質及VP3蛋白質之單一多順反子ORF，其中編碼VP1蛋白質之ORF包含ACG或ATG起始密碼子，編碼VP2蛋白質之ORF包含ACG起始密碼子，且編碼VP3蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子。表3：例示性啟動子序列

名稱	SEQ ID NO	序列
polh啟動子1	167	ATCATGGAGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAAT
polh啟動子2	2220	ATCtTGGAGATAATTAAAtTGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAAT
p10啟動子	200	GACCTTTAATTCAACCCAACACAATATATTATAGTTAAATAAGAATTATTATCAAATCATTTGTATATTAATTAAAATACTATACTGTAAATTACATTTTA
gp64啟動子	217	AAATTATCGCAAGATAAGGCGCACGTTGATTGGGTCACCCGAGTGTACGTTGATAAAGTCACGTGGGCACCCAACGCGTTGATAAGCATCGGTATATAAGGGCCTACAGTGTTCTGGTAAATCAGTTGCACTGTGCTCTTCACAGGAACACTACAAGACCTACAAG
CTX啟動子	164	tgaaactaacttacaagTtggctagtttgttaaaatacgcgctgcgcttgactcgggaatacaaagaaaacattattccacactttgatcacttgactcgattgcgcgatttaatcgacggcTtgattaaaagcgaggatgtacaacgttttaatcgcactaatcgcaatgatttaatttcggcttgcTtgcaaatcaacgttcggacgtacTtgcccaacgccacgatagatTtgcgcaaacaacccaactgtatatattttcgaatttgccaatattgccacttggaggccgacgtgccttcgcccgacgatcattcggtgtacagatacttgtgcgtcgcgtgcggcacgccgctggtcatcgaccacccgctcgacgtgttcggccacacggaggaaggcgtcaacgaactgctcgaggtgcagcgagtcaacgcgggcggggagttgtaggcgtcataactatttattaaATAAGataatttaaaaaatcgccgttaat
CTX啟動子	165	ATAAGataatttaaaaaatcgccgttaat
CTX啟動子	166	gggcggggagttgtaggcgtcataactatttattaaATAAGataatttaaaaaatcgccgttaat
gp64-polh啟動子	21	aaattatcgcaagATAAGgcgcacgttgattgggtcacccgagtgtacgttgataaagtcacgtgggcacccaacgcgttgATAAGcatCggTATATAAgggcctacagtgttctggtaaatCAGTtgcactgtgctcttcacaggaacactacaagacctacaagGctagcgtatacATCtTGGAGATAATTAAAtTGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATAgatctaccgcc

在一些實施例中，本文中所描述之桿狀病毒表現構築體或變異型桿狀病毒基因體包含有包含Rep編碼區之AAV表現構築體。在一些實施例中，AAV表現構築體可包含Rep52、Rep78、Rep40及/或Rep68蛋白質之編碼區。在一些實施例中，AAV表現構築體包含第一核苷酸序列，其包含Rep52編碼區、Rep78編碼區或其組合。在一些實施例中，第一核苷酸序列包含單一開放閱讀框架。在一些實施例中，第一核苷酸序列包含有包含Rep52編碼區之第一開放閱讀框架，及包含Rep78編碼區且與第一開放閱讀框架不同之第二開放閱讀框架。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV表現構築體中之Rep編碼區包含表4中之核苷酸序列，或編碼包含表4中提供之胺基酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)之序列之Rep蛋白質。在一些實施例中，編碼Rep52之核苷酸序列包含SEQ ID NO:201之核苷酸673-1866。在一些實施例中，經編碼之Rep52蛋白質包含SEQ ID NO:202之胺基酸225-621。在一些實施例中，Rep編碼區包含SEQ ID NO:201之核苷酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:201具有至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400或450個，但不超過500個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:201具有至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400或450個，但不超過500個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。在一些實施例中，Rep編碼區編碼SEQ ID NO:202之胺基酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列；相對於SEQ ID NO:202包含至少1、2、3、4、5、10、15或20個，但不超過30個不同胺基酸之胺基酸序列；或相對於SEQ ID NO:202之胺基酸序列包含至少1、2、3、4、5、10、15或20個，但不超過30個修飾(例如，取代(例如，保守性取代)、插入或缺失)之胺基酸序列。表4：例示性全長Rep序列

說明	SEQ ID NO:	序列
Rep78 (DNA)	201	ATGGCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAGTGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACTTGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAGTGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACTTACACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCTTAGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAACGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGACGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATTTAGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGACGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGaTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAA
Rep78 (胺基酸)	202	MAGFYEIVIKVPSDLDEHLPGISDSFVNWVAEKEWELPPDSDLDLNLIEQAPLTVAEKLQRDFLTEWRRVSKAPEALFFVQFEKGESYFHLHVLVETTGVKSLVLGRFLSQIREKLIQRIYRGIEPTLPNWFAVTKTRNGAGGGNKVVDECYIPNYLLPKTQPELQWAWTNLEQYLSACLNLTERKRLVAQHLTHVSQTQEQNKENQNPNSDAPVIRSKTSARYMELVGWLVDKGITSEKQWIQEDQASYISFNAASNSRSQIKAALDNAGKIMSLTKTAPDYLVGQQPVEDISSNRIYKILELNGYDPQYAASVFLGWATKKFGKRNTIWLFGPATTGKTNIAEAIAHTVPFYGCVNWTNENFPFNDCVDKMVIWWEEGKMTAKVVESAKAILGGSKVRVDQKCKSSAQIDPTPVIVTSNTNMCAVIDGNSTTFEHQQPLQDRMFKFELTRRLDHDFGKVTKQEVKDFFRWAKDHVVEVEHEFYVKKGGAKKRPAPSDADISEPKRVRESVAQPSTSDAEASINYADRYQNKCSRHVGMNLMLFPCRQCERMNQNSNICFTHGQKDCLECFPVSESQPVSVVKKAYQKLCYIHHIMGKVPDACTACDLVNVDLDDCIFEQ
Rep52 (DNA)	203	ATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGgtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaataa
Rep52 (胺基酸)	204	MELVGWLVDKGITSEKQWIQEDQASYISFNAASNSRSQIKAALDNAGKIMSLTKTAPDYLVGQQPVEDISSNRIYKILELNGYDPQYAASVFLGWATKKFGKRNTIWLFGPATTGKTNIAEAIAHTVPFYGCVNWTNENFPFNDCVDKMVIWWEEGKMTAKVVESAKAILGGSKVRVDQKCKSSAQIDPTPVIVTSNTNMCAVIDGNSTTFEHQQPLQDRMFKFELTRRLDHDFGKVTKQEVKDFFRWAKDHVVEVEHEFYVKKGGAKKRPAPSDADISEPKRVRESVAQPSTSDAEASINYADRYQNKCSRHVGMNLMLFPCRQCERMNQNSNICFTHGQKDCLECFPVSESQPVSVVKKAYQKLCYIHHIMGKVPDACTACDLVNVDLDDCIFEQ

在一些實施例中，Rep編碼區可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，啟動子係桿狀病毒主要晚期啟動子、病毒啟動子、昆蟲病毒啟動子、非昆蟲病毒啟動子、脊椎動物病毒啟動子、來自一或多個物種之包括病毒及非病毒元件之嵌合啟動子、合成啟動子或其變異體。在一些實施例中，啟動子係選自polh啟動子、p10啟動子、Ctx啟動子、gp64啟動子、IE啟動子、IE-1啟動子、p6.9啟動子、Dmhsp70啟動子、Hsp70啟動子、p5啟動子、p19啟動子、p35啟動子、p40啟動子或其變異體，例如功能性片段。在一些實施例中，啟動子係p10啟動子。在一些實施例中，啟動子包含表3中提供之核苷酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，啟動子包含SEQ ID NO:200之核苷酸序列，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，啟動子係p10啟動子且包含SEQ ID NO:200之核苷酸序列，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，啟動子係ctx啟動子。在一些實施例中，CTX啟動子包含表3中提供之序列，或與其實質上一致(例如，具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%或99%序列一致性)之序列。

在一些實施例中，病毒表現構築體包含第一轉錄卡匣(例如，ORF)中之Rep78編碼區。在一些實施例中，病毒表現構築體包含與包含Rep78編碼區之第一轉錄卡匣間隔開的第二轉錄卡匣(例如，ORF)中之Rep52編碼區。在一些實施例中，第一轉錄卡匣位於AAV表現構築體之第一位置，且第二轉錄卡匣位於AAV表現構築體之第二位置。在一些實施例中，第一轉錄卡匣位於AAV表現構築體之 polh基因位置。在一些實施例中，第一轉錄卡匣位於AAV表現構築體之 egt基因位置。在一些實施例中，第二轉錄卡匣位於AAV表現構築體之 polh基因座。在一些實施例中，第二轉錄卡匣位於AAV表現構築體之 egt基因座。在一些實施例中，第一轉錄卡匣位於 polh基因座且第二轉錄卡匣位於AAV表現載體之 egt基因座。在一些實施例中，第一轉錄卡匣位於 egt基因座且第二轉錄卡匣位於AAV表現載體之 polh基因座。在一些實施例中，Rep編碼區位於病毒(AAV)表現載體之p74基因位置。

在一些實施例中，非結構性蛋白質Rep52及Rep78可在利用替代性剪接受體及非典型轉譯起始密碼子調節之單一開放閱讀框架中編碼。

Rep78及Rep52皆可自單一轉錄物轉譯：Rep78轉譯起始於第一起始密碼子(AUG或非AUG)，且Rep52轉譯起始於Rep78序列內之Rep52起始密碼子(例如，AUG)。Rep78及Rep52亦可自具有獨立起始密碼子之獨立的轉錄物轉譯。Rep78序列內之Rep52起始密碼子可經突變、修飾或移除，使得對經修飾之Rep78序列之處理不會產生Rep52蛋白質。在一些實施例中，單一編碼序列用於Rep78及Rep52蛋白質，其中用於Rep78蛋白質之轉譯之起始密碼子係選自由ACG、TTG、CTG及GTG組成之群之次最佳起始密碼子，其在昆蟲細胞中之表現後實現部分外顯子跳躍，如美國專利案第8,512,981號中所描述，其內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，(i)編碼Rep78蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子且編碼Rep52蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子；(ii)編碼Rep78蛋白質之ORF包含CTG起始密碼子且編碼Rep52蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子；(iii)編碼Rep78蛋白質之ORF包含ATG起始密碼子且編碼Rep52蛋白質之ORF包含CTG起始密碼子；或(iv)編碼Rep78蛋白質之ORF包含CTG起始密碼子且編碼Rep52蛋白質之ORF包含CTG起始密碼子。

在一些實施例中，Rep編碼區包含滿足以下條件之核苷酸序列：(i)編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質；(ii)相對於Rep52蛋白質主要編碼Rep78蛋白質，例如至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的Rep78蛋白質；(iii)僅編碼Rep78蛋白質；(iv)編碼Rep78蛋白質，但不編碼Rep52蛋白質；(v)僅編碼Rep52蛋白質；或(vi)編碼Rep52蛋白質，但不編碼Rep78蛋白質。在一些實施例中，Rep編碼區包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之核苷酸序列，其中編碼Rep52蛋白質之核苷酸序列包含於編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列內。在一些實施例中，Rep編碼區包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之單一多順反子ORF。

在一些實施例中，AAV表現構築體可含有具有差異密碼子偏差之重複密碼子，例如以實現經改良之Rep蛋白質，例如Rep78及Rep52之比率，藉此改良昆蟲細胞中之病毒表現構築體及/或有效負載構築體載體之大規模(商業)產生，如美國專利案第8,697 417號中所教示，其內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，可使用美國專利案第8,642,314號中所描述之方法及構築體實現經改良之rep蛋白質之比率，其內容以全文引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，AAV表現構築體可編碼突變型細小病毒Rep多肽，該等多肽與其相應野生型Rep多肽相比具有一或多種經改良之特性，諸如在大規模製備時產生較高病毒效價。或者，其可能能夠實現產生品質更佳之病毒粒子或維持更穩定的病毒產生。在非限制性實例中，病毒表現構築體可編碼具有突變型核定位序列或鋅指域之突變型Rep多肽，如US2013/0023034中所描述，其內容以全文引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，AAV表現構築體包含第一核苷酸序列及分開的第二核苷酸序列，其中第一核苷酸序列包含Rep52編碼區及2A序列區域，且其中第二核苷酸序列包含Rep78編碼區及2A序列區域。在一些實施例中，第一核苷酸序列包含Rep52編碼區及2A序列區域。在一些實施例中，第一核苷酸序列包含Rep78編碼區及2A序列區域。在一些實施例中，第一核苷酸序列包含Rep52編碼區、Rep78編碼區及2A序列區域。在一些實施例中，第一核苷酸序列包含核苷酸序列上的位於Rep52編碼區與Rep78編碼區之間的2A序列區域。在一些實施例中，以5'端至3'端順序，第一核苷酸包含Rep52編碼區、2A序列區域及Rep78編碼區。在一些實施例中，以5'端至3'端順序，第一核苷酸包含Rep78編碼區、2A序列區域及Rep52編碼區。

在一些實施例中，第一核苷酸序列包含Rep52編碼區、Rep78編碼區及IRES序列區域。在一些實施例中，第一核苷酸序列包含核苷酸序列上的位於Rep52編碼區與Rep78編碼區之間的IRES序列區域。在一些實施例中，以5'端至3'端順序，第一核苷酸包含Rep52編碼區、IRES序列區域及Rep78編碼區。在某些實施例中，以5'端至3'端順序，第一核苷酸包含Rep78編碼區、IRES序列區域及Rep52編碼區。在一些實施例中，第一核苷酸序列包含有包含Rep52編碼區之第一開放閱讀框架、包含Rep78編碼區之第二開放閱讀框架，及位於第一開放閱讀框架與第二開放閱讀框架之間的IRES序列區域。在一些實施例中，以5'端至3'端順序，第一核苷酸序列包含有包含Rep52編碼區之第一開放閱讀框架、IRES序列區域及包含Rep78編碼區之第二開放閱讀框架。在一些實施例中，以5'端至3'端順序，第一核苷酸序列包含有包含Rep78編碼區之第一開放閱讀框架、IRES序列區域及包含Rep52編碼區之第二開放閱讀框架。

在一些實施例中，Rep52或Rep78係自桿狀病毒衍生之多面體啟動子(polh)轉錄。Rep52或Rep78亦可自較弱的啟動子轉錄，例如IE-1啟動子之缺失突變體(ΔIE-1啟動子)，其轉錄活性係IE-1啟動子之約20%。

在一些實施例中，本文中所描述之桿狀病毒表現構築體或變異型桿狀病毒基因體包含AAV表現構築體，其包含Rep編碼區，該Rep編碼區包含編碼選自以下之Rep蛋白質之核苷酸序列：Rep52、Rep40、Rep68、Rep78或其組合(例如，Rep52蛋白質及/或Rep78蛋白質)，其中Rep編碼區可操作地連接至第一啟動子及視情況選用之第二啟動子。在一些實施例中，Rep編碼區可操作地連接至第一啟動子及第二啟動子。

在一些實施例中，第一及/或第二啟動子係選自桿狀病毒啟動子、病毒啟動子、昆蟲病毒啟動子、非昆蟲病毒啟動子、脊椎動物病毒啟動子、來自一或多個物種之包括病毒及非病毒元件之嵌合啟動子、合成啟動子或其變異體。在一些實施例中，第一及/或第二啟動子係選自polh啟動子、p10啟動子、ctx啟動子、gp64啟動子、IE啟動子、IE-1啟動子、p6.9啟動子、Dmhsp70啟動子、Hsp70啟動子、p5啟動子、p19啟動子、p35啟動子、p40啟動子或其變異體，例如功能性片段。

在一些實施例中，Rep編碼區可操作地連接至第一啟動子及第二啟動子，其中(a)第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子，(b)第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子，(c)第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子，(d)第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子，(e)第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子，(f)第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子，(g)第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子，(h)第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子，(i)第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子，(j)第一啟動子係且桿狀病毒極晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子，(k)第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子，(l)第一啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子，(m)第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒早期啟動子，(n)第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子，或(o)第一啟動子係桿狀病毒晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子。

在一些實施例中，第一啟動子係桿狀病毒早期啟動子或桿狀病毒早期-(例如，gp64啟動子)。在一些實施例中，第二啟動子係桿狀病毒晚期啟動子或桿狀病毒極晚期啟動子(例如，polh啟動子)。

在一些實施例中，第一或第二啟動子係gp64啟動子(例如，OpMNPV gp64啟動子)。在一些實施例中，gp64啟動子包含SEQ ID NO:217之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。

在一些實施例中，第一或第二啟動子係polh啟動子(例如，OpMNPV polh啟動子或AcMNPV polh啟動子)。在一些實施例中，polh啟動子包含SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:220之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:220包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:220包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。

在一些實施例中，第一啟動子係gp64啟動子且第二啟動子係polh啟動子，或第一啟動子係polh啟動子且第二啟動子係gp64啟動子。在一些實施例中，第一啟動子係gp64啟動子且第二啟動子係polh啟動子，其中經組合之啟動子包含SEQ ID NO:221之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:221包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:221包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列。

在一些實施例中，第一啟動子係桿狀病毒早期-晚期啟動子且第二啟動子係桿狀病毒極晚期啟動子，例如gp64啟動子及polh啟動子，視情況其中Rep編碼區位於同源重複序列區hr5之下游。

桿狀病毒早期啟動子、早期-晚期啟動子、晚期啟動子及極晚期啟動子詳細描述於例如Chen等人( Journal of Virology2013;87:6391-405，其內容以全文引用之方式併入本文中；尤其參見Chen等人之補充表S2)中。在一些實施例中，本文中所描述之桿狀病毒表現構築體、變異型桿狀病毒基因體或AAV表現構築體中使用之啟動子係Chen等人( Journal of Virology2013;87:6391-405，其內容以全文引用之方式併入本文中；尤其參見Chen等人之補充表S2)中提供之啟動子。

在一些實施例中，桿狀病毒早期啟動子係由宿主細胞RNA聚合酶II識別且可含有TATA盒模體及/或CATG模體。在一些實施例中，由桿狀病毒早期啟動子起始之轉錄係α-阿馬那汀(α-amanatin)抗性。例示性桿狀病毒早期啟動子包括(但不限於) lef3啟動子、dbp啟動子、p35啟動子、orf82啟動子、get啟動子、orf81啟動子、orf122啟動子、pk-2啟動子、orf55啟動子、etl啟動子、hcf-1啟動子、etm啟動子、lef-2啟動子、lef-6啟動子、orf84啟動子、orf118啟動子及orf111啟動子。

在一些實施例中，桿狀病毒早期-晚期啟動子可含有早期啟動子及晚期啟動子之組分。在一些實施例中，早期-晚期啟動子可包含例如TATA盒模體及/或CATG模體及TAAG模體(例如，ATAAG核苷酸序列)。例示性桿狀病毒早期-晚期啟動子包括(但不限於) lef2啟動子、orf13啟動子、orf23啟動子、pkip啟動子、v-fgf啟動子、pp31啟動子、odv-e66啟動子、orf74啟動子、orf79啟動子、orf82啟動子、p15啟動子、cg30啟動子、解螺旋酶啟動子、he65啟動子、orf114啟動子、pk-2啟動子、gp64啟動子、gp16啟動子、alk-exo啟動子、p35啟動子、me53啟動子或ie0啟動子。在一些實施例中，第一或第二啟動子係早期-晚期啟動子，如gp64啟動子。在一些實施例中，第一或第二啟動子係早期-晚期啟動子，如OpMNPV gp64啟動子。gp64啟動子描述於例如Garrity等人, Virology1997;231:167-81以及Blissard及Rohrmann. Virology1989;170:537-55中，其內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，第一或第二啟動子係p35啟動子，例如Hershberger等人, J. Virology1994;68:3467-77以及Nissen及Friesen. J. Virology1989;63:493-503中所描述，其內容各自以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，第一或第二啟動子係v-fgf啟動子，例如Detvisitsakun等人, Virology2005;336:308-17中所描述，其內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，第一或第二啟動子係pp31啟動子，例如Guarino及Summers. J. Virology1986;57:563-71中所描述，其內容以全文引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，桿狀病毒晚期啟動子係由桿狀病毒RNA聚合酶識別。晚期啟動子可包含例如TAAG模體(例如，ATAAG核苷酸序列)。例示性桿狀病毒晚期啟動子包括(但不限於) ptpase啟動子、Ac-bro啟動子、ctx啟動子、orf5啟動子、orf19啟動子、orf20啟動子、sod啟動子、HisP啟動子、orf34啟動子、v-ubi啟動子、orf38啟動子、orf43啟動子、orf44啟動子、orf56啟動子、orf59啟動子、orf60啟動子及fp-25k啟動子。

在一些實施例中，桿狀病毒極晚期啟動子係由病毒(例如，桿狀病毒) RNA聚合酶及極晚期因子1 (VLF-1)識別。在一些實施例中，極晚期啟動子可包含例如TAAG模體(例如，ATAAG核苷酸序列)及/或近端破裂元件序列。在一些實施例中，VLF-1結合於破裂元件序列。例示性桿狀病毒晚期啟動子包括(但不限於)p10啟動子及polh啟動子。在一些實施例中，第一或第二啟動子係polh啟動子。在一些實施例中，第一或第二啟動子係OpMNPV polh啟動子。

在一些實施例中，以5'至3'順序，本文中所描述之病毒表現構築體包含：第一啟動子(例如，桿狀病毒早期-晚期啟動子，諸如gp64啟動子)、第二啟動子(例如，桿狀病毒極晚期啟動子，諸如polh啟動子)及Rep編碼區，其包含編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之核苷酸序列，例如編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質之單一多順反子ORF。

在一些實施例中，Rep編碼區位於同源重複序列區hr5之下游。在一些實施例中，Rep編碼區位於變異型桿狀病毒基因體之p74基因座中，且可操作地連接至gp64啟動子及polh啟動子。

在一些實施例中，第一啟動子引起VP編碼區之轉錄之前的Rep編碼區之轉錄。在一些實施例中，第一及第二啟動子引起VP編碼區之轉錄之前的Rep編碼區之轉錄。

在一些實施例中，本文中所描述之桿狀病毒表現構築體或變異型桿狀病毒基因體包含編碼組裝活化蛋白質(AAP)蛋白質之核苷酸序列。在一些實施例中，AAP蛋白質位於變異型桿狀病毒基因體中之以下之位置：ChiA、v-cath、p10、egt、多角體蛋白、SOD、ctx、p26、odv-e56、p74 (PIF0)、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94。在一些實施例中，AAP蛋白質位於p10、p26及/或p74基因座中，視情況其中p10、p26及/或p74基因係缺失的。在一些實施例中，編碼AAP蛋白質之核苷酸序列可操作地連接至啟動子，例如gp64啟動子(例如，包含SEQ ID NO:217之核苷酸序列；與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個不同核苷酸之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:217包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過十個修飾(例如，取代)之核苷酸序列之啟動子)。在一些實施例中，經編碼之AAP蛋白質係AAV2 AAP蛋白質。在一些實施例中，經編碼之AAP蛋白質包含SEQ ID NO:218之胺基酸序列；與SEQ ID NO:218包含至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列；相對於SEQ ID NO:218包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過30、20或10個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之胺基酸序列；或相對於SEQ ID NO:218包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過30、20或10個不同胺基酸之胺基酸序列。在一些實施例中，編碼AAP蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO:219之核苷酸序列；與SEQ ID NO:219包含至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:219包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但不超過30、20或10個修飾，例如取代(例如，保守性取代)、插入或缺失之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:219包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個，但不超過30、20或10個不同核苷酸之核苷酸序列。表5：例示性AAP蛋白質序列

說明	SEQ ID NO:	序列
AAP (胺基酸)	218	METQTQYLTPSLSDSHQQPPLVWELIRWLQAVAHQWQTITRAPTEWVIPREIGIAIPHGWATESSPPAPEPGPCPPTTTTSTNKFPANQEPRTTITTLATAPLGGILTSTDSTATFHHVTGKDSSTTTGDSDPRDSTSSSLTFKSKRSRRMTVRRRLPITLPARFRCLLTRSTSSRTSSARRIKDASRRSQQTSSWCHSMDTSP
AAP (DNA)	219	ATGGAGACACAGACGCAGTACCTGACGCCATCATTGTCTGATAGCCATCAGCAGCCTCCGCTTGTATGGGAACTTATACGTTGGCTCCAGGCCGTCGCCCATCAATGGCAGACGATCACTAGGGCTCCTACCGAATGGGTAATCCCCAGAGAGATTGGTATCGCCATCCCCCATGGCTGGGCTACCGAATCATCTCCTCCCGCCCCTGAGCCAGGTCCTTGTCCTCCGACAACTACAACTTCGACGAATAAATTCCCGGCTAACCAAGAGCCACGTACTACCATCACAACTTTGGCAACAGCTCCACTGGGTGGAATACTCACAAGCACAGACTCGACTGCTACGTTCCACCATGTGACAGGTAAGGATAGTAGTACAACGACCGGCGACTCTGATCCAAGGGACTCTACGTCATCGTCTTTGACTTTTAAGTCGAAAAGAAGCCGTCGTATGACTGTTCGTCGCAGGCTTCCCATTACCCTTCCCGCTAGGTTCAGATGCCTCCTTACACGCAGTACCAGTTCCAGAACTTCATCGGCTAGGAGAATAAAGGATGCTTCTAGACGCAGCCAACAAACTAGTTCATGGTGCCATTCCATGGACACTAGCCCAAGCGGAGACTATAAGGATGATGACGACAAGTAATAA

在一些實施例中，本文中所描述之桿狀病毒表現構築體或桿狀病毒變異型基因體包含小型順反子。在一些實施例中，小型順反子序列係來自桿狀病毒基因；視情況來自桿狀病毒gp64基因。在一些實施例中，小型順反子序列包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10；與SEQ ID NO:9或10至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；相對於SEQ ID NO:9或10包含一個、兩個或三個修飾(例如，取代)，但不超過四個修飾(例如，取代)之核苷酸序列；或相對於SEQ ID NO:9或10包含一個、兩個或三個，但不超過四個不同核苷酸之核苷酸序列。表6：例示性小型順反子序列

說明	SEQ ID NO:	序列
小型順反子變異體1	9	ATGAACAAAGATTAA
小型順反子變異體2	10	ATGCCTCAATGCTACTAG

在一些實施例中，本文中所描述之桿狀病毒表現構築體或桿狀病毒變異型基因體包含經修飾之Kozak序列。在一些實施例中，經修飾之Kozak序列位於VP編碼區，例如VP1、VP2或VP3編碼區之上游。在一些實施例中，經修飾之Kozak序列位於Rep編碼區，例如Rep52編碼區或Rep78編碼區之上游。在一些實施例中，經修飾之Kozak序列包含表7中提供之序列。在一些實施例中，經修飾之Kozak序列包含表8中提供之序列。在一些實施例中，經修飾之Kozak序列包含以下中所描述之序列：Noderer, William L.等人, 「Quantitative analysis of mammalian translation initiation sites by FACS-seq.」 Molecular systems biology 10.8 (2014): 748；及Diaz de Arce等人, 「Complete motif analysis of sequence requirements for translation initiation at non-AUG start codons」 Nucleic Acids Res. 2018年1月, 46(2):985-994；及Kondratov等人, 「Direct Head-to-Head Evaluation of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors Manufactured in Human versus Insect Cells」 Molecular Therapy. 2017年12月, 25(12):2661-2675，其內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，經修飾之Kozak序列包含US20200123572、WO2017181162及WO2021222472中提供之序列，其內容以全文引用之方式併入本文中。表7：例示性經修飾之Kozak序列

名稱	序列 (RNA)	SEQ ID NO:	序列 (DNA)	SEQ ID NO:
VP1aug13	cgguguAUGgc	21	cggtgtATGgc	32
VP1aug14	cgguguAUGag	22	cggtgtATGag	33
VP1aug28	uaguggAUGag	23	tagtggATGag	34
VP1aug29	uauuggAUGag	24	tattggATGag	35
VP1aug30	caguggAUGag	25	cagtggATGag	36
VP1aug31	cauuggAUGag	26	cattggATGag	37
VP1aug32	ugguggAUGag	27	tggtggATGag	38
VP1aug33	aauuggAUGag	28	aattggATGag	39
VP1aug34	aaguggAUGag	29	aagtggATGag	40
VP1aug35	ccguggAUGag	30	ccgtggATGag	41
VP1aug36	ggguggAUGag	31	gggtggATGag	42
VP1aug52	agguguAUGgc	222	aggtgtATGgc	223

表8：例示性經修飾之Kozak序列

序列 (RNA)	SEQ ID NO:	序列 (DNA)	SEQ ID NO:
UAGUGUAUGUC	73	TAGTGTATGTC	118
UAGUUUAUGUC	74	TAGTTTATGTC	119
UGUUUUAUGUC	75	TGTTTTATGTC	120
UCUUUUAUGUC	76	TCTTTTATGTC	121
UAGUGUAUGGG	77	TAGTGTATGGG	122
UAGUUUAUGGG	78	TAGTTTATGGG	123
UGUUUUAUGGG	79	TGTTTTATGGG	124
UCUUUUAUGGG	80	TCTTTTATGGG	125
UAGUGUAUGGC	81	TAGTGTATGGC	126
UAGUUUAUGGC	82	TAGTTTATGGC	127
UGUUUUAUGGC	83	TGTTTTATGGC	128
UCUUUUAUGGC	84	TCTTTTATGGC	129
CAUUGUAUGUC	85	CATTGTATGTC	130
UCGUUUAUGGA	86	TCGTTTATGGA	131
CAGUUUAUGGU	87	CAGTTTATGGT	132
CAUUGUAUGGU	88	CATTGTATGGT	133
UAGUGUAUGCU	89	TAGTGTATGCT	134
CAUUGUAUGCU	90	CATTGTATGCT	135
UCUUUUAUGUC	91	TCTTTTATGTC	136
UGUUUUAUGUC	92	TGTTTTATGTC	137
UAGUUUAUGUC	93	TAGTTTATGTC	138
UAGUGUAUGUC	94	TAGTGTATGTC	139
CGACAUGAAUGUC	95	CGACATGAATGTC	140
AGGGAUGGAUGUC	96	AGGGATGGATGTC	141
CUUGAUGGAUGUC	97	CTTGATGGATGTC	142
CGUGAUGUAUGUC	98	CGTGATGTATGTC	143
GGCGAUGGAUGUC	99	GGCGATGGATGTC	144
CGUGAUGGAUGUC	100	CGTGATGGATGTC	145
CGUAAUGCAUGUC	101	CGTAATGCATGTC	146
GAACAUGAAUGUC	102	GAACATGAATGTC	147
GGACAUGCAUGUC	103	GGACATGCATGTC	148
AAGAAUGAAUGUC	104	AAGAATGAATGTC	149
CCCGAUGGAUGUC	105	CCCGATGGATGTC	150
GCCGAUGUAUGUC	106	GCCGATGTATGTC	151
CGGGAUGAAUGUC	107	CGGGATGAATGTC	152
GACCAUGCAUGGCU	108	GACCATGCATGGCT	153
AAUUAUGCAUGGC	109	AATTATGCATGGC	154
AGACAUGUAUGGC	110	AGACATGTATGGC	155
AAGAAUGUAUGGC	111	AAGAATGTATGGC	156
GACCAUGCAUGGCU	112	GACCATGCATGGCT	157
CGCGAUGGAUGGC	113	CGCGATGGATGGC	158
AGCGAUGGAUGGC	114	AGCGATGGATGGC	159
GAUCAUGCAUGGC	115	GATCATGCATGGC	160
CGUAAUGGAUGGC	116	CGTAATGGATGGC	161
AACGAUGUAUGGC	117	AACGATGTATGGC	162

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含插入一或多個非必需桿狀病毒基因之基因座中的一或多個(例如，1、2、3、4或5個或更多個)聚核苷酸插入物(例如，Rep編碼區及/或VP編碼區)。在一些實施例中，非必需桿狀病毒基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)係選自egt、p74 (PIF0)、p26、SOD、ChiA、v-cath、p10、多角體蛋白、ctx、odv-e56、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體包含桿狀病毒基因體，例如變異型桿狀病毒基因體之至少一部分，其包含至少兩個非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)之破壞，其中該至少兩個非必需基因係獨立地選自egt、p74 (PIF0)、p26、SOD、ChiA、v-cath、p10、多角體蛋白、ctx、odv-e56、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94。在一些實施例中，該至少兩個非必需基因包含(i) (i) v-cath及egt；(ii) v-cath、egt及SOD；(iii) chiA、v-cath、egt、p26、p10及p74；(iv) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74及SOD；或(v) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74、SOD、AcORF-91及AcORF-108；或(vi) chiA、v-cath、egt、p26、p10、p74及SOD。在一些實施例中，破壞包含chiA基因、v-cath基因、p26基因、p10基因、p74基因及/或SOD基因或其一部分之缺失。在一些實施例中，該至少兩個非必需基因中之一者係p74基因，其位於同源重複序列區5 (hr5)之下游。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體或變異型桿狀病毒基因體包含Rep編碼區，其位於(例如，且破壞)變異型桿狀病毒基因體之p74基因座。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體或變異型桿狀病毒基因體包含AAV表現構築體。在一些實施例中，AAV表現構築體包含VP編碼區，其位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座。在一些實施例中，AAV表現構築體包含有效負載編碼區，其位於(例如，且破壞)變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座。在一些實施例中，AAV表現構築體包含Rep編碼區，其位於(例如，且破壞)變異型桿狀病毒基因體之p74基因座，及VP編碼區，其位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座。在一些實施例中，AAV表現構築體包含Rep編碼區，其位於(例如，且破壞)變異型桿狀病毒基因體之p74基因座；VP編碼區，其位於(例如，且破壞)變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座；及有效負載編碼區，其位於(例如，且破壞)變異型桿狀病毒基因體之v-cath基因座。

在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體或變異型桿狀病毒基因體包含(i)Rep編碼區，其位於變異型桿狀病毒基因體之p74基因座，視情況其中Rep編碼區(例如，Rep編碼區編碼Rep78蛋白質及Rep52蛋白質，其中編碼Rep52蛋白質之核苷酸序列包含於編碼Rep78蛋白質之核苷酸序列內)可操作地連接至gp64啟動子及polh啟動子；(ii)VP編碼區(例如，其中編碼VP2蛋白質之核苷酸序列及編碼VP3蛋白質之核苷酸序列包含於編碼VP1蛋白質之核苷酸序列內之VP編碼區)，其位於變異型桿狀病毒基因體之SOD基因座，視情況其中VP編碼區可操作地連接至p10啟動子；及(iii)有效負載編碼區，其位於變異型桿狀病毒之v-cath基因座且包含編碼有效負載之核苷酸序列。 桿狀病毒產生系統

在一些實施例中，使用桿狀病毒表現構築體及有效負載構築體在桿狀病毒系統中產生AAV粒子或病毒載體。在一些實施例中，桿狀病毒系統包含桿狀病毒表現構築體(例如，桿狀病毒質體)及/或經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)。在一些實施例中，桿狀病毒表現構築體及有效負載構築體可為例如本文中所描述之桿狀病毒質體、桿狀病毒表現構築體或BAC。獨立病毒複製細胞群體之轉染生產兩組或更多組(例如兩組、三組)桿狀病毒(BEV)，其中一或多個可包含病毒表現構築體(例如桿狀病毒為「表現BEV」或「表現Bac」)，且一或多種組可包含有效負載構築體(例如桿狀病毒為「有效負載BEV」或「有效負載Bac」)。桿狀病毒可用於感染病毒產生細胞以產生AAV粒子或病毒載體。

在一些實施例中，方法包含轉染單一病毒複製細胞群體以產生單一桿狀病毒(BEV)組，其包含本文中所描述之桿狀病毒表現構築體及本文中所描述之有效負載構築體。此等桿狀病毒可用於感染病毒產生細胞以產生AAV粒子或病毒載體。

在一些實施例中，使用桿狀病毒質體轉染劑，諸如Promega FuGENE HD、WFI水或ThermoFisher Cellfectin II試劑製備BEV。在一些實施例中，在病毒產生細胞，諸如昆蟲細胞中產生及擴增BEV。

在一些實施例中，方法利用包含一或多種BEV，包含經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)的病毒產生細胞之種菌培養物。種子BIIC已由包含本文中所描述之桿狀病毒表現構築體之表現BEV及包含本文中所描述之有效負載構築體之有效負載BEV轉染/轉導/感染。在一些實施例中，收集種菌培養物，將其分成等分試樣且冷凍，且可在稍後的時間使用以起始原生產生細胞群體之轉染/轉導/感染。

用於在包含(但不限於)草地黏蟲(Sf9)細胞之昆蟲細胞中產生AAV粒子之桿狀病毒表現載體(BEV)提供高效價之病毒載體產物。編碼本文中所描述之桿狀病毒表現構築體及本文中所描述之有效負載構築體之重組桿狀病毒起始病毒載體複製細胞之產生性感染。由初次感染釋放之感染性桿狀病毒粒子在培養物中二次感染其他細胞，在多個感染週期中以指數方式感染整個細胞培養物群體，其為初始感染倍率之函數，參見Urabe, M.等人, J Virol. 2006年2月;80(4):1874-85，其關於BEV及病毒粒子之產生及用途之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。

在一些實施例中，產生系統利用無效價感染細胞保存及按比例擴大系統來解決在多次繼代時桿狀病毒之不穩定性。病毒產生細胞之小規模種菌培養物經編碼AAV粒子之結構性及/或非結構性組分的桿狀病毒表現構築體轉染。將經桿狀病毒感染之病毒產生細胞收集為可在液氮中冷凍保存之等分試樣；該等等分試樣保留感染大規模病毒產生細胞培養物之存活率及感染性，Wasilko DJ等人, Protein Expr Purif. 2009年6月;65(2):122-32，其關於BEV及病毒粒子之產生及用途的內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。

遺傳穩定之桿狀病毒可用於產生用以在無脊椎細胞中產生AAV粒子之組分中的一或多者之來源。在一些實施例中，缺陷性桿狀病毒表現構築體可以游離方式維持在昆蟲細胞中。在此類實施例中，相應的桿狀病毒表現構築體用複製控制元件，包含(但不限於)啟動子、強化子及/或細胞週期調節之複製元件來工程改造。

在一些實施例中，桿狀病毒可用標記物工程改造以用於重組至殼質酶/組織蛋白酶基因座中。chia/v-cath基因座對於在組織培養物中繁殖桿狀病毒係非必需的，且V-cath (EC 3.4.22.50)係對含有Arg-Arg二肽之受質具有最強活性之半胱胺酸內切蛋白酶。Arg-Arg二肽存在於濃核病毒及細小病毒衣殼結構性蛋白質中，但偶爾出現於依賴病毒VP1中。

在一些實施例中，允許進行桿狀病毒感染之穩定病毒產生細胞經AAV複製及載體產生所必需的任何元件之至少一個穩定整合複本工程改造，該等元件包含(但不限於)整個AAV基因體、Rep及Cap基因、Rep基因、Cap基因、呈獨立的轉錄卡匣形式之各Rep蛋白質、呈獨立的轉錄卡匣形式之各VP蛋白質、AAP (組裝活化蛋白質)或具有原生或非原生啟動子之桿狀病毒輔助基因中之至少一者。

在一些實施例中，桿狀病毒接種物庫可使用小比例搖瓶，諸如3L或5L搖瓶產生。在一些實施例中，桿狀病毒接種物庫可使用生物反應器，諸如20-50L生物反應器產生。

在一些實施例中，灌注技術可用於產生桿狀病毒接種物庫。灌注系統係流體循環系統，其使用泵、過濾器與篩網之組合來保持生物反應器內部之細胞，同時持續地移除細胞廢棄物及藉由細胞代謝來置換缺乏營養的培養基。在一些實施例中，灌注系統係交替切向流(ATF)灌注系統。在一些實施例中，在製備經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)期間，灌注系統可與生物反應器結合使用以管理及循環生物反應器內之細胞培養基。在一些實施例中，灌注系統可用於支持大規模製備具有出乎意料的高細胞密度之高品質BIIC庫。在一些實施例中，灌注系統可用於提供大於70% (例如，75-80%、80-85%、85-90%、90-95%或95-100%)之感染細胞與產物細胞之產率。在一些實施例中，灌注系統可用於進行生物反應器內之培養基切換，諸如用允許冷凍及保藏BIIC細胞之冷凍保存培養基更換細胞培養基。

本文中亦提供用於製備經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)，例如表現BIIC及/或有效負載BIIC之方法。在一些實施例中，方法包含以下步驟：(a)將一體積之細胞培養基引入生物反應器中；(b)將至少一種病毒產生細胞(VPC)引入生物反應器中且至生物反應器中將VPC之數目擴增至目標VPC細胞密度；(c)將至少一種桿狀病毒表現載體(BEV)引入生物反應器中，其中BEV包含AAV病毒表現構築體或AAV有效負載構築體；(d)在生物反應器中，在允許至少一個BEV感染至少一個VPC以產生經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)之條件下培育VPC及BEV之混合物；(e)在允許生物反應器中之BIIC之數目達到目標BIIC細胞密度之條件下培育生物反應器；及(f)自生物反應器收集BIIC。在一些實施例中，生物反應器具有至少5 L、10 L、20 L、50 L、100 L或200 L之體積。在一些實施例中，生物反應器中之細胞培養基之體積(亦即，工作體積)係至少5 L、10 L、20 L、50 L、100 L或200 L。

在一些實施例中，本文中提供用於產生包含編碼有效負載之聚核苷酸之腺相關病毒(AAV)之方法，該方法包含： (a) 在生物反應器中將VPC培養至目標細胞密度，其中生物反應器包含本文中所描述之細胞培養基， (b) 將至少一種包含本文中所描述之桿狀病毒表現構築體之桿狀病毒(表現Bac)及至少一種包含本文中所描述之有效負載構築體之桿狀病毒(有效負載Bac)引入生物反應器中，其中桿狀病毒表現構築體包含腺相關病毒(AAV)病毒表現構築體，且其中有效負載構築體包含編碼有效負載之聚核苷酸，及 (c) 在生物反應器中，在引起一或多種VPC內產生一或多種AAV之條件下培育VPC，其中一或多種AAV包含編碼有效負載之聚核苷酸。在一些實施例中，該方法進一步包含自生物反應器收集病毒產生池之步驟，其中病毒產生池包含有一或多種包含一或多種AAV之VPC。

在一些實施例中，本文中提供用於產生包含編碼有效負載之聚核苷酸之腺相關病毒(AAV)之方法，該方法包含： (a) 提供病毒產生細胞(VPC)，其包含有至少一種包含AAV病毒表現構築體之桿狀病毒(表現Bac)及至少一種包含編碼有效負載之聚核苷酸之桿狀病毒(有效負載Bac)；及 (b) 在本文中所描述之細胞培養基一個，在適於產生包含有效負載之AAV之條件下培養VPC；藉此產生包含有效負載之AAV。在一些實施例中，在步驟(a)之前，將至少一種包含AAV病毒表現構築體之桿狀病毒(表現Bac)及至少一種包含編碼有效負載之聚核苷酸之桿狀病毒(有效負載Bac)引入VPC中。在一些實施例中，該方法包含收集AAV之額外步驟(c)。

在一些實施例中，相同桿狀病毒包含AAV病毒表現構築體，及編碼有效負載之聚核苷酸。在一些實施例中，不同桿狀病毒包含AAV病毒表現構築體及編碼有效負載之聚核苷酸。

在一些實施例中，至少一種表現Bac包含於至少一種VPC，例如昆蟲細胞(表現BIIC)中，及/或至少一種有效負載Bac包含於至少一種VPC，例如昆蟲細胞(有效負載BIIC)中。

在一些實施例中，VPC係昆蟲細胞。在一些實施例中，昆蟲細胞係Sf9細胞。

在一些實施例中，本文中提供藉由本文中所描述之方法產生之AAV。

在一些實施例中，生物反應器可包含用於管理生物反應器內之細胞培養基之灌注系統。在一些實施例中，灌注系統係交替切向流(ATF)灌注系統。

在一些實施例中，使用BIIC (表現BIIC、有效負載BIIC)轉染病毒產生細胞，例如Sf9細胞。在一些實施例中，使用包含桿狀病毒質體之桿狀病毒轉染病毒產生細胞，例如Sf9細胞。 治療性應用

本發明提供用於治療個體，包括人類個體中之疾病、病症及/或病狀之方法，其包含向個體投與本文中所描述之AAV粒子，例如包含AAV衣殼多肽之AAV粒子，或向個體投與任何所描述之組合物，包括本文中所描述之醫藥組合物。

在一些實施例中，向個體防治性投與本文中所描述之AAV粒子以預防疾病發作。在另一實施例中，投與AAV粒子(例如，本文中所描述之AAV)以治療疾病或其症狀(例如，減輕其作用)。在另一實施例中，投與本文中所描述之AAV粒子以治癒(消除)疾病。在另一實施例中，投與本文中所描述之AAV粒子以預防或減緩疾病之進展。在另一實施例中，使用本文中所描述之AAV粒子逆轉疾病之不利影響。可藉由此項技術中已知的標準方法測定或監測疾病狀態及/或進展。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善遺傳病症，例如體染色體顯性遺傳病症、體染色體隱性遺傳病、X性聯顯性遺傳病症、X性聯隱性遺傳病症或Y性聯遺傳病症。在一些實施例中，遺傳病症係單基因病症或多基因病症。在一些實施例中，遺傳病症，例如單基因性病症之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。

在一些實施例中，本文提供用於治療個體之神經病症及/或神經退化性病症之方法，其包含向個體投與有效量之本文中所描述之醫藥組合物或包含本文中所描述之AAV衣殼多肽之AAV粒子，例如複數個粒子。在一些實施例中，神經病症及/或神經退化性病症之治療包含預防該神經病症及/或神經退化性病症。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善神經疾病及/或病症。在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善Tau蛋白病變。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子係用於治療、預防、減輕或改善阿茲海默氏病(Alzheimer's Disease)。在一些實施例中，阿茲海默氏病之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽編碼之AAV粒子之有效負載包含ApoE2蛋白質、ApoE4蛋白質、ApoE3蛋白質、BDNF蛋白質、CYP46A1蛋白質、克羅索蛋白質(Klotho protein)、弗拉塔凱(fractalkine；FKN)蛋白質、腦啡肽酶蛋白質(NEP)、CD74蛋白質、窖蛋白-1或其組合或變異體。在一些實施例中，阿茲海默氏病之治療包含使用描述之AAV粒子以減少tau基因及/或蛋白質、共核蛋白基因及/或蛋白質或其組合或變異體之表現。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含結合於tau或共核蛋白之抗體、用於抑制tau或共核蛋白之RNAi試劑、用於改變tau或共核蛋白表現之基因編輯系統(例如，CRISPR-Cas系統)或其組合。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子係治療、預防、減輕或改善額顳葉癡呆。在一些實施例中，額顳葉癡呆之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含顆粒蛋白前體蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善弗里德希氏共濟失調(Friedreich's ataxia)或任何由共濟蛋白之損失或部分損失引起之疾病。在一些實施例中，弗里德希氏共濟失調之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善帕金森氏病(Parkinson's Disease)。在一些實施例中，帕金森氏病之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼變異體之AAV粒子編碼之有效負載包含AADC蛋白質、GAD蛋白質、GDNF蛋白質、TH-GCH1蛋白質、GBA蛋白質、AIMP2-DX2蛋白質或其組合或變異體。在一些實施例中，帕金森氏病之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因減弱療法或基因編輯療法(例如，基因剔除、抑制或校正)。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼變異體之AAV粒子編碼之有效負載包含調節劑，例如RNAi試劑或CRISPR-Cas系統，以用於改變α-突觸核蛋白基因、mRNA及/或蛋白質或其變異體之表現。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善AADC不足。在一些實施例中，AADC不足之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼變異體之AAV粒子編碼之有效負載包含AADC蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善肌肉萎縮性側索硬化(ALS)。在一些實施例中，ALS之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼變異體之AAV粒子編碼之有效負載包含TDP-43蛋白質、UPF1蛋白質、C9orf72蛋白質、CCNF蛋白質、HSF1蛋白質、因子H蛋白質、NGF蛋白質、ADAR2蛋白質、GDNF蛋白質、VEGF蛋白質、HGF蛋白質、NRTN蛋白質、AIMP2-DX2蛋白質或其組合或變異體。在一些實施例中，ALS之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因減弱療法或基因編輯療法(例如，基因剔除、抑制或校正)。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含調節劑，例如RNAi試劑或CRISPR-Cas系統，以用於改變SOD1或C9ORF72基因、mRNA及/或蛋白質或其組合或變異體之表現。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善杭丁頓氏病(Huntington's Disease)。在一些實施例中，ALS之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因減弱(例如，基因剔除)療法或基因編輯療法(例如，基因剔除、抑制或校正)。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼變異體之AAV粒子編碼之有效負載包含調節劑，例如RNAi試劑或CRISPR-Cas系統，以用於改變HTT基因、mRNA及/或蛋白質或其變異體之表現。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善脊髓性肌萎縮。在一些實施例中，脊髓性肌萎縮之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼變異體之AAV粒子編碼之有效負載包含SMN1蛋白質、SMN2蛋白質或其組合或變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善多發性系統萎縮症。在一些實施例中，多發性系統萎縮症之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善高歇氏病(Gaucher disease；GD) (例如，1型GD、2型GD或3型GD)。在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善與GBA突變相關之帕金森氏病。在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善路易體癡呆(dementia with Lewy Bodies；DLB)。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善腦白質失養症(例如亞歷山大氏疾病)、伴有自主神經疾病之體染色體顯性腦白質失養症(ADLD)、腎上腺腦白質營養不良(ALD)、卡納萬疾病(Canavan Disease)、腦腱性黃色瘤症(CTX)、異染性腦白質營養不良(MLD)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher Disease)或雷夫蘇姆疾病(Refsum Disease)。在一些實施例中，MLD之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼變異體之AAV粒子編碼之有效負載包含ARSA蛋白質或其變異體。在一些實施例中，ALD之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含ABCD-1蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善巨腦性腦白質病(MLC)。在一些實施例中，MLC之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含MLC1蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善克拉培疾病(Krabbe disease)。在一些實施例中，克拉培疾病之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含GALC蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善黏多醣病，例如I型(MPS I)、II型(MPS II)、IIIA型(MPS IIIA)、IIIB型(MPS IIIB)或IIIC型(MPS IIIC)。在一些實施例中，黏多醣病之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法或基因編輯療法(例如，增強或校正)。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼或校正之有效負載包含IDUA蛋白質、IDS蛋白質、SGSH蛋白質、NAGLU蛋白質、HGSNAT蛋白質或其組合或變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善巴氏病(Batten)/NCL。在一些實施例中，巴氏病/NCL之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由本文中所描述之AAV粒子編碼之有效負載包含CLN1蛋白質、CLN2蛋白質、CLN3蛋白質、CLN5蛋白質、CLN6蛋白質、CLN7蛋白質、CLN8蛋白質或其組合或變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善雷特氏症候群(Rett Syndrome)。在一些實施例中，雷特氏症候群之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子(例如，包含本文中所描述之AAV衣殼多肽之AAV粒子)進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含MeCP2蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善安格爾曼氏症候群(Angelman Syndrome)。在一些實施例中，安格爾曼氏症候群之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含UBE3A蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善脆弱X染色體症候群(Fragile X Syndrome)。在一些實施例中，脆弱X染色體症候群之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽編碼之AAV粒子之有效負載包含瑞林蛋白質(Reelin protein)、DgkK蛋白質、FMR1蛋白質或其組合或變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善卡納萬疾病。在一些實施例中，卡納萬疾病之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含ASPA蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善神經節苷脂症，例如GM1神經節苷脂症或GM2神經節苷脂症(例如，泰-薩克斯桑多霍夫氏病(Tay Sachs Sandhoff))。在一些實施例中，神經節苷脂症，例如GM1神經節苷脂症或GM2神經節苷脂症(例如，泰-薩克斯桑多霍夫氏病)之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含GLB1蛋白質、HEXA蛋白質、HEXB蛋白質、GM2A蛋白質或其組合或變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善GM3合酶不足。在一些實施例中，GM3合酶不足之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含ST3GAL5蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善尼曼-匹克病症(Niemann-Pick disorder)，例如尼曼-匹克A或尼曼-匹克C1 (NPC-1)。在一些實施例中，尼曼-匹克病症，例如尼曼-匹克A或尼曼-匹克C1 (NPC-1)之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含ASM蛋白質、NPC1蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善神經鞘瘤(例如，神經瘤)。在一些實施例中，神經鞘瘤(例如，神經瘤)之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含凋亡蛋白酶-1蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善結節性硬化症，例如1型結節性硬化症或2型結節性硬化症。在一些實施例中，結節性硬化症，例如1型結節性硬化症或2型結節性硬化症之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含TSC1蛋白質、TSC2蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善CDKL5不足。在一些實施例中，CDKL5不足之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含CDKL5蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善恰克-馬利-杜斯氏病症(Charcot-Marie-Tooth disorder)，例如1X型恰克-馬利-杜斯氏(CMT1X)病症、2A型恰克-馬利-杜斯氏(CMT2A)病症或4J型恰克-馬利-杜斯氏(CMT4J)病症。在一些實施例中，恰克-馬利-杜斯氏病症，例如1X型恰克-馬利-杜斯氏(CMT1X)病症、2A型恰克-馬利-杜斯氏(CMT2A)病症或4J型恰克-馬利-杜斯氏(CMT4J)病症之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含GJB1蛋白質、MFN2蛋白質、FIG4蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善天冬胺醯葡萄糖胺尿症(AGU)。在一些實施例中，AGU之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含AGA蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善萊氏症候群(Leigh Syndrome)。在一些實施例中，萊氏症候群之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含SURF1蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善癲癇症。在一些實施例中，癲癇症之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含NPY/Y2蛋白質、甘丙胺素(Galanin)蛋白質、強啡肽(Dynorphin)蛋白質、AIMP2-DX2蛋白質、SLC6A1蛋白質、SLC13A5蛋白質、KCNQ2蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善德拉韋症候群(Dravet Syndrome)。在一些實施例中，德拉韋症候群之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含SCN1a蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善杜氏肌營養不良(Duchenne muscular dystrophy；DMD)。在一些實施例中，DMD之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法或增強(例如，外顯子跳躍之校正)，或基因編輯療法(例如，增強或校正)。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼或校正之有效負載包含肌縮蛋白(Dystrophin)基因及/或蛋白質、肌營養相關蛋白(Utrophin)基因及/或蛋白質，或GALGT2基因及/或蛋白質，或卵泡抑素(Follistatin)基因及/或蛋白質，或其組合或變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善龐貝氏病(Pompe Disease)。在一些實施例中，龐貝氏病之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含GAA蛋白質或其變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善肢帶型肌肉萎縮症(Limb-Girdle Muscular Dystrophy；LGMD2A)。在一些實施例中，LGMD2A之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。在一些實施例中，由包含本文中所描述之衣殼多肽之AAV粒子編碼之有效負載包含CAPN-3蛋白質、DYSF蛋白質、SGCG蛋白質、SGCA蛋白質、SGCB蛋白質、FKRP蛋白質、ANO5蛋白質或其組合或變異體。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善慢性或神經性疼痛。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善與中樞神經系統相關之疾病。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善與周邊神經系統相關之疾病。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善個體中之神經腫瘤病症。在一些實施例中，神經腫瘤病症之治療包含預防該神經腫瘤病症。在一些實施例中，神經腫瘤病症包含初代CNS起源(例如CNS細胞、組織或區域)之癌症或CNS細胞、組織或區域中之轉移癌。初代CNS癌症之實例可尤其為神經膠質瘤(其可包括神經膠母細胞瘤(亦稱為多形性神經膠母細胞瘤)、星形細胞瘤、寡樹突神經膠質瘤及室管膜瘤，及混合型神經膠質瘤)、腦脊髓膜瘤、神經管胚細胞瘤、神經瘤及初代CNS淋巴瘤(在腦部、脊髓或腦膜中)。轉移性癌症之實例包括在另一組織或器官(例如乳房、肺、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤(皮膚癌)、大腸、腎臟、前列腺)中起始之癌症或其他類型之轉移至腦部之癌症。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善與HER2之表現相關之疾病，例如與HER2之過表現相關之疾病。在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善HER2陽性癌症。在一些實施例中，HER2陽性癌症係HER2陽性實體腫瘤。或者或另外，HER2陽性癌症可為局部晚期或轉移性HER2陽性癌症。在一些情況下，HER2陽性癌症係HER2陽性乳癌或HER2陽性胃癌。在一些實施例中，HER2陽性癌症係選自由以下組成之群：HER2陽性胃食管結合癌、HER2陽性大腸直腸癌、HER2陽性肺癌(例如，HER2陽性非小細胞肺癌)、HER2陽性胰臟癌、HER2陽性大腸直腸癌、HER2陽性膀胱癌、HER2陽性唾液管癌症、HER2陽性卵巢癌(例如，HER2陽性上皮卵巢癌)或HER2陽性子宮內膜癌。在一些情況下，HER2陽性癌症係前列腺癌。在一些實施例中，HER2陽性癌症已轉移至中樞神經系統(CNS)。在一些情況下，轉移之HER2癌症已形成CNS贅瘤。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善個體中之肌肉病症及/或神經肌肉病症。在一些實施例中，肌肉病症及/或神經肌肉病症之治療包含對該肌肉病症及/或神經肌肉病症之預防。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善心臟疾病或心臟病及/或改良(例如，增強)個體中之心臟功能之方法。在一些實施例中，心臟疾病係心肌病(例如，心律失常性右心室心肌病、擴張型心肌症或肥厚性心肌病)、充血性心臟衰竭、心動過速(例如，兒茶酚胺敏感性多形性心室性心動過速)、缺血性心臟病及/或心肌梗塞。在一些實施例中，心臟疾病係與以下之表現，例如異常表現相關之疾病：LAMP2B、MYBPC3、TNNI3、LMNA、BAG3、DWORF、PKP2、Cx43、TAZ、CASQ2、SERCA2a、I-1c、S100A1及/或ARC、S100A1、ASCL1、miR133、Mydelta3、Sav或其組合或變異體。在一些實施例中，本文中所描述之心臟病症之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。

在一些實施例中，心臟疾病係遺傳病症，例如體染色體顯性遺傳病症、體染色體隱性遺傳病或X性聯隱性遺傳病症。在一些實施例中，心肌病係遺傳病症，例如與選自以下之基因之異常(例如，突變、插入、重排及/或缺失)相關之遺傳病症：TTN、LMNA、MYH7、MYH6、SCN5A、TNNT2、RBM20、TNNI3、MYL2、MYL3、PKP2、DSP、DSG2、DSC2、JUP或其組合。在一些實施例中，心臟病症係擴張型心肌症，例如與選自以下之基因之異常(例如，突變、插入、重排及/或缺失)相關之擴張型心肌症：TTN、LMNA、MIH7、BAG3、MIPN、TNNT2、SCN5A、RBN20、TNPO、LAMA4、VCL、LDB3、TCAP、PSEN1/2、ACTN2、CRYAB、TPM1、ABCC9、ACTC1、PDLIM3、ILK、TNNC1、TNNI3、PLN、DES、SGCD、CSRP3、MIH6、EYA4、ANKRD1、DMD、GATAD1、TAZ/G4.5或其組合。在一些實施例中，心臟病症係肥厚性心肌病，例如與選自以下之基因之異常(例如，突變、插入、重排及/或缺失)相關之肥厚性心肌病：MYH7、TNNT2、TNNI3、TPM1、MYL2、MYL3、ACTC1、CSRP3、TTN、ACTN2、MYH6、TCAP、TNNC1或其組合。在一些實施例中，心臟病症係心律失常性心室心肌病，例如與選自以下之基因之異常(例如，突變、插入、重排及/或缺失)相關之心律失常性心室心肌病：PKP2、DSG2、DSP、RYR2、DSC2、TGFB3、TMEM43、DES、TTN、LMNA或其組合。

在一些實施例中，向患有至少一種本文中所描述之疾病或症狀之個體投與本文中所描述之AAV粒子。在一些實施例中，向患有或經診斷患有本文中所描述之疾病或病症之個體投與本發明之AAV粒子。

任何神經疾病或病症、神經退化性病症、肌肉病症、神經肌肉病症及/或神經腫瘤病症可經包括(但不限於)以下之本發明之AAV粒子或其醫藥組合物治療：透明隔不存在、酸性脂肪酶疾病、酸性麥芽糖酶缺乏症、後天性癲癇樣失語症、急性播散性腦脊髓炎、注意力缺陷過動症(ADHD)、艾迪氏瞳孔(Adie's Pupil)、艾迪氏症候群(Adie's Syndrome)、腎上腺腦白質營養不良、胼胝體無發育、認知障礙症、艾卡迪症候群(Aicardi Syndrome)、艾卡迪-古蒂耶爾症候群病症(Aicardi-Goutieres Syndrome Disorder)、AIDS神經併發症、亞歷山大氏疾病(Alexander Disease)、阿爾珀斯氏疾病(Alpers' Disease)、交替性半身麻痹、阿茲海默症(Alzheimer's Disease)、肌萎縮性側索硬化(ALS)、無腦、動脈瘤、安格爾曼氏症候群(Angelman Syndrome)、血管瘤病、缺氧症、抗磷脂症候群、失語症、失用症、蜘蛛膜囊腫、蜘蛛膜炎、阿諾德-希阿里畸形(Arnold-Chiari Malformation)、動靜脈畸形、亞斯伯格症候群(Asperger Syndrome)、運動失調、運動失調毛細血管擴張症、運動失調及小腦或脊髓小腦退化、心房震顫及中風、注意力缺陷過動症、泛自閉症障礙、自主神經機能異常、背痛、巴特症候群(Barth Syndrome)、巴氏病(Batten Disease)、貝克氏肌強直(Becker's Myotonia)、比切特氏疾病(Bechet's Disease)、伯耳氏癱(Bell's Palsy)、良性自發性瞼痙攣、良性局部肌萎縮、良性顱內高血壓、伯羅二氏症候群(Bernhardt-Roth Syndrome)、貝瓦克氏疾病(Binswanger's Disease)、瞼痙攣、布洛赫-蘇茲貝格症候群(Bloch-Sulzberger Syndrome)、肱神經叢產傷、肱神經叢損傷、布瑞德伯里-埃格爾斯頓症候群(Bradbury-Eggleston Syndrome)、腦及脊髓腫瘤、腦動脈瘤、腦損傷、布斯二氏症候群(Brown-Sequard Syndrome)、延髓性癱瘓、延髓肌肉萎縮症、大腦體染色體顯性動脈病伴皮質下梗塞及腦白質病(CADASIL)、卡納萬疾病、腕隧道症候群、灼性神經痛、海綿狀血管瘤(Cavernomas/Cavernous Angioma)、海綿狀畸形、中樞頸髓症候群、脊髓空洞症候群、中樞性疼痛症候群、中央腦橋脊髓溶解、頭部病症、神經醯胺酶缺乏症、小腦退化、小腦發育不全、大腦動脈瘤、大腦動脈硬化、腦萎縮、大腦腳氣病、大腦海綿狀畸形、大腦巨人症、大腦缺氧、腦性麻痺、腦-眼-面-骨骼症候群(Cerebro-Oculo-Facio-Skeletal Syndrome，COFS)、恰克-馬利-杜斯氏病(Charcot-Marie-Tooth Disease)、希阿里畸形(Chiari Malformation)、膽固醇酯貯積病、舞蹈症、舞蹈型棘細胞增多症、慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病(CIDP)、慢性直立性不耐受、慢性疼痛、II型科凱恩氏症候群(Cockayne Syndrome Type II)、科芬-勞里症候群(Coffin Lowry Syndrome)、空洞腦、昏迷、複雜區域疼痛症候群、同心性硬化(巴洛氏硬化(Baló's sclerosis))、先天性兩側面癱、先天性肌無力、先天性肌病變、先天性血管海綿狀畸形、皮質基底核退化、顱骨動脈炎、顱縫線封閉過早、克里腦炎(Cree encephalitis)、庫賈氏疾病(Creutzfeldt-Jakob Disease)、慢性進行性外部眼肌麻痹、累積性創傷病症、庫欣氏症候群(Cushing's Syndrome)、巨細胞包涵體疾病、巨細胞病毒感染、眼陣攣-肌陣攣症候群、丹迪-沃克症候群(Dandy-Walker Syndrome)、道生疾病(Dawson Disease)、德莫西氏症候群(De Morsier's Syndrome)、代-克二氏癱瘓(Dejerine-Klumpke Palsy)、癡呆、癡呆-多發性梗塞、詞義性癡呆、皮質下癡呆、路易體癡呆、脫髓鞘疾病、齒狀小腦運動失調、齒狀紅核萎縮症、皮肌炎、發育運用障礙、德維克氏症候群(Devic's Syndrome)、糖尿病性神經病變、彌漫性硬化、遠端遺傳性運動神經元病、德拉韋症候群、自主神經障礙、書寫障礙、閱讀障礙、吞咽困難、運用障礙、肌陣攣性小腦性失調症、進行性小腦性失調症、肌張力障礙、早期嬰兒癲癇性腦病、空蝶鞍症候群、腦炎、昏睡性腦炎、腦膨出、腦脊髓炎、腦病、腦病(家族性嬰兒)、腦三叉神經血管瘤病、癲癇、癲癇性半身麻痹、間歇性運動失調、艾爾布氏癱瘓(Erb's Palsy)、艾爾布-杜興氏及代-克二氏癱瘓(Erb-Duchenne and Dejerine-Klumpke Palsy)、自發性震顫、橋腦外髓鞘溶解症、費伯氏疾病(Faber's disease)、法布立疾病(Fabry Disease)、法氏症候群(Fahr's Syndrome)、昏厥、家族性自主神經障礙、家族性血管瘤、家族性特發性基底神經節鈣化、家族性週期性癱瘓、家族性痙攣性癱瘓、法伯氏疾病(Farber's Disease)、發熱性癲癇發作、纖維肌性發育不良、費舍爾症候群(Fisher Syndrome)、嬰兒鬆弛症候群、垂足、弗里德賴希運動失調(Friedreich's Ataxia)、額顳葉型癡呆、高歇氏病、全身性神經節苷脂沈積症(GM1、GM2)、格斯特曼氏症候群(Gerstmann's Syndrome)、格斯特曼-史特勞斯勒-申克疾病(Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease)、巨大軸索神經病變、巨大細胞動脈炎、巨大細胞包涵疾病、球狀細胞腦白質營養不良、舌咽神經痛、肝糖貯積病、格巴二氏症候群(Guillain-Barré Syndrome)、哈-斯二氏疾病(Hallervorden-Spatz Disease)、頭部損傷、頭痛、持續性偏頭痛、半面痙攣、交叉性半身麻痹、遺傳性神經病變、遺傳性痙攣性截癱、多神經炎型遺傳性運動失調、帶狀疱疹、耳部帶狀疱疹、平山症候群(Hirayama Syndrome)、霍姆斯-艾迪氏症候群(Holmes-Adie syndrome)、前腦無裂畸形、HTLV-1相關脊髓病、休斯症候群(Hughes Syndrome)、杭丁頓氏病、賀勒侯症群(Hurler syndrome)、腦內積水、腦積水、腦積水-法向壓力、脊髓積水、皮質醇增多症、嗜睡、張力亢進、張力減退、缺氧、免疫介導之腦脊髓炎、包涵體肌炎、色素失禁症、嬰兒張力減退、嬰兒神經軸索營養不良、嬰兒植烷酸貯積病、嬰兒雷夫蘇姆疾病(Infantile Refsum Disease)、嬰兒痙攣、發炎性肌病變、枕骨裂露腦畸形、腸脂質營養不良、顱內囊腫、顱內高血壓、伊薩克斯氏症候群(Isaacs' Syndrome)、朱伯特症候群(Joubert Syndrome)、卡恩斯-塞爾症候群(Kearns-Sayre Syndrome)、肯尼迪氏疾病(Kennedy's Disease)、金斯布林納氏症候群(Kinsbourne syndrome)、克萊恩-萊文症候群(Kleine-Levin Syndrome)、克-費二氏症候群(Klippel-Feil Syndrome)、克-特二氏症候群(Klippel-Trenaunay Syndrome，KTS)、克魯爾-布西症候群(Klüver-Bucy Syndrome)、高沙可夫氏健忘症候群(Korsakoff's Amnesic Syndrome)、克拉培疾病、庫格爾貝格-韋蘭德疾病(Kugelberg-Welander Disease)、庫魯病(Kuru)、藍伯-伊頓重肌無力症候群(Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome)、藍道-克利夫症候群(Landau-Kleffner Syndrome)、股外側皮膚神經嵌壓、外側延髓症候群、學習障礙、萊氏疾病(Leigh's Disease)、雷諾斯-加斯圖症候群(Lennox-Gastaut Syndrome)、萊希-尼亨症候群(Lesch-Nyhan Syndrome)、腦白質營養不良、萊文-克里奇利症候群(Levine-Critchley Syndrome)、路易體性癡呆、利什特海姆氏疾病(Lichtheim's disease)、脂質貯積病、類脂蛋白沈積症、平腦症、閉鎖症候群(Locked-In Syndrome)、盧·賈里格氏病(Lou Gehrig's Disease)、狼瘡神經後遺症、萊姆病(Lyme Disease)神經併發症、溶酶體貯積病、馬查多-約瑟夫疾病(Machado-Joseph Disease)、巨腦、巨腦症、梅-羅症候群(Melkersson-Rosenthal Syndrome)、腦膜炎、腦膜炎及腦炎、門克斯疾病(Menkes Disease)、異常性股痛、異染性腦白質營養不良、小頭畸形、偏頭痛、米勒費舍爾症候群(Miller Fisher Syndrome)、小中風、粒線體肌病變、粒線體DNA耗乏症候群、牟比士症候群(Moebius Syndrome)、單體肌萎縮、莫旺症候群(Morvan Syndrome)、運動神經元疾病、毛毛樣血管疾病(Moyamoya Disease)、黏脂貯積症、黏多醣貯積症、多梗塞性癡呆、多灶性運動神經病變、多發性硬化症、多發性系統萎縮症、多發性系統萎縮症伴直立性低血壓、肌肉萎縮症、先天性肌無力、重症肌無力、瀰漫性脫髓鞘硬化症、脊髓炎、嬰兒肌痙攣腦病、肌陣攣、肌陣攣癲癇、肌病變、先天性肌病變、甲狀腺肌病變、肌強直、先天性肌強直、嗜睡症、NARP (神經病變、運動失調及色素性視網膜炎)、神經性棘紅細胞增多症、神經退化伴腦鐵積聚、神經退化性疾病、神經纖維瘤、抗精神病藥惡性綜合症候群、AIDS神經併發症、萊姆病神經併發症、巨細胞病毒感染之神經結果、龐貝氏病之神經表現、狼瘡神經後遺症、視神經脊髓炎、神經肌強直、神經性類蠟脂褐質病、神經元遷移病症、神經病變性疼痛、遺傳性神經病變、神經病變、神經系統結節病、神經梅毒、神經毒性、海綿狀痣、尼曼-匹克疾病(Niemann-Pick Disease)、奧沙利文-麥克勞德症候群(O'Sullivan-McLeod Syndrome)、枕骨神經痛、大田原症候群(Ohtahara Syndrome)、橄欖體腦橋小腦萎縮、斜視眼陣攣肌陣攣、直立性低血壓、過度使用症候群、慢性疼痛、泛酸激酶相關神經退化、副腫瘤症候群、感覺異常、帕金森氏病、陣發性舞蹈指痙病、陣發性偏頭痛、帕-羅二氏病(Parry-Romberg)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、佩娜-舒凱爾II型症候群(Pena Shokeir II Syndrome)、神經周囊腫、腓骨肌萎縮症、週期性癱瘓、周邊神經病變、腦室周圍白質軟化症(Periventricular Leukomalacia)、持續性植物狀態、廣泛性發展障礙、植烷酸貯積病、匹克病(Pick's Disease)、夾神經、梨狀肌症候群、腦垂體腫瘤、多發性肌炎、龐培病、腦穿通畸形、小兒痲痺後症候群、疱疹後遺神經痛、感染後腦脊髓炎、姿勢性低血壓、端坐性心搏過速症候群、體位性心搏過速症候群、原發性齒狀體萎縮症、原發性側索硬化症、原發性進行性失語症、普里昂疾病(Prion Disease)、進行性延髓性癱瘓、進行性半面萎縮症、進行性運動失調(Progressive Locomotor Ataxia)、進行性多病灶腦白質病、進行性肌肉萎縮症、進行性硬化性灰質萎縮、進行性核上癱瘓、臉孔失認症、假延髓性癱瘓、假性Torch症候群(Pseudo-Torch syndrome)、假弓蟲症症候群、大腦假腫瘤、心因性運動、I型拉姆齊亨特症候群(Ramsay Hunt Syndrome I)、II型拉姆齊亨特症候群、羅斯苗遜氏腦炎(Rasmussen's Encephalitis)、反射性交感神經失養症症候群、雷夫蘇姆疾病、嬰兒雷夫蘇姆疾病、重複運動病症、重複應激損傷、不寧腿症候群、反轉錄病毒相關脊髓病、雷特氏症候群、雷氏症候群(Reye's Syndrome)、風濕性腦炎、萊利-戴症候群(Riley-Day Syndrome)、薦骨神經根囊腫、聖維特斯舞蹈症(Saint Vitus Dance)、唾液腺疾病、桑多霍夫疾病(Sandhoff Disease)、希爾逗病(Schilder's Disease)、裂腦症、賽特貝格疾病(Seitelberger Disease)、癲癇發作症、詞義性癡呆、腦室中隔缺損合併視神經發育不全、嬰兒期重度肌痙攣癲癇症(SMEI)、嬰兒搖晃症候群、帶狀疱疹(Shingles)、希-德二氏症候群(Shy-Drager Syndrome)、薛格連氏症候群(Sjögren's Syndrome)、睡眠呼吸中止症、昏睡病、索托氏症候群(Sotos Syndrome)、痙攣、脊柱裂、脊髓梗塞、脊髓損傷、脊髓腫瘤、脊髓性肌肉萎縮症、脊髓小腦失調、脊髓小腦萎縮症、脊髓小腦退化、偶發性運動失調、斯-里-奧三氏症候群(Steele-Richardson-Olszewski Syndrome)、僵體症候群(Stiff-Person Syndrome)、紋狀體黑質退化、中風、斯特奇-韋伯症候群(Sturge-Weber Syndrome)、亞急性硬化性泛腦炎、皮質下動脈硬化腦病、單側短暫性神經痛樣(SUNCT)頭痛、吞咽障礙、西登哈姆舞蹈病(Sydenham Chorea)、暈厥、梅毒性脊髓硬化、脊髓積水空洞(Syringohydromyelia)、脊髓空洞病、全身性紅斑狼瘡、運動失調(Tabes Dorsalis)、遲發性運動不能、塔勒夫囊腫(Tarlov Cyst)、戴薩克斯疾病(Tay-Sachs Disease)、顳動脈炎、脊髓栓系症候群、湯姆森氏肌強直(Thomsen's Myotonia)、胸廓出口症候群、甲狀腺毒性肌病變、三叉神經痛、托德氏癱瘓(Todd's Paralysis)、妥瑞氏症候群(Tourette Syndrome)、短暫局部缺血發作、傳染性海綿狀腦病、橫貫性脊髓炎、創傷性腦損傷、震顫、三叉神經痛、熱帶痙攣性截癱、特洛伊症候群(Troyer Syndrome)、結節性硬化症、血管勃起腫瘤、中樞及周邊神經系統之血管炎症候群、維生素B12缺乏症、馮·伊科諾莫氏疾病(Von Economo's Disease)、馮·希伯-林道疾病(Von Hippel-Lindau Disease，VHL)、馮·雷克林豪森氏疾病(Von Recklinghausen's Disease)、瓦倫堡氏症候群(Wallenberg's Syndrome)、沃尼克-霍夫曼疾病(Werdnig-Hoffman Disease)、魏尼克-科爾薩科夫症候群(Wernicke-Korsakoff Syndrome)、韋斯特症候群(West Syndrome)、揮鞭症(Whiplash)、惠普爾疾病(Whipple's Disease)、威廉姆斯症候群(Williams Syndrome)、威爾遜疾病(Wilson Disease)、沃爾曼疾病(Wolman's Disease)、X性聯脊髓延髓肌肉萎縮。 醫藥組合物及調配物

本文中提供包含本文中所描述之AAV粒子之醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含至少一種活性成分。在一些實施例中，醫藥組合物包含醫藥學上可接受之賦形劑。

在一些實施例中，使用賦形劑調配本文中所描述之AAV粒子以：：(1)增加穩定性；(2)增加細胞轉染或轉導；(3)允許有效負載之持續或延遲表現；(4)改變生物分佈(例如，使病毒粒子靶向特定組織或細胞類型)；(5)增加經編碼之蛋白質之轉譯；(6)改變經編碼之蛋白質之釋放概況；及/或(7)實現有效負載之可調節表現。本發明之調配物可包括(但不限於)生理鹽水、脂質體、脂質奈米粒子、聚合物、肽、蛋白質、經病毒載體轉染之細胞(例如用於轉移或移植至個體中)及其組合。

在一些實施例中，本發明之醫藥組合物中之活性成分(例如本文中所描述之AAV粒子)、醫藥學上可接受之賦形劑及/或任何額外成分的相對量可視所治療之個體之身分、體型及/或條件且進一步視組合物之投與途徑而變化。舉例而言，組合物可包含0.1%與99%(w/w)之間的活性成分。作為實例，組合物可包含0.1%與100%之間，例如0.5與50%之間、1-30%之間、5-80%之間、至少80% (w/w)的活性成分。

在一些實施例中，包含本文中所描述之AAV粒子之醫藥組合物可在具有或不具有醫藥學上可接受之賦形劑之情況下包含AAV衣殼多肽及編碼有效負載，例如本文中所描述之有效負載之病毒基因體。

在一些實施例中，本發明亦提供適用於投與個體，例如人類之醫藥組合物。在一些實施例中，向個體，例如人類投與醫藥組合物。套組

本文中亦提供套組，其包含本文中所描述之AAV粒子，例如使用一或多種桿狀病毒產生之AAV粒子及使用說明書，該一或多種桿狀病毒係使用本文中所描述之變異型桿狀病毒基因體、桿狀病毒表現構築體、桿狀病毒質體及/或BAC產生。投藥

在一些實施例中，可藉由例如局部遞送途徑或全身遞送途徑之遞送途徑向個體投與本文中所揭示之AAV粒子。

在一些實施例中，可經由能夠穿過血腦障壁、血管障壁或其他上皮障壁之途徑投與本文中所描述之AAV粒子。在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子可以任何適合之形式、以液態溶液或懸浮液、適用於液態溶液或液態溶液中之懸浮液之固體形式投與。在一些實施例中，可使用任何適當及醫藥學上可接受之賦形劑調配AAV粒子。

在一些實施例中，肌肉內、靜脈內、腦內、鞘內、腦室內、經由實質內投藥或經由大池內注射(ICM)來投與本文中所描述之AAV粒子。

在一些實施例中，可經由單一途徑投藥向個體遞送本文中所描述之AAV粒子。在一些實施例中，可經由多位點投藥途徑向個體遞送本文中所描述之AAV粒子。在一些實施例中，可在2、3、4、5個或超過5個部位向個體投與。

在一些實施例中，經由推注來投與本文中所描述之AAV粒子。在一些實施例中，本發明之AAV粒子係經數分鐘、數小時或數天之時段經由持續遞送來投與。在一些實施例中，輸注速率可視個體、分佈、調配及/或另一遞送參數而改變。在一些實施例中，使用控制釋放來投與本文中所描述之AAV粒子。在一些實施例中，使用持續釋放，例如符合經特定時段之釋放速率之釋放概況來投與本文中所描述之AAV粒子。

在一些實施例中，可藉由超過一種投藥途徑來遞送本文中所描述之AAV粒子。作為組合投藥之非限制性實例，AAV粒子可藉由鞘內及腦室內或藉由靜脈內及實質內投藥來遞送。 靜脈內投藥

在一些實施例中，可藉由全身投藥向個體投與本文中所描述之AAV粒子。在一些實施例中，全身投藥為靜脈內投藥。在另一實施例中，全身投藥為動脈內投藥。在一些實施例中，可藉由靜脈內投藥向個體投與本文中所描述之AAV粒子。在一些實施例中，可藉由皮下遞送來達成靜脈內投藥。在一些實施例中，經由聚焦式超音波(FUS)，例如FUS聯合微泡靜脈內投藥(FUS-MB)，或MRI引導之FUS聯合靜脈內投藥向投與個體AAV粒子，例如Terstappen等人(Nat Rev Drug Discovery, https://doi.org/10.1038/s41573-021-00139-y (2021))中所描述，其內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，向個體靜脈內投與AAV粒子。在一些實施例中，個體係人類。向 CNS 投藥

在一些實施例中，可藉由直接注射至腦部來遞送本文中所描述之AAV粒子。作為非限制性實例，腦部遞送可藉由海馬內投藥來進行。在一些實施例中，可藉由實質內投藥向個體投與本文中所描述之AAV粒子。在一些實施例中，實質內投藥係針對中樞神經系統之組織。在一些實施例中，可藉由顱內遞送向個體投與本文中所描述之AAV粒子(參見例如美國專利案第8119611號；其內容以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，可藉由注射至CSF路徑來遞送本文中所描述之AAV粒子。遞送至CSF路徑之非限制性實例包括鞘內及腦室內投藥。在一些實施例中，可經由枕大池內(ICM)注射來投與本文中所描述之AAV粒子。

在一些實施例中，可藉由全身遞送來向腦部遞送本文中所描述之AAV粒子。作為非限制性實例，全身遞送可藉由血管內投藥來進行。作為非限制性實例，全身或血管內投藥可為靜脈內的。

在一些實施例中，可藉由眼內遞送途徑來遞送本文中所描述之AAV粒子。眼內投藥之非限制性實例包括玻璃體內注射。 肌肉內投藥

在一些實施例中，可藉由肌肉內投藥來遞送本文中所描述之AAV粒子。不希望受理論約束，咸信在一些實施例中，肌肉細胞之多核性質在AAV遞送之後提供基因轉導優勢。在一些實施例中，肌肉細胞能夠表現具有適合的轉譯後修飾之重組蛋白質。不希望受理論約束，咸信在一些實施例中，肌肉組織增濃血管結構允許轉移至血流及全身(whole-body)遞送。肌肉內投藥之實例包括全身性(例如靜脈內)、皮下或直接投與至肌肉中。在一些實施例中，投與超過一種注射劑。在一些實施例中，可藉由肌肉內遞送途徑來遞送本文中所描述之AAV粒子(參見例如美國專利案第6506379號；其內容以全文引用之方式併入本文中)。肌肉內投藥之非限制性實例包括靜脈內注射或皮下注射。

在一些實施例中，向個體投與本文中所描述之AAV粒子及轉導個體之肌肉。作為非限制性實例，藉由肌肉內投藥來投與AAV粒子。在一些實施例中，可藉由皮下投藥向個體投與本文中所描述之AAV粒子。在一些實施例中，肌肉內投藥係經由全身遞送來進行。在一些實施例中，肌肉內投藥係經由靜脈內遞送來進行。在一些實施例中，肌肉內投藥係經由直接注射至肌肉中來進行。

在一些實施例中，藉由投藥，例如肌肉內投藥來轉導肌肉。在一些實施例中，肌肉內遞送包含在一個部位處投藥。在一些實施例中，肌肉內遞送包含在超過一個部位處投藥。在一些實施例中，肌肉內遞送包含在兩個、三個、四個或更多個部位處投藥。在一些實施例中，肌肉內遞送與至少一種其他投藥方法組合。

在一些實施例中，可藉由外周注射向個體投與本文中所描述之AAV粒子。外周注射之非限制性實例包括腹膜內、肌肉內、靜脈內、結膜或關節注射。此項技術中揭示可將AAV載體之外周投藥輸送至中樞神經系統，例如輸送至運動神經元(例如美國專利公開案第US20100240739號及第US20100130594號；其內容各自以全文引用之方式併入本文中)。

在一些實施例中，可藉由實質內投藥向個體投與本文中所描述之AAV粒子。在一些實施例中，實質內投藥係針對肌肉組織。在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子係如Bright等人, 2015 (Neurobiol Aging. 36(2):693-709)中所描述來遞送，其內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，向個體之腓腸肌投與本文中所描述之AAV粒子。在一些實施例中，向個體之股二頭肌投與本文中所描述之AAV粒子。在一些實施例中，向脛骨前肌肉投與本文中所描述之AAV粒子。在一些實施例中，向比目魚肌投與本文中所描述之AAV粒子。 積存式投藥

在一些實施例中，在儲槽中調配本文中所描述之醫藥組合物及/或AAV粒子(例如，包含AAV衣殼多肽之AAV粒子)以用於延長釋放。通常，以特定器官或組織為目標來進行投藥。

在一些實施例中，在目標組織內或附近的空間留存本文中所描述之醫藥組合物及/或AAV粒子(例如，包含AAV衣殼多肽之AAV粒子)。提供用於向哺乳動物個體之目標組織提供醫藥組合物、AAV粒子之方法，其係藉由使目標組織(其包含一或多個目標細胞)與醫藥組合物及/或AAV粒子在使得該等醫藥組合物、AAV粒子實質上留存於目標組織中之條件下接觸來進行，例如使得至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%或超過99.99%的組合物留存於目標組織中。在一些實施例中，留存係藉由量測進入一個目標細胞或複數個目標細胞中之醫藥組合物及/或AAV粒子之量來測定。舉例而言，在投藥後的一段時間，至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%或超過99.99%的投與個體之醫藥組合物及/或AAV粒子存在於細胞內。舉例而言，對個體之肌肉內注射可使用包含本文中所描述之醫藥組合物及/或AAV粒子以及轉染劑之水性組合物來進行，且留存係藉由量測存在於肌肉細胞或複數個肌肉細胞中之醫藥組合物及/或AAV粒子之量來測定。

在一些實施例中，提供向個體之組織提供本文中所描述之醫藥組合物及/或AAV粒子(例如，包含AAV衣殼多肽之AAV粒子)之方法，該等方法係藉由在使得醫藥組合物及/或AAV粒子實質上留存於組織(包含細胞，例如複數個細胞)中之條件下使組織與醫藥組合物及/或AAV粒子接觸來進行。在一些實施例中，本文中所描述之醫藥組合物及/或AAV粒子包含足夠量的活性成分，使得在至少一種細胞中產生所關注的作用。在一些實施例中，醫藥組合物及/或AAV粒子通常包含一或多種細胞滲透劑。在一些實施例中，本發明提供具有或不具有醫藥學上可接受之載劑之裸調配物(諸如不具有細胞滲透劑或其他試劑)。 治療方法

本發明中提供用於將本文中所描述之AAV粒子(例如，包含AAV衣殼多肽之AAV粒子)引入(例如，遞送至)細胞中之方法。在一些實施例中，該方法包含將足以調節，例如增加目標基因、mRNA及/或蛋白質之產生之量的本文中所描述之AAV粒子或載體引入該等細胞中。在一些實施例中，該方法包含將足以調節，例如減少目標基因、mRNA及/或蛋白質之表現之量的本文中所描述之AAV粒子或載體引入該等細胞中。在一些態樣中，細胞可為神經元，諸如(但不限於)運動神經元、海馬神經元、內嗅神經元、丘腦神經元、皮質神經元、感覺神經元、交感神經元或副交感神經元，以及膠質細胞，諸如星狀細胞、小神經膠質細胞及/或寡樹突細胞。在其他態樣中，細胞可為肌肉細胞，例如隔膜、四頭肌或心臟(例如心腔或心室)細胞。

本發明揭示用於治療需要治療之個體中之與蛋白質，例如目標蛋白質之功能/存在異常(例如，不足或增加)相關的神經疾病/病症或神經退化性病症、肌肉或神經肌肉病症或神經腫瘤病症的方法。

在一些實施例中，方法包含向個體投與治療有效量之包含本文中所描述之AAV粒子之組合物。作為非限制性實例，AAV粒子可以增加個體中之目標基因表現、增加目標蛋白質產生且因此減少神經疾病之一或多種症狀，使得個體得到治療性治療。

在其他實施例中，方法包含向個體投與治療有效量之包含AAV粒子(例如，包含AAV衣殼多肽之AAV粒子)之組合物，該等AAV粒子包含具有編碼一或多個siRNA分子之核酸序列之病毒基因體。作為非限制性實例，siRNA分子可使個體中之目標基因表現緘默、抑制目標蛋白質產生，及減少神經疾病之一或多種症狀，使得個體得到治療性治療。

在一些實施例中，經由全身投藥向個體之中樞神經系統投與包含所描述之AAV粒子之組合物。在一些實施例中，全身投藥為靜脈內(IV)注射。在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子或包含本文中所描述之AAV粒子之醫藥組合物係藉由聚焦式超音波(FUS)，例如聯合微泡之靜脈內投藥(FUS-MB)或MRI引導之FUS聯合靜脈內投藥來投與。

在一些實施例中，經由室內投藥向個體之中樞神經系統投與包含本文中所描述之AAV粒子之組合物。在一些實施例中，經由大池內注射(ICM)來投與包含本文中所描述之AAV粒子之組合物。

在一些實施例中，經由室內注射及靜脈內注射向個體之中樞神經系統投與包含本文中所描述之AAV粒子之組合物。

在一些實施例中，對每名個體以特定劑量經由ICM注射及靜脈內注射向個體之中樞神經系統投與包含本文中所描述之AAV粒子之組合物。作為非限制性實例，AAV粒子係經由ICM注射以1×10 ⁴個VG/個體之劑量投與。作為非限制性實例，AAV粒子係經由IV注射以2×10 ¹³個VG/個體之劑量投與。

在一些實施例中，向個體之中樞神經系統投與包含本文中所描述之AAV粒子之組合物。在其他實施例中，向個體之CNS組織(例如，個體之殼核、海馬區、丘腦或皮質)投與包含本文中所描述之AAV粒子之組合物。

在一些實施例中，經由實質內注射向個體之中樞神經系統投與包含本文中所描述之AAV粒子之組合物。實質內注射之非限制性實例包括殼核內、皮質內、丘腦內、紋狀體內、海馬內或注射至內嗅皮質中。

在一些實施例中，經由實質內注射及靜脈內注射向個體之中樞神經系統投與包含本文中所描述之AAV粒子之組合物。

在一些實施例中，經由室內注射、實質內注射及靜脈內注射向個體之中樞神經系統投與包含本文中所描述之AAV粒子之組合物。

在一些實施例中，經由靜脈內注射向個體之肌肉投與包含本文中所描述之AAV粒子或本發明之複數個粒子之組合物。在一些實施例中，經由肌肉內注射向個體之肌肉投與包含本發明之複數個AAV粒子中之AAV粒子之組合物。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子可遞送至特定類型之細胞中，包括(但不限於)丘腦、海馬、內嗅、皮質、運動、感官、興奮性、抑制性、交感或副交感神經元；膠細胞，包括寡樹突細胞、星狀細胞及小神經膠質細胞；及/或神經元周圍之其他細胞，諸如T細胞。在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子可遞送至肌肉細胞中，例如四頭肌、隔膜、肝臟及/或心臟(例如，心腔或心室)之細胞。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可遞送至中腦之細胞或區域。在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可遞送至腦幹之細胞或區域。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可遞送殼核、海馬區、丘腦及/或皮質中之神經元。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可用作遺傳病症，例如體染色體顯性遺傳病症、體染色體隱性遺傳病、X性聯顯性遺傳病症、X性聯隱性遺傳病症或Y性聯遺傳病症之療法。在一些實施例中，遺傳病症係單基因病症或多基因病症。在一些實施例中，遺傳病症，例如單基因性病症之治療包含使用本文中所描述之AAV粒子進行基因替代療法。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可用作神經疾病之療法。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可用作tau蛋白病變之療法。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可用作阿茲海默氏病之療法。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可用作肌萎縮性側索硬化之療法。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可用作杭丁頓氏病之療法。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可用作帕金森氏病之療法。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可用作高歇氏病(GD) (例如，1型GD、2型GD或3型GD)之療法。在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可用作與GBA突變相關之帕金森氏病之療法。在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可用作路易體癡呆(DLB)之療法。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可用作脊髓性肌萎縮之療法。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可用作腦白質失養症(例如亞歷山大氏疾病)、伴有自主疾病之體染色體顯性腦白質失養症(ADLD)、卡納萬疾病、腦腱性黃色瘤症(CTX)、異染性腦白質營養不良(MLD)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病或雷夫蘇姆疾病之療法。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可用作弗里德希氏共濟失調之療法。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可用作慢性或神經性疼痛之療法。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可用作與HER2之表現相關之疾病，例如與HER2之過表現相關之疾病之療法。在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善HER2陽性癌症。在一些實施例中，HER2陽性癌症係HER2陽性實體腫瘤。或者或另外，HER2陽性癌症可為局部晚期或轉移性HER2陽性癌症。在一些情況下，HER2陽性癌症係HER2陽性乳癌或HER2陽性胃癌。在一些實施例中，HER2陽性癌症係選自由以下組成之群：HER2陽性胃食管結合癌、HER2陽性大腸直腸癌、HER2陽性肺癌(例如，HER2陽性非小細胞肺癌)、HER2陽性胰臟癌、HER2陽性大腸直腸癌、HER2陽性膀胱癌、HER2陽性唾液管癌症、HER2陽性卵巢癌(例如，HER2陽性上皮卵巢癌)或HER2陽性子宮內膜癌。在一些情況下，HER2陽性癌症係前列腺癌。在一些實施例中，HER2陽性癌症已轉移至中樞神經系統(CNS)。在一些情況下，轉移之HER2癌症已形成CNS贅瘤。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可用作神經腫瘤病症之療法。在一些實施例中，神經腫瘤病症為初代CNS起源之癌症(例如CNS細胞及/或CNS組織之癌症)。在一些實施例中，神經腫瘤病症為CNS細胞、CNS區域及/或CNS組織中之轉移性癌症。初代CNS癌症之實例可尤其為神經膠質瘤(其可包括神經膠母細胞瘤(亦稱為多形性神經膠母細胞瘤)、星形細胞瘤、寡樹突神經膠質瘤及室管膜瘤，及混合型神經膠質瘤)、腦脊髓膜瘤、神經管胚細胞瘤、神經瘤及初代CNS淋巴瘤(在腦部、脊髓或腦膜中)。轉移性癌症之實例包括在另一組織或器官(例如乳房、肺、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤(皮膚癌)、大腸、腎臟、前列腺)中起始之癌症或其他類型之轉移至腦部之癌症。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可用作肌肉病症或神經肌肉病症之療法。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子，例如複數個粒子可用作心臟疾病或心臟病之療法及/或改良(例如，增強)個體之心臟功能之方法。在一些實施例中，心臟疾病係心肌病(例如，心律失常性右心室心肌病、擴張型心肌症或肥厚性心肌病)、充血性心臟衰竭、心動過速(例如，兒茶酚胺敏感性多形性心室性心動過速)、缺血性心臟病及/或心肌梗塞。

在一些實施例中，與接受AAV粒子之前的個體中之對照性，例如基因、mRNA及/或mRNA含量相比，向個體投與本文中所描述之AAV粒子可增加個體中之目標基因、mRNA及/或蛋白質含量。個體中之目標基因、mRNA及/或蛋白質含量可增加約30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%，諸如(但不限於)個體之CNS、CNS之區域或CNS之特定細胞，或肌肉、肌肉之區域或肌肉之細胞。在一些實施例中，CNS之細胞包含星狀細胞、小神經膠質細胞、皮層神經元、海馬神經元、DRG及/或交感神經元、感官神經元、寡樹突神經膠細胞、運動神經元或其組合。作為非限制性實例，AAV粒子可以使目標蛋白質之、基因、mRNA及/或蛋白質含量相對於基線成倍地增加。在一些實施例中，AAV粒子引起目標基因、mRNA或蛋白質之含量高5-6倍。

在一些實施例中，與接受AAV粒子之前的個體中之對照性，例如基因、mRNA及/或mRNA含量相比，向個體投與本文中所描述之AAV粒子(例如，包含AAV衣殼多肽之AAV粒子)，例如包含編碼siRNA分子或抗體或抗體片段之核酸之AAV粒子可降低個體中之目標基因、mRNA及/或蛋白質含量。個體中之目標基因、mRNA及/或蛋白質含量可減少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%，諸如(但不限於)個體之CNS、CNS之區域或CNS之特定細胞，或肌肉、肌肉之區域或肌肉之細胞。在一些實施例中，CNS之細胞包含星狀細胞、小神經膠質細胞、皮層神經元、海馬神經元、DRG及/或交感神經元、感官神經元、寡樹突神經膠細胞、運動神經元或其組合。作為非限制性實例，AAV粒子可以使目標蛋白質之、基因、mRNA及/或蛋白質含量相對於基線成倍地降低。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子可用於增加目標蛋白質及減少個體中之神經疾病之症狀。在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子可用於減少目標蛋白質及減少個體中之神經疾病之症狀。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子可用於減少功能能力及日常生活活動的下降，藉由標準評估系統，諸如(但不限於)總功能能力(total functional capacity，TFC)量表量測。

在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子可用於改良用於量測神經疾病之症狀的任何評估之效能。該等評估包含(但不限於)阿茲海默氏病認知評估量表(Alzheimer Disease Assessment Scale-cognitive，ADAS-cog)、簡易精神狀態檢查(Mini-Mental State Examination，MMSE)、老人憂鬱量表(Geriatric Depression Scale，GDS)、功能活動問卷(Functional Activities Questionnaire，FAQ)、日常生活活動(Activities of Daily Living，ADL)、全科醫師認知評估(General Practitioner Assessment of Cognition，GPCOG)、簡易認知量表(Mini-Cog)、簡略心理測試評分(Abbreviated Mental Test Score，AMTS)、畫鐘測試(Clock-drawing test)、6項認知障礙測試(6-item Cognitive Impairment Test，6-CIT)、記憶力測試(Test Your Memory，TYM)、蒙特利爾認知評估(Montreal Cognitive Assessment，MoCa)、阿登布魯克斯認知評估(Addenbrookes Cognitive Assessment，ACE-R)、記憶障礙篩檢(Memory Impairment Screen，MIS)、布里斯托爾日常生活活動量表(Bristol Activities of Daily Living Scale，BADLS)、巴式指數(Barthel Index)、功能獨立性量測(Functional Independence Measure)、工具性日常生活活動(Instrumental Activities of Daily Living)、老人認知減退知情者問卷(Informant Questionnaire on Cognitive Decline in the Elderly，IQCODE)、神經精神評估量表(Neuropsychiatric Inventory)、柯恩-曼斯菲爾德激動情緒行為量表(The Cohen-Mansfield Agitation Inventory)、BEHAVE-AD、EuroQol、簡表-36 (Short Form-36)及/或MBR照顧者壓力量表(Caregiver Strain Instrument)，或如Sheehan B (Ther Adv Neurol Disord. 5(6):349-358 (2012))中所描述之任何其他測試，其內容以全文引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，本發明之組合物係作為單獨的治療劑或作為組合治療劑投與，以用於治療神經疾病/病症或神經退化性病症、肌肉病症或神經肌肉病症及/或神經腫瘤病症。

編碼目標蛋白質之AAV粒子可與一或多種其他治療劑組合使用。在一些實施例中，組合物可與其他治療性或醫學程序同時、在其之前或在其之後投與。通常，各藥劑將以關於該藥劑所確定之劑量及/或時程來投與。

可與本文中所描述之AAV粒子組合使用之治療劑可為小分子化合物，其係抗氧化劑、消炎劑、抗細胞凋亡劑、鈣調節劑、抗麩胺酸激導性劑(anti-glutamatergic agent)、結構蛋白抑制劑、涉及肌肉功能之化合物及涉及金屬離子調節之化合物。作為非限制性實例，組合療法可與一或多種神經保護劑組合，諸如對運動神經元退化之神經保護作用已經過測試的小分子化合物、生長因子及激素。

針對治療神經疾病進行測試之可與本文中所描述之AAV粒子組合使用的化合物包括(但不限於)膽鹼酯酶抑制劑(多奈哌齊(donepezil)、雷斯替明(rivastigmine)、加蘭他敏(galantamine))、NMDA受體拮抗劑(諸如美金剛胺(memantine))、抗精神病劑、抗抑鬱劑、抗驚厥劑(例如，用於肌陣攣之丙戊酸鈉及左乙拉西坦(levetiracetam))、分泌酶抑制劑、類澱粉蛋白聚集抑制劑、銅或鋅調節劑、BACE抑制劑、tau聚集抑制劑(諸如亞甲基藍、啡噻𠯤(phenothiazines)、蒽醌、正苯胺或若丹明(rhodamines))、微管穩定劑(諸如NAP、紫杉醇(taxol)或太平洋紫杉醇(paclitaxel))、激酶或磷酸酶抑制劑(諸如靶向GSK3β (鋰)或PP2A之抑制劑)、用Aβ肽或tau磷酸化-抗原決定基進行之免疫接種、抗tau或抗類澱粉蛋白抗體、多巴胺消耗劑(例如，用於舞蹈病之丁苯那嗪(tetrabenazine))、苯并二氮呯(例如，用於肌陣攣、舞蹈病、肌肉張力不足、僵直及/或痙攣之可那氮平(clonazepam))、多巴胺(dopamine)之胺基酸前驅體(例如，用於僵直之左旋多巴(levodopa))、骨骼肌鬆弛劑(例如，用於僵直及/或痙攣之氯苯胺丁酸(baclofen)、替紮尼定(tizanidine))、引起肌肉麻痹之神經肌肉接合區處之乙醯膽鹼釋放之抑制劑(例如，用於睡中磨牙及/或肌肉張力不足之肉毒桿菌毒素)、非典型精神安定劑(例如，用於精神病及/或易怒之奧氮平(olanzapine)及喹硫平(quetiapine)；用於精神病、舞蹈病及/或易怒之利培酮(risperidone)、舒必利(sulpiride)及氟哌啶醇(haloperidol)；用於難治性精神病之氯氮平(clozapine)；用於具有明顯負性症狀之精神病之阿立哌唑(aripiprazole))、選擇性血清素再吸收抑制劑(SSRI)(例如，用於抑鬱症、焦慮症、強迫行為及/或易怒之西他普蘭(citalopram)、氟西汀(fluoxetine)、帕羅西汀(paroxetine)、舍曲林(sertraline)、米氮平(mirtazapine)、文拉法辛(venlafaxine))、安眠藥(例如，用於改變睡眠-覺醒週期之可匹隆(xopiclone)及/或唑吡坦(zolpidem))、抗驚厥劑(例如，用於躁症或輕躁症之丙戊酸鈉及卡馬西平(carbamazepine))及情感穩定劑(例如，用於躁症或輕躁症之鋰)。

神經營養因子可與本文中所描述之AAV粒子一起用於組合療法以治療神經疾病。通常，神經營養因子定義為促進神經元之存活、生長、分化、增殖及/或成熟或刺激神經元活性增加的物質。在一些實施例中，本發明之方法進一步包含將一或多種營養因子遞送至需要治療之個體中。營養因子可包括(但不限於) IGF-I、GDNF、BDNF、CTNF、VEGF、科利維林(Colivelin)、哈利普登(Xaliproden)、促甲狀腺素釋放激素及ADNF以及其變異體。

在一個態樣中，本文中所描述之AAV粒子可與表現神經營養因子之AAV粒子共同投與，諸如AAV-IGF-I (參見例如Vincent等人, Neuromolecular medicine, 2004, 6, 79-85，其內容以全文引用之方式併入本文中)及AAV-GDNF (參見例如Wang等人, J Neurosci., 2002, 22, 6920-6928，其內容以全文引用之方式併入本文中)。

在一些實施例中，向個體投與本文中所描述之AAV粒子將調節，例如增加或減少個體中之目標蛋白質之表現，且目標蛋白質之調節，例如存在、含量、活性及/或表現之增加或減少將減少個體中之神經疾病/病症一個神經退化性病症、肌肉病症或神經肌肉病症及/或神經腫瘤病症之作用及/或症狀。定義

除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語皆具有與一般熟習本發明所屬領域之技術者通常所理解之含義相同之含義。

除非相反地指示或另外自上下文顯而易見，否則諸如「一(a)」、「一(an)」及「該」之冠詞可意謂一個或超過一個。除非相反地指示或以其他方式自上下文顯而易見，否則若一個、超過一個或所有群成員存在於給定產物或方法中、用於給定產物或方法中或以其他方式與給定產物或方法相關，則在該群的一或多個成員之間包括「或」的申請專利範圍或描述視為滿足。本發明包括群組中恰好一個成員存在於、用於既定產物或方法中或以其他方式與既定產物或方法相關之實施例。本發明包括超過一個或所有的群組成員存在於、用於既定產物或方法中或以其他方式與既定產物或方法有關的實施例。

亦應注意，術語「包含」意欲為開放的且容許但不要求包括額外要素或步驟。當本文中使用術語「包含」時，因此亦涵蓋且揭示術語「由……組成」及「基本上由……組成」。

在給出範圍的情況下，包括端點。此外，應理解，除非另外指示或以其他方式自上下文及一般技術者之理解顯而易見，否則表示為範圍之值可在本發明之不同實施例中採用所陳述範圍內之任何特定值或子範圍，除非上下文另外明確規定，否則達到該範圍下限之單位的十分之一。

腺相關病毒：如本文中所使用，術語「腺相關病毒」或「AAV」係指依賴病毒屬(dependovirus genus)之成員或其變異體，例如功能性變異體。在一些實施例中，AAV係野生型或天然存在的。在一些實施例中，AAV係重組的。

AAV 粒子：如本文中所使用之「AAV粒子」係指包含例如AAV衣殼變異體之AAV衣殼及例如病毒基因體或載體基因體之聚核苷酸的粒子或病毒粒子。在一些實施例中，AAV粒子之病毒基因體包含至少一個有效負載區域及至少一個ITR。在一些實施例中，本發明之AAV粒子係包含AAV變異體之AAV粒子。在一些實施例中，AAV粒子能夠將編碼有效負載之核酸(例如，有效負載區域)遞送至細胞，該等細胞通常為哺乳動物(例如，人類)細胞。在一些實施例中，本發明之AAV粒子可以重組方式產生。在一些實施例中，AAV粒子可衍生自本文中所描述或此項技術中已知之任何血清型，包括血清型之組合(例如「假模式化」AAV)，或衍生自各種基因體(例如，單股的或自互補的)。在一些實施例中，AAV粒子可為複製缺陷型及/或靶向型。應理解，所提及之本發明之AAV粒子亦包括其醫藥組合物，即使未明確地敍述。

投與：如本文中所使用之術語「投與」係指向個體提供醫藥劑或醫藥組合物。

緩解：如本文中所使用之術語「緩解(amelioration)」或「緩解(ameliorating)」係指病況或疾病之至少一個指標之嚴重程度減輕。舉例而言，在神經退化病症之情形下，緩解包含神經元損失之減少。

擴增子：如本文中所使用之「擴增子」可指形成為例如PCR之擴增事件產物之RNA或DNA之任何片段。在一些實施例中，全長衣殼擴增子可用作次世代定序(NGS)庫生成之模板。全長衣殼擴增子可用於選殖至DNA庫中以進行任何額外輪數之如本文所描述之AAV選擇。

動物：如本文中所使用之術語「動物」係指動物界之任何成員。在一些實施例中，「動物」係指處於任何發育階段之人類。在一些實施例中，「動物」係指處於任何發育階段之非人類動物。在一些實施例中，非人類動物為哺乳動物(例如嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、綿羊、牛、靈長類動物或豬)。在一些實施例中，動物包含(但不限於)哺乳動物、鳥、爬行動物、兩棲動物、魚及蠕蟲。在一些實施例中，動物為轉殖基因動物、經基因工程改造之動物或純系。

反義股：如本文中所使用之術語siRNA分子之「反義股」或「第一股」或「引導股」係指與經靶向以緘默之基因之mRNA的約10-50個核苷酸、例如約15-30、16-25、18-23或19-22個核苷酸之一部分實質上互補的股。反義股或第一股具有與所需目標mRNA序列充分互補之序列以引導目標特異性緘默，例如足以藉由RNAi機制或過程觸發對所需目標mRNA之破壞的互補性。

大致：如本文中所使用，在應用於一或多個所關注的值時，術語「大致」或「約」係指與所陳述之參考值類似的值。如本文中所使用，術語「約」意謂所敍述的值之+/-10%。在一些實施例中，除非另外規定或另外自上下文顯而易見，否則術語「約」係指在所陳述的參考值沿任一方向上(大於或小於)之25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少範圍內的值(此類數字將超過100%可能值之情形除外)。

與 …… 締合：如本文中所使用，當關於兩個或更多個部分使用時，術語「與……締合」、「結合」、「連接」、「附接」及「系留」意謂該等部分直接或經由一或多個充當連接劑之額外部分而在物理上彼此締合或連接以形成足夠穩定之結構，使得該等部分在使用該結構之條件(例如生理學條件)下保持在物理上締合。「締合」不必嚴格經由直接共價化學鍵結進行。其亦可表明離子鍵或氫鍵或基於雜交之連接性足夠穩定以使得「締合」之實體保持在物理上締合。

桿狀病毒表現載體 (BEV)：如本文中所使用，BEV為桿狀病毒表現載體，例如桿狀病毒來源之聚核苷酸載體。桿狀病毒表現載體(BEV)係已經基因修飾以引起外源基因之表現之重組桿狀病毒。使用BEV之系統稱為桿狀病毒表現載體系統(BEVS)。

mBEV 或經修飾之 BEV：如本文中所使用，經修飾之BEV為桿狀病毒來源之表現載體，其已藉由以下一或多者之添加及/或缺失及/或複製及/或倒置而相對於起始BEV (無論野生型或人工的)而改變：基因；基因片段；裂解位點；限制位點；序列區域；編碼有效負載或所關注的基因之序列；或前述各者之組合。

BIIC：如本文中所使用，BIIC係經桿狀病毒感染之昆蟲細胞。

衣殼：如本文中所使用之術語「衣殼」係指實質上(例如＞50%、＞60%、＞70%、＞80%、＞90%、＞95%、＞99%或100%)為蛋白質之例如AAV粒子之病毒粒子的例如蛋白質殼之外部。在一些實施例中，衣殼為包含例如VP1、VP2及/或VP3多肽之本文所描述之AAV衣殼蛋白的AAV衣殼。AAV衣殼蛋白可為野生型AAV衣殼蛋白或變異體，該變異體例如為來自野生型或參考衣殼蛋白之結構及/或功能性變異體，其在本文中稱為「AAV衣殼變異體」。在一些實施例中，本文所描述之AAV衣殼變異體具有封閉，例如囊封病毒基因體之能力且/或能夠進入例如哺乳動物細胞之細胞中。在一些實施例中，本文所描述之AAV衣殼變異體可具有與例如對應野生型衣殼之野生型AAV衣殼之趨性相比經調節的向性。

經密碼子最佳化：如本文中所使用，術語「經密碼子最佳化」或「密碼子最佳化」係指編碼與親本/參考序列相同的胺基酸序列之經修飾之核酸序列，但已改變，使得經修飾之核酸序列之密碼子針對在特定系統(諸如特定物種或物種群)中之表現最佳化或改良。作為非限制性實例，包含AAV衣殼蛋白質之核酸序列可經密碼子最佳化以用於在昆蟲細胞中或在特定昆蟲細胞(諸如草地黏蟲細胞)中表現。密碼子最佳化可使用熟習此項技術者已知的方法及資料庫完成。

互補及實質上互補 ：如本文中所使用之術語「互補」係指聚核苷酸與彼此形成鹼基對之能力。鹼基對通常由反平行聚核苷酸股中之核苷酸單元之間的氫鍵形成。互補聚核苷酸股可以沃森-克里克方式(例如A與T、A與U、C與G)或以允許形成雙螺旋體之任何其他方式形成鹼基對。隨著熟習此項技術者意識到，當相對於DNA使用RNA時，尿嘧啶而非胸腺嘧啶為視為與腺嘌呤互補之鹼基。然而，除非另外說明，否則當在本發明之上下文中指示U時，暗示能夠取代T。完美互補性或100%互補性係指一個聚核苷酸股之各核苷酸單元可與第二聚核苷酸股之核苷酸單元一起形成氫鍵之情形。次完美互補性係指兩個股之核苷酸單元中之一些而非全部可與彼此形成氫鍵之情形。舉例而言，對於兩個20聚體，若各股上僅兩個鹼基對可與彼此形成氫鍵，則聚核苷酸股展現10%互補性。在相同實例中，若各股上之18個鹼基對可與彼此形成氫鍵，則聚核苷酸股展現90%互補性。如本文中所使用之術語「互補」可涵蓋完全互補、部分互補或實質上互補。如本文中所使用之術語「實質上互補」意指siRNA具有足以結合所需目標mRNA且觸發目標mRNA之RNA緘默的序列(例如在反義股中)。「完全互補」、「完美互補性」或「100%互補性」係指一個聚核苷酸或寡核苷酸股之各核苷酸單元可與第二聚核苷酸或寡核苷酸股之核苷酸單元進行鹼基配對之情形。

保守性胺基酸取代：如本文中所使用，「保守性胺基酸取代」係其中胺基酸殘基由具有類似側鏈之胺基酸殘基置換的取代。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。

保守性：如本文中所使用，術語「保守性」係指聚核苷酸序列或多肽序列之核苷酸或胺基酸殘基分別在所比較之兩個或更多個序列之相同位置中未發生改變。相對保守之核苷酸或胺基酸為與序列中其他地方出現之核苷酸或胺基酸相比而言相關性較高之序列中之保守性核苷酸或胺基酸。在一些實施例中，若兩個或更多個序列為彼此100%一致，則將其稱為「完全保守」。在一些實施例中，若兩個或更多個序列彼此至少70%一致、至少80%一致、至少90%一致或至少95%一致，則將其稱為「高度保守」。在一些實施例中，若兩個或更多個序列彼此約70%一致、約80%一致、約90%一致、約95%、約98%或約99%一致，則將其稱為「高度保守」。在一些實施例中，若兩個或更多個序列彼此至少30%一致、至少40%一致、至少50%一致、至少60%一致、至少70%一致、至少80%一致、至少90%一致或至少95%一致，則將其稱為「保守」。在一些實施例中，若兩個或更多個序列彼此約30%一致、約40%一致、約50%一致、約60%一致、約70%一致、約80%一致、約90%一致、約95%一致、約98%一致或約99%一致，則將其稱為「保守」。序列之保守可應用於聚核苷酸或多肽之整個長度，或可應用於其一部分、區域或特徵。

控制元件：如本文中所使用之「控制元件」、「調節性控制元件」或「調節性序列」係指提供接受細胞中之編碼序列之複製、轉錄及轉譯之啟動子區、多腺苷酸化信號、轉錄終止序列、上游調節域、複製起點、內部核糖體進入位點(「IRES」)、強化子及其類似物。並非全部此等控制元件皆需要始終存在，只要所選擇之編碼序列能夠在適當宿主細胞中進行複製、轉錄及/或轉譯即可。

遞送：如本文中所使用之「遞送」係指遞送AAV粒子、化合物、物質、實體、部分、負荷物或有效負載之動作或方式。

消化：如本文中所使用，術語「消化」意謂分裂成較小的碎片或組分。在提及多肽或蛋白質時，消化引起產生肽。

早期啟動子：如本文中所使用，「早期啟動子」係指由宿主細胞(例如，昆蟲細胞，例如Sf9細胞) RNA聚合酶II識別之啟動子。在一些實施例中，早期啟動子可包含TATA盒模體及/或CAGT模體。在一些實施例中，早期啟動子在病毒(例如，桿狀病毒)或經病毒感染之細胞中在發生病毒DNA複製之前具有活性。在一些實施例中，由早期啟動子起始之轉錄係α瓢菌素抗性。

晚期啟動子：如本文中所使用，「晚期啟動子」係指由病毒(例如，桿狀病毒) RNA聚合酶識別之啟動子。在一些實施例中，晚期啟動子可包含TAAG模體(例如，ATAAG核苷酸序列)。

早期 - 晚期啟動子：如本文中所使用，「早期-晚期啟動子」係指具有早期啟動子及晚期啟動子之組分之啟動子。在一些實施例中，早期-晚期啟動子可包含TATA盒模體及/或CAGT模體及TAAG模體(例如，ATAAG核苷酸序列)。

極晚期啟動子：如本文中所使用，「極晚期啟動子」係指由病毒(例如，桿狀病毒) RNA聚合酶及極晚期因子1 (VLF-1)識別之啟動子。在一些實施例中，極晚期啟動子可包含TAAG模體(例如，ATAAG核苷酸序列)及/或近端破裂元件序列。在一些實施例中，VLF-1結合於破裂元件序列。

元件：如本文中所使用之術語「元件」係指實體之不同部分。在一些實施例中，元件可為併入較長聚核苷酸序列中之具有特定目的之聚核苷酸序列。

囊封：如本文中所使用之術語「囊封」意謂封閉、包圍或包覆。作為實例，例如AAV衣殼變異體之衣殼蛋白質通常囊封病毒基因體。在一些實施例中，囊封於例如AAV衣殼變異體之衣殼內涵蓋由衣殼進行之100%覆蓋以及小於100%覆蓋，例如95%、90%、85%、80%、70%、60%或更小覆蓋。舉例而言，例如在進入細胞中之前，空位或不連續可存在於衣殼中，只要病毒基因體保留於衣殼中即可。

經工程改造：如本文中所使用，當本發明之實施例經設計以具有在起始點、野生型或天然分子範圍內變化之特點或特性(無論結構上抑或化學上)時，該等實施例係「經工程改造」。

有效量：如本文中所使用之術語藥劑之「有效量」為足以實現有益或所需之例如臨床結果之結果的量，且因此「有效量」係視其應用情形而定。舉例而言，在投與治療癌症之藥劑之情形下，藥劑之有效量為例如與在未投與藥劑之情況下所獲得的反應相比足以達成如本文所定義之癌症治療的量。

表現：如本文中所使用之核酸序列之「表現」係指以下事件中之一或多者：(1)自DNA序列產生RNA模板(例如藉由轉錄)；(2)加工RNA轉錄物(例如藉由剪接、編輯、5'帽形成及/或3'端加工)；(3)將RNA轉譯成多肽或蛋白質；及(4)多肽或蛋白質之轉譯後修飾。

表現 Bac：如本文中所使用，「表現Bac」或「rep/cap bac」係指包含腺相關病毒(AAV)病毒表現構築體及/或區域之桿狀病毒。在一些實施例中，表現Bac之病毒表現構築體包含一或多種編碼用於AAV，諸如(但不限於) AAV2之衣殼及/或複製基因之聚核苷酸。舉例而言，一或多種編碼用於AAV之衣殼及/或複製基因之聚核苷酸可編碼VP1、VP2、VP3、Rep52及/或Rep78，且此等聚核苷酸可存在於一或多個開放閱讀框架，例如兩個開放閱讀框架中之構築體中。

表現 BIIC：如本文中所使用，「表現BIIC」或「rep/cap BIIC」係指包含一或多種桿狀病毒(例如，表現Bac)之昆蟲細胞，該一或多種桿狀病毒包含有包含病毒表現構築體之桿狀病毒質體。在一些實施例中，表現構築體包含一或多種編碼用於AAV，諸如(但不限於) AAV2之衣殼及/或複製基因之聚核苷酸。舉例而言，一或多種編碼用於AAV之衣殼及/或複製基因之聚核苷酸可編碼VP1、VP2、VP3、Rep52及/或Rep78，且此等聚核苷酸可存在於一或多個開放閱讀框架，例如兩個開放閱讀框架中之構築體中。在一些實施例中，昆蟲細胞係Sf9細胞。

調配物：如本文中所使用，「調配物」包含至少一種AAV粒子及遞送劑或賦形劑。

片段：如本文中所使用之「片段」係指一部分。舉例而言，抗體片段可包含CDR或重鏈可變區或scFv等。

功能性：如本文中所使用，「功能性」生物分子為呈其呈現特性及/或活性之形式之生物分子，其特徵在於該特性及/或活性。

基因表現：術語「基因表現」係指核酸序列進行成功轉錄且在大部分情況下，進行轉譯以產生蛋白質或肽之過程。為了清楚起見，在提及量測「基因表現」時，此應該理解為意謂量測可針對核酸轉錄產物，例如對RNA或mRNA，或針對胺基酸轉譯產物，例如多肽或肽。量測RNA、mRNA、多肽及肽之量或含量之方法為此項技術中熟知的。

同源性：如本文中所使用之術語「同源性」係指例如聚核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的聚合分子之間的總體相關性。在一些實施例中，若聚合分子序列至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致或類似，則聚合分子視為與彼此「同源」。術語「同源」必然指在至少兩個序列(聚核苷酸或多肽序列)之間的比較。根據本發明，若對於具有至少約20個胺基酸之至少一個延伸部，兩個聚核苷酸序列所編碼之多肽至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或甚至99%，則兩個聚核苷酸序列視為同源的。在一些實施例中，同源聚核苷酸序列之特徵在於編碼具有至少4-5個獨特地指定之胺基酸之延伸部之能力。對於長度少於60個核苷酸之聚核苷酸序列，同源性係由編碼具有至少4-5個獨特地指定之胺基酸之延伸部的能力來測定。根據本發明，若對於具有至少約20個胺基酸之至少一個延伸部，兩個蛋白質為至少約50%、60%、70%、80%或90%一致，則兩個蛋白質序列視為同源的。

一致性：如本文中所使用之術語「一致性」係指例如聚核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的聚合分子之間的總體相關性。舉例而言，兩個聚核苷酸序列之一致性百分比之計算可藉由出於最佳比較目的而比對兩個序列來進行(例如出於比較目的，可將空位引入第一及第二核酸序列中之一者或兩者中以進行最佳比對且可忽略非一致序列)。在一些實施例中，出於比較目的而比對之序列之長度為參考序列之長度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。接著，比較在對應核苷酸位置處之核苷酸。當第一序列中之位置經與第二序列中之對應位置相同之核苷酸佔據時，則該等分子在彼位置處一致。考慮到為了最佳比對兩個序列而需要引入之空位數目及各空位長度，兩個序列之間的一致性百分比隨該等序列共有的一致位置數目變化。可使用數學演算法實現序列比較及兩個序列之間的一致性百分比測定。舉例而言，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可使用諸如以下中所描述之方法的方法來測定：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.編, Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.,編, Academic Press, New York, 1993；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Computer Analysis of Sequence Data, 第I部分, Griffin, A. M.及Griffin, H. G.編, Humana Press, New Jersey, 1994；及Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J.編, M Stockton Press, New York, 1991；該等文獻中之各者之內容以全文引用之方式併入本文中。舉例而言，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可使用已併入ALIGN程式(2.0版本)中之Meyers及Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17)演算法、使用PAM120權重殘基表、12空位長度罰分及4空位罰分來測定。可替代地，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可使用GCG套裝軟體中之GAP程式、使用NWSgapdna.CMP矩陣來測定。通常用於測定序列之間的一致性百分比之方法包括但不限於Carillo, H.及Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988)中所揭示之方法，該文獻以引用之方式併入本文中。用於測定一致性之技術編碼於公開可獲得之電腦程式中。用於測定兩個序列之間的同源性之例示性電腦軟體包括但不限於GCG套裝程式(Devereux, J.等人, Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA (Altschul, S. F.等人, J. Molec. Biol., 215, 403 (1990))。

抑制基因表現：如本文中所使用之片語「抑制基因表現」意謂使基因表現產物之量減少。表現產物可為自基因轉錄之RNA (例如mRNA)或由自基因轉錄之mRNA轉譯之多肽。通常而言，mRNA含量之減少引起自其轉譯之多肽之含量減少。表現量可使用量測mRNA或蛋白質之標準技術來測定。

反向末端重複序列：如本文中所使用之術語「反向末端重複序列」或「ITR」係指用於將聚核苷酸序列封裝至病毒衣殼中之順式調節元件。

經分離：如本文所使用，術語「經分離」係指自天然狀態更改或移除，例如自與其在天然狀態上相關之組分中之至少一些更改或移除的物質或實體。舉例而言，天然存在於活動物中之核酸或肽並非「經分離」，但自其天然狀態之共存材料部分或完全分離之相同核酸或肽「經分離」。經分離之核酸或蛋白質可以實質上純化形式存在，或可存在於諸如宿主細胞之非天然環境中。該等聚核苷酸可為載體之一部分且/或該等聚核苷酸或多肽可為組合物之一部分，且仍經分離以使得該載體或組合物不為天然存在於其中之環境的一部分。在一些實施例中，經分離之核酸為重組的，例如併入載體中。

接合區：如本文中所使用，術語「接合區」係指兩個相鄰區域(例如，次基因體區域、次區域、次片段、片段或次基因體片段)之間的重疊(例如，1-50個鹼基對)之雙股核苷酸序列，其中第一區域之3'端與第二區域之5'端鹼基配對。在一些實施例中，接合區係獨有的，例如獨有的接合區。

獨有的接合區：如本文中所使用，術語「獨有的接合區」係指在桿狀病毒表現構築體或桿狀病毒基因體(例如，變異型桿狀病毒基因體)中存在一次之接合區。

連接子：如本文中所使用，「連接子」係指連接兩個分子之分子或分子之基團。連接子可為連接編碼兩種不同多肽的兩個核酸序列之核酸序列。連接子可經轉譯或可未經轉譯。連接子可為可裂解連接子。

微型 RNA (miRNA) 結合位點：如本文中所使用，微型RNA (miRNA)結合位點表示核酸轉錄物中至少由miRNA之「種子」區域結合之核苷酸位置或區域。

經修飾：如本文中所使用，「經修飾」係指本發明之分子之狀態或結構改變。分子可以包含化學上、結構上及功能上之多種方式經修飾。如本文中所使用，當本發明之實施例具有或擁有與起始點、野生型或原生分子不同的特徵或特性(無論結構上或化學上)時，該等實施例係「經修飾」的。

突變：如本文中所使用，術語「突變」係指基因結構之任何變化，該變化產生可傳遞至後代之變異(亦稱為「突變」)形式。基因中之突變可由DNA中之單鹼基之交替，或基因或染色體之較大部分之缺失、插入或重排引起。

非必需基因：如本文中所使用，當在桿狀病毒之情形下使用時，術語「非必需基因」係指在經修飾時不會實質上改變，例如減少在感染期間產生之感染性桿狀病毒之量的基因或基因調節區。在一些實施例中，非必需基因之修飾不會減少極晚期基因轉錄。在一些實施例中，對非必需基因或非必需基因之調節區之修飾包括任何引起減少或消除基因產物之變化，例如缺失、插入、突變(例如，讀框轉移突變)、啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入。

核酸：如本文中所使用，術語「核酸」、「聚核苷酸」及「寡核苷酸」係指由多去氧核糖核苷酸(含有2-去氧-D-核糖)或多核糖核苷酸(含有D-核糖)構成的任何核酸聚合物，或任何其他類型的聚核苷酸，亦即，嘌呤或嘧啶鹼基之N醣苷或經修飾之嘌呤或嘧啶鹼基。在術語「核酸」、「聚核苷酸」及「寡核苷酸」之間不存在預期長度區別，且此等術語應可互換使用。此等術語僅指分子之一級結構。因此，此等術語包含雙股及單股DNA以及雙股及單股RNA。

開放閱讀框架：如本文中所使用，「開放閱讀框架」或「ORF」係指除了閱讀框架之末端以外，在給定閱讀框架內不含終止密碼子之序列。

可操作地連接：如本文中所使用，片語「可操作地連接」係指在兩個或更多個分子、構築體、轉錄物、實體、部分或其類似物之間的功能性連接。作為非限制性實例，當啟動子序列控制及/或調節核苷酸序列之轉錄時，啟動子「可操作地連接」至核苷酸序列。

5 ' 突出物：如本文中所使用，術語「5'突出物」係指位於片段(例如，次基因體片段或次片段)或線性化載體(例如，目的載體)之5'端(例如，左端)之單股黏性端部。

3 ' 突出物：如本文中所使用，術語「3'突出物」係指位於片段(例如，次基因體片段或次片段)或線性化載體(例如，目的載體)之3'端(例如，右端)之單股黏性端部。

黏性端部：如本文中所使用，關於5'突出物或3'突出物之術語「黏性端部」係指片段之5'端處的與相鄰片段之3'端處的突出物互補之單股核苷酸序列，或片段之3'端處的與相鄰片段之5'端處的突出物互補之單股核苷酸序列。在一些實施例中，黏性端部係指線性化載體(例如，目的載體，例如目標桿狀病毒質體)之5'端處的與片段之3'端處的突出物互補之單股核苷酸序列，或線性化載體(例如，目的載體，例如目標桿狀病毒質體)之3'端處的與相鄰片段之5'端處的突出物互補之單股核苷酸序列。

有效負載區域：如本文中所使用之「有效負載區域」為編碼一或多種本發明之「有效負載」之任何核酸序列(例如在病毒基因體內)。作為非限制性實例，有效負載區域可為AAV粒子之病毒基因體內之編碼有效負載之核酸序列，其中有效負載為RNAi試劑或多肽。本發明之有效負載可為(但不限於)肽、多肽、蛋白質、抗體、RNAi試劑等。

有效負載 Bac：如本文中所使用，「有效負載Bac」係指包含有效負載構築體及/或區域之桿狀病毒。在一些實施例中，有效負載Bac之有效負載構築體及/或區域包含編碼有效負載之聚核苷酸。

有效負載 BIIC：如本文中所使用，「有效負載BIIC」係指包含一或多種桿狀病毒(例如，有效負載Bac)之昆蟲細胞，該一或多種桿狀病毒包含有效負載構築體及/或區域。在一些實施例中，有效負載構築體及/或區域包含編碼有效負載之聚核苷酸。在一些實施例中，昆蟲細胞係Sf9細胞。

有效負載構築體：如本文中所使用，「有效負載構築體」係一或多個載體構築體，其包含聚核苷酸區域，該聚核苷酸區域編碼或包含藉由反向末端重複序列(ITR)而側接在一側或兩側上的有效負載。有效負載構築體可呈現在病毒產生細胞中複製以產生治療性病毒基因體之模板。

有效負載構築體載體：如本文中所使用，「有效負載構築體載體」係編碼或包含有效負載構築體及用於在細菌細胞中複製及表現有效負載構築體之調節區之載體。

有效負載構築體表現載體：如本文中所使用，「有效負載構築體表現載體」係滿足以下條件之載體：其編碼或包含有效負載構築體且進一步包含一或多個編碼或包含用於病毒複製細胞中之病毒表現的組分之聚核苷酸區域。

多肽：如本文中所使用之「多肽」意謂最常藉由肽鍵連接在一起之胺基酸殘基(天然或非天然)之聚合物。如本文所使用，該術語係指具有任何尺寸、結構或功能之蛋白質、多肽及肽。在一些情況下，經編碼之多肽小於約50個胺基酸，則將多肽稱為肽。若多肽為肽，則其長度將為至少約2、3、4或至少5個胺基酸殘基。因此，多肽包括基因產物、天然存在之多肽、合成多肽、同源物、異種同源物、同種同源物、前述者之片段及其他等效物、變異體及類似物。多肽可為單分子或可為諸如二聚體、三聚體或四聚體之多分子複合物。其亦可包含單鏈或多鏈多肽，且可為締合的或連接的。術語多肽亦可應用於其中一或多個胺基酸殘基為對應天然存在之胺基酸之人工化學類似物的胺基酸聚合物。

多肽變異體：術語「多肽變異體」係指胺基酸序列與天然或參考序列不同之分子。與天然或參考序列相比，胺基酸序列變異體可在胺基酸序列內之某些位置處具有取代、缺失及/或插入。在一些實施例中，變異體包含與天然或參考序列具有至少約50%、至少約80%或至少約90%一致性(同源性)之序列。

肽：如本文中所使用之「肽」之長度為少於或等於50個胺基酸，例如長度為約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸。

醫藥學上可接受的：片語「醫藥學上可接受的」在本文中用於指在合理醫學判斷範疇內適用於與人類及動物之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症、與合理效益/風險比相稱之化合物、材料、組合物及/或劑型。

預防 (preventing)：如本文中所使用之術語「預防(preventing)」或「預防(prevention)」係指部分或完全延遲感染、疾病、病症及/或病狀之發作；部分或完全延遲特定感染、疾病、病症及/或病狀之一或多種症狀、特點或臨床表現之發作；部分或完全延遲特定感染、疾病、病症及/或病狀之一或多種症狀、特點或表現之發作；部分或完全延遲感染、特定疾病、病症及/或病狀之發展；及/或降低罹患與感染、疾病、病症及/或病狀相關之病變之風險。

防治性：如本文中所使用之「防治性」係指用於預防疾病擴散之治療或作用過程。

防治：如本文中所使用之「防治」係指為維持健康且預防疾病擴散而採用之措施。

區域 (region)：如本文中所使用之術語「區域」係指區帶(zone)或一般區域(area)。在一些實施例中，當提及蛋白質或蛋白質模組時，區域可包含沿著蛋白質或蛋白質模組之線性胺基酸序列，或可包含三維區域、抗原決定基及/或抗原決定基簇。在一些實施例中，區域包含末端區。如本文中所使用之術語「末端區」係指位於既定藥劑之端部或末端處之區域。當提及蛋白質時，末端區可包含N端及/或C端。

在一些實施例中，當提及聚核苷酸時，區域可包含沿著聚核苷酸之線形核酸序列，或可包含三維區域、二級結構或三級結構。在一些實施例中，區域包含末端區。如本文中所使用之術語「末端區」係指位於既定藥劑之端部或末端處之區域。當提及聚核苷酸時，末端區可包含5'端及/或3'端。

RNA 或 RNA 分子：如本文中所使用之術語「RNA」或「RNA分子」或「核糖核酸分子」係指核糖核苷酸之聚合物；術語「DNA」或「DNA分子」或「去氧核糖核酸分子」係指去氧核糖核苷酸之聚合物。DNA及RNA可例如分別藉由DNA複製及DNA轉錄來天然地合成；或以化學方式合成。DNA及RNA可為單股的(亦即，分別為ssRNA或ssDNA)或多股的(例如雙股的，亦即，分別為dsRNA及dsDNA)。如本文中所使用之術語「mRNA」或「信使RNA」係指編碼一或多個多肽鏈之胺基酸序列之單股RNA。

RNA 干擾或 RNAi：如本文中所使用之術語「RNA干擾」或「RNAi」係指由RNA分子介導之序列特異性調節機制，該介導引起對對應蛋白質編碼基因之表現的抑制或干擾或「緘默」。已在許多類型之生物中觀測到RNAi，該等生物包括植物、動物及真菌。RNAi天然存在於細胞中以移除外來RNA (例如病毒RNA)。天然RNAi經由自游離dsRNA裂解之片段前進，該等片段將降解機制引導至其他類似RNA序列。RNAi受RNA誘導之緘默複合體(RISC)控制且由細胞之細胞質中之短/小dsRNA分子起始，在該細胞質中其與催化性RISC組分AGO蛋白(argonaute)相互作用。可將dsRNA分子外源地引入細胞中。外源性dsRNA藉由活化核糖核酸酶蛋白質切丁酶起始RNAi，該核糖核酸酶蛋白質切丁酶結合且裂解dsRNA以產生具有21-25個鹼基對之雙股片段，其中各端上有幾個未配對突出鹼基。此等短雙股片段稱為小型干擾RNA (siRNA)。

RNAi 試劑：如本文中所使用之術語「RNAi試劑」係指可誘導對目標基因及/或其蛋白質產物之表現之抑制、干擾或「緘默」之RNA分子或其衍生物。RNAi試劑可剔除(幾乎消除或消除)表現，或減弱(衰減或減少)表現。RNAi試劑可為(但不限於) dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA。

miR 結合位點：如本文中所使用之「miR結合位點」包含能夠經由完全或部分雜交來完全或部分結合、或經由完全或部分雜交來完全或部分結合至微型RNA (miR)的核酸序列(無論RNA或DNA，例如相差RNA之「U」或DNA中之「T」)。通常而言，該結合在反向補體取向上發生在miR與miR結合位點之間。在一些實施例中，miR結合位點係由編碼miR結合位點之AAV載體基因體轉錄。

在一些實施例中，miR結合位點可經串聯編碼或轉錄。此類「miR結合位點系列」或「miR BSs」可包括兩個或更多個具有相同或不同核酸序列之miR結合位點。

樣本：如本文中所使用之術語「樣本」或「生物樣本」係指其組織、細胞、核酸或組分部分之子組(例如體液，包括但不限於血液、血清、黏液、淋巴液、滑液、腦脊髓液、唾液、羊水、羊膜臍帶血、尿液、陰道液及精液)。

自互補病毒粒子：如本文中所使用，「自互補病毒粒子」係包含至少兩種組分之粒子，該至少兩種組分係蛋白質衣殼及密封於衣殼內之編碼自互補基因體之聚核苷酸序列。

有義股：如本文中所使用之術語siRNA分子之「有義股」或「第二股」或「隨從股」係指與反義股或第一股互補之股。siRNA分子之反義股與有義股雜交以形成雙螺旋結構。如本文中所使用之「siRNA雙螺旋體」包括與經靶向以緘默之基因之mRNA的約10-50個核苷酸之部分具有足夠互補性的siRNA股以及具有足夠互補性以與另一siRNA股形成雙螺旋體的siRNA股。

類似性：如本文中所使用之術語「類似性」係指例如聚核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的聚合分子之間的總體相關性。聚合分子與彼此之類似性百分比之計算可以與一致性百分比之計算相同的方式進行，不同之處在於類似性百分比之計算考慮如此項技術中所理解之保守性取代。

短干擾 RNA 或 siRNA ：如本文中所使用之術語「短干擾RNA」、「小干擾RNA」或「siRNA」係指能夠引導或調節RNAi之包含在約5-60個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)的RNA分子(或RNA類似物)。較佳地，siRNA分子包含在約15-30個之間的核苷酸或核苷酸類似物，諸如在約16-25個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)、在約18-23個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)、在約19-22個之間的核苷酸(或核苷酸類似物) (例如19、20、21或22個核苷酸或核苷酸類似物)、在約19-25個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)及在約19-24個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)。術語「短」siRNA係指包含5-23個核苷酸、較佳21個核苷酸(或核苷酸類似物)、例如19、20、21或22個核苷酸之siRNA。術語「長」siRNA係指包含24-60個核苷酸、較佳約24-25個核苷酸、例如23、24、25或26個核苷酸之siRNA。在一些情況下，短siRNA可包括少於19個核苷酸，例如16、17或18個核苷酸，或少至5個核苷酸，其限制條件為較短siRNA保留介導RNAi之能力。同樣地，在一些情況下，長siRNA可包括超過26個核苷酸，例如27、28、29、30、35、40、45、50、55或甚至60個核苷酸，其限制條件為較長siRNA保留介導RNAi或轉譯抑制而不需進一步加工，例如酶加工成短siRNA之能力。siRNA可為單股RNA分子(ss-siRNA)或包含雜交以形成稱為siRNA雙螺旋體之雙螺旋結構之有義股及反義股的雙股RNA分子(ds-siRNA)。

信號序列：如本文中所使用，片語「信號序列」係指可引導蛋白質之轉運或定位之序列。

類似性：如本文中所使用，術語「類似性」係指聚合分子之間，例如聚核苷酸分子(例如，DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的整體相關性。聚合分子彼此之類似性百分比的計算可以與一致性百分比之計算相同的方式進行，不同之處在於計算類似性百分比時考慮保守性取代，如此項技術中所理解。

間隔子：如本文中所使用之「間隔子」通常為位於兩個或更多個連續miR結合位點序列之間的例如長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸的任何所選擇的核酸序列。間隔子之長度亦可為超過10個核苷酸，例如20、30、40或50個或超過50個核苷酸。

個體：如本文中所使用，術語「個體」或「患者」係指可例如出於實驗、診斷、預防及/或治療目的向其投與根據本發明之組合物的任何生物體。典型個體包含動物(例如哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔、非人類靈長類動物及人類)及/或植物。個體或患者可能尋求或需要治療、要求治療、正在接受治療、即將接受治療，或受到經過訓練的專業人員針對特定疾病或病狀之照護。

實質上：如本文中所使用之術語「實質上」係指展現所關注的特徵或特性之全部或接近全部限度或程度的定性狀況。生物技術中之一般技術者應理解，生物及化學現象很少(若曾有)進行完整及/或繼續達到完整或達成或避免絕對結果。因此，術語「實質上」在本文中用於獲得許多生物及化學現象中所固有之完整性之潛在缺乏。

合成或化學合成：如本文中所使用，在核酸序列之情形下，術語「合成」或「化學合成」係指相對於天然來源之分子或經由天然來源之分子的基於模板之擴增衍生之分子，至少部分經由化學過程形成之核酸分子。在一些實施例中，與天然DNA複製或活體外聚合酶反應，例如PCR不同，化學合成之DNA係非模板化的(例如，序列係任意決定的且不會在物理上依賴於親本序列)。

目標細胞：如本文中所使用之「目標細胞」或「目標組織」係指任一或多個所關注的細胞。細胞可活體外、活體內、原位存在或存在於生物之組織或器官中。生物可為動物、較佳地哺乳動物、更佳地人類且最佳地患者。

治療劑：術語「治療劑」係指當向個體投與時具有治療、診斷及/或防治效果及/或引發所需生物學及/或藥理學效果之任何藥劑。

治療有效量：如本文中所使用之術語「治療有效量」意謂當向患有或易患感染、疾病、病症及/或病狀之個體投與時足以治療感染、疾病、病症及/或病狀、改善其症狀、對其進行診斷、預防及/或延遲其發作的待遞送之藥劑(例如核酸、藥物、治療劑、診斷劑、預防劑等)的量。在一些實施例中，治療有效量係以單次劑量形式提供。

治療有效結果：如本文中所使用之術語「治療有效結果」意謂在患有或易患感染、疾病、病症及/或病狀之個體中足以治療感染、疾病、病症及/或病狀、改善其症狀、對其進行診斷、預防及/或延遲其發作的結果。

轉染：如本文中所使用，術語「轉染」係指將外源核酸引入細胞中之方法。轉染方法包含(但不限於)化學方法、物理處理及陽離子脂質或混合物。

治療：如本文中所使用之術語「治療」係指部分或完全減緩、緩解、改善、減輕特定感染、疾病、病症及/或病狀、延遲其發作、抑制其發展、降低其嚴重程度及/或降低其一或多種症狀或特點之發生率。舉例而言，「治療」癌症可指抑制腫瘤之存活、生長及/或擴散。出於降低罹患與疾病、病症及/或病狀相關之病變之風險之目的，可向未展現疾病、病症及/或病狀之病徵之個體及/或向僅展現疾病、病症及/或病狀之早期病徵之個體投與治療。

獨有的接合區：如本文中所使用，術語「獨有的接合區」係指由一個片段中之獨有的5'突出物與另一片段中之獨有的3'突出物之共價鍵基於該等突出物之互補性而形成之接合區。「獨有的接合區」亦可由一個片段中之獨有的5'突出物與目的載體(例如，承載載體或桿狀病毒表現構築體)之獨有的3'突出物或片段中之獨有的3'突出物與目的載體之獨有的5'突出物之共價鍵形成。

獨有的突出物：如本文中所使用，獨有的突出物係指片段中之分別僅與複數個片段內之另一片段之單一其他3'或5'突出物配對之5'或3'突出物。在一些實施例中，次基因體片段之獨有的5'突出物係僅與另一次基因體片段之單一3'突出物或目的載體(例如，承載載體或桿狀病毒表現構築體)之3'突出物配對之5'突出物。類似地，在一些實施例中，次基因體片段之獨有的3'突出物係僅與另一次基因體片段之單一5'突出物或目的載體之5'突出物配對之3'突出物。

未經修飾：如本文中所使用，「未經修飾」係指任何以任何方式改變之前的物質、化合物或分子。未經修飾可指，但並不始終指生物分子之野生型或原生形式。分子可經歷一系列修飾，由此，各經修飾之分子可充當後續修飾之「未經修飾」之起始分子。分子(例如，桿狀病毒基因體)亦可相對於參考分子(例如，參考桿狀病毒基因體)而係未經修飾的。

變異體：如本文中所使用之術語「變異體」係指具有與參考序列實質上一致(例如具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之胺基酸或核苷酸序列的多肽或聚核苷酸。在一些實施例中，變異體為功能性變異體。如本文中所使用之術語「功能性變異體」係指具有參考序列之至少一種活性之多肽變異體或聚核苷酸變異體。當提及多肽時，「插入型變異體」為例如緊鄰胺基酸序列中之一位置或緊隨其後插入有一或多個胺基酸之變異體。「緊鄰胺基酸」或「緊隨胺基酸之後」意謂連接至胺基酸之α-羧基或α-胺基官能基。當提及多肽時，「缺失型變異體」為相對於參考蛋白而言缺失一或多個胺基酸之變異體。

如本文中所使用之術語「載體」為轉運、轉導或另外充當異源分子之運載體的任何分子或部分。在一些實施例中，載體可為質體。在一些實施例中，載體可為病毒。AAV粒子為載體之實例。本發明之載體可以重組方式產生，且可基於及/或可包含腺相關病毒(AAV)母序列或參考序列。異源分子可為聚核苷酸及/或多肽。

病毒基因體：如本文中所使用，當在AAV之情形下使用時，術語「病毒基因體」或「載體基因體」係指囊封於AAV粒子中之核酸序列。病毒基因體包含具有至少一個編碼有效負載之有效負載區域及至少一個ITR之核酸序列。 等效物及範疇

文所引用之每一專利案、專利申請案、公開案及序列之揭示內容均特此以全文引用之方式併入本文中。熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗即可確定本文所描述之本發明之特定實施例之許多等效方案。本發明之範疇不意欲受限於以上描述，而是如所附申請專利範圍中所闡述。

另外，應理解，屬於先前技術內之本發明之任何特定實施例可自申請專利範圍中之任一或多個中明確排除。因為認為該等實施例為一般熟習此項技術者已知的，因此可對其進行排除，即使未在本文中明確地闡述該排除。出於任何原因，無論是否與先前技術之存在有關，本發明之組合物之任何特定實施例(例如任何抗生素、治療性或活性成分；任何產生方法；任何使用方法；等)可自任一或多個申請專利範圍中排除。

應理解，已使用之字語為描述性而非限制性字語，且可在不背離本發明在其較廣泛態樣中之真實範疇及精神之情況下，在所附申請專利範圍之範圍內作出改變。

儘管已相對於所描述之若干實施例以某一長度及某一特殊性描述本發明，但並非意指本發明應受限於任何該等細節或實施例或任何特定實施例，而是應參考所附申請專利範圍進行解釋，以便考慮到先前技術提供對該等申請專利範圍之儘可能最廣泛的解釋，因此有效地涵蓋本發明之預期範疇。

本發明由以下非限制性實例進一步說明。實例實例 1 ： 合成桿狀病毒載體構築體之產生

此實例描述藉由使用Golden Gate Assembly策略將若干核酸分子組裝至單一連續序列中來產生含有合成桿狀病毒基因體之桿狀病毒載體構築體。該策略無需先前桿狀病毒設計中之逐步修飾，該逐步修飾係勞力密集、低效且易於出錯的。實情為，可藉由將變化引入含有改良之次基因體質體中，且將由該等質體釋放之片段組合以重新構築全新的桿狀病毒基因體來同時引入對參考(例如，親本)桿狀病毒載體之多種獨立設計之改良。

作為設計起始步驟，藉由引入緘默突變(亦即，在IIS型位點位於基因編碼序列內時不會改變基因之胺基酸序列之突變)來移除桿狀病毒基因體(寄存編號KM667940.1；野生型AcMNPV，病毒株E2)中之所有BsaI及BsmBI限制酶識別位點(皆係IIS型限制酶)。此過程稱為桿狀病毒基因體之馴化。AcMNPV病毒株E2 (寄存編號KM667940.1)之野生型基因體中存在總共11個BsaI位點及44個BsmBI位點( 圖 1)。關於可與此策略一起使用之其他IIS型限制位點，野生型AcMNPV病毒株E2基因體中亦存在5個AarI識別位點。

為了最小化所引入之消除IIS型限制位點之突變影響必需的桿狀病毒功能之可能性，突變係衍生自在NCBI資料庫中之其他α-桿狀病毒分離物中發現之變異體，例如圖 2中所示。

接著，使用軟體演算法將輸入序列(亦即，不具有BsaI及BsmBI位點之親本桿狀病毒基因體序列)分成指定數目之次基因體『A』片段。接著，將『A』片段分成(使用相同演算法)所需數目之較小的合成『B』片段。在此實例中，將親本桿狀病毒載體分成16個次基因體『A』片段(各約8 kb)，且由16個合成『B』片段(各約0.5 kb；總共256個合成『B』片段用於組裝一個桿狀病毒基因體)組裝各『A』片段。簡言之，演算法定義一種接合區，其係輸入序列之具有既定核苷酸窗尺寸之區域。接著，演算法將單一4-鹼基突出物分配至一組接合區目標，使得其在Golden Gate Assembly中彼此相容。圖 3及圖 4展示接合區如何實現16個次基因體『A』片段之相鄰有序組裝，最終引起組裝完整的合成桿狀病毒基因體之示意圖。相同的基本原理適用於如何由合成『B』片段組裝各次基因體『A』片段。

將256個『B』片段與側接BsaI位點一起化學合成及選殖至質體中。藉由在化學合成『B』片段時將突變(在電腦模擬階段設計)直接併入其中來消除基因體內之BsaI及BsmBI識別位點。待合成之序列具有以下組態：5'-NNN(BsaI位點à)NXXXX[『B』片段序列]XXXXN(ßBsaI位點)NNN-3'，其中N對應於填充核苷酸，且XXXX係在由BsaI進行切割之後留存的『B』片段之端部處的所欲末端4-鹼基突出物。在化學合成之後，將『B』片段個別地選殖至不具有此步驟中使用之IIS型限制酶(在此實例中，BsaI)之識別位點之標準選殖質體中。

將含有構成次基因體『A』片段之『B』片段的質體合併，用BsaI消化且經由Golden Gate組裝反應接合至目的載體中。獨有的突出物使得片段以所需順序接合至次基因體『A』片段中。進行十六個獨立反應以形成16個次基因體『A』片段，在Golden Gate目標載體中捕捉該等片段。設計此等目標載體，使得將在BsaI Golden Gate組裝期間移除用於藍色/白色群落篩選之LacZα報導子且由經組裝之『A』片段置換。此外，此等目標載體亦包括在『A』片段插入物之各端側接之BsmBI識別位點，其使得隨後能夠將『A』片段以Golden Assembly方式組裝至完整的桿狀病毒基因體中。簡言之，在25 μL反應中，在一鍋式反應中將等莫耳量(100 fmol)之各含有『B』片段之質體與以下組合：(a)目的載體(50 fmol)，(b) T4連接酶緩衝液/10 mM ATP，(c) BsaI酶(30 U)，及(d) T4連接酶(2500 U)。混合物經歷(a) 60個在37℃下保持5分鐘，接著在16℃下保持5分鐘之循環，及(b) 1個在60℃下，接著保持在4℃下之循環。

在製備16個含有次基因體『A』片段之質體之後，在第二Golden Gate組裝中，藉由用BsmBI消化來使質體釋放片段且使用DNA連接酶，在接合反應中經由獨有的突出物將該等片段組裝至合成桿狀病毒基因體中。在此實例中，在Golden Gate相容目的載體，諸如經馴化之細菌人工染色體(BAC)中捕捉完整基因體。簡言之，在25 μL反應中，在一鍋式反應中將等莫耳量(100 fmol)之各含有『A』片段之質體與以下組合：(a)目的載體(50 fmol)，(b) T4連接酶緩衝液/10 mM ATP，(c) BsmBI酶(30 U)，及(d) T4連接酶(2500 U)。混合物經歷(a) 60個在42℃下保持50分鐘，接著在16℃下保持5分鐘之循環，及(b) 1個在60℃下，接著保持在4℃下之循環。

接著，使用最外側的突出物序列ACAA ( 圖 5中展示)及CATC ( 圖 5中未展示，但對應於圖 5中展示之以TACA突出物開始之『A』片段之端部突出物)將完整組裝之桿狀病毒基因體接合至細菌人工染色體(BAC)中，以將最終構築體維持於大腸桿菌中。此引起由BAC序列置換一部分原生多角體蛋白基因座。

為了證明合成桿狀病毒構築體係衍生自非模板化、合成DNA，除了移除多角體蛋白基因座以外，相對於含有野生型AcMNPV病毒株E2基因體之對照性桿狀病毒質體，用具有相同或不同數目之識別位點的各種酶消化含有使用以上策略完整組裝之合成桿狀病毒基因體之桿狀病毒質體。如圖 6中所示，HindIII酶，其在對照性及合成基因體中具有相同數目之識別位點，對兩種桿狀病毒質體展示相同的消化模式，然而在具有不同數目之識別位點的酶之情況下觀測到不同模式。

以上合成性桿狀病毒基因體產生策略亦可用於操作桿狀病毒基因體，例如用於在基因體之不同部分中引入多個修飾，諸如取代、添加、缺失，或甚至引入用於表現之所關注的轉殖基因序列(病毒基因)。此可藉由以下步驟來達成：首先確定需要修飾之基因座，鑑別包括該等基因座之相應的合成『B』片段，使用標準選殖技術(例如，定點突變誘發)進行修飾，及使用上文所描述之程序組裝桿狀病毒基因體。圖 7展示如何進行此類修飾以產生變異型桿狀病毒基因體之示意圖。實例 2 ： 在合成桿狀病毒基因體中引入修飾

此實例描述如何基於實例1中所描述之方法來修飾合成桿狀病毒基因體，該基因體係使用寄存編號KM667940.1之NCBI基因體作為起始物質而製備。

由實例1中產生之含有合成桿狀病毒基因體之桿狀病毒質體(SynBac1)製備之桿狀病毒係複製勝任型，但呈現複製缺陷，如藉由與由對照性桿狀病毒質體(「對照物」；除多角體蛋白基因座以外，含有AcMNPV-E2基因體之bMON14272 (Luckow等人, J Virology1993; 67:4566-79))產生之桿狀病毒相比具有較低效價證明，如圖 8中所示。野生型AcMNPV E2 DNA之再定序及與KM667940.1之定序讀取結果之比較表明KM667940.1含有基因 lef8及 p49中之插入誤差。SynBac1中之複製缺陷係由合併有此等插入誤差引起。

因此，以如下方式構築具有野生型 p49及 lef8蛋白質序列之新穎合成桿狀病毒基因體。鑑別含有相關合成『B』片段之質體，該等片段具有p49及lef8中之插入誤差。重新化學合成含有真實野生型序列之經校正之『B』片段，使用經校正之『B』片段組裝次基因體『A』片段，且如實例1中所描述使用經校正之次基因體『A』片段組裝整個合成桿狀病毒基因體且選殖至桿狀病毒質體中。

接著，測試由經校正之合成桿狀病毒質體(SynBac2)產生之桿狀病毒之複製活性。簡言之，將5 µg經純化之對照物、SynBac1及SynBac2桿狀病毒質體各自一式三份地與200 µL格雷斯鹽(Grace's Salts)及10 µL Mirus TransIT Insect Cell轉染劑組合，以產生轉染複合物。在室溫下培育20分鐘之後，將轉染複合物逐滴添加至Sf9搖瓶培養物(30 mL，1.2×10 ⁶個活細胞/毫升)中。將培養物在28℃下以140 RPM振盪且在所指示之時間點獲取樣本。在五天之後收集細胞上清液作為出芽病毒原料。對於單循環複製研究，使用上述出芽病毒原料，以3個50%組織培養物感染劑量(TCID50)單元/細胞之感染倍率(MOI)感染Sf9搖瓶培養物(如上文所描述)。在所指示之時間點獲取樣本。

如圖 9A及圖 9B中所示，在Sf9細胞之轉染之後( 圖 9A)及在以MOI 3 TCID50/細胞進行之Sf9細胞之感染之後( 圖 9B)，由SynBac2產生之桿狀病毒展示與由對照物產生之桿狀病毒類似的複製。此等結果表明，可完全由化學合成之DNA序列組裝複製勝任型AcMNPV基因體(約130 kb)，且可實現序列之快速及可靠操作(例如，校正)。實例 3 ： 使用合成桿狀病毒基因體產生 rAAV1

此實例描述使用添加有腺相關病毒(AAV)基因之合成桿狀病毒基因體(如以上實例2中所描述來構築及測試)產生rAAV1。

簡言之，對Rep52及Rep78/AAV1衣殼基因進行PCR擴增且藉由Gibson Assembly™反應選殖至經AgeI及AvrII酶消化之Synbac2中，以產生Synbac2-AAV1/Rep桿狀病毒質體。將經組裝之產物透析且轉形至NEB-10-β細胞中，在振盪器中培育1小時，塗佈至KANA/CAM盤上且在37℃下培育隔夜。使用單一群落接種KANA/CAM培養物且置放於振盪器培育箱中在37℃下隔夜。藉由酚/氯仿提取來自培養物提取桿狀病毒質體DNA。接著，使用EcoNI及SbfI限制酶(對於Rep78)以及KpnI及BamHI (對於Rep52)篩選所提取之桿狀病毒質體DNA以確認成功選殖，且藉由下一代定序證實不具有Rep78及Rep52基因之突變。作為對照，將相同的Rep52及Rep78/AAV1衣殼基因選殖至包含野生型AcMNPV-E2基因體之桿狀病毒質體之經改良之版本中以產生表現構築體1，該經改良之版本相對於來自實例2之對照性桿狀病毒質體具有經改良之多重繼代穩定性。藉由ITR-SEAP-ITR片段之Gibson Assembly™來產生Synbac2轉殖基因(SEAP)表現載體，該片段係藉由PacI消化而自質體DNA主鏈切除。藉由用相關限制酶消化來篩選所得桿狀病毒質體DNA，且藉由下一代定序證實不具有SEAP轉殖基因之突變。

藉由將200 μL格雷斯昆蟲培養基(Grace's insect media)、2 μL Mirus TransIT試劑以及2 μL以下中之各者混合來製備桿狀病毒感染前之昆蟲細胞(前-BIIC)：Synbac2-AAV1/Rep桿狀病毒質體(或表現構築體1)及Synbac2-SEAP桿狀病毒質體。將轉染複合物添加至30 ml Sf9細胞(1.5×10 ⁶)且在振盪器中，在23℃下培育隔夜。接著將細胞冷凍且作為BIIC儲存。第二天，將BIIC解凍且用於TCID50分析法中以測定病毒效價。病毒效價如下：對於表現構築體1係1.3×10 ⁷，對於Synbac2-AAV1/Rep係4.2×10 ⁸且對於Synbac2-SEAP係7.5×10 ⁸。用Sf9細胞在3×10 ⁶VCD下起始用於產生AAV的在MOI 0.002下之BIIC Synbac2-AAV1/Rep及BIIC Synbac2-SEAP之雙重感染。同時，作為AAV產生之對照物，用BIIC表現構築體1 (用於代替BIIC Synbac2-AAV1/Rep)及BIIC Synbac2-SEAP進行Sf9細胞之雙重感染。當存活率低於50%時將經感染之細胞溶解。自感染後第2天開始收集各條件之1 mL等分試樣直至第5天。將一部分所收集之樣本(100 μL)溶解且用於西方墨點分析(Western blot analysis)。藉由添加60 μL 10% Triton、120 μL 2M精胺酸及10 U/ml之全能核酸酶將樣本之其餘部分溶解。使用來自經溶解之樣本的澄清溶解物進行定量聚合酶鏈反應(qPCR)分析。

在起始qPCR之前，用去氧核糖核酸酶I預先消化rAAV樣本以消除非衣殼相關DNA。將去氧核糖核酸酶I (2 U/μL，Teknova 3D1401)在1X去氧核糖核酸酶I緩衝液(10 mM Tris-HCl、2.5 mM MgCl2、0.5 mM CaCl2，pH 7.6)中稀釋30倍，且將95 μL體積之所得去氧核糖核酸酶I反應緩衝液與5 μL體積之rAAV樣本組合。將樣本在37℃下培育1小時且接著藉由添加125 μL體積之蛋白酶K/EDTA反應緩衝液(pH 8.0)來停止去氧核糖核酸酶I消化，該緩衝液含有1 mg/ml之蛋白酶K(Teknova P2050)、111 mM NaCl、0.11% w/v之十二烷基肌胺酸鈉(sarkosyl)及4 mM EDTA。在添加蛋白酶K/EDTA反應緩衝液之後，將樣本在55℃下加熱1小時，接著在95℃下進行蛋白酶K之熱不活化持續10分鐘。接著，將經去氧核糖核酸酶I/蛋白酶K處理之rAAV樣本在200 μL 10 mM Tris pH 7.5中稀釋40倍。在200 μL容量、96孔PCR盤中，將四微升體積之所得經tris稀釋之rAAV樣本添加至16 μL體積之Q-PCR反應混合物中。在相同PCR盤上包括經十倍連續稀釋之DNA標準物以實現定量。一式三份地操作所有Q-PCR樣本。Q-PCR反應混合物包括稀釋至1.2X之TaqMan Fast Advanced Mastermix (ThermoFisher)及6 μM對CMV啟動子具有特異性之引子；正向引子(5'-TACGGTAAACTGCCCACTTG-3'；SEQ ID NO:11)、反向引子(5'-GTCCCATAAGGTCATGTACTGG-3'；SEQ ID NO:12)及探針引子(5'-FAM-GTCCCATAAGGTCATGTACTGG-ZEN-3'；SEQ ID NO:13)。用Lightcycler 480 (Roche)進行Q-PCR反應，以10分鐘、95℃下之熱變性開始，接著進行45個在95℃下10秒、在60℃下10秒之循環，以及在72℃下10秒之最後處理步驟。用MS-Excel分析所得資料。

如圖 10A及圖 10B中所示，與表現構築體1相比，由Synbac2實現類似的rAAV1蛋白質之表現及rAAV1產生，由所產生之病毒蛋白質之量及藉由qPCR測定之病毒效價(vg/mL)反映。如所預期，與Synbac2及表現構築體1相比，Synbac1展示較低的rAAV1效價。此等結果表明，合成桿狀病毒基因體可以與非合成桿狀病毒基因體類似之水平支持AAV粒子之產生，但具有模組化程度更高及易於在多個桿狀病毒基因座中進行修飾之顯著優點。

前述及其他目標、特徵及優點將自如隨附圖式中所說明之本發明之特定實施例的以下描述顯而易見。

圖 1係展示AcMNPV病毒株E2桿狀病毒基因體中之BsmBI及BsaI限制酶識別位點之圖。

圖 2描繪用於比較待突變之II型限制位點與其他α-桿狀病毒基因體中之相應位點之序列，以確定將最小化影響必需的桿狀病毒功能之可能性的取代之策略。

圖 3描繪使用具有含有4個鹼基之突出物的合成『B』片段或次基因體『A』片段可引起片段以所需順序組裝及與Golden Gate Assembly方法之相容性。

圖 4描繪256個合成『B』片段(各約0.5 kb)之產生，該等合成『B』片段形成16個次基因體『A』片段(各約8.0 kb)，該等次基因體『A』片段最終形成合成AcMNPV-E2基因體(約133 kb)。

圖 5係經組裝之『A』片段及『B』片段以及其突出物序列之圓形表示圖。較小字體指示用於由『B』片段組裝『A』片段之突出物。較大的粗體字體指示用於由『A』片段組裝完整基因體之突出物。用於選殖至桿狀病毒質體中之大型粗體字體突出物序列係ACAA (展示)及CATC (未展示，但對應於以TACA突出物開始之『A』片段之端部突出物)。

圖 6展示具有AcMNPV病毒株E2基因體之桿狀病毒質體來源(「對照」)及重新產生之合成桿狀病毒質體(「合成」)之由所指示的限制酶進行之消化模式。

圖 7描繪使用Golden Gate Assembly策略將修飾(例如，取代)引入桿狀病毒基因體中之策略。

圖 8展示使用實例1中所描述之合成桿狀病毒質體製備的桿狀病毒係複製勝任型，但呈現複製缺陷，其係由與參考桿狀病毒質體製備之桿狀病毒(「對照」)相比較低的效價證明，該參考桿狀病毒質體包含野生型AcMNPV-E2基因體，但已移除多角體蛋白基因座。

圖 9A及圖 9B展示使用具有經校正之p49及lef8基因之合成桿狀病毒質體(Synbac2)產生之桿狀病毒與由包含野生型AcMNPV-E2基因體但已移除多角體蛋白基因座之參考桿狀病毒質體產生之桿狀病毒(「對照」) ，在MOI TCID50 (組織培養感染劑量50)為3之情況下，在Sf9細胞之轉染之後( 圖 9A)及在Sf9細胞之感染之後，二者均顯示類似的複製。

圖 10A及圖 10B展示由經桿狀病毒共同感染之Sf9細胞達到類似的rAAV1蛋白質之表現及rAAV1產生，該桿狀病毒係由經工程改造以表現Rep/AAV1衣殼蛋白質之Synbac2及經工程改造以表現SEAP之Synbac2產生。作為對照，採用由表現構築體1產生之桿狀病毒(包含野生型AcMNPV-E2基因體之桿狀病毒質體之改良版，其具有多重繼代穩定性且相對於來自實例2之對照性桿狀病毒質體達成增加之VP比率及衣殼品質)共同感染Sf9細胞。表現構築體1經工程改造以表現Rep/AAV1衣殼蛋白質，且Synbac2經工程改造以表現SEAP。藉由qPCR測定病毒效價(vg/mL)。

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Claims

一種桿狀病毒表現構築體，其包含至少兩個次基因體區域，其中各次基因體區域包含： (i) 第一獨有接合區及第二獨有接合區，其中該第一獨有接合區位於該次基因體區域之5'端，且該第二獨有接合區位於該次基因體區域之3'端；及 (ii) 變異型桿狀病毒核苷酸序列，其所包含之功能性IIS型限制酶位點比野生型桿狀病毒基因體之核苷酸序列少至少5個；其中該桿狀病毒表現構築體係複製勝任型。
一種複數個片段，例如次基因體片段或次片段，其中各片段包含： (i) 獨有的5'突出物及獨有的3'突出物；及 (ii) 變異型桿狀病毒核苷酸序列，其所包含之功能性限制IIS型限制酶位點比野生型桿狀病毒基因體之核苷酸序列少至少5個。
一種變異型桿狀病毒基因體，其包含變異型桿狀病毒核苷酸序列，該變異型桿狀病毒核苷酸序列所包含之功能性IIS型限制酶位點比野生型桿狀病毒基因體之核苷酸序列少至少5個，其中該變異型桿狀病毒基因體係複製勝任型。
如請求項1之桿狀病毒表現構築體、如請求項2之複數個片段或如請求項3之變異型桿狀病毒基因體，其中該變異型桿狀病毒核苷酸序列： (i) 所包含之功能性IIS型限制酶位點比野生型桿狀病毒基因體之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個； (ii) 所包含之兩個或更多個(例如，2-5、2、3、4或5個)或所有所選擇的IIS型限制酶之功能性IIS型限制酶位點比野生型桿狀病毒基因體之核苷酸序列少至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個或至少60個； (iii) 與野生型桿狀病毒基因體之核苷酸序列相比，不包含兩個或更多個(例如，2-5、2、3、4或5個)或所有所選擇的IIS型限制酶之功能性識別位點；或 (iv) 與野生型桿狀病毒基因體之核苷酸序列相比，不包含功能性IIS型限制酶位點。
如請求項1或4之桿狀病毒表現構築體、如請求項2或4之複數個片段或如請求項3或4之變異型桿狀病毒基因體，其中該減少的至少5個功能性IIS型限制酶位點中之至少一個、兩個、三個、四個或更多個係不同的IIS型限制酶位點，例如第一IIS型限制酶位點及第二IIS型限制酶位點，視情況其中： (i) 該第一IIS型限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶(isoschizomer)；及 (ii) 該第二IIS型限制酶位點係由選自以下之限制酶識別：AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。
如請求項5之桿狀病毒表現構築體、如請求項5之複數個片段或如請求項5之變異型桿狀病毒基因體，其中該第一IIS型限制酶位點係BsmBI限制酶位點且該第二IIS型限制酶位點係BsaI限制酶位點。
如請求項1或4之桿狀病毒表現構築體、如請求項2或4之複數個片段或如請求項3或4之變異型桿狀病毒基因體，其中該減少的至少5個功能性IIS型限制酶位點中之至少一個、兩個、三個、四個或全部係BsmBI限制酶位點、BsaI限制酶位點、PaqCI限制酶位點或其組合。
如請求項1、4或5至7中任一項之桿狀病毒表現構築體，其包含： (i) 2-20個次基因體區域(例如，16個次基因體區域)；或 (ii) 至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個次基因體區域(例如，16個次基因體區域)。
如請求項1或4至8中任一項之桿狀病毒表現構築體，或如請求項2、4或5至7之複數個片段，其中該第一獨有接合區及該第二獨有接合區之長度獨立地包含至少1-6個核苷酸(例如，4個核苷酸)。
如請求項1或4至9中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該至少兩個次基因體區域係由第一次基因體片段及第二次基因體片段形成，視情況其中該至少兩個次基因體區域進一步包含一或多個次片段。
如請求項8至10中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中該2-20個次基因體區域係由2-20個次基因體片段，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個次基因體片段形成，視情況其中該2-20個次基因體片段進一步包含一或多個次片段，例如2-300、2-250、2-200、2-150、2-100、2-50、2-20、2-10、10-300、10-250、10-200、10-150、10-100、10-50、10-20、15-300、15-250、15-200、15-150、15-100、15-50、15-20、25-300、25-250、25-200、25-150、25-100、25-50、50-300、50-250、50-200、50-150、50-100、100-300、100-250、100-200、100-150、150-300、150-250、150-200、200-300、200-250或250-300個次片段。
如請求項1或4至11中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中各次基因體片段包含至少1-20個，例如10-20、12-18、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(例如，16個)次片段。
如請求項12之桿狀病毒表現構築體，其中： (a) 該等次基因體區域中之一或多者之長度係約100-25000 bp (例如，長度係約100-1000 bp、約100-10000、約100-20000、約100-25000、約1000-10000 bp、約1000-8000 bp、約1000-5000 bp、約1000-2500 bp、約2500-25000 bp、約2500-20000 bp、約2500-15000 bp、約2500-10000 bp、約2500-5000 bp、約5000-25000 bp、約5000-20000 bp、約5000-15000 bp、約5000-10000 bp、約7500-25000 bp、約7500-20000 bp、約7500-15000 bp、約7500-10000 bp、約10000-25000 bp、約10000-20000 bp、約10000-15000 bp、約15000-25000 bp、約15000-20000 bp、約20000-25000 bp、約7000-9000 bp或約8000 bp)；及/或 (b) 該至少1-20個次片段之長度係約50-1000 bp，例如約50-900、50-800、50-700、50-600、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、100-900、100-800、100-700、100-600、100-500、100-400、100-300、100-200、200-1000、200-900、200-800、200-700、200-600、200-500、200-400、200-300、400-1000、400-900、400-800、400-700、400-600、400-500、600-1000、600-900、600-800、600-700、800-1000、800-900、900-1000 bp (例如，100-800 bp、約250-750 bp、約400-600 bp或約500 bp)。
如請求項12或13之桿狀病毒表現構築體，其中： (i) 該第一次基因體片段及該第二次基因體片段中之各者包含獨有的5'突出物及獨有的3'突出物； (ii) 該2-20個次基因體片段中之各者包含獨有的5'突出物及獨有的3'突出物；及/或 (ii) 該至少1-20個次片段中之各者包含獨有的5'突出物及獨有的3'突出物。
如請求項12至14中任一項之桿狀病毒表現構築體或如請求項2、4或5至7之複數個片段，其中： (i) 該第一獨有接合區包含該第一次基因體片段之獨有的5'突出物及該第二次基因體片段之獨有的3'突出物，其中該第一次基因體片段之獨有的5'突出物與該第二次基因體片段之獨有的3'突出物部分互補或完全互補； (ii) 第一次片段之該獨有的5'突出物與該第二次片段之獨有的3'突出物部分互補或完全互補；及/或 (iii) 該複數個片段中之一者之獨有的5'突出物與該複數個片段中之另一者之獨有的3'突出物互補或完全互補。
如請求項14或15之桿狀病毒表現構築體，或如請求項2、4或5至7或15之複數個片段，其中該獨有的5'突出物及該獨有的3'突出物係由IIS型限制酶裂解該次基因體片段、次片段及/或片段所產生。
如請求項14至16中任一項之桿狀病毒表現構築體，或如請求項2、4、5至7、15或16中任一項之複數個片段，其中該獨有的5'突出物及該獨有的3'突出物： (i) 在長度上各自獨立地包含至少1-6個核苷酸(例如，4個核苷酸)； (ii) 包含黏性端部；及/或 (iii) 各自包含獨立地選自以下之核苷酸序列：ACAA、GGTC、GACC、CCAG、CTGG、CCTT、AAGG、TCAT、ATGA、TCGC、GCGA、AGAG、CTCT、AACT、AGTT、CGGT、ACCG、ATAC、GTAT、GAGT、ACTC、TTCC、GGAA、ATTA、TAAT、TCCT、AGGA、TCTA、TAGA、TGTA、TACA、GATG、CATC或TTGT，其中次基因體片段中之該獨有的5'突出物及3'突出物之序列係不同的及/或其中片段中之該獨有的5'突出物及3'突出物之序列係不同的。
如請求項14至17中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中使用相同的限制酶，例如相同的IIS型限制酶，產生各次基因體片段之該獨有的5'突出物及該獨有的3'突出物。
如請求項14至18中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中使用該相同的IIS型限制酶產生各次片段之該獨有的5'突出物及該獨有的3'突出物，其中該相同的IIS型限制酶與用於產生該等次基因體片段之IIS型限制酶不同。
如請求項14至19中任一項之複數個片段，其中： (i) 該等次基因體片段係由第一IIS型限制酶進行之裂解產生；及/或 (ii) 該等次片段係由第二IIS型限制酶進行之裂解產生；其中該第一IIS型限制酶與該第二IIS型限制酶不同。
如請求項12至20中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中： (i) 該2-20個次基因體片段中之一或多者位於第一承載載體或分開的第一載劑片段中；及/或 (ii) 該至少1-20個次片段中之一或多者位於第二承載載體或分開的第二承載載體中。
如請求項21之桿狀病毒表現構築體，其中該2-20個次基因體片段中之各者係由該第一承載載體或該等分開的第一承載載體使用該相同的IIS型限制酶產生。
如請求項21或22之桿狀病毒表現構築體，其中該至少1-20個次片段中之各者係由該第二承載載體或該等分開的第二承載載體使用該相同的IIS型限制酶產生，其中該相同的限制酶與用於產生該等次基因體片段之IIS型限制酶不同。
如請求項1或4至23中任一項之桿狀病毒表現構築體，或如請求項2、4、5至7或15至17中任一項之複數個片段，或如請求項3至7中任一項之變異型桿狀病毒，其中該IIS型限制酶係選自AcuI、AlwI、AaR1、BaeI、BbsI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MnlI、Nme-AIII、PaqCI、PleI、SapI或SfaNI，或任何前述限制酶之同裂酶。
如請求項1或4至24中任一項之桿狀病毒表現構築體、如請求項2、4、5至7、15至17或24中任一項之複數個片段或如請求項3至7或24中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其中該IIS型限制酶係BsaI限制酶、BsmBI限制酶、PaqCI限制酶或其組合，視情況其中該用於產生該等次基因體片段之限制酶係BsmBI且該用於產生該等次片段之限制酶係BsaI。
如請求項14至25中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中： (i) 該等次基因體片段，例如該2-20個次基因體片段能夠基於一個次基因體片段中之5'突出物與另一次基因體片段中之3'突出物之互補性而有序地組裝，以產生變異型桿狀病毒基因體或該桿狀病毒表現構築體；及/或 (ii) 該至少1-20個次片段能夠基於一個次片段中之5'突出物與另一次片段中之3'突出物之互補性而有序地組裝，以產生該等次基因體片段及/或該桿狀病毒表現構築體。
如請求項12至26中任一項之桿狀病毒表現構築體，其中： (i) 該等次基因體片段中之至少兩者係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly，使得形成至少兩個次基因體區域及/或產生變異型桿狀病毒基因體或該桿狀病毒表現構築體，視情況其中該等次基因體片段係在單步驟中接合以產生變異型桿狀病毒基因體或該桿狀病毒表現構築體； (ii) 該2-20個次基因體片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly，使得形成2-20個次基因體區域及/或產生變異型桿狀病毒基因體或該桿狀病毒表現構築體，視情況其中該等次基因體片段(例如，16個次基因體片段)係在單步驟中接合以產生變異型桿狀病毒基因體或該桿狀病毒表現構築體；及/或 (iii) 該至少1-20個次片段係共價連接，例如使用連接酶(例如，T4連接酶)，例如使用Golden Gate Assembly，使得形成一或多個次基因體區域及/或產生該桿狀病毒表現構築體，視情況其中該等次片段係在單步驟中接合以產生一或多個次基因體片段(或次基因體區域)、變異型桿狀病毒基因體或該桿狀病毒表現構築體。
如請求項2、4、5至7、15至17、24或25中任一項之複數個片段，其中該複數個片段中之各者，例如次片段係： (a) 長度在50-1000 bp之間，例如約50-900、50-800、50-700、50-600、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、100-900、100-800、100-700、100-600、100-500、100-400、100-300、100-200、200-1000、200-900、200-800、200-700、200-600、200-500、200-400、200-300、400-1000、400-900、400-800、400-700、400-600、400-500、600-1000、600-900、600-800、600-700、800-1000、800-900或900-1000 bp (例如，100-800 bp、約250-750 bp、約400-600 bp或約500 bp)；或 (b) 長度在100-25000 bp之間(例如長度係約100-1000 bp、約100-10000、約100-20000、約100-25000、約1000-10000 bp、約1000-8000 bp、約1000-5000 bp、約1000-2500 bp、約2500-25000 bp、約2500-20000 bp、約2500-15000 bp、約2500-10000 bp、約2500-5000 bp、約5000-25000 bp、約5000-20000 bp、約5000-15000 bp、約5000-10000 bp、約7500-25000 bp、約7500-20000、約7500-15000 bp、約7500-10000 bp、約10000-25000 bp、約10000-20000 bp、約10000-15000 bp、約15000-25000 bp、約15000-20000 bp、約20000-25000 bp、約7000-9000 bp或約8000 bp)。
如請求項2、4、5至7、15至17、24、25或28中任一項之複數個片段，其中： (i) 該複數個片段中之一或多者(例如，次基因體片段)位於第一承載載體或分開的第一承載載體中；及/或 (ii) 該複數個片段中之一或多者(例如，次片段)位於第二承載載體或分開的第二承載載體中。
如請求項29之複數個片段，其中： (i) 該一或多個片段中之各者(例如，次基因體片段)係由第一承載載體或分開的第一承載載體使用該相同的IIS型限制酶產生；及/或 (ii) 該一或多個片段中之各者(例如，次片段)係由第二承載載體或分開的第二承載載體使用該相同的IIS型限制酶產生，其中該相同的IIS型限制酶與用於由該第一承載載體或分開的第一承載載體產生片段之IIS型限制酶不同。
如請求項12至27中任一項之桿狀病毒表現構築體，或如請求項2、4、5至7、15至17、24、25或28至30中任一項之複數個片段，其中滿足以下條件中之一者、兩者或全部： (i) 該2-20個次基因體片段中之一或多者包含來自該變異型桿狀病毒核苷酸序列之異源核苷酸序列； (ii) 該至少1-20個次片段中之一或多者包含來自該變異型桿狀病毒核苷酸序列之異源核苷酸序列；或 (iii) 該複數個片段中之一或多者包含異源核苷酸序列。
如請求項31之桿狀病毒表現構築體，或如請求項31之複數個片段，其中該異源核苷酸序列包含所關注的序列，該所關注的序列包含編碼所關注的多肽之核苷酸序列或所關注的核苷酸序列，視情況其中該異源核苷酸序列係化學合成、非模板化核苷酸序列(例如，非模板化片段)或藉由基於PCR之方法產生。
如請求項32之桿狀病毒表現構築體，或如請求項32之複數個片段，其中該所關注的序列： (i) 編碼治療性蛋白質或其功能性變異體、抗體或抗體片段；酶；基因編輯系統之組分；RNAi試劑(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、前miRNA、初代miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)；或其組合；或 (ii) 包含一或多個腺相關病毒(AAV)基因編碼區域及/或有效負載。
如請求項12至27或31至33中任一項之桿狀病毒表現構築體，或如請求項2、4、5至7、15至17、24、25或28至33中任一項之複數個片段，其中該等次基因體片段中之一或多者、該等次片段中之一或多者及/或該複數個片段中之一或多者編碼AAV Rep蛋白質，例如Rep40、Rep52、Rep68、Rep78或其組合，視情況為Rep78蛋白質及/或Rep52蛋白質。
如請求項12至27或31至34中任一項之桿狀病毒表現構築體，或如請求項2、4、5至7、15至17、24、25或28至34中任一項之複數個片段，其中該等次基因體片段中之一或多者、該等次片段中之一或多者及/或該複數個片段中之一或多者編碼AAV衣殼蛋白質，例如VP1蛋白質、VP2蛋白質、VP3蛋白質或其組合。
如請求項12至27或31至35之桿狀病毒表現構築體，或如請求項2、4、5至7、15至17、24、25或28至35中任一項之複數個片段，其中該等次基因體片段中之一或多者、該等次片段中之一或多者及/或該複數個片段中之一或多者編碼AAV1衣殼蛋白質或其變異體、AAV2衣殼蛋白質或其變異體、AAV3衣殼蛋白質或其變異體、AAV4衣殼蛋白質或其變異體、AAV5衣殼蛋白質或其變異體、AAV6衣殼蛋白質或其變異體、AAV8衣殼蛋白質或其變異體、AAV9衣殼蛋白質或其變異體或AAVrh10衣殼蛋白質或其變異體。
如請求項31至36中任一項之桿狀病毒表現構築體，或如請求項31至36中任一項之複數個片段，其中該異源核苷酸序列係化學合成、非模板化核苷酸序列(例如，非模板化片段)或藉由基於PCR之分析法產生。
如請求項12至27或31至37中任一項之桿狀病毒表現構築體，或如請求項2、4、5至7、15至17、24、25或28至37中任一項之複數個片段，其中： (i) 該等次基因體片段中之一或多者之變異型桿狀病毒核苷酸序列包含修飾，例如插入、缺失或取代； (ii) 該至少1-20個次片段中之一或多者之變異型桿狀病毒核苷酸序列包含修飾，例如插入、缺失或取代；及/或 (iii) 該複數個片段中之一或多者之變異型桿狀病毒核苷酸序列包含修飾，例如插入、缺失或取代。
如請求項38之桿狀病毒表現構築體，或如請求項38之複數個片段，其中該修飾，例如插入、缺失、取代或突變(例如，框移突變)位於非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)或非必需基因之調節區中(例如，啟動子修飾)，視情況其中該修飾引起該非必需基因或非必需基因之該調節區之不活化。
如請求項39之桿狀病毒表現構築體，或如請求項39之複數個片段，其中該非必需基因係選自以下中之一者、兩者、三者或更多者(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21者)：egt、p74 (PIF0)、p26、SOD、ChiA、v-cath、p10、多角體蛋白、ctx、odv-e56、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、Tn7、AcORF-91、AcORF-108、AcORF-52、v-ubi或p94。
如請求項38至40中任一項之桿狀病毒表現構築體，或如請求項38至40中任一項之複數個片段，其中該修飾包含： (i) chiA基因、v-cath基因、p26基因、p10基因及/或p74基因或其一部分之缺失； (ii) 該非必需基因或相鄰區域中之異源序列之插入；或 (iii) 該非必需基因或相鄰區域中之一或多個突變，視情況其中該等非必需基因位於同源重複序列區5 (hr5)附近(例如，下游或上游)。
如請求項12至27或31至41中任一項之桿狀病毒表現構築體，或如請求項2、4、5至7、15至17、24、25或28至41中任一項之複數個片段，其中該等次基因體片段中之一或多者、該至少1-20個次片段中之一或多者或該複數個片段中之一或多者之變異型桿狀病毒核苷酸序列包含非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)或非必需基因之調節區之破壞，例如突變(例如，框移突變)、缺失、插入或不活化(例如，啟動子修飾或與非必需基因相鄰之異源DNA之插入)。
如請求項38至42中任一項之桿狀病毒表現構築體，或如請求項38至42中任一項之複數個片段，其中藉由化學合成或PCR，例如基於PCR之定點突變誘發來引入該修飾。
如請求項1、4至27或31至43中任一項之桿狀病毒表現構築體，其包含桿狀病毒基因體或其一部分。
如請求項44之桿狀病毒表現構築體，其中該桿狀病毒基因體或其一部分： (i) 長度係至少10 kb-140 kb，例如至少10 kb、20 kb、30 kb、40 kb、50 kb、60 kb、70 kb、80 kb、90 kb、100 kb、110 kb、120 kb、130 kb或140 kb； (ii) 包含來自桿狀病毒基因體之核苷酸序列或其一部分，該桿狀病毒基因體係選自：苜蓿銀紋夜蛾( Autographa californica)多核多角體病毒(AcMNPV) (例如，AcMNPV病毒株E2、C6或HR3)、家蠶( Bombyx mori)核多角體病毒(BmNPV)、黎豆夜蛾( Anticarsia gemmatalis)核多角體病毒(AgMNPV)、花旗松毒蛾( Orgyia pseudotsugata)核多角體病毒(OpMNPV)、弧金翅夜蛾( Thysanoplusia orichalcea)核多角體病毒(ThorMNPV)或其變異體； (iii) 包含野生型桿狀病毒基因體或經修飾之桿狀病毒基因體，例如具有至少一個非必需基因(例如，輔助及/或經口感染因子基因)之缺失，例如具有多角體蛋白(polh)基因座之缺失之桿狀病毒基因體；或 (iv) 係bMON14272桿狀病毒基因體。
如請求項1、4至27或31至45中任一項之桿狀病毒表現構築體，其能夠產生至少70% (例如，至少80%、至少90%、至少100%、至少110%、至少120%、70-200%、70-150%、70-100%、80-200%、80-150%、80-100%、90-200%、90-150%、90-100%、100-200%、100-150%、100-125%、100-110%、125-200%、150-200%或175-200%)之由野生型桿狀病毒基因體產生之桿狀病毒。
如請求項1、4至27或31至46中任一項之桿狀病毒表現構築體，或如請求項3至7、24或25中任一項之變異型桿狀病毒基因體，其包含至少一個非天然存在，例如經工程改造之功能性IIS型限制酶位點，視情況其中該非天然存在之功能性IIS型限制酶位點包含相對於天然存在之序列經修飾之序列或與該野生型桿狀病毒基因體相比位於不同位置。
如請求項1、4至27或31至47中任一項之桿狀病毒表現構築體、如請求項3至7、24、25或47中任一項之變異型桿狀病毒基因體，或如請求項2、4、5至7、15至17、24、25或28至43中任一項之複數個片段，其中變異型桿狀病毒核苷酸序列係化學合成及/或非模板化核苷酸序列(例如，非模板化片段)。
一種載體，其包含如請求項1、4至27或31至48中任一項之桿狀病毒表現構築體、如請求項2、4、5至7、15至17、24、25、28至43或48中任一項之複數個片段或如請求項3至7、24、25、47或48中任一項之變異型桿狀病毒基因體，視情況其中該載體係細菌人工染色體(BAC)。
如請求項49之載體，其包含BAC，其中該BAC不含所選擇的IIS型限制酶之識別位點，視情況其中該BAC不含兩個或更多個所選擇的IIS型限制酶之識別位點。
一種細菌人工染色體(BAC)，其所包含之功能性IIS型限制酶位點比參考BAC，例如野生型BAC少至少5個。
一種細胞，其包含如請求項1、4至27或31至48中任一項之桿狀病毒表現構築體、如請求項2、4、5至7、15至17、24、25、28至43或48中任一項之複數個片段、如請求項3至7、24、25、47或48中任一項之變異型桿狀病毒基因體、如請求項49或50之載體或如請求項51之BAC，視情況其中該細胞係昆蟲細胞(例如，Sf9細胞或Sf21)、哺乳動物細胞(例如，HEK293細胞)或細菌細胞(例如，大腸桿菌( E. coli))。
一種組合物，其包含如請求項1、4至27或31至48中任一項之桿狀病毒表現構築體、如請求項2、4、5至7、15至17、24、25、28至43或48中任一項之複數個片段、如請求項3至7、24、25、47或48中任一項之變異型桿狀病毒基因體、如請求項49或50之載體或如請求項51之BAC，及載劑。
一種套組，其包含如請求項1、4至27或31至48中任一項之桿狀病毒表現構築體、如請求項2、4、5至7、15至17、24、25、28至43或48中任一項之複數個片段、如請求項3至7、24、25、47或48中任一項之變異型桿狀病毒基因體、如請求項49或50之載體或如請求項51之BAC，及使用說明書，視情況其中該套組進一步包含IIS型限制酶。
一種產生變異型桿狀病毒基因體之方法，其包含： (i) 提供如請求項2、4、5至7、15至17、24、25、28至43或48中任一項之複數個片段； (ii) 將修飾(例如，插入、取代或缺失)，例如一或多個修飾引入一或多個包含該變異型桿狀病毒核苷酸序列之片段中；及 (iii) 在適合於形成變異型桿狀病毒基因體之條件下培育該複數個片段；藉此產生該變異型桿狀病毒基因體。
一種產生變異型桿狀病毒基因體之方法，其包含： (i) 提供如請求項2、4、5至7、15至17、24、25、28至43或48中任一項之複數個片段；及 (iii) 在適合於形成變異型桿狀病毒基因體之條件下培育該複數個片段；藉此產生該變異型桿狀病毒基因體。