TW202337491A - 包含結合之莢膜醣抗原的免疫原組合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於新的經結合莢膜醣抗原(醣結合物)、包含該等醣結合物之免疫原組合物及其用途。
Description
本發明係關於新的經結合莢膜醣抗原(醣結合物)、包含該等醣結合物之免疫原組合物及其用途。本發明之免疫原組合物通常包含醣結合物，其中醣來源於細菌莢膜多醣抗原，尤其為來源於病原性細菌之莢膜多醣。本發明亦係關於使用該等醣結合物對人類個體尤其嬰兒及老年人進行疫苗接種以抵抗感染。
革蘭氏陽性細菌及革蘭氏陰性細菌均可能產生細胞外隔室，亦即莢膜，它覆蓋細菌細胞且通常會阻止潛在的細胞表面抗原與其同源抗體發生反應。夾膜存在於數種具有醫療重要性之細菌中，尤其是腸道外及侵襲性菌株。細菌莢膜主要係由多醣構成。多醣在細胞周圍形成凝膠狀物質。莢膜多醣為重要的免疫原，由此使得其成為疫苗設計中之重要組分。莢膜多醣已被證明可用於誘發免疫反應，尤其當與載體蛋白連接時。
數十年來，已成功地利用藉由將此等分子結合至「載體」分子來提高弱免疫原分子之免疫原性的方法(參見例如Goebel等人(1939) J. Exp. Med. 69: 53)。舉例而言，已描述了許多免疫原組合物，其中經純化之莢膜聚合物已與載體蛋白結合，以藉由採用此「載體效應」來產生更高效的免疫原組合物(Schneerson等人(1984) Infect. Immun. 45: 582-591)。亦已證明，結合可避免在用游離多醣進行免疫接種時通常在嬰兒中觀測到的不良抗體反應(Anderson等人(1985) J. Pediatr. 107: 346；Insel等人(1986) J. Exp. Med. 158: 294)。
已成功使用各種交聯劑或偶合劑，諸如同型雙官能、異型雙官能或零長度交聯劑來產生結合物。目前許多方法可供用於將免疫原分子(諸如醣、蛋白質及肽)與肽或蛋白質載體偶合。大部分方法產生胺、醯胺、胺基甲酸酯、異硫脲或二硫鍵，或在一些情況下產生硫醚。使用將反應性位點引入載體及/或免疫原分子上之反應性胺基酸分子之側鏈中的交聯劑或偶合劑的不足之處在於，反應性位點在未中和的情況下會在活體外與任何非所需分子自由反應(因此可能不利地影響結合物之功能性或穩定性)，或在活體內與任何非所需分子自由反應(因此在用製劑進行免疫接種之個人或動物中引起不良事件的可能風險)。可利用各種已知的化學反應來使此類過量的反應性位點發生反應或對其進行「封端」，以便使此等位點失活，但此等反應可能在其他方面破壞結合物之功能性。
因此，仍需要新的經適當封端之醣結合物及製備該等結合物之方法，使得功能性得以保留且結合物仍能夠誘發所需免疫反應。
本發明人已發現用以產生醣結合物的有效新方法。該方法允許產生游離醣含量極低且產率良好的結合物。此外，本發明人已發現，一些肺炎鏈球菌(
Streptococcus pneumoniae)血清型(例如35B及29多醣)由於其獨特結構而在產生結合物方面造成特定挑戰。需要免疫原肺炎鏈球菌血清型多醣-載體蛋白結合物及其經改良製備方法。
在一態樣中，本發明係關於一種製備莢膜醣醣結合物之方法，其包含以下步驟：
(a)使經分離莢膜醣與碳酸衍生物及疊氮基連接子在非質子性溶劑中反應以產生經活化疊氮基醣，
(b)使載體蛋白與帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應，其中NHS部分與胺基反應以形成醯胺鍵，從而獲得經炔烴官能化載體蛋白，
(c)藉由Cu
+1介導之疊氮-炔烴環加成反應使步驟(a)之經活化疊氮基醣與步驟(b)之經活化炔烴-載體蛋白發生反應以形成醣結合物。
在一態樣中，經分離醣在活化步驟(a)前係經尺寸設定。
在一態樣中，碳酸衍生物係選自由以下組成之群：1,1'-羰基二咪唑(CDI)、1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑) (CDT)、碳酸二琥珀醯亞胺酯(DSC)及氯甲酸N-羥基琥珀醯亞胺酯。
在一態樣中，該疊氮基連接子為式(I)化合物，
其中X係選自由以下組成之群：CH
2(CH
2)
n、(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、NHCO(CH
2)
n、NHCO(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、OCH
2(CH
2)
n及O(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2；其中n係選自1至10且m係選自1至4。
在一態樣中，該帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑為帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及末端炔烴之試劑。
在一態樣中，步驟a)包含使莢膜醣與碳酸衍生物在非質子性溶劑中反應，隨後使經碳酸衍生物活化之莢膜醣與疊氮基連接子在非質子性溶劑中反應，以產生經活化疊氮基莢膜醣。
在一態樣中，結合反應c)係在水性緩衝液中在作為催化劑之銅(I)存在下進行。
在一態樣中，在步驟c)之後，該方法進一步包含用疊氮基封端劑對結合物中保留之未反應疊氮基進行封端的步驟。
在一態樣中，在步驟c)之後，該方法進一步包含用炔烴基封端劑對結合物中保留之未反應炔烴基進行封端的步驟。
在一態樣中，本發明係關於一種根據該等方法產生之莢膜醣醣結合物。
在另一態樣中，本發明係關於一種莢膜醣醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之莢膜醣且具有通式(VII)：
，
其中X係選自由以下組成之群：CH
2(CH
2)
n'、(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、NHCO(CH
2)
n'、NHCO(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、OCH
2(CH
2)
n'及O(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2；其中n'係選自1至10且m係選自1至4，
且其中X'係選自由以下組成之群：CH
2O(CH
2)
n''CH
2C=O、CH
2O(CH
2CH
2O)
m'(CH
2)
n''CH
2C=O，其中n''係選自0至10且m'係選自0至4。
在特定態樣中，本發明係針對一種莢膜醣醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之莢膜醣且具有通式(VII)，其中X為CH
2(CH
2)
n'，其中n'為2，且其中X'為CH
2O(CH
2)
n''CH
2C=O，其中n''為1。
在一特定態樣中，本發明係關於一種莢膜醣醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之莢膜醣且具有通式(VIII)，
。
本發明人已研發出新的多醣-載體蛋白結合物及製備此等結合物之方法。已發現用以產生醣結合物之方法允許生產游離醣含量極低且產率良好的醣結合物。
此外，本發明人已發現肺炎鏈球菌血清型35B及29多醣在產生結合物方面造成特定挑戰。已發現肺炎鏈球菌血清型35B及29多醣在用過碘酸鹽活化期間裂解，過碘酸鹽為常用還原胺化方法中使用的典型氧化劑。看起來，過碘酸鹽氧化在血清型35B及29多醣之主鏈上發生且使甘露糖醇或核糖醇裂解，引起尺寸減小。此情形導致若干問題，包括難以獲得某一尺寸之經活化之血清型35B及29多醣。用過碘酸鹽進行活化導致多醣Mw減小，從而大幅度限制了有效活化範圍。
WO 2020/247299提出，據稱為了改良血清型35B結合物屬性，可減少過碘酸鹽之量且使用某一溫度範圍來進行結合反應。然而，已發現此類溶液會導致低產率及/或較高含量之游離醣。本發明人已研發出新的肺炎鏈球菌血清型35B及29多醣-載體蛋白結合物及製備此等結合物之經改良方法，其不具有此等缺陷。
1.
本發明之醣結合物
本發明部分針對經結合細菌莢膜醣抗原(亦稱為醣結合物)。出於本發明之目的，術語『醣結合物』指示與載體蛋白共價連接之莢膜醣(尤其細菌莢膜醣)。
1.1 本發明之莢膜醣在整個本說明書中，術語「醣」可指示多醣或寡醣且包括兩者。在一實施例中，本發明之醣可為寡醣。寡醣具有低數目之重複單元(通常5至15個重複單元)且通常以合成方式或藉由多醣之水解得到。然而較佳地，本發明之所有醣及本發明之免疫原組合物中之所有醣為多醣。高分子量多醣由於存在於抗原表面上之抗原決定基而能夠誘導某些抗體免疫反應。較佳地，考慮高分子量莢膜多醣之分離及純化以用於本發明之結合物、組合物及方法中。因此，在本發明之一較佳實施例中，醣為多醣。
較佳地，本發明中所使用之醣為細菌莢膜醣(本文中亦稱為『莢膜醣』)。具有醫療重要性之若干細菌中存在莢膜。細菌莢膜主要由多醣構成。莢膜醣係藉由一般熟習此項技術者已知之標準技術製備。
在本發明之一最佳實施例中，醣為肺炎鏈球菌莢膜多醣。
在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為合成碳水化合物。
然而，在一較佳實施例中，根據本發明之細菌莢膜醣來源可為細菌細胞。可用作莢膜醣來源之細菌菌株可獲自現有培養物保藏中心(諸如來自美國典型培養物保藏中心(ATCC，Manassas, VA USA)或鏈球菌參考實驗室(疾病控制與預防中心，Atlanta, GA USA))或臨床標本。
細菌莢膜醣可使用一般熟習此項技術者已知之分離程序自細菌直接獲得(參見例如US2006/0228380、US2006/0228381、US2007/0184071、US2007/0184072、US2007/0231340及US2008/0102498及WO2008/118752中所揭示之方法)。其亦可使用熟習此項技術者已知之合成方案產生。
在細菌莢膜醣自細菌直接獲得的情況下，細菌細胞可在培養基中生長。在產生莢膜醣之細菌細胞醱酵之後，細菌細胞可溶解以產生細胞溶解產物。莢膜醣接著可使用此項技術中已知之純化技術自細胞溶解產物分離，包括使用離心、深層過濾、沈澱、超濾、用活性碳處理、透濾及/或管柱層析(參見例如US2006/0228380、US2006/0228381及WO2008/118752)。經純化之莢膜醣隨後可用於製備免疫原結合物。
藉由純化獲得的經分離莢膜醣可藉由不同參數表徵，包括例如重量平均分子量(Mw)。多醣之分子量可藉由尺寸排阻層析(SEC)與多角度雷射光散射偵測器(MALLS)之組合來量測。
在一實施例中，製備本發明之醣結合物或本發明之醣結合物之一部分的方法中使用的莢膜醣為來自病原性細菌之莢膜醣。較佳地，本發明中所使用之莢膜醣為來自病原性鏈球菌屬(
Streptococcus)、病原性葡萄球菌屬(
Staphylococcus)、病原性腸球菌屬(
Enterococcus)、病原性芽孢桿菌屬(
Bacillus)、病原性棒狀桿菌屬(
Corynebacterium)、病原性李氏菌屬(
Listeria)、病原性丹毒桿菌屬(
Erysipelothrix)、病原性芽孢梭菌屬(
Clostridium)、病原性嗜血桿菌屬(
Haemophilus)、病原性奈瑟氏菌屬(
Neisseria)或病原性埃希氏菌屬(
Escherichia)之莢膜醣。更佳地，本發明中所使用之莢膜醣為來自病原性鏈球菌屬、病原性奈瑟氏菌屬或病原性埃希氏菌屬之莢膜醣。
在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自以下之莢膜醣：嗜水氣單胞菌(
Aeromonas hydrophila)及其他菌種；炭疽芽孢桿菌(
Bacillus anthracis)；蠟樣芽胞桿菌(
Bacillus cereus)；梭菌屬之產生肉毒桿菌(
Botulinum)神經毒素之菌種；流產布魯氏菌(
Brucella abortus)；馬爾他布魯氏菌(
Brucella melitensis)；豬布魯氏菌(
Brucella suis)；鼻疽伯克霍爾德菌(
Burkholderia mallei) (官方名稱鼻疽假單胞菌(
Pseudomonas mallei))；類鼻疽伯克霍爾德菌(
Burkholderia pseudomallei)(以前稱為類鼻疽假單胞菌(
Pseudomonas pseudomallei))；空腸彎曲桿菌(
Campylobacter jejuni)；鸚鵡熱衣原體(
Chlamydia psittaci)；砂眼披衣菌(
Chlamydia trachomatis)、肉毒芽孢梭菌(
Clostridium botulinum)；難養芽孢梭菌(
Clostridium dificile)；產氣莢膜芽胞梭菌(
Clostridium perfringens)；粗球孢子菌(
Coccidioides immitis)；波薩達斯球孢子菌(
Coccidioides posadasii)；反芻動物考德里氏體(
Cowdria ruminantium) (水胸病(Heartwater))；貝氏考克斯菌(
Coxiella burnetii)；糞腸球菌(
Enterococcus faecalis)；致瀉性大腸桿菌(
Enterovirulent Escherichia coli)群(EEC群)，諸如腸毒性大腸桿菌(ETEC)、腸病原性大腸桿菌(EPEC)、O157:H7腸出血性大腸桿菌(EHEC)及腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)；艾利希體屬(
Ehrlichia)菌種，諸如查菲艾利希體(
Ehrlichia chajfeensis)；土拉熱弗朗西斯氏菌(
Francisella tularensis)；退伍軍人症嗜肺桿菌(
Legionella pneumophilia)；非洲柑橘黃龍病菌(
Liberobacter africanus)；亞洲柑橘黃龍病菌(
Liberobacter asiaticus)；單核球增多性李氏菌(
Listeria monocytogenes)；其他腸道菌屬(
miscellaneous enterics)，諸如克雷伯氏菌屬(
Klebsiella)、腸桿菌屬(
Enterobacter)、變形桿菌屬(
Proteus)、檸檬酸桿菌屬(
Citrobacter)、產氣桿菌屬(
Aerobacter)、普羅威登斯菌屬(
Providencia)及沙雷氏菌屬(
Serratia)；牛分枝桿菌(
Mycobacterium bovis)；結核分枝桿菌(
Mycobacterium tuberculosis)；山羊黴漿菌(
Mycoplasma capricolum)；絲狀黴漿菌絲狀亞種(
Mycoplasma mycoides ssp mycoides)；菲律賓露菌(
Peronosclerosporaphilippinensis)；豆薯層鏽菌(
Phakopsora pachyrhizi)；類志賀鄰單胞菌(
Plesiomonas shigelloides)；青枯雷爾氏菌生理小種3生物變種2 (
Ralstonia solanacearum race 3 , biovar 2)；普氏立克次體(
Rickettsia prowazekii)；落磯山熱立克次體(
Rickettsia rickettsii)；沙門氏菌屬菌種(
Salmonella spp.)；玉米褐條霜黴病菌(
Schlerophthora rayssiae var zeae)；志賀氏桿菌屬菌種(
Shigella spp.)；金黃色葡萄球菌(
Staphylococcus aureus)；鏈球菌；馬鈴薯癌腫病菌(
Synchytrium endobioticum)；非01霍亂弧菌(
Vibrio cholerae non-01)；01霍亂弧菌；副溶血性弧菌(
Vibrio par ahaemo Iy ticus)及其他弧菌；創傷弧菌(
Vibrio vulnificus)；水稻黃單孢菌(
Xanthomonas oryzae)；葉緣焦枯病菌(
Xylella fastidiosa)
(柑桔雜色褪綠病菌株(
citrus variegated chlorosis strain))；小腸大腸炎耶氏桿菌(
Yersinia enterocolitica)及假性結核病耶氏桿菌(
Yersinia pseudotuberculosis)；或鼠疫耶氏桿菌(
Yersinia pestis)。較佳地，本發明中所使用之莢膜醣為來自糞腸球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌或鏈球菌之莢膜醣。
在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自流感嗜血桿菌(
Haemophilus influenzae)、腦膜炎奈瑟氏菌(
Neisseria meningitidis)、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌(
S. pyogenes)、無乳鏈球菌(
S. agalactiae)、C組及G組鏈球菌或大腸桿菌之莢膜醣。更佳地，本發明中所使用之莢膜醣為來自腦膜炎奈瑟氏菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌或大腸桿菌之莢膜醣。甚至更佳地，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌或無乳鏈球菌之莢膜醣。甚至更佳地，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌之莢膜醣。
在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自金黃色葡萄球菌之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自金黃色葡萄球菌5型或金黃色葡萄球菌8型之莢膜醣。
在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自糞腸球菌之莢膜醣。在另一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自流感嗜血桿菌b型之莢膜醣。
在另一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自腦膜炎奈瑟氏菌之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自腦膜炎奈瑟氏菌血清群A (MenA)、腦膜炎奈瑟氏菌血清群W135 (MenW135)、腦膜炎奈瑟氏菌血清群Y (MenY)、腦膜炎奈瑟氏菌血清群X (MenX)或腦膜炎奈瑟氏菌血清群C (MenC)之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自腦膜炎奈瑟氏菌血清群A (MenA)之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自腦膜炎奈瑟氏菌血清群W135 (MenW135)之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自腦膜炎奈瑟氏菌血清群Y (MenY)之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自腦膜炎奈瑟氏菌血清群C (MenC)之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自腦膜炎奈瑟氏菌血清群X (MenX)之莢膜醣。
在另一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自大腸桿菌之莢膜醣。在另一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自糞腸球菌之莢膜醣。
在另一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自無乳鏈球菌(B組鏈球菌(GBS))之莢膜醣。在一些實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自GBS Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII或VIII型之莢膜醣。在一些實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自GBS Ia、Ib、II、III或V型之莢膜醣。
在另一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自大腸桿菌之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自致瀉性大腸桿菌群(EEC群)，諸如腸毒性大腸桿菌(ETEC)、腸病原性大腸桿菌(EPEC)、O157:H7腸出血性大腸桿菌(EHEC)或腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)之大腸桿菌部分之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自致腎盂腎炎大腸桿菌(UPEC)之莢膜醣。
在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自選自由血清型O157:H7、O26:H11、O111:H-及O103:H2組成之群之大腸桿菌血清型的莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自選自由血清型O6:K2:H1及O18:K1:H7組成之群之大腸桿菌血清型的莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自選自由血清型O45:K1、O17:K52:H18、O19:H34及O7:K1組成之群之大腸桿菌血清型的莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自大腸桿菌血清型O104:H4之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自大腸桿菌血清型O1:K12:H7之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自大腸桿菌血清型O127:H6之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自大腸桿菌血清型O139:H28之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自大腸桿菌血清型O128:H2之莢膜醣。
在一較佳實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌之莢膜醣。較佳地，本發明中所使用之莢膜醣為來自選自由以下組成之群之肺炎鏈球菌血清型的莢膜醣：血清型1、2、4、5、6A、6B、6C、7C、7F、8、9V、9N、10A、10B、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24B、24F、27、29、31、33B、33F、34、35B、35F、38、72及73。
在一較佳實施例中，本發明中所使用之莢膜醣不為來自肺炎鏈球菌血清型3之莢膜醣。
在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型1之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型2之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型4之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型5之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型6A之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型6B之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型7C之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型7F之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型8之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型9V之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型9N之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型10A之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型10B之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型11A之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型12F之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型14之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型15A之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型15B之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型15C之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型16F之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型17F之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型18C之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型19A之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型19F之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型20之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型21之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型22A之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型22F之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型23A之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型23B之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型23F之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型24B之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型24F之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型27之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型29之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型31之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型33B之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型33F之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型34之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型35B之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型35F之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型38之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型72之莢膜醣。在一實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型73之莢膜醣。
在一較佳實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型35B之莢膜醣。在另一較佳實施例中，本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型29之莢膜醣。
在一較佳實施例中，本發明中所使用之(在進一步處理之前經純化之)莢膜醣具有50 kDa與5000 kDa之間的重量平均分子量。在一較佳實施例中，本發明中所使用之莢膜醣具有500 kDa與5000 kDa之間的重量平均分子量。在另一較佳實施例中，本發明中所使用之莢膜醣具有1000 kDa與5000 kDa之間的重量平均分子量。
考慮以上範圍中之任一者內之任何全數整數作為本發明之一實施例。
較佳地，為了產生具有有利可過濾性特性、免疫原性及/或產率之醣結合物，醣在與載體蛋白結合前，將尺寸設定為目標分子量範圍。
有利地，經純化莢膜醣之尺寸減小，同時保留多醣結構之關鍵特徵。可採用機械或化學尺寸設定。
在一實施例中，經純化莢膜醣之尺寸藉由化學水解減小。化學水解可使用弱酸(例如乙酸、甲酸、丙酸)進行。在一實施例中，化學水解係使用甲酸進行。在一實施例中，化學品水解係使用丙酸進行。在一較佳實施例中，化學水解係使用乙酸進行。化學水解亦可使用經稀釋之強酸(諸如稀鹽酸、稀硫酸、稀磷酸、稀硝酸或稀過氯酸)進行。在一實施例中，化學水解係使用稀鹽酸進行。在一實施例中，化學水解係使用烯硫酸進行。在一實施例中，化學水解係使用烯磷酸進行。在一實施例中，化學水解係使用烯硝酸進行。在一實施例中，化學水解係使用烯過氯酸進行。
經純化莢膜醣之尺寸亦可藉由機械均質化減小。在一實施例中，經純化莢膜醣之尺寸藉由高壓均質化減小。高壓均質化藉由經由具有足夠小尺寸之流徑泵送製程流來達成高剪切速率。剪切速率藉由使用較大的所施加均質化壓力而增加，且暴露時間可藉由使進料流再循環通過均質器而增加。
高壓均質化製程可適用於減小經純化莢膜醣之尺寸，同時保留醣之結構特徵。
在一較佳實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為10 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為50 kDa與500 kDa之間的重量平均分子量。在一實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為50 kDa與400 kDa之間的重量平均分子量。在一實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為50 kDa與250 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為250 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為250 kDa與500 kDa之間的重量平均分子量。在一實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為250 kDa與400 kDa之間的重量平均分子量。在一較佳實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為200 kDa與800 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為約250 kDa之重量平均分子量。在一實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為約300 kDa之重量平均分子量。在一實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為約350 kDa之重量平均分子量。在一實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為約400 kDa之重量平均分子量。在一實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為約450 kDa之重量平均分子量。在一實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為約500 kDa之重量平均分子量。在一實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為約550 kDa之重量平均分子量。在一實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為約600 kDa之重量平均分子量。在一實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為約700 kDa之重量平均分子量。在一實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為約800 kDa之重量平均分子量。在一實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為約900 kDa之重量平均分子量。在一實施例中，經分離莢膜醣之尺寸設定為約1000 kDa之重量平均分子量。
在一實施例中，經分離莢膜醣未經尺寸設定。
上文所描述之經分離莢膜醣可經活化(例如經化學活化)，使得其能夠(例如與連接子)反應且隨後併入醣結合物中，如本文進一步所描述。
出於本發明之目的，術語『醣結合物』指示與載體蛋白共價連接之醣。
一般而言，醣與載體之共價結合會增強醣之免疫原性，因為共價結合將該等醣自T非依賴性抗原轉化為T依賴性抗原，由此引起免疫記憶之激活。結合尤其適用於兒童疫苗。
1.2 本發明之莢膜醣醣結合物在一些實施例中，本發明之醣結合物包含莢膜醣，其中該多醣在結合前的重量平均分子量(Mw)在10 kDa與2,000 kDa之間。
醣在結合前的重量平均分子量(Mw)係指醣活化之前(亦即在最終尺寸設定步驟之後但在醣與活化劑反應之前)的Mw。在本發明之上下文中，醣之Mw未由活化步驟實質上改變，且併入結合物中的醣之Mw與活化之前量測的醣之Mw類似。在一實施例中，醣係用碳酸衍生物(例如CDI或CDT)與疊氮基連接子之組合活化(參見下文部分1.3)。在一實施例中，醣係用CDI與疊氮基連接子之組合活化(參見下文部分1.3)。在一實施例中，醣係用CDT與疊氮基連接子之組合活化(參見下文部分1.3)。
在一實施例中，本發明之醣結合物包含莢膜醣，其中該醣在結合前的重量平均分子量(Mw)在50 kDa與1,000 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在50 kDa與750 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在50 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在50 kDa與250 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在50 kDa與200 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在50 kDa與150 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在50 kDa與100 kDa之間。
在一實施例中，本發明之醣結合物包含莢膜醣，其中該醣在結合前的重量平均分子量(Mw)在75 kDa與1,000 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在75 kDa與750 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在75 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在75 kDa與250 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在75 kDa與200 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在75 kDa與150 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在75 kDa與100 kDa之間。
在一實施例中，本發明之醣結合物包含莢膜醣，其中該醣在結合前的重量平均分子量(Mw)在100 kDa與1,000 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在100 kDa與750 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在100 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在100 kDa與250 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在100 kDa與200 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在100 kDa與150 kDa之間。
在一實施例中，本發明之醣結合物包含莢膜醣，其中該醣在結合前的重量平均分子量(Mw)在150 kDa與1,000 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在150 kDa與750 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在150 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在150 kDa與250 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在150 kDa與200 kDa之間。
在一實施例中，本發明之醣結合物包含莢膜醣，其中該醣在結合前的重量平均分子量(Mw)在200 kDa與1,000 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在200 kDa與750 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在200 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在200 kDa與300 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在200 kDa與250 kDa之間。
在一實施例中，本發明之醣結合物包含莢膜醣，其中該醣在結合前的重量平均分子量(Mw)在500 kDa與1,000 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在500 kDa與750 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在500 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)在500 kDa與600 kDa之間。
考慮以上範圍中之任一者內之任何全數整數作為本發明之一實施例。
在一實施例中，本發明之醣結合物包含莢膜醣，其中該醣在結合前的重量平均分子量(Mw)為約1,000 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約750 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約700 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約600 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約500 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約400 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約300 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約200 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約150 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約125 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約100 kDa。
在一些實施例中，本發明之醣結合物具有250 kDa與20,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，本發明之醣結合物具有500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在又其他實施例中，本發明之醣結合物具有500 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在其他實施例中，本發明之醣結合物具有500 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，本發明之醣結合物具有500 kDa與7,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有500 kDa與5,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有500 kDa與2,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有500 kDa與2,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有500 kDa與1,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有500 kDa與1,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有500 kDa與750 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在其他實施例中，本發明之醣結合物具有750 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，本發明之醣結合物具有750 kDa與7,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有750 kDa與5,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有750 kDa與2,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有750 kDa與2,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有750 kDa與1,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有750 kDa與1,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在其他實施例中，本發明之醣結合物具有1,000 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，本發明之醣結合物具有1,000 kDa與7,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有1,000 kDa與5,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有1,000 kDa與2,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有1,000 kDa與2,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有1,000 kDa與1,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在其他實施例中，本發明之醣結合物具有2,000 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，本發明之醣結合物具有2,000 kDa與7,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有2,000 kDa與5,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有2,000 kDa與4,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有2,000 kDa與3,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有2,000 kDa與3,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有2,250 kDa與3,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在較佳實施例中，本發明之醣結合物具有1,000 kDa與2,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
考慮以上範圍中之任一者內之任何全數整數作為本發明之一實施例。
在其他實施例中，本發明之醣結合物具有約10,000 kDa之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，本發明之醣結合物具有約9,000 kDa之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，本發明之醣結合物具有約8,000 kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有約7,500 kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有約6,000 kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有約5,000 kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有約4,000 kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有約3,500 kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有約3,250 kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有約3,000 kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有約2,500 kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有約2,000 kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有約1,500 kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有約1,000 kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他實施例中，本發明之醣結合物具有約750 kDa之重量平均分子量(Mw)。
表徵本發明之醣結合物之另一方式為藉由在載體蛋白(例如CRM
197或SCP)中變得與醣結合之離胺酸殘基之數目來表徵，此可表徵為結合之離胺酸之範圍(結合程度)。載體蛋白由於與醣之共價連接而發生的離胺酸修飾之證據可藉由使用熟習此項技術者已知之常規方法的胺基酸分析來獲得。與用於產生結合物物質之載體蛋白起始物質相比，結合引起所回收之離胺酸殘基之數目減少。在一較佳實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在2與15之間。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在2與13之間。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在2與10之間。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在2與8之間。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在2與6之間。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在2與5之間。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在2與4之間。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在3與15之間。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在3與13之間。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在3與10之間。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在3與8之間。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在3與6之間。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在3與5之間。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在3與4之間。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在5與15之間。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在5與10之間。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在8與15之間。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在8與12之間。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在10與15之間。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在10與12之間。
在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度為約2。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度為約3。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度為約4。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度為約5。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度為約6。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度為約7。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度為約8。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度為約9。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度為約10、約11。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度為約12。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度為約13。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度為約14。在一實施例中，本發明之醣結合物之結合程度為約15。在一較佳實施例中，本發明之醣結合物之結合程度在4與7之間。在一些此類實施例中，載體蛋白為CRM
197。在其他此類實施例中，載體蛋白為SCP。
本發明之醣結合物亦可由醣與載體蛋白之比率(重量/重量)表徵。在一些實施例中，醣結合物中醣與載體蛋白之比率(w/w)在0.5與3.0之間。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)在0.5與2.0之間。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)在0.5與1.5之間。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)在0.8與1.2之間。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)在0.5與1.0之間。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)在1.0與1.5之間。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)在1.0與2.0之間。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)在0.8與1.2之間。在一較佳實施例中，結合物中醣與載體蛋白之比率在0.9與1.1之間。
在一實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約0.5。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約0.6。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約0.7。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約0.8。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約0.9。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約1.0。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約1.1。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約1.2。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約1.3。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約1.4。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約1.5。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約1.6。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約1.7。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約1.8。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約1.9。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約2.0。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約2.1。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約2.2。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約2.5。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約2.8。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為約3.0。在一些此類實施例中，載體蛋白為CRM
197。在其他此類實施例中，載體蛋白為SCP。
本發明之醣結合物亦可藉由載體蛋白與醣之間的共價連接之數目表徵，其隨醣之重複單元而變化。在一個實施例中，本發明之醣結合物針對醣之每4個醣重複單元在載體蛋白與醣之間包含至少一個共價連接。在另一實施例中，載體蛋白與醣之間的共價連接在醣之每10個醣重複單元中出現至少一次。在另一實施例中，載體蛋白與醣之間的共價連接在醣之每15個醣重複單元中出現至少一次。在另一實施例中，載體蛋白與醣之間的共價連接在醣之每25個醣重複單元中出現至少一次。在另一實施例中，載體蛋白與醣之間的共價連接在醣之每50個醣重複單元中出現至少一次。在又另一實施例中，載體蛋白與醣之間的共價連接在醣之每100個醣重複單元中出現至少一次。
在其他實施例中，本發明之醣結合物針對醣之每5至10個醣重複單元在載體蛋白與醣之間包含至少一個共價連接。
在其他實施例中，本發明之醣結合物針對醣之每2至7個醣重複單元在載體蛋白與醣之間包含至少一個共價連接。
在其他實施例中，本發明之醣結合物針對醣之每6至11個醣重複單元在載體蛋白與醣之間包含至少一個共價連接。
在其他實施例中，本發明之醣結合物針對醣之每9至14個醣重複單元在載體蛋白與醣之間包含至少一個共價連接。
在其他實施例中，本發明之醣結合物針對醣之每10至20個醣重複單元在載體蛋白與醣之間包含至少一個共價連接。
在其他實施例中，本發明之醣結合物針對醣之每4至25個醣重複單元在載體蛋白與醣之間包含至少一個共價連接。
在常見實施例中，載體蛋白質為CRM
197。在其他實施例中，載體蛋白為SCP。
在一些實施例中，載體蛋白為CRM
197，且CRM
197與醣之間的共價連接在醣之每4、10、15或25個醣重複單元中出現至少一次。在其他實施例中，載體蛋白為SCP，且SCP與醣之間的共價連接在醣之每4、10、15或25個醣重複單元中出現至少一次。
本發明之醣結合物及免疫原組合物可含有並未與載體蛋白共價結合但仍存在於醣結合物組合物中之游離醣。游離醣可與醣結合物非共價締合(亦即，與醣結合物非共價鍵結、吸附至醣結合物、或者包覆於醣結合物中或由醣結合物包覆)。
在一較佳實施例中，與該醣之總量相比，醣結合物包含少於約50%之游離醣。在一較佳實施例中，與該醣之總量相比，醣結合物包含少於約40%之游離醣。在另一較佳實施例中，與該醣之總量相比，醣結合物包含少於約25%之游離醣。在一甚至更佳實施例中，與該醣之總量相比，醣結合物包含少於約20%之游離醣。在另一較佳實施例中，與該醣之總量相比，醣結合物包含少於約15%之游離醣。
醣結合物亦可由其分子尺寸分佈(K
d)表徵。尺寸排阻層析介質(CL-4B)可用於測定結合物之相對分子尺寸分佈。在重力饋送管柱中使用尺寸排阻層析(SEC)以得到結合物之分子尺寸分佈概況。自介質之孔中排阻之大分子比小分子溶離得更快。使用溶離份收集器來收集管柱溶離液。藉由醣分析對溶離份進行比色測試。為了測定K
d，將管柱進行校準，以確立分子被完全排阻之溶離份(V
0), (K
d=0)及表示最大保留之溶離份(V
i), (K
d=1)。達到指定樣品屬性之溶離份(V
e)藉由表達式K
d= (V
e- V
0)/(V
i- V
0)與K
d相關。
在一較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少30%的本發明之醣結合物具有小於或等於0.3之K
d。在一較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少40%的本發明之醣結合物具有小於或等於0.3之K
d。在一較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%的本發明之醣結合物具有小於或等於0.3之K
d。在一較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少60%的本發明之醣結合物具有小於或等於0.3之K
d。在一較佳實施例中，在CL-4B管柱中，50%與80%之間的本發明之醣結合物具有小於或等於0.3之K
d。在一較佳實施例中，在CL-4B管柱中，65%與80%之間的本發明之醣結合物具有小於或等於0.3之K
d。
1.3 使用點擊化學製備的本發明之莢膜醣醣結合物本發明之醣結合物係使用點擊化學製備。本發明亦係關於製備如本文所揭示之醣結合物的方法。
根據本發明，點擊化學包含三個步驟：(a)使經分離莢膜醣與碳酸衍生物及疊氮基連接子在非質子性溶劑中反應以產生經活化疊氮基醣(醣活化)，(b)使載體蛋白與帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應，其中NHS部分與胺基反應以形成醯胺鍵，從而獲得經炔烴官能化之載體蛋白(載體蛋白活化)，(c)藉由Cu
+1介導之疊氮-炔烴環加成反應使步驟(a)之經活化疊氮基醣與步驟(b)之經活化炔烴-載體蛋白發生反應以形成醣結合物。
在步驟(a)之後，醣被稱為經活化，且在本文中被稱作「經活化醣」或「經活化疊氮基醣」。
在步驟(b)之後，載體被稱為經活化，且被稱作「經活化載體」。
如上文所提及，醣在活化(a)前，將尺寸設定為目標分子量(MW)範圍。因此，在一實施例中，經分離醣在用碳酸衍生物及疊氮基連接子活化之前經尺寸設定。在一實施例中，經分離醣經尺寸設定為上文所定義之目標分子量(MW)範圍中之任一者。
在一實施例中，該碳酸衍生物係選自由以下組成之群：1,1'-羰基二咪唑(CDI)、1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑) (CDT)、碳酸二琥珀醯亞胺酯(DSC)及氯甲酸N-羥基琥珀醯亞胺酯。
在一實施例中，該碳酸衍生物為1,1'-羰基二咪唑(CDI)。在另一實施例中，該碳酸衍生物為1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑) (CDT)。在另一實施例中，該碳酸衍生物為碳酸二琥珀醯亞胺酯(DSC)。在又另一實施例中，該碳酸衍生物為氯甲酸N-羥基琥珀醯亞胺酯。
在一實施例中，該碳酸衍生物為1,1'-羰基二咪唑(CDI)或1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑) (CDT)。較佳地，該碳酸衍生物為1,1'-羰基二咪唑(CDI)。
在一實施例中，該疊氮基連接子為式(I)化合物，
其中X係選自由以下組成之群：CH
2(CH
2)
n、(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、NHCO(CH
2)
n、NHCO(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、OCH
2(CH
2)
n及O(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2；其中n係選自1至10且m係選自1至4。
在一實施例中，該疊氮基連接子為式(I)化合物，其中X為CH
2(CH
2)
n，且n係選自1至10。在一實施例中，n係選自1至5。在一實施例中，n係選自1至4。在一實施例中，n係選自1至3。在一實施例中，n係選自1至2。在一特定實施例中，n為1。在另一實施例中，n為2。在又另一實施例中，n為3。在又另一實施例中，n為4。在又另一實施例中，n為5。在又另一實施例中，n為6。在又另一實施例中，n為7。在又另一實施例中，n為8。在又另一實施例中，n為9。在又另一實施例中，n為10。
在一實施例中，該疊氮基連接子為式(I)化合物，其中X為(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2，其中m係選自1至4。在一實施例中，m係選自1至3。在一實施例中，m係選自1至2。在一特定實施例中，m為1。在另一實施例中，m為2。在又另一實施例中，m為3。在又另一實施例中，m為4。
在一實施例中，該疊氮基連接子為式(I)化合物，其中X為NHCO(CH
2)
n，且n係選自1至10。在一實施例中，n係選自1至5。在一實施例中，n係選自1至4。在一實施例中，n係選自1至3。在一實施例中，n係選自1至2。在一特定實施例中，n為1。在另一實施例中，n為2。在又另一實施例中，n為3。在又另一實施例中，n為4。在又另一實施例中，n為5。在又另一實施例中，n為6。在又另一實施例中，n為7。在又另一實施例中，n為8。在又另一實施例中，n為9。在又另一實施例中，n為10。
在一實施例中，該疊氮基連接子為式(I)化合物，其中X為NHCO(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2，其中m係選自1至4。在一實施例中，m係選自1至3。在一實施例中，m係選自1至2。在一特定實施例中，m為1。在另一實施例中，m為2。在又另一實施例中，m為3。在又另一實施例中，m為4。
在一實施例中，該疊氮基連接子為式(I)化合物，其中X為OCH
2(CH
2)
n，且n係選自1至10。在一實施例中，n係選自1至5。在一實施例中，n係選自1至4。在一實施例中，n係選自1至3。在一實施例中，n係選自1至2。在一特定實施例中，n為1。在另一實施例中，n為2。在又另一實施例中，n為3。在又另一實施例中，n為4。在又另一實施例中，n為5。在又另一實施例中，n為6。在又另一實施例中，n為7。在又另一實施例中，n為8。在又另一實施例中，n為9。在又另一實施例中，n為10。
在一實施例中，該疊氮基連接子為式(I)化合物，其中X為O(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2，其中m係選自1至4。在一實施例中，m係選自1至3。在一實施例中，m係選自1至2。在一特定實施例中，m為1。在另一實施例中，m為2。在又另一實施例中，m為3。在又另一實施例中，m為4。
在一實施例中，該疊氮基連接子為式(II)化合物，
在一較佳實施例中，該疊氮基連接子為3-疊氮基-丙胺。
在一實施例中，該帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑為帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及末端炔烴之試劑。
在一實施例中，該帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑為帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及環炔烴之試劑。
在一實施例中，該帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑為式(III)化合物，
其中X係選自由以下組成之群：CH
2O(CH
2)
nCH
2C=O及CH
2O(CH
2CH
2O)
m(CH
2)
nCH
2C=O，其中n係選自0至10且m係選自0至4。
在一實施例中，該帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑為式(III)化合物，其中X為CH
2O(CH
2)
nCH
2C=O，其中n係選自0至10。在一實施例中，n係選自0至5。在一實施例中，n係選自0至4。在一實施例中，n係選自0至3。在一實施例中，n係選自0至2。在一特定實施例中，n為0。在一特定實施例中，n為1。在另一實施例中，n為2。在又另一實施例中，n為3。在又另一實施例中，n為4。在又另一實施例中，n為5。在又另一實施例中，n為6。在又另一實施例中，n為7。在又另一實施例中，n為8。在又另一實施例中，n為9。在又另一實施例中，n為10。
在一實施例中，該帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑為式(III)化合物，其中X為CH
2O(CH
2CH
2O)
m(CH
2)
nCH
2C=O，其中n係選自0至10且m係選自0至4。在一實施例中，n係選自0至5。在一實施例中，n係選自0至4。在一實施例中，n係選自0至3。在一實施例中，n係選自0至2。在一特定實施例中，n為0。在一特定實施例中，n為1。在另一實施例中，n為2。在又另一實施例中，n為3。在又另一實施例中，n為4。在又另一實施例中，n為5。在又另一實施例中，n為6。在又另一實施例中，n為7。在又另一實施例中，n為8。在又另一實施例中，n為9。在又另一實施例中，n為10。在一實施例中，m係選自0至3。在一實施例中，m係選自0至2。在一特定實施例中，m為1。在一特定實施例中，m為1。在另一實施例中，m為2。在又另一實施例中，m為3。在又另一實施例中，m為4。
在一實施例中，n係選自0至5且m係選自0至3。在一實施例中，n係選自0至5且m係選自0至2。
在一實施例中，n係選自0至4且m係選自0至3。在一實施例中，n係選自0至4且m係選自0至2。
在一實施例中，n係選自0至3且m係選自0至3。在一實施例中，n係選自0至3且m係選自0至2。
在一實施例中，n係選自0至2且m係選自0至3。在一實施例中，n係選自0至2且m係選自0至2。
在一實施例中，n係選自0至1且m係選自0至3。在一實施例中，n係選自0至1且m係選自0至2。
在一實施例中，n為0且m為0。在一實施例中，n為1且m為0。在一實施例中，n為2且m為0。在一實施例中，n為3且m為0。在一實施例中，n為4且m為0。在一實施例中，n為5且m為0。在一實施例中，n為6且m為0。在一實施例中，n為7且m為0。在一實施例中，n為8且m為0。在一實施例中，n為9且m為0。在一實施例中，n為10且m為0。
在一實施例中，n為0且m為1。在一實施例中，n為1且m為1。在一實施例中，n為2且m為1。在一實施例中，n為3且m為1。在一實施例中，n為4且m為1。在一實施例中，n為5且m為1。在一實施例中，n為6且m為1。在一實施例中，n為7且m為1。在一實施例中，n為8且m為1。在一實施例中，n為9且m為1。在一實施例中，n為10且m為1。
在一實施例中，n為0且m為2。在一實施例中，n為1且m為2。在一實施例中，n為2且m為2。在一實施例中，n為3且m為2。在一實施例中，n為4且m為2。在一實施例中，n為5且m為2。在一實施例中，n為6且m為2。在一實施例中，n為7且m為2。在一實施例中，n為8且m為2。在一實施例中，n為9且m為2。在一實施例中，n為10且m為2。
在一實施例中，n為0且m為3。在一實施例中，n為1且m為3。在一實施例中，n為2且m為3。在一實施例中，n為3且m為3。在一實施例中，n為4且m為3。在一實施例中，n為5且m為3。在一實施例中，n為6且m為3。在一實施例中，n為7且m為3。在一實施例中，n為8且m為3。在一實施例中，n為9且m為3。在一實施例中，n為10且m為3。
在一實施例中，n為0且m為4。在一實施例中，n為1且m為4。在一實施例中，n為2且m為4。在一實施例中，n為3且m為4。在一實施例中，n為4且m為4。在一實施例中，n為5且m為4。在一實施例中，n為6且m為4。在一實施例中，n為7且m為4。在一實施例中，n為8且m為4。在一實施例中，n為9且m為4。在一實施例中，n為10且m為4。
在一實施例中，該帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑為式(IV)化合物：
在一實施例中，步驟a)包含使醣與碳酸衍生物反應，隨後使經碳酸衍生物活化之醣與疊氮基連接子在非質子性溶劑中反應以產生經活化疊氮基醣。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.01至10莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.05至10莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.1至10莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.2至10莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.3至10莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.4至10莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.5至10莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.8至10莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在1至10莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在2至10莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在3至10莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在5至10莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.01至5莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.05至5莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.1至5莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.2至5莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.3至5莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.4至5莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.5至5莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.8至5莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在1至5莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在2至5莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在3至5莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.01至3莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.05至3莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.1至3莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.2至3莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.3至3莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.4至3莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.5至3莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.8至3莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在1至3莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在2至3莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.01至2莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.05至2莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.1至2莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.2至2莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.3至2莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.4至2莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.5至2莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.8至2莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在1至2莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.01至1莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.05至1莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.1至1莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.2至1莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.3至1莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.4至1莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.5至1莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.8至1莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.01至0.5莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.05至0.5莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.1至0.5莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.2至0.5莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.3至0.5莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.4至0.5莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與一量之碳酸衍生物反應
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.01至0.4莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.05至0.4莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.1至0.4莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.2至0.4莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.3至0.4莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.01至0.3莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.05至0.3莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.1至0.3莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量在0.2至0.3莫耳當量之間的量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量約0.01莫耳當量之量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量約0.05莫耳當量之量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量約0.08莫耳當量之量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量約0.1莫耳當量之量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量約0.2莫耳當量之量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量約0.3莫耳當量之量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量約0.4莫耳當量之量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量約0.5莫耳當量之量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量約1莫耳當量之量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量約2莫耳當量之量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量約3莫耳當量之量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量約4莫耳當量之量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量約5莫耳當量之量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量約8莫耳當量之量的碳酸衍生物反應。
在一個實施例中，步驟a)包含使醣與相對於反應混合物中所存在之醣的量約10莫耳當量之量的碳酸衍生物反應。
在一實施例中，在步驟a)處，經分離醣與碳酸衍生物在非質子性溶劑中反應。
在一個實施例中，經分離醣與碳酸衍生物在基本上由二甲亞碸(DMSO)或二甲基甲醯胺(DMF)組成之溶液中反應。在一個實施例中，經分離醣與碳酸衍生物在基本上由二甲基甲醯胺(DMF)組成之溶液中反應。在一個實施例中，經分離醣與碳酸衍生物在基本上由二甲亞碸(DMSO)組成之溶液中反應。
在一實施例中，經分離醣與碳酸衍生物在基本上由二甲基乙醯胺組成之溶液中反應。在一實施例中，經分離醣與碳酸衍生物在基本上由N-甲基-2-吡咯啶酮組成之溶液中反應。在一實施例中，經分離醣與碳酸衍生物在基本上由六甲基磷醯胺(HMPA)組成之溶液中反應。
在一較佳實施例中，經分離醣與碳酸衍生物在基本上由二甲亞碸(DMSO)組成之溶液中反應。
在一個實施例中，經分離醣與碳酸衍生物在二甲亞碸(DMSO)或二甲基甲醯胺(DMF)中反應。在一個實施例中，經分離醣與碳酸衍生物在二甲基甲醯胺(DMF)中反應。在一個實施例中，經分離醣與碳酸衍生物在二甲亞碸(DMSO)中反應。
在一實施例中，經分離醣與碳酸衍生物在二甲基乙醯胺中反應。在一實施例中，經分離醣與碳酸衍生物在N-甲基-2-吡咯啶酮中反應。在一實施例中，經分離醣與碳酸衍生物在六甲基磷醯胺(HMPA)中反應。
在一較佳實施例中，經分離醣與CDI在二甲亞碸(DMSO)中反應。在一實施例中，經分離醣與CDI在無水DMSO中反應。
已出人意料地發現，使經分離醣與CDI在水分含量約0.1%至1% (v/v)之環境中反應能夠避免副反應。因此，在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.1%至1% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.1%至0.8% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.1%至0.5% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.1%至0.4% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.1%至0.3% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.1%至0.2% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。
在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.2%至1% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.2%至0.8% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.2%至0.5% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.2%至0.4% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.2%至0.3% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。
在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.3%至0.8% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.3%至0.5% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.3%至0.4% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。
在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含約0.1% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含約0.2% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含約0.3% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含約0.4% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含約0.5% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含約0.6% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含約0.7% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含約0.8% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含約0.9% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。
在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.1%至1% (v/v)水之DMSO中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.1%至0.8% (v/v)水之DMSO中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.1%至0.5% (v/v)水之DMSO中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.1%至0.4% (v/v)水之DMSO中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.1%至0.3% (v/v)水之DMSO中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.1%至0.2% (v/v)水之DMSO中反應。
在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.2%至1% (v/v)水之DMSO中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.2%至0.8% (v/v)水之DMSO中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.2%至0.5% (v/v)水之DMSO中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.2%至0.4% (v/v)水之DMSO中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.2%至0.3% (v/v)水之DMSO中反應。
在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.3%至0.8% (v/v)水之DMSO中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.3%至0.5% (v/v)水之DMSO中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含0.3%至0.4% (v/v)水之DMSO中反應。
在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含約0.1% (v/v)水之DMSO中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含約0.2% (v/v)水之DMSO中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含約0.3% (v/v)水之DMSO中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含約0.4% (v/v)水之DMSO中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含約0.5% (v/v)水之DMSO中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含約0.6% (v/v)水之DMSO中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含約0.7% (v/v)水之DMSO中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含約0.8% (v/v)水之DMSO中反應。在一個實施例中，經分離醣與CDI在包含約0.9% (v/v)水之DMSO中反應。
在一個實施例中，在添加疊氮基連接子之前藉由添加水來淬滅游離碳酸衍生物。水可使游離CDI不活化。因此，在一實施例中，在碳酸衍生物活化之後添加水。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約1%至約10% (v/v)之間。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約1.2%至約8% (v/v)之間。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約1.5%至約5% (v/v)之間。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約1.5%至約3% (v/v)之間。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約1.5%至約2.5% (v/v)之間。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約1% (v/v)。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約1.2% (v/v)。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約1.4% (v/v)。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約1.5% (v/v)。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約2% (v/v)。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約2.5% (v/v)。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約3% (v/v)。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約5% (v/v)。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約7% (v/v)。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約10% (v/v)。
一旦醣已與碳酸衍生物反應且在最終用水淬滅碳酸衍生物之後，經碳酸衍生物活化之醣便與疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量(RU之莫耳當量)在0.01至10莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.01至8莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.01至5莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.01至4莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.01至3莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.01至2莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.01至1莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.01至0.5莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.01至0.1莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.05至10莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.05至8莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.05至5莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.05至4莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.05至3莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.05至2莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.05至1莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.05至0.5莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.05至0.1莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.1至10莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.1至8莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.1至5莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.1至4莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.1至3莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.1至2莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.1至1莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.1至0.5莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.5至10莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.5至8莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.5至5莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.5至4莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.5至3莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.5至2莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.5至1莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在1至10莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在1至8莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在1至5莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在1至4莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在1至3莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在1至2莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在2至10莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在2至8莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在2至5莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在2至4莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在2至3莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在3至10莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在3至8莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在3至5莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在3至4莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在4至10莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在4至8莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在4至5莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在5至10莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在5至8莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量在8至10莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量約0.01莫耳當量之量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量約0.05莫耳當量之量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量約0.1莫耳當量之量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量約0.5莫耳當量之量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量約1莫耳當量之量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量約2莫耳當量之量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量約3莫耳當量之量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量約4莫耳當量之量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量約5莫耳當量之量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量約8莫耳當量之量的疊氮基連接子反應。
在一個實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之多醣重複單元的量約10莫耳當量之量的疊氮基連接子反應。
在上述實施例中，該碳酸衍生物較佳為CDI。在另一實施例中，該碳酸衍生物為CDT。
在一個實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度在0.5%至50%之間。疊氮基醣之活化程度定義為與疊氮基連接子連接之重複單元的百分比。
在一個實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度在1%至30%之間。在另一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度在2%至25%之間。在另一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度在3%至20%之間。
在另一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度在3%至15%之間。在另一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度在4%至15%之間。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度在1%至6%之間。
在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度在3%至6%之間。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度在10%至15%之間。
在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約1%。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約2%。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約3%。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約4%。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約5%。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約6%。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約7%。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約8%。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約9%。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約10%。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約11%。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約12%。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約13%。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約14%。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約15%。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約16%。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約17%。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約18%。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約19%。在一實施例中，步驟a)之後經活化醣之活化程度為約20%。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸0.1至10莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸0.5至10莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸1至10莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸1.5至10莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸2至10莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸2.5至10莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸3至10莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸5至10莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸7.5至10莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸0.1至7.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸0.5至7.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸1至7.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸1.5至7.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸2至7.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸2.5至7.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸3至7.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸5至7.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸0.1至5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸0.5至5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸1至5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸1.5至5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸2至5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸2.5至5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸3至5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸0.1至3莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸0.5至3莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸1至3莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸1.5至3莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸2至3莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸2.5至3莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸0.1至2.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸0.5至2.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸1至2.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸1.5至2.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸2至2.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸0.1至2莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸0.5至2莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸1至2莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸1.5至2莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸0.1至1.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸0.5至1.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸1至1.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸0.1至1莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸0.5至1莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸0.1至0.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸約10莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸約7.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸約5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸約3莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸約2.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸約2莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸約1.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸約1莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸約0.5莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸約0.1莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
在一個實施例中，步驟b)之後經活化載體之活化程度在1至50之間。經活化載體之活化程度定義為載體蛋白中變得與帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑連接的離胺酸殘基之數目。
在一實施例中，載體蛋白為CRM
197，其含有39個離胺酸殘基。在該實施例中，步驟b)之後經活化載體之活化程度可在1至30之間。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度在5至20之間。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度在9至18之間。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度在8至11之間。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度在15至20之間。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約5。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約6。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約7。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約8。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約9。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約10。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約11。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約12。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約13。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約14。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約15。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約16。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約17。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約18。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約19。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約20。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約21。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約22。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約23。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約24。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(CRM
197)之活化程度為約25。
在一實施例中，載體蛋白為SCP或其片段。在該實施例中，步驟b)之後經活化載體之活化程度可在1至50之間。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度在5至50之間。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度在7至45之間。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度在5至15之間。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度在20至30之間。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度在30至50之間。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度在30至40之間。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度在10至40之間。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度為約5。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度為約7。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度為約10。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度為約13。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度為約15。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度為約20。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度為約26。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度為約30。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度為約35。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度為約37。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度為約40。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度為約45。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(SCP)之活化程度為約50。
在一實施例中，載體蛋白為TT或其片段。在該實施例中，步驟b)之後經活化載體之活化程度可在1至30之間。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(TT)之活化程度在5至25之間。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(TT)之活化程度在7至25之間。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(TT)之活化程度在10至20之間。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(TT)之活化程度為約5。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(TT)之活化程度為約7。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(TT)之活化程度為約10。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(TT)之活化程度為約12。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(TT)之活化程度為約15。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(TT)之活化程度為約20。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(TT)之活化程度為約25。在另一實施例中，步驟b)之後經活化載體(TT)之活化程度為約30。
在一實施例中，結合反應c)係在水性緩衝液中進行。在一實施例中，結合反應c)係在水性緩衝液中於作為催化劑之銅(I)存在下進行。在一實施例中，結合反應c)係在水性緩衝液中在氧化劑及作為催化劑之銅(I)存在下進行。在一較佳實施例中，結合反應c)係在水性緩衝液中於作為催化劑之銅(I)及作為氧化劑之抗壞血酸鹽存在下進行。在一實施例中，可進一步添加THPTA (參(3-羥丙基三唑基甲基)胺)及胺基胍以防止蛋白質發生副反應。因此，在一較佳實施例中，結合反應c)係在水性緩衝液中在作為催化劑之銅(I)及作為氧化劑之抗壞血酸鹽存在下進行，其中反應混合物進一步包含THPTA (參(3-羥丙基三唑基甲基)胺)及胺基胍。
在一實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)在0.1與3之間。在一實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)在0.5與2之間。在一實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)在0.6與1.5之間。在一較佳實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)在0.8與1之間。在一實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)為約0.5。在一實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)為約0.6。在一實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)為約0.7。在一實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)為約0.8。在一實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)為約0.9。在一實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)為約1。在一實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)為約1.1。在一實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)為約1.2。在一實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)為約1.3。在一實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)為約1.4。在一實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)為約1.5。在一實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)為約1.6。在一實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)為約1.7。在一實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)為約1.8。在一實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)為約1.9。在一實施例中，步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)為約2。
在單擊結合反應之後，結合物中可能保留有未反應疊氮基，可使用適合的疊氮基封端劑對此等未反應疊氮基進行封端。因此，在一實施例中，在步驟c)之後，使用適合的疊氮基封端劑對結合物中之未反應疊氮基進行封端。在一個實施例中，此疊氮基封端劑為帶有炔烴基之試劑。在一個實施例中，此疊氮基封端劑為帶有末端炔烴之試劑。在一個實施例中，此疊氮基封端劑為帶有環炔烴之試劑。
在一實施例中，該疊氮基封端劑為式(V)化合物，
其中X為(CH
2)
n，其中n係選自1至15。
在一個實施例中，此疊氮基封端劑為炔丙醇。
因此，在一實施例中，在步驟c)之後，該方法進一步包含用疊氮基封端劑對結合物中保留之未反應疊氮基進行封端的步驟。
在一實施例中，未反應疊氮基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.05至20莫耳當量之間的量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應疊氮基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.1至15莫耳當量之間的量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應疊氮基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.5至10莫耳當量之間的量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應疊氮基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.5至5莫耳當量之間的量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應疊氮基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.5至2莫耳當量之間的量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應疊氮基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.5至1莫耳當量之間的量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應疊氮基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量在1至2莫耳當量之間的量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應疊氮基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.75至1.5莫耳當量之間的量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應疊氮基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量約1莫耳當量之量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應疊氮基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量約1.5莫耳當量之量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應疊氮基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量約0.5莫耳當量之量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應疊氮基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量約2莫耳當量之量的封端劑進行。
在單擊結合反應之後，未反應之炔烴基可仍存在於結合物中，可使用適合的炔烴基封端劑對此等未反應之炔烴基進行封端。在一個實施例中，此炔烴基封端劑為帶有疊氮基之試劑。
在一實施例中，該炔烴基封端劑為式(VI)化合物，
其中X為(CH
2)
n，其中n係選自1至15。
在一個實施例中，此炔烴基封端劑為3-疊氮基-1-丙醇。
因此，在一實施例中，在步驟c)之後，該方法進一步包含用炔烴基封端劑對結合物中保留之未反應炔烴基進行封端的步驟。
在一實施例中，未反應炔烴基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.05至20莫耳當量之間的量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應炔烴基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.1至15莫耳當量之間的量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應炔烴基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.5至10莫耳當量之間的量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應炔烴基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.5至5莫耳當量之間的量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應炔烴基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.5至2莫耳當量之間的量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應炔烴基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量在0.5至1莫耳當量之間的量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應炔烴基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量在1至5莫耳當量之間的量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應炔烴基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量在1至2莫耳當量之間的量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應炔烴基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量在1.5至2.5莫耳當量之間的量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應炔烴基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量約0.5莫耳當量之量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應炔烴基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量約1莫耳當量之量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應炔烴基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量約1.5莫耳當量之量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應炔烴基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量約2莫耳當量之量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應炔烴基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量約2.5莫耳當量之量的封端劑進行。
在一實施例中，未反應炔烴基之封端係用相對於經活化醣之多醣重複單元的量約5莫耳當量之量的封端劑進行。
在與載體蛋白結合之後，可藉由技術人員已知之多種技術來純化(就醣-蛋白結合物之量而言富集)醣結合物。此等技術包括透析、濃縮/透濾操作、切向流過濾沈澱/溶離、管柱層析(DEAE或疏水性相互作用層析)及深層過濾。因此，在一個實施例中，用於產生本發明之醣結合物的方法包含在產生醣結合物之後對其進行純化的步驟。
在一態樣中，本發明提供一種根據本文所揭示之方法中之任一者產生的醣結合物。
在一態樣中，本發明提供一種莢膜醣醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之莢膜醣且具有通式(VII)：
，
其中X係選自由以下組成之群：CH
2(CH
2)
n'、(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、NHCO(CH
2)
n'、NHCO(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、OCH
2(CH
2)
n'及O(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2；其中n'係選自1至10且m係選自1至4，
且其中X'係選自由以下組成之群：CH
2O(CH
2)
n''CH
2C=O、CH
2O(CH
2CH
2O)
m'(CH
2)
n''CH
2C=O，其中n''係選自0至10且m'係選自0至4。其中方括號中之結構表示莢膜醣之重複單元。
在一實施例中，莢膜醣不為來自肺炎鏈球菌血清型3之莢膜醣。
式(VII)為本發明之醣結合物之示意性表示。不應理解為醣之每一重複單元(方括號中之結構)處均存在連接。實情為，大部分醣重複單元保持未經修飾，且少數醣重複單元處存在載體蛋白與醣之共價連接。另外，個別載體蛋白(CP)分子可連接至多於一個醣分子，且個體醣分子可連接至多於一個個別載體蛋白(CP)分子。方括號中之結構表示莢膜醣之重複單元。
在一較佳實施例中，本發明提供一種醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之醣且具有通式(VII)，其中X為CH
2(CH
2)
n'，其中n'為2，且其中X'為CH
2O(CH
2)
n''CH
2C=O，其中n''為1。在一實施例中，醣不為來自肺炎鏈球菌血清型3之莢膜醣。
因此，在一較佳實施例中，本發明提供一種莢膜醣醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之莢膜醣且具有通式(VIII)，
。
其中方括號中之結構表示莢膜醣之重複單元。
式(VIII)為本發明之較佳醣結合物之示意性表示。不應理解為醣之每一重複單元(方括號中之結構)處均存在連接。實情為，大部分醣重複單元保持未經修飾，且少數醣重複單元處存在載體蛋白與醣之共價連接。另外，個別載體蛋白(CP)分子可連接至多於一個醣分子，且個體醣分子可連接至多於一個個別載體蛋白(CP)分子。方括號中之結構為醣之重複單元的示意性表示。
在一實施例中，醣不為來自肺炎鏈球菌血清型3之莢膜醣。
在一實施例中，本發明提供一種醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之醣且具有通式(VII)，其中X為CH
2(CH
2)
n'，其中n'係選自1至10，且其中X'為CH
2O(CH
2)
n''CH
2C=O，其中n''係選自0至10。在一實施例中，n'係選自1至5且n''係選自0至10。在一實施例中，n'係選自1至5且n''係選自0至5。在一實施例中，n'係選自1至3且n''係選自0至3。在一實施例中，n'係選自1至2且n''係選自0至2。在一特定實施例中，n'為1且n''為0。在另一實施例中，n'為2且n''為0。在又另一實施例中，n'為3且n''為0。在又另一實施例中，n'為4且n"為0。在又另一實施例中，n'為5且n"為0。在又另一實施例中，n'為6且n"為0。在一特定實施例中，n'為1且n''為1。在另一實施例中，n'為2且n''為1。在又另一實施例中，n'為3且n''為1。在又另一實施例中，n'為4且n"為1。在又另一實施例中，n'為5且n"為1。在又另一實施例中，n'為6且n"為1。在一特定實施例中，n'為1且n''為2。在另一實施例中，n'為2且n''為2。在又另一實施例中，n'為3且n''為2。在又另一實施例中，n'為4且n"為2。在又另一實施例中，n'為5且n"為2。在又另一實施例中，n'為6且n"為2。在一特定實施例中，n'為1且n''為3。在另一實施例中，n'為2且n''為3。在又另一實施例中，n'為3且n''為3。在又另一實施例中，n'為4且n"為3。在又另一實施例中，n'為5且n"為3。在又另一實施例中，n'為6且n"為3。在一特定實施例中，n'為1且n''為4。在另一實施例中，n'為2且n''為4。在又另一實施例中，n'為3且n''為4。在又另一實施例中，n'為4且n"為4。在又另一實施例中，n'為5且n"為4。在又另一實施例中，n'為6且n"為4。在一特定實施例中，n'為1且n''為5。在另一實施例中，n'為2且n''為5。在又另一實施例中，n'為3且n''為5。在又另一實施例中，n'為4且n"為5。在又另一實施例中，n'為5且n"為5。在又另一實施例中，n'為6且n"為5。在一特定實施例中，n'為1且n''為6。在另一實施例中，n'為2且n''為6。在又另一實施例中，n'為3且n''為6。在又另一實施例中，n'為4且n"為6。在又另一實施例中，n'為5且n"為6。在又另一實施例中，n'為6且n"為6。較佳地，醣不為來自肺炎鏈球菌血清型3之莢膜醣。
在一實施例中，本發明提供一種醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之醣且具有通式(VII)，其中X為CH
2(CH
2)
n'，其中n'係選自1至10，且其中CH
2O(CH
2CH
2O)
m'(CH
2)
n''CH
2C=O，其中n''係選自0至10且m'係選自0至4。
在一實施例中，n'係選自1至5，m'係選自0至4，且n''係選自0至10。在一實施例中，n'係選自1至5，m'係選自0至4，且n''係選自0至5。在一實施例中，n'係選自1至3，m'係選自0至2，且n''係選自0至3。在一實施例中，n'係選自1至2，m'係選自0至2，且n''係選自0至1。
在一特定實施例中，n'為1，m'為0，且n''為0。在另一實施例中，n'為1，m'為1，且n''為0。在另一實施例中，n'為1，m'為2，且n''為0。在另一實施例中，n'為1，m'為3，且n''為0。
在另一實施例中，n'為2，m'為0，且n''為0。在另一實施例中，n'為2，m'為1，且n''為0。在另一實施例中，n'為2，m'為2，且n''為0。在另一實施例中，n'為2，m'為3，且n''為0。
在又另一實施例中，n'為3，m'為0，且n''為0。在又另一實施例中，n'為3，m'為1，且n''為0。在又另一實施例中，n'為3，m'為2，且n''為0。在又另一實施例中，n'為3，m'為3，且n''為0。
在又另一實施例中，n'為4，m'為0，且n"為0。在又另一實施例中，n'為4，m'為1，且n"為0。在又另一實施例中，n'為4，m'為2，且n"為0。在又另一實施例中，n'為4，m'為3，且n"為0。
在又另一實施例中，n'為5，m'為0，且n"為0。在又另一實施例中，n'為5，m'為1，且n"為0。在又另一實施例中，n'為5，m'為2，且n"為0。在又另一實施例中，n'為5，m'為3，且n"為0。
在一特定實施例中，n'為1，m'為0，且n''為1。在一特定實施例中，n'為1，m'為1，且n''為1。在一特定實施例中，n'為1，m'為2，且n''為1。在一特定實施例中，n'為1，m'為3，且n''為1。
在另一實施例中，n'為2，m'為0，且n''為1。在另一實施例中，n'為2，m'為1，且n''為1。在另一實施例中，n'為2，m'為2，且n''為1。在另一實施例中，n'為2，m'為3，且n''為1。
在又另一實施例中，n'為3，m'為0，且n''為1。在又另一實施例中，n'為3，m'為1，且n''為1。在又另一實施例中，n'為3，m'為2，且n''為1。在又另一實施例中，n'為3，m'為3，且n''為1。
在又另一實施例中，n'為4，m'為0，且n"為1。在又另一實施例中，n'為4，m'為1，且n"為1。在又另一實施例中，n'為4，m'為2，且n"為1。在又另一實施例中，n'為4，m'為3，且n"為1。
在又另一實施例中，n'為5，m'為0，且n"為1。在又另一實施例中，n'為5，m'為1，且n"為1。在又另一實施例中，n'為5，m'為2，且n"為1。在又另一實施例中，n'為5，m'為3，且n"為1。
在一特定實施例中，n'為1，m'為0，且n''為2。在一特定實施例中，n'為1，m'為1，且n''為2。在一特定實施例中，n'為1，m'為2，且n''為2。在一特定實施例中，n'為1，m'為3，且n''為2。
在另一實施例中，n'為2，m'為0，且n''為2。在另一實施例中，n'為2，m'為1，且n''為2。在另一實施例中，n'為2，m'為2，且n''為2。在另一實施例中，n'為2，m'為3，且n''為2。
在又另一實施例中，n'為3，m'為0，且n''為2。在又另一實施例中，n'為3，m'為1，且n''為2。在又另一實施例中，n'為3，m'為2，且n''為2。在又另一實施例中，n'為3，m'為3，且n''為2。
在又另一實施例中，n'為4，m'為0，且n"為2。在又另一實施例中，n'為4，m'為1，且n"為2。在又另一實施例中，n'為4，m'為2，且n"為2。在又另一實施例中，n'為4，m'為3，且n"為2。
在又另一實施例中，n'為5，m'為0，且n"為2。在又另一實施例中，n'為5，m'為1，且n"為2。在又另一實施例中，n'為5，m'為2，且n"為2。在又另一實施例中，n'為5，m'為3，且n"為2。
在一特定實施例中，n'為1，m'為0，且n''為3。在一特定實施例中，n'為1，m'為1，且n''為3。在一特定實施例中，n'為1，m'為2，且n''為3。在一特定實施例中，n'為1，m'為3，且n''為3。
在另一實施例中，n'為2，m'為0，且n''為3。在另一實施例中，n'為2，m'為1，且n''為3。在另一實施例中，n'為2，m'為2，且n''為3。在另一實施例中，n'為2，m'為3，且n''為3。
在又另一實施例中，n'為3，m'為0，且n''為3。在又另一實施例中，n'為3，m'為1，且n''為3。在又另一實施例中，n'為3，m'為2，且n''為3。在又另一實施例中，n'為3，m'為3，且n''為3。
在又另一實施例中，n'為4，m'為0，且n"為3。在又另一實施例中，n'為4，m'為1，且n"為3。在又另一實施例中，n'為4，m'為2，且n"為3。在又另一實施例中，n'為4，m'為3，且n"為3。
在又另一實施例中，n'為5，m'為0，且n"為3。在又另一實施例中，n'為5，m'為1，且n"為3。在又另一實施例中，n'為5，m'為2，且n"為3。在又另一實施例中，n'為5，m'為3，且n"為3。
在一特定實施例中，n'為1，m'為0，且n''為4。在一特定實施例中，n'為1，m'為1，且n''為4。在一特定實施例中，n'為1，m'為2，且n''為4。在一特定實施例中，n'為1，m'為3，且n''為4。
在另一實施例中，n'為2，m'為0，且n''為4。在另一實施例中，n'為2，m'為1，且n''為4。在另一實施例中，n'為2，m'為2，且n''為4。在另一實施例中，n'為2，m'為3，且n''為4。
在又另一實施例中，n'為3，m'為0，且n''為4。在又另一實施例中，n'為3，m'為1，且n''為4。在又另一實施例中，n'為3，m'為2，且n''為4。在又另一實施例中，n'為3，m'為3，且n''為4。
在又另一實施例中，n'為4，m'為0，且n"為4。在又另一實施例中，n'為4，m'為1，且n"為4。在又另一實施例中，n'為4，m'為2，且n"為4。在又另一實施例中，n'為4，m'為3，且n"為4。
在又另一實施例中，n'為5，m'為0，且n"為4。在又另一實施例中，n'為5，m'為1，且n"為4。在又另一實施例中，n'為5，m'為2，且n"為4。在又另一實施例中，n'為5，m'為3，且n"為4。
在一特定實施例中，n'為1，m'為0，且n''為5。在一特定實施例中，n'為1，m'為1，且n''為5。在一特定實施例中，n'為1，m'為2，且n''為5。在一特定實施例中，n'為1，m'為3，且n''為5。
在另一實施例中，n'為2，m'為0，且n''為5。在另一實施例中，n'為2，m'為1，且n''為5。在另一實施例中，n'為2，m'為2，且n''為5。在另一實施例中，n'為2，m'為3，且n''為5。
在又另一實施例中，n'為3，m'為0，且n''為5。在又另一實施例中，n'為3，m'為1，且n''為5。在又另一實施例中，n'為3，m'為2，且n''為5。在又另一實施例中，n'為3，m'為3，且n''為5。
在又另一實施例中，n'為4，m'為0，且n"為5。在又另一實施例中，n'為4，m'為1，且n"為5。在又另一實施例中，n'為4，m'為2，且n"為5。在又另一實施例中，n'為4，m'為3，且n"為5。
在又另一實施例中，n'為5，m'為0，且n"為5。在又另一實施例中，n'為5，m'為1，且n"為5。在又另一實施例中，n'為5，m'為2，且n"為5。在又另一實施例中，n'為5，m'為3，且n"為5。
較佳地，醣不為來自肺炎鏈球菌血清型3之莢膜醣。
在一實施例中，本發明提供一種醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之醣且具有通式(VII)，其中X為(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2，其中m係選自1至4，且其中X'為CH
2O(CH
2)
n''CH
2C=O，其中n''係選自0至10。在一實施例中，m係選自1至3，且n''係選自0至10。在一實施例中，m係選自1至3，且n''係選自0至5。在一實施例中，m係選自1至2，且n''係選自0至3。在一實施例中，m係選自1至2，且n''係選自0至2。在一特定實施例中，m為1，且n''為0。在另一實施例中，m為2，且n''為0。在又另一實施例中，m為3，且n''為0。在又另一實施例中，m為4，且n"為0。在一特定實施例中，m為1，且n''為1。在另一實施例中，m為2，且n''為1。在又另一實施例中，m為3，且n''為1。在又另一實施例中，m為4，且n"為1。在一特定實施例中，m為1，且n''為2。在另一實施例中，m為2，且n''為2。在又另一實施例中，m為3，且n''為2。在又另一實施例中，m為4，且n"為2。在一特定實施例中，m為1，且n''為3。在另一實施例中，m為2，且n''為3。在又另一實施例中，m為3，且n''為3。在又另一實施例中，m為4，且n"為3。在一特定實施例中，m為1，且n''為4。在另一實施例中，m為2，且n''為4。在又另一實施例中，m為3，且n''為4。在又另一實施例中，m為4，且n"為4。在一特定實施例中，m為1，且n''為5。在另一實施例中，m為2，且n''為5。在又另一實施例中，m為3，且n''為5。在又另一實施例中，m為4，且n"為5。在一特定實施例中，m為1，且n''為6。在另一實施例中，m為2，且n''為6。在又另一實施例中，m為3，且n''為6。在又另一實施例中，m為4，且n"為6。較佳地，醣不為來自肺炎鏈球菌血清型3之莢膜醣。
在一實施例中，本發明提供一種醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之醣且具有通式(VII)，其中X為(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2，其中m係選自1至4，且其中X'為CH
2O(CH
2CH
2O)
m'(CH
2)
n''CH
2C=O，其中n''係選自0至10且m'係選自0至4。
在一實施例中，m係選自1至3，m'係選自0至4，且n''係選自0至10。在一實施例中，m係選自1至2，m'係選自0至4，且n''係選自0至5。在一實施例中，m係選自1至2，m'係選自0至2，且n''係選自0至3。在一實施例中，m係選自1至2，m'係選自0至2，且n''係選自0至1。
在一特定實施例中，m為1，m'為0，且n''為0。在另一實施例中，m為1，m'為1，且n''為0。在另一實施例中，m為1，m'為2，且n''為0。在另一實施例中，m為1，m'為3，且n''為0。
在另一實施例中，m為2，m'為0，且n''為0。在另一實施例中，m為2，m'為1，且n''為0。在另一實施例中，m為2，m'為2，且n''為0。在另一實施例中，m為2，m'為3，且n''為0。
在又另一實施例中，m為3，m'為0，且n''為0。在又另一實施例中，m為3，m'為1，且n''為0。在又另一實施例中，m為3，m'為2，且n''為0。在又另一實施例中，m為3，m'為3，且n''為0。
在又另一實施例中，m為4，m'為0，且n"為0。在又另一實施例中，m為4，m'為1，且n"為0。在又另一實施例中，m為4，m'為2，且n"為0。在又另一實施例中，m為4，m'為3，且n"為0。
在一特定實施例中，m為1，m'為0，且n''為1。在一特定實施例中，m為1，m'為1，且n''為1。在一特定實施例中，m為1，m'為2，且n''為1。在一特定實施例中，m為1，m'為3，且n''為1。
在另一實施例中，m為2，m'為0，且n''為1。在另一實施例中，m為2，m'為1，且n''為1。在另一實施例中，m為2，m'為2，且n''為1。在另一實施例中，m為2，m'為3，且n''為1。
在又另一實施例中，m為3，m'為0，且n''為1。在又另一實施例中，m為3，m'為1，且n''為1。在又另一實施例中，m為3，m'為2，且n''為1。在又另一實施例中，m為3，m'為3，且n''為1。
在又另一實施例中，m為4，m'為0，且n"為1。在又另一實施例中，m為4，m'為1，且n"為1。在又另一實施例中，m為4，m'為2，且n"為1。在又另一實施例中，m為4，m'為3，且n"為1。
在一特定實施例中，m為1，m'為0，且n''為2。在一特定實施例中，m為1，m'為1，且n''為2。在一特定實施例中，m為1，m'為2，且n''為2。在一特定實施例中，m為1，m'為3，且n''為2。
在另一實施例中，m為2，m'為0，且n''為2。在另一實施例中，m為2，m'為1，且n''為2。在另一實施例中，m為2，m'為2，且n''為2。在另一實施例中，m為2，m'為3，且n''為2。
在又另一實施例中，m為3，m'為0，且n''為2。在又另一實施例中，m為3，m'為1，且n''為2。在又另一實施例中，m為3，m'為2，且n''為2。在又另一實施例中，m為3，m'為3，且n''為2。
在又另一實施例中，m為4，m'為0，且n"為2。在又另一實施例中，m為4，m'為1，且n"為2。在又另一實施例中，m為4，m'為2，且n"為2。在又另一實施例中，m為4，m'為3，且n"為2。
在一特定實施例中，m為1，m'為0，且n''為3。在一特定實施例中，m為1，m'為1，且n''為3。在一特定實施例中，m為1，m'為2，且n''為3。在一特定實施例中，m為1，m'為3，且n''為3。
在另一實施例中，m為2，m'為0，且n''為3。在另一實施例中，m為2，m'為1，且n''為3。在另一實施例中，m為2，m'為2，且n''為3。在另一實施例中，m為2，m'為3，且n''為3。
在又另一實施例中，m為3，m'為0，且n''為3。在又另一實施例中，m為3，m'為1，且n''為3。在又另一實施例中，m為3，m'為2，且n''為3。在又另一實施例中，m為3，m'為3，且n''為3。
在又另一實施例中，m為4，m'為0，且n"為3。在又另一實施例中，m為4，m'為1，且n"為3。在又另一實施例中，m為4，m'為2，且n"為3。在又另一實施例中，m為4，m'為3，且n"為3。
在一特定實施例中，m為1，m'為0，且n''為4。在一特定實施例中，m為1，m'為1，且n''為4。在一特定實施例中，m為1，m'為2，且n''為4。在一特定實施例中，m為1，m'為3，且n''為4。
在另一實施例中，m為2，m'為0，且n''為4。在另一實施例中，m為2，m'為1，且n''為4。在另一實施例中，m為2，m'為2，且n''為4。在另一實施例中，m為2，m'為3，且n''為4。
在又另一實施例中，m為3，m'為0，且n''為4。在又另一實施例中，m為3，m'為1，且n''為4。在又另一實施例中，m為3，m'為2，且n''為4。在又另一實施例中，m為3，m'為3，且n''為4。
在又另一實施例中，m為4，m'為0，且n"為4。在又另一實施例中，m為4，m'為1，且n"為4。在又另一實施例中，m為4，m'為2，且n"為4。在又另一實施例中，m為4，m'為3，且n"為4。
在一特定實施例中，m為1，m'為0，且n''為5。在一特定實施例中，m為1，m'為1，且n''為5。在一特定實施例中，m為1，m'為2，且n''為5。在一特定實施例中，m為1，m'為3，且n''為5。
在另一實施例中，m為2，m'為0，且n''為5。在另一實施例中，m為2，m'為1，且n''為5。在另一實施例中，m為2，m'為2，且n''為5。在另一實施例中，m為2，m'為3，且n''為5。
在又另一實施例中，m為3，m'為0，且n''為5。在又另一實施例中，m為3，m'為1，且n''為5。在又另一實施例中，m為3，m'為2，且n''為5。在又另一實施例中，m為3，m'為3，且n''為5。
在又另一實施例中，m為4，m'為0，且n"為5。在又另一實施例中，m為4，m'為1，且n"為5。在又另一實施例中，m為4，m'為2，且n"為5。在又另一實施例中，m為4，m'為3，且n"為5。
較佳地，醣不為來自肺炎鏈球菌血清型3之莢膜醣。
在一實施例中，本發明提供一種醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之醣且具有通式(VII)，其中X為NHCO(CH
2)
n'，其中n'係選自1至10，且其中X'為CH
2O(CH
2)
n''CH
2C=O，其中n''係選自0至10。在一實施例中，n'係選自1至5，且n''係選自0至10。在一實施例中，n'係選自1至5，且n''係選自0至5。在一實施例中，n'係選自1至3，且n''係選自0至3。在一實施例中，n'係選自1至2，且n''係選自0至2。在一特定實施例中，n'為1，且n''為0。在另一實施例中，n'為2，且n''為0。在又另一實施例中，n'為3，且n''為0。在又另一實施例中，n'為4，且n"為0。在又另一實施例中，n'為5，且n"為0。在又另一實施例中，n'為6，且n"為0。在一特定實施例中，n'為1，且n''為1。在另一實施例中，n'為2，且n''為1。在又另一實施例中，n'為3，且n''為1。在又另一實施例中，n'為4，且n"為1。在又另一實施例中，n'為5，且n"為1。在又另一實施例中，n'為6，且n"為1。在一特定實施例中，n'為1，且n''為2。在另一實施例中，n'為2，且n''為2。在又另一實施例中，n'為3，且n''為2。在又另一實施例中，n'為4，且n"為2。在又另一實施例中，n'為5，且n"為2。在又另一實施例中，n'為6，且n"為2。在一特定實施例中，n'為1，且n''為3。在另一實施例中，n'為2，且n''為3。在又另一實施例中，n'為3，且n''為3。在又另一實施例中，n'為4，且n"為3。在又另一實施例中，n'為5，且n"為3。在又另一實施例中，n'為6，且n"為3。在一特定實施例中，n'為1，且n''為4。在另一實施例中，n'為2，且n''為4。在又另一實施例中，n'為3，且n''為4。在又另一實施例中，n'為4，且n"為4。在又另一實施例中，n'為5，且n"為4。在又另一實施例中，n'為6，且n"為4。在一特定實施例中，n'為1，且n''為5。在另一實施例中，n'為2，且n''為5。在又另一實施例中，n'為3，且n''為5。在又另一實施例中，n'為4，且n"為5。在又另一實施例中，n'為5，且n"為5。在又另一實施例中，n'為6，且n"為5。在一特定實施例中，n'為1，且n''為6。在另一實施例中，n'為2，且n''為6。在又另一實施例中，n'為3，且n''為6。在又另一實施例中，n'為4，且n"為6。在又另一實施例中，n'為5，且n"為6。在又另一實施例中，n'為6，且n"為6。較佳地，醣不為來自肺炎鏈球菌血清型3之莢膜醣。
在一實施例中，本發明提供一種醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之醣且具有通式(VII)，其中X為NHCO(CH
2)
n'，其中n'係選自1至10，且其中X'為CH
2O(CH
2CH
2O)
m'(CH
2)
n''CH
2C=O，其中n''係選自0至10且m'係選自0至4。
在一實施例中，n'係選自1至5，m'係選自0至4，且n''係選自0至10。在一實施例中，n'係選自1至5，m'係選自0至4，且n''係選自0至5。在一實施例中，n'係選自1至3，m'係選自0至2，且n''係選自0至3。在一實施例中，n'係選自1至2，m'係選自0至2，且n''係選自0至1。
在一特定實施例中，n'為1，m'為0，且n''為0。在另一實施例中，n'為1，m'為1，且n''為0。在另一實施例中，n'為1，m'為2，且n''為0。在另一實施例中，n'為1，m'為3，且n''為0。
在另一實施例中，n'為2，m'為0，且n''為0。在另一實施例中，n'為2，m'為1，且n''為0。在另一實施例中，n'為2，m'為2，且n''為0。在另一實施例中，n'為2，m'為3，且n''為0。
在又另一實施例中，n'為3，m'為0，且n''為0。在又另一實施例中，n'為3，m'為1，且n''為0。在又另一實施例中，n'為3，m'為2，且n''為0。在又另一實施例中，n'為3，m'為3，且n''為0。
在又另一實施例中，n'為4，m'為0，且n"為0。在又另一實施例中，n'為4，m'為1，且n"為0。在又另一實施例中，n'為4，m'為2，且n"為0。在又另一實施例中，n'為4，m'為3，且n"為0。
在又另一實施例中，n'為5，m'為0，且n"為0。在又另一實施例中，n'為5，m'為1，且n"為0。在又另一實施例中，n'為5，m'為2，且n"為0。在又另一實施例中，n'為5，m'為3，且n"為0。
在一特定實施例中，n'為1，m'為0，且n''為1。在一特定實施例中，n'為1，m'為1，且n''為1。在一特定實施例中，n'為1，m'為2，且n''為1。在一特定實施例中，n'為1，m'為3，且n''為1。
在另一實施例中，n'為2，m'為0，且n''為1。在另一實施例中，n'為2，m'為1，且n''為1。在另一實施例中，n'為2，m'為2，且n''為1。在另一實施例中，n'為2，m'為3，且n''為1。
在又另一實施例中，n'為3，m'為0，且n''為1。在又另一實施例中，n'為3，m'為1，且n''為1。在又另一實施例中，n'為3，m'為2，且n''為1。在又另一實施例中，n'為3，m'為3，且n''為1。
在又另一實施例中，n'為4，m'為0，且n"為1。在又另一實施例中，n'為4，m'為1，且n"為1。在又另一實施例中，n'為4，m'為2，且n"為1。在又另一實施例中，n'為4，m'為3，且n"為1。
在又另一實施例中，n'為5，m'為0，且n"為1。在又另一實施例中，n'為5，m'為1，且n"為1。在又另一實施例中，n'為5，m'為2，且n"為1。在又另一實施例中，n'為5，m'為3，且n"為1。
在一特定實施例中，n'為1，m'為0，且n''為2。在一特定實施例中，n'為1，m'為1，且n''為2。在一特定實施例中，n'為1，m'為2，且n''為2。在一特定實施例中，n'為1，m'為3，且n''為2。
在另一實施例中，n'為2，m'為0，且n''為2。在另一實施例中，n'為2，m'為1，且n''為2。在另一實施例中，n'為2，m'為2，且n''為2。在另一實施例中，n'為2，m'為3，且n''為2。
在又另一實施例中，n'為3，m'為0，且n''為2。在又另一實施例中，n'為3，m'為1，且n''為2。在又另一實施例中，n'為3，m'為2，且n''為2。在又另一實施例中，n'為3，m'為3，且n''為2。
在又另一實施例中，n'為4，m'為0，且n"為2。在又另一實施例中，n'為4，m'為1，且n"為2。在又另一實施例中，n'為4，m'為2，且n"為2。在又另一實施例中，n'為4，m'為3，且n"為2。
在又另一實施例中，n'為5，m'為0，且n"為2。在又另一實施例中，n'為5，m'為1，且n"為2。在又另一實施例中，n'為5，m'為2，且n"為2。在又另一實施例中，n'為5，m'為3，且n"為2。
在一特定實施例中，n'為1，m'為0，且n''為3。在一特定實施例中，n'為1，m'為1，且n''為3。在一特定實施例中，n'為1，m'為2，且n''為3。在一特定實施例中，n'為1，m'為3，且n''為3。
在另一實施例中，n'為2，m'為0，且n''為3。在另一實施例中，n'為2，m'為1，且n''為3。在另一實施例中，n'為2，m'為2，且n''為3。在另一實施例中，n'為2，m'為3，且n''為3。
在又另一實施例中，n'為3，m'為0，且n''為3。在又另一實施例中，n'為3，m'為1，且n''為3。在又另一實施例中，n'為3，m'為2，且n''為3。在又另一實施例中，n'為3，m'為3，且n''為3。
在又另一實施例中，n'為4，m'為0，且n"為3。在又另一實施例中，n'為4，m'為1，且n"為3。在又另一實施例中，n'為4，m'為2，且n"為3。在又另一實施例中，n'為4，m'為3，且n"為3。
在又另一實施例中，n'為5，m'為0，且n"為3。在又另一實施例中，n'為5，m'為1，且n"為3。在又另一實施例中，n'為5，m'為2，且n"為3。在又另一實施例中，n'為5，m'為3，且n"為3。
在一特定實施例中，n'為1，m'為0，且n''為4。在一特定實施例中，n'為1，m'為1，且n''為4。在一特定實施例中，n'為1，m'為2，且n''為4。在一特定實施例中，n'為1，m'為3，且n''為4。
在另一實施例中，n'為2，m'為0，且n''為4。在另一實施例中，n'為2，m'為1，且n''為4。在另一實施例中，n'為2，m'為2，且n''為4。在另一實施例中，n'為2，m'為3，且n''為4。
在又另一實施例中，n'為3，m'為0，且n''為4。在又另一實施例中，n'為3，m'為1，且n''為4。在又另一實施例中，n'為3，m'為2，且n''為4。在又另一實施例中，n'為3，m'為3，且n''為4。
在又另一實施例中，n'為4，m'為0，且n"為4。在又另一實施例中，n'為4，m'為1，且n"為4。在又另一實施例中，n'為4，m'為2，且n"為4。在又另一實施例中，n'為4，m'為3，且n"為4。
在又另一實施例中，n'為5，m'為0，且n"為4。在又另一實施例中，n'為5，m'為1，且n"為4。在又另一實施例中，n'為5，m'為2，且n"為4。在又另一實施例中，n'為5，m'為3，且n"為4。
在一特定實施例中，n'為1，m'為0，且n''為5。在一特定實施例中，n'為1，m'為1，且n''為5。在一特定實施例中，n'為1，m'為2，且n''為5。在一特定實施例中，n'為1，m'為3，且n''為5。
在另一實施例中，n'為2，m'為0，且n''為5。在另一實施例中，n'為2，m'為1，且n''為5。在另一實施例中，n'為2，m'為2，且n''為5。在另一實施例中，n'為2，m'為3，且n''為5。
在又另一實施例中，n'為3，m'為0，且n''為5。在又另一實施例中，n'為3，m'為1，且n''為5。在又另一實施例中，n'為3，m'為2，且n''為5。在又另一實施例中，n'為3，m'為3，且n''為5。
在又另一實施例中，n'為4，m'為0，且n"為5。在又另一實施例中，n'為4，m'為1，且n"為5。在又另一實施例中，n'為4，m'為2，且n"為5。在又另一實施例中，n'為4，m'為3，且n"為5。
在又另一實施例中，n'為5，m'為0，且n"為5。在又另一實施例中，n'為5，m'為1，且n"為5。在又另一實施例中，n'為5，m'為2，且n"為5。在又另一實施例中，n'為5，m'為3，且n"為5。
較佳地，醣不為來自肺炎鏈球菌血清型3之莢膜醣。
在一實施例中，本發明提供一種醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之醣且具有通式(VII)，其中X為NHCO(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2，其中m係選自1至4，且其中X'為CH
2O(CH
2)
n''CH
2C=O，其中n''係選自0至10。在一實施例中，m係選自1至3，且n''係選自0至10。在一實施例中，m係選自1至3，且n''係選自0至5。在一實施例中，m係選自1至2，且n''係選自0至3。在一實施例中，m係選自1至2，且n''係選自0至2。在一特定實施例中，m為1，且n''為0。在另一實施例中，m為2，且n''為0。在又另一實施例中，m為3，且n''為0。在又另一實施例中，m為4，且n"為0。在一特定實施例中，m為1，且n''為1。在另一實施例中，m為2，且n''為1。在又另一實施例中，m為3，且n''為1。在又另一實施例中，m為4，且n"為1。在一特定實施例中，m為1，且n''為2。在另一實施例中，m為2，且n''為2。在又另一實施例中，m為3，且n''為2。在又另一實施例中，m為4，且n"為2。在一特定實施例中，m為1，且n''為3。在另一實施例中，m為2，且n''為3。在又另一實施例中，m為3，且n''為3。在又另一實施例中，m為4，且n"為3。在一特定實施例中，m為1，且n''為4。在另一實施例中，m為2，且n''為4。在又另一實施例中，m為3，且n''為4。在又另一實施例中，m為4，且n"為4。在一特定實施例中，m為1，且n''為5。在另一實施例中，m為2，且n''為5。在又另一實施例中，m為3，且n''為5。在又另一實施例中，m為4，且n"為5。在一特定實施例中，m為1，且n''為6。在另一實施例中，m為2，且n''為6。在又另一實施例中，m為3，且n''為6。在又另一實施例中，m為4，且n"為6。較佳地，醣不為來自肺炎鏈球菌血清型3之莢膜醣。
在一實施例中，本發明提供一種醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之醣且具有通式(VII)，其中X為NHCO(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2，其中m係選自1至4，且其中X'為CH
2O(CH
2CH
2O)
m'(CH
2)
n''CH
2C=O，其中n''係選自0至10且m'係選自0至4。
在一實施例中，m係選自1至3，m'係選自0至4，且n''係選自0至10。在一實施例中，m係選自1至2，m'係選自0至4，且n''係選自0至5。在一實施例中，m係選自1至2，m'係選自0至2，且n''係選自0至3。在一實施例中，m係選自1至2，m'係選自0至2，且n''係選自0至1。
在一特定實施例中，m為1，m'為0，且n''為0。在另一實施例中，m為1，m'為1，且n''為0。在另一實施例中，m為1，m'為2，且n''為0。在另一實施例中，m為1，m'為3，且n''為0。
在另一實施例中，m為2，m'為0，且n''為0。在另一實施例中，m為2，m'為1，且n''為0。在另一實施例中，m為2，m'為2，且n''為0。在另一實施例中，m為2，m'為3，且n''為0。
在又另一實施例中，m為3，m'為0，且n''為0。在又另一實施例中，m為3，m'為1，且n''為0。在又另一實施例中，m為3，m'為2，且n''為0。在又另一實施例中，m為3，m'為3，且n''為0。
在又另一實施例中，m為4，m'為0，且n"為0。在又另一實施例中，m為4，m'為1，且n"為0。在又另一實施例中，m為4，m'為2，且n"為0。在又另一實施例中，m為4，m'為3，且n"為0。
在一特定實施例中，m為1，m'為0，且n''為1。在一特定實施例中，m為1，m'為1，且n''為1。在一特定實施例中，m為1，m'為2，且n''為1。在一特定實施例中，m為1，m'為3，且n''為1。
在另一實施例中，m為2，m'為0，且n''為1。在另一實施例中，m為2，m'為1，且n''為1。在另一實施例中，m為2，m'為2，且n''為1。在另一實施例中，m為2，m'為3，且n''為1。
在又另一實施例中，m為3，m'為0，且n''為1。在又另一實施例中，m為3，m'為1，且n''為1。在又另一實施例中，m為3，m'為2，且n''為1。在又另一實施例中，m為3，m'為3，且n''為1。
在又另一實施例中，m為4，m'為0，且n"為1。在又另一實施例中，m為4，m'為1，且n"為1。在又另一實施例中，m為4，m'為2，且n"為1。在又另一實施例中，m為4，m'為3，且n"為1。
在一特定實施例中，m為1，m'為0，且n''為2。在一特定實施例中，m為1，m'為1，且n''為2。在一特定實施例中，m為1，m'為2，且n''為2。在一特定實施例中，m為1，m'為3，且n''為2。
在另一實施例中，m為2，m'為0，且n''為2。在另一實施例中，m為2，m'為1，且n''為2。在另一實施例中，m為2，m'為2，且n''為2。在另一實施例中，m為2，m'為3，且n''為2。
在又另一實施例中，m為3，m'為0，且n''為2。在又另一實施例中，m為3，m'為1，且n''為2。在又另一實施例中，m為3，m'為2，且n''為2。在又另一實施例中，m為3，m'為3，且n''為2。
在又另一實施例中，m為4，m'為0，且n"為2。在又另一實施例中，m為4，m'為1，且n"為2。在又另一實施例中，m為4，m'為2，且n"為2。在又另一實施例中，m為4，m'為3，且n"為2。
在一特定實施例中，m為1，m'為0，且n''為3。在一特定實施例中，m為1，m'為1，且n''為3。在一特定實施例中，m為1，m'為2，且n''為3。在一特定實施例中，m為1，m'為3，且n''為3。
在另一實施例中，m為2，m'為0，且n''為3。在另一實施例中，m為2，m'為1，且n''為3。在另一實施例中，m為2，m'為2，且n''為3。在另一實施例中，m為2，m'為3，且n''為3。
在又另一實施例中，m為3，m'為0，且n''為3。在又另一實施例中，m為3，m'為1，且n''為3。在又另一實施例中，m為3，m'為2，且n''為3。在又另一實施例中，m為3，m'為3，且n''為3。
在又另一實施例中，m為4，m'為0，且n"為3。在又另一實施例中，m為4，m'為1，且n"為3。在又另一實施例中，m為4，m'為2，且n"為3。在又另一實施例中，m為4，m'為3，且n"為3。
在一特定實施例中，m為1，m'為0，且n''為4。在一特定實施例中，m為1，m'為1，且n''為4。在一特定實施例中，m為1，m'為2，且n''為4。在一特定實施例中，m為1，m'為3，且n''為4。
在另一實施例中，m為2，m'為0，且n''為4。在另一實施例中，m為2，m'為1，且n''為4。在另一實施例中，m為2，m'為2，且n''為4。在另一實施例中，m為2，m'為3，且n''為4。
在又另一實施例中，m為3，m'為0，且n''為4。在又另一實施例中，m為3，m'為1，且n''為4。在又另一實施例中，m為3，m'為2，且n''為4。在又另一實施例中，m為3，m'為3，且n''為4。
在又另一實施例中，m為4，m'為0，且n"為4。在又另一實施例中，m為4，m'為1，且n"為4。在又另一實施例中，m為4，m'為2，且n"為4。在又另一實施例中，m為4，m'為3，且n"為4。
在一特定實施例中，m為1，m'為0，且n''為5。在一特定實施例中，m為1，m'為1，且n''為5。在一特定實施例中，m為1，m'為2，且n''為5。在一特定實施例中，m為1，m'為3，且n''為5。
在另一實施例中，m為2，m'為0，且n''為5。在另一實施例中，m為2，m'為1，且n''為5。在另一實施例中，m為2，m'為2，且n''為5。在另一實施例中，m為2，m'為3，且n''為5。
在又另一實施例中，m為3，m'為0，且n''為5。在又另一實施例中，m為3，m'為1，且n''為5。在又另一實施例中，m為3，m'為2，且n''為5。在又另一實施例中，m為3，m'為3，且n''為5。
在又另一實施例中，m為4，m'為0，且n"為5。在又另一實施例中，m為4，m'為1，且n"為5。在又另一實施例中，m為4，m'為2，且n"為5。在又另一實施例中，m為4，m'為3，且n"為5。較佳地，醣不為來自肺炎鏈球菌血清型3之莢膜醣。
在一實施例中，本發明提供一種醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之醣且具有通式(VII)，其中X為OCH
2(CH
2)
n'，其中n'係選自1至10，且其中X'為CH
2O(CH
2)
n''CH
2C=O，其中n''係選自0至10。
在一實施例中，n'係選自1至5，且n''係選自0至10。在一實施例中，n'係選自1至5，且n''係選自0至5。在一實施例中，n'係選自1至3，且n''係選自0至3。在一實施例中，n'係選自1至2，且n''係選自0至2。在一特定實施例中，n'為1，且n''為0。在另一實施例中，n'為2，且n''為0。在又另一實施例中，n'為3，且n''為0。在又另一實施例中，n'為4，且n"為0。在又另一實施例中，n'為5，且n"為0。在又另一實施例中，n'為6，且n"為0。在一特定實施例中，n'為1，且n''為1。在另一實施例中，n'為2，且n''為1。在又另一實施例中，n'為3，且n''為1。在又另一實施例中，n'為4，且n"為1。在又另一實施例中，n'為5，且n"為1。在又另一實施例中，n'為6，且n"為1。在一特定實施例中，n'為1，且n''為2。在另一實施例中，n'為2，且n''為2。在又另一實施例中，n'為3，且n''為2。在又另一實施例中，n'為4，且n"為2。在又另一實施例中，n'為5，且n"為2。在又另一實施例中，n'為6，且n"為2。在一特定實施例中，n'為1，且n''為3。在另一實施例中，n'為2，且n''為3。在又另一實施例中，n'為3，且n''為3。在又另一實施例中，n'為4，且n"為3。在又另一實施例中，n'為5，且n"為3。在又另一實施例中，n'為6，且n"為3。在一特定實施例中，n'為1，且n''為4。在另一實施例中，n'為2，且n''為4。在又另一實施例中，n'為3，且n''為4。在又另一實施例中，n'為4，且n"為4。在又另一實施例中，n'為5，且n"為4。在又另一實施例中，n'為6，且n"為4。在一特定實施例中，n'為1，且n''為5。在另一實施例中，n'為2，且n''為5。在又另一實施例中，n'為3，且n''為5。在又另一實施例中，n'為4，且n"為5。在又另一實施例中，n'為5，且n"為5。在又另一實施例中，n'為6，且n"為5。在一特定實施例中，n'為1，且n''為6。在另一實施例中，n'為2，且n''為6。在又另一實施例中，n'為3，且n''為6。在又另一實施例中，n'為4，且n"為6。在又另一實施例中，n'為5，且n"為6。在又另一實施例中，n'為6，且n"為6。較佳地，醣不為來自肺炎鏈球菌血清型3之莢膜醣。
在一實施例中，本發明提供一種醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之醣且具有通式(VII)，其中X為OCH
2(CH
2)
n'，其中n'係選自1至10，且其中X'為CH
2O(CH
2CH
2O)
m'(CH
2)
n''CH
2C=O，其中n''係選自0至10且m'係選自0至4。
在一實施例中，n'係選自1至5，m'係選自0至4，且n''係選自0至10。在一實施例中，n'係選自1至5，m'係選自0至4，且n''係選自0至5。在一實施例中，n'係選自1至3，m'係選自0至2，且n''係選自0至3。在一實施例中，n'係選自1至2，m'係選自0至2，且n''係選自0至1。
在一特定實施例中，n'為1，m'為0，且n''為0。在另一實施例中，n'為1，m'為1，且n''為0。在另一實施例中，n'為1，m'為2，且n''為0。在另一實施例中，n'為1，m'為3，且n''為0。
在另一實施例中，n'為2，m'為0，且n''為0。在另一實施例中，n'為2，m'為1，且n''為0。在另一實施例中，n'為2，m'為2，且n''為0。在另一實施例中，n'為2，m'為3，且n''為0。
在又另一實施例中，n'為3，m'為0，且n''為0。在又另一實施例中，n'為3，m'為1，且n''為0。在又另一實施例中，n'為3，m'為2，且n''為0。在又另一實施例中，n'為3，m'為3，且n''為0。
在又另一實施例中，n'為4，m'為0，且n"為0。在又另一實施例中，n'為4，m'為1，且n"為0。在又另一實施例中，n'為4，m'為2，且n"為0。在又另一實施例中，n'為4，m'為3，且n"為0。
在又另一實施例中，n'為5，m'為0，且n"為0。在又另一實施例中，n'為5，m'為1，且n"為0。在又另一實施例中，n'為5，m'為2，且n"為0。在又另一實施例中，n'為5，m'為3，且n"為0。
在一特定實施例中，n'為1，m'為0，且n''為1。在一特定實施例中，n'為1，m'為1，且n''為1。在一特定實施例中，n'為1，m'為2，且n''為1。在一特定實施例中，n'為1，m'為3，且n''為1。
在另一實施例中，n'為2，m'為0，且n''為1。在另一實施例中，n'為2，m'為1，且n''為1。在另一實施例中，n'為2，m'為2，且n''為1。在另一實施例中，n'為2，m'為3，且n''為1。
在又另一實施例中，n'為3，m'為0，且n''為1。在又另一實施例中，n'為3，m'為1，且n''為1。在又另一實施例中，n'為3，m'為2，且n''為1。在又另一實施例中，n'為3，m'為3，且n''為1。
在又另一實施例中，n'為4，m'為0，且n"為1。在又另一實施例中，n'為4，m'為1，且n"為1。在又另一實施例中，n'為4，m'為2，且n"為1。在又另一實施例中，n'為4，m'為3，且n"為1。
在又另一實施例中，n'為5，m'為0，且n"為1。在又另一實施例中，n'為5，m'為1，且n"為1。在又另一實施例中，n'為5，m'為2，且n"為1。在又另一實施例中，n'為5，m'為3，且n"為1。
在一特定實施例中，n'為1，m'為0，且n''為2。在一特定實施例中，n'為1，m'為1，且n''為2。在一特定實施例中，n'為1，m'為2，且n''為2。在一特定實施例中，n'為1，m'為3，且n''為2。
在另一實施例中，n'為2，m'為0，且n''為2。在另一實施例中，n'為2，m'為1，且n''為2。在另一實施例中，n'為2，m'為2，且n''為2。在另一實施例中，n'為2，m'為3，且n''為2。
在又另一實施例中，n'為3，m'為0，且n''為2。在又另一實施例中，n'為3，m'為1，且n''為2。在又另一實施例中，n'為3，m'為2，且n''為2。在又另一實施例中，n'為3，m'為3，且n''為2。
在又另一實施例中，n'為4，m'為0，且n"為2。在又另一實施例中，n'為4，m'為1，且n"為2。在又另一實施例中，n'為4，m'為2，且n"為2。在又另一實施例中，n'為4，m'為3，且n"為2。
在又另一實施例中，n'為5，m'為0，且n"為2。在又另一實施例中，n'為5，m'為1，且n"為2。在又另一實施例中，n'為5，m'為2，且n"為2。在又另一實施例中，n'為5，m'為3，且n"為2。
在一特定實施例中，n'為1，m'為0，且n''為3。在一特定實施例中，n'為1，m'為1，且n''為3。在一特定實施例中，n'為1，m'為2，且n''為3。在一特定實施例中，n'為1，m'為3，且n''為3。
在另一實施例中，n'為2，m'為0，且n''為3。在另一實施例中，n'為2，m'為1，且n''為3。在另一實施例中，n'為2，m'為2，且n''為3。在另一實施例中，n'為2，m'為3，且n''為3。
在又另一實施例中，n'為3，m'為0，且n''為3。在又另一實施例中，n'為3，m'為1，且n''為3。在又另一實施例中，n'為3，m'為2，且n''為3。在又另一實施例中，n'為3，m'為3，且n''為3。
在又另一實施例中，n'為4，m'為0，且n"為3。在又另一實施例中，n'為4，m'為1，且n"為3。在又另一實施例中，n'為4，m'為2，且n"為3。在又另一實施例中，n'為4，m'為3，且n"為3。
在又另一實施例中，n'為5，m'為0，且n"為3。在又另一實施例中，n'為5，m'為1，且n"為3。在又另一實施例中，n'為5，m'為2，且n"為3。在又另一實施例中，n'為5，m'為3，且n"為3。
在一特定實施例中，n'為1，m'為0，且n''為4。在一特定實施例中，n'為1，m'為1，且n''為4。在一特定實施例中，n'為1，m'為2，且n''為4。在一特定實施例中，n'為1，m'為3，且n''為4。
在另一實施例中，n'為2，m'為0，且n''為4。在另一實施例中，n'為2，m'為1，且n''為4。在另一實施例中，n'為2，m'為2，且n''為4。在另一實施例中，n'為2，m'為3，且n''為4。
在又另一實施例中，n'為3，m'為0，且n''為4。在又另一實施例中，n'為3，m'為1，且n''為4。在又另一實施例中，n'為3，m'為2，且n''為4。在又另一實施例中，n'為3，m'為3，且n''為4。
在又另一實施例中，n'為4，m'為0，且n"為4。在又另一實施例中，n'為4，m'為1，且n"為4。在又另一實施例中，n'為4，m'為2，且n"為4。在又另一實施例中，n'為4，m'為3，且n"為4。
在又另一實施例中，n'為5，m'為0，且n"為4。在又另一實施例中，n'為5，m'為1，且n"為4。在又另一實施例中，n'為5，m'為2，且n"為4。在又另一實施例中，n'為5，m'為3，且n"為4。
在一特定實施例中，n'為1，m'為0，且n''為5。在一特定實施例中，n'為1，m'為1，且n''為5。在一特定實施例中，n'為1，m'為2，且n''為5。在一特定實施例中，n'為1，m'為3，且n''為5。
在另一實施例中，n'為2，m'為0，且n''為5。在另一實施例中，n'為2，m'為1，且n''為5。在另一實施例中，n'為2，m'為2，且n''為5。在另一實施例中，n'為2，m'為3，且n''為5。
在又另一實施例中，n'為3，m'為0，且n''為5。在又另一實施例中，n'為3，m'為1，且n''為5。在又另一實施例中，n'為3，m'為2，且n''為5。在又另一實施例中，n'為3，m'為3，且n''為5。
在又另一實施例中，n'為4，m'為0，且n"為5。在又另一實施例中，n'為4，m'為1，且n"為5。在又另一實施例中，n'為4，m'為2，且n"為5。在又另一實施例中，n'為4，m'為3，且n"為5。
在又另一實施例中，n'為5，m'為0，且n"為5。在又另一實施例中，n'為5，m'為1，且n"為5。在又另一實施例中，n'為5，m'為2，且n"為5。在又另一實施例中，n'為5，m'為3，且n"為5。
較佳地，醣不為來自肺炎鏈球菌血清型3之莢膜醣。
在一實施例中，本發明提供一種醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之醣且具有通式(VII)，其中X為O(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2，其中m係選自1至4，且其中X'為CH
2O(CH
2)
n''CH
2C=O，其中n''係選自0至10。
在一實施例中，m係選自1至3，且n''係選自0至10。在一實施例中，m係選自1至3，且n''係選自0至5。在一實施例中，m係選自1至2，且n''係選自0至3。在一實施例中，m係選自1至2，且n''係選自0至2。在一特定實施例中，m為1，且n''為0。在另一實施例中，m為2，且n''為0。在又另一實施例中，m為3，且n''為0。在又另一實施例中，m為4，且n"為0。在一特定實施例中，m為1，且n''為1。在另一實施例中，m為2，且n''為1。在又另一實施例中，m為3，且n''為1。在又另一實施例中，m為4，且n"為1。在一特定實施例中，m為1，且n''為2。在另一實施例中，m為2，且n''為2。在又另一實施例中，m為3，且n''為2。在又另一實施例中，m為4，且n"為2。在一特定實施例中，m為1，且n''為3。在另一實施例中，m為2，且n''為3。在又另一實施例中，m為3，且n''為3。在又另一實施例中，m為4，且n"為3。在一特定實施例中，m為1，且n''為4。在另一實施例中，m為2，且n''為4。在又另一實施例中，m為3，且n''為4。在又另一實施例中，m為4，且n"為4。在一特定實施例中，m為1，且n''為5。在另一實施例中，m為2，且n''為5。在又另一實施例中，m為3，且n''為5。在又另一實施例中，m為4，且n"為5。在一特定實施例中，m為1，且n''為6。在另一實施例中，m為2，且n''為6。在又另一實施例中，m為3，且n''為6。在又另一實施例中，m為4，且n"為6。較佳地，醣不為來自肺炎鏈球菌血清型3之莢膜醣。
在一實施例中，本發明提供一種醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之醣且具有通式(VII)，其中X為O(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2，其中m係選自1至4，且其中X'為CH
2O(CH
2CH
2O)
m'(CH
2)
n''CH
2C=O，其中n''係選自0至10且m'係選自0至4。
在一實施例中，m係選自1至3，m'係選自0至4，且n''係選自0至10。在一實施例中，m係選自1至2，m'係選自0至4，且n''係選自0至5。在一實施例中，m係選自1至2，m'係選自0至2，且n''係選自0至3。在一實施例中，m係選自1至2，m'係選自0至2，且n''係選自0至1。
在一特定實施例中，m為1，m'為0，且n''為0。在另一實施例中，m為1，m'為1，且n''為0。在另一實施例中，m為1，m'為2，且n''為0。在另一實施例中，m為1，m'為3，且n''為0。
在另一實施例中，m為2，m'為0，且n''為0。在另一實施例中，m為2，m'為1，且n''為0。在另一實施例中，m為2，m'為2，且n''為0。在另一實施例中，m為2，m'為3，且n''為0。
在又另一實施例中，m為3，m'為0，且n''為0。在又另一實施例中，m為3，m'為1，且n''為0。在又另一實施例中，m為3，m'為2，且n''為0。在又另一實施例中，m為3，m'為3，且n''為0。
在又另一實施例中，m為4，m'為0，且n"為0。在又另一實施例中，m為4，m'為1，且n"為0。在又另一實施例中，m為4，m'為2，且n"為0。在又另一實施例中，m為4，m'為3，且n"為0。
在一特定實施例中，m為1，m'為0，且n''為1。在一特定實施例中，m為1，m'為1，且n''為1。在一特定實施例中，m為1，m'為2，且n''為1。在一特定實施例中，m為1，m'為3，且n''為1。
在另一實施例中，m為2，m'為0，且n''為1。在另一實施例中，m為2，m'為1，且n''為1。在另一實施例中，m為2，m'為2，且n''為1。在另一實施例中，m為2，m'為3，且n''為1。
在又另一實施例中，m為3，m'為0，且n''為1。在又另一實施例中，m為3，m'為1，且n''為1。在又另一實施例中，m為3，m'為2，且n''為1。在又另一實施例中，m為3，m'為3，且n''為1。
在又另一實施例中，m為4，m'為0，且n"為1。在又另一實施例中，m為4，m'為1，且n"為1。在又另一實施例中，m為4，m'為2，且n"為1。在又另一實施例中，m為4，m'為3，且n"為1。
在一特定實施例中，m為1，m'為0，且n''為2。在一特定實施例中，m為1，m'為1，且n''為2。在一特定實施例中，m為1，m'為2，且n''為2。在一特定實施例中，m為1，m'為3，且n''為2。
在另一實施例中，m為2，m'為0，且n''為2。在另一實施例中，m為2，m'為1，且n''為2。在另一實施例中，m為2，m'為2，且n''為2。在另一實施例中，m為2，m'為3，且n''為2。
在又另一實施例中，m為3，m'為0，且n''為2。在又另一實施例中，m為3，m'為1，且n''為2。在又另一實施例中，m為3，m'為2，且n''為2。在又另一實施例中，m為3，m'為3，且n''為2。
在又另一實施例中，m為4，m'為0，且n"為2。在又另一實施例中，m為4，m'為1，且n"為2。在又另一實施例中，m為4，m'為2，且n"為2。在又另一實施例中，m為4，m'為3，且n"為2。
在一特定實施例中，m為1，m'為0，且n''為3。在一特定實施例中，m為1，m'為1，且n''為3。在一特定實施例中，m為1，m'為2，且n''為3。在一特定實施例中，m為1，m'為3，且n''為3。
在另一實施例中，m為2，m'為0，且n''為3。在另一實施例中，m為2，m'為1，且n''為3。在另一實施例中，m為2，m'為2，且n''為3。在另一實施例中，m為2，m'為3，且n''為3。
在又另一實施例中，m為3，m'為0，且n''為3。在又另一實施例中，m為3，m'為1，且n''為3。在又另一實施例中，m為3，m'為2，且n''為3。在又另一實施例中，m為3，m'為3，且n''為3。
在又另一實施例中，m為4，m'為0，且n"為3。在又另一實施例中，m為4，m'為1，且n"為3。在又另一實施例中，m為4，m'為2，且n"為3。在又另一實施例中，m為4，m'為3，且n"為3。
在一特定實施例中，m為1，m'為0，且n''為4。在一特定實施例中，m為1，m'為1，且n''為4。在一特定實施例中，m為1，m'為2，且n''為4。在一特定實施例中，m為1，m'為3，且n''為4。
在另一實施例中，m為2，m'為0，且n''為4。在另一實施例中，m為2，m'為1，且n''為4。在另一實施例中，m為2，m'為2，且n''為4。在另一實施例中，m為2，m'為3，且n''為4。
在又另一實施例中，m為3，m'為0，且n''為4。在又另一實施例中，m為3，m'為1，且n''為4。在又另一實施例中，m為3，m'為2，且n''為4。在又另一實施例中，m為3，m'為3，且n''為4。
在又另一實施例中，m為4，m'為0，且n"為4。在又另一實施例中，m為4，m'為1，且n"為4。在又另一實施例中，m為4，m'為2，且n"為4。在又另一實施例中，m為4，m'為3，且n"為4。
在一特定實施例中，m為1，m'為0，且n''為5。在一特定實施例中，m為1，m'為1，且n''為5。在一特定實施例中，m為1，m'為2，且n''為5。在一特定實施例中，m為1，m'為3，且n''為5。
在另一實施例中，m為2，m'為0，且n''為5。在另一實施例中，m為2，m'為1，且n''為5。在另一實施例中，m為2，m'為2，且n''為5。在另一實施例中，m為2，m'為3，且n''為5。
在又另一實施例中，m為3，m'為0，且n''為5。在又另一實施例中，m為3，m'為1，且n''為5。在又另一實施例中，m為3，m'為2，且n''為5。在又另一實施例中，m為3，m'為3，且n''為5。
在又另一實施例中，m為4，m'為0，且n"為5。在又另一實施例中，m為4，m'為1，且n"為5。在又另一實施例中，m為4，m'為2，且n"為5。在又另一實施例中，m為4，m'為3，且n"為5。
較佳地，醣不為來自肺炎鏈球菌血清型3之莢膜醣。
較佳地，本發明之醣結合物之醣不為來自肺炎鏈球菌血清型3之莢膜醣。
1.5 本發明之醣結合物之載體蛋白醣結合物之組分為與醣結合之載體蛋白。術語「蛋白載體」或「載體蛋白」或「載體」可在本文中互換使用。載體蛋白應適於標準結合程序。
在一較佳實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白係在由以下組成之群中選擇：DT (白喉類毒素)、TT (破傷風類毒素)或TT之片段C、CRM
197(白喉毒素之無毒但抗原一致之變體)、其他DT突變體(諸如CRM
176、CRM
228、CRM
45(Uchida等人(1973) J. Biol. Chem. 218:3838-3844)、CRM
9、CRM
102、CRM
103或CRM
107；及Nicholls及Youle在Genetically Engineered Toxins, 編: Frankel, Maecel Dekker Inc. (1992)中描述之其他突變；Glu-148缺失或突變為Asp、Gln或Ser，及/或Ala 158缺失或突變為Gly，及美國專利第4,709,017號及第4,950,740號中所揭示之其他突變；至少一或多個殘基Lys 516、Lys 526、Phe 530及/或Lys 534之突變，及美國專利第5,917,017號及第6,455,673號中所揭示之其他突變；或美國專利第5,843,711號中所揭示之片段，肺炎鏈球菌性肺炎鏈球菌溶血素(ply) (Kuo等人(1995) Infect lmmun 63:2706-2713)包括以一些型式解毒之ply，例如dPLY-GMBS (WO 2004/081515、WO 2006/032499)或dPLY-formol、PhtX (包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE (PhtA、PhtB、PhtD或PhtE之序列揭示於WO 00/37105及WO 00/39299中)及Pht蛋白之融合物，例如PhtDE融合物、PhtBE融合物、Pht A-E (WO 01/98334、WO 03/054007、WO 2009/000826)、OMPC (腦膜炎球菌性外膜蛋白) (其通常提取自腦膜炎奈瑟氏菌血清群B (EP0372501))、PorB (來自腦膜炎奈瑟氏菌)、PD (流感嗜血桿菌蛋白D；參見例如EP0594610 B)或其免疫功能等效物、合成肽(EP0378881、EP0427347)、熱休克蛋白(WO 93/17712、WO 94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668、EP0471177)、細胞介素、淋巴激素、生長因子或激素(WO 91/01146)、人工蛋白質，包含來自各種病原體衍生抗原之多種人類CD4+ T細胞抗原決定基(Falugi等人(2001) Eur J Immunol 31:3816-3824)，諸如N19蛋白(Baraldoi等人(2004) Infect lmmun 72:4884-4887)、肺炎鏈球菌性表面蛋白PspA (WO 02/091998)、鐵攝取蛋白(WO 01/72337)、難養芽孢梭菌之毒素A或B (WO 00/61761)、轉鐵蛋白結合蛋白、肺炎鏈球菌性黏附蛋白(PsaA)、重組銅綠假單胞菌(
Pseudomonas aeruginosa)外毒素A (尤其其無毒突變體(諸如具有麩胺酸553處之取代的外毒素A (Douglas等人(1987) J. Bacteriol. 169(11):4967-4971))。其他蛋白，諸如卵白蛋白、匙孔螺血氰蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結核菌素之純化蛋白衍生物(PPD)亦可用作載體蛋白。其他適合的載體蛋白包括不活化之細菌毒素，諸如霍亂類毒素(例如如WO 2004/083251中所描述)；大腸桿菌LT；大腸桿菌ST；及來自銅綠假單胞菌之外毒素A。另一適合的載體蛋白為來自鏈球菌(SCP)之C5a肽酶。
在一較佳實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為TT、DT、DT突變體(諸如CRM
197)或來自鏈球菌之C5a肽酶(SCP)。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為DT (白喉類毒素)。在另一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為TT (破傷風類毒素)。
在另一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為PD (流感嗜血桿菌蛋白D；參見例如EP0594610 B)。
在一較佳實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為CRM
197或來自鏈球菌之C5a肽酶(SCP)。
在一較佳實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為CRM
197。CRM
197蛋白為一種無毒形式之白喉毒素，但在免疫學上與白喉毒素無法區分。CRM
197係由受無毒噬菌體β197
tox-感染之白喉棒狀桿菌(
Corynebacterium diphtheriae)產生，該無毒噬菌體由產毒棒狀桿菌噬菌體β之亞硝基胍突變誘發產生(Uchida等人(1971) Nature New Biology 233:8-11)。CRM
197蛋白具有與白喉毒素相同的分子量，但因結構基因中之單個鹼基變化(鳥嘌呤變為腺嘌呤)而與白喉毒素不同。此單個鹼基變化引起成熟蛋白中之胺基酸取代(麩胺酸取代甘胺酸)，且消除白喉毒素之毒性特性。CRM
197蛋白為醣之安全且有效的T細胞依賴性載體。關於CRM
197及其產生之其他細節可例如見於美國專利第5,614,382號中。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為CRM
197之A鏈(參見CN103495161)。在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為經由藉由基因重組之大腸桿菌進行表現而獲得的CRM
197之A鏈(參見CN103495161)。
在其他較佳實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為SCP (鏈球菌C5a肽酶)。β溶血性鏈球菌之兩種重要菌種化膿性鏈球菌(A組鏈球菌，GAS)及無乳鏈球菌(B組鏈球菌，GBS)引起多種嚴重人類感染，自輕症咽炎及膿皰至嚴重侵襲性疾病(諸如壞死性筋膜炎(GAS)及新生兒敗血症(GBS))都有，已針對此兩種菌種研發出消除此免疫反應之方式。β溶血性鏈球菌(包括GAS及GBS)之所有人類分離株均產生特異性地使C5a不活化之高度保守的細胞壁蛋白SCP (鏈球菌C5a肽酶)。來自GAS及GBS之
scp基因編碼含有1,134至1,181個胺基酸之多肽(Brown等人, PNAS, 2005, 第102卷, 第51期, 第18391-18396頁)。前31個殘基為輸出信號前序列且在穿過細胞質膜時被移除。隨後68個殘基充當後序列且必須經移除以產生活性SCP。隨後10個殘基可經移除而不損失蛋白酶活性。在另一端，以Lys-1034開始為四個連續的17個殘基模體，接著為細胞分選及細胞壁連接信號。此組合信號由含有LPTTND序列之20個殘基親水性序列、17個殘基疏水性序列及較短鹼性羧基端構成。
SCP可分成域(參見Brown等人, PNAS, 2005, 第102卷, 第51期第18391-18396頁之圖1B)。此等域為前域/後域(其包含輸出信號前序列(通常為前31個殘基)及後序列(通常為隨後68個殘基))、蛋白酶域(其分解為兩部分(蛋白酶部分1，通常為殘基89至333/334；及蛋白酶域部分2，且通常為殘基467/468至583/584)、蛋白酶相關域(PA域) (通常為殘基333/334至467/468)、三個纖維結合蛋白III型(Fn)域(Fn1，通常為殘基583/584至712/713；Fn2，通常為殘基712/713至928/929/930；通常Fn3，殘基929/930至1029/1030/1031)及細胞壁錨定域(通常為殘基1029/1030/1031至C端)。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為來自GBS之SCP (SCPB)。SCPB之實例提供於WO97/26008之SEQ ID.NO: 3處。亦參見WO00/34487之SEQ ID NO: 3。
在另一較佳實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為來自GAS之SCP (SCPA)。SCPA之實例可見於WO97/26008之SEQ ID.No.1及SEQ ID.No.2。亦參見WO00/34487之SEQ ID NO: 1、2及23。
在一較佳實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCP。
在其他較佳實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的來自GBS之SCP (SCPB)。
在另一較佳實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的來自GAS之SCP (SCPA)。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為SCP之片段。在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為SCPA之片段。較佳地，本發明之醣結合物之載體蛋白為SCPB之片段。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為SCP之片段，其包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域，但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為SCP之片段，其包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域，但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCP之片段，其包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)以及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域中之兩者，但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCP之片段。在一實施例中，該酶促不活化的SCP之片段包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域，但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCPA之片段。在一實施例中，該酶促不活化的SCPA之片段包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域，但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域。
在一較佳實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCPB之片段。較佳地，該酶促不活化的SCPB之片段包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域，但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域。
在一實施例中，SCP之酶促活性係藉由置換野生型序列之至少一個胺基酸而不活化。在一實施例中，該置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。數目指示根據WO00/34487之SEQ ID NO: 1之編號的肽酶中之胺基酸殘基位置。
因此，在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCP，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少一個胺基酸來實現。較佳地，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該置換為D130A。在另一實施例中，該置換為H193A。在另一實施例中，該置換為N295A。在又另一實施例中，該置換為S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCPA，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少一個胺基酸來實現。較佳地，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該置換為D130A。在另一實施例中，該置換為H193A。在另一實施例中，該置換為N295A。在又另一實施例中，該置換為S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCPB，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少一個胺基酸來實現。較佳地，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該置換為D130A。在另一實施例中，該置換為H193A。在另一實施例中，該置換為N295A。在又另一實施例中，該置換為S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCP之片段，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少一個胺基酸來實現。較佳地，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該置換為D130A。在另一實施例中，該置換為H193A。在另一實施例中，該置換為N295A。在又另一實施例中，該置換為S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCP之片段，其包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少一個胺基酸來實現。較佳地，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該置換為D130A。在另一實施例中，該置換為H193A。在另一實施例中，該置換為N295A。在又另一實施例中，該置換為S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCPA之片段，其包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少一個胺基酸來實現。較佳地，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該置換為D130A。在另一實施例中，該置換為H193A。在另一實施例中，該置換為N295A。在又另一實施例中，該置換為S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCPB之片段，其包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少一個胺基酸來實現。較佳地，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該置換為D130A。在另一實施例中，該置換為H193A。在另一實施例中，該置換為N295A。在又另一實施例中，該置換為S512A。
在一實施例中，SCP之酶促活性係藉由置換野生型序列之至少兩個胺基酸而不活化。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及H193A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及N295A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及N295A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為N295A及S512A。
因此，在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCP，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少兩個胺基酸來實現。較佳地，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及H193A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及N295A。較佳地，該至少兩個胺基酸置換為D130A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及N295A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCPA，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少兩個胺基酸來實現。較佳地，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及H193A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及N295A。較佳地，該至少兩個胺基酸置換為D130A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及N295A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCPB，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少兩個胺基酸來實現。較佳地，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及H193A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及N295A。較佳地，該至少兩個胺基酸置換為D130A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及N295A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCP之片段，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少兩個胺基酸來實現。較佳地，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及H193A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及N295A。較佳地，該至少兩個胺基酸置換為D130A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及N295A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCP之片段，其包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少兩個胺基酸來實現。較佳地，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及H193A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及N295A。較佳地，該至少兩個胺基酸置換為D130A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及N295A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCPA之片段，其包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少兩個胺基酸來實現。較佳地，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及H193A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及N295A。較佳地，該至少兩個胺基酸置換為D130A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及N295A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCPB之片段，其包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少兩個胺基酸來實現。較佳地，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及H193A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及N295A。較佳地，該至少兩個胺基酸置換為D130A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及N295A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸置換為N295A及S512A。
在一實施例中，SCP之酶促活性係藉由置換野生型序列之至少三個胺基酸而不活化。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及N295A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為H193A、N295A及S512A。
因此，在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCP，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少三個胺基酸來實現。較佳地，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及N295A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCPA，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少三個胺基酸來實現。較佳地，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及N295A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCPB，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少三個胺基酸來實現。較佳地，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及N295A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCP之片段，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少三個胺基酸來實現。較佳地，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及N295A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCP之片段，其包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少三個胺基酸來實現。較佳地，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及N295A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCPA之片段，其包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少三個胺基酸來實現。較佳地，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及N295A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCPB之片段，其包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少三個胺基酸來實現。較佳地，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及N295A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為D130A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸置換為H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，SCP之酶促活性係藉由置換野生型序列之至少四個胺基酸而不活化。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換為D130A、H193A、N295A及S512A。
因此，在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCP，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少四個胺基酸來實現。較佳地，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換為D130A、H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCPA，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少四個胺基酸來實現。較佳地，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換為D130A、H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCPB，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少四個胺基酸來實現。較佳地，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換為D130A、H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCP之片段，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少四個胺基酸來實現。較佳地，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換為D130A、H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCP之片段，其包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少四個胺基酸來實現。較佳地，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換為D130A、H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCPA之片段，其包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少四個胺基酸來實現。較佳地，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少一個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換為D130A、H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為酶促不活化的SCPB之片段，其包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少四個胺基酸來實現。較佳地，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分1中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換係在蛋白酶域之部分2中。在一實施例中，該至少四個胺基酸置換為D130A、H193A、N295A及S512A。
在一特定實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為由SEQ ID NO: 41組成的酶促不活化的SCP之片段。
在一特定實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為由SEQ ID NO: 42組成的酶促不活化的SCP之片段。
SEQ ID NO: 41之長度為950個胺基酸。
SEQ ID NO: 42之長度為949個胺基酸。
在一特定實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為由與SEQ ID NO: 41具有至少90%一致性之多肽組成的酶促不活化的SCP之片段。
在一特定實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為由與SEQ ID NO: 41具有至少95%一致性之多肽組成的酶促不活化的SCP之片段。
在一特定實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為由與SEQ ID NO: 41具有至少99%一致性之多肽組成的酶促不活化的SCP之片段。
在一特定實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為由與SEQ ID NO: 41具有至少99.5%一致性之多肽組成的酶促不活化的SCP之片段。
在一特定實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為由與SEQ ID NO: 41具有至少99.8%一致性之多肽組成的酶促不活化的SCP之片段。
在一特定實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為由與SEQ ID NO: 41具有至少99.85%一致性之多肽組成的酶促不活化的SCP之片段。
在一特定實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為由與SEQ ID NO: 42具有至少90%一致性之多肽組成的酶促不活化的SCP之片段。
在一特定實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為由與SEQ ID NO: 42具有至少95%一致性之多肽組成的酶促不活化的SCP之片段。
在一特定實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為由與SEQ ID NO: 42具有至少99%一致性之多肽組成的酶促不活化的SCP之片段。
在一特定實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為由與SEQ ID NO: 42具有至少99.5%一致性之多肽組成的酶促不活化的SCP之片段。
在一特定實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為由與SEQ ID NO: 42具有至少99.8%一致性之多肽組成的酶促不活化的SCP之片段。
在一特定實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為由與SEQ ID NO: 42具有至少99.85%一致性之多肽組成的酶促不活化的SCP之片段。
2 免疫原組合物 2.1 本發明之醣結合物之組合在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物(如上文部分1處所揭示)。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含1至25種不同醣結合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含1至25種來自不同肺炎鏈球菌血清型之醣結合物(1至25種肺炎鏈球菌結合物)。在一個實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含來自7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25種不同肺炎鏈球菌血清型之醣結合物。在一個實施例中，免疫原組合物包含來自16或20種不同肺炎鏈球菌血清型之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20價肺炎鏈球菌結合物組合物。在一實施例中，免疫原組合物為14、15、16、17、18或19價肺炎鏈球菌結合物組合物。在一實施例中，免疫原組合物為16價肺炎鏈球菌結合物組合物。在一實施例中，免疫原組合物為19價肺炎鏈球菌結合物組合物。在一實施例中，免疫原組合物為20價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，免疫原組合物為21、22、23、24或25價肺炎鏈球菌結合物組合物。在一實施例中，免疫原組合物為21價肺炎鏈球菌結合物組合物。在一實施例中，免疫原組合物為22價肺炎鏈球菌結合物組合物。在一實施例中，免疫原組合物為23價肺炎鏈球菌結合物組合物。在一實施例中，免疫原組合物為24價肺炎鏈球菌結合物組合物。在一實施例中，免疫原組合物為25價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F及23F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為11價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為13價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為15價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為20價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為21價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為21價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、2、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為22價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、2、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、22F、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為23價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為24價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為21價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為21價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為21價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為21價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為21價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為22價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為22價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為22價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為22價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為22價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、24F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為22價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為22價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為22價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為22價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為22價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為23價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、24F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為23價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為23價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為23價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為23價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為23價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為23價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為23價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、24F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為23價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為23價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為24價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為24價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、24F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為24價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為24價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為24價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為25價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含選自由以下組成之群的本發明之醣結合物：來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含選自由以下組成之群的本發明之醣結合物：來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為21價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含二十一種選自由以下組成之群之醣結合物：來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為22價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含至少一種選自由以下組成之群之醣結合物：來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含二十二種選自由以下組成之群之醣結合物：來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為23價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含二十三種選自由以下組成之群之醣結合物：來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為24價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型2、9N、15A、17F、20、23A、23B、24F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為10價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型2、9N、15A、17F、19A、19F、20、23A、23B、24F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為12價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為23價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之醣結合物且包含來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物為25價肺炎鏈球菌結合物組合物。
在一較佳實施例中，醣各自個別地與蛋白載體之不同分子結合(蛋白載體之各分子僅具有與其結合之一種類型的醣)。在該實施例中，莢膜醣被稱為個別地與載體蛋白結合。較佳地，上述免疫原組合物之所有醣結合物均個別地與載體蛋白結合。
在上述免疫原組合物中之任一者之一實施例中，本發明之醣結合物與CRM
197結合。在上述免疫原組合物中之任一者之一實施例中，本發明之醣結合物與SCP結合。
在上述免疫原組合物中之任一者之一實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型22F之醣結合物與CRM
197結合。在上述免疫原組合物中之任一者之一實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型33F之醣結合物與CRM
197結合。在上述免疫原組合物中之任一者之一實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型15B之醣結合物與CRM
197結合。在上述免疫原組合物中之任一者之一實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型12F之醣結合物與CRM
197結合。在上述免疫原組合物中之任一者之一實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型10A之醣結合物與CRM
197結合。在上述免疫原組合物中之任一者之一實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型11A之醣結合物與CRM
197結合。在上述免疫原組合物中之任一者之一實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型8之醣結合物與CRM
197結合。在上述免疫原組合物中之任一者之一實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F之醣結合物與CRM
197結合。在上述免疫原組合物中之任一者之一實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型1、5及7F之醣結合物與CRM
197結合。在上述免疫原組合物中之任一者之一實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型6A及19A之醣結合物與CRM
197結合。
在上述免疫原組合物中之任一者之一實施例中，上述免疫原組合物中之任一者之醣結合物均個別地與CRM
197結合。
在上述免疫原組合物中之任一者之一實施例中，本發明之醣結合物與SCP結合且其他醣結合物均個別地與CRM
197結合。
在一實施例中，上述免疫原組合物中之任一者之來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14及/或23F之醣結合物個別地與PD結合。
在一實施例中，上述免疫原組合物中之任一者之來自肺炎鏈球菌血清型18C之醣結合物與TT結合。
在一實施例中，上述免疫原組合物中之任一者之來自肺炎鏈球菌血清型19F之醣結合物與DT結合。
在一實施例中，上述免疫原組合物中之任一者之來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14及/或23F之醣結合物個別地與PD結合，來自肺炎鏈球菌血清型18C之醣結合物與TT結合，且來自肺炎鏈球菌血清型19F之醣結合物與DT結合。
在一實施例中，上述免疫原組合物包含8至25種不同肺炎鏈球菌血清型。
本發明之組合物可包括少量游離載體。當給定載體蛋白以游離及結合形式存在於本發明之組合物中時，未結合形式較佳總體上不超過組合物中之載體蛋白之總量的5%，且更佳以少於2重量%存在。
2.2 本發明之免疫原組合物之劑量各劑量中之醣結合物之量經選擇為誘導免疫保護性反應而無典型疫苗接種者中之明顯不良副作用之量。此種量將視採用何種特定免疫原及其呈現方式而變化。
免疫原組合物中之特定醣結合物之量可基於該結合物之總醣(結合醣及未結合醣)來計算。舉例而言，在100 µg醣劑量中，具有20%游離醣之醣結合物將具有約80 µg之結合醣及約20 µg之未結合醣。醣結合物之量可視細菌及細菌血清型而變化。可藉由醣醛酸分析來測定醣濃度。
免疫原組合物中之不同醣組分之「免疫原性量」可不同，且各自可包含約0.5 µg、約0.75 µg、約1 µg、約2 µg、約3 µg、約4 µg、約5 µg、約6 µg、約7 µg、約8 µg、約9 µg、約10 µg、約15 µg、約20 µg、約30 µg、約40 µg、約50 µg、約60 µg、約70 µg、約80 µg、約90 µg或約100 µg之任何特定醣抗原。
一般而言，各劑量將包含0.1 µg至100 µg之醣。在一實施例中，各劑量將包含0.1 µg至100 µg之醣。在一較佳實施例中，各劑量將包含0.5 µg至20 µg。在一較佳實施例中，各劑量將包含1.0 µg至10 µg。在一甚至更佳實施例中，各劑量將包含2.0 µg至5.0 µg之血清型3多醣。考慮以上範圍中之任一者內之任何全數整數作為本發明之一實施例。
在一實施例中，各劑量將包含約0.5 µg之醣。在一實施例中，各劑量將包含約0.55 µg之醣。在一實施例中，各劑量將包含約0.75 µg之醣。在一實施例中，各劑量將包含約1.0 µg之醣。在一實施例中，各劑量將包含約1.1 µg之醣。在一實施例中，各劑量將包含約1.5 µg之醣。在一實施例中，各劑量將包含約2.0 µg之醣。在一實施例中，各劑量將包含約2.2 µg之醣。在一實施例中，各劑量將包含約2.5 µg之醣。在一實施例中，各劑量將包含約3.0 µg之醣。在一實施例中，各劑量將包含約3.5 µg之醣。在一實施例中，各劑量將包含約4.0 µg醣。在一實施例中，各劑量將包含約4.4 µg之醣。在一實施例中，各劑量將包含約5.0 µg之醣。在一實施例中，各劑量將包含約5.5 µg之醣。在一實施例中，各劑量將包含約6.0 µg之醣。
一般而言，各劑量將包含0.1 µg至100 µg之針對給定細菌或血清型之醣。在一實施例中，各劑量將包含0.1 µg至100 µg之針對給定細菌或血清型之醣。在一較佳實施例中，各劑量將包含0.5 µg至20 µg。在一較佳實施例中，各劑量將包含1.0 µg至10 µg。在一甚至更佳實施例中，各劑量將包含2.0 µg至5.0 µg之針對給定細菌或血清型之醣。考慮以上範圍中之任一者內之任何全數整數作為本發明之一實施例。
在一實施例中，各劑量將包含約0.5 µg之用於各特定醣結合物之醣。在一實施例中，各劑量將包含約0.55 µg之用於各特定醣結合物之醣。在一實施例中，各劑量將包含約0.75 µg之用於各特定醣結合物之醣。在一實施例中，各劑量將包含約1.0 µg之用於各特定醣結合物之醣。在一實施例中，各劑量將包含約1.1 µg之用於各特定醣結合物之醣。在一實施例中，各劑量將包含約1.5 µg之用於各特定醣結合物之醣。在一實施例中，各劑量將包含約2.0 µg之用於各特定醣結合物之醣。在一實施例中，各劑量將包含約2.2 µg之用於各特定醣結合物之醣。在一實施例中，各劑量將包含約2.5 µg之用於各特定醣結合物之醣。在一實施例中，各劑量將包含約3.0 µg之用於各特定醣結合物之醣。在一實施例中，各劑量將包含約3.5 µg之用於各特定醣結合物之醣。在一實施例中，各劑量將包含約4.0 µg之用於各特定醣結合物之醣。在一實施例中，各劑量將包含約4.4 µg之用於各特定醣結合物之醣。在一實施例中，各劑量將包含約5.0 µg之用於各特定醣結合物之醣。在一實施例中，各劑量將包含約5.5 µg之用於各特定醣結合物之醣。在一實施例中，各劑量將包含約6.0 µg之用於各特定醣結合物之醣。
2.3 載體量一般而言，各劑量將包含10 µg至150 µg之載體蛋白，尤其15 µg至100 µg之載體蛋白，更尤其25 µg至75 µg之載體蛋白，且甚至更尤其40 µg至60 µg之載體蛋白。在一實施例中，該載體蛋白為CRM
197。在一實施例中，該載體蛋白為SCP。
在一實施例中，各劑量將包含約10 µg、約15 µg、約20 µg、約25 µg、約26 µg、約27 µg、約28 µg、約29 µg、約30 µg、約31 µg、約32 µg、約33 µg、約34 µg、約35 µg、約36 µg、約37 µg、約38 µg、約39 µg、約40 µg、約41 µg、約42 µg、約43 µg、約44 µg、約45 µg、約46 µg、約47 µg、約48 µg、約49 µg、約50 µg、約51 µg、約52 µg、約53 µg、約54 µg、約55 µg、約56 µg、約57 µg、約58 µg、約59 µg、約60 µg、約61 µg、約62 µg、約63 µg、約64 µg、約65 µg、約66 µg、約67 µg、約68 µg、約69 µg、約70 µg、約71 µg、約72 µg、約73 µg、約74 µg或約75 µg之載體蛋白。
在一實施例中，各劑量將包含約25 µg、約26 µg、約27 µg、約28 µg、約29 µg、約30 µg、約31 µg、約32 µg、約33 µg、約34 µg、約35 µg、約36 µg、約37 µg、約38 µg、約39 µg、約40 µg、約41 µg、約42 µg、約43 µg、約44 µg、約45 µg、約46 µg、約47 µg、約48 µg、約49 µg、約50 µg、約51 µg、約52 µg、約53 µg、約54 µg、約55 µg、約56 µg、約57 µg、約58 µg、約59 µg、約60 µg、約61 µg、約62 µg、約63 µg、約64 µg、約65 µg、約66 µg、約67 µg、約68 µg、約69 µg、約70 µg、約71 µg、約72 µg、約73 µg、約74 µg或約75 µg之載體蛋白。
在一實施例中，各劑量將包含約30 µg之載體蛋白。在一實施例中，各劑量將包含約31 µg之載體蛋白。在一實施例中，各劑量將包含約32 µg之載體蛋白。在一實施例中，各劑量將包含約33 µg之載體蛋白。在一實施例中，各劑量將包含約34 µg之載體蛋白。在一實施例中，各劑量將包含約45 µg之載體蛋白。
在一實施例中，各劑量將包含約40 µg之載體蛋白。在一實施例中，各劑量將包含約41 µg之載體蛋白。在一實施例中，各劑量將包含約42 µg之載體蛋白。在一實施例中，各劑量將包含約43 µg之載體蛋白。在一實施例中，各劑量將包含約44 µg之載體蛋白。在一實施例中，各劑量將包含約45 µg之載體蛋白。
在一實施例中，各劑量將包含約48 µg之載體蛋白。在一實施例中，各劑量將包含約49 µg之載體蛋白。在一實施例中，各劑量將包含約50 µg之載體蛋白。在一實施例中，各劑量將包含約51 µg之載體蛋白。在一實施例中，各劑量將包含約52 µg之載體蛋白。在一實施例中，各劑量將包含約53 µg之載體蛋白。
在一實施例中，該載體蛋白為CRM
197。
在一實施例中，該載體蛋白為SCP。
2.4 其他抗原本發明之免疫原組合物包含結合之醣抗原(醣結合物)。其亦可進一步包含來自其他病原體，尤其來自細菌及/或病毒之抗原。較佳的其他抗原係選自：白喉類毒素(D)、破傷風類毒素(T)、百日咳抗原(P) (其通常為非細胞型(Pa))、B型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)、A型肝炎病毒(HAV)抗原、結合之流感嗜血桿菌b型莢膜醣(Hib)、不活化之脊髓灰白質炎病毒疫苗(IPV)。
在一實施例中，本發明之免疫原組合物包含D-T-Pa。在一實施例中，本發明之免疫原組合物包含D-T-Pa-Hib、D-T-Pa-IPV或D-T-Pa-HBsAg。在一實施例中，本發明之免疫原組合物包含D-T-Pa-HBsAg-IPV或D-T-Pa-HBsAg-Hib。在一實施例中，本發明之免疫原組合物包含D-T-Pa-HBsAg-IPV-Hib。
百日咳抗原：百日咳博德特氏菌(
Bordetella pertussis)引起百日咳。疫苗中之百日咳抗原為細胞型(全細胞，呈不活化之百日咳博德特氏菌細胞形式)或非細胞型的。細胞型百日咳抗原之製備已有完備記載(例如其可藉由使百日咳博德特氏菌之I期培養物熱不活化獲得)。然而，較佳地，本發明使用非細胞型抗原。在使用非細胞型抗原之情況下，較佳使用以下抗原中之一者、兩者或(較佳地)三者：(1)解毒之百日病毒素(百日咳類毒素或PT)；(2)絲狀血球凝集素(FHA)；(3)百日咳桿菌黏附素(pertactin) (亦稱為69千道爾頓外膜蛋白)。FHA及百日咳桿菌黏附素在根據本發明使用之前可用甲醛處理。PT較佳藉由用甲醛及/或戊二醛處理來解毒。非細胞型百日咳抗原較佳吸附至一或多種鋁鹽佐劑上。作為替代方案，其可以未吸附狀態添加。在添加百日咳桿菌黏附素之情況下，其較佳已吸附至氫氧化鋁佐劑上。PT及FHA可吸附至氫氧化鋁佐劑或磷酸鋁上。最佳地，PT、FHA及百日咳桿菌黏附素皆吸附至氫氧化鋁。
不活化之脊髓灰白質炎病毒疫苗：脊髓灰白質炎病毒引起脊髓灰白質炎。本發明之較佳實施例使用IPV，而非使用口服脊髓灰白質炎病毒疫苗。在向患者投與之前，脊髓灰白質炎病毒必須為不活化的，且此可藉由用甲醛處理來達成。脊髓灰白質炎可由三種類型之脊髓灰白質炎病毒中之一者引起。三種類型類似且引起相同症狀，但其在抗原上不同且一種類型之感染不會避免其他類型之感染。因此，較佳使用本發明中之三種脊髓灰白質炎病毒抗原：1型脊髓灰白質炎病毒(例如Mahoney病毒株)、2型脊髓灰白質炎病毒(例如MEF-1病毒株)及3型脊髓灰白質炎病毒(例如Saukett病毒株)。病毒較佳分別生長、純化及不活化，且接著合併，得到供本發明使用之主體三價混合物。
白喉類毒素：白喉棒狀桿菌引起白喉。可對白喉毒素進行處理(例如使用福馬林或甲醛)以去除毒性。同時保留在注射之後誘導特異性抗毒素抗體之能力。此等白喉類毒素用於白喉疫苗中。較佳白喉類毒素為藉由甲醛處理製備之彼等。白喉類毒素可藉由使白喉棒狀桿菌在生長培養基中生長，隨後甲醛處理、超濾及沈澱來獲得。接著可藉由包含無菌過濾及/或透析之方法處理類毒素化物質。白喉類毒素較佳吸附至氫氧化鋁佐劑上。
破傷風類毒素：破傷風芽孢梭菌(
Clostridium tetani)引起破傷風。可對破傷風毒素進行處理以得到保護性類毒素。類毒素用於破傷風疫苗中。較佳破傷風類毒素為藉由甲醛處理製備之彼等。破傷風類毒素可藉由使破傷風芽孢梭菌在生長培養基中生長，隨後甲醛處理、超濾及沈澱來獲得。接著可藉由包含無菌過濾及/或透析之方法處理物質。
A型肝炎病毒抗原：A型肝炎病毒(HAV)為引起病毒性肝炎之已知因子中之一者。較佳HAV組分係基於不活化病毒，且不活化可藉由福馬林處理來達成。
B型肝炎病毒(HBV)為引起病毒性肝炎之已知因子中之一者。蛋白殼之主要組分為被稱為HBV表面抗原或更常被稱為HBsAg之蛋白質，其通常為具有約24 kDa之分子量的226胺基酸多肽。所有現有B型肝炎疫苗均含有HBsAg，且當此抗原向正常疫苗接種者投與時，其刺激避免HBV感染之抗HBsAg抗體之產生。
對於疫苗製造，HBsAg以兩種方式製得：純化來自慢性B型肝炎攜帶者之血漿的呈微粒形式之抗原，或藉由重組DNA方法表現蛋白質(例如，在酵母細胞中重組表現)。不同於天然HBsAg (亦即，如在血漿純化產物中)，酵母表現之HBsAg通常未經糖基化，且此為用於本發明之最佳HBsAg形式。
結合之流感嗜血桿菌b型抗原：流感嗜血桿菌b型(Hib)引起細菌性腦膜炎。Hib疫苗通常係基於莢膜醣抗原，其製備已有完備記載。Hib醣可與載體蛋白結合以增強其免疫原性，尤其在兒童中之免疫原性。典型載體蛋白為破傷風類毒素、白喉類毒素、CRM
197、流感嗜血桿菌蛋白D及來自血清群B腦膜炎雙球菌之外膜蛋白複合物。結合物之醣部分可包含由Hib細菌製備之全長磷酸多聚核糖基核糖醇(PRP)及/或全長PRP之片段。Hib結合物可或可不吸附至鋁鹽佐劑。
2.5 佐劑在一些實施例中，本文所揭示之免疫原組合物可進一步包含至少一種、兩種或三種佐劑。在一些實施例中，本文所揭示之免疫原組合物可進一步包含至少一種佐劑。在一些實施例中，本文所揭示之免疫原組合物可進一步包含一種佐劑。在一些實施例中，本文所揭示之免疫原組合物可進一步包含兩種佐劑。術語「佐劑」係指增強針對抗原之免疫反應的化合物或混合物。抗原可主要用作遞送系統，主要用作免疫調節劑，或具有兩者之強力特徵。
適合的佐劑包括適用於哺乳動物(包括人類)之彼等佐劑。已知可在人類中使用之適合的遞送系統類型佐劑之實例包括(但不限於)明礬(例如磷酸鋁、硫酸鋁或氫氧化鋁)、磷酸鈣、脂質體、水包油乳液(諸如MF59) (4.3% w/v角鯊烯、0.5% w/v聚山梨醇酯80 (Tween 80)、0.5% w/v脫水山梨糖醇三油酸酯(Span 85))、油包水乳液(諸如孟塔納(Montanide))及聚(D,L-乳酸交酯-共聚-乙交酯) (PLG)微米粒子或奈米粒子。
在一實施例中，本文所揭示之免疫原組合物包含作為佐劑之鋁鹽(明礬) (例如磷酸鋁、硫酸鋁或氫氧化鋁)。在一較佳實施例中，本文所揭示之免疫原組合物包含作為佐劑之磷酸鋁或氫氧化鋁。在一較佳實施例中，本文所揭示之免疫原組合物包含作為佐劑之磷酸鋁。
增強如本文所揭示之免疫原組合物之有效性的其他例示性佐劑包括(但不限於)：(1)水包油乳液調配物(具有或不具有其他特定免疫刺激劑，諸如胞壁醯基肽(參見下文)或細菌細胞壁組分)，諸如(a) SAF，其含有微流化成次微米級乳液或渦旋以產生較大粒徑乳液之10%角鯊烯、0.4% Tween 80、5%普洛尼克嵌段聚合物L121及thr-MDP，及(b) RIBI™佐劑系統(RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT)，其含有2%角鯊烯、0.2% Tween 80及一或多種細菌細胞壁組分(諸如單磷醯基脂質A (MPL)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)及細胞壁骨架(CWS)，較佳地MPL+CWS (DETOX™)；(2)可使用皂素佐劑，諸如QS21、STIMULON™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA)、ABISCO® (Isconova, Sweden)或ISCOMATRIX® (Commonwealth Serum Laboratories, Australia)，或自其產生之粒子，諸如ISCOMs (免疫刺激複合物)，該ISCOMS可不含額外清潔劑(例如WO 00/07621)；(3)弗氏完全佐劑(CFA)及弗氏不完全佐劑(IFA)；(4)細胞介素，諸如介白素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12 (例如WO 99/44636))、干擾素(例如γ干擾素)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(5)單磷醯基脂質A (MPL)或3-O-去醯化MPL (3dMPL) (參見例如GB-2220221、EP0689454)，視情況在與肺炎鏈球菌醣一起使用時實質上不存在明礬(參見例如WO 00/56358)；(6) 3dMPL與例如QS21及/或水包油乳液之組合(參見例如EP0835318、EP0735898、EP0761231)；(7)聚氧化乙烯醚或聚氧化乙烯酯(參見例如WO 99/52549)；(8)與辛苯聚醇組合之聚氧化乙烯脫水山梨糖醇酯界面活性劑(例如WO 01/21207)或與至少一種額外非離子界面活性劑(諸如辛苯聚醇)組合之聚氧化乙烯烷基醚或酯界面活性劑(例如WO 01/21152)；(9)皂素及免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸) (例如WO 00/62800)；(10)免疫刺激劑及金屬鹽粒子(參見例如WO 00/23105)；(11)皂素及水包油乳液(例如WO 99/11241)；(12)皂素(例如QS21) + 3dMPL + IM2 (視情況+固醇) (例如WO 98/57659)；(13)充當增強組合物之功效之免疫刺激劑的其他物質。胞壁醯基肽包括N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-25乙醯基-去甲胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(nor-MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二棕櫚醯基-sn-丙三氧基-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺MTP-PE)等。
在本發明之一實施例中，如本文所揭示之免疫原組合物包含作為佐劑之CpG寡核苷酸。如本文中所使用之CpG寡核苷酸係指免疫刺激性CpG寡去氧核苷酸(CpG ODN)，且因此除非另外指示，否則此等術語可互換使用。免疫刺激性CpG寡去氧核苷酸含有一或多個免疫刺激性CpG模體，其為未甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸，視情況在某些較佳的鹼基背景內。CpG免疫刺激性模體之甲基化狀態通常係指二核苷酸中之胞嘧啶殘基。含有至少一個未甲基化CpG二核苷酸之免疫刺激性寡核苷酸為含有藉由磷酸酯鍵與3'鳥嘌呤連接之5'未甲基化胞嘧啶且經由與鐸樣受體9 (TLR-9)結合而活化免疫系統的寡核苷酸。在另一實施例中，免疫刺激性寡核苷酸可含有一或多個甲基化CpG二核苷酸，其將經由TLR9活化免疫系統但不如CpG模體之未甲基化一樣強烈。CpG免疫刺激性寡核苷酸可包含一或多個回文序列，其亦可涵蓋CpG二核苷酸。CpG寡核苷酸已在多個發佈專利、公開專利申請案及其他公開案中描述，包括美國專利第6,194,388號、第6,207,646號、第6,214,806號、第6,218,371號、第6,239,116號；及第6,339,068號。在本發明之一實施例中，如本文所揭示之免疫原組合物包含WO 2010/125480之第3頁第22行至第12頁第36行所描述之CpG寡核苷酸中之任一者。
已鑑別出不同類別之CpG免疫刺激性寡核苷酸。此等被稱為A、B、C及P類，且更詳細地描述於WO 2010/125480之第3頁第22行至第12頁第36行。本發明之方法涵蓋此等不同類別之CpG免疫刺激性寡核苷酸之用途。
在本發明之一實施例中，如本文所揭示之免疫原組合物包含A類CpG寡核苷酸。較佳地，本發明之「A類」CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5' GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3' (SEQ ID NO: 1)。A類寡核苷酸之一些非限制性實例包括：5' G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G 3' (SEQ ID NO: 2)；其中「*」係指硫代磷酸酯鍵，且「_」係指磷酸二酯鍵。
在本發明之一實施例中，如本文所揭示之免疫原組合物包含B類CpG寡核苷酸。在一個實施例中，用於本發明中之CpG寡核苷酸為至少由下式表示之B類CpG寡核苷酸：5' X
1X
2CGX
3X
43'，其中X1、X2、X3及X4為核苷酸。在一個實施例中，X
2為腺嘌呤、鳥嘌呤或胸腺嘧啶。在另一實施例中，X
3為胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶。
本發明之B類CpG寡核苷酸序列為上文大致描述以及以下文獻中所揭示之彼等：WO 96/02555、WO 98/18810及美國專利第6,194,388號、第6,207,646號、第6,214,806號、第6,218,371號、第6,239,116號及第6,339,068號。例示性序列包括(但不限於)此等後面申請案及專利中所揭示之彼等。
在一實施例中，本發明之「B類」CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：
5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3' (SEQ ID NO: 3)，或
5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3' (SEQ ID NO: 4)，或
5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 5)，或
5' TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 6)，或
5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3' (SEQ ID NO: 7)。
在此等序列中之任一者中，所有鍵聯可皆為硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，在此等序列中之任一者中，鍵聯中之一或多者可為磷酸二酯，較佳在CpG模體之「C」與「G」之間，產生半軟的CpG寡核苷酸。在此等序列中之任一者中，乙基-尿苷或鹵素可取代5' T；鹵素取代之實例包括(但不限於)溴-尿苷或碘-尿苷取代。
B類寡核苷酸之一些非限制性實例包括：
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO: 8)，或
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO: 9)，或
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3' (SEQ ID NO: 10)，或
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3' (SEQ ID NO: 11)，或
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A 3' (SEQ ID NO: 12)。
其中「*」係指硫代磷酸酯鍵。
在本發明之一實施例中，如本文所揭示之免疫原組合物包含C類CpG寡核苷酸。在一實施例中，本發明之「C類」CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：
5' TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 13)，或
5' TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 14)，或
5' TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 15)，或
5' TCGGACGTTCGGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 16)，或
5' TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 17)，或
5' TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 18)，或
5' TCGACGTTCGGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 19)，或
5' TCGCGTCGTTCGGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 20)，或
5' TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 21)，或
5' TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 22)，或
5' TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 3' (SEQ ID NO: 23)，或
5' TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG 3' (SEQ ID NO: 24)，或
5' TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3' (SEQ ID NO: 25)。
在此等序列中之任一者中，所有鍵聯可皆為硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，在此等序列中之任一者中，鍵聯中之一或多者可為磷酸二酯，較佳在CpG模體之「C」與「G」之間，產生半軟的CpG寡核苷酸。
C類寡核苷酸之一些非限制性實例包括：
5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 26)，或
5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 27)，或
5' T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 28)，或
5' T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 29)，或
5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 30)，或
5' T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 31)，或
5' T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 32)，或
5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 33)，或
5' T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 34)，或
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 35)，或
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 36)，或
5' T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C_G*T*G*C *C*G 3' (SEQ ID NO: 37)，或
5' T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3' (SEQ ID NO: 38)
其中「*」係指硫代磷酸酯鍵，且「_」係指磷酸二酯鍵。
在此等序列中之任一者中，乙基-尿苷或鹵素可取代5' T；鹵素取代之實例包括(但不限於)溴-尿苷或碘-尿苷取代。
在本發明之一實施例中，如本文所揭示之免疫原組合物包含P類CpG寡核苷酸。在一實施例中，用於本發明中之CpG寡核苷酸為P類CpG寡核苷酸，其含有5' TLR活化域及至少兩個回文區域，一個回文區域為至少6個核苷酸長之5'回文區域且其直接或經由間隔子連接至至少8個核苷酸長之3'回文區域，其中寡核苷酸包括至少一個YpR二核苷酸。在一實施例中，該寡核苷酸不為T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 27)。在一個實施例中，P類CpG寡核苷酸包括至少一個未甲基化CpG二核苷酸。在另一實施例中，TLR活化域為TCG、TTCG、TTTCG、TYpR、TTYpR、TTTYpR、UCG、UUCG、UUUCG、TTT或TTTT。在又另一實施例中，TLR活化域在5'回文區域內。在另一實施例中，TLR活化域緊鄰5'回文區域之5'。在一實施例中，本發明之「P類」CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5' TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 39)。
在該等序列中，所有鍵聯可皆為硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，鍵聯中之一或多者可為磷酸二酯，較佳在CpG模體之「C」與「G」之間，產生半軟的CpG寡核苷酸。在此等序列中之任一者中，乙基-尿苷或鹵素可取代5' T；鹵素取代之實例包括(但不限於)溴-尿苷或碘-尿苷取代。
P類寡核苷酸之非限制性實例包括：
5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 40)
其中「*」係指硫代磷酸酯鍵，且「_」係指磷酸二酯鍵。
在一個實施例中，寡核苷酸包括至少一個硫代磷酸酯鍵聯。在另一實施例中，寡核苷酸之所有核苷酸間鍵聯皆為硫代磷酸酯鍵聯。在另一實施例中，寡核苷酸包括至少一個磷酸二酯樣鍵聯。在另一實施例中，磷酸二酯樣鍵聯為磷酸二酯鍵聯。在另一實施例中，親脂性基團與寡核苷酸結合。在一個實施例中，親脂性基團為膽固醇。
在一實施例中，本文所揭示之CpG寡核苷酸之所有核苷酸間鍵聯為磷酸二酯鍵(「軟」寡核苷酸，如WO 2007/026190中所描述)。在另一實施例中，本發明之CpG寡核苷酸抗降解(例如為穩定的)。「穩定寡核苷酸」係指相對抗活體內降解(例如經由核酸外切酶或核酸內切酶之活體內降解)的寡核苷酸。核酸穩定性可經由主鏈修飾實現。具有硫代磷酸酯鍵聯之寡核苷酸提供最大活性且防止寡核苷酸由細胞內核酸外切酶及核酸內切酶降解。
免疫刺激性寡核苷酸可具有嵌合主鏈，其具有磷酸二酯鍵聯與硫代磷酸酯鍵聯之組合。出於本發明之目的，嵌合主鏈係指部分穩定主鏈，其中至少一個核苷酸間鍵聯為磷酸二酯鍵聯或磷酸二酯樣鍵聯，且其中至少一個其他核苷酸間鍵聯為穩定核苷酸間鍵聯，其中至少一個磷酸二酯鍵聯或磷酸二酯樣鍵聯與至少一個穩定鍵聯不同。當磷酸二酯鍵聯較佳位於CpG模體內時，此類分子被稱為「半軟的」，如WO 2007/026190中所描述。
其他經修飾寡核苷酸包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯及/或對乙氧基鍵聯之組合。
混合主鏈修飾之ODN可如WO 2007/026190中所描述合成。
CpG寡核苷酸之大小(亦即，沿寡核苷酸之長度的核苷酸殘基數目)亦可促成寡核苷酸之刺激性活性。為了促進至細胞中之吸收，本發明之CpG寡核苷酸較佳具有6個核苷酸殘基之最小長度。若存在足夠的免疫刺激性模體，則大於6個核苷酸之任何大小(甚至許多kb長)之寡核苷酸均能夠誘導免疫反應，因為較大寡核苷酸會在細胞內部降解。在某些實施例中，CpG寡核苷酸為6至100個核苷酸長，較佳8至30個核苷酸長。在重要實施例中，本發明之核酸及寡核苷酸不為質體或表現載體。
在一實施例中，本文所揭示之CpG寡核苷酸包含取代或修飾，諸如在如WO 2007/026190之第134至147段所描述的鹼基及/或糖之取代或修飾。
在一實施例中，本發明之CpG寡核苷酸經化學修飾。化學修飾之實例為技術人員已知的，且描述於例如Uhlmann等人(1990) Chem. Rev. 90:543；S. Agrawal編, Humana Press, Totowa, USA 1993；Crooke等人(1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129；及Hunziker等人(1995) Mod. Synth. Methods 7:331-417中。根據本發明之寡核苷酸可具有一或多個修飾，其中與由天然DNA或RNA構成之具有相同序列之寡核苷酸相比，各修飾位於特定磷酸二酯核苷間橋處及/或特定β-D-核糖單元處及/或特定天然核苷鹼基位置處。
在本發明之一些實施例中，含CpG之核酸可根據熟習此項技術者已知之方法簡單地與免疫原性載體混合(參見例如WO 03/024480)。
在本發明之一特定實施例中，本文所揭示之免疫原組合物中之任一者包含2 μg至100 mg之CpG寡核苷酸。在本發明之一特定實施例中，本發明之免疫原組合物包含0.1 mg至50 mg之CpG寡核苷酸，較佳0.2 mg至10 mg之CpG寡核苷酸，更佳0.3 mg至5 mg之CpG寡核苷酸。在本發明之一特定實施例中，本發明之免疫原組合物包含0.3 mg至5 mg之CpG寡核苷酸。甚至較佳地，本發明之免疫原組合物可包含0.5至2 mg之CpG寡核苷酸。最佳地，本發明之免疫原組合物可包含0.75至1.5 mg之CpG寡核苷酸。在一較佳實施例中，本文所揭示之免疫原組合物中之任一者可包含約1 mg之CpG寡核苷酸。
3 調配物本發明之免疫原組合物可調配成液體形式(亦即溶液或懸浮液)或凍乾形式。在一實施例中，本發明之免疫原組合物調配成液體形式。在一實施例中，本發明之免疫原組合物調配成凍乾形式。液體調配物可有利地自其封裝形式直接投與，且因此對於注射而言為理想的，其無需如本發明之凍乾組合物那般在水性介質中復原。
本發明之免疫原組合物之調配可使用此項技術中公認的方法來實現。舉例而言，可將個別多醣及/或結合物與生理學上可接受之媒劑一起調配以製備組合物。此類媒劑之實例包括(但不限於)水、緩衝鹽水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)及右旋糖溶液。
本發明提供一種免疫原組合物，其包含本文所揭示之醣結合物之任何組合及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。
在一實施例中，本發明之免疫原組合物呈液體形式，較佳地呈水性液體形式。
本發明之免疫原組合物可包含以下中之一或多者：緩衝液、鹽、二價陽離子、非離子清潔劑、低溫保護劑(諸如糖)及抗氧化劑(諸如游離基清除劑或螯合劑)或其任何多個組合。
在一實施例中，本發明之免疫原組合物包含緩衝液。在一實施例中，該緩衝液具有約3.5至約7.5之pKa。在一些實施例中，緩衝液為磷酸鹽、琥珀酸鹽、組胺酸或檸檬酸鹽。在一些實施例中，緩衝液為琥珀酸鹽。在一些實施例中，緩衝液為組胺酸。在某些實施例中，緩衝液為1 mM至10 mM之最終濃度之琥珀酸鹽。在一個特定實施例中，丁二酸鹽緩衝液之最終濃度為約5 mM。
在一實施例中，本發明之免疫原組合物包含鹽。在一些實施例中，鹽係選自由以下組成之群：氯化鎂、氯化鉀、氯化鈉及其組合。在一個特定實施例中，鹽為氯化鈉。在一個特定實施例中，本發明之免疫原組合物包含150 mM之氯化鈉。
在一實施例中，本發明之免疫原組合物包含界面活性劑。在一實施例中，界面活性劑係選自由以下組成之群：聚山梨醇酯20 (TWEEN
TM20)、聚山梨醇酯40 (TWEEN
TM40)、聚山梨醇酯60 (TWEEN™60)、聚山梨醇酯65 (TWEEN™65)、聚山梨醇酯80 (TWEEN™80)、聚山梨醇酯85 (TWEEN™85)、TRITON™ N-101、TRITON™ X-100、辛苯聚醇40、壬苯醇醚-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸酯、聚氧化乙烯-660羥基硬脂酸酯(PEG-15、Solutol H 15)、聚氧化乙烯-35-蓖麻油酸酯(CREMOPHOR® EL)、大豆卵磷脂及泊洛沙姆(poloxamer)。
在一個特定實施例中，界面活性劑為聚山梨醇酯80。在一些該實施例中，調配物中之聚山梨醇酯80之最終濃度為至少0.0001%至10%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯80。在一些該等實施例中，調配物中之聚山梨醇酯80之最終濃度為至少0.001%至1%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯80。在一些該等實施例中，調配物中之聚山梨醇酯80之最終濃度為至少0.01%至1%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯80。在其他實施例中，調配物中之聚山梨醇酯80之最終濃度為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1% (w/w)聚山梨醇酯80。在另一實施例中，調配物中之聚山梨醇酯80之最終濃度為0.02% (w/w)聚山梨醇酯80。在另一實施例中，調配物中之聚山梨醇酯80之最終濃度為0.01% (w/w)聚山梨醇酯80。在另一實施例中，調配物中之聚山梨醇酯80之最終濃度為0.03% (w/w)聚山梨醇酯80。在另一實施例中，調配物中之聚山梨醇酯80之最終濃度為0.04% (w/w)聚山梨醇酯80。在另一實施例中，調配物中之聚山梨醇酯80之最終濃度為0.05% (w/w)聚山梨醇酯80。在另一實施例中，調配物中之聚山梨醇酯80之最終濃度為1% (w/w)聚山梨醇酯80。
在一個特定實施例中，界面活性劑為聚山梨醇酯20。在一些該實施例中，調配物中之聚山梨醇酯20之最終濃度為至少0.0001%至10%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯20。在一些該等實施例中，調配物中之聚山梨醇酯20之最終濃度為至少0.001%至1%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯20。在一些該等實施例中，調配物中之聚山梨醇酯20之最終濃度為至少0.01%至1%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯20。在其他實施例中，調配物中之聚山梨醇酯20之最終濃度為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1% (w/w)聚山梨醇酯20。在另一實施例中，調配物中之聚山梨醇酯20之最終濃度為0.02% (w/w)聚山梨醇酯20。在另一實施例中，調配物中之聚山梨醇酯20之最終濃度為0.01% (w/w)聚山梨醇酯20。在另一實施例中，調配物中之聚山梨醇酯20之最終濃度為0.03% (w/w)聚山梨醇酯20。在另一實施例中，調配物中之聚山梨醇酯20之最終濃度為0.04% (w/w)聚山梨醇酯80。在另一實施例中，調配物中之聚山梨醇酯20之最終濃度為0.05% (w/w)聚山梨醇酯20。在另一實施例中，調配物中之聚山梨醇酯20之最終濃度為1% (w/w)聚山梨醇酯20。
在一個特定實施例中，界面活性劑為聚山梨醇酯40。在一些該實施例中，調配物中之聚山梨醇酯40之最終濃度為至少0.0001%至10%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯40。在一些該等實施例中，調配物中之聚山梨醇酯40之最終濃度為至少0.001%至1%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯40。在一些該等實施例中，調配物中之聚山梨醇酯40之最終濃度為至少0.01%至1%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯40。在其他實施例中，調配物中之聚山梨醇酯40之最終濃度為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1% (w/w)聚山梨醇酯40。在另一實施例中，調配物中之聚山梨醇酯40之最終濃度為1% (w/w)聚山梨醇酯40。
在一個特定實施例中，界面活性劑為聚山梨醇酯60。在一些該實施例中，調配物中之聚山梨醇酯60之最終濃度為至少0.0001%至10%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯60。在一些該等實施例中，調配物中之聚山梨醇酯60之最終濃度為至少0.001%至1%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯60。在一些該等實施例中，調配物中之聚山梨醇酯60之最終濃度為至少0.01%至1%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯60。在其他實施例中，調配物中之聚山梨醇酯60之最終濃度為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1% (w/w)聚山梨醇酯60。在另一實施例中，調配物中之聚山梨醇酯60之最終濃度為1% (w/w)聚山梨醇酯60。
在一個特定實施例中，界面活性劑為聚山梨醇酯65。在一些該實施例中，調配物中之聚山梨醇酯65之最終濃度為至少0.0001%至10%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯65。在一些該等實施例中，調配物中之聚山梨醇酯65之最終濃度為至少0.001%至1%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯65。在一些該等實施例中，調配物中之聚山梨醇酯65之最終濃度為至少0.01%至1%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯65。在其他實施例中，調配物中之聚山梨醇酯65之最終濃度為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1% (w/w)聚山梨醇酯65。在另一實施例中，調配物中之聚山梨醇酯65之最終濃度為1% (w/w)聚山梨醇酯65。
在一個特定實施例中，界面活性劑為聚山梨醇酯85。在一些該實施例中，調配物中之聚山梨醇酯85之最終濃度為至少0.0001%至10%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯85。在一些該等實施例中，調配物中之聚山梨醇酯85之最終濃度為至少0.001%至1%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯85。在一些該等實施例中，調配物中之聚山梨醇酯85之最終濃度為至少0.01%至1%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯85。在其他實施例中，調配物中之聚山梨醇酯85之最終濃度為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1% (w/w)聚山梨醇酯85。在另一實施例中，調配物中之聚山梨醇酯85之最終濃度為1% (w/w)聚山梨醇酯85。
在某些實施例中，本發明之免疫原組合物具有5.5至7.5之pH，更佳5.6至7.0之pH，甚至更佳5.8至6.0之pH。
在一個實施例中，本發明提供一種填充有本文所揭示之免疫原組合物中之任一者的容器。在一個實施例中，容器係選自由以下組成之群：小瓶、注射器、燒瓶、醱酵器、生物反應器、袋子、廣口瓶、安瓿、藥筒及拋棄式筆。在某些實施例中，容器為矽化的。
在一實施例中，本發明之容器係由玻璃、金屬(例如鋼、不鏽鋼、鋁等)及/或聚合物(例如熱塑性塑膠、彈性體、熱塑性彈性體)製成。在一實施例中，本發明之容器係由玻璃製成。
在一個實施例中，本發明提供一種填充有本文所揭示之免疫原組合物中之任一者的注射器。在某些實施例中，注射器為矽化的及/或係由玻璃製成。
用於注射之本發明之免疫原組合物的典型劑量具有0.1 mL至2 mL之體積。在一實施例中，用於注射之本發明之免疫原組合物具有0.2 mL至1 mL之體積，甚至更佳約0.5 mL之體積。
4 本發明之醣結合物及免疫原組合物之用途本文所揭示之醣結合物可用作抗原。舉例而言，其可為疫苗之一部分。
因此，在一實施例中，本發明之免疫原組合物適用作藥劑。
在一實施例中，本發明之免疫原組合物適用作疫苗。
因此，在一實施例中，本文所描述之免疫原組合物適用於在個體中產生免疫反應。在一個態樣中，個體為哺乳動物，諸如人類、非人類靈長類動物、貓、綿羊、豬、馬、牛科動物或狗。在一個態樣中，個體為人類。
本文所描述之免疫原組合物可用於預防、治療或改善個體之細菌感染、疾病或病狀之治療性或預防性方法中。因此，在一個態樣中，本發明提供一種預防、治療或改善個體之與細菌感染相關之感染、疾病或病狀的方法，其包含向該個體投與免疫有效量的本發明之免疫原組合物。
本發明之免疫原組合物可用於保護或治療易受細菌感染影響之人類，其係藉助於經由全身或黏膜途徑來投與該免疫原組合物。在一實施例中，本發明之免疫原組合物藉由肌肉內、腹膜內、皮內或皮下途徑投與。在一實施例中，本發明之免疫原組合物藉由肌肉內、腹膜內、皮內或皮下注射投與。在一實施例中，本發明之免疫原組合物藉由肌肉內或皮下注射投與。在一實施例中，本發明之免疫原組合物藉由肌肉內注射投與。在一實施例中，本發明之免疫原組合物藉由皮下注射投與。
5 待用本發明之免疫原組合物治療的個體如本文所揭示，本文所描述之免疫原組合物可用於預防、治療或改善個體之細菌感染、疾病或病狀之各種治療性或預防性方法中。
在一較佳實施例中，該個體為人類。在一個最佳實施例中，該個體為新生兒(亦即低於三月齡)、嬰兒(亦即年齡在3個月至一歲)或幼兒(亦即一歲至四歲)。
在一實施例中，本文所揭示之免疫原組合物適用作疫苗。
在此類實施例中，待進行疫苗接種之個體可小於1歲。舉例而言，待進行疫苗接種之個體可為約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11或約12個月齡。在一實施例中，待進行疫苗接種之個體為約2、約4或約6個月齡。在另一實施例中，待進行疫苗接種之個體小於2歲。舉例而言，待進行疫苗接種之個體可為約12個月齡至約15個月齡。在一些情況下，需要少至一次劑量之根據本發明之免疫原組合物，但在一些情況下，可給與第二次、第三次或第四次劑量(參見下方部分8)。
在本發明之一實施例中，待進行疫苗接種之個體為50歲或更大之人類成人，更佳55歲或更大之人類成人。在一實施例中，待進行疫苗接種之個體為65歲或更大、70歲或更大、75歲或更大、或80歲或更大之人類成人。
在一實施例中，待進行疫苗接種之個體為免疫功能不全個體，尤其人類。免疫功能不全個體一般定義為呈現建立對於感染劑刺激之正常體液或細胞防禦之能力減弱或降低的人。
在本發明之一實施例中，待進行疫苗接種之免疫功能不全個體罹患削弱免疫系統且引起不足以防止肺炎鏈球菌疾病或治療肺炎鏈球菌疾病之抗體反應的疾病或病狀。
在一實施例中，該疾病為原發性免疫缺乏病症。較佳地，該原發性免疫缺乏病症係選自由以下組成之群：組合性T細胞及B細胞免疫缺乏症、抗體缺乏症、界定明確的症候群、免疫調節異常疾病、吞噬細胞病症、先天性免疫缺乏症、自體發炎性病症及補體缺乏症。在一實施例中，該原發性免疫缺乏病症係選自WO 2010/125480之第24頁第11行至第25頁第19行所揭示之病症。
在本發明之一特定實施例中，待進行疫苗接種之免疫功能不全個體罹患選自由以下組成之群之疾病：HIV感染、後天免疫缺乏症候群(AIDS)、癌症、慢性心臟病或肺病、充血性心臟衰竭、糖尿病、慢性肝病、酒精中毒、肝硬化、脊髓液滲漏、心肌病、慢性支氣管炎、肺氣腫、慢性阻塞性肺病(COPD)、脾功能障礙(諸如鐮狀細胞疾病)、脾功能缺乏(無脾症)、血液惡性疾病、白血病、多發性骨髓瘤、霍奇金氏疾病(Hodgkin's disease)、淋巴瘤、腎衰竭、腎病症候群及哮喘。
在本發明之一實施例中，待進行疫苗接種之免疫功能不全個體罹患營養不良。
在本發明之一特定實施例中，待進行疫苗接種之免疫功能不全個體服用或進行減少身體對於感染之抵抗的藥物或治療。在一實施例中，該藥物係選自WO 2010/125480之第26頁第33行至第26頁第4行所揭示之藥物。
在本發明之一特定實施例中，待進行疫苗接種之免疫功能不全個體為吸菸者。
在本發明之一特定實施例中，待進行疫苗接種之免疫功能不全個體具有以下之白血球計數(白細胞計數)：低於5 × 10
9個細胞/公升、或低於4 × 10
9個細胞/公升、或低於3 × 10
9個細胞/公升、或低於2 × 10
9個細胞/公升、或低於1 × 10
9個細胞/公升、或低於0.5 × 10
9個細胞/公升、或低於0.3 × 10
9個細胞/公升、或低於0.1 × 10
9個細胞/公升。
白血球計數(白細胞計數)：血液中之白血球(WBC)之數目。WBC通常作為CBC (全血球計數)之一部分量測。白血球為血液中之感染對抗細胞，且不同於被稱為紅血球之紅色(含氧)血細胞。存在不同類型的白血球，包括嗜中性球(多形核白細胞；PMN)、帶狀細胞(略微不成熟的嗜中性球)、T型淋巴球(T細胞)、B型淋巴球(B細胞)、單核球、嗜酸性球及嗜鹼性球。所有類型之白血球均在白血球計數中反映。白血球計數之正常範圍通常在4,300與10,800個細胞/立方毫米血液之間。此亦可被稱作白細胞計數，且可以國際單位形式表述為4.3 - 10.8 × 10
9個細胞/公升。
在本發明之一特定實施例中，待進行疫苗接種之免疫功能不全個體罹患嗜中性球減少症。在本發明之一特定實施例中，待進行疫苗接種之免疫功能不全個體具有以下之嗜中性球計數：低於2 × 10
9個細胞/公升、或低於1 × 10
9個細胞/公升、或低於0.5 × 10
9個細胞/公升、或低於0.1 × 10
9個細胞/公升、或低於0.05 × 10
9個細胞/公升。
低白血球計數或「嗜中性球減少症」為特徵在於在循環血液中異常低含量之嗜中性球的病狀。嗜中性球為幫助預防及對抗感染之一種特定種類之白血球。癌症患者經歷嗜中性球減少症之最常見原因為作為化學療法之副作用。化學療法誘發的嗜中性球減少症增加患者之感染風險且干擾癌症治療。
在本發明之一特定實施例中，待進行疫苗接種之免疫功能不全個體具有低於500/mm
3之CD4+細胞計數、或低於300/mm
3之CD4+細胞計數、或低於200/mm
3之CD4+細胞計數、低於100/mm
3之CD4+細胞計數、低於75/mm
3之CD4+細胞計數、或低於50/mm
3之CD4+細胞計數。
CD4細胞測試通常報導為mm
3中之細胞數目。正常CD4計數在500與1,600之間，且CD8計數在375與1,100之間。CD4計數在患有HIV之人中大大降低。
在本發明之一實施例中，本文所揭示之免疫功能不全個體中之任一者為男性人類。在本發明之一實施例中，本文所揭示之免疫功能不全個體中之任一者為女性人類。
6 方案在一些情況下，需要少至一次劑量之根據本發明之免疫原組合物，但在一些情形下，諸如較高免疫缺乏之條件下，可給與第二次、第三次或第四次劑量。在初次疫苗接種之後，個體可接受經恰當間隔之一次或若干次增強免疫接種。
在一實施例中，根據本發明之免疫原組合物之疫苗接種之時程為單次劑量。在一特定實施例中，該單次劑量時程係針對至少2歲之健康人群。
在一實施例中，根據本發明之免疫原組合物之疫苗接種之時程為多劑量時程。在一特定實施例中，該多劑量時程由相隔約1個月至約2個月之時間間隔的一系列2次劑量組成。在一特定實施例中，該多劑量時程由相隔約1個月之時間間隔的一系列2次劑量組成，或由相隔約2個月之時間間隔的一系列2次劑量組成。
在另一實施例中，該多劑量時程由相隔約1個月至約2個月之時間間隔的一系列3次劑量組成。在另一實施例中，該多劑量時程由相隔約1個月之時間間隔的一系列3次劑量組成，或由相隔約2個月之時間間隔的一系列3次劑量組成。
在另一實施例中，該多劑量時程由以下組成：相隔約1個月至約2個月之時間間隔的一系列3次劑量，及隨後在第一次劑量之後約10個月至約13個月之第四次劑量。在另一實施例中，該多劑量時程由以下組成：相隔約1個月之時間間隔的一系列3次劑量及隨後在第一次劑量之後約10個月至約13個月之第四次劑量組成，或相隔約2個月之時間間隔的一系列3次劑量及隨後在第一次劑量之後約10個月至約13個月之第四次劑量。
在一實施例中，多劑量時程由以下組成：在一歲中之至少一次劑量(例如1、2或3次劑量)及隨後至少一次幼兒劑量。
在一實施例中，多劑量時程由以下組成：自2個月齡開始相隔約1個月至約2個月之時間間隔的一系列2或3次劑量(例如劑量之間相隔28至56天)，及隨後在12至18個月齡時之幼兒劑量。在一實施例中，該多劑量時程由以下組成：自2個月齡開始相隔約1個月至約2個月之時間間隔的一系列3次劑量(例如劑量之間相隔28至56天)，及隨後在12至15個月齡時之幼兒劑量。在另一實施例中，該多劑量時程由以下組成：自2個月齡開始相隔約2個月之時間間隔的一系列2次劑量，及隨後在12至18個月齡時之幼兒劑量。
在一實施例中，該多劑量時程由在2、4、6及12至15個月齡時之4次劑量系列疫苗組成。
在一實施例中，在第0天給與初次劑量，且以在約2至約24周範圍內之間隔，較佳地以4至8週之給藥間隔，給與一或多次加強劑量。
在一實施例中，在第0天給與初次劑量，且在約3個月後給與加強劑量。
7. 本發明亦提供如以下編號段落 1 至 96 中所定義之以下實施例1. 一種製備莢膜醣醣結合物之方法，其包含以下步驟：
(a)使經分離莢膜醣與碳酸衍生物及疊氮基連接子在非質子性溶劑中反應以產生經活化之疊氮基醣，
(b)使載體蛋白與帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應，其中NHS部分與胺基反應以形成醯胺鍵，從而獲得炔烴官能化之載體蛋白，
(c)藉由Cu
+1介導之疊氮-炔烴環加成反應使步驟(a)之經活化之疊氮基醣與步驟(b)之經活化之炔烴-載體蛋白發生反應以形成醣結合物。
2. 如段落1之方法，其中經分離醣在活化步驟(a)之前經尺寸設定。
3. 如段落2之方法，其中經分離莢膜醣之尺寸設定為200 kDa與800 kDa之間的重量平均分子量。
4. 如段落1至3中任一者之方法，該碳酸衍生物係選自由以下組成之群：1,1'-羰基二咪唑(CDI)、1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑) (CDT)、碳酸二琥珀醯亞胺酯(DSC)及氯甲酸N-羥基琥珀醯亞胺酯。
5. 如段落1至3中任一者之方法，其中該碳酸衍生物為1,1'-羰基二咪唑(CDI)。
6. 如段落1至3中任一者之方法，其中該碳酸衍生物為1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑) (CDT)。
7. 如段落1至6中任一者之方法，其中該疊氮基連接子為式(I)化合物，
其中X係選自由以下組成之群：CH
2(CH
2)
n、(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、NHCO(CH
2)
n、NHCO(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、OCH
2(CH
2)
n及O(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2；其中n係選自1至10且m係選自1至4。
8. 如段落1至6中任一者之方法，其中該疊氮基連接子為式(II)化合物，
9. 如段落1至8中任一者之方法，其中該帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑為帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及末端炔烴之試劑。
10. 如段落1至8中任一者之方法，其中該帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑為帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及環炔烴之試劑。
11. 如段落1至8中任一者之方法，其中該帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑為式(III)化合物，
其中X係選自由以下組成之群：CH
2O(CH
2)
nCH
2C=O及CH
2O(CH
2CH
2O)
m(CH
2)
nCH
2C=O，其中n係選自0至10且m係選自0至4。
12. 如段落1至8中任一者之方法，其中該帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑為式(IV)化合物：
13. 如段落1至12中任一者之方法，其中步驟a)包含使莢膜醣與碳酸衍生物在非質子性溶劑中反應，隨後使經碳酸衍生物活化之莢膜醣與疊氮基連接子在非質子性溶劑中反應，以產生經活化之疊氮基莢膜醣。
14. 如段落1至13中任一者之方法，其中在步驟a)處，經分離莢膜醣與該碳酸衍生物在非質子性溶劑中反應。
15. 如段落1至13中任一者之方法，其中在步驟a)處，經分離莢膜醣與碳酸衍生物在基本上由二甲亞碸(DMSO)組成之溶液中反應。
16. 如段落1至14中任一者之方法，其中在步驟a)處，經分離莢膜醣與CDI在包含0.1%至1% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。
17. 如段落1至14中任一者之方法，其中在步驟a)處，經分離莢膜醣與CDI在包含0.1%至1% (v/v)水之DMSO中反應。
18. 如段落1至17中任一者之方法，其中在步驟a)處，在碳酸衍生物活化之後添加水。
19. 如段落18之方法，其中添加水以使混合物中之總水含量達到約1%至約10% (v/v)之間。
20. 如段落1至19中任一者之方法，其中步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之醣與相對於經活化醣之醣重複單元的量在0.01至10莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
21. 如段落1至20中任一者之方法，其中步驟a)之後經活化醣之活化程度在0.5%至50%之間。
22. 如段落1至21中任一者之方法，其中步驟b)包含使載體蛋白與相對於載體上之離胺酸0.1至10莫耳當量之量的帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑反應。
23. 如段落1至22中任一者之方法，其中步驟b)之後經活化載體之活化程度在1與50之間。
24. 如段落1至23中任一者之方法，其中結合反應c)係在水性緩衝液中在作為催化劑之銅(I)存在下進行。
25. 如段落1至23中任一者之方法，其中結合反應c)係在水性緩衝液中在氧化劑及作為催化劑之銅(I)存在下進行。
26. 如段落1至23中任一者之方法，其中結合反應c)係在水性緩衝液中在作為催化劑之銅(I)及作為氧化劑之抗壞血酸鹽存在下進行，其中反應混合物進一步包含THPTA (參(3-羥丙基三唑基甲基)胺)及胺基胍。
27. 如段落1至26中任一者之方法，其中步驟c)處之經活化疊氮基醣與經活化炔烴-載體之初始輸入比率(重量/重量)在0.1與3之間。
28. 如段落1至27中任一者之方法，其中在步驟c)之後，該方法進一步包含用疊氮基封端劑對結合物中保留之未反應疊氮基進行封端的步驟。
29. 如段落28之方法，其中該疊氮基封端劑為式(V)化合物，
其中X為(CH
2)
n，其中n係選自1至15。
30. 如段落28之方法，其中該疊氮基封端劑為炔丙醇。
31. 如段落28至30中任一者之方法，其中未反應疊氮基之封端係用相對於經活化醣之醣重複單元的量在0.05至20莫耳當量之間的量的封端劑進行。
32. 如段落1至31中任一者之方法，其中在步驟c)之後，該方法進一步包含用炔烴基封端劑對結合物中保留之未反應炔烴基進行封端的步驟。
33. 如段落32之方法，其中該炔烴基封端劑為帶有疊氮基之試劑。
34. 如段落33之方法，其中該炔烴基封端劑為式(VI)化合物，
其中X為(CH
2)
n，其中n係選自1至15。
35. 如段落32之方法，其中該炔烴基封端劑為3-疊氮基-1-丙醇。
36. 如段落32至35中任一者之方法，其中未反應炔烴基之封端係用相對於經活化醣之醣重複單元的量在0.05至20莫耳當量之間的量的封端劑進行。
37. 如段落1至36中任一者之方法，其中該方法進一步包含在產生醣結合物之後對其進行純化的步驟。
38. 一種莢膜醣醣結合物，其係根據如段落1至37之方法中之任一者產生。
39. 一種莢膜醣醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之莢膜醣且具有通式(VII)：
，
其中X係選自由以下組成之群：CH
2(CH
2)
n'、(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、NHCO(CH
2)
n'、NHCO(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、OCH
2(CH
2)
n'及O(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2；其中n'係選自1至10且m係選自1至4，
且其中X'係選自由以下組成之群：CH
2O(CH
2)
n''CH
2C=O、CH
2O(CH
2CH
2O)
m'(CH
2)
n''CH
2C=O，其中n''係選自0至10且m'係選自0至4。
40. 一種莢膜醣醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之莢膜醣且具有通式(VII)，其中X為CH
2(CH
2)
n'，其中n'為2，且其中X'為CH
2O(CH
2)
n''CH
2C=O，其中n''為1。
41. 一種莢膜醣醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之莢膜醣且具有通式(VIII)，
。
42. 如段落38至41中任一者之莢膜醣醣結合物，其包含莢膜醣，其中該莢膜醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)在10 kDa與2,000 kDa之間。
43. 如段落38至41中任一者之莢膜醣醣結合物，其包含莢膜醣，其中該莢膜醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)在50 kDa與1,000 kDa之間。
44. 如段落38至41中任一者之莢膜醣醣結合物，其包含莢膜醣，其中該莢膜醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)在200 kDa與750 kDa之間。
45. 如段落38至44中任一者之莢膜醣醣結合物，其具有250 kDa與20,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
46. 如段落38至44中任一者之莢膜醣醣結合物，其具有500 kDa與5,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
47. 如段落38至44中任一段之莢膜醣醣結合物，其具有750 kDa與2,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
48. 如段落38至47中任一者之莢膜醣醣結合物，其中莢膜醣醣結合物之結合程度在2與15之間。
49. 如段落38至48中任一者之莢膜醣醣結合物，其中醣結合物中莢膜醣與載體蛋白之比率(w/w)在0.5與3.0之間。
50. 如段落38至49中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣醣結合物針對醣之每4個醣重複單元在載體蛋白與醣之間包含至少一個共價連接。
51. 如段落38至49中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣醣結合物針對醣之每25個醣重複單元在載體蛋白與醣之間包含至少一個共價連接。
52. 如段落38至49中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣醣結合物針對醣之每5至10個醣重複單元在載體蛋白與醣之間包含至少一個共價連接。
53. 如段落38至56中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該載體蛋白為CRM
197。
54. 如段落38至53中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該載體蛋白為SCP。
55. 如段落38至53中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該載體蛋白為酶促不活化的SCP。
56. 如段落38至53中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該載體蛋白為酶促不活化的來自GBS之SCP (SCPB)。
57. 如段落38至53中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該載體蛋白為SCPB之片段。
58. 如段落38至53中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該載體蛋白為SCP之片段，其包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域。
59. 如段落38至53中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該載體蛋白為酶促不活化的SCP之片段，其中該酶促不活化的SCP之片段包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域。
60. 如段落38至53中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該載體蛋白為酶促不活化的SCP之片段，其包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少一個胺基酸來實現，且其中該置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A組成之群，其中數目指示根據WO00/34487之SEQ ID NO: 1之編號的肽酶中之胺基酸殘基位置。
61. 如段落38至53中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該載體蛋白為酶促不活化的SCP之片段，其包含蛋白酶域、蛋白酶相關域(PA域)及三個纖維結合蛋白III型(Fn)域但不包含輸出信號前序列、後序列及細胞壁錨定域，其中該不活化係藉由置換野生型序列之至少兩個胺基酸來實現，其中該至少兩個胺基酸置換為D130A及S512A，其中數目指示根據WO00/34487之SEQ ID NO: 1之編號的肽酶中之胺基酸殘基位置。
62. 如段落38至53中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該載體蛋白為由與SEQ ID NO: 41具有至少95%一致性之多肽組成的酶促不活化的SCP之片段。
63. 如段落38至53中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該載體蛋白為由與SEQ ID NO: 42具有至少95%一致性之多肽組成的酶促不活化的SCP之片段。
64. 如段落38至53中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該載體蛋白為由SEQ ID NO: 41組成的酶促不活化的SCP之片段。
65. 如段落38至53中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該載體蛋白為由SEQ ID NO: 42組成的酶促不活化的SCP之片段。
66. 如段落38至53中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該載體蛋白為DT (白喉類毒素)。
67. 如段落38至53中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該載體蛋白為TT (破傷風類毒素)。
68. 如段落38至53中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該載體蛋白為PD (流感嗜血桿菌蛋白D)。
69. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自病原性細菌之莢膜醣。
70. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自病原性鏈球菌屬、病原性葡萄球菌屬、病原性腸球菌屬、病原性芽孢桿菌屬、病原性棒狀桿菌屬、病原性李氏菌屬、病原性丹毒桿菌屬、病原性芽孢梭菌屬、病原性嗜血桿菌屬、病原性奈瑟氏菌屬或病原性埃希氏菌屬之莢膜醣。
71. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自糞腸球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌或鏈球菌之莢膜醣。
72. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、無乳鏈球菌、C組及G組鏈球菌或大腸桿菌之莢膜醣。
73. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自腦膜炎奈瑟氏菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌或大腸桿菌之莢膜醣。
74. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自肺炎鏈球菌或無乳鏈球菌之莢膜醣。
75. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自肺炎鏈球菌之莢膜醣。
76. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自金黃色葡萄球菌之莢膜醣。
77. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自糞腸球菌之莢膜醣。
78. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自流感嗜血桿菌b型之莢膜醣。
79. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自腦膜炎奈瑟氏菌之莢膜醣。
80. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自大腸桿菌之莢膜醣。
81. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自糞腸球菌之莢膜醣。
82. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自無乳鏈球菌(B組鏈球菌(GBS))之莢膜醣。
83. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自GBS Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII或VIII型之莢膜醣。
84. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自選自由以下組成之群之肺炎鏈球菌血清型的莢膜醣：血清型1、2、4、5、6A、6B、6C、7C、7F、8、9V、9N、10A、10B、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24B、24F、27、29、31、33B、33F、34、35B、35F、38、72及73。
85. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型35B之莢膜醣。
86. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型29之莢膜醣。
87. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型15A之莢膜醣。
88. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型24F之莢膜醣。
89. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型23A之莢膜醣。
90. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型23B之莢膜醣。
91. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型6B之莢膜醣。
92. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型19A之莢膜醣。
93. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型19F之莢膜醣。
94. 如段落1至37中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或如段落38至68中任一者之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自肺炎鏈球菌血清型23F之莢膜醣。
95. 如段落1至94中任一者之製備莢膜醣醣結合物之方法或莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣不為來自肺炎鏈球菌血清型3之莢膜醣。
96. 一種免疫原組合物，其包含如段落38至95中任一者之莢膜醣醣結合物。
如本文所使用，術語「約」意謂在值之統計學上有意義的範圍內，諸如所陳述之濃度範圍、時間範圍、分子量、溫度或pH。此類範圍可在給定值或範圍之一數量級內，通常在20%內，更通常在10%內，且甚至更通常在5%內或在1%內。有時，此類範圍可能在用於量測及/或測定給定值或範圍之標準方法的典型實驗誤差內。術語「約」所涵蓋之容許偏差將取決於所研究之特定系統，且可由一般熟習此項技術者容易地理解。每當在本申請案中敍述一個範圍時，亦考慮該範圍內之每個數目作為本發明之一實施例。
本發明人預期，在各情況下，本文中之術語「包含(comprising)」、「包含(comprise)」及「包含(comprises)」視情況可分別替換為術語「基本上由…組成(consisting essentially of)」、「基本上由…組成(consist essentially of)」、「基本上由…組成(consists essentially of)」、「由…組成(consisting of)」、「由…組成(consist of)」及「由…組成(consists of)」。
「免疫原性量」、「免疫有效量」、「治療有效量」、「預防有效量」或「劑量」中之各者在本文中可互換使用，通常係指藉由熟習此項技術者已知之標準分析所量測，足以誘發免疫反應，亦即細胞(T細胞)或體液(B細胞或抗體)反應或兩種反應的抗原或免疫原組合物之量。
考慮本文件之範圍中之任一者內之任何全數整數作為本發明之一實施例。
在本專利說明書內引用之所有參考文獻或專利申請案均以引用的方式併入本文中。
在隨附實例中說明本發明。除非另外詳細描述，否則使用熟習此項技術者所熟知且常用的標準技術進行以下實例。實例為說明性的，而非限制本發明。
實例 實例 1 ： 使用點擊化學結合肺炎鏈球菌血清型 35B 莢膜多醣 ( 參見圖 3 )
1. 用疊氮基連接子活化血清型35B莢膜多醣
將血清型35B莢膜多醣(200 mg)與咪唑(600 mg)混合，且隨後冷凍並凍乾。
在凍乾3天之後，用無水DMSO (100 mL)復原凍乾之多醣。隨後使反應混合物升溫至45℃，且添加669 µL (2 MEq)之CDI (100 mg/mL於DMSO中)。將反應混合物在45℃下攪拌2小時。在將反應混合物冷卻至23℃之後，添加2 mL (2% v/v)之WFI以淬滅游離CDI，且在23℃下攪拌30分鐘。隨後，添加41 µL (2 MEq)之3-疊氮基-1-丙胺，且隨後在23℃下攪拌20小時。在反應20小時之後，用400 mL含10 mM磷酸鈉緩衝液(SPB)之鹽水(pH 7) (5×，v/v)將反應混合物稀釋至冷卻(5℃)。隨後藉由UF/DF使用10K MWCO PES膜(Millipore Pellicon 2 Mini)相對於含10 mM SPB之鹽水(pH 7) (30×，v/v)純化經稀釋之反應混合物。
2. 用炔烴NHS酯將CRM
197及SCP活化為炔烴-CRM
197CRM
197之活化：
向CRM
197溶液(1000 mg)中添加57 mL WFI及50 mL之0.5 M磷酸鈉緩衝液(pH 8.3)。在冷卻至8℃之後，向反應混合物中逐滴添加3.8 mL (相對於CRM
197上之離胺酸0.5 MEq)之3-炔丙氧基-丙酸NHS酯(POPS) (20 mg/mL於DMSO中)，將反應溫度維持在8 ± 3℃。將反應混合物在8℃下攪拌2小時之後，藉由UF/DF使用10K MWCO PES膜(Millipore Pellicon 2 Mini)相對於含100 mM磷酸鈉緩衝液之鹽水(pH 7.0) (30×透濾體積)進行純化。UF/DF之後，添加23 g (15% v/v)蔗糖。
SCP之活化：
SCP之活化類似於CRM
197之活化，不同之處在於調適連接子之量。連接子之最終量為相對於SCP 0.5 MEq (每SCP 0.092 w/w連接子)。
點擊結合：
經活化之疊氮基聚合物及炔烴CRM
197或SCP係藉由Cu+1介導之疊氮-炔烴環加成反應結合，該環加成反應被稱為「點擊反應」
在23℃下，向用疊氮基連接子活化之血清型35B莢膜多醣(參見上文步驟1)及炔烴-CRM
197或炔烴-SCP (參見上文步驟2) (於含100 mM磷酸鈉緩衝液(SPB)之鹽水(pH 7.0)中)之混合物中添加5 mM硫酸銅(CuSO
4) (1 mL)及25 mM參(3-羥丙基三唑基甲基)胺(THPTA) (1 mL)之混合物，且接著添加100 mM胺基胍(2 mL)及100 mM抗壞血酸鈉(2 mL)。將反應混合物在23℃下攪拌2小時之後，在23℃下用炔丙醇(1 MEq)對未反應疊氮基進行封端，持續2小時，且在第一次封端之後，在23℃下藉由3-疊氮基-1-丙醇(2 MEq)對未反應炔烴基進行封端，持續2小時。隨後，藉由UF/DF使用100K MWCO PES膜相對於含10 mM EDTA + 10 mM SPB之鹽水(pH 7.0) (30×透濾體積)且接著相對於含5 mM琥珀酸鹽之鹽水(pH 6.0) (30×透濾體積)來純化反應混合物。
表 1. 使用點擊化學獲得之 Pn35B 結合物之屬性
MW：分子量；SPR：醣與蛋白質之比率
| 結合物編號 | 1 | 2 | 3 | ||
| 多醣 | |||||
| 多醣MW，kDa | 816 | 252 | 252 | ||
| 經活化多醣之屬性 | |||||
| 活化程度(DoA) | ~18 | ~20 | ~26 | ||
| 經活化多醣MW，kDa | 898 | 326 | 306 | ||
| 經活化載體之屬性 | |||||
| 活化程度(DoA) | 15 | 17 | ~26 | ||
| 經活化載體MW，kDa | 58 | 58 | 101 | ||
| 結合物屬性 | |||||
| 載體蛋白 | CRM 197 | CRM 197 | SCP | ||
| 產率(%) | 56 | 79 | 73 | ||
| SPR比率 | 1.2 | 0.9 | 0.8 | ||
| 游離醣，% | 6 | ＜5 | ＜5 | ||
| 結合物MW，kDa | 1729 | 1093 | 939 | ||
點擊化學允許產生游離醣含量極低且產率良好之35B結合物。此外，其允許獲得包含接近天然多醣之多醣的35B結合物(與用過碘酸鹽活化相反，在活化步驟期間未觀測到尺寸減小，參見WO 2020/247299)。
實例 2 ： 使用點擊化學結合肺炎鏈球菌血清型 29 莢膜多醣 ( 參見圖 3)
1. 用疊氮基連接子活化血清型29莢膜多醣
將血清型29莢膜多醣(200 mg)與咪唑(600 mg)混合，且隨後冷凍並凍乾。
在凍乾3天之後，用無水DMSO (100 mL)復原凍乾之多醣。隨後使反應混合物升溫至45℃，且添加1050 µL (3 MEq)之CDI (100 mg/mL於DMSO中)。將反應混合物在45℃下攪拌(300 rpm) 3小時。在將反應混合物冷卻至23℃之後，添加2 mL (2% v/v)之WFI以淬滅游離CDI，且在23℃下攪拌30分鐘。隨後，添加42 µL (2 MEq)之3-疊氮基-1-丙胺，接著添加60 µL三乙胺，且隨後在23℃下攪拌20小時。在反應20小時之後，用400 mL含10 mM磷酸鈉緩衝液(SPB)之鹽水(pH 7) (5×，v/v)將反應混合物稀釋至冷卻(5℃)。隨後藉由UF/DF使用10K MWCO PES膜(Millipore Pellicon 2 Mini)相對於含10 mM SPB之鹽水(pH 7) (30×，v/v)純化經稀釋之反應混合物。
2. 用炔烴NHS酯將CRM
197活化為炔烴-CRM
197向CRM
197溶液(1000 mg)中添加57 mL WFI及50 mL之0.5 M磷酸鈉緩衝液(pH 8.3)。在冷卻至8℃之後，向反應混合物中逐滴添加3.8 mL (相對於CRM
197上之離胺酸0.5 MEq)之3-炔丙氧基-丙酸NHS酯(POPS) (20 mg/mL於DMSO中)，將反應溫度維持在8 ± 3℃。將反應混合物在8℃下攪拌2小時之後，藉由UF/DF使用10K MWCO PES膜(Millipore Pellicon 2 Mini)相對於含100 mM磷酸鈉緩衝液之鹽水(pH 7.0) (30×透濾體積)進行純化。UF/DF之後，添加23 g (15% v/v)蔗糖。
3. 點擊結合：經活化之疊氮基聚合物及炔烴CRM
197係藉由Cu+1介導之疊氮-炔烴環加成反應結合，該環加成反應被稱為「點擊反應」
在23℃下，向用疊氮基連接子活化之血清型29莢膜多醣(參見上文步驟1)及炔烴-CRM
197(參見上文步驟2) (於含100 mM磷酸鈉緩衝液(SPB)之鹽水(pH 7.0)中)之混合物中添加5 mM硫酸銅(CuSO
4) (1 mL)及25 mM參(3-羥丙基三唑基甲基)胺(THPTA) (1 mL)之混合物，且接著添加100 mM胺基胍(2 mL)及100 mM抗壞血酸鈉(2 mL)。將反應混合物在23℃下攪拌2小時之後，在23℃下用炔丙醇(1 MEq)對未反應疊氮基進行封端，持續2小時，且在第一次封端之後，在23℃下藉由3-疊氮基-1-丙醇(2 MEq)對未反應炔烴基進行封端，持續2小時。隨後，藉由UF/DF使用100K MWCO PES膜相對於含10 mM EDTA + 10 mM SPB之鹽水(pH 7.0) (30×透濾體積)且接著相對於含5 mM琥珀酸鹽之鹽水(pH 6.0) (30×透濾體積)來純化反應混合物。
表 2. 使用點擊化學獲得之 Pn29 結合物之屬性
MW：分子量；SPR：醣與蛋白質之比率
| 結合物編號 | 1 |
| 起始多醣 | |
| 多醣MW，kDa | 674 |
| 經活化多醣之屬性 | |
| 活化程度(DoA) | ~9 |
| 經活化多醣MW，kDa | 755 |
| 結合物屬性 | |
| 載體蛋白 | CRM 197 |
| 產率(%) | 56 |
| SPR比率 | 1.6 |
| 游離醣，% | 11 |
| 結合物MW，kDa | 1165 |
點擊化學允許產生游離醣含量較低且產率良好之29結合物。此外，其允許獲得包含接近天然多醣之多醣的血清型29結合物(與用過碘酸鹽活化相反，在活化步驟期間未觀測到尺寸減小，參見WO 2020/247299)。
實例 3. 使用點擊化學結合之血清型 35B 結合物之免疫原性在標準條件下測定與-CRM
197或SCP之血清型35B結合物在小鼠中之調理吞噬活性(OPA)效價。使用點擊化學(點擊)來產生所測試之結合物(參見表1處之屬性)。
在第0週，經由皮下途徑用0.01 µg/動物、0.05 µg/動物或0.1 µg/動物之測試結合物對6至8週齡雌性瑞士韋伯斯特(Swiss Webster)小鼠組進行免疫接種(250 µL)。在第3週用相同劑量之結合物對小鼠進行加強，且隨後在第5週抽血。對第5週血清樣品進行血清型特異性OPA。
結果呈現於表3處。
NA：『未獲得』
| 表 3 -- 用與-CRM 197 或SCP 點擊結合之 血清型35B 抗原進行疫苗接種後之OPA 效價。使用結合之血清型35B 在佐劑存在下 對 小鼠進行疫苗接種。雌性瑞士韋伯斯特小鼠，6 至8 週齡 ；劑量：0.01 、0.05 及0.1 μg/ 動物 + AlPO4 ；疫苗接種：第 0 週及第3 週 ；第 5 週抽血讀數：OPA | ||||
| 劑量(μg/動物) | 0.01 | 0.05 | 0.1 | |
| 點擊-CRM 197(天然) 表1之結合物編號1 | 平均值(OPA效價) | 21 | 341 | 2013 |
| 小鼠總數 | 45 | 25 | 46 | |
| 無反應者數目 | 31 | 5 | 0 | |
| 無反應者% | 69 | 20 | 0 | |
| 點擊-CRM 197(尺寸設定) 表1之結合物編號2 | 平均值(OPA效價) | NA | 44 | NA |
| 小鼠總數 | NA | 25 | NA | |
| 無反應者數目 | NA | 14 | NA | |
| 無反應者% | NA | 56 | NA | |
| 點擊-SCP 表1之結合物編號3 | 平均值(OPA效價) | 27 | 182 | 752 |
| 小鼠總數 | 25 | 25 | 25 | |
| 無反應者數目 | 13 | 5 | 3 | |
| 無反應者% | 52 | 20 | 12 |
表3之資料指示所有血清型35B結合物均在鼠類免疫原性模型中引起劑量依賴性OPA效價。
實例 4 ： 使用點擊化學結合肺炎鏈球菌血清型 23A 及 23B 莢膜多醣 ( 參見圖 3)
使用用於血清型35B及29之類似方法(參見實例1及2)，用疊氮基連接子(3-疊氮基-1-丙胺)活化血清型23A及23B莢膜多醣。使用實例1及2之類似方法，用炔烴NHS酯將CRM
197及SCP活化為炔烴-CRM
197或炔烴-SCP，且將經活化之疊氮基多醣23A及23B與炔烴CRM
197或SCP單擊結合(藉由Cu+1介導之疊氮-炔烴環加成反應結合)。
已獲得之結合物之屬性呈現於表4及5處。
表 4. 使用點擊化學獲得之 Pn23A 結合物之屬性
MW：分子量；SPR：醣與蛋白質之比率
| 結合物編號 | 1 | 2 | |
| 多醣 | |||
| 多醣MW，kDa | 196 | 196 | |
| 經活化多醣之屬性 | |||
| 活化程度(DoA) | ~10-20 | ~10-20 | |
| 經活化多醣MW，kDa | 248 | 248 | |
| 經活化載體之屬性 | |||
| 活化程度(DoA) | 15 | 26 | |
| 經活化載體MW，kDa | 65 | 99.3 | |
| 結合物屬性 | |||
| 載體蛋白 | CRM 197 | SCP | |
| 產率(%) | 57 | 77 | |
| SPR比率 | 1.2 | 1 | |
| 游離醣，% | ＜5 | ＜5 | |
| 結合物MW，kDa | 1469 | 1412 | |
點擊化學允許產生游離醣含量極低且產率良好之23A結合物。
表 5. 使用點擊化學獲得之 Pn23B 結合物之屬性
MW：分子量；SPR：醣與蛋白質之比率
| 結合物編號 | 1 | 2 | |
| 多醣 | |||
| 多醣MW，kDa | 157 | 157 | |
| 經活化多醣之屬性 | |||
| 活化程度(DoA) | 18 | 18 | |
| 經活化多醣MW，kDa | 165 | 165 | |
| 經活化載體之屬性 | |||
| 活化程度(DoA) | 17 | 26 | |
| 經活化載體MW，kDa | 58 | 101 | |
| 結合物屬性 | |||
| 載體蛋白 | CRM 197 | SCP | |
| 產率(%) | 58 | 63 | |
| SPR比率 | 0.91 | 0.85 | |
| 游離醣，% | 10.6 | 11.5 | |
| 結合物MW，kDa | 1113 | 919 | |
點擊化學允許產生游離醣百分比較低且產率良好之23B結合物。
實例 5 ： 使用點擊化學結合肺炎鏈球菌血清型 15A 莢膜多醣 ( 參見圖 3)
使用用於血清型35B及29之類似方法(參見實例1及2)，用疊氮基連接子(3-疊氮基-1-丙胺)活化血清型15A莢膜多醣。使用實例1及2之類似方法，用炔烴NHS酯將CRM
197及SCP活化為炔烴-CRM
197或炔烴-SCP，且將經活化之疊氮基多醣15A與炔烴CRM
197或SCP單擊結合(藉由Cu+1介導之疊氮-炔烴環加成反應結合)。
已獲得之結合物之屬性呈現於表6處。
表 6. 使用點擊化學獲得之 Pn15A 結合物之屬性
MW：分子量；SPR：醣與蛋白質之比率
| 結合物編號 | 1 | 2 | |
| 多醣 | |||
| 多醣MW，kDa | 175 | 229 | |
| 經活化多醣之屬性 | |||
| 活化程度(DoA) | ~15 | ~17 | |
| 經活化多醣MW，kDa | 244 | 320 | |
| 經活化載體之屬性 | |||
| 活化程度(DoA) | 17 | ~26 | |
| 經活化載體MW，kDa | 58 | 101 | |
| 結合物屬性 | |||
| 載體蛋白 | CRM 197 | SCP | |
| 產率(%) | 25 | 64 | |
| SPR比率 | 1.0 | 1.1 | |
| 游離醣，% | 6 | 9 | |
| 結合物MW，kDa | 2249 | 802 | |
點擊化學允許產生游離醣含量較低且針對SPC之產率良好之15A結合物。
實例 6 ： 使用點擊化學結合肺炎鏈球菌血清型 24F 莢膜多醣 ( 參見圖 3)
使用用於血清型35B及29之類似方法(參見實例1及2)，用疊氮基連接子(3-疊氮基-1-丙胺)活化血清型24F莢膜多醣。使用實例1及2之類似方法，用炔烴NHS酯將CRM
197及SCP活化為炔烴-CRM
197或炔烴-SCP，且將經活化之疊氮基多醣24F與炔烴CRM
197或SCP單擊結合(藉由Cu+1介導之疊氮-炔烴環加成反應結合)。
已獲得之結合物之屬性呈現於表7處。
表 7. 使用點擊化學獲得之 Pn24F 結合物之屬性
MW：分子量；SPR：醣與蛋白質之比率
| 結合物編號 | 1 | 2 | |
| 多醣 | |||
| 多醣MW，kDa | 194 | 194 | |
| 經活化多醣之屬性 | |||
| 活化程度(DoA) | 6~10 | 6~10 | |
| 經活化多醣MW，kDa | 282 | 282 | |
| 經活化載體之屬性 | |||
| 活化程度(DoA) | 15 | 20 | |
| 經活化載體MW，kDa | 65 | 101 | |
| 結合物屬性 | |||
| 載體蛋白 | CRM 197 | SCP | |
| 產率(%) | 52 | 82 | |
| SPR比率 | 1.1 | 0.9 | |
| 游離醣，% | 7 | ＜5 | |
| 結合物MW，kDa | 1195 | 2206 | |
點擊化學允許產生游離醣含量較低且產率良好之24F結合物。
實例 7 ： 使用點擊化學結合肺炎鏈球菌血清型 6B 莢膜多醣 ( 參見圖 3)
使用用於血清型35B及29之類似方法(參見實例1及2)，用疊氮基連接子(3-疊氮基-1-丙胺)活化血清型6B莢膜多醣。使用實例1及2之類似方法，用炔烴NHS酯將CRM
197及SCP活化為炔烴-CRM
197或炔烴-SCP，且將經活化之疊氮基多醣6B與炔烴CRM
197或SCP單擊結合(藉由Cu+1介導之疊氮-炔烴環加成反應結合)。
已獲得之結合物之屬性呈現於表8處。
表 8. 使用點擊化學獲得之 6B 結合物之屬性
MW：分子量；SPR：醣與蛋白質之比率
| 結合物編號 | 1 | 2 | |
| 經活化多醣之屬性 | |||
| 活化程度(DoA) | 20 | 20 | |
| 經活化載體之屬性 | |||
| 活化程度(DoA) | 15 | 26 | |
| 結合物屬性 | |||
| 載體蛋白 | CRM 197 | SCP | |
| SPR比率 | 1.20 | 1.10 | |
| 游離醣，% | ＜5 | ＜5 | |
| 游離蛋白，% | ＜1 | ＜1 | |
| 結合物MW，kDa | 1919 | 1927 | |
點擊化學允許產生游離醣及游離蛋白含量極低之6B結合物。
實例 8 ： 使用點擊化學結合肺炎鏈球菌血清型 19A 莢膜多醣 ( 參見圖 3)
使用用於血清型35B及29之類似方法(參見實例1及2)，用疊氮基連接子(3-疊氮基-1-丙胺)活化血清型19A莢膜多醣。使用實例1及2之類似方法，用炔烴NHS酯將CRM
197及SCP活化為炔烴-CRM
197或炔烴-SCP，且將經活化之疊氮基多醣19A與炔烴CRM
197或SCP單擊結合(藉由Cu+1介導之疊氮-炔烴環加成反應結合)。
已獲得之結合物之屬性呈現於表9處。
表 9. 使用點擊化學獲得之 19A 結合物之屬性
MW：分子量；SPR：醣與蛋白質之比率
| 結合物編號 | 1 | 2 | |
| 經活化多醣之屬性 | |||
| 活化程度(DoA) | 17 | 17 | |
| 經活化載體之屬性 | |||
| 活化程度(DoA) | 15 | 26 | |
| 結合物屬性 | |||
| 載體蛋白 | CRM 197 | SCP | |
| SPR比率 | 1.50 | 1.20 | |
| 游離醣，% | 14 | ＜5 | |
| 游離蛋白，% | ＜1 | ＜1 | |
| 結合物MW，kDa | 1360 | 994 | |
點擊化學允許產生游離醣含量較低且游離蛋白含量極低之19A結合物。
實例 9 ： 使用點擊化學結合肺炎鏈球菌血清型 19F 莢膜多醣 ( 參見圖 3)
使用用於血清型35B及29之類似方法(參見實例1及2)，用疊氮基連接子(3-疊氮基-1-丙胺)活化血清型19F莢膜多醣。使用實例1及2之類似方法，用炔烴NHS酯將CRM
197及SCP活化為炔烴-CRM
197或炔烴-SCP，且將經活化之疊氮基多醣19F與炔烴CRM
197或SCP單擊結合(藉由Cu+1介導之疊氮-炔烴環加成反應結合)。
已獲得之結合物之屬性呈現於表10處。
表 10. 使用點擊化學獲得之 19F 結合物之屬性
MW：分子量；SPR：醣與蛋白質之比率
| 結合物編號 | 1 | 2 | |
| 經活化多醣之屬性 | |||
| 活化程度(DoA) | 24 | 24 | |
| 經活化載體之屬性 | |||
| 活化程度(DoA) | 15 | 26 | |
| 結合物屬性 | |||
| 載體蛋白 | CRM 197 | SCP | |
| SPR比率 | 0.88 | 0.92 | |
| 游離醣，% | 7 | 1 | |
| 游離蛋白，% | ＜1 | ＜1 | |
| 結合物MW，kDa | 1775 | 2099 | |
點擊化學允許產生游離醣含量較低且游離蛋白含量極低之19F結合物。
實例 10 ： 使用點擊化學結合肺炎鏈球菌血清型 23F 莢膜多醣 ( 參見圖 3)
使用用於血清型35B及29之類似方法(參見實例1及2)，用疊氮基連接子(3-疊氮基-1-丙胺)活化血清型23F莢膜多醣。使用實例1及2之類似方法，用炔烴NHS酯將CRM
197及SCP活化為炔烴-CRM
197或炔烴-SCP，且將經活化之疊氮基多醣23F與炔烴CRM
197或SCP單擊結合(藉由Cu+1介導之疊氮-炔烴環加成反應結合)。
已獲得之結合物之屬性呈現於表11處。
表 11. 使用點擊化學獲得之 23F 結合物之屬性
MW：分子量；SPR：醣與蛋白質之比率
| 結合物編號 | 1 | 2 | |
| 經活化多醣之屬性 | |||
| 活化程度(DoA) | 26 | 28 | |
| 經活化載體之屬性 | |||
| 活化程度(DoA) | 15 | 26 | |
| 結合物屬性 | |||
| 載體蛋白 | CRM 197 | SCP | |
| SPR比率 | 1.20 | 1.10 | |
| 游離醣，% | 5 | 8 | |
| 游離蛋白，% | ＜1 | ＜1 | |
| 結合物MW，kDa | 2111 | 1798 | |
點擊化學允許產生游離醣含量較低且游離蛋白含量極低之23F結合物。
實例 11. 使用點擊化學結合之血清型 19F 結合物之免疫原性在標準條件下測定與-CRM
197或SCP之血清型19F結合物在小鼠中之調理吞噬活性(OPA)效價。使用點擊化學(點擊)來產生所測試之結合物(參見實例9表10處之屬性)。
在第0週，經由皮下途徑用0.05 µg/動物或0.1 µg/動物之測試結合物對6至8週齡雌性瑞士韋伯斯特小鼠組進行免疫接種(250 µL)。在第3週用相同劑量之結合物對小鼠進行加強，且隨後在第5週抽血。對第5週血清樣品進行血清型特異性OPA。
結果呈現於表12處。
| 表 12 -- 用與-CRM 197 或SCP 點擊 結合之 血清型19F 抗原進行疫苗接種後之OPA 效價。使用結合之血清型19F 在佐劑存在下 對 小鼠進行疫苗接種。雌性瑞士韋伯斯特小鼠，6 至8 週齡 ；劑量：0.1 及0.05 μg/ 動物 + AlPO4 ；疫苗接種：第 0 週及第3 週 ；第 5 週抽血讀數：OPA | |||
| 劑量(µg/動物) | 0.05 | 0.1 | |
| 點擊-CRM 197表10之結合物編號1 | 平均值 | 102 | 143 |
| 小鼠總數 | 50 | 50 | |
| 無反應者數目 | 8 | 8 | |
| 無反應者% | 16 | 16 | |
| 點擊-SCP 表10之結合物編號2 | 平均值 | 306 | 328 |
| 小鼠總數 | 50 | 50 | |
| 無反應者數目 | 0 | 1 | |
| 無反應者% | 0 | 2 |
實例 12. 使用點擊化學結合之血清型 29 結合物之免疫原性在標準條件下測定與-CRM
197之血清型29結合物在小鼠中之調理吞噬活性(OPA)效價。使用點擊化學(點擊)來產生所測試之結合物(參見實例2表2處之屬性)。
在第0週，經由皮下途徑用0.01 µg/動物、0.05 µg/動物或0.1 µg/動物之測試結合物對6至8週齡雌性瑞士韋伯斯特小鼠組進行免疫接種(250 µL)。在第3週用相同劑量之結合物對小鼠進行加強，且隨後在第5週抽血。對第5週血清樣品進行血清型特異性OPA。
結果呈現於表13處。
| 表 13 -- 用藉由點擊化學與-CRM 197 結合之 血清型29 抗原進行疫苗接種後之OPA 效價。使用結合之血清型29 在佐劑存在下 對 小鼠進行疫苗接種。雌性瑞士韋伯斯特小鼠，6 至8 週齡 ；劑量：0.01 、0.05 及0.1 μg/ 動物 + AlPO4 ；疫苗接種：第 0 週及第3 週 ；第 5 週抽血讀數：OPA | ||||
| 劑量(μg/動物) | 0.01 | 0.05 | 0.1 | |
| 點擊-CRM 197 | 平均值(OPA效價) | 28 | 1332 | 2271 |
| 小鼠總數 | 25 | 25 | 25 | |
| 無反應者數目 | 12 | 1 | 0 | |
| 無反應者% | 48 | 4 | 0 |
表13之資料指示血清型29結合物在鼠類免疫原性模型中引起劑量依賴性OPA效價。
實例 13. 使用點擊化學結合之血清型 19A 結合物之免疫原性在標準條件下測定與-CRM
197或SCP之血清型19A結合物在小鼠中之調理吞噬活性(OPA)效價。使用點擊化學(點擊)來產生所測試之結合物(參見實例8表9處之屬性)。
在第0週，經由皮下途徑用0.05 µg/動物或0.1 µg/動物之測試結合物對6至8週齡雌性瑞士韋伯斯特小鼠組進行免疫接種(250 µL)。在第3週用相同劑量之結合物對小鼠進行加強，且隨後在第5週抽血。對第5週血清樣品進行血清型特異性OPA。
結果呈現於表14處。
| 表14 -- 用與-CRM 197 或SCP 點擊 結合之 血清型19A 抗原進行疫苗接種後之OPA 效價。使用結合之血清型19A 在佐劑存在下 對 小鼠進行疫苗接種。雌性瑞士韋伯斯特小鼠，6 至8 週齡 ；劑量：0.05 及0.1 μg/ 動物 + AlPO4 ；疫苗接種：第 0 週及第3 週 ；第 5 週抽血讀數：OPA | |||
| 劑量(µg/動物) | 0.05 | 0.1 | |
| 點擊-CRM 197表9之結合物編號1 | 平均值 | 25 | 40 |
| 小鼠總數 | 50 | 49 | |
| 無反應者數目 | 24 | 19 | |
| 無反應者% | 48 | 39 | |
| 點擊-SCP 表9之結合物編號2 | 平均值 | 126 | 327 |
| 小鼠總數 | 50 | 50 | |
| 無反應者數目 | 4 | 2 | |
| 無反應者% | 8 | 4 |
實例 14 . 使用點擊化學結合之血清型 6B 結合物之免疫原性在標準條件下測定與-CRM
197或SCP之血清型6B結合物在小鼠中之調理吞噬活性(OPA)效價。使用點擊化學(點擊)來產生所測試之結合物(參見實例7表8處之屬性)。
在第0週，經由皮下途徑用0.05 µg/動物、0.1 µg/動物或0.2 µg/動物之測試結合物對6至8週齡雌性瑞士韋伯斯特小鼠組進行免疫接種(250 µL)。在第3週用相同劑量之結合物對小鼠進行加強，且隨後在第5週抽血。對第5週血清樣品進行血清型特異性OPA。
結果呈現於表15處。
| 表15 -- 用與-CRM 197 或SCP 點擊 結合之 血清型6B 抗原進行疫苗接種後之OPA 效價。使用結合之血清型6B 在佐劑存在下 對 小鼠進行疫苗接種。雌性瑞士韋伯斯特小鼠，6 至8 週齡 ；劑量0.2 、0.1 及0.05 μg/ 動物 + AlPO4 ；疫苗接種：第 0 週及第3 週 ；第 5 週抽血讀數：OPA | ||||
| 劑量(µg/動物) | 0.05 | 0.1 | 0.2 | |
| 點擊-CRM 197表8之結合物編號1 | 平均值 | 76 | 255 | 217 |
| 小鼠總數 | 50 | 50 | 50 | |
| 無反應者數目 | 15 | 9 | 7 | |
| 無反應者% | 30 | 18 | 14 | |
| 點擊-SCP 表8之結合物編號2 | 平均值 | 54 | 70 | 202 |
| 小鼠總數 | 48 | 50 | 49 | |
| 無反應者數目 | 18 | 16 | 7 | |
| 無反應者% | 38 | 32 | 14 |
實例 15 . 使用點擊化學結合之血清型 15A 結合物之免疫原性在標準條件下測定與-CRM
197或SCP之血清型15A結合物在小鼠中之調理吞噬活性(OPA)效價。使用點擊化學(點擊)來產生所測試之結合物(參見實例5表6處之屬性)。
在第0週，經由皮下途徑用0.01 µg/動物、0.1 µg/動物或1.0 µg/動物之測試結合物對6至8週齡雌性瑞士韋伯斯特小鼠組進行免疫接種(250 µL)。在第3週用相同劑量之結合物對小鼠進行加強，且隨後在第5週抽血。對第5週血清樣品進行血清型特異性OPA。
結果呈現於表16處。
| 表 16 -- 用與-CRM 197 或SCP 點擊 結合之 血清型15A 抗原進行疫苗接種後之OPA 效價。使用結合之血清型 15A在佐劑存在下對小鼠進行疫苗接種。 雌性瑞士韋伯斯特小鼠， 6 至8 週齡 ；劑量：1.0 、0.1 及0.01 μg/ 動物 + AlPO4 ；疫苗接種：第 0 週及第3 週 ；第 5 週抽血讀數：OPA | ||||
| 劑量(µg/動物) | 0.01 | 0.1 | 1.0 | |
| 點擊-CRM 197表6之結合物編號1 | 平均值 | 135 | 6457 | 16624 |
| 小鼠總數 | 23 | 25 | 25 | |
| 無反應者數目 | 5 | 0 | 0 | |
| 無反應者% | 22 | 0 | 0 | |
| 點擊-SCP 表6之結合物編號2 | 平均值 | 463 | 3294 | 5578 |
| 小鼠總數 | 25 | 25 | 25 | |
| 無反應者數目 | 2 | 0 | 1 | |
| 無反應者% | 8 | 0 | 4 |
本說明書中提及之所有公開案及專利申請案指示熟習本發明所屬領域之技術者的水準。所有公開案及專利申請案均在此以引用之方式併入，如同各個別公開案或專利申請案特定且單獨地指示為以引用之方式併入一般。
儘管出於清晰理解的目的已經藉助於說明及實例相當詳細地描述了前述發明，但可在隨附申請專利範圍之範疇內實踐某些改變及修改。
圖 1展示肺炎鏈球菌血清型35B莢膜多醣之重複多醣結構。
圖 2展示肺炎鏈球菌血清型29莢膜多醣之重複多醣結構。
圖 3展示使用點擊化學且使用3-疊氮基-1-丙胺作為疊氮基連接子來製備的本發明之醣結合物之通用製備流程。CP = 載體蛋白，CDI = 1,1'-羰基二咪唑。
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Claims (29)
- 一種製備莢膜醣醣結合物之方法，該方法包含以下步驟： (a)使經分離莢膜醣與碳酸衍生物及疊氮基連接子在非質子性溶劑中反應以產生經活化疊氮基醣， (b)使載體蛋白與帶有N-羥基琥珀醯亞胺(N-Hydroxysuccinimide；NHS)部分及炔烴基之試劑反應，其中NHS部分與胺基反應以形成醯胺鍵，從而獲得經炔烴官能化之載體蛋白， (c)藉由Cu +1介導之疊氮-炔烴環加成反應使步驟(a)之經活化疊氮基醣與步驟(b)之經活化炔烴-載體蛋白發生反應以形成醣結合物。
- 如請求項2之方法，其中經分離莢膜醣在活化步驟(a)之前，將尺寸設定為200 kDa與800 kDa之間的重量平均分子量。
- 如請求項1至2中任一項之方法，該碳酸衍生物係選自由以下組成之群：1,1'-羰基二咪唑(1,1’-carbonyldiimidazole；CDI)、1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑) (1,1’-carbonyl-di-(1,2,4-triazole)；CDT)、碳酸二琥珀醯亞胺酯(disuccinimidyl carbonate；DSC)及氯甲酸N-羥基琥珀醯亞胺酯。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該疊氮基連接子為式(I)化合物， 其中X係選自由以下組成之群：CH 2(CH 2) n、(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2、NHCO(CH 2) n、NHCO(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2、OCH 2(CH 2) n及O(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2；其中n係選自1至10且m係選自1至4。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該疊氮基連接子為式(II)化合物， 。
- 如請求項1至5中任一項之方法，其中該帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑為帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及末端炔烴之試劑。
- 如請求項1至5中任一項之方法，其中該帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑為帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及環炔烴之試劑。
- 如請求項1至5中任一項之方法，其中該帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑為式(III)化合物， 其中X係選自由以下組成之群：CH 2O(CH 2) nCH 2C=O及CH 2O(CH 2CH 2O) m(CH 2) nCH 2C=O，其中n係選自0至10且m係選自0至4。
- 如請求項1至5中任一項之方法，其中該帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之試劑為式(IV)化合物： 。
- 如請求項1至9中任一項之方法，其中步驟a)包含使莢膜醣與碳酸衍生物在非質子性溶劑中反應，隨後使經碳酸衍生物活化莢膜醣與疊氮基連接子在非質子性溶劑中反應，以產生經活化疊氮基莢膜醣。
- 如請求項1至10中任一項之方法，其中在步驟a)處，經分離莢膜醣與CDI係在包含0.1%至1% (v/v)水之非質子性溶劑中反應。
- 如請求項1至11中任一項之方法，其中在步驟a)處，在碳酸衍生物活化之後添加水。
- 如請求項1至12中任一項之方法，其中步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化醣與相對於經活化醣醣重複單元的量在0.01至10莫耳當量之間的量的疊氮基連接子反應。
- 如請求項1至13中任一項之方法，其中結合反應c)係在水性緩衝液中於作為催化劑之銅(I)存在下進行。
- 如請求項1至14中任一項之方法，其中該方法進一步包含在產生醣結合物之後，純化該醣結合物的步驟。
- 一種莢膜醣醣結合物，其係根據如請求項1至15之方法中之任一者產生。
- 一種莢膜醣醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(carrier protein；CP)共價結合之莢膜醣且具有通式(VII)： ， 其中X係選自由以下組成之群：CH 2(CH 2) n'、(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2、NHCO(CH 2) n'、NHCO(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2、OCH 2(CH 2) n'及O(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2；其中n'係選自1至10且m係選自1至4， 且其中X'係選自由以下組成之群：CH 2O(CH 2) n''CH 2C=O、CH 2O(CH 2CH 2O) m'(CH 2) n''CH 2C=O，其中n''係選自0至10且m'係選自0至4。
- 一種莢膜醣醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之莢膜醣且具有通式(VII)，其中X為CH 2(CH 2) n'，其中n'為2，且其中X'為CH 2O(CH 2) n''CH 2C=O，其中n"為1。
- 一種莢膜醣醣結合物，其包含經由間隔子與載體蛋白(CP)共價結合之莢膜醣且具有通式(VIII)， 。
- 如請求項16至19中任一項之莢膜醣醣結合物，其包含莢膜醣，其中該莢膜醣在結合前的重量平均分子量(Mw)在10 kDa與2,000 kDa之間。
- 如請求項16至20中任一項之莢膜醣醣結合物，其具有250 kDa與20,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
- 如請求項16至21中任一項之莢膜醣醣結合物，其中莢膜醣醣結合物之結合程度在2與15之間。
- 如請求項16至22中任一項之莢膜醣醣結合物，其中醣結合物中莢膜醣與載體蛋白之比率(w/w)在0.5與3.0之間。
- 如請求項16至23中任一項之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣醣結合物以醣的每5至10個醣重複單元計，於載體蛋白與醣之間包含至少一個共價連接。
- 如請求項16至24中任一項之莢膜醣醣結合物，其中該載體蛋白為CRM 197、SCP、DT (白喉類毒素)、TT (破傷風類毒素)或PD (流感嗜血桿菌( H. influenzae)蛋白D)。
- 如請求項1至15中任一項之製備莢膜醣醣結合物之方法或如請求項16至25中任一項之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自病原性細菌之莢膜醣。
- 如請求項1至15中任一項之製備莢膜醣醣結合物之方法或如請求項16至25中任一項之莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣為來自肺炎鏈球菌( S. pneumoniae)之莢膜醣。
- 如請求項1至27中任一項之製備莢膜醣醣結合物之方法或莢膜醣醣結合物，其中該莢膜醣不為來自肺炎鏈球菌血清型3之莢膜醣。
- 一種免疫原組合物，其包含如請求項16至28中任一項之莢膜醣醣結合物。
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