CN117729933A - 包含缀合的荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其用途 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本公开涉及新的缀合荚膜糖抗原(糖缀合物)、包含此类糖缀合物的免疫原性组合物及其用途。
Description
技术领域
本公开是关于新的缀合的荚膜糖抗原(糖缀合物)、包含此类糖缀合物的免疫原性组合物及其用途。本发明的免疫原性组合物通常将包含糖缀合物，其中糖是源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的血清型。本公开也是关于使用此类糖缀合物针对肺炎球菌感染对人对象、特定而言婴儿及老年人接种疫苗。
背景技术
通过使免疫原性较差的分子缀合至“载体”分子来增加此类分子的免疫原性的方式已成功地利用数十年(例如参见Goebel等，(1939)J.Exp.Med.69:53)。举例而言，描述许多免疫原性组合物，其中已使经纯化荚膜聚合物缀合至载体蛋白以通过利用此“载体效应”来产生更有效的免疫原性组合物。Schneerson等，(1984)Infect.Immun.45:582-591)。也已证实，缀合可避免在使用游离多糖实施免疫时通常观察于婴儿中的差的抗体反应(Anderson等，(1985)J.Pediatr.107:346；Insel等，(1986)J.Exp.Med.158:294)。
已成功地使用各种交联或偶合试剂(例如同双官能、异双官能或零长度交联剂)来生成缀合物。当前可利用许多方法来使免疫原分子(例如糖、蛋白质及肽)偶合至肽或蛋白质载体。大部分方法产生胺、酰胺、氨基甲酸酯、异硫脲或二硫键，或在一些情况下产生硫醚。使用将反应性位点引入载体及/或免疫原分子上的反应性氨基酸分子的侧链中的交联或偶合试剂的缺点在于，反应性位点在未经中和的情况下将与在活体外(由此可能不良地影响缀合物的功能性或稳定性)或在活体内(由此在经此类制剂免疫化的人或动物引起不良事件的潜在风险)与任何不期望分子自由反应。可利用各种已知化学反应使此类过量反应性位点发生反应或“封端”以失活此类位点，但此类反应可另外破坏缀合物的功能性。
因此，仍需要适当封端的新糖缀合物及制备此类缀合物的方法，从而功能性得以保留且缀合物保留诱发期望免疫反应的能力。
肺炎球菌多糖、尤其荚膜多糖是发现于细菌表面上的重要免疫原。此使得其成为肺炎球菌疫苗的设计中的重要组分。其已证实可用于诱发免疫反应，尤其在连接至载体蛋白时。
一些血清型、尤其肺炎链球菌血清型3会产生较大粘性的多糖链(例如关于3型的2-3百万道尔顿(Dalton)的葡萄糖/葡萄糖醛酸链)。其粘性使得其难以处理。
另外，难以获得关于血清型3多糖的显著免疫原性。举例而言，在11价肺炎球菌蛋白D缀合疫苗(11-Pn-PD)的免疫原性及安全性的研究中，在已接受三个剂量的疫苗且随后接受加强剂量的相同疫苗或肺炎球菌多糖疫苗的婴儿中未观察到血清型3的引发效应(Nurkka等，(2004)Ped.Inf.Dis.J.,23:1008-1014)。在另一研究中，已接受11-Pn-PD剂量的婴儿的调理吞噬分析(OPA)结果未示出了与其它所测试血清型程度相当的针对血清型3的抗体反应(Gatchalian等，17th annual Meeting of the Eur.Soc.Paed.Inf.Dis.(ESPID)，第4号海报，PIA海报示出了1，Istanbul Turkey,Mar.27,2001)。在评价11-Pn-PD在预防急性中耳炎中的效能又一研究中，疫苗不能防止由血清型3引起的发作(Prymula等，The Lancet，第367卷：740-748(2006年3月4日))。
因此，需要能够生成针对肺炎链球菌血清型3的较稳定免疫反应的抗原。
本公开尤其提供示出了改良免疫原性的肺炎链球菌血清型3糖缀合物。本公开也提供以改良的缀合产率生成肺炎链球菌血清型3糖缀合物的过程(制备方法)。
发明简述
在一个方面中，本公开是关于制备肺炎链球菌血清型3糖缀合物的方法，其包括以下步骤：
(a)使分离的肺炎链球菌血清型3荚膜多糖与碳酸衍生物及叠氮基接头在质子惰性溶剂中进行反应以产生活化的叠氮基多糖，
(b)使载体蛋白与具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂(agent)进行反应，其中NHS部分与氨基进行反应以形成酰胺键，由此获得炔基官能化的载体蛋白，
(c)通过Cu+1介导的叠氮基-炔基环加成反应使步骤(a)的活化的叠氮基多糖与步骤(b)的活化的炔基-载体蛋白进行反应以形成糖缀合物。
在一个特别的方面中，在活化步骤(a)之前，分离的多糖的大小为重量平均分子量在100kDa与200kDa之间。
在一方面中，碳酸衍生物是1,1’-羰基二咪唑(CDI)。
在一方面中，本公开是关于根据此类方法产生的肺炎链球菌血清型3糖缀合物。
在一方面中，本公开是关于肺炎链球菌血清型3糖缀合物，其包含通过间隔子共价缀合至载体蛋白(CP)的肺炎链球菌血清型3糖且具有通式(VII)：
其中X选自CH2(CH2)n’、(CH2CH2O)mCH2CH2、NHCO(CH2)n’、NHCO(CH2CH2O)mCH2CH2、OCH2(CH2)n’及O(CH2CH2O)mCH2CH2；其中n’选自1至10且m选自1至4，
且其中X'选自CH2O(CH2)n”CH2C＝O、CH2O(CH2CH2O)m’(CH2)n”CH2C＝O，其中n”选自0至10且m’选自0至4。
在又一方面中，本公开是关于包含该肺炎链球菌血清型3糖缀合物的免疫原性组合物。
附图说明
图1示出了肺炎链球菌血清型3荚膜多糖的重复多糖结构。
图2示出了使用点击化学制备本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物的一般反应图。Pn3 poly＝肺炎链球菌血清型3荚膜多糖；CP＝载体蛋白，CDI＝1,1’-羰基二咪唑。
图3示出了包含不同大小的多糖的血清型3-CRM197缀合物在小鼠中的调理吞噬活性(OPA)效价。将使用RAC/水性或RAC/DMSO缀合缀合至CRM197的改变大小的血清型3多糖(约25、150或250kDa)用于对小鼠接种疫苗。
图4示出了具有不同活化程度(DoA)的血清型3-CRM197缀合物在小鼠中的调理吞噬活性(OPA)效价。利用RAC/水性或RAC/DMSO缀合作用与CRM197缀合的改变大小的血清型3多糖用于对小鼠接种疫苗。
图5示出了与-CRM197、SCP或破伤风类毒素(TT)的血清型3缀合物在小鼠中的调理吞噬活性(OPA)效价。使用DMSO中还原胺化(RAC/DMSO)。
图6示出了血清型3-CRM197缀合物在小鼠中的调理吞噬活性(OPA)效价。已使用不同化学(水性还原胺化(RAC/Aq.)、DMSO中还原胺化(RAC/DMSO)、eTEC连接的糖缀合物(eTEC)或点击化学(点击)。
图7示出了使用血清型3化学物/载体缀合物接种疫苗的婴儿恒河猴中的剂量1后OPA效价。已使用不同化学(水性还原胺化(RAC/Aq.)或点击化学(点击)。自在剂量1后4周时间点时收集的血清来测量不同缀合化学的调理吞噬效价。每一点代表单独的动物且数据表示为具有95％置信区间的几何平均效价。基于单因子ANOVA来测定统计学显著性。报告经杜克多重性(Tukey’s multiplicity)调节的p值。****＝p≤0.0001LLOQ-量化下限。
图8示出了使用血清型3化学物/载体缀合物接种疫苗的婴儿恒河猴中的剂量2后OPA反应。自在剂量2后4周时收集的血清来测量不同缀合化学的调理吞噬效价。每一点代表单独的动物且数据表示为具有95％置信区间的几何平均效价。基于单因子ANOVA来测定统计学显著性。报告经杜克多重性调节的p值。LLOQ-量化下限。
发明详述
1.本发明的糖缀合物
本公开部分涉及缀合的荚膜糖抗原(也称为糖缀合物)，其中糖是衍生自肺炎链球菌血清型、尤其衍生自血清型3。出于本发明的目的，术语“糖缀合物”指示共价连接至载体蛋白的荚膜糖。在一个实施方式中，荚膜糖直接连接至载体蛋白。在第二实施例中，细菌糖通过间隔子/接头连接至蛋白质。
1.1来自肺炎链球菌血清型3的肺炎球菌糖
如图1所示出的，血清型3的多糖重复单元由具有一个吡喃葡萄糖(Glcp)及一个葡萄糖醛酸(GlcpA)的线性二糖单元组成(例如参见Geno K等，(2015)Clin Microbiol Rev，第28卷:3，p 871-899)。
在一个实施方式中，本公开中所使用的荚膜肺炎链球菌血清型3糖是合成碳水化合物。合成肺炎链球菌类型3荚膜糖的合成可例如如WO2017178664中所公开实施。
然而，在一个优选实施方式中，本发明的细菌多糖的来源可为肺炎链球菌血清型3细菌细胞。可用作肺炎链球菌血清型3多糖的来源的细菌菌株可自给定培养物保藏所(例如自链球菌参考实验室(Streptococcal Reference Laboratory)(疾病控制与预防中心(Centers for Disease Control and Prevention)，Atlanta,GA USA))或临床样品获得。
血清型3多糖可使用本领域技术人员已知的分离程序(例如参见US2006/0228380、US2006/0228381、US2007/0184071、US2007/0184072、US2007/0231340及US2008/0102498以及WO2008/118752中所公开的方法)自细菌直接获得。其也可使用本领域技术人员已知的合成方案来产生。其也可购得(例如来自美国模式培养物保藏所(American Type CultureCollection)(ATCC,Manassas,VAUSA)(例如参考号ATCC 172-X或ATCC 33-X))。
如果血清型3多糖是自细菌直接获得，则可在培养基中、优选地在基于大豆的培养基中生长细菌细胞。在产生肺炎链球菌血清型3荚膜多糖的细菌细胞发酵后，可使细菌细胞溶解以产生细胞溶解物。然后可使用业内已知的纯化技术自细胞溶解物来分离血清型3多糖，包括使用离心、深度过滤、沉淀、超滤、使用活性碳处理、渗滤及/或柱层析(例如参见US2006/0228380、US2006/0228381及WO2008/118752)。然后可使用经纯化血清型3荚膜多糖来制备免疫原缀合物。
可通过不同参数(包括例如重量平均分子量(Mw))来表征通过自肺炎链球菌溶解物纯化血清型3多糖且任选地将纯化多糖所获得的分离的血清型3荚膜多糖改变大小。
可通过尺寸排除层析(SEC)以及多角度激光光散射检测器(MALLS)来测量多糖的分子量。
在一个优选实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖(即在进一步处理之前纯化)具有在5kDa与5000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在5kDa与4000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在5kDa与3000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在5kDa与2000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在5kDa与1500kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在5kDa与1000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在5kDa与500kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在5kDa与400kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在5kDa与300kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在5kDa与200kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在5kDa与100kDa之间的重量平均分子量。
在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在50kDa与5000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在50kDa与4000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在50kDa与3000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在50kDa与2000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在50kDa与1500kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在50kDa与1000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在50kDa与500kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在50kDa与400kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在50kDa与300kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在50kDa与200kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在50kDa与100kDa之间的重量平均分子量。
在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在100kDa与5000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在100kDa与4000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在100kDa与3000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在100kDa与2000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在100kDa与1500kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在100kDa与1000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在100kDa与500kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在100kDa与400kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在100kDa与300kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在100kDa与200kDa之间的重量平均分子量。
在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在150kDa与5000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在150kDa与4000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在150kDa与3000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在150kDa与2000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在150kDa与1500kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在150kDa与1000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在150kDa与500kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在150kDa与400kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在150kDa与300kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在150kDa与200kDa之间的重量平均分子量。
在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在200kDa与5000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在200kDa与4000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在200kDa与3000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在200kDa与2000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在200kDa与1500kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在200kDa与1000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在200kDa与500kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在200kDa与400kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在200kDa与300kDa之间的重量平均分子量。
在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在300kDa与5000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在300kDa与4000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在300kDa与3000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在300kDa与2000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在300kDa与1500kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在300kDa与1000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在300kDa与500kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在300kDa与400kDa之间的重量平均分子量。
在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在400kDa与5000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在400kDa与4000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在400kDa与3000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在400kDa与2000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在400kDa与1500kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在400kDa与1000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在400kDa与500kDa之间的重量平均分子量。
在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在500kDa与5000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在500kDa与4000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在500kDa与3000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在500kDa与2000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在500kDa与1500kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在500kDa与1000kDa之间的重量平均分子量。
在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在750kDa与5000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在750kDa与4000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在750kDa与3000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在750kDa与2000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在750kDa与1500kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在750kDa与1000kDa之间的重量平均分子量。
在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在1000kDa与5000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在1000kDa与4000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在1000kDa与3000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在1000kDa与2000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在1000kDa与1500kDa之间的重量平均分子量。
在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在1500kDa与5000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在1500kDa与4000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在1500kDa与3000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在1500kDa与2000kDa之间的重量平均分子量。
在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在2000kDa与5000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在2000kDa与4000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在2000kDa与3000kDa之间的重量平均分子量。
在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在2500kDa与5000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在2500kDa与4000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖具有在2500kDa与3000kDa之间的重量平均分子量。
考虑任一上述范围内的任一整数以作为本公开的一个实施方式。
优选地，为产生具有有利的滤过特性、免疫原性及/或产率的血清型3缀合物，在缀合至载体蛋白之前将多糖改变大小至目标分子量范围。有利的是，减小经纯化血清型3多糖的大小，而保留多糖结构的关键特征。可采用机械或化学改变大小。在一个实施方式中，通过化学水解来减小经纯化血清型3多糖的大小。可使用弱酸(例如乙酸、甲酸、丙酸)实施化学水解。在一个实施方式中，使用甲酸实施化学水解。在一个实施方式中，使用丙酸实施化学水解。在一个优选实施方式中，使用乙酸实施化学水解。也可使用稀强酸(例如稀盐酸、稀硫酸、稀磷酸、稀硝酸或稀过氯酸)实施化学水解。在一个实施方式中，使用稀盐酸实施化学水解。在一个实施方式中，使用稀硫酸实施化学水解。在一个实施方式中，使用稀磷酸实施化学水解。在一个实施方式中，使用稀硝酸实施化学水解。在一个实施方式中，使用稀过氯酸实施化学水解。也可通过机械均质化减小经纯化血清型3多糖的大小。在实施方式中，通过高压均质化减小经纯化血清型3多糖的大小。高压均质化通过将过程流泵送通过具有足够小尺寸的流动路径实现高剪切速率。通过施加较大均质压力来增加剪切速率，且可通过使进料流再循环通过均质机来延长暴露时间。
高压均质化过程可适于减小经纯化血清型3多糖的大小，而保留多糖的结构特征。
在一个优选实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在5kDa与1000kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在5kDa与900kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在5kDa与800kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在5kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在5kDa与600kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在5kDa与500kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在5kDa与450kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在5kDa与400kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在5kDa与350kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在5kDa与300kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在5kDa与250kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在5kDa与200kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在5kDa与150kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在5kDa与100kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在5kDa与50kDa之间。
在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在50kDa与1000kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在50kDa与900kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在50kDa与800kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在50kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在50kDa与600kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在50kDa与500kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在50kDa与450kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在50kDa与400kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在50kDa与350kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在50kDa与300kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在50kDa与250kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在50kDa与200kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在50kDa与150kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在50kDa与100kDa之间。
在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在100kDa与1000kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在100kDa与900kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在100kDa与800kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在100kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在100kDa与600kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在100kDa与500kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在100kDa与450kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在100kDa与400kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在100kDa与350kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在100kDa与300kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在100kDa与250kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在100kDa与200kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在100kDa与150kDa之间。
在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在110kDa与150kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在120kDa与150kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在110kDa与150kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在130kDa与150kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在120kDa与150kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在120kDa与140kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在120kDa与130kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在130kDa与150kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在130kDa与140kDa之间。
在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在150kDa与1000kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在150kDa与900kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在150kDa与800kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在150kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在150kDa与600kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在150kDa与500kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在150kDa与450kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在150kDa与400kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在150kDa与350kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在150kDa与300kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在150kDa与250kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在150kDa与200kDa之间。
在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在200kDa与1000kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在200kDa与900kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在200kDa与800kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在200kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在200kDa与600kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在200kDa与500kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在200kDa与450kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在200kDa与400kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在200kDa与350kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在200kDa与300kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在200kDa与250kDa之间。
在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在250kDa与1000kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在250kDa与900kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在250kDa与800kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在250kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在250kDa与600kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在250kDa与500kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在250kDa与450kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在250kDa与400kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在250kDa与350kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在250kDa与300kDa之间。
在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在300kDa与1000kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在300kDa与900kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在300kDa与800kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在300kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在300kDa与600kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在300kDa与500kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在300kDa与450kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在300kDa与400kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在300kDa与350kDa之间。
在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在350kDa与1000kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在350kDa与900kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在350kDa与800kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在350kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在350kDa与600kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在350kDa与500kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在350kDa与450kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在350kDa与400kDa之间。
在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在400kDa与1000kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在400kDa与900kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在400kDa与800kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在400kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在400kDa与600kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在400kDa与500kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在400kDa与450kDa之间。
在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在450kDa与1000kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在450kDa与900kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在450kDa与800kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在450kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在450kDa与600kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在450kDa与500kDa之间。
在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在500kDa与1000kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在500kDa与900kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在500kDa与800kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在500kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在500kDa与600kDa之间。
在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在500kDa与1000kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在500kDa与900kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在500kDa与800kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在500kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在500kDa与600kDa之间。
在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在600kDa与1000kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在600kDa与900kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在600kDa与800kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在600kDa与700kDa之间。
在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在700kDa与1000kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在700kDa与900kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在700kDa与800kDa之间。
在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在800kDa与1000kDa之间。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在800kDa与900kDa之间。
在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在900kDa与1000kDa之间。
在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约5kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约50kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约100kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约110kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约120kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约130kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约140kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约150kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约160kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约170kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约180kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约190kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约200kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约250kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约300kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约350kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约400kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约450kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约500kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约550kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约600kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约700kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约800kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约900kDa。在一个实施方式中，将分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量为约1000kDa。
在一个实施方式中，分离的血清型3荚膜多糖未经改变大小。
可活化(例如以化学方式活化)上述分离的血清型3荚膜多糖以使其能够发生反应(例如与接头或直接与载体蛋白)且然后并入糖缀合物中，如本文进一步所描述的。
出于本发明的目的，术语“糖缀合物”指示共价连接至载体蛋白的糖。在一个实施方式中，糖直接连接至载体蛋白。在第二实施方式中，糖通过间隔子/接头连接至载体蛋白。
一般而言，糖与载体的共价缀合增强了糖的免疫原性，这是因其将糖自T独立性抗原转化成T依赖性抗原，由此可引发免疫记忆。缀合尤其可用于儿科疫苗。
1.2本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物
在一些实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在10kDa与2,000kDa之间。
糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)是指在活化的多糖(即在最终改变大小步骤之后但在多糖与活化剂反应之前)之前的Mw。在本发明的上下文中，多糖的Mw并不由活化步骤实质上改变，且并入缀合物中的多糖的Mw类似于在活化之前所测量多糖的Mw。在一个实施方式中，使用碳酸衍生物(例如CDI或CDT)与叠氮基接头(参见下文的章节1.3)的组合来活化多糖。在一个实施方式中，使用CDI与叠氮基接头(参见下文的章节1.3)的组合来活化多糖。在一个实施方式中，使用CDT与叠氮基接头(参见下文的章节1.3)的组合来活化多糖。
在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在50kDa与1,000kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在50kDa与750kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在50kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在50kDa与600kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在50kDa与500kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在50kDa与400kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在50kDa与300kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在50kDa与200kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在50kDa与150kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在50kDa与140kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在50kDa与130kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在50kDa与120kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在50kDa与110kDa之间。
在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在75kDa与1,000kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在75kDa与750kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在75kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在75kDa与600kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在75kDa与500kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在75kDa与400kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在75kDa与300kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在75kDa与200kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在75kDa与150kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在75kDa与140kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在75kDa与130kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在75kDa与120kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在75kDa与110kDa之间。
在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在100kDa与1,000kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在100kDa与750kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在100kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在100kDa与600kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在100kDa与500kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在100kDa与400kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在100kDa与300kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在100kDa与200kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在100kDa与150kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在100kDa与140kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在100kDa与130kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在100kDa与120kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在100kDa与110kDa之间。
在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在125kDa与1,000kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在125kDa与750kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在125kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在125kDa与600kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在125kDa与500kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在125kDa与400kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在125kDa与300kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在125kDa与200kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在125kDa与150kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在125kDa与140kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在125kDa与130kDa之间。
在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在130kDa与1,000kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在130kDa与750kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在130kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在130kDa与600kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在130kDa与500kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在130kDa与400kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在130kDa与300kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在130kDa与200kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在130kDa与150kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在130kDa与140kDa之间。
在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在150kDa与1,000kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在150kDa与750kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在150kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在150kDa与600kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在150kDa与500kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在150kDa与400kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在150kDa与300kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在150kDa与200kDa之间。
在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在200kDa与1,000kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在200kDa与750kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在200kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在200kDa与600kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在200kDa与500kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在200kDa与400kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在200kDa与300kDa之间。
在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在300kDa与1,000kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在300kDa与750kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在300kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在300kDa与600kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在300kDa与500kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在300kDa与400kDa之间。
在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在400kDa与1,000kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在400kDa与750kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在400kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在400kDa与600kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在400kDa与500kDa之间。
在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在500kDa与1,000kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在500kDa与750kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在500kDa与700kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在500kDa与600kDa之间。
在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在600kDa与1,000kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在600kDa与750kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在600kDa与700kDa之间。
在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在700kDa与1,000kDa之间。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)在700kDa与750kDa之间。
在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在750kDa与1,000kDa之间。
考虑任一上述范围内的任一整数以作为本公开的一个实施方式。
在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)为约1,000kDa。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)为约750kDa。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)为约700kDa。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)为约600kDa。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)为约500kDa。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)为约400kDa。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)为约300kDa。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)为约200kDa。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)为约150kDa。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)为约140kDa。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)为约130kDa。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)为约120kDa。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)为约110kDa。在一个实施方式中，重量平均分子量(Mw)为约100kDa。
在一些此类实施方式中，使用点击化学制备血清型3糖缀合物(参见章节1.3)。
在一些实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物具有在250kDa与20,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在500kDa与15,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在500kDa与10,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。
在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在250kDa与10,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在250kDa与9,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在250kDa与8,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在250kDa与7,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在250kDa与6,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在250kDa与5,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在250kDa与4,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在250kDa与3,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在250kDa与2,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在250kDa与1,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在250kDa与1,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在250kDa与750kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在250kDa与600kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在250kDa与500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在250kDa与400kDa之间的重量平均分子量(Mw)。
在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在500kDa与10,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在500kDa与9,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在500kDa与8,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在500kDa与7,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在500kDa与6,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在500kDa与5,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在500kDa与4,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在500kDa与3,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在500kDa与2,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在500kDa与1,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在500kDa与1,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在500kDa与750kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在500kDa与600kDa之间的重量平均分子量(Mw)。
在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在750kDa与10,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在750kDa与9,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在750kDa与8,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在750kDa与7,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在750kDa与6,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在750kDa与5,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在750kDa与4,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在750kDa与3,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在750kDa与2,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在750kDa与1,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在750kDa与1,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。
在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在1,000kDa与10,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在1,000kDa与9,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在1,000kDa与8,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在1,000kDa与7,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在1,000kDa与6,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在1,000kDa与5,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在1,000kDa与4,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在1,000kDa与3,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在1,000kDa与2,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在1,000kDa与1,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。
在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在2,000kDa与10,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在2,000kDa与9,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在2,000kDa与8,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在2,000kDa与7,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在2,000kDa与6,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在2,000kDa与5,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在2,000kDa与4,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在2,000kDa与3,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在2,000kDa与3,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。
在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在2,250kDa与3,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。
在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在3,000kDa与10,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在3,000kDa与9,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在3,000kDa与8,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在3,000kDa与7,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在3,000kDa与6,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在3,000kDa与5,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在3,000kDa与4,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。
在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在4,000kDa与10,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在4,000kDa与9,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在4,000kDa与8,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在4,000kDa与7,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在4,000kDa与6,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在4,000kDa与5,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。
在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在5,000kDa与10,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在5,000kDa与9,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在5,000kDa与8,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在5,000kDa与7,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在5,000kDa与6,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。
在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在6,000kDa与10,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在6,000kDa与9,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在6,000kDa与8,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在6,000kDa与7,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。
在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在7,000kDa与10,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在7,000kDa与9,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在7,000kDa与8,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。
在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在8,000kDa与10,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在8,000kDa与9,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。
在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有在9,000kDa与10,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。
考虑任一上述范围内的任一整数以作为本公开的一个实施方式。
在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有约10,000kDa的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有约9,000kDa的重量平均分子量(Mw)。在其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有约8,000kDa的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有约7,000kDa的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有约6,000kDa的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有约5,000kDa的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有约4,000kDa的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有约3,500kDa的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有约3,250kDa的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有约3,000kDa的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有约2,500kDa的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有约2,250kDa的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有约2,000kDa的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有约1,000kDa的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有约750kDa的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有约600kDa的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有约500kDa的重量平均分子量(Mw)。在再其它实施方式中，血清型3糖缀合物具有约400kDa的重量平均分子量(Mw)。
可通过粒径排除层析(SEC)以及多角度激光光散射检测器(MALLS)来测量多糖的分子量。
表征本公开血清型3糖缀合物的另一方式通过载体蛋白(例如CRM197或SCP)中缀合至糖的赖氨酸残基数，此可表征为所缀合赖氨酸的范围(缀合度)。可使用本领域技术人员已知的常规方法通过氨基酸分析获得因共价连接至多糖导致的载体蛋白的赖氨酸修饰的证据。缀合使得与用于产生缀合材料的载体蛋白起始材料相比，所回收的赖氨酸残基数有所减少。在一个优选实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在2与15之间。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在2与13之间。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在2与10之间。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在2与8之间。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在2与6之间。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在2与5之间。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在2与4之间。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在3与15之间。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在3与13之间。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在3与10之间。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在3与8之间。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在3与6之间。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在3与5之间。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在3与4之间。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在5与15之间。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在5与10之间。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在8与15之间。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在8与12之间。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在10与15之间。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在10与12之间。
在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度为约2。
在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度为约3。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度为约4。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度为约5。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度为约6。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度为约7。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度为约8。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度为约9。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度为约10、约11。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度为约12。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度为约13。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度为约14。在一个实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度为约15。在一个优选实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的缀合度在4与7之间。在一些此类实施方式中，载体蛋白是CRM197。在其它此类实施方式中，载体蛋白是SCP。
也可通过糖对载体蛋白的比(重量/重量)来表征本发明的血清型3糖缀合物。在一些实施方式中，糖缀合物中血清型3多糖对载体蛋白的比(w/w)在0.5与3.0之间。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)在0.5与2.0之间。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)在0.5与1.5之间。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)在0.8与1.2之间。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)在0.5与1.0之间。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)在1.0与1.5之间。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)在1.0与2.0之间。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)在0.8与1.2之间。在一个优选实施方式中，缀合物中血清型3荚膜多糖对载体蛋白的比在0.9与1.1之间。
在一个实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约0.5。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约0.6。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约0.7。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约0.8。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约0.9。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约1.0。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约1.1。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约1.2。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约1.3。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约1.4。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约1.5。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约1.6。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约1.7。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约1.8。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约1.9。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约2.0。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约2.1。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约2.2。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约2.5。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约2.8。在其它实施方式中，糖与载体蛋白的比(w/w)为约3.0。在一些此类实施方式中，载体蛋白是CRM197。在其它此类实施方式中，载体蛋白是SCP。
也可通过载体蛋白与糖之间的共价连接数来表征本发明的血清型3糖缀合物，该共价连接数随糖重复单元数而变化。在一个实施方式中，对于多糖的每4个糖重复单元，本发明的血清型3糖缀合物在载体蛋白与多糖之间包含至少一个共价连接。在另一实施方式中，在多糖的每10个糖重复单元中，载体蛋白与多糖之间的共价连接出现至少一次。在另一实施方式中，在多糖的每15个糖重复单元中，载体蛋白与多糖之间的共价连接出现至少一次。在另一实施方式中，在多糖的每25个糖重复单元中，载体蛋白与多糖之间的共价连接出现至少一次。在另一实施方式中，在多糖的每50个糖重复单元中，载体蛋白与多糖之间的共价连接出现至少一次。在又一实施方式中，在多糖的每100个糖重复单元中，载体蛋白与多糖之间的共价连接出现至少一次。
在其它实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的多糖的每5至10个糖重复单元包含至少一个载体蛋白与多糖之间的共价连接。
在其它实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的多糖的每2至7个糖重复单元包含至少一个载体蛋白与多糖之间的共价连接。
在其它实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的多糖的每6至11个糖重复单元包含至少一个载体蛋白与多糖之间的共价连接。
在其它实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的多糖的每9至14个糖重复单元包含至少一个载体蛋白与多糖之间的共价连接。
在其它实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的多糖的每10至20个糖重复单元包含至少一个载体蛋白与多糖之间的共价连接。
在其它实施方式中，本发明的血清型3糖缀合物的多糖的每4至25个糖重复单元包含至少一个载体蛋白与多糖之间的共价连接。
在常见实施方式中，载体蛋白是CRM197。在常见实施方式中，载体蛋白是SCP。
在一些实施方式中，载体蛋白是CRM197，且在多糖的每4个、10个、15个或25个糖重复单元中，CRM197与多糖之间的共价连接出现至少一次。在常见实施方式中，载体蛋白是SCP，且在多糖的每4个、10个、15个或25个糖重复单元中，SCP与多糖之间的共价连接出现至少一次。
本发明的血清型3糖缀合物及免疫原性组合物可含有并不共价缀合至载体蛋白、但仍存在于糖缀合物组合物中的游离糖。游离糖可与糖缀合物非共价缔合(即非共价缀合至该糖缀合物中、吸附至该糖缀合物中或包埋于该糖缀合物中或与其一起包埋)。
在一个优选实施方式中，与血清型3多糖的总量相比，血清型3糖缀合物包含小于约50％的游离血清型3多糖。在一个优选实施方式中，与血清型3多糖的总量相比，血清型3糖缀合物包含小于约40％的游离血清型3多糖。在又一个优选实施方式中，与血清型3多糖的总量相比，血清型3糖缀合物包含小于约25％的游离血清型3多糖。在一更优选地实施方式中，与血清型3多糖的总量相比，血清型3糖缀合物包含小于约20％的游离血清型3多糖。在又一个优选实施方式中，与血清型3多糖的总量相比，血清型3糖缀合物包含小于约15％的游离血清型3多糖。
血清型3糖缀合物也可通过其分子大小分布(Kd)来表征。缀合物的相对分子大小分布可使用粒径筛选层析培养基(CL-4B)来测定。将粒径排除层析(SEC)用于重力进料柱中以剖析缀合物的分子大小分布。自培养基中的孔排除的大分子比小分子洗脱更快速。使用级分收集器来收集柱洗脱物。通过糖分析以比色方式测试此类级分。为测定Kd，对柱进行校准以确立分子被完全排除时的分数(V0)(Kd＝0)及代表最大滞留的分数(Vi)(Kd＝1)。达到指定样品属性时的分数(Ve)与Kd相关，且表示为Kd＝(Ve-V0)/(Vi-V0)。
在一个优选实施方式中，在CL-4B柱中，至少30％的血清型3糖缀合物的Kd小于或等于0.3。在一个优选实施方式中，在CL-4B柱中，至少40％的糖缀合物的Kd小于或等于0.3。在一个优选实施方式中，在CL-4B柱中，至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％的血清型3糖缀合物的Kd小于或等于0.3。在一个优选实施方式中，在CL-4B柱中，至少60％的血清型3糖缀合物的Kd小于或等于0.3。在一个优选实施方式中，在CL-4B柱中，在50％与80％之间的血清型3糖缀合物的Kd小于或等于0.3。在一个优选实施方式中，在CL-4B柱中，在65％与80％之间的血清型3糖缀合物的Kd小于或等于0.3。
1.3使用点击化学制得的本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物
在一个实施方式中，使用点击化学制备本发明的血清型3糖缀合物。
本公开也是关于制备如本文所公开的血清型3糖缀合物的方法。
根据本公开，点击化学包含以下三个步骤：(a)使分离的血清型3荚膜多糖与碳酸衍生物及叠氮基接头在质子惰性溶剂中进行反应以产生活化的叠氮基多糖(多糖活化)；(b)使载体蛋白与具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，其中NHS部分与氨基进行反应以形成酰胺键，由此获得炔基官能化的载体蛋白(载体蛋白活化)；(c)通过Cu+1介导的叠氮基-炔基环加成反应使步骤(a)的活化的叠氮基多糖与步骤(b)的活化的炔基-载体蛋白进行反应以形成糖缀合物。
在步骤(a)后，多糖可视为活化的且在本文中称为“活化的多糖”或“活化的叠氮基多糖”。
在步骤(b)后，载体可视为活化的且称为“活化的载体”。
如上文所提及，在活化(a)之前，可将多糖改变大小至目标分子量(MW)范围。
因此，在一个实施方式中，在使用碳酸衍生物及叠氮基接头活化之前，将分离的多糖改变大小。
在一个实施方式中，将分离的多糖改变大小至上文所定义的任一靶分子量(MW)范围。
在一个实施方式中，该碳酸衍生物选自1,1’-羰基二咪唑(CDI)、1,1’-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)、碳酸二琥珀酰亚氨基酯(DSC)及氯甲酸N-羟基琥珀酰亚氨基酯。
在一个实施方式中，该碳酸衍生物是1,1’-羰基二咪唑(CDI)。在一个实施方式中，该碳酸衍生物是1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)。在另一实施方式中，该碳酸衍生物是碳酸二琥珀酰亚氨基酯(DSC)。在又一实施方式中，该碳酸衍生物是氯甲酸N-羟基琥珀酰亚氨基酯。
在一个实施方式中，该碳酸衍生物是1,1’-羰基二咪唑(CDI)或1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)。优选地，该碳酸衍生物是1,1’-羰基二咪唑(CDI)。
在一个实施方式中，该叠氮基接头是式(I)的化合物，
H2N-X-N3
其中X选自CH2(CH2)n、(CH2CH2O)mCH2CH2、NHCO(CH2)n、NHCO(CH2CH2O)mCH2CH2、OCH2(CH2)n及O(CH2CH2O)mCH2CH2；其中n选自1至10且m选自1至4。
在一个实施方式中，该叠氮基接头是式(I)的化合物，其中X是CH2(CH2)n，且n选自1至10。在一个实施方式中，n选自1至5。在一个实施方式中，n选自1至4。在一个实施方式中，n选自1至3。在一个实施方式中，n选自1至2。在一个特定实施方式中，n为1。在另一实施方式中，n为2。在又一实施方式中，n为3。在又一实施方式中，n为4。在又一实施方式中，n为5。在又一实施方式中，n为6。在又一实施方式中，n为7。在又一实施方式中，n为8。在又一实施方式中，n为9。在又一实施方式中，n为10。
在一个实施方式中，该叠氮基接头是式(I)的化合物，其中X是(CH2CH2O)mCH2CH2，其中m选自1至4。在一个实施方式中，m选自1至3。在一个实施方式中，m选自1至2。在一个特定实施方式中，m为1。在另一实施方式中，m为2。在又一实施方式中，m为3。在又一实施方式中，m为4。
在一个实施方式中，该叠氮基接头是式(I)的化合物，其中X是NHCO(CH2)n，且n选自1至10。在一个实施方式中，n选自1至5。在一个实施方式中，n选自1至4。在一个实施方式中，n选自1至3。在一个实施方式中，n选自1至2。在一个特定实施方式中，n为1。在另一实施方式中，n为2。在又一实施方式中，n为3。在又一实施方式中，n为4。在又一实施方式中，n为5。在又一实施方式中，n为6。在又一实施方式中，n为7。在又一实施方式中，n为8。在又一实施方式中，n为9。在又一实施方式中，n为10。
在一个实施方式中，该叠氮基接头是式(I)的化合物，其中X是NHCO(CH2CH2O)mCH2CH2，其中m选自1至4。在一个实施方式中，m选自1至3。在一个实施方式中，m选自1至2。在一个特定实施方式中，m为1。在另一实施方式中，m为2。在又一实施方式中，m为3。在又一实施方式中，m为4。
在一个实施方式中，该叠氮基接头是式(I)的化合物，其中X是OCH2(CH2)n，且n选自1至10。在一个实施方式中，n选自1至5。在一个实施方式中，n选自1至4。在一个实施方式中，n选自1至3。在一个实施方式中，n选自1至2。在一个特定实施方式中，n为1。在另一实施方式中，n为2。在又一实施方式中，n为3。在又一实施方式中，n为4。在又一实施方式中，n为5。在又一实施方式中，n为6。在又一实施方式中，n为7。在又一实施方式中，n为8。在又一实施方式中，n为9。在又一实施方式中，n为10。
在一个实施方式中，该叠氮基接头是式(I)的化合物，其中X是O(CH2CH2O)mCH2CH2，其中m选自1至4。在一个实施方式中，m选自1至3。在一个实施方式中，m选自1至2。在一个特定实施方式中，m为1。在另一实施方式中，m为2。在又一实施方式中，m为3。在又一实施方式中，m为4。
在一个实施方式中，该叠氮基接头是式(II)的化合物，
在一个实施方式中，该叠氮基接头是3-叠氮基-丙基胺。
在一个实施方式中，该具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂是具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及末端炔基的药剂。
在一个实施方式中，该具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂是具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及环炔基的药剂。
在一个实施方式中，该具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂是式(III)的化合物，
其中X选自CH2O(CH2)nCH2C＝O及CH2O(CH2CH2O)m(CH2)nCH2C＝O，其中n选自0至10且m选自0至4。
在一个实施方式中，该具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂是式(III)的化合物，其中X是CH2O(CH2)nCH2C＝O，其中n选自0至10。在一个实施方式中，n选自0至5。在一个实施方式中，n选自0至4。在一个实施方式中，n选自0至3。在一个实施方式中，n选自0至2。在一个特定实施方式中，n为0。在一个特定实施方式中，n为1。在另一实施方式中，n为2。在又一实施方式中，n为3。在又一实施方式中，n为4。在又一实施方式中，n为5。在又一实施方式中，n为6。在又一实施方式中，n为7。在又一实施方式中，n为8。在又一实施方式中，n为9。在又一实施方式中，n为10。
在一个实施方式中，该具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂是式(III)的化合物，其中X是CH2O(CH2CH2O)m(CH2)nCH2C＝O，其中n选自0至10且m选自0至4。在一个实施方式中，n选自0至5。在一个实施方式中，n选自0至4。在一个实施方式中，n选自0至3。在一个实施方式中，n选自0至2。在一个特定实施方式中，n为0。在一个特定实施方式中，n为1。在另一实施方式中，n为2。在又一实施方式中，n为3。在又一实施方式中，n为4。在又一实施方式中，n为5。在又一实施方式中，n为6。在又一实施方式中，n为7。在又一实施方式中，n为8。在又一实施方式中，n为9。在又一实施方式中，n为10。在一个实施方式中，m选自0至3。在一个实施方式中，m选自0至2。在一个特定实施方式中，m为1。在一个特定实施方式中，m为1。在另一实施方式中，m为2。在又一实施方式中，m为3。在又一实施方式中，m为4。
在一个实施方式中，n选自0至5且m选自0至3。在一个实施方式中，n选自0至5且m选自0至2。
在一个实施方式中，n选自0至4且m选自0至3。在一个实施方式中，n选自0至4且m选自0至2。
在一个实施方式中，n选自0至3且m选自0至3。在一个实施方式中，n选自0至3且m选自0至2。
在一个实施方式中，n选自0至2且m选自0至3。在一个实施方式中，n选自0至2且m选自0至2。
在一个实施方式中，n选自0至1且m选自0至3。在一个实施方式中，n选自0至1且m选自0至2。
在一个实施方式中，n为0且m为0。在一个实施方式中，n为1且m为0。在一个实施方式中，n为2且m为0。在一个实施方式中，n为3且m为0。在一个实施方式中，n为4且m为0。在一个实施方式中，n为5且m为0。在一个实施方式中，n为6且m为0。在一个实施方式中，n为7且m为0。在一个实施方式中，n为8且m为0。在一个实施方式中，n为9且m为0。在一个实施方式中，n为10且m为0。
在一个实施方式中，n为0且m为1。在一个实施方式中，n为1且m为1。在一个实施方式中，n为2且m为1。在一个实施方式中，n为3且m为1。在一个实施方式中，n为4且m为1。在一个实施方式中，n为5且m为1。在一个实施方式中，n为6且m为1。在一个实施方式中，n为7且m为1。在一个实施方式中，n为8且m为1。在一个实施方式中，n为9且m为1。在一个实施方式中，n为10且m为1。
在一个实施方式中，n为0且m为2。在一个实施方式中，n为1且m为2。在一个实施方式中，n为2且m为2。在一个实施方式中，n为3且m为2。在一个实施方式中，n为4且m为2。在一个实施方式中，n为5且m为2。在一个实施方式中，n为6且m为2。在一个实施方式中，n为7且m为2。在一个实施方式中，n为8且m为2。在一个实施方式中，n为9且m为2。在一个实施方式中，n为10且m为2。
在一个实施方式中，n为0且m为3。在一个实施方式中，n为1且m为3。在一个实施方式中，n为2且m为3。在一个实施方式中，n为3且m为3。在一个实施方式中，n为4且m为3。在一个实施方式中，n为5且m为3。在一个实施方式中，n为6且m为3。在一个实施方式中，n为7且m为3。在一个实施方式中，n为8且m为3。在一个实施方式中，n为9且m为3。在一个实施方式中，n为10且m为3。
在一个实施方式中，n为0且m为4。在一个实施方式中，n为1且m为4。在一个实施方式中，n为2且m为4。在一个实施方式中，n为3且m为4。在一个实施方式中，n为4且m为4。在一个实施方式中，n为5且m为4。在一个实施方式中，n为6且m为4。在一个实施方式中，n为7且m为4。在一个实施方式中，n为8且m为4。在一个实施方式中，n为9且m为4。在一个实施方式中，n为10且m为4。
在一个实施方式中，该具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂是式(IV)的化合物：
在一个实施方式中，步骤a)包含在质子惰性溶剂中使多糖与碳酸衍生物进行反应且随后使经碳酸衍生物活化的多糖与叠氮基接头进行反应以产生活化的叠氮基多糖。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.01-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.05-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.1-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.2-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.3-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.4-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.5-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.8-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的1-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的2-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的3-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的5-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.01-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.05-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.1-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.2-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.3-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.4-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.5-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.8-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的1-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的2-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的3-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.01-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.05-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.1-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.2-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.3-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.4-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.5-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.8-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的1-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的2-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.01-2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.05-2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.1-2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.2-2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.3-2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.4-2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.5-2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.8-2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的1-2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.01-1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.05-1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.1-1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.2-1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.3-1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.4-1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.5-1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.8-1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.01-0.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.05-0.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.1-0.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.2-0.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.3-0.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.4-0.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.01-0.4摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.05-0.4摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.1-0.4摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.2-0.4摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.3-0.4摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.01-0.3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.05-0.3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.1-0.3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的0.2-0.3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的约0.01摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的约0.05摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的约0.08摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的约0.1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的约0.2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的约0.3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的约0.4摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的约0.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的约1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的约2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的约3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的约4摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的约5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的约8摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)包含使多糖与一定量的碳酸衍生物进行反应，该量是反应混合物中存在的血清型3荚膜多糖的量的约10摩尔当量。
在一个实施方式中，在步骤a)处，使分离的多糖与碳酸衍生物在质子惰性溶剂中进行反应。
在一个实施方式中，使分离的多糖与碳酸衍生物在基本上由二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)组成的溶液中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与碳酸衍生物在基本上由二甲基甲酰胺(DMF)组成的溶液中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与碳酸衍生物在基本上由二甲基亚砜(DMSO)组成的溶液中进行反应。
在一个实施方式中，使分离的多糖与碳酸衍生物在基本上由二甲基乙酰胺组成的溶液中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与碳酸衍生物在基本上由N-甲基-2-吡咯啶酮组成的溶液中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与碳酸衍生物在基本上由六甲基磷酰胺(HMPA)组成的溶液中进行反应。
在一个优选实施方式中，使分离的多糖与碳酸衍生物在基本上由二甲基亚砜(DMSO)组成的溶液中进行反应。
在一个实施方式中，使分离的多糖与碳酸衍生物在二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与碳酸衍生物在二甲基甲酰胺(DMF)中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与碳酸衍生物在二甲基亚砜(DMSO)中进行反应。
在一个实施方式中，使分离的多糖与碳酸衍生物在二甲基乙酰胺中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与碳酸衍生物在N-甲基-2-吡咯啶酮中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与碳酸衍生物在六甲基磷酰胺(HMPA)中进行反应。
在一个优选实施方式中，使分离的多糖与CDI在二甲基亚砜(DMSO)中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在无水DMSO中进行反应。
已令人吃惊地发现，使分离的多糖与CDI在水分含量为约0.1％至1％(v/v)的环境中进行反应使得可避免副反应。因此，在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.1％至1％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.1％至0.8％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.1％至0.5％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.1％至0.4％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.1％至0.3％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.1％至0.2％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。
在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.2％至1％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.2％至0.8％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.2％至0.5％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.2％至0.4％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.2％至0.3％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。
在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.3％至0.8％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.3％至0.5％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.3％至0.4％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。
在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含约0.1％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含约0.2％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含约0.3％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含约0.4％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含约0.5％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含约0.6％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含约0.7％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含约0.8％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含约0.9％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。
在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.1％至1％(v/v)水的DMSO中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.1％至0.8％(v/v)水的DMSO中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.1％至0.5％(v/v)水的DMSO中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.1％至0.4％(v/v)水的DMSO中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.1％至0.3％(v/v)水的DMSO中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.1％至0.2％(v/v)水的DMSO中进行反应。
在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.2％至1％(v/v)水的DMSO中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.2％至0.8％(v/v)水的DMSO中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.2％至0.5％(v/v)水的DMSO中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.2％至0.4％(v/v)水的DMSO中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.2％至0.3％(v/v)水的DMSO中进行反应。
在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.3％至0.8％(v/v)水的DMSO中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.3％至0.5％(v/v)水的DMSO中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含0.3％至0.4％(v/v)水的DMSO中进行反应。
在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含约0.1％(v/v)水的DMSO中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含约0.2％(v/v)水的DMSO中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含约0.3％(v/v)水的DMSO中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含约0.4％(v/v)水的DMSO中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含约0.5％(v/v)水的DMSO中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含约0.6％(v/v)水的DMSO中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含约0.7％(v/v)水的DMSO中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含约0.8％(v/v)水的DMSO中进行反应。在一个实施方式中，使分离的多糖与CDI在包含约0.9％(v/v)水的DMSO中进行反应。
在一个实施方式中，然后通过在添加叠氮基接头之前添加水来淬灭游离碳酸衍生物。水可失活游离CDI。
因此，在一个实施方式中，在碳酸衍生物活化后添加水。在一个实施方式中，添加水以使混合物中的总水含量达到约1％至约10％(v/v)之间。在一个实施方式中，添加水以使混合物中的总水含量达到约1.2％至约8％(v/v)之间。在一个实施方式中，添加水以使混合物中的总水含量达到约1.5％至约5％(v/v)之间。在一个实施方式中，添加水以使混合物中的总水含量达到约1.5％至约3％(v/v)之间。在一个实施方式中，添加水以使混合物中的总水含量达到约1.5％至约2.5％(v/v)之间。在一个实施方式中，添加水以使混合物中的总水含量达到约1％(v/v)。在一个实施方式中，添加水以使混合物中的总水含量达到约1.2％(v/v)。在一个实施方式中，添加水以使混合物中的总水含量达到约1.4％(v/v)。在一个实施方式中，添加水以使混合物中的总水含量达到约1.5％(v/v)。在一个实施方式中，添加水以使混合物中的总水含量达到约2％(v/v)。在一个实施方式中，添加水以使混合物中的总水含量达到约2.5％(v/v)。在一个实施方式中，添加水以使混合物中的总水含量达到约3％(v/v)。在一个实施方式中，添加水以使混合物中的总水含量达到约5％(v/v)。在一个实施方式中，添加水以使混合物中的总水含量达到约7％(v/v)。在一个实施方式中，添加水以使混合物中的总水含量达到约10％(v/v)。
当多糖已与碳酸衍生物发生反应后，且接着在最后使用水淬灭碳酸衍生物后，使经碳酸衍生物活化的多糖与叠氮基接头进行反应。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量(RU的摩尔当量)的0.01-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.01-8摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.01-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.01-4摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.01-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.01-2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.01-1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.01-0.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.01-0.1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.05-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.05-8摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.05-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.05-4摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.05-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.05-2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.05-1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.05-0.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.05-0.1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.1-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.1-8摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.1-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.1-4摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.1-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.1-2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.1-1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.1-0.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.5-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.5-8摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量活化的多糖中多糖重复单元的量是的0.5-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.5-4摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.5-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.5-2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.5-1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的1-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖多糖重复单元的量的1-8摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的1-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的1-4摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的1-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的1-2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的2-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的2-8摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的2-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的2-4摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的2-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的3-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的3-8摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的3-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的3-4摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的4-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的4-8摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的4-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的5-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的5-8摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的8-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约0.01摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约0.05摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约0.1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约0.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约4摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约8摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约10摩尔当量。
在上述实施方式中，该碳酸衍生物优选是CDI。在另一实施方式中，该碳酸衍生物是CDT。
在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度在0.5％至50％之间。叠氮基多糖的活化度定义为连接至叠氮基接头的重复单元的百分比。
在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度在1％至30％之间。在另一实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度在2％至25％之间。在另一实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度在3％至20％之间。
在另一实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度在3％至15％之间。在另一实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度在4％至15％之间。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度在1％至6％之间。
在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度在3％至6％之间。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度在10％至15％之间。
在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约1％。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约2％。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约3％。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约4％。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约5％。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约6％。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约7％。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约8％。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约9％。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约10％。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约11％。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约12％。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约13％。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约14％。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约15％。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约16％。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约17％。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约18％。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约19％。在一个实施方式中，在步骤a)后活化的多糖的活化度为约20％。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的0.1-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的0.5-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的1-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的1.5-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的2-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的2.5-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的3-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的5-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的7.5-10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的0.1-7.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的0.5-7.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的1-7.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的1.5-7.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的2-7.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的2.5-7.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的3-7.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的5-7.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的0.1-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的0.5-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的1-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的1.5-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的2-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的2.5-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的3-5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的0.1-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的0.5-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的1-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的1.5-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的2-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的2.5-3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的0.1-2.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的0.5-2.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的1-2.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的1.5-2.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的2-2.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的0.1-2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的0.5-2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的1-2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的1.5-2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的0.1-1.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的0.5-1.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的1-1.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的0.1-1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的0.5-1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的0.1-0.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的约10摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的约7.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的约5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的约3摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的约2.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的约2摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的约1.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的约1摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的约0.5摩尔当量。
在一个实施方式中，步骤b)包括使载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是载体上的赖氨酸的约0.1摩尔当量。
在一个实施方式中，在步骤b)后活化的载体的活化度在1与50之间。活化的载体的活化度定义为载体蛋白中变得连接至具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂的赖氨酸残基数。
在一个实施方式中，载体蛋白是含有39个赖氨酸残基的CRM197。在该实施方式中，在步骤b)后活化的载体的活化度可在1至30之间。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度在5至20之间。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度在9至18之间。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度在8至11之间。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度在15至20之间。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约5。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约6。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约7。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约8。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约9。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约10。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约11。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约12。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约13。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约14。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约15。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约16。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约17。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约18。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约19。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约20。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约21。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约22。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约23。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约24。在另一实施方式中，活化的载体(CRM197)在步骤b)后的活化度为约25。
在一个实施方式中，载体蛋白是SCP或其片段。在该实施方式中，在步骤b)后活化的载体的活化度可在1至50之间。
在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度在5至50之间。在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度在7至45之间。在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度在5至15之间。在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度在20至30之间。在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度在30至50之间。在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度在30至40之间。在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度在10至40之间。在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度为约5。在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度为约7。在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度为约10。在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度为约13。在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度为约15。在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度为约20。在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度为约26。在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度为约30。在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度为约35。在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度为约37。在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度为约40。在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度为约45。在另一实施方式中，活化的载体(SCP)在步骤b)后的活化度为约50。
在一个实施方式中，载体蛋白是TT或其片段。在该实施方式中，在步骤b)后活化的载体的活化度可在1至30之间。
在另一实施方式中，活化的载体(TT)在步骤b)后的活化度在5至25之间。在另一实施方式中，活化的载体(TT)在步骤b)后的活化度在7至25之间。在另一实施方式中，活化的载体(TT)在步骤b)后的活化度在10至20之间。在另一实施方式中，活化的载体(TT)在步骤b)后的活化度为约5。在另一实施方式中，活化的载体(TT)在步骤b)后的活化度为约7。在另一实施方式中，活化的载体(TT)在步骤b)后的活化度为约10。在另一实施方式中，活化的载体(TT)在步骤b)后的活化度为约12。在另一实施方式中，活化的载体(TT)在步骤b)后的活化度为约15。在另一实施方式中，活化的载体(TT)在步骤b)后的活化度为约20。在另一实施方式中，活化的载体(TT)在步骤b)后的活化度为约25。在另一实施方式中，活化的载体(TT)在步骤b)后的活化度为约30。
在一个实施方式中，在水性缓冲液中进行缀合反应c)。在一个实施方式中，于水性缓冲液中在作为催化剂的铜(I)存在下实施缀合反应c)。在一个实施方式中，于水性缓冲液中在氧化剂及作为催化剂的铜(I)存在下实施缀合反应c)。在一个优选实施方式中，于水性缓冲液中在作为催化剂的铜(I)及作为氧化剂的抗坏血酸盐存在下实施缀合反应c)。在一个实施方式中，可进一步添加THPTA(参(3-羟丙基三唑基甲基)胺)及氨基胍以保护蛋白质免于副反应。因此，在一个优选实施方式中，于水性缓冲液中在作为催化剂的铜(I)及作为氧化剂的抗坏血酸盐存在下实施缀合反应c)，其中反应混合物进一步包含THPTA(参(3-羟丙基三唑基甲基)胺)及氨基胍。
在一个实施方式中，步骤c)活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)在0.1与3之间。在一个实施方式中，步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)在0.5与2之间。在一个实施方式中，步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)在0.6与1.5之间。在一个优选实施方式中，步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)在0.8与1之间。在一个实施方式中，步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)为约0.5。在一个实施方式中，步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)为约0.6。在一个实施方式中，步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)为约0.7。在一个实施方式中，步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)为约0.8。在一个实施方式中，步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)为约0.9。在一个实施方式中，步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)为约1。在一个实施方式中，步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)为约1.1。在一个实施方式中，步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)为约1.2。在一个实施方式中，步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)为约1.3。在一个实施方式中，步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)为约1.4。在一个实施方式中，步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)为约1.5。在一个实施方式中，步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)为约1.6。在一个实施方式中，步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)为约1.7。在一个实施方式中，步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)为约1.8。在一个实施方式中，步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)为约1.9。在一个实施方式中，步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)为约2。
在点击缀合反应后，未反应的叠氮基可保留于缀合物中，可使用适宜叠氮基封端剂将此类基团封端。因此，在一个实施方式中，在步骤c)后，使用适宜叠氮基封端剂将缀合物中的未反应的叠氮基封端。在一个实施方式中，此叠氮基封端剂是具有炔基的药剂。在一个实施方式中，此叠氮基封端剂是具有末端炔基的药剂。在一个实施方式中，此叠氮基封端剂是具有环炔基的药剂。
在一个实施方式中，该叠氮基封端剂是式(V)的化合物，
＝-X-OH
其中X是(CH2)n，其中n选自1至15。
在一个实施方式中，该叠氮基封端剂是炔丙醇。
因此，在一个实施方式中，在步骤(c)后，该过程进一步包含用叠氮基封端剂将保留于缀合物中的未反应的叠氮基封端的步骤。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的叠氮基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.05摩尔至20摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的叠氮基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.1摩尔至15摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的叠氮基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.5摩尔至10摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的叠氮基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.5摩尔至5摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的叠氮基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.5摩尔至2摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的叠氮基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.5摩尔至1摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的叠氮基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的1摩尔至2摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的叠氮基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.75摩尔至1.5摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的叠氮基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约1摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的叠氮基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约1.5摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的叠氮基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约0.5摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的叠氮基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约2摩尔当量。
在点击缀合反应后，未反应的炔基可仍存在于缀合物中，可使用合适的炔基封端剂将此类基团封端。在一个实施方式中，此炔基封端剂是具有叠氮基的药剂。
在一个实施方式中，该炔基封端剂是式(VI)的化合物，
N3-X-OH
其中X是(CH2)n，其中n选自1至15。
在一个实施方式中，此炔基封端剂是3-叠氮基-1-丙醇。
因此，在一个实施方式中，在步骤(c)后，该过程进一步包含使用炔基封端剂将保留于缀合物中的未反应的炔基封端的步骤。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的炔基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.05摩尔至20摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的炔基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.1摩尔至15摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的炔基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.5摩尔至10摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的炔基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.5摩尔至5摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的炔基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.5摩尔至2摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的炔基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的0.5摩尔至1摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的炔基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的1摩尔至5摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的炔基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的1摩尔至2摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的炔基实施封端，该量是活化的多糖的多糖重复单元的量1.5摩尔至2.5摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的炔基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约0.5摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的炔基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约1摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的炔基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约1.5摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的炔基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约2摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的炔基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约2.5摩尔当量。
在一个实施方式中，使用一定量的封端剂对未反应的炔基实施封端，该量是活化的多糖中多糖重复单元的量的约5摩尔当量。
在缀合至载体蛋白后，可通过本领域技术人员已知的多种技术来纯化糖缀合物(相对于糖-蛋白质缀合物的量进行富集)。此类技术包括透析、浓縮/渗滤操作、切向流过滤沉淀/洗脱、柱层析(DEAE或疏水相互作用层析)及深度过滤。因此，在一个实施方式中，产生本发明的糖缀合物的过程包含在产生之后纯化糖缀合物的步骤。
在一方面中，本发明提供了根据本文所公开的任一方法产生的血清型3糖缀合物。
在一方面中，本发明提供了血清型3糖缀合物，其包含通过间隔子缀合至载体蛋白(CP)的血清型3糖共价且具有通式(VII)：
其中X选自CH2(CH2)n’、(CH2CH2O)mCH2CH2、NHCO(CH2)n’、NHCO(CH2CH2O)mCH2CH2、OCH2(CH2)n’及O(CH2CH2O)mCH2CH2；其中n’选自1至10且m选自1至4，
且其中X'选自CH2O(CH2)n”CH2C＝O、CH2O(CH2CH2O)m’(CH2)n”CH2C＝O，其中n”选自0至10且m’选自0至4。
式(VII)是本发明的血清型3糖缀合物的示意图示。不应理解，连接存在于糖的每一重复单元处。而是，大部分肺炎链球菌血清型3糖重复单元保持未修饰且载体蛋白与糖之间的共价连接仅涉及少数糖重复单元。另外，单独的载体蛋白(CP)分子可连接至一个以上肺炎链球菌血清型3糖分子且单独的肺炎链球菌血清型3糖分子可连接至一个以上单独的载体蛋白(CP)分子。
在一个优选实施方式中，本发明提供了血清型3糖缀合物，其包含通过间隔子共价缀合至载体蛋白(CP)的血清型3糖且具有通式(VII)，其中X是CH2(CH2)n’，其中n’为2且其中X'是CH2O(CH2)n”CH2C＝O，其中n”为1。
在一个实施方式中，本发明提供了血清型3糖缀合物，其包含通过间隔子共价缀合至载体蛋白(CP)的血清型3糖且具有通式(VII)，其中X是CH2(CH2)n’，其中n’选自1至10且其中X'是CH2O(CH2)n”CH2C＝O，其中n”选自0至10。在一个实施方式中，n’选自1至5且n”选自0至10。在一个实施方式中，n’选自1至5且n”选自0至5。在一个实施方式中，n’选自1至3且n”选自0至3。在一个实施方式中，n’选自1至2且n”选自0至2。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为0。在另一实施方式中，n’为2且n”为0。在又一实施方式中，n’为3且n”为0。在又一实施方式中，n’为4且n”为0。在又一实施方式中，n’为5且n”为0。在又一实施方式中，n’为6且n”为0。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为1。在另一实施方式中，n’为2且n”为1。在又一实施方式中，n’为3且n”为1。在又一实施方式中，n’为4且n”为1。在又一实施方式中，n’为5且n”为1。在又一实施方式中，n’为6且n”为1。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为2。在另一实施方式中，n’为2且n”为2。在又一实施方式中，n’为3且n”为2。在又一实施方式中，n’为4且n”为2。在又一实施方式中，n’为5且n”为2。在又一实施方式中，n’为6且n”为2。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为3。在另一实施方式中，n’为2且n”为3。在又一实施方式中，n’为3且n”为3。在又一实施方式中，n’为4且n”为3。在又一实施方式中，n’为5且n”为3。在又一实施方式中，n’为6且n”为3。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为4。在另一实施方式中，n’为2且n”为4。在又一实施方式中，n’为3且n”为4。在又一实施方式中，n’为4且n”为4。在又一实施方式中，n’为5且n”为4。在又一实施方式中，n’为6且n”为4。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为5。在另一实施方式中，n’为2且n”为5。在又一实施方式中，n’为3且n”为5。在又一实施方式中，n’为4且n”为5。在又一实施方式中，n’为5且n”为5。在又一实施方式中，n’为6且n”为5。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为6。在另一实施方式中，n’为2且n”为6。在又一实施方式中，n’为3且n”为6。在又一实施方式中，n’为4且n”为6。在又一实施方式中，n’为5且n”为6。在又一实施方式中，n’为6且n”为6。
在一个实施方式中，本发明提供了血清型3糖缀合物，其包含通过间隔子共价缀合至载体蛋白(CP)的血清型3糖且具有通式(VII)，其中X是CH2(CH2)n’，其中n’选自1至10，且其中X’是CH2O(CH2CH2O)m’(CH2)n”CH2C＝O，其中n”选自0至10且m’选自0至4。
在一个实施方式中，n’选自1至5，m’选自0至4且n”选自0至10。在一个实施方式中，n’选自1至5，m’选自0至4且n”选自0至5。在一个实施方式中，n’选自1至3，m’选自0至2且n”选自0至3。在一个实施方式中，n’选自1至2，m’选自0至2且n”选自0至1。
在一个特定实施方式中，n’为1，m’为0且n”为0。在另一实施方式中，n’为1，m’为1且n”为0。在另一实施方式中，n’为1，m’为2且n”为0。在另一实施方式中，n’为1，m’为3且n”为0。
在另一实施方式中，n’为2，m’为0且n”为0。在另一实施方式中，n’为2，m’为1且n”为0。在另一实施方式中，n’为2，m’为2且n”为0。在另一实施方式中，n’为2，m’为3且n”为0。
在又一实施方式中，n’为3，m’为0且n”为0。在又一实施方式中，n’为3，m’为1且n”为0。在又一实施方式中，n’为3，m’为2且n”为0。在又一实施方式中，n’为3，m’为3且n”为0。
在又一实施方式中，n’为4，m’为0且n”为0。在又一实施方式中，n’为4，m’为1且n”为0。在又一实施方式中，n’为4，m’为2且n”为0。在又一实施方式中，n’为4，m’为3且n”为0。
在又一实施方式中，n’为5，m’为0且n”为0。在又一实施方式中，n’为5，m’为1且n”为0。在又一实施方式中，n’为5，m’为2且n”为0。在又一实施方式中，n’为5，m’为3且n”为0。
在一个特定实施方式中，n’为1，m’为0且n”为1。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为1且n”为1。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为2且n”为1。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为3且n”为1。
在另一实施方式中，n’为2，m’为0且n”为1。在另一实施方式中，n’为2，m’为1且n”为1。在另一实施方式中，n’为2，m’为2且n”为1。在另一实施方式中，n’为2，m’为3且n”为1。
在又一实施方式中，n’为3，m’为0且n”为1。在又一实施方式中，n’为3，m’为1且n”为1。在又一实施方式中，n’为3，m’为2且n”为1。在又一实施方式中，n’为3，m’为3且n”为1。
在又一实施方式中，n’为4，m’为0且n”为1。在又一实施方式中，n’为4，m’为1且n”为1。在又一实施方式中，n’为4，m’为2且n”为1。在又一实施方式中，n’为4，m’为3且n”为1。
在又一实施方式中，n’为5，m’为0且n”为1。在又一实施方式中，n’为5，m’为1且n”为1。在又一实施方式中，n’为5，m’为2且n”为1。在又一实施方式中，n’为5，m’为3且n”为1。
在一个特定实施方式中，n’为1，m’为0且n”为2。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为1且n”为2。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为2且n”为2。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为3且n”为2。
在另一实施方式中，n’为2，m’为0且n”为2。在另一实施方式中，n’为2，m’为1且n”为2。在另一实施方式中，n’为2，m’为2且n”为2。在另一实施方式中，n’为2，m’为3且n”为2。
在又一实施方式中，n’为3，m’为0且n”为2。在又一实施方式中，n’为3，m’为1且n”为2。在又一实施方式中，n’为3，m’为2且n”为2。在又一实施方式中，n’为3，m’为3且n”为2。
在又一实施方式中，n’为4，m’为0且n”为2。在又一实施方式中，n’为4，m’为1且n”为2。在又一实施方式中，n’为4，m’为2且n”为2。在又一实施方式中，n’为4，m’为3且n”为2。
在又一实施方式中，n’为5，m’为0且n”为2。在又一实施方式中，n’为5，m’为1且n”为2。在又一实施方式中，n’为5，m’为2且n”为2。在又一实施方式中，n’为5，m’为3且n”为2。
在一个特定实施方式中，n’为1，m’为0且n”为3。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为1且n”为3。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为2且n”为3。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为3且n”为3。
在另一实施方式中，n’为2，m’为0且n”为3。在另一实施方式中，n’为2，m’为1且n”为3。在另一实施方式中，n’为2，m’为2且n”为3。在另一实施方式中，n’为2，m’为3且n”为3。
在又一实施方式中，n’为3，m’为0且n”为3。在又一实施方式中，n’为3，m’为1且n”为3。在又一实施方式中，n’为3，m’为2且n”为3。在又一实施方式中，n’为3，m’为3且n”为3。
在又一实施方式中，n’为4，m’为0且n”为3。在又一实施方式中，n’为4，m’为1且n”为3。在又一实施方式中，n’为4，m’为2且n”为3。在又一实施方式中，n’为4，m’为3且n”为3。
在又一实施方式中，n’为5，m’为0且n”为3。在又一实施方式中，n’为5，m’为1且n”为3。在又一实施方式中，n’为5，m’为2且n”为3。在又一实施方式中，n’为5，m’为3且n”为3。
在一个特定实施方式中，n’为1，m’为0且n”为4。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为1且n”为4。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为2且n”为4。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为3且n”为4。
在另一实施方式中，n’为2，m’为0且n”为4。在另一实施方式中，n’为2，m’为1且n”为4。在另一实施方式中，n’为2，m’为2且n”为4。在另一实施方式中，n’为2，m’为3且n”为4。
在又一实施方式中，n’为3，m’为0且n”为4。在又一实施方式中，n’为3，m’为1且n”为4。在又一实施方式中，n’为3，m’为2且n”为4。在又一实施方式中，n’为3，m’为3且n”为4。
在又一实施方式中，n’为4，m’为0且n”为4。在又一实施方式中，n’为4，m’为1且n”为4。在又一实施方式中，n’为4，m’为2且n”为4。在又一实施方式中，n’为4，m’为3且n”为4。
在又一实施方式中，n’为5，m’为0且n”为4。在又一实施方式中，n’为5，m’为1且n”为4。在又一实施方式中，n’为5，m’为2且n”为4。在又一实施方式中，n’为5，m’为3且n”为4。
在一个特定实施方式中，n’为1，m’为0且n”为5。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为1且n”为5。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为2且n”为5。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为3且n”为5。
在另一实施方式中，n’为2，m’为0且n”为5。在另一实施方式中，n’为2，m’为1且n”为5。在另一实施方式中，n’为2，m’为2且n”为5。在另一实施方式中，n’为2，m’为3且n”为5。
在又一实施方式中，n’为3，m’为0且n”为5。在又一实施方式中，n’为3，m’为1且n”为5。在又一实施方式中，n’为3，m’为2且n”为5。在又一实施方式中，n’为3，m’为3且n”为5。
在又一实施方式中，n’为4，m’为0且n”为5。在又一实施方式中，n’为4，m’为1且n”为5。在又一实施方式中，n’为4，m’为2且n”为5。在又一实施方式中，n’为4，m’为3且n”为5。
在又一实施方式中，n’为5，m’为0且n”为5。在又一实施方式中，n’为5，m’为1且n”为5。在又一实施方式中，n’为5，m’为2且n”为5。在又一实施方式中，n’为5，m’为3且n”为5。
在一个实施方式中，本发明提供了血清型3糖缀合物，其包含通过间隔子共价缀合至载体蛋白(CP)的血清型3糖且具有通式(VII)，其中X是(CH2CH2O)mCH2CH2，其中m选自1至4且其中X'是CH2O(CH2)n”CH2C＝O，其中n”选自0至10。在一个实施方式中，m选自1至3且n”选自0至10。在一个实施方式中，m选自1至3且n”选自0至5。在一个实施方式中，m选自1至2且n”选自0至3。在一个实施方式中，m选自1至2且n”选自0至2。在一个特定实施方式中，m为1且n”为0。在另一实施方式中，m为2且n”为0。在又一实施方式中，m为3且n”为0。在又一实施方式中，m为4且n”为0。在一个特定实施方式中，m为1且n”为1。在另一实施方式中，m为2且n”为1。在又一实施方式中，m为3且n”为1。在又一实施方式中，m为4且n”为1。在一个特定实施方式中，m为1且n”为2。在另一实施方式中，m为2且n”为2。在又一实施方式中，m为3且n”为2。在又一实施方式中，m为4且n”为2。在一个特定实施方式中，m为1且n”为3。在另一实施方式中，m为2且n”为3。在又一实施方式中，m为3且n”为3。在又一实施方式中，m为4且n”为3。在一个特定实施方式中，m为1且n”为4。在另一实施方式中，m为2且n”为4。在又一实施方式中，m为3且n”为4。在又一实施方式中，m为4且n”为4。在一个特定实施方式中，m为1且n”为5。在另一实施方式中，m为2且n”为5。在又一实施方式中，m为3且n”为5。在又一实施方式中，m为4且n”为5。在一个特定实施方式中，m为1且n”为6。在另一实施方式中，m为2且n”为6。在又一实施方式中，m为3且n”为6。在又一实施方式中，m为4且n”为6。
在一个实施方式中，本发明提供了血清型3糖缀合物，其包含通过间隔子共价缀合至载体蛋白(CP)的血清型3糖且具有通式(VII)，其中X是(CH2CH2O)mCH2CH2，其中m选自1至4；且其中X’是CH2O(CH2CH2O)m’(CH2)n”CH2C＝O，其中n”选自0至10且m’选自0至4。
在一个实施方式中，m选自1至3，m’选自0至4且n”选自0至10。在一个实施方式中，m选自1至2，m’选自0至4且n”选自0至5。在一个实施方式中，m选自1至2，m’选自0至2且n”选自0至3。在一个实施方式中，m选自1至2，m’选自0至2且n”选自0至1。
在一个特定实施方式中，m为1，m’为0且n”为0。在另一实施方式中，m为1，m’为1且n”为0。在另一实施方式中，m为1，m’为2且n”为0。在另一实施方式中，m为1，m’为3且n”为0。
在另一实施方式中，m为2，m’为0且n”为0。在另一实施方式中，m为2，m’为1且n”为0。在另一实施方式中，m为2，m’为2且n”为0。在另一实施方式中，m为2，m’为3且n”为0。
在又一实施方式中，m为3，m’为0且n”为0。在又一实施方式中，m为3，m’为1且n”为0。在又一实施方式中，m为3，m’为2且n”为0。在又一实施方式中，m为3，m’为3且n”为0。
在又一实施方式中，m为4，m’为0且n”为0。在又一实施方式中，m为4，m’为1且n”为0。在又一实施方式中，m为4，m’为2且n”为0。在又一实施方式中，m为4，m’为3且n”为0。
在一个特定实施方式中，m为1，m’为0且n”为1。在一个特定实施方式中，m为1，m’为1且n”为1。在一个特定实施方式中，m为1，m’为2且n”为1。在一个特定实施方式中，m为1，m’为3且n”为1。
在另一实施方式中，m为2，m’为0且n”为1。在另一实施方式中，m为2，m’为1且n”为1。在另一实施方式中，m为2，m’为2且n”为1。在另一实施方式中，m为2，m’为3且n”为1。
在又一实施方式中，m为3，m’为0且n”为1。在又一实施方式中，m为3，m’为1且n”为1。在又一实施方式中，m为3，m’为2且n”为1。在又一实施方式中，m为3，m’为3且n”为1。
在又一实施方式中，m为4，m’为0且n”为1。在又一实施方式中，m为4，m’为1且n”为1。在又一实施方式中，m为4，m’为2且n”为1。在又一实施方式中，m为4，m’为3且n”为1。
在一个特定实施方式中，m为1，m’为0且n”为2。在一个特定实施方式中，m为1，m’为1且n”为2。在一个特定实施方式中，m为1，m’为2且n”为2。在一个特定实施方式中，m为1，m’为3且n”为2。
在另一实施方式中，m为2，m’为0且n”为2。在另一实施方式中，m为2，m’为1且n”为2。在另一实施方式中，m为2，m’为2且n”为2。在另一实施方式中，m为2，m’为3且n”为2。
在又一实施方式中，m为3，m’为0且n”为2。在又一实施方式中，m为3，m’为1且n”为2。在又一实施方式中，m为3，m’为2且n”为2。在又一实施方式中，m为3，m’为3且n”为2。
在又一实施方式中，m为4，m’为0且n”为2。在又一实施方式中，m为4，m’为1且n”为2。在又一实施方式中，m为4，m’为2且n”为2。在又一实施方式中，m为4，m’为3且n”为2。
在一个特定实施方式中，m为1，m’为0且n”为3。在一个特定实施方式中，m为1，m’为1且n”为3。在一个特定实施方式中，m为1，m’为2且n”为3。在一个特定实施方式中，m为1，m’为3且n”为3。
在另一实施方式中，m为2，m’为0且n”为3。在另一实施方式中，m为2，m’为1且n”为3。在另一实施方式中，m为2，m’为2且n”为3。在另一实施方式中，m为2，m’为3且n”为3。
在又一实施方式中，m为3，m’为0且n”为3。在又一实施方式中，m为3，m’为1且n”为3。在又一实施方式中，m为3，m’为2且n”为3。在又一实施方式中，m为3，m’为3且n”为3。
在又一实施方式中，m为4，m’为0且n”为3。在又一实施方式中，m为4，m’为1且n”为3。在又一实施方式中，m为4，m’为2且n”为3。在又一实施方式中，m为4，m’为3且n”为3。
在一个特定实施方式中，m为1，m’为0且n”为4。在一个特定实施方式中，m为1，m’为1且n”为4。在一个特定实施方式中，m为1，m’为2且n”为4。在一个特定实施方式中，m为1，m’为3且n”为4。
在另一实施方式中，m为2，m’为0且n”为4。在另一实施方式中，m为2，m’为1且n”为4。在另一实施方式中，m为2，m’为2且n”为4。在另一实施方式中，m为2，m’为3且n”为4。
在又一实施方式中，m为3，m’为0且n”为4。在又一实施方式中，m为3，m’为1且n”为4。在又一实施方式中，m为3，m’为2且n”为4。在又一实施方式中，m为3，m’为3且n”为4。
在又一实施方式中，m为4，m’为0且n”为4。在又一实施方式中，m为4，m’为1且n”为4。在又一实施方式中，m为4，m’为2且n”为4。在又一实施方式中，m为4，m’为3且n”为4。
在一个特定实施方式中，m为1，m’为0且n”为5。在一个特定实施方式中，m为1，m’为1且n”为5。在一个特定实施方式中，m为1，m’为2且n”为5。在一个特定实施方式中，m为1，m’为3且n”为5。
在另一实施方式中，m为2，m’为0且n”为5。在另一实施方式中，m为2，m’为1且n”为5。在另一实施方式中，m为2，m’为2且n”为5。在另一实施方式中，m为2，m’为3且n”为5。
在又一实施方式中，m为3，m’为0且n”为5。在又一实施方式中，m为3，m’为1且n”为5。在又一实施方式中，m为3，m’为2且n”为5。在又一实施方式中，m为3，m’为3且n”为5。
在又一实施方式中，m为4，m’为0且n”为5。在又一实施方式中，m为4，m’为1且n”为5。在又一实施方式中，m为4，m’为2且n”为5。在又一实施方式中，m为4，m’为3且n”为5。
在一个实施方式中，本发明提供了血清型3糖缀合物，其包含通过间隔子共价缀合至载体蛋白(CP)的血清型3糖且具有通式(VII)，其中X是NHCO(CH2)n’，其中n’选自1至10；且其中X’是CH2O(CH2)n”CH2C＝O，其中n”选自0至10。在一个实施方式中，n’选自1至5且n”选自0至10。在一个实施方式中，n’选自1至5且n”选自0至5。在一个实施方式中，n’选自1至3且n”选自0至3。在一个实施方式中，n’选自1至2且n”选自0至2。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为0。在另一实施方式中，n’为2且n”为0。在又一实施方式中，n’为3且n”为0。在又一实施方式中，n’为4且n”为0。在又一实施方式中，n’为5且n”为0。在又一实施方式中，n’为6且n”为0。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为1。在另一实施方式中，n’为2且n”为1。在又一实施方式中，n’为3且n”为1。在又一实施方式中，n’为4且n”为1。在又一实施方式中，n’为5且n”为1。在又一实施方式中，n’为6且n”为1。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为2。在另一实施方式中，n’为2且n”为2。在又一实施方式中，n’为3且n”为2。在又一实施方式中，n’为4且n”为2。在又一实施方式中，n’为5且n”为2。在又一实施方式中，n’为6且n”为2。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为3。在另一实施方式中，n’为2且n”为3。在又一实施方式中，n’为3且n”为3。在又一实施方式中，n’为4且n”为3。在又一实施方式中，n’为5且n”为3。在又一实施方式中，n’为6且n”为3。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为4。在另一实施方式中，n’为2且n”为4。在又一实施方式中，n’为3且n”为4。在又一实施方式中，n’为4且n”为4。在又一实施方式中，n’为5且n”为4。在又一实施方式中，n’为6且n”为4。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为5。在另一实施方式中，n’为2且n”为5。在又一实施方式中，n’为3且n”为5。在又一实施方式中，n’为4且n”为5。在又一实施方式中，n’为5且n”为5。在又一实施方式中，n’为6且n”为5。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为6。在另一实施方式中，n’为2且n”为6。在又一实施方式中，n’为3且n”为6。在又一实施方式中，n’为4且n”为6。在又一实施方式中，n’为5且n”为6。在又一实施方式中，n’为6且n”为6。
在一个实施方式中，本发明提供了血清型3糖缀合物，其包含通过间隔子共价缀合至载体蛋白(CP)的血清型3糖且具有通式(VII)，其中X是NHCO(CH2)n’，其中n’选自1至10；且其中X’是CH2O(CH2CH2O)m’(CH2)n”CH2C＝O，其中n”选自0至10且m’选自0至4。
在一个实施方式中，n’选自1至5，m’选自0至4且n”选自0至10。在一个实施方式中，n’选自1至5，m’选自0至4且n”选自0至5。在一个实施方式中，n’选自1至3，m’选自0至2且n”选自0至3。在一个实施方式中，n’选自1至2，m’选自0至2且n”选自0至1。
在一个特定实施方式中，n’为1，m’为0且n”为0。在另一实施方式中，n’为1，m’为1且n”为0。在另一实施方式中，n’为1，m’为2且n”为0。在另一实施方式中，n’为1，m’为3且n”为0。
在另一实施方式中，n’为2，m’为0且n”为0。在另一实施方式中，n’为2，m’为1且n”为0。在另一实施方式中，n’为2，m’为2且n”为0。在另一实施方式中，n’为2，m’为3且n”为0。
在又一实施方式中，n’为3，m’为0且n”为0。在又一实施方式中，n’为3，m’为1且n”为0。在又一实施方式中，n’为3，m’为2且n”为0。在又一实施方式中，n’为3，m’为3且n”为0。
在又一实施方式中，n’为4，m’为0且n”为0。在又一实施方式中，n’为4，m’为1且n”为0。在又一实施方式中，n’为4，m’为2且n”为0。在又一实施方式中，n’为4，m’为3且n”为0。
在又一实施方式中，n’为5，m’为0且n”为0。在又一实施方式中，n’为5，m’为1且n”为0。在又一实施方式中，n’为5，m’为2且n”为0。在又一实施方式中，n’为5，m’为3且n”为0。
在一个特定实施方式中，n’为1，m’为0且n”为1。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为1且n”为1。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为2且n”为1。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为3且n”为1。
在另一实施方式中，n’为2，m’为0且n”为1。在另一实施方式中，n’为2，m’为1且n”为1。在另一实施方式中，n’为2，m’为2且n”为1。在另一实施方式中，n’为2，m’为3且n”为1。
在又一实施方式中，n’为3，m’为0且n”为1。在又一实施方式中，n’为3，m’为1且n”为1。在又一实施方式中，n’为3，m’为2且n”为1。在又一实施方式中，n’为3，m’为3且n”为1。
在又一实施方式中，n’为4，m’为0且n”为1。在又一实施方式中，n’为4，m’为1且n”为1。在又一实施方式中，n’为4，m’为2且n”为1。在又一实施方式中，n’为4，m’为3且n”为1。
在又一实施方式中，n’为5，m’为0且n”为1。在又一实施方式中，n’为5，m’为1且n”为1。在又一实施方式中，n’为5，m’为2且n”为1。在又一实施方式中，n’为5，m’为3且n”为1。
在一个特定实施方式中，n’为1，m’为0且n”为2。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为1且n”为2。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为2且n”为2。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为3且n”为2。
在另一实施方式中，n’为2，m’为0且n”为2。在另一实施方式中，n’为2，m’为1且n”为2。在另一实施方式中，n’为2，m’为2且n”为2。在另一实施方式中，n’为2，m’为3且n”为2。
在又一实施方式中，n’为3，m’为0且n”为2。在又一实施方式中，n’为3，m’为1且n”为2。在又一实施方式中，n’为3，m’为2且n”为2。在又一实施方式中，n’为3，m’为3且n”为2。
在又一实施方式中，n’为4，m’为0且n”为2。在又一实施方式中，n’为4，m’为1且n”为2。在又一实施方式中，n’为4，m’为2且n”为2。在又一实施方式中，n’为4，m’为3且n”为2。
在又一实施方式中，n’为5，m’为0且n”为2。在又一实施方式中，n’为5，m’为1且n”为2。在又一实施方式中，n’为5，m’为2且n”为2。在又一实施方式中，n’为5，m’为3且n”为2。
在一个特定实施方式中，n’为1，m’为0且n”为3。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为1且n”为3。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为2且n”为3。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为3且n”为3。
在另一实施方式中，n’为2，m’为0且n”为3。在另一实施方式中，n’为2，m’为1且n”为3。在另一实施方式中，n’为2，m’为2且n”为3。在另一实施方式中，n’为2，m’为3且n”为3。
在又一实施方式中，n’为3，m’为0且n”为3。在又一实施方式中，n’为3，m’为1且n”为3。在又一实施方式中，n’为3，m’为2且n”为3。在又一实施方式中，n’为3，m’为3且n”为3。
在又一实施方式中，n’为4，m’为0且n”为3。在又一实施方式中，n’为4，m’为1且n”为3。在又一实施方式中，n’为4，m’为2且n”为3。在又一实施方式中，n’为4，m’为3且n”为3。
在又一实施方式中，n’为5，m’为0且n”为3。在又一实施方式中，n’为5，m’为1且n”为3。在又一实施方式中，n’为5，m’为2且n”为3。在又一实施方式中，n’为5，m’为3且n”为3。
在一个特定实施方式中，n’为1，m’为0且n”为4。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为1且n”为4。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为2且n”为4。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为3且n”为4。
在另一实施方式中，n’为2，m’为0且n”为4。在另一实施方式中，n’为2，m’为1且n”为4。在另一实施方式中，n’为2，m’为2且n”为4。在另一实施方式中，n’为2，m’为3且n”为4。
在又一实施方式中，n’为3，m’为0且n”为4。在又一实施方式中，n’为3，m’为1且n”为4。在又一实施方式中，n’为3，m’为2且n”为4。在又一实施方式中，n’为3，m’为3且n”为4。
在又一实施方式中，n’为4，m’为0且n”为4。在又一实施方式中，n’为4，m’为1且n”为4。在又一实施方式中，n’为4，m’为2且n”为4。在又一实施方式中，n’为4，m’为3且n”为4。
在又一实施方式中，n’为5，m’为0且n”为4。在又一实施方式中，n’为5，m’为1且n”为4。在又一实施方式中，n’为5，m’为2且n”为4。在又一实施方式中，n’为5，m’为3且n”为4。
在一个特定实施方式中，n’为1，m’为0且n”为5。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为1且n”为5。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为2且n”为5。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为3且n”为5。
在另一实施方式中，n’为2，m’为0且n”为5。在另一实施方式中，n’为2，m’为1且n”为5。在另一实施方式中，n’为2，m’为2且n”为5。在另一实施方式中，n’为2，m’为3且n”为5。
在又一实施方式中，n’为3，m’为0且n”为5。在又一实施方式中，n’为3，m’为1且n”为5。在又一实施方式中，n’为3，m’为2且n”为5。在又一实施方式中，n’为3，m’为3且n”为5。
在又一实施方式中，n’为4，m’为0且n”为5。在又一实施方式中，n’为4，m’为1且n”为5。在又一实施方式中，n’为4，m’为2且n”为5。在又一实施方式中，n’为4，m’为3且n”为5。
在又一实施方式中，n’为5，m’为0且n”为5。在又一实施方式中，n’为5，m’为1且n”为5。在又一实施方式中，n’为5，m’为2且n”为5。在又一实施方式中，n’为5，m’为3且n”为5。
在一个实施方式中，本发明提供了血清型3糖缀合物，其包含通过间隔子共价缀合至载体蛋白(CP)的血清型3糖且具有通式(VII)，其中X是NHCO(CH2CH2O)mCH2CH2，其中m选自1至4；且其中X’是CH2O(CH2)n”CH2C＝O，其中n”选自0至10。在一个实施方式中，m选自1至3且n”选自0至10。在一个实施方式中，m选自1至3且n”选自0至5。在一个实施方式中，m选自1至2且n”选自0至3。在一个实施方式中，m选自1至2且n”选自0至2。在一个特定实施方式中，m为1且n”为0。在另一实施方式中，m为2且n”为0。在又一实施方式中，m为3且n”为0。在又一实施方式中，m为4且n”为0。在一个特定实施方式中，m为1且n”为1。在另一实施方式中，m为2且n”为1。在又一实施方式中，m为3且n”为1。在又一实施方式中，m为4且n”为1。在一个特定实施方式中，m为1且n”为2。在另一实施方式中，m为2且n”为2。在又一实施方式中，m为3且n”为2。在又一实施方式中，m为4且n”为2。在一个特定实施方式中，m为1且n”为3。在另一实施方式中，m为2且n”为3。在又一实施方式中，m为3且n”为3。在又一实施方式中，m为4且n”为3。在一个特定实施方式中，m为1且n”为4。在另一实施方式中，m为2且n”为4。在又一实施方式中，m为3且n”为4。在又一实施方式中，m为4且n”为4。在一个特定实施方式中，m为1且n”为5。在另一实施方式中，m为2且n”为5。在又一实施方式中，m为3且n”为5。在又一实施方式中，m为4且n”为5。在一个特定实施方式中，m为1且n”为6。在另一实施方式中，m为2且n”为6。在又一实施方式中，m为3且n”为6。在又一实施方式中，m为4且n”为6。
在一个实施方式中，本发明提供了血清型3糖缀合物，其包含通过间隔子共价缀合至载体蛋白(CP)的血清型3糖且具有通式(VII)，其中X是NHCO(CH2CH2O)mCH2CH2，其中m选自1至4；且其中X’是CH2O(CH2CH2O)m’(CH2)n”CH2C＝O，其中n”选自0至10且m’选自0至4。
在一个实施方式中，m选自1至3，m’选自0至4且n”选自0至10。在一个实施方式中，m选自1至2，m’选自0至4且n”选自0至5。在一个实施方式中，m选自1至2，m’选自0至2且n”选自0至3。在一个实施方式中，m选自1至2，m’选自0至2且n”选自0至1。
在一个特定实施方式中，m为1，m’为0且n”为0。在另一实施方式中，m为1，m’为1且n”为0。在另一实施方式中，m为1，m’为2且n”为0。在另一实施方式中，m为1，m’为3且n”为0。
在另一实施方式中，m为2，m’为0且n”为0。在另一实施方式中，m为2，m’为1且n”为0。在另一实施方式中，m为2，m’为2且n”为0。在另一实施方式中，m为2，m’为3且n”为0。
在又一实施方式中，m为3，m’为0且n”为0。在又一实施方式中，m为3，m’为1且n”为0。在又一实施方式中，m为3，m’为2且n”为0。在又一实施方式中，m为3，m’为3且n”为0。
在又一实施方式中，m为4，m’为0且n”为0。在又一实施方式中，m为4，m’为1且n”为0。在又一实施方式中，m为4，m’为2且n”为0。在又一实施方式中，m为4，m’为3且n”为0。
在一个特定实施方式中，m为1，m’为0且n”为1。在一个特定实施方式中，m为1，m’为1且n”为1。在一个特定实施方式中，m为1，m’为2且n”为1。在一个特定实施方式中，m为1，m’为3且n”为1。
在另一实施方式中，m为2，m’为0且n”为1。在另一实施方式中，m为2，m’为1且n”为1。在另一实施方式中，m为2，m’为2且n”为1。在另一实施方式中，m为2，m’为3且n”为1。
在又一实施方式中，m为3，m’为0且n”为1。在又一实施方式中，m为3，m’为1且n”为1。在又一实施方式中，m为3，m’为2且n”为1。在又一实施方式中，m为3，m’为3且n”为1。
在又一实施方式中，m为4，m’为0且n”为1。在又一实施方式中，m为4，m’为1且n”为1。在又一实施方式中，m为4，m’为2且n”为1。在又一实施方式中，m为4，m’为3且n”为1。
在一个特定实施方式中，m为1，m’为0且n”为2。在一个特定实施方式中，m为1，m’为1且n”为2。在一个特定实施方式中，m为1，m’为2且n”为2。在一个特定实施方式中，m为1，m’为3且n”为2。
在另一实施方式中，m为2，m’为0且n”为2。在另一实施方式中，m为2，m’为1且n”为2。在另一实施方式中，m为2，m’为2且n”为2。在另一实施方式中，m为2，m’为3且n”为2。
在又一实施方式中，m为3，m’为0且n”为2。在又一实施方式中，m为3，m’为1且n”为2。在又一实施方式中，m为3，m’为2且n”为2。在又一实施方式中，m为3，m’为3且n”为2。
在又一实施方式中，m为4，m’为0且n”为2。在又一实施方式中，m为4，m’为1且n”为2。在又一实施方式中，m为4，m’为2且n”为2。在又一实施方式中，m为4，m’为3且n”为2。
在一个特定实施方式中，m为1，m’为0且n”为3。在一个特定实施方式中，m为1，m’为1且n”为3。在一个特定实施方式中，m为1，m’为2且n”为3。在一个特定实施方式中，m为1，m’为3且n”为3。
在另一实施方式中，m为2，m’为0且n”为3。在另一实施方式中，m为2，m’为1且n”为3。在另一实施方式中，m为2，m’为2且n”为3。在另一实施方式中，m为2，m’为3且n”为3。
在又一实施方式中，m为3，m’为0且n”为3。在又一实施方式中，m为3，m’为1且n”为3。在又一实施方式中，m为3，m’为2且n”为3。在又一实施方式中，m为3，m’为3且n”为3。
在又一实施方式中，m为4，m’为0且n”为3。在又一实施方式中，m为4，m’为1且n”为3。在又一实施方式中，m为4，m’为2且n”为3。在又一实施方式中，m为4，m’为3且n”为3。
在一个特定实施方式中，m为1，m’为0且n”为4。在一个特定实施方式中，m为1，m’为1且n”为4。在一个特定实施方式中，m为1，m’为2且n”为4。在一个特定实施方式中，m为1，m’为3且n”为4。
在另一实施方式中，m为2，m’为0且n”为4。在另一实施方式中，m为2，m’为1且n”为4。在另一实施方式中，m为2，m’为2且n”为4。在另一实施方式中，m为2，m’为3且n”为4。
在又一实施方式中，m为3，m’为0且n”为4。在又一实施方式中，m为3，m’为1且n”为4。在又一实施方式中，m为3，m’为2且n”为4。在又一实施方式中，m为3，m’为3且n”为4。
在又一实施方式中，m为4，m’为0且n”为4。在又一实施方式中，m为4，m’为1且n”为4。在又一实施方式中，m为4，m’为2且n”为4。在又一实施方式中，m为4，m’为3且n”为4。
在一个特定实施方式中，m为1，m’为0且n”为5。在一个特定实施方式中，m为1，m’为1且n”为5。在一个特定实施方式中，m为1，m’为2且n”为5。在一个特定实施方式中，m为1，m’为3且n”为5。
在另一实施方式中，m为2，m’为0且n”为5。在另一实施方式中，m为2，m’为1且n”为5。在另一实施方式中，m为2，m’为2且n”为5。在另一实施方式中，m为2，m’为3且n”为5。
在又一实施方式中，m为3，m’为0且n”为5。在又一实施方式中，m为3，m’为1且n”为5。在又一实施方式中，m为3，m’为2且n”为5。在又一实施方式中，m为3，m’为3且n”为5。
在又一实施方式中，m为4，m’为0且n”为5。在又一实施方式中，m为4，m’为1且n”为5。在又一实施方式中，m为4，m’为2且n”为5。在又一实施方式中，m为4，m’为3且n”为5。
在一个实施方式中，本发明提供了血清型3糖缀合物，其包含通过间隔子共价缀合至载体蛋白(CP)的血清型3糖且具有通式(VII)，其中X是OCH2(CH2)n’，其中n’选自1至10；且其中X’是CH2O(CH2)n”CH2C＝O，其中n”选自0至10。
在一个实施方式中，n’选自1至5且n”选自0至10。在一个实施方式中，n’选自1至5且n”选自0至5。在一个实施方式中，n’选自1至3且n”选自0至3。在一个实施方式中，n’选自1至2且n”选自0至2。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为0。在另一实施方式中，n’为2且n”为0。在又一实施方式中，n’为3且n”为0。在又一实施方式中，n’为4且n”为0。在又一实施方式中，n’为5且n”为0。在又一实施方式中，n’为6且n”为0。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为1。在另一实施方式中，n’为2且n”为1。在又一实施方式中，n’为3且n”为1。在又一实施方式中，n’为4且n”为1。在又一实施方式中，n’为5且n”为1。在又一实施方式中，n’为6且n”为1。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为2。在另一实施方式中，n’为2且n”为2。在又一实施方式中，n’为3且n”为2。在又一实施方式中，n’为4且n”为2。在又一实施方式中，n’为5且n”为2。在又一实施方式中，n’为6且n”为2。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为3。在另一实施方式中，n’为2且n”为3。在又一实施方式中，n’为3且n”为3。在又一实施方式中，n’为4且n”为3。在又一实施方式中，n’为5且n”为3。在又一实施方式中，n’为6且n”为3。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为4。在另一实施方式中，n’为2且n”为4。在又一实施方式中，n’为3且n”为4。在又一实施方式中，n’为4且n”为4。在又一实施方式中，n’为5且n”为4。在又一实施方式中，n’为6且n”为4。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为5。在另一实施方式中，n’为2且n”为5。在又一实施方式中，n’为3且n”为5。在又一实施方式中，n’为4且n”为5。在又一实施方式中，n’为5且n”为5。在又一实施方式中，n’为6且n”为5。在一个特定实施方式中，n’为1且n”为6。在另一实施方式中，n’为2且n”为6。在又一实施方式中，n’为3且n”为6。在又一实施方式中，n’为4且n”为6。在又一实施方式中，n’为5且n”为6。在又一实施方式中，n’为6且n”为6。
在一个实施方式中，本发明提供了血清型3糖缀合物，其包含通过间隔子共价缀合至载体蛋白(CP)的血清型3糖且具有通式(VII)，其中X是OCH2(CH2)n’，其中n’选自1至10；且其中X’是CH2O(CH2CH2O)m’(CH2)n”CH2C＝O，其中n”选自0至10且m’选自0至4。
在一个实施方式中，n’选自1至5，m’选自0至4且n”选自0至10。在一个实施方式中，n’选自1至5，m’选自0至4且n”选自0至5。在一个实施方式中，n’选自1至3，m’选自0至2且n”选自0至3。在一个实施方式中，n’选自1至2，m’选自0至2且n”选自0至1。
在一个特定实施方式中，n’为1，m’为0且n”为0。在另一实施方式中，n’为1，m’为1且n”为0。在另一实施方式中，n’为1，m’为2且n”为0。在另一实施方式中，n’为1，m’为3且n”为0。
在另一实施方式中，n’为2，m’为0且n”为0。在另一实施方式中，n’为2，m’为1且n”为0。在另一实施方式中，n’为2，m’为2且n”为0。在另一实施方式中，n’为2，m’为3且n”为0。
在又一实施方式中，n’为3，m’为0且n”为0。在又一实施方式中，n’为3，m’为1且n”为0。在又一实施方式中，n’为3，m’为2且n”为0。在又一实施方式中，n’为3，m’为3且n”为0。
在又一实施方式中，n’为4，m’为0且n”为0。在又一实施方式中，n’为4，m’为1且n”为0。在又一实施方式中，n’为4，m’为2且n”为0。在又一实施方式中，n’为4，m’为3且n”为0。
在又一实施方式中，n’为5，m’为0且n”为0。在又一实施方式中，n’为5，m’为1且n”为0。在又一实施方式中，n’为5，m’为2且n”为0。在又一实施方式中，n’为5，m’为3且n”为0。
在一个特定实施方式中，n’为1，m’为0且n”为1。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为1且n”为1。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为2且n”为1。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为3且n”为1。
在另一实施方式中，n’为2，m’为0且n”为1。在另一实施方式中，n’为2，m’为1且n”为1。在另一实施方式中，n’为2，m’为2且n”为1。在另一实施方式中，n’为2，m’为3且n”为1。
在又一实施方式中，n’为3，m’为0且n”为1。在又一实施方式中，n’为3，m’为1且n”为1。在又一实施方式中，n’为3，m’为2且n”为1。在又一实施方式中，n’为3，m’为3且n”为1。
在又一实施方式中，n’为4，m’为0且n”为1。在又一实施方式中，n’为4，m’为1且n”为1。在又一实施方式中，n’为4，m’为2且n”为1。在又一实施方式中，n’为4，m’为3且n”为1。
在又一实施方式中，n’为5，m’为0且n”为1。在又一实施方式中，n’为5，m’为1且n”为1。在又一实施方式中，n’为5，m’为2且n”为1。在又一实施方式中，n’为5，m’为3且n”为1。
在一个特定实施方式中，n’为1，m’为0且n”为2。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为1且n”为2。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为2且n”为2。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为3且n”为2。
在另一实施方式中，n’为2，m’为0且n”为2。在另一实施方式中，n’为2，m’为1且n”为2。在另一实施方式中，n’为2，m’为2且n”为2。在另一实施方式中，n’为2，m’为3且n”为2。
在又一实施方式中，n’为3，m’为0且n”为2。在又一实施方式中，n’为3，m’为1且n”为2。在又一实施方式中，n’为3，m’为2且n”为2。在又一实施方式中，n’为3，m’为3且n”为2。
在又一实施方式中，n’为4，m’为0且n”为2。在又一实施方式中，n’为4，m’为1且n”为2。在又一实施方式中，n’为4，m’为2且n”为2。在又一实施方式中，n’为4，m’为3且n”为2。
在又一实施方式中，n’为5，m’为0且n”为2。在又一实施方式中，n’为5，m’为1且n”为2。在又一实施方式中，n’为5，m’为2且n”为2。在又一实施方式中，n’为5，m’为3且n”为2。
在一个特定实施方式中，n’为1，m’为0且n”为3。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为1且n”为3。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为2且n”为3。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为3且n”为3。
在另一实施方式中，n’为2，m’为0且n”为3。在另一实施方式中，n’为2，m’为1且n”为3。在另一实施方式中，n’为2，m’为2且n”为3。在另一实施方式中，n’为2，m’为3且n”为3。
在又一实施方式中，n’为3，m’为0且n”为3。在又一实施方式中，n’为3，m’为1且n”为3。在又一实施方式中，n’为3，m’为2且n”为3。在又一实施方式中，n’为3，m’为3且n”为3。
在又一实施方式中，n’为4，m’为0且n”为3。在又一实施方式中，n’为4，m’为1且n”为3。在又一实施方式中，n’为4，m’为2且n”为3。在又一实施方式中，n’为4，m’为3且n”为3。
在又一实施方式中，n’为5，m’为0且n”为3。在又一实施方式中，n’为5，m’为1且n”为3。在又一实施方式中，n’为5，m’为2且n”为3。在又一实施方式中，n’为5，m’为3且n”为3。
在一个特定实施方式中，n’为1，m’为0且n”为4。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为1且n”为4。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为2且n”为4。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为3且n”为4。
在另一实施方式中，n’为2，m’为0且n”为4。在另一实施方式中，n’为2，m’为1且n”为4。在另一实施方式中，n’为2，m’为2且n”为4。在另一实施方式中，n’为2，m’为3且n”为4。
在又一实施方式中，n’为3，m’为0且n”为4。在又一实施方式中，n’为3，m’为1且n”为4。在又一实施方式中，n’为3，m’为2且n”为4。在又一实施方式中，n’为3，m’为3且n”为4。
在又一实施方式中，n’为4，m’为0且n”为4。在又一实施方式中，n’为4，m’为1且n”为4。在又一实施方式中，n’为4，m’为2且n”为4。在又一实施方式中，n’为4，m’为3且n”为4。
在又一实施方式中，n’为5，m’为0且n”为4。在又一实施方式中，n’为5，m’为1且n”为4。在又一实施方式中，n’为5，m’为2且n”为4。在又一实施方式中，n’为5，m’为3且n”为4。
在一个特定实施方式中，n’为1，m’为0且n”为5。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为1且n”为5。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为2且n”为5。在一个特定实施方式中，n’为1，m’为3且n”为5。
在另一实施方式中，n’为2，m’为0且n”为5。在另一实施方式中，n’为2，m’为1且n”为5。在另一实施方式中，n’为2，m’为2且n”为5。在另一实施方式中，n’为2，m’为3且n”为5。
在又一实施方式中，n’为3，m’为0且n”为5。在又一实施方式中，n’为3，m’为1且n”为5。在又一实施方式中，n’为3，m’为2且n”为5。在又一实施方式中，n’为3，m’为3且n”为5。
在又一实施方式中，n’为4，m’为0且n”为5。在又一实施方式中，n’为4，m’为1且n”为5。在又一实施方式中，n’为4，m’为2且n”为5。在又一实施方式中，n’为4，m’为3且n”为5。
在又一实施方式中，n’为5，m’为0且n”为5。在又一实施方式中，n’为5，m’为1且n”为5。在又一实施方式中，n’为5，m’为2且n”为5。在又一实施方式中，n’为5，m’为3且n”为5。
在一个实施方式中，本发明提供了血清型3糖缀合物，其包含通过间隔子共价缀合至载体蛋白(CP)的血清型3糖且具有通式(VII)，其中X是O(CH2CH2O)mCH2CH2，其中m选自1至4及其中X’是CH2O(CH2)n”CH2C＝O，其中n”选自0至10。
在一个实施方式中，m选自1至3且n”选自0至10。在一个实施方式中，m选自1至3且n”选自0至5。在一个实施方式中，m选自1至2且n”选自0至3。在一个实施方式中，m选自1至2且n”选自0至2。在一个特定实施方式中，m为1且n”为0。在另一实施方式中，m为2且n”为0。在又一实施方式中，m为3且n”为0。在又一实施方式中，m为4且n”为0。在一个特定实施方式中，m为1且n”为1。在另一实施方式中，m为2且n”为1。在又一实施方式中，m为3且n”为1。在又一实施方式中，m为4且n”为1。在一个特定实施方式中，m为1且n”为2。在另一实施方式中，m为2且n”为2。在又一实施方式中，m为3且n”为2。在又一实施方式中，m为4且n”为2。在一个特定实施方式中，m为1且n”为3。在另一实施方式中，m为2且n”为3。在又一实施方式中，m为3且n”为3。在又一实施方式中，m为4且n”为3。在一个特定实施方式中，m为1且n”为4。在另一实施方式中，m为2且n”为4。在又一实施方式中，m为3且n”为4。在又一实施方式中，m为4且n”为4。在一个特定实施方式中，m为1且n”为5。在另一实施方式中，m为2且n”为5。在又一实施方式中，m为3且n”为5。在又一实施方式中，m为4且n”为5。在一个特定实施方式中，m为1且n”为6。在另一实施方式中，m为2且n”为6。在又一实施方式中，m为3且n”为6。在又一实施方式中，m为4且n”为6。
在一个实施方式中，本发明提供了血清型3糖缀合物，其包含通过间隔子共价缀合至载体蛋白(CP)的血清型3糖且具有通式(VII)，其中X是O(CH2CH2O)mCH2CH2，其中m选自1至4及其中X’是CH2O(CH2CH2O)m’(CH2)n”CH2C＝O，其中n”选自0至10且m’选自0至4。
在一个实施方式中，m选自1至3，m’选自0至4且n”选自0至10。在一个实施方式中，m选自1至2，m’选自0至4且n”选自0至5。在一个实施方式中，m选自1至2，m’选自0至2且n”选自0至3。在一个实施方式中，m选自1至2，m’选自0至2且n”选自0至1。
在一个特定实施方式中，m为1，m’为0且n”为0。在另一实施方式中，m为1，m’为1且n”为0。在另一实施方式中，m为1，m’为2且n”为0。在另一实施方式中，m为1，m’为3且n”为0。
在另一实施方式中，m为2，m’为0且n”为0。在另一实施方式中，m为2，m’为1且n”为0。在另一实施方式中，m为2，m’为2且n”为0。在另一实施方式中，m为2，m’为3且n”为0。
在又一实施方式中，m为3，m’为0且n”为0。在又一实施方式中，m为3，m’为1且n”为0。在又一实施方式中，m为3，m’为2且n”为0。在又一实施方式中，m为3，m’为3且n”为0。
在又一实施方式中，m为4，m’为0且n”为0。在又一实施方式中，m为4，m’为1且n”为0。在又一实施方式中，m为4，m’为2且n”为0。在又一实施方式中，m为4，m’为3且n”为0。
在一个特定实施方式中，m为1，m’为0且n”为1。在一个特定实施方式中，m为1，m’为1且n”为1。在一个特定实施方式中，m为1，m’为2且n”为1。在一个特定实施方式中，m为1，m’为3且n”为1。
在另一实施方式中，m为2，m’为0且n”为1。在另一实施方式中，m为2，m’为1且n”为1。在另一实施方式中，m为2，m’为2且n”为1。在另一实施方式中，m为2，m’为3且n”为1。
在又一实施方式中，m为3，m’为0且n”为1。在又一实施方式中，m为3，m’为1且n”为1。在又一实施方式中，m为3，m’为2且n”为1。在又一实施方式中，m为3，m’为3且n”为1。
在又一实施方式中，m为4，m’为0且n”为1。在又一实施方式中，m为4，m’为1且n”为1。在又一实施方式中，m为4，m’为2且n”为1。在又一实施方式中，m为4，m’为3且n”为1。
在一个特定实施方式中，m为1，m’为0且n”为2。在一个特定实施方式中，m为1，m’为1且n”为2。在一个特定实施方式中，m为1，m’为2且n”为2。在一个特定实施方式中，m为1，m’为3且n”为2。
在另一实施方式中，m为2，m’为0且n”为2。在另一实施方式中，m为2，m’为1且n”为2。在另一实施方式中，m为2，m’为2且n”为2。在另一实施方式中，m为2，m’为3且n”为2。
在又一实施方式中，m为3，m’为0且n”为2。在又一实施方式中，m为3，m’为1且n”为2。在又一实施方式中，m为3，m’为2且n”为2。在又一实施方式中，m为3，m’为3且n”为2。
在又一实施方式中，m为4，m’为0且n”为2。在又一实施方式中，m为4，m’为1且n”为2。在又一实施方式中，m为4，m’为2且n”为2。在又一实施方式中，m为4，m’为3且n”为2。
在一个特定实施方式中，m为1，m’为0且n”为3。在一个特定实施方式中，m为1，m’为1且n”为3。在一个特定实施方式中，m为1，m’为2且n”为3。在一个特定实施方式中，m为1，m’为3且n”为3。
在另一实施方式中，m为2，m’为0且n”为3。在另一实施方式中，m为2，m’为1且n”为3。在另一实施方式中，m为2，m’为2且n”为3。在另一实施方式中，m为2，m’为3且n”为3。
在又一实施方式中，m为3，m’为0且n”为3。在又一实施方式中，m为3，m’为1且n”为3。在又一实施方式中，m为3，m’为2且n”为3。在又一实施方式中，m为3，m’为3且n”为3。
在又一实施方式中，m为4，m’为0且n”为3。在又一实施方式中，m为4，m’为1且n”为3。在又一实施方式中，m为4，m’为2且n”为3。在又一实施方式中，m为4，m’为3且n”为3。
在一个特定实施方式中，m为1，m’为0且n”为4。在一个特定实施方式中，m为1，m’为1且n”为4。在一个特定实施方式中，m为1，m’为2且n”为4。在一个特定实施方式中，m为1，m’为3且n”为4。
在另一实施方式中，m为2，m’为0且n”为4。在另一实施方式中，m为2，m’为1且n”为4。在另一实施方式中，m为2，m’为2且n”为4。在另一实施方式中，m为2，m’为3且n”为4。
在又一实施方式中，m为3，m’为0且n”为4。在又一实施方式中，m为3，m’为1且n”为4。在又一实施方式中，m为3，m’为2且n”为4。在又一实施方式中，m为3，m’为3且n”为4。
在又一实施方式中，m为4，m’为0且n”为4。在又一实施方式中，m为4，m’为1且n”为4。在又一实施方式中，m为4，m’为2且n”为4。在又一实施方式中，m为4，m’为3且n”为4。
在一个特定实施方式中，m为1，m’为0且n”为5。在一个特定实施方式中，m为1，m’为1且n”为5。在一个特定实施方式中，m为1，m’为2且n”为5。在一个特定实施方式中，m为1，m’为3且n”为5。
在另一实施方式中，m为2，m’为0且n”为5。在另一实施方式中，m为2，m’为1且n”为5。在另一实施方式中，m为2，m’为2且n”为5。在另一实施方式中，m为2，m’为3且n”为5。
在又一实施方式中，m为3，m’为0且n”为5。在又一实施方式中，m为3，m’为1且n”为5。在又一实施方式中，m为3，m’为2且n”为5。在又一实施方式中，m为3，m’为3且n”为5。
在又一实施方式中，m为4，m’为0且n”为5。在又一实施方式中，m为4，m’为1且n”为5。在又一实施方式中，m为4，m’为2且n”为5。在又一实施方式中，m为4，m’为3且n”为5。
1.6本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物的载体蛋白
糖缀合物的一种组分是纯化多糖所缀合的载体蛋白。术语“蛋白载体”或“载体蛋白”或“载体”在本文中可互换使用。载体蛋白应适用于标准缀合程序。
在一个优选实施方式中，血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白选自DT(白喉类毒素)、TT(破伤风类毒素)或TT的片段C、CRM197(白喉毒素的无毒但在抗原性上相同的变体)、其它DT突变体(例如CRM176、CRM228、CRM45(Uchida等，(1973)J.Biol.Chem.218:3838-3844)、CRM9、CRM102、CRM103或CRM107；及由Nicholls及Youle在Genetically Engineered Toxins，编者：Frankel,Maecel Dekker Inc.(1992)中所描述的的其它突变；Glu-148的缺失或至Asp、Gln或Ser的突变及/或Ala 158的缺失或至GIy的突变及公开于美国专利第4,709,017号及第4,950,740号中的其它突变；至少一种或多种残基Lys516、Lys 526、Phe 530及/或Lys534的突变及公开于美国专利第5,917,017号及第6,455,673号中的其它突变；或公开于美国专利第5,843,711号中的片段)、肺炎球菌溶血素(ply)(Kuo等，(1995)Infect lmmun 63:2706-2713)(包括以某一方式去毒的ply，例如dPLY-GMBS(WO 2004/081515、WO 2006/032499)或dPLY-甲醛)、PhtX(包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE(PhtA、PhtB、PhtD或PhtE的序列公开于WO 00/37105及WO 00/39299中)及Pht蛋白融合体(例如PhtDE融合体、PhtBE融合体、Pht A-E(WO 01/98334、WO 03/054007、WO 2009/000826)))、OMPC(脑膜炎球菌外膜蛋白，其通常提取自脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)血清群B(EP0372501))、PorB(来自脑膜炎双球菌)、PD(流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)蛋白D；例如参见EP0594610B))或其免疫功能等效物、合成肽(EP0378881、EP0427347)、热休克蛋白(WO 93/17712、WO94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668、EP0471177)、细胞介素、淋巴因子、生长因子或激素(WO 91/01146)、包含多个来自各种病原体源抗原的人CD4+T细胞表位的人工蛋白(Falugi等，(2001)Eur J Immunol 31:3816-3824)(例如N19蛋白(Baraldoi等，(2004)Infectlmmun 72:4884-4887))、肺炎球菌表面蛋白PspA(WO 02/091998)、铁摄取蛋白(WO 01/72337)、难养芽胞梭菌(Clostridium difficile)的毒素A或B(WO 00/61761)、转铁蛋白缀合蛋白、肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)、重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(尤其其无毒突变体(例如在谷氨酸553处具有取代的外毒素A (Douglas等，(1987)J.Bacteriol.169(11):4967-4971))。也可使用其它蛋白质(例如卵白蛋白、钥孔帽贝血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素的经纯化蛋白质衍生物(PPD))作为载体蛋白。其它合适的载体蛋白包括失活的细菌毒素，例如霍乱类毒素(例如如WO 2004/083251中所描述的)、大肠杆菌(Escherichia coli)LT、大肠杆菌ST及来自铜绿假单胞菌的外毒素A。另一合适的载体蛋白是来自链球菌(Streptococcus)的C5a肽酶(SCP)。
在一个优选实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白选自TT、DT、DT突变体(例如CRM197)及来自链球菌的C5a肽酶(SCP)。
在一个实施方式中，血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是DT(白喉类毒素)。在另一实施方式中，血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是TT(破伤风类毒素)。
在另一实施方式中，血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是PD(流感嗜血杆菌蛋白D；例如参见EP0594610 B)。
在一个优选实施方式中，血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是CRM197或来自链球菌的C5a肽酶(SCP)。
在一个优选实施方式中，血清型3荚膜多糖缀合至CRM197蛋白。CRM197蛋白是白喉毒素的无毒形式，但在免疫上无异于白喉毒素。CRM197是由感染不产毒素的噬菌体β197tox-的白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)产生，该不产毒素的噬菌体β197tox-通过亚硝基胍诱变产毒素的棒状噬菌体β所产生(Uchida等，(1971)Nature New Biology 233:8-11)。CRM197蛋白具有与白喉毒素相同的分子量，但其不同的处在于结构基因中的单一碱基变化(鸟嘌呤至腺嘌呤)。此单一碱基变化引起成熟蛋白质中的氨基酸取代(谷氨酸取代甘氨酸)且消除白喉毒素的毒性性质。CRM197蛋白是糖的安全且有效的T细胞依赖性载体。关于CRM197及其产生的其它细节可参见例如美国专利第5,614,382号。
在一个实施方式中，血清型3荚膜多糖缀合至CRM197蛋白。在一个实施方式中，血清型3荚膜多糖缀合至CRM197蛋白或CRM197的A链(参见CN103495161)。在一个实施方式中，血清型3荚膜多糖缀合至经由通过基因重组大肠杆菌的表现获得的CRM197A链(参见CN103495161)。
在其它优选实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCP(链球菌C5a肽酶)。
β-溶血性链球菌的两种重要物种酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌，GAS)及无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌，GBS)会引起自轻度咽炎及脓疱病病例至严重侵袭性疾病(例如坏死性筋膜炎(GAS)及新生儿败血症(GBS))的各种严重人感染，且已形成击败此免疫反应的方式。β-溶血性链球菌(包括GAS及GBS)的所有人分离物均产生特异性失活C5a的高度保守的细胞壁蛋白SCP(链球菌C5a肽酶)。来自GAS及GBS的scp基因编码含有1,134至1,181个氨基酸的多肽(Brown等，PNAS,2005，第102卷，第51期，第18391-18396页)。前31个残基是输出信号前序列且在通过细胞质膜后去除。接下来中的68个残基用作原序列且必须去除以产生活性SCP。可去除接下来的10个残基而不损失蛋白酶活性。在另一端，自Lys-1034开始是4个连续17-残基基序，随后是细胞分选及细胞壁附接信号。此组合信号是由含有LPTTND序列的20-残基亲水性序列、17-残基疏水性序列及短碱性羧基末端构成。
SCP可分成多个结构域(参见Brown等，PNAS,2005，第102卷，第51期第18391-18396页的图1B)。此类结构域是Pre/Pro结构域(其包含输出信号前序列(通常是前31个残基)及原序列(通常是接下来的68个残基))、蛋白酶结构域(其分成两个部分(蛋白酶部分1(通常是残基89-333/334)及蛋白酶结构域部分2(通常是残基467/468-583/584))、蛋白酶相关结构域(PA结构域)(通常是残基333/334-467/468)、三个III型纤连蛋白(Fn)结构域(Fn1，通常是残基583/584-712/713；Fn2，通常是残基712/713-928/929/930；Fn3，通常是残基929/930-1029/1030/1031)及细胞壁锚结构域(通常是C-末端的残基1029/1030/1031)。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是来自GBS的SCP(SCPB)。SCPB的一个实例提供于WO97/26008的SEQ.ID.NO:3处。也参见WO00/34487的SEQID NO:3。
在另一个优选实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是来自GAS的SCP(SCPA)。
SCPA的实例可参见WO97/26008的SEQ.ID.No.1及SEQ.ID.No.2。也参见WO00/34487的SEQ ID NO:1、2及23。
在一个优选实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是酶促惰性SCP。
在其它优选实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是来自GBS的酶促惰性SCP(SCPB)。
在另一个优选实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是来自GAS的酶促惰性SCP(SCPA)。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCP的片段。在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCPA的片段。优选地，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCPB的片段。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域的SCP片段。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域的SCP片段。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域中的两者但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域的SCP酶促惰性片段。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCP的酶促惰性片段。在一个实施方式中，该SCP的酶促惰性片段包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域，但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCPA的酶促惰性片段。在一个实施方式中，SCPA的该酶促惰性片段包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域，但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域。
在一个优选实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCPB的酶促惰性片段。优选地，SCPB的该酶促惰性片段包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域，但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域。
在一个实施方式中，通过取代野生型序列的至少一个氨基酸来失活SCP的酶促活性。在一个实施方式中，该取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。数字指示根据WO00/34487的SEQ ID NO:1的编号肽酶中的氨基酸残基位置。
因此，在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是酶促惰性SCP，其中该失活通过取代野生型序列的至少一个氨基酸所实现。优选地，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该取代是D130A。在另一实施方式中，该取代是H193A。在另一实施方式中，该取代是N295A。在又一实施方式中，该取代是S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是酶促惰性SCPA，其中该失活通过取代野生型序列的至少一个氨基酸所实现。优选地，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该取代是D130A。在另一实施方式中，该取代是H193A。在另一实施方式中，该取代是N295A。在又一实施方式中，该取代是S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是酶促惰性SCPB，其中该失活通过取代野生型序列的至少一个氨基酸所实现。优选地，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该取代是D130A。在另一实施方式中，该取代是H193A。在另一实施方式中，该取代是N295A。在又一实施方式中，该取代是S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCP的酶促惰性片段，其中该失活通过取代野生型序列的至少一个氨基酸所实现。优选地，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该取代是D130A。在另一实施方式中，该取代是H193A。在另一实施方式中，该取代是N295A。在又一实施方式中，该取代是S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCP的酶促惰性片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域，其中该失活通过取代野生型序列的至少一个氨基酸所实现。优选地，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该取代是D130A。在另一实施方式中，该取代是H193A。在另一实施方式中，该取代是N295A。在又一实施方式中，该取代是S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCPA的酶促惰性片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域，其中该失活通过取代野生型序列的至少一个氨基酸所实现。优选地，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该取代是D130A。在另一实施方式中，该取代是H193A。在另一实施方式中，该取代是N295A。在又一实施方式中，该取代是S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCPB的酶促惰性片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域，其中该失活通过取代野生型序列的至少一个氨基酸所实现。优选地，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少一个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该取代是D130A。在另一实施方式中，该取代是H193A。在另一实施方式中，该取代是N295A。在又一实施方式中，该取代是S512A。
在一个实施方式中，通过取代野生型序列的至少两个氨基酸来失活SCP的酶促活性。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是D130A及H193A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是D130A及N295A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是D130A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是H193A及N295A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是H193A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是N295A及S512A。
因此，在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是酶促惰性SCP，其中该失活通过取代野生型序列的至少两个氨基酸所实现。优选地，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是D130A及H193A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是D130A及N295A。优选地，该至少两个氨基酸取代是D130A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是H193A及N295A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是H193A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是N295A及S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是酶促惰性SCPA，其中该失活通过取代野生型序列的至少两个氨基酸所实现。优选地，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是D130A及H193A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是D130A及N295A。优选地，该至少两个氨基酸取代是D130A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是H193A及N295A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是H193A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是N295A及S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是酶促惰性SCPB，其中该失活通过取代野生型序列的至少两个氨基酸所实现。优选地，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是D130A及H193A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是D130A及N295A。优选地，该至少两个氨基酸取代是D130A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是H193A及N295A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是H193A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是N295A及S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCP的酶促惰性片段，其中该失活通过取代野生型序列的至少两个氨基酸所实现。优选地，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是D130A及H193A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是D130A及N295A。优选地，该至少两个氨基酸取代是D130A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是H193A及N295A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是H193A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是N295A及S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCP的酶促惰性片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域，其中该失活通过取代野生型序列的至少两个氨基酸所实现。优选地，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是D130A及H193A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是D130A及N295A。优选地，该至少两个氨基酸取代是D130A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是H193A及N295A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是H193A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是N295A及S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCPA的酶促惰性片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域，其中该失活通过取代野生型序列的至少两个氨基酸所实现。优选地，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，至少一种氨基酸的该取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是D130A及H193A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是D130A及N295A。优选地，该至少两个氨基酸取代是D130A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是H193A及N295A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是H193A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是N295A及S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCPB的酶促惰性片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域，其中该失活通过取代野生型序列的至少两个氨基酸所实现。优选地，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是D130A及H193A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是D130A及N295A。优选地，该至少两个氨基酸取代是D130A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是H193A及N295A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是H193A及S512A。在一个实施方式中，该至少两个氨基酸取代是N295A及S512A。
在一个实施方式中，通过取代野生型序列的至少三个氨基酸来失活SCP的酶促活性。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、H193A及N295A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、H193A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是H193A、N295A及S512A。
因此，在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是酶促惰性SCP，其中该失活通过取代野生型序列的至少三个氨基酸所实现。优选地，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、H193A及N295A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、H193A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是H193A、N295A及S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是酶促惰性SCPA，其中该失活通过取代野生型序列的至少三个氨基酸所实现。优选地，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、H193A及N295A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、H193A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是H193A、N295A及S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是酶促惰性SCPB，其中该失活通过取代野生型序列的至少三个氨基酸所实现。优选地，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、H193A及N295A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、H193A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是H193A、N295A及S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCP的酶促惰性片段，其中该失活通过取代野生型序列的至少三个氨基酸所实现。优选地，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、H193A及N295A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、H193A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是H193A、N295A及S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCP的酶促惰性片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域，其中该失活通过取代野生型序列的至少三个氨基酸所实现。优选地，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、H193A及N295A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、H193A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是H193A、N295A及S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCPA的酶促惰性片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域，其中该失活通过取代野生型序列的至少三个氨基酸所实现。优选地，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、H193A及N295A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、H193A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是H193A、N295A及S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCPB的酶促惰性片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域，其中该失活通过取代野生型序列的至少三个氨基酸所实现。优选地，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代选自D130A、H193A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、H193A及N295A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、H193A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是D130A、N295A及S512A。在一个实施方式中，该至少三个氨基酸取代是H193A、N295A及S512A。
在一个实施方式中，通过取代野生型序列的至少四个氨基酸来失活SCP的酶促活性。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸取代是D130A、H193A、N295A及S512A。
因此，在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是酶促惰性SCP，其中该失活通过取代野生型序列的至少四个氨基酸所实现。优选地，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸取代是D130A、H193A、N295A及S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是酶促惰性SCPA，其中该失活通过取代野生型序列的至少四个氨基酸所实现。优选地，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸取代是D130A、H193A、N295A及S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是酶促惰性SCPB，其中该失活通过取代野生型序列的至少四个氨基酸所实现。优选地，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸取代是D130A、H193A、N295A及S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCP的酶促惰性片段，其中该失活通过取代野生型序列的至少四个氨基酸所实现。优选地，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸取代是D130A、H193A、N295A及S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCP的酶促惰性片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域，其中该失活通过取代野生型序列的至少四个氨基酸所实现。优选地，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸取代是D130A、H193A、N295A及S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCPA的酶促惰性片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域，其中该失活通过取代野生型序列的至少四个氨基酸所实现。优选地，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，至少一种氨基酸的该取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸取代是D130A、H193A、N295A及S512A。
在一个实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是SCPB的酶促惰性片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域，其中该失活通过取代野生型序列的至少四个氨基酸所实现。优选地，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分1中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸的取代位于蛋白酶结构域的部分2中。在一个实施方式中，该至少四个氨基酸取代是D130A、H193A、N295A及S512A。
在一个特定实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是由SEQID NO:41组成的SCP酶促惰性片段。
在一个特定实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是由SEQID NO:42组成的SCP酶促惰性片段。
SEQ ID NO:41长950个氨基酸。
/>
SEQ ID NO:42长949个氨基酸。
在一个特定实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是由与SEQ ID NO:41具有至少90％相同性的多肽组成的SCP酶促惰性片段。
在一个特定实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是由与SEQ ID NO:41具有至少95％相同性的多肽组成的SCP酶促惰性片段。
在一个特定实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是由与SEQ ID NO:41具有至少99％相同性的多肽组成的SCP酶促惰性片段。
在一个特定实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是由与SEQ ID NO:41具有至少99.5％相同性的多肽组成的SCP酶促惰性片段。
在一个特定实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是由与SEQ ID NO:41具有至少99.8％相同性的多肽组成的SCP酶促惰性片段。
在一个特定实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是由与SEQ ID NO:41具有至少99.85％相同性的多肽组成的SCP酶促惰性片段。
在一个特定实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是由与SEQ ID NO:42具有至少90％相同性的多肽组成的SCP酶促惰性片段。
在一个特定实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是由与SEQ ID NO:42具有至少95％相同性的多肽组成的SCP酶促惰性片段。
在一个特定实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是由与SEQ ID NO:42具有至少99％相同性的多肽组成的SCP酶促惰性片段。
在一个特定实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是由与SEQ ID NO:42具有至少99.5％相同性的多肽组成的SCP酶促惰性片段。
在一个特定实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是由与SEQ ID NO:42具有至少99.8％相同性的多肽组成的SCP酶促惰性片段。
在一个特定实施方式中，本发明的血清型3荚膜多糖糖缀合物的载体蛋白是由与SEQ ID NO:42具有至少99.85％相同性的多肽组成的SCP酶促惰性片段。
2免疫原性组合物
2.1本公开糖缀合物的组合
本发明的一个实施方式中涉及包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物的免疫原性组合物。
本发明的一个实施方式中涉及包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且包含1至25种不同糖缀合物的免疫原性组合物。
本发明的一个实施方式中涉及包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且包含1至25种来自不同肺炎链球菌血清型的糖缀合物(1至25种肺炎球菌缀合物)的免疫原性组合物。本发明的一个实施方式中涉及包含来自7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25种不同肺炎链球菌血清型的糖缀合物的免疫原性组合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物包含来自16或20种不同肺炎链球菌血清型的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20价肺炎球菌缀合物组合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是14、15、16、17、18或19价肺炎球菌缀合物组合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是16价肺炎球菌缀合物组合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是19价肺炎球菌缀合物组合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是20价肺炎球菌缀合物组合物。
在一个实施方式中，免疫原性组合物是21、22、23、24或25价肺炎球菌缀合物组合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是21价肺炎球菌缀合物组合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是22价肺炎球菌缀合物组合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是23价肺炎球菌缀合物组合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是24价肺炎球菌缀合物组合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是25价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F的糖缀合物。
在一个实施方式中，该免疫原性组合物另外包含来自肺炎链球菌血清型1、5及7F的糖缀合物。
在一个实施方式中，上述任一免疫原性组合物另外包含来自肺炎链球菌血清型6A及19A的糖缀合物。
在一个实施方式中，上述任一免疫原性组合物另外包含来自肺炎链球菌血清型22F及33F的糖缀合物。
在一个实施方式中，上述任一免疫原性组合物另外包含来自肺炎链球菌血清型8、10A、11A、12F及15B的糖缀合物。
在一个实施方式中，上述任一免疫原性组合物另外包含来自肺炎链球菌血清型2的糖缀合物。
在一个实施方式中，上述任一免疫原性组合物另外包含来自肺炎链球菌血清型9N的糖缀合物。
在一个实施方式中，上述任一免疫原性组合物另外包含来自肺炎链球菌血清型17F的糖缀合物。
在一个实施方式中，上述任一免疫原性组合物另外包含来自肺炎链球菌血清型20的糖缀合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是8价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F及23F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是11价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是13价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是15价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是20价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、2、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是21价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是21价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、2、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是22价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、2、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、22F、23F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是23价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、2、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是24价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是21价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是21价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是21价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是21价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、33F及35B的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是21价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是22价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是22价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是22价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F、33F及35B的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是22价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是22价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、24F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是22价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、33F及35B的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是22价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是22价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、33F及35B的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是22价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F、33F及35B的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是22价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是23价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、24F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是23价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、33F及35B的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是23价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是23价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、33F及35B的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是23价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F、33F及35B的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是23价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、33F及35B的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是23价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是23价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、24F、33F及35B的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是23价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是23价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F及33F的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是24价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、33F及35B的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是24价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、24F、33F及35B的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是24价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是24价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及35B的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是24价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及35B的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是25价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含至少一种选自以下的糖缀合物：来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的糖缀合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含20种选自以下的糖缀合物：来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是21价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含21种选自以下的糖缀合物：来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是22价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含至少一种选自以下的糖缀合物：来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的糖缀合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含22种选自以下的糖缀合物：来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是23价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含23种选自以下的糖缀合物：来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是24价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型2、9N、15A、17F、20、23A、23B、24F及35B的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是10价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型2、9N、15A、17F、19A、19F、20、23A、23B、24F及35B的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是12价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是23价肺炎球菌缀合物组合物。
本发明的一个实施方式中涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明的肺炎链球菌血清型3糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的糖缀合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物是25价肺炎球菌缀合物组合物。
在一个优选实施方式中，糖各自单独地缀合至蛋白质载体的不同分子(蛋白质载体的每一分子仅具有与其缀合的一种类型的糖)。在该实施方式中，认为荚膜糖单独地缀合至载体蛋白。优选地，上述免疫原性组合物的所有糖缀合物均单独地缀合至载体蛋白。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至CRM197。在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物缀合至CRM197。在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物缀合至CRM197。在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物缀合至CRM197。在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物缀合至CRM197。在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型10A的糖缀合物缀合至CRM197。在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型11A的糖缀合物缀合至CRM197。在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型8的糖缀合物缀合至CRM197。在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F的糖缀合物缀合至CRM197。在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型1、5及7F的糖缀合物缀合至CRM197。在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型6A及19A的糖缀合物缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，任一上述免疫原性组合物的糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在一个实施方式中，任一上述免疫原性组合物的来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14及/或23F的糖缀合物单独地缀合至PD。
在一个实施方式中，任一上述免疫原性组合物的来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物缀合至TT。
在一个实施方式中，任一上述免疫原性组合物的来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物缀合至DT。
在一个实施方式中，任一上述免疫原性组合物的来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14及/或23F的糖缀合物单独地缀合至PD，来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物缀合至TT，且来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物缀合至DT。
在一个实施方式中，上述免疫原性组合物包含8至20种不同肺炎链球菌血清型。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，至少一种其它糖缀合物缀合至TT且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，一种其它糖缀合物缀合至TT且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，至少两种其它糖缀合物缀合至TT且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，两种其它糖缀合物缀合至TT且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，至少三种其它糖缀合物缀合至TT且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，三种其它糖缀合物缀合至TT且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，至少4种其它糖缀合物缀合至TT且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，4种其它糖缀合物缀合至TT且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，至少5种其它糖缀合物缀合至TT且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，5种其它糖缀合物缀合至TT且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，至少一种其它糖缀合物缀合至SCP且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，一种其它糖缀合物缀合至SCP且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，至少两种其它糖缀合物缀合至SCP且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，两种其它糖缀合物缀合至SCP且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，至少三种其它糖缀合物缀合至SCP且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，三种其它糖缀合物缀合至SCP且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，至少4种其它糖缀合物缀合至SCP且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，4种其它糖缀合物缀合至SCP且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，至少5种其它糖缀合物缀合至SCP且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
在任一上述免疫原性组合物的实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物缀合至SCP，5种其它糖缀合物缀合至SCP且其它糖缀合物均单独地缀合至CRM197。
本公开组合物可包括少量游离载体。在给定载体蛋白以游离及缀合形式存在于本公开组合物中时，未缀合形式优选地不超过整体组合物中的载体蛋白总量的5％，且更优选地地以小于2重量％存在。
2.2本发明的免疫原性组合物的剂量
各剂量中的糖缀合物的量选择成在典型接种疫苗者中诱导免疫保护性反应而无显著不良副作用的量。该量将依赖所采用的特异性免疫原及其呈递方式而变化。
免疫原性组合物中的具体糖缀合物的量可基于用于该缀合物的总多糖(缀合及未缀合)来计算。举例而言，具有20％游离多糖的糖缀合物将在100μg多糖剂量中具有约80μg缀合多糖及约20μg未缀合多糖。糖缀合物的量可依赖肺炎球菌血清型而变化。糖浓度可通过糖醛酸分析来确定。
免疫原性组合物中的不同多糖组分的“免疫原性量”可有所不同且各自可包含约0.5μg、约0.75μg、约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg、约10μg、约15μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg或约100μg的任何特定多糖抗原。
通常，每一剂量将包含0.1μg至100μg血清型3多糖。在一个实施方式中，每一剂量将包含0.1μg至100μg血清型3多糖。在一个优选实施方式中，每一剂量将包含0.5μg至20μg。在一个优选实施方式中，每一剂量将包含1.0μg至10μg。在一更优选地实施方式中，每一剂量将包含2.0μg至5.0μg血清型3多糖。考虑任一上述范围内的任一整数以作为本公开的一个实施方式。
在一个实施方式中，每一剂量将包含约0.5μg血清型3多糖。
在一个实施方式中，每一剂量将包含约0.55μg血清型3多糖。在一个实施方式中，每一剂量将包含约0.75μg血清型3多糖。在一个实施方式中，每一剂量将包含约1.0μg血清型3多糖。在一个实施方式中，每一剂量将包含约1.1μg血清型3多糖。
在一个实施方式中，每一剂量将包含约1.5μg血清型3多糖。在一个实施方式中，每一剂量将包含约2.0μg血清型3多糖。在一个实施方式中，每一剂量将包含约2.2μg血清型3多糖。在一个实施方式中，每一剂量将包含约2.5μg血清型3多糖。在一个实施方式中，每一剂量将包含约3.0μg血清型3多糖。在一个实施方式中，每一剂量将包含约3.5μg血清型3多糖。在一个实施方式中，每一剂量将包含约4.0μg血清型3多糖。在一个实施方式中，每一剂量将包含约4.4μg血清型3多糖。在一个实施方式中，每一剂量将包含约5.0μg血清型3多糖。在一个实施方式中，每一剂量将包含约5.5μg血清型3多糖。在一个实施方式中，每一剂量将包含约6.0μg血清型3多糖。
通常，给定血清型的每一剂量将包含0.1μg至100μg多糖。在一个实施方式中，给定血清型的每一剂量将包含0.1μg至100μg多糖。在一个优选实施方式中，每一剂量将包含0.5μg至20μg。在一个优选实施方式中，每一剂量将包含1.0μg至10μg。在更优选地实施方式中，给定血清型的每一剂量将包含2.0μg至5.0μg多糖。考虑任一上述范围内的任一整数以作为本公开的一个实施方式。
在一个实施方式中，每一特定糖缀合物的每一剂量将包含约0.5μg多糖。在一个实施方式中，每一特定糖缀合物的每一剂量将包含约0.55μg多糖。在一个实施方式中，每一特定糖缀合物的每一剂量将包含约0.75μg多糖。在一个实施方式中，每一特定糖缀合物的每一剂量将包含约1.0μg多糖。在一个实施方式中，每一特定糖缀合物的每一剂量将包含约1.1μg多糖。在一个实施方式中，每一特定糖缀合物的每一剂量将包含约1.5μg多糖。在一个实施方式中，每一特定糖缀合物的每一剂量将包含约2.0μg多糖。在一个实施方式中，每一特定糖缀合物的每一剂量将包含约2.2μg多糖。在一个实施方式中，每一特定糖缀合物的每一剂量将包含约2.5μg多糖。在一个实施方式中，每一特定糖缀合物的每一剂量将包含约3.0μg多糖。在一个实施方式中，每一特定糖缀合物的每一剂量将包含约3.5μg多糖。在一个实施方式中，每一特定糖缀合物的每一剂量将包含约4.0μg多糖。在一个实施方式中，每一特定糖缀合物的每一剂量将包含约4.4μg多糖。在一个实施方式中，每一特定糖缀合物的每一剂量将包含约5.0μg多糖。在一个实施方式中，每一特定糖缀合物的每一剂量将包含约5.5μg多糖。在一个实施方式中，每一特定糖缀合物的每一剂量将包含约6.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F的糖缀合物而言，每一剂量将包含约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2.0μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg或约3.0μg的多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F的糖缀合物而言，每一剂量将包含约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2.0μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg或约3.0μg的多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.0μg、约2.2μg、约2.4μg、约2.6μg、约2.8μg、约3.0μg、约3.2μg、约3.4μg、约3.6μg、约3.8μg、约4.0μg、约4.2μg、约4.4μg、约4.6μg、约4.8μg、约5.0、约5.2μg、约5.4μg、约5.6μg、约5.8μg或约6.0μg的多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F的糖缀合物而言，每一剂量将包含约0.5μg、约0.55μg、约0.75μg、约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2.0μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg或约3.0μg的多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F的糖缀合物而言，每一剂量将包含约0.5μg、约0.55μg、约0.75μg、约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2.0μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg或约3.0μg的多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言，每一剂量将包含约1.0μg、约1.1μg、约2.0μg、约2.2μg、约2.4μg、约2.6μg、约2.8μg、约3.0μg、约3.2μg、约3.4μg、约3.6μg、约3.8μg、约4.0μg、约4.2μg、约4.4μg、约4.6μg、约4.8μg、约5.0、约5.2μg、约5.4μg、约5.6μg、约5.8μg或约6.0μg的多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约0.5μg至约1.0μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约1.0μg至约2.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约1.5μg至约3.0μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约3.0μg至约6.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.0μg至约2.5μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约4.0μg至约4.8μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.2μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约4.4μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约0.5μg至约1.0μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约1.0μg至约2.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约1.5μg至约3.0μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约3μg至约6μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.0μg至约2.5μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约4.0μg至约4.8μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.0μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约4.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.2μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约4.4μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约0.5μg至约1.0μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约1.0μg至约2.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约1.5μg至约3.0μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约3.0μg至约6.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.0μg至约2.5μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约4.0μg至约4.8μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.2μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约4.4μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约0.5μg至约1.0μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约1.0μg至约2.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约1.5μg至约3.0μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约3.0μg至约6.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.0μg至约2.5μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约4.0μg至约4.8μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.2μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约4.4μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及/或35B的糖缀合物而言，每一剂量将包含约0.5μg、约0.55μg、约0.75μg、约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2.0μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg或约3.0μg的多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及/或35B的糖缀合物而言，每一剂量将包含约0.5μg、约0.55μg、约0.75μg、约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2.0μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg或约3.0μg的多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言，每一剂量将包含约1.0μg、约1.1μg、约2.0μg、约2.2μg、约2.4μg、约2.6μg、约2.8μg、约3.0μg、约3.2μg、约3.4μg、约3.6μg、约3.8μg、约4.0μg、约4.2μg、约4.4μg、约4.6μg、约4.8μg、约5.0、约5.2μg、约5.4μg、约5.6μg、约5.8μg或约6.0μg的多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及35B的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约1.5μg至约3.0μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约3.0μg至约6.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及35B的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.0μg至约2.5μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约4.0μg至约4.8μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及35B的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.2μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约4.4μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约0.5μg至约1.0μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约1.0μg至约2.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约1.5μg至约3.0μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约3.0μg至约6.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.0μg至约2.5μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约4.0μg至约4.8μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.2μg多糖，且对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物而言将包含约4.4μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及/或38的糖缀合物而言，每一剂量将包含约0.5μg、约0.55μg、约0.75μg、约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2.0μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg或约3.0μg的多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及/或38的糖缀合物而言，每一剂量将包含约0.5μg、约0.55μg、约0.75μg、约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2.0μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg或约3.0μg的多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及/或38的糖缀合物而言，每一剂量将包含约0.5μg、约0.55μg、约0.75μg、约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2.0μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg或约3.0μg的多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的糖缀合物而言，每一剂量将包含约0.5μg、约0.55μg、约0.75μg、约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2.0μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg或约3.0μg的多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的糖缀合物而言，每一剂量将包含约0.5μg、约0.55μg、约0.75μg、约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2.0μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg或约3.0μg的多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的糖缀合物而言，每一剂量将包含约0.5μg、约0.55μg、约0.75μg、约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2.0μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg或约3.0μg的多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约0.5μg至约1.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约1.5μg至约3.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.0μg至约2.5μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.2μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约0.5μg至约1.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约1.5μg至约3.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.0μg至约2.5μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.2μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约0.5μg至约1.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约1.5μg至约3.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.0μg至约2.5μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.0μg多糖。
在一个实施方式中，对于来自肺炎链球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的每一糖缀合物而言，每一剂量将包含约2.2μg多糖。
2.3载体量
通常，每一剂量将包含10μg至150μg载体蛋白、尤其15μg至100μg载体蛋白、更尤其地25μg至75μg载体蛋白及甚至更尤其地40μg至60μg载体蛋白。在一个实施方式中，该载体蛋白是CRM197。在一个实施方式中，该载体蛋白是SCP。
在一个实施方式中，每一剂量将包含约10μg、约15μg、约20μg、约25μg、约26μg、约27μg、约28μg、约29μg、约30μg、约31μg、约32μg、约33μg、约34μg、约35μg、约36μg、约37μg、约38μg、约39μg、约40μg、约41μg、约42μg、约43μg、约44μg、约45μg、约46μg、约47μg、约48μg、约49μg、约50μg、约51μg、约52μg、约53μg、约54μg、约55μg、约56μg、约57μg、约58μg、约59μg、约60μg、约61μg、约62μg、约63μg、约64μg、约65μg、约66μg、约67μg、约68μg、约69μg、约70μg、约71μg、约72μg、约73μg、约74μg或约75μg的载体蛋白。
在一个实施方式中，每一剂量将包含约25μg、约26μg、约27μg、约28μg、约29μg、约30μg、约31μg、约32μg、约33μg、约34μg、约35μg、约36μg、约37μg、约38μg、约39μg、约40μg、约41μg、约42μg、约43μg、约44μg、约45μg、约46μg、约47μg、约48μg、约49μg、约50μg、约51μg、约52μg、约53μg、约54μg、约55μg、约56μg、约57μg、约58μg、约59μg、约60μg、约61μg、约62μg、约63μg、约64μg、约65μg、约66μg、约67μg、约68μg、约69μg、约70μg、约71μg、约72μg、约73μg、约74μg或约75μg的载体蛋白。
在一个实施方式中，每一剂量将包含约30μg载体蛋白。在一个实施方式中，每一剂量将包含约31μg载体蛋白。在一个实施方式中，每一剂量将包含约32μg载体蛋白。在一个实施方式中，每一剂量将包含约33μg载体蛋白。在一个实施方式中，每一剂量将包含约34μg载体蛋白。在一个实施方式中，每一剂量将包含约45μg载体蛋白。
在一个实施方式中，每一剂量将包含约40μg载体蛋白。在一个实施方式中，每一剂量将包含约41μg载体蛋白。在一个实施方式中，每一剂量将包含约42μg载体蛋白。在一个实施方式中，每一剂量将包含约43μg载体蛋白。在一个实施方式中，每一剂量将包含约44μg载体蛋白。在一个实施方式中，每一剂量将包含约45μg载体蛋白。
在一个实施方式中，每一剂量将包含约48μg载体蛋白。在一个实施方式中，每一剂量将包含约49μg载体蛋白。在一个实施方式中，每一剂量将包含约50μg载体蛋白。在一个实施方式中，每一剂量将包含约51μg载体蛋白。在一个实施方式中，每一剂量将包含约52μg载体蛋白。在一个实施方式中，每一剂量将包含约53μg载体蛋白。
在一个实施方式中，该载体蛋白是CRM197。
在一个实施方式中，该载体蛋白是SCP。
2.4其它抗原
本发明的免疫原性组合物包含缀合的肺炎链球菌糖抗原(糖缀合物)。其也可进一步包括来自其它病原体、尤其来自细菌及/或病毒的抗原。优选的其它抗原选自：白喉类毒素(D)、破伤风类毒素(T)、百日咳抗原(P)(其通常为非细胞的(Pa))、B型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)、A型肝炎病毒(HAV)抗原、缀合的b型流感嗜血杆菌荚膜糖(Hib)、失活的脊髓灰白质炎病毒疫苗(IPV)。
在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含D-T-Pa。在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含D-T-Pa-Hib、D-T-Pa-IPV或D-T-Pa-HBsAg。在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含D-T-Pa-HBsAg-IPV或D-T-Pa-HBsAg-Hib。在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含D-T-Pa-HBsAg-IPV-Hib。
百日咳抗原：百日咳博德氏菌(Bordetella pertussis)会引起咳嗽。疫苗中的百日咳抗原是细胞(完整细胞，呈失活的百日咳博德氏菌细胞形式)或非细胞的。细胞百日咳抗原的制备在文献中有充分记载(举例而言，其可通过热失活百日咳博德氏菌的I期培养物来获得)。然而，优选地，本公开使用非细胞抗原。在使用非细胞抗原时，优选使用以下抗原中的一者、两者或(优选)三者：(1)去毒百日咳毒素(百日咳类毒素或PT)；(2)丝状血球凝集素(FHA)；(3)百日咳菌素(也称为69千道尔顿外膜蛋白)。FHA及百日咳菌素可在用于本公开之前使用甲醛进行处理。优选地，通过使用甲醛及/或戊二醛进行处理来将PT去毒。非细胞百日咳抗原优选地吸附于一或多种铝盐佐剂上。或者，其可以未吸附状态添加。在添加百日咳菌素时，则其优选地已吸附至氢氧化铝佐剂上。PT及FHA可吸附至氢氧化铝佐剂或磷酸铝上。最优选使PT、FHA及百日咳菌素均吸附至氢氧化铝。
失活的脊髓灰白质炎病毒疫苗：脊髓灰白质炎病毒会引起脊髓灰白质炎。本发明的优选实施方式使用IPV，而非使用口服脊髓灰白质炎病毒疫苗。在施用患者之前，必须失活脊髓灰白质炎病毒，且此可通过使用甲醛进行处理实现。脊髓灰白质炎可由三类脊髓灰白质炎病毒中的一者引起。该三种类型类似且引起相同症状，但其抗原不同，且感染一种类型不会针对其它类型的感染进行保护。因此，在本公开中优选使用三种脊髓灰白质炎病毒抗原：1型脊髓灰白质炎病毒(例如Mahoney株)、2型脊髓灰白质炎病毒(例如MEF-1株)及3型脊髓灰白质炎病毒(例如Saukett株)。优选使病毒单独地生长、纯化及失活，且然后组合以获得与本公开一起使用的三价本体混合物。
白喉类毒素：白喉棒状杆菌会引起白喉。可对白喉毒素进行处理(例如使用福尔马林(formalin)或甲醛)以去除毒性，同时保留在注射后诱导特异性抗毒素抗体的能力。将此类白喉类毒素用于白喉疫苗中。优选白喉类毒素是通过甲醛处理制备的那些。白喉类毒素可通过使白喉棒状杆菌于生长培养基中生长、然后通过甲醛处理、超滤及沉淀来获得。然后可通过包含无菌过滤及/或透析的过程处理类毒素化材料。白喉类毒素优选地吸附于氢氧化铝佐剂上。
破伤风类毒素：破伤风梭菌(Clostridium tetani)会引起破伤风。可对破伤风毒素进行处理以获得保护性类毒素。将此类类毒素用于破伤风疫苗中。优选破伤风类毒素是通过甲醛处理制备的那些。破伤风类毒素可通过使破伤风梭菌于生长培养基中生长、然后通过甲醛处理、超滤及沉淀来获得。然后可通过包含无菌过滤及/或透析的过程处理该材料。
A型肝炎病毒抗原：A型肝炎病毒(HAV)是导致病毒性肝炎的已知因素中的一者。优选HAV组分是基于失活病毒，且失活可通过福尔马林处理实现。
B型肝炎病毒(HBV)是导致病毒性肝炎的已知因素中的一者。衣壳的主要组分是称为HBV表面抗原或更通常而言HBsAg的蛋白质，其通常是分子量为约24kDa的226氨基酸多肽。所有现有B型肝炎疫苗均含有HBsAg，且当将此抗原施用正常接种疫苗者时，其刺激针对HBV感染进行保护的抗HBsAg抗体的产生。
对于疫苗制造而言，已以两种方式制得HBsAg：自慢性B型肝炎载体的血浆纯化呈微粒形式的抗原或通过重组DNA方法(例如酵母细胞中的重组表现)表现该蛋白质。与天然HBsAg(即作为血浆纯化产物)不同，酵母表现的HBsAg通常未经糖基化，且此是与本公开一起使用的最佳HBsAg形式。
缀合的b型流感嗜血杆菌抗原：b型流感嗜血杆菌(Hib)会引起细菌性脑膜炎。Hib疫苗通常是基于荚膜糖抗原，该荚膜糖抗原的制备已有充分记载。Hib糖可缀合至载体蛋白以增强其免疫原性，尤其是在儿童中。典型载体蛋白是破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、流感嗜血杆菌蛋白D及来自血清群B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物。缀合物的糖部分可包含全长聚核糖基核糖醇磷酸酯(PRP)(如自Hib细菌制得)及/或全长PRP的片段。Hib缀合物可或可不吸附至铝盐佐剂上。
在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物进一步包括缀合的脑膜炎双球菌血清群Y荚膜糖(MenY)及/或缀合的脑膜炎双球菌血清群C荚膜糖(MenC)。
在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物进一步包括缀合的脑膜炎双球菌血清群A荚膜糖(MenA)、缀合的脑膜炎双球菌血清群W135荚膜糖(MenW135)、缀合的脑膜炎双球菌血清群Y荚膜糖(MenY)及/或缀合的脑膜炎双球菌血清群C荚膜糖(MenC)。
在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物进一步包括缀合的脑膜炎双球菌血清群W135荚膜糖(MenW135)、缀合的脑膜炎双球菌血清群Y荚膜糖(MenY)及/或缀合的脑膜炎双球菌血清群C荚膜糖(MenC)。
2.5佐剂
在一些实施方式中，本文所公开的免疫原性组合物可进一步包含至少一种、两种或三种佐剂。在一些实施方式中，本文所公开的免疫原性组合物可进一步包含至少一种佐剂。在一些实施方式中，本文所公开的免疫原性组合物可进一步包含一种佐剂。在一些实施方式中，本文所公开的免疫原性组合物可进一步包含两种佐剂。术语“佐剂”是指增强针对抗原的免疫反应的化合物或混合物。抗原可主要用作递送系统、主要用作免疫调节剂或具有二者的较强特征。合适的佐剂包括适用于哺乳动物(包括人)的那些。
已知可用于人中的合适的递送系统型佐剂的实例包括但不限于明矾(例如磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝)、磷酸钙、脂质体、水包油型乳液(例如MF59(4.3％w/v鲨烯/0.5％w/v聚山梨醇酯80(Tween 80)/0.5％w/v去水山梨醇三油酸酯(Span 85)))、油包水型乳液(例如Montanide)及聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒或纳米粒子。
在一个实施方式中，本文所公开的免疫原性组合物包含铝盐(明矾)作为佐剂(例如磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝)。在一个优选实施方式中，本文所公开的免疫原性组合物包含磷酸铝或氢氧化铝作为佐剂。在一个优选实施方式中，本文所公开的免疫原性组合物包含磷酸铝作为佐剂。
增强如本文所公开的免疫原性组合物的有效性的其它实例性佐剂包括但不限于：(1)水包油型乳液配制物(具有或不具有其它特异性免疫刺激剂，例如胞壁酰基肽(参见下文)或细菌细胞壁组分)，例如(a)SAF，其含有10％角鲨烷、0.4％ Tween 80、5％普罗尼克(pluronic)嵌段聚合物L121及thr-MDP，将其微流化成次微米乳液或渦旋以产生较大粒径乳液，及(b)RIBITM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem,Hamilton,MT)，其含有2％鲨烯、0.2％Tween 80及一或多种细菌细胞壁组分，例如单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)及细胞壁骨架(CWS)，优选地MPL+CWS(DETOXTM)；(2)可使用皂素佐剂，例如QS21、STIMULONTM(Cambridge Bioscience,Worcester,MA)、(Isconova,Sweden)或(Commonwealth Serum Laboratories,Australia)，或自其产生的粒子，例如ISCOMs(免疫刺激复合物)，该ISCOMS可不含其它清洁剂(例如WO 00/07621)；(3)完全弗氏佐剂(Complete Freund's Adjuvant,CFA)及不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund'sAdjuvant,IFA)；(4)细胞介素，例如介白素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(例如WO 99/44636))、干扰素(例如γ干扰素)、巨噬球菌落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酰基脂质A(MPL)或3-O-去酰基化MPL(3dMPL)(例如参见GB-2220221、EP0689454)，当与肺炎球菌糖一起使用时任选地实质上缺乏明矾(例如参见WO 00/56358)；(6)3dMPL与例如QS21及/或水包油型乳液的组合(例如参见EP0835318、EP0735898、EP0761231)；(7)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(例如参见WO 99/52549)；(8)聚氧乙烯去水山梨醇酯表面活性剂与辛苯昔醇的组合(例如WO 01/21207)或聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种其它非离子型表面活性剂(例如辛苯聚醇(octoxynol))的组合(例如WO 01/21152)；(9)皂素及免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)(例如WO 00/62800)；(10)免疫刺激剂及金属盐粒子(例如参见WO 00/23105)；(11)皂素及水包油型乳液(例如WO 99/11241)；(12)皂素(例如QS21)+3dMPL+IM2(任选地+固醇)(例如WO 98/57659)；(13)作为免疫刺激剂起增强组合物效能作用的其它物质。胞壁酰基肽包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏酰胺基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-25乙酰基-去甲胞壁酰基-L-丙胺酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙胺酰基-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺MTP-PE)等。
在本发明的一个实施方式中，如本文所公开的免疫原性组合物包含CpG寡核苷酸作为佐剂。除非另外指明，否则本文所用的CpG寡核苷酸是指免疫刺激性CpG寡去氧核苷酸(CpG ODN)，且因此此类术语可互换使用。免疫刺激性CpG寡去氧核苷酸含有一或多个免疫刺激性CpG基序，其任选地在某些优选碱基背景内为未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸。CpG免疫刺激性基序的甲基化状态通常是指二核苷酸中的胞嘧啶残基。含有至少一个未甲基化CpG二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸是含有通过磷酸酯键连接至3'鸟嘌呤的5'未甲基化胞嘧啶且经由缀合至Toll样受体9(TLR-9)活化免疫系统的寡核苷酸。在另一实施方式中，免疫刺激性寡核苷酸可含有一或多个甲基化CpG二核苷酸，其将经由TLR9活化免疫系统，但不如CpG基序未甲基化时强。CpG免疫刺激性寡核苷酸可包含一或多个进而可涵盖CpG二核苷酸的回文结构。CpG寡核苷酸已描述于多个已公布专利、公开专利申请案及其它公开案中，包括美国专利第6,194,388号；第6,207,646号；第6,214,806号；第6,218,371号；第6,239,116号；及6,339,068号。
在本发明的一个实施方式中，如本文所公开的免疫原性组合物包含WO 2010/125480的第3页第22行至第12页第36行所描述的的任一CpG寡核苷酸。
已鉴定出CpG免疫刺激性寡核苷酸的不同种类。此类种类称为A类、B类、C类及P类，且更详细描述于WO 2010/125480的第3页第22行至第12页第36行中。本公开方法涵盖此类不同种类的CpG免疫刺激性寡核苷酸的应用。
在本发明的一个实施方式中，如本文所公开的免疫原性组合物包含A类CpG寡核苷酸。优选地，本发明的“A类”CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5’GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3’(SEQ ID NO:1)。A类寡核苷酸的一些非限制性实例包括：5’G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G 3’(SEQ ID NO:2)；其中“*”是指硫代磷酸酯键，且“_”是指磷酸二酯键。
在本发明的实施方式中，如本文所公开的免疫原性组合物包含B类CpG寡核苷酸。在一个实施方式中，用于本公开中的CpG寡核苷酸是由至少下式表示的B类CpG寡核苷酸：
5'X1X2CGX3X4 3’，其中X1、X2、X3及X4为核苷酸。在一个实施方式中，X2是腺嘌呤、鸟嘌呤或胸腺嘧啶。在另一实施方式中，X3是胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶。
本发明的B类CpG寡核苷酸序列是上文所廣泛描述以及公开于WO 96/02555、WO98/18810及美国专利第6,194,388号、第6,207,646号、第6,214,806号、第6,218,371号、第6,239,116号及第6,339,068号中的那些。实例性序列包括但不限于公开于此类后续申请案及专利中的那些。
在一个实施方式中，本发明的“B类”CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：
5’TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3’(SEQ ID NO:3)，或
5’TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3’(SEQ ID NO:4)，或
5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3’(SEQ ID NO:5)，或
5’TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3’(SEQ ID NO:6)，或
5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3’(SEQ ID NO:7)。
在这些序列中的任一者中，所有连接均可为硫代磷酸酯键。在另一实施方式中，在这些序列中的任一者中，一或多个连接可为优选地在CpG基序的“C”与“G”之间的磷酸二酯，从而产生半软CpG寡核苷酸。在这些序列中的任一者中，乙基-尿苷或卤素可取代5'T；卤素取代的实例包括但不限于溴-尿苷或碘-尿苷取代。
B类寡核苷酸的一些非限制性实例包括：
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3’(SEQ ID NO:8)，或
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3’(SEQ ID NO:9)，或
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’(SEQ ID NO:10)，或
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’(SEQ ID NO:11)，或
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A 3’(SEQ ID NO:12)
其中“*”是指硫代磷酸酯键。
在本发明的一个实施方式中，如本文所公开的免疫原性组合物包含C类CpG寡核苷酸。在一个实施方式中，本发明的“C类”CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：
5’TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:13)，或
5’TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:14)，或
5’TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:15)，或
5’TCGGACGTTCGGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:16)，或
5’TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:17)，或
5’TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:18)，或
5’TCGACGTTCGGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:19)，或
5’TCGCGTCGTTCGGCGCCG 3’(SEQ ID NO:20)，或
5’TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:21)，或
5’TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:22)，或
5’TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 3’(SEQ ID NO:23)，或
5’TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG 3’(SEQ ID NO:24)，或
5’TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3’(SEQ ID NO:25)。
在这些序列中的任一者中，所有连接均可为硫代磷酸酯键。在另一实施方式中，在这些序列中的任一者中，一或多个连接可为优选地在CpG基序的“C”与“G”之间的磷酸二酯，从而产生半软CpG寡核苷酸。
C类寡核苷酸的一些非限制性实例包括：
5’T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:26)，或
5’T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:27)，或
5’T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:28)，或
5’T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:29)，或
5’T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:30)，或
5’T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:31)，或
5’T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:32)，或
5’T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:33)，或
5’T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:34)，或
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:35)，或
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:36)，或
5’T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:37)，或
5’T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3’(SEQ ID NO:38)
其中“*”是指硫代磷酸酯键，且“_”是指磷酸二酯键。
在这些序列中的任一者中，乙基-尿苷或卤素可取代5'T；卤素取代的实例包括但不限于溴-尿苷或碘-尿苷取代。
在本发明的一个实施方式中，如本文所公开的免疫原性组合物包含P类CpG寡核苷酸。在一个实施方式中，用于本公开中的CpG寡核苷酸是含有5'TLR活化结构域及至少两个回文区域的P类CpG寡核苷酸，一个回文区域是长度为至少6个核苷酸的5'回文区域且直接或通过间隔子连结至长度为至少8个核苷酸的3'回文区域，其中寡核苷酸包含至少一个YpR二核苷酸。在一个实施方式中，该寡核苷酸不是T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:27)。在一个实施方式中，P类CpG寡核苷酸包括至少一个未甲基化CpG二核苷酸。在另一实施方式中，TLR活化结构域是TCG、TTCG、TTTCG、TYpR、TTYpR、TTTYpR、UCG、UUCG、UUUCG、TTT或TTTT。在另一实施方式中，TLR活化结构域位于5'回文区域内。在另一实施方式中，TLR活化结构域紧邻5'回文区域的5'端。
在一个实施方式中，本发明的“P类”CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5’TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:39)。
在这些序列中，所有连接均可为硫代磷酸酯键。在另一实施方式中，一或多个连接可为优选地在CpG基序的“C”与“G”之间的磷酸二酯，从而产生半软CpG寡核苷酸。在这些序列中的任一者中，乙基-尿苷或卤素可取代5'T；卤素取代的实例包括但不限于溴-尿苷或碘-尿苷取代。
P类寡核苷酸的非限制性实例包括：
5’T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:40)
其中“*”是指硫代磷酸酯键，且“_”是指磷酸二酯键。
在一个实施方式中，寡核苷酸包括至少一个硫代磷酸酯连接。在另一实施方式中，寡核苷酸的所有核苷酸间连接均为硫代磷酸酯连接。在另一实施方式中，寡核苷酸包括至少一个磷酸二酯样连接。在另一实施方式中，磷酸二酯样连接是磷酸二酯连接。在另一实施方式中，亲脂性基团缀合至寡核苷酸。在一个实施方式中，亲脂性基团是胆固醇。
在一个实施方式中，本文所公开CpG寡核苷酸的所有核苷酸间连接均是磷酸二酯键(“软”寡核苷酸，如WO 2007/026190中所描述的)。在另一实施方式中，使本发明的CpG寡核苷酸抵抗降解(例如经稳定化)。“稳定化寡核苷酸”是指相对抵抗活体内降解(例如经由外切酶或内切酶)的寡核苷酸。核酸稳定化可经由主链修饰实现。具有硫代磷酸酯连接的寡核苷酸提供最大活性且保护寡核苷酸免于细胞内外切酶及内切酶的降解。
免疫刺激性寡核苷酸可具有具磷酸二酯及硫代磷酸酯连接的组合的嵌合主链。出于本发明的目的，嵌合主链是指部分稳定化的主链，其中至少一个核苷酸间连接是磷酸二酯键或磷酸二酯样连接，且其中至少一个其它核苷酸间连接是稳定化核苷酸间连接，其中至少一个磷酸二酯或磷酸二酯样连接与至少一个稳定化连接不同。在磷酸二酯连接优先位于CpG基序内时，此类分子称为“半软”分子，如WO 2007/026190中所描述的。
其它经修饰的寡核苷酸包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯及/或对乙氧基连接的组合。
混合主链经修饰ODN可如WO 2007/026190中所描述的来合成。
CpG寡核苷酸的大小(即沿寡核苷酸长度的核苷酸残基数)也可有助于寡核苷酸的刺激活性。为促进吸收至细胞中，本发明的CpG寡核苷酸优选具有6核苷酸残基的最小长度。若存在足够的免疫刺激性基序，则大于6个核苷酸(甚至许多kb长)的任一大小的寡核苷酸均能够诱导免疫反应，这是因较大寡核苷酸在细胞内部被降解。在某些实施方式中，CpG寡核苷酸长6至100个核苷酸，优先地长8至30个核苷酸。在重要实施方式中，本发明的核酸及寡核苷酸并非质体或表现载体。
在一个实施方式中，本文所公开的CpG寡核苷酸包含例如碱基及/或糖中的取代或修饰，如WO 2007/026190的第134段至第147段中所描述的。
在一个实施方式中，本发明的CpG寡核苷酸经化学修饰。化学修饰的实例为本领域技术人员所已知且描述于例如以下文献中：Uhlmann等，(1990)Chem.Rev.90:543；S.Agrawal编辑，Humana Press,Totowa,USA 1993；Crooke等，(1996)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.36:107-129；及Hunziker等，(1995)Mod.Synth.Methods 7:331-417。与由天然DNA或RNA构成的相同序列的寡核苷酸相比，本发明的寡核苷酸可具有一或多个修饰，其中每一修饰位于特定磷酸二酯核苷间桥及/或特定β-D-核糖单元及/或特定天然核苷碱位置处。
在本发明的一些实施方式中，可根据本领域技术人员已知的方法简单地混合含有CpG的核酸与免疫原载体(例如参见WO 03/024480)。
在本发明的一个特定实施方式中，本文所公开的任一免疫原性组合物包含2μg至100mg CpG寡核苷酸。在本发明的一个特定实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含0.1mg至50mg CpG寡核苷酸、优选地0.2mg至10mg CpG寡核苷酸、更优选地地0.3mg至5mgCpG寡核苷酸。在本发明的一个特定实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含0.3mg至5mgCpG寡核苷酸。甚至优选地，本发明的免疫原性组合物可包含0.5mg至2mg CpG寡核苷酸。最佳地，本发明的免疫原性组合物可包含0.75mg至1.5mg CpG寡核苷酸。在一个优选实施方式中，本文所公开的任一免疫原性组合物可包含约1mg CpG寡核苷酸。
3配制物
本发明的免疫原性组合物可配制成液体形式(即溶液或悬浮液)或冻干形式。在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物配制成液体形式。在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物配制成冻干形式。液体配制物可有利地直接自其封装形式施用，且因此理想地用于注射而无需在水性培养基中重构为本公开冻干组合物所需的其它形式。
本发明的免疫原性组合物的配制可使用本领域认可的方法实现。举例而言，可使用生理上可接受的载体配制单独的多糖及/或缀合物以制备组合物。此类载体的实例包括但不限于水、缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及右旋糖溶液。
本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含本文所公开的糖缀合物及药学上可接受的賦形剂、载体或稀释剂的任一组合。
在一个实施方式中，本公开的免疫原性组合物呈液体形式，优选呈水性液体形式。
本公开的免疫原性组合物可包含以下各项中的一或多者：缓冲液、盐、二价阳离子、非离子型清洁剂、低温保护剂(例如糖)及抗氧化剂(例如自由基清除剂或螯合剂)或其任何多个组合。
在一个实施方式中，本公开的免疫原性组合物包含缓冲液。在一个实施方式中，该缓冲液的pKa为约3.5至约7.5。在一些实施方式中，缓冲液是磷酸盐、琥珀酸盐、组氨酸或柠檬酸盐。在一些实施方式中，缓冲液是琥珀酸盐。在一些实施方式中，缓冲液是组氨酸。在某些实施方式中，缓冲液是最终浓度为1mM至10mM的琥珀酸盐。在一个特定实施方式中，琥珀酸盐缓冲液的最终浓度为约5mM。
在一个实施方式中，本公开的免疫原性组合物包含盐。在一些实施方式中，盐选自氯化镁、氯化钾、氯化钠及其组合。在一个特定实施方式中，盐是氯化钠。在一个特定实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含150mM的氯化钠。
在一个实施方式中，本公开的免疫原性组合物包含表面活性剂。在一个实施方式中，表面活性剂选自聚山梨醇酯20(TWEENTM 20)、聚山梨醇酯40(TWEENTM 40)、聚山梨醇酯60(TWEENTM60)、聚山梨醇酯65(TWEENTM65)、聚山梨醇酯80(TWEENTM80)、聚山梨醇酯85(TWEENTM85)、TRITONTMN-101、TRITONTMX-100、辛苯醇醚40、壬苯醇醚-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸酯、聚氧乙烯-660羟基硬脂酸酯(PEG-15、Solutol H 15)、聚氧乙烯-35-蓖麻油酸酯(EL)、大豆卵磷脂及泊洛沙姆(poloxamer)。在一个特定实施方式中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。在一些所述实施方式中，配制物中聚山梨醇酯80的最终浓度是至少0.0001％至10％聚山梨醇酯80(重量/重量，w/w)。在一些所述实施方式中，配制物中聚山梨醇酯80的最终浓度是至少0.001％至1％聚山梨醇酯80(重量/重量，w/w)。在一些所述实施方式中，配制物中聚山梨醇酯80的最终浓度是至少0.01％至1％聚山梨醇酯80(重量/重量，w/w)。在其它实施方式中，配制物中聚山梨醇酯80的最终浓度是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％聚山梨醇酯80(w/w)。在另一实施方式中，配制物中聚山梨醇酯80的最终浓度是0.02％聚山梨醇酯80(w/w)。在另一实施方式中，配制物中聚山梨醇酯80的最终浓度是0.01％聚山梨醇酯80(w/w)。在另一实施方式中，配制物中聚山梨醇酯80的最终浓度是0.03％聚山梨醇酯80(w/w)。在另一实施方式中，配制物中聚山梨醇酯80的最终浓度是0.04％聚山梨醇酯80(w/w)。在另一实施方式中，配制物中聚山梨醇酯80的最终浓度是0.05％聚山梨醇酯80(w/w)。在另一实施方式中，配制物中聚山梨醇酯80的最终浓度是1％聚山梨醇酯80(w/w)。
在一个特定实施方式中，表面活性剂是聚山梨醇酯20。在一些所述实施方式中，配制物中聚山梨醇酯20的最终浓度是至少0.0001％至10％聚山梨醇酯20(重量/重量，w/w)。在一些此类实施方式中，配制物中聚山梨醇酯20的最终浓度是至少0.001％至1％聚山梨醇酯20(重量/重量，w/w)。在一些此类实施方式中，配制物中聚山梨醇酯20的最终浓度是至少0.01％至1％聚山梨醇酯20(重量/重量，w/w)。在其它实施方式中，配制物中聚山梨醇酯20的最终浓度是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％聚山梨醇酯20(w/w)。在另一实施方式中，配制物中聚山梨醇酯20的最终浓度是0.02％聚山梨醇酯20(w/w)。在另一实施方式中，配制物中聚山梨醇酯20的最终浓度是0.01％聚山梨醇酯20(w/w)。在另一实施方式中，配制物中聚山梨醇酯20的最终浓度是0.03％聚山梨醇酯20(w/w)。在另一实施方式中，配制物中聚山梨醇酯80的最终浓度是0.04％聚山梨醇酯20(w/w)。在另一实施方式中，配制物中聚山梨醇酯20的最终浓度是0.05％聚山梨醇酯20(w/w)。在另一实施方式中，配制物中聚山梨醇酯20的最终浓度是1％聚山梨醇酯20(w/w)。
在一个特定实施方式中，表面活性剂是聚山梨醇酯40。在一些所述实施方式中，配制物中聚山梨醇酯40的最终浓度是至少0.0001％至10％聚山梨醇酯40(重量/重量，w/w)。在一些此类实施方式中，配制物中聚山梨醇酯40的最终浓度是至少0.001％至1％聚山梨醇酯40(重量/重量，w/w)。在一些此类实施方式中，配制物中聚山梨醇酯40的最终浓度是至少0.01％至1％聚山梨醇酯40(重量/重量，w/w)。在其它实施方式中，配制物中聚山梨醇酯40的最终浓度是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％聚山梨醇酯40(w/w)。在另一实施方式中，配制物中聚山梨醇酯40的最终浓度是1％聚山梨醇酯40(w/w)。
在一个特定实施方式中，表面活性剂是聚山梨醇酯60。在一些所述实施方式中，配制物中聚山梨醇酯60的最终浓度是至少0.0001％至10％聚山梨醇酯60(重量/重量，w/w)。在一些此类实施方式中，配制物中聚山梨醇酯60的最终浓度是至少0.001％至1％聚山梨醇酯60(重量/重量，w/w)。在一些此类实施方式中，配制物中聚山梨醇酯60的最终浓度是至少0.01％至1％聚山梨醇酯60(重量/重量，w/w)。在其它实施方式中，配制物中聚山梨醇酯60的最终浓度是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％聚山梨醇酯60(w/w)。在另一实施方式中，配制物中聚山梨醇酯60的最终浓度是1％聚山梨醇酯60(w/w)。
在一个特定实施方式中，表面活性剂是聚山梨醇酯65。在一些所述实施方式中，配制物中聚山梨醇酯65的最终浓度是至少0.0001％至10％聚山梨醇酯65(重量/重量，w/w)。在一些此类实施方式中，配制物中聚山梨醇酯65的最终浓度是至少0.001％至1％聚山梨醇酯65(重量/重量，w/w)。在一些此类实施方式中，配制物中聚山梨醇酯65的最终浓度是至少0.01％至1％聚山梨醇酯65(重量/重量，w/w)。在其它实施方式中，配制物中聚山梨醇酯65的最终浓度是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％聚山梨醇酯65(w/w)。在另一实施方式中，配制物中聚山梨醇酯65的最终浓度是1％聚山梨醇酯65(w/w)。
在一个特定实施方式中，表面活性剂是聚山梨醇酯85。在一些所述实施方式中，配制物中聚山梨醇酯85的最终浓度是至少0.0001％至10％聚山梨醇酯85(重量/重量，w/w)。在一些此类实施方式中，配制物中聚山梨醇酯85的最终浓度是至少0.001％至1％聚山梨醇酯85(重量/重量，w/w)。在一些此类实施方式中，配制物中聚山梨醇酯85的最终浓度是至少0.01％至1％聚山梨醇酯85(重量/重量，w/w)。在其它实施方式中，配制物中聚山梨醇酯85的最终浓度是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％聚山梨醇酯85(w/w)。在另一实施方式中，配制物中聚山梨醇酯85的最终浓度是1％聚山梨醇酯85(w/w)。
在某些实施方式中，本公开的免疫原性组合物具有5.5至7.5的pH，更优选地5.6至7.0的pH，甚至更优选地5.8至6.0的pH。
在一个实施方式中，本发明提供了填充有本文所公开的任一免疫原性组合物的容器。在一个实施方式中，容器选自小瓶、注射器、烧瓶、发酵罐、生物反应器、袋、罐、安瓿、柱及一次性笔。在某些实施方式中，容器经硅化。
在一个实施方式中，本公开容器是由玻璃、金属(例如钢、不锈钢、铝等)及/或聚合物(例如热塑性体、弹性体、热塑性弹性体)制得。在一个实施方式中，本公开容器是由玻璃制得。
在一个实施方式中，本发明提供了填充有本文所公开的任一免疫原性组合物的注射器。在某些实施方式中，注射器经硅化及/或由玻璃制得。
本发明的免疫原性组合物用于注射的典型剂量具有0.1mL至2mL的体积。在一个实施方式中，用于注射的本发明的免疫原性组合物具有0.2mL至1mL的体积、甚至更优选地地约0.5mL的体积。
4本发明的糖缀合物及免疫原性组合物的用途
本文所公开的糖缀合物可用作抗原。举例而言，其可为疫苗的一部分。
因此，在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物用作药物。
在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物用作疫苗。
因此，在一个实施方式中，本文所描述的的免疫原性组合物用于在对象生成免疫反应。在一方面中，对象是哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、猫、绵羊、猪、马、牛或犬。在一方面中，对象是人。
本文所描述的的免疫原性组合物可在治疗性或预防性方法中用于预防、治疗或改善对象的细菌感染、疾病或病况。特定而言，本文所描述的的免疫原性组合物可用于预防、治疗或改善对象的肺炎链球菌血清型3感染、疾病或病况。
因此，在一方面中，本发明提供了预防、治疗或改善对象的与肺炎链球菌血清型3有关的感染、疾病或病况的方法，其包含向对象施用免疫有效量的本发明的免疫原性组合物。
在一些此类实施方式中，感染、疾病或病况选自肺炎、窦炎、中耳炎、急性中耳炎、脑膜炎、菌血症、败血症、胸膜积脓、结膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂巢组织炎、软组织感染及脑脓肿。
在一个实施方式中，本发明提供了诱导对象的针对肺炎链球菌血清型3的免疫反应的方法，其包含向对象施用免疫有效量的本发明的免疫原性组合物。在一方面中，对象是哺乳动物，例如人、猫、绵羊、猪、马、牛或犬。在一方面中，对象是人。
在一个实施方式中，本文所公开的免疫原性组合物用作疫苗。在此类实施方式中，本文所描述的的免疫原性组合物可用于预防对象的肺炎链球菌血清型3感染。因此，在一方面中，本发明提供了预防对象的肺炎链球菌血清型3感染的方法，其包含向对象施用免疫有效量的本发明的免疫原性组合物。在一些此类实施方式中，感染选自肺炎、窦炎、中耳炎、急性中耳炎、脑膜炎、菌血症、败血症、胸膜积脓、结膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂巢组织炎、软组织感染及脑脓肿。在一方面中，对象是哺乳动物，例如人、猫、绵羊、猪、马、牛或犬。在一方面中，对象是人。
本发明的免疫原性组合物可用于通过经由全身或粘膜途径施用此类免疫原性组合物来保护易受肺炎链球菌血清型3感染的人或治疗肺炎链球菌血清型3感染。在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物通过肌内、腹膜腔内、皮内或皮下途径施用。在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物通过肌内、腹膜腔内、皮内或皮下注射施用。在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物通过肌内或皮下注射施用。在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物通过肌内注射施用。在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物通过皮下注射施用。
5待使用本发明的免疫原性组合物治疗的对象
如本文所公开，本文所描述的的免疫原性组合物可于多种治疗或预防性方法中用于预防、治疗或改善对象的细菌感染、疾病或病况。
在一个优选实施方式中，该对象是人。在一个最优选实施方式中，该对象是新生儿(即年龄在三个月以下)、婴儿(即年龄为3个月至一岁)或幼儿(即年龄为一岁至四岁)。
在一个实施方式中，本文所公开的免疫原性组合物用作疫苗。
在此类实施方式中，待接种疫苗的对象的年龄可小于1岁。举例而言，待接种疫苗的对象的年龄可为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12个月。在一个实施方式中，待接种疫苗的对象的年龄为约2个月、约4个月或约6个月。在另一实施方式中，待接种疫苗的对象的年龄小于2岁。举例而言，待接种疫苗的对象的年龄可为约12个月至约15个月。在一些情况下，需要少至一个剂量的本发明的免疫原性组合物，但在一些情况下，可给出第二、第三或第四剂量(参见下文的章节8)。
在本发明的一个实施方式中，待接种疫苗的对象是年龄为50岁或以上的成年人，更优选地年龄为55岁或以上的成年人。在一个实施方式中，待接种疫苗的对象是年龄为65岁或以上、年龄为70岁或以上、年龄为75岁或以上或年龄为80岁或以上的成年人。
在一个实施方式中，待接种疫苗的对象是免疫受损的个体、尤其人。免疫受损的个体通常定义为展现减弱或降低的引起针对感染物的攻击的正常体液或细胞防禦的能力的人。
在本发明的一个实施方式中，待接种疫苗的免疫受损对象患有损害免疫系统且引起不足以防止或治疗肺炎球菌性疾病的抗体反应的疾病或病况。
在一个实施方式中，该疾病是原发性免疫缺陷病症。优选地，该原发性免疫缺陷病症选自组合的T细胞及B细胞免疫缺陷、抗体缺陷、经明确定义的综合征、免疫失调疾病、吞噬细胞病症、固有免疫缺陷、自体发炎性病症及补体缺陷。在一个实施方式中，该原发性免疫缺陷病症选自WO 2010/125480的第24页第11行至第25页第19行中所公开者。
在本发明的一个特定实施方式中，待接种疫苗的免疫受损对象患有选自以下的疾病：HIV感染、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、癌症、慢性心脏或肺病症、充血性心脏衰竭、糖尿病、慢性肝病、酒精中毒、硬化、脊髓液渗漏、心肌病、慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)、脾功能障碍(例如镰形血球疾病)、脾功能缺乏(无脾)、恶性血液病、白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金氏病(Hodgkin’s disease)、淋巴瘤、肾衰竭、肾病综合征及哮喘。
在本发明的一个实施方式中，待接种疫苗的免疫受损对象患有营养失调。
在本发明的一个特定实施方式中，待接种疫苗的免疫受损对象正服用降低身体对感染的抗性的药物或治疗剂。在一个实施方式中，该药物选自WO 2010/125480的第26页第33行至第26页第4行中所公开者。
在本发明的一个特定实施方式中，待接种疫苗的免疫受损对象是吸烟者。
在本发明的一个特定实施方式中，待接种疫苗的免疫受损对象的白血细胞计数(白血球计数)小于5×109个细胞/升或小于4×109个细胞/升或小于3×109个细胞/升或小于2×109个细胞/升或小于1×109个细胞/升或小于0.5×109个细胞/升或小于0.3×109个细胞/升或小于0.1×109个细胞/升。
白血细胞计数(白血球计数)：血液中的白血细胞(WBC)数量。WBC通常是作为CBC(全血计数)的部分来测量。白血细胞是血液中的抗感染细胞且不同于红(携带氧)血细胞(称为红血球)。存在不同类型的白血细胞，包括嗜中性粒细胞(多形核白血球；PMN)、杆状核细胞(稍不成熟的嗜中性粒细胞)、T型淋巴球(T细胞)、B型淋巴球(B细胞)、单核细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞。白血细胞的所有类型以白血细胞计数来反映。白血细胞计数的正常范围通常在4,300与10,800个细胞/立方毫米血液之间。此也可提及为白血球计数且可以国际单位表示为4.3-10.8×109个细胞/升。
在本发明的一个特定实施方式中，待接种疫苗的免疫受损对象患有嗜中性粒细胞减少症。在本发明的一个特定实施方式中，待接种疫苗的免疫受损对象的嗜中性粒细胞计数小于2×109个细胞/升或小于1×109个细胞/升或小于0.5×109个细胞/升或小于0.1×109个细胞/升或小于0.05×109个细胞/升。
低白血细胞计数或“嗜中性粒细胞减少症”是特征在于循环血液中的嗜中性粒细胞量异常低的病况。嗜中性粒细胞是有助于预防及抵抗感染的特定类型的白血细胞。癌症患者经历嗜中性粒细胞减少症的最常见原因在于化学疗法的副作用。化学疗法引起的嗜中性粒细胞减少症增加患者感染的风险且破坏癌症治疗。
在本发明的一个特定实施方式中，待接种疫苗的免疫受损对象具有小于500/mm3的CD4+细胞计数或小于300/mm3的CD4+细胞计数或小于200/mm3的CD4+细胞计数、小于100/mm3的CD4+细胞计数、小于75/mm3的CD4+细胞计数或小于50/mm3的CD4+细胞计数。
CD4细胞测试通常报告为mm3中的细胞数。正常CD4计数在500与1,600之间，且CD8计数在375与1,100之间。CD4计数在患有HIV的个体中显著降低。
在本发明的一个实施方式中，本文所公开的任一免疫受损对象是男性或女性。
6方案
在一些情况下，需要少至一个剂量的本发明的免疫原性组合物，但在一些情况(例如较大免疫缺陷的病况)下，可给出第二、第三或第四剂量。在初始接种疫苗后，对象可接受一个或若干个适当间隔的加强免疫。
在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物的接种疫苗时间表是单剂量时间表。在一个特定实施方式中，该单剂量时间表是用于至少2岁的健康人。
在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物的接种疫苗时间表是多剂量时间表。在一个特定实施方式中，该多剂量时间表是由一系列相隔约1个月至约2个月间隔的2个剂量组成。在一个特定实施方式中，该多剂量时间表是由一系列相隔约1个月间隔的2个剂量或一系列相隔约2个月间隔的2个剂量组成。
在另一实施方式中，该多剂量时间表是由一系列相隔约1个月至约2个月间隔的3个剂量组成。在另一实施方式中，该多剂量时间表是由一系列相隔约1个月间隔的3个剂量或一系列相隔约2个月间隔的3个剂量组成。
在另一实施方式中，该多剂量时间表是由一系列相隔约1个月至约2个月间隔的3个剂量、在第一剂量后约10个月至约13个月的第四剂量组成。在另一实施方式中，该多剂量时间表是由一系列相隔约1个月间隔的3个剂量、在第一剂量后约10个月至约13个月的第四剂量或一系列相隔约2个月间隔的3个剂量、在第一剂量后约10个月至约13个月的第四剂量组成。
在一个实施方式中，多剂量时间表是由生命第一年中的至少一个剂量(例如1个、2个或3个剂量)、随后至少一个幼儿剂量组成。
在一个实施方式中，多剂量时间表是由一系列在年龄为2个月时开始的相隔约1个月至约2个月(例如剂量之间为28-56天)间隔的2个或3个剂量及随后在年龄为12-18个月时的幼儿剂量组成。在一个实施方式中，该多剂量时间表是由一系列在年龄为2个月时开始的相隔约1个月至约2个月(例如剂量之间为28-56天)间隔的3个剂量及随后在年龄为12-15个月时的幼儿剂量组成。在另一实施方式中，该多剂量时间表是由一系列在年龄为2个月时开始的相隔约2个月间隔的2个剂量及随后在年龄为12-18个月时的幼儿剂量组成。
在一个实施方式中，多剂量时间表是由在年龄为2个月、4个月、6个月及12-15个月时疫苗的4剂量系列组成。
在一个实施方式中，在第0天给予初次剂量，且以在约2周至约24周范围内之间隔、优选使用4-8周的投药间隔给予一或多个加强。
在一个实施方式中，在第0天给予初次剂量，且在约3个月后给予加强。
7.本公开也提供如下列编号段落1至84中所定义的下列实施方式：
1.一种制备肺炎链球菌血清型3糖缀合物的方法，其包括以下步骤：
(a)使分离的肺炎链球菌血清型3荚膜多糖与碳酸衍生物及叠氮基接头在质子惰性溶剂中进行反应以产生活化的叠氮基多糖，
(b)使载体蛋白与具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，其中该NHS部分与氨基进行反应以形成酰胺键，由此获得炔基官能化的载体蛋白，
(c)通过Cu+1介导的叠氮基-炔基环加成反应使步骤(a)的该活化的叠氮基多糖与步骤(b)的该活化的炔基-载体蛋白进行反应以形成糖缀合物。
2.段落1的方法，其中在该活化步骤(a)之前将该分离的多糖改变大小。
3.段落2的方法，其中将该分离的血清型3荚膜多糖改变大小至重量平均分子量在100kDa与200kDa之间。
4.段落1至3中任一项的方法，其中该碳酸衍生物选自1,1’-羰基二咪唑(CDI)、1,1’-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)、碳酸二琥珀酰亚氨基酯(DSC)及氯甲酸N-羟基琥珀酰亚氨基酯。
5.段落1至3中任一项的方法，其中该碳酸衍生物是1,1’-羰基二咪唑(CDI)。
6.段落1至3中任一项的方法，其中该碳酸衍生物是1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)。
7.段落1至6中任一项的方法，其中该叠氮基接头是式(I)的化合物，
H2N-X-N3
其中X选自CH2(CH2)n、(CH2CH2O)mCH2CH2、NHCO(CH2)n、NHCO(CH2CH2O)mCH2CH2、OCH2(CH2)n及O(CH2CH2O)mCH2CH2；其中n选自1至10且m选自1至4。
8.段落1至6中任一项的方法，其中该叠氮基接头是式(II)的化合物，
9.段落1至8中任一项的方法，其中该具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂是具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及末端炔基的药剂。
10.段落1至8中任一项的方法，其中该具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂是具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及环炔基的药剂。
11.段落1至8中任一项的方法，其中该具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂是式(III)的化合物，
其中X选自CH2O(CH2)nCH2C＝O及CH2O(CH2CH2O)m(CH2)nCH2C＝O，其中n选自0至10且m选自0至4。
12.段落1至8中任一项的方法，其中该具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂是式(IV)的化合物：
13.段落1至12中任一项的方法，其中步骤a)包含在质子惰性溶剂中使该多糖与碳酸衍生物进行反应且随后使经碳酸衍生物活化的多糖与叠氮基接头进行反应以产生活化的叠氮基多糖。
14.段落1至13中任一项的方法，其中在步骤a)处，使该分离的多糖与该碳酸衍生物在质子惰性溶剂中进行反应。
15.段落1至13中任一项的方法，其中在步骤a)处，使该分离的多糖与碳酸衍生物在基本上由二甲基亚砜(DMSO)组成的溶液中进行反应。
16.段落1至14中任一项的方法，其中在步骤a)处，使该分离的多糖与CDI在包含0.1％至1％(v/v)水的质子惰性溶剂中进行反应。
17.段落1至14中任一项的方法，其中在步骤a)处，使该分离多糖与CDI在包含0.1％至1％(v/v)水的DMSO中进行反应。
18.段落1至17中任一项的方法，其中在步骤a)处，碳酸衍生物活化是在添加水后进行。
19.段落18的方法，其中添加水以使混合物中的总水含量在约1％至约10％(v/v)之间。
20.段落1至19中任一项的方法，其中步骤a)进一步包括使该经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，该量是该活化的多糖中多糖重复单元的量的0.01至10摩尔当量。
21.段落1至20中任一项的方法，其中在步骤a)后该活化的多糖的活化度在0.5％至50％之间。
22.段落1至21中任一项的方法，其中步骤b)包括使该载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，该量是该载体上的赖氨酸的0.1至10摩尔当量。
23.段落1至22中任一项的方法，其中在步骤b)后该活化的载体的活化度在1与50之间。
24.段落1至23中任一项的方法，其中缀合反应c)在作为催化剂的铜(I)存在下在水性缓冲液中进行。
25.段落1至23中任一项的方法，其中缀合反应c)在氧化剂及作为催化剂的铜(I)存在下在水性缓冲液中进行。
26.段落1至23中任一项的方法，其中缀合反应c)在作为催化剂的铜(I)及作为氧化剂的抗坏血酸盐存在下在水性缓冲液中进行，其中反应混合物进一步包含THPTA(参(3-羟丙基三唑基甲基)胺)及氨基胍。
27.段落1至26中任一项的方法，其中步骤c)处活化的叠氮基多糖对活化的炔烃-载体的初始输入比(重量/重量)在0.1与3之间。
28.段落1至27中任一项的方法，其中在步骤c)后，该方法进一步包括用叠氮基封端剂将保留于该缀合物中的未反应的叠氮基封端的步骤。
29.段落28的方法，其中该叠氮基封端剂是式(V)的化合物，
≡-X-OH
其中X是(CH2)n，其中n选自1至15。
30.段落28的方法，其中该叠氮基封端剂是炔丙醇。
31.段落28至30中任一项的方法，其中使用一定量的封端剂实施此类未反应的叠氮基的该封端，该量是该活化的多糖中多糖重复单元的量的0.05至20摩尔当量。
32.段落1至31中任一项的方法，其中在步骤c)后，该方法进一步包括使用炔基封端剂将保留于该缀合物中的未反应的炔基封端的步骤。
33.段落32的方法，其中该炔基封端剂是具有叠氮基的药剂。
34.段落33的方法，其中该炔基封端剂是式(VI)化合物，
N3-X-OH
其中X是(CH2)n，其中n选自1至15。
35.段落32的方法，其中该炔基封端剂是3-叠氮基-1-丙醇。
36.段落32至35中任一项的方法，其中使用一定量的封端剂实施此类未反应的炔基的该封端，该量是该活化的多糖中多糖重复单元的量的0.05至20摩尔当量。
37.段落1至36中任一项的方法，其中该方法进一步包括在产生之后纯化该糖缀合物的步骤。
38.一种肺炎链球菌血清型3糖缀合物，其是根据段落1至37中任一项的方法所产生。
39.一种肺炎链球菌血清型3糖缀合物，其包含通过间隔子共价缀合至载体蛋白(CP)的肺炎链球菌血清型3糖且具有通式(VII)：
其中X选自CH2(CH2)n’、(CH2CH2O)mCH2CH2、NHCO(CH2)n’、NHCO(CH2CH2O)mCH2CH2、OCH2(CH2)n’及O(CH2CH2O)mCH2CH2；其中n’选自1至10且m选自1至4，
且其中X'选自CH2O(CH2)n”CH2C＝O、CH2O(CH2CH2O)m’(CH2)n”CH2C＝O，其中n”选自0至10且m’选自0至4。
40.一种肺炎链球菌血清型3糖缀合物，其包含通过间隔子共价缀合至载体蛋白(CP)的肺炎链球菌血清型3糖且具有通式(VII)，其中X是CH2(CH2)n’，其中n’为2；且其中X’是CH2O(CH2)n”CH2C＝O，其中n”为1。
41.段落38至40中任一项的血清型3糖缀合物，其包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在10kDa与2,000kDa之间。
42.段落38至40中任一项的血清型3糖缀合物，其包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在50kDa与300kDa之间。
43.段落38至40中任一项的血清型3糖缀合物，其包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在75kDa与200kDa之间。
44.段落38至40中任一项的血清型3糖缀合物，其包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在100kDa与200kDa之间。
45.段落38至40中任一项的血清型3糖缀合物，其包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在125kDa与200kDa之间。
46.段落38至40中任一项的血清型3糖缀合物，其包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)为约200kDa。
47.段落38至40中任一项的血清型3糖缀合物，其包含血清型3荚膜多糖，其中该多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)为约150kDa。
48.段落38至47中任一项的血清型3糖缀合物，其具有在250kDa与20,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。
49.段落38至47中任一项的血清型3糖缀合物，其具有在500kDa与5,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。
50.段落38至47中任一项的血清型3糖缀合物，其具有在750kDa与2,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。
51.段落38至47中任一项的血清型3糖缀合物，其具有在1,000kDa与4,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。
52.段落38至51中任一项的血清型3糖缀合物，其中该血清型3糖缀合物的缀合度在2与15之间。
53.段落38至52中任一项的血清型3糖缀合物，其中该糖缀合物(w/w)中血清型3多糖对载体蛋白的比在0.5与3.0之间。
54.段落38至52中任一项的血清型3糖缀合物，其中对于该多糖的每4个糖重复单元，该血清型3糖缀合物在该载体蛋白与该多糖之间包含至少一个共价连接。
55.段落38至52中任一项的血清型3糖缀合物，其中对于该多糖的每25个糖重复单元，该血清型3糖缀合物在该载体蛋白与该多糖之间包含至少一个共价连接。
56.段落38至52中任一项的血清型3糖缀合物，其中对于该多糖的每5至10个糖重复单元，该血清型3糖缀合物在该载体蛋白与该多糖之间包含至少一个共价连接。
57.段落38至56中任一项的血清型3糖缀合物，其中该载体蛋白是CRM197。
58.段落38至56中任一项的血清型3糖缀合物，其中该载体蛋白是SCP。
59.段落38至56中任一项的血清型3糖缀合物，其中该载体蛋白是酶促惰性SCP。
60.段落38至56中任一项的血清型3糖缀合物，其中该载体蛋白是来自GBS的酶促惰性SCP(SCPB)。
61.段落38至56中任一项的血清型3糖缀合物，其中该载体蛋白是SCPB的片段。
62.段落38至56中任一项的血清型3糖缀合物，其中该载体蛋白是包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域的SCP片段。
63.段落38至56中任一项的血清型3糖缀合物，其中该载体蛋白是SCP的酶促惰性片段。在一个实施方式中，该SCP的酶促惰性片段包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域，但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域。
64.段落38至56中任一项的血清型3糖缀合物，其中该载体蛋白是包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域的SCP酶促惰性片段，其中该失活通过取代野生型序列的至少一个氨基酸所实现且其中该取代选自D130A、H193A、N295A及S512A，其中数字指示根据WO00/34487的SEQ ID NO:1的编号肽酶中的氨基酸残基位置。
65.段落38至56中任一项的血清型3糖缀合物，其中该载体蛋白是包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA结构域)及三个III型纤连蛋白(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚结构域的SCP酶促惰性片段，其中该失活通过取代野生型序列的至少两个氨基酸所实现，其中该至少两个氨基酸取代是D130A及S512A，其中数字指示根据WO00/34487的SEQ ID NO:1的编号肽酶中的氨基酸残基位置。
66.段落38至56中任一项的血清型3糖缀合物，其中该载体蛋白是由与SEQ ID NO:41具有至少95％相同性的多肽组成的SCP酶促惰性片段。
67.段落38至56中任一项的血清型3糖缀合物，其中该载体蛋白是由与SEQ ID NO:42具有至少95％相同性的多肽组成的SCP酶促惰性片段。
68.段落38至56中任一项的血清型3糖缀合物，其中该载体蛋白是由SEQ ID NO:41组成的SCP酶促惰性片段。
69.段落38至56中任一项的血清型3糖缀合物，其中该载体蛋白是由SEQ ID NO:42组成的SCP酶促惰性片段。
70.一种免疫原性组合物，其包含段落38至69中任一项的肺炎链球菌血清型3糖缀合物。
71.段落70的免疫原性组合物，其包含1至25种来自不同肺炎链球菌血清型的糖缀合物。
72.段落70的免疫原性组合物，其包含来自7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25种不同肺炎链球菌血清型的糖缀合物。
73.段落70的免疫原性组合物，其是15价肺炎球菌缀合物组合物。
74.段落70的免疫原性组合物，其是20价肺炎球菌缀合物组合物。
75.段落70至74中任一项的免疫原性组合物，其包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F的糖缀合物。
76.段落75的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、5及7F的糖缀合物。
77.段落76的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型6A及19A的糖缀合物。
78.段落77的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型22F及33F的糖缀合物。
79.段落78的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型8、10A、11A、12F及15B的糖缀合物。
80.段落70的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F的糖缀合物，其中该免疫原性组合物是13价肺炎球菌缀合物组合物。
81.段落70的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F的糖缀合物，其中该免疫原性组合物是15价肺炎球菌缀合物组合物。
82.段落70的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的糖缀合物，其中该免疫原性组合物是20价肺炎球菌缀合物组合物。
83.段落70的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及35B的糖缀合物，其中该免疫原性组合物是25价肺炎球菌缀合物组合物。
84.段落70的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38的糖缀合物，其中该免疫原性组合物是25价肺炎球菌缀合物组合物。
如本文中所使用，术语“约”意指在值的统计学上有意义的范围内，例如所述浓度范围、时段、分子量、温度或pH。此一范围可在一定数量级内，通常在给定值或范围的20％内、更通常10％内及甚至更通常5％内或1％内。有时，此一范围可在用于测量及/或确定给定值或范围的标准方法的典型实验误差内。术语“约”所涵盖的允许变化形式将依赖于研究下的特定系统，且可容易地为本领域技术人员所了解。每当在本申请案内陈述范围时，也考虑在该范围内的每个数值以作为本发明的一个实施方式。
发明人在本文中所用术语“包含(comprising、comprise及comprises)”意欲可在每一情况下任选地分别经术语“基本上由……组成(consisting essentially of、consistessentially of)”、“由……组成(consisting of、consist of及consists of)”取代。
“免疫原性量”、“免疫有效量”、“治疗有效量”、“防治有效量”或“剂量”(其中的每一者可在本文中互换使用)通常是指抗原或免疫原性组合物足以诱发免疫反应的量，该免疫反应是细胞(T细胞)或体液(B细胞或抗体)反应或二者，如通过本领域技术人员已知的标准分析所测量。
考虑在本文件的任一范围内的任何整数以作为本发明的一个实施方式。
本专利说明书中所引用的所有参考文献或专利申请案均以引用方式并入本文中。
在随附实施例中阐释本公开。除非另有详细描述，否则以下实例使用标准技术实施，此类技术为本领域技术人员所熟知且是常规技术。此类实施例具有阐释性，但并不限制本公开。
实施例
实施例1.使用水性缓冲液中还原胺化(RAC/Aq.)来制备血清型3糖缀合物
1.水解
在活化之前水解天然多糖以减小分子量。将计算体积的2M乙酸添加至多糖溶液中以实现2.0±0.2g/L的最终多糖浓度及0.2M的最终乙酸浓度。将经稀释多糖溶液加热至85±5℃。依赖靶多糖Mw，维持水解反应某一时间。在反应结束时，将混合物冷卻至23±2℃。
2.氧化
对于氧化反应而言，将1M氯化镁添加至反应溶液中直至最终浓度为0.10M。然后将过碘酸添加至多糖溶液中以引发氧化反应(以于WFI中的50mg/mL溶液形式添加)。基于靶氧化度(DO)来选择过碘酸的所需摩尔当量。DO的靶范围为5.0±3.0。氧化反应时间为20±4小时，且在23±2℃下进行。
3.活化多糖的纯化
通过针对WFI的切向流过滤来纯化活化多糖。使用截止分子量(MWCO)为100kDa的聚醚砜(PES)平板膜实施渗滤。在完成渗滤后，表征活化多糖的以下各项：(i)糖浓度-通过比色分析；(ii)醛浓度-通过比色分析；(iii)氧化度；及(iv)分子量-通过SEC-MALLS。将纯化糖的pH调节至6.3±0.3。然后以预定比添加蛋白质(CRM197、TT或SCP)。然后壳式冷冻混合物并冻干至干燥。
4.缀合反应
在0.1M磷酸钠缓冲液中重构经冻干的活化多糖及蛋白质。在重构完成之后，使用1N盐酸或1N氢氧化钠将pH调节至最终pH为6.5±0.2。为引发缀合反应，将预定摩尔当量的氰基硼氢化钠添加至反应混合物中。在30±2℃下使缀合进行40±4小时的时段，同时在100±10rpm下连续混合。
5.稀释及封端反应
在缀合反应时间完成之后，将反应溶液冷卻至23±2℃并使用0.9％ NaCl缓冲液将反应体积稀释0.5-1.0倍，然后将1摩尔当量的硼氢化钠添加至混合物中。在23±2℃下使封端反应进行3-6小时的时段，同时在100±10rpm下连续混合。
6.缀合物的纯化
使经稀释的缀合物溶液通过5μm过滤器，且使用5mM琥珀酸盐/0.9％盐水(pH 6.0)作为培养基实施渗滤。在完成渗滤之后，经由0.45um/0.22μm过滤器过滤缀合物滞留物。
实施例2.使用二甲基亚砜中还原胺化(RAC/DMSO)来制备血清型3糖缀合物
1.水解及氧化
以与针对上述水性基缀合所描述的相同的方式实施多糖水解、活化及渗滤。基于靶DO来选择过碘酸钠的所需摩尔当量。DO的靶范围为15.0±4.0。氧化反应时间为20±4小时，且在23±2℃下进行。
2.复合及冻干
将活化多糖与蔗糖以25-100克蔗糖/克活化多糖的比、优选地以40-60克蔗糖/克活化多糖的比复合。然后冻干经复合混合物。将计算量的载体蛋白(CRM197、TT或SCP)壳式冷冻并单独冻干。
3.缀合及封端
在无水二甲基亚砜(DMSO)中重构经冻干的活化多糖，使用等量无水DMSO重构载体蛋白。
在反应容器中合并重构的活化多糖与重构的载体蛋白，随后充分混合以获得澄清溶液，随后使用氰基硼氢化钠引发缀合。反应溶液中的最终多糖浓度为约1g/L。通过将0.5-2.0MEq的氰基硼氢化钠添加至反应混合物中来引发缀合并在23±2℃下培养20-48hr。通过添加2MEq硼氢化钠(NaBH4)来终止缀合反应以将未反应醛封端。在23±2℃下持续此封端反应3±1hr。
4.纯化
在制备中使用经冷卻的5mM琥珀酸盐-0.9％盐水(pH 6.0)以1:10稀释缀合物溶液，使用100-300K MWCO膜通过切向流过滤来纯化。然后使用5mM琥珀酸盐/0.9％盐水(pH6.0)作为培养基实施渗滤。在完成渗滤之后，经由0.22μm过滤器转移缀合物滞留物。使用5mM琥珀酸盐/0.9％盐水(pH 6)将缀合物进一步稀释至约0.5mg/mL的目标糖浓度。或者，使用20mM组氨酸-0.9％盐水(pH 6.5)通过切向流过滤使用100-300K MWCO膜来纯化缀合物。完成最终0.22μm过滤步骤以获得免疫原缀合物。
表1总结了使用两种缀合(DMSO或水性缓冲液中的还原胺化)获得的一些缀合物的结果
实施例3.多糖大小对血清型3糖缀合物的效应
在标准条件下测定小鼠中包含不同大小的多糖的血清型3-CRM197缀合物的调理吞噬活性(OPA)效价。
使用利用RAC/水性(参见实施例1)或RAC/DMSO(参见实施例2)缀合至CRM197来缀合至CRM197的改变大小的血清型3多糖(约25、150或250kDa)在佐剂存在下对动物接种疫苗(参见表2处的测试缀合物的属性)。
表2.用于评估多糖大小效应的Pn3缀合物的属性
MW：分子量；SPR：糖与蛋白质比
在第0周使用0.01μg/ml、0.1μg/ml或1μg/ml测试缀合物经由皮下途径对25只6-8周龄雌性瑞士韦伯斯特小鼠(Swiss Webster mice)的各组实施免疫(250μL)。在第3周使用相同剂量的缀合物对小鼠加强免疫且然后在第5周抽血。使用100μg/剂量的AlPO4作为佐剂来配制所接种的每种疫苗。所有临床前免疫原性研究均能够使用25只小鼠/组来检测OPA效价的4至5倍差异。在第二接种疫苗之后两周(第5周，PD 2)自小鼠收集全血并使用血清进行分析。对第5周血清样品实施血清型特异性OPA分析。
使用调理吞噬活性(OPA)分析来测量鼠类血清中对肺炎链球菌血清型3具有特异性的功能抗体。将测试血清置于分析反应中，此类分析反应测量荚膜多糖特异性免疫球蛋白调理细菌、觸发补体沉积以由此促进吞噬作用并通过吞噬细胞杀死细菌的能力。OPA效价定义为使细菌计数比不含测试血清的对照孔减少50％的倒数稀释度。OPA效价是自两种涵盖此50％杀死截止值的稀释物内插。
OPA程序是基于Hu等，(2005)Clin Diagn Lab Immunol 12(2):287-295中所描述的的方法且进行下列修改。将测试血清连续稀释2.5倍且添加至微量滴定分析板中。将活血清型3靶细菌菌株添加至孔中，且在25℃下将板振荡30分钟。将分化的HL-60细胞(吞噬细胞)及幼兔血清(3至4周龄，12％最终浓度)添加至孔中，且在37℃下将板振荡45分钟。为终止反应，将80μL 0.9％ NaCl添加至所有孔中，混合，且将10μL等分样品转移至含有200μL水的/>HTS HV过滤板/>的孔中。在真空下经由板过滤液体，且将150μL/>培养基添加至每孔中并过滤。然后在37℃、5％ CO2下将过滤板培养过夜，且然后使用脱色溶液(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)固定。然后使用考马斯蓝(Coomassie Blue)对板进行染色且去色一次。使菌落成像且列举在Cellular Technology Limited(CTL)(Shaker Heights,OH)/>分析仪上。使用生菌落计数来繪制杀死曲线并计算OPA效价。
在5周时不同剂量下的OPA效价(具有95％置信区间(CI)的几何平均效价(GMT))示出了于表3中。结果呈现于图3中。
表3及图3的数据指示，血清型3缀合物在鼠类免疫原性模型中诱发剂量依賴性OPA效价。如表3中所示出了，随著多糖大小降低，使用RAC/水性化学的血清型3缀合物在所有剂量下均诱导较高OPA GMT。对于RAC/DMSO化学而言，在0.01μg剂量及较小多糖大小下，无反应者较少。
实施例4.多糖的氧化度(DO)/活化度(DoA)对血清型3糖缀合物的效应
在标准条件下测定小鼠中使用不同氧化度生成的血清型3-CRM197缀合物的调理吞噬活性(OPA)效价。
使用利用RAC/水性(参见实施例1)或RAC/DMSO(参见实施例4)缀合至CRM197来缀合至CRM197的改变大小的血清型3多糖(约120-170kDa)在佐剂存在下对动物接种疫苗(参见表2处的测试缀合物的属性)。
表4.用于评估氧化度的Pn3缀合物的属性
MW：分子量；SPR：糖与蛋白质比
在第0周时，使用0.01μg/ml、0.1μg/ml或1μg/ml测试缀合物经由皮下途径对25只6-8周龄的雌性瑞士韦伯斯特小鼠的各组实施免疫(250μL)。在第3周时使用相同剂量的缀合物对小鼠实施加强免疫，且然后在第5周时采血。对第5周血清样品实施血清型特异性OPA分析。
如实施例3处所描述的实施OPA。结果呈现于表5及图4中。
表5及图4的数据指示，血清型3缀合物在鼠类免疫原性模型中诱发剂量依賴性OPA效价。如表5中所示出了，使用RAC/水性或RAC/DMSO化学的血清型3缀合物在所有剂量及较高DO下均诱导较高OPA GMT。
实施例5：使用点击化学缀合血清型3荚膜多糖(参见图2)
1.使用叠氮基接头活化血清型3荚膜多糖
将血清型3荚膜多糖与咪唑(3x,w/w)混合且使用1M-HCl将pH调节至3.5，然后冷冻并冻干。
在冻干3天之后，使用无水DMSO(4mg/mL)重构经冻干多糖。然后将反应混合物升温至35℃，且添加CDI(0.2MEq)。将反应混合物在35℃下搅拌3hr。在将反应混合物冷卻至23℃之后，添加WFI(2％v/v)以淬灭游离CDI且然后在23℃下进一步搅拌30min。向反应混合物中添加3-叠氮基-丙基胺(2MEq)。在23℃下反应20hr之后，将反应混合物稀释至冷冻(在5℃下)10mM NaH2PO4缓冲液(5X,v/v)中。然后通过UF/DF使用10K MWCO PES膜针对WFI(30X,v/v)来纯化经稀释反应混合物。
2.使用炔烃NHS酯将CRM197活化成炔烃-CRM197
向CRM197溶液(1000mg)中添加57mL WFI及50mL 0.5M磷酸钠缓冲液(pH 8.3)。在冷卻至8℃之后，将18mL 3-炔丙基氧基-丙酸NHS酯(POPS)(20mg/mL于DMSO中)(相对于CRM197上的离氨酸，2.4MEq)逐滴添加至反应混合物中且将反应温度维持于8±3℃。在将反应混合物在8℃下搅拌2hr之后，通过UF/DF使用10K MWCO PES膜(Millipore Pellicon 2Mini)针对100mM磷酸钠缓冲液/盐水(pH 7.0)(30X透析体积)进行纯化。在UF/DF之后，添加蔗糖23g(15％v/v)。
3.点击缀合：通过Cu+1介导的叠氮基-炔基环加成反应(称为“点击反应”)使活化的叠氮基poly及炔烃CRM缀合。
在23℃下，将5mM硫酸铜(CuSO4)(1mL)及25mM参(3-羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)(1mL)的混合物添加至经叠氮基接头活化的血清型3荚膜多糖(参见上述步骤1)及炔烃-CRM197(参见上述步骤2)(于100mM磷酸钠缓冲液(SPB)/盐水中，pH 7.0)的混合物中，且随后添加100mM氨基基团胍(2mL)及100mM抗坏血酸钠(2mL)。在将反应混合物在23℃下搅拌2小时之后，在23℃下通过炔丙醇(1MEq)将未反应叠氮基封端2小时，且在第一封端之后，随后在23℃下通过3-叠氮基-1-丙醇(2MEq)将未反应炔基基团封端2小时。然后，通过UF/DF使用100K MWCO PES膜针对(10mM EDTA+10mM SPB)/盐水(pH 7.0)(30X透析体积)且随后针对5mM琥珀酸盐/盐水(pH 6.0)(30X透析体积)来纯化反应混合物。
实施例6.载体蛋白对血清型3糖缀合物的免疫原性的效应
在标准条件下测定小鼠中血清型3-CRM197、SCP或破伤风类毒素缀合物的调理吞噬活性(OPA)效价。使用DMSO中还原胺化(RAC/DMSO)(参见实施例2)。
使用缀合至不同蛋白质载体的改变大小的血清型3多糖(约160-250kDa)在佐剂存在下对动物接种疫苗(参见表6处的测试缀合物的属性)。
表6.用于化学评估(RAC/DMSO)的Pn3缀合物的属性
MW：分子量；SPR：糖与蛋白质比
在第0周时，使用0.01μg/ml、0.1μg/ml或1μg/ml测试缀合物经由皮下途径对25只6-8周龄的雌性瑞士韦伯斯特小鼠的各组实施免疫(250μL)。在第3周时使用相同剂量的缀合物对小鼠实施加强免疫，且然后在第5周时采血。对第5周血清样品实施血清型特异性OPA分析。
结果呈现于表7及图5中。
表7及图5的数据指示，血清型3缀合物在鼠类免疫原性模型中诱发剂量依賴性OPA效价。如表7中所示出了，缀合至SCP的血清型3诱导较高OPA GMT，且所有小鼠均具有反应并获得可测量OPA效价(0％无反应者)，即使在低剂量下。
如本文所述，仅SCP真正增加了对0.01ug/ml剂量下的接种疫苗具有反应的小鼠的百分比。TT所诱发的反应通常低于CRM197。
实施例7.化学对血清型3糖缀合物的免疫原性的效应
在标准条件下测定小鼠中血清型3-CRM197缀合物的调理吞噬活性(OPA)效价。使用不同化学(水性还原胺化(RAC/Aq.)，参见实施例1；DMSO中还原胺化(RAC/DMSO)，参见实施例2；eTEC连接的糖缀合物(eTEC)，参见WO2014/027302；或点击化学(点击)，参见实施例5)评估小鼠中的OPA反应变化。
使用利用不同化学缀合至CRM197的改变大小的血清型3多糖(约160-1100kDa)在佐剂存在下对动物接种疫苗(参见表8处的测试缀合物的属性)。
表8.用于评估缀合化学的Pn3缀合物的属性
| RAC/Aq. | RAC/DMSO | eTEC | 点击 | |
| 活化多糖MW，kDa | 250 | 234 | 1131 | 470 |
| 缀合物MW(kDa) | 2467 | 3123 | 2278 | 598 |
| 活化度 | 3.9 | 14 | 19 | 12 |
| SPR比 | 0.9 | 1 | 1.1 | 0.4 |
| 游离糖，％ | <5 | 4.5 | 3 | 9 |
MW：分子量；SPR：糖与蛋白质比
在第0周时，使用0.01μg/ml、0.1μg/ml或1μg/ml测试缀合物经由皮下途径对25只6-8周龄的雌性瑞士韦伯斯特小鼠的各组实施免疫(250μL)。在第3周时使用相同剂量的缀合物对小鼠实施加强免疫，且然后在第5周时采血。对第5周血清样品实施血清型特异性OPA分析。
结果呈现于表9及图6中。
表9及图6的数据指示所有血清型3缀合物均在鼠类免疫原性模型中诱发剂量依賴性OPA效价。如表9及图6中所示出了，与其他化学相比，使用点击化学的血清型3在所有小鼠中均诱导指示可测量OPA反应的较高OPA GMT。
实施例8：利用CRM197作为载体蛋白使用点击化学的肺炎链球菌血清型3糖缀合物
使用类似于实施例5中者的过程(点击化学)且使用CRM197作为载体来生成具有不同属性的缀合物(参见表10)。通过Pn3与叠氮基poly(活化度(DoA)12％)及炔烃CRM197(DoA18)的点击缀合生成的1号及2号缀合物获得低产率、低MW及低糖蛋白质比(SPR)。已通过降低叠氮基多糖及炔烃CRM197的DoA来最佳化过程以增加缀合产率及靶缀合物SPR(约1)。使用叠氮基多糖(DoA 5％)及炔烃CRM197(DoA11)产生具有SPR 1.1及较高产率的3号缀合物。
然后使用此过程，且产率增至76％。大部分此类参数生成游离糖小于20％的缀合物。
表10.
实施例9：利用SCP作为载体蛋白使用点击化学的肺炎链球菌血清型3糖缀合物
使用类似于实施例5中者的过程(点击化学)且使用SCP作为载体来生成具有不同属性的缀合物。叠氮基poly(DOA 5％)及炔烃SCP(DOA 26)的点击缀合生成具有中等产率及SPR的1号缀合物。然而，在最佳化期间，使用具有4％及13％ DOA的叠氮基poly及具有DOA13、26及37的炔烃SCP生成2号至7号缀合物。如自下表(表11)所示出了，具有DOA 26的炔烃SCP生成具有高产率、SPR～1及较高MW的2号及3号缀合物。与2号及3号缀合物相比，使用具有DOA13及37的炔烃SCP制得的缀合物是具有较低产率、MW及SPR的4号至6号缀合物。
表11.
实施例10：利用TT作为载体蛋白使用点击化学的肺炎链球菌血清型3糖缀合物
使用类似于实施例5中者的过程(点击化学)且使用TT作为载体来生成具有不同属性的缀合物。
叠氮基poly(DOA～5％)及炔烃TT(DOA～10、15及20)的点击缀合生成具有较高游离糖含量的1-4号缀合物。然而，在过程最佳化期间，具有DOA～10％的叠氮基poly及具有DOA～20的炔烃TT生成具有低游离糖的5号缀合物(参见表12)。
表12.
实施例11：使用不同化学及不同载体的肺炎链球菌血清型3糖缀合物的免疫原性的评估
使用利用RAC/Aq.或点击化学缀合至2种载体蛋白(CRM197或SCP)中的任一者的肺炎链球菌血清型3对婴儿恒河猴接种疫苗。
1.婴儿恒河猴研究
将年龄及性别匹配的婴儿恒河猴(IRM)(3-6个月龄)随机分成3组(参见研究设计表13)。
经肌内使用点击多糖化学(点击-SCP、点击-CRM；poly大小均为约130kDa)或使用ST3 RAC-水性CRM缀合物(poly大小为约250kDa)对幼猴接种疫苗。在初次接种疫苗(D0)之前1周(wk＝-1)预采血以评价基线ST3特异性血清效价。在初次接种疫苗后第8周及第16周重复接种疫苗两次。
在剂量1后(PD1)4-及8周、PD2 1、4及8周及PD3 1、4、16及36周收集全血以获得血清。
2.调理吞噬分析
实施微菌落调理吞噬分析(mcOPA)。
在Pn3 mcOPA中，将由靶细菌细胞及热灭活测试血清构成的反应混合物在25℃下于环境振荡器中培养30分钟。然后将分化的HL-60组织培养细胞(效应细胞)及仔兔补体添加至反应混合物中，并在37℃下于环境振荡器中培养45分钟。通过测量含有测试血清的mcOPA反应液中的细菌存活率来测定功能性抗肺炎链球菌抗体效价。平铺分析混合物并生长过夜。
在第2天，测定未吞噬活细菌的数量。mcOPA抗体效价是使得与不含血清的细菌-效应细胞-补体对照孔相比细菌群落数减小50％的血清稀释度的倒数。
表13.
3.结果
3.1.点击-SCP化学显著改良了婴儿恒河猴在剂量1后的血清型3特异性OPA效价：
评估与RAC/Aq-CRM化学相比使用肺炎球菌血清型3点击化学(点击-SCP、点击-CRM)在婴儿恒河猴的初次接种疫苗之后的OPA反应。所有构建体均经AlPO4佐剂化(表13)。有趣的是，与RAC/Aq-CRM相比，点击-SCP化学/载体组合显著改良了血清型3特异性OPA(>8倍)(图7；表14)。
表14.婴儿恒河猴中的剂量1后第4周OPA效价
*单向ANOVA与杜克多重对照测试
3.2点击-SCP化学诱导婴儿恒河猴在剂量2后(PD2)的最高OPA效价
进一步测试第2个月时的第二剂量是否诱导婴儿恒河猴中的OPA效价增加。与相应PD1效价相比，使用所有不同化学的缀合物接种疫苗均诱导较高PD2 OPA效价(图8)。点击-SCP接种疫苗诱导约4.5倍于RAC/Aq-CRM化学的最高几何平均效价(表15)。此外，点击-SCP诱导的效价具有窄置信区间，此指示在该组的所有猴中生成均匀免疫反应(图8)。与RAC/Aq-CRM相比，点击-CRM接种疫苗改良了各别剂量下的PD2 OPA效价，但具有较宽置信区间(图8)。
表15.婴儿恒河猴中的剂量2后第4周OPA效价
*单向ANOVA与杜克多重对照测试
与使用单一剂量的RAC/Aq-CRM缀合物相比，使用点击-SCP缀合物接种疫苗在婴儿恒河猴中诱导显著更高的血清型3特异性OPA/IgG效价且维持较高PD2反应。点击-CRM接种疫苗所诱导的婴儿恒河猴平均效价高于RAC/Aq-CRM缀合物。
本说明书中所提及的所有出版物及专利申请案均指示本领域技术人员的技术水准。所有出版物及专利申请案均以引用方式并入本文中，其程度如同指示每一单独的出版物或专利申请案特定地且单独地以引用方式并入本文中。
尽管出于清晰理解的目的已通过说明及实施例相当详细地描述了上述发明，但可在随附申请专利范围的范围内实践某些变化及修改。
Claims (27)
1.一种制备肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型3糖缀合物的方法，其包括以下步骤：
(a)使分离的肺炎链球菌血清型3荚膜多糖与碳酸衍生物及叠氮基接头在质子惰性溶剂中进行反应以产生活化的叠氮基多糖，
(b)使载体蛋白与具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，其中所述NHS部分与氨基进行反应以形成酰胺键，由此获得炔基官能化的载体蛋白，
(c)通过Cu+1介导的叠氮基-炔基环加成反应使步骤(a)的活化的叠氮基多糖与步骤(b)的活化的炔基-载体蛋白进行反应以形成糖缀合物。
2.权利要求1的方法，其中所述分离的多糖在所述活化步骤(a)之前被改变大小。
3.权利要求2的方法，其中所述分离的血清型3荚膜多糖被改变大小至重量平均分子量在100kDa与200kDa之间。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述碳酸衍生物是1,1’-羰基二咪唑(1,1’-CDI)、1,1’-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)、碳酸二琥珀酰亚氨基酯(DSC)或氯甲酸N-羟基琥珀酰亚氨基酯。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述叠氮基接头是式(I)的化合物，
H2N-X-N3 (I)
其中X选自CH2(CH2)n、(CH2CH2O)mCH2CH2、NHCO(CH2)n、NHCO(CH2CH2O)mCH2CH2、OCH2(CH2)n及O(CH2CH2O)mCH2CH2；其中n选自1至10，且m选自1至4。
6.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述叠氮基接头是式(II)的化合物，
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂是具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及末端炔基的药剂。
8.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂是具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及环炔基的药剂。
9.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂是式(III)的化合物，
其中X选自CH2O(CH2)nCH2C＝O及CH2O(CH2CH2O)m(CH2)nCH2C＝O，其中n选自0至10，且m选自0至4。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂是式(IV)的化合物：
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中步骤a)进一步包括使所述经碳酸衍生物活化的多糖与一定量的叠氮基接头进行反应，所述量是所述活化的多糖中多糖重复单元的量的0.01至10摩尔当量。
12.权利要求1至11中任一项的方法，其中步骤b)包括使所述载体蛋白与一定量的具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔基的药剂进行反应，所述量是所述载体上的赖氨酸的0.1至10摩尔当量。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中缀合反应c)在作为催化剂的铜(I)存在下在水性缓冲液中进行。
14.权利要求1至13中任一项的方法，其中在步骤c)后，所述方法进一步包括用叠氮基封端剂将保留于所述缀合物中的未反应的叠氮基封端的步骤。
15.权利要求1至14中任一项的方法，其中在步骤c)后，所述方法进一步包括使用炔基封端剂将保留于所述缀合物中的未反应的炔基封端的步骤。
16.权利要求1至15中任一项的方法，其中所述方法进一步包括在所述糖缀合物产生后对其进行纯化的步骤。
17.根据权利要求1至16中任一项的方法产生的肺炎链球菌血清型3糖缀合物。
18.一种肺炎链球菌血清型3糖缀合物，其包含通过间隔子共价缀合至载体蛋白(CP)的肺炎链球菌血清型3糖，且具有通式(VII)：
其中X选自CH2(CH2)n’、(CH2CH2O)mCH2CH2、NHCO(CH2)n’、NHCO(CH2CH2O)mCH2CH2、OCH2(CH2)n’及O(CH2CH2O)mCH2CH2；其中n’选自1至10，且m选自1至4，
且其中X'选自CH2O(CH2)n”CH2C＝O、CH2O(CH2CH2O)m’(CH2)n”CH2C＝O，其中n”选自0至10，且m’选自0至4。
19.一种肺炎链球菌血清型3糖缀合物，其包含通过间隔子共价缀合至载体蛋白(CP)的肺炎链球菌血清型3糖，且具有通式(VII)，其中X是CH2(CH2)n’，其中n’为2；且其中X’是CH2O(CH2)n”CH2C＝O，其中n”为1。
20.权利要求17至19中任一项的血清型3糖缀合物，其包含血清型3荚膜多糖，其中所述多糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在75kDa与200kDa之间。
21.权利要求17至20中任一项的血清型3糖缀合物，其具有在1,000kDa与4,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。
22.权利要求17至21中任一项的血清型3糖缀合物，其中所述载体蛋白是CRM197。
23.权利要求17至21中任一项的血清型3糖缀合物，其中所述载体蛋白是SCP。
24.一种免疫原性组合物，其包含权利要求17至23中任一项的肺炎链球菌血清型3糖缀合物。
25.权利要求24的免疫原性组合物，其包含1至25种来自不同肺炎链球菌血清型的糖缀合物。
26.权利要求24的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的糖缀合物，其中所述免疫原性组合物是20价肺炎球菌缀合物组合物。
27.权利要求24的免疫原性组合物，其进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及35B的糖缀合物，其中所述免疫原性组合物是25价肺炎球菌缀合物组合物。
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