TW202227106A - 胎盤萃取物之用途 - Google Patents

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清水邦義
西尾朋恵
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國立大學法人九州大學
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Abstract

本發明課題係提供一種與以往相比，胎盤萃取物在更明確目的下之新的使用方法。 解決手段為，作為選自抑制或促進化妝料或機能性食品中的黑色素生成之成分、促進玻尿酸產生成分、促進膠原蛋白產生成分、抑制彈性蛋白酶活性成分、促進抗過敏活性成分、抑制酪胺酸酶活性成分的任一種成分之添加材料，茲使用胎盤萃取物。此外，前述胎盤萃取物係具有以下特徵：由對非水系特定溶媒顯示溶解性的成分群所構成，或由對以水為主成分之水系溶媒顯示溶解性的成分群所構成。

Description

胎盤萃取物之用途
本發明係有關於一種胎盤萃取物之用途。
健康美容係跨越時代備受許多人關注。因此，作為有益健康美容者，迄此已有人提出各種素材。
其中，哺乳類的胎盤(placenta)或其萃取物係作為增進健康與美容此兩項之新穎素材，不分男女備受廣大年齡層的矚目(例如參照專利文獻1)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2006-158214號公報
[發明所欲解決之課題]
諸如上述，胎盤係以維護健康為目的，於健康食品，且為了保持美容而於化妝料領域，主要以萃取物之狀態分別利用，於日常健康或肌膚狀況方面獲得使用者的好評。
然而，迄此所提案之健康食品或化妝料，有摻混胎盤的意義不明而使用的情形。
本發明係有鑑於所述實情而完成者，茲提供胎盤萃取物在更明確目的下之新的使用方法。 [解決課題之手段]
為解決上述習知課題，於本發明中，(1)作為選自抑制或促進化妝料或機能性食品中的黑色素生成之成分、促進玻尿酸產生成分、促進膠原蛋白產生成分、抑制彈性蛋白酶活性成分、促進抗過敏活性成分、抑制酪胺酸酶活性成分的任一種成分之添加材料，茲使用胎盤萃取物。
又，於本發明中，亦具有以下特徵： (2)前述胎盤萃取物係由對非水系特定溶媒顯示溶解性的成分群所構成；該非水系特定溶媒係由選自二甲基亞碸、乙醇、甲醇、己烷的任1種或者任2種以上之混合液所構成。 (3)前述胎盤萃取物係由對以水為主成分之水系溶媒顯示溶解性的成分群所構成。
此外，於本發明中，茲使用(4)下述通式(i)：
Figure 02_image001
表示之膽固醇(Cholesterol)，或下述通式(ii)：
Figure 02_image003
表示之膽固醇-7-酮(Cholesterol-7-one)，或下述通式(iii)：
Figure 02_image005
表示之膽甾-3,5-二烯-7-酮(Cholesta-3,5-diene-7-one)，或下述通式(iv)：
Figure 02_image007
表示之尿苷單磷酸(Uridine Monophosphate)作為以促進化妝料中或機能性食品中的黑色素生成為目的之有效成分或保健機能成分。
又，於本發明中，茲使用(5)下述通式(iv)：
Figure 02_image009
表示之尿苷單磷酸(Uridine Monophosphate)，或下述通式(v)：
Figure 02_image011
表示之3β-羥基膽甾-4-烯-6-酮(3β-hydroxycholest-4-ene-6-one)，或下述通式(vi)：
Figure 02_image013
表示之3β,6β-二羥基膽甾-5-烯(3β,6β-dihydroxycholest-5-ene)，或下述通式(vii)：
Figure 02_image015
表示之油酸膽甾酯(Cholestereyl oleate)，或下述通式(viii)：
Figure 02_image017
表示之棕櫚酸(Palmitic acid)，或下述通式(ix)：
Figure 02_image019
表示之胸腺嘧啶(Thymine)作為以抑制化妝料中或機能性食品中的黑色素生成為目的之有效成分或保健機能成分。 [發明之效果]
根據本發明，由於作為選自抑制或促進化妝料或機能性食品中的黑色素生成之成分、促進玻尿酸產生成分、促進膠原蛋白產生成分、抑制彈性蛋白酶活性成分、促進抗過敏活性成分、抑制酪胺酸酶活性成分的任一種成分之添加材料，係使用胎盤萃取物，而能夠提供一種胎盤萃取物在更明確目的下之新的使用方法。
又，前述胎盤萃取物若由對非水系特定溶媒顯示溶解性的成分群所構成；該非水系特定溶媒係由選自二甲基亞碸、乙醇、甲醇、己烷的任1種或者任2種以上之混合液所構成，則可呈現促進黑色素生成之作用，且比起對水性溶媒顯示溶解性的成分群所含之抑制彈性蛋白酶活性成分，可呈現更顯著的彈性蛋白酶活性抑制作用。
又，前述胎盤萃取物若由對以水為主成分之水系溶媒顯示溶解性的成分群所構成，則可呈現抑制黑色素生成之作用，或比起對非水系特定溶媒顯示溶解性的成分群所含之促進玻尿酸產生成分或促進膠原蛋白產生成分，可呈現更顯著的各作用。
又，若使用下述通式(i)：
Figure 02_image021
表示之膽固醇(Cholesterol)，或下述通式(ii)：
Figure 02_image023
表示之膽固醇-7-酮(Cholesterol-7-one)，或下述通式(iii)：
Figure 02_image025
表示之膽甾-3,5-二烯-7-酮(Cholesta-3,5-diene-7-one)，或下述通式(iv)：
Figure 02_image027
表示之尿苷單磷酸(Uridine Monophosphate)作為以促進化妝料中或機能性食品中的黑色素生成為目的之有效成分或保健機能成分，則可提供藉由上述成分促進黑色素的生成之新的化妝料或機能性食品。
又，若使用下述通式(iv)：
Figure 02_image029
表示之尿苷單磷酸(Uridine Monophosphate)，或下述通式(v)：
Figure 02_image031
表示之3β-羥基膽甾-4-烯-6-酮(3β-hydroxycholest-4-ene-6-one)，或下述通式(vi)：
Figure 02_image033
表示之3β,6β-二羥基膽甾-5-烯(3β,6β-dihydroxycholest-5-ene)，或下述通式(vii)：
Figure 02_image035
表示之油酸膽甾酯(Cholestereyl oleate)，或下述通式(viii)：
Figure 02_image037
表示之棕櫚酸(Palmitic acid)，或下述通式(ix)：
Figure 02_image039
表示之胸腺嘧啶(Thymine)作為以抑制化妝料中或機能性食品中的黑色素生成為目的之有效成分或保健機能成分，則可提供藉由上述成分而抑制黑色素的生成之新的化妝料或機能性食品。
[實施發明之形態]
本發明係有關於一種胎盤萃取物之使用方法，更詳而言之，係提供一種在迄此添加胎盤萃取物的意義未必明確而使用的健康食品或化妝料中，胎盤萃取物在更明確目的下之新的使用方法。
尤其是就本實施形態之用途，其特徵為，作為選自抑制或促進化妝料或機能性食品中的黑色素生成之成分、促進玻尿酸產生成分、促進膠原蛋白產生成分、抑制彈性蛋白酶活性成分、促進抗過敏活性成分、抑制酪胺酸酶活性成分的任一種成分之添加材料，係使用胎盤萃取物。
胎盤萃取物為哺乳類的胎盤(placenta)之萃取物，使用例如溶媒萃取而出時，其萃取液，或萃取液之乾燥物包含於胎盤萃取物。
胎盤萃取物的萃取來源之胎盤不特別限定，可採用以豬、馬、人類為主之各種哺乳類的胎盤。
化妝料除所謂的上妝化妝品外，亦包含基礎化妝品、護髮素、香水、牙膏、洗髮精、潤絲精或用於清洗身體等之香皂或清潔品、入浴劑等化妝用品，且包含宣稱有預防效果等的藥用化妝品。
又，上妝化妝品可舉出粉底、眉筆(眉粉)、睫毛膏、眼影、眼線、口紅、光澤劑、腮紅(cheek)、白粉或指甲油等；基礎化妝品可舉出例如化妝水、乳液、洗面乳、潔面劑、美容液或乳霜等。
另外，機能性食品係不包含醫藥品成分且包含咸認有助於維持增進健康的所有食品之概念，例如除營養輔助食品或健康輔助食品、營養調整食品外，亦包含所謂的營養補充品等一般食品、特定保健用食品或營養機能食品、如機能性標示食品之保健機能食品。
此外，針對上述化妝料或機能性食品之說明係供理解本發明而列舉相當於此等物品等之一例者，各詞語的解讀非限定於此等所列舉之物品等。惟，本案申請人將本案權利化時，不妨礙將本發明限定於此等物品等。
且於本實施形態中，係使用胎盤萃取物作為選自抑制或促進黑色素生成之成分、促進玻尿酸產生成分、促進膠原蛋白產生成分、抑制彈性蛋白酶活性成分、促進抗過敏活性成分、抑制酪胺酸酶活性成分的任一種成分之添加材料。
此處所稱作為添加材料之用途，除意指為了使其含有上述各成分而將胎盤萃取物添加於化妝料或機能性食品外，亦包含將胎盤萃取物作為上述各成分之萃取材料使用。若為後者時，萃取出之各成分便添加於化妝料或機能性食品中。
胎盤萃取物之用途係以為抑制或促進選自黑色素生成之成分、促進玻尿酸產生成分、促進膠原蛋白產生成分、抑制彈性蛋白酶活性成分、促進抗過敏活性成分、抑制酪胺酸酶活性成分的任一種成分之添加材料為目的。
針對此等各成分進一步詳細敘述，根據本案發明人等致力研究而闡明，胎盤萃取物本身可發揮作為此等成分之機能。惟構成胎盤萃取物的所有成分無需發揮相同機能，實質上可藉由胎盤萃取物所含之部分單一物質而發揮作用，又亦可藉由多種物質而發揮作用。
抑制或促進黑色素生成之成分只要以化妝料之樣態採外用式，及/或以機能性食品之樣態採口服式(下稱外用/口服使用樣態)使用而抑制或促進皮膚中的黑色素的生成即可。此種成分能以後述之黑色素生成試驗進行確認。
促進玻尿酸產生成分或促進膠原蛋白產生成分只要能以外用/口服使用樣態之用途而促進玻尿酸或膠原蛋白的產生即可，能以例如後述之產生膠原蛋白、玻尿酸之試驗進行確認。
抑制彈性蛋白酶活性成分只要能以外用/口服使用樣態之用途抑制彈性蛋白酶的活性而進行彈性蛋白的分解即可，能以例如後述之抑制彈性蛋白酶活性試驗進行確認。
促進抗過敏活性成分只要能以外用/口服使用樣態之用途抑制過敏症狀即可，可如例如後述之抗過敏活性試驗藉由測定β-己醣胺酶活性來進行確認。
抑制酪胺酸酶活性成分只要能以外用/口服使用樣態之用途抑制酪胺酸酶的活性而防止黑色素的沉積即可，能以例如後述之抑制酪胺酸酶活性試驗進行確認。
且胎盤萃取物可為由對非水系特定溶媒顯示溶解性的成分群所構成；該非水系特定溶媒係由選自二甲基亞碸、乙醇、甲醇、己烷的任1種或者任2種以上之混合液所構成。
亦即，胎盤萃取物可為由非水系特定溶媒萃取而出之萃取物。
而且，透過使用由對非水系特定溶媒顯示溶解性的成分群所構成的胎盤萃取物作為前述之各成分，可呈現促進黑色素生成之作用，且比起對水性溶媒顯示溶解性的成分群所含之彈性蛋白酶活性抑制成分，可呈現更顯著的彈性蛋白酶活性抑制作用。
且胎盤萃取物可為由對以水為主成分之水系溶媒顯示溶解性的成分群所構成。換言之，胎盤萃取物可為由水系溶媒萃取而出的萃取物。
於此，水系溶媒係以水為主成分之溶媒，除水本身外，尚含有例如以50w/w%以上之比例含有水的溶媒。作為構成水系溶媒之水以外的成分，可為例如對水顯示溶解性的固體(粉末等)成分，或如醇類之與水顯示混和性的液體。
如此，透過使用由對水系溶媒顯示溶解性的成分群所構成的胎盤萃取物作為前述各成分，可呈現抑制黑色素生成之作用，或比對非水系特定溶媒顯示溶解性的成分群所含之促進玻尿酸產生成分或促進膠原蛋白產生成分更顯著的各作用。
且溶媒可採水系溶媒與非水系特定溶媒的混合溶媒。亦即，透過採用以未達50w/w%的比例含有水，且其餘部分為非水系特定溶媒、或對調製之混合溶媒顯示溶解性的固體(粉末等)之混合溶媒，可調製具備與上述之胎盤萃取物不同組成比例的胎盤萃取物。
且本案亦提供一種本案發明人由胎盤萃取物發現出之成分之以促進黑色素生成為目的之作為化妝料中的有效成分或機能性食品中的保健機能成分之使用方法。
具體而言，係一種下述通式(i)：
Figure 02_image041
表示之膽固醇(Cholesterol)，或下述通式(ii)：
Figure 02_image043
表示之膽固醇-7-酮(Cholesterol-7-one)，或下述通式(iii)：
Figure 02_image045
表示之膽甾-3,5-二烯-7-酮(Cholesta-3,5-diene-7-one)，或下述通式(iv)：
Figure 02_image047
表示之尿苷單磷酸(Uridine Monophosphate)之以促進黑色素生成為目的之用途，茲針對此等(i)~(iv)所示物質之黑色素的生成促進能力，進一步顯示數據加以說明。
且本案係一種下述通式(iv)：
Figure 02_image049
表示之尿苷單磷酸(Uridine Monophosphate)，或下述通式(v)：
Figure 02_image051
表示之3β-羥基膽甾-4-烯-6-酮(3β-hydroxycholest-4-ene-6-one)，或下述通式(vi)：
Figure 02_image053
表示之3β,6β-二羥基膽甾-5-烯(3β,6β-dihydroxycholest-5-ene)，或下述通式(vii)：
Figure 02_image055
表示之油酸膽甾酯(Cholestereyl oleate)，或下述通式(viii)：
Figure 02_image057
表示之棕櫚酸(Palmitic acid)，或下述通式(ix)：
Figure 02_image059
表示之胸腺嘧啶(Thymine)之以抑制黑色素生成為目的之用途，茲針對此等(iv)~(ix)所示物質之黑色素的生成抑制能力，隨後顯示數據加以說明。
而且，若使用此等(i)~(ix)之成分作為化妝料中或機能性食品中以促進黑色素生成或抑制其生成為目的之有效成分或保健機能成分使用，則可藉由上述成分而提供可促進或抑制黑色素生成之新的化妝料或機能性食品。
以下針對本實施形態之各使用方法，邊參照實驗結果邊進一步進行說明。此外，以下針對採用萃取自源於馬之胎盤(placenta)的胎盤萃取物(下稱馬胎盤萃取物)之實例加以說明，惟胎盤的來源非限定於馬。
[1.胎盤萃取物的調製] 近年來作為摻混於化妝料或機能性食品的機能性素材，常使用各種天然成分。其中，哺乳類的胎盤之胎盤係屬有益於維持美容或健康的素材而備受矚目。
然而，如前所述，現況在於針對胎盤或其萃取物所具有的機能性進行科學研究的案例仍偏少。因此，此處係以馬胎盤作為代表例，為了實施數個機能性評估試驗而確認有效性，首先係進行胎盤萃取物的調製。
作為馬胎盤萃取物之萃取原料，係使用馬胎盤粉末。馬胎盤粉末為馬胎盤的冷凍乾燥粉末。
首先，於1.5ml微量離心管中量取100mg的馬胎盤粉末，添加1ml的萃取溶媒，於室溫下進行攪拌30分鐘。就萃取溶媒，水系溶媒係使用滅菌超純水，非水系特定溶媒則使用二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide：下稱DMSO)。
攪拌後，將微量離心管靜置於室溫下，以所得上清液作為馬胎盤萃取物。此外，此馬胎盤萃取物係源於對100mg的胎盤粉末添加1ml的萃取溶媒所調製者，係稱100mg/ml試樣。又，於以下各試驗中，關於將100mg/ml試樣適宜稀釋所調製而成的稀釋試樣，若為例如稀釋100倍之試樣係表現為1mg/ml試樣，若為稀釋10000倍之試樣則表現為10μg/ml試樣。
[2.黑色素生成暨抑制能力確認試驗(第1試驗)] 黑色素係酚類物質經高分子化而形成色素之物質的總稱。存在於人體皮膚之黑色素係呈現合成自酪胺酸之各種吲哚化合物形成聚合物的形態。
黑色素最重要的作用係防禦紫外線，抑制紫外線所致之日光病或惡性腫瘤的發生。作為黑色素的其他機能，週知有吸收對生物體有害的活性氧物種、載入金屬或藥劑等。
含黑色素之細胞會緩緩地於角質上層進行異同化，藉由脂質代謝酵素(脂酶等)或蛋白質分解酵素(彈性蛋白酶等)的作用使細胞間的黏著被分解，最終角質即剝離、脫落。
於本試驗中，係以人類黑色素瘤細胞(G361細胞株)為模型細胞，共同培養細胞與試樣，並測定培養液中所生成的黑色素與細胞生存率。
作為細胞培養之方法，人類黑色素瘤細胞(G361細胞株)係使用McCoy's 5A medium(含1%青黴素-鏈黴素及10%胎牛血清(FBS))進行前培養。
其後，對24孔孔盤以1.0×10 5cells/ml的濃度播種0.5ml，於CO 2恆溫箱(37℃、5% CO 2)中進行隔夜培養。
隔夜後，去除培養基，添加0.5ml之新的培養基與稀釋成既定濃度之2.5μl的胎盤萃取物之各試樣(下稱各稀釋試樣)，再度於CO 2恆溫箱中進行72小時培養。
此外，黑色素生成暨抑制能力的確認係藉由確認產生的黑色素量來進行。具體而言，係由經72小時培養的孔盤中去除培養基，將各井孔以PBS(Phosphate Buffered Saline; 磷酸緩衝食鹽水)洗淨後對各井孔添加1ml的1M NaOH溶液，於室溫下使其反應4小時，並以微盤分析儀測定405nm下的吸光度而作為黑色素產生量。
又，細胞生存率的測定係藉由MTT法來進行。由經72小時培養的孔盤中去除培養基，對各井孔添加1ml之新的培養基。其次，對各井孔添加200μl的MTT染色液(5mg/ml in PBS)，於CO 2恆溫箱中靜置培養達4小時。
然後，去除培養基，對各井孔各添加1ml的鹽酸-異丙醇溶液，藉由吸量管吸放使甲䐶完全溶解，並以微盤分析儀測定570nm下的吸光度而進行細胞生存率的算出。
圖1為表示相對於控制組之黑色素產生比的圖表，圖1(a)表示以水系溶媒萃取而出之胎盤萃取物(下稱胎盤水系萃取物)的黑色素產生比；圖1(b)表示以非水系特定溶媒萃取而出之胎盤萃取物(下稱胎盤非水系萃取物)的黑色素產生比。
如圖1(a)所示，關於胎盤水系萃取物，針對400μg/ml試樣、100μg/ml試樣、10μg/ml試樣進行確認，結果在探討的所有濃度下可看出約20%左右的抑制黑色素生成之效果。
由此，研判胎盤水系萃取物中存有抑制黑色素生成之成分，即有益於肌膚美白的成分。
且相對於此，關於胎盤非水系萃取物，針對各稀釋試樣進行確認，結果如圖1(b)所示，在探討的所有濃度下可看出約20~40%左右的促進黑色素生成之效果。
由此，研判胎盤非水系萃取物中含有促進黑色素生成之成分，而具有維持毛髮之黑色等效果。
又，根據針對此等水系、非水系胎盤萃取物之結果，顯然胎盤水系萃取物與胎盤非水系萃取物，在黑色素的產生上分別具有「抑制」與「促進」之恰好相反的性質，如此可謂確實耐人尋味。
[3.膠原蛋白暨玻尿酸產生試驗] 膠原蛋白係形成動物的皮膚等結締組織之結構蛋白質。膠原蛋白的重要性在於有益於維持皮膚的構造，使皮膚保持幼嫩，不產生皺紋。
膠原蛋白係由存在於皮膚的真皮之纖維母細胞所產生，只要可促進纖維母細胞之膠原蛋白的產生，則可維持幼嫩的皮膚。因此，促進纖維母細胞的膠原蛋白產生之成分研判有用於作為抗老化之化妝品素材。
且玻尿酸係主要由皮膚真皮的主要細胞之纖維母細胞或其他結締組織的細胞所產生。作為細胞外基質之主成分，參與各種細胞間的相互作用。此外，其以高濃度存在於滑液中，擔負關節之正常的水分保持與潤滑。
於本試驗中，係測定本實施形態之胎盤萃取物添加至纖維母細胞培養體系所得之膠原蛋白或玻尿酸的產生能力，來進行胎盤萃取物中與肌膚水分保持效果有關的評估。 就本試驗方法，作為模型細胞係使用成人皮膚纖維母細胞(NHDF-Ad)。 對微井孔孔盤各播種1.0×10 4cells/well，於CO 2恆溫箱(37℃、5% CO 2)中進行前培養達24小時。
前培養後，去除培養基，添加新的培養基與稀釋成既定濃度的各稀釋試樣，再度於CO 2恆溫箱中進行72小時培養，並使用市售ELISA套組測定培養液中所產生的膠原蛋白量與玻尿酸量。同樣地，使用同樣細胞進行MTT試驗。
圖2為表示相對於控制組之玻尿酸產生比的圖表，圖2(a)表示胎盤水系萃取物的玻尿酸產生比；圖2(b)表示胎盤非水系萃取物的玻尿酸產生比。
如圖2(a)所示，藉由添加胎盤水系萃取物，可看出玻尿酸產生上升。由此示意胎盤水系萃取物中含有促進玻尿酸產生的成分。
相對於此，關於胎盤非水系萃取物，針對各稀釋試樣進行確認，如圖2(b)所示，在探討的任一種濃度下，均未看出玻尿酸產生上升。亦即，研判胎盤非水系萃取物不具有促進玻尿酸產生之效果。
圖3為表示相對於控制組之膠原蛋白產生比的圖表，圖3(a)表示胎盤水系萃取物的膠原蛋白產生比，圖3(b)表示胎盤非水系萃取物的膠原蛋白產生比。
如圖3(a)所示，就胎盤水系萃取物，可看出顯著的膠原蛋白產生上升。又，就胎盤非水系萃取物，亦可看出添加100μg/ml試樣所致之膠原蛋白產生的上升。
由此示意水系、非水系胎盤萃取物之任一者，均含有促進膠原蛋白產生的成分。
且根據本試驗結果，示意胎盤水系萃取物中含有促進玻尿酸及膠原蛋白產生的成分，且胎盤非水系萃取物中含有促進膠原蛋白產生的成分。
[4.彈性蛋白酶活性抑制試驗] 存在於真皮之膠原蛋白-彈性蛋白的交聯結構係發揮保持肌膚彈性的重要作用。屬彈性蛋白分解酵素之彈性蛋白酶由紫外線等所造成的刺激誘導而使彈性蛋白被分解時，交聯結構會脆化而喪失肌膚彈性。於本試驗中，係藉由測定彈性蛋白酶抑制活性，來評估胎盤萃取物所具有的肌膚彈力保持機能。
於本試驗中，係將細胞溶解液用於實驗。細胞溶解液的調製係首先將經前培養至滿盤的人類皮膚纖維母細胞(NHDF-Ad)以PBS洗淨，予以再懸浮於細胞溶解液中成為1.0×10 6cells/ml。其後，進行超音波處理，以4℃、13,000rpm進行15分鐘離心，回收上清液作為細胞溶解液。
其次，對如此調製之細胞溶解液12.5μl混合35.5μl的0.2M三羥甲基胺基甲烷鹽酸緩衝液(pH8.0)與2μl的各稀釋試樣，於37℃培養15分鐘。其後，添加作為彈性蛋白酶之基質之50μl的5mM N-琥珀醯基-Ala-Ala-Ala-p-硝基苯胺化物(N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide)，於37℃培養3小時。然後，以微盤分析儀測定405nm下的吸光度，算出彈性蛋白酶活性。此外，作為正控制組，係使用屬彈性蛋白酶抑制劑之磷酸阿米酮(最終濃度0.04mM)。
圖4為表示相對於控制組之彈性蛋白酶活性比的圖表，圖4(a)表示胎盤水系萃取物的彈性蛋白酶活性比；圖4(b)表示胎盤非水系萃取物的彈性蛋白酶活性比。
如圖4(a)所示，就胎盤水系萃取物，1600μg/ml試樣與400μg/ml試樣，可看出約30%左右的彈性蛋白酶活性降低。然而，40μg/ml試樣則未看出彈性蛋白酶活性降低。
相對於此，就胎盤非水系萃取物，如圖4(b)所示，400μg/ml試樣可看出約20%、1600μg/ml試樣則可看出高達約60%的彈性蛋白酶活性降低。
由此示意水系、非水系胎盤萃取物含有抑制彈性蛋白酶活性的成分。
尤其是就胎盤水系萃取物，根據約100μg/ml以上的濃度，若基於圖4(a)所示結果則為400μg/ml以上的濃度之用途，且就胎盤非水系萃取物，根據40μg/ml以上的濃度，更有效則為400μg/ml以上的濃度之用途，可望能有助於以胎盤萃取物作為抑制彈性蛋白酶活性之有效成分之肌膚彈力的保持。
[5.抗過敏活性評估試驗] 常反覆發炎之花粉症或異位性皮膚炎等過敏的發病機制仍舊不明，咸認原因之一在於各種的免疫機構當中嗜鹼性球釋放出顆粒所致。
因此，於本試驗中，作為嗜鹼性球之模型細胞係使用大鼠嗜鹼性球白血病細胞(RBL-2H3)，來進行胎盤萃取物之抑制顆粒釋放活性(抗過敏活性)的評估。顆粒中含有β-己醣胺酶(β-hexosaminidase)，藉由測定細胞上清液中的酵素量來測定顆粒的釋放量，且酵素量係根據細胞上清液之酵素活性的強度而測得。
具體而言，係將大鼠嗜鹼性球白血病細胞(RBL-2H3)調製成5×10 5cells/ml的濃度，以100μl播種於96孔孔盤中。將此種孔盤製成β-己醣胺酶活性測定用與MTT試驗用此2者，於CO 2恆溫箱(37℃、5% CO 2)中進行前培養達40小時。
前培養後，去除培養基並以Tyrode’s buffer將井孔洗淨，將含有0.5μl之各稀釋試樣的100μl的Turode’s buffer(或EMEM培養基)添加於各井孔中。以37℃、5%CO 2培養1小時後，β-己醣胺酶活性測定用之孔盤係棄除上清液並將井孔洗淨，添加100μl的A23187(in Tyrode’s buffer)。於恆溫箱中培養1小時後，自各井孔的上清液中分取50μl，移至新的96孔孔盤中。
β-己醣胺酶活性的測定係對各以50μl分取上清液之新的孔盤的各井孔添加作為基質之50μl的p-硝基苯基-N-乙醯基-β-葡萄胺糖苷(p-Nitrophenyl-N-acetyl-beta-glucosaminide)溶液，用鋁箔遮光後於室溫下使其反應1~3小時。反應後，對所有井孔添加100μl的反應停止液使酵素反應停止，以微孔分析儀測定405nm的吸光度，而測定β-己醣胺酶活性。
另MTT試驗係針對添加各稀釋試樣且經過1小時的孔盤，首先移除各井孔的培養基，各添加100μl的MTT染色液(5mg/ml in medium)，以5%CO 2、37℃靜置培養4小時。其次，去除培養基，對各井孔各添加1ml的鹽酸-異丙醇溶液並遮光，於室溫下放置4小時。其後，以微盤分析儀測定570nm下的吸光度，作為細胞生存率之指標。
圖5為表示相對於控制組之β-己醣胺酶活性比的圖表。由圖5可知，就水系、非水系胎盤萃取物任一者，在添加屬高濃度區的400μg/ml試樣時，β-己醣胺酶活性減少。
由此示意本實施形態之胎盤萃取物中含有顯示抗過敏活性的成分。
[6.酪胺酸酶抑制活性試驗] 造成肌膚上斑點或雀斑的黑色素色素係由所稱黑色素細胞內之酪胺酸酶的酵素之作用所形成。已知酪胺酸酶會被紫外線活化而產生黑色素，但藉由抑制此酵素的作用可防止黑色素的沉積，而獲得美白效果。
於本試驗中，係以L-酪胺酸或者L-DOPA作為基質，來評估各稀釋試樣對酪胺酸酶活性所造成的影響。
作為試驗方法，係將33.3μl的各稀釋試樣、333μl的2.5mM基質(L-酪胺酸或L-DOPA)、600μl的0.1M磷酸緩衝液(pH6.8)與33μl的酪胺酸酶(1380unit/ml)混合，隨後立即藉由分光光度計記錄475nm下的吸光度的歷時變化。475nm的吸光度咸認係由酵素-基質反應後形成多巴色素所產生，藉由算出每小時之吸光度的增加而作為酵素活性值(L-酪胺酸：測定10分鐘、L-DOPA：測定3分鐘)。將添加控制組(溶媒)時的酪胺酸酶活性值作為100%，算出添加各稀釋試樣時的相對酪胺酸酶活性。作為正控制組，係使用麴酸(最終濃度：17μg/ml)。
圖6(a)為表示以L-DOPA為基質之酪胺酸酶活性率之水系或非水系胎盤萃取物的影響的圖表，圖6(b)為以L-酪胺酸為基質之酪胺酸酶活性率之水系或非水系胎盤萃取物的影響的圖表。
如圖6(a)所示，將添加控制組(溶媒)時的酪胺酸酶活性值(基質：L-DOPA)設為100算出相對值的結果，就水系或非水系之任一種胎盤萃取物，均隨濃度變化而看出酪胺酸酶活性率的減少，藉由添加最終濃度3.3mg/ml的水系或非水系胎盤萃取物，酪胺酸酶活性顯著降低。
且如圖6(b)所示，將添加控制組(溶媒)時的酪胺酸酶活性值(基質：L-酪胺酸)設為100算出相對值的結果，就胎盤非水系萃取物(最終濃度3.3mg/ml)，可看出顯著的酪胺酸酶活性率減少。就胎盤水系萃取物，可看出探討濃度下之酪胺酸酶活性率的降低。
由此等結果示意本實施形態之水系或非水系胎盤萃取物中含有顯示酪胺酸酶抑制活性的成分；且此效果在胎盤非水系萃取物中有更顯著的傾向。
[7.黑色素生成暨抑制能力確認試驗(第2試驗)] 其次，就黑色素生成暨抑制能力確認試驗之第2試驗加以說明。於先前說明之[2.黑色素生成暨抑制能力確認試驗(第1試驗)]中，已針對胎盤水系萃取物與胎盤非水系萃取物進行所產生之黑色素量的確認；而於本第2試驗中，係著眼於胎盤非水系萃取物，由本案發明人等針對由該萃取物分離鑑定之各成分各者進行黑色素生成暨抑制能力的確認。
本案發明人等由胎盤非水系萃取物分離之各成分如下。
依本案發明人之分離鑑定作業上，暫定命名為HS-1之通式(i)：
Figure 02_image061
表示之膽固醇(Cholesterol)。
同樣暫定命名為HS-2之通式(ii)：
Figure 02_image063
表示之膽固醇-7-酮(Cholesterol-7-one)。
暫定命名為HS-3之下述通式(v)：
Figure 02_image065
表示之3β-羥基膽甾-4-烯-6-酮(3β-hydroxycholest-4-ene-6-one)。
暫定命名為HS-4之通式(x)：
Figure 02_image067
表示之5α,6α-環氧膽甾烷-3β-醇(5α,6α-epoxycholestan-3β-ol)。
暫定命名為HS-6之下述通式(vi)：
Figure 02_image069
表示之3β,6β-二羥基膽甾-5-烯(3β,6β-dihydroxycholest-5-ene)。
暫定命名為HS-7之通式(iii)：
Figure 02_image071
表示之膽甾-3,5-二烯-7-酮(Cholesta-3,5-diene-7-one)。
暫定命名為HS-8之通式(vii)：
Figure 02_image073
表示之油酸膽甾酯(Cholestereyl oleate)。
暫定命名為HS-10之通式(viii)：
Figure 02_image075
表示之棕櫚酸(Palmitic acid)。
暫定命名為HAS-1之通式(xi)：
Figure 02_image077
表示之尿苷(Uridine)。
暫定命名為HAS-2之下述通式(iv)：
Figure 02_image079
表示之尿苷單磷酸(Uridine Monophosphate)。
暫定命名為HSE-2之下述通式(ix)：
Figure 02_image081
表示之胸腺嘧啶(Thymine)。
針對此11種各分離成分HS-1、HS-2、HS-3、HS-4、HS-6、HS-7、HS-8、HS-10、HAS-1、HAS-2、HSE-2進行黑色素生成暨抑制能力的確認。
試驗方法係與前述第1試驗相同，惟添加之試樣非為胎盤萃取物，而是將此等各成分各自以最終濃度成為100μM的方式溶解於二甲基亞碸溶液後，再添加於培養液中。
圖7(a)為表示各試樣之細胞生存率的圖表；圖7(b)為表示每個細胞相對於控制組之細胞外黑色素產生比、圖7(c)為表示每個細胞相對於控制組之細胞內黑色素產生比的圖表。且表1表示加入細胞生存率之每個細胞之細胞外・細胞內黑色素產生比的表。此外，表1中所示"type"中，「A +」表示相對於控制組，黑色素產生量以超過20%的比例增大；「A -」表示相對於控制組為20%以下之比例，但黑色素產生量增大；「B ++」表示黑色素產生量與熊果素(100 µM)同等程度地減少；「B +」表示相對於控制組，黑色素產生量以超過20%的比例減少；「B -」表示相對於控制組為20%以下之比例，但黑色素產生量減少。
Figure 02_image083
首先探討圖7(a)之細胞生存率，HS-1(膽固醇)、HS-2(膽固醇-7-酮)及HS-4(5α,6α-環氧膽甾烷-3β-醇)，與控制組(DMSO)相比，細胞生存率急遽減少(HS-1：55.7 %、HS-2：36.5 %、HS-4：28.6 %)。又，HAS-2(尿苷單磷酸)與控制組(DMSO)相比，細胞生存率亦顯著減少(HAS-2：79.8 %)。
另一方面，確認HS-3(3β-羥基膽甾-4-烯-6-酮)、HS-7(膽甾-3,5-二烯-7-酮)、HS-10(棕櫚酸)及HSE-2(胸腺嘧啶)與控制組(DMSO)相比，細胞生存率顯著上升(HS-3：109.4 %、HS-7：113.3 %、HS-10：110.3 %、HSE-2：114.3 %)。根據此等結果，可確認HS-3、HS-6、HS-7、HS-8、HS-10、HSE-2及HAS-1對於B16黑色素瘤細胞未顯示細胞毒性。
又，根據圖7(b)，添加HS-3、HS-4、HS-6、HS-8、HS-10、HSE-2、HAS-1及HAS-2時，每個細胞的細胞外黑色素產生比與控制組(DMSO)相比有所抑制。尤以HS-3、HS-6、HSE-2及HAS-2，可確認與正控制組之熊果素(100 µM)同等地抑制細胞外黑色素的產生。另一方面，添加HS-1、HS-2及HS-7時，與控制組(DMSO)相比，每個細胞的細胞外黑色素產生比上升。
又，根據圖7(c)，藉由添加HS-3、HS-4、HS-8、HS-10、HSE-2及HAS-1，每個細胞的細胞內黑色素產生比與控制組(DMSO)相比有所抑制。另一方面，添加HS-1、HS-2、HS-6、HS-7及HAS-2時，與控制組(DMSO)相比每個細胞的細胞外黑色素產生比上升。
進而，邊參照表1邊按各成分進行研究，首先就HS-1(膽固醇)，於細胞內及細胞外此兩者，可看出相對於控制組有超過20%之黑色素產生量的增大。
且HS-2(膽固醇-7-酮)於細胞外可看出相對於控制組有超過20%之黑色素產生量的增大。又，於細胞內，相對於控制組雖為20%以下，但可看出黑色素產生量的增大。
就HS-3(3β-羥基膽甾-4-烯-6-酮)，於細胞內及細胞外此兩者，可看出黑色素產生量相對於控制組以超過20%的比例減少。尤其是於細胞外，可看出與熊果素(100 µM)同等程度之黑色素產生量的減少。
就HS-4(5α,6α-環氧膽甾烷-3β-醇)，於細胞內及細胞外此兩者，相對於控制組雖為20%以下的比例，但可看出黑色素產生量的減少。
就HS-6(3β,6β-二羥基膽甾-5-烯)，於細胞外可看出相對於控制組，黑色素產生量以超過20%的比例，尤為與熊果素(100 µM)同等程度地減少；而於細胞內，反之，相對於控制組雖為20%以下的比例，但可看出黑色素產生量的增大。
HS-7(膽甾-3,5-二烯-7-酮)，於細胞內及細胞外此兩者，相對於控制組可看出超過20%之黑色素產生量的增大。
就HS-8(油酸膽甾酯)，於細胞外相對於控制組雖為20%以下的比例，但可看出黑色素產生量的減少；又，於細胞內，可看出相對於控制組，黑色素產生量以超過20%的比例減少。
就HS-10(棕櫚酸)，於細胞內及細胞外此兩者，可看出相對於控制組，黑色素產生量以超過20%的比例減少。
就HSE-2(胸腺嘧啶)，於細胞內及細胞外此兩者，可看出相對於控制組，黑色素產生量以超過20%的比例減少。尤其是在細胞外，可看出黑色素產生量與熊果素(100 µM)同等程度地減少。
就HAS-1(尿苷)，於細胞內及細胞外此兩者，於細胞內及細胞外此兩者，相對於控制組雖為20%以下的比例，但可看出黑色素產生量的減少。
就HAS-2(尿苷單磷酸)，於細胞外可看出相對於控制組，黑色素產生量以超過20%的比例，尤為與熊果素(100 µM)同等程度地減少；而於細胞內，反之，可看出相對於控制組，黑色素產生量以超過20%的比例增大。
而且，綜合考察此等結果，膽固醇(HS-1)、膽固醇-7-酮(HS-2)、3β,6β-二羥基膽甾-5-烯(HS-6)、膽甾-3,5-二烯-7-酮(HS-7)、尿苷單磷酸(HAS-2)之各成分，與控制組(DMSO)相比顯示促進黑色素的生成。更詳而言之，膽固醇(HS-1)、膽固醇-7-酮(HS-2)、膽甾-3,5-二烯-7-酮(HS-7)之各成分，於細胞內及細胞外此兩者，且3β,6β-二羥基膽甾-5-烯(HS-6)、尿苷單磷酸(HAS-2)之各成分於細胞內顯示促進黑色素的生成。由此可謂，於化妝料或機能性食品中，此等成分有用於作為以促進黑色素的生成為目的之有效成分或保健機能成分。
且同樣地，3β-羥基膽甾-4-烯-6-酮(HS-3)、5α,6α-環氧膽甾烷-3β-醇(HS-4)、3β,6β-二羥基膽甾-5-烯(HS-6)、油酸膽甾酯(HS-8)、棕櫚酸(HS-10)、胸腺嘧啶(HSE-2)、尿苷(HAS-1)、尿苷單磷酸(HAS-2)顯示抑制黑色素的生成。更詳而言之，3β-羥基膽甾-4-烯-6-酮(HS-3)、5α,6α-環氧膽甾烷-3β-醇(HS-4)、油酸膽甾酯(HS-8)、棕櫚酸(HS-10)、胸腺嘧啶(HSE-2)、尿苷(HAS-1)之各成分於細胞內及細胞外此兩者可抑制黑色素的生成，其中HS-3、HS-8、HS-10、HSE-2、HAS-1可顯著抑制細胞外黑色素的生成，且3β,6β-二羥基膽甾-5-烯(HS-6)、尿苷單磷酸(HAS-2)之各成分於細胞外顯示抑制黑色素的生成。由此可謂，表示於化妝料或機能性食品中，此等成分係有用於作為抑制黑色素的生成，以及以美白為目的之有效成分或保健機能成分。
且耐人尋味的是，3β,6β-二羥基膽甾-5-烯(HS-6)或尿苷單磷酸(HAS-2)雖可促進細胞內之黑色素的生成，但可與熊果素(100 µM)同等程度地抑制細胞外之黑色素的生成。由此，可望獲致作為例如對於細胞內，抗紫外線而達到黑色素所產生的防護，並抑制細胞外的黑色素分泌而抑制過度的色素沉積等之化妝料或機能性食品，甚而醫藥品等之製劑的效果。
諸如上述，根據本實施形態之發明，由於作為選自抑制或促進化妝料或機能性食品中的黑色素生成之成分、促進玻尿酸產生成分、促進膠原蛋白產生成分、抑制彈性蛋白酶活性成分、促進抗過敏活性成分、抑制酪胺酸酶活性成分的任一種成分之添加材料，係使用胎盤萃取物，而能夠提供一種胎盤萃取物在更明確目的下之新的使用方法。
最終，上述各實施形態之說明僅為本發明之一例，本發明非限定於上述實施形態。因此，縱為上述各實施形態以外者，只要是不悖離本發明技術思想之範圍，理應可依據設計等而實施種種變更。
[圖1]為表示黑色素生成暨抑制能力確認試驗(第1試驗)之試驗結果的說明圖。 [圖2]為表示玻尿酸產生試驗之試驗結果的說明圖。 [圖3]為表示膠原蛋白產生試驗之試驗結果的說明圖。 [圖4]為表示彈性蛋白酶活性抑制試驗之試驗結果的說明圖。 [圖5]為表示抗過敏活性評估試驗之試驗結果的說明圖。 [圖6]為表示酪胺酸酶抑制活性試驗之試驗結果的說明圖。 [圖7]為表示黑色素生成暨抑制能力確認試驗(第2試驗)之試驗結果的說明圖。

Claims (5)

  1. 一種胎盤萃取物之用途，其係作為選自抑制或促進化妝料或機能性食品中的黑色素生成之成分、促進玻尿酸產生成分、促進膠原蛋白產生成分、抑制彈性蛋白酶活性成分、促進抗過敏活性成分、抑制酪胺酸酶活性成分的任一種成分之添加材料。
  2. 如請求項1之胎盤萃取物之用途，其中前述胎盤萃取物係由對非水系特定溶媒顯示溶解性的成分群所構成；該非水系特定溶媒係由選自二甲基亞碸、乙醇、甲醇、己烷的任1種或者任2種以上之混合液所構成。
  3. 如請求項1之胎盤萃取物之用途，其中前述胎盤萃取物係由對以水為主成分之水系溶媒顯示溶解性的成分群所構成。
  4. 一種下述通式(i)：
    Figure 03_image001
    表示之膽固醇(Cholesterol)，或下述通式(ii)：
    Figure 03_image003
    表示之膽固醇-7-酮(Cholesterol-7-one)，或下述通式(iii)：
    Figure 03_image005
    表示之膽甾-3,5-二烯-7-酮(Cholesta-3,5-diene-7-one)，或下述通式(iv)：
    Figure 03_image007
    表示之尿苷單磷酸(Uridine Monophosphate)之以促進化妝料中或機能性食品中的黑色素生成為目的之作為有效成分或保健機能成分之用途。
  5. 一種下述通式(iv)：
    Figure 03_image009
    表示之尿苷單磷酸(Uridine Monophosphate)，或下述通式(v)：
    Figure 03_image011
    表示之3β-羥基膽甾-4-烯-6-酮(3β-hydroxycholest-4-ene-6-one)，或下述通式(vi)：
    Figure 03_image013
    表示之3β,6β-二羥基膽甾-5-烯(3β,6β-dihydroxycholest-5-ene)，或下述通式(vii)：
    Figure 03_image015
    表示之油酸膽甾酯(Cholestereyl oleate)，或下述通式(viii)：
    Figure 03_image017
    表示之棕櫚酸(Palmitic acid)，或下述通式(ix)：
    Figure 03_image019
    表示之胸腺嘧啶(Thymine)之以抑制化妝料中或機能性食品中的黑色素生成為目的之作為有效成分或保健機能成分之用途。
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