TW202221114A - 經細胞介白素預刺激之人類臍帶間質幹細胞於治療類風濕性關節炎之組成及用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種用於治療類風濕性關節炎之醫藥組成物及方法，特徵在於包含一經細胞介白素 (Interleukins, ILs)，包括介白素-1β (IL-1β)，預刺激的人類臍帶間質幹細胞 (Human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)。本發明之經IL預刺激的人類臍帶間質幹細胞可誘導類風濕關節炎成纖維母細胞樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes-rheumatoid arthritis, HFLS-RA)之細胞凋亡，並藉以改善發炎腫脹及軟骨侵蝕情形等症狀，對於類風濕性關節炎有治療效果。

Description

經細胞介白素預刺激之人類臍帶間質幹細胞於治療類風濕性關節炎之組成及用途
本發明係關於一種利用經過細胞介白素 (Interleukin)預刺激所產生的人類臍帶間質幹細胞治療類風濕性關節炎之醫藥組成物及方法。更特別地，係關於一種包含一經介白素-1β (IL-1β)預刺激的人類臍帶間質幹細胞之醫藥組成物用於治療類風濕性關節炎的用途。
類風濕性關節炎(RA)屬於一種自體免疫疾病，以其關節中的滑膜增生及淋巴球的聚集而逐步導致關節及關節周邊結構受損。滑膜存在兩種型態的細胞，分別是具主導性的纖維母細胞樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte)以及巨噬細胞樣滑膜細胞(macrophage-like synoviocyte)。滑膜內層過度增生的現象主要是因纖維母細胞樣滑膜細胞的增生且侵蝕組織並且形成血管翳，同時伴隨著淋巴球及巨噬細胞的浸潤。先前文獻指出，纖維母細胞樣滑膜細胞增生能力的增加及細胞凋亡能力的不足，為類風濕性關節炎中最主要的關鍵因素(Pope, R.M. Nature Reviews Immunology. 2:527, 2002)，因此誘導增加纖維母細胞樣滑膜細胞自身的細胞凋亡能力，為類風濕性關節炎可能的治療方針。
人類臍帶間質幹細胞 (human umbilical cord mesenchymal stem cells)具有自我更新(self-renewal)以及多重分化之特性。人類臍帶間質幹細胞具有旁泌作用(paracrine effect)，並且會移行(migrate)至發炎處進行修復，同時具有抗發炎以及免疫調節等作用。先前文獻指出，骨髓間質幹細胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)對於類風濕性關節炎有良好的治療效果(Papadopoulou, A.等人, Annals of the rheumatic diseases: annrheumdis-2011-200985, 2012)。而在臨床試驗上也發現，在關節間移植入自體骨髓間質幹細胞，對於類風濕性關節炎之治療具有安全性及良好的耐受性(Shadmanfar, S. 等人, Cytotherapy. 20:499-506, 2018)。另外亦有報告指出，利用抗風濕藥物結合人類間質幹細胞，可以增強其對於類風濕性關節炎的治療效果(Wang, L.等人, Stem cells and development. 22:3192-3202, 2013)。先前雖有關於骨髓間質幹細胞對於患有類風濕性關節炎的動物模式進行其治療功效的研究，但是對於其治療功效的機制則未有探討。
處在發炎的環境下，許多發炎因子(例如TGF-β、TNF-α、IL-10)會增進纖維母細胞樣滑膜細胞的增生，然而人類臍帶間質幹細胞卻可以抑制滑膜細胞的異常增生(Liu, Y.等人, Arthritis research & therapy. 12:R210, 2010)。由於成纖維母細胞樣滑膜細胞增生能力的增加，以及該細胞之凋亡能力不足，是造成類風濕性關節炎最主要的關鍵因素，因此誘導人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞(Human fibroblast-like synoviocytes-rheumatoid arthritis, HFLS-RA)產生細胞凋亡，減少細胞增生以降低周邊硬骨及關節軟骨被破壞是治療的方向。人類臍帶間質幹細胞 (Human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs) 相較於骨髓間質幹細胞較易取得，不過關於其應用於改善類風濕性關節炎動物模式的研究探討甚少。因此，研發可誘導人類臍帶間質幹細胞使其產生能夠引起人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞細胞凋亡的方法，並將其用以改善類風濕性關節炎症狀，實有其應用性。
本發明遂首先於細胞體外實驗發現，經過IL-1β的刺激後，會提升人類臍帶間質幹細胞TRAIL的表現，亦能提升人類類風濕性關節炎成纖維母細胞樣滑膜細胞(HFLS-RA) DR4、DR5的表現，進而誘導HFLS-RA之細胞凋亡，達到抑制滑膜細胞異常增生的效果。在活體動物實驗方面，給予IL-1β刺激之人類臍帶間質幹細胞，能顯著緩解類風濕性關節炎病程發炎腫脹之情形，也能顯著改善關節軟骨被滑膜細胞侵蝕，保護關節的正常功能。
於是，於一方面，本發明係關於一種用於治療類風濕性關節炎之醫藥組成物，特徵在於包含一經細胞介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞 (Human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。於一些具體實施例中，所述之經介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞係以5-1000 ng/ml (較佳為50-200 ng/ml)之介白素進行預刺激8-72小時，較佳為預刺激16-48小時，最佳為預刺激24-30小時而成。於一較佳具體實施例中，所述之介白素為介白素-1β (IL-1β)。
於一些具體實施例中，所述之經介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞係用於促進類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞細胞之細胞凋亡。於一些具體實施例中，所述之經介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞係用於抑制滑膜細胞異常增生，進而防止關節軟骨被滑膜細胞侵蝕。於本發明之其他具體實施例，所述之經介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞係用於緩解類風濕性關節炎之發炎腫脹病徵。
於一方面，本發明係關於一種經細胞介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞用於治療類風濕性關節炎之用途，特徵在於所述之經介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞係以5-1000 ng/ml (較佳為50-200 ng/ml)之介白素進行預刺激8-72小時，較佳為預刺激24-30小時而成。於一較佳具體實施例中，所述之介白素為介白素-1β (IL-1β)。
於一些具體實施例中，所述之經介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞係用於抑制纖維母細胞樣滑膜細胞之增生。於本發明之其他具體實施例，所述之經介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞係用於減緩關節發炎、腫脹。於一些具體實施例中，所述之經介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞係用於抑制關節炎病人之關節軟骨侵蝕情形。
於一方面，本發明係關於一種用於治療類風濕性關節炎之方法，特徵在於將一經細胞介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞 (Human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)投藥予需要此類治療的患者。於一些具體實施例中，所述之經介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞係以5-1000 ng/ml (較佳為50-200 ng/ml)之介白素進行預刺激8-72小時，較佳為預刺激24-30小時而成。於一較佳具體實施例中，所述之介白素為介白素-1β (IL-1β)。
本發明之其他特徵與優點將於以下實施例中做進一步舉例說明。本文所述之實施例為用於說明，並非用以限制本發明之範圍。
實施例一、 IL-1β 刺激人類臍帶間質幹細胞黏附至人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞
人類臍帶間質幹細胞(hUCMSCs)係培養於由56%低葡萄糖Dulbecco’s Modified Eagle培養基(DMEM-LG)、37% MCBD 201、2% 胎牛血清、0.5 mg/ml of AlbuMAX ®I、1X胰島素-轉運蛋白-硒-A、10 nM地塞美松、10 ng/ml 表皮生長因子、50nM L-抗壞血酸2-磷酸鹽及1 ng/ml血小板生長因子-BB 所組成的低血清確定培養基中，加濕培養箱條件5% CO 2、37℃。
於進行細胞因子刺激前，先將細胞培養於不含血清的DMEM-LG培養基中進行飢餓培育16小時。之後，以濃度5-1000 ng/ml (較佳為50, 100, 200 ng/ml)的IL-1β刺激24-30小時，而得到經IL-1β刺激之人類臍帶間質幹細胞。
IL-1β 刺激人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞中 ICAM-1 的表現
細胞間黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)蛋白已知參與許多免疫反應過程，包括免疫細胞粘附以及促進免疫細胞跨內皮遷移至發炎部位。於是本發明首先研究細胞因子IL-1β與ICAM-1表現的關係，以模擬發炎環境。人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞經過濃度5-1000 ng/ml (例如 50-200 ng/ml)的IL-1β刺激24-30小時後，利用西方墨點法及細胞螢光染色分析ICAM-1的表現。
由圖一之結果顯示，在經過IL-1β的刺激後，細胞膜表面上LFA-1之配體 - ICAM-1蛋白的表現量有顯著提升。而於100 ng/ml的IL-1β刺激下，細胞表面ICAM-1蛋白的表現量最高(圖一 (B)及(D))。由於ICAM-1是LFA-1的配體，因此本實例亦藉由使用雷射共軛焦顯微鏡分析細胞膜表面ICAM-1的表現量變化。由圖一 (E)的結果顯示，在經過IL-1β的刺激後，細胞膜表面之ICAM-1蛋白分布量有顯著提升。
IL-1β 刺激提升細胞的黏附能力
人類臍帶間質幹細胞與人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞經過100 ng/ml濃度的IL-1β預刺激24小時後，將兩種細胞共同培養1小時以偵測其間黏附能力。在與人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞進行共培養之前，先將人類臍帶間質幹細胞以6 μM Calcein AM (鈣黃綠素-乙酰甲氧基甲酯)活細胞螢光染劑(Tocris, UK)標記，細胞核以1:5000 稀釋之Hoechst 33258 (Sigma, MO, USA)進行染色。將hUCMSCs (5x10 4/900 μl)加入含有HFLS-RA細胞的24-well培養皿之各孔中，於37℃下避光培養一小時。洗去未黏附之細胞後，使用螢光顯微鏡(Leica DM6000B, Wetzlar, Germany)觀察、記錄，並以隨機五個視野下利用Image J分析進行定量統計。
圖二之結果顯示，人類臍帶間質幹細胞經過IL-1β刺激後會提升黏附能力，而HFLS-RA同時經IL-1β刺激更會大幅提升兩細胞之黏附能力。在加入LFA-1的拮抗劑Lovastatin後顯著抑制兩細胞黏附，實驗結果可推測兩細胞是藉由LFA-1/ICAM-1交互作用而互相黏附。
IL-1β 刺激增加人類臍帶間質幹細胞細胞中 TRAIL 的表現
腫瘤壞死因子關聯凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL或Apo 2配體)屬於腫瘤壞死因子超家族(TNF superfamily)，近年來TRAIL由於具有誘導細胞凋亡的潛力，已被應用在癌症治療研究中。TRAIL具有五個受體：死亡受體4 (DR4，TRAIL-R1)、DR5 (TRAIL-R2)、誘餌受體1 (DcR1，TRAIL-R3)、DcR2 (TRAIL-R4)和骨蛋白原(OPG)。TRAIL與含有可誘導細胞凋亡之死亡結構域的DR4和DR5接觸，並藉而引發細胞凋亡。
人類臍帶間質幹細胞細胞經過濃度5-1000 ng/ml (例如 50-200 ng/ml)之IL-1β刺激24-30小時後，利用西方墨點法及細胞螢光染色分析的表現。圖三之實驗結果顯示，隨著IL-1β濃度的提升，其細胞之TRAIL的表現量也隨之提升。由於TRAIL是一種II型跨膜蛋白，本實施例亦利用雷射共軛焦顯微鏡分析細胞膜表面TRAIL的表現量變化(圖三 (E))。
IL-1β 刺激提升人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞之細胞凋亡受體 (Death Receptor) DR4 and DR5 的蛋白表現量
已有報導指出，類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞(HFLS-RA)會表現TRAIL受體—DR4與DR5蛋白。並且類風濕性關節炎病人之發炎關節組織中有高度表現的IL-1β 。為進一步確認在病理環境中，IL-1β刺激是否影響細胞凋亡受體DR4 and DR5的蛋白表現量，遂將HFLS-RA細胞經過濃度5-1000 ng/ml (例如 50-200 ng/ml)的IL-1β刺激24-30小時後，利用西方墨點法分析DR4及DR5的表現。
綜合圖四之結果，顯示經過IL-1β刺激後，有助於提升人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞之細胞凋亡受體的蛋白表現量，而且在給予濃度100 ng/ml之IL-1β刺激後，DR4及DR5表現量達到最高。利用細胞螢光染色分析之結果亦顯示，細胞經IL-1β刺激後，人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞表面之DR4及DR5表現均有提升(圖五 (A)-(B))，而且，在經過IL-1β刺激24小時，其細胞DR4及DR5表現量達到最高(圖五(C)-(F))。
綜合本實施例之結果顯示，經過IL-1β的刺激後，會提升其人類臍帶間質幹細胞TRAIL的表現，以及提升人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞之ICAM-1表現，進而使人類臍帶間質幹細胞黏附人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞能力增加。並且IL-1β可使人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞細胞表面細胞凋亡受體DR4、DR5蛋白表現增加。
實施例二、 IL-1β 刺激之人類臍帶間質幹細胞 (hUCMSCs) 誘導人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞 (HFLS-RA) 之細胞凋亡
將人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞細胞接種在12 mm顯微鏡蓋玻片上，並在24孔板中培養，而人類臍帶間質幹細胞係在10cm培養皿中進行培養。細胞以100 ng/ml IL-1β預刺激24小時後，將hUCMSCs在37℃、避光下用5μMCellTracker Orange（Life technology, NY, USA）進行標記30分鐘。之後，將5x10 4個 hUCMSC細胞加至含有HFLS-RA之24孔板中。經過24小時共同培養後，以annexin V/ PI染色套組(Strong Biotech Corporation, Taipei, Taiwan)進行分析。樣本在染色後立即以螢光顯微鏡(Leica DM6000B, Wetzlar, Germany)觀察及照相。 人類臍帶間質幹細胞以CellTracker Orange標記，annexin V表示早期凋亡，PI則表示晚期凋亡。
圖六之結果顯示，在僅僅使用IL-1β刺激下，並不會促使人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞之細胞凋亡，而在與IL-1β刺激之人類臍帶間質幹細胞共同培養後，HFLS-RA會顯著表現凋亡蛋白caspase-3及caspase-8。因此，將經IL-1β刺激後的人類臍帶間質幹細胞與人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞接觸時，始能促進成纖維樣滑膜細胞之凋亡。
由以上實施例一及二之細胞體外實驗結果得知，IL-1β預刺激之人類臍帶間質幹細胞藉由LFA-1/ICAM-1交互作用黏附至成纖維樣滑膜細胞，IL-1β刺激可提升其移行及黏附能力，並且藉由增進人類臍帶間質幹細胞上TRAIL的表現，鍵結至人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞上的細胞凋亡受體DR4及DR5，誘導人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞之細胞凋亡，以達到抑制滑膜細胞異常增生。
實施例三、人類臍帶間質幹細胞對於膠原蛋白誘導關節炎 (CIA) 模式小鼠的治療效果評估
本實例係使用第二型膠原蛋白誘導關節炎模式小鼠(Collagen-induce Arthritis, CIA)，評估經IL-1β預刺激的人類臍帶間質幹細胞對於類風性關節炎之治療功效。動物實驗方案係經由國立陽明大學機構動物護理和使用委員會(IACUC)批准。所有實驗均根據“在小鼠中成功誘導膠原誘導的關節炎(CIA)的協議”(Chondrex，Inc.)完成。
將八週齡的DBA / 1J品系小鼠在尾皮下注射100μg牛第Ⅱ型膠原蛋白(CⅡ)，其係以完全弗氏佐劑(CFA)乳化。在第21天，以含有100μgCⅡ的弗氏不完全佐劑(IFA)進行追加注射，小鼠會在第一次注射後28-35天發展為關節炎。
CIA模式小鼠分組：Sham，空白對照組；RA，CIA誘導組；RA + hUCMSCs，以尾靜脈注射1x10 6個人類臍帶間質幹細胞；RA + IL-1β-hUCMSCs，以尾靜脈注射1x10 6個經Y濃度IL-1β刺激24小時後的人類臍帶間質幹細胞。
在第36天，通過尾靜脈施用1×10 6個hUCMSC細胞(懸浮在100μlPBS中)。在給予人類臍帶間質幹細胞注射治療後，每10天進行稱體重、觀察其發炎腫脹情形測量其掌厚度，並以臨床關節炎積分表進行評估統計，判讀關節炎之嚴重程度。實驗進行至開始使用CⅡ誘導CIA後第76天，亦即施予人類臍帶間質幹細胞注射後第40天，將小鼠犧牲，並以蘇木紫伊紅染色法分析關節腔軟骨侵蝕程度及滑膜增生厚度，以及以小動物正子斷層造影([ 18F]FDG/micro-PET-CT)評估IL-1β-hUCMSC對於關節炎之療效。
通過拍攝前爪和後爪的外觀來檢查治療效果。臨床關節炎積分之得分定義如下：得分0 =正常，得分1 =一種關節類型發紅腫脹，得分2 =兩種關節類型發紅腫脹，得分3 =三個關節全部發紅腫脹，得分4 =整個爪的兩種症狀都極為嚴重，很難區分其解剖外觀。從4個爪子獲得總分，因此每隻小鼠的最高分是16。
圖七之結果顯示，與未經發炎誘導之對照組(Sham組)相比，RA組的小鼠四肢關節發紅和嚴重腫脹。由臨床關節炎積分表統計結果可得知，在給予人類臍帶間質幹細胞後顯著緩解並改善臨床關節炎積分(圖七 (A))。根據小鼠掌厚度統計圖，實驗結果得知在給予人類臍帶間質幹細胞治療後，能顯著改善其掌發炎腫脹情形(圖七(B))。
利用蘇木紫和伊紅染色法分析人類臍帶間質幹細胞對於類風濕性關節炎的治療效果。為進一步確認治療效果，本實例遂通過H＆E染色檢查進行關節組織的病理分析。CIA小鼠在人類臍帶間質幹細胞注射後第40天進行犧牲，取其關節組織進行病理分析其關節滑膜增生及骨組織破損之情形。實驗結果得知，關節炎RA組其滑膜顯著增生變厚，並且關節處的軟骨組織明顯侵蝕。然而給予人類臍帶間質幹細胞治療後，能改善關節滑膜異常增生情形，並且能保護軟骨組織不被侵蝕。白箭頭:增生之滑膜組織，紅箭頭:關節腔之距離(圖八)。利用小動物正子斷層造影([18F]FDG/microPET-CT)分析關節炎發炎情形，亦得到同樣的結果(圖九)。
小鼠足掌外觀分析人類臍帶間質幹細胞對於類風濕性關節炎治療之效果。另通過拍攝前爪和後爪的外觀，來檢查及分析治療效果。在給予人類臍帶間質幹細胞後每10天觀察記錄小鼠足掌發炎腫脹之情形。由結果照片可觀察到，RA組從第0天至第40天其足掌有顯著的發炎腫脹情形出現。而在給予人類臍帶間質幹細胞治療後，隨著時間的遞進，有顯著改善其發炎腫脹的關節炎病癥(圖十)。
經由本發明之動物活體實驗結果證明，給予IL-1β刺激之人類臍帶間質幹細胞能顯著緩解類風濕性關節炎病程發炎腫脹之情形，也能顯著改善關節軟骨被滑膜細胞侵蝕，以保護關節的正常功能。因此，本發明之提案以細胞因子(特別是IL-1β)刺激人類臍帶間質幹細胞，增進該細胞經過穿內皮遷移至滑膜囊發炎處，經由LFA-1/ICAM-1交互作用與成纖維母細胞樣滑膜細胞黏附並引起TRAIL誘導的細胞凋亡等能力，藉以改善關節炎病人關節軟骨受到侵蝕及緩解發炎腫脹程度，在臨床治療上是一大突破，且在未來可望取代以非類固醇藥物治療類風濕性關節炎之臨床應用。
圖一係顯示人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞細胞經IL-1β刺激後的ICAM-1表現情形。圖一(A) 為利用西方墨點法分析ICAM-1的表現。圖一(B)為西方墨點法ICAM-1 (圖一, A) 的定量結果(n=6)。圖一(C)為利用細胞螢光染色分析ICAM-1的表現。圖一(D)為細胞螢光染色ICAM-1(圖一, C) 的定量結果。圖一(E)為利用雷射共軛焦顯微鏡分析細胞膜表面ICAM-1的表現量變化。 (* P＜0.05, ** P＜0.01, ***P＜0.001) 圖二係顯示經IL-1β刺激後對於細胞黏附能力之影響。圖二(A)係將經過100 ng/ml濃度的IL-1β預刺激之人類臍帶間質幹細胞與人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞共同培養1小時以偵測其黏附能力，其中人類臍帶間質幹細胞以Calcein AM標記，細胞核以Hoechst 33258進行染色。圖二(B)為將圖(A)之實驗結果以隨機五個視野下利用Image J分析進行定量統計。 (* P＜0.05, ** P＜0.01, ***P＜0.001) 圖三係顯示人類臍帶間質幹細胞細胞經IL-1β刺激後TRAIL的表現。圖三(A) 為利用西方墨點法分析TRAIL的表現。圖三(B)為西方墨點法TRAIL (圖三, A)的定量結果(n=6)。圖三(C)為利用細胞螢光染色觀察TRAIL的表現。圖三(D)為細胞螢光染色TRAIL(圖三, C)的定量結果。圖三(E)為利用雷射共軛焦顯微鏡分析細胞膜表面TRAIL的表現量變化。比例尺: 10 μm. (* P＜0.05, ** P＜0.01, ***P＜0.001) 圖四係顯示人類類風濕性關節炎成纖維母細胞樣滑膜細胞經IL-1β刺激後的DR4及DR5表現。圖四(A) 為利用西方墨點法分析DR4的表現。圖四(B)為西方墨點法DR4 (圖四, A)的定量結果(n=7)。圖四(C)為利用西方墨點法分析DR5的表現。圖四(D)為西方墨點法DR5 (圖四, C)的定量結果(n=5)。 (* P＜0.05) 圖五係顯示利用細胞螢光染色分析經IL-1β刺激對人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞之DR4及DR5表現的影響。圖五(A)為利用雷射共軛焦顯微鏡分析細胞螢光染色DR4的表現。綠色:DR4，藍色:Hoechst 33258 (細胞核)。圖五 (B)為利用雷射共軛焦顯微鏡分析細胞螢光染色DR5的表現。綠色:DR5，藍色:Hoechst 33258 (細胞核)。圖五(C)、(E)為利用細胞螢光染色分析人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞上DR4 (n=4)及DR5 (n=3)的表現。綠色:DR4或DR5，藍色:Hoechst 33258 (細胞核)。圖五 (D)、(F)為利用Image J分析圖五(C)、(E) 細胞螢光染色的定量結果。 (* P＜0.05, ** P＜0.01, ***P＜0.001) 圖六係顯示人類臍帶間質幹細胞誘導人類類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞之細胞凋亡能力的分析結果。圖六(A)是以annexin V/ PI染色套組進行分析。人類臍帶間質幹細胞以CellTracker Orange標記，annexin V表示早期凋亡，PI則表示晚期凋亡。綠色: annexin V，紅色: 細胞核-PI；細胞質(整顆細胞)-人類臍帶間質幹細胞。圖六(B)、(C)為兩細胞共同培養後以細胞螢光染色偵測凋亡蛋白胱天蛋白酶-3(caspase-3)及胱天蛋白酶-8(caspase-8)的表現變化。人類臍帶間質幹細胞以CellTracker Orange標記，表現紅色螢光，綠色螢光為胱天蛋白酶-3或-8，藍色螢光為Hoechst 33258 (細胞核)。 圖七係顯示人類臍帶間質幹細胞對於膠原蛋白誘導關節炎(CIA)模式小鼠的治療效果的評估結果。圖七(A)為臨床關節炎積分表統計結果。圖七(B)為小鼠掌厚度統計圖。(* P＜0.05, ** P＜0.01, ***P＜0.001) 圖八係顯示利用蘇木紫和伊紅染色法分析人類臍帶間質幹細胞對於類風濕性關節炎的治療效果。膠原蛋白誘導關節炎(CIA)模式小鼠在施予人類臍帶間質幹細胞注射後第40天進行犧牲，取其關節組織進行病理分析其關節滑膜增生及骨組織破損之情形。白箭頭:增生之滑膜組織，紅箭頭:關節腔之距離。 圖九係顯示利用小動物正子斷層造影([ 18F]FDG/microPET-CT)分析關節炎發炎情形。 圖十係顯示小鼠足掌外觀分析人類臍帶間質幹細胞對於類風濕性關節炎治療之效果。箭頭:表示發炎腫脹之足掌部位。
無

Claims (18)

  1. 一種用於治療類風濕性關節炎之醫藥組成物，其特徵在於包含一經細胞介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞 (Human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中該經介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞係以介白素進行預刺激8-72小時而成。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之醫藥組成物，其中該經介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞係以5-1000 ng/ml之介白素進行預刺激16-48小時而成。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中該介白素為介白素-1β (IL-1β)。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中該經介白素預刺激的人類臍帶間質幹細胞係用於促進類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞細胞之細胞凋亡。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中該經介白素預刺激的人類臍帶間質幹細胞係用於抑制滑膜細胞異常增生。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中該經介白素預刺激的人類臍帶間質幹細胞係用於防止關節軟骨被滑膜細胞侵蝕。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中該經介白素預刺激的人類臍帶間質幹細胞係用於緩解類風濕性關節炎之發炎腫脹病徵。
  9. 一種經細胞介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞用於製備治療類風濕性關節炎之醫藥品的用途，特徵在於所述之經介白素預刺激的人類臍帶間質幹細胞係以介白素進行預刺激8-72小時而成。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該經介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞係以5-1000 ng/ml之介白素進行預刺激16-48小時而成。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該介白素為介白素-1β (IL-1β)。
  12. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該經介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞係用於抑制纖維母細胞樣滑膜細胞之增生。
  13. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該經介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞係用於減緩關節發炎、腫脹。
  14. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該經介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞係用於抑制關節炎病人之關節軟骨侵蝕情形。
  15. 一種用於治療類風濕性關節炎之方法，特徵在於將如申請專利範圍第1項所述之包含經介白素預刺激的人類臍帶間質幹細胞的醫藥組成物投藥予需要此類治療的患者。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該經介白素預刺激的人類臍帶間質幹細胞係以介白素進行預刺激8-72小時而成。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該經介白素(Interleukin, IL)預刺激的人類臍帶間質幹細胞係以5-1000 ng/ml之介白素進行預刺激16-48小時而成。
  18. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該介白素為介白素-1β (IL-1β)
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