TW202208364A

TW202208364A - 喹啉衍生物，其藥學上可接受的鹽及其使用方法

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Publication number: TW202208364A
Application number: TW110123699A
Authority: TW
Inventors: 巴普加德丹
Original assignee: 美商維特衛治療有限責任公司
Priority date: 2020-06-29
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2022-03-01
Also published as: KR20220004023A; CN111808098B; KR20230066650A; WO2022005494A1; CN111808098A; CA3183465A1; US20230265089A1; JP7137040B2; JP2022537595A; EP4175955A1; AU2020456223A1; CN113861189A

Abstract

本發明涉及化合物反式- 4-[1-(3-氯苯基)-7-甲氧基-2,4-二氧代-嘧啶並[5,4-c]喹啉-3-基]環己烷甲酸，其藥學上可接受的鹽及它們作為治療劑的用途，包括在治療炎性障礙中的用途。

Description

喹啉衍生物，其藥學上可接受的鹽及其使用方法

本發明涉及化合物反式-4-[1-(3-氯苯基)-7-甲氧基-2,4-二氧代-嘧啶並[5,4-c]喹啉-3-基]環己烷甲酸、其藥學上可接受的鹽及它們作為治療TNF-α或PDE4介導的疾病的治療劑的用途。

腫瘤壞死因子-α (TNF-α)，也稱為TNF、DIF、TNF-α、TNFA和TNFSF2，是一種從26 kd前體形式加工成17 kd可溶形式的細胞相關的細胞因子。已經表明TNF-α是人和動物中炎症、發燒和急性期應答的主要調節劑，與急性感染和休克過程中觀察到的那些相似。已經表明過量的TNF-α是致命的。目前對如下情況存在大量證據：通過使用可溶性TNF受體或用特異性中和抗體來阻斷TNF-α的作用在各種情況中是有益的，這些情況包括自身免疫疾病，如類風濕性關節炎 (RA)、非胰島素依賴性糖尿病 (NIDDM或II型糖尿病)和克隆氏症。

磷酸二酯酶 (PDE)包括負責第二信使環腺苷單磷酸(cAMP)和環鳥苷單磷酸(cGMP)的水解和滅活的酶的超家族。已經鑒定出不同的PDE家族 (PDE1、PDE2、PDE3、PDE4等)，它們在受質特異性基質、催化活性、內源性啟動劑(endogenous promoter)和抑制劑在敏感性和遺傳密碼上有差異。

PDE4同功酶家族對環狀AMP具有高親和力，但對環狀GMP具有弱親和力。由PDE4抑制引起的環狀AMP水平提高與多種炎症和免疫細胞中的細胞啟動抑制有關，這些細胞包括淋巴細胞、巨噬細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞。此外，PDE4抑制降低了細胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的釋放。

鑒於這些生理效應，最近公開了不同化學結構的PDE4抑制劑用於治療慢性或急性炎性疾病和已知可通過抑制PDE4緩解的其他病理狀況、疾病及障礙。

認為PDE4抑制劑可用於治療和/或預防哺乳動物(例如，人)的各種疾病/病症，尤其是炎性和/或過敏性疾病，例如：哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD) (例如慢性支氣管炎和/或肺氣腫)、異位性皮炎、蕁麻疹、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、春季結膜炎、嗜酸性肉芽腫、牛皮癬、類風濕關節炎、膿毒性休克、潰瘍性結腸炎、克隆氏症、心肌和腦的再灌注損傷、慢性腎小球腎炎、內毒素性休克、成人呼吸窘迫綜合征、多發性硬化、認知損傷 (例如，在神經系統障礙中，例如阿茲海默症)、抑鬱或疼痛。通常將潰瘍性結腸炎和/或克隆氏症統稱為炎性腸病。

此外，認為抑制TNF-α產生的化合物通過基於治療干預的機制能夠用於多種疾病和障礙中。認為TNF-α抑制劑可用於包括但不限於以下疾病：病毒性、酒精性或藥物誘發的急性或暴發性肝炎、脂肪肝、酒精性和非酒精性、病毒性和非病毒性肝炎、肝硬化、自身免疫性肝炎、慢性活動性肝炎、威爾森氏症、重症肌無力、特發性口炎性腹瀉、自身免疫性炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克隆氏症、炎性腸病、內分泌性眼病、葛瑞夫茲氏症、結節病、原發性膽汁性肝硬化、胰腺炎、腎炎、內毒素休克、膿毒性休克、血液動力學休克、膿毒綜合征、缺血後再灌注損傷、瘧疾、分枝桿菌感染、腦膜炎、牛皮癬、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、嗜酸性粒細胞增多、充血性心力衰竭、纖維化疾病、囊性纖維化、肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化、惡病質、移植物排斥、移植排斥、癌症、涉及血管生成的疾病、自身免疫疾病、強直性脊柱炎、自身免疫性腦脊髓炎、自身免疫性造血系統疾病、溶血性貧血、再生障礙性貧血、單純紅細胞性貧血、特發性血小板減少症、系統性紅斑狼瘡(SLE)、多發性軟骨炎、硬皮病、韋格納肉芽腫病、皮肌炎、萊特氏症候群、非傳染性葡萄膜炎、自身免疫性角膜炎、乾燥性角膜結膜炎、春季角膜結膜炎、間質性肺纖維化、牛皮癬關節炎、牛皮癬和其他良性或惡性增殖性皮膚病、異位性皮炎、蕁麻疹、神經變性疾病、帕金森氏症、阿茲海默症、急性和慢性多發性硬化、癌症、病毒感染(例如SARS、MERS或COVID-19)、人免疫缺陷病毒(HIV)、惡病質、血栓形成、皮膚炎性疾病、骨關節炎 (OA)、骨質疏鬆症、RA、肺氣腫、慢性支氣管炎、過敏性鼻炎、輻射損傷、高氧肺泡損傷、牙周病、非胰島素依賴性糖尿病 (II型糖尿病)和胰島素依賴性糖尿病(青少年或I型糖尿病)。

由於PDE4抑制劑獨特的作用機制，使得上游抑制多種細胞因子訊號傳導途徑並調節促炎性/抗炎性的平衡，因此所述PDE4抑制劑可為治療呼吸道病毒感染(例如SARS、MERS或COVID-19治療)的有用的治療選擇。此外，PDE4抑制劑可特異性改善氣道和肺部炎症，並保護患者免受由於相關的急性肺損傷和嚴重的呼吸衰竭而導致的插管和高死亡率。

因此，仍然需要鑒定和開發抑制PDE4酶活性和/或TNF-α產生的新化合物。

本文公開了化合物I及其藥學上可接受的鹽、它們的製備和它們作為PDE4活性的抑制劑的用途以及在各種醫學病症的治療中的用途。

在一個方面，本發明提供了反式- 4-[1-(3-氯苯基)-7-甲氧基-2,4-二氧代-嘧啶並[5,4-c]喹啉-3-基]環己烷甲酸 (“化合物I”)及其藥學上可接受的鹽。在一個實施方案中，本發明提供了化合物I及其HCl鹽。

在另一方面，本發明提供了藥物組合物，其包含化合物I或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體。

在另一方面，本發明提供了製備化合物I或其藥學上可接受的鹽的方法。

在另一方面，本發明提供了治療由TNF-α或PDE4介導的障礙的方法，其包括向有此需要的受試者給藥化合物I或其藥學上可接受的鹽，或向有此需要的受試者給藥包含化合物I或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體的藥物組合物。在一個實施方案中，本發明提供了治療選自以下疾病的方法：COPD、異位性皮炎、牛皮癬、IBD和克隆氏症。

在另一方面，本發明提供了化合物I或其藥學上可接受的鹽，其用於製備用於治療由TNF-α或PDE4介導的疾病的藥物。

本發明的這些或其他方面和實施方案在下文中進行更詳盡地描述。

定義

如文本所用，化合物I或式(I)化合物是指具有如下所示結構的化合物：

其可被確定為反式- 4-[1-(3-氯苯基)-7-甲氧基-2,4-二氧代-嘧啶並[5,4-c]喹啉-3-基]環己烷甲酸。

除非另有說明，否則本文所描述的結構也意指包括差別僅在於存在一個或多個同位素富集的原子的化合物。例如，具有本結構的化合物，但氫原子被氘或氚替代，或碳原子被富含¹³ C-或¹⁴ C的碳取代，這些都在本發明的範圍內。

本文所用術語“治療有效量”表示將引起所尋求物件的治療回應的化合物I或其藥學上可接受的鹽的量。在一個實施方案中，治療響應可以是在受試者的個體細胞、組織、器官中抑制PDE4酶活性和/或抑制TNF-α產生。在一個實施方案中，通過給予每天小於1克或小於100毫克的劑量的化合物可以在受試者中獲得治療有效量。在另一個實施方案中，施用的劑量水平為每天大於1毫克的化合物。在一個實施方案中，所施用的化合物I或其藥學上可接受的鹽的劑量為1至100毫克、或1至50毫克、或10至50毫克、或30至50毫克。在其他實施方案中，化合物I或其藥學上可接受的鹽的劑量為1至20毫克，或5至15毫克或10至20毫克或20至30毫克。

如文本所用術語“治療”是指針對受試者所遭受的特定病症或障礙的全部治療方法，包括減輕或緩解由該障礙引起的一種或多種症狀，從而延遲該障礙的發作或進展。

術語“受試者”可以指任何哺乳動物，例如但不限於人類。在一個實施方案中，受試者是人。在另一實施方案中，受試者是表現出需要治療的病症的一種或多種症狀特徵的人。術語“受試者”並不必須是在任何醫院、診所或研究機構具有任何特定身份的人(例如，作為入院患者，研究參與者等)。在一個實施方案中，該受試者可以是“有此需要的受試者”。

“藥學上可接受的載體”是本領域普遍接受的用於向哺乳動物例如人類遞送生物活性劑的介質。這些載體通常是根據所屬技術領域中具有通常知識者能力範圍內的許多因素來配製的。這些方法包括但不限於所配製活性劑的類型和性質；含藥劑的組合物要施用的受試者；組合物的預期給藥途徑；和所靶向的治療性適應症。藥學上可接受的載體包括水性和非水性液體介質，以及各種固體和半固體劑型。此類載體除活性成分外還可以包含多種不同的成分和添加劑，由於各種原因(例如活性劑的穩定化)而將這些額外成分包含在製劑中，這是所屬技術領域中具有通常知識者眾所周知的。合適的藥學上可接受的載體及其選擇所涉及的因素的描述可在各種容易獲得的來源中找到，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa. 1985，其內容併入本文作為參考。

術語“藥學上可接受的鹽”是指由藥學上可接受的無機和有機酸和鹼製備的鹽。例如，化合物I可與多種無機和有機酸反應形成藥學上可接受的酸加成鹽，例如但不限於鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、丙酸、檸檬酸、酒石酸和苯甲酸。藥學上可接受的鹼加成鹽可以從無機鹼和有機鹼製備。從無機鹼衍生的鹽，例如包括鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽和鎂鹽。從有機鹼衍生的鹽包括但不限於一級、二級和三級胺的鹽。此類胺的具體實例包括，例如，異丙胺、三甲胺、二乙胺、三(異丙基)胺、三(正丙基)胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、氨丁三醇、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因、膽鹼、甜菜鹼和乙二胺。這種藥學上可接受的鹽和製備它們的常用方法是本領域眾所周知的。參見，例如，P. Stahl等人，HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S. M. Berge，等人，"Pharmaceutical Salts"，Journal of Pharmaceutical Sciences，第66卷，No. 1，1977年1月。

1.化合物在一個方面，本發明提供了化合物I或其藥學上可接受的鹽。在一個實施方案中，本發明提供了化合物I。在另一實施方案中，本發明提供了化合物I的藥學上可接受的鹽。在另一實施方案中，本發明提供了化合物I的酸式鹽。在另一實施方案中，本發明提供了化合物I的HCl酸鹽。

在另一方面，本發明提供了下式化合物

, 其中R¹ 為任選被鹵素取代1-3次的(C1-C6)烷基。在一個實施方案中，R¹ 為甲基或叔丁基。

2.藥物組合物在另一方面，本發明提供了藥物組合物，其包含化合物I或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體。

在一個實施方案中，本發明提供了藥物組合物，其包含化合物I。在另一實施方案中，本發明提供了藥物組合物，其包含化合物I的藥學上可接受的鹽。在另一實施方案中，本發明提供了藥物組合物，其包含化合物I的酸式鹽。在另一實施方案中，本發明提供了藥物組合物，其包含化合物I的HCl酸鹽。

在另一實施方案中，本發明提供前述實施方案中任一項的藥物組合物且其進一步包含一種或多種另外的治療劑。所述一種或多種另外的治療劑選自類固醇、環氧合酶抑制劑、非甾體類抗炎藥或TNF-α抗體，例如例如乙醯水楊酸、丁苯羥酸(bufexamac)、雙氯芬酸鉀、舒林酸、雙氯芬酸鈉、酮咯酸氨丁三醇、托美汀、布洛芬、萘普生、萘普生鈉、噻洛芬酸(tiaprofen acid)、氟比洛芬、甲芬那酸、尼氟酸(nifluminic acid)、甲氯芬那酸、吲哚美辛、普各洛美他辛、酮洛芬、萘丁美酮、撲熱息痛、吡羅昔康、替諾昔康、尼美舒利、保泰松、曲馬多、二丙酸倍氯米松、倍他米松、倍氯米松、布地奈德、氟替卡松、莫米松、地塞米松、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松龍、強的松、去炎松、塞來昔布、羅非昔布、英夫利昔單抗、來氟米特、依那西普、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、抗淋巴細胞免疫球蛋白、抗胸腺細胞免疫球蛋白、硫唑嘌呤、環孢菌素、他克莫司物質(tacrolimus substances)、子囊黴素、雷帕黴素或莫羅莫那-CD3。

本發明還提供了上述任一實施方案的藥物組合物，其包含治療有效量化合物I或其藥學上可接受的鹽。

根據本發明的另一方面，還提供了一種製備藥物製劑的方法，該方法包括將化合物I或其藥學上可接受的鹽與一種或多種藥學上可接受的載體混合。

可以以含有預定量的活性成分／單位劑量的單位劑型來提供藥物製劑。作為非限制性實例，這樣的單位可以含有0.5 mg~l g的化合物I或其藥學上可接受的鹽，這取決於待治療的疾病、給藥途徑和患者的年齡、體重和一般狀況。典型的單位劑型是含有日劑量或亞劑量(如上文所述)或其適當分數的活性成分的劑型。可以通過製藥領域中公知的任一種方法來製備這樣的藥物製劑。

在一個實施方案中，藥物組合物的單個劑型可以包含化合物I或其藥學上可接受的鹽，其量為大於1mg的化合物I或其藥學上可接受的鹽。在另一個實施方案中，所述藥物組合物可以包含化合物I或其藥學上可接受的鹽，其量為1至100mg、或1至50mg、或10至50mg、或30至50mg。在其他實施方案中，所述藥物組合物可以包含化合物I或其藥學上可接受的鹽，其量為1至20mg、或5至15mg、或10至20mg、或20至30mg。

可以將藥物製劑進行改變以適於通過任何合適途徑來給藥，例如，通過口服(包括含服或舌下)、直腸、鼻、局部(包括含服、舌下或經皮)、陰道或胃腸外(包括皮下、肌內、靜脈內或皮內)途徑。可以通過製藥領域已知的任何方法來製備這樣的製劑，例如，通過使活性成分與載體或賦形劑締合。舉例來說，並且不是用來限制本發明，對於認為使用本發明的化合物是有用的特定病症和障礙來說，特定的給藥途徑與其他相比是更優先的。

適於口服給藥的藥物製劑可以呈現為離散單位，如膠囊或片劑；粉末或顆粒；溶液或混懸劑，它們各自含有水性或非水性液體；可食泡沫或攪打物；或水包油型液體乳劑或油包水型液體乳劑。例如，對於片劑或膠囊形式的口服給藥，可以將活性藥物成分與口服的、無毒藥學可接受的惰性載體(如乙醇、甘油、水等)混合。通常，通過將化合物粉碎成合適的微細尺寸並與合適的藥物載體(如可食用的碳水化合物，例如，澱粉或甘露醇)混合來製備粉末。調味劑、防腐劑、分散劑和著色劑也可以存在。

可以通過製備粉末、液體或混懸液的混合物並用明膠或其他一些適合的外殼材料包囊來製備膠囊。在包囊前，可以將助流劑和潤滑劑例如矽膠、滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣或固體聚乙二醇加入混合物中。還可以加入崩解劑或增溶劑，如瓊脂、碳酸鈣或碳酸鈉，以提高在攝入膠囊後藥物的利用度。此外，期望或需要時，還可以將合適的結合劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑摻入混合物中。合適的結合劑的實例包括澱粉、明膠、天然糖類(如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜昧劑)、天然和合成膠(如阿拉伯膠、西黃蓍膠或海藻酸鈉)、羧甲基纖維素、聚乙二醇、蠟等。

這些劑型中使用的潤滑劑包括，例如，油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。崩解劑包括但不限於，澱粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤土、黃原膠等。

例如，通過製備粉末混合物、造粒或重壓法(slugging)、添加潤滑劑和崩解劑、壓制成片劑來配製片劑。可以通過將適當粉碎的化合物與如上所述的稀釋劑或基質混合來制得粉末混合物。任選的成分包括結合劑，如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠或聚乙烯吡咯烷酮；溶液緩凝劑(solution retardant)，如石蠟；再吸收加速劑，如季鹽；和/或吸附劑，如膨潤土、高嶺土或磷酸二鈣。粉末混合物可以用結合劑濕法造粒，結合劑例如是糖漿、澱粉糊、阿拉伯膠粘液或纖維素或聚合材料的溶液，並壓制通過篩網。作為造粒的可替換方案，可以將粉末混合物通過壓片機，結果，未完全形成的塊狀物粉碎成顆粒。可以通過加入硬脂酸、硬脂酸鹽、滑石粉或礦物油，將顆粒潤滑以防止顆粒黏著在形成片劑的模具上。然後將潤滑的混合物壓制成片劑。本發明的化合物還可以與自由流動的惰性載體混合並直接壓制成片劑，而不必通過造粒或重壓步驟。可以提供由蟲膠隔離層、糖衣或聚合物包衣和蠟拋光層組成的透明或不透明的保護塗層。可以將染料加入這些塗層中，以區別不同的單位劑量。

在適當的情況下，用於口服給藥的單位劑型製劑可以是微囊化的。還可以制得製劑以使其延長或持續釋放，例如通過將顆粒材料塗覆或包埋於聚合物、蠟等中。

可以以單位劑型形式製備口服液體，例如溶液、糖漿或酏劑，使得給定的量含有預定量的化合物。例如，可以通過將化合物溶解於適當調味的水溶液中制得糖漿，而通過使用無毒醇媒介物制得酏劑。通常通過將化合物分散於無毒媒介物中來配製混懸液。還可以加入增溶劑和乳化劑，例如乙氧基化異硬脂醇和聚氧乙烯山梨糖醇醚，防腐劑；風味添加劑，例如薄荷油，或天然甜味劑，糖精，或其他人造甜味劑等。

用於藥物溶液製劑的合適包裝可以是所有批准的可用於胃腸外使用的容器，如塑膠和玻璃容器、即用型注射器等。在一個實施方案中，容器是密封的玻璃容器，如小瓶或安瓿。氣密性玻璃小瓶是密封玻璃容器的一個實例。根據本發明的一個實施方案，在密封的玻璃容器中提供了無菌可注射溶液，該溶液包含在生理學可接受的溶劑中的化合物I或其藥學上可接受的鹽，並且為了穩定性其具有合適的pH。本發明化合物的酸式鹽在水溶液中的溶解度可能大於它們的游離鹼對應物，但將該酸式鹽加入水溶液中時，溶液的pH太低，使得不適於給藥。因此，pH在pH4.5以上的溶液製劑可以在給藥前與pH高於7的稀釋液混合，使得所給藥的組合製劑的pH為pH 4.5或更高。在一個實施方案中，稀釋液包含藥學上可接受的鹼，如氫氧化鈉，並且所給藥的組合製劑的pH在pH 5.0~7.0之間。在將溶液通過滅菌篩檢程式之前，可以將一種或多種其他成分加入溶液中，這些成分例如是共溶劑、張力調節劑、穩定劑和防腐劑，例如之前所列舉的種類。

適於局部給藥的藥物製劑可以配製成膏劑、霜劑、混懸液、洗液、粉末、溶液、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣溶膠或油。

對於眼睛或其他外部組織(例如嘴和皮膚)的治療，可以作為局部膏劑或霜劑來施用製劑。配製於膏劑中時，可以將活性成分與石蠟或水可混溶性膏劑基質一起使用。或者可以將活性成分與水包油型霜劑基質或油包水型基質一起配入霜劑中。適於局部給藥於眼睛的藥物製劑包括滴眼劑，其中將活性成分溶解或混懸於合適的載體中，尤其是含水溶劑中。

適於在口中局部給藥的藥物製劑包括錠劑(lozenges)、糖錠劑(pastilles)和漱口劑。

適於鼻給藥的藥物製劑(其中載體是固體)包括具有例如20~500微米粒徑的粗粉。以採用吸入的方式來給藥粉末，即，通過從靠近鼻子的裝有粉末的容器，通過鼻通道快速吸入。其中載體是液體的、作為鼻噴霧劑或作為滴鼻劑來給藥的合適製劑包括活性成分的水性溶液或油性溶液。

適於通過吸入給藥的藥物製劑包括細顆粒粉塵或細霧，這可以通過各種類型的計量劑量的加壓氣霧劑、噴霧器或吸入器來產生。

此外，本發明的組合物還可以栓劑的形式用於直腸給藥本發明的化合物。可以通過將藥物與合適的非刺激性賦形劑混合來製備這種組合物，該賦形劑在常溫下是固體的，但在直腸溫度下是液體的，並因此將在直腸中熔化，以釋放藥物。例如，這樣的材料包括可可脂和聚乙二醇。適於直腸給藥的藥物製劑可以作為栓劑或作為灌腸劑存在。

適於胃腸外給藥的藥物製劑包括含水和無水無菌注射液，其可以含有抗氧化劑、緩衝劑、殺菌劑和使得製劑與預期的接受者的血液等滲的溶質；含水和無水無菌混懸液，其可以包含助懸劑和增稠劑。可以在單位劑型或多劑量的容器中提供製劑，這些容器例如為密封的安瓿和小瓶，並且可以貯存於冷凍乾燥(凍乾)條件下，臨用前只需要加入無菌液體載體，例如注射用水。

即時注射液和混懸液可以從無菌粉末、顆粒和片劑制得。

除了以上特別提及的成分，本發明製劑可以包括適於目標製劑類型的本領域常規的其他試劑。例如，適於口服給藥的製劑可以包括調味劑或著色劑。

合成方法

化合物I及其鹽酸鹽的製備方法在以下實施例部分中描述。

在另一方面，本發明提供了製備化合物I或其鹽的方法，該方法包括將化合物

水解，其中R¹ 為(C1-C6)烷基，其任選被鹵素取代1-3次。在一個實施方案中，R¹ 為甲基或叔丁基。在另一實施方案中，R¹ 為乙基。

在另一方面，本發明提供了製備化合物I的藥學上可接受的酸式鹽的方法，其包括將化合物I與藥學上可接受的酸在適合的溶劑中反應。在一個實施方案中，所述藥學上可接受的酸為鹽酸。在其他實施方案中，化合物I與鹽酸反應形成化合物I的HCl鹽。

治療方法

在另一方面，本發明提供了一種治療方法，其包括向有此需要的受試者給藥化合物I或其藥學上可接受的鹽，或給藥藥物組合物，其包含化合物I或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體。在一個實施方案中，所述方法包括給藥治療有效量的化合物I或其藥學上可接受的鹽。

本發明藥物組合物可以按每劑或每天小於1g化合物I或其藥學上可接受的鹽的劑量水平施用。在另一實施方案中，施用的劑量水平為每劑或每天大於1 mg的化合物I或其藥學上可接受的鹽。可與載體材料組合以產生單一劑量的活性成分的量將根據所治療的主體和具體的給藥方式而變化。例如，在一個非限制性實施方案中，旨在向人口服施用的劑量單位形式，例如片劑或膠囊劑，可包含少於100mg的化合物I或其藥學上可接受的鹽以及適當和方便量的載體材料。在另一實施方案中，每天施用的劑量水平為大於1 mg的化合物I或其藥學上可接受的鹽。在一個實施方案中，化合物I或其藥學上可接受的鹽的施用劑量為1至100mg，或1至50mg，或10至50mg，或30至50mg。在其他實施方案中，化合物I或其藥學上可接受的鹽的給藥劑量為1至20mg、或5至15mg、或10至20mg、或20至30mg。

臨床醫生可以根據被治療的物件具體的臨床狀況來確定每天或每個時期的劑量和/或每天(一天一次，一天兩次等)或每個時期(一週一次，一周兩次等)的給藥頻率。因此，應理解，任何特定受試者的具體劑量水平和給藥頻率可取決於多種因素，例如但不限於年齡、體重、總體健康、性別、飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄率、藥物組合以及接受治療的特定疾病的嚴重程度。

本發明的另一個實施方案包括通過給予化合物I或其藥學上可接受的鹽來抑制有此需要的受試者中TNF-α活性的方法。

本發明的另一個實施方案包括通過給予化合物I或其藥學上可接受的鹽來抑制有此需要的受試者中的PDE4的方法。

本發明的另一個實施方案包括通過給予化合物I或其藥學上可接受的鹽來治療由TNF-α的活性介導的病症或障礙的方法。

本發明的另一個實施方案包括通過給予化合物I或其藥學上可接受的鹽來治療由PDE4介導的病症或障礙的方法。

本發明的另一個實施方案包括通過施用化合物I或其藥學上可接受的鹽治療炎性疾病的方法。作為非限制性實例，炎性疾病可包括病毒性、酒精性或藥物誘發的急性或暴發性肝炎、脂肪肝、酒精性和非酒精性、病毒性和非病毒性肝炎、肝硬化、自身免疫性肝炎、慢性活動性肝炎、威爾森氏症、重症肌無力、特發性口炎性腹瀉、自身免疫性炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克隆氏症、炎性腸病、內分泌性眼病、葛瑞夫茲氏症、結節病、原發性膽汁性肝硬化、胰腺炎、腎炎、內毒素休克、膿毒性休克、血液動力學休克、膿毒綜合征、缺血後再灌注損傷、瘧疾、分枝桿菌感染、腦膜炎、牛皮癬、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、嗜酸性粒細胞增多、充血性心力衰竭、纖維化疾病、囊性纖維化、肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化、惡病質、移植物排斥、移植物抗宿主病、移植排斥、癌症、涉及血管生成的疾病、自身免疫疾病、強直性脊柱炎、自身免疫性腦脊髓炎、自身免疫性造血系統疾病、溶血性貧血、再生障礙性貧血、單純紅細胞性貧血、特發性血小板減少症、系統性紅斑狼瘡(SLE)、多發性軟骨炎、硬皮病、韋格納肉芽腫病、皮肌炎、萊特氏症候群、非傳染性葡萄膜炎、自身免疫性角膜炎、乾燥性角膜結膜炎、春季角膜結膜炎、間質性肺纖維化、牛皮癬關節炎、牛皮癬和其他良性或惡性增殖性皮膚病、異位性皮炎、蕁麻疹、神經變性疾病、帕金森氏症、阿茲海默症、急性和慢性多發性硬化、癌症、病毒感染(例如SARS、MERS或COVID-19)、人免疫缺陷病毒(HIV)、惡病質、血栓形成、皮膚炎性疾病、骨關節炎 (OA)、骨質疏鬆症、RA、肺氣腫、慢性支氣管炎、過敏性鼻炎、輻射損傷、高氧肺泡損傷、牙周病、非胰島素依賴性糖尿病 (II型糖尿病)和胰島素依賴性糖尿病(青少年或I型糖尿病)。

在另一實施方案中，這種治療涉及通過抑制PDE4介導的疾病。這種病症包括各種病症，尤其是在哺乳動物(例如人)中的炎性和/或過敏性疾病，例如：哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD) (例如慢性支氣管炎和/或肺氣腫)、異位性皮炎、蕁麻疹、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、春季結膜炎、嗜酸性肉芽腫、牛皮癬、類風濕關節炎、膿毒性休克、潰瘍性結腸炎、克隆氏症、心肌和腦的再灌注損傷、慢性腎小球腎炎、內毒素性休克、成人呼吸窘迫綜合征、多發性硬化、認知損傷 (例如在神經系統障礙中例如阿茲海默症)、抑鬱或疼痛。潰瘍性結腸炎和/或克隆氏症統稱為炎性腸病。

在本發明的一個實施方案中，在哺乳動物 (例如人)中的所述炎性和/或過敏性疾病為慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、牛皮癬或類風濕關節炎。在另一實施方案中，本發明提供了治療以下疾病的方法，所述疾病選自COPD、異位性皮炎、牛皮癬、IBD和克隆氏症。

本發明的化合物也可以與其他常規抗炎或免疫抑制劑組合施用，例如類固醇、環氧合酶抑制劑、非固醇類抗炎藥物、TNF-α抗體或其他TNF-結合蛋白，例如乙醯水楊酸、丁苯羥酸、雙氯芬酸鉀、舒林酸(Sulindac)、雙氯芬酸鈉(Diclofenac sodium)、酮咯酸氨丁三醇(Ketorolac tromethamine)、托美汀(Tolmetin)、布洛芬(Ibuprofen)、萘普生(Naproxen)、萘普生鈉、噻洛芬酸(Thioprofen acid)、氟比洛芬(Flurbiprofen)、甲芬那酸(Mefenamic acid)、尼氟酸(Niflumic acid)、甲氯芬那酸(Meclofenamic Acid)、吲哚美辛(Indomethacin)、普各洛美他辛(Proglumetacin)、酮洛芬(Ketoprofen)、萘丁美酮(Nabumetone)、撲熱息痛(Paracetamol)、吡羅昔康(Piroxicam)、替諾昔康(Tenoxicam)、尼美舒利(Nimesulide)、保泰松(Phenylbutazone)、曲馬多(Tramadol)、二丙酸倍氯米松(Beclometasone dipropionate)、倍他米松(Betamethasone)、倍氯米松(Beclometasone)、布地奈德(Budesonide)、氟替卡松(Fluticasone)、莫米松(Mometasone)、地塞米松(Dexamethasone)、氫化可的松(Hydrocortisone)、甲潑尼龍(Methylprednisolone)、潑尼松龍(Prednisolone)、強的松(Prednisone)、去炎松(Triamcinolone)、塞來昔布(Celecoxib)、羅非昔布(Rofecoxib)、英夫利昔單抗(Infliximab)、來氟米特(Leflunomide)、依那西普(Etanercept)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine)、抗淋巴細胞免疫球蛋白、抗胸腺細胞免疫球蛋白、硫唑嘌呤(Azathioprine)、環孢菌素、他克莫司(Tacrolimus)物質、子囊黴素、雷帕黴素(Rapamycin)、阿達木單抗(Adalimumab)、莫羅莫那(Muromonab)-CD3或其他調節T細胞功能的抗體或融合蛋白，例如阿巴西普(Abatacept)、阿法西普和依法珠單抗(Efalizumab)。

如上所述，本發明的化合物可以單獨使用或與其他治療劑組合使用。這樣的藥物活性劑的組合可以一起給藥或分開給藥，當分開給藥時，可以同時或以任何次序按序進行給藥。選擇化合物或藥物的用量以及給藥的相對時間，以獲得所需的治療效果。本發明的通式化合物(包括其鹽)與其他治療劑的組合給藥可以伴隨以下方式來組合給藥：(1)包含兩種化合物的單一組合物，或(2)各自包含一種化合物的分開的藥物組合物。或者，可以以有序的方式分開給藥組合藥劑，其中首先給藥一種治療劑，隨後給藥另一種，或反之。這樣的按序給藥可以間隔短或間隔長。本發明的化合物可以用於各種障礙和病症的治療中，同樣地，本發明的化合物也可以與在那些障礙或病症的治療或預防中有用的各種其他適合的治療劑組合使用。

在製備藥物的方法中的用途

在另一方面，本發明提供了化合物I或其藥學上可接受的鹽在製備用於治療炎性疾病的藥物中的用途。作為非限制性實例，炎性疾病可包括病毒性、酒精性或藥物誘發的急性或暴發性肝炎、脂肪肝、酒精性和非酒精性、病毒性和非病毒性肝炎、肝硬化、自身免疫性肝炎、慢性活動性肝炎、威爾森氏症、重症肌無力、特發性口炎性腹瀉、自身免疫性炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克隆氏症、炎性腸病、內分泌性眼病、葛瑞夫茲氏症、結節病、原發性膽汁性肝硬化、胰腺炎、腎炎、內毒素休克、膿毒性休克、血液動力學休克、膿毒綜合征、缺血後再灌注損傷、瘧疾、分枝桿菌感染、腦膜炎、牛皮癬、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、嗜酸性粒細胞增多、充血性心力衰竭、纖維化疾病、囊性纖維化、肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化、惡病質、移植物排斥、移植物抗宿主病、移植排斥、癌症、涉及血管生成的疾病、自身免疫疾病、強直性脊柱炎、自身免疫性腦脊髓炎、自身免疫性造血系統疾病、溶血性貧血、再生障礙性貧血、單純紅細胞性貧血、特發性血小板減少症、系統性紅斑狼瘡(SLE)、多發性軟骨炎、硬皮病、韋格納肉芽腫病、皮肌炎、萊特氏症候群、非傳染性葡萄膜炎、自身免疫性角膜炎、乾燥性角膜結膜炎、春季角膜結膜炎、間質性肺纖維化、牛皮癬關節炎、牛皮癬和其他良性或惡性增殖性皮膚病、異位性皮炎、蕁麻疹、神經變性疾病、帕金森氏症、阿茲海默症、急性和慢性多發性硬化、癌症、病毒感染(例如SARS、MERS或COVID-19)、人免疫缺陷病毒(HIV)、惡病質、血栓形成、皮膚炎性疾病、骨關節炎 (OA)、骨質疏鬆症、RA、肺氣腫、慢性支氣管炎、過敏性鼻炎、輻射損傷、高氧肺泡損傷、牙周病、非胰島素依賴性糖尿病 (II型糖尿病)和胰島素依賴性糖尿病(青少年或I型糖尿病)。

在另一實施方案中，本發明提供了化合物I或其藥學上可接受的鹽在製備在哺乳動物例如人中用於治療炎性和/或過敏性疾病的藥物中的用途，例如：哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD) (例如慢性支氣管炎和/或肺氣腫)、異位性皮炎、蕁麻疹、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、春季結膜炎、嗜酸性肉芽腫、牛皮癬、類風濕關節炎、膿毒性休克、潰瘍性結腸炎、克隆氏症、心肌和腦的再灌注損傷、慢性腎小球腎炎、內毒素性休克、成人呼吸窘迫綜合征、多發性硬化、認知損傷 (例如在神經系統障礙中，例如阿茲海默症)、抑鬱、或疼痛。潰瘍性結腸炎和/或克隆氏症統稱為炎性腸病。在一個實施方案中，在哺乳動物 (例如人)中，所述炎性和/或過敏性疾病為慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、類風濕關節炎或過敏性鼻炎。

化合物I或其藥學上可接受的鹽可與其他常規抗炎藥或免疫抑制劑組合用於藥物製備，所述其他常規抗炎藥或免疫抑制劑例如類固醇、環氧合酶抑制劑、非固醇類抗炎藥物、TNF-α抗體或其他TNF-結合蛋白，例如乙醯水楊酸、丁苯羥酸、雙氯芬酸鉀、舒林酸、雙氯芬酸鈉、酮咯酸氨丁三醇、托美汀、布洛芬、萘普生、萘普生鈉、噻洛芬酸、氟比洛芬、甲芬那酸、尼氟酸、甲氯芬那酸、吲哚美辛、普各洛美他辛、酮洛芬、萘丁美酮、撲熱息痛、吡羅昔康、替諾昔康、尼美舒利、保泰松、曲馬多、二丙酸倍氯米松、倍他米松、倍氯米松、布地奈德、氟替卡松、莫米松、地塞米松、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松龍、強的松、去炎松、塞來昔布、羅非昔布、英夫利昔單抗、來氟米特、依那西普、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、抗淋巴細胞免疫球蛋白、抗胸腺細胞免疫球蛋白、硫唑嘌呤、環孢菌素、他克莫司物質、子囊黴素、雷帕黴素、阿達木單抗、莫羅莫那-CD3或其他調節T細胞功能的抗體或融合蛋白，例如阿巴西普、阿法西普和依法珠單抗。

本發明的其他實施方案包括化合物I或其藥學上可接受的鹽在製備用於在有此需要的受試者中抑制TNF-α活性的藥物中的用途。

本發明的其他實施方案包括化合物I或其藥學上可接受的鹽在製備用於在有此需要的受試者中抑制PDE4的藥物中的用途。

本發明的其他實施方案包括化合物I或其藥學上可接受的鹽在製備用於治療由TNF-α的活性介導的病症或障礙的藥物中的用途。

本發明的其他實施方案包括化合物I或其藥學上可接受的鹽在製備用於治療由PDE4介導的病症或障礙的藥物中的用途。

實施例

化合物I及其HCl鹽的合成

步驟1：

向一個40 mL反應小瓶中加入4-氯-8-甲氧基喹啉-3-甲酸乙酯(1.25 g，4.7 mmol)、間氯苯胺(0.69 g，5.4 mmol，1.15當量)、1-丁醇(10 mL)和乙酸(0.3mL)。將該混合物在95℃攪拌5小時，IPC LCMS指示反應完成。真空除去1-丁醇，並將該混合物用乙酸乙酯(75mL)稀釋。將有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液(25mL)洗滌，並濃縮至乾。將該殘餘物通過快速層析法純化，用DCM/乙酸乙酯(1:0至1:1)沖提，得到酯中間體4-(3-氯苯氨基)-8-甲氧基-喹啉-3-甲酸乙酯(1.05 g)。產率62%。LCMS m/e 357.1 (M+1)⁺ ;¹ H NMR, 300 MHz (CDCl₃ ) δ 1.45 (t, 3H), 4.08 (s, 3H), 4.44 (q, 2H), 6.84 (br d, 1H), 6.99 (t, 1H), 7.04 (dd, 1H), 7.05 (d, 1H), 7.16 (t, 1H), 7.20 s, 1H), 7.22 (dd, 1H), 9.29 (s, 1H) , 10.25 (s, 1H) ppm。

步驟2：

向250 mL圓底燒瓶中加入步驟1中得到的酯 (1.05 g, 2.94 mmol)、THF/MeOH (40 mL, 1:1)、4 N NaOH水溶液 (3 mL, 12.0 mmol)和水 (17 mL)。將該反應在60^o C攪拌1.0小時，IPC LCMS指示反應完成。將該混合物濃縮至乾，用2N HCl (8 mL)酸化並用水 (50 mL)稀釋。將該漿液過濾，並將濕濾餅用水洗滌。將該固體乾燥18小時，得到步驟2的酸，4-(3-氯苯氨基)-8-甲氧基-喹啉-3-甲酸 (0.77 g)，產率79%。注意：加入幾滴37% HCl用於NMR和LCMS分析。

LCMS m/e 329.0 (M+1)⁺ ;¹ H NMR, 300 MHz (d₆ -DMSO) δ 4.10 (s, 3H), 7.34 (m, 1H), 7.40 (m, 1H), 7.45 (d, 1H), 7.52 (m, 1H), 7.76 (m, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.78 (dd, 1H), 8.80 (s, 1H) , 11.78 (s, 1H) ppm (COOH質子不可見)。

步驟3：

向一個40 mL反應小瓶中加入步驟2的酸 (0.73 g, 2.22 mmol)、EDC- HCl (0.64 g, 3.33 mmol 1.5 eq)、HOBt (0.45 g, 3.33 mmol. 1.5 eq)、4-二甲氨基吡啶 (DMAP) (0.41 g, 3.33 mmol, 1.5 eq)和無水DMF (9 mL)。將該漿液在25^o C攪拌30 min並加入反式-4-氨基環己-1-甲酸叔丁酯 (0.84 g, 4.21 mmol, 1.9 eq)。將該混合物在25^o C攪拌3小時。通過LCMS進行IPC分析，3小時後顯示出16%的轉化率。將該混合物在37^o C攪拌24小時。在IPC分析顯示97%轉化率後，將該反應用乙酸乙酯 (75 ml)稀釋並用鹽水 (3 x 25 mL)洗滌。將有機層濃縮至乾。將該殘餘物通過矽膠快速層析純化，用乙酸乙酯/甲醇沖提(100/0-100/10)，得到如下所示的醯胺1 (0.96 g)。產率84 %。

LCMS m/e 510.2 (M)⁺ ;¹ H NMR, 300 MHz (CDCl₃ ) δ 1.24 (m, 2H), 1.34 (m, 2H) 1.44 (s, 9H), 1.57 (m, 3H), 2.05 (br d, 1H), 2.17 (m, 1H), 3.97 (m, 1H), 4.08 (s, 3H), 6.13 (br d, 1H), 6.80 (d, 1H), 6.89 (t, 1H), 7.02 (m, 2H), 7.14 (t, 1H), 7.25 (m, 2H), 8.84 (s, 1H) , 10.14 (s, 1H) ppm。

醯胺1

步驟4：

向一個40 mL反應小瓶中加入步驟3的醯胺1 (510 mg, 1.0 mmol)、氯甲酸4-硝基苯酯 (605 mg, 3.0 mmol, 3.0 eq)、DMAP (489 mg, 4.0 mmol, 4.0 eq)和NMP (5 mL)。將該混合物在95^o C攪拌18小時，且18小時後的IPC LCMS分析顯示90%轉化率。將該反應混合物用乙酸乙酯 (75 ml)稀釋並用水 (35 mL)和鹽水 (2x35 mL)洗滌。將該有機層濃縮至乾。將該殘餘物通過矽膠快速層析純化，用庚烷/乙酸乙酯(3:1-1:1)沖提，得到如下所示的環脲1 (350 mg)。產率65.3 %。

LCMS m/e 536.2 (M)⁺ ;¹ H NMR, 300 MHz (CDCl₃ ) δ 1.45 (s, 9H), 1.56 (qd, 2H), 1.83 ( br d, 2H), 2.10 (br d, 2H), 2.25 (tt, 1H), 2.54 (qd, 2H), 4.07 (s, 3H), 4.92 (tt, 1H), 6.48 (dd, 1H), 7.06 (dd, 1H) 7.10 (t, 1H), 7.24 (dd, 1H), 7.39 (t, 1H), 7.50 (t, 1H), 7.54 (ddd, 1H), 9.54 (s, 1H) ppm。

環脲1

步驟5：

向一個40 mL反應小瓶中加入上一步中的環脲1 (350 mg)、AcOH (20 mL)和6 N HCl (10 mL)。將該反應在20^o C攪拌18小時，通過IPC LCMS，在18小時顯示反應完成。將該反應用水 (20 mL)和DCM (75 mL)稀釋並分離各層。將有機層濃縮至乾。將該殘餘物用乙酸乙酯 (25 mL)漿化。過濾漿液。將收集的固體用庚烷洗滌並在氮氣流下在真空烘箱中乾燥24小時，得到220mg化合物I，產率為70%。

LCMS m/e 480.1 (M+1)⁺ ;

¹ H NMR, 300 MHz (CDCl₃ ) δ 1.64 (dt, 2H), 1.88 ( br d, 2H), 2.20 (br d, 2H), 2.42 (tt, 1H), 2.58 (dt, 2H), 4.07 (s, 3H), 4.95 (br t, 1H), 6.48 (dd, 1H), 7.07 (dd, 1H), 7.11 (t, 1H), 7.26 (m, 1H), 7.40 (t, 1H), 7.48 (t, 1H) 7.54 (d, 1H), 9.55 (s, 1H) ppm (COOH和HCl質子不可見)。

¹ H NMR, 300 MHz (d₆ -DMSO) δ 1.44 (br dd, 2H), 1.79 ( br d, 2H), 2.04 (br d, 2H), 2.20 (br t, 1H) 2.40 (br dd, 2H), 3.96 ( s, 3H), 4.1 (br, 水和/或HCl 和/或COOH), 4.74 (br tt, 1H), 6.37 (d, 1H), 7.20 (t, 1H), 7.27 (d, 1H), 7.52 (dt, 1H), 7.61 (t, 1H), 7.67 (表觀s, 1H), 7.68 (表觀d, 1H), 9.27 (s, 1H) ppm。

PDE4抑制測定

使用BPS BioSciences^TM 的PDE4B2螢光偏振測定試劑盒(目錄號60343)和PDE4D7 TR-FRET測定試劑盒(目錄號60708)來篩選化合物I的HCl鹽，以抑制PDE4B2和PDE4D7酶。

根據BPS BioSciences產品資訊，PDE4B2螢光偏振測定試劑盒測定是基於PDE4B2生成的螢光核苷酸單磷酸酯與結合劑的結合。磷酸二酯酶催化染料標記的環狀單磷酸酯中磷酸二酯鍵的水解。珠子選擇性結合核苷酸產物中的磷酸基團。相對於未反應的環狀單磷酸酯，這增加了核苷酸的大小。在偏振測定中，具有與線性偏振激發光平行的吸收轉換向量的染料分子被選擇性地激發。附著在快速旋轉的環狀單磷酸酯上的染料將獲得隨機的取向並發出低偏振光。附著在緩慢旋轉的核苷酸-珠子複合物上的染料將沒有時間重新取向，因此將發出高偏振光。

根據BPS Biosciences產品資訊，PDE4D7 TR-FRET測定法旨在使用TR-FRET(時間分辨螢光共振能量轉移)技術鑒定PDE4D7的抑制劑。該測定法基於FAM標記的核苷酸單磷酸酯的生成（通過磷酸二酯酶）。這些磷酸基團與鋱-標記的奈米顆粒結合，導致能量從鋱轉移到所述FAM，並在520 nm處發出螢光訊號。螢光強度的變化可以使用螢光讀取盤輕鬆測量。

PDE4B2螢光偏振測定

用於獲得以下描述的實驗資料的PDE4B2螢光偏振測定的通用測定方案包括兩個步驟：首先，將螢光標記的cAMP與含PDE4B2的樣品培養1小時。第二，在反應混合物中加入結合劑以產生螢光偏振的變化，該變化可以使用配備有用於測量螢光偏振的螢光讀取器來測量。詳細方案如下：

步驟1：用PDE緩衝液將20μMFAM-Cyclic-3´,5´-AMP儲備液稀釋100倍，製成200 nM溶液。僅做足夠量的該測定；將剩餘的20μM儲備溶液等分儲存在-20°C。將25 μl的FAM-Cyclic-3´,5´-AMP(200 nM)加入分別標明“陽性對照”、“測試抑制劑”和“基質對照”的各個孔中。分別向每個標有“基質對照”的孔中添加20μl的PDE測定緩衝液，向每個標有“空白”的孔中添加45μl的PDE測定緩衝液。向每個標有“測試抑制劑”的孔中添加5μl的抑制劑溶液。對於標有“陽性對照”、“基質對照”和“空白”的孔，添加5μl的不含抑制劑(抑制劑緩衝液)的相同溶液。在冰上融化PDE4B2。第一次融化後，短暫地旋轉裝有酶的管以回收該管中的全部內容物。將PDE4B2酶分裝成一次性使用的等分試樣。立即將剩餘的未稀釋酶等分保存在-70^oC 。注意：PDE4B2對冷凍/融化迴圈非常敏感。將PDE4B2在PDE緩衝液中稀釋至7.5 pg/μl (0.15 ng/反應)*。通過將20μl的PDE4B2 (7.5 pg/μl)加入標有“陽性對照”和“測試抑制劑”的孔中來啟動反應。*注意：最佳酶濃度可能因酶的比活性而變化。在室溫下培養1小時。

第二步：將結合劑充分混合，並用結合劑稀釋劑以1:100的比例稀釋結合劑。在每個微孔中加入100μl稀釋的結合劑。在室溫下緩慢搖動培養1小時。在配備有螢光偏振測量功能的微量滴定板讀取器上讀取樣品的螢光偏振，該讀數器能夠在485±5 nm的波長範圍內激發，並檢測528±10 nm的發射光。從所有其他值中減去空白值。

PDE4D7 TR-FRET測定

用於獲取以下描述的實驗資料的PDE4D7 TR-FRET測定的通用測定方案包括兩個步驟：首先，將螢光標記的cAMP與含有PDE4D7的樣品培養1小時。其次，將結合劑和鋱供體加入該反應混合物中，培養1小時。然後，可以使用螢光讀取器測量螢光強度。詳細操作步驟如下

步驟1：用PDE緩衝液將20μMFAM-Cyclic-3’,5’-AMP基質原液稀釋100倍，製成200 nM溶液。所製備的量僅足夠用於該測定；將剩餘的儲備溶液等分儲存在-20°C。將25μl的FAM-Cyclic-3’,5’-AMP(200 nM)加入指定的“基質對照”、“陽性對照”和“測試抑制劑”的各孔中。向指定為“僅Tb的對照”的每個孔中添加25μl的PDE測定緩衝液。向指定為“測試抑制劑”的每個孔中添加5μl抑制劑溶液。將5μl不含抑制劑(抑制劑緩衝液)的相同溶液添加到“僅Tb對照”，“基質對照”和“陽性對照”中。在冰上融化PDE4D7。第一次融化後，短暫地旋轉裝有酶的管以回收該管中的全部內容物。將PDE4D7酶分裝成一次性使用的等分試樣。立即將剩餘的未稀釋酶等分保存在-80^oC 。將PDE緩衝液中的PDE4D7稀釋成5 pg/μl(100 pg/反應)的PDE緩衝液。將20μl的PDE測定緩衝液添加到指定為“僅Tb-對照”和“基質對照”的孔中。通過向指定為“陽性對照”和“測試抑制劑”的孔中添加20μl的PDE4D7(5 pg/μl)來啟動反應。*注意：最佳酶濃度可能會隨酶的比活性而變化。

步驟2：將等體積的結合緩衝液A和結合緩衝液B混合，製成結合稀釋緩衝液。例如，將1 ml的結合緩衝液A與1 ml的結合緩衝液B混合。將結合劑充分混合，將結合劑用步驟1中製備的結合稀釋緩衝液以1:50稀釋。向步驟2中的混合物中添加Tb供體(1:1000稀釋)。向每個孔中添加100μl。在室溫緩慢搖動培養1小時。在具有TR-FRET功能的微孔讀取盤中讀取螢光強度。

使用上面描述的篩選程式，使用不同批次的化合物I * HCl，獲得以下資料。還篩選了已知的PDE4抑制劑阿普斯特(Apremilast)。

樣品	PDE4B2 IC50 (nM)	PDE4D7 IC50 (nM)
化合物I * HCl (第1批)	1.9	1.5
化合物I * HCl (第2批)	5.9	3.3
化合物I * HCl (第3批)	1.3	1.1
阿普斯特	9.8	7.6

無。

Claims

一種具有式(I)的化合物：
(I) 或其藥學上可接受的鹽。
如請求項1的化合物，其中所述化合物為式(I)化合物。
如請求項1的化合物，其中所述化合物為式(I)化合物的酸式鹽。
如請求項3的化合物，其中所述化合物為式(I)化合物的HCl鹽。
一種藥物組合物，其包含式(I)化合物：
(I) 或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體。
如請求項5的藥物組合物，其包含式(I)化合物。
如請求項5的藥物組合物，其包含式(I)化合物的酸式鹽。
如請求項7的藥物組合物，其包含式(I)化合物的HCl鹽。
一種治療受試者中的炎性疾病的方法，其包括給藥式(I)化合物：
(I) 或其藥學上可接受的鹽，其中所述炎性疾病選自病毒性、酒精性或藥物誘發的急性或暴發性肝炎、脂肪肝、酒精性和非酒精性、病毒性和非病毒性肝炎、肝硬化、自身免疫性肝炎、慢性活動性肝炎、威爾森氏症、重症肌無力、特發性口炎性腹瀉、自身免疫性炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克隆氏症、炎性腸病、內分泌性眼病、葛瑞夫茲氏症、結節病、原發性膽汁性肝硬化、胰腺炎、腎炎、內毒素休克、膿毒性休克、血液動力學休克、膿毒綜合征、缺血後再灌注損傷、瘧疾、分枝桿菌感染、腦膜炎、牛皮癬、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、嗜酸性粒細胞增多、充血性心力衰竭、纖維化疾病、囊性纖維化、肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化、惡病質、移植物排斥、移植物抗宿主病、移植排斥、癌症、涉及血管生成的疾病、自身免疫疾病、強直性脊柱炎、自身免疫性腦脊髓炎、自身免疫性造血系統疾病、溶血性貧血、再生障礙性貧血、單純紅細胞性貧血、特發性血小板減少症、系統性紅斑狼瘡(SLE)、多發性軟骨炎、硬皮病、韋格納肉芽腫病、皮肌炎、萊特氏症候群、非傳染性葡萄膜炎、自身免疫性角膜炎、乾燥性角膜結膜炎、春季角膜結膜炎、間質性肺纖維化、牛皮癬關節炎、牛皮癬和其他良性或惡性增殖性皮膚病、異位性皮炎、蕁麻疹、神經變性疾病、帕金森氏症、阿茲海默症、急性和慢性多發性硬化、癌症、病毒感染例如SARS、MERS或COVID-19、人免疫缺陷病毒(HIV)、惡病質、血栓形成、皮膚炎性疾病、骨關節炎 (OA)、骨質疏鬆症、RA、肺氣腫、慢性支氣管炎、過敏性鼻炎、輻射損傷、高氧肺泡損傷、牙周病、非胰島素依賴性糖尿病 (II型糖尿病)和胰島素依賴性糖尿病(青少年或I型糖尿病)。
一種治療受試者的疾病的方法，其包括給藥式(I)化合物：
(I) 或其藥學上可接受的鹽，其中所述疾病選自哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD) (例如慢性支氣管炎和/或肺氣腫)、異位性皮炎、蕁麻疹、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、春季結膜炎、嗜酸性肉芽腫、牛皮癬、類風濕關節炎、膿毒性休克、潰瘍性結腸炎、克隆氏症、心肌和腦的再灌注損傷、慢性腎小球腎炎、內毒素性休克、成人呼吸窘迫綜合征、多發性硬化、認知損傷 (例如在神經系統障礙中，例如阿茲海默症)、抑鬱、或疼痛。
如請求項10的方法，其中所述疾病為慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、牛皮癬或類風濕關節炎。
一種用於合成式(I)化合物或其鹽的方法：
(I) 其包括水解下式化合物
，其中R¹ 為(C1-C6)烷基，其任選被鹵素取代1-3次。
如請求項12的方法，其中R¹ 為甲基或叔丁基。
一種用於合成式(I)化合物的藥學上可接受的酸式鹽的方法：
(I) 其包括將式(I)化合物與藥學上可接受的酸在適合的溶劑中反應。
如請求項14的方法，其中所述藥學上可接受的酸為鹽酸。
一種具有下式的化合物
，其中R¹ 為(C1-C6)烷基，其任選被鹵素取代1-3次。