TW202135672A - 肉類產品之特性 - Google Patents

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凱文 Ｊ 卡塞爾
摩根 勞倫斯 利斯
馬克 Ｅ 尤哈斯
潔西卡 Ｍ 喬斯林
烏瑪 Ｓ 瓦萊蒂
艾瑞克 Ｎ 舒爾茨
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美商孟菲斯肉類公司
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Abstract

本發明提供可用於生產免屠宰肉類產品的方法及組成，及該等肉類產品之表徵。與藉由收集死亡動物之組織而獲得的習知肉類相比時，該等免屠宰肉類產品有數點不同之處。此等不同之處包括但不限於顯著減少的或實質上無：類固醇激素、抗生素或微生物污染；較低脂肪含量；無血管結構；及在室溫下及在冷藏時延長的儲存壽命。

Description

肉類產品之特性
動物肉類為世界上許多人之首選蛋白質來源。2018年美國之肉類(雞肉、火雞肉、小牛肉、羔羊肉、牛肉、豬肉)總估算消耗量為219磅/人。預期自屠宰的動物，諸如家畜、家禽及魚類收集肉類之傳統(習知)方法(通常涉及屠宰)可能不足以滿足未來的肉類需求。另外，儘管法律上可接受，但自此等來源生產肉類存在若干缺點，諸如增加的微生物污染程度，及暴露於傳統見於習知肉類產品中之激素及抗生素。習知肉類生產亦存在環境缺點，諸如熱量輸入轉化不良、溫室氣體排放、土地使用、水使用及區域污染。涉及屠宰之習知肉類生產之一個替代方案為藉由在實驗室中培養後生動物細胞來生產肉類(在本文中亦可互換地稱為基於細胞之肉類、基於細胞之肉類、基於細胞培養物之肉類、基於細胞之肉類、基於細胞之肉類或培養之肉類)。
將基於細胞之肉類產品用於食品供應鏈中將取決於多種因素，諸如肉類自身之可定量特徵，包括但不限於巨量及微量營養素概況、激素及抗生素之含量及儲存壽命。將需要與習知產品進行比較以確保相當的營養素概況，同時找出可區別的因素，諸如低/無激素或抗生素含量及微生物計數。基於細胞之肉類產品尚未市售，但最終，監管主體亦將需要意欲投入市場之肉類產品之定量及責任制(accountability)、意欲投入市場之肉類產品的銷售前食品安全性認證以及售後順應性(post-market compliance)。
基於細胞之肉類之生產及針對風味及質地之定製仍然受若干因素限制，恆定且有條不紊的生產方法很少。本文提供解決此需求及其他相關需求之組成及方法。
本文提供與由培養物中生長之細胞產生的免屠宰肉類產品之生產相關的方法及組成；此等肉類產品在本文中可互換地稱為基於細胞之肉類產品。
在一個態樣中，本文提供一種用於膳食攝入的免屠宰肉類產品，其與藉由屠宰獲得之習知肉類相比時，呈現延長的儲存壽命，其中在收集之後，儲存壽命延長不同持續時間。在一相關態樣中，本文提供一種用於膳食攝入的免屠宰肉類產品，其與藉由屠宰獲得之習知肉類相比，呈現更低的微生物污染計數，其中在收集之後，更低的微生物污染計數呈現不同持續時間。免屠宰肉類產品可為如本文所揭示之任何物種。
本文亦提供產生本發明之免屠宰肉類產品之方法，其包含以懸浮培養或以貼壁形式培養細胞，諸如纖維母細胞、肌母細胞、脂肪細胞、內皮細胞、中胚層譜系之細胞及其組合。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2020年9月25日申請之美國非臨時專利申請案第17/033,635號及2020年2月4日申請之美國臨時專利申請案第62/970,109號之優先權，該等申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。
本文提供與肉類產品之免屠宰生產相關之方法及組成，且依賴於使用基於細胞培養之方法來將細胞生長、收集且調配成肉類產品。本發明之免屠宰肉類產品與藉由屠宰獲得之習知肉類相比時存在若干差異，且通篇描述此等差異。
在詳細描述特定實施例之前，應理解，本發明不限於本文所述之特定實施例，該等特定實施例可變化。亦應理解，除非另外定義，否則本文所用之術語僅出於描述特定說明性實施例之目的，且並不意欲為限制性的。在本發明之上下文內及在使用各術語之特定上下文中，本說明書中所使用之術語一般具有其在此項技術中之一般含義。下文或本說明書中其他地方論述某些術語，以向從業者提供描述本發明之組成及方法以及如何製造及使用其之額外指導。術語之任何用途之範疇及含義將自其中使用該術語之特定上下文顯而易見。因此，本文所闡述之定義意欲提供說明性指導以確定本發明之特定實施例，但不限於特定組成或生物系統。
如本發明及隨附申請專利範圍中所用，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個指代物。
在本發明及隨附申請專利範圍通篇中，除非上下文另外需要，否則字組「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」之變化形式應理解為暗示包括所陳述之要素或要素群組，但不排除任何其他要素或要素群組。
如本文所用，在基於細胞之肉類的上下文中，術語「可食用」涵蓋生肉或未烹飪之肉類以及部分或完全烹熟之肉類。
除非提供特定定義，否則本文所述之與分子生物學、細胞生物學、分析化學及合成有機化學結合使用之命名法及其實驗室程序及技術為此項技術中熟知且常用者。標準技術可用於重組技術、分子生物學、微生物學、化學合成及化學分析。
如應用於獲得習知肉類之方式的術語「屠宰」涵蓋傳統上用於殺死動物之所有方法，目的為直接收集其肉以供膳食攝入。
如應用於本發明之基於細胞之肉類產品的術語「免屠宰」係指自培養物中之細胞起始產生肉類的過程，且該方法不涉及屠宰動物以便直接自動物獲得肉類用於膳食攝入。應理解，在一些實施例中，可能的係，用於細胞培養方法之起始細胞可在動物之屠宰或活檢之後獲得-儘管用於培養之起始細胞可以此方式獲得，但藉由收集及可能的後續調配產生於細胞培養之肉類仍視為以免屠宰方式獲得之肉類。應注意，如本文所用，一般而言，收集免屠宰基於細胞之肉類產品可以涉及使用緩衝水溶液(或其他水性溶液)將肉類自其生長位置(例如生物反應器表面，或包含在懸浮液中培養之細胞的容器中)移除，且肉類接著可以捕獲於收集裝置(例如網、篩、濾器)中。在一些實施例中，肉類可藉由物理方法(諸如刮)、酶方法及/或化學方法收集。在一些實施例中，肉類可以藉由上文所提及之方法中之任一者收集，且隨後用緩衝溶液(或其他水性溶液)沖洗。
片語「基於細胞之肉類」、「免屠宰基於細胞之肉類」、「活體外產生之肉類」、「活體外基於細胞之肉類」、「培養之肉類」、「免屠宰培養之肉類」、「活體外產生之培養之肉類」、「活體外肉類」、「活體外培養之肉類」及其他類似此等片語在本文中可互換使用，且係指自培養物中之細胞起始，活體外產生之肉類，且該方法不涉及屠宰動物以便直接自動物獲得肉類用於膳食攝入。 I. 免屠宰基於細胞之肉類的產生
本文提供以免屠宰方式生產基於細胞之肉類產品之方法。 A. 細胞
本發明之免屠宰基於細胞之肉類產品為藉由在培養物中培養天然存在、轉殖基因或經修飾之細胞產生的組合物。
用於本發明方法之細胞可為初級細胞或細胞株。本文所提供之方法適用於培養物中之任何後生動物細胞。一般而言，細胞可來自其組織適用於膳食攝入之任何後生動物物種。在一些實施例中，細胞展現骨胳肌肉組織標準(例如肌母細胞)之能力。在其他實施例中，細胞不展示骨胳肌肉組織標準之能力。
在一些實施例中，細胞源於意欲用於人類或非人類膳食攝入之任何非人類動物物種。在一些實施例中，細胞可源自禽類、綿羊、山羊、豬、牛或魚類來源。在一些實施例中，細胞可為家畜、家禽、禽類、野味或水生物種。
在一些實施例中，細胞來自家畜，諸如家牛、豬、綿羊、山羊、駱駝、水牛、兔及其類似動物。在一些實施例中，細胞來自家禽，諸如家雞、火雞、鴨、鵝、鴿及其類似動物。在一些實施例中，細胞來自野味物種，諸如野鹿、鶉雞類鳥、水禽、野兔及其類似動物。在一些實施例中，細胞來自自野生漁業或水產養殖業商業收購或釣來之水生物種或半水生物種，包括某些魚類、甲殼動物、軟體動物、頭足類、鯨類、鱷目、龜類、蛙類及其類似動物。
在一些實施例中，細胞來自外來、保護或滅種動物物種。在一些實施例中，細胞來自原雞(Gallus gallus )、家雞(Gallus domesticus )、溫帶牛(Bos taurus )、野豬(Sous scrofa )、火雞(Meleagris gallopavo )、綠頭鴨(Anas platyrynchos )、大西洋鮭(Salmo salar )、鮪(Thunnus thynnus )、綿羊(Ovis aries )、鶉(Coturnix )、家山羊(Capra aegagrus hircus )或美洲螯龍蝦(Homarus americanus )。因此，本發明之例示性免屠宰基於細胞之肉類產品包括禽類肉類產品、雞肉產品、鴨肉產品及牛肉產品。
在一些實施例中，細胞為初級幹細胞、自身更新幹細胞、胚胎幹細胞、多能幹細胞、誘導多能幹細胞或轉分化多能幹細胞。
在一些實施例中，細胞可藉由基因開關(genetic switch)修飾，以誘導細胞快速且高效轉化為骨胳肌肉，以用於培養之肉類生產。
在一些實施例中，細胞為肌原性細胞，預定變成肌肉或肌樣細胞。在一些實施例中，肌原性細胞原生地為肌原性，例如肌母細胞。原生肌原性細胞包括但不限於肌母細胞、肌細胞、衛星細胞、側群細胞、肌源性幹細胞、間葉幹細胞、肌原性外被細胞或中成血管細胞。
在一些實施例中，細胞為骨胳肌肉譜系。骨胳肌肉譜系之細胞包括肌母細胞、肌細胞及骨胳肌肉祖細胞，亦稱為肌原性祖細胞，其包括衛星細胞、側群細胞、肌源性幹細胞、間葉幹細胞、肌原性外被細胞及中成血管細胞。
在一些實施例中，細胞為非肌原性細胞，且此等非肌原性細胞可經程式化成為肌原性細胞，例如細胞可包含經修飾以表現一或多種肌原性轉錄因子的纖維母細胞。在例示性實施例中，肌原性轉錄因子包括MYOD1、MYOG、MYF5、MYF6、PAX3、PAX7、旁系同源物、直系同源物及其基因變異體。在一些實施例中，細胞經修飾以表現一或多種肌原性轉錄因子，如PCT公開案WO/2015/066377中所描述，其以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，細胞包含本文所述之細胞群體之混合物，例如共培養中之纖維發生細胞(fibrogenic cell)及肌原性細胞之混合物，例如共培養中之纖維母細胞與肌母細胞之混合物。在一些實施例中，用於生產基於細胞之肉類之細胞為懸浮共培養中之纖維母細胞與肌母細胞之混合物。在一些實施例中，用於生產基於細胞之肉類之細胞為貼壁共培養中之纖維母細胞與肌母細胞之混合物。在一些實施例中，共培養中之細胞包含額外細胞類型，諸如脂肪細胞、內皮細胞及一般來自中胚層譜系之細胞。
在一些共培養實施例中，細胞在懸浮共培養中，在一些實施例中，細胞在貼壁共培養中，且在一些實施例中，培養處理利用兩種技術。本文提供之共培養物包含至少纖維母細胞與肌母細胞之混合物。在一些實施例中，纖維母細胞與肌母細胞(稱為F及M)之比率在約5F:95M至約95F:5M範圍內。在例示性實施例中，纖維母細胞與肌母細胞之比率為約5F:95M、10F:90M、15F:85M、20F:80M、25F:75M、30F:70M、35F:65M、40F:60M、45F:55M、50F:50M、55F:45M、60F:40M、65F:35M、70F:30M、75F:25M、80F:20M、85F:15M、90F:10M或甚至約95F:5M。
在一些實施例中，細胞經基因修飾以抑制例如HIPPO信號傳導路徑之路徑。抑制HIPPO信號傳導路徑之例示性方法如PCT申請案第PCT/US2018/031276號中所描述，該申請案以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，細胞經修飾以表現端粒酶逆轉錄酶(TERT)及/或抑制週期素依賴性激酶抑制因子(CKI)。在一些實施例中，細胞經修飾以表現TERT及/或抑制週期素依賴性激酶抑制因子，如PCT公開案WO 2017/124100中所述，該公開案以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，細胞經修飾以表現麩醯胺酸合成酶(GS)、胰島素樣生長因子(IGF)及/或白蛋白。修飾細胞以表現GS、IGF及/或白蛋白之例示性方法描述於PCT申請案第PCT/US2018/042187號中，該申請案以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，細胞可包含本文所述之修飾之任何組合。 B. 培養基礎設施
如本文中所提及，培養基礎設施係指其中培養或培育細胞以提供二維或三維肉類產品之環境。
培養基礎設施包括但不限於滾瓶、管、圓筒、燒瓶、培養皿(petri-dish)、多孔盤、皿、甕、培育箱、生物反應器及工業醱酵器。
儘管培養基礎設施自身可具有三維結構或形狀，但培養基礎設施中培養之細胞可形成單層細胞。本發明之組成及方法可促進後生動物細胞在培養基礎設施中三維生長，以提供三維細胞生物質之無骨架自組裝(scaffold-less self-assembly)。
三維培養基礎設施可視需要塑成不同大小、形狀及形式，以提供肌肉細胞生長的形狀及形式且類似於不同類型之肌肉組織，諸如牛排、里脊肉、小腿肉、雞胸肉、雞腿下段、羊排、魚排、龍蝦尾等。三維培養基礎設施可由無毒，以使得在攝入時可不有害的天然或合成生物材料製成。天然生物材料可包括例如膠原蛋白、纖維結合蛋白、層黏連蛋白或其他細胞外基質。合成生物材料可包括例如羥基磷灰石、海藻酸酯、聚乙醇酸、聚乳酸或其共聚物。三維培養基礎設施可形成為固體或半固體載體。
培養基礎設施可具有任何規模，且支持任何體積之細胞生物質及培養試劑。在一些實施例中，培養基礎設施在約10 µL至約100,000 L範圍內。在例示性實施例中，培養基礎設施為約10 µL、約100 µL、約1 mL、約10 mL、約100 mL、約1 L、約10 L、約100 L、約1000 L、約10,000 L或甚至約100,000 L。
在一些實施例中，培養基礎設施包含基板。培養基礎設施可包含可滲透基板(例如生理溶液可滲透)或不可滲透基板(例如生理溶液不可滲透)。基板可為扁平的、凹面的或凸面的。基板可經紋理化以便促進細胞生長及細胞膜片附接。
在一些實施例中，培養基礎設施中之細胞培養可誘發細胞外基質(ECM)之產生，該細胞外基質可充當自體骨架以引導三維細胞生長，例如以引導細胞在垂直於基板之平面上之附接、增殖及肥大。
在一些實施例中，培養基礎設施不包含外源添加之骨架以促進三維細胞生物質之自組裝。在一些實施例中，培養基礎設施不包含外源性骨架，諸如水凝膠或軟瓊脂。 C. 培養條件
用於產生基於細胞之肉類的培養條件一般為無菌(aseptic)且滅菌(sterile)的。
細胞可以貼壁培養形式生長以形成細胞膜片或可以懸浮培養形式生長以形成細胞集結粒。表1提供可生產之各種肉類產品之例示性培養方法。
在一些實施例中，培養基實質上不含血清或源於動物之其他組分。
因此，在一些實施例中，本文提供一種生產免屠宰基於細胞之肉類之方法，其包含：(a)提供來自非人類生物體之細胞；(b)在培養基中在細胞在懸浮培養物或貼壁培養物中生長的條件下培養細胞，其中該培養基實質上不含血清及源於動物之其他組分；及視情況(c)分離細胞且產生免屠宰肉類產品。在一些實施例中，培養中之細胞包含纖維母細胞、肌母細胞或纖維母細胞與肌母細胞之共培養物；在一些實施例中，共培養中之細胞包含額外細胞類型，諸如脂肪細胞、內皮細胞及一般來自中胚層譜系之細胞。
在一些實施例中，本文提供一種生產免屠宰肉類產品的方法，該肉類產品與藉由屠宰獲得之習知肉類相比呈現延長的儲存壽命及/或更低微生物含量，該方法包含：(a)提供來自非人類生物體之細胞；(b)在懸浮培養條件或貼壁培養條件下在培養基中培養細胞，其中該培養基實質上不含血清及源於動物之其他組分；及視情況(c)分離細胞且產生免屠宰肉類產品。在一些實施例中，培養中之細胞包含纖維母細胞、肌母細胞或纖維母細胞與肌母細胞之共培養物；在一些實施例中，共培養中之細胞包含額外細胞類型，諸如脂肪細胞、內皮細胞及一般來自中胚層譜系之細胞。
在一些實施例中，細胞在懸浮培養中，例如在搖瓶中生長，且培養產物產生細胞集結粒。在一些實施例中，產物可藉由物理方法(例如離心、重力輔助沈降)、化學方法、酶方法、沈降、濃縮、絮凝及其類似方法獲得。在其他實施例中，細胞在貼壁培養中生長，且培養產物為細胞膜片。 D. 收集及調配
在一些實施例中，自生物反應器(或其他細胞生長設備)收集本發明之免屠宰基於細胞之肉類且在調配之前評估其特性。在一些實施例中，收集在無菌條件下進行(例如在層流罩中使用無菌手套及工作條件)。
本發明之免屠宰基於細胞之肉類可在收集後調配(例如操縱、加工)成特定可食用食品類型，包括但不限於以下的任何種類的產品：肉丸、肉餅、魚漿、肉排、香腸、肉塊(loaf)、嫩肉(tender)、菲力型產品(filet-style product)、熱狗、肉粒(nugget)等。本發明之免屠宰基於細胞之肉類調配產品亦可包括已調味或乾燥之肉類，諸如肉乾或點心棒型產品，例如以便進一步延長儲存壽命。本發明之免屠宰基於細胞之肉類調配產品亦可包含額外成分(添加劑)，諸如黏合劑、香辛料、穩定劑、防腐劑及其類似物。在例示性實施例中，調配包括向所收集之基於細胞之肉類添加以下成分中之一或多者：活性小麥麩質、氯化鈣、i-角叉菜膠、風味前驅混合物、轉麩醯胺酸酶粉末(麥芽糊精、酶)、蛋白質濃縮物、蛋白質分離物、多醣、角叉菜膠、調味劑、酵母提取物、酶、纖維、組織化蛋白質、果膠、澱粉。 II. 基於細胞之肉類之特徵
本文提供免屠宰基於細胞之肉類產品，其包含使其區別於習知肉類(其涉及活動物之屠宰或其他方式的死亡)之多種獨特特徵。方法亦可經調適以實現所要性狀，諸如健康益處及感官益處。不同之處至少包括基於細胞之肉類之延長的儲存壽命、基於細胞之肉類中之激素、抗生素之含量及微生物污染程度，且亦可包括進一步定製，諸如改變脂肪含量、胺基酸概況、質地及其類似者。此等不同之處在下文中依次考慮。 A. 激素
相比於習知肉類，本發明之免屠宰基於細胞之肉類包含顯著更低量之類固醇激素。舉例而言，使用所描述培養方法，不必向培養物中添加任何外源性激素，由此在所得肉類中產生較低激素含量或不存在激素。因此，在一些實施例中，免屠宰基於細胞之肉類產品實質上不含類固醇激素(亦即含有極少或不含類固醇激素)。此與針對習知肉類生產而飼養之動物形成對比，其中通常向該等動物飼餵或以其他方式投與外源性激素。應注意，即使係未飼餵或投與任何外源性激素之針對習知肉類生產而飼養之動物(例如，雞、家畜)，簡單地歸因於動物之腺系統之基本產生量，該等動物仍具有睪固酮、雌二醇、孕酮，以及一系列其他激素。雌二醇、孕酮及睪固酮係習知肉類中視動物性別而定以某較低含量存在之天然激素。相比之下，本發明之基於細胞之肉類包含較低含量之類固醇激素或甚至實質上不含類固醇激素。舉例而言，17β-雌二醇之ELISA結果指示，免屠宰雞肉樣品相較於習知雞肉產生之濃度較低。藉由使用ELISA套組，免屠宰雞肉的17β-雌二醇含量係平均35 ng雌二醇/kg濕質量，而獲自當地雜貨店的習知雞肉係90 ng/kg雌二醇/kg濕質量。
因此，在一些實施例中，本發明之基於細胞之肉類包含不超過約1 μg、0.5 μg、0.1 μg、0.05 μg、0.01 μg、0.005 μg或甚至約0.001 μg類固醇激素/kg乾質量之基於細胞之肉類。在一些實施例中，基於細胞之肉類包含不超過約1 μg、0.5 μg、0.1 μg、0.05 μg、0.01 μg、0.005 μg或甚至約0.001 μg孕酮/kg乾質量之基於細胞之肉類。在一些實施例中，基於細胞之肉類包含不超過約1 μg、0.5 μg、0.1 μg、0.05 μg、0.01 μg、0.005 μg或甚至約0.001 μg睪固酮/kg乾質量之基於細胞之肉類。在一些實施例中，基於細胞之肉類包含不超過約0.05 μg、0.01 μg、0.005 μg或甚至約0.001 μg雌二醇/kg乾質量之基於細胞之肉類。在例示性實施例中，基於細胞之肉類包含不超過約35 ng雌二醇/kg乾質量之基於細胞之肉類。 B. 微生物污染
使用所描述之培養方法，免屠宰基於細胞之肉類產品實質上不含微生物污染物。「實質上不含」意謂微生物或寄生蟲之濃度低於臨床上顯著之污染程度，例如低於攝取將引起疾病或不利健康狀況之程度。此等低程度之污染使得儲存壽命增加。此與預定屠宰的針對習知肉類生產飼養之動物形成對比。如本文所用，微生物污染包括但不限於細菌、真菌、病毒、原蟲及其組合。有害微生物可包括大腸菌群(糞便細菌)、大腸桿菌、酵母、黴菌、曲狀桿菌(Campylobacter)、沙門氏菌(Salmonella)、李氏菌(Listeria)、腸桿菌(Enterobacteriaceae)、陰溝腸桿菌複合物(Enterobacter cloacae complex)、A型流感病毒、B型流感病毒及葡萄球菌(Staph)。熟習此項技術者應理解，可量測任何污染物。
應注意，與藉由屠宰獲得之習知肉類相比，與本發明之免屠宰基於細胞之肉類產品相關的更低微生物污染在所有溫度下呈現：例如約0℃至約30℃，例如在標準家庭冰箱溫度(例如約2℃至約6℃)下及在室溫(例如約22℃至約25℃)下。亦應注意，與藉由屠宰獲得之習知肉類相比，與本發明之免屠宰基於細胞之肉類產品相關的更低微生物污染在收集之後呈現至少3天、7天、14天、30天或148天，在收集之後呈現至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20週及更多週。亦應注意，在無菌條件下以及在非無菌條件下觀測到更低污染，且當在無後續調配之情況下在收集後量測肉類時，以及當在收集後及調配後時量測肉類時，觀測到更低污染。
此外，培養物中生長之細胞可實質上不含寄生蟲，諸如絛蟲，其感染整個動物之細胞且經由攝食未充分烹熟之肉類轉移至人類。
無菌技術亦可用於在肉類產品離開生物生產線時包裝該等肉類產品。此等品質保證可藉由此項技術中已知之微生物體或化學物質的標準分析來監測。
相比於習知肉類，本發明之免屠宰基於細胞之肉類包含顯著較低量之微生物污染。實例3、實例9、表12及13提供免屠宰基於細胞之肉類相對於藉由屠宰獲得之習知雜貨店肉類中之污染物的比較。習知鴨肉且尤其習知牛肉具有顯著較高量之微生物污染。圖3展示指示細菌菌落之代表性培養盤，其尤其展示基於細胞之鴨肉、習知牛肉及習知雞肉之結果。
因此，在一些實施例中，本文提供一種用於膳食攝入的免屠宰肉類產品，其與藉由屠宰獲得之習知肉類相比，呈現更低的微生物污染計數，其中在收集之後，更低的微生物污染計數呈現至少3天。
在一些實施例中，更低的微生物污染計數在收集之後呈現至少2、3、4、5、6、7、10、14、15、20、21、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、148、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或至少250天。
在一些實施例中，微生物污染計數係在收集之後且在調配之前測定。在其他實施例中，微生物污染計數係在調配之後測定。
在一些實施例中，免屠宰肉類產品維持在非無菌條件下且仍呈現更低的微生物污染計數。
在一些實施例中，微生物污染計數係藉由量測總微生物計數(TC)、大腸桿菌/大腸菌群計數(EC)、大腸桿菌微生物計數、大腸菌群計數或大腸桿菌/大腸菌群計數來測定。在一些實施例中，微生物污染計數係藉由量測其他微生物，包括但不限於黴菌、酵母、沙門氏菌、李氏菌及葡萄球菌之計數來測定。
在一些實施例中，免屠宰肉類產品包含： (a)    根據FDA細菌學分析手冊(FDA bacteriological analytical manual)所測定，不超過100 cfus微生物污染/g濕質量； (b)    根據FDA細菌學分析手冊所測定，不超過10 cfus大腸菌群污染/g濕質量； (c)    根據FDA細菌學分析手冊所測定，不超過10 cfus大腸桿菌污染/g濕質量； (d)    根據FDA細菌學分析手冊所測定，不超過10 cfus酵母污染/g濕質量； (e)    根據FDA細菌學分析手冊所測定，不超過10 cfus黴菌污染/g濕質量； (f)    根據FDA細菌學分析手冊所測定，無可偵測量之沙門氏菌污染/25 g濕質量； (g)    根據AOAC 2004.06方法所測定，無可偵測量之李氏菌污染/25 g濕質量； (h)    根據AOAC 2003.07方法所測定，不超過10 cfus葡萄球菌污染/g濕質量；及/或 (i)    根據CompactDry方案所測定，不超過55 cfus總好氧性生菌數(aerobic count)污染/g濕質量。
在一些實施例中，免屠宰肉類產品包含免屠宰雞肉、鴨肉或牛肉，且習知肉類包含藉由屠宰獲得之雞肉、鴨肉或牛肉。
實例3及9提供多種例示性方案，在該等方案下觀測儲存壽命及微生物污染。熟習此項技術者應瞭解，存在多種量測微生物污染之方法。其至少由以下文本提供：(1) FDA細菌學分析手冊(BAM) (第8版，修訂A/1998)及(2) USDA食品安全檢驗局微生物學實驗室指南(USDA Food Safety and Inspection Service Microbiology Laboratory Guidebook)。AOAC亦至少提供以下用於測定微生物污染之測試： a. 腸桿菌，AOAC 2003.01 b. 大腸桿菌及大腸菌群，AOAC 998.08 c. 酵母及黴菌，FDA BAM第18章 d. 李氏菌，AOAC 2004.06 e. 沙門氏菌(25 g)，AOAC 2011.03 f. 曲狀桿菌，AOAC RI 051201 g. AOAC 2003.07 -葡萄球菌 h. 好氧性生菌數，AOAC 990.12 i. 沙門氏菌，AOAC 2013.02，RI PTM 081201 j. 李氏菌物種，AOAC-RI PTM #081401 k. 好氧性生菌數，AOAC 990.12 l. 大腸菌群及大腸桿菌，AOAC 991.14 m.    Y及M計數，AOAC 2014.05 C. 抗生素
與習知肉類相比，本發明之免屠宰基於細胞之肉類包含顯著較低量之抗生素，或實質上不含抗生素，或完全不含抗生素。舉例而言，使用所描述培養方法，可控制或消除培養中抗生素之使用，由此在所得基於細胞之肉類中產生較低抗生素含量或不存在抗生素。因此，在一些實施例中，免屠宰基於細胞之肉類產品實質上不含抗生素(亦即含有極少或不含抗生素)。此與針對習知肉類生產而飼養之動物形成對比，其中通常向該等動物飼餵或以其他方式投與外源性抗生素。
因此，在一些實施例中，本發明之基於細胞之肉類包含不超過約100 μg抗生素/kg乾質量之基於細胞之肉類、90 μg抗生素/kg乾質量之基於細胞之肉類、80 μg抗生素/kg乾質量之基於細胞之肉類、70 μg抗生素/kg乾質量之基於細胞之肉類、60 μg抗生素/kg乾質量之基於細胞之肉類、50 μg抗生素/kg乾質量之基於細胞之肉類、40 μg抗生素/kg乾質量之基於細胞之肉類、30 μg抗生素/kg乾質量之基於細胞之肉類、20 μg抗生素/kg乾質量之基於細胞之肉類、10 μg抗生素/kg乾質量之基於細胞之肉類、5 μg抗生素/kg乾質量之基於細胞之肉類、1 μg抗生素/kg乾質量之基於細胞之肉類、0.5 μg抗生素/kg乾質量之基於細胞之肉類、0.1 μg抗生素/kg乾質量之基於細胞之肉類、0.05 μg抗生素/kg乾質量之基於細胞之肉類，或甚至約0.01 μg/kg抗生素/kg乾質量之基於細胞之肉類。 D. 脂質
相比於習知肉類，本發明之免屠宰基於細胞之肉類包含更低平均總脂質(脂肪)含量。基於細胞之肉類一般具有約0.5%至約5.0%的平均總脂肪含量，而習知肉類中之脂肪酸含量廣泛變化且視肉類之分切部位(cut of meat)而定，可介於約3%至約18%之範圍內。
表14展示若干例示性免屠宰基於細胞之肉類樣品的總脂肪酸分析。圖4展示跨越例示性免屠宰基於細胞之肉類樣品之飽和、單不飽和及多不飽和脂肪酸的總脂肪酸組成。
因此，在一些實施例中，當以基於細胞之肉類之總濕質量的百分比量測時，本發明之基於細胞之肉類包含約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.8%、約0.9%、約1.0%、約1.1%、約1.2%、約1.3%、約1.4%、約1.5%、約1.6%、約1.7%、約1.8%、約1.9%、約2.0%、約2.1%、約2.2%、約2.3%、約2.4%、約2.5%、約2.6%、約2.7%、約2.8%、約2.9%、約3.0%、約3.1%、約3.2%、約3.3%、約3.4%、約3.5%、約3.6%、約3.7%、約3.8%、約3.9%、約4.0%、約4.1%、約4.2%、約4.3%、約4.4%、約4.5%、約4.6%、約4.7%、約4.8%、約4.9%或約5.0%的平均總脂肪含量。
在一些例示性實施例中，基於細胞之肉類包含呈指定量之以下脂肪酸類別中之一或多者，該量表示為該類別相對於總脂肪酸之%：a. 在約10%至約60%，例如約20%至約50%、約30%至約40%、約10%至約50%、約10%至約40%、約10%至約30%及/或約10%至約20%之間的飽和脂肪酸含量。b. 在約10%至約60%，例如約20%至約50%、約30%至約40%、約10%至約50%、約10%至約40%、約10%至約30%及/或約10%至約20%之間的單不飽和脂肪酸含量。c. 在約1%至約50%，例如約10%至約40%、約20%至約30%、約30%至約20%及/或約40%至約10%之間的多不飽和脂肪酸含量。
在一些實施例中，本發明之基於細胞之肉類包含約2:1至約18:1比率之ω 6:ω 3脂肪酸類別。(α-次亞麻油酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)及二十二碳六烯酸(DHA)為主要之ω 3脂肪酸)。因此，在一些實施例中，本發明之基於細胞之肉類包含約2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1或約18:1比率之ω 6:ω 3脂肪酸類別。另一方面，習知肉類(例如習知雞肉)包含＞18:1比率之ω 6:ω 3脂肪酸類別。
當與習知肉類相比時，基於細胞之肉類的更低脂肪含量提供更低熱量含量、更低ω 6:ω 3比率以及其他相關健康益處。
免屠宰基於細胞之肉類生產可進一步經定製以實現所要概況。收集後乾化可進一步增加脂肪含量及/或其他固體組分。增加生長培養基中之脂質含量亦可增加脂肪含量。
在生產期間可改變本發明之基於細胞之肉類之風味及香味。一般而言，肉類中更高比例之不飽和脂肪酸產生更多不飽和揮發性醛，且此等化合物在確定此等物種之特定香味方面可為重要的。
因此，本文所提供之方法可經由至少以下機制改變特定脂肪酸概況以獲得所要風味特徵或脂肪酸概況，諸如ω 3:ω 6比率：a. 在一些實施例中，培養基中血清之存在可影響脂肪酸概況。圖7展示無血清培養基相對於含有血清之培養基中之脂肪酸百分比。b. 在一些實施例中，不同來源之血清可用於培養以在免屠宰基於細胞之肉類產品中獲得不同脂肪酸概況。(圖8)c. 在一些實施例中，使用來自多株群體之經分離純系亦可用於改變脂肪酸概況。(圖9)。d. 在一些實施例中，脂肪酸概況藉由改變培養基之脂肪酸組成或藉由添加培養基組分來調節，該等培養基組分包括添加以改變脂肪酸組成之化合物，諸如但不限於促效劑(例如，LXRβ之促效劑)或核黃素。此等對培養基之調節可影響脂肪概況。(圖10，圖11)。e. 在一些實施例中，脂肪酸概況藉由培養中之細胞之組成調節。因此，在一些實施例中，培養中之纖維母細胞、培養中之肌母細胞或共培養中之纖維母細胞/肌母細胞可以進一步經修改以包括脂肪細胞。
在圖9中，組織(細胞膜片)使用共培養方法(描述於表1中之方法15中)使用具有提高含量之調節特定生物化學路徑的各種化合物之培養基形成。將核黃素、維生素及常見輔因子滴定至細胞培養基中。展示對脂肪酸濃度之整體影響。
本發明之基於細胞之肉類中的較低含量之脂肪酸亦例如藉由使得肉類中產生較低含量之脂肪酸氧化產物，來促進肉類之儲存壽命延長。 E. 胺基酸
亦期望本發明之免屠宰基於細胞之肉類產品與習知肉類產品共有類似性。本發明之免屠宰基於細胞之肉類產品一般包含約50 g至約95 g重量之胺基酸/100 g乾質量。舉例而言，本發明之基於細胞之肉類包含呈指定量(量表示為g胺基酸/100 g總胺基酸)的以下胺基酸中之一或多者：色胺酸約1至約2.2，蘇胺酸約4.6至6.5，異白胺酸約3.8至約5，白胺酸約6.1至約8.9，離胺酸約5.7至約8.8，甲硫胺酸約0.14至約3.0，半胱胺酸約1.5至約1.8，苯丙胺酸約3.7至約4.8，酪胺酸約3.0至約5.2，纈胺酸約4.8至約6.1，精胺酸約7.0至約8.0，組胺酸約2.5至約4，丙胺酸約5.0至約6.3，天冬胺酸約8.6至約10.4，麩胺酸約12.5至約14.6，甘胺酸約4.6至約9.8，脯胺酸約4.6至約6.8，絲胺酸4.4至5.3，及/或羥脯胺酸約0.0至4.0。
在一些實施例中，相比於習知對應物，由纖維母細胞單培養物產生之基於細胞之肉類中的羥脯胺酸含量升高。不希望受任何理論或機制束縛，羥脯胺酸含量之此等增加可歸因於由纖維母細胞分泌細胞外基質組分引起的較高程度之膠原蛋白形成。在一些實施例中，當將肌母細胞(MB)以多株細胞混合物(肌母細胞之混合群體)或單株肌母細胞混合物(自混合群體分離且擴增之單細胞)形式添加至培養系統中時，羥脯胺酸濃度可降低至接近習知肉類之羥脯胺酸濃度。應注意，在本文所提供之實施例中，亦可調節羥脯胺酸濃度以改變肉類產品之質地。 F. 維生素E含量
相比於習知肉類，本發明之免屠宰基於細胞之肉類包含較高維生素E (α-生育酚)含量。在一些實施例中，本發明之免屠宰基於細胞之肉類產品包含至少約0.5 mg、至少約0.6 mg、至少約0.7 mg、至少約0.8 mg、至少約0.9 mg或至少約1.0 mg/維生素E/100 g濕質量之基於細胞之肉類。 G. 水分含量
本發明之免屠宰基於細胞之肉類產品一般具有約65%至約95%之水分含量。在一些實施例中，水分含量係在收集之後但在調配之前量測。在其他實施例中，水分含量係在調配之後量測。 H. 基於細胞之肉類之架構
免屠宰基於細胞之肉類與習知肉類之間存在另外的不同之處。儘管細胞不需要純粹出於肉類目的(如本文所述)生長才能具有將允許移植及功能之功能特徵，但在某些情況下，該等細胞可進一步經工程改造以包括將賦予功能性之組分。
除非另外操縱以包括，否則基於細胞之肉類不包括血管組織，諸如靜脈及動脈，而習知肉類含有此等血管結構，且含有在血管結構中存在之血液。因此，在一些實施例中，基於細胞之肉類實質上不含任何血管結構。如本文一般考慮，血管結構包括血液及/或淋巴液。
同樣地，除非另外操縱以包括，否則基於細胞之肉類儘管由肌肉或肌樣組織構成，但不包含有功能性之肌肉組織。因此，在一些實施例中，基於細胞之肉類不包含有功能性之肌肉組織。
應注意，若需要如此，則諸如血管結構(其可含有血液、淋巴等)及功能性肌肉組織之特徵可進一步工程改造至基於細胞之肉類中。舉例而言，可以利用引起血管芽生(sprouting)之方案來將血管結構引入本發明之免屠宰肉類產品中，且允許增加對肉類產品之灌注。 I. 風味
肉類之脂肪酸組成一般影響整體肉類品質且影響肉類之風味、多汁性及柔嫩度(Wood等人，Manipulating meat quality and composition. Proceedings of the Nutrition Society. 1999;58:363-370. DOI: org/10.1017/S009665199000488)。特定脂肪酸，諸如MUFA油酸(18:1 ω9)及MUFA棕櫚油酸(16:1 ω9)為通常主要與良好風味相關之脂肪酸。
更肥美之肉類通常為更美味的，但伴隨著更大脂肪含量，將存在更大之不利脂肪概況風險，該等脂肪概況屬於肉類驅動關鍵官能概況，其不僅驅動消費者偏好，且亦確立獨特物種鑑別。然而，某些脂肪類型與較大的諸如心臟病之不利健康後果的風險相關。因此，可在培養物中調節整體細胞培養基組成、補充至培養物中之脂肪酸及/或肌母細胞/纖維母細胞/脂肪細胞/內皮細胞/其他中胚層譜系細胞之比率以產生具有最佳風味及健康作用之免屠宰基於細胞之肉類產品。在例示性實施例中，改變共培養物中脂肪細胞之比率。調節可藉由選擇肌原性細胞之特定純系、控制最初接種於培養物中之細胞之比率及/或藉由視需要改變生長因子或作用於細胞之其他培養基組分之濃度及比率來實現。特定脂肪酸，如MUFA油酸(18:1 ω9)，可經由培養基組成及營養設計富集。 J. 補充物
在其他實施例中，可添加諸如維生素之其他營養素以增加肉類之營養價值。舉例而言，此可經由外源性添加營養素至生長培養基或經由基因工程改造技術實現。 K. 烹熟咀嚼力及硬度
可修飾本發明之免屠宰免屠宰基於細胞之肉類產品以獲得某些質地特徵，諸如所要烹熟咀嚼力或烹熟硬度。表17展示例示性基於細胞之肉類樣品之烹熟質地。圖13展示由肌母細胞:纖維母細胞共培養物或纖維母細胞單培養物中之細胞產生之例示性肉類的烹熟硬度。
本發明之基於細胞之肉類之烹熟咀嚼力可在約100 g至5000 g範圍內。在一些例示性實施例中，如自培養物中之貼壁細胞收集之本發明之基於細胞之肉類的烹熟咀嚼力在約450 g至約3000 g範圍內。在一些實施例中，如自培養物中之貼壁細胞收集之本發明之基於細胞之肉類的烹熟硬度在約2500 g至約2000 g範圍內。在一些實施例中，本發明之基於細胞之肉類的烹熟咀嚼力及/或烹熟硬度處於或低於偵測極限，例如在其中自懸浮培養物中生長之細胞收集肉類之一些實施例中。 L. 儲存壽命
每年，顯著部分之肉類及肉類產品均會被浪費。據估計，在消費者、零售商及餐飲業層級，浪費了大約35億kg之家禽及肉類，其具有實質性經濟及環境影響(Kantor等人(1997))。此損失之顯著部分係歸因於微生物腐敗。
習知肉類容易腐爛且具有相對較短之儲存壽命穩定性(在本文中可互換地簡稱為「儲存壽命」)。習知肉類之組成及用於屠宰及收集肉類之條件一般產生對包括糞便細菌(例如大腸菌群細菌)之各種微生物體有利之生長條件；習知肉類亦由於化學、氧化及酶活性而極易於腐敗。因此，如本文所用，在一些實施例中，儲存壽命為食品保持適於膳食攝入同時仍可口(例如在攝入後不引起任何疾病或不利健康影響，諸如嘔吐、腹瀉、噁心及其類似者，且不產生將表明腐爛過程(例如微生物誘發之腐爛、分子腐爛、物理腐爛)已開始之氣味)的時間量。
不希望受理論或機制約束，一般認為微生物生長、氧化及酶促自溶為造成肉類腐敗，從而減少儲存壽命的三種機制。肉類之脂肪、蛋白質及碳水化合物之分解使得產生不良氣味及不良風味，且此等不良氣味及不良風味使得肉類不適於人類攝食。視物種及收集之方法而定，習知肉類產品在相對短的儲存時間段之後對於攝食而言不安全。舉例而言，雞肉應在購買數天內烹飪。熟家禽可安全地儲存於冰箱中持續僅約3至5天，且儲存於冷凍器中持續至多約3至5個月。因此，必需控制肉類腐敗以增加其儲存壽命且維持其營養價值、質地及風味。
習知肉類之儲存壽命通常藉由各種方法增加，包括添加防腐劑、醃漬、鹽漬、脫水、罐裝、醱酵或在暗處儲存。不使用此等方法中之任一者之情況下，本發明之基於細胞之肉類便呈現延長的儲存壽命，但應注意，可添加此等方法以甚至進一步提高儲存壽命。因此，在一些實施例中，本發明之基於細胞之肉類呈現指示相比於藉由屠宰獲得之習知肉類，儲存壽命增加之量測值，其中習知肉類未加工(例如未進一步施加方法，諸如上文所列之彼等方法)。
免屠宰基於細胞之肉類，經由其生產方法及組成，產生相比於習知肉類產品具有延長的儲存壽命且不需要添加防腐劑以獲得儲存壽命穩定性的肉類產品。基於細胞之肉類之組成使得偵測到較少不良氣味及不良風味。此外，用以生產基於細胞之肉類之製造方法需要潔淨及無菌條件。此等條件確保所收集之產物及後續食品加工中的微生物細胞計數較低。此等多種因素有助於基於細胞之肉類之延長的儲存壽命穩定性
本發明之基於細胞之肉類之歸因於腐敗的儲存壽命相對於習知肉類提高。在所有溫度下均為此情況，例如在室溫(約22℃至約26℃)下及在較冷溫度(類似於家庭冰箱溫度(例如在約2℃至約4℃下))下。延長的儲存壽命與減少之污染、基於細胞之肉類之組成、減少之基於細胞之肉類之降解及降低之基於細胞之肉類之顏色、腐敗、氣味及風味之變化速率相關，且允許維持肉類以供膳食攝入。
不希望受理論或機制約束，與習知肉類相比，基於細胞之肉類中總脂肪酸含量降低，從而產生含量更低之脂肪酸氧化產物，使得肉類之顏色、氣味或風味之變化速率較慢。氧化酸敗與空氣中氧氣之降解相關。不飽和脂肪酸之雙鍵可藉由涉及分子氧之自由基反應裂解。此反應引起惡臭及高揮發性醛及酮之釋放。氧化主要在不飽和脂肪之情況下發生。舉例而言，即使肉類在冷藏下或在冷凍狀態下保持，多不飽和脂肪仍可繼續氧化且緩慢變得酸敗。脂肪氧化過程緊接著在動物被屠宰，且肌肉、肌內、肌間及表面脂肪暴露於空氣中之氧氣之後開始。
不希望受理論或機制約束，與習知肉類相比，基於細胞之肉類中脂肪酶數目降低，從而產生程度更低之脂肪酸分解，使得肉類之顏色、氣味或風味之變化速率較慢。
不希望受理論或機制約束，歸因於基於細胞之肉類中不存在血管結構，當與習知肉類相比時，其中存在較少氧氣，從而產生更低程度之脂肪酸氧化及好氧細菌生長，使得微生物污染程度降低，且使得肉類之顏色、氣味、香味或風味之變化速率較慢。
不希望受理論或機制約束，歸因於基於細胞之肉類中不存在功能性肌肉組織(例如肌血球素)，當與習知肉類相比時，其中存在較少氧氣，從而產生更低程度之脂肪酸氧化及好氧細菌生長，使得微生物污染程度降低，且使得肉類之顏色、氣味或風味之變化速率較慢。
不希望受理論或機制約束，歸因於基於細胞之肉類中的較高量之維生素E，當與習知肉類相比時，存在較高程度之抗氧化活性，從而產生針對脂肪酸氧化之保護，且使得肉類之顏色、氣味或風味之變化速率較慢。肉類中脂質之氧化取決於若干因素，包括肌肉中存在之脂肪酸組成、抗氧化維生素E (α-生育酚)及氧化促進物質，諸如游離鐵之含量。
因此，在一些實施例中，與習知肉類相比，免屠宰基於細胞之肉類產品之儲存壽命延長至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約5.5倍、至少約6倍、至少約6.5倍、至少約7倍、至少約7.5倍、至少約8倍、至少約8.5倍、至少約9倍、至少約9.5倍或甚至至少約10倍。在約2℃及約26℃及兩者之間的所有溫度(包括端點)下觀測到儲存壽命增加。
在一些實施例中，本文提供一種用於膳食攝入之免屠宰基於細胞之肉類產品，其呈現延長的儲存壽命，其中儲存壽命與藉由屠宰獲得之習知肉類相比延長，且其中儲存壽命在所有溫度下延長。在一些實施例中，延長的儲存壽命在收集之後維持至少2、3、4、5、6、7、10、14、15、20、21、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、148、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或至少250天。在一些實施例中，在收集之後，在約22℃至26℃下，延長的儲存壽命維持至少3、7、14、30或148天。在一些實施例中，儲存壽命係在收集後且在調配前測定。在一些實施例中，儲存壽命係在調配之後測定。在一些實施例中，儲存壽命在非無菌條件下，在約2℃至約6℃下且在約22℃至26℃下延長。在一些實施例中，儲存壽命藉由量測總微生物計數(TC)、大腸桿菌/大腸菌群(EC)、大腸桿菌微生物計數或大腸菌群計數來測定。
在一些實施例中，藉由屠宰獲得之習知肉類的TC量測值比免屠宰肉類產品之TC量測值高至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、10倍、15倍、20倍或甚至25倍，且產生其較短的儲存壽命。
在一些例示性實施例中，免屠宰基於細胞之肉類產品包含以下特徵中之一或多者，其部分地促成所呈現之延長的儲存壽命： (a)    根據FDA細菌學分析手冊所測定，無可偵測量或不超過1、10、50或100 cfus微生物污染/g濕質量； (b)    根據FDA細菌學分析手冊所測定，無可偵測量或不超過1、10、50或100 cfus大腸菌群污染/g濕質量； (c)    根據FDA細菌學分析手冊所測定，無可偵測量或不超過1、10、50或100 cfus大腸桿菌污染/g濕質量； (d)    根據FDA細菌學分析手冊所測定，無可偵測量或不超過1、10、50或100 cfus酵母污染/g濕質量； (e)    根據FDA細菌學分析手冊所測定，無可偵測量或不超過1、10、50或100 cfus黴菌污染/g濕質量； (f)    根據FDA細菌學分析手冊所測定，無可偵測量或不超過1、10、50或100 cfus沙門氏菌污染/g濕質量； (g)    根據AOAC 2004.06方法所測定，無可偵測量或不超過1、10、50或100 cfus李氏菌污染/g濕質量； (h)    根據AOAC 2003.07方法所測定，無可偵測量或不超過1、10、50或100 cfus葡萄球菌污染/g濕質量；及/或 (i)    根據CompactDry方案所測定，無可偵測量或不超過1、10、50或100 cfus不超過55 cfus總好氧性生菌數污染/g濕質量。
在一些實施例中，呈現延長的儲存壽命之免屠宰肉類產品包含免屠宰雞肉、鴨肉或牛肉，且習知肉類包含藉由屠宰獲得之雞肉、鴨肉或牛肉。
實例9論述多種例示性方案，在該等方案下觀測儲存壽命及微生物污染。熟習此項技術者應瞭解，存在多種量測儲存壽命之方法及與儲存壽命相關之參數，諸如微生物污染。其至少由以下文本提供：(1) FDA細菌學分析手冊(BAM) (第8版，修訂A/1998)及(2) USDA食品安全檢驗局微生物學實驗室指南。AOAC亦至少提供以下用於測定微生物污染之測試： a) 腸桿菌，AOAC 2003.01 b) 大腸桿菌及大腸菌群，AOAC 998.08 c) 酵母及黴菌，FDA BAM第18章 d) 李氏菌，AOAC 2004.06 e) 沙門氏菌(25 g)，AOAC 2011.03 f)  曲狀桿菌，AOAC RI 051201 g) AOAC 2003.07 -葡萄球菌 h) 好氧性生菌數，AOAC 990.12 i)  沙門氏菌，AOAC 2013.02，RI PTM 081201 j)  李氏菌物種，AOAC-RI PTM #081401 k) 好氧性生菌數，AOAC 990.12 l)  大腸菌群及大腸桿菌，AOAC 991.14 m) Y及M計數，AOAC 2014.05
可測試額外終點以指示儲存壽命。此等終點測試包括但不限於：酸敗測試；加速儲存壽命研究；水分、pH值及水活性變化性；在不同儲存條件下之產品穩定性；微生物、化學及物理測試；感官評價；及益生菌穩定性。 III. 列舉之實施例
本發明可參考以下列舉的說明性實施例集合定義：集合 1
實施例1.  一種基於細胞之肉類產品，其中該基於細胞之肉類產品包含以下特徵中之至少兩者： a.     不超過約1 μg類固醇激素/kg乾質量之基於細胞之肉類產品； b.     不超過約100 μg抗生素/kg乾質量之基於細胞之肉類產品； c.     不超過約100 cfus微生物污染/g濕質量之基於細胞之肉類產品 d.     作為基於細胞之肉類產品之濕質量之%量測時，在約0.5%至約5.0%之間的平均總脂肪含量； e.     實質上不含血管結構；及 f.      具有相比於習知肉類至少2倍之儲存壽命增加。
實施例2.  如實施例1之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類產品包含特徵(a)至(f)中之至少三者、四者、五者或六者。
實施例3.  如實施例1至2之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類產品包含不超過約1 μg孕酮/kg乾質量之基於細胞之肉類。
實施例4.  如實施例1至3之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類產品包含不超過約1 μg睪固酮/kg乾質量之基於細胞之肉類。
實施例5.  如實施例1至4中任一項之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類產品包含不超過約35 ng雌二醇/kg乾質量之基於細胞之肉類。
實施例6.  如實施例1至5中任一項之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類產品包含約50 g至約90 g重量之胺基酸/100 g乾質量。
實施例7.  如實施例1至6中任一項之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類產品包含呈指定量(表示為g胺基酸/100 g總胺基酸)的以下胺基酸中之一或多者：色胺酸約1至約2.2，蘇胺酸約4.6至6.5，異白胺酸約3.8至約5，白胺酸約6.1至約8.9，離胺酸約5.7至約8.8，甲硫胺酸約0.14至約3.0，半胱胺酸約1.5至約1.8，苯丙胺酸約3.7至約4.8，酪胺酸約3.0至約5.2，纈胺酸約4.8至約6.1，精胺酸約7.0至約8.0，組胺酸約2.5至約4，丙胺酸約5.0至約6.3，天冬胺酸約8.6至約10.4，麩胺酸約12.5至約14.6，甘胺酸約4.6至約9.8，脯胺酸約4.6至約6.8，絲胺酸約4.4至約5.3，及/或羥脯胺酸約0.0至4.0。
實施例8.  如實施例1至7中任一項之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類產品之水分含量為約65%至約95%。
實施例9.  如實施例8之基於細胞之肉類產品，其中水分含量係在收集之後但在調配之前量測。
實施例10. 如實施例8之基於細胞之肉類產品，其中水分含量係在調配及脫水過程之後但在添加成分之前量測。
實施例11. 如實施例1至10中任一項之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類產品為基於細胞之禽類肉類產品。
實施例12. 如實施例11之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之禽類肉類產品為基於雞細胞之肉類產品。
實施例13. 如實施例11之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之禽類肉類產品為基於鴨細胞之肉類產品。
實施例14. 如實施例1至10中任一項之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類產品為基於細胞之牛類肉類產品。
實施例15. 如實施例1至14中任一項之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類產品為細胞集結粒。
實施例16. 如實施例1至14中任一項之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類產品為細胞膜片。
實施例17. 如實施例1至16中任一項之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類產品係由培養物中之纖維母細胞產生。
實施例18. 如實施例1至16中任一項之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類產品係由培養物中之肌母細胞產生。
實施例19. 如實施例1至16中任一項之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類產品係由在培養物中包含纖維母細胞及肌母細胞之共培養物產生。
實施例20. 如實施例16至19中任一項之基於細胞之肉類產品，其中培養物進一步包含脂肪細胞、內皮細胞及/或中胚層譜系之細胞。
實施例21. 如實施例19之基於細胞之肉類產品，其中共培養物中纖維母細胞與肌母細胞之比率係約95F:5M至約5F:95M之比率。
實施例22. 如實施例1至21中任一項之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類產品包含至少約0.5 mg維生素E/100 g濕質量之基於細胞之肉類。
實施例23. 如實施例1至22中任一項之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類產品包含呈指定量之以下脂肪酸類別中之一或多者，該量表示為該類別相對於總脂肪酸之%： a.     在約29%至約42%之間的飽和脂肪酸含量； b.     在約19%至約54%之間的單不飽和脂肪酸含量；及 c.     在約5%至約36%之間的多不飽和脂肪酸含量。
實施例24. 如實施例1至23中任一項之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類產品包含約2:1至18:1比率之ω 6:ω 3脂肪酸類別。
實施例25. 如實施例23或24之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類產品係由雞細胞、鴨細胞或牛細胞產生。
實施例26. 如實施例23或24之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類在脂肪酸含量已經操縱之培養基中產生。
實施例27. 如實施例1至25中任一項之基於細胞之肉類產品，其中基於細胞之肉類產品包含以下質地特徵中之至少一者： a.     450 g至約2970 g之烹熟咀嚼力；及 b.     約280 g至約1900 g之烹熟硬度。
實施例28. 如實施例1至27中任一項之基於細胞之肉類產品，與習知肉類相比，基於細胞之肉類產品之穩定性及儲存壽命至少增加10倍。
實施例29. 如實施例28之基於細胞之肉類產品，其中儲存壽命增加在約4℃下量測。
實施例30. 如實施例28之基於細胞之肉類產品，其中儲存壽命增加在約25℃下量測。
實施例31. 一種生產基於細胞之肉類之方法，其包含： a.     提供來自非人類生物體之纖維母細胞及/或肌母細胞； b.     在懸浮培養條件或貼壁培養條件下在培養基中培養纖維母細胞及/或肌母細胞，其中該培養基實質上不含血清及源於動物之其他組分；及 c.     分離細胞並產生基於細胞之肉類。
實施例32. 如實施例31之方法，其中纖維母細胞及/或肌母細胞係以約95F:5M至約5F:95M之比率提供。
實施例33. 如實施例31至32中任一項之方法，其中基於細胞之肉類產品具有相比於習知肉類至少2倍之儲存壽命增加。
實施例34. 如實施例31至33中任一項之方法，其中該方法包含調節該培養基之脂肪酸含量，其中所得基於細胞之肉類產品具有約2:1至約18:1比率之ω 6:ω 3脂肪酸類別。集合 2
實施例1.  一種用於膳食攝入之免屠宰肉類產品，其呈現延長的儲存壽命，其中該儲存壽命與藉由屠宰獲得之習知肉類相比延長，且其中在收集之後，該儲存壽命延長至少3天。
實施例2.  如實施例1之免屠宰肉類產品，其中在收集之後，該延長的儲存壽命在約0℃至約30℃下維持至少3天。
實施例3.  如實施例1至2中任一項之免屠宰肉類產品，其中該儲存壽命係在收集後且在調配前測定。
實施例4.  如實施例1至3中任一項之免屠宰肉類產品，其中該儲存壽命係在調配之後測定。
實施例5.  如實施例3之免屠宰肉類產品，其中當肉類在非無菌條件下收集時，該儲存壽命延長。
實施例6.  如實施例1至5中任一項之免屠宰肉類產品，其中該儲存壽命藉由量測總微生物計數(TC)、大腸桿菌/大腸菌群計數(EC)、大腸桿菌微生物計數或大腸菌群計數來測定。
實施例7.  如實施例6之免屠宰肉類產品，其中藉由屠宰獲得之習知肉類的TC量測值比免屠宰肉類產品之TC量測值高至少1.5倍。
實施例8.  如實施例1至7中任一項之免屠宰肉類產品，其包含不超過1 cfus微生物污染/g濕質量。
實施例9.  如實施例1至8中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含不超過約1 μg類固醇激素。
實施例10. 如實施例1至9中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含約50 g至約90 g重量之胺基酸/100 g乾質量。
實施例11. 如實施例1至10中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含呈指定量(表示為g胺基酸/100 g總胺基酸)的以下胺基酸中之一或多者：色胺酸約1至約2.2，蘇胺酸約4.6至6.5，異白胺酸約3.8至約5，白胺酸約6.1至約8.9，離胺酸約5.7至約8.8，甲硫胺酸約0.14至約3.0，半胱胺酸約1.5至約1.8，苯丙胺酸約3.7至約4.8，酪胺酸約3.0至約5.2，纈胺酸約4.8至約6.1，精胺酸約7.0至約8.0，組胺酸約2.5至約4，丙胺酸約5.0至約6.3，天冬胺酸約8.6至約10.4，麩胺酸約12.5至約14.6，甘胺酸約4.6至約9.8，脯胺酸約4.6至約6.8，絲胺酸約4.4至約5.3，及/或羥脯胺酸約0.0至4.0。
實施例12. 如實施例1至11中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品具有約65%至約95%之水分含量，其中該水分含量係在收集之後但在調配之前量測。
實施例13. 如實施例1至12中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含至少約0.5 mg維生素E/100 g濕質量之該免屠宰肉類產品。
實施例14. 如實施例1至13中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含呈指定量之以下脂肪酸類別中之一或多者，該量表示為該類別相對於總脂肪酸之%： a.     在約10%至約60%之間的飽和脂肪酸含量； b.     在約10%至約60%之間的單不飽和脂肪酸含量；及 c.     在約1%至約50%之間的多不飽和脂肪酸含量。
實施例15. 如實施例1至14中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含約2:1至18:1比率之ω 6:ω 3脂肪酸類別。
實施例16. 如實施例1至15中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含免屠宰雞肉、鴨肉或牛肉，且該習知肉類包含藉由屠宰獲得之雞肉、鴨肉或牛肉。
實施例17. 如實施例1至16中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品實質上不含血管結構。
實施例18. 如實施例1至17中任一項之免屠宰肉類產品，其中該習知肉類未經加工。
實施例19. 一種用於膳食攝入之免屠宰肉類產品，其與藉由屠宰獲得之習知肉類相比，呈現更低的微生物污染計數，其中在收集之後，該更低的微生物污染計數呈現至少3天。
實施例20. 如實施例19之免屠宰肉類產品，其中在收集之後，該更低的微生物污染計數在約0℃至約30℃下維持至少3天。
實施例21. 如實施例19至20中任一項之免屠宰肉類產品，其中該微生物污染計數係在收集之後且在調配之前測定。
實施例22. 如實施例19至21中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品維持在非無菌條件下。
實施例23. 如實施例19至22中任一項之免屠宰肉類產品，其中該微生物污染計數藉由量測總微生物計數(TC)、大腸桿菌/大腸菌群計數(EC)、大腸桿菌微生物計數或大腸菌群計數來測定。
實施例24. 如實施例19至23中任一項之免屠宰肉類產品，其包含不超過1 cfus微生物污染/g濕質量。
實施例25. 如實施例19至24中任一項之免屠宰肉類產品，其中藉由屠宰獲得之習知肉類的TC量測值比免屠宰肉類產品之TC量測值高至少1.5倍。
實施例26. 如實施例19至25中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含不超過約1 μg類固醇激素。
實施例27. 如實施例19至26中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含呈指定量(表示為g胺基酸/100 g總胺基酸)的以下胺基酸中之一或多者：色胺酸約1至約2.2，蘇胺酸約4.6至6.5，異白胺酸約3.8至約5，白胺酸約6.1至約8.9，離胺酸約5.7至約8.8，甲硫胺酸約0.14至約3.0，半胱胺酸約1.5至約1.8，苯丙胺酸約3.7至約4.8，酪胺酸約3.0至約5.2，纈胺酸約4.8至約6.1，精胺酸約7.0至約8.0，組胺酸約2.5至約4，丙胺酸約5.0至約6.3，天冬胺酸約8.6至約10.4，麩胺酸約12.5至約14.6，甘胺酸約4.6至約9.8，脯胺酸約4.6至約6.8，絲胺酸約4.4至約5.3，及/或羥脯胺酸約0.0至4.0。
實施例28. 如實施例19至27中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含呈指定量之以下脂肪酸類別中之一或多者，該量表示為該類別相對於總脂肪酸之%： a.     在約10%至約50%之間的飽和脂肪酸含量； b.     在約10%至約54%之間的單不飽和脂肪酸含量；及 c.     在約1%至約50%之間的多不飽和脂肪酸含量。
實施例29. 如實施例19至28之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含約2:1至18:1比率之ω 6:ω 3脂肪酸類別。
實施例30. 如實施例19至29之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含免屠宰雞肉、鴨肉或牛肉，且該習知肉類包含藉由屠宰獲得之雞肉、鴨肉或牛肉。
實施例31. 一種生產相較於未加工的藉由屠宰獲得之習知肉類呈現儲存壽命增加的免屠宰肉類產品之方法，該方法包含： a.     提供來自非人類生物體之細胞； b.     在懸浮培養條件或貼壁培養條件下在培養基中培養該等細胞，其中該培養基實質上不含血清及源於動物之其他組分；及 c.     分離細胞且產生免屠宰肉類產品。
實施例32. 如實施例31之方法，其中該等細胞包含肌母細胞、纖維母細胞、脂肪細胞、內皮細胞、中胚層譜系之細胞及其組合。
實施例33. 如實施例31-32中任一項之方法，其中該等細胞至少包含纖維母細胞及肌母細胞，且該等纖維母細胞及肌母細胞係以約95F:5M至約5F:95M之比率提供。
實施例34. 如實施例31-33中任一項之方法，該方法包含調節該培養基之脂肪酸含量，其中所得免屠宰肉類產品具有約2:1至約18:1比率之ω 6:ω 3脂肪酸類別。集合 3
實施例1.  一種用於膳食攝入之免屠宰肉類產品，其呈現延長的儲存壽命，其中該儲存壽命與藉由屠宰獲得之習知肉類相比延長，且其中在收集之後，該儲存壽命延長至少3天。
實施例2.  如實施例1之免屠宰肉類產品，其中在收集之後，該延長的儲存壽命在約0℃至約30℃下維持至少3天。
實施例3.  如實施例1之免屠宰肉類產品，其中該儲存壽命係在收集後且在調配前測定。
實施例4.  如實施例1之免屠宰肉類產品，其中該儲存壽命係在調配之後測定。
實施例5.  如實施例3之免屠宰肉類產品，其中當肉類在非無菌條件下收集時，該儲存壽命延長。
實施例6.  如實施例1之免屠宰肉類產品，其中該儲存壽命藉由量測總微生物計數(TC)、大腸桿菌/大腸菌群計數(EC)、大腸桿菌微生物計數或大腸菌群計數來測定。
實施例7.  如實施例6之免屠宰肉類產品，其中藉由屠宰獲得之習知肉類的TC量測值比免屠宰肉類產品之TC量測值高至少1.5倍。
實施例8.  如實施例1之免屠宰肉類產品，其包含不超過1 cfus微生物污染/g濕質量。
實施例9.  如實施例1之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含不超過約1 μg類固醇激素。
實施例10. 如實施例1之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含約50 g至約90 g重量之胺基酸/100 g乾質量。
實施例11. 如實施例1之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含呈指定量(表示為g胺基酸/100 g總胺基酸)的以下胺基酸中之一或多者：色胺酸約1至約2.2，蘇胺酸約4.6至6.5，異白胺酸約3.8至約5，白胺酸約6.1至約8.9，離胺酸約5.7至約8.8，甲硫胺酸約0.14至約3.0，半胱胺酸約1.5至約1.8，苯丙胺酸約3.7至約4.8，酪胺酸約3.0至約5.2，纈胺酸約4.8至約6.1，精胺酸約7.0至約8.0，組胺酸約2.5至約4，丙胺酸約5.0至約6.3，天冬胺酸約8.6至約10.4，麩胺酸約12.5至約14.6，甘胺酸約4.6至約9.8，脯胺酸約4.6至約6.8，絲胺酸約4.4至約5.3，及/或羥脯胺酸約0.0至4.0。
實施例12. 如實施例1之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品具有約65%至約95%之水分含量，其中該水分含量係在收集之後但在調配之前量測。
實施例13. 如實施例1之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含至少約0.5 mg維生素E/100 g濕質量之該免屠宰肉類產品。
實施例14. 如實施例1之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含呈指定量之以下脂肪酸類別中之一或多者，該量表示為該類別相對於總脂肪酸之%： a.     在約10%至約60%之間的飽和脂肪酸含量； b.     在約10%至約60%之間的單不飽和脂肪酸含量；及 c.     在約1%至約50%之間的多不飽和脂肪酸含量。
實施例15. 如實施例1之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含約2:1至18:1比率之ω 6:ω 3脂肪酸類別。
實施例16. 如實施例1之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含免屠宰雞肉、鴨肉或牛肉，且該習知肉類包含藉由屠宰獲得之雞肉、鴨肉或牛肉。
實施例17. 如實施例1之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品實質上不含血管結構。
實施例18. 如實施例1之免屠宰肉類產品，其中該習知肉類未經加工。
實施例19. 一種用於膳食攝入之免屠宰肉類產品，其與藉由屠宰獲得之習知肉類相比，呈現更低的微生物污染計數，其中在收集之後，該更低的微生物污染計數呈現至少3天。
實施例20. 如實施例19之免屠宰肉類產品，其中在收集之後，該更低的微生物污染計數在約0℃至約30℃下維持至少3天。
實施例21. 如實施例19之免屠宰肉類產品，其中該微生物污染計數係在收集之後且在調配之前測定。
實施例22. 如實施例19之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品維持在非無菌條件下。
實施例23. 如實施例19之免屠宰肉類產品，其中該微生物污染計數藉由量測總微生物計數(TC)、大腸桿菌/大腸菌群計數(EC)、大腸桿菌微生物計數或大腸菌群計數來測定。
實施例24. 如實施例19之免屠宰肉類產品，其包含不超過1 cfus微生物污染/g濕質量。
實施例25. 如實施例19之免屠宰肉類產品，其中藉由屠宰獲得之習知肉類的TC量測值比免屠宰肉類產品之TC量測值高至少1.5倍。
實施例26. 如實施例19之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含不超過約1 μg類固醇激素。
實施例27. 如實施例19之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含呈指定量(表示為g胺基酸/100 g總胺基酸)的以下胺基酸中之一或多者：色胺酸約1至約2.2，蘇胺酸約4.6至6.5，異白胺酸約3.8至約5，白胺酸約6.1至約8.9，離胺酸約5.7至約8.8，甲硫胺酸約0.14至約3.0，半胱胺酸約1.5至約1.8，苯丙胺酸約3.7至約4.8，酪胺酸約3.0至約5.2，纈胺酸約4.8至約6.1，精胺酸約7.0至約8.0，組胺酸約2.5至約4，丙胺酸約5.0至約6.3，天冬胺酸約8.6至約10.4，麩胺酸約12.5至約14.6，甘胺酸約4.6至約9.8，脯胺酸約4.6至約6.8，絲胺酸約4.4至約5.3，及/或羥脯胺酸約0.0至4.0。
實施例28. 如實施例19之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含呈指定量之以下脂肪酸類別中之一或多者，該量表示為該類別相對於總脂肪酸之%： a.     在約29%至約42%之間的飽和脂肪酸含量； b.     在約19%至約54%之間的單不飽和脂肪酸含量；及 c.     在約5%至約36%之間的多不飽和脂肪酸含量。
實施例29. 如實施例19之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含約2:1至18:1比率之ω 6:ω 3脂肪酸類別。
實施例30. 如實施例19之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含免屠宰雞肉、鴨肉或牛肉，且該習知肉類包含藉由屠宰獲得之雞肉、鴨肉或牛肉。
實施例31. 一種生產相較於未加工的藉由屠宰獲得之習知肉類呈現儲存壽命增加的免屠宰肉類產品之方法，該方法包含： a.     提供來自非人類生物體之細胞； b.     在懸浮培養條件或貼壁培養條件下在培養基中培養該等細胞，其中該培養基實質上不含血清及源於動物之其他組分；及 c.     分離細胞且產生免屠宰肉類產品。
實施例32. 如實施例31之方法，其中該等細胞包含肌母細胞、纖維母細胞、脂肪細胞、內皮細胞、中胚層譜系之細胞及其組合。
實施例33. 如實施例31之方法，其中該等細胞至少包含纖維母細胞及肌母細胞，且該等纖維母細胞及肌母細胞係以約95F:5M至約5F:95M之比率提供。
實施例34. 如實施例31之方法，其中該方法包含調節該培養基之脂肪酸含量，其中所得免屠宰肉類產品具有約2:1至約18:1比率之ω 6:ω 3脂肪酸類別。
本文中所揭示之發明藉由以下額外實例進一步說明，該等實例不應理解為限制性的。依據本發明，熟習此項技術者應瞭解，在不脫離本發明之精神及範疇之情況下可對所揭示之特定實施例作出許多改變且仍獲得相同或類似結果。
在整個本發明中參考之所有專利及非專利文獻均以全文引用的方式併入本文中。實例 實例 1 ： 基於細胞培養物之肉類產品之產生
舉例而言，如下文及表1中所述，在培養物中產生來自原雞(雞)、綠頭鴨(鴨)及溫帶牛(牛、牛肉)之肉類。
培養條件 ：所分析之細胞膜片(組織)及細胞係藉由纖維母細胞(F)及肌母細胞(M)之單培養物或共培養物產生。除非指定為單株(例如方法14)，否則所有群體均為多株的。
貼壁培養形式 ：將細胞解凍至容器中且在貼壁培養物中生長至接近匯合(70%至90%)。細胞在貼壁培養物中擴增6至10倍，直至達至適於接種以形成組織的數目。藉由以目標密度(目標範圍：10,000至20,000個細胞/cm2)且組織含有兩種或更多種細胞類型之情況下，以特定比率以貼壁方式接種細胞來產生組織。細胞在含有特定量之動物血清的培養基中培養一定量的時間(10至20天)。在培養結束時物理收集肉類組織且在緩衝劑中洗滌以移除培養基組分。
懸浮培養形式 ：將細胞解凍至含有特定量之動物血清的培養基中且在懸浮培養物中生長。添加新鮮培養基以維持50,000至1,000,000個細胞/毫升之密度以擴增細胞群體。
表1提供用於本文所產生之各種肉類產品之例示性培養方法。除非指定為單株(例如方法14、15，單株肌母細胞群體)，否則所有群體均為多株的。
表格關鍵詞-纖維母細胞：F；肌母細胞：M；牛血清：BS；雞血清：CS；胎牛血清：FBS；馬血清：HS；(高)：培養基含有8至10%特定血清；(低)：培養基含有1至2.5%特定血清。除非在種串(seed train)或組織形成部分中另外描述，否則使用具有10% FBS的DMEM-F12表 1 ： 用於產生基於細胞之肉類之細胞培養方法
方法編號 樣品ID 培養條件 一或多種細胞類型( 比率) 培養形式 基礎培養基
1 綠頭鴨(鴨)纖維母細胞/肌母細胞組織1 共培養 F/M (50/50) 貼壁 DMEM-F12，具有FBS (高)、BS (高)、CS (低)、HS (低)
2 綠頭鴨(鴨)纖維母細胞組織1 單培養 F 貼壁 DMEM-F12，具有FBS (高)、BS (高)、CS (低)、HS (低)
3 溫帶牛(牛)纖維母細胞組織1 單培養 F 貼壁 DMEM-F12，具有FBS (高)、BS (高)、CS (低)、HS (低)
4 原雞(雞)纖維母細胞組織1 單培養 F 貼壁 DMEM-F12，具有FBS (高)、CS (低)
5 原雞(雞)纖維母細胞組織2 單培養 F 貼壁 DMEM-F12，具有CS (高)、BS (低)
6 原雞(雞)纖維母細胞組織3 單培養 F 貼壁 DMEM-F12，具有CS (高)、BS (高)
7 原雞(雞)纖維母細胞組織4 單培養 F 貼壁 DMEM-F12，具有BS (高)、CS (低)
8 原雞(雞)纖維母細胞細胞1 單培養 F 貼壁 DMEM-F12，具有10% FBS
9 原雞(雞)纖維母細胞/肌母細胞組織1 共培養 F/M (30/70) 貼壁 DMEM-F12，具有FBS (高)、CS (低)
10 原雞(雞)纖維母細胞 組織5 單培養 F 貼壁 DMEM-F12，具有BS (高)、CS (低)
11 原雞(雞)肌母細胞細胞1 單培養 M 懸浮 DMEM-F12，具有BS (高)、CS (低)
12 原雞(雞)纖維母細胞/肌母細胞組織2 共培養 F/M (30/70) 貼壁 DMEM-F12，具有BS (高)、CS (低
13 原雞(雞)纖維母細胞/肌母細胞組織3 共培養 F/M (50/50) 貼壁 DMEM-F12，具有BS (高)、CS (低)
14 原雞(雞)纖維母細胞/肌母細胞組織4 共培養 F/單株M (50/50) 貼壁 DMEM-F12，具有BS (高)、CS (低
15 原雞(雞)纖維母細胞/肌母細胞組織5 共培養 F/單株M (70/30) 貼壁 化學成分確定的培養基，具有BS (低)
16 原雞(雞)肌母細胞細胞2 單培養 M 懸浮 化學成分確定的培養基配方。無血清
17 原雞(雞)肌母細胞細胞3 單培養 M 懸浮 SMEM-F12，具有BS (高)、CS (低)
實例 2 ： 基於細胞培養物之肉類產品之胺基酸概況
如實例1中所述，使用所描述之方法及表1，在培養物中產生肉類組織。
如下分析基於細胞培養物之肉類產品的胺基酸概況。總胺基酸概況包括游離及結合胺基酸之總和，而游離胺基酸概況包括並非結合蛋白質之胺基酸。
樣品製備 ：於1.7 mL微管中獲得約100 mg濕樣品。將樣品在管中冷凍乾燥48小時直至完全乾燥。
總水解 ：將約4 mg凍乾組織置放於水解管中(注意樣品之實際質量)。樣品在500 µL甲酸中浸沒隔夜，且隨後乾燥。對樣品執行液相水解(在110℃下，200 µL 6 N鹽酸/1%苯酚，24小時)，且隨後乾燥樣品。隨後將樣品渦旋、短暫離心且將50 µL用於分析。因此，經由鹽酸消化實現總水解。
游離水解 ：將約18 mg凍乾組織置放於水解管中(注意樣品之實際質量)。將樣品溶解於1 mL 0.1 N鹽酸中，且隨後用玻璃珠(BioEruptor)音波處理15分鐘。整個樣品隨後用250 μL 10% 5-磺基水楊酸沈澱，且隨後使其在室溫下靜置15分鐘，隨後將樣品在-20℃下冷凍隔夜。隨後將樣品離心，且獲取上清液且製備AE-cys (或NorLeu)稀釋液以按所指示最終稀釋。隨後將樣品渦旋、短暫離心且將50 µL用於分析。此方法用於除MET、CYS及TRP (其在鹽酸破壞胺基酸時需要不同水解條件)以外之所有胺基酸。對於MET及CYS，使用過甲酸進行單獨的水解，且TRP需要使用氫氧化鈉進行鹼性水解。
分析 ：經由利用針對生理樣品最佳化的檸檬酸鋰緩衝系統之Hitachi L-8900及L-8800a分析器分析酸穩定胺基酸。分析器使用離子交換層析法分離胺基酸，之後為「管柱後」茚三酮反應偵測系統。各胺基酸藉由峰滯留時間(RT)鑑別且藉由峰面積定量；相關胺基酸的代表性RT值列舉於下文表2中。表 2 ： 胺基酸之峰滯留時間
胺基酸 縮寫 RT (min)
天冬胺酸 ASX 8.5
蘇胺酸 THR 12.2
絲胺酸 SER 13.4
麩胺酸 GLX 16.8
脯胺酸 PRO 25.7
甘胺酸 GLY 26.9
丙胺酸 ALA 28.4
纈胺酸 VAL 33.9
異白胺酸 ILE 53.4
白胺酸 LEU 57.5
酪胺酸 TYR 61.4
苯丙胺酸 PHE 66.4
離胺酸 LYS 100.5
組胺酸 HIS 103.2
精胺酸 ARG 116
下表3-5概述若干表1中所列之樣品的胺基酸(AA)概況資料-在一些情況下，一式兩份或一式三份地進行量測。值表示為g/100 g總胺基酸。標記為「總」之欄表示不包括TRP、CYS、MET、HYP、HYL的胺基酸之總公克數，且用於使呈現之胺基酸值正規化。排除TRP、CYS、MET、HYP及HYL係因為在所有樣品中量測不一致。NT=未測試。表 3 ：胺基酸概況
   色胺酸 蘇胺酸 異白胺酸 白胺酸 離胺酸 甲硫胺酸
方法ID 總* TRP THR ILE LEU LYS MET
1 96.13 NT 5.76 4.57 7.55 6.6 NT
1 96.50 NT 5.83 4.7 7.63 6.69 NT
1 96.25 NT 5.85 4.69 7.66 6.66 NT
3 96.00 NT 5.82 4.71 7.67 6.73 NT
3 96.19 NT 5.93 4.71 7.64 6.56 NT
4 96.70 NT 5.72 4.74 7.94 7.06 NT
4 97.44 NT 5.42 4.94 8.6 8.37 NT
5 91.50 2.22 5.3 4.35 7.55 6.94 2.95
6 92.12 2.12 5.22 4.39 7.71 7.17 2.95
7 92.26 1.98 5.32 4.37 7.63 7.21 2.96
7 99.98 NT 6.47 4.95 8 7.02 NT
8 95.15 NT 5.1 4.65 8.93 8.6 2.55
9 95.00 NT 5.09 4.74 8.61 8.8 2.7
9 93.47 NT 4.89 4.25 7.68 7.23 2.28
9 93.27 NT 4.97 4.25 7.56 7.06 2.24
10 97.24 NT 5.72 4.78 8.43 7.96 0.14
11 94.30 NT 5.65 4.68 8.05 7.57 2.46
11 93.72 NT 5.41 4.32 7.54 6.87 2.2
表 4 ：胺基酸概況
   半胱胺酸 苯丙胺酸 酪胺酸 纈胺酸 精胺酸 組胺酸 丙胺酸
方法ID CYS PHE TYR VAL ARG HIS ALA
1 NT 4.14 4.09 5.78 7.63 3.46 5.3
1 NT 4.18 4.13 5.86 7.52 3.47 5.25
1 NT 4.15 4.08 5.83 7.54 3.37 5.27
3 NT 4.2 4.04 5.81 7.47 3.36 5.29
3 NT 4.17 4.17 5.86 7.57 3.37 5.2
4 NT 4.29 4.05 5.92 7.59 3.56 5.42
4 NT 4.62 3.96 5.86 7.45 3.94 5.52
5 1.72 4.27 3.93 5.33 7.07 3.51 5.02
6 1.6 4.38 3.92 5.35 7.17 3.52 5.08
7 1.54 4.09 3.77 5.5 7.21 3.45 5.12
7 NT 4.23 5.15 5.88 7.95 2.51 5.54
8 1.8 4.76 3.94 6.1 7.6 3.85 5.63
9 1.7 4.65 3.89 5.95 7.37 3.9 5.58
9 1.72 4.39 3.69 5.32 7.13 3.38 5.95
9 1.69 4.42 3.72 5.37 7.12 3.46 5.91
10 1.7 4.52 3.98 6.07 7.56 3.79 5.6
11 1.82 4.34 4.01 5.89 7.33 3.83 5.37
11 1.67 4.13 3.73 5.53 7.41 3.41 5.71
表 5 ：胺基酸概況
   丙胺酸 天冬胺酸 麩胺酸 甘胺酸 脯胺酸 絲胺酸 羥脯胺酸
方法ID ALA ASX GLX GLY PRO SER HYP
1 5.3 9.91 13.52 7.03 5.99 4.8 1.58
1 5.25 9.98 13.57 6.8 6.04 4.85 1.32
1 5.27 9.87 13.51 6.89 6.07 4.81 1.26
3 5.29 9.82 13.47 6.73 6.09 4.79 1.37
3 5.2 9.91 13.49 6.82 5.95 4.84 1.28
4 5.42 9.71 13.73 6.39 5.75 4.83 1.07
4 5.52 9.97 13.92 5 4.91 4.96 NT
5 5.02 9.19 13.55 5.63 5.16 4.7 1.02
6 5.08 9.31 13.64 5.39 5.16 4.71 0.64
7 5.12 9.41 13.8 5.56 5.03 4.79 0.86
7 5.54 10.39 14.64 6.18 5.78 5.29 0
8 5.63 9.48 12.63 4.56 4.59 4.73 0
9 5.58 9.57 12.47 4.94 4.78 4.66 0
9 5.95 9.15 13.29 7.06 5.49 4.57 1.51
9 5.91 9.05 13.15 7.12 5.6 4.51 1.71
10 5.6 9.89 13.24 5.33 5.3 5.07 0.36
11 5.37 9.57 12.67 5.44 5.05 4.85 0.8
11 5.71 9.38 12.65 6.95 6.01 4.67 1.64
表6-8分別展示雞、鴨及牛之複合平均胺基酸值(表示為總胺基酸%)。總胺基酸之%表示為藉由對所有量測之分析物求和而正規化之各個別胺基酸的g/100 g值，其中不包括色胺酸(TRP)、半胱胺酸(CYS)、甲硫胺酸(MET)、羥脯胺酸(HYP)及羥離胺酸(HYL)，因為彼等參數在所有樣品中量測不一致。因此，不管是否特定量測TRP、CYS、MET、HYP及HYL，總值之%均允許對所有樣品進行直接比較。
表 9 展示表6-8合起來之資料-所有基於細胞之肉類樣品(表1中方法之複合物)胺基酸組成資料。表 6 ：基於雞細胞之肉類胺基酸組成
表 6 ：雞- 總 AA%
THR ILE LEU LYS MET CYS
平均值 5.53 4.60 7.91 7.28 2.34 1.70
標準差 0.40 0.22 0.44 0.70 0.83 0.08
N 18 18 18 18 10 10
95% CI 0.19 0.10 0.20 0.32 0.51 0.05
最小值 4.89 4.25 7.54 6.56 0.14 1.54
最大值 6.47 4.95 8.93 8.80 2.96 1.82
   PHE TYR VAL ARG HIS ALA
平均值 4.33 4.01 5.73 7.43 3.51 5.43
標準差 0.20 0.32 0.26 0.23 0.32 0.27
N 18 18 18 18 18 18
95% CI 0.09 0.15 0.12 0.10 0.15 0.12
最小值 4.09 3.69 5.32 7.07 2.51 5.02
最大值 4.76 5.15 6.10 7.95 3.94 5.95
   ASX GLX GLY PRO SER HYP
平均值 9.64 13.39 6.10 5.49 4.80 0.97
標準差 0.35 0.54 0.86 0.50 0.18 0.59
N 18 18 18 18 18 17
95% CI 0.16 0.25 0.40 0.23 0.08 0.28
最小值 9.05 12.47 4.56 4.59 4.51 0.00
最大值 10.39 14.64 7.12 6.09 5.29 1.71
表 7 ： 基於鴨細胞之肉類胺基酸組成
表 7 ：鴨 - 總 AA%
   THR ILE LEU LYS MET CYS
平均值 5.10 3.99 6.42 6.35 2.09 1.61
標準差 0.09 0.15 0.43 0.33 0.06 0.09
N 3 3 3 3 3 3
95% CI 0.10 0.17 0.48 0.38 0.07 0.10
最小值 5.01 3.82 6.10 6.09 2.02 1.51
最大值 5.18 4.12 6.90 6.73 2.13 1.68
   PHE TYR VAL ARG HIS ALA
平均值 4.08 3.26 4.99 7.36 2.76 6.15
標準差 0.19 0.18 0.23 0.25 0.15 0.17
N 3 3 3 3 3 3
95% CI 0.21 0.21 0.26 0.28 0.17 0.19
最小值 3.87 3.05 4.78 7.12 2.65 5.96
最大值 4.23 3.40 5.24 7.62 2.93 6.28
   ASX GLX GLY PRO SER HYP
平均值 8.78 13.16 8.76 6.56 4.56 3.48
標準差 0.24 0.31 0.73 0.34 0.08 0.54
N 3 3 3 3 3 3
95% CI 0.28 0.35 0.83 0.39 0.09 0.61
最小值 8.61 12.80 7.95 6.17 4.49 3.01
最大值 9.06 13.36 9.38 6.79 4.65 4.07
表 8 ：基於牛細胞之肉類胺基酸組成
表 8 ：牛 - 總 AA%
   THR ILE LEU LYS MET CYS
平均值 4.60 3.96 7.03 5.96 2.01 1.53
標準差 0.02 0.09 0.24 0.39 0.01 0.06
N 2 2 2 2 2 2
95% CI 0.03 0.13 0.33 0.54 0.01 0.09
最小值 4.58 3.89 6.86 5.68 2.00 1.48
最大值 4.61 4.02 7.20 6.23 2.01 1.57
   PHE TYR VAL ARG HIS ALA
平均值 3.82 3.37 4.89 7.25 2.74 6.07
標準差 0.14 0.02 0.13 0.28 0.07 0.10
N 2 2 2 2 2 2
95% CI 0.20 0.03 0.18 0.39 0.10 0.14
最小值 3.72 3.35 4.80 7.05 2.69 6.00
最大值 3.92 3.38 4.98 7.45 2.79 6.14
   ASX GLX GLY PRO SER HYP
平均值 8.77 13.03 9.27 6.26 4.50 3.21
標準差 0.22 0.46 0.79 0.40 0.06 0.42
N 2 2 2 2 2 2
95% CI 0.30 0.64 1.10 0.56 0.08 0.58
最小值 8.61 12.70 8.71 5.97 4.46 2.91
最大值 8.92 13.35 9.83 6.54 4.54 3.50
表 9 ： 所有基於細胞之肉類樣品 ( 表 1 中之方法之複合物 ) 胺基酸組成 (g 胺基酸 /100 g 樣品 )
平均值 標準差 N 最小值 最大值
色胺酸 TRP 1.67 0.60 5 1 2.22
蘇胺酸 THR 5.39 0.46 23 4.58 6.47
異白胺酸 ILE 4.46 0.33 23 3.82 4.95
白胺酸 LEU 7.64 0.68 23 6.1 8.93
離胺酸 LYS 7.05 0.78 23 5.68 8.80
甲硫胺酸 MET 2.25 0.68 15 0.14 2.96
半胱胺酸 CYS 1.66 0.10 15 1.48 1.82
苯丙胺酸 PHE 4.25 0.25 23 3.72 4.76
酪胺酸 TYR 3.86 0.41 23 3.05 5.15
纈胺酸 VAL 5.56 0.41 23 4.78 6.10
精胺酸 ARG 7.40 0.23 23 7.05 7.95
組胺酸 HIS 3.34 0.43 23 2.51 3.94
丙胺酸 ALA 5.58 0.38 23 5.02 6.28
天冬胺酸 ASX 9.45 0.49 23 8.61 10.39
麩胺酸 GLX 13.32 0.50 23 12.47 14.64
甘胺酸 GLY 6.72 1.46 23 4.56 9.83
脯胺酸 PRO 5.69 0.61 23 4.59 6.79
絲胺酸 SER 4.74 0.20 23 4.46 5.29
總體而言，肉類之胺基酸概況與習知肉類相當(圖1)，然而存在關鍵差異。舉例而言，基於細胞之肉類中的羥脯胺酸濃度高於習知肉類(USDA資料庫食品中心資料庫[https://fdc.nal.usda.gov/ ])。與基於細胞之肉類之比較展示於表10中(單位以g羥脯胺酸/100 g總蛋白展示)。展示了牛、鴨及雞習知及基於細胞之肉類的濃度。使用來自表1之方法2、3及7產生基於細胞之肉類。在用作比較者之三個物種中，基於細胞之肉類中羥脯胺酸濃度升高。表 10 ：羥脯胺酸濃度 ( g 羥脯胺酸 /100 g 總蛋白 )
   USDA/文獻 實驗分析
   習知 基於細胞之肉類
   牛 鴨 雞 雞 牛 鴨 雞
平均值 0.839 0.852 0.371 0.223 3.205 3.477 1.424
SD 0.489 0.167 0.160 0.146 0.417 1.521 0.288
N 8 40 8 4 2 3 10
圖2及表11展示進一步處理的由方法7、13及14產生的基於細胞之肉類的基於雞細胞之肉類的羥脯胺酸濃度。圖2展示以g/100 g濕質量之基於細胞之肉類為單位的羥脯胺酸濃度。基於細胞之肉類的羥脯胺酸平均濃度範圍在0.15與0.17 g/100 g濕質量之基於細胞之肉類之間(圖2)。表11展示以g/100 g總蛋白為單位的羥脯胺酸濃度。分別針對FB、FB/MB(多株)及FB/MB(單株)使用來自表1之方法7、13、14產生對照條件(Ctrl)。相比於習知對應物，由纖維母細胞單培養物產生之基於細胞之肉類中的羥脯胺酸含量升高。當將肌母細胞(MB)以多株細胞混合物(肌母細胞之混合群體) (例如來自表1之方法13)或單株肌母細胞混合物(來自表1之方法14) (自混合群體分離且擴增之單細胞)形式添加至培養系統中時，羥脯胺酸濃度可降低至接近習知肉類之羥脯胺酸濃度。羥脯胺酸濃度進一步使用經修改培養條件(處理1，熊果酸，20 mM；或處理2，白胺酸，20 mM)減少。將此等處理應用於來自表1之方法13及14。表 11 ：羥脯胺酸濃度 (g/100 g 總蛋白 )
   FB FB/MB( 多株) FB/MB( 單株)
   Cnt Cnt Tx-1 Tx-2 Cnt Tx-1 Tx-2
平均值 1.424 0.898 0.649 0.308 0.814 0.510 0.162
SD 0.288 0.449 0.044 0.112 0.438 0.014 0.090
N 10 8 3 3 6 3 3
實例 3 ：基於細胞之肉類產品之微生物污染的分析
評估基於細胞之肉類組織的微生物污染，例如大腸菌群細菌、酵母、黴菌、沙門氏菌及李氏菌。
此等研究由第三方實驗室Anresco實驗室進行。標準培養盤計數(SPC)、大腸桿菌/大腸菌群及酵母/黴菌藉由標準FDA生物分析方法方案測定。AOAC方法用於沙門氏菌(AOAC 2011.03)、李氏菌(AOAC 2004.06)及葡萄球菌(AOAC 2003.07)。
簡言之，SPC藉由製備基於細胞之肉類均質物之數十倍稀釋液，且每次稀釋將1 mL等分試樣移液至單獨的一式兩份大致標記的添加有12至15 mL培養盤計數瓊脂的培養皿中來實現。將樣品稀釋液及瓊脂培養基充分混合且使瓊脂固化。將經固化之培養皿倒置且在35℃下培育48±2小時，其後讀取培養盤計數。(https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-aerobic-plate-count#conventional)
藉由將50 g基於細胞之肉類均質化樣品製備於450 mL巴氏磷酸鹽緩衝液(Butterfield's phosphate buffer)中且混合來測定大腸桿菌/大腸菌群量測結果；製備數十倍稀釋液且將1 mL體積等分至3個月桂基胰醣(LST)培養液中之每一者中，以獲得3管最大可能數(most probable number，MPN)。將LST管在35℃下培育且在24±2小時之後檢驗以觀測排氣或起泡；將任何氣體陰性管再培育24小時以確認陰性。為確認大腸菌群，自各產氣LST管將一環量(loopful)之樣品轉移至亮綠色乳糖膽汁(BGLB)培養液之管中且在35℃下培育48±3小時。針對3個連續稀釋液，基於確認之產氣LST管之比例計算MPN。為確認大腸桿菌，自各產氣LST管將一環量之樣品轉移至EC培養液之管中且在44.5℃下培育24±2小時。任何陰性結果再次培育且再次在48小時檢驗。此外，藉由移出一環量之培養液對各產氣EC管取樣，且在35℃下在L-EMB瓊脂盤上劃線分離18-24小時；將任何大腸桿菌菌落轉移至PCA斜面管，且在35℃下進一步培育18-24小時。在含有大腸桿菌之3個連續稀釋液中，基於EC管之比例計算MPN。(https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-4-enumeration-escherichia-coli-and-coliform-bacteria#conventional)
藉由分析在0.1%蛋白腖水中消化以達成10-1 稀釋且在均質器中均質化2分鐘或摻合30至60秒之25至50 g基於細胞之肉類樣品獲得酵母/黴菌計數。進行塗佈盤或傾倒盤塗鋪，且於暗處在25℃下培育。5天後對培養盤計數；陰性培養盤再培育48小時。(https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-yeasts-molds-and-mycotoxins)
表12提供基於細胞之肉類相對於習知雜貨店肉類中之污染物的比較。習知鴨肉且尤其習知牛肉具有顯著較高量之微生物污染。
習知鴨肉購自當地雜貨店(Berkeley, CA)。將肉類與皮膚及脂肪分離，且用滅菌之刀及砧板細細切碎。將肉類封裝於50 mL法爾康管(falcon tube)中且密封。封閉管用70%乙醇噴灑且在-80℃下冷凍。樣品在-80℃下冷凍，隨後在測試之前保持在4℃下。
基於細胞之鴨肉為使用描述於表1中之方法1及2之組織之組合。自冷凍儲存移出組織，混合且使用滅菌之砧板及刀切碎。將肉類封裝於50 mL法爾康管中且密封。封閉管用70%乙醇噴灑且在-80℃下冷凍。樣品在-80℃下冷凍，隨後在測試之前保持在4℃下。
超瘦(97%瘦肉)碎牛肉購自當地雜貨店(Berkeley, CA)。將牛肉直接封裝於50 mL法爾康管中。管密封且用70%乙醇噴灑。將管在-80℃下冷凍。樣品在-80℃下冷凍，隨後在測試之前保持在4℃下。
基於細胞之牛肉為來自使用表1中之方法3的組織之組合。自冷凍儲存移出組織，混合且使用滅菌之砧板及刀切碎。將肉類封裝於50 mL法爾康管中且密封。封閉管用70%乙醇噴灑且在-80℃下冷凍。樣品在-80℃下冷凍，隨後在測試之前保持在4℃下。表 12 ：習知及基於細胞之肉類中的污染物比較
樣品 標準培養盤計數 (cfu/g) 確認之大腸菌群 (cfu/g) 大腸桿菌 (cfu/g) 酵母 (cfu/g) 黴菌 (cfu/g) 沙門氏菌 ( 每 25 g) 李氏菌 ( 每25 g) CP 葡萄球菌 (cfu/g)
習知鴨肉 100 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 陰性 陰性 ＜10
基於細胞之鴨肉 ＜100 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 陰性 陰性 ＜10
習知牛肉 6000000 1300 ＜10 2300 ＜10 陰性 陽性-偵測到單核球增多性李氏菌(L. monoctogenes) ＜10
基於細胞之牛肉 ＜100 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 陰性 陰性 ＜10
在進一步實驗中，使用CompactDry培養盤評估基於細胞之肉類樣品及習知肉類樣品之總好氧性生菌數及大腸桿菌/大腸菌群計數；所有評價之樣品未經烹飪且係生的。
採用CompactDry方案，其涉及用乙醇滅菌之用品收集1 g大小之樣品且轉移至無菌管；添加無菌巴氏磷酸鹽緩衝液以維持25 g樣品:225 mL緩衝液之比率。將管渦旋，在室溫下靜置10分鐘以將任何細菌轉移至溶液中，隨後在300×g下離心5分鐘以將固體牽拉至底部；將上清液收集至無菌管中且製備數十倍稀釋液。每次稀釋將1 mL等分試樣塗鋪於總計數CompactDry™ TC及CompactDry™ EC培養盤上，分別以得到總好氧性生菌數(TC)及大腸桿菌/大腸菌群(EC)。根據製造商說明培育培養盤，且菌落計數為cfu/mL且基於25 g/225 mL樣品消化比率轉化為cfu/g。
一般而言，基於細胞之肉類回收率較低，通常小於分析之偵測極限(約10 cfu/g)，且因此未偵測到(ND)，表13。更特定言之，不同批次的基於細胞之鴨肉產生ND (＜9 cfu/g)至54 cfu/g之TC，及ND (＜9 cfu/g)之總EC。對於TC，基於細胞之牛肉樣品產生ND (＜9 cfu/g)且基於細胞之雞肉樣品產生ND (＜9 cfu/g)至18 cfu/g。當基於細胞之鴨肉及牛肉樣品(具有低總好氧性生菌數)有意混雜有習知生雞肉 時(在表13中表示為「混雜有雞肉」之基於細胞之樣品)，TC上升至＞900 cfu/g，指示具有樣品基質之分析之效用且確認未由於基質影響發生信號抑制。習知生牛肉及雞肉樣品均呈現＞900 cfu/g TC且分別呈現315 cfu/g及＞900 cfu/g EC。與習知生肉樣品相比，基於細胞之肉類樣品均呈現不可偵測至較低(＜100 cfu/g)之TC及EC計數，指示顯著較少生物負荷。圖3展示指示細菌菌落之代表性CompactDry培養盤，其尤其展示基於細胞之鴨肉、習知牛肉及習知雞肉之EC及TC結果。此在表13中定量。表 13 ：習知及基於細胞之肉類樣品之生物負荷
樣品 總好氧性生菌數 ，cfu/g 大腸桿菌 / 大腸菌群， cfu/g
習知牛肉 ＞1000 350
習知雞肉 ＞1000 ＞1000
基於細胞之鴨肉 60 ＜10
基於細胞之鴨肉，混雜有雞肉 ＞1000 未量測到
基於細胞之牛肉 ＜10 未量測到
基於細胞之牛肉，混雜有雞肉 ＞1000 未量測到
基於細胞之雞肉 ＜10至20 未量測到
基於細胞之雞肉，混雜有雞肉 ＞1000 未量測到
實例 4 ：基於細胞之肉類產品之脂肪酸含量的分析
此部分中之大部分資料涉及經由GC-FAME方法(方法FA1)分析脂肪酸概況，其中樣品經歷直接水解(在加熱下使用鹽酸，其中樣品溶解於氯仿及乙醇中)以分解樣品基質，釋放三酸甘油酯(TG)且將TG轉化成脂肪酸。脂肪酸經由乙醚萃取回收且作為非極性層收集。脂肪酸經由甲醇硫酸衍生化成其脂肪酸甲酯(FAME)對應物，且經由乙醚萃取回收最終FAME化合物。注射非極性含FAME層以用於經由GC-FID進行分析。基於滯留時間鑑別個別FAME化合物，且藉由相較於標準曲線之峰下面積定量。基於三酸甘油酯內標評價回收率。圖8中呈現之資料經由技術上不同(儘管類似)之方法(方法FA2)根據AOCS CE 1F-96分析，由此採用氣相層析以藉由鏈長、飽和度/不飽和度及不飽和位置分離脂肪酸衍生物(FAME)。
在兩種方法中，自分析回收之原始值報導為總脂肪酸之各脂肪酸百分比。在方法FA1中，由分析報導之值為μg脂肪酸/g濕質量。總脂肪酸之%表示為藉由對所有量測之脂肪酸分析物求和而正規化之各個別脂肪酸的g/100 g值。方法FA2報導脂肪酸占總脂肪之百分比。
表14展示基於細胞之肉類之總脂肪酸分析。如所指示，在使用表1之方法所製備之基於細胞之肉類中測定總FA。表中之資料量測為濕質量之%。當調節基於細胞之肉類以模擬習知肉類之水分含量時(對於已經受強制風乾過程以將水分含量調節至65%至85%之間的基於細胞之肉類)，如通常量測到及USDA所記錄，FA %升至約5%之最大值。表 14 ：總脂肪酸分析
方法名稱 ( 表1) 濕質量之總 FA 百分比 (%)
7 0.97
14 0.88
14 0.77
17 1.11
17 2.17
13 1.12
13 1.15
14 1.45
14 1.25
14 0.96
17 0.57
17 1.15
17 1.01
17 0.86
16 0.96
14 1.01
14 1.2
16 0.68
16 0.64
16 0.66
7 1.12
7 1.07
7 1.4
14 1.38
平均值 1.06
最小值 0.57
最大值 2.17
店售雞肉 3.96
店售雞肉 3.98
店售雞肉 4.13
平均值 4.02
圖4展示包括使用表1中之各方法之代表性樣品的樣品(N=24)中之飽和、單不飽和及多不飽和脂肪酸之總脂肪酸組成。資料以FA類別/總FA之百分比形式呈現。除懸浮單培養物M  (方法16，表1) (其在化學成分確定的(CD)細胞培養基中)以外，所有樣品(表1，1至15)在含血清培養基中。該圖展示跨越四個主要脂肪酸類別名稱(飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸及高度不飽和脂肪酸(HUFA))的來源於所有物種的基於細胞之肉類原型之脂肪酸之分佈。方塊之末端為上四分位數及下四分位數，因此方塊跨越四分位數範圍，中值由方塊內部之豎直線標記，將方塊括起來的鬚或線為延伸至最高及最低觀測值之方塊外部之兩條線。
圖5展示USDA物種FA之PCA。其展示FA在物種之間不同，但在類似物種(例如家禽)中類似。脂肪酸資料之主成分分析(PCA)收集自USDA資料庫肉類產品，圖5。左側之圖展示分析之主成分。三角形表示家禽產品，圓形表示魚類產品，正方形為牛肉，且菱形為豬肉。此分析占脂肪酸資料中發現之變化的66.3%。右側之圖展示各脂肪酸對成分之分析具有之方向性及幅度影響。自此分析顯而易見，基於各肉類之脂肪酸概況，不同類型之肉類(雞肉、豬肉、牛肉及魚肉)以個別及不同的群組彼此聚集。在習知肉類中，飼料顯著影響脂肪酸概況。同樣地，脂肪酸概況對於不同物種為不同的。
圖6展示基於細胞之雞肉N=23中ω 6:ω 3脂肪酸之比率。離群資料點全部源於按照表1之方法16之化學成分確定的(CD)細胞培養基。在n=3之樣品大小中，習知雞肉(獲自當地雜貨店)之ω 6:ω 3脂肪酸比率＞18:1。
本文所提供之方法可經由若干機制改變特定脂質概況，以獲得所要風味特徵或脂肪酸概況，諸如ω 3/ω 6比率：a. 培養基中血清之存在可影響脂肪酸概況。圖7展示無血清培養基相對於含有血清之培養基中之脂肪酸百分比。b. 不同來源之血清在所培養之組織中賦予不同脂肪酸概況。(圖8)c. 來自多株群體之經分離純系亦影響FA概況。肌母細胞純系7相對於8 (圖9)。d. 脂肪酸概況受培養基組成及添加培養基組分影響，該等培養基組分包括添加以改變FA組成之化合物，如促效劑，或核黃素(例如)。對培養基之調節可影響脂肪概況。(圖10，圖11)。
圖10. 組織使用共培養方法(描述於表1中之方法15中)使用具有提高含量之調節特定生物化學路徑的各種化合物之培養基形成。在圖10中，將促效劑T0901317滴定至細胞培養基中。展示對脂肪酸濃度之整體影響。促效劑T0901317靶向肝X受體β (LXRβ)。LXRβ之抑制上調硬脂醯基-CoA去飽和酶(SCD)合成，使得飽和脂肪酸進一步轉化為不飽和脂肪酸(例如硬脂酸-18:0至油酸-18:1及亞麻油酸-18: 2。
圖11 組織使用共培養方法(描述於表1中之方法15中)使用具有提高含量之調節特定生物化學路徑的各種化合物之培養基形成。在該圖中，將核黃素、維生素及常見輔因子滴定至細胞培養基中。展示對脂肪酸濃度之整體影響。
圖12展示將FA滴定至培養基中以改變特定FA之概況。基於其在習知雞肉中之普遍性，選擇四種特定脂肪酸：棕櫚油酸(C16:1)、棕櫚酸(C16:0)、亞麻油酸(C18:2)及油酸(C18:1)來經由補充至細胞培養基中而靶向增加。組織使用共培養方法(描述於表1中之方法14中)使用具有如圖12中所描繪提高含量之各脂肪酸(10 mg/L總FA：2.8 mg/L C16:0，0.5 mg/L C16:1，4.2 mg/L C18:1，及2.5 mg/L C18:2；20 mg/L總FA：5.6 mg/L C16:0，1.0 mg/L C16:1，8.4 mg/L C18:1，及5.0 mg/L C18:2)之培養基形成。實例 5 ： 基於細胞之肉類產品中之巨量營養素之分析
評估肉類組織之巨量營養素含量，包括水分、蛋白質及脂肪。
藉由兩種方法，亦即水分-1或水分-2中之一者分析總水分。在水分1中，採用AOAC方法950.46。簡而言之，此方法採用2 g樣品，其在鋁盤中稱重且在機械對流空氣烘箱中在100℃至102℃下乾燥16小時至18小時。經乾燥樣品在乾燥器中冷卻且再稱重；水分以樣品重量之損失報導。在水分-2中，將＞100 mg樣品添加至預稱重之鋁盤中且在70℃下乾燥至少隔夜至質量恆定。亦可使用其他溫度，諸如50℃。在水分-1及水分-2兩者中，乾燥後樣品之質量損失歸為樣品中總水分之百分比。
藉由兩種方法，蛋白-1或蛋白-2中之一者分析總蛋白。在蛋白-1中，採用AOAC方法977.14。此方法為Kjeldahl方法，其中樣品中之氮在酸中在加熱下用催化劑還原成氨。氨隨後用水蒸氣蒸餾，且用酸來滴定。使用6.25之氮因子將氮含量轉化為粗蛋白質。在蛋白-2中，使用修改之Pierce BCA分析。在音波處理下將100 mg樣品以0.1 g/mL之比率在1 M氫氧化鈉中消化3小時以溶解樣品基質。隨後稀釋樣品消化物並經由比色Pierce BCA分析來分析。最終µg/mL值使用0.1 g/mL消化比率轉化為g蛋白/g濕質量。
藉由兩種方法，脂肪-1或脂肪-2中之一者分析總脂肪。在脂肪-1中，將石油醚用作溶劑以經由AOAC方法991.36自樣品基質萃取可溶性脂肪。在此方法中，將樣品在套管中稱重且插入萃取單元中，該單元添加溶劑以經由溶劑回收系統進行萃取。將萃取杯乾燥且稱重。以類似方式，脂肪-2涉及經修改之Folch萃取，其中在預稱重之16 mL小瓶中稱量＞250 mg樣品且在70℃下乾燥隔夜；乾燥後的質量損失歸為水分。乾燥樣品保持在小瓶中，且使用Hydranal LipoSolverCM溶劑(10 mL)進行萃取。小瓶用內襯有PTFE之蓋封蓋，且在室溫下以200 rpm震盪24小時。萃取後，經由預稱重PTFE過濾器(0.2 µm孔隙尺寸)過濾樣品且在50℃下乾燥48小時，通風至化學通風櫥。在脂肪-1及脂肪-2兩者中，萃取後樣品之質量損失歸為樣品中總脂肪之百分比。實例 6 ：基於細胞培養物之肉類產品中的激素之分析
由第3方分析實驗室(Eurofins中央分析實驗室)使用具有內部參考之LC-MS/MS方法分析肉類樣品之激素含量。激素ELISA分析結果指示，相較於基於細胞之雞肉樣品(作為貼壁或懸浮培養物生長)，習知雞肉樣品產生更高激素濃度。將收集額外資料以確認此分析對相關樣品基質之有效性。簡言之，17β-雌二醇分析係使用來自R-biopharm之RIDASCREEN® 17β-Östradiol套組進行。在具有內襯有PTFE之蓋之玻璃小瓶中，量測出1至1.5 g濕肉類樣品且使用具有鋸齒配件之手持型均質器，以1 mL緩衝劑:1 g濕樣品質量之比率，在67 mM磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中均質化。均質化後，添加5 mL甲基三級丁基醚(MTBE)，且隨後震盪30分鐘。將樣品管離心，且收集MTBE上清液層且對樣品進行額外5 mL MTBE萃取；合併兩個MTBE層以用於後續用途。在40℃下蒸發MTBE溶劑隔夜，且隨後將1 mL 80%甲醇添加至「經乾燥」小瓶中，渦旋以混合，且隨後添加2 mL 20 mM PBS且渦旋。使所得溶液穿過RIDA® C18管柱，該管柱用甲醇預沖洗且用20 mM PBS調節。在使樣品部分穿過管柱之後，用40%甲醇溶液清潔管柱(丟棄層)，隨後在氮氣流下乾燥，且藉由使80%甲醇穿過管柱且收集層來收集最終樣品。使用真空濃縮器乾燥樣品，且隨後在臨分析之前再懸浮於50 µL緩衝劑中。根據製造商說明使用套組，使用0至12.8 µg/L之校準範圍。最後使用盤讀取器量測盤之吸光度，且根據所衍生之校準曲線確定樣品值。分析輸出單位為µg/L，其使用初始樣品製備比率(1 g樣品:1 mL萃取緩衝劑)轉化成ng/kg。
質譜方法不具有適於相關激素分析物之偵測極限(LOD)來產生基於細胞之肉類中之含量極低或不存在之樣品的定量回收率。舉例而言，激素睪固酮、孕酮及17β-雌二醇之LOD值分別為1、1及20 µg/kg。MS層析圖未展示對應於基於細胞之肉類樣品中此等激素之任何色帶。表15展示LC-MS/MS結果之概述。所有激素結果為未偵測到(ND)或小於偵測極限
17β-雌二醇之ELISA結果指示基於細胞之雞肉樣品產生比習知雞肉及牛肉樣品更低的濃度。藉由使用ELISA套組，基於細胞之肉類的17β-雌二醇含量係平均35 ng雌二醇/kg濕質量，而獲自當地雜貨店的習知雞肉係90 ng/kg雌二醇/kg濕質量。後續研究中之陰性對照組在30 ng/kg雌二醇/kg濕質量範圍中，指示基於細胞之肉類樣品亦具有接近或低於兩種分析之偵測極限的含量。表16展示17β-雌二醇含量，其使用基於ELISA之方法來分析習知及基於細胞之雞肉。表 15 ：基於細胞之肉類樣品中之激素含量
參數 濃度 (µg /kg)
睪固酮 ＜1
表睪固酮 ＜10
氯睾酮 NR
甲基睪固酮 ＜10
睪固酮丙酸酯 NR
勃地酮(Boldenone) ＜10
17α-勃地酮 ＜10
大力補(Dianabol) ＜10
17α-群勃龍(17α-Trenbolone) ＜10
群勃龍 ＜10
16-羥基司坦唑醇(16-Hydroxystanozolole) NR
司坦唑醇 NR
諾龍(Nandrolone) ＜10
群勃龍-乙酸酯 ＜10
17α-炔雌醇 NR
17α-雌二醇 ＜20
17β-雌二醇 ＜20
雙烯雌酚 ＜10
乙烯雌酚 ＜10
雌三醇 ＜10
雌酮 ＜5.0
己雌酚 ＜5
α-玉米赤黴醇(α-Zearalanol) ＜10
β-玉米赤黴醇 ＜10
孕酮 ＜1.0
甲羥孕酮 NR
美侖孕酮乙酸酯(Melengestrole acetate) ＜10
氯地孕酮乙酸酯(Chlormadinone acetate) ＜10
17α-羥基孕酮 ＜10
可體松 ＜10
氫可體松 ＜10
氟可體松乙酸酯 ＜10
表 16. 17β- 雌二醇含量
樣品 ng/kg 17β- 雌二醇
雞 89
原雞(雞)纖維母細胞/肌母細胞組織4 (表1) 34
原雞(雞)肌母細胞細胞2 (表1) 36
實例 7 ： 基於細胞培養物之肉類產品之烹熟質地的分析
評估基於細胞之肉類樣品之人類質地感受顯著性的物理特性，包括「烹熟咀嚼力」及「烹熟硬度」。
對由生長於貼壁培養物中之細胞產生的肉類產品進行分析，該等肉類產品經歷強制風乾過程以將水分含量調節至65%至85%之間。脫水在低於100℉之溫度下發生，以免「烹熟」或以其他方式使肉類產品內之組分變性。
所有樣品之分析由公司使用配備有5 kg荷重計之TA.XTplus質地分析儀進行。用於分析之樣品具有400 mg+/-40 mg之質量且封裝於直徑為10.4 mm且高度為17 mm之圓柱形容器中。將烹熟樣品在其個別密封容器內部之水浴中保持在150℉下持續90分鐘且在分析之前冷卻。
「烹熟咀嚼力」使用不鏽鋼TA-45門齒探針在以下測試設置下量測：(a) 測試模式                   壓縮(b) 測前速度                   3.00 mm/sec(c) 測試速度                   3.00 mm/sec(d) 測後速度                   10.00 mm/sec(e) 目標模式                   應變(f) 力                            100.0 g(g) 距離                         5.000 mm(h) 應變                         98.0%(i) 觸發類型                   自動(力)(j) 觸發力                      1.0 g(k) 觸發距離                   2.000 mm(l) 斷裂模式                   關閉(m) 斷裂敏感性               10.0 g(n) 斷裂偵測                   停止(o) 停止位置                   起始位置(p) 皮重模式                   自動(q) 溫度設定點               40.0℃(r) 高級選項                   關閉
「烹熟硬度」使用不鏽鋼TA-24圓柱形探針在以下測試設置下量測：(a) 測前速度                   2.00 mm/sec(b) 測試速度                   1.00 mm/sec(c) 測後速度                   5.00 mm/sec(d) 目標模式                   應變(e) 力臨限值                   0(f) 距離                         10.000 mm(g) 應變                         40.0 %(h) 時間                         5.00 sec(i) 觸發類型                   自動(力)(j) 觸發力                      1.0 g(k) 觸發距離                   2.000 mm(l) 斷裂模式                   關閉(m) 斷裂敏感性               10.0 g(n) 皮重模式                   自動(o) 溫度                         4.0℃(p) 高級選項                   開啟(q) 控制烘箱                   禁用(r) 等待溫度                   是(s) 溫度區±                    0.0℃(t) 框偏轉校正               關閉(XT2相容性)
表17展示基於細胞之肉類樣品之烹熟質地。圖13展示共培養物及纖維母細胞單培養組織之烹熟硬度。表 17 ：烹熟質地
   基於細胞之肉類樣品之烹熟質地
   烹熟硬度(g) 烹熟咀嚼力(g)
最小值 284 449
最大值 1903 2966
平均值 947 1343
中值 779 1198
N 33 66
實例 8 ：基於細胞之肉類中的維生素 E 含量
基於細胞之肉類具有較高度富集之α-生育酚(維生素E)。表18展示與習知肉類相比，例示性基於細胞之肉類樣品中維生素E之量為約0.90 mg維生素E/100 g濕質量之基於細胞之肉類(表18)。維生素E使用外部實驗室Certified實驗室根據UPLC方法AOAC 2001.13測定。表 18 ：維生素 E 含量
樣品 n 平均值 標準差
基於細胞之肉類 3 0.90 mg/100g 0.08mg/100g
習知生產的雞肉 27 0.28 mg/100g 0.12 mg/100g
實例 9 ：儲存壽命之測定
方法 I ：將0.5至1.5 g習知或基於細胞之肉類等分至乾淨的新15 mL法爾康管中。樣品全部在-80℃下在管中冷凍。隨後自-80℃移出冷凍的樣品管且使其在室溫下靜置0、1、2、7、14及28天。
在指定天數過去之後，打開樣品管且使用巴氏調配物製得連續稀釋液。將連續稀釋液塗鋪於瓊脂盤(40 g/L Miller LB瓊脂粉末) (100 μL溶液)且用乙醇/火焰滅菌之塗佈器塗開。稀釋為10-1 ，例如1 g於9 ml中。各樣品稀釋液製備兩個培養盤-在37℃下培育所有培養盤48小時且在0、24及48小時攝影。表19展示結果。表 19 ：室溫下之儲存壽命
   0 天 1 天 2 天 7 天 14 天 28 天
基於細胞之肉類 ND ND ND ND ND ND
鴨肉 ND TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC
雞肉 ND TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC
TNTC=過多而未計數 ND=未偵測到                  
方法 II ：將1.0 g習知或活體外基於細胞之肉類等分至乾淨的新15 mL法爾康管中。將樣品在4℃或25℃ (室溫)下儲存3天。
在3天過去之後，打開樣品管且使用巴氏調配物製得連續稀釋液。針對總微生物計數(TC)或大腸桿菌/大腸菌群計數(EC)將連續稀釋液塗鋪在瓊脂盤上-添加1 ml溶液至如上所述之compact Dry培養盤。製備10-1 稀釋液，例如1 g於9 ml中。各樣品稀釋液製備三個培養盤-在37℃下培育所有培養盤48小時且在0、24及48小時攝影。表20展示結果。表 20 ： 室溫下 3 天之儲存壽命 ， EC 及 TC 計數
方法ID 樣品ID 儲存溫度 [ ℃ ] EC 計數(cfu/mL) TC 計數(cfu/mL)
10 習知雞肉 4 ND 2
10 基於細胞之肉類(收集) 4 ND ND
10 基於細胞之肉類(調配) 4 ND ND
10 對照組(空白管) 4 ND ND
10 習知雞肉 25 5.80E+06 7.40E+07
10 基於細胞之肉類(收集) 25 ND ND
10 基於細胞之肉類(調配) 25 ND 8.70E+06
10 對照組(空白管) 25 ND ND
使用上文所提供之方法進行額外分析以評估更長時間段之儲存壽命。在4℃下指定天數過去之後，打開樣品管且使用巴氏調配物製得連續稀釋液。將連續稀釋液塗鋪於瓊脂盤上且評估總好氧細菌計數。表21展示結果。表 21 ： 4 ℃ 下 0-148 天之儲存壽命 ， 總好氧細菌計數 (cfu/g)
   天
   0 2 3 14 30 148
習知雞肉 0 16 17 73 6854 1492063
普通基於細胞之雞肉(收集) 0 0 0 0 442 0
無菌基於細胞之雞肉(收集) 0 0 0 0 49 0
                    
進行額外分析以評估儲存壽命，詳言之以測定在4℃及23℃下直至148天之大腸桿菌及大腸菌群計數。表22至24展示結果。表22展示在4℃下第148天以cfu/g為單位之大腸桿菌及大腸菌群計數。表23及24展示在23℃下第0天、第1天、第2天、第3天、第7天、第30天及第148天之大腸桿菌(表23)及大腸菌群(表24)計數。TMTC指示菌落過多而未計數。表 22 ： 在 4 ℃ 下 148 天之儲存壽命 ， 大腸桿菌及大腸菌群計數
4 ℃      
樣品 第148 天
   大腸桿菌 (cfu/g) 大腸菌群 (cfu/g)
習知雞肉 0 990476
基於細胞之肉類(收集) 0 0
無菌基於細胞之肉類(收集) 0 0
基於細胞之肉類(調配) 0 0
無菌基於細胞之肉類(調配) 0 0
表 23 ： 23 ℃下 0-148 天之儲存壽命，大腸桿菌計數
23 ℃ ，大腸桿菌                     
第 0 天 第 1 天 第 2 天 第 3 天 第 7 天 第 30 天 第 148 天
習知雞肉 3.23E+00 1.33E+06 4.07E+06 3.84E+07 9.75E+06 終止
基於細胞之肉類(收集) 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
無菌基於細胞之肉類(收集) 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
基於細胞之肉類(調配) 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
無菌基於細胞之肉類(調配) 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
表 24 ： 23 ℃下 0-148 天之儲存壽命，大腸菌群計數
23 ℃， 大腸菌群 (cfu/g)                     
第 0 天 第 1 天 第 2 天 第 3 天 第 14 天 第 30 天 第 148 天
習知雞肉 0.00E+00 0.00E+00 6.11E+06 5.77E+06 7.47E+05 終止
基於細胞之肉類(收集) 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
無菌基於細胞之肉類(收集) 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
基於細胞之肉類(調配) 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
無菌基於細胞之肉類(調配) 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
實例 10 ：基於細胞之家禽肉類中水分之測定
根據AOAC 950.46分析水分。表25中所展示之結果包括使用血清產生的三個非連續批次之基於細胞之家禽肉類及無血清的三個非連續批次之基於細胞之家禽肉類。當與USDA之農業研究服務中心食品資料中心資料庫(Agricultural Research Service FoodData Central database)比較基於細胞之家禽肉類結果時，習知雞肉選擇兩種類別：(1)所有USDA雞肉(無器官)，其包括來自27個不同公開樣品之資料，範圍跨越帶皮及無皮淡色肉、帶皮及無皮暗色肉、碎生肉及用於焙烤或燉燒之其他雞肉樣品，但不包括僅皮或雞器官之資料；及(2) USDA白雞肉(無皮膚)，其包括來自4個公開樣品的資料，規定為淡色肉，僅肉類。
表25展示一式三份含血清生產批次、一式三份無血清生產批次以及來自USDA之農業研究服務中心食品資料中心資料庫之雞肉資料(「所有USDA雞肉(無器官)」及「USDA白雞肉(無皮膚)」)之水分資料，報導為平均值(avg.)及標準差(std. dev.)。表 25. 水分分析
參數 單位 含血清基於細胞之家禽肉類 無血清基於細胞之家禽肉類 所有 USDA 雞肉 ( 無器官 ) USDA 白 雞 肉 ( 無皮膚 )
Avg. Std. Dev. Avg. Std. Dev Avg. Std. Dev. N Avg. Std. Dev. N
水分 g/100 g 80.68 0.45 75.10 2.67 71.00 5.20 27 74.08 0.68 4
圖 1 展示與習知肉類相比的例示性免屠宰基於細胞之肉類樣品中發現的胺基酸概況。USDA資料庫包括來自以下之胺基酸資料：藍鰭鮪、吳郭魚、黃鰭鮪、火雞、羔羊、雞、牛肉、可尼西野味雞(cornish game hen)、珠雞、野雞、鵪鶉、乳鴿、鵝、鴨、鴕鳥、牛上腰脊肉、牛短肋肉、牛小腿肉、雞胸肉、雞大腿、豬肩、草飼野牛、雞翅、雞頸、火雞胸肉、火雞翅、火雞大腿及羔羊小腿肉。
圖 2 展示例示性基於細胞之肉類樣品中羥脯胺酸之平均濃度範圍(表示為g羥脯胺酸/100 g濕質量之基於細胞之肉類)。
圖 3 展示具有指示微生物污染的細菌菌落之代表性培養盤，展示免屠宰基於細胞之鴨肉、店售(習知)牛肉及店售雞肉之例示性樣品的結果。
圖 4 展示跨越例示性免屠宰基於細胞之肉類樣品之飽和、單不飽和及多不飽和脂肪酸的總脂肪酸組成。
圖 5 展示收集自習知肉類產品之USDA資料庫之脂肪酸資料的主成分分析(PCA)。
圖 6 展示免屠宰基於細胞之雞肉之例示性樣品中的ω 6:ω 3脂肪酸之比率。
圖 7 展示在用於自培養物中之細胞產生基於細胞之肉類(CBM)之培養基中血清之存在可影響脂肪酸概況；該圖展示在無血清培養基相對於含有血清之培養基中產生之例示性免屠宰基於細胞之肉類樣品中之脂肪酸百分比。W3=ω 3 FA；W=6=ω 6 FA；W=9=ω 9 FA。
圖 8 展示使用來自不同來源之血清在免屠宰基於細胞之肉類樣品中賦予不同脂肪酸概況。資料來自表1之方法10。關鍵詞-BS：牛血清；CS：雞血清；FBS：胎牛血清；Hy：基於大豆之植物水解產物；培養基含有8-10%特定血清；DMEM-F12用作基礎培養基。
圖 9 展示來自肌母細胞之多株群體的肌母細胞之經分離純系可影響免屠宰基於細胞之肉類樣品的脂肪酸概況。
圖 10 展示免屠宰基於細胞之肉類之脂肪酸概況受培養基組成及靶向肝X受體β (LXRβ)之促效劑之添加影響。
圖 11 展示免屠宰基於細胞之肉類之脂肪酸概況受培養基組成及核黃素之添加影響。
圖 12 展示將脂肪酸滴定至用於培養基於細胞之肉類之培養基中可改變免屠宰基於細胞之肉類的脂肪酸概況。
圖 13 展示與習知雞肉及牛肉相比的由纖維母細胞/肌母細胞共培養物及單培養物產生之免屠宰基於細胞之肉類的烹熟硬度。

Claims (34)

  1. 一種用於膳食攝入之免屠宰肉類產品，其呈現延長的儲存壽命，其中該儲存壽命與藉由屠宰獲得之習知肉類相比延長，且其中在收集之後，該儲存壽命延長至少3天。
  2. 如請求項1之免屠宰肉類產品，其中在收集之後，該延長的儲存壽命在約0℃至約30℃下維持至少3天。
  3. 如請求項1至2中任一項之免屠宰肉類產品，其中該儲存壽命係在收集後且在調配前測定。
  4. 如請求項1至3中任一項之免屠宰肉類產品，其中該儲存壽命係在調配之後測定。
  5. 如請求項3之免屠宰肉類產品，其中當肉類在非無菌條件下收集時，該儲存壽命延長。
  6. 如請求項1至5中任一項之免屠宰肉類產品，其中該儲存壽命藉由量測總微生物計數(TC)、大腸桿菌/大腸菌群計數(EC)、大腸桿菌微生物計數或大腸菌群計數來測定。
  7. 如請求項6之免屠宰肉類產品，其中藉由屠宰獲得之習知肉類的TC量測值比免屠宰肉類產品之TC量測值高至少1.5倍。
  8. 如請求項1至7中任一項之免屠宰肉類產品，其包含不超過1 cfus微生物污染/g濕質量。
  9. 如請求項1至8中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含不超過約1 μg類固醇激素。
  10. 如請求項1至9中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含約50 g至約90 g重量之胺基酸/100 g乾質量。
  11. 如請求項1至10中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含呈指定量(表示為g胺基酸/100 g總胺基酸)的以下胺基酸中之一或多者：色胺酸約1至約2.2，蘇胺酸約4.6至6.5，異白胺酸約3.8至約5，白胺酸約6.1至約8.9，離胺酸約5.7至約8.8，甲硫胺酸約0.14至約3.0，半胱胺酸約1.5至約1.8，苯丙胺酸約3.7至約4.8，酪胺酸約3.0至約5.2，纈胺酸約4.8至約6.1，精胺酸約7.0至約8.0，組胺酸約2.5至約4，丙胺酸約5.0至約6.3，天冬胺酸約8.6至約10.4，麩胺酸約12.5至約14.6，甘胺酸約4.6至約9.8，脯胺酸約4.6至約6.8，絲胺酸約4.4至約5.3，及/或羥脯胺酸約0.0至4.0。
  12. 如請求項1至11中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品具有約65%至約95%之水分含量，其中該水分含量係在收集之後但在調配之前量測。
  13. 如請求項1至12中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含至少約0.5 mg維生素E/100 g濕質量之該免屠宰肉類產品。
  14. 如請求項1至13中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含呈指定量之以下脂肪酸類別中之一或多者，該量表示為該類別相對於總脂肪酸之%：a. 在約10%至約60%之間的飽和脂肪酸含量；b. 在約10%至約60%之間的單不飽和脂肪酸含量；及c. 在約1%至約50%之間的多不飽和脂肪酸含量。
  15. 如請求項1至14中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含約2:1至18:1比率之ω 6:ω 3脂肪酸類別。
  16. 如請求項1至15中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含免屠宰雞肉、鴨肉或牛肉，且該習知肉類包含藉由屠宰獲得之雞肉、鴨肉或牛肉。
  17. 如請求項1至16中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品實質上不含血管結構。
  18. 如請求項1至17中任一項之免屠宰肉類產品，其中該習知肉類未經加工。
  19. 一種用於膳食攝入之免屠宰肉類產品，其與藉由屠宰獲得之習知肉類相比，呈現更低的微生物污染計數，其中在收集之後，該更低的微生物污染計數呈現至少3天。
  20. 如請求項19之免屠宰肉類產品，其中在收集之後，該更低的微生物污染計數在約0℃至約30℃下維持至少3天。
  21. 如請求項19至20中任一項之免屠宰肉類產品，其中該微生物污染計數係在收集之後且在調配之前測定。
  22. 如請求項19至21中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品維持在非無菌條件下。
  23. 如請求項19至22中任一項之免屠宰肉類產品，其中該微生物污染計數藉由量測總微生物計數(TC)、大腸桿菌/大腸菌群計數(EC)、大腸桿菌微生物計數或該大腸菌群計數來測定。
  24. 如請求項19至23中任一項之免屠宰肉類產品，其包含不超過1 cfus微生物污染/g濕質量。
  25. 如請求項19至24中任一項之免屠宰肉類產品，其中藉由屠宰獲得之習知肉類的TC量測值比免屠宰肉類產品之TC量測值高至少1.5倍。
  26. 如請求項19至25中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含不超過約1 μg類固醇激素。
  27. 如請求項19至26中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含呈指定量(表示為g胺基酸/100 g總胺基酸)的以下胺基酸中之一或多者：色胺酸約1至約2.2，蘇胺酸約4.6至6.5，異白胺酸約3.8至約5，白胺酸約6.1至約8.9，離胺酸約5.7至約8.8，甲硫胺酸約0.14至約3.0，半胱胺酸約1.5至約1.8，苯丙胺酸約3.7至約4.8，酪胺酸約3.0至約5.2，纈胺酸約4.8至約6.1，精胺酸約7.0至約8.0，組胺酸約2.5至約4，丙胺酸約5.0至約6.3，天冬胺酸約8.6至約10.4，麩胺酸約12.5至約14.6，甘胺酸約4.6至約9.8，脯胺酸約4.6至約6.8，絲胺酸約4.4至約5.3，及/或羥脯胺酸約0.0至4.0。
  28. 如請求項19至27中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含呈指定量之以下脂肪酸類別中之一或多者，該量表示為該類別相對於總脂肪酸之%：a. 在約29%至約42%之間的飽和脂肪酸含量；b. 在約19%至約54%之間的單不飽和脂肪酸含量；及c. 在約5%至約36%之間的多不飽和脂肪酸含量。
  29. 如請求項19至28中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含約2:1至18:1比率之ω 6:ω 3脂肪酸類別。
  30. 如請求項19至29中任一項之免屠宰肉類產品，其中該免屠宰肉類產品包含免屠宰雞肉、鴨肉或牛肉，且該習知肉類包含藉由屠宰獲得之雞肉、鴨肉或牛肉。
  31. 一種生產相較於未加工的藉由屠宰獲得之習知肉類呈現儲存壽命增加的免屠宰肉類產品之方法，該方法包含： a. 提供來自非人類生物體之細胞； b. 在懸浮培養條件或貼壁培養條件下在培養基中培養該等細胞，其中該培養基實質上不含血清及源於動物之其他組分；及 c. 分離該等細胞且產生該免屠宰肉類產品。
  32. 如請求項31之方法，其中該等細胞包含肌母細胞、纖維母細胞、脂肪細胞、內皮細胞、中胚層譜系之細胞及其組合。
  33. 如請求項31至32中任一項之方法，其中該等細胞至少包含纖維母細胞及肌母細胞，且該等纖維母細胞及肌母細胞係以約95F:5M至約5F:95M之比率提供。
  34. 如請求項31至33中任一項之方法，其中該方法包含調節該培養基之脂肪酸含量，其中所得免屠宰肉類產品具有約2:1至約18:1比率之ω 6:ω 3脂肪酸類別。
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