KR20220137722A - 육류 제품의 특징 - Google Patents

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KR20220137722A
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케빈 제이 카이저
모건 로렌스 리스
마크 이 주하스
제시카 엠 조슬린
우마 에스 발레티
에릭 엔 슐즈
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업사이드 푸즈 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 도축되지 않은 육류 제품의 생산에 유용한 방법 및 조성물, 및 이의 특징을 제공한다. 도축되지 않은 육류 제품은 죽은 동물의 조직을 채취하여 조달하는 통상적인 육류와 비교할 때 몇 가지 차이점이 있다. 이러한 구별 지점은 스테로이드 호르몬, 항생제 또는 미생물 오염의 현저한 감소 또는 실질적 없음; 낮은 지방 함량; 혈관 구조 없음; 실온 및 냉장 시 보관 수명 연장을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

Description

육류 제품의 특징
본 발명은 육류 제품의 생산에 관한 것이다.
동물 육류는 전 세계의 많은 사람들에게 최우선적으로 선택되는 단백질 공급원이다. 2018년 미국에서 육류(닭고기, 칠면조 고기, 송아지 고기, 양고기, 쇠고기, 돼지고기)의 총 추정 소비량은 1인당 219 파운드이었다. 일반적으로 도축을 포함하는 가축, 가금류 및 어류와 같은 도축된 동물에서 육류를 채취하는 전통적인(통상적인) 방법은 미래의 육류 수요를 충족시키기에 충분하지 않을 수 있다고 예상된다. 또한, 이러한 공급원으로부터의 육류 생산은 법적으로 허용되지만, 미생물 오염 수준이 증가하고 기존 육류 제품에서 전통적으로 발견되는 호르몬 및 항생제에 대한 노출과 같은 몇 가지 단점과 관련이 있다. 통상적인 육류 생산은 또한 열량 투입의 열악한 전환, 온실 가스 배출, 토지 사용, 물 사용 및 지역 오염과 같은 환경적 단점과 관련이 있다. 도축을 포함하는 통상적인 육류 생산에 대한 한 가지 대안은 실험실에서 후생동물 세포를 배양하여 육류를 생산하는 것이다(본 명세서에서는 세포 기반 육류, 세포 기반 육류, 세포 배양 기반 육류, 세포 기반 육류, 세포 기반 육류 또는 배양 육류으로 상호교환적으로 지칭됨).
세포 기반 육류 제품을 식품 공급망에 채택하는 것은 다량 및 미량 영양소 프로필, 호르몬 수준, 및 항생제 및 저장 수명을 포함하나 이에 제한되지 않는 육류 자체의 정량적 특성과 같은 다양한 인자에 의존할 것이다. 낮은/없는 호르몬 또는 항생제 함량 및 미생물 계수와 같은 구별 가능한 요소를 찾는 동시에 비교 가능한 영양소 프로필을 보장하기 위해 기존 제품과 비교가 필요할 것이다. 세포 기반 육류 제품은 아직 상업적으로 이용 가능하지 않지만 궁극적으로 규제 기관은 시장용 육류 제품의 정량화 및 책임, 판매 전 식품 안전 확립 및 시장용 육류 제품의 시판 후 규정 준수를 요구할 것이다.
세포 기반 육류의 생산 및 풍미 및 질감에 대한 맞춤화는 여전히 여러 요인에 의해 제한되며 일관되고 체계적인 생산은 소수에 불과하다. 본 명세서에는 이러한 요구 및 기타 관련 요구를 처리하는 조성물 및 방법이 제공된다.
배양액에서 성장된 세포로부터 생성된 도축되지 않은 육류 제품의 생산과 관련된 방법 및 조성물이 본 명세서에 제공된다; 이들 육류 제품은 본 명세서에서 세포 기반 육류 제품으로 상호교환적으로 지칭된다.
한 양태에서, 연장된 저장 수명을 나타내는 식이 소비용 도축 없는 육류 제품이 본 명세서에 제공되며, 여기서 저장 수명은 도축에 의해 얻은 통상적인 육류와 비교할 때 채취 후 다양한 기간 동안 연장된다. 관련 양태에서, 도축에 의해 얻은 통상적인 육류와 비교하여 더 낮은 미생물 오염 계수를 나타내는 식이 소비용 도살되지 않은 육류 제품이 본 명세서에 제공하며, 여기서 더 낮은 미생물 오염 계수는 채취 후 다양한 기간 동안 나타난다. 도축되지 않은 육류 제품은 본 명세서에 개시된 바와 같은 임의의 종의 것일 수 있다.
또한 섬유아세포, 근아세포, 지방세포, 내피 세포, 중배엽 계통의 세포, 및 이들의 조합과 같은 세포를 현탁액 배양 또는 부착 형식으로 배양하는 단계를 포함하여 본 발명의 도축되지 않은 육류 제품을 생성하는 방법이 또한 본 명세서에 제공된다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 통상적인 육류와 비교하여 예시적인 도축되지 않은 세포 기반 육류 샘플에서 발견되는 아미노산 프로파일을 보여준다. USDA 데이터베이스는 참다랑어, 틸라피아, 황다랑어, 칠면조, 양고기, 닭고기, 쇠고기, 콘월어 게임 암탉, 기니 가금, 꿩, 메추라기, 비둘기 새끼, 거위, 오리, 타조, 쇠고기 등심, 쇠고기 쇼트 갈비, 비프 정강이, 닭 가슴살, 닭 허벅지, 돼지 어깨, 풀을 먹인 들소, 닭 날개, 닭 목, 칠면조 가슴살, 칠면조 날개, 칠면조 허벅지 및 양고기 정강이의 아미노산 데이터를 포함한다.
도 2는 예시적인 세포 기반 육류 샘플에서 하이드록시프롤린의 평균 농도 범위를 보여준다(세포 기반 육류의 습식 질량 100g당 하이드록시프롤린의 그램으로 표시됨).
도 3은 미생물 오염을 나타내는 박테리아 콜로니가 있는 대표적인 플레이트를 보여주며, 도축되지 않은 세포 기반 오리, 매장에서 구매한(일반) 쇠고기 및 매장에서 구매한 닭고기의 예시적인 샘플에 대한 결과를 보여준다.
도 4는 도축되지 않은 세포 기반 육류 샘플의 예시에 걸친 포화, 단일불포화 및 다중불포화 지방산에 대한 총 지방산 조성물을 보여준다.
도 5는 기존 육류 제품에 대한 USDA 데이터베이스에서 수집된 지방산 데이터의 주성분 분석(PCA)을 보여준다.
도 6은 도축되지 않은 세포 기반 닭고기의 예시적인 샘플에서 오메가 6 대 3 지방산의 비율을 보여준다.
도 7은 배양액 속 세포로부터 세포 기반 육류(CBM)를 생성하는 데 사용되는 배지에 혈청이 존재하면 지방산 프로필에 영향을 미칠 수 있음을 보여준다; 도면은 무혈청 배지 대 혈청 함유 배지에서 생산된 예시적인 도축되지 않은 세포 기반 육류 샘플의 지방산 백분율을 보여준다. W3 = 오메가 3 FA; W=6= 오메가 6 FA; W=9 = 오메가 9 FA.
도 8은 상이한 공급원으로부터의 혈청을 사용하는 것이 도축되지 않은 세포 기반 육류 샘플에서 상이한 지방산 프로파일을 부여함을 보여준다. 데이터는 표 1의 방법 10에서 가져온 것다. Key - BS: 소 혈청; CS: 치킨 혈청; FBS: 소 태아 혈청; Hy: 대두 기반 식물 가수분해물; 배지는 특정 혈청의 8-10%를 함유하였고; DMEM-F12를 기본 배지로 사용하였다.
도 9는 근아세포의 다클론성 집단으로부터 근아세포의 분리된 클론이 도축되지 않은 세포 기반 육류 샘플의 지방산 프로파일에 영향을 미칠 수 있음을 보여준다.
도 10은 도축되지 않은 세포 기반 육류의 지방산 프로파일이 배지 조성물 및 간 X 수용체 β(LXRβ)를 표적으로 하는 효현제의 추가에 의해 영향을 받는다는 것을 보여준다.
도 11은 도축되지 않은 세포 기반 육류의 지방산 프로파일이 배지 조성물 및 리보플라빈 첨가에 의해 영향을 받는다는 것을 보여준다.
도 12는 세포 기반 육류를 배양하는 데 사용되는 배지에 지방산을 적정하면 도축되지 않은 세포 기반 육류의 지방산 프로필을 변경할 수 있음을 보여준다.
도 13은 섬유아세포/근아세포 공동 배양 및 단일 배양에서 생성된 도축되지 않은 세포 기반 육류의 조리된 경도를 기존 닭고기 및 쇠고기와 비교하여 보여준다.
육류 제품의 도축되지 않은 생산과 관련된 방법 및 조성물이 본 명세서에 제공되며, 세포의 성장, 채취 및 육류 제품으로의 제제화를 위한 세포 배양 기반 방법의 사용에 의존한다. 본 발명의 도축되지 않은 육류 제품은 도축으로 얻은 통상적인 육류와 비교할 때 몇 가지 차이점이 있으며, 이러한 차이점은 전체에 걸쳐 기술된다.
특정 실시태양을 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 본 명세서에 설명된 특정 실시태양으로 제한되지 않으며, 이는 다양할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정한 예시적인 실시예를 설명하기 위한 것이며, 달리 정의되지 않는 한 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 일반적으로 본 발명의 맥락 내에서, 그리고 각 용어가 사용되는 특정 맥락에서 본 기술 분야에서 통상적인 의미를 갖는다. 특정 용어는 본 발명의 조성물 및 방법 및 이를 제조 및 사용하는 방법을 설명함에 있어 실무자에게 추가 지침을 제공하기 위해 이하 또는 명세서의 다른 곳에서 논의된다. 용어 사용의 범위와 의미는 해당 용어가 사용되는 특정 맥락에서 명백할 것이다. 이와 같이, 본 명세서에 기술된 정의는 특정 조성물 또는 생물학적 시스템에 제한되지 않고, 본 발명의 특정 실시태양을 확인하는 예시적인 지침을 제공하기 위한 것이다.
본 발명 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 내용이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다.
본 발명 및 첨부된 청구범위 전체에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 다음의 언급된 요소 또는 요소들의 그룹의 포함을 암시하나 다른 요소 또는 요소들의 그룹의 배제를 암시하지 않는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 세포 기반 육류의 맥락에서 용어 "식용"은 날고기 또는 조리되지 않은 육류 뿐만 아니라 부분적으로 또는 완전히 조리된 육류를 포함한다.
특정 정의가 제공되지 않는 한, 본 명세서에 기술된 분자 생물학, 세포 생물학, 분석 화학 및 합성 유기 화학과 관련하여 사용되는 명명법, 실험실 절차 및 기술은 당업계에 널리 공지되고 일반적으로 사용되는 것이다. 표준 기술은 재조합 기술, 분자 생물학, 미생물학, 화학 합성 및 화학 분석에 사용될 수 있다.
통상적인 육류를 얻는 방식에 적용되는 용어 "도축"은 식이 소비를 위해 육류를 직접 채취할 목적으로 동물을 죽이는 데 전통적으로 사용되는 모든 방법을 포함한다.
본 발명의 세포 기반 육류 제품에 적용되는 용어 "도축되지 않는"은 배양 중인 세포로부터 시작하여 육류가 생성되는 과정 및 식이 섭취를 위해 그 동물로부터 고기를 직접 얻기 위해 동물의 도축을 포함하지 않는 방법을 지칭한다. 일부 실시태양에서, 세포 배양 방법에 사용하기 위한 출발 세포는 동물의 도축 또는 생검 후에 얻어질 수 있는 것이 가능하다는 것이 이해되며, 비록 배양에 사용하기 위한 출발 세포는 이런 방식으로 얻을 수 있지만, 채취 및 가능한 후속 제제에 의한 세포 배양으로 얻은 육류는 여전히 도축되지 않은 방식으로 얻은 육류로 간주된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 일반적으로 도축되지 않은 세포 기반 육류 제품의 채취는 완충된 물(또는 기타 수용액) 용액을 사용하여 육류가 성장하는 곳(예를 들어, 표면 생물 반응기의 또는 현탁액에서 배양된 세포를 포함하는 용기에서)에서 육류를 제거할 수 있고 육류는 수집 장치(예를 들어, 그물, 체, 소쿠리)에 포획될 수 있다. 일부 실시태양에서 육류는 물리적 방법(스크레이핑과 같은), 효소적 방법 및/또는 화학적 방법에 의해 채취될 수 있다. 일부 실시태양에서 육류는 상기 언급된 방법 중 임의의 것에 의해 채취될 수 있고 후속적으로 완충 용액(또는 다른 수용액)으로 헹구어질 수 있다.
"세포 기반 육류", "도축되지 않은 세포 기반 육류", "시험관 내 생산 육류", "시험관 내 세포 기반 육류", "배양 육류", "도축되지 않은 배양 육류", "시험관 내 생산 배양 육류", "시험관 내 육류", "시험관 내 배양 육류" 및 기타 유사한 문구는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 배양액 속 세포에서 시작하여 시험관 내에서 생성된 육류 및 식이 소비를 위해 동물로부터 육류를 직접 얻기 위해 동물을 도축하는 것을 포함하지 않는 방법을 의미한다.
I. 도축되지 않은 세포 기반 육류의 생성
도축되지 않는 방식으로 세포 기반 육류 제품을 생산하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
A. 세포
본 발명의 도축되지 않은 세포 기반 육류 제품은 자연 발생, 형질전환 또는 변형된 세포를 배양액에서 배양함으로써 생산된 조성물이다.
본 발명의 방법에 사용된 세포는 1차 세포 또는 세포주일 수 있다. 본 명세서에 제공된 방법은 배양 중인 모든 후생동물 세포에 적용할 수 있다. 일반적으로, 세포는 조직이 식이 섭취에 적합한 모든 후생동물 종에서 유래할 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포는 골격근 조직 사양(예를 들어, 근아세포)에 대한 능력을 입증한다. 다른 실시태양에서, 세포는 골격근 조직 사양에 대한 능력을 나타내지 않는다.
일부 실시태양에서, 세포는 인간 또는 비인간 식이 소비를 위해 의도된 임의의 비인간 동물 종으로부터 유래된다. 일부 실시태양에서 세포는 조류, 양, 염소, 돼지, 소 또는 물고기 기원의 세포일 수 있다. 일부 실시태양에서 세포는 가축, 가금류, 조류, 사냥감 또는 수생 종의 것일 수 있다.
일부 실시태양에서, 세포는 가축, 예컨대 가축, 예컨대 가축, 염소, 낙타, 물소, 토끼 등에서 유래된다. 일부 실시태양에서, 세포는 국내 닭, 칠면조, 오리, 거위, 비둘기 등과 같은 가금류로부터 유래된다. 일부 실시태양에서, 세포는 야생 사슴, 가금류, 물새, 토끼 등과 같은 사냥감 종으로부터 유래한다. 일부 실시태양에서, 세포는 특정 어류, 갑각류, 연체동물, 두족류, 고래류, 악어, 거북이, 개구리 등을 포함하여, 야생 어업 또는 양식업으로부터 상업적으로 채취된 수생 종 또는 반수생 종으로부터 유래한다.
일부 실시태양에서, 세포는 외래종, 보존 또는 멸종 동물 종으로부터 유래한다. 일부 실시태양에서, 세포는 갈루스 갈루스(Gallus gallus), 갈루스 도메스티쿠스(Gallus domesticus), 보스 타우루스(Bos taurus), 수 스크로파(Sous scrofa), 멜레아그리스 갈로파보(Meleagris gallopavo), 아나스 플라티린초스(Anas platyrynchos), 살모 살라르(Salmo salar), 툰누스 티누스(Thunnus thynnus), 오비스 아리에스(Ovis aries), 코터닉스(Coturnix), 카프라 아이가루스 히르쿠스(Capra aegagrus hircus), 또는 호마루 아메리카누스(Homarus americanus)로부터 유래한다. 따라서, 본 발명의 예시적인 도축 없는 세포 기반 육류 제품은 조류 육류 제품, 닭 육류 제품, 오리 육류 제품, 및 소 육류 제품을 포함한다.
일부 실시태양에서, 세포는 1차 줄기 세포, 자가 재생 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 또는 전환분화된 만능 줄기 세포이다.
일부 실시태양에서, 세포는 배양된 육류 생산을 위한 골격근으로의 세포의 신속하고 효율적인 전환을 유도하기 위해 유전자 스위치에 의해 변형될 수 있다.
일부 실시태양에서, 세포는 근육 또는 근육 유사 세포가 되도록 예정된 근원성 세포이다. 일부 실시태양에서, 근원성 세포는 본래 근원성이며, 예를 들어, 근아세포이다. 본래의 근원성 세포는 근아세포, 근육세포, 위성 세포, 측부 집단 세포, 근육 유래 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 근원성 세포주위세포 또는 중간혈관모세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시태양에서, 세포는 골격근 계통의 세포이다. 골격근 계통의 세포는 근아세포, 근육세포, 및 위성 세포, 측부 집단 세포, 근육 유래 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 근원 혈관주위세포 및 중혈관모세포를 포함하는 근원성 전구체라고 불리는 골격근 전구 세포를 포함한다.
일부 실시태양에서, 세포는 비-근원성 세포이고, 이러한 비-근원성 세포는 근원성으로 프로그래밍될 수 있으며, 예를 들어 세포는 하나 이상의 근원성 전사 인자를 발현하도록 변형된 섬유아세포를 포함할 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 근원성 전사 인자는 MYOD1, MYOG, MYF5, MYF6, PAX3, PAX7, 파라로그, 오쏘로그, 및 이의 유전적 변이체를 포함한다. 일부 실시태양에서, 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된 PCT 공개 WO/2015/066377에 기술된 바와 같이 세포가 하나 이상의 근원성 전사 인자를 발현하도록 변형된다.
일부 실시태양에서, 세포는 본 명세서에 기술된 세포 집단의 혼합물, 예를 들어, 공동 배양에서 섬유성 세포와 근육 세포의 혼합물, 예를 들어, 공동 배양에서 섬유아세포와 근아세포의 혼합물을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세포 기반 육류의 생산에 사용되는 세포는 현탁액 공동 배양액에서 섬유아세포 및 근아세포의 혼합물이다. 일부 실시태양에서 세포 기반 육류의 생산에 사용되는 세포는 부착 공동 배양액에서 섬유아세포 및 근아세포의 혼합물이다. 일부 실시태양에서, 공동 배양액의 세포는 지방세포, 내피 세포, 및 일반적으로 중배엽 계통으로부터의 세포와 같은 추가 세포 유형을 포함한다.
일부 공동-배양 실시태양에서, 세포는 현탁 공동-배양에 있고, 일부 실시태양에서, 세포는 부착 공동-배양에 있으며, 일부 실시태양에서, 배양 공정은 두 기술을 모두 사용한다. 본 명세서에서 제공하는 공동-배양액은 적어도 섬유아세포 및 근아세포의 혼합물을 포함한다. 일부 실시태양에서, 섬유아세포 대 근아세포(F 및 M으로 지정됨)의 비는 약 5F:95M 내지 약 95F:5M의 범위이다. 예시적인 실시태양에서, 섬유아세포 대 근아세포의 비는 약 5F:95M, 10F:90M, 15F:85M, 20F:80M, 25F:75M, 30F:70M, 35F:65M, 40F:60M, 45F:05:50M, 55F:45M, 60F:40M, 65F:35M, 70F:30M, 75F:25M, 80F:20M, 85F:15M, 90F:10M, 또는 약 95F:5M이다.
일부 실시태양에서, 세포는 경로, 예를 들어, HIPPO 신호 경로를 억제하도록 유전적으로 변형된다. HIPPO 신호전달 경로를 억제하는 예시적인 방법은 전체가 본 명세서에 참조로 포함된 PCT 출원 번호 PCT/US2018/031276에 기술된다.
일부 실시태양에서, 세포는 텔로머라제 역전사효소(TERT)를 발현하고/하거나 사이클린-의존성 키나제 억제제(CKI)를 억제하도록 변형된다. 일부 실시태양에서, 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된 PCT 공개 WO 2017/124100에 기술된 바와 같이 세포는 TERT를 발현하고/하거나 사이클린 의존성 키나제 억제제를 억제하도록 변형된다.
일부 실시태양에서, 세포는 글루타민 합성효소(GS), 인슐린 유사 성장 인자(IGF) 및/또는 알부민을 발현하도록 변형된다. GS, IGF, 및/또는 알부민을 발현하도록 세포를 변형시키는 예시적인 방법은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 PCT 출원 번호 PCT/US2018/042187에 기술된다.
일부 실시태양에서, 세포는 본 명세서에 기술된 변형의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
B. 배양 기반시설
본 명세서에 언급된 바와 같이, 배양 기반시설은 2차원 또는 3차원 육류 제품을 제공하기 위해 세포가 배양되거나 배양되는 환경을 지칭한다.
배양 기반시설은 롤러 병, 튜브, 실린더, 플라스크, 페트리 접시, 멀티웰 플레이트, 접시, 통, 인큐베이터, 생물반응기 및 산업용 발효기를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
배양 기반시설 자체는 3차원 구조 또는 모양을 가질 수 있지만, 배양 기반시설에서 배양된 세포는 세포의 단층을 형성할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 3차원 세포 바이오매스의 스캐폴드가 없는 자가 조립을 제공하기 위해 배양 기반시설에서 후생동물 세포의 3차원 성장을 촉진할 수 있다.
3차원 배양 기반시설은 원하는 대로 다양한 크기, 모양 및 형태로 조각될 수 있어 근육 세포가 스테이크, 안심, 정강이, 닭 가슴살, 드럼스틱, 양갈비, 생선 필레, 랍스터 꼬리 등과 같은 다양한 유형의 근육 조직과 유사하게 성장하고 닮을 수 있도록 모양과 형태를 제공할 수 있다. 3차원 배양 기반시설은 무독성 천연 또는 합성 생체 재료로 만들어 섭취해도 유해하지 않을 수 있다. 천연 생체재료는, 예를 들어, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 또는 기타 세포외 기질을 포함할 수 있다. 합성 생체재료는, 예를 들어, 수산화인회석, 알지네이트, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 또는 이들의 코폴리머를 포함할 수 있다. 3차원 재배 기반시설은 고체 또는 반고체 지지체로 형성될 수 있다.
배양 기반시설은 임의의 규모일 수 있고 임의의 부피의 세포 바이오매스 및 배양 시약을 지원할 수 있다. 일부 실시태양에서, 배양 기반시설은 약 10μL 내지 약 100,000L의 범위이다. 예시적인 실시태양에서, 배양 기반시설은 약 10μL, 약 100μL, 약 1mL, 약 10mL, 약 100mL, 약 1L, 약 10L, 약 100L, 약 1000L, 약 10,000L, 또는 심지어 약 100,000 범위이다.
일부 실시태양에서, 재배 기반시설은 기질을 포함한다. 배양 기반시설은 투과성 기질(예를 들어, 생리학적 용액에 대한 투과성) 또는 불투과성 기질(예를 들어, 생리학적 용액에 대한 불투과성)을 포함할 수 있다. 기판은 평평하거나 오목하거나 볼록할 수 있다. 기질은 세포 성장 및 세포 시트 부착을 촉진하도록 텍스처링될 수 있다.
일부 실시태양에서, 배양 기반시설에서 세포의 배양은 자가 스캐폴드로서 작용하여 3차원 세포 성장을 지시, 예를 들어, 기질에 수직인 평면에서 세포의 부착, 증식 및 비대를 지시할 수 있는 세포외 기질(ECM)의 생산을 유도할 수 있다.
일부 실시태양에서, 배양 기반시설은 3차원 세포 바이오매스의 자가 조립을 촉진하기 위해 외인성으로 추가된 스캐폴드를 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 배양 기반시설은 하이드로겔 또는 연질 한천과 같은 외인성 스캐폴드를 포함하지 않는다.
C. 배양조건
세포 기반 육류의 생성을 위한 배양 조건은 일반적으로 무균 및 살균이다.
세포는 부착 배양 형식으로 성장하여 세포 시트를 형성하거나 현탁액 배양 형식으로 성장하여 세포 펠릿을 형성할 수 있다. 표 1은 생산될 수 있는 다양한 육류 제품에 대한 예시적인 배양 방법을 제공한다.
일부 실시태양에서, 배지는 동물로부터 유래된 혈청 또는 기타 성분이 실질적으로 없다.
따라서, 일부 실시태양에서, (a) 비-인간 유기체로부터의 세포를 제공하는 단계; (b) 세포가 현탁 배양 또는 부착 배양에서 성장하는 조건하에서 배지에서 세포를 배양하는 단계, 여기서 배지는 혈청 및 동물 유래의 기타 성분이 실질적으로 없다; 및 선택적으로 (c) 세포를 분리하고 도축되지 않은 육류 제품을 생산하는 단계를 포함하여 도축되지 않은 세포 기반 육류를 생산하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시태양에서, 배양액 속 세포는 섬유아세포, 근아세포, 또는 섬유아세포 및 근아세포의 공동-배양액을 포함하고; 일부 실시태양에서 공동 배양액 속 세포는 지방세포, 내피 세포, 및 일반적으로 중배엽 계통의 세포와 같은 추가 세포 유형을 포함한다.
일부 실시태양에서, 도축에 의해 얻은 통상적인 육류에 비해 연장된 저장 수명 및/또는 더 낮은 미생물 함량을 나타내는 도축되지 않은 육류 제품을 생산하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 이 방법은 (a) 비-인간 유기체로부터의 세포를 제공하는 단계; (b) 현탁 배양 조건 또는 부착 배양 조건하에서 배지에서 세포를 배양하는 단계, 여기서 배지는 동물 유래의 혈청 및 기타 성분이 실질적으로 없다; 및 선택적으로 (c) 세포를 분리하고 도축되지 않은 육류 제품을 생산하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 배양액 속 세포는 섬유아세포, 근아세포, 또는 섬유아세포 및 근아세포의 공동-배양액을 포함하고; 일부 실시태양에서 공동 배양액 속 세포는 지방세포, 내피 세포, 및 일반적으로 중배엽 계통의 세포와 같은 추가 세포 유형을 포함한다.
일부 실시태양에서, 세포는 현탁 배양, 예를 들어 진탕 플라스크에서 성장되고 배양의 생성물은 세포 펠릿을 생성한다. 일부 실시태양에서 생성물은 물리적 방법(예를 들어, 원심분리, 중력 보조 침전), 화학적 방법, 효소적 방법, 침강, 농축, 응집 등에 의해 얻어질 수 있다. 다른 실시태양에서, 세포는 부착 배양에서 성장되고, 배양의 생성물은 세포 시트이다.
D. 채취 및 제제화
일부 실시태양에서, 본 발명의 도축되지 않은 세포 기반 육류는 생물반응기(또는 다른 세포 성장 장치)로부터 채취되고 제제화 전에 이의 특성에 대해 평가된다. 일부 실시태양에서, 채취는 무균 조건하에서 수행된다(예를 들어, 층류 후드에서 살균 장갑 및 작업 조건을 사용하여).
본 발명의 도축되지 않은 세포 기반 육류는 특정 식용 식품 유형, 미트볼, 패티, 패티, 수리미, 커틀릿, 소시지, 로프, 부드러운 필레 스타일 제품, 핫도그, 너겟 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 다양한 제품으로 채취 후 제제화(예를 들어, 조작, 가공)될 수 있다. 본 발명의 도축되지 않은 세포 기반 육류 제제 제품은 또한 예를 들어, 보관 수명을 더 연장하기 위해 육포 또는 스낵-스틱형 제품과 같은 양념되거나 건조된 육류를 포함할 수 있다. 본 발명의 도축되지 않은 세포 기반 육류 제제화된 제품은 또한 결합제, 향신료, 안정화제, 방부제 등과 같은 추가 성분(첨가제)을 포함할 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 제제는 다음 성분 중 하나 이상을 채취된 세포 기반 육류에 첨가하는 것을 포함한다: 필수 밀 글루텐, 염화칼슘, 이오타 카라기난, 풍미 전구체 믹스, 트랜스글루타미나제 효소 분말(말토덱스트린, 효소), 단백질 농축물, 단백질 분리물, 다당류, 카라기난, 향료, 효모 추출물, 효소, 섬유, 질감 단백질, 펙틴, 전분.
Ⅱ. 세포 기반 육류의 특징
통상적인 육류(살아 있는 동물의 도축 또는 사망을 포함함)와 구별될 수 있도록 하는 다수의 독특한 특징을 포함하는 도축되지 않은 세포 기반 육류 제품이 본 명세서에 제공된다. 방법은 또한 건강상의 이점 및 감각적 이점과 같은 원하는 특성을 달성하도록 맞춤화될 수 있다. 구별의 포인트는 적어도 연장된 저장 수명, 호르몬 수준, 항생제 및 세포 기반 육류의 미생물 오염을 포함하지만 지방 함량, 아미노산 프로필, 질감, 및 등의 변화된 수준은 추가 맞춤화를 포함할 수 있다. 이들은 아래에서 차례로 고려된다.
A. 호르몬
통상적인 육류와 비교하여, 본 발명의 도축되지 않은 세포 기반 육류는 상당히 더 적은 양의 스테로이드 호르몬을 포함한다. 예를 들어, 기술된 배양 방법을 사용하면, 배양액에 외인성 호르몬을 첨가할 필요가 없으므로 생성된 육류에서 호르몬 수치가 더 낮아지거나 존재하지 않는다. 따라서, 일부 실시태양에서, 도축되지 않은 세포 기반 육류 제품은 스테로이드 호르몬을 실질적으로 함유하지 않는다(즉, 스테로이드 호르몬을 거의 함유하지 않거나 전혀 함유하지 않음). 이것은 종종 외인성 호르몬을 먹거나 투여받는 통상적인 육류 생산을 위해 길러진 동물과 대조적이다. 외인성 호르몬을 먹이거나 투여받지 않은 통상적인 육류 생산을 위해 사육된 동물(예를 들어, 닭, 가축)조차도 단순히 동물의 선 시스템에 의한 기초 생산 수준으로 인해 다른 호르몬 중에서 테스토스테론, 에스트라다이올, 프로게스테론이 여전히 존재한다는 점에 유의한다. 에스트라다이올, 프로게스테론 및 테스토스테론은 동물의 성별에 따라 약간 낮은 수준으로 기존 육류에서 발견되는 천연 호르몬이다. 대조적으로, 본 발명의 세포 기반 육류는 더 낮은 수준의 스테로이드 호르몬을 포함하거나 심지어 실질적으로 스테로이드 호르몬이 없다. 예를 들어, 17β-에스트라다이올에 대한 ELISA 결과는 도축되지 않은 닭고기 샘플이 기존 닭고기에 비해 더 낮은 농도를 산출했음을 나타낸다. 17β-에스트라다이올 수준은 ELISA 키트를 사용하여 도축되지 않은 닭고기의 경우 평균 35ng 에스트라다이올/kg 젖은 질량인 반면, 지역 식료품점에서 조달한 기존 닭고기는 90ng/kg 에스트라다이올/kg 습식 질량이었다.
따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 세포 기반 육류는 약 1ug, 0.5ug, 0.1ug, 0.05ug, 0.01ug, 0.005ug, 또는 심지어 약 0.001ug 스테로이드 호르몬/kg 건식 질량의 세포 기반 육류를 포함한다. 일부 실시태양에서, 세포 기반 육류는 약 1ug, 0.5ug, 0.1ug, 0.05ug, 0.01ug, 0.005ug, 또는 심지어 약 0.001ug 프로게스테론/kg 건식 질량의 세포 기반 육류를 포함한다. 일부 실시태양에서, 일부 실시태양에서, 세포 기반 육류는 약 1ug, 0.5ug, 0.1ug, 0.05ug, 0.01ug, 0.005ug, 또는 심지어 약 0.001ug 테스토스테론/kg 건식 질량의 세포 기반 육류를 포함한다. 일부 실시태양에서, 세포 기반 육류는 약 1ug, 0.5ug, 0.1ug, 0.05ug, 0.01ug, 0.005ug, 또는 심지어 약 0.001ug 에스트라다이올/kg 건식 질량의 세포 기반 육류를 포함한다. 예시적인 실시태양에서, 세포 기반 육류는 약 35ng 이하의 에스트라다이올/kg 건식 질량의 세포 기반 육류를 포함한다.
B. 미생물 오염
기술된 배양 방법을 사용하여, 도축되지 않은 세포 기반 육류 제품은 미생물 오염물이 실질적으로 없다. "실질적으로 없는"은 미생물 또는 기생충의 농도가 임상적으로 유의한 수준의 오염 미만, 예를 들어 섭취가 질병 또는 불리한 건강 상태를 유발할 수 있는 수준 미만임을 의미한다. 이러한 낮은 수준의 오염은 저장 수명을 증가시킨다. 이것은 도축을 목적으로 하는 통상적인 육류 생산을 위해 길러진 동물과 대조적이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 미생물 오염은 박테리아, 진균, 바이러스, 원생동물, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 유해 미생물은 대장균군(분변 세균), 대장균, 효모, 곰팡이, 캠필로박터, 살모넬라, 리스테리아, 장내세균과, 장내세균복합체, 인플루엔자 A형, B형 인플루엔자, 포도상구균을 포함할 수 있다. 당업자는 모든 오염 물질을 측정할 수 있음을 이해할 것이다.
도축에 의해 얻은 통상적인 육류와 비교하여 본 발명의 도축되지 않은 세포 기반 육류 제품과 관련된 더 낮은 미생물 오염이 모든 온도에서 나타남에 유의한다: 예를 들어, 약 0℃ 내지 약 30℃, 예를 들어. 표준 가정용 냉장고 온도(예를 들어, 약 2℃ 내지 약 6℃) 및 실온(예를 들어, 약 22℃ 내지 약 25℃) 모두에서. 또한, 도축에 의해 얻은 통상적인 육류와 비교하여 본 발명의 도축되지 않은 세포 기반 육류 제품과 관련된 더 낮은 미생물 오염이 적어도 3일, 7일, 14일, 30일, 또는 148일 동안 나타나고, 채취 후 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 및 그 이상 주 동안 나타남에 유의한다. 또한 더 낮은 오염은 무균 조건과 비무균 조건 모두에서 관찰되며, 육류가 후속 제제 없이 채취 후 측정될 때와 육류가 채취 후 및 제제화 후 측정될 때 더 낮은 오염이 관찰된다는 점도 유의해야 한다.
또한, 배양액에서 성장된 세포는 전체 동물의 세포를 감염시키고 불충분하게 조리된 육류의 소비를 통해 인간에게 전달되는 촌충과 같은 기생충이 실질적으로 없을 수 있다.
생물학적 생산 라인에서 나오는 육류 제품을 포장하는 데 무균 기술이 사용될 수도 있다. 이러한 품질 보증은 이미 당업계에 알려진 미생물 또는 화학물질에 대한 표준 분석에 의해 모니터링될 수 있다.
통상적인 육류와 비교하여, 본 발명의 도축되지 않은 세포 기반 육류는 상당히 더 적은 양의 미생물 오염을 포함한다. 실시예 3, 실시예 9, 표 12 및 13은 도축을 통해 얻은 기존 식료품점 육류와 도축되지 않은 세포 기반 육류의 오염 물질을 비교한 것이다. 전통적인 오리 육류, 특히 일반 쇠고기는 훨씬 더 많은 양의 미생물 오염이 있었다. 도 3은 박테리아 콜로니를 나타내는 대표적인 플레이트를 나타내며, 구체적으로 세포 기반 오리, 일반 쇠고기 및 일반 닭고기에 대한 결과를 보여준다.
따라서, 일부 실시태양에서,도축에 의해 얻은 통상적인 육류와 비교하여 더 낮은 미생물 오염 계수를 나타내는 식이 소비용 도축되지 않은 육류 제품이 본 명세서에 제공되며, 여기서 더 낮은 미생물 오염 계수는 채취 후 적어도 3일 동안 나타난다.
일부 실시태양에서, 더 낮은 미생물 오염 계수는 채취 후 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 15, 20, 21, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 148, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 적어도 250일 동안 나타난다.
일부 실시태양에서, 미생물 오염 계수는 채취 후 및 제제화 전에 결정된다. 다른 실시태양에서, 미생물 오염 계수는 제제화 후에 결정된다.
일부 실시태양에서, 도축되지 않은 육류 제품은 비무균 조건하에서 유지되고 여전히 더 낮은 미생물 오염 계수를 나타낸다.
일부 실시태양에서, 미생물 오염 계수는 총 미생물 계수(TC), 대장균/대장균군 계수(EC), 대장균 미생물 계수, 대장균군 계수, 또는 대장균/대장균군 계수를 측정함으로써 결정된다. 일부 실시태양에서, 미생물 오염 계수는 곰팡이, 효모, 살모넬라, 리스테리아 및 포도상구균을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 미생물에 대한 계수를 측정함으로써 결정된다.
일부 실시태양에서, 도축되지 않은 육류 제품은 다음을 포함한다:
(a) FDA 세균 분석 매뉴얼에 따라 결정된 100 cfus 이하의 미생물 오염/g 습식 질량;
(b) FDA 세균 분석 매뉴얼에 따라 결정된 10 cfus 이하의 대장균군 오염/g 습식 질량;
(c) FDA 세균학적 분석 매뉴얼에 따라 결정된 10 cfus 이하의 대장균 오염/g 습식 질량;
(d) FDA 세균 분석 매뉴얼에 따라 결정된 10 cfus 이하의 효모 오염/g 습식 질량;
(e) FDA 세균 분석 매뉴얼에 따라 결정된 10 cfus 이하의 곰팡이 오염/g 습식 질량;
(f) FDA 세균 분석 매뉴얼에 따라 결정된 검출 가능하지 않은 수준의 살모넬라 오염 수준/25g 습식 질량;
(g) AOAC 2004.06 방법에 따라 결정된 검출 가능하지 않은 수준의 리스테리아 오염 수준/25g 습식 질량;
(h) AOAC 2003.07 방법에 따라 결정된 10 cfus 이하의 포도상구균 오염/g 습식 질량; 및/또는
(i) CompactDry 프로토콜에 따라 결정된 55 cfu 이하의 총 호기성 계수 오염/g 습식 질량.
일부 실시태양에서, 도축되지 않은 육류 제품은 도축되지 않은 닭, 오리 또는 소 육류를 포함하고, 통상적인 육류는 도축에 의해 얻은 닭, 오리 또는 소 육류를 포함한다.
실시예 3 및 9는 저장 수명 및 미생물 오염이 관찰되는 다양한 예시적인 프로토콜을 제공한다. 당업자는 미생물 오염을 측정하는 여러 방법이 있음을 이해할 것이다. 이는 적어도 다음 교과서에서 제공된다: (1) FDA Bacteriological Analytical Manual(BAM)(Edition 8, Revision A/1998) 및 (2) USDA USDA Food Safety and Inspection Service Microbiology Laboratory Guidebook. AOAC는 또한 미생물 오염 결정을 위해 최소한 다음과 같은 테스트를 제공한다:
a. 장내세균과, AOAC 2003.01
b. 대장균 및 대장균군, AOAC 998.08
c. 효모 및 곰팡이, FDA BAM Ch. 18
d. 리스테리아, AOAC 2004.06
e. 살모넬라균(25g), AOAC 2011.03
f. 캄필로박터, AOAC RI 051201
g. AOAC 2003.07 - 포도상구균
h. 호기성 플레이트 계수, AOAC 990.12
i. 살모넬라균, AOAC 2013.02, RI PTM 081201
j. 리스테리아 종, AOAC-RI PTM #081401
k. 호기성 계수, AOAC 990.12
l. 대장균군 및 대장균, AOAC 991.14
m. Y&M 계수, AOAC 2014.05
C. 항생제
통상적인 육류와 비교하여, 본 발명의 도축되지 않은 세포 기반 육류는 상당히 더 적은 양의 항생제를 포함하거나, 항생제가 실질적으로 없거나, 또는 항생제가 완전히 없다. 예를 들어, 설명된 배양 방법을 사용하여 배양에서 항생제의 사용을 제어하거나 제거할 수 있으므로 결과적으로 생성되는 세포 기반 육류에서 항생제 수준이 더 낮아지거나 존재하지 않는다. 따라서, 일부 실시태양에서, 도축되지 않은 세포 기반 육류 제품은 항생제가 실질적으로 없다(즉, 항생제를 거의 또는 전혀 함유하지 않음). 이것은 종종 외인성 항생제를 먹거나 투여하는 통상적인 육류 생산을 위해 길러진 동물과 대조적이다.
따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 세포 기반 육류는 약 100ug 이하의 항생제/kg 건식 질량의 세포 기반 육류, 90ug 항생제/kg 건식 질량의 세포 기반 육류, 80ug 이하의 항생제/kg 건식 질량의 세포 기반 육류, 70ug 항생제/kg 건식 질량의 세포 기반 육류, 60ug 항생제/kg 건식 질량의 세포 기반 육류, 50ug 항생제/kg 건식 질량의 세포 기반 육류, 40ug 항생제/kg 건식 질량의 세포 기반 육류, 30ug 항생제/kg 건식 질량의 세포 기반 육류, 20ug 항생제/kg 건식 질량의 세포 기반 육류, 10ug 항생제/kg 건식 질량의 세포 기반 육류, 5ug 항생제/kg 건식 질량의 세포 기반 육류, 1ug 항생제/kg 건식 질량의 세포 기반 육류, 0.5ug 항생제/kg 건식 질량의 세포 기반 육류, 0.1ug 항생제/kg 건식 질량의 세포 기반 육류, 0.05ug 항생제/kg 건식 질량의 세포 기반 육류, 또는 심지어 약 0.01ug/kg 항생제/kg 건식 질량의 세포 기반 육류를 포함한다.
D. 지질
통상적인 육류와 비교하여, 본 발명의 도축되지 않은 세포 기반 육류는 더 낮은 평균 총 지질(지방) 함량을 포함한다. 세포 기반 육류는 일반적으로 약 0.5%에서 약 5.0% 사이의 평균 총 지방 함량을 갖는 반면, 통상적인 육류의 지방산 함량은 육류 부위에 따라 크게 변하고 약 3%에서 약 18% 범위일 수 있다.
표 14는 몇 가지 예시적인 도축되지 않은 세포 기반 육류 샘플에 대한 총 지방산 분석을 보여준다. 도 4는 예시적인 도축되지 않은 세포 기반 육류 샘플에 걸친 포화, 단일불포화 및 다중불포화 지방산에 대한 총 지방산 조성물을 나타낸다.
따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 세포 기반 육류는 세포 기반 육류의 총 습식 질량의 %로 측정할 때, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1.0%, 약 1.1%, 약 1.2%, 약 1.3%, 약 1.4%, 약 1.5%, 약 1.6%, 약 1.7%, 약 1.8%, 약 1.9%, 약 2.0%, 약 2.1%, 약 2.2%, 약 2.3%, 약 2.4%, 약 2.5%, 약 2.6%, 약 2.7%, 약 2.8%, 약 2.9%, 약 3.0%, 약 3.1%, 약 3.2%, 약 3.3%, 약 3.4%, 약 3.5%, 약 3.6 %, 약 3.7%, 약 3.8%, 약 3.9%, 약 4.0%, 약 4.1%, 약 4.2%, 약 4.3%, 약 4.4%, 약 4.5%, 약 4.6%, 약 4.7%, 약 4.8%, 약 4.9%, 또는 약 5.0%의 평균 총 지방 함량을 포함한다.
일부 예시적인 실시태양에서, 세포 기반 육류는 총 지방산에 대한 해당 부류의 %로 표현되는 표시된 양으로 하기 지방산 부류 중 하나 이상을 포함한다:
a. 약 10% 내지 약 60%, 예를 들어, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 및/또는 약 10% 내지 약 20%의 포화 지방산 함량.
b. 약 10% 내지 약 60%, 예를 들어, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 및/또는 약 10% 내지 약 20%의 단일불포화 지방산 함량.
c. 약 1% 내지 약 50%, 예를 들어, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 20%, 및/또는 약 40% 내지 약 10%의 고도불포화 지방산 함량.
일부 실시태양에서, 본 발명의 세포 기반 육류는 약 2:1 내지 약 18:1의 비율의 오메가 6:3 지방산 부류를 포함한다. (α-리놀렌산(ALA), 에이코사펜타엔산(EPA) 및 도코사헥사엔산(DHA)은 주요 오메가 3 지방산이다). 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 세포 기반 육류는 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1 또는 약 18:1의 오메가 6:3 지방산 부류의 비를 포함한다. 반면에, 통상적인 육류, 예를 들어 전통적인 닭고기는 >18:1 오메가 6:3 지방산 부류의 비율로 구성된다.
세포 기반 육류의 더 낮은 지방 함량은 기존 육류와 비교할 때 더 낮은 칼로리 함량, 더 낮은 오메가 6:3 비율 및 기타 관련된 건강상의 이점을 제공한다.
도축되지 않은 세포 기반 육류 생산은 원하는 프로파일을 달성하기 위해 추가로 맞춤화될 수 있다. 채취 후 건조는 지방 함량 및/또는 기타 고형 성분을 더욱 증가시킬 수 있다. 성장 배지의 지질 함량을 높이면 지방 함량도 증가할 수 있다.
본 발명의 세포 기반 육류의 풍미 및 향은 생산 동안 변경될 수 있다. 일반적으로, 육류의 불포화 지방산 비율이 높을수록 더 많은 불포화 휘발성 알데하이드가 생성되며 이러한 화합물은 이러한 종의 특정 향을 결정하는 데 중요할 수 있다.
따라서, 본 명세서에 제공된 방법은 적어도 다음 메커니즘을 통해 오메가 3:6 비율과 같은 지방산 프로필 또는 원하는 풍미 특성을 달성하기 위해 특정 지방산 프로필을 변경할 수 있다.
a. 일부 실시태양에서, 배지 내 혈청의 존재는 지방산 프로파일에 영향을 미칠 수 있다. 도 7은 무혈청 배지 대 혈청 함유 배지에서의 지방산 백분율을 나타낸다.
b. 일부 실시태양에서, 도축되지 않은 세포 기반 육류 제품에서 상이한 지방산 프로파일을 달성하기 위해 상이한 공급원의 혈청이 배양에 사용될 수 있다. (도 8)
c. 일부 실시태양에서, 다클론성 집단으로부터 단리된 클론의 사용은 또한 지방산 프로파일을 변경하는 데 사용될 수 있다. (도 9).
d. 일부 실시태양에서, 지방산 프로파일은 배지의 지방산 조성물을 변경하거나, 예를 들어 비제한적으로 효현제(예를 들어, LXRβ의 효현제), 또는 리보플라빈과 같으나 이에 제한되지 않는 지방산 조성물을 변화시키는 데 첨가된 조성물을 포함하는 배지 구성요소의 첨가에 의해 조절된다. 배지에 대한 이러한 조정은 지방 프로필에 영향을 줄 수 있다. (도 10, 도 11).
e. 일부 실시태양에서, 지방산 프로파일은 배양액 중 세포의 조성물에 의해 조절된다. 따라서, 일부 실시태양에서, 배양액 속 섬유아세포, 배양액 속 근아세포, 또는 공동-배양액 속 섬유아세포/근아세포는 지방세포를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다.
도 9에서, 조직(세포 시트)은 특정 생화학적 경로를 조절하기 위해 다양한 화합물의 수준이 향상된 배양 배지를 사용하여 공동 배양 방법(표 1의 방법 15에 기술됨)을 사용하여 형성되었다. 비타민 및 공통 보조 인자인 리보플라빈은 세포 배양 배지에 적정하였다. 지방산 농도에 대한 전체적인 효과가 표시된다.
본 발명의 세포 기반 육류에서 더 낮은 수준의 지방산은 또한, 예를 들어, 육류에서 더 낮은 수준의 지방산 산화 생성물을 유도함으로써 육류의 연장된 저장 수명을 촉진한다.
E. 아미노산
본 발명의 도축되지 않은 세포 기반 육류 제품이 통상적인 육류 제품과 유사성을 공유하는 것이 또한 바람직하다. 본 발명의 도축되지 않은 세포 기반 육류 제품은 일반적으로 건식 질량 100g당 약 50g 내지 약 95g의 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 세포 기반 육류는 다음 아미노산 중 하나 이상을 지시된 양(아미노산 g/100g 총 아미노산으로 표현된 양)으로 포함한다: 트립토판 약 1 내지 약 2.2, 트레오닌 약 4.6 및 6.5, 아아이소류신 약 3.8 내지 약 5, 류신 약 6.1 내지 약 8.9, 라이신 약 5.7 내지 약 8.8, 메티오닌 약 0.14 내지 약 3.0, 시스테인 약 1.5 내지 약 1.8, 페닐알라닌 약 3.7 내지 약 4.8, 티로신 약 3.0 내지 약 5.2, 발린 약 4.8 내지 약 6.1, 아르기닌 약 7.0 내지 약 8.0, 히스티딘 약 2.5 내지 약 4, 알라닌 약 5.0 내지 약 6.3, 아스파르트산 약 8.6 내지 약 10.4, 글루탐산 약 12.5 내지 약 4, 글리신 약 14.6 내지 약 9.8, 프롤린 약 4.6 내지 약 6.8, 세린 4.4 내지 5.3, 및/또는 하이드록시프롤린 약 0.0 내지 4.0.
일부 실시태양에서, 하이드록시프롤린 수준은 통상적인 대응물과 비교하여 섬유아세포 단일배양으로부터 생성된 세포 기반 육류에서 상승된다. 어떠한 이론이나 기전에 구애받지 않고, 하이드록시프롤린 수준의 이러한 증가는 섬유아세포에 의한 세포외 기질 성분의 분비로 인한 더 높은 수준의 콜라겐 형성 때문일 수 있다. 일부 실시태양에서, 근아세포(MB)가 다클론성 세포 혼합물(근육모세포의 혼합 집단) 또는 단클론성 근아세포 세포 혼합물(혼합 집단으로부터 분리되고 확장된 단일 세포)으로서 배양 시스템에 첨가되는 경우, 하이드록시프롤린 농도는 통상적인 육류의 농도와 유사하게 감소될 수 있다. 본 명세서에 제공된 실시태양에서 하이드록시프롤린 농도는 또한 육류 제품의 질감을 변경하도록 조절될 수 있음에 유의한다.
F. 비타민 E 함량
종래의 육류와 비교하여, 본 발명의 도축되지 않은 세포 기반 육류는 더 높은 비타민 E(α-토코페롤) 함량을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 도축되지 않은 세포 기반 육류 제품은 적어도 약 0.5mg, 적어도 약 0.6mg, 적어도 약 0.7mg, 적어도 약 0.8mg, 적어도 약 0.9mg, 또는 적어도 약 1.0mg/비타민 E/100g 습식 질량의 세포 기반 육류를 포함한다.
G. 수분 함량
본 발명은 일반적으로 약 65% 내지 약 95%의 수분 함량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 수분 함량은 채취 후, 그러나 제제화 전에 측정된다. 다른 실시태양에서, 수분 함량은 제제화 후에 측정된다.
H. 세포 기반 육류의 구조
도축되지 않은 세포 기반 육류와 일반 육류 사이에는 추가적인 구별점이 있다. (여기에 기술된 바와 같이) 순전히 육류 목적으로 성장한 세포가 이식 및 기능을 허용하는 기능적 특징을 가질 필요는 없으며, 일부 상황에서는 기능을 부여하는 구성요소를 포함하도록 추가로 조작될 수 있다.
세포 기반 육류는 포함하도록 달리 조작되지 않는 한 정맥 및 동맥과 같은 혈관 조직을 포함하지 않는 반면, 통상적인 육류는 이러한 혈관 구조를 포함하고 혈관 구조에서 발견되는 혈액을 포함한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 세포 기반 육류는 임의의 혈관 구조가 실질적으로 없다. 본 명세서에서 일반적으로 고려되는 바와 같이, 혈관 구조는 혈액 및/또는 림프액을 포함한다.
유사하게, 세포 기반 육류는 근육 또는 근육 유사 조직으로 구성되지만 포함하도록 달리 조작되지 않는 한 기능하는 근육 조직을 포함하지 않는다. 따라서, 일부 실시태양에서, 세포 기반 육류는 기능하는 근육 조직을 포함하지 않는다.
혈관 구조(혈액, 림프 등을 함유할 수 있음) 및 기능적 근육 조직과 같은 특징은 원하는 경우 세포 기반 육류로 추가로 조작될 수 있다는 점에 유의한다. 예를 들어, 혈관의 발아로 이어지는 프로토콜은 혈관 구조를 본 발명의 도축되지 않은 육류 제품에 도입하고 육류 제품에 대한 증가된 관류를 허용하는 데 사용될 수 있다.
I. 풍미
육류의 지방산 조성물은 일반적으로 전체 육류 품질에 영향을 미치고 육류의 풍미, 육즙 및 부드러움에 영향을 미친다(Wood et al., Manipulating meat quality and composition. Proceedings of the Nutrition Society. 1999;58:363-370. DOI: org/10.1017/S009665199000488). MUFA 올레산(18:1 ω9) 및 MUFA 팔미톨레산(16:1 ω9)과 같은 특정 지방산은 주로 좋은 맛과 관련된 지방산이다.
지방이 많은 육류는 일반적으로 더 맛있지만, 지방 함량이 높을수록 육류의 지방 프로필이 소비자 선호도를 유도할 뿐만 아니라 고유한 종 식별을 확립하는 주요 관능 프로필에 부정적인 영향을 미칠 위험이 커진다. 그러나, 특정 지방 유형은 심장병과 같은 건강에 좋지 않은 결과를 초래할 위험이 더 크다. 따라서, 전체 세포 배양 배지 조성물, 배양액에 지방산 보충, 및/또는 근아세포/섬유아세포/지방세포/내피 세포/기타 세포 중배엽 계통의 비율이 배양액에서 조절되어 최적의 풍미와 건강 효과를 가진 도축되지 않은 세포 기반 육류 제품을 생산할 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 지방세포의 비율은 공동 배양에서 변경된다. 조절은 근원 세포의 특정 클론을 선택하고, 배양에서 초기에 접종되는 세포의 비율을 조절하고, 및/또는 원하는 대로 세포에 작용하는 성장 인자 또는 기타 배지 구성요소의 농도와 비율을 변경하여 달성할 수 있다. MUFA 올레산(18:1 ω9)과 같은 특정 지방산은 배지 조성물 및 영양 설계를 통해 강화될 수 있다.
J. 보충
다른 실시태양에서, 비타민과 같은 다른 영양소가 육류의 영양가를 증가시키는 데 첨가될 수 있다. 예를 들어, 이것은 성장 배지에 영양소를 외인성으로 첨가하거나 유전 공학 기술을 통해 달성될 수 있다.
K. 조리된 교합력 및 경도
본 발명의 도축되지 않은 세포 기반 육류 제품은 원하는 조리된 교합력 또는 조리된 경도와 같은 특정 질감 특성을 달성하도록 변형될 수 있다. 표 17은 예시적인 세포 기반 육류 샘플의 조리된 질감을 보여준다. 도 13은 근아세포:섬유아세포 공동배양 또는 섬유아세포 단일배양에서 세포로부터 생성된 예시적인 육류의 조리된 경도를 나타낸다.
본 발명의 세포 기반 육류의 조리된 교합력은 약 100g 내지 5000g 범위일 수 있다. 일부 예시적인 실시태양에서, 배양액 속 부착 세포로부터 채취된 본 발명의 세포 기반 육류의 조리된 교합력은 약 450g 내지 약 3000g의 범위이다. 일부 실시태양에서, 배양액 속 부착 세포로부터 채취된 본 발명의 세포 기반 육류의 조리된 경도는 약 2500g 내지 약 2000g 범위이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 세포 기반 육류의 조리된 교합력 및/또는 조리된 경도는, 예를 들어 육류가 현탁 배양액에서 성장한 세포로부터 채취되는 일부 실시태양에서 검출 한계 이하이다.
L. 저장 수명
육류 및 육류 제품의 상당 부분이 매년 부패한다. 약 35억 kg의 가금류 및 육류가 소비자, 소매업체 및 식품 서비스 수준에서 낭비되는 것으로 추정되며 이는 상당한 경제적 및 환경적 영향을 미친다(Kantor et al.(1997)). 이 손실의 상당 부분은 미생물 부패로 인한 것이다.
통상적인 육류는 부패하기 쉽고 비교적 짧은 저장 수명 안정성(본 명세서에서 단순히 "저장 수명"으로 상호교환 가능하게 지칭됨)을 갖는다. 일반 육류의 조성물과 육류 도축 및 채취에 사용되는 조건은 일반적으로 분변 박테리아(예를 들어, 대장균군 박테리아)를 비롯한 다양한 미생물에 유리한 성장 조건을 형성하며; 통상적인 육류는 또한 화학적, 산화적, 효소적 활동으로 인해 부패하기 매우 쉽다. 따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 일부 실시태양에서, 저장 수명은 식품이 여전히 맛이 좋으면서도 식이 소비에 적합하게 유지되는, 예를 들어, 섭취 시 구토, 설사, 메스꺼움 등과 같은 질병이나 유해한 건강 영향을 일으키지 않고 부패 과정(예를 들어, 미생물 유발, 분자 붕괴, 물리적 부패)이 시작되었음을 암시하는 냄새를 생성하지 않는 시간의 양이다.
이론이나 메커니즘에 얽매이지 않고, 일반적으로 미생물 성장, 산화 및 효소적 자가분해는 육류의 부패에 원인이 되는 세 가지 메커니즘으로 간주되어 저장 수명을 단축시킨다. 육류의 지방, 단백질 및 탄수화물이 분해되면 이취 및 잡내가 발생하고 이러한 이취 및 잡내는 육류를 사람이 먹기에 불쾌하게 만든다. 종과 채취 방법에 따라 기존의 육류 제품은 비교적 짧은 보관 기간 후에 섭취하는 것이 안전하지 않다. 예를 들어, 닭고기는 구입 후 며칠 이내에 조리해야 한다. 조리된 가금류는 약 3-5일 동안 냉장고에서 그리고 최대 약 3-5개월 냉동실에서 안전하게 보관될 수 있다. 따라서, 저장 수명을 늘리고 영양가, 질감 및 풍미를 유지하기 위해 육류 부패를 제어하는 것이 필요하다.
통상적인 육류의 저장 수명은 종종 방부제 첨가, 산세척, 염장, 탈수, 통조림, 발효 또는 암실 저장을 포함하는 다양한 공정에 의해 증가된다. 본 발명의 세포 기반 육류는 이들 방법 중 어느 것의 사용 없이도 연장된 저장 수명을 나타내지만, 이러한 방법은 저장 수명을 더욱 향상시키도록 추가될 수 있음에 유의한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 세포 기반 육류는 도축에 의해 얻은 통상적인 육류와 비교하여 저장 수명의 증가를 나타내는 측정을 나타내며, 여기서 통상적인 육류는 가공되지 않는다(예를 들어, 위에 나열된 것과 같은 공정이 더 이상 적용되지 않았다).
도축되지 않은 세포 기반 육류는 그 제조 방법 및 조성물을 통해 통상적인 육류 제품에 비해 저장 수명이 연장되고 저장 수명 안정성을 얻기 위해 방부제를 첨가할 필요가 없는 육류 제품을 생산한다. 세포 기반 육류의 조성물은 이취와 잡내가 덜 감지되도는 것이다. 또한, 세포 기반 육류를 생산하는 데 사용되는 제조 방법은 깨끗하고 무균적인 조건을 필요로 한다. 이러한 조건은 채취된 제품과 후속 식품 가공 모두에서 미생물 세포 수가 적은 것을 보장한다. 이러한 여러 요소는 세포 기반 육류의 저장 수명 안정성 연장에 기여한다.
본 발명의 세포 기반 육류의 부패로 인한 저장 수명은 통상적인 육류에 비해 향상된다. 이것은 모든 온도, 예를 들어, 실온(약 22℃ 내지 약 26℃) 및 가정용 냉장고 온도와 유사한 더 낮은 온도(예를 들어, 약 2℃ 내지 약 4℃)에서 모두 해당한다. 연장된 저장 수명은 오염 감소, 세포 기반 육류의 조성물, 세포 기반 육류의 분해 감소 및 세포 기반 육류의 색, 부패, 냄새 및 풍미의 느린 변화 속도와 관련이 있으며 육류가 식이 섭취를 위해 유지되게 한다.
이론이나 메커니즘에 얽매이지 않고, 통상적인 육류와 비교하여 세포 기반 육류의 총 지방산 함량이 감소하여 지방산 산화 생성물의 수준이 낮아져서 육류의 색깔, 냄새 또는 풍미에 변화 속도가 느려진다. 산화적 산패는 공기 중의 산소에 의한 분해와 관련이 있다. 불포화 지방산의 이중 결합은 분자 산소와 관련된 자유 라디칼 반응에 의해 절단될 수 있다. 이 반응은 악취가 나고 휘발성이 높은 알데하이드와 케톤을 방출한다. 산화는 주로 불포화 지방에서 발생한다. 예를 들어, 육류를 냉장 보관하거나 냉동 상태로 보관하더라도, 고도불포화 지방은 계속 산화되어 천천히 산패될 수 있다. 지방 산화 과정은 동물이 도축된 직후 시작되며 근육, 근육 내, 근육 간 및 표면 지방이 공기 중의 산소에 노출된다.
이론이나 메커니즘에 얽매이지 않고, 기존의 육류에 비해 세포 기반 육류의 리파아제 수가 감소하여 지방산 분해 수준이 낮아져서 육류의 색, 냄새 또는 풍미의 변화 속도를 늦춘다.
이론이나 메카니즘에 얽매이지 않고, 세포 기반 육류에 혈관 구조가 없기 때문에 통상적인 육류에 비해 존재하는 산소가 적어 지방산 산화 수준이 낮고 호기성 박테리아가 성장하여, 미생물 오염 수준을 낮추고 육류의 색, 냄새 향기 또는 풍미의 변화 속도를 늦춘다.
이론이나 메커니즘에 얽매이지 않고, 통상적인 육류에 비해 세포 기반 육류에 기능적 근육 조직(예를 들어, 미오글로빈)이 없기 때문에 존재하는 산소가 적어 지방산 산화 수준이 낮고 호기성 박테리아가 성장하여, 미생물 오염 수준을 낮추고 육류의 색, 냄새 또는 풍미의 변화 속도를 늦춘다.
이론이나 메커니즘에 얽매이지 않고, 통상적인 육류에 비해 세포 기반 육류의 더 많은 양의 비타민 E로 인해 항산화 활성 수준이 더 높아 지방산 산화에 대한 보호가 이루어지고 육류의 색, 냄새 또는 풍미의 변화 속도를 늦춘다. 육류의 지질 산화는 지방산 조성물, 항산화 비타민 E(α-토코페롤) 수준, 근육 내 유리 철과 같은 산화촉진제를 비롯한 여러 요인에 따라 달라진다.
따라서, 일부 실시태양에서, 통상적인 육류에 비해, 도축되지 않은 세포 기반 육류 제품의 저장 수명은 약 1.5배 이상, 약 2배 이상, 약 2.5배 이상, 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7배, 적어도 약 7.5 x, 적어도 약 8x, 적어도 약 8.5x, 적어도 약 9x, 적어도 약 9.5x, 또는 심지어 적어도 약 10x 연장된다. 저장 수명 증가는 종점을 포함하여 약 2℃ 및 약 26℃ 및 그 사이의 모든 온도에서 관찰된다.
일부 실시태양에서, 연장된 저장 수명을 나타내는 식이 소비를 위한 도축되지 않은 세포 기반 육류 제품이 본 명세서에 제공되며, 여기서 저장 수명은 도축에 의해 얻은 통상적인 육류에 비해 연장되고, 저장 수명은 모든 온도에서 연장된다. 일부 실시태양에서, 연장된 저장 수명은 채취 후 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 15, 20, 21, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 148, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 적어도 250일 동안 유지된다. 일부 실시태양에서 연장된 저장 수명은 약 22℃ - 26℃에서 채취 후 적어도 3, 7, 14, 30, 또는 148일 동안 유지된다. 일부 실시태양에서, 저장 수명은 채취 후 및 제제화 전에 결정된다. 일부 실시태양에서 저장 수명은 제제화 후에 결정된다. 일부 실시태양에서, 저장 수명은 약 2℃ 내지 약 6℃ 및 약 22℃ 내지 26℃ 둘 다에서 비-무균 조건하에서 연장된다. 일부 실시태양에서, 저장 수명은 총 미생물 계수(TC), 대장균/대장균군(EC), 대장균 미생물 수, 또는 대장균군 계수를 측정함으로써 결정된다.
일부 실시태양에서, 도축에 의해 얻은 통상적인 육류의 TC 측정값은 도축되지 않은 육류 제품의 TC 측정값보다 적어도 1.5x, 2x, 2.5x, 3x, 3.5x, 4x, 4.5x, 5x, 10x, 15x, 20x, 또는 심지어 25x 더 높고 저장 수명을 단축시킨다.
일부 예시적인 실시태양에서, 도축되지 않은 세포 기반 육류 제품은 다음 특징 중 하나 이상을 포함하며, 이는 부분적으로 나타낸 연장된 저장 수명에 기여한다:
(a) FDA 세균 분석 매뉴얼에 따라 측정된 검출 가능하지 않은 수준 또는 1, 10, 50 또는 100 cfus 이하 미생물 오염/g 습식 질량;
(b) FDA 세균 분석 매뉴얼에 따라 측정된 검출 가능하지 않은 수준 또는 1, 10, 50 또는 100 cfus 이하 대장균군 오염/g 습식 질량;
(c) FDA 세균 분석 매뉴얼에 따라 결정된 검출 가능하지 않은 수준 또는 1, 10, 50 또는 100 cfus 이하 대장균 오염/g 습식 질량;
(d) FDA 세균 분석 매뉴얼에 따라 측정된 검출 가능하지 않은 수준 또는 1, 10, 50 또는 100 cfus 이하 효모 오염/g 습식 질량;
(e) FDA 세균 분석 매뉴얼에 따라 측정된 검출 가능하지 않은 수준 또는 1, 10, 50 또는 100 cfus 이하 곰팡이 오염/g 습식 질량;
(f) FDA 세균 분석 매뉴얼에 따라 측정된 검출 가능하지 않은 수준 또는 1, 10, 50 또는 100 cfus 이하 살모넬라 오염/g 습식 질량;
(g) AOAC 2004.06 방법에 따라 측정된 검출 가능하지 않은 수준 또는 1, 10, 50 또는 100 cfus 이하 리스테리아 오염/g 습식 질량;
(h) AOAC 2003.07 방법에 따라 측정된 검출 가능하지 않은 수준 또는 1, 10, 50 또는 100 cfus 이하 포도상구균 오염/g 습식 질량; 및/또는
(i) CompactDry 프로토콜에 따라 측정된 검출 가능하지 않은 수준 또는 1, 10, 50 또는 100 cfus 또는 55 cfu 이하 총 호기성 계수 오염/g 습식 질량.
일부 실시태양에서, 연장된 저장 수명을 나타내는 도축되지 않은 육류 제품은 도축되지 않은 닭, 오리 또는 소 육류를 포함하고, 통상적인 육류는 도축에 의해 얻은 닭, 오리 또는 소 육류를 포함한다.
실시예 9는 저장 수명 및 미생물 오염이 관찰되는 다양한 예시적인 프로토콜을 논의한다. 당업자는 저장 수명 및 미생물 오염과 같은 저장 수명과 관련된 매개변수를 측정하는 여러 방법이 있음을 이해할 것이다. 이는 적어도 다음 교과서에서 제공된다: (1) FDA Bacteriological Analytical Manual(BAM)(Edition 8, Revision A/1998) 및 (2) USDA USDA Food Safety and Inspection Service Microbiology Laboratory Guidebook. AOAC는 또한 미생물 오염 결정을 위해 최소한 다음과 같은 테스트를 제공한다:
a) 장내세균과, AOAC 2003.01
b) 대장균 및 대장균군, AOAC 998.08
c) 효모 및 곰팡이, FDA BAM Ch. 18
d) 리스테리아, AOAC 2004.06
e) 살모넬라균(25g), AOAC 2011.03
f) 캄필로박터, AOAC RI 051201
g) AOAC 2003.07 - 포도상구균
h) 호기성 플레이트 계수, AOAC 990.12
i) 살모넬라균, AOAC 2013.02, RI PTM 081201
j) 리스테리아 종, AOAC-RI PTM #081401
k) 호기성 계수, AOAC 990.12
l) 대장균군 및 대장균, AOAC 991.14
m) Y&M 계수, AOAC 2014.05
추가 종말점은 저장 수명을 나타내는 것으로 테스트될 수 있다. 이들은 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 산패 테스트; 가속화된 저장 수명 연구; 수분, pH 및 수분 활성 변동성; 다양한 보관 조건하에서 제품 안정성; 미생물, 화학적 및 물리적 테스트; 관능 평가; 및 프로바이오틱 안정성.
III. 열거된 실시태양
본 발명은 다음 세트의 열거된 예시적인 실시태양 세트를 참조하여 정의될 수 있다:
세트 1
실시태양 1. 세포 기반 육류 제품으로서, 세포 기반 육류 제품은 하기 특징들 중 적어도 2가지를 포함하는 세포 기반 육류 제품:
a. 약 1ug 이하의 스테로이드 호르몬/kg 건식 질량 세포 기반 육류 제품;
b. 약 100ug 이하의 항생제/kg/건식 질량 세포 기반 육류 제품 ;
c. 약 100 cfu 이하의 미생물 오염/g 습식 질량 세포 기반 육류 제품;
d. 세포 기반 육류 제품의 습식 질량 %로 측정된 약 0.5% 내지 약 5.0%의 평균 총 지방 함량;
e. 실질적으로 혈관 구조가 없음; 및
f. 통상적인 육류에 비해 적어도 2배 저장 수명 증가.
실시태양 2. 실시태양 1에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 특징 (a) 내지 (f) 중 적어도 3개, 4개, 5개 또는 6개를 포함하는 것인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 3. 실시태양 1 또는 2에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 약 1ug 이하의 프로게스테론/kg 건식 질량의 세포 기반 육류를 포함하는 것인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 4. 실시태양 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 약 1ug 이하의 테스토스테론/kg 건식 질량의 세포 기반 육류를 포함하는 것인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 5. 실시태양 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 약 35ng 이하의 에스트라다이올/kg 건식 질량의 세포 기반 육류를 포함하는 것인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 6. 실시태양 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 건식 질량 100g당 약 50g 내지 약 90g의 아미노산을 포함하는 것인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 7. 실시태양 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 표시된 양(아미노산/100g 총 아미노산의 g으로 표현됨)으로 하기 아미노산 중 하나 이상을 포함하는 세포 기반 육류 제품: 트립토판 약 1 내지 약 2.2, 트레오닌 약 4.6 및 6.5, 아이소류신 약 3.8 내지 약 5, 류신 약 6.1 내지 약 8.9, 라이신 약 5.7 내지 약 8.8, 메티오닌 약 0.14 내지 약 3.0, 시스테인 약 1.5 내지 약 1.8, 페닐알라닌 약 3.7 내지 약 4.8, 티로신 약 3.0 내지 약 5.2, 발린 약 4.8 내지 약 6.1, 아르기닌 약 7.0 내지 약 8.0, 히스티딘 약 2.5 내지 약 4, 알라닌 약 5.0 내지 약 6.3, 아스파르트산 약 8.6 약 10.4, 글루탐산 약 12.5 내지 약 14.6, 글리신 약 4.6 내지 약 9.8, 프롤린 약 4.6 내지 약 6.8, 세린 약 4.4 내지 약 5.3, 및/또는 하이드록시프롤린 약 0.0 내지 4.0.
실시태양 8. 실시태양 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 약 65% 내지 약 95%의 수분 함량을 갖는 것인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 9. 실시태양 8에 있어서, 수분 함량은 채취 후 제제화 전에 측정되는 것인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 10. 실시태양 8에 있어서, 수분 함량은 제제화 및 탈수 공정 후, 그러나 성분의 첨가 전에 측정되는 것인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 11. 실시태양 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 세포 기반 조류 육류 제품인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 12. 실시태양 11에 있어서, 세포 기반 조류 육류 제품은 닭 세포 기반 육류 제품인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 13. 실시태양 11에 있어서, 세포 기반 조류 육류 제품은 오리 세포 기반 육류 제품인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 14. 실시태양 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 세포 기반 소 육류 제품인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 15. 실시태양 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 세포 기반 육류 제품이 세포 펠릿인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 16. 실시태양 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 세포 시트인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 17. 실시태양 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 배양액에서 섬유아세포로부터 생성되는 것인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 18. 실시태양 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 배양액에서 근아세포로부터 생성되는 것인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 19. 실시태양 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 배양액에서 섬유아세포 및 근아세포를 포함하는 공동-배양액로부터 생성되는 것인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 20. 실시태양 16 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 배양액은 지방세포, 내피 세포, 및/또는 중배엽 계통의 세포를 추가로 포함하는 것인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 21. 실시태양 19에 있어서, 공동 배양액에서 섬유아세포 대 근아세포의 비율은 약 95F:5M 내지 약 5F:95M의 비율인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 22. 실시태양 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 적어도 약 0.5mg 비타민 E/100g 습식 질량의 세포 기반 육류를 포함하는 것인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 23. 실시태양 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 총 지방산에 대해 해당 부류에 대한 %로 표현된 표시된 양으로 하기 지방산 부류 중 하나 이상을 포함하는 것인 세포 기반 육류 제품:
a. 약 29% 내지 약 42%의 포화 지방산 함량;
b. 약 19% 내지 약 54%의 단일불포화 지방산 함량; 및
c. 약 5% 내지 약 36%의 고도불포화 지방산 함량.
실시태양 24. 실시태양 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 약 2:1 내지 18:1 오메가 6:3 지방산 부류의 비율을 포함하는 것인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 25. 실시태양 23 또는 24에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 닭 세포, 오리 세포, 또는 소 세포로부터 생산되는 것인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 26. 실시태양 23 또는 24에 있어서, 세포 기반 육류는 지방산 함량이 조작된 배지에서 생성되는 것인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 27. 실시태양 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 하기 질감 특징 중 적어도 하나를 포함하는 것인 세포 기반 육류 제품:
a. 450g 내지 약 2970g의 조리된 교합력; 및
b. 약 280g 내지 약 1900g의 조리된 경도.
실시태양 28. 실시태양 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 통상적인 육류에 비해 안정성 및 저장 수명이 적어도 10배 증가하는 것인 세포 기반 육류 제품
실시태양 29. 실시태양 28에 있어서, 저장 수명의 증가는 약 4℃에서 측정되는 것인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 30. 실시태양 28에 있어서, 저장 수명의 증가는 약 25℃에서 측정되는 것인 세포 기반 육류 제품.
실시태양 31. 다음을 포함하는 세포 기반 육류의 생산 방법:
a. 비인간 유기체로부터 섬유모세포 및/또는 근아세포를 제공하는 단계;
b. 현탁 배양 조건 또는 부착 배양 조건하에서 배지에서 섬유모세포 및/또는 근아세포를 배양하는 단계, 여기서 배지는 동물로부터 유래된 혈청 및 기타 성분이 실질적으로 없다; 및
c. 세포를 분리하고 세포 기반 육류를 생산하는 단계.
실시태양 32. 실시태양 31에 있어서, 섬유아세포 및/또는 근아세포는 약 95F:5M 내지 약 5F:95M의 비율로 제공되는 것인 방법.
실시태양 33. 실시태양 31 또는 32에 있어서, 세포 기반 육류 제품은 통상적인 육류와 비교하여 저장 수명이 적어도 2배 증가하는 것인 방법.
실시태양 34. 실시태양 31 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 방법은 배지의 지방산 함량을 조정하는 단계를 포함하고, 여기서 생성된 세포 기반 육류 제품은 약 2:1 내지 약 18:1의 오메가 6:3 지방산 부류의 비율을 갖는 것인 방법.
세트 2
실시태양 1. 연장된 저장 수명을 나타내는 식이 소비용 도축되지 않은 육류 제품으로서, 저장 수명은 도축에 의해 수득된 통상적인 육류에 비해 연장되고, 저장 수명은 채취 후 적어도 3일 동안 연장되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 2. 실시태양 1에 있어서, 연장된 저장 수명은 약 0℃ 내지 약 30℃에서 채취 후 적어도 3일 동안 유지되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 3. 실시태양 1 또는 2에 있어서, 저장 수명은 채취 후 및 제제화 전에 결정되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 4. 실시태양 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 저장 수명은 제제화 후에 결정되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 5. 실시태양 3에 있어서, 저장 수명은 육류가 비-무균 조건하에서 채취될 때 연장되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 6. 실시태양 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 저장 수명은 총 미생물 계수(TC), 대장균/대장균군 계수(EC), 대장균 미생물 계수 또는 대장균군 계수를 측정함으로써 결정되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 7. 실시태양 6에 있어서, 도축에 의해 얻은 통상적인 육류의 TC 측정값은 도축되지 않은 육류 제품의 TC 측정값보다 적어도 1.5배 더 높은 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 8. 실시태양 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, g/습식 질량당 1 cfus 이하의 미생물 오염을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 9. 실시태양 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 약 1ug 이하의 스테로이드 호르몬을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 10. 실시태양 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 100g 건식 질량당 약 50g 내지 약 90g의 아미노산을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 11. 실시태양 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 표시된 양(아미노산/100g 총 아미노산의 g으로 표현됨)으로 하기 아미노산 중 하나 이상을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품: 트립토판 약 1 내지 약 2.2, 트레오닌 약 4.6 및 6.5, 아이소류신 약 3.8 내지 약 5, 류신 약 6.1 내지 약 8.9, 라이신 약 5.7 내지 약 8.8, 메티오닌 약 0.14 내지 약 3.0, 시스테인 약 1.5 내지 약 1.8, 페닐알라닌 약 3.7 내지 약 4.8, 티로신 약 3.0 내지 약 5.2, 발린 약 4.8 내지 약 6.1, 아르기닌 약 7.0 내지 약 8.0, 히스티딘 약 2.5 내지 약 4, 알라닌 약 5.0 내지 약 6.3, 아스파르트산 약 8.6 약 10.4, 글루탐산 약 12.5 내지 약 14.6, 글리신 약 4.6 내지 약 9.8, 프롤린 약 4.6 내지 약 6.8, 세린 약 4.4 내지 약 5.3, 및/또는 하이드록시프롤린 약 0.0 내지 4.0.
실시태양 12. 실시태양 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 약 65% 내지 약 95%의 수분 함량을 가지며, 여기서 수분 함량은 채취 후 그러나 제제화 전에 측정되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 13. 실시태양 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 적어도 약 0.5mg 비타민 E/100g 습식 질량의 도축되지 않은 육류 제품을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 14. 실시태양 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 표시된 양으로 하기 지방산 부류 중 하나 이상을 포함하며, 이는 총 지방산에 대해 해당 부류에 대한 %로 표시되는 것인 도축되지 않은 육류 제품:
a. 약 10% 내지 약 60%의 포화 지방산 함량;
b. 약 10% 내지 약 60%의 단일불포화 지방산 함량; 및
c. 약 1% 내지 약 50%의 고도불포화 지방산 함량.
실시태양 15. 실시태양 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 약 2:1 내지 18:1 오메가 6:3 지방산 부류의 비율을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 16. 실시태양 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 도축되지 않은 닭, 오리 또는 소 육류를 포함하고, 통상적인 육류는 닭, 오리 또는 소 육류를 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 17. 실시태양 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 실질적으로 혈관 구조가 없는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 18. 실시태양 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 통상적인 육류는 가공되지 않은 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 19. 도축에 의해 얻은 통상적인 육류와 비교하여 더 낮은 미생물 오염 계수를 나타내는 식이 소비용 도축 없는 육류 제품으로서, 여기서 더 낮은 미생물 오염 계수는 채취 후 적어도 3일 동안 나타나는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 20. 실시태양 19에 있어서, 더 낮은 미생물 오염 계수는 약 0℃ 내지 약 30℃에서 채취 후 적어도 3일 동안 유지되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 21. 실시태양 19 또는 20에 있어서, 미생물 오염 계수는 채취 후, 및 제제화 전에 결정되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 22. 실시태양 19 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 비-무균 조건하에서 유지되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 23. 실시태양 19 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 미생물 오염 계수는 총 미생물 계수(TC), 대장균/대장균군 계수(EC), 대장균 미생물 수 또는 대장균군 계수를 측정함으로써 결정되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 24. 실시태양 19 내지 23 중 어느 하나에 있어서, g/습식 질량당 1 cfu 이하의 미생물 오염을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 25. 실시태양 19 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 도축에 의해 얻어진 통상적인 육류의 TC 측정값은 도축되지 않은 육류 제품의 TC 측정값보다 적어도 1.5배 더 높은 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 26. 실시태양 19 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 약 1ug 이하의 스테로이드 호르몬을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 27. 실시태양 19 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 표시된 양(아미노산/100g 총 아미노산의 g으로 표현됨)으로 하기 아미노산 중 하나 이상을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품: 트립토판 약 1 내지 약 2.2, 트레오닌 약 4.6 및 6.5, 아이소류신 약 3.8 내지 약 5, 류신 약 6.1 내지 약 8.9, 라이신 약 5.7 내지 약 8.8, 메티오닌 약 0.14 내지 약 3.0, 시스테인 약 1.5 내지 약 1.8, 페닐알라닌 약 3.7 내지 약 4.8, 티로신 약 3.0 내지 약 5.2, 발린 약 4.8 내지 약 6.1, 아르기닌 약 7.0 내지 약 8.0, 히스티딘 약 2.5 내지 약 4, 알라닌 약 5.0 내지 약 6.3, 아스파르트산 약 8.6 약 10.4, 글루탐산 약 12.5 내지 약 14.6, 글리신 약 4.6 내지 약 9.8, 프롤린 약 4.6 내지 약 6.8, 세린 약 4.4 내지 약 5.3, 및/또는 하이드록시프롤린 약 0.0 내지 4.0.
실시태양 28. 실시태양 19 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 총 지방산에 대해 해당 부류에 대한 %로 표현된 표시된 양으로 하기 지방산 부류 중 하나 이상을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품:
a. 약 10% 내지 약 50%의 포화 지방산 함량;
b. 약 10% 내지 약 54%의 단일불포화 지방산 함량; 및
c. 약 1% 내지 약 50%의 고도불포화 지방산 함량.
실시태양 29. 실시태양 19 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 약 2:1 내지 18:1 오메가 6:3 지방산 부류의 비율을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 30. 실시태양 19 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 도축되지 않은 닭, 오리 또는 소 육류를 포함하고, 통상적인 고기는 도축에 의해 얻은 닭, 오리 또는 소 육류를 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 31. 다음 단계를 포함하여 도축에 의해 얻은 미가공 통상적인 육류와 비교하여 저장 수명의 증가를 나타내는 도축되지 않은 육류 제품의 제조 방법:
a. 비인간 유기체로부터 세포를 제공하는 단계;
b. 현탁 배양 조건 또는 부착 배양 조건하에서 배지에서 세포를 배양하는 단계, 여기서, 배지는 동물로부터 유래된 혈청 및 기타 성분이 실질적으로 없다; 및
c. 세포를 분리하고 도축되지 않은 육류 제품을 생산하는 단계.
실시태양 32. 실시태양 31에 있어서, 세포는 근아세포, 섬유아세포, 지방세포, 내피 세포, 중배엽 계통의 세포, 및 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시태양 33. 실시태양 31 또는 32에 있어서, 세포는 적어도 섬유아세포 및 근아세포를 포함하고, 섬유아세포 및 근아세포는 약 95F:5M 내지 약 5F:95M의 비율로 제공되는 것인 방법.
실시태양 34. 실시태양 31 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 방법은 배지의 지방산 함량을 조정하는 단계를 포함하고, 여기서 생성된 도축되지 않은 육류 제품은 약 2:1 내지 약 18:1의 오메가 6:3 지방산 부류의 비율을 갖는 것인 방법.
세트 3
실시태양 1. 연장된 저장 수명을 나타내는 식이 소비용 도축되지 않은 육류 제품으로서, 저장 수명은 도축에 의해 수득된 통상적인 육류에 비해 연장되고, 저장 수명은 채취 후 적어도 3일 동안 연장되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 2. 실시태양 1에 있어서, 연장된 저장 수명은 약 0℃ 내지 약 30℃에서 채취 후 적어도 3일 동안 유지되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 3. 실시태양 1에 있어서, 저장 수명은 채취 후 및 제제화 전에 결정되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 4. 실시태양 1에 있어서, 저장 수명은 제제화 후에 결정되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 5. 실시태양 3에 있어서, 저장 수명은 육류가 비-무균 조건하에서 채취될 때 연장되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 6. 실시태양 1에 있어서, 저장 수명은 총 미생물 계수(TC), 대장균/대장균군 계수(EC), 대장균 미생물 계수 또는 대장균군 계수를 측정함으로써 결정되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 7. 실시태양 6에 있어서, 도축에 의해 얻은 통상적인 육류의 TC 측정값은 도축되지 않은 육류 제품의 TC 측정값보다 적어도 1.5배 더 높은 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 8. 실시태양 1에 있어서, g/습식 질량당 1 cfus 이하의 미생물 오염을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 9. 실시태양 1에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 약 1ug 이하의 스테로이드 호르몬을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 10. 실시태양 1에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 100g 건식 질량당 약 50g 내지 약 90g의 아미노산을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 11. 실시태양 1에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 표시된 양(아미노산/100g 총 아미노산의 g으로 표현됨)으로 하기 아미노산 중 하나 이상을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품: 트립토판 약 1 내지 약 2.2, 트레오닌 약 4.6 및 6.5, 아이소류신 약 3.8 내지 약 5, 류신 약 6.1 내지 약 8.9, 라이신 약 5.7 내지 약 8.8, 메티오닌 약 0.14 내지 약 3.0, 시스테인 약 1.5 내지 약 1.8, 페닐알라닌 약 3.7 내지 약 4.8, 티로신 약 3.0 내지 약 5.2, 발린 약 4.8 내지 약 6.1, 아르기닌 약 7.0 내지 약 8.0, 히스티딘 약 2.5 내지 약 4, 알라닌 약 5.0 내지 약 6.3, 아스파르트산 약 8.6 약 10.4, 글루탐산 약 12.5 내지 약 14.6, 글리신 약 4.6 내지 약 9.8, 프롤린 약 4.6 내지 약 6.8, 세린 약 4.4 내지 약 5.3, 및/또는 하이드록시프롤린 약 0.0 내지 4.0.
실시태양 12. 실시태양 1에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 약 65% 내지 약 95%의 수분 함량을 가지며, 여기서 수분 함량은 채취 후 그러나 제제화 전에 측정되는 것인 도축되지 않은 육류 제품
실시태양 13. 실시태양 1에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 적어도 약 0.5mg 비타민 E/100g 습식 질량의 도축되지 않은 육류 제품을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 14. 실시태양 1에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 표시된 양으로 하기 지방산 부류 중 하나 이상을 포함하며, 이는 총 지방산에 대해 해당 부류에 대한 %로 표시되는 것인 도축되지 않은 육류 제품:
a. 약 10% 내지 약 60%의 포화 지방산 함량;
b. 약 10% 내지 약 60%의 단일불포화 지방산 함량; 및
c. 약 1% 내지 약 50%의 고도불포화 지방산 함량.
실시태양 15. 실시태양 1에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 약 2:1 내지 18:1 오메가 6:3 지방산 부류의 비율을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 16. 실시태양 1에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 도축되지 않은 닭, 오리 또는 소 육류를 포함하고, 통상적인 육류는 닭, 오리 또는 소 육류를 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 17. 실시태양 1에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 실질적으로 혈관 구조가 없는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 18. 실시태양 1에 있어서, 통상적인 육류는 가공되지 않은 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 19. 도축에 의해 얻은 통상적인 육류와 비교하여 더 낮은 미생물 오염 계수를 나타내는 식이 소비용 도축 없는 육류 제품으로서, 여기서 더 낮은 미생물 오염 계수는 채취 후 적어도 3일 동안 나타나는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 20. 실시태양 19에 있어서, 더 낮은 미생물 오염 계수는 약 0℃ 내지 약 30℃에서 채취 후 적어도 3일 동안 유지되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 21. 실시태양 19에 있어서, 미생물 오염 계수는 채취 후, 및 제제화 전에 결정되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 22. 실시태양 19에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 비무균 조건하에서 유지되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 23. 실시태양 19에 있어서, 미생물 오염 계수는 총 미생물 계수(TC), 대장균/대장균군 계수(EC), 대장균 미생물 수 또는 대장균군 계수를 측정함으로써 결정되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 24. 실시태양 19 내지 23 중 어느 하나에 있어서, g/습식 질량당 1 cfu 이하의 미생물 오염을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 25. 실시태양 19에 있어서, 도축에 의해 얻어진 통상적인 육류의 TC 측정값은 도축되지 않은 육류 제품의 TC 측정값보다 적어도 1.5배 더 높은 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 26. 실시태양 19에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 약 1ug 이하의 스테로이드 호르몬을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 27. 실시태양 19에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 표시된 양(아미노산/100g 총 아미노산의 g으로 표현됨)으로 하기 아미노산 중 하나 이상을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품: 트립토판 약 1 내지 약 2.2, 트레오닌 약 4.6 및 6.5, 아이소류신 약 3.8 내지 약 5, 류신 약 6.1 내지 약 8.9, 라이신 약 5.7 내지 약 8.8, 메티오닌 약 0.14 내지 약 3.0, 시스테인 약 1.5 내지 약 1.8, 페닐알라닌 약 3.7 내지 약 4.8, 티로신 약 3.0 내지 약 5.2, 발린 약 4.8 내지 약 6.1, 아르기닌 약 7.0 내지 약 8.0, 히스티딘 약 2.5 내지 약 4, 알라닌 약 5.0 내지 약 6.3, 아스파르트산 약 8.6 약 10.4, 글루탐산 약 12.5 내지 약 14.6, 글리신 약 4.6 내지 약 9.8, 프롤린 약 4.6 내지 약 6.8, 세린 약 4.4 내지 약 5.3, 및/또는 하이드록시프롤린 약 0.0 내지 4.0.
실시태양 28. 실시태양 19에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 총 지방산에 대해 해당 부류에 대한 %로 표현된 표시된 양으로 하기 지방산 부류 중 하나 이상을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품:
a. 약 29% 내지 약 42%의 포화 지방산 함량;
b. 약 19% 내지 약 54%의 단일불포화 지방산 함량; 및
c. 약 5% 내지 약 36%의 고도불포화 지방산 함량.
실시태양 29. 실시태양 19에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 약 2:1 내지 18:1 오메가 6:3 지방산 부류의 비율을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 30. 실시태양 19에 있어서, 도축되지 않은 육류 제품은 도축되지 않은 닭, 오리 또는 소 육류를 포함하고, 통상적인 고기는 도축에 의해 얻은 닭, 오리 또는 소 육류를 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
실시태양 31. 다음 단계를 포함하여 도축에 의해 얻은 미가공 통상적인 육류와 비교하여 저장 수명의 증가를 나타내는 도축되지 않은 육류 제품의 제조 방법:
a. 비인간 유기체로부터 세포를 제공하는 단계;
b. 현탁 배양 조건 또는 부착 배양 조건하에서 배지에서 세포를 배양하는 단계, 여기서 배지는 동물로부터 유래된 혈청 및 기타 성분이 실질적으로 없다; 및
c. 세포를 분리하고 도축되지 않은 육류 제품을 생산하는 단계.
실시태양 32. 실시태양 31에 있어서, 세포는 근아세포, 섬유아세포, 지방세포, 내피 세포, 중배엽 계통의 세포, 및 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시태양 33. 실시태양 31에 있어서, 세포는 적어도 섬유아세포 및 근아세포를 포함하고, 섬유아세포 및 근아세포는 약 95F:5M 내지 약 5F:95M의 비율로 제공되는 것인 방법.
실시태양 34. 실시태양 31에 있어서, 방법은 배지의 지방산 함량을 조정하는 단계를 포함하고, 여기서 생성된 도축되지 않은 육류 제품은 약 2:1 내지 약 18:1의 오메가 6:3 지방산 부류의 비율을 갖는 것인 방법.
본 명세서에 개시된 발명은 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되는 하기 추가 실시예에 의해 추가로 예시된다. 당업자는 본 발명에 비추어 많은 변경이 개시되고 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 유사하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 인식해야 한다.
본 발명 전체에 걸쳐 참조된 모든 특허 및 비특허 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
실시예
실시예 1: 세포 배양 기반 육류 제품의 생성
예로서, 갈루스(닭), 아나스 플라티린초스(오리), 및 보스 토러스(소, 쇠고기)로부터의 육류를 하기 및 표 1에 기술된 바와 같이 배양액에서 생성하였다.
배양 조건: 세포 시트(조직) 및 분석된 세포를 섬유아세포(F) 및 근아세포(M)의 단일 배양 또는 공동 배양에 의해 생하였다. 단클론으로 지정되지 않는 한 모든 집단은 다클론이다(예를 들어, 방법 14).
부착 배양 형식: 세포를 용기로 해동시키고 부착 배양에서 거의 합류(70-90%)까지 성장시켰다. 세포는 조직 형성을 위한 종자에 적절한 수에 도달할 때까지 부착 배양에서 6 내지 10배 확장되었다. 조직은 표적 밀도(목표 범위: cm2당 10,000-20,000개 세포)에서 세포를 부착하여 시딩하고 조직에 2개 이상의 세포 유형이 포함된 경우 특정 비율로 시딩하여 조직을 생성하였다. 세포를 특정 양의 동물 혈청을 함유하는 배지에서 일정 시간(10-20일) 동안 배양하였다. 육류 조직은 배양이 끝날 때 물리적으로 채취하고 완충액으로 세척하여 배지 성분을 제거하였다.
현탁 배양 형식: 세포를 특정 양의 동물 혈청을 함유하는 배지로 해동하고 현탁 배양에서 성장시켰다. 새로운 배지를 추가하여 mL당 50,000 내지 1,000,000개 세포의 밀도를 유지하여 세포 집단을 확장하였다.
표 1은 여기에서 생산된 다양한 육류 제품에 대한 예시적인 배양 방법을 제공한다. 단클론으로 지정되지 않는 한 모든 집단은 다클론이다(예를 들어, 방법 14, 15, 단클론 근아세포 집단).
표에 대한 키 - 섬유아세포: F; 근아세포: M; 소 혈청: BS; 닭 혈청: CS; 소태아혈청: FBS; 말 혈청: HS; (높음): 특정 혈청의 8-10%를 포함하는 배지; (낮음): 특정 혈청의 1-2.5%를 포함하는 배지. 시드 트레인 또는 조직 형성 섹션에서 달리 설명되지 않는 한 10% FBS를 포함하는 DMEM-F12를 사용하였다.
세포 기반 고기를 생성하는 데 사용되는 세포 배양 방법
방법 # 샘플 ID 배양 조건

세포 유형(들) (비율) 		배양 형식 기본 배지
1 A. 플라티린초스(오리) 섬유아세포/근아세포 조직 1 공동배양 F/M (50/50) 부착 FBS(높음), BS(높음), CS(낮음), HS(낮음)가 있는 DMEM-F12
2 A. 플라티린초스(오리) 섬유아세포 조직 1 단일배양 F 부착 FBS(높음), BS(높음), CS(낮음), HS(낮음)가 있는 DMEM-F12
3 보스(소) 섬유아세포 조직 1 단일배양 F 부착 FBS(높음), BS(높음), CS(낮음), HS(낮음)가 있는 DMEM-F12
4 갈루스(닭) 섬유아세포 조직 1 단일배양 F 부착 FBS(높음), CS(낮음)가 있는 DMEM-F12
5 갈루스(닭) 섬유아세포 조직 2 단일배양 F 부착 CS(높음), BS(낮음)가 있는 DMEM-F12
6 갈루스(닭) 섬유아세포 조직 3 단일배양 F 부착 CS(높음), BS(높음)가 있는 DMEM-F12
7 갈루스(닭) 섬유아세포 조직 4 단일배양 F 부착 BS(높음), CS(낮음)가 있는 DMEM-F12
8 갈루스(닭) 섬유아세포 세포 1 단일배양 F 부착 10% FBS가 있는 DMEM-F12
9 갈루스(닭) 섬유아세포/근아세포 조직 1 공동배양 F/M (30/70) 부착 FBS(높음), CS(낮음)가 있는 DMEM-F12
10 갈루스(닭) 섬유아세포 조직 5 단일배양 F 부착 BS(높음), CS(낮음)가 있는 DMEM-F12
11 갈루스(닭) 근아세포 세포 1 단일배양 M 현탁 BS(높음), CS(낮음)가 있는 DMEM-F12
12 갈루스(닭) 섬유아세포/근아세포 조직 2 공동배양 F/M (30/70) 부착 BS(높음), CS(낮음)가 있는 DMEM-F12
13 갈루스(닭) 섬유아세포/근아세포 조직 3 공동배양 F/M (50/50) 부착 BS(높음), CS(낮음)가 있는 DMEM-F12
14 갈루스(닭) 섬유아세포/근아세포 조직 4 공동배양 F/단일클론 M (50/50) 부착 BS(높음), CS(낮음)가 있는 DMEM-F12
15 갈루스(닭) 섬유아세포/근아세포 조직 5 공동배양 F/단일클론
M (70/30)		 부착 BS(낮음)가 있는 화학적으로 정의된 배지
16 갈루스(닭) 근아세포 세포 2 단일배양 M 현탁 화학적으로 정의된 배지 제제. 혈청 없음
17 갈루스(닭) 근아세포 세포 3 단일배양 M 현탁 BS(높음), CS(낮음)가 있는 SMEM-F12
실시예 2: 세포 배양 기반 육류 제품의 아미노산 프로파일
기술된 방법 및 표 1을 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이, 육류 조직을 배양액에서 생성하였다.
세포 배양 기반 육류 제품의 아미노산 프로파일을 다음과 같이 분석하였다. 총 아미노산 프로필은 유리 및 결합된 아미노산의 합계가 포함되는 반면 유리 아미노산 프로필은 단백질에 결합되지 않은 아미노산을 포함한다.
샘플 준비: 1.7mL 마이크로튜브에서 약 100mg의 습윤 샘플을 얻었다. 샘플을 완전히 건조될 때까지 튜브에서 48시간 동안 동결 건조시켰다.
전체 가수분해: 약 4mg의 동결건조된 조직을 가수분해 튜브에 넣었다(샘플의 실제 질량 참고). 샘플을 500μL의 포름산에 밤새 담그고 건조시켰다. 샘플에 대한 액상 가수분해(200μL 6N 염산/1% 페놀 @ 110℃에서 24시간)를 수행한 다음 샘플을 건조하였다. 그런 다음 샘플을 와류하고 회전시켜 분석에 50μL를 사용하였다. 따라서, 전체 가수분해는 염산 분해를 통해 달성되었다.
유리 가수분해: 약 18mg의 동결건조된 조직을 가수분해 튜브에 넣었다(샘플의 실제 질량 참고). 샘플을 0.1N 염산 1mL에 녹인 다음 유리 비드(BioEruptor)로 15분 동안 초음파 처리하였다. 그런 다음 전체 샘플을 250uL 10% 5-설포살리실산으로 침전시킨 다음 실온에서 15분 동안 방치한 후 -20C에서 밤새 동결시켰다. 그런 다음 샘플을 원심분리하고 상층액을 취하여 표시된 대로 최종 희석을 위해 AE-cys(또는 NorLeu) 희석액을 준비하였다. 그런 다음 샘플을 와류하고 회전시켜 분석에 50μL를 사용하였다. 이 방법은 염산이 이들을 분해하므로 상이한 가수분해 조건을 필요로 하는 MET, CYS, TRP를 제외한 모든 아미노산에 적용되었다. MET와 CYS의 경우, 별도의 과포름산을 이용하여 가수분해를 하였고, TRP는 수산화나트륨을 이용하는 염기성 가수분해를 필요로 한다.
분석: 산-안정성 아미노산은 생리학적 샘플에 최적화된 시트르산리튬 완충 시스템을 사용하는 히타치 L-8900 및 L-8800a 분석기를 통해 분석되었다. 분석기는 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 아미노산을 분리한 후 "컬럼 후" 닌히드린 반응 검출 시스템을 사용하였다. 각 아미노산은 피크 체류 시간(RT)으로 확인하고 피크 면적으로 정량화하였다; 대표적인 RT 값은 관심 아미노산에 대해 아래 표 2에 나열된다.
아미노산의 피크 체류 시간
아미노산 약어 RT (min)
아스파르트산 ASX 8.5
트레오닌 THR 12.2
세린 SER 13.4
글루탐산 GLX 16.8
프롤린 PRO 25.7
글리신 GLY 26.9
알라닌 ALA 28.4
발린 VAL 33.9
아이소류신 ILE 53.4
류신 LEU 57.5
티로신 TYR 61.4
페닐알라닌 PHE 66.4
리신 LYS 100.5
히스티딘 HIS 103.2
아르기닌 ARG 116
하기 표 3-5는 표 1에 열거된 몇몇 샘플에 대한 아미노산(AA) 프로파일 데이터를 요약하고 - 일부 경우에 측정은 이중 또는 삼중으로 수행되었다. 값은 총 아미노산의 g/100g으로 표시된다. "총"으로 표시된 열은 TRP, CYS, MET, HYP, HYL을 제외한 아미노산의 총 그램을 나타내며 제시된 아미노산 값을 정규화하는 데 사용되었다. TRP, CYS, MET, HYP 및 HYL은 측정값이 모든 샘플에서 일관되지 않았기 때문에 제외되었다. NT = 테스트되지 않음.
아미노산 프로파일
트립토판 트레오닌 아이소류신 류신 리신 메티오닌
방법 ID 총* TRP THR ILE LEU LYS MET
1 96.13 NT 5.76 4.57 7.55 6.6 NT
1 96.50 NT 5.83 4.7 7.63 6.69 NT
1 96.25 NT 5.85 4.69 7.66 6.66 NT
3 96.00 NT 5.82 4.71 7.67 6.73 NT
3 96.19 NT 5.93 4.71 7.64 6.56 NT
4 96.70 NT 5.72 4.74 7.94 7.06 NT
4 97.44 NT 5.42 4.94 8.6 8.37 NT
5 91.50 2.22 5.3 4.35 7.55 6.94 2.95
6 92.12 2.12 5.22 4.39 7.71 7.17 2.95
7 92.26 1.98 5.32 4.37 7.63 7.21 2.96
7 99.98 NT 6.47 4.95 8 7.02 NT
8 95.15 NT 5.1 4.65 8.93 8.6 2.55
9 95.00 NT 5.09 4.74 8.61 8.8 2.7
9 93.47 NT 4.89 4.25 7.68 7.23 2.28
9 93.27 NT 4.97 4.25 7.56 7.06 2.24
10 97.24 NT 5.72 4.78 8.43 7.96 0.14
11 94.30 NT 5.65 4.68 8.05 7.57 2.46
11 93.72 NT 5.41 4.32 7.54 6.87 2.2
아미노산 프로파일
시스테인 페닐알라닌 티로신 발린 아르기닌 히스티딘 알라닌
방법 ID CYS PHE TYR VAL ARG HIS ALA
1 NT 4.14 4.09 5.78 7.63 3.46 5.3
1 NT 4.18 4.13 5.86 7.52 3.47 5.25
1 NT 4.15 4.08 5.83 7.54 3.37 5.27
3 NT 4.2 4.04 5.81 7.47 3.36 5.29
3 NT 4.17 4.17 5.86 7.57 3.37 5.2
4 NT 4.29 4.05 5.92 7.59 3.56 5.42
4 NT 4.62 3.96 5.86 7.45 3.94 5.52
5 1.72 4.27 3.93 5.33 7.07 3.51 5.02
6 1.6 4.38 3.92 5.35 7.17 3.52 5.08
7 1.54 4.09 3.77 5.5 7.21 3.45 5.12
7 NT 4.23 5.15 5.88 7.95 2.51 5.54
8 1.8 4.76 3.94 6.1 7.6 3.85 5.63
9 1.7 4.65 3.89 5.95 7.37 3.9 5.58
9 1.72 4.39 3.69 5.32 7.13 3.38 5.95
9 1.69 4.42 3.72 5.37 7.12 3.46 5.91
10 1.7 4.52 3.98 6.07 7.56 3.79 5.6
11 1.82 4.34 4.01 5.89 7.33 3.83 5.37
11 1.67 4.13 3.73 5.53 7.41 3.41 5.71
아미노산 프로파일
알라닌 아스파르트산 글루탐산 글리신 프롤린 세린 하이드록시-프롤린
방법 ID ALA ASX GLX GLY PRO SER HYP
1 5.3 9.91 13.52 7.03 5.99 4.8 1.58
1 5.25 9.98 13.57 6.8 6.04 4.85 1.32
1 5.27 9.87 13.51 6.89 6.07 4.81 1.26
3 5.29 9.82 13.47 6.73 6.09 4.79 1.37
3 5.2 9.91 13.49 6.82 5.95 4.84 1.28
4 5.42 9.71 13.73 6.39 5.75 4.83 1.07
4 5.52 9.97 13.92 5 4.91 4.96 NT
5 5.02 9.19 13.55 5.63 5.16 4.7 1.02
6 5.08 9.31 13.64 5.39 5.16 4.71 0.64
7 5.12 9.41 13.8 5.56 5.03 4.79 0.86
7 5.54 10.39 14.64 6.18 5.78 5.29 0
8 5.63 9.48 12.63 4.56 4.59 4.73 0
9 5.58 9.57 12.47 4.94 4.78 4.66 0
9 5.95 9.15 13.29 7.06 5.49 4.57 1.51
9 5.91 9.05 13.15 7.12 5.6 4.51 1.71
10 5.6 9.89 13.24 5.33 5.3 5.07 0.36
11 5.37 9.57 12.67 5.44 5.05 4.85 0.8
11 5.71 9.38 12.65 6.95 6.01 4.67 1.64
표 6-8은 개별적으로 닭, 오리 및 소에 대한 복합 평균 아미노산 값(% 총 아미노산으로 표시됨)을 나타낸다. 총 아미노산의 %는 이러한 매개변수가 모든 샘플에서 일관되게 측정되지 않았기 때문에 트립토판(TRP), 시스테인(CYS), 메티오닌(MET), 하이드록시프롤린(HYP) 및 하이드록시리신(HYL)을 제외한 모든 측정된 분석물에 대한 합계로 정규화된 각 개별 아미노산에 대한 g/100g 값으로 표시된다. 따라서 TRP, CYS, MET, HYP 및 HYL이 구체적으로 측정되었는지 여부에 관계없이 총 값의 %가 모든 샘플을 직접 비교를 가능하게 한다.
표 9는 결합된 표 6-8의 데이터 - 모든 세포 기반 육류 샘플(표 1의 방법의 합성물) 아미노산 조성 데이터를 보여준다.
닭고기 세포 기반 육류 아미노산 조성물
표 6: 닭고기 - % 총 AA
THR ILE LEU LYS MET CYS
AVG 5.53 4.60 7.91 7.28 2.34 1.70
STDEV 0.40 0.22 0.44 0.70 0.83 0.08
N 18 18 18 18 10 10
95% CI 0.19 0.10 0.20 0.32 0.51 0.05
MIN 4.89 4.25 7.54 6.56 0.14 1.54
MAX 6.47 4.95 8.93 8.80 2.96 1.82
PHE TYR VAL ARG HIS ALA
AVG 4.33 4.01 5.73 7.43 3.51 5.43
STDEV 0.20 0.32 0.26 0.23 0.32 0.27
N 18 18 18 18 18 18
95% CI 0.09 0.15 0.12 0.10 0.15 0.12
MIN 4.09 3.69 5.32 7.07 2.51 5.02
MAX 4.76 5.15 6.10 7.95 3.94 5.95
ASX GLX GLY PRO SER HYP
AVG 9.64 13.39 6.10 5.49 4.80 0.97
STDEV 0.35 0.54 0.86 0.50 0.18 0.59
N 18 18 18 18 18 17
95% CI 0.16 0.25 0.40 0.23 0.08 0.28
MIN 9.05 12.47 4.56 4.59 4.51 0.00
MAX 10.39 14.64 7.12 6.09 5.29 1.71
오리고기 세포 기반 육류 아미노산 조성물
표 7: 오리고기 - % 총 AA
THR ILE LEU LYS MET CYS
AVG 5.10 3.99 6.42 6.35 2.09 1.61
STDEV 0.09 0.15 0.43 0.33 0.06 0.09
N 3 3 3 3 3 3
95% CI 0.10 0.17 0.48 0.38 0.07 0.10
MIN 5.01 3.82 6.10 6.09 2.02 1.51
MAX 5.18 4.12 6.90 6.73 2.13 1.68
PHE TYR VAL ARG HIS ALA
AVG 4.08 3.26 4.99 7.36 2.76 6.15
STDEV 0.19 0.18 0.23 0.25 0.15 0.17
N 3 3 3 3 3 3
95% CI 0.21 0.21 0.26 0.28 0.17 0.19
MIN 3.87 3.05 4.78 7.12 2.65 5.96
MAX 4.23 3.40 5.24 7.62 2.93 6.28
ASX GLX GLY PRO SER HYP
AVG 8.78 13.16 8.76 6.56 4.56 3.48
STDEV 0.24 0.31 0.73 0.34 0.08 0.54
N 3 3 3 3 3 3
95% CI 0.28 0.35 0.83 0.39 0.09 0.61
MIN 8.61 12.80 7.95 6.17 4.49 3.01
MAX 9.06 13.36 9.38 6.79 4.65 4.07
쇠고기 세포 기반 육류 아미노산 조성물
표 8: 쇠고기 - % 총 AA
THR ILE LEU LYS MET CYS
AVG 4.60 3.96 7.03 5.96 2.01 1.53
STDEV 0.02 0.09 0.24 0.39 0.01 0.06
N 2 2 2 2 2 2
95% CI 0.03 0.13 0.33 0.54 0.01 0.09
MIN 4.58 3.89 6.86 5.68 2.00 1.48
MAX 4.61 4.02 7.20 6.23 2.01 1.57
PHE TYR VAL ARG HIS ALA
AVG 3.82 3.37 4.89 7.25 2.74 6.07
STDEV 0.14 0.02 0.13 0.28 0.07 0.10
N 2 2 2 2 2 2
95% CI 0.20 0.03 0.18 0.39 0.10 0.14
MIN 3.72 3.35 4.80 7.05 2.69 6.00
MAX 3.92 3.38 4.98 7.45 2.79 6.14
ASX GLX GLY PRO SER HYP
AVG 8.77 13.03 9.27 6.26 4.50 3.21
STDEV 0.22 0.46 0.79 0.40 0.06 0.42
N 2 2 2 2 2 2
95% CI 0.30 0.64 1.10 0.56 0.08 0.58
MIN 8.61 12.70 8.71 5.97 4.46 2.91
MAX 8.92 13.35 9.83 6.54 4.54 3.50
모든 세포 기반 육류 샘플(표 1의 방법 조합) 아미노산 조성물(샘플 100g당 아미노산 g)
AVG STDEV N MIN MAX
트립토판 TRP 1.67 0.60 5 1 2.22
트레오닌 THR 5.39 0.46 23 4.58 6.47
아이소류신 ILE 4.46 0.33 23 3.82 4.95
류신 LEU 7.64 0.68 23 6.1 8.93
리신 LYS 7.05 0.78 23 5.68 8.80
메티오닌 MET 2.25 0.68 15 0.14 2.96
시스테인 CYS 1.66 0.10 15 1.48 1.82
페닐알라닌 PHE 4.25 0.25 23 3.72 4.76
티로신 TYR 3.86 0.41 23 3.05 5.15
발린 VAL 5.56 0.41 23 4.78 6.10
아르기닌 ARG 7.40 0.23 23 7.05 7.95
히스티딘 HIS 3.34 0.43 23 2.51 3.94
알라닌 ALA 5.58 0.38 23 5.02 6.28
아스파르트산 ASX 9.45 0.49 23 8.61 10.39
글루탐산 GLX 13.32 0.50 23 12.47 14.64
글리신 GLY 6.72 1.46 23 4.56 9.83
프롤린 PRO 5.69 0.61 23 4.59 6.79
세린 SER 4.74 0.20 23 4.46 5.29
종합적으로, 육류의 아미노산 프로파일은 통상적인 육류와 유사하지만(도 1), 결정적인 차이가 있다. 예를 들어, 세포 기반 육류의 하이드록시프롤린 농도는 기존 육류보다 높다(USDA 데이터베이스 Food Central Database [https://fdc.nal.usda.gov/]). 세포 기반 육류와의 비교는 표 10에 도시된다(단위는 총 단백질 100g당 하이드록시프롤린의 그램으로 표시됨). 농도는 통상적인 및 세포 기반 육류 소, 오리 및 닭에 대해 표시된다. 세포 기반 육류는 표 1의 방법 2, 3 및 7을 사용하여 생성되었다. 하이드록시프롤린 농도는 비교 대상으로 사용된 3종의 세포 기반 육류에서 상승하였다.
하이드록시프롤린 농도(하이드록시프롤린 g/총 단백질 100g)
　 USDA/문헌 실험 분석
　 통상적인 세포 기반 육류
　 소 오리 닭 닭 소 오리 닭
Mean 0.839 0.852 0.371 0.223 3.205 3.477 1.424
SD 0.489 0.167 0.160 0.146 0.417 1.521 0.288
N 8 40 8 4 2 3 10
도 2 및 표 11은 추가 처리와 함께 방법 7, 13 및 14에서 생성된 세포 기반 육류에 대한 닭 세포 기반 육류에 대한 하이드록시프롤린 농도를 보여준다. 도 2는 세포 기반 육류의 습식 질량 100g당 하이드록시프롤린 농도를 그램 단위로 보여준다. 세포 기반 육류의 하이드록시프롤린 평균 농도는 세포 기반 육류의 습윤 질량 100g당 0.15 내지 0.17g 범위이다(도 2). 표 11은 총 단백질 100g당 하이드록시프롤린 농도를 그램 단위로 보여준다. 제어 조건(Ctrl)은 각각 FB, FB/MB(poly) 및 FB/MB(mono)에 대해 표 1의 방법 7, 13, 14를 사용하여 생성되었다. 하이드록시프롤린 수치는 통상적인 대응물과 비교하여 섬유아세포 배양 단독으로 생성된 세포 기반 육류에서 증가한다. 근아세포(MB)가 다클론성 세포 혼합물(근육모세포의 혼합 집단)(예를 들어, 표 1의 방법 13) 또는 단클론성 근아세포 세포 혼합물(표 1의 방법 14)(혼합 집단으로부터 분리되고 확장된 단일 세포)로 배양 시스템에 추가되는 경우, 하이드록시프롤린 농도는 통상적인 육류의 농도에 가깝게 감소된다. 하이드록시프롤린 농도는 수정된 배양 조건(처리 1 우르솔산, 20mM 또는 처리 2 류신, 20mM)을 사용하여 추가로 감소한다. 이러한 처리는 표 1의 방법 13 및 14에 적용되었다.
하이드록시프롤린 농도(g/100g 총 단백질)
FB FB/MB(poly) FB/MB(mono)
Cnt Cnt Tx-1 Tx-2 Cnt Tx-1 Tx-2
Mean 1.424 0.898 0.649 0.308 0.814 0.510 0.162
SD 0.288 0.449 0.044 0.112 0.438 0.014 0.090
N 10 8 3 3 6 3 3
실시예 3: 세포 기반 육류 제품의 미생물 오염 분석
세포 기반 육류 조직을 미생물 오염, 예를 들어 대장균군 박테리아, 효모, 곰팡이, 살모넬라 및 리스테리아에 대해 평가하였다.
이러한 연구는 제3자 연구소인 Anresco Laboratories에서 수행되었다. 표준 플레이트 계수(SPC), 대장균/대장균군, 효모/곰팡이는 표준 FDA 생물학적 분석 방법 프로토콜에 의해 결정되었다. 살모넬라(AOAC 2011.03), 리스테리아(AOAC 2004.06), 포도상구균(AOAC 2003.07)에 대해서는 AOAC 방법을 사용하였다.
간단히 말해서, SPC는 세포 기반 육류 균질액의 10진 희석액을 제조하고 희석액당 1mL 분취량을 별도의 중복된 대략적으로 표시된 페트리 접시에 피펫팅하고 여기에 12-15mL의 플레이트 계수 한천을 첨가함으로써 달성되었다. 샘플 희석액과 한천 배지를 완전히 혼합하고 한천을 응고시켰다. 응고된 페트리 접시를 뒤집고 35℃에서 48±2시간 동안 배양하고, 그 시간 이후 플레이트 계수를 읽는다.(https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-aerobic-plate-count#conventional)
대장균/대장균군 측정값은 50g의 세포 기반 육류 균질화 샘플을 450mL의 완충액필드(Butterfield)의 인산염 완충액에 준비하고 혼합하여 결정하였다. 10진 희석액을 준비하고 1mL 부피를 3개의 튜브 가장 가능성 있는 수(MPN)에 대해 3개의 라우릴 트립토스(LST) 브로스 각각에 분취하였다. LST 튜브를 35℃에서 배양하고 24±2시간 후에 검사하여 기체 변위 또는 기포를 관찰하였다; 모든 기체 음성 튜브는 음성을 확인하기 위해 추가로 24시간 동안 배양되었다. 각 기체 주입 LST 튜브로부터, 대장균군을 확인하기 위해, 루프풀의 샘플을 브릴리언트 그린 락토스 담즙(BGLB) 브로스 튜브로 옮기고 35℃에서 48±3시간 동안 배양하였다. MPN은 3회의 연속 희석에 대한 확인된 기체 주입 LST 튜브의 비율을 기반으로 계산되었다. 각 기체 주입 LST 튜브에서, 대장균을 확인하기 위해, 루프풀의 샘플을 EC 브로스 튜브로 옮기고 44.5℃에서 24±2시간 동안 배양하였다. 모든 음성 결과는 다시 배양하고 48시간에 다시 검사하였다. 추가로, 각각의 기체 주입 EC 튜브는 18-24시간 동안 35℃에서 L-EMB 한천 플레이트에서 루프풀의 브로스를 제거하고 줄무늬 분리하여 샘플링되었다; 모든 대장균 콜로니를 PCA 경사로 옮기고 35℃에서 18-24시간 동안 추가로 배양하였다. MPN은 대장균을 함유하는 3개의 연속 희석액에서 EC 튜브의 비율을 기반으로 계산되었다. (https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-4-enumeration-escherichia-coli-and-coliform-bacteria#conventional)
효모/곰팡이 계수는 0.1% 펩톤 물에 분해된 25-50g 세포 기반 육류 샘플을 분석하여 10-1 희석을 달성하고 스토머에서 2분 동안 균질화하거나 30-60초 동안 블렌딩하여 얻었다. 스프레드-플레이트(spread-plate) 또는 푸어-플레이트(pour-plate) 플레이팅을 수행하고 25℃의 암실에서 배양하였다. 5일 후에 플레이트를 계수하고; 음성 플레이트를 추가로 48시간 동안 배양하였다. (https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-yeasts-molds-and-mycotoxins)
표 12는 세포 기반 육류와 통상적인 식료품점 육류의 오염 물질의 비교를 제공한다. 통상적인 오리 육류, 특히 일반 쇠고기는 현저하게 더 많은 양의 미생물 오염이 있었다.
통상적인 오리 육류는 지역 식료품점(캘리포니아주 버클리)에서 구입하였다. 육류를 피부와 지방으로부터 분리하여 소독한 칼과 도마로 잘게 다져준다. 육류를 50mL 팔콘 튜브에 포장하고 밀봉하였다. 닫힌 튜브에 70% 에탄올을 분사하고 -80℃에서 동결하였다. 샘플을 -80℃에서 동결한 다음 테스트 전에 4℃에서 유지하였다.
세포 기반 오리 육류는 표 1에 기술된 방법 1 및 2를 사용하여 조직의 조합이었다. 조직을 냉동 저장고에서 제거하고, 혼합하고, 멸균된 도마와 칼을 사용하여 잘게 썬다. 육류를 50mL 팔콘 튜브에 포장하고 밀봉하였다. 닫힌 튜브에 70% 에탄올을 분사하고 -80℃에서 동결하였다. 샘플을 -80℃에서 동결한 다음 테스트 전에 4℃에서 유지하였다.
엑스트라 린(97% 린) 간 쇠고기는 지역 식료품점(캘리포니아주 버클리)에서 구입하였다. 쇠고기를 50mL 팔콘 튜브에 직접 포장하였다. 튜브를 밀봉하고 70% 에탄올로 분사하였다. 튜브는 -80℃에서 동결하였다. 샘플을 -80℃에서 동결한 다음 테스트 전에 4℃에서 유지하였다.
세포 기반 소 육류는 표 1의 방법 3을 사용하여 조직의 조합이었다. 조직을 냉동 보관에서 제거하고 혼합하고 멸균된 도마와 칼을 사용하여 잘게 썬다. 육류를 50mL 팔콘 튜브에 포장하고 밀봉하였다. 닫힌 튜브에 70% 에탄올을 분사하고 -80℃에서 동결하였다. 샘플을 -80℃에서 동결한 다음 테스트 전에 4℃에서 유지하였다.
통상적인 육류와 세포 기반 육류의 오염 물질 비교
샘플 표준 플레이트 계수 (cfu/g) 확인된 대장균군 (cfu/g) 대장균 (cfu/g) 효모(cfu/g) 곰팡이(cfu/g) 살모넬라(per 25g) 리스테리아 (per 25g) CP 포도상구균 (cfu/g)
통상적인 오리 100 <10 <10 <10 <10 음성 음성 <10
세포 기반 오리 <100 <10 <10 <10 <10 음성 음성 <10
통상적인 소 6000000 1300 <10 2300 <10 음성 양성 - L. monoctogenes가 검출됨 <10
세포 기반 소 <100 <10 <10 <10 <10 음성 음성 <10
추가 실험에서 CompactDry 플레이트를 사용하여 세포 기반 육류 샘플 및 통상적인 육류 샘플에 대한 총 호기성 계수 및 대장균/대장균군 계수를 평가하였다. 모든 평가된 샘플은 조리되지 않은 날 것이었다.
에탄올로 살균된 공급품으로 1g 샘플 크기를 수집하고 살균 튜브로 옮기는 것을 포함하는 CompactDry 프로토콜이 사용되었다; 살균 버터필드의 인산염 완충액을 첨가하여 시료 25g 대 완충액 225mL의 비율을 유지하였다. 튜브를 와류하고 실온에서 10분 동안 방치하여 박테리아를 용액으로 옮기고 나서 300xg에서 5분 동안 원심분리하여 고체를 바닥으로 끌어당겼다; 상청액을 살균 튜브에 수집하고 10진 희석액을 준비하였다. 희석액당 1mL 분취량을 총 호기성 계수(TC) 및 대장균/대장균군(EC)에 대해 각각 총 계수 CompactDry™ TC 및 CompactDry™ EC 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이트를 제조사 사양에 따라 배양하고, 콜로니를 cfu/mL로 계산하고 225mL 샘플 분해 비율당 25g을 기준으로 cfu/g으로 전환하였다.
일반적으로, 세포 기반 육류 회수율은 낮았고, 일반적으로 분석에 대한 검출 한계(~10 cfu/g) 미만이었고 따라서 검출되지 않았다(ND), 표 13. 보다 구체적으로, 상이한 배치의 세포 기반 오리 육류는 TC의 경우 ND(<9 cfu/g) 내지 54 cfu/g, 총 EC의 경우 ND(<9 cfu/g)로 산출되었다. TC의 경우 세포 기반 쇠고기 샘플은 ND(<9 cfu/g)를 산출하고 세포 기반 닭고기 샘플은 ND(<9 cfu/g)에서 18 cfu/g으로 산출했습니다. 세포 기반 오리 및 쇠고기 샘플(총 호기성 수치가 낮음)이 통상적인 날 닭고기로 의도적으로 오염되었을 때(표 13에서 "닭고기로 오염된" 세포 기반 샘플로 표시됨), TC는 >900 cfu/g으로 급등하였고 이는 샘플 매트릭스를 사용한 분석의 유용성을 나타내고 매트릭스 효과로 인해 신호 억제가 발생하지 않았음을 확인시킨다. 통상적인 생 쇠고기 및 닭고기 샘플은 모두 >900 cfu/g TC 및 315 cfu/g 및 >900 cfu/g EC를 나타내었다. 통상적인 날 육류 샘플과 비교하여, 세포 기반 육류 샘플은 모두 바이오버든(bioburden)이 상당히 적은 것을 나타내는 낮은(<100 cfu/g) TC 및 EC 계수를 나타내지 않았다. 도 3은 박테리아 콜로니를 나타내는 대표적인 CompactDry 플레이트를 보여주며, 구체적으로 세포 기반 오리고기, 일반 쇠고기 및 일반 닭고기에 대한 EC 및 TC 결과를 보여준다. 이는 표 13에 정량화되어 있다.
통상적인 및 세포 기반 육류 샘플의 바이오버든
샘플 총 호기성 계수, cfu/g 대장균 / 대장균군, cfu/g
통상적인 쇠고기 >1000 350
통상적인 닭고기 >1000 >1000
세포 기반 오리고기 60 <10
닭고기로 오염된 세포 기반 오리고기 >1000 측정되지 않음
세포 기반 쇠고기 <10 측정되지 않음
닭고기로 오염된 세포 기반 쇠고기 >1000 측정되지 않음
세포 기반 닭고기 <10 내지 20 측정되지 않음
닭고기로 오염된 세포 기반 닭고기 >1000 측정되지 않음
실시예 4: 세포 기반 육류 제품의 지방산 함량 분석
이 섹션의 대부분의 데이터는 GC-FAME 방법(방법 FA1)을 통해 지방산 프로필을 분석하는 것과 관련되어 있으며, 여기서 샘플은 직접 가수분해(샘플이 클로로포름 및 에탄올에 용해된 상태에서 열 하에서 염산 사용)를 거쳐 샘플 매트릭스를 분해하고, 트라이글리세리드(TG)를 유리시키고 TG를 지방산으로 전환한다. 지방산은 에테르 추출을 통해 회수되었고 비극성 층으로 수집되었다. 지방산은 메탄올성 황산을 통해 지방산 메틸 에스터(FAME) 대응물로 유도체화되었고 최종 FAME 화합물은 에터 추출을 통해 회수되었다. 비극성 FAME 함유 층은 GC-FID를 통한 분석을 위해 주입되었다. 개별 FAME 화합물은 머무름 시간을 기준으로 식별하고 표준 곡선과 비교하여 피크 아래 면적으로 정량화하였다. 회복은 트리글리세리드 내부 표준을 기준으로 평가되었다. 도 8에 제시된 데이터는 AOCS CE 1F-96에 따라 기술적으로 다른(비슷하지만) 방법(방법 FA2)을 통해 분석되었으며, 기체 크로마토그래피를 사용하여 사슬 길이, 포화/불포화도 및 불포화 위치에 의해 지방산 유도체를 분리하였다.
두 방법 모두에서, 분석에서 회수된 원시 값은 총 지방산에 대한 각 지방산의 백분율로 보고된다. 방법 FA1에서, 분석법에서 보고된 값은 습식 질량 g당 ug 지방산이었다. 총 지방산의 %는 측정된 모든 지방산 분석물에 대한 합계로 정규화된 각 개별 지방산에 대한 g/100g 값으로 표시된다. 방법 FA2는 지방산을 총 지방의 백분율로 보고하였다.
표 14는 세포 기반 육류에 대한 총 지방산 분석을 보여준다. 총 FA는 표시된 대로 표 1의 방법을 사용하여 준비된 세포 기반 육류에서 결정되었다. 표의 데이터는 습식 질량의 %로 측정된다. 세포 기반 육류가 통상적인 육류(수분 함량을 65%에서 85% 사이로 조절하기 위해 강제 공기 탈수 과정을 거친 세포 기반 육류)의 수분 함량을 모방하도록 조정될 때, USDA에 의해 일반적으로 측정되고 기록된 바와 같이, %FA가 최대 약 5%까지 올라갔다.
총 지방산 분석
방법 명칭
(표 1) 		습식 질량의 백분율 총 FA (%)
7 0.97
14 0.88
14 0.77
17 1.11
17 2.17
13 1.12
13 1.15
14 1.45
14 1.25
14 0.96
17 0.57
17 1.15
17 1.01
17 0.86
16 0.96
14 1.01
14 1.2
16 0.68
16 0.64
16 0.66
7 1.12
7 1.07
7 1.4
14 1.38
Avg 1.06
Min 0.57
Max 2.17
Store-bought chicken 3.96
Store-bought chicken 3.98
Store-bought chicken 4.13
Avg 4.02
도 4는 표 1의 각 방법을 사용한 대표적인 샘플을 포함하는 샘플(N=24)에 걸친 포화, 단일불포화 및 다중불포화 지방산에 대한 총 지방산 조성물을 보여준다. 데이터는 FA 등급/총 FA의 백분율로 표시된다. 모든 샘플(표 1, 1-15)은 화학적으로 정의된(CD) 세포 배양 배지에 있는 현탁액 단일배양 M(방법 16, 표 1)을 제외하고 혈청 함유 배지에 있었다. 도면은 4가지 주요 지방산 등급 지정(포화 지방산, 단일불포화 지방산, 다중불포화 지방산 및 고도 불포화 지방산(HUFA))에 걸쳐 모든 종 세포 기반 육류 프로토타입에서 파생된 지방산의 분포를 보여준다. 상자의 끝은 상위 및 하위 사분위수이므로, 상자는 사분위수 범위에 걸쳐 있으며 중앙값은 상자 내부의 수직선으로 표시되며 상자를 묶는 빗살모양 또는 선은 최고 및 최저 관찰까지 연장되는 상자 외부의 두 줄이다.
도 5는 USDA 종 FA의 PCA를 보여준다. 이것은 FA가 종에 따라 다르지만 유사한 종(예를 들어, 가금류)에서 유사함을 보여준다. 지방산 데이터의 주성분 분석(PCA)은 USDA 데이터베이스 육류 제품에서 수집되었다. 도5. 왼쪽 그래프는 분석의 주요 구성 요소를 보여준다. 삼각형은 가금류 제품, 원은 생선 제품, 사각형은 쇠고기, 다이아몬드는 돼지고기이다. 이 분석은 지방산 데이터에서 발견된 변동의 66.3%를 설명한다. 오른쪽 그래프는 각 지방산이 성분 분석에 미치는 방향성과 크기 효과를 보여준다. 이 분석을 통해 다양한 유형의 육류(닭고기, 돼지고기, 쇠고기 및 생선)가 각 육류의 지방산 프로필에 따라 서로 다른 별개의 그룹으로 모여 있음이 분명하다. 기존 육류에서 식단은 지방산 프로필에 상당한 영향을 미친다. 마찬가지로, 지방산 프로필은 종에 따라 다르다.
도 6은 세포 기반 닭고기 N=23에서 오메가 6 대 3 지방산의 비율을 나타낸다. 이상치 데이터 포인트는 모두 표 1의 방법 16에 따라 화학적으로 정의된(CD) 세포 배양 배지에서 파생되었다. 오메가 6:3 지방산의 통상적인 닭고기(현지에서 구입) 육류 비율은 n=3의 샘플 크기 > 18:1이었다.
본 명세서에 제공된 방법은 특정 지질 프로필을 변경하여 원하는 풍미 특성 또는 지방산 프로필, 예를 들어 오메가 3/6 비율을 여러 메커니즘을 통해 달성할 수 있다.
a. 배지에 혈청이 있으면 지방산 프로필에 영향을 줄 수 있다. 도 7은 무혈청 배지 대 혈청 함유 배지에서의 지방산 백분율을 나타낸다.
b. 다양한 공급원의 혈청은 배양된 조직에 다양한 지방산 프로필을 부여한다. (도 8)
c. 다클론 집단에서 분리된 클론은 FA 프로필에도 영향을 미친다. 근아세포 클론 7 대 8(도 9).
d. 지방산 프로필은 배지 조성물과 효현제 또는 리보플라빈(예를 들어)과 같이 FA 조성물을 변경하기 위해 추가되는 화합물을 포함한 배지 구성요소의 추가에 의해 영향을 받는다. 배지 조정은 지방 프로필에 영향을 줄 수 있다. (도 10, 도 11).
도 10. 특정 생화학적 경로를 조절하기 위해 다양한 화합물의 수준이 향상된 배양 배지를 사용하여 공동 배양 방법(표 1의 방법 15에 기술됨)을 사용하여 조직을 형성하였다. 도 10에서, 효현제 T0901317을 세포 배양 배지에 적정하였다. 지방산 농도에 대한 전체적인 효과가 표시된다. 효현제 T0901317은 간 X 수용체 β(LXRβ)를 표적으로 한다. LXRβ의 억제는 스테아로일-CoA 불포화 효소(SCD) 합성을 상향 조절하여 포화 지방산을 불포화 지방산으로 추가 전환한다(예를 들어, 스테아르산-18:0 내지 올레산-18:1 및 리놀레산-18:2).
도 11. 특정 생화학적 경로를 조절하기 위해 다양한 화합물의 수준이 향상된 배양 배지를 사용하여 공동 배양 방법(표 1의 방법 15에 기술됨)을 사용하여 조직을 형성하였다. 도면에서, 비타민과 공통 보조 인자인 리보플라빈은 세포 배양 배지에 적정되었다. 지방산 농도에 대한 전체적인 영향이 도시된다.
도 12는 특정 FA의 프로필을 변경하기 위한 배지로의 FA 적정을 보여준다. 통상적인 닭고기에서의 유병률에 따라, 팔미톨레산(C16:1), 팔미트산(C16:0), 리놀레산(C18:2) 및 올레산(C18:1)의 4가지 특정 지방산가 세포 배양 배지에 보충을 통한 목표 증가를 위해 선택되었다. 조직은 도 12에 도시된 바와 같이 각각의 지방산의 수준이 향상된 배양 배지를 사용하는 공동 배양 방법(표 1의 방법 14에 기술됨)을 사용하여 형성되었다(10mg/L 총 FA: 2.8mg/L C16:0, 0.5mg/L C16:1, 4.2mg/L C18:1 및 2.5mg/L C18:2, 20mg/L 총 FA: 5.6mg/L C16:0, 1.0mg/L C16:1, 8.4mg/L C18:1 및 5.0 mg/L C18:2).
실시예 5: 세포 기반 육류 제품의 다량 영양소 분석
수분, 단백질 및 지방을 포함하는 다량 영양소 함량에 대해 육류 조직을 평가하였다.
총 수분은 수분-1 또는 수분-2의 두 가지 방법 중 하나로 분석하였다. 수분 1에서, AOAC 방법 950.46을 사용하였다. 간단히 말해서, 이 방법은 알루미늄 접시에 칭량된 샘플 2g을 사용하고 기계적 대류 공기 오븐에서 100-102℃에서 16-18시간 동안 건조된다. 건조된 샘플을 데시케이터에서 냉각하고 무게를 다시 잰다; 수분은 샘플 무게의 손실로 보고된다. 수분-2에서, >100mg 샘플을 미리 칭량한 알루미늄 접시에 추가하고 70℃에서 밤새 건조하여 일정한 질량을 유지한다. 50℃와 같은 다른 온도도 사용할 수 있다. 수분-1 및 수분-2 모두에서 건조 후 샘플의 질량 손실은 샘플의 총 수분 백분율에 기인한다.
총 단백질은 단백질-1 또는 단백질-2의 두 가지 방법 중 하나로 분석하였다. 단백질-1에서, AOAC 방법 977.14를 사용하였다. 이 방법은 시료의 질소를 촉매로 가열하여 산에서 암모니아로 환원시키는 키엘달 방법이다. 그런 다음 암모니아를 수증기로 증류하고 산으로 적정한다. 6.25의 질소 계수는 질소 함량을 조단백질로 변환하는 데 사용된다. 단백질-2에서, 피어스 BCA 분석의 변형을 사용하였다. 100mg 샘플을 3시간 동안 초음파 처리하에서 0.1g/mL의 비율로 1M 수산화나트륨에서 분해시켜 샘플 매트릭스를 용해시켰다. 그런 다음 샘플 분해물을 희석하고 비색 피어스 BCA 분석을 통해 분석하였다. 최종 μg/mL 값은 0.1g/mL 분해 비율을 사용하여 습식 질량 g당 단백질 g으로 변환된다.
총 지방은 Fat-1 또는 Fat-2의 두 가지 방법 중 하나로 분석하였다. Fat-1에서, 석유 에터를 용매로 사용하여 AOAC 방법 991.36을 통해 샘플 매트릭스에서 가용성 지방을 추출하였다. 이 방법에서, 샘플을 금속통에서 계량하고 추출 장치에 삽입하여 용매를 추가하여 용매 회수 시스템을 통해 추출을 수행하였다. 추출 컵을 건조시키고 무게를 잰다. 유사한 방식으로 Fat-2는 미리 계량된 16mL 바이알에서 >250mg 샘플을 계량하고 70℃에서 밤새 건조하는 변형된 Folch 추출을 포함한다; 건조 후 질량 손실은 수분에 기인한다. 건조된 샘플은 바이알에 남아 있고 Hydranal LipoSolverCM 용매(10mL)를 사용하여 추출하였다. 바이알을 PTFE 라이닝된 캡으로 덮고 실온에서 24시간 동안 200rpm으로 진탕시켰다. 추출 후, 샘플을 미리 칭량한 PTFE 필터(0.2μm 기공 크기)를 통해 여과하고 50℃에서 48시간 동안 건조하여 화학 흄 후드로 배출하였다. Fat-1 및 Fat-2 모두에서 추출 후 샘플의 질량 손실은 샘플의 총 지방 비율에 기인한다.
실시예 6: 세포 배양 기반 육류 제품의 호르몬 분석
육류 샘플은 내부 참조와 함께 LC-MS/MS 방법을 사용하여 제 3 자 분석 실험실(Eurofins Central Analytical Laboratories)에 의해 호르몬 수준에 대해 분석하였다. 호르몬 ELISA 분석 결과는 통상적인 닭고기 시료가 세포 기반 닭고기 시료(부착 또는 현탁 배양으로 성장)에 비해 더 높은 호르몬 농도를 산출했음을 나타내었다. 관심 샘플 매트릭스에 대한 이 분석의 유효성을 확인하기 위해 추가 데이터가 수집된다. 간단히 말해서, 17β-에스트라다이올 분석은 R-biopharm의 RIDASCREEN® 17β-에스트라다이올 키트를 사용하여 수행되었다. PTFE 라이닝 캡이 있는 유리 바이알에서, 젖은 고기 샘플 1-1.5g을 측정하고 톱니 액세서리가 있는 휴대용 균질화기를 사용하여 젖은 샘플 질량 1g에 완충액 1mL의 비율로 67mM 인산완충식염수(PBS)에서 균질화하였다. 균질화 후, 5mL의 메틸 tert-부틸 에터(MTBE)를 첨가한 다음, 30분 동안 진탕하였다. 샘플 튜브를 원심분리하고 MTBE 상층액을 수집하고 샘플에 대해 MTBE의 추가 5mL 추출을 수행하였다. 두 MTBE 레이어는 후속 사용을 위해 결합되었다. MTBE 용매를 40℃에서 밤새 증발시킨 다음, 1mL의 80% 메탄올을 "건조된" 바이알에 첨가하고, 볼텍싱하여 혼합한 다음, 2mL의 20mM PBS를 첨가하고 와류하였다. 생성된 용액을 메탄올로 미리 헹구고 20mM PBS로 컨디셔닝한 RIDA® C18 컬럼을 통과시켰다. 시료 분획물을 컬럼에 통과시킨 후 40% 메탄올 용액으로 컬럼을 세척한 후(층은 버려짐), 질소 기체 기류하에서 건조시키고, 80% 메탄올을 컬럼에 통과시키고 층을 수집하여 최종 시료를 채취하였다. 샘플은 진공 농축기를 사용하여 건조한 다음 분석 직전에 50μL의 완충액에 재현탁하였다. 키트는 0 내지 12.8μg/L의 교정 범위를 사용하여 제조업체 사양에 따라 사용하였다. 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트의 흡광도를 최종적으로 측정하고 도출된 검량선에 따라 샘플 값을 결정하였다. 분석 결과는 초기 샘플 준비 비율(1g 샘플 대 1mL 추출 완충액)을 사용하여 ng/kg으로 변환된 μg/L 단위이었다.
질량 분석법은 세포 기반 육류의 수준이 매우 낮거나 존재하지 않는 샘플에 대한 정량적 회복을 산출하기 위해 관심 호르몬 분석물에 대한 적절한 검출 한계(LOD)를 갖지 않았다. 예를 들어, 테스토스테론, 프로게스테론 및 17β-에스트라다이올 호르몬의 LOD 값은 각각 1, 1 및 20μg/kg이다. MS 크로마토그래프는 세포 기반 육류 샘플에서 이러한 호르몬에 해당하는 밴드를 보여주지 않았다. 표 15는 LC-MS/MS 결과의 요약을 보여준다. 모든 호르몬이 검출되지 않음(ND) 또는 검출 한계 미만으로 보고되었다.
17β-에스트라다이올에 대한 ELISA 결과는 세포 기반 닭고기 샘플이 통상적인 닭고기 및 쇠고기 샘플과 비교하여 더 낮은 농도를 산출함을 나타내었다. 17β-에스트라다이올 수준은 ELISA 키트를 사용한 세포 기반 육류의 경우 평균 35ng 에스트라다이올/kg 습식 질량인 반면, 지역 식료품점에서 구입한 통상적인 닭고기는 90ng/kg 에스트라다이올/kg 습식 질량이었다. 후속 연구에서 음성 대조군은 30ng/kg 에스트라다이올/kg 습식 질량 범위에 있었으며, 이는 세포 기반 육류 샘플도 두 분석 모두에서 검출 한계에 가깝거나 그 이하인 수준을 가짐을 나타낸다. 표 16은 ELISA 기반 방법을 사용하여 통상적인 및 세포 기반 닭고기를 분석한 17β-에스트라다이올 수준을 보여준다.
세포 기반 육류 샘플의 호르몬 수치
매개변수 농도(μg/kg)
테스토스테론 <1
에피테스토스테론 <10
클로스테볼 NR
메틸테스토스테론 <10
테스토스테론 프로피오네이트 NR
볼데논 <10
17α-볼데논 <10
다이아나볼 <10
17α-트렌볼론 <10
트렌볼론 <10
16-하이드록시스타노졸레 NR
스타노졸롤 NR
난드롤론 <10
트렌볼론-아세테이트 <10
17α-에티닐에스트라다이올 NR
17α-에스트라다이올 <20
17β-에스트라다이올 <20
다이에네스트롤 <10
다이에틸스틸베스트롤 <10
에스트리올 <10
에스트론 <5.0
헥세스트롤 <5
α-지랄라놀 <10
β-지랄라놀 <10
프로게스테론 <1.0
메드록시프로게스테론 NR
멜렝게스트롤 아세테이트 <10
클로르마디논 아세테이트 <10
17α-하이드록시프로게스테론 <10
코르티손 <10
하이드로코르티손 <10
플루드로코르티손 아세테이트 <10
17β-에스트라다이올 수준
샘플 ng/kg 17β-에스트라다이올
닭 89
갈루스(닭) 섬유아세포/근아세포 조직 4(표 1) 34
갈루스(닭) 근아세포 세포 2 (표 1) 36
실시예 7: 세포 배양 기반 육류 제품의 조리된 질감 분석
세포 기반 고기 샘플은 "조리된 교합력" 및 "조리된 경도"를 포함하여 질감에 대한 인간의 인식에 중요한 물리적 특성에 대해 평가되었다.
수분 함량을 65% 내지 85%로 조정하기 위해 강제 공기 탈수 공정을 거친 부착 배양에서 성장한 세포로부터 생성된 육류 제품에 대해 분석을 수행하였다. 탈수는 100℉ 미만의 온도에서 발생하여 육류 제품 내의 구성 요소를 "조리"하거나 다른 방식으로 변성시키지 않았다.
모든 샘플의 분석은 5kg 로드 셀이 장착된 TA.XTplus 텍스처 분석기를 사용하여 회사에서 수행하였다. 분석용 시료는 400mg +/- 40mg의 질량을 가지며 직경 10.4mm, 높이 17mm의 원통형 용기에 포장하였다. 조리된 샘플을 90분 동안 개별 밀봉 용기 내부의 수조에서 150℉로 유지하고 분석 전에 냉각하였다.
"조리된 교합력"은 테스트 설정하에서 스테인리스강 TA-45 앞니 프로브를 사용하여 측정하였다:
(a) 테스트 모드 압축
(b) 사전 테스트 속도 3.00mm/sec
(c) 테스트 속도 3.00mm/초
(d) 테스트 후 속도 10.00mm/sec
(e) 목표 모드 변형
(f) 힘 100.0g
(g) 거리 5.000mm
(h) 변형률 98.0%
(i) 트리거 유형 자동(강제)
(j) 트리거 포스 1.0g
(k) 트리거 거리 2.000mm
(l) 브레이크 모드 끄기
(m) 브레이크 감도 10.0g
(n) 브레이크 감지 정지
(o) 플롯 At중지 시작 위치
(p) 용기 모드 자동
(q) 온도 설정점 40.0℃
(r) 고급 옵션 끄기
"조리된 경도"는 테스트 설정하에서 스테인리스강 TA-24 원통형 프로브를 사용하여 측정하였다:
(a) 사전 테스트 속도 2.00mm/초
(b) 테스트 속도 1.00mm/초
(c) 테스트 후 속도 5.00mm/초
(d) 목표 모드 변형
(e) 강제 임계값 0
(f) 거리 10.000mm
(g) 변형률 40.0%
(h) 시간 5.00초
(i) 트리거 유형 자동(강제)
(j) 트리거 포스 1.0g
(k) 트리거 거리 2.000mm
(l) 브레이크 모드 끄기
(m) 브레이크 감도 10.0g
(n) 용기 모드 자동
(o) 온도 4.0℃
(p) 고급 옵션 켜기
(q) 제어 오븐 비활성화됨
(r) 온도 대기 예
(s) 온도 영역 ± 0.0℃
(t) 프레임 편향 보정 끄기(XT2 호환)
표 17은 세포 기반 육류 샘플의 조리된 질감을 보여준다. 도 13은 공동 배양 및 섬유아세포 단일 배양 조직의 조리된 경도를 보여준다.
조리된 질감
세포 기반 육류 샘플의 조리된 질감
조리된 경도 (g) 조리된 교합력 (g)
Min 284 449
Max 1903 2966
Mean 947 1343
Median 779 1198
N 33 66
실시예 8: 세포 기반 육류의 비타민 E 수준
세포 기반 육류는 α-토코페롤(비타민 E)이 더 많이 농축되어 있다. 표 18은 예시적인 세포 기반 육류 샘플에서 비타민 E의 양을 나타내며, 기존 육류와 비교하여 약 0.90mg의 비타민 E/100g의 세포 기반 육류 습윤 질량을 갖는다(표 18). 비타민 E는 외부 실험실인 서티파이드 랩(Certified Labs)을 사용하여 UPLC 방법 AOAC 2001.13에 따라 측정되었다.
비타민 E 수치
샘플 n 평균 값 Std Dev
세포 기반 육류 3 0.90 mg/100g 0.08mg/100g
통상적으로 구입된 닭 27 0.28 mg/100g 0.12 mg/100g
실시예 9: 저장 수명의 결정
방법론 I: 0.5-1.5g의 통상적인 육류 또는 세포 기반 육류를 깨끗한 새 15mL 팔콘 튜브에 분취하였다. 샘플은 모두 튜브에서 -80℃에서 동결하였다. 동결된 샘플 튜브를 -80℃에서 제거하고 0, 1, 2, 7, 14 및 28일 동안 실온에 두었다.
지정된 일수가 경과한 후, 샘플 튜브를 열고 버터필드 제제를 사용하여 연속 희석을 수행하였다. 일련의 희석액을 한천 플레이트(40g/L의 Miller LB Agar 분말) - 100uL의 용액에 플레이팅하고 에탄올/화염 멸균 스프레더로 퍼뜨렸다. 희석은 10-1, 예를 들어 9ml에 1g이었다. 각 샘플 희석액에 대해 2개의 플레이트를 준비하였다 - 모든 플레이트를 37℃에서 48시간 동안 배양하고 0, 24 및 48시간에 사진을 찍었다. 표 19는 결과를 보여준다.
실온에서의 저장 수명
0 days 1 day 2 day 7 day 14 day 28 days
세포 기반 육류 ND ND ND ND ND ND
오리 ND TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC
닭 ND TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC
TNTC = 너무 많아서 계수 못함
ND = 탐지되지 않음
방법론 II: 1.0g의 통상적인 또는 시험관내 세포 기반 육류를 깨끗한 새 15mL 팔콘 튜브에 분취하였다. 샘플을 4℃ 또는 25℃(실온)에서 3일 동안 보관하였다.
3일이 경과한 후, 샘플 튜브를 열고 버터필드 제형을 사용하여 연속 희석을 수행하였다. 총 미생물 수(TC) 또는 대장균/대장균군 계수(EC)를 위해 일련의 희석액을 한천 플레이트에 플레이팅하였다. 1ml의 용액을 위와 같이 컴팩트한 건조 플레이트에 첨가하였다. 희석은 10-1, 예를 들어 9ml에 1g이었다. 각 샘플 희석액에 대해 3개의 플레이트를 준비하였다 - 모든 플레이트를 37℃에서 48시간 동안 배양하고 0, 24 및 48시간에 사진을 찍었다. 표 20은 결과를 보여준다.
실온에서의 저장 수명, 3일, EC 및 TC 계수
방법 ID 샘플 ID 저장 온도 [C] EC 계수 (cfu/mL) TC 계수 (cfu/mL)
10 통상적인 닭 4 ND 2
10 세포 기반 육류
(채취)		 4 ND ND
10 세포 기반 육류
(제제화)		 4 ND ND
10 대조군(블랭크 튜브) 4 ND ND
10 통상적인 닭 25 5.80E+06 7.40E+07
10 세포 기반 육류
(채취)		 25 ND ND
10 세포 기반 육류
(제제화)		 25 ND 8.70E+06
10 대조군(블랭크 튜브) 25 ND ND
상기 제공된 방법을 사용하여 더 오랜 기간 동안 저장 수명을 평가하기 위해 추가 검정을 수행하였다. 지정된 일수가 4℃에서 경과한 후, 샘플 튜브를 열고 버터필드 제제를 사용하여 연속 희석을 수행하였다. 일련의 희석액을 한천 플레이트에 플레이팅하고 총 호기성 박테리아 계수를 평가하였다. 표 21은 결과를 보여준다.
4℃에서 저장 수명, 0-148일, 총 호기성 박테리아 계수(cfu/g)
DAY
0 2 3 14 30 148
통상적인 닭 0 16 17 73 6854 1492063
일반적인 세포 기반 닭 채취 0 0 0 0 442 0
무균 세포 기반 닭 채취 0 0 0 0 49 0
저장 수명을 평가하기 위해, 특히 4℃ 및 23℃에서 148일까지 대장균 및 대장균군 계수를 결정하기 위해 추가 검정을 수행하였다. 표 22-24는 결과를 보여준다. 표 22는 4℃, 148일에서 cfu/g로서 대장균 및 대장균군 계수를 보여준다. 표 23 및 24는 23℃, 0, 1, 2, 3, 7, 30, 148에서 대장균(표 23) 및 대장균군(표 24) 계수를 보여준다. TMTC는 너무 많은 콜로니를 지정하여 셀 수 없다.
4℃에서 저장 수명, 148일, 대장균 및 대장균군 계수
4℃
샘플 DAY 148
대장균 (cfu/g) 대장균군 (cfu/g)
통상적인 닭 0 990476
세포 기반 육류 채취 0 0
무균 세포 기반 육류 채취 0 0
세포 기반 육류 제제화 0 0
무균 세포 기반 육류 제제화 0 0
23℃에서 저장 수명, 0-148일, 대장균 계수
23℃, 대장균
DAY 0 DAY 1 DAY 2 DAY 3 DAY 7 DAY 30 DAY 148
통상적인 닭 3.23E+00 1.33E+06 4.07E+06 3.84E+07 9.75E+06 종료
세포 기반 육류 채취 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
무균 세포 기반 육류 채취 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
세포 기반 육류 제제화 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
무균 세포 기반 육류 제제화 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
23℃에서 저장 수명, 0-148일, 대장균군 계수
23℃, 대장균군
(cfu/g)
DAY 0 DAY 1 DAY 2 DAY 3 DAY 14 DAY 30 DAY 148
통상적인 닭 0.00E+00 0.00E+00 6.11E+06 5.77E+06 7.47E+05 종료
세포 기반 육류 채취 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
무균 세포 기반 육류 채취 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
세포 기반 육류 제제화 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
무균 세포 기반 육류 제제화 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
실시예 10: 세포 기반 가금 육류의 수분 측정
수분은 AOAC 950.46에 따라 분석하였다. 표 25에 나타난 결과는 혈청을 사용하여 생산된 3개의 비연속적인 세포 기반 가금류 육류 로트와 무혈청 세포 기반 가금류 육류의 3개의 비연속적인 로트를 포함한다. 세포 기반 가금류 고기 결과를 USDA의 Agricultural Research Service FoodData Central 데이터베이스와 비교할 때 기존 닭고기에 대해 두 가지 범주가 선택되었다: (1) 껍질이 있거나 없는 밝은색 육류, 껍질이 있거나 없는 검은색 육류, 갈은 날 것, 구이 또는 스튜용 기타 닭고기 샘플 범위에 이르기까지 27개의 서로 다른 공개 샘플의 데이터를 포함하나 껍질만 또는 닭 내장에 대한 데이터를 포함하지 않는 모든 USDA 닭(장기 없음); 및 (2) 밝은색 육류, 육류로만 지정된 4개의 게시된 샘플 데이터를 포함하는 USDA 닭 흰색 육류(껍질 없음)
표 25는 3중 혈청 함유 생산 로트, 3중 무혈청 생산 로트 및 USDA의 Agricultural Research Service FoodData Central 데이터베이스("모든 USDA 닭(장기 없음)" 및 "USDA 닭 흔색 육류(껍질 없음)")에 대한 평균(avg.) 및 표준 편차(std. dev.)로 보고된 수분 데이터를 보여준다.
수분 분석
매개변수 단위 혈청 함유 세포 기반 가금 육류 무혈청 세포 기반 가금 육류 모든 USDA 닭(장기 없음) USDA 닭 흰색 육류(껍질 없음)
Avg. Std.
Dev. 		Avg. Std.
Dev. 		Avg. Std.
Dev. 		N Avg. Std.
Dev. 		N
수분 100g당 g 80.68 0.45 75.10 2.67 71.00 5.20 27 74.08 0.68 4

Claims (34)

  1. 연장된 저장 수명을 나타내는 식이 소비용 도축되지 않은 육류 제품으로서, 저장 수명은 도축에 의해 수득된 통상적인 육류에 비해 연장되고, 저장 수명은 채취 후 적어도 3일 동안 연장되는 것인 도축되지 않은 육류 제품(slaughter-free meat product).
  2. 제 1 항에 있어서,
    연장된 저장 수명은 약 0℃ 내지 약 30℃에서 채취 후 적어도 3일 동안 유지되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    저장 수명은 채취 후 및 제제화 전에 결정되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    저장 수명은 제제화 후에 결정되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  5. 제 3 항에 있어서,
    저장 수명은 육류가 비-무균 조건하에서 채취될 때 연장되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    저장 수명은 총 미생물 계수(TC), 대장균/대장균군 계수(EC), 대장균 미생물 계수 또는 대장균군 계수를 측정함으로써 결정되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  7. 제 6 항에 있어서,
    도축에 의해 얻은 통상적인 육류의 TC 측정값은 도축되지 않은 육류 제품의 TC 측정값보다 적어도 1.5배 더 높은 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    g/습식 질량당 1 cfus 이하의 미생물 오염을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    도축되지 않은 육류 제품은 약 1ug 이하의 스테로이드 호르몬을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    도축되지 않은 육류 제품은 100g 건식 질량당 약 50g 내지 약 90g의 아미노산을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    도축되지 않은 육류 제품은 표시된 양(아미노산/100g 총 아미노산의 g으로 표현됨)으로 하기 아미노산 중 하나 이상을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품: 트립토판 약 1 내지 약 2.2, 트레오닌 약 4.6 및 6.5, 아이소류신 약 3.8 내지 약 5, 류신 약 6.1 내지 약 8.9, 라이신 약 5.7 내지 약 8.8, 메티오닌 약 0.14 내지 약 3.0, 시스테인 약 1.5 내지 약 1.8, 페닐알라닌 약 3.7 내지 약 4.8, 티로신 약 3.0 내지 약 5.2, 발린 약 4.8 내지 약 6.1, 아르기닌 약 7.0 내지 약 8.0, 히스티딘 약 2.5 내지 약 4, 알라닌 약 5.0 내지 약 6.3, 아스파르트산 약 8.6 약 10.4, 글루탐산 약 12.5 내지 약 14.6, 글리신 약 4.6 내지 약 9.8, 프롤린 약 4.6 내지 약 6.8, 세린 약 4.4 내지 약 5.3, 및/또는 하이드록시프롤린 약 0.0 내지 4.0.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    도축되지 않은 육류 제품은 약 65% 내지 약 95%의 수분 함량을 가지며, 여기서 수분 함량은 채취 후 그러나 제제화 전에 측정되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    도축되지 않은 육류 제품은 적어도 약 0.5mg 비타민 E/100g 습식 질량의 도축되지 않은 육류 제품을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    도축되지 않은 육류 제품은 표시된 양으로 하기 지방산 부류 중 하나 이상을 포함하며, 이는 총 지방산에 대해 해당 부류에 대한 %로 표시되는 것인 도축되지 않은 육류 제품:
    a. 약 10% 내지 약 60%의 포화 지방산 함량;
    b. 약 10% 내지 약 60%의 단일불포화 지방산 함량; 및
    c. 약 1% 내지 약 50%의 고도불포화 지방산 함량.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    도축되지 않은 육류 제품은 약 2:1 내지 18:1 오메가 6:3 지방산 부류의 비율을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    도축되지 않은 육류 제품은 도축되지 않은 닭, 오리 또는 소 육류를 포함하고, 통상적인 육류는 닭, 오리 또는 소 육류를 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    도축되지 않은 육류 제품은 실질적으로 혈관 구조가 없는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    통상적인 육류는 가공되지 않은 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  19. 도축에 의해 얻은 통상적인 육류와 비교하여 더 낮은 미생물 오염 계수를 나타내는 식이 소비용 도축 없는 육류 제품으로서, 여기서 더 낮은 미생물 오염 계수는 채취 후 적어도 3일 동안 나타나는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  20. 제 19 항에 있어서,
    더 낮은 미생물 오염 계수는 약 0℃ 내지 약 30℃에서 채취 후 적어도 3일 동안 유지되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,
    미생물 오염 계수는 채취 후, 및 제제화 전에 결정되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  22. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    도축되지 않은 육류 제품은 비-무균 조건하에서 유지되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  23. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 오염 계수는 총 미생물 계수(TC), 대장균/대장균군 계수(EC), 대장균 미생물 수 또는 대장균군 계수를 측정함으로써 결정되는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  24. 제 19 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    g/습식 질량당 1 cfu 이하의 미생물 오염을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  25. 제 19 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    도축에 의해 얻어진 통상적인 육류의 TC 측정값은 도축되지 않은 육류 제품의 TC 측정값보다 적어도 1.5배 더 높은 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  26. 제 19 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    도축되지 않은 육류 제품은 약 1ug 이하의 스테로이드 호르몬을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  27. 제 19 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    도축되지 않은 육류 제품은 표시된 양(아미노산/100g 총 아미노산의 g으로 표현됨)으로 하기 아미노산 중 하나 이상을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품: 트립토판 약 1 내지 약 2.2, 트레오닌 약 4.6 및 6.5, 아이소류신 약 3.8 내지 약 5, 류신 약 6.1 내지 약 8.9, 라이신 약 5.7 내지 약 8.8, 메티오닌 약 0.14 내지 약 3.0, 시스테인 약 1.5 내지 약 1.8, 페닐알라닌 약 3.7 내지 약 4.8, 티로신 약 3.0 내지 약 5.2, 발린 약 4.8 내지 약 6.1, 아르기닌 약 7.0 내지 약 8.0, 히스티딘 약 2.5 내지 약 4, 알라닌 약 5.0 내지 약 6.3, 아스파르트산 약 8.6 약 10.4, 글루탐산 약 12.5 내지 약 14.6, 글리신 약 4.6 내지 약 9.8, 프롤린 약 4.6 내지 약 6.8, 세린 약 4.4 내지 약 5.3, 및/또는 하이드록시프롤린 약 0.0 내지 4.0.
  28. 제 19 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    도축되지 않은 육류 제품은 총 지방산에 대해 해당 부류에 대한 %로 표현된 표시된 양으로 하기 지방산 부류 중 하나 이상을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품:
    a. 약 29% 내지 약 42%의 포화 지방산 함량;
    b. 약 19% 내지 약 54%의 단일불포화 지방산 함량; 및
    c. 약 5% 내지 약 36%의 고도불포화 지방산 함량.
  29. 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    도축되지 않은 육류 제품은 약 2:1 내지 18:1 오메가 6:3 지방산 부류의 비율을 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  30. 제 19 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    도축되지 않은 육류 제품은 도축되지 않은 닭, 오리 또는 소 육류를 포함하고, 통상적인 고기는 도축에 의해 얻은 닭, 오리 또는 소 육류를 포함하는 것인 도축되지 않은 육류 제품.
  31. 다음 단계를 포함하여 도축에 의해 얻은 미가공 통상적인 육류와 비교하여 저장 수명의 증가를 나타내는 도축되지 않은 육류 제품의 제조 방법:
    a. 비인간 유기체로부터 세포를 제공하는 단계;
    b. 현탁 배양 조건 또는 부착 배양 조건하에서 배지에서 세포를 배양하는 단계, 여기서 배지는 동물로부터 유래된 혈청 및 기타 성분이 실질적으로 없다; 및
    c. 세포를 분리하고 도축되지 않은 육류 제품을 생산하는 단계.
  32. 제 31 항에 있어서,
    세포는 근아세포, 섬유아세포, 지방세포, 내피 세포, 중배엽 계통의 세포, 및 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  33. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서,
    세포는 적어도 섬유아세포 및 근아세포를 포함하고, 섬유아세포 및 근아세포는 약 95F:5M 내지 약 5F:95M의 비율로 제공되는 것인 방법.
  34. 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    방법은 배지의 지방산 함량을 조정하는 단계를 포함하고, 여기서 생성된 도축되지 않은 육류 제품은 약 2:1 내지 약 18:1의 오메가 6:3 지방산 부류의 비율을 갖는 것인 방법.
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