CN117561323A - 用于生长基于细胞的肉的植物脂肪支架以及制造这种产品的方法 - Google Patents

Abstract

一种供消费的用于生长基于细胞的肉类产品的植物脂肪基支架。支架包括添加了细胞结合蛋白的主要植物脂肪或蜡和任选地附加成分，所述附加成分辅助培养的动物细胞生长。支架可以在灭菌过程中以液态存在，在支架形成、接种所述培养的细胞和细胞生长阶段以固态存在。支架能够保留在供消费的最终产品中，或部分或完全从最终产品中熔化出来，并回收成原材料用于形成新支架。

Description

用于生长基于细胞的肉的植物脂肪支架以及制造这种产品的 方法

技术领域

本发明属于供消费的基于细胞的产品领域，具体而言，涉及一种供消费的产品，所述产品由源自非人类动物的培养的贴壁和悬浮细胞的组合制备。本公开涉及新型消耗性产品和制备这种消耗性产品的方法。

背景技术

随着世界人口持续增长，对供人类食用的产品的需求比以往任何时候都大。也就是说，鉴于人口不断增长，传统产品市场正在努力满足需求。体外生产供消费的基于细胞的产品已成为补充传统产品需求的一个有吸引力的选择。此外，体外生产的产品有助于减轻与传统产品相关的若干缺陷。例如，传统肉类生产涉及与畜牧业和屠宰相关的有争议的行为。与传统肉类生产相关的其他缺陷包括热量输入转化为可食用的营养素的低转化率、产品的微生物污染、兽医和人畜共患疾病的出现和传播、相关自然资源要求以及由此产生的工业污染物，如温室气体排放和氮废物流。

实验室培育或培养肉属于新兴的细胞农业领域，代表了一种有前景的技术，可以提供迄今为止可以通过牲畜生产的产品。这项技术创新旨在减少传统肉类生产技术对人类、牲畜和环境的负面影响。培养肉的生产需要合适的细胞和合适的生长培养基。实验室培育肉也可以是一种极好的功能性食品，以满足患有各种疾病的患者的特定饮食需求。这是由于该技术能够改变必需氨基酸和脂肪的特性，并富含维生素、矿物质和生物活性化合物。然而，培育和加工培养肉存在各种技术问题。

对于具有多核的典型纹理相关肌纤维的生长，重要的是细胞结合，以实现信号传导、蛋白质排泄和融合。可以将支架引入细胞生长环境，以进一步实现粘附和细胞通信。例如，培养肉的生长细胞片层需要支撑结构，如支架，其能够被灭菌以防止培养肉的污染，能够允许细胞片层在生长过程中获得关键营养，并且能够在不损害肉和/或基质结构的情况下被移除。

然而，大多数常用于医疗目的的已知支架被设计为仅基于功能，并使用不可食用的成分。这些支架不能食用，必须在人类食用之前从基于细胞的肉类产品中完全去除，这可能既耗时又耗费资源。因此，本发明的目的是提供由可食用的基于植物的产品制备的消耗性支架和生产此类支架的方法，所述支架能够为基于细胞的肉类产品提供必要的结构和生长支持。

发明内容

本发明通常涉及供消费的用于基于细胞的肉类产品生长的支架。在一些实施方案中，所述支架主要由植物基脂肪制成，食用安全，能够形成固体结构，为基于细胞的肉的生长提供必要的支持。创建支架的示例方法包括但不限于使用如下所述的自含式生物反应器。创建支架的其他示例方法包括在灭菌环境中使用3D打印机或超净工作台。在一些实施方案中，所述支架可以呈现多种形状，这取决于将支架输送到自含式生物反应器的方法。例如，所述支架可以以液滴的形式喷雾干燥到生物反应器中，或者通过喷嘴直接注入生物反应器，形成意大利面条状的线。这些不同支架形状的组合也可以同时使用。

在所有实施方案中，天然植物脂肪和蜡在此用作支架成分。所述支架可能包括不同类型的植物脂肪和蜡的组合，每种都具有不同的熔点特性。由于这些材料是疏水性的，细胞不以纯的形式附着在这些材料上，因此将其他功能成分，如细胞结合蛋白、碳水化合物、纤维和/或矿物质添加到植物脂肪基支架中，以更好地帮助细胞附着于支架，提高支架上细胞的生长速率，或保持支架结构的稳定性，优选在高温和无菌条件下。这些成分可以在支架处于液态或固态时加入到支架中。

支架的所有成分在加入支架之前都可以使用已知的灭菌方法进行灭菌。灭菌的示例方法包括但不限于使用热、过滤或两者的组合。在一个实施方案中，所述植物脂肪基成分被熔化成液态，并在通过无菌过滤系统过滤之前通过加热灭菌。热灭菌可能涉及将植物脂肪基成分加热至灭菌温度35℃至100℃之间，并将升高的温度保持特定时间以确保灭菌。通常来讲，灭菌温度越高，所述成分需要在灭菌温度下保持的时间量越短。将热灭菌与无菌过滤结合用于液化植物脂肪基成分是一种更有效的方法，因为液体通常比固体成分更容易灭菌。此外，加热液化植物脂肪基成分会影响液化成分的粘度，使其更容易通过无菌过滤系统过滤。其他功能成分可能被添加到植物脂肪悬浮液中，并与植物脂肪基成分一起灭菌或单独灭菌。

在一些实施方案中，在所述成分灭菌后，含有所述成分的悬浮液在支架形成前冷却至掺入温度。所述掺入温度基于期望生长的细胞类型而不同。掺入温度为支架固化最佳、细胞粘附最佳或支架固化或细胞粘附的一些组合的温度范围。掺入温度基于期望生长的细胞类型而不同。通常，掺入温度在10℃至40℃之间。当使用具有较高最佳生长温度的细胞时，掺入温度可能也相应升高。在一些实施方案中，加热的悬浮液通过使用冷气体冷却从而将悬浮液固化为支架。在其他实施方案中，所述悬浮液分散在冷的无菌液体中，导致悬浮液固化为支架。所述悬浮液可以直接注入冷流体中，也可以喷洒到液体中，以产生大量具有大表面积的液滴，用于细胞粘附。在优选的实施方案中，将悬浮液冷却并在一定温度下形成支架，在该温度下接种的细胞可以结合到支架上并融合形成所需的组织。

细胞接种可以在掺入温度下进行。所述掺入温度可能低于最佳细胞生长温度，在低于该温度进行细胞接种可确保整个支架保持固体。可选地，细胞接种可以在比掺入温度更高的温度下进行，以确保支架保持部分或完全液态。基于期望生长的细胞类型，最佳细胞生长温度可以波动。例如，哺乳动物细胞通常生长在35℃至37℃的环境中，而鱼类细胞更喜欢15℃至20℃的寒冷环境。接种步骤完成后，细胞浸入营养丰富的环境中。然后逐渐升高温度，以达到接种的细胞的最佳生长温度。在不需要支架的整个结构为细胞提供稳定性的实施方案中，温度升高到一个点，其中在这个点，一部分支架熔化，这释放出有益于细胞生长的额外营养，并进一步使细胞暴露于营养丰富的环境。在可选的实施方案中，所述支架由一种或多种脂肪、一种或多种蜡或其组合构成，具有相对较高的熔点，其中将温度升高到最佳生长温度不会导致支架熔化。在一个实施例中，所述支架由两种或两种以上不同类型的脂肪或蜡构成，每种脂肪或蜡具有不同的熔化温度，以扩大支架部分熔化和支架完全熔化之间的温度范围。在一些例子中，细胞接种阶段可能在高于接种的细胞的最佳生长温度的温度，但低于细胞温度耐受范围的上限下进行，以确保在加入细胞结合蛋白之前，支架处于至少部分熔化状态。然后温度可以降低至接种的细胞的最佳生长温度。哺乳动物细胞对延长期的温度耐受范围一般在20-55℃之间，而冷血细胞(包括鱼类)对延长期的温度耐受范围一般在10-40℃之间。在一些例子中，哺乳动物细胞和冷血细胞可能在短时间(例如过夜)内保持在4℃，一旦恢复到最佳温度，对生长或存活率没有不利影响。

在一些实施方案中，在达到期望的生物量和组织形成/细胞融合程度后，全部支架或部分支架可以留在最终产品中，因为它是可食用的。在其他实施方案中，植物脂肪基支架的熔点低于温度耐受范围的上限，在温度耐受范围的上限时，由此支架可以在收获细胞组织之前部分或完全熔化，而不会损坏细胞组织。所述熔化的支架也可以通过传统已知的方法(例如在污水处理厂)回收，或者熔化的支架可以作为新的支架材料重新用于后续批次。

附图说明

图1示出了演示支架创建的示例流程图。

具体实施方式

本文提供了与制备用于生长基于细胞的肉的植物脂肪基支架相关的方法和产品。

在详细描述具体实施方案之前，应理解所述公开不限于本文描述的具体实施方式，可能有所不同。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定的说明性实施方案，除非另有说明不旨在进行限定。本说明书中所用术语通常在本公开的上下文和使用每个术语的具体上下文中具有其领域内的一般含义。本说明书下文或其他地方讨论了一些术语，以向从业者提供描述本发明的组合物和方法以及如何制造和使用它们的额外指南。任何术语的范围和含义在使用该术语的具体情况中显而易见。因此，本文给出的定义旨在为确定本发明的特定实施方案提供说明性指导，不限于特定组合物或生物系统。

如本公开和所附权利要求中所用，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数引用，除非内容另有明确规定。

除非提供了具体定义，否则本文所述与分子生物学、细胞生物学、分析化学和合成有机化学相关的名称以及实验室程序和技术在本领域中是众所周知和常用的。标准技术可用于重组技术、分子生物学、微生物学、化学合成和化学分析。

供消费的基于细胞的产品的生产

本公开所述供消费的基于细胞的产品是通过体外培养天然存在的、转基因或改性动物细胞生产的产品。

本公开所述方法中使用的细胞可以是原代细胞或细胞系。本文提供的方法适用于培养中的任何后生动物细胞。通常，所述细胞来自任何后生动物，所述后生动物的组织适合饮食消费，并显示出骨骼肌组织特化的能力。

在一些实施方案中，所述细胞源自任何旨在供人类或非人类饮食消费的非人类动物物种(例如，禽、绵羊、山羊、猪、牛或鱼来源的细胞)(例如，牲畜、家禽、鸟、狩猎动物或水生物种的细胞)。

在一些实施方案中，所述细胞来自牲畜，如家牛、猪、绵羊、山羊、骆驼、水牛、兔子等。在一些实施方案中，所述细胞来自家禽，如家鸡、火鸡、鸭子、鹅、鸽子等。在一些实施方案中，所述细胞来自狩猎动物，如野鹿、鸡、水禽、野兔等。在一些实施方案中，所述细胞来自野生渔业或水产养殖作业商业收获，或用于运动的的水生物种或半水生物种，包括某些鱼类、甲壳类动物、软体动物、头足类、鲸类、鳄鱼、海龟、青蛙等。

在一些实施方案中，所述细胞来自外来、保护或灭绝的动物物种。在一些实施方案中，所述细胞来自原鸡(Gallus gallus)、家鸡(Gallus domesticus)、家牛(Bos taurus)、家猪(Sous scrofa)、火鸡(Meleagris gallopavo)、绿头鸭(Anas platyrynchos)、大西洋鲑(Salmo salar)、蓝鳍金枪鱼(Thunnus thynnus)、绵羊(Ovis aries)、鹌鹑(Coturnix)、家山羊(Capra aegagrus hircus)或美洲螯龙虾(Homarus americanus)。

在一些实施方案中，所述细胞是原代干细胞、自我更新干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞或转分化多能干细胞。

在一些实施方案中，所述细胞可以通过基因开关进行修饰，以诱导细胞快速有效地转化为骨骼肌进行培养。

在一些实施方案中，所述细胞是肌源性细胞，旨在成为肌肉或肌肉样细胞。在一些实施方案中，所述肌源性细胞是天然肌源性的，例如成肌细胞。天然肌源性细胞包括但不限于成肌细胞、肌细胞、卫星细胞、侧群细胞、肌源性干细胞、间充质干细胞、肌源周细胞或成血管细胞。

在一些实施方案中，所述细胞属于骨骼肌谱系。骨骼肌谱系的细胞包括成肌细胞、肌细胞和骨骼肌祖细胞，也称为肌原祖细胞，包括卫星细胞、侧群细胞、肌源性干细胞、间充质干细胞、肌生成周细胞和成血管细胞。

在一些实施方案中，所述细胞是非肌源性的，并且这种非肌源细胞可以被编程为肌源性，例如，所述细胞可以包括经修饰以表达一种或多种肌源性转录因子的成纤维细胞。在示例性实施方案中，所述肌源性转录因子包括MYOD1、MYOG、MYF5、MYF6、PAX3、PAX7、旁系同源基因、直系同源基因和遗传变体。在一些实施方案中，所述细胞被修饰以表达的一个或多个肌源性转录因子(如PCT出版物WO/2015/066377中所述，所述出版物通过引用全部并入本文)。

在一些实施方案中，所述细胞包括本文所述细胞群的混合物，例如，成纤维细胞和成肌细胞混合物的共培养物。在一些实施方案中，用于体外生产供消费的基于细胞的产品的细胞是成纤维细胞和成肌细胞混合物的悬浮共培养物。在一些实施方案中，用于体外生产供消费的基于细胞的产品的细胞是成纤维细胞和成肌细胞混合物的贴壁共培养物。在一些实施方案中，所述共培养物还可以包括脂肪细胞。

在一些实施方案中，所述细胞是悬浮培养物或贴壁共培养物，包括成纤维细胞和成肌细胞的混合物，其中成纤维细胞与成肌细胞(命名为F和M)的比例范围从约5F:95M到约95F:5M。在示例性的实施方案中，所述成纤维细胞与成肌细胞的比例约为5F:95M、10F:90M、15F:85M、20F:80M、25F:75M、30F:70M、35F:65M、40F:60M、45F:55M、50F:50M、55F:45M、60F:40M、65F:35M、70F:30M、75F:25M、80F:20M、85F:15M、90F:10M或甚至约95F:5M。

在一些实施方案中，所述细胞被基因修饰以抑制如HIPPO信号通路的通路。抑制HIPPO信号通路的示例方法，如序列号PCT/US2018/031276的PCT申请所述，其通过引用全部并入本文。

在一些实施方案中，所述细胞被修饰以表达端粒酶逆转录酶(TERT)和/或抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKI)。在一些实施方案中，细胞被修饰以表达TERT和/或抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，如PCT出版物WO 2017/124100中所述，其通过引用全部并入本文。

在一些实施方案中，所述细胞被修饰以表达谷氨酰胺合成酶(GS)、胰岛素样生长因子(IGF)和/或白蛋白。序列号为PCT/US2018/042187的PCT申请描述了修饰细胞以表达GS、IGF和/或白蛋白的示例方法，该申请通过引用全部并入本文。

在一些实施方案中，所述细胞可能包括本文所述的修饰和细胞的任何组合。

培养基础设施

如本文所述，培养基础设施是指细胞被培养(cultured)或培养(cultivation)以提供二维或三维的供消费产品的环境。

培养基础设施可以是滚筒、管、圆筒、烧瓶、陪替氏培养皿、多孔板、培养皿、大桶、培养箱、生物反应器、工业发酵罐等。

虽然所述培养基础设施本身可能具有三维结构或形状，但培养基础设施中培养的细胞可能形成单层细胞。本公开的组合物和方法可促进培养基础设施中后生动物细胞的三维生长，以提供三维的细胞生物质的无支架自组装。

三维的培养基础设施可根据需要雕刻成不同的大小、形状和形式，为肌肉细胞提供形状和形态，以生长并模仿不同类型的肌肉组织，如牛排、里脊肉、小腿、鸡胸肉、鸡腿、羊排、鱼片、龙虾尾等。所述三维的培养基础结构可由无毒的天然或合成生物材料制成，因此如果摄入它们可能是无害的。天然生物材料可包括，如胶原蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白或其他细胞外基质。合成生物材料可包括例如羟基磷灰石、海藻酸盐、聚乙醇酸、聚乳酸或其共聚物。三维的培养基础设施可以形成固体或半固体支撑物。

培养基础设施可以是任何规模的，并支持任何体积的细胞生物质和培养试剂。在一些实施方案中，所述培养基础设施范围约为10μL至约100000L。在一些示例实施方案中，所述培养基础设施范围约为10μL、约100μL，约1mL、约10mL、约100mL、约1L、约10L、约100L、约1000L、约10000L，甚至约100000L。

在一些实施方案中，所述培养基础设施包括支架。培养基础设施可包括可渗透支架(例如，可渗透生理溶液)或不可渗透支架(例如，不可渗透生理溶液)。所述支架可以是平的、凹的或凸的。所述支架可能具有纹理，以促进细胞生长和细胞片层附着。使用这种支架的优点包括通过不需要使用额外细胞培养物形成自体支架来降低生产成本，能够控制支架形状和大小，能够形成仅使用可由细胞产生的组分(例如ECM)在物理上不可能形成的形状和结构，能够快速形成必要的结构(因为这种结构的细胞生产可能非常缓慢)，并且能够将额外的组分(例如有益于细胞生长的营养物)掺入支架本身以促进细胞生长期。

在一些实施方案中，所述培养基础设施中细胞的培养可诱导细胞外基质(ECM)的产生，其可作为自体支架指导三维细胞生长，例如，指导细胞在底物平面上附着、增殖和肥大。

在一些实施方案中，所述培养基础设施可能不包括外源性添加的支架，以促进三维的细胞生物质自组装。在一些实施方案中，所述培养基础设施可能不包括外源性支架，如本文所述的植物脂肪基支架、水凝胶或软琼脂。

培养条件

生产供消费的细胞产品的培养条件通常是消毒的和无菌的。

细胞可以以贴壁培养物形式生长以形成细胞片层，或者可以以悬浮培养物形式生长以形成细胞颗粒。表1提供了可在体外生产的各种产品的示例培养方法。

表1:用于体外生产基于细胞的肉的细胞培养方法

在一些实施方案中，所述培养基基本上没有血清或其他来源于动物的成分。

同样，生产体外生产的基于细胞的肉的示例方法包括：(a)提供来自非人类生物体的成纤维细胞和/或成肌细胞；(b)在培养基中以一定条件培养成纤维细胞和/或成肌细胞，在所述条件下成纤维细胞和/或成肌细胞在悬浮培养物或贴壁培养物中生长，其中所述培养基基本上不含血清和其他来源于动物的成分。

在一些实施方案中，所述细胞生长在悬浮培养物中，例如在摇动烧瓶中，培养物的产品被离心，产生细胞颗粒。在一些实施方案中，细胞生长在贴壁培养物中，培养物的产品是细胞片层。

配方

本公开的供消费的基于细胞的产品可被加工成任何种类的产品，包括但不限于基于细胞的肉类产品、补充剂和维生素。本公开的示例产品包括基于细胞的肉类产品，例如禽肉产品、鸡肉产品、鸭肉产品和牛肉产品。其他示例产品可能包括使用外来、保护或灭绝动物物种的细胞培养的基于细胞的肉类产品，例如但不限于原鸡、家鸡、家牛(Bos taurus)、家猪、火鸡、绿头鸭、大西洋鲑、蓝鳍金枪鱼、绵羊、鹌鹑、家山羊或美洲螯龙虾。

供消费的基于细胞的产品的特性

本文提供了供消费的体外生产的基于细胞的产品，包括许多独特的特性，使其与传统产品(可能涉及杀死或消灭活动物)区别开来。体外方法也可以被定制以实现期望的特性，例如健康和感官益处。

激素

与传统产品相比，本公开体外生产的基于细胞的产品包括显著减少的类固醇激素。例如，使用所述体外培养方法，不需要向培养物中添加任何外源激素，从而导致基于细胞的肉类产品中激素水平较低或不存在。同样，在一些实施方案中，基于细胞的产品基本上不含类固醇激素(即，含有少量或不含类固醇激素)。这与为传统肉类生产而饲养的动物相反，后者通常被喂食或施用外源性抗生素。

同样，在一些实施方案中，本公开基于细胞的产品包括不超过约1μg、0.5μg、0.1μg、0.05μg、0.01μg、0.005μg，或甚至约0.001μg类固醇激素/kg基于细胞的产品的干重。在一些实施方案中，所述基于细胞的产品包括不超过约1μg、0.5μg、0.1μg、0.05μg、0.01μg、0.005μg或甚至约0.001μg孕酮/kg基于细胞的产品的干重。在一些实施方案中，所述基于细胞的产品包括不超过约1μg、0.5μg、0.1μg、0.05μg、0.01μg、0.005μg或甚至约0.001μg睾酮/kg基于细胞的产品的干重。在一些实施方案中，基于细胞的产品包括不超过约0.05μg、0.01μg、0.005μg或甚至约0.001μg雌二醇/kg基于细胞的产品的干重。在示例实施方案中，所述基于细胞的产品包括不超过约35ng雌二醇/kg基于细胞的产品的干重。

微生物污染

使用所述无菌、基于实验室的体外培养方法，所述基于细胞的产品基本上不含微生物污染物。“基本上不含”意味着微生物或寄生虫的浓度低于临床上显著污染水平，即低于摄入会导致疾病或不利健康状况的水平。如此低的污染水平允许延长货架期。这与为传统肉类生产而饲养的动物相反。如本文所述，微生物污染包括但不限于细菌、真菌、病毒、朊病毒、原生动物及其组合。有害微生物可能包括大肠菌群(粪便细菌)、大肠杆菌、酵母、霉菌、弯曲杆菌、沙门氏菌、李斯特菌和葡萄球菌。

此外，培养物中生长的细胞可能基本上不含寄生虫，如感染整个动物细胞并通过食用未充分煮熟的肉而转移至人类的绦虫。

抗生素

就传统产品而言，本公开体外生产的基于细胞的产品包括显著较少的抗生素或基本上不含抗生素或完全不含抗生素。例如，使用所述的体外培养方法，可以控制或消除培养物中抗生素的使用，从而导致生成的基于细胞的产品中抗生素水平较低或不存在。当然，在一些实施方案中，所述基于细胞的产品基本上不含抗生素(即，含有很少或不含抗生素)。这与为传统肉类生产而饲养的动物相反，后者通常被喂食或施用外源性抗生素。

同样，在一些实施方案中，本公开基于细胞的产品包括不超过100μg抗生素/kg基于细胞的产品的干重、90μg抗生素/kg基于细胞的产品的干重、80μg抗生素/kg基于细胞的产品的干重、70μg抗生素/kg基于细胞的产品的干重、60μg抗生素/kg基于细胞的产品的干重、50μg抗生素/kg基于细胞的产品的干重、40μg抗生素/kg基于细胞的产品的干重、30μg抗生素/kg基于细胞的产品的干重、20μg抗生素/kg基于细胞的产品的干重、10μg抗生素/kg基于细胞的产品的干重、5μg抗生素/kg基于细胞的产品的干重、1μg抗生素/kg基于细胞的产品的干重、0.5μg抗生素/kg基于细胞的产品的干重、0.1μg抗生素/kg基于细胞的产品的干重、0.05μg抗生素/kg基于细胞的产品的干重、或甚至约0.01μg抗生素/kg基于细胞的产品的干重。

脂质

与传统产品相比，本公开体外生产的基于细胞的产品包括较低的平均总脂质(脂肪，fat)含量。例如，基于细胞的肉类通常具有约0.5％至约5.0％之间的平均总脂肪含量，其中传统肉中的脂肪酸含量变化很大，取决于肉的切割，其范围约为3％至约18％。

同样，在一些实施方案中，当以基于细胞的产品的总湿重的百分比测量时，本公开基于细胞的产品包括平均总脂肪含量为约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％、约2.1％、约2.2％、约2.3％、约2.4％、约2.5％、约2.6％、约2.7％、约2.8％、约2.9％、约3.0％、约3.1％、约3.2％、约3.3％、约3.4％、约3.5％、约3.6％、约3.7％、约3.8％、约3.9％、约4.0％、约4.1％、约4.2％、约4.3％、约4.4％、约4.5％、约4.6％、约4.7％、约4.8％、约4.9％或约5.0％。与传统产品相比，低脂肪含量提供了较低的卡路里含量以及其他相关健康益处。

本文提供的方法可以改变特定的脂肪酸谱，以实现期待的风味特征或脂肪酸谱。本公开所述基于细胞的产品中脂肪酸水平较低也促进了货架期的增加，例如通过导致产品中脂肪氧化水平较低。

氨基酸

本公开所述基于细胞的肉类产品通常包括每100g干重约50g至约95g重量的氨基酸。

维生素E含量

与传统产品相比，本公开体外生产的基于细胞的产品含有较高的维生素E(α生育酚)含量。在一些实施方案中，本公开所述基于细胞的产品包括至少约0.5mg、至少约0.6mg、至少约0.7mg、至少约0.8mg、至少约0.9mg或至少约1.0mg/维生素E/100g基于细胞的产品湿重。

水分含量

本公开所述基于细胞的产品通常含水量为约65％至约95％。

基于细胞的肉的结构

举例来说，基于细胞的肉，除非另有操作以包括，否则不包括血管组织，如静脉和动脉，其中常规肉含有此类血管，并含有血管中发现的血液。同样，在一些实施方案中，所述基于细胞的肉不包括任何脉管系统。

同样，基于细胞的肉，尽管由肌肉或肌肉样组织组成，除非另有操作以包括，否则不包括功能性肌肉组织。同样，在一些实施方案中，所述基于细胞的肉不包括功能性肌肉组织。

值得注意的是，如果需要，脉管系统和功能性肌肉组织等特征可以进一步被工程化到基于细胞的肉中。

补充剂

在一些实施方案中，可添加其他营养素，如维生素，以增加基于细胞的产品的营养价值。例如，这可以通过向生长培养基中添加外源性营养或通过基因工程技术来实现。

货架期

每年有大量肉类和肉类产品变质。据估计，消费者、零售商和餐饮服务水平，约有35亿公斤的禽和肉类被浪费，对经济和环境产生了重大影响(Kantor等人，1997年)。这种损失的很大一部分是由于微生物造成的腐败。

传统肉类是易腐的，具有相对较短的货架期稳定性(此处可互换地简称为“货架期”)。货架期是指食物保持适合人类食用的时间。传统肉类的组成以及用于屠宰和收获肉类的条件为包括粪便细菌(如大肠菌群)在内的各种微生物创造了有利的生长条件。由于化学、氧化和酶活性，肉类也极易变质。一般认为，微生物生长、氧化和酶自溶是导致肉变质的三种机制。肉类脂肪、蛋白质和碳水化合物的分解导致臭味和异味的发展，这些臭味和异味使肉类不适合人类食用。根据收获的物种和方法，传统肉类产品在相对较短的储存时间后食用不安全。例如，鸡肉应在购买后几天内烹饪。煮熟的禽可以安全地存放在冰箱里4天，冷冻室里最多4个月。因此，控制肉类变质以增加其货架期并保持其营养价值、质地和风味是必要的。

体外生产基于细胞的肉通过其生产和组成方法，生产出与传统肉制品相比具有延长货架期的肉类产品，并且不需要添加防腐剂以获得货架期稳定性。基于细胞的肉的组成使得检测到较少的臭味和异味。此外，用于体外生产基于细胞的肉的制造方法需要清洁和无菌条件。这些条件确保收获的产品和后续食品加工中的微生物细胞数量较低。这些多个因素有助于延长体外基于细胞的肉的货架期稳定性。

本公开基于细胞的肉与传统肉类相比，货架期(由变质导致的)延长。在室温(约25℃)和低温(如约4℃)下均如此。货架期的增加与污染的减少、基于细胞的肉的组成、基于细胞肉的降解以及基于细胞肉颜色、变质、气味和口味的变化率的降低有关。

支架的形成

如上所述，支架包括约90％或更大重量的植物基脂肪和蜡。示例性脂肪和蜡包括棕榈仁油、椰子油、可可油和棕榈油。当然，也可以使用其他(饱和和/或不饱和)脂肪(脂肪酸)/蜡。可应用乳化来自植物的油和脂肪混合物的已知技术，如分馏、酯交换和/或氢化以实现期望的性能。在一些实施方案中，植物基脂肪和蜡约占支架重量的98％或更大。

除了植物基脂肪和蜡外，支架的剩余约10％或更少还包括其他功能成分，以帮助接种的细胞与支架结合并保持支架的结构完整性。这些功能成分应具有与细胞表面/细胞膜上天然存在的对应物相似的功能。实例性成分包括结合/信号蛋白，如选择素、钙粘蛋白、整合素、紧密连接蛋白和连接蛋白；碳水化合物，如糖、淀粉和果胶；纤维，如纤维素纤维、真菌菌丝体和藻类；维生素和矿物质以促进细胞生长；以及气体，如空气、氮气和氧气。在一些实施方案中，额外的功能性成分占支架重量的约2％或更低。在一些实施方案中，支架中的功能成分有限，因此暴露于生长培养基和暴露于熔融支架的组合不会对生长中的细胞产生过度或不可接受的渗透应力。

为了防止生长阶段污染基于细胞的肉，应在细胞生长阶段之前通过加热支架容易地对支架进行灭菌。因此，植物基脂肪(主要饱和脂肪酸)和/或蜡被加热到高于熔点和低于烟点的灭菌温度。其他物质可单独灭菌和/或添加到悬浮液中。热灭菌过程所需的时间和灭菌温度应根据潜在有害微生物和孢子(D-和Z-值)选择，也可根据其他成分的稳定性(如酶和孢子的变性温度)进行调整。生物的D值是在给定的培养基中，给定的温度下，生物数量减少10倍所需的时间，而Z值是实现D值减少10倍(即1log₁₀)温度必须增加的度数。如果产品的无菌过滤是加热灭菌的补充或替代，所有使用的物质应该是可溶/可熔的。

所有成分灭菌完成后，可在支架形成前将支架冷却至掺入温度。其他无菌成分，包括气体，可在冷却之前或之后注入混合物中，以保持其化学物理性质(如蛋白质和/或晶体结构的功能)。支架本身的形成是由分散和冷却引起的。在一些实施方案中，冷气被用于固化混合物。在一些实施方案中，无菌粉末和矿物可用作种子和/或涂料(例如喷雾干燥反应器)。也可以通过交替不同的悬浮液和成分的变化，在这些单元中创建具有不同特性的多个支架层。

尽管使用气体分散和冷却来形成支架可以创建功能性和特定设计的支架，但该方法复杂且成本高昂。因此，在其他实施方案中，所述支架可以通过将其分散在冷的、无菌的液体如水或培养基(含或不含细胞)中而固化，以更好地适用于基于细胞的肉的大规模生产。

在一些实施方案中，熔化的液体支架可以注入冷液体中，形成细线支架材料。在其他实施方案中，所述支架被喷洒在冷液体上，产生大量具有大表面积的小液滴，用于细胞粘附。由于这些无菌功能性支架非常有价值，如果需要，可以在不同的时间生产和使用，或可以在不同的设施中生产和使用。

在某些实施方案中，所述植物脂肪基功能性支架在一定温度下加工，所述支架通过冷却先前热灭菌的成分以使其至少部分固化而形成，其中所述温度下，细胞可与所含蛋白质结合、融合并形成组织。因此，接种可以在比细胞最佳生长温度更冷的环境中进行，以确保支架的结构。可选地，，可以在细胞的最佳生长温度或更高温度(支架至少部分熔化时)进行接种。为了确保接种的细胞能够粘附在支架上，在接种阶段将细胞结合蛋白也添加到支架。在用所期待的细胞群接种支架后，将所述接种的支架浸入富含营养的肉汤中，以刺激细胞生长。

由于支架的熔点低于接种细胞的温度耐受范围上限，因此在细胞生长阶段，温度可以升高到支架部分熔化而不损害细胞的点，这使接种的细胞更容易暴露于营养丰富的环境，所述接种的支架浸没在所述营养丰富的环境。这为培养的细胞的生长提供了更多的空间，也使培养细胞暴露于更多的营养，以帮助细胞生长。在一些实施方案中，所述支架本身含有额外的维生素和矿物质，所述维生素和矿物质刺激细胞生长。这些额外的维生素和矿物质可能会随着支架熔化而释放。在一个示例中，所述支架熔化释放了储存在支架中的营养，使细胞与培养基流和其中的营养更多的接触，为细胞生长提供了增加的空间，或它们的一些组合。在其他实施方案中，在接种细胞的最佳生长温度范围内选择低于支架熔点的恒温，使得支架在细胞生长期不熔化。

在达到期望的生物量和组织形成/细胞融合程度后，在一些实施方案中，所述支架全部留在最终产品中，因为它是食用安全的。在其他实施方案中，在收获细胞组织之前，所述支架可能部分或完全从最终产品中熔化。

如果所述支架熔化，所述熔化的支架材料可以使用任何已知的常规方法回收，例如通过废水处理厂。或者，由于熔化的支架材料由于其密度低而易于分离，在某些实施方案中，所述熔化的支架可以被分离并作为新的支架材料重新使用。

在一些实施方案中，所述支架是在自封闭生物反应器中创建的，包括用于与反应室流体连通的储罐的灭菌系统，以及一个或多个能够输送一个或更多灭菌植物基脂肪、细胞结合蛋白、培养基和培养细胞的喷嘴。

实施例

实施例1：用于哺乳动物肉生长的乳化椰子油支架

在一个非限制性实施例中，将含有90％或更多乳化椰子和10％或更少选择素、纤维素纤维和果胶的混合物加热至65℃以上的温度30分钟，以对混合物进行灭菌。可以使用更高的灭菌温度来缩短灭菌时间。然后，使混合物冷却至掺入温度，通过将混合物喷洒到含有15℃营养培养基的生物反应器，以形成大量液滴支架。其他功能成分，包括细胞结合蛋白、糖、维生素和矿物质，通过输送管线或喷嘴添加到生物反应器中。体外制备的哺乳动物肉细胞接种于支架直至达到期望的群落。然后温度升高到哺乳动物细胞的最佳细胞生长温度30℃到40℃之间，接种的细胞进行生长。在一些实施方案中，所述温度暂时升高至41-43℃，直到支架材料从细胞组织中熔化期望的部分，将额外的糖、维生素和矿物质从支架释放到培养基中，以帮助细胞生长，然后降至最佳生长温度。然后从生物反应器中提取细胞组织，同时熔化的支架从最终产物中熔化出来，并使用已知密度过滤方法从水溶液中分离。可选地，所述支架从细胞组织中移除而无需熔化。在另一种替换方案中，所述支架是可食用的，并且仍然是细胞组织的一部分。

Claims (15)

1.一种供人类消费的用于生长基于细胞的动物组织的植物脂肪基支架，所述支架包括：

a、至少一种植物基饱和脂肪酸或蜡，具有掺入温度和灭菌温度；和

b、细胞结合蛋白，使动物组织细胞粘附在支架上生长；

其中，在所述至少一种植物基饱和脂肪酸或蜡的灭菌温度下，支架以液态存在；并且细胞粘附和生长期间，在掺入温度下支架以固态存在。

2.根据权利要求1所述的植物脂肪基支架，其中所述支架是可食用的。

3.根据权利要求1所述的植物脂肪基支架，还包括一种或多种辅助成分，所述辅助成分选自促进细胞生长的营养素和矿物质、防腐剂、着色剂、风味增强剂、细胞结合辅助分子和结构支持成分。

4.一种用于形成供人类消费的被设计为用于基于细胞的动物组织的植物脂肪基支架的方法，所述方法包括：

a、选择至少一种植物基饱和脂肪酸或蜡形成支架；

b、通过将所述支架加热至高于所述至少一种植物基饱和脂肪酸或蜡的熔点或烟点，对至少部分支架进行灭菌；

c、将所述支架掺入低温液体或气体中以形成固体支架；

d、将动物细胞群接种于固体支架以进行生长；和

e、在细胞生长完成或动物组织形成后，将所述支架的至少50％与动物细胞分离。

5.根据权利要求3所述的方法，其中可以通过将支架熔化回液相并从组织产品中去除液体支架，将支架的大部分与动物细胞分离，而不损害细胞组织。

6.根据权利要求4所述的方法，其中在将所述支架与动物细胞分离后，支架可被回收作为原材料形成另一支架。

7.一种使用植物基脂肪支架生长来自动物细胞群的动物组织产品的方法，所述方法包括：

a、将动物细胞群接种于植物脂肪基支架；

b、向动物细胞提供一种或多种生长营养素；

c、评估细胞的生长，以确定它们何时达到期望的大小或形状；和

d、生长完成后将所述支架与所述动物细胞分离。

8.根据权利要求6所述的方法，其中向动物细胞提供一种或多种生长营养素以加速生长。

9.根据权利要求7所述的方法，其中一种或多种生长营养素被掺入所述支架。

10.根据权利要求8所述的方法，其中包括一种或多种生长营养素的支架可以通过在生长阶段将温度升高到高于细胞的最佳生长温度，但低于细胞温度耐受范围的上限而部分熔化，以释放一种或多种生长营养素。

11.一种用植物脂肪基支架生长基于细胞的动物组织产品的方法，所述方法包括：

a、引入至少一种植物基脂肪或蜡，其中提供用于细胞生长的支架；

b、当所述支架部分固体和部分液体时，将动物细胞群接种于所述支架；以及

c、在接种动物细胞后，将所述支架冷却为固体形式。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述支架包括两种或两种以上不同类型的脂肪或蜡，每种都有不同的熔化温度。

13.根据权利要求11所述的方法，其中当至少一种脂肪或蜡处于液态且至少一种脂肪或蜡处于固态时，对所述支架进行接种。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述支架在动物细胞的最佳生长温度下形成固体。

15.根据权利要求10所述的方法，包括在支架部分固态和部分液态时引入一种或多种细胞结合蛋白的步骤。