CN115397972A - 体外禽类食品 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了由禽类成纤维细胞在体外制作的食品及用于收获所述禽类成纤维细胞的方法。特别是，生产体外生成的鸡肉产品。本发明还提供了它们的生成方法。

Description

体外禽类食品
发明领域
本发明涉及衍生自体外生成的禽类细胞的食品以及在低血清或无血清条件下培养禽类细胞的方法。
发明背景
几千年来，鸡肉一直是人类饮食的一部分。现代家鸡(Gallus domesticus)是原产于东南亚的红原鸡(Gallus gallus)后裔，尽管一些相关物种亦可能在家鸡的进化过程中进行了杂交(Lawler et al.)。据信，其最早在公元前2000年左右在印度驯化(美国农业部情况说明书(USDA Fact Sheet))。目前，据信世界上约有20亿只鸡，它们有望取代猪成为人类饮食中最常见的动物蛋白来源(Gorman et al.)。因为其具有高蛋白质含量和低脂肪含量，鸡肉是一种非常受欢迎的食品成分。
鸡肉是我们这个时代无处不在的食物，轻松跨越多种文化界限。鸡肉以其温和的味道和均匀的质地，为几乎所有菜肴的风味调色板提供了有趣的空白画布。
鸡肉通常被推荐为比红肉更健康的替代品。与红肉或加工肉类相比，食用鸡肉患结直肠癌的风险更低(English et al.)，食用白肉(鸡肉、火鸡和鱼)可降低全因死亡率、癌症风险、及心血管疾病风险(Sinha et al.)。此外，鸡肉的饱和脂肪和胆固醇含量低于红肉(国际癌症研究机构)，而饱和脂肪和胆固醇正是心血管疾病的危险因素。
此外，当鸡肉消费出现安全问题时，其通常包括与畜牧业、屠宰或加工实践中的缺陷相关的微生物污染，以及未完全杀死鸡肉上可能存在的所有微生物的未充分烹饪。在屠宰和加工过程中，肉类被粪便污染屡见不鲜。在2012年对美国各地鸡肉产品的抽样调查中，负责医学的医师委员会发现48％的样本含有粪便，而美国农业部2009年的一项研究发现，87％的鸡胴体检测出泛型大肠杆菌呈阳性，这是粪便污染的迹象，就在包装之前。虽然彻底烹饪可杀死污染微生物，但如果烹饪不彻底，一些微生物可能会存活下来导致食源性疾病。
而培养肉制品具有以下潜力：(1)大幅减少对屠宰动物的食用依赖，(2)减轻饲养动物用于食品供应的环境负担，以及(3)提供安全且质量稳定的可靠蛋白质来源。
发明摘要
本发明提供了体外培养禽类成纤维细胞的方法。本发明还提供了用于禽类食品的组合物。本发明还阐述了制备和使用产品的方法。
在一些实施方案，本发明提供了制作包含体外培养的禽类成纤维细胞的食品的方法，所述方法包含在能够维持禽类成纤维细胞的生长培养基中体外培养所述禽类成纤维细胞群体，回收所述禽类成纤维细胞，和将所述回收的禽类成纤维细胞配制成可食用食品。在一些实施方案，所述禽类成纤维细胞包含原代禽类成纤维细胞。在一些实施方案，所述禽类成纤维细胞包含继代(secondary)禽类成纤维细胞。
在一些实施方案，本发明提供了制备由体外生长的禽类成纤维细胞制成的食品的方法，所述方法包含以下步骤：用磷酸盐调节水以制备调理水，用所述调理水使植物蛋白分离物或植物蛋白浓缩物水合以生成水合植物蛋白，使所述细胞膏(cell paste)与所述水合植物蛋白接触以生成细胞和豆类蛋白质混合物，分步加热所述细胞和植物蛋白质混合物，其中所述步骤包含下列至少之一：
将所述细胞和蛋白质混合物的所述温度斜升至40-65℃之间的温度，将所述细胞和蛋白质混合物的所述温度保持在40-65℃之间的温度1至30分钟，将所述细胞和蛋白质混合物的所述温度斜升至60-85℃之间的温度，将所述细胞和蛋白质混合物冷却至-1-25℃之间的温度，和将所述细胞和蛋白质混合物与脂肪混合以制成预烹饪产品。无需进一步烹饪即可食用所述预烹饪产品。或者，将所述预烹饪产品烹饪以生成所述可食用食品。任选地，所述预烹饪产品可在室温、冷藏温度或冷冻下储存。
在一些实施方案，本发明提供了由禽类成纤维细胞制成的食品，其包含细胞膏，所述细胞膏含量为至少5重量％，和其中所述细胞膏由体外生长的禽类成纤维细胞制成；植物蛋白分离物或植物蛋白浓缩物，所述植物蛋白含量为至少5重量％；脂肪，所述脂肪含量为至少5重量％；和水，所述水含量为至少5重量％。
在一些实施方案，所述食品组合物或食品包含约1重量％-100重量％的湿细胞膏。
在一些实施方案，所述植物蛋白分离物或植物蛋白浓缩物得自选自由以下组成的组的豆类：干豆、扁豆、绿豆、蚕豆、干豌豆、鹰嘴豆、豇豆、班巴拉豆(bambara beans)、木豆、羽扇豆、野豌豆、红小豆、云扁豆(common beans)、胡芦巴、长豆、利马豆、红花菜豆、或宽叶菜豆、大豆或黎豆。在多个实施方案中，本发明提供的豆类蛋白分离物或植物蛋白浓缩物衍生自赤豆(Vigna angularis)、蚕豆(Vicia faba)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、小扁豆(Lens culinaris)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、豇豆(Vigna unguiculata)、刚果落花生(Vigna subterranea)、木豆(Cajanus cajan)、羽扇豆属(Lupinus sp.)、野豌豆属(Vetchsp.)、胡芦巴(Trigonella foenum-graecum)、棉豆(Phaseolus lunatus)、荷包豆(Phaseolus coccineus)或尖叶菜豆(Phaseolus acutifolius)。在一些实施方案，所述豆类蛋白分离物衍生自绿豆。在一些实施方案，所述绿豆是绿豆(Vigna radiata)。
在一些实施方案，动物蛋白分离物和动物蛋白浓缩物得自动物或动物产品。动物蛋白分离物或动物蛋白浓缩物的实例包括乳清、酪蛋白和蛋蛋白。
在一些实施方案，植物蛋白分离物得自小麦、水稻、画眉草、燕麦、玉米、大麦、高粱、黑麦、小米、黑小麦、苋菜、荞麦、藜麦、杏仁、腰果、山核桃、花生、核桃、澳洲坚果、榛子、开心果、巴西木(brazil)、栗子、可乐果、葵花籽、南瓜子、亚麻籽、可可、松子、银杏、及其他坚果类。
附图简要说明
图1描绘了用于培养禽类成纤维细胞的流程图。
图2描绘了收获培养的禽类成纤维细胞的流程图。
图3描绘了用于制作培养鸡肉产品(JUST7、JUST8、JUST9)的鸡细胞库的三个生物学重复(JUST1、JUST2、JUST3)的转录组分析的层次聚类。
图4A描绘了鸡成纤维细胞在低血清培养基中的适应性，表明细胞活力随培养时间的变化。图4B描绘了鸡成纤维细胞在低血清培养基中的适应性，表明群体倍增时间随传代数的变化。
图5A描绘了鸡成纤维细胞在补充有脂肪酸和生长因子的基础培养基中随培养时间变化的适应性。图5B描绘了鸡成纤维细胞在不含生长因子的基础培养基中随培养时间变化的适应性。图5C描绘了鸡成纤维细胞在补充有生长因子的无血清基础培养基中随培养时间变化的适应性。生长因子包含胰岛素样生长因子、表皮样生长因子和成纤维细胞样生长因子。
图6A描绘了在本发明定义的ITSEEF存在下，C1F鸡细胞在FBS浓度降低的培养基中，随培养时间变化的适应性。图6B描绘了鸡成纤维细胞对无血清培养基的适应性，表明群体倍增时间随传代数的变化。图6C描绘了图6A和6B中所示培养物随时间变化的细胞活力。
发明详述
提供以下描述以使本领域普通技术人员能够制作和使用所公开的主题并将其并入应用的上下文中。各种修改或修饰以及在不同应用中的各种用途对于本领域技术人员而言均将是显而易见的，并且本发明定义的一般原理可应用于广泛的实施方案。因此，本发明不旨在限于所呈现的实施方案，而是赋予与本发明公开的原理和新颖特征一致的最宽范围。
定义
本发明使用的术语“分批培养”是指具有营养物、温度、压力、通气及其他环境条件从而优化生长的封闭培养系统。由于在孵育过程中未添加营养物，亦未去除废物，分批培养可在营养物耗尽和生长停止之前完成有限数量的生命周期。
本发明使用的术语“可食用食品”是指人类食用安全的食品。譬如，其包括但不限于政府或监管机构(例如，美国食品和药物管理局)普遍认为安全的食品。在某些实施方案，技术人员认为此食品可安全食用。任何适合人类食用的可食用食品亦应适合另一种动物食用，并且此类实施方案亦旨在属于本发明范围内。
本发明使用的术语“酶”或“酶促”是指生物催化剂。酶加速或催化化学反应。酶通过降低活化能来提高反应速率。
本发明使用的术语“表达”是来自基因的信息用于合成功能性基因产物的过程。
本发明使用的术语“补料分批培养”是指一种操作技术，其中一种或多种营养物，例如底物，在培养过程中以连续或周期性模式被送入生物反应器，其中产物保留在生物反应器中直至运行完毕。另一种描述是一种培养，其中基础培养基支持初始细胞培养，并添加补料培养基以防止营养物耗尽。在补料分批培养中，可将培养液中补料底物的浓度控制在所需水平以支持连续生长。
本发明使用的“基因产物”是由基因表达产生的生化材料，RNA或蛋白质。
本发明使用的“生长培养基”是指支持微生物或细胞或小植物生长的媒介或培养基。生长培养基可以是但不限于固体或液体或半固体。生长培养基亦应与“生长介质”同义。
本发明使用的“基础培养基”是指促进多种类型的微生物和/或细胞生长且不需要任何特殊营养补充剂的非补充培养基。
本发明使用的“体外”是指在试管、培养皿、生物反应器或活生物体外部的其他地方进行或发生的过程。在本发明的正文中，产品亦可称为体外产品，在此种情况下，体外应是形容词，其含义应是所述产品是采用活生物体外部的方法或过程生成的。
本发明使用的“悬浮培养”是指其中单个细胞或细胞的小聚集体在悬浮于搅动的液体培养基中时进行增殖的培养类型。其亦指细胞培养或细胞悬浮培养。
本发明使用的“成纤维细胞”是指负责细胞外基质、上皮分化以及炎症和伤口愈合调节的间充质衍生细胞。此外，成纤维细胞还负责分泌生长因子并作为其他细胞类型的支架。成纤维细胞是在传统肉类中发现的一种细胞类型。
本发明使用的“细胞膏(cell paste)”是指从含水的细胞培养物中收获的细胞的糊体。细胞膏的细胞干重可以是1％-5％、5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、或更高。技术人员可制备具有所需含水量的细胞膏。通常，细胞膏包含按细胞干重计约5％-15％的细胞。制备包含经培养细胞的所需细胞干重的细胞膏，包括按细胞干重计包含任何其他所需百分比的细胞膏，均在技术人员的能力范围内。技术人员可通过离心、冻干、加热或任何其他众所周知的干燥技术去除水分。根据美国农业部的数据，包括家禽在内的动物肉的天然水分含量为约75％的水。在一些实施方案，本发明提供的细胞膏包含大量的水。如本发明所用，“湿细胞膏”包含约25％-90％的水、25％-85％的水、25％-80％的水、25％-75％的水、25％-70％的水、25％-65％的水、25％-60％的水、25％-55％的水、25％-50％的水、30％-90％的水、30％-85％的水、30％-80％的水、30％-75％的水、30％-70％的水、30％-65％的水、30％-60％的水、30％-55％的水、30％-50％的水、35％-90％的水、35％-85％的水、35％-80％的水、35％-75％的水、35％-70％的水、35％-65％的水、35％-60％的水、35％-55％的水、35％-50％的水、40％-90％的水、40％-85％的水、40％-80％的水、40％-75％的水、40％-70％的水、40％-65％的水、40％-60％的水、40％-60％的水、40％-55％的水、40％-50％的水、45％-90％的水、45％-85％的水、45％-80％的水、45％-75％的水、45％-70％的水、45％-75％的水、45％-70％的水、45％-65％的水、45％-60％的水、45％-55％的水、45％-50％的水、50％-90％的水、50％-85％的水、50％-80％的水、50％-75％的水、50％-70％的水、50％-65％的水、50％-60％的水、或50％-55％的水。细胞膏是培养的细胞肉类的另一个术语。
本发明使用的“基本上纯的”是指按干重计为至少80％细胞的细胞。基本纯的细胞为按干重计在80％-85％之间的细胞、按干重计在85％-90％之间的细胞、按干重计在90％-92％之间的细胞、按干重计在92％-94％之间的细胞、按干重计在94％-96％之间的细胞、按干重计在96％-98％之间的细胞、或按干重计在98％-99％之间的细胞。
本发明使用的“调味料”是指一种或多种呈固体和液体形式的草药和香料。
本发明使用的“原代禽类成纤维细胞”是指来自亲本动物的细胞，其在合适的生长培养基中，例如在受控环境条件下保持生长。原代培养的细胞与原始组织中的细胞具有相同的核型(真核细胞的核中染色体的数量和外观)。
本发明使用的“继代禽类成纤维细胞(secondary avian fibroblast cells)”是指经历遗传转化并永生化以使得无限增殖的原代细胞。
本发明使用的“增殖”是指使得细胞数量增加的过程。其特征是细胞分裂与细胞死亡或分化所导致的细胞损失之间的平衡。
本发明使用的“外来的”是指一种或多种污染物，例如但不限于：病毒、细菌、支原体和真菌。
本发明使用的“肽交联酶”或“交联酶”是催化一种或多种多肽之间共价键形成的酶。
本发明使用的“转谷氨酰胺酶”或“TG”是指催化γ-羧酰胺基团和各种伯胺之间形成肽(酰胺)键的酶(R-谷氨酰-肽胺谷氨酰转移酶)，分类为EC 2.3.2.13。转谷氨酰胺酶催化多肽间共价键形成，从而使多肽交联。交联酶如转谷氨酰胺酶用于食品工业以改善某些食品如乳制品、肉类和谷物产品的质地。其可从细菌来源、真菌、霉菌、鱼、哺乳动物、或植物中分离得到。
本发明使用的“蛋白浓缩物”是从植物来源或动物来源获得的一种或多种不同多肽的集合。蛋白浓缩物的蛋白质百分比(按干重计)大于25％的蛋白质(按干重计)。
本发明使用的“蛋白分离物”是从植物来源或动物来源获得的一种或多种不同多肽的集合。蛋白浓缩物的蛋白质百分比(按干重计)大于50％的蛋白质(按干重计)。
如本发明所用，除非另有说明，否则百分比(％)是指通常基于干重的总的重量％，除非另有说明。
术语“约”或“大约”表示并涵盖指定值及高于和低于所述值的范围。在某些实施方案，术语“约”表示指定值±10％、±5％或±1％。在某些实施方案，术语“约”表示指定值±所述值的一个标准偏差。
在本发明中，提出了体外培养禽类衍生细胞的方法。本发明方法提供了增殖细胞培养物、回收细胞培养物和监测细胞培养物纯度的方法。所述细胞可用于例如一种或多种食品。
本发明公开内容阐述了包含体外生长的禽类衍生细胞的禽类食品组合物的实施方案。在一些实施方案，所述组合物包含植物蛋白、细胞膏、脂肪、水及肽交联酶。
本发明公开内容阐述了制备由体外生长的禽类衍生细胞制成的禽类食品的方法的实施方案。禽类食品是可食用食品。
细胞
本发明提供了包含细胞的食品或方法。在一些实施方案，所述细胞是禽类细胞。在一些实施方案，所述禽类细胞选自但不限于：鸡、野鸡、鹅、天鹅、鸽子、火鸡和鸭。在一些实施方案，所述细胞包含原代禽类成纤维细胞。在一些实施方案，所述细胞包含继代禽类成纤维细胞。
在一些实施方案，所述细胞是UMNSAH/DFl(C1F)细胞。在某些实施方案，所述细胞是于1996年10月11日保藏在美国菌种保藏中心(ATCC，Manassas，Virginia，USA)的市售鸡细胞系。在一些实施方案，所使用的细胞衍生自ATCC保藏号CRL12203。
在一些实施方案，所述禽类细胞系具有自发永生化的成纤维细胞表型。在一些实施方案，所述禽类细胞系具有高增殖率。在某些实施方案，所述细胞具有永生化的成纤维细胞表型和高增殖率两者。
在一些实施方案，所述细胞并非以任何方式进行重组或改造的(即，为非转基因)。在一些实施方案，所述细胞未暴露于任何病毒和/或病毒DNA。在某些实施方案，所述细胞既非重组的，也未暴露于任何病毒和/或病毒DNA和/或RNA。
培养基与生长
在一些实施方案，增殖发生在悬浮或贴壁条件下，含或不含饲养细胞和/或在含血清或无血清培养基条件下。在一些实施方案，用于增殖的培养基含有氨基酸类、肽类、蛋白质类、碳水化合物类、必需金属类、矿物质类、维生素类、缓冲剂类、抗微生物剂类、生长因子类、和/或附加组分中的一种或多种。
在一些实施方案，增殖通过本领域技术人员已知的任何方法进行测定。在一些实施方案，增殖通过直接细胞计数进行测定。在某些实施方案，增殖通过血细胞计数器进行测定。在一些实施方案，增殖通过自动细胞成像进行测定。在某些实施方案，增殖通过库尔特计数器(Coulter counter)进行测定。
在一些实施方案，增殖是通过使用活力染色进行测定。在某些实施方案，所使用的染色剂包含台盼蓝。
在一些实施方案，增殖通过总DNA进行测定。在一些实施方案，增殖通过BrdU标记进行测定。在一些实施方案，增殖通过代谢测定法进行测定。在某些实施方案，增殖通过使用四唑盐类进行测定。在某些实施方案，增殖通过ATP耦合发光进行测定。
在一些实施方案，所述培养基是基础培养基。在一些实施方案，所述基础培养基是DMEM、DMEM/F12、MEM、HAMS’s F10、HAM’s F12、IMDM、McCoy's培养基和RPMI。
在一些实施方案，所述基础培养基包含氨基酸。在一些实施方案，所述基础培养基包含生物素。在一些实施方案，所述基础培养基包含氯化胆碱。在一些实施方案，所述基础培养基包含D-泛酸钙。在一些实施方案，所述基础培养基包含叶酸。在一些实施方案，所述基础培养基包含烟酰胺。在一些实施方案，所述基础培养基包含盐酸吡哆醇。在一些实施方案，所述基础培养基包含核黄素。在一些实施方案，所述盐酸硫胺素是基础培养基(DMEM/F12)的一部分。在一些实施方案，所述基础培养基包含维生素B12(亦称为氰钴胺素)。在一些实施方案，所述基础培养基包含i-肌醇(myo-inositol)。在一些实施方案，所述基础培养基包含氯化钙。在一些实施方案，所述基础培养基包含硫酸铜。在一些实施方案，所述基础培养基包含硝酸铁。在一些实施方案，所述基础培养基包含氯化镁。在一些实施方案，所述基础培养基包含硫酸镁。在一些实施方案，所述基础培养基包含氯化钾。在一些实施方案，所述基础培养基包含碳酸氢钠。在一些实施方案，所述基础培养基包含氯化钠。在一些实施方案，所述基础培养基包含磷酸氢二钠。在一些实施方案，所述基础培养基包含磷酸二氢钠。在一些实施方案，所述基础培养基包含硫酸锌。在一些实施方案，所述生长培养基包含糖类。在一些实施方案，所述糖类包括但不限于D-葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、或其任何组合。在一个实施方案，所述糖类包括D-葡萄糖和甘露糖两者。在葡萄糖和甘露糖均用于生长培养基中以培养细胞的实施方案中，所述生长培养基(培养基)中葡萄糖的量是介于0.1-10g/L之间、0.1-9g/L、0.1-8g/L、0.1-7g/L、0.1-6g/L、0.1-5g/L、0.1-4g/L、0.1-3g/L、0.1-2g/L、0.1-1g/L、0.5-10g/L、0.5-9g/L、0.5-8g/L、0.5-7g/L、0.5-6g/L、0.5-5g/L、0.5-4g/L、0.5-3g/L、0.5-2g/L、0.5-1g/L、1-10g/L、1-9g/L、1-8g/L、1-9g/L、1-8g/L、1-7g/L、1-6g/L、1-5g/L、1-4g/L、1-3g/L、1-2g/L、2-10g/L、2-9g/L、2-8g/L、2-9g/L、2-8g/L、2-7g/L、2-6g/L、2-5g/L、2-4g/L、2-3g/L、3-10g/L、3-9g/L、3-8g/L、3-9g/L、3-8g/L、3-7g/L、3-6g/L、3-5g/L、3-4g/L、4-10g/L、4-9g/L、4-8g/L、4-9g/L、4-8g/L、4-7g/L、4-6g/L、4-5g/L、5-10g/L、5-9g/L、5-8g/L、5-9g/L、5-8g/L、5-7g/L、或5-6g/L，和所述生长培养基中甘露糖的量是介于0.1-10g/L之间、0.1-9g/L、0.1-8g/L、0.1-7g/L、0.1-6g/L、0.1-5g/L、0.1-4g/L、0.1-3g/L、0.1-2g/L、0.1-1g/L、0.5-10g/L、0.5-9g/L、0.5-8g/L、0.5-7g/L、0.5-6g/L、0.5-5g/L、0.5-4g/L、0.5-3g/L、0.5-2g/L、0.5-1g/L、1-10g/L、1-9g/L、1-8g/L、1-9g/L、1-8g/L、1-7g/L、1-6g/L、1-5g/L、1-4g/L、1-3g/L、1-2g/L、2-10g/L、2-9g/L、2-8g/L、2-9g/L、2-8g/L、2-7g/L、2-6g/L、2-5g/L、2-4g/L、2-3g/L、3-10g/L、3-9g/L、3-8g/L、3-9g/L、3-8g/L、3-7g/L、3-6g/L、3-5g/L、3-4g/L、4-10g/L、4-9g/L、4-8g/L、4-9g/L、4-8g/L、4-7g/L、4-6g/L、4-5g/L、5-10g/L、5-9g/L、5-8g/L、5-9g/L、5-8g/L、5-7g/L、或5-6g/L。技术人员将理解可使用所述这些量的葡萄糖和甘露糖的组合，例如介于2-5克葡萄糖和1-4克甘露糖之间。
在一些实施方案，所述基础培养基包含亚油酸。在一些实施方案，所述基础培养基包含硫辛酸。在一些实施方案，所述基础培养基包含腐胺-2HCl。在一些实施方案，所述基础培养基包含1,4-丁二胺。在一些实施方案，所述基础培养基包含Pluronic F-68。在一些实施方案，所述基础培养基包含胎牛血清。在某些实施方案，所述基础培养基包含本段中的每一种成分。在某些实施方案，所述基础培养基是DMEM/F12。
在一些实施方案，所述生长培养基包含血清。在一些实施方案，所述血清选自小牛血清、鸡血清、及其任何组合。
在一些实施方案，所述生长培养基包含至少10％胎牛血清。在某些实施方案，所述禽类成纤维细胞群体在具有至少10％胎牛血清的培养基中生长，随后在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于2％。
在另一实施方案，所述培养基不含血清，包括胎牛血清、胎小牛血清、或任何动物来源的血清。
在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于1.9％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于1.7％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于1.5％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于1.3％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于1.1％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于0.9％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于0.7％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于0.5％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于0.3％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于0.1％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于0.05％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至约0％胎牛血清。
在一些实施方案，所述基础培养基是DMEM/F12且比例为3:1、2:1、或1:1。在某些实施方案，所述基础培养基是DMEM/F12且比例为约3:1。在某些实施方案，所述基础培养基是DMEM/F12且比例为约2:1。在某些实施方案，所述基础培养基是DMEM/F12且比例为约1:1。
在一些实施方案，所述生长培养基经修饰以优化来自细胞信号传导通路的至少一种基因的表达，所述细胞信号传导通路(cell signaling pathway)选自由以下组成的组：蛋白酶体、类固醇生物合成、氨基酸降解、氨基酸生物合成、药物代谢、粘着斑、细胞周期、MAPK信号传导、谷胱甘肽代谢、TGF-β、吞噬体、萜类化合物生物合成、DNA复制、糖酵解、糖异生、蛋白质输出、丁酸代谢、以及酮体的合成和降解。
在一些实施方案，针对生成禽类成纤维细胞的步骤的一种或多种细胞信号传导通路的基因表达进行监测。在某些实施方案，根据从所述监测基因表达获得的数据，在细胞生成的各个阶段调整生长培养基。
在一些实施方案，通过向生长培养基添加足以诱导一种或多种脂质蓄积的量的一种或多种化合物或从生长培养基去除足以诱导一种或多种脂质蓄积的量的一种或多种化合物，从而诱导禽类成纤维细胞蓄积脂质。
在一些实施方案，通过生长因子类、蛋白质类、肽类、脂肪酸类、元素类、小分子类、植物水解产物类、定向进化、基因工程、培养基组成、生物反应器设计、和/或支架设计中的一种或多种，改善在任何培养条件下禽类成纤维细胞的以下中的一种或多种：维持、增殖、分化、脂质蓄积、脂质含量、纯化倾向和/或收获效率、生长速率、细胞密度、细胞重量、抗污染性、禽类成纤维细胞特异性基因表达和/或蛋白质分泌、剪切敏感性、风味、质地、颜色、气味、香气、味觉质量、营养质量、最小化的生长抑制性副产物分泌、和/或最小化的培养基需求。在某些实施方案，所述脂肪酸包含十八碳四烯酸(SDA)。在某些实施方案，所述脂肪酸包含亚油酸。在某些实施方案，所述生长因子包含胰岛素或胰岛素样生长因子。在某些实施方案，所述生长因子包含成纤维细胞生长因子或类似物。在某些实施方案，所述生长因子包含表皮生长因子或类似物。在某些实施方案，所述蛋白质包含转铁蛋白。在某些实施方案，所述元素包括硒。在某些实施方案，所述小分子包含乙醇胺。培养中乙醇胺的量是介于0.05-10mg/L之间、0.05-10mg/L、0.1-10mg/L、0.1-9.5mg/L、0.1-9mg/L、0.1-8.5mg/L、0.1-8.0mg/L、0.1-7.5mg/L、0.1-7.0mg/L、0.1-6.5mg/L、0.1-6.0mg/L、0.1-5.5mg/L、0.1-5.0mg/L、0.1-4.5mg/L、0.1-4.0mg/L、0.1-3.5mg/L、0.1-3.0mg/L、0.1-2.5mg/L、0.1-2.0mg/L、0.1-1.5mg/L、和0.1-1.0mg/L。
在某些实施方案，所述培养基可补充有植物水解产物。在某些实施方案，所述水解产物包含酵母提取物、小麦蛋白胨、大米蛋白胨、植物蛋白胨、yeastolate、豌豆蛋白胨、大豆蛋白胨、豌豆蛋白胨、马铃薯蛋白胨、绿豆蛋白水解物或sheftone。用于培养的水解产物的量是在0.1g/L至5g/L之间、0.1g/L至4.5g/L之间、0.1g/L至4g/L之间、0.1g/L至3.5g/L之间、0.1g/L至3g/L之间、0.1g/L至2.5g/L之间、0.1g/L至2g/L之间、0.1g/L至1.5g/L之间、0.1g/L至1g/L之间、或0.1g/L至0.5g/L之间。
在一些实施方案，所述小分子包含乳酸脱氢酶抑制剂。如以下实施例中所述，乳酸脱氢酶抑制剂抑制乳酸形成。禽类细胞生成的乳酸会抑制细胞的生长。示例性乳酸脱氢酶抑制剂选自由以下组成的组：草氨酸盐、培黄素(galloflavin)、棉酚、喹啉3-磺胺类、N-羟基吲哚类抑制剂、和FX11。在一些实施方案，发酵培养基中乳酸脱氢酶抑制剂的量是在1-500mM之间、1-400mM、1-300mM、1-250mM、1-200mM之间、1-175mM、1-150mM、1-100mM、1-50mM、1-25mM、25-500mM、25-400mM、25-300mM、25-250mM、25-200mM、25-175mM、25-125M、25-100mM、25-75mM、25-50mM、50-500mM、50-400mM、50-300mM、50-250mM、50-200mM、50-175mM、50-150mM、50-125mM、50-100mM、50-75mM、75-500mM、75-400mM、75-300mM、75-250mM、75-200mM、75-175mM、75-150mM、75-125mM、75-100mM、100-500mM、100-400mM、100-300mM、100-250mM、100-200mM、100-150mM、100-125mM、和100-500mM。
在一些实施方案，禽类成纤维细胞在悬浮培养系统中生长。在一些实施方案，禽类成纤维细胞是在分批、补料分批、半连续(填充和抽取)或灌注培养系统或其某种组合中生长。当在悬浮培养中生长时，所述悬浮培养可在所需尺寸的容器(发酵罐、生物反应器)中进行。所述容器的尺寸适合禽类细胞生长，而不会出现不可接受的细胞破裂。在一些实施方案，所述悬浮培养系统可在至少25升(L)、50L、100L、200L、250L、350L、500升(L)、1,000L、2,500L、5,000L、10,000L、25,000L、50,000L、100,000L、200,000L、250,000L、或500,000L的容器中进行。对于较小规模的悬浮培养，细胞的培养可在至少125mL、250mL、500mL、1L、1.5L、2L、2.5L、3L、5L、10L或更大的烧瓶中进行。
在一些实施方案，所述悬浮培养的细胞密度是0.25x106个细胞/ml、介于0.5x106个细胞/ml和1.0x106个细胞/ml之间、介于1.0x106个细胞/ml和2.0x106个细胞/ml之间、介于2.0x106个细胞/ml和3.0x106个细胞/ml之间、介于3.0x106个细胞/ml和4.0x106个细胞/ml之间、介于4.0x106个细胞/ml和5.0x106个细胞/ml之间、介于5.0x106个细胞/ml和6.0x106个细胞/ml之间、介于6.0x106个细胞/ml和7.0x106个细胞/ml之间、介于7.0x106个细胞/ml和8.0x106个细胞/ml之间、介于8.0x106个细胞/ml和9.0x106个细胞/ml之间、介于9.0x106个细胞/ml和10x106个细胞/ml之间、介于10x106个细胞/ml和15.0x106个细胞/ml之间、介于15x106个细胞/ml和20x106个细胞/ml之间、介于20x106个细胞/ml和25.0x106个细胞/ml之间、介于25x106个细胞/ml和30x106个细胞/ml之间、介于30x106个细胞/ml和35x106个细胞/ml之间、介于35x106个细胞/ml和40x106个细胞/ml之间、介于40x106个细胞/ml和45x106个细胞/ml之间、介于45x106个细胞/ml和50x106个细胞/ml之间、介于50x106个细胞/ml和55x106个细胞/ml之间、介于55x106个细胞/ml和60x106个细胞/ml之间、介于60x106个细胞/ml和65x106个细胞/ml之间、介于70x106个细胞/ml和75x106个细胞/ml之间、介于75x106个细胞/ml和80x106个细胞/ml之间、介于85x106个细胞/ml和90x106个细胞/ml之间、介于90x106个细胞/ml和950x106个细胞/ml之间、介于95x106个细胞/ml和100x106个细胞/ml之间、介于100x106个细胞/ml和125x106个细胞/ml之间、或介于125x106个细胞/ml和150x106个细胞/ml之间。
在一些实施方案，所述禽类成纤维细胞在嵌入支架中或附着于支架材料时生长。在一些实施方案，所述禽类成纤维细胞在生物反应器和/或支架上分化或增殖。在一些实施方案，所述支架包含微载体、类器官和/或血管化培养物、自组装共培养物、单层、水凝胶支架、脱细胞禽类成纤维细胞和/或可食用基质中的至少一种或多种。在一些实施方案，所述支架包含塑料和/或玻璃或其他材料中的至少一种。在一些实施方案，所述支架包含基于天然的(生物)聚合物甲壳质、藻酸盐、硫酸软骨素、角叉菜胶、结冷胶、透明质酸、纤维素、胶原蛋白、明胶、和/或弹性蛋白。在一些实施方案，所述支架包含蛋白质或多肽，或经修饰的蛋白质或经修饰的多肽。未经修饰的蛋白质或多肽或经修饰的蛋白质或多肽包含从植物或其他生物体中分离的蛋白质或多肽。示例性植物蛋白分离物或植物蛋白浓缩物包含豆类蛋白、野豌豆蛋白、谷物蛋白、坚果蛋白、大藻蛋白、微藻蛋白、及其他植物蛋白。豆类蛋白可从干豆、扁豆、绿豆、蚕豆、干豌豆、鹰嘴豆、豇豆、班巴拉豆(bambara beans)、木豆、羽扇豆、野豌豆、红小豆、云扁豆(common beans)、胡芦巴、长豆、利马豆、红花菜豆、或宽叶菜豆、大豆或黎豆获得。野豌豆蛋白可从豌豆属获得。谷物蛋白可从小麦、大米、画眉草、燕麦、玉米、大麦、高粱、黑麦、小米、黑小麦、苋菜、荞麦、藜麦和其他谷物获得。坚果蛋白可从杏仁、腰果、山核桃、花生、核桃、澳洲坚果、榛子、开心果、巴西木(brazil)、栗子、可乐果、葵花籽、南瓜子、亚麻籽、可可、松子、银杏和其他坚果得到。从动物来源获得的蛋白质亦可用作支架，包括乳蛋白、乳清、酪蛋白、蛋蛋白及其他动物蛋白。在一些实施方案，自组装共培养物包含球状体和/或聚集体。在一些实施方案，单层具有或不具有细胞外基质。在一些实施方案，水凝胶支架包含透明质酸、藻酸盐和/或聚乙二醇中的至少一种。在一些实施方案，可食用基质包含脱细胞植物组织。
在一些实施方案，原代或继代禽类成纤维细胞如前述段落中的任一段所述进行修饰或生长。
细胞回收
可通过技术人员显而易见的任何技术来回收细胞。在一些实施方案，将禽类成纤维细胞与生长培养基分离或从生物反应器或支架中移出。在某些实施方案，禽类成纤维细胞通过离心、机械挤压/压滤、过滤、絮凝或凝结或重力沉降或干燥或其某种组合来分离。在某些实施方案，过滤方法包含切向流过滤、真空过滤、旋转真空过滤及类似方法。在某些实施方案，干燥可通过快速干燥、床干燥、盘式干燥和/或流化床干燥及类似方法来完成。在某些实施方案，将禽类成纤维细胞进行酶促分离。在某些实施方案，将禽类成纤维细胞进行机械分离。
细胞安全性
在一些实施方案，所述禽类成纤维细胞群体基本上是纯的。
在一些实施方案，在细胞培养的一个或多个步骤中进行测试以确定所述禽类成纤维细胞是否基本上纯。
在一些实施方案，针对禽类成纤维细胞是否存在细菌进行测试。在某些实施方案，测试的细菌类型包括但不限于：肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejunim)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、粪链球菌(Fecal streptococcus)、支原体属(Mycoplasma genus)、肺支原体(Mycoplasma pulmonis)、大肠菌群(Coliforms)和大肠杆菌(Escherichia coli)。
在一些实施方案，针对细胞培养基的组分进行测试，例如胎牛血清，以确定病毒是否存在。在某些实施方案，所述病毒包括但不限于：蓝舌病、牛腺病毒、牛细小病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛科病毒性腹泻病毒、狂犬病、呼肠孤病毒、腺相关病毒、BK病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、疱疹病毒6型、疱疹病毒7型、疱疹病毒8型、HIV1、HIV-2、HPV-16、HPV18、人巨细胞病毒、人泡沫病毒、人T淋巴细胞病毒、约翰坎宁安病毒(John Cunninghamvirus)和细小病毒B19。
在一些实施方案，针对是否存在酵母和/或霉菌进行测试。
在一些实施方案，通过质谱法，例如电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)，对金属浓度进行测试。在某些实施方案，所测试的金属包括但不限于：砷、铅、汞、镉和铬。
在一些实施方案，针对培养物中产生的激素进行测试。在某些实施方案，所述激素包括但不限于：17β-雌二醇、睾酮、黄体酮、右环十四酮酚、醋酸美伦孕酮(melengesterolacetate)、醋酸群勃龙、醋酸甲地孕酮、醋酸美伦孕酮(melengesterol acetate)、醋酸氯地孕酮、己二烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚、左环十四酮酚、玉米赤霉酮、和右环十四酮酚。
在一些实施方案，所述这些测试符合美国食品和药品管理局详细规定的当前良好生产过程。
表型分析、过程监测和数据分析
在一些实施方案，可通过本领域技术人员已知的任何技术监测细胞。在一些实施方案，在使用RT-qPCR提取总RNA之后使用分化的转录标记来测定和/或确认分化，然后将目的转录基因的水平与参比例如持家基因进行比较。
食品组合物
在某些实施方案，本发明提供了包含禽类成纤维细胞的食品组合物或食品。在一些实施方案，将禽类成纤维细胞与其他物质或成分组合以制备组合物，所述组合物为禽类食品组合物。在某些实施方案，禽类成纤维细胞单独用于制备作为禽类食品组合物的组合物。在某些实施方案，禽类食品组合物是类似于以下的产品：禽肉块、禽柳(aviantenders)、禽胸肉、禽牡蛎、禽足、禽翅、禽香肠、禽饲料或禽皮。在某些实施方案，禽类产品类似于鸡肉产品。
在一些实施方案，将所述回收的禽类成纤维细胞与其他成分制备成组合物。在某些实施方案，所述组合物包含细胞膏、绿豆、脂肪和水。
在某些实施方案，所述食品组合物或食品具有至少100重量％、90重量％、80重量％、75重量％、70重量％、65重量％、60重量％、50重量％、40重量％、30重量％、35重量％、25重量％、15重量％、10重量％、5重量％、或1重量％的湿细胞膏含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品具有在10重量％-20重量％之间、20重量％-30重量％之间、30重量％-40重量％之间、40重量％-50重量％之间、60重量％-70重量％之间、80重量％-90重量％之间、或90重量％-100重量％之间的湿细胞膏含量。在某些实施方案，所述组合物包含至少75重量％、70重量％、60重量％、50重量％、40重量％、30重量％、25重量％、20重量％、或15重量％的豆类蛋白含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品具有在10重量％-20重量％之间、20重量％-30重量％之间、30重量％-40重量％之间、40重量％-50重量％之间、60重量％-70重量％之间、80重量％-90重量％之间、或90重量％-95重量％之间的豆类蛋白含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少50重量％、40重量％、30重量％、25重量％、20重量％、15重量％、10重量％、5重量％、或1重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品具有在10重量％-20重量％之间、20重量％-30重量％之间、30重量％-40重量％之间、40重量％-50重量％之间、60重量％-70重量％之间、80重量％-90重量％之间、或90重量％-95重量％之间的脂肪含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少50重量％、40重量％、30重量％、25重量％、20重量％、15重量％、10重量％、或5重量％的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品具有在10重量％-20重量％之间、20重量％-30重量％之间、30重量％-40重量％之间、40重量％-50重量％之间、60重量％-70重量％之间、80重量％-90重量％之间、或90重量％-95重量％之间的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含在2％-5％之间、5％-10％之间、10％-15％之间、15％-20％之间、20％-25％之间、25％-30％之间、30％-35％之间、35％-40％之间、40％-45％之间、45％-50％之间、50％-55％之间、55％-60％之间、65％-70％之间、70％-75％之间、75％-80％之间、80％-85％之间、85％-90％之间、或90％-95％之间的湿细胞膏含量。
在一些实施方案，所述组合物包含肽交联酶，例如，含量在0.0001-0.0125％之间的转谷氨酰胺酶。
在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少1重量％的细胞干重含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少5重量％的细胞干重含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少10重量％的细胞干重含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少15重量％的细胞干重含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少20重量％的细胞干重含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少25重量％的细胞干重含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少30重量％的细胞干重。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少35重量％的细胞干重。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少40重量％的细胞干重。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少45重量％的细胞干重。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少50重量％的细胞干重。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少55重量％的细胞干重。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少60重量％的细胞干重。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少65重量％的细胞干重。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少70重量％的细胞干重。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少75重量％的细胞干重。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少80重量％的细胞干重。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少85重量％的细胞干重。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少90重量％的细胞干重。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少95重量％的细胞干重。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少97重量％的细胞干重。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少98重量％的细胞干重。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少99重量％的细胞干重。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少100重量％的细胞干重。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含在2％-5％之间、5％-10％之间、10％-15％之间、15％-20％之间、20％-25％之间、25％-30％之间、30％-35％之间、35％-40％之间、40％-45％之间、45％-50％之间、50％-55％之间、55％-60％之间、65％-70％之间、70％-75％之间、75％-80％之间、80％-85％之间、85％-90％、或90％-95％之间的细胞干重含量。
在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少2重量％、5重量％、10重量％、15重量％、20重量％、25重量％、30重量％、35重量％、40重量％、45重量％、50重量％、55重量％、60重量％、65重量％、70重量％、75重量％、80重量％、85重量％、90重量％或95重量％的豆类蛋白含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含在2％-5％之间、5％-10％之间、10％-15％之间、15％-20％之间、20％-25％之间、25％-30％之间、30％-35％之间、35％-40％之间、40％-45％之间、45％-50％之间、50％-55％之间、55％-60％之间、65％-70％之间、70％-75％之间、75％-80％之间、80％-85％之间、85％-90％、或90％-95％之间的豆类蛋白。在一些实施方案，所述豆类蛋白是绿豆蛋白。
在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少1重量％的脂肪含量、至少2重量％的脂肪含量、至少5重量％的脂肪含量、至少7.5重量％的脂肪含量、或至少10重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少15重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少20重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少25重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少27重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少30重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少35重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少40重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少45重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少50重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少55重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少60重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少65重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少70重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少75重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少80重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少85重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少90重量％的脂肪含量。在一些实施方案，所述食品组合物或食品包含在1％-5％之间、5％-10％之间、10％-15％之间、15％-20％之间、20％-25％之间、25％-30％之间、30％-35％之间、35％-40％之间、45％-50％之间、50％-55％之间、55％-60％之间、60％-65％之间、65％-70％之间、70％-75％之间、75％-80％之间、80％-85％之间、85％-90％之间、或90％-95％之间的脂肪含量。
在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少5重量％的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少10重量％的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含15重量％的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少20重量％的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少25重量％的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少30重量％的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少35重量％的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少40重量％的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含至少45重量％的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含50重量％的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含55重量％的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含60重量％的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含65重量％的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含70重量％的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含75重量％的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含80重量％的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含85重量％的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含90重量％的水含量。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含95重量％的水含量。
在一个实施方案，所述食品组合物或食品包含在25重量％-75重量％之间的湿细胞膏含量、在15重量％-45重量％之间的绿豆蛋白含量、在10重量％-30重量％之间的脂肪含量、和在20重量％-50重量％之间的水含量。
在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含肽交联酶。示例性肽交联酶选自由以下组成的组：转谷氨酰胺酶、分选酶、枯草杆菌蛋白酶、酪氨酸酶、漆酶、过氧化物酶、和赖氨酰氧化酶。在某些实施方案，所述组合物包含介于0.0001重量％-0.025重量％之间、0.0001重量％-0.020重量％之间、0.0001重量％-0.0175重量％之间、0.0001重量％-0.0150重量％之间、0.0001重量％-0.0125重量％之间、0.0001重量％-0.01重量％之间、0.0001重量％-0.0075重量％之间、0.0001重量％-0.005重量％之间、0.0001重量％-0.0025重量％之间、0.0001重量％-0.002重量％之间、0.0001重量％-0.0015重量％之间、0.0001重量％-0.001重量％之间、或0.0001重量％-0.00015重量％之间的交联酶。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含介于0.0001重量％-0.025重量％之间、0.0001重量％-0.020重量％之间、0.0001重量％-0.0175重量％之间、0.0001重量％-0.0150重量％之间、0.0001重量％-0.0125重量％之间、0.0001重量％-0.01重量％之间、0.0001重量％-0.0075重量％之间、0.0001重量％-0.005重量％之间、0.0001重量％-0.0025重量％之间、0.0001重量％-0.002重量％之间、0.0001重量％-0.0015重量％之间、0.0001重量％-0.001重量％之间、或0.0001重量％-0.00015重量％之间的转谷氨酰胺酶含量。不受理论的束缚，据信所述肽交联酶交联所述豆类蛋白或野豌豆蛋白，并且据信所述肽交联酶将所述豆类或野豌豆蛋白交联至禽类细胞。
在一个实施方案，相对于不含转谷氨酰胺酶的细胞膏，以体积为基础表示，所述食品组合物或食品包含0.0001％至0.0125％的转谷氨酰胺酶，并表现出降低或显着降低的脂氧合酶活性或降低或显着降低的氧化脂质的其他酶。更优选地，所述食品组合物或食品基本上不含脂氧合酶或可氧化脂质的酶。在一些实施方案，观察到氧化酶活性相对于组合物降低了5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、或80％。脂氧合酶催化脂质的氧化，其帮助形成赋予组合物不良风味的化合物。
在一些实施方案，绿豆蛋白被基于植物的蛋白质替代，所述基于植物的蛋白质包含来自鹰嘴豆、蚕豆、黄豌豆、甜糙米、黑麦、金扁豆、开边扁豆(chana dal)、大豆、小豆、高粱、发芽的绿小扁豆、杜风小扁豆(du pung style lentil)、和/或白利马豆的蛋白质。
在一些实施方案，附加可食用成分的添加可用于制备食品的所述食品组合物。可食用食品成分包含质地改性成分，例如淀粉类、改性淀粉类、树胶类及其他亲水胶体类(hydrocolloids)。其他食品成分包含pH调节剂类、抗结块剂类、色素类、乳化剂类、调味剂类、增味剂类、发泡剂类、消泡剂类、保湿剂类、甜味剂类、及其他可食用成分。
在某些实施方案，所述方法和食品组合物或食品包含与所述食品组合联合的有效量的添加防腐剂。
防腐剂防止食品因细菌、霉菌、真菌、或酵母而变质(抗微生物剂类)；减缓或防止颜色、风味或质地变化并延迟酸败(抗氧化剂)；保持新鲜度。在某些实施方案，防腐剂是下列中的一种或多种：抗坏血酸、柠檬酸、苯甲酸钠、丙酸钙、异抗坏血酸钠、亚硝酸钠、山梨酸钙、山梨酸钾、BHA、BHT、EDTA、生育酚类(维生素E)和抗氧化剂类，其可防止脂肪类和油类以及含有其的所述食品变质或产生异味。
食品加工
在一些实施方案，本发明提供了用于制作禽类食品的方法，其包含将豆类蛋白、细胞膏和磷酸盐组合至水中并分三个步骤加热所述混合物。在某些实施方案，所述方法包含向水中添加磷酸盐，从而调节水以制备调理水。在某些实施方案，将豆类蛋白添加至所述调理水中以使豆类蛋白水合，从而制备水合植物蛋白。在一些实施方案，将细胞膏添加至所述水合植物蛋白(已添加植物蛋白的调理水)以生成细胞蛋白质混合物。在一些实施方案，所述植物蛋白是豆类蛋白。在一些实施方案，所述豆类蛋白是绿豆蛋白。
在一些实施方案，所述磷酸盐选自由磷酸二钠(DSP)、六偏磷酸钠(SHMP)、焦磷酸四钠(TSPP)组成的组。在一个特定实施方案中，添加至水中的磷酸盐是DSP。在一些实施方案，添加至水中的DSP的量为至少或约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、或大于0.15％。
在一些实施方案，所述流程方法包括经历三个加热步骤。在一些实施方案，第一加热步骤包含将所述细胞和蛋白质混合物加热至40-65℃之间的温度，其中加入调味料。在一些实施方案，第二步包含将所述细胞和蛋白质混合物在40-65℃之间的温度下保持至少10分钟，其中添加肽交联酶(例如，转谷氨酰胺酶)。在一些实施方案，第三加热步骤包含将所述细胞和蛋白质混合物的温度升高至60-85℃之间的温度，其中向水中加入油。在一些实施方案，所述方法包含将温度降低至5-15℃之间温度的温度以制备预烹饪产品的第四步骤。
在一些实施方案，将调味料加至第一步、第二步、第三步或第四步中。在一些实施方案，调味料包括但不限于盐、糖、辣椒粉、洋葱粉、大蒜粉、黑胡椒、白胡椒、和天然鸡肉调味剂(素食)。
在一些实施方案，所加入的油(脂肪)用于第一步、第二步、第三步或第四步，以制备预烹饪产品。油选自由以下组成的组：植物油、花生油、菜籽油、椰子油、橄榄油、玉米油、大豆油、葵花籽油、人造黄油、植物起酥油、动物油、黄油、牛油、猪油、人造黄油、或食用油。
在一些实施方案，可在无额外准备或烹饪的情况下食用所述预烹饪产品，或者可使用众所周知的烹饪技术进一步烹饪所述预烹饪产品。
在一些实施方案，所述方法包含通过放置在烹饪模具中来制备禽类食品。在一些实施方案，所述方法包含对烹饪模具施加真空，从而有效地改变禽类食品的密度和质地。
在一些实施方案，将所述禽类食品裹上面包屑。
在一些实施方案，所述禽类食品被蒸、煮、炒、炸、烘焙、烧烤、炙烤、微波、脱水、真空低温烹饪法烹制、压力烹制、或冷冻，或其任何组合进行烹制。
植物蛋白分离物
本申请全文引用并并入来自以下美国公开号的处理植物蛋白以生成植物蛋白浓缩物和/或植物蛋白浓缩物的方法：WO2013/067453、US 2017/0238590 A1、WO2017/143298、WO2017/143301和US 62/981,890。
本发明提供了生成具有高功能性的植物蛋白分离物或植物蛋白浓缩物的方法，用于广泛的食品应用。在一些实施方案，用于生成分离物的方法包含选自下列的一个或多个步骤：
(a)在水溶液中从植物蛋白源提取一种或多种植物蛋白。在一些实施方案，所述提取在约5.0-10.0之间的pH值下进行。
(b)使用以下两种方法中的至少一种，由所述提取物纯化蛋白质：
(i)在接近富含球蛋白级分的等电点的pH值(例如，在约5.0-6.0之间的pH值)下，从所述提取物沉淀蛋白质；和/或
(ii)使用微滤、超滤或色谱法等过滤方法，由所述提取物分离和浓缩蛋白质。
(c)回收经纯化的蛋白分离物。
在特定实施方案，所述植物蛋白分离物是使用一系列机械方法产生，唯一使用的化学品是pH调节剂，例如氢氧化钠和柠檬酸，以及任选的乙二胺四乙酸(EDTA)，以防止脂质氧化活性影响分离物的风味。
尽管本发明提供的植物蛋白分离物或植物蛋白浓缩物可由任何合适的植物蛋白来源制备，其中起始材料是全植物材料，例如全绿豆、全红小豆、豌豆或其他植物材料，本发明提供方法的第一步通常包括对原材料进行脱壳。在一些此类实施方案中，生豆在去核、浸泡和干燥的一个或多个步骤中去壳以去除种皮(壳)和果皮(麸)。然后将去壳的绿豆碾磨以产生具有明确粒子分布尺寸的粉状物。在一些实施方案，平均粒子分布尺寸小于1000μm、900μm、800μm、700μm、600μm、500μm、400μm、300μm、200μm或100μm。在特定实施方案，粒子分布尺寸小于300μm以在提取步骤期间增加蛋白质的速率和产率。所用磨机的类型包括但不限于锤、销、刀、毛刺和空气分级磨机中的一种或组合。
在可行情况下，所得粉状物的空气分级可加速蛋白质提取流程并提高整个流程的效率。所采用的方法是确保使用细磨机(例如，空气分级磨机)将豆类研磨至通常小于45μm的粒度。然后将所得粉状物通过空气分级机，将粉状物分为粗粉和细粉。使粉状物通过空气分级器的动作旨在将粉状物中的大部分可用蛋白质浓缩成粉状物总质量的一小部分。典型的细粒级分(高蛋白)产率为5-50％。细粒部分的粒度往往小于20μm；然而，这可能会受原始豆类的生长季节和地区的影响。高蛋白部分通常包含原始样品中蛋白质的150-220％。由此产生的富含淀粉的副产品流亦成为附加值，并亦具有可行且可销售的利益。
在优选实施方案，纯化植物蛋白分离物或植物蛋白浓缩物的方法包含提取步骤。在提取步骤的一些实施方案中，中间起始材料例如豆粉与水溶液混合以形成浆液。在一些实施方案，所述水溶液是水，例如软水。水性提取包括产生水溶液，所述水溶液包含一份植物蛋白源(例如，粉状物)与约例如2至15份水性提取溶液。在其他实施方案，每一份植物蛋白源采用5至10体积的水性提取溶液。水性提取溶液与粉状物的其他有用比例包括1:1、2:1、4:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1，或者1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15。
优选地，在所需温度下，例如约2-50℃下，在冷却的混合罐中进行水性提取以形成浆液。在一些实施方案，所述混合在中剪切至高剪切下进行。在一些实施方案，将食品级消泡剂(例如，KFO 402聚乙二醇)添加至浆液中以减少混合过程中的起泡。在其他实施方案，在提取期间不使用消泡剂。
在一些实施方案，进行具有多个阶段的顺序提取以改进所述提取。
在一些实施方案，顺序提取以分批模式或连续模式进行。
在一些实施方案，以电流或逆电流模式进行顺序提取。
用食品级50％氢氧化钠溶液调节浆液的pH值，以达到所需的提取pH值，以便将目标蛋白质溶于水溶液中。在一些实施方案，提取是在约5-10.0之间的pH值下进行。在其他实施方案，提取是在中性或接近中性的pH值下进行。在一些实施方案，提取是在约pH 5.0-pH9、pH 6.0-pH 8.5或更优选pH 6.5-pH8的pH值下进行。在特定实施方案，提取是在约6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或10.0的pH值下进行。在特定实施方案，提取是在约7.0的pH值下进行。
在提取之后，经溶解的蛋白质提取物，譬如，在由滗析器和盘式离心机组成的固/液分离单元中，从浆液分离。提取物在低温(优选在3-10℃之间)下离心。收集提取物，并将沉淀重新悬浮，优选以3:1的水与粉状物重新悬浮。再次调节pH值并离心。将两种提取物合并，并使用尼龙网过滤。
任选地，蛋白质提取物经受碳吸附步骤以从蛋白质提取物中去除非蛋白质、异味成分及其他纤维状固体。所述碳吸附步骤使得到澄清的蛋白质提取物。在碳吸附步骤的一个实施方案中，然后将蛋白质提取物在4至8℃下输送通过食品级颗粒状木炭填充环形篮式柱(<5％w/w木炭与蛋白质提取物比率)。
在一些实施方案，在提取和任选地碳吸附之后，将澄清的蛋白质提取物用食品安全级的酸性溶液酸化以在冷冻条件(例如，2至8℃)下达到其等电点。在此种条件下，目标蛋白质沉淀并从水溶液中分离出来。在一些实施方案，将水溶液的pH值调节至大约富含蛋白质级分中的一种或多种球蛋白型蛋白质中的至少一种的等电点，例如，绿豆8S/β伴大豆球蛋白。在一些实施方案，调节包含蛋白质提取物的水溶液的pH值，所述蛋白质提取物在调节步骤之前具有约5.0-10.0的初始pH值。在一些实施方案，将pH值调节至约5.0至6.5。在一些实施方案，将pH值调节至约5.2-6.5、5.3至6.5、5.4至6.5、5.5至6.5或5.6至6.5。在一些实施方案，将pH值调节至约5.2-6.0、5.3至6.0、5.4至6.0、5.5至6.0或5.6至6.0。在某些实施方案，将pH值调节至约pH 5.4-5.8。在一些实施方案，将pH值调节至约5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1或6.2。
在本发明提供方法的优选实施方案中，对于绿豆蛋白纯化，调节pH值至约pH 5.6至pH 6.0的范围，并得到所需绿豆蛋白的沉淀。不受理论束缚，据信在约pH 5.6至pH 6.0的范围内等电沉淀产生优良的绿豆蛋白分离物，这关乎选自以下的一种或多种品质：蛋白质产量、蛋白质纯度、小分子量非蛋白质种类(包括单糖类和二糖类)的保留减少、油和脂质的保留减少、结构构建特性(例如，高凝胶强度和凝胶弹性)、卓越的感官特性、以及选择性富集高功能性8S球蛋白/β伴大豆球蛋白。通过本发明提供的方法制备的绿豆蛋白分离物或绿豆蛋白浓缩物的这些出乎意料的优越特性记载在，例如，美国公开号：US2017/0238590A1的实施例6和实施例8中。如US2017/0238590A1的实施例6记载的结果所证明，与在低于pH 5.6的pH值下经历酸沉淀的绿豆蛋白分离物相比，在约pH 5.6至pH 6.0的pH值范围内经历酸沉淀的绿豆蛋白分离物表现出关于以下的优异品质：蛋白质回收率(与小分子的回收率相比)、凝胶起始温度、凝胶强度、凝胶弹性、和感官特性。与在此范围之外经历酸沉淀的绿豆蛋白分离物相比，在约pH 5.2至pH 5.8的pH值范围内经历酸沉淀的绿豆蛋白分离物亦表现出显著更低的脂质保留。
诱导蛋白质沉淀的适宜食品级酸包括但不限于苹果酸、乳酸、盐酸和柠檬酸。在特定实施方案，沉淀是用20％食品级柠檬酸溶液进行。在其他实施方案，沉淀是用40％食品级柠檬酸溶液进行。
在一些实施方案，除调节pH值外，将EDTA，例如2mM食品级EDTA加至沉淀溶液中以抑制脂质氧化，从而避免产生异味化合物。
在替代实施方案，沉淀步骤包含在pH 5.6下的等电沉淀与低温沉淀(在1-4℃下)相结合，其中将pH值调节至5.4-5.8。
在另一替代实施方案，将高流速下的低离子强度沉淀与低温沉淀(在1-4℃下)相结合。在一些此类实施方案中，滤液的快速稀释在冷的(1-4℃)0.3％NaCl中以1体积的上清液与3体积的冷0.3％NaCl的比例进行。额外的重悬浮和均质化步骤可确保生成所需的蛋白质分离物。
在一些实施方案，然后将沉淀的蛋白质浆液从经pH调节的水溶液中除去并送至固/液分离单元(例如，单碟片式离心机)。在所述方法的一些实施方案中，通过添加0.3％(w/w)食品级氯化钠进行分离，并在重相中回收蛋白质凝乳。在优选实施方案，在冷却条件(2至8℃)下用4体积的软水清洗蛋白质凝乳，去除最终残留的杂质，例如纤维状固体、盐类和碳水化合物类。
在所述方法的一些实施方案中，过滤用作酸沉淀的替代或补充。不受理论束缚，据信虽然蛋白质的酸沉淀有助于去除小分子，但采用替代方法(例如超滤(UF))以避免沉淀/蛋白质聚集事件。因此，在一些实施方案，纯化富含蛋白质的级分以得到绿豆蛋白分离物或绿豆蛋白浓缩物包含使用至少一种选择性膜进行过滤、微滤或超滤程序。
超滤过程使用至少一个半透选择性膜，所述膜将渗余物部分(包含不能通过膜的材料)与渗透部分(包含可通过膜的材料)分离。半透膜根据分子大小分离材料(例如蛋白质及其他成分)。例如，在本方法的超滤过程中使用的半透膜可排除分子大小为10kDa或更大的分子(即，这些分子保留在渗余物部分中)。在一些实施方案，半透膜可排除分子大小为25kDa或更大的分子(例如，豆类蛋白)。在一些实施方案，半透膜可排除分子大小为50kDa或更大的分子。在多个实施方案中，在本发明所讨论方法的超滤过程中使用的半透膜可排除分子大小大于5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa、55kDa、60kDa、65kDa、70kDa、75kDa、80kDa、85kDa、90kDa或95kDa的分子(例如，豆类蛋白)。例如，10kDa的膜允许分子大小小于10kDa的分子(包括豆类蛋白)穿过膜进入渗透部分，而等于或大于10kDa的分子(包括豆类蛋白)则保留在渗余物部分中。
在一些实施方案，由酸沉淀和分离产生的经清洗蛋白质凝乳溶液在高温/短时间巴氏杀菌步骤中进行巴氏杀菌以杀死溶液中存在的任何病原菌。在特定实施方案，巴氏杀菌在74℃下进行20至23秒。在需要干燥分离物的特定实施方案中，将巴氏杀菌溶液通过喷雾干燥器以去除任何残留的水含量。典型的喷雾干燥条件包括170℃的入口温度和70℃的出口温度。最终干燥的蛋白分离物粉末通常具有小于5％的水分含量。在本发明所述方法的一些实施方案中，省略巴氏杀菌以保持蛋白分离物的更广泛功能。
提供以下非限制性方法以进一步说明本发明公开的本发明实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表已发现在本发明的多个实施方案的实践中运行良好的方法，因此被视为构成其实践模式的示例。然而，本领域技术人员根据本发明内容应当理解，在不脱离本发明精神和范围的情况下，可对所公开的具体实施方案进行许多改变或变化并仍获得相似或近似结果。
实施例
实施例1：培养细胞
细胞是衍生自市售鸡细胞系UMNSAH/DF1(C1F是申请人对所述细胞的内部名称)的子细胞系，所述鸡细胞系UMNSAH/DF1于1996年10月11日保藏在美国菌种保藏中心(ATCC，Manassas，Virginia，USA)。
培养基配方是基础培养基(DMEM/F12)，包含氨基酸类、维生素类、无机盐类和补充有FBS或BCS(小牛血清)的其他成分。
创建主工作细胞库(MCWB)
从C1F主细胞库(MCB)检索得到单瓶细胞以建立C1F MWCB。简言之，将C1F MCB冷冻小瓶从液氮储存器中取出并立即放入37℃水浴中。通过轻轻摇动小瓶使细胞悬液快速解冻。将C1F细胞悬液在层流罩中逐渐转移至15mL锥形管中，其中含有10mL预热的培养基。将所得稀释的C1F细胞悬浮液以300xg离心5分钟。在不干扰细胞团块(cell pellet)的情况下无菌吸出上清液。将C1F细胞轻轻重悬于培养基中，并转移至250mL旋转培养瓶中，最终工作体积为50mL。测定解冻后的细胞密度和活力以监测C1F的健康状况及对已建立的MCB进行质量控制。
C1F细胞在125rpm的搅拌下培养总共9天，并进行四个放大步骤。首先，将细胞在5％CO2的加湿培养箱中于37℃下培养2天。然后将培养物以300xg离心5分钟。倒出培养物上清液，将C1F细胞团块重新悬浮在新鲜培养基中，并接种在500mL摇瓶中，最终体积为130mL。其次，将C1F细胞在37℃和5％CO2的加湿培养箱中以125rpm搅拌再培养2天。然后将培养物再次以300xg离心5分钟；在1L摇瓶中，将细胞团块重悬于新鲜培养基中至终体积为340mL的培养基。最后，培养2天后，收集细胞培养物并以300xg离心5分钟；将C1F细胞团块重悬于新鲜培养基中，最终工作体积为880mL，置于2L摇瓶中。C1F细胞在相同条件下培养2天，以300xg离心5分钟；将细胞团块重悬于新鲜培养基中，最终体积为2.3L，置于5L摇瓶中。将C1F细胞培养物在含有5％CO2的加湿培养箱中于搅拌下再放置1天，并收获以创建MWCB。
收集最终扩增培养物中的C1F细胞并以300xg离心5分钟。将细胞重新悬浮在较小体积的培养基中，并使用半自动细胞计数系统(Vi-Cell)对浓缩的C1F细胞进行取样和计数。C1F细胞经历另一个300xg离心循环持续5分钟，并以20-25百万个细胞/mL的浓度重新悬浮于冷冻保存培养基(含10％DMSO)中。在异丙醇室中，在16至24小时内，将细胞在印有条形码的冷冻管中以-1℃/min的速率从4℃冷冻至-80℃。然后将细胞转移并储存在气相液氮储存系统(Taylor Wharton(<-175℃))。小瓶内容物和库存存储位置均记录在受控数据库中。
CGMP监管链文件(小瓶身份确证)用来确保从MWCB检索得到适当小瓶，用于细胞库释放测试及培养肉生成。
实施例2：培养鸡(Cultured Chicken)生成
一次性系统用于示例性制作过程中的种子扩增和细胞生长。与培养基接触时间长的处理系统包括用于大型500L生物反应器的摇瓶、波袋(Wave Bags)、培养基保持袋和搅拌罐生物反应器袋。图1描绘了细胞培养禽类成纤维细胞的流程图。图2描绘了收获细胞的流程图。
种子扩增通过解冻来自MWCB的细胞小瓶开始，并于工作体积为100mL的500mL摇瓶中培养。含有5％FBS的DMEM/F12用于种子扩增。然后将培养物按1:3至1:6的比例分流并接种到工作体积为300mL的1L摇瓶中。
C1F细胞在大型摇瓶中以1:3至1:6的分流比在3L烧瓶中以900mL进行放大培养，然后在5L烧瓶中将900mL培养物分流为2.7L进行放大培养。最后，使用1:3分流比将5L烧瓶中的2.7L培养物进一步分成3个2.7L烧瓶，以便转移至波袋(Wave Bag)中。
波袋(WAVE BAG)中的细胞培养
在无菌条件下，按照先前针对摇瓶培养物(8.1L细胞悬浮液+15.9L新鲜培养基)指示的1:3分流比，使用来自3个5L摇瓶(2.7L培养物)的培养物在无菌条件下接种波袋(WaveBag)(总体积为50L，最大工作体积为25L)。低血清培养基(DMEM/F12+1.25％FBS)用于生产系统(波袋(Wave Bag)或500L生物反应器)中的细胞生长。如果将5％血清用作500L生物反应器的种子，则其在波袋(Wave Bag)中用于细胞生长。
波袋(Wave Bag)中的C1F培养物被收获用于生产或用于接种500L生物反应器。
500L生物反应器中的培养
将波袋(Wave Bag，25L)中的内容物无菌转移至具有100L初始培养基(具有1:3至1:6分流比，总体积为125L)的大型生物反应器(总体积700L，最大工作体积500L)中。
培养3天(+/-0.5天)后，通过添加375L新培养基将培养基体积增至500L，并继续再培养3天(+/-0.5天)。定期对培养物取样以测定细胞数量和活力。离线监测生物反应器培养物的pH值、乳酸、葡萄糖、谷氨酰胺及谷氨酸水平。
浓缩和回收
使用垂直轴流通过滗析器离心机浓缩细胞培养液(cell culture broth，25-100倍)。细胞分离的方法可包括离心、过滤、絮凝及其组合。离心机的速度为500-1000rcf，每碗尺寸的流速为0.4-1.2min-1。收集浓缩的细胞培养浆液并移至下一阶段的清洗流程。
清洗细胞
通过在离心后有效清洗细胞团块，可减少培养肉中培养基成分的残留。具体而言，在细胞培养结束时，将用过的培养基离心后得到的细胞团块通过使用5倍(w/v)0.45％NaCl溶液进行重悬浮&离心流程依次清洗两次。通过清洗，培养肉中培养基成分的残留有效减少至少25倍。除了葡萄糖、谷氨酰胺&钠，根据经验估计，培养基成分的残留量非常低，基于清洗结束时的25倍稀释，<10ppm。葡萄糖和谷氨酰胺在细胞培养过程中均作为碳/氮源被消耗。
清洗效率通过测定第二次清洗溶液中Pluronic F-68的保留量来追踪。PluronicF-68在生长培养基中的初始浓度为0.1％w/v(1000mg/L)。未检测到第二次清洗溶液中的Pluronic F-68浓度(<<0.01％w/v)，证实清洗在去除其他可溶性培养基成分方面的效率。
使用对牛血清白蛋白具有高灵敏度和特异性的牛白蛋白ELISA试剂盒(LifespanBiosciences)来检测和定量所述清洗溶液中的白蛋白。在最终清洗液中，所测定的白蛋白浓度低于10mg/L，可能在0-100ppm(mg/L)范围内。
在用于最终产品配方之前，将清洗的细胞(培养鸡(Cultured Chicken))储存在密封的食品安全级容器中，温度低于或等于-20℃。
实施例3：测试细胞对细菌和病毒的安全性
在细胞生长和收获的所有阶段检测细胞的安全性和有效性。评估培养的C1F细胞是否存在病毒、酵母和细菌的外来病原体。
使用FDA细菌学分析手册(BAM)中的方案来分析鸡肉产品中是否存在细菌。
总平板计数(TPC)与需氧菌平板计数(APC)同义。正如美国FDA细菌学分析手册(BAM)第3章所述，所述检测旨在表明产品中的微生物水平。简言之，所述方法包括对样品进行适当的十进制稀释，并接种至琼脂平板的非选择性培养基中。孵育约48小时后，计算菌落形成单位(CFU)并报告为总平板计数。
根据美国FDA细菌学分析手册(BAM)第18章中概述的方法学分析酵母和霉菌。简言之，所述方法包括在0.1％蛋白胨水中连续稀释样品，然后分配到含有营养物质和抗生素的培养皿上，所述抗生素抑制微生物生长但促进酵母和霉菌计数。平板在25℃下孵育并在5天后计数。或者，通过使用0.1％蛋白胨水中的10倍连续稀释样品并将1mL分配到Petrifilm上来分析酵母和霉菌，Petrifilm含有营养物质和抗生素，可促进酵母和霉菌计数。Petrifilm在25℃或28℃下孵育48小时，结果报告为CFU。
根据美国FDA细菌学分析手册(BAM)第4章中概述的方法学分析大肠杆菌和大肠菌群。所述方法包括在月桂基硫酸盐胰蛋白胨培养基中进行连续十进制稀释，并于35℃下孵育并检查气体形成情况。下一步涉及由充气管(使用3mm环)转移至BGLB培养基中，并于35℃下孵育48+/-2小时。结果报告为MPN(最大可能数)大肠菌群数/g。
如BAM第9章所述，使用CMMEF方法分析链球菌。检测原理基于链球菌对酸形成的检测，并通过颜色由紫色变为黄色来表示。KF链球菌琼脂培养基与氯化三苯基四唑鎓(TTC)一同用于选择性分离和计数。在35+/-2℃下有氧孵育46-48小时后，培养响应报告为CFU。
根据美国FDA细菌学分析手册(BAM)第5章中概述的方法学分析沙门氏菌。简言之，准备分析物以分离沙门氏菌，然后通过转移至选择性富集培养基进行分离，将其在亚硫酸铋(BS)琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐(XLD)琼脂和Hektoen肠溶(HE)琼脂上铺板。重复此步骤并转移至RV培养基上。平板在35℃下孵育24+/-2小时，并检查是否存在可能是沙门氏菌的菌落。根据所采用的试验/底物及所产生的结果，通过各种方法学进一步测试推定的沙门氏菌，以观察沙门氏菌的生化及血清学反应。由于25L波袋(Wave Bags)生成的肉量很少，因此仅有5克经过沙门氏菌检测。从500L收获产品中测试的数量符合FDA BAM–第5章。
通过与上述实施例一致的方法制备得到培养鸡。表1表明与美国FDA指南相比，细菌污染可以忽略不计。
表1：培养鸡肉的微生物分析
Figure BDA0003503923680000231
支原体污染
如果使用MycoAlertTM支原体检测试剂盒解冻至少3％的随机选择和测试的每个细胞库的细胞小瓶，并且其培养上清液提供阴性结果，则认为所培养的C1F细胞可用于支原体(Mycoplasma)检测。按照试剂盒指南，将受试样品根据发光读数B和发光读数A的比值进行分类：比值<0.9，支原体阴性；0.9<比值<1.2临界值(24小时后需重新检测细胞)；比值>1.2，支原体污染。
病毒评估
病毒评估是通过第三方(查尔斯河研究动物诊断服务(Charles River ResearchAnimal Diagnostic Services))–人类基本清除小组(Human Essential CLEAR Panel)；禽类病毒和细菌小组(Avian Virus and Bacteria Panel)进行的传染病聚合酶链反应(PCR)分析外来的人类及禽类病毒和细菌病原体而进行。
如果来自测试库的至少3％的独立细胞小瓶被解冻，并且其细胞团块针对所有外来因子提供阴性结果，则认为来自细胞库的C1F可用于病毒评估。
培养的C1F细胞被认为不存在外来的禽类及人类病毒和细菌病原体，因为来自每个细胞库的独立细胞团块对于整个人类和禽类小组均呈阴性。
实施例4：培养鸡(Cultured Chicken)分析
将培养鸡的营养成分与传统鸡进行比较。
采用水分、蛋白质含量、脂肪含量、灰分含量、碳水化合物等指标对培养鸡进行化学分析。使用重量分析烘箱干燥法分析水分含量，使用10克培养鸡的受试部分于105℃下在对流烘箱中干燥24小时以上。使用LECO FP 628氮/蛋白质分析仪基于通过杜马斯燃烧法(Dumas combustion)测定的总氮来分析总的粗蛋白。脂肪含量测定为蓄积脂肪酸甲酯(FAME)与起始受试部分的质量之比。将30mg干燥的细胞受试部分通过甲醇盐酸进行直接酯交换，然后经由液-液萃取到庚烷中进行分离以通过GC-FID进行FAME分析。通过将10-十七碳烯酸甲酯作为内标添加至受试样品和校准标准中来实现定量。在所述方法中鉴定的FAME是从Nuchek Prep公司购买的GLC-74X分析标准品的成分，其是15种常见的饱和及不饱和FAME的混合物，介于辛酸甲酯和二十二烷酸甲酯之间。GC色谱图中的所有其他显著峰均根据其最靠近洗脱峰的校准曲线进行定量。使用Milestone Pyro 260微波炉基于重量法来分析总灰分含量。将样品加热至900℃并保持50分钟以上，然后在900℃下保持1小时。碳水化合物含量通过与水分、蛋白质、灰分和脂肪含量的总和的差计算得到。
表2总结了与传统去骨鸡胸肉相比，培养鸡的灰分、碳水化合物、蛋白质和脂肪的百分比。
表2培养鸡与传统去骨鸡胸肉的营养分析比较
Figure BDA0003503923680000241
Figure BDA0003503923680000251
表3总结了与传统去骨鸡胸肉相比，培养鸡的饱和脂肪、单不饱和脂肪和多不饱和脂肪的百分比。脂肪值表示为样本中特定脂肪相对于总脂肪的百分比(％)。
表3培养鸡的饱和脂肪、单不饱和脂肪和多不饱和脂肪百分比汇总
Figure BDA0003503923680000252
将每100克干细胞膏的克数与干生鸡肉进行比较时，培养鸡与传统鸡相似。传统鸡胸肉与培养鸡的整体热量值相近。单不饱和脂肪(通常称为健康类型的脂肪)代表了传统鸡和培养鸡中较高百分比的脂肪类型(分别为34.1％和50％)，其次是饱和脂肪和多不饱和脂肪。有趣的是，培养鸡中的高灰分含量是由于残留的盐分所致，主要来自用于制备所述材料的0.45％NaCl清洗液，以及来自用于培养鸡细胞的培养基。培养鸡中的钠含量(3.6％)亦证实了这一点。从分析中去除灰分后，其蛋白质、脂肪和碳水化合物水平在培养鸡和传统鸡之间均非常一致。
实施例5：禽类食品组合物
代表性的禽类食品组合物如下表4中所述(按重量百分比)。
表4：示例禽类食品组合物
成分 重量％
水 20-40
细胞膏 25-50
绿豆 10-20
脂肪 5-20
转谷氨酰胺酶 0.0001-0.0125
实施例6：鸡块制作配方
下面描述了一种非限制性配方。
首先，用浓度在0.03-0.16％之间的磷酸二钠对水进行调节。待水调和后，将绿豆蛋白分离物加至所述调理水中，以制备水合豆类蛋白。接下来，将由浓度为25-65％的C1F细胞制成的细胞膏与水合豆类蛋白接触以制备细胞和蛋白质混合物。
对所述细胞和蛋白质混合物进行一系列加热步骤。在第一步中，将细胞和蛋白质混合物的温度斜升至45-60℃之间的温度。在这一步加入调味料。在第二步中，将细胞和蛋白质混合物的温度保持在45-60℃，并加入转谷氨酰胺酶。转谷氨酰胺酶的酶促反应在45-60℃之间的温度下运行10-20分钟。在第三步中，通过将细胞和蛋白质混合物的温度升高至70℃来使酶失活，从而停止转谷氨酰胺酶的酶促反应。如本发明所讨论，转谷氨酰胺酶被认为可使蛋白分离物中的肽共价连接在一起并可与存在于培养细胞上的肽共价连接。在第三步中，以5-20％(v/v)之间的浓度加入油。
然后将第三步处理后的细胞和蛋白质混合物冷却至5-15℃之间的温度。
然后将第三步之后的细胞和蛋白质混合物在5-25％的脂肪中乳化，以产生转移至模具中的乳化混合物。通过对模具施加真空来改变乳化混合物的密度和质地。然后将乳化混合物分装到硅树脂模具/托盘中。然后将硅树脂模具/托盘在200-275℃下烘焙5-19分钟，并注入35-75％的蒸汽。
然后将经烘焙的材料装袋、速冻或冷藏。然后将经烘焙的材料裹上面包屑并油炸以生成人工培养的禽类鸡块。
由品尝小组测试人工培养的禽类鸡块，所述小组确定人工培养的禽类细胞鸡块在味道、质地和口感方面与由农场养殖或家畜动物制作的鸡块相当。
实施例7：对用于制作的鸡细胞进行测序分析
将用于制作的鸡细胞的测序分析与亲本细胞进行比较，以评估培养条件诱导的潜在遗传漂移。
简言之，基于参考出版物，使用R程序DESeq2_1.20.0进行差异基因表达分析。之后，使用ClusterProfiler：cluster_2.0.7-1对样本进行层次聚类。
图3描绘了在亲本鸡细胞库的3个生物学重复和用于制作培养鸡的鸡细胞库的3个生物学重复之间进行的聚类分析。
图3绘制了超过10,400个基因，统计差异表达的基因选择为p<0.01，不同表达基因的比例以热图形式呈现。
样品JUST1-JUST3从于贴壁条件下培养的亲本鸡细胞获得，培养基补充有高(10％v/v)血清浓度。样品JUST 7-JUST9在培养基悬浮液中培养，培养基中补充有低(1.25％v/v)血清浓度。如图3所示，每个组内的样品聚集在一起，表明每个培养条件下生物重复样品之间的同质性。
基于原鸡(Gallus gallus)数据库(GenomeInfoDbData_1.1.0和Org.Gg.eg.db(Gallus数据库)v2.1，更新于2018年4月9日)上的注释，使用丰富的KEGG进行通路富集，以验证不同表达的基因是否在某些通路中分组。
受影响的通路包括与DNA复制、蛋白酶体、核糖体、细胞凋亡和类固醇生物合成机制相关的那些通路。上调基因及下调基因均与代谢物、蛋白质或其他对人类消费有害的毒素无关。
实施例8：降低血清含量的影响
分析了低血清培养基对细胞活力(图4A)和群体倍增时间(图4B)的影响。细胞最初在0.5％(v/v)血清浓度下生长，然后降至0％(v/v)–无血清。
研究了在补充有脂肪酸和生长因子的无血清基础培养基(图5A)中以及在补充有脂肪酸和生长因子的无血清基础培养基(图5C)中，对C1F细胞生长的影响，并与在不含血清及不含生长因子的基础培养基中生长的C1F细胞进行比较(图5B)。所使用的生长因子是胰岛素样生长因子、表皮样生长因子和成纤维细胞样生长因子，浓度在5-200μg/mL之间。图5A和图5C在实验过程中使用了100μg/mL的生长因子。使用50μg/mL的生长因子亦观察到类似的效果。其结果证明补充有生长因子的无血清培养基达到与补充有生长因子的含血清基础培养基相似的活细胞密度。
实施例9：对无血清条件的适应
在确保细胞从前一步适应成功后，基于每一步血清百分比的依次降低，采用逐步适应的方法学。细胞对较低血清浓度的适应并非一个直接的过程，需要一段时间来适应新的微环境，并在血清降低的每个阶段获得健康的外观和明显生长。首先，我们确定了FBS的阈值浓度，低于所述浓度的悬浮液中细胞表现出显著的生长停滞。将维持在含有5％FBS的培养基中的C1F细胞转移至2％、1％和0.5％FBS中。当FBS浓度降低至1％(v/v)以下时，细胞表现出生长减少。为了使细胞适应低血清浓度，将含有1％v/v和0.5％(v/v)FBS的培养基补充有胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺(ITSE)(ThermoFisher)和生长因子(表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(FGF)，Peprotech)。ITSE、EGF和碱性FGF一同使用被称为ITSEEF。图6公开了适于在无血清培养基中生长的细胞的活力、群体倍增时间和群体倍增水平。图6a示出了血清断奶过程中的活细胞密度。图6b示出了血清断奶过程中的群体倍增时间。图6c示出了C1F细胞从含有0.5％FBS的培养基过渡到含有0％FBS的培养基时的活力。
为了在无血清培养基中达到更高的细胞密度，测试了额外的由化学成分定义的补充剂。如表5所示，维生素、脂质和痕量元素均与生长因子和ITSE的断奶一同筛选。在本实施例中，粉体(ThermoFisher，目录号A42914EK)和补充有Pluronic-F68和ITSEEF(称为JUSTBasal(JB)培养基)的液体(基础培养基(DMEM/F-12，目录号11320-033)形式的DMEM/F12培养基均被使用。液体DMEM/F12用于大部分适应性研究。具有标准渗透压(约330mOsm/Kg)的SFM(SFC-2)使用市售的DMEM/F12粉体形式制备，而具有低渗透压(约280mOsm/Kg)的SFM(SFC-4)使用定制的粉体DMEM/F12变体(不含葡萄糖、HEPES缓冲液、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和氯化钠)制备。SFC-4的缺失组分单独添加，并根据氯化钠添加量的不同调整渗透压。内部自制的RO/DI水用于由粉体配方制备DMEM/F12基础培养基。
表5.在适应无血清条件的不同阶段优化的不同SFM的组成
Figure BDA0003503923680000271
Figure BDA0003503923680000281
无血清C1F(SF-C1F)细胞扩增及冷冻保存
基于活细胞密度，确定了用于扩增C1F细胞的分流比，其通常为1:3(v/v)。在无血清培养基(SFM)中培养的C1F细胞从具有50mL工作培养物的125mL烧瓶扩增至最后一步中具有2.5L工作体积的5L烧瓶，经由多个增量传代步骤：100mL于250mL烧瓶中，300mL于500mL烧瓶中，900mL于2.8L烧瓶中。每次细胞传代后，按照先前描述的相同方案对细胞密度和活力进行新的测定。
SF-C1F细胞库由5L摇瓶中生长活跃的培养物制备得到。以300x g离心含有需要储存的细胞数量的C1F细胞悬液体积。在不干扰C1F细胞团块的情况下，无菌倒出或吸出上清液。将细胞团块轻轻重悬于冷冻保存培养基中。筛选了各种内部自制和市售冷冻培养基以确定性能最佳的培养基(表6)。通过向SFM(SFC-2)培养基中添加FBS和/或DMSO来制备内部自制冷冻培养基。商业途径冷冻保存培养基购自BioLife Solutions(CryoStor CS2、CS5、CS10)和PromoCell(Cryo-SFM)。SF-C1F细胞库以2000万至3000万个细胞等分试样在-185℃下储存在液氮冷冻机的气相中。将用于内部自制冷冻保存培养基的一(1)mL等分试样和用于商购冷冻培养基的2mL等分试样分装到低温储存小瓶中。在异丙醇室中，在16至24小时内，将细胞在印有条形码的冷冻管中以-1℃/min的速率从4℃冷冻至-80℃。然后将C1F细胞转移并储存在气相液氮储存系统(Taylor Wharton(<-175℃))中。小瓶内容物和库存存储位置均记录在受控数据库中。GMP监管链文件(小瓶身份确证)用于确保从细胞库中检索得到适当的小瓶。
两小瓶SF-C1F细胞库在37℃水浴中解冻不到2分钟，并在使用SFM(SFC-2)进行10倍稀释后重新悬浮。以300x g离心后，去除上清液，将细胞重新悬浮于新鲜SFM中，密度介于0.3x106-0.6x106个细胞/mL之间。进行旋转传代，直至细胞通过生长至活细胞密度(VCD)为1.2x106个细胞/mL或高于1.2x106个细胞/mL，表示恢复。恢复后，细胞按照1:3的比例分流传代。通过将细胞以300x g离心5分钟，并弃去上清液，进行自旋传代。然后将细胞团块重悬于新鲜培养基中。在分流传代方法中，将一部分细胞培养物转移至含有预定量新鲜培养基的新烧瓶中。对于1:3的细胞分流比，将原始C1F悬浮液总体积的三分之一转移至含有新鲜培养基总体积的三分之二的烧瓶中。VCD根据实施例13中公开的方法进行测定。
表6：针对SF-C1F细胞测试的冷冻保存培养基
Figure BDA0003503923680000282
Figure BDA0003503923680000291
出于定量活细胞密度和活力的目的，将1mL的C1F悬浮液收集在Eppendorf管中并以300x g离心5分钟。弃去上清液，或将上清液用于测定代谢物浓度。将C1F细胞团块重新悬浮于500μL TrypLE Express(Gibco)中，并于37℃下在摇床中孵育5-8分钟，然后通过添加500μL培养基使酶活性失活。将总体积(每个样品的最小体积为550mL)转移至Vi-Celltm XR细胞活力分析仪(Beckman Coulter)的采样杯中。使用Vi-Cell分析仪量化细胞密度和活力。Nova Flex生物分析仪(Nova Biomedical，USA)用于评估pH、葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸、铵、钾和钠的值。一(1)mL样品(用过的培养基或新鲜培养基)用于培养基组分和代谢物分析。采用OsmoPro渗透压计(Advanced Instruments)使用20μL样品测定新鲜和用过培养基的渗透压。根据以下公式计算群体倍增时间(PDT)和群体倍增水平(PDL)：
PDT＝t*log10(2)/((log10(n/n0))，其中t＝培养时间，n＝最终细胞数量，和n0＝接种细胞数量。
PDL＝3.32[log10(n/n0)]，其中n＝最终细胞数量，和n0＝接种细胞数量。
在C1F细胞成功适应0.5％FBS后，将FBS逐步降低至0.25％、0.1％、0.05％和0％FBS。在ITSEEF存在下，C1F细胞在不含FBS的情况下成功生长，但是，细胞密度和增殖率略低于在含有5％FBS的培养基中生长的细胞。
实施例10：附加培养基组分
本实施例公开了向无血清培养基添加营养成分，以提高细胞密度和增殖率。表5中公开的培养基称为JUST Basal(JB)培养基。之前有报道称从ThermoFisher(CD-lipid)购买的脂质溶液有助于细胞培养基中FBS断奶。脂质，尤其是必需脂肪酸和乙醇胺已被证明可促进细胞(包括成纤维细胞)生长。其储存能量并充当细胞膜的组成部分；其还有助于信号传导和传输。补充由化学成分定义的维生素和脂质可将无血清C1F细胞的VCD从约0.8x106-1.0x106个细胞/mL提高至1.5x106个细胞/mL。VCD根据实施例13中公开的方法进行测定。
接下来，我们添加痕量元素，以增加VCD和增殖率。譬如，众所周知，硒作为谷胱甘肽(GSH)合成酶的辅因子，可有助于自由基解毒。其他痕量元素如铜、锌和三羧酸，尽管其数量很少，但对于细胞生长和增殖而言均是必需的。微量营养素对于某些酶的功能和维持亦是必不可少的。对从康宁(Corning)购买的痕量元素A、B和C进行了测试。痕量A(Trace A)混合物包含规定浓度的CuSO4、ZnSO4、亚硒酸钠和柠檬酸铁。当与痕量A(Trace A)(JB-VLA)一同培养时，C1F细胞能够随时间的推移达到～2x106个细胞/mL或更高的VCD。有趣的是，痕量B(Trace B)和痕量C(Trace C)均对SFM中C1F鸡细胞的生长没有可观测到的影响。VCD根据实施例13中公开的方法进行测定。
实施例11：生长因子的减少
本实施例公开了SFM中生长因子的减少。将C1F细胞如实施例10中公开的那样进行培养，但通过缓慢减少添加至培养基中的生长因子的量以进行调整适应，从而最小化生长因子的添加。随着时间的推移，C1F细胞在不含EGF和FGF的培养基中，以类似于实施例10所示的VCD和增殖率成功生长。
减少ITSE的实验成功地将ITSE补充量减少了10倍，而不影响SFM中鸡细胞的生长和增殖。VCD根据实施例13中公开的方法进行测定。
实施例12：禽类细胞的大规模制造
使用无血清(C1F-SFM)和含血清培养基(C1F-SCM)对一次性使用的C1F细胞和规模高达1,000L的不锈钢生物反应器中的C1F细胞进行了多次大规模制造。本发明描述了无血清和含血清培养基。
随着发酵容器尺寸的增加，高压、混合时间、营养流、较低的O2水平和CO2积累以及剪切作用会抑制或阻止细胞生长或细胞裂解。随着发酵容器尺寸的高度增加，容器底部的压力会非常高，从而导致细胞裂解。禽类细胞可在大型发酵罐中培养，这是令人惊讶且出乎意料的结果。禽类细胞不具有保护细胞免受高压影响的保护性细胞壁。
一次性波袋(wavebag)生物反应器用于分批细胞培养模式或灌注模式。
对于分批细胞培养模式，来自5L摇瓶的培养物用于在无菌条件下接种50L摇动波袋(wavebag)，以得到所需分流比。在达到所需细胞密度后，将额外的培养基添加至波袋(wavebag)以达到所需分流比。此时总培养体积为50L。在所述50L波袋(wavebag)培养完成后，将两个波袋(wavebag)分批培养物的全部内容物用于接种200L不锈钢生物反应器。
对于用于生成500L生物反应器接种物的灌注波袋(wavebag)培养物，用来自5L摇瓶的培养物接种单个50L波袋(wavebag)生物反应器，并加入新鲜培养基以实现所需分流比。接种后，使细胞培养物生长1天，然后在第1天开始灌注流程。持续灌注预定量的时间，在灌注的最后一天，按照所需分流比转移细胞培养物并用于接种500L一次性生物反应器。
进行多次200L和1,000L不锈钢生物反应器培养以制造培养的鸡细胞。将上文讨论的波袋(wavebag)培养的内容物转移至200L生物反应器并将培养基添加至所述生物反应器以实现所需分流比。在培养期间，离线监测生物反应器培养物的pH、溶解氧、葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸、铵和渗透压水平。在培养过程中，收集样品以确证不存在微生物。
1,000L不锈钢和500L一次性使用生物反应器亦可采用抽取和填充方法运行。通过此流程，将所需量的生物反应器培养物，譬如，750L的1,000L生物反应器培养物或375L的500L生物反应器培养物收集到临时储存容器(一次性生物袋(BioBag))中，并立即将新鲜培养基添加至剩余的培养物中，使总体积恢复至1,000L或500L。在进行再填充操作的同时，将收集的细胞培养物浓缩以用于收获目的。一旦生物反应器重新填充至其所需体积，继续培养以达到所需细胞密度。抽取和填充程序可执行多次，最终收获采集整个培养物体积。
细胞收获定义为从生长培养基/液体中分离和收集细胞。通常，收获是通过离心并清洗残余培养基组分来完成。细胞可用任何清洗溶液清洗，通常是含有0.45％(w/v)NaCl的水。收获的产品，培养鸡，亦称为“细胞膏”，是指离心和清洗后产生的湿细胞团块。
常规获得远远超过200万个细胞/mL的细胞密度。
实施例13：减少乳酸生成
在细胞生长期间，代谢物(例如乳酸、氨、氨基酸中间体)蓄积已被证明在某些浓度下对细胞生长和生产力有害(Claudia Altamirano et al.,2006；Freund&Croughan,2018；Lao&Toth,1997；Pereira et al.,2018)。在分批补料过程中，乳酸蓄积导致培养物pH值降低，需要添加碱以将pH值维持在设定值或生理范围内。不利的是，添加碱会导致培养基的渗透压增加，并且已表明较高的渗透压水平会强烈抑制大多数细胞系的生长和蛋白质生成(Christoph Kuper et al.,2007；Kiehl et al.,2011；McNeil et al.,1999)。
乳酸蓄积的主要途径是由乳酸脱氢酶(LDH)催化的丙酮酸与乳酸的相互转化。在哺乳动物细胞中，研究表明LDH以带有亚基A或B的同源四聚体或异源四聚体形式存在，分别由LDHA或LDHB编码(Urbańska&Orzechowski,2019)。此外，已表明LDHA催化正向反应(丙酮酸到乳酸)，而LDHB催化逆向反应(乳酸到丙酮酸)。LDHA在Warburg效应中发挥关键作用，所述效应发生在细胞系中，这些细胞系不会通过柠檬酸循环驱动丙酮酸分解，即使在氧气存在的情况下也不会从丙酮酸生成乳酸。
草氨酸盐，丙酮酸盐的类似物，是一种强竞争性的LDHA抑制剂，通过引导大部分葡萄糖经由三羧酸(TCA)循环分解–一个更节能的过程，来阻止Warburg效应(Wang et al.,2019)。然而，此分子的使用可抑制细胞增殖，这是大多数工业哺乳动物细胞系早期阶段生成的关键因素(Kim et al.,2019；Wang et al.,2019)。
C1F细胞在悬浮培养中培养，并添加1.25％牛血清。测试了不同浓度的草氨酸钠：1mM、3mM、5mM、10mM、30mM、60mM、100mM和200mM，并测定了乳酸的生成、葡萄糖消耗、细胞生长速率和细胞密度。
在细胞培养期间，使用每日活细胞浓度和代谢物浓度计算比速率。比净生长率(μN)计算为使用方程式(1)在时间间隔t1至t2内VCD的变化：
Figure BDA0003503923680000321
比葡萄糖消耗率(qGluc)或比乳酸生成率(qLac)使用方程式(2)确定，其中P是葡萄糖或乳酸浓度：
qGluc或
Figure BDA0003503923680000322
活细胞密度(VCD)和活力通过台盼蓝排除法使用Vi-cell TM(Beckman Coulter)，从摇瓶细胞培养物每天取样1mL的样品进行测定。采用Bioprofile Flex分析仪(NovaBiomedical)测定气体和pH值，包括代谢物(葡萄糖、乳酸谷氨酰胺、谷氨酸、铵)浓度。使用OsmoPro多样品微渗透压计(Advanced Instruments)，其采用冰点技术，来测定渗透压。
用不同浓度的草氨酸钠(1mM、3mM、5mM和10mM)处理的C1F-SCM细胞，包括未处理的对照细胞，均使用重复摇瓶以分批模式培养3天。我们观察到，与对照条件相比，经10mM草氨酸盐处理的细胞的乳酸生成量减少了28％(p<0.05)，并且在第2天测试的其他浓度的草氨酸盐处理的细胞中乳酸生成量明显减少。此外，我们观察到草氨酸盐对第2天经草氨酸盐处理细胞中乳酸生成和葡萄糖消耗的浓度依赖性影响，即，草氨酸盐浓度增加导致乳酸生成量减少。其他控制参数均在可接受的生理范围内。
当在为期3天的分批细胞培养中使用更高浓度的草氨酸钠(10mM、15mM、20mM和30mM)进行草氨酸钠重复实验时，乳酸生成量以浓度依赖性方式降低，乳酸生成量降低了约52％。
我们继续为为期3天的分批培养进一步增加草氨酸盐的浓度(30mM、60mM、100mM和200mM)。正如预期的那样，在用草氨酸盐处理的细胞中观察到乳酸生成量的浓度依赖性降低。
为了进一步检测草氨酸盐在细胞培养中的作用是否与已存在的代谢副产物相似，我们使用新鲜培养基以1:3(v/v)分液(1/3用过的培养基和2/3新鲜培养基)对用30mM草氨酸盐处理的细胞进行传代。在培养中使用几天后，携带的培养基总是含有细胞消耗所产生的残留量(携带)代谢物。
用30mM草氨酸盐处理的C1F细胞在培养的第5天显示出持续的线性增殖，峰值为2.79x106个细胞/mL。对照培养物在培养的第3天达到峰值，为1.64x106个细胞/mL，此后滞后。因此，经草氨酸盐处理的培养物显示出最大活细胞密度显著增加约44％。尽管经草氨酸盐处理的细胞在第5天表现出更高的细胞密度，但与对照组相比，这些C1F-SCM细胞的蓄积乳酸生成量仍减少了约23％。此外，经草氨酸盐处理的C1F细胞显示出比葡萄糖消耗量(qGluc)降低。培养基的细胞活力和渗透压并未因添加草氨酸盐而受到损害。相对于未经草氨酸盐处理的对照，在培养的第3天和第5天之间，经草氨酸盐处理的培养物的铵蓄积量激增。对于对照培养物，培养基的pH值为约7.0，而对于经草氨酸盐处理的C1F-SCM细胞，培养基的pH值为约7.2。
经草氨酸盐处理的细胞的细胞密度增加是令人惊讶且出乎意料的。使用草氨酸盐对癌细胞进行的研究显示，其可抑制细胞增殖。草氨酸盐对细胞增殖的抑制作用可能是由于癌细胞依赖糖酵解途径作为能量来源，因为其代表了比经由TCA循环更快的ATP生成途径(Kim et al.,2019；Lu et al.,2014)。
实施例13：替代糖类
我们评估了替代糖类(甘露糖、果糖和半乳糖)对在含有1.25％FBS的悬浮培养物中生长的内部C1F鸡细胞生长和代谢的影响。比净生长率(μN)和比葡萄糖消耗率(qGluc)或比乳酸生成率(qLac)根据实施例12中公开的方程式1或2计算得到。
如本发明所述的悬浮培养物使用从第0天添加的3g/L的相应糖类进行培养，并以分批模式培养至第3天。在取样后的第3天，将另外3g/L的每种糖添加至各自的烧瓶。到第3天，在细胞密度达到峰值时，使用葡萄糖作为碳源的烧瓶具有最高的活细胞密度(～2.805x106个细胞/mL)，其次是含有甘露糖的烧瓶(～2.40x106个细胞/mL)，然后是果糖(1.935x106个细胞/mL)，最后是半乳糖(0.915x106个细胞/mL)。
虽然甘露糖饲喂的烧瓶在第2天具有较低的总乳酸生成量，但当归一化到第3天VCD时，与用葡萄糖培养的细胞相比，所生成的乳酸显示出1.7％的轻微增加。
由于我们观察到C1F细胞可利用果糖作为碳源，因此我们评估了不同起始果糖浓度的影响。在一个实验中，从第0天起将6g/L的果糖添加至一组重复烧瓶中，并且从第0天开始将3g/L的果糖添加至另一组重复烧瓶中。在用3g/L果糖开始的烧瓶中，在其中一个重复的第1天和另一个重复的第2天添加额外的3g/L果糖。总体而言，这些烧瓶在第2天表现出相似的细胞密度和生长速率曲线，尽管从第0天开始用6g/L果糖培养的烧瓶显示乳酸蓄积量从第1天略微增加，到第3天高出36％。
我们接下来评估了葡萄糖、甘露糖和果糖的组合对生长和乳酸生成的影响。采用实验设计(DOE)方法，进行了17个批量摇瓶运行，以评估作为悬浮鸡C1F细胞能源的葡萄糖、甘露糖和果糖浓度的不同组合。所使用的实验设计包括3个因子(葡萄糖、甘露糖和果糖)及4个水平(0g/L、0.5g/L、1.5g/L和3.0g/L)。到第3天，具有基础碳源3.0葡萄糖/0.5果糖/0.5甘露糖的细胞具有最高的活细胞密度(VCD)，为3.8x106个细胞/mL，其次是3.0葡萄糖/0.0果糖/3.0甘露糖以及3.0葡萄糖/3.0果糖/3.0甘露糖。此外，到第4天，3.0葡萄糖/3.0果糖/3.0甘露糖烧瓶的VCD从3.54x106个细胞/mL增加至3.78x106个细胞/mL。有趣的是，上述烧瓶均显示出与对照烧瓶相似的乳酸分布曲线。
为了最大化VCD，DOE分析表明葡萄糖的存在非常显著(p值＝0.001)。随后是甘露糖的存在。此外，DOE分析表明，为了最大化VCD，需要优化最小的乳酸、葡萄糖和甘露糖组合。此外，果糖组合表现出最低的乳酸蓄积水平和较低的VCD。与具有更多葡萄糖和一定量甘露糖的培养物相比，具有最低葡萄糖量(或无葡萄糖或低/无甘露糖)的培养物表现不佳。同时，具有3.0g/L葡萄糖和至少≥1.5g/L甘露糖的三个烧瓶(3葡萄糖/1.5果糖/3甘露糖、3.0葡萄糖/0.0果糖/3.0甘露糖和3.0葡萄糖/3.0果糖/3.0甘露糖)表现出葡萄糖消耗缓慢。
由于我们发现了培养物中存在葡萄糖的重要性以及甘露糖对细胞培养寿命的额外好处，因此我们使用DOE筛选了不同的葡萄糖/甘露糖比率。所使用的DOE设计包括2个因子(葡萄糖和甘露糖)和4个水平(0.5g/L、1.5g/L、3.0g/L和4.0g/L)。到细胞培养的第4天，我们观察到与对照(仅3.0g/L葡萄糖)相比，含有3.0g/L葡萄糖和额外1.5-3.0g/L甘露糖的烧瓶表现出最高的VCD(与对照相比增加了约10-25％)并延长了细胞培养寿命。含有3.0g/L葡萄糖和1.5g/L甘露糖的烧瓶的VCD为约3x106个细胞/mL，而含有3.0g/L葡萄糖和不含甘露糖的对照烧瓶的VCD为约2.5x106个细胞/mL。
实施例14:由培养的禽类细胞制备的鸡皮
使用根据本发明教导制备的培养的禽类细胞，来制备基于细胞培养的鸡皮产品。鸡皮产品通过将10％-60％湿细胞膏、介于80％-40％之间的水和介于0.1.％-25％之间的淀粉、改性淀粉或亲水胶体混合制备得到。将成分混合在一起并加热至65℃以凝固淀粉。然后将混合物薄薄地铺在片材上并于120℃-160°F下蒸直至混合物胶凝，通常约20分钟。取出凝胶产物并使其冷却至室温。将冷却的凝胶产品破碎成碎片并于120℃-160°F下干燥并呈褐色直至变干，从而制备基于细胞培养的鸡皮产品。通常，干燥时间在4-12小时之间。
基于细胞培养的鸡皮产品具有来自农场养殖或家畜动物的鸡皮的深鲜味特征和口感。在口味测试中，一些受试者更喜欢基于细胞培养的鸡皮产品的味道，而非农场养殖或家畜鸡的皮。
上述实施方案和实施例旨在仅是说明性目的而非限制性的。本领域技术人员将认识到或将能够仅使用常规实验来确定特定化合物、材料和程序的许多等同物。所有此类等同物均被认为在本发明范围内并被所附权利要求所涵盖。
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Claims (60)

1.体外生成禽类成纤维细胞食品的方法，所述方法包含以下步骤：
a.在能够维持禽类成纤维细胞的生长培养基中体外培养所述禽类成纤维细胞群体；
b.回收所述禽类成纤维细胞；和
c.将所述回收的禽类成纤维细胞配制成可食用食品。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生长培养基包含至少10％胎牛血清。
3.根据权利要求1所述的方法，其包含在含有至少10％胎牛血清的培养基中使所述禽类成纤维细胞群体生长，然后在回收所述细胞之前将所述培养基的胎牛血清降低至小于2％。
4.根据权利要求3所述的方法，其中在回收所述细胞之前将胎牛血清降低至0％。
5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其进一步包含修饰所述生长培养基以优化来自细胞信号传导通路(cell signaling pathway)的至少一种基因的表达，所述细胞信号传导通路选自由以下组成的组：蛋白酶体、类固醇生物合成、氨基酸降解、氨基酸生物合成、药物代谢、粘着斑、细胞周期、MAPK信号传导、谷胱甘肽代谢、TGF-β、吞噬体、萜类化合物生物合成、DNA复制、糖酵解、糖异生、蛋白质输出、丁酸代谢、以及酮体的合成和降解。
6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其进一步包含针对细胞信号传导通路的基因表达监测其中生成禽类成纤维细胞阶段。
7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其进一步包含根据从基因表达的所述监测获得的数据，在细胞生成的每个阶段调整所述培养基。
8.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中所述禽类成纤维细胞群体基本上是纯的。
9.根据前述权利要求任一项所述的方法，其进一步包含通过向所述生长培养基添加足以诱导一种或多种脂质蓄积的量的一种或多种化合物或从所述生长培养基去除足以诱导一种或多种脂质蓄积的量的一种或多种化合物，从而诱导禽类成纤维细胞蓄积脂质。
10.根据前述权利要求任一项所述的方法，其进一步包含从所述生长培养基分离所述禽类成纤维细胞或从生物反应器或支架移出所述细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述禽类成纤维细胞通过离心、过滤、絮凝、凝结、挤压、和/或重力或其组合进行分离。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述过滤类型是微滤或超滤、或其组合。
13.根据权利要求10所述的方法，其进一步包含酶促或机械分离所述禽类成纤维细胞。
14.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述方法在悬浮培养系统中以分批培养、补料分批培养、半连续(填充和抽取)培养、连续培养、或灌注培养、或其某种组合的方式进行。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述悬浮培养达到0.25x 106个细胞/ml、介于0.5x106个细胞/ml和1.0x 106个细胞/ml之间、介于1.0x 106个细胞/ml和2.0x 106个细胞/ml之间、介于2.0x 106个细胞/ml和3.0x 106个细胞/ml之间、介于3.0x 106个细胞/ml和4.0x 106个细胞/ml之间、介于4.0x 106个细胞/ml和5.0x 106个细胞/ml之间、介于5.0x106个细胞/ml和6.0x 106个细胞/ml之间、介于6.0x 106个细胞/ml和7.0x 106个细胞/ml之间、介于7.0x 106个细胞/ml和8.0x 106个细胞/ml之间、介于8.0x 106个细胞/ml和9.0x106个细胞/ml之间、介于9.0x 106个细胞/ml和10x 106个细胞/ml之间、介于10x 106个细胞/ml和15.0x 106个细胞/ml之间、介于15x 106个细胞/ml和20x 106个细胞/ml之间、介于20x 106个细胞/ml和25x 106个细胞/ml之间、介于25x 106个细胞/ml和30x 106个细胞/ml之间、介于30x 106个细胞/ml和35x106个细胞/ml之间、介于35x 106个细胞/ml和40x 106个细胞/ml之间、介于40x 106个细胞/ml和45x 106个细胞/ml之间、介于45x 106个细胞/ml和50x 106个细胞/ml之间、介于50x 106个细胞/ml和55x 106个细胞/ml之间、介于55x 106个细胞/ml和60x 106个细胞/ml之间、介于60x 106个细胞/ml和65x 106个细胞/ml之间、介于70x 106个细胞/ml和75x 106个细胞/ml之间、介于75x 106个细胞/ml和80x 106个细胞/ml之间、介于85x 106个细胞/ml和90x 106个细胞/ml之间、介于90x 106个细胞/ml和950x 106个细胞/ml之间、介于95x 106个细胞/ml和100x 106个细胞/ml之间、介于100x 106个细胞/ml和125x 106个细胞/ml之间、或介于125x 106个细胞/ml和150x 106个细胞/ml之间的细胞密度。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述悬浮培养系统可在至少500升(L)、1,000L、2,000L、2,500L、5,000L、10,000L、25,000L、50,000L、100,000L、200,000L、或500,000L的容器中进行。
17.根据前述权利要求任一项所述的方法，其进一步包含通过生长因子类、脂肪酸类、蛋白质类、元素类、小分子类、定向进化、基因工程、培养基组成、生物反应器设计、和/或支架设计中的一种或多种，改善在任何培养条件下禽类成纤维细胞的以下中的一种或多种：维持、增殖、分化、脂质蓄积、脂质含量、纯化和/或收获效率、生长速率、细胞密度、细胞重量、抗污染性、禽类成纤维细胞特异性基因表达和/或蛋白质分泌、剪切敏感性、风味、质地、颜色、气味、香气、味觉质量、营养质量、最小化的生长抑制性副产物分泌、和/或最小化的培养基需求。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述脂肪酸包含十八碳四烯酸和亚麻酸。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述生长因子包含胰岛素生长因子、成纤维细胞生长因子、和表皮生长因子。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述蛋白质包含转铁蛋白。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述元素包含硒。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述小分子包含乙醇胺。
23.根据权利要求17所述的方法，其中所述小分子是乳酸脱氢酶抑制剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述乳酸脱氢酶抑制剂选自由以下组成的组：草氨酸盐、培黄素(galloflavin)、棉酚、喹啉3-磺胺类(quinoline 3-dulfonamides)、N-羟基吲哚类抑制剂、和FX11。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述乳酸脱氢酶抑制剂是草氨酸盐。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述生长培养基中草氨酸盐的浓度选自由以下组成的组：1mM-500mM、1mM-400mM、1mM-300mM、1mM-250mM、1mM-200mM之间、1mM-175mM、1mM-150mM、1mM-100mM、1mM-50mM、和1mM-25mM。
27.根据权利要求1-26任一项所述的方法，其中所述生长培养基包含选自由葡萄糖和甘露糖组成的组的糖。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述生长培养基包含葡萄糖或甘露糖。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述生长培养基中葡萄糖和/或甘露糖的量为1g/L-10g/L、1g/L-9g/L、1g/L-8g/L、1g/L-9g/L、1g/L-8g/L、1g/L-7g/L、1g/L-6g/L、1g/L-5g/L、1g/L-4g/L、1g/L-3g/L、或1g/L-2g/L。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述生长培养基中葡萄糖的量为1g/L-10g/L、1g/L-9g/L、1g/L-8g/L、1g/L-9g/L、1g/L-8g/L、1g/L-7g/L、1g/L-6g/L、1g/L-5g/L、1g/L-4g/L、1g/L-3g/L、或1g/L-2g/L，和所述生长培养基中甘露糖的量为1g/L-10g/L、1g/L-9g/L、1g/L-8g/L、1g/L-9g/L、1g/L-8g/L、1g/L-7g/L、1g/L-6g/L、1g/L-5g/L、1g/L-4g/L、1g/L-3g/L、或1g/L-2g/L。
31.根据权利要求1所述的方法，其中所述可食用食品包含：
细胞膏(cell paste)，所述细胞膏含量为至少90重量％、80重量％、75重量％、70重量％、65重量％、60重量％、50重量％、或25重量％，和其中所述细胞膏内容物是由体外生长的禽类成纤维细胞制成。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述可食用食品进一步包含绿豆蛋白，所述绿豆蛋白含量为至少5重量％。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述可食用食品进一步包含脂肪，所述脂肪含量为至少5重量％。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述可食用食品进一步包含水，所述水含量为至少20重量％。
35.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述食品类似于禽肉块、禽柳(aviantenders)、禽胸肉、禽牡蛎、禽足、禽翅、禽香肠、禽饲料、和禽皮。
36.根据权利要求1所述的方法，其中将所述回收的禽类成纤维细胞配制成可食用食品进一步包含在调理水(conditioned water)中使植物蛋白分离物水合以生成水合植物蛋白。
37.根据权利要求36所述的方法，其中将所述回收的禽类成纤维细胞配制成可食用食品进一步包含将细胞膏添加至所述水合植物蛋白。
38.根据权利要求1所述的方法，其中将所述回收的禽类成纤维细胞配制成可食用食品进一步包含：
a.用磷酸盐类调节水以制备调理水；
b.用所述调理水使植物蛋白分离物水合以生成水合植物蛋白；
c.使细胞膏与水合植物蛋白接触以生成细胞和蛋白质混合物；
d.分步加热所述细胞和蛋白质混合物，其中所述步骤包含下列至少之一：
i.将所述细胞和蛋白质混合物的所述温度斜升至40-65℃之间的温度；
ii.将所述细胞和蛋白质混合物的所述温度保持在40-65℃之间的温度至少15分钟；
iii.将所述细胞和蛋白质混合物的所述温度斜升至60-85℃之间的温度以制备预烹饪产品；
iv.任选地，将所述细胞和蛋白质混合物冷却至5-15℃之间温度的温度以制备预烹饪产品；
e.任选地，在步骤(i)、(ii)、(iii)、(iv)中添加油或将油添加至所述预烹饪产品；和
f.任选地，烹饪所述预烹饪产品以制备所述禽类食品。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述植物蛋白分离物选自由豆类蛋白分离物组成的组。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述豆类蛋白分离物是绿豆蛋白分离物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中将所述回收的禽类成纤维细胞配制成可食用食品进一步包含分步加热所述细胞和蛋白质混合物，其中所述步骤包含下列至少之一：
a.将所述细胞和蛋白质混合物的所述温度斜升至40-65℃之间的温度；
b.将所述细胞和蛋白质混合物的所述温度保持至少15分钟；
c.将所述细胞和蛋白质混合物的所述温度斜升至60-85℃之间的温度。
42.根据权利要求38-41任一项所述的方法，其中步骤(i)进一步包含向所述细胞和蛋白质混合物中加入调味料。
43.根据权利要求38-42任一项所述的方法，其中步骤(ii)进一步包含添加肽交联酶。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述交联酶选自由以下组成的组：转谷氨酰胺酶、分选酶、枯草杆菌蛋白酶、酪氨酸酶、漆酶、过氧化物酶、和赖氨酰氧化酶。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述转谷氨酰胺酶以介于0.0001重量％-0.025重量％之间、介于0.0001重量％-0.020重量％之间、介于0.0001重量％-0.0175重量％之间、介于0.0001重量％-0.0150重量％之间、介于0.0001重量％-0.0125重量％之间、介于0.0001重量％-0.01重量％之间、介于0.0001重量％-0.0075重量％之间、介于0.0001重量％-0.005重量％之间、介于0.0001重量％-0.0025重量％之间、介于0.0001重量％-0.002重量％之间、介于0.0001重量％-0.0015重量％之间、介于0.0001重量％-0.001重量％之间、或介于0.0001重量％-0.00015重量％之间的浓度添加。
46.根据权利要求38所述的方法，其中步骤(iii)进一步包含添加油。
47.根据权利要求1所述的方法，其中将所述回收的禽类成纤维细胞配制成可食用食品进一步包含将所述细胞和蛋白质混合物冷却至5-10℃之间的温度。
48.根据权利要求1所述的方法，其中将所述回收的禽类成纤维细胞配制成可食用食品进一步包含在步骤(i)、(ii)、(iii)或(iv)中添加油以制成预烹饪产品。
49.根据权利要求48所述的方法，其进一步包含下列至少之一：
a.煎炸所述预烹饪产品；
b.烘焙所述预烹饪产品；
c.烧烤所述预烹饪产品；和
d.冷冻所述预烹饪产品。
50.由体外生长的禽类成纤维细胞制成的供食用的禽类产品的制备方法，所述方法包含：
a.用磷酸盐类调节水；
b.用所述调理水使豆类蛋白分离物水合以生成水合豆类蛋白；
c.将细胞膏加至所述水合豆类蛋白以生成细胞和蛋白质混合物；
d.分步加热所述细胞和蛋白质混合物，其中所述步骤包含下列至少之一：
i.将所述细胞和蛋白质混合物的所述温度斜升至40-65℃之间的温度；
ii.将所述细胞和蛋白质混合物的所述温度保持至少15分钟；
iii.将所述细胞和蛋白质混合物的所述温度斜升至60-85℃之间的温度；
e.将所述细胞和蛋白质混合物冷却至5-15℃之间的温度；和
f.向所述细胞和蛋白质混合物中添加油以制成预烹饪产品；和
g.烹饪所述预烹饪产品以制备所述可食用食品。
51.根据权利要求50所述的方法，其进一步包含下列至少之一：
a.煎炸所述预烹饪产品；
b.烘焙所述预烹饪产品；
c.烧烤所述预烹饪产品；和
d.冷冻所述预烹饪产品。
52.根据权利要求50所述的方法，其中步骤(i)进一步包含向所述水中加入调味料。
53.根据权利要求50所述的方法，其中步骤(ii)进一步包含添加肽交联酶。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述肽交联酶选自由以下组成的组：转谷氨酰胺酶、分选酶、枯草杆菌蛋白酶、酪氨酸酶、漆酶、过氧化物酶、和赖氨酰氧化酶。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述肽交联酶是转谷氨酰胺酶。
56.根据权利要求50所述的方法，其中步骤(iii)进一步包含添加油。
57.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述细胞包含原代禽类成纤维细胞。
58.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述细胞包含继代禽类成纤维细胞。
59.食品，其由前述权利要求任一项所述的方法制成。
60.由禽类成纤维细胞制成的食品，其包含：
a.细胞膏，所述细胞膏含量为至少25重量％，和其中所述细胞膏由体外生长的禽类成纤维细胞制成；
b.绿豆蛋白，所述绿豆蛋白含量为至少15重量％；
c.脂肪，所述脂肪含量为至少1重量％；和
d.水，所述水含量为至少20重量％。
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