TW202128980A - Ace阻礙用或血壓上升抑制用之組成物、其製造方法、酵素劑、多核苷酸、及形質轉換體 - Google Patents
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Abstract
本發明之課題在於提供一種含有ACE阻礙肽之組成物、其製造方法、含有能夠生成上述肽之合成酵素之酵素劑、具有上述合成酵素之基因之多核苷酸、及形質轉換體。
本發明之酵素劑含有合成酵素,該合成酵素具有序列編號1或與其類似之胺基酸序列,且具有選自Arg-Asn連接酶、Arg-Gln連接酶、Asn-Arg連接酶、及Gln-Arg連接酶之酵素活性。本發明之上述組成物之製造方法係使上述合成酵素進行酵素反應,生成Arg-Asn、Arg-Gln、Asn-Arg、及/或Gln-Arg之ACE阻礙二肽。本發明之多核苷酸具有序列編號2或與其類似之鹼基序列。本發明之形質轉換體係微生物利用上述多核苷酸被形質轉換而成者。本發明之上述組成物之製造方法係培養上述形質轉換體而生成上述ACE阻礙二肽。
Description
本發明係關於一種含有具有血管收縮素I轉化酶(Angiotensin I-Converting Enzyme:以下稱為「ACE」)阻礙活性之肽的ACE阻礙用或血壓上升抑制用之組成物、其製造方法、含有能夠生成上述肽之合成酵素之酵素劑、具有上述合成酵素之基因之多核苷酸、及導入有上述基因之形質轉換體。
心血管病(腦中風或心肌梗塞等)中最大之危險因素為高血壓。若能夠提供可預防或改善高血壓之食物,則會使健康壽命增加、醫療費用降低。例如,非專利文獻3中報告了芝麻肽具有ACE阻礙活性之內容。ACE係使血管收縮素I水解而生成血管收縮素II之酵素。血管收縮素II促進使血壓上升之醛固酮之分泌。因此,若藉由阻礙ACE而使得血管收縮素II之生成量減少,則血壓之上升就會被抑制。
又,眼蟲(屬名:Euglena、又名:綠蟲藻)係兼具進行鞭毛運動之動物性質與進行光合之植物性質的獨特之單細胞生物。眼蟲之細胞(以下稱為「眼蟲細胞」)能夠在多種營養條件下生長,並能夠蓄積各種營養素。因此,進行了欲將眼蟲細胞活用作食糧等生物資源之各種研究開發。例如,專利文獻1所記載之降血壓劑係利用含有大量二十二碳六烯酸(以下稱為「DHA」)之培養基培養眼蟲細胞,採集將培養後之培養基進行離心分離而沈澱之眼蟲細胞並使其乾燥而獲得的細胞粉末。專利文獻1中報告有如下內容:將摻合有該降血壓劑之飼料投餵腦中風易發病性高血壓自然發病大鼠進行飼養,結果在該大鼠中抑制了血壓之上升。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]日本特開平8-133980號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1]E. S. Kempner及其他1人,"The Molecular Biology of Euglena gracilis. III. General Carbon Metabolism", Biochemistry, 1965, volume 4, issue 12, pp.2735-2739
[非專利文獻2]E. S. Kempner及其他1人,"The Molecular Biology of Euglena gracilis IX. Amino Acid pool Composition", The Journal of Protozoology, 1974, volume 21, issue 2, pp.363-367
[非專利文獻3]Daisuke Nakano及其他15人,"Antihypertensive Effect of Angiotensin I-Converting Enzyme Inhibitory Peptides from a Sesame Protein Hydrolysate in Spontaneously Hypertensive Rats", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2006, volume 70, issue 5, pp.1118-1126
[非專利文獻4]Gietz RD及其他1人,"Transformation of yeast by lithium acetate/single - stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.", Methods in enzymology, 2002, volume 350, pp.87-96
[非專利文獻5]M. Cramer及其他1人,Arch. Mikrobiol., 1952, volume 17, pp.384-402
[非專利文獻6]J. A. Schiff及其他2人,Methods Enzymol., 1971, volume 23, pp.143-162
[非專利文獻7]L. E. Koren及其他1人,The Journal of Protozoology, 1967, volume 14, supplement, p.17
[非專利文獻8]Yasuhito Shomura及其他9人,"Structural and enzymatic characterization of BacD, an L-amino acid dipeptide ligase from Bacillus subtilis", Protein Science, 2012, volume 21, issue 5, pp.707-716
[非專利文獻9]Francis C. Neuhaus, "The Enzymatic Synthesis of D-Alanyl-D-alanine I. PURIFICATION AND PROPERTIES OF D-ALANYL-D-ALANINE SYNTHETASE", The Journal of Biological Chemistry, 1962, Volume 237, No.3, pp.778-786
[發明所欲解決之課題]
非專利文獻1中報告有:在眼蟲細胞中生成L-甲硫胺酸或L-精胺酸等游離胺基酸。又,已知若攝取DHA或二十碳五烯酸等n-3系之多元不不飽和脂肪酸(以下稱為「n-3系PUFA」)或L-甲硫胺酸等含硫胺基酸,則能夠預防高血壓性疾病。亦已知L-精胺酸具有ACE阻礙活性。根據該等見解,以往之本行業者考慮專利文獻1中報告之血壓上升抑制作用可能係以眼蟲細胞中蓄積之n-3系PUFA或游離胺基酸作為有效成分而發揮之作用。
另一方面,非專利文獻2中報告有如下內容:眼蟲細胞可蓄積分子內具有精胺酸殘基之肽。本案之發明者等人(以下稱為「本發明者等人」)反覆研究是否能夠將該肽有效活用於蛋白源以外之用途。認為該肽係於眼蟲細胞中生成之天然物,因此混合存在胺基酸序列不同之多種多樣之肽。以往,幾乎不知道作為眼蟲細胞中蓄積之分子內具有精胺酸殘基之肽,具體混合存在具有何種胺基酸序列之肽。本發明者等人想到:期望像從芝麻中發現芝麻肽般,從眼蟲細胞中蓄積之多種多樣之肽中發現具有ACE阻礙活性之肽。又,想到:更期望從眼蟲細胞之染色體DNA中發現能夠生成具有ACE阻礙活性之肽的合成酵素之基因,使用該合成酵素或其基因或眼蟲等微生物,高效率地生成上述肽,從而能夠量產容易預防或改善高血壓之食品組成物。
因此,本發明之課題在於從眼蟲細胞發現具有ACE阻礙活性之肽及能夠生成上述肽之合成酵素之基因,提供一種含有上述肽之ACE阻礙用或血壓上升抑制用之組成物、上述組成物之製造方法、含有上述合成酵素之酵素劑、具有上述基因之多核苷酸、及導入有上述多核苷酸之形質轉換體。
[解決課題之技術手段]
為了解決前述課題,本發明之酵素劑係一種含有二肽合成酵素之酵素劑,上述二肽合成酵素具有選自由以下(a)、(b)、以及(c)所組成之群中之1種多肽之胺基酸序列:(a)由序列編號1所記載之胺基酸序列構成之多肽;(b)由相對於序列編號1所記載之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列構成之多肽;(c)由在序列編號1所記載之胺基酸序列中置換、插入、缺失、及/或附加1個以上且20個以下之胺基酸殘基而成之胺基酸序列構成的多肽;上述二肽合成酵素具有選自由L-精胺醯基-L-天冬醯胺酸(Arg-Asn)連接酶活性、L-精胺醯基-L-麩醯胺酸(Arg-Gln)連接酶活性、L-天冬醯胺醯基-L-精胺酸(Asn-Arg)連接酶活性、及L-麩胺醯基-L-精胺酸(Gln-Arg)連接酶活性所組成之群中之1種以上之酵素活性。
本發明之組成物之製造方法係一種ACE阻礙用或血壓上升抑制用之組成物之製造方法,其包括如下步驟:準備本發明之酵素劑;及在選自由L-精胺酸(Arg)及其鹽所組成之群中之1種以上之化合物、以及選自由L-天冬醯胺酸(Asn)、L-麩醯胺酸(Gln)、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之化合物、以及上述酵素劑之存在下,使上述二肽合成酵素進行酵素反應,生成具有血管收縮素I轉化酶(ACE)阻礙活性之二肽化合物,該二肽化合物係選自由Arg-Asn、Arg-Gln、Asn-Arg、Gln-Arg、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之化合物。
本發明之多核苷酸係一種具有編碼二肽合成酵素之鹼基序列之多核苷酸,上述編碼二肽合成酵素之鹼基序列具有選自由以下(d)、(e)、(f)、以及(g)所組成之群中之1種多核苷酸之鹼基序列:(d)由序列編號2所記載之鹼基序列構成之多核苷酸;(e)由相對於序列編號2所記載之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列構成之多核苷酸;(f)由在序列編號2所記載之鹼基序列中置換、插入、缺失、及/或附加1個以上且20個以下之鹼基而成之鹼基序列構成的多核苷酸;(g)在嚴格(stringent)之條件下與DNA雜交的多核苷酸,該DNA係由與序列編號2所記載之鹼基序列互補之鹼基序列構成;上述編碼二肽合成酵素之鹼基序列係編碼具有選自由Arg-Asn連接酶活性、Arg-Gln連接酶活性、Asn-Arg連接酶活性、及Gln-Arg連接酶活性所組成之群中之1種以上之酵素活性之酵素的鹼基序列。
本發明之重組載體係一種包含本發明之多核苷酸之重組載體。
本發明之形質轉換體係一種微生物利用本發明之多核苷酸或本發明之重組載體被形質轉換而成之形質轉換體。
於本發明之形質轉換體中,上述微生物可為眼蟲或酵母。
本發明之套組係一種具有選自由本發明之酵素劑、本發明之多核苷酸、本發明之重組載體、及本發明之形質轉換體所組成之群中之1種以上的套組。
或者,本發明之組成物之製造方法係一種ACE阻礙用或血壓上升抑制用之組成物之製造方法,其包括如下步驟:準備本發明之形質轉換體、及含有上述形質轉換體能夠進行氮同化之氮源之培養基;及在上述培養基之存在下培養上述形質轉換體,生成具有ACE阻礙活性之二肽化合物,該二肽化合物係選自由Arg-Asn、Arg-Gln、Asn-Arg、Gln-Arg、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之化合物。
於本發明之組成物之製造方法中,上述氮源可包含選自由Arg及其鹽所組成之群中之1種以上之化合物、以及選自由Asn、Gln、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之化合物。
本發明之組成物係一種ACE阻礙用或血壓上升抑制用之組成物,藉由包含選自由本發明之形質轉換體、在含有上述形質轉換體能夠進行氮同化之氮源之培養基中被培養之該形質轉換體、該形質轉換體之乾燥物、及該形質轉換體之細胞破碎物所組成之群中之1種以上,從而含有具有ACE阻礙活性之二肽化合物,該二肽化合物係選自由Arg-Asn、Arg-Gln、Asn-Arg、Gln-Arg、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之化合物。
本發明之組成物可含有上述二肽合成酵素或其變性蛋白質。
於本發明之組成物中,上述二肽化合物之含量可為0.10 mg/L以上。
或者,本發明之組成物係一種ACE阻礙用或血壓上升抑制用之組成物,其係由含有源自眼蟲細胞之分子質量未達4.0 kDa之肽的水溶性成分之組分構成或包含上述組分而成之組成物,上述組成物不含源自上述細胞之脂質、源自該細胞之分子質量為4.0 kDa以上之蛋白質、及源自該細胞之分子質量為4.0 kDa以上之多肽,源自上述細胞之分子質量未達4.0 kDa之肽包括具有ACE阻礙活性之二肽化合物,該二肽化合物係選自由Arg-Asn、Arg-Gln、Asn-Arg、Gln-Arg、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之化合物。
[發明之效果]
根據本發明之組成物,由於係選自由Asn-Arg、Arg-Asn、Gln-Arg、Arg-Gln、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之化合物的二肽化合物具有強於L-精胺酸之ACE阻礙活性,故而能夠作為ACE阻礙用或血壓上升抑制用進行攝取。根據本發明之組成物之製造方法,能夠製造本發明之組成物。根據本發明之酵素劑,含有二肽合成酵素,能夠用於生成上述二肽化合物。根據本發明之多核苷酸,具有編碼上述二肽合成酵素之胺基酸序列之鹼基序列。根據本發明之形質轉換體,能夠活用於製造本發明之酵素劑時或製造本發明之組成物時。
<酵素劑>
本說明書中,關於游離胺基酸或其鹽,分別將L-精胺酸亦稱為「Arg」,將L-天冬醯胺酸亦稱為「Asn」,將L-天冬胺酸亦稱為「Asp」,將L-麩醯胺酸亦稱為「Gln」,將L-麩胺酸亦稱為「Glu」,將能夠以游離胺基酸或其鹽為受質而合成二肽之酵素亦稱為「二肽合成酵素」。本說明書中,關於游離之二肽或其鹽,分別將L-精胺醯基-L-天冬醯胺酸亦稱為「Arg-Asn」,將L-精胺醯基-L-麩醯胺酸亦稱為「Arg-Gln」,將L-天冬醯胺醯基-L-精胺酸亦稱為「Asn-Arg」,將L-麩胺醯基-L-精胺酸亦稱為「Gln-Arg」,該等4種二肽各自之式中,「-」表示羧基與α位之胺基之肽鍵。本說明書中,分別將能夠以Arg與Asn為受質而合成Arg-Asn之連接酶的酵素活性亦稱為「Arg-Asn連接酶活性」,將具有Arg-Asn連接酶活性之多肽亦稱為「Arg-Asn連接酶」,將能夠以Arg與Gln為受質而合成Arg-Gln之連接酶的酵素活性亦稱為「Arg-Gln連接酶活性」,將具有Arg-Gln連接酶活性之多肽亦稱為「Arg-Gln連接酶」,將能夠以Asn與Arg為受質而合成Asn-Arg之連接酶的酵素活性亦稱為「Asn-Arg連接酶活性」,將具有Asn-Arg連接酶活性之多肽亦稱為「Asn-Arg連接酶」,將能夠以Gln與Arg為受質而合成Gln-Arg之連接酶的酵素活性亦稱為「Gln-Arg連接酶活性」,將具有Gln-Arg連接酶活性之多肽亦稱為「Gln-Arg連接酶」。
本發明者等人在完成本發明之過程中,分析從眼蟲細胞萃取之水溶性成分(以下稱為「眼蟲水性萃取物」)之組成,發現:(i)眼蟲水性萃取物中含有Arg-Gln或Arg-Asn,亦有含有Gln-Arg或Asn-Arg之情況。本發明者等人意外地發現:(ii)上述(i)中列舉之4種二肽各自具有強於Arg之ACE阻礙活性。本發明者等人亦發現:(iii)眼蟲細胞中有以最大約0.5 mmol/L之高濃度蓄積Arg-Gln或Arg-Asn之情況;(iv)眼蟲之染色體DNA中包含編碼能夠生成上述(i)中列舉之4種二肽之二肽合成酵素的鹼基序列。就本發明者等人所知,在本案之優先權日以前,未找到論及上述(i)至上述(iv)中列舉之見解之報告。因此,認為上述(i)至上述(iv)中列舉之見解均在本案之優先權日以前未被本行業者所知曉。以下,於本說明書中,將選自由Arg-Asn、Arg-Gln、Asn-Arg、Gln-Arg、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之具有ACE阻礙活性之化合物亦稱為「本二肽化合物」。本二肽化合物之鹽只要為藥理學上容許之鹽即可。作為本二肽化合物之鹽,例如可列舉鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽等。就不易析出而容易操作之觀點而言,本二肽化合物之鹽較佳為鈉鹽或鉀鹽。
基於上述(i)至(iv)中列舉之見解,本發明者等人考慮如下。眼蟲細胞具有在氮源(眼蟲細胞能夠進行氮同化之1種或2種以上之氮化合物)較多之環境下,在細胞內蓄積分子內具有複數個氮原子之胺基酸的特性(參照非專利文獻1與非專利文獻2)。例如眼蟲細胞具有容易將銨鹽納入至細胞內,而生成分子內具有4個氮原子之Arg、或分子內具有2個氮原子之Asn或Gln的特性。認為該特性作為藉由儘可能多地在細胞內以該等胺基酸之形態蓄積作為營養素之氮原子從而保障饑餓環境下之眼蟲之生存力的特性,係在進化之過程中藉由自然選擇(自然淘汰)而被眼蟲細胞所具備。又,認為眼蟲細胞具有為了使在其細胞內生成之Arg、Asn、及Gln儘可能地緊湊(compact)化,減少細胞內密度,降低滲透壓,而轉化為二肽之Arg-Gln或Arg-Asn之形態在細胞內蓄積的特性。本發明者等人發現之關於二肽合成酵素使用粗酵素之實驗中,對Arg、Asn、及Gln之3種胺基酸確認到受質特異性,藉由添加ATP(adenosine triphosphate,腺苷三磷酸)而確認到促進反應。因此,認為本發明者等人發現之二肽合成酵素可能係具有以下化學反應式所表示之酵素活性之Arg-Asn連接酶或Arg-Gln連接酶。
眼蟲細胞由於能夠大量地蓄積Arg-Asn或Arg-Gln,故而穩定地表現具有選自由Arg-Asn連接酶活性、及Arg-Gln連接酶活性所組成之群中之1種以上之酵素活性的二肽合成酵素。因此,若自眼蟲細胞萃取Arg-Asn連接酶或Arg-Gln連接酶,則容易獲得某種程度之產量。又,眼蟲細胞中,亦可能蓄積少量之Asn-Arg或Gln-Arg,故而亦表現Asn-Arg連接酶或Gln-Arg連接酶。出於該等原因,可自眼蟲細胞萃取能夠生成選自由Arg-Asn、Arg-Gln、Asn-Arg、及Gln-Arg所組成之群中之1種以上之二肽的二肽合成酵素。認為Asn-Arg連接酶或Gln-Arg連接酶中之反應機制係在上述之化學反應式中,調換胺基酸1之記載與胺基酸2之記載,且調換R1之記載與R2之記載所獲得之式。基於以上所說明之發現或想法,本發明者等人創作了以下說明之酵素劑等發明。
本發明之酵素劑(以下稱為「本酵素劑」)係含有1種以上之二肽合成酵素之酵素劑。本酵素劑所含有之二肽合成酵素係具有選自由以下之(a)、(b)、及(c)所組成之群中之1種多肽之胺基酸序列,且具有選自由Arg-Asn連接酶活性、Arg-Gln連接酶活性、Asn-Arg連接酶活性、及Gln-Arg連接酶活性所組成之群中之1種以上之酵素活性的酵素(以下稱為「本酵素」)。(a)係由序列編號1所記載之胺基酸序列構成之多肽。(b)係由相對於序列編號1所記載之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列構成之多肽。此處之胺基酸序列之同一性可為95%以上,或者亦可為98%以上。(c)係由在序列編號1所記載之胺基酸序列中置換、插入、缺失、及/或附加1個以上且20個以下之胺基酸殘基而成之胺基酸序列構成的多肽。此處之置換、插入、缺失、及/或附加之胺基酸殘基可為1個以上且10個以下,或者可為1個以上且5個以下。本說明書所記載之「置換、插入、缺失、及/或附加」可為天然產生之變異,亦可為藉由公知之方法而導入之變異。上述之(a)、(b)、及(c)之各者中,「多肽」意指多個胺基酸進行肽鍵結而成之胺基酸之聚合物。
序列編號1所記載之胺基酸序列係本發明者等人進行眼蟲之染色體DNA之基因解析而發現之二肽合成酵素之胺基酸序列。關於胺基酸序列之同一性,例如通過網際網路,以Swiss-Prot、PIR、或DAD等資料庫為對象,使用BLAST或FASTA等程式進行檢索即可。本酵素可為由選自由前述之(a)、(b)、及(c)所組成之群中之1種多肽之胺基酸序列構成之酵素。或者,本酵素只要實質上無損其酵素活性,亦可為在選自由(a)、(b)、及(c)所組成之群中之1種多肽之胺基酸序列上結合附加之胺基酸序列而成者。例如,本酵素可附加有標籤序列,或者亦可與其他蛋白質結合而形成融合蛋白。標籤序列只要不違背本發明之目的則無特別限定,例如可列舉His標籤序列、即由6個左右之連續之組胺酸殘基構成之胺基酸序列。
本酵素或本酵素劑之製造方法無特別限定,例如可列舉如下方法:利用培養基培養眼蟲或後述之本發明之形質轉換體,使細胞數增加,自培養基採集培養後之眼蟲或本形質轉換體,進行細胞破碎,將從獲得之細胞破碎液去除脂質所得之水性萃取物通過分子篩(例如凝膠過濾層析等),回收含有本酵素之組分,加以冷凍乾燥。可將此處所獲得之冷凍乾燥物本身作為本酵素劑。或者,就避免長期保管時吸濕而劣化等觀點而言,較佳為將使該乾燥物與pH緩衝劑混合而調整成最佳pH所獲得之組成物作為本酵素劑。就同樣之觀點而言,亦較佳為將使該冷凍乾燥物或調整了pH之組成物藉由常法成形為粉末劑、顆粒劑、膠囊、液劑、或乳霜等任意之劑型所得者作為本酵素劑。如前所述,由於眼蟲細胞不僅可表現Arg-Asn連接酶或Arg-Gln連接酶,亦可表現Asn-Arg連接酶或Gln-Arg連接酶,故而認為若培養眼蟲或使其進行形質轉換之情形之本形質轉換體,利用與上述同樣之方法回收含有本酵素之組分等,則可製造含有2種以上能夠生成本二肽化合物之二肽合成酵素的酵素劑。由於與Asn-Arg或Gln-Arg相比,Arg-Asn或Arg-Gln容易大量蓄積於眼蟲細胞,故而認為本酵素中Arg-Asn連接酶活性或Arg-Gln活性強於Asn-Arg連接酶活性或Gln-Arg連接酶活性,就該觀點而言,本酵素所具有之酵素活性可為選自由Arg-Asn連接酶活性、及Arg-Gln連接酶活性所組成之群中之1種以上之酵素活性。
本酵素劑例如能夠活用於在後述本發明之組成物之第1實施形態之製造時生成本二肽化合物之用途。就能夠高效率地大量地生成本二肽化合物之觀點而言,本酵素劑較佳為以包含本酵素之1種以上之二肽合成酵素作為固定化酵素之形態。固定化酵素係指以能夠連續反應且反應後能夠回收再利用之狀態與載體結合或被封入至一定之空間內的酵素。例如本酵素劑可為以能夠與生成之本二肽化合物分離之方式被填充至經賽璐玢膜等半透性膜隔離之空間內的形態。就避免失活並固定化之觀點而言,固定化酵素之情形時之本酵素劑較佳為包含於高分子凝膠中或與不溶性載體結合之形態。作為高分子凝膠,例如可列舉:聚丙烯醯胺凝膠、瓊脂、明膠、角叉菜膠、或海藻酸鈣等。作為不溶性載體,例如可列舉:纖維素、糊精、樹脂珠、活性炭、矽膠、磁性粒子、或高分子膜等載體。二肽合成酵素與載體例如可藉由如下公知之方法結合:藉由靜電相互作用而使二肽合成酵素結合於離子交換樹脂等之離子結合法、藉由物理相互作用而使二肽合成酵素吸附於多孔載體之孔內之物理吸附法、或者藉由抗原抗體反應而使二肽合成酵素與載體結合之親和結合法等。
固定化酵素之情形之本酵素劑就二肽合成酵素不易自載體脫離之觀點而言,進而較佳為包含本酵素之1種以上之二肽合成酵素藉由親和結合法而與不溶性載體結合之形態。眼蟲細胞由於可表現Arg-Asn連接酶、Arg-Gln連接酶、Asn-Arg連接酶、及Gln-Arg連接酶,故而例如若使用眼蟲細胞之破碎液進行親和結合法,則能夠製造包含藉由抗原抗體反應而與不溶性載體結合之該等4種二肽合成酵素之固定化酵素。
<多核苷酸>
本說明書中「多核苷酸」係指DNA或RNA,較佳為DNA。本發明之多核苷酸(以下稱為「本多核苷酸」)係具有編碼二肽合成酵素之鹼基序列之多核苷酸,該編碼二肽合成酵素之鹼基序列具有選自由以下之(d)、(e)、(f)、及(g)所組成之群中之1種多核苷酸之鹼基序列,該多核苷酸具有編碼「具有選自由Asn-Arg連接酶活性、Arg-Asn連接酶活性、Gln-Arg連接酶活性、及Arg-Gln連接酶活性所組成之群中之1種以上之酵素活性之二肽合成酵素」的鹼基序列。(d)為由序列編號2所記載之鹼基序列構成之多核苷酸。(e)為由相對於序列編號2所記載之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列構成之多核苷酸。此處之鹼基序列之同一性可為95%以上,或者可為98%以上。(f)為由在序列編號2所記載之鹼基序列中置換、插入、缺失、及/或附加1個以上且20個以下之鹼基而成之鹼基序列構成的多核苷酸。此處,置換、插入、缺失、及/或附加之鹼基數可為1個以上且10個以下,或者可為1個以上且5個以下。(g)為在嚴格之條件下與DNA雜交的多核苷酸,該DNA係由與序列編號2所記載之鹼基序列互補之鹼基序列構成。
本說明書中所謂「嚴格之條件」,係指形成所謂特異性之雜種(hybrid)且不形成非特異性之雜種的條件。即,所謂「嚴格之條件」,係指鹼基序列之同一性較高之DNA彼此、例如同一性為80%以上、較佳為90%以上、進而較佳為95%以上、進而更佳為98%以上之DNA彼此雜交,且同一性明顯比此低之DNA彼此不雜交之條件。或者,所謂「嚴格之條件」,例如可列舉:作為通常之南方雜交中之沖洗條件的利用含有1×SSC與0.1質量%之SDS(Sodium dodecyl sulfate,十二基硫酸鈉)之60℃之溶液、較佳為含有0.1×SSC與0.1質量%SDS之60℃之溶液、進而較佳為含有0.1×SSC與0.1質量%SDS之68℃之溶液例如洗淨1次之條件、較佳為洗淨2次或3次之條件。又,若此處所例示之條件下稍作升溫,則容易高效率地獲得鹼基序列具有較高之同一性之多核苷酸。只要是本行業者,即可藉由適當選擇溫度、探針之濃度、探針之長度、離子強度、時間、鹽濃度等而實現同樣之嚴格度。作為「在嚴格之條件下雜交之多核苷酸」,例如可列舉如下多核苷酸:其係以由與序列編號2所記載之鹼基序列互補之鹼基序列構成之DNA之全部或一部分作為探針,藉由南方雜交法、或者北方雜交法等公知之雜交法獲得。雜交法例如可依據Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition (1989) (Cold Spring Habor Laboratory Press)、Current Protocols in Molecular Biology (1994) (Wiley-Interscience)、 或者DNA Cloning 1 : A Practical Approach Core Techniques, Second Edition (1995) (Oxford University Press)等所記載之方法進行。
序列編號2所記載之鹼基序列係本發明者等人進行眼蟲之染色體DNA之基因解析而發現的編碼二肽合成酵素之開讀框之鹼基序列。在2019年發現當時,序列編號2所記載之鹼基序列與編碼其他種類之微生物所具有之連接酶的公知之鹼基序列相比,具有50%左右之同一性。若轉譯序列編號2所記載之鹼基序列,則表現具有序列編號1所記載之胺基酸序列之二肽合成酵素。只要是本行業者,即可藉由對具有序列編號2所記載之鹼基序列之DNA,使用定點突變導入法等公知之方法適當導入置換、插入、缺失、及/或附加,從而針對該DNA獲得鹼基序列具有較高之同一性之多核苷酸。藉由將該多核苷酸導入至微生物,能夠表現具有與序列編號1所記載之胺基酸序列同一或類似之胺基酸序列之多肽,並從微生物將該多肽進行萃取等而收集。如此獲得之多肽具有選自由Arg-Asn連接酶活性、Arg-Gln連接酶活性、Asn-Arg連接酶活性、及Gln-Arg連接酶活性所組成之群中之1種以上之酵素活性,亦可包含作為二肽合成酵素發揮功能之多肽。關於鹼基序列之同一性,例如通過網際網路,以DDBJ、EMBL、或GenBank等資料庫為對象,使用BLAST或FASTA等程式進行檢索即可。
單離或純化本多核苷酸之方法無特別限定。例如可基於選自由前述之(d)、(e)、(f)、及(g)所組成之群中之1種多核苷酸之鹼基序列,設計PCR(polymerase chain reaction,聚合酶鏈鎖反應)用之引子,以眼蟲之染色體DNA或cDNA(complementary DNA,互補DNA)庫為模板進行PCR,藉此獲得本多核苷酸之DNA片段。亦可以藉由該PCR所獲得之DNA片段為探針,將眼蟲染色體DNA之限制酶消化物導入至噬菌體或質體等,利用使大腸桿菌進行形質轉換而獲得之庫或cDNA庫,藉由菌落雜交等而獲得本多核苷酸。或者基於對藉由PCR而獲得之DNA片段之鹼基序列進行解析所獲得的序列,設計用以向已知之DNA之外側伸長之引子,利用適當之限制酶消化眼蟲之染色體DNA後,藉由自環化反應而以DNA為模板進行反向PCR,亦能夠獲得本多核苷酸。
作為本多核苷酸,例如可列舉藉由以下說明之方法而經選殖之基因體DNA或cDNA等,但亦可為合成之DNA。在雜交中,以由與序列編號2所記載之鹼基序列對應之互補序列或其部分序列構成之DNA或RNA作為探針,對眼蟲之染色體DNA進行雜交,例如在前述之嚴格之條件下進行洗淨後,確認探針對染色體DNA中之序列編號2所記載之鹼基序列有意義地雜交。探針之長度例如可為連續之20個鹼基以上,就容易有意義地雜交之觀點而言,可為25個鹼基以上,較佳為30個鹼基以上,進而較佳為40個鹼基以上,進而更佳為80個鹼基以上。本行業者例如可使用尼龍膜或硝化纖維素膜等,藉由公知之方法實施雜交。
本多核苷酸亦可對選自由前述之(d)、(e)、(f)、及(g)所組成之群中之1種多核苷酸之鹼基序列,在其上游(5'末端側)或下游(3'末端側)具有附加之序列。附加之序列例如在上游中為啟動子序列、或強化子序列等,在下游中為終止子序列等。附加之序列與選自由前述之(d)、(e)、(f)、及(g)所組成之群中之1種多核苷酸之鹼基序列可以其間介隔之鹼基數為0之方式直接連結,或者亦可其間隔著1個鹼基以上且1,000個鹼基以下、500個鹼基以下、100個鹼基以下、50個鹼基以下、或10個鹼基以下之鹼基序列間接地結合。眼蟲之染色體DNA中,在序列編號2所記載之鹼基序列之下游,以其間介隔之鹼基數為0之方式,直接連結有與終止密碼子對應之三聯體taa。同樣地,本多核苷酸亦可於選自由前述之(d)、(e)、(f)、及(g)所組成之群中之1種多核苷酸之鹼基序列之下游直接連結有taa。
本多核苷酸就容易用於微生物之形質轉換之觀點而言,較佳為包含選自由前述之(d)、(e)、(f)、及(g)所組成之群中之1種多核苷酸之鹼基序列的重組載體之形態,進而較佳為該重組載體為表現載體。本多核苷酸或包含其之重組載體例如可與pH緩衝劑混合等而以基因重組用DNA溶液之形態市售。本多核苷酸或包含其之重組載體例如可如以下說明,活用於製作本形質轉換體之用途。
<形質轉換體>
本發明之形質轉換體(以下稱為「本形質轉換體」)係微生物利用前述之本多核苷酸或包含本多核苷酸之重組載體被形質轉換所得之形質轉換體。換言之,本形質轉換體亦可謂係將本多核苷酸或包含本多核苷酸之重組載體導入至細胞內進行形質轉換所得之微生物。本形質轉換體較佳為於其細胞核內含有本多核苷酸或包含本核苷酸之重組載體並加以保持,進而較佳為於染色體DNA中組入有本多核苷酸。本形質轉換體可良好地活用於生成本二肽化合物之用途、或作為用以製造前述之本酵素劑之原料的用途。
製作本形質轉換體時,導入本多核苷酸或包含本多核苷酸之重組載體前之原始種類之微生物(以下稱為「宿主」)無特別限定,就經口攝取時之安全性之觀點而言,較佳為即便不經過滅菌處理亦能夠食用之微生物。例如可列舉:麴菌、乳酸菌、納豆菌、醋酸菌、酵母、綠藻類、褐藻類、紅藻類、藍藻類、或眼蟲等。本形質轉換體能夠根據原始宿主之種類,活用於例如製造含有本二肽化合物之醱酵食品之用途。原始之宿主例如於製造醬油或味噌等之情形時較佳為麴菌,於製造乳酪、朝鮮泡菜、或熟壽司等之情形時,較佳為乳酸菌,於製造納豆之情形時,較佳為納豆菌,於製造食醋之情形時,較佳為醋酸菌,或者於製造麵包或酒精飲料之情形時,較佳為酵母。此處之酵母就容易製造麵包、葡萄酒、或啤酒之觀點而言,較佳為酵母菌(Saccharomyces)屬之酵母,進而較佳為釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。作為對葡萄酒釀造而言較佳之酵母,亦可列舉貝酵母(Saccharomyces bayanus)等。
宿主為釀酒酵母菌之情形時之本形質轉換體只要不違背本發明之目的,則無特別限定,作為該情形之本形質轉換體之一例,可使用:作為識別標識W303A1/pYES::EgDPL、收置編號NITE ABP-03293,於收置日2020年9月28日被獨立行政法人製品評價技術基盤機構 專利微生物寄存中心(日本 〒292-0818 千葉縣木更津市上總鎌足2-5-8 122號室)收置之酵母株(以下,將該酵母株稱為「酵母株(NITE ABP-03293)」或在本案之申請後被寄存之情形時亦稱為「酵母株(NITE BP-03293)」或「酵母株(NITE BP-3293)」)。
或者,考慮到意欲藉由量產含有本二肽化合物之食品而廉價地提供給眾多人群,從而在社會上廣泛普遍地謀求高血壓之預防或改善,則須為能夠在多種營養條件下蓄積本二肽化合物並增殖之微生物,就該觀點而言,本形質轉換體之原始宿主進而較佳為眼蟲。本說明書中之「眼蟲」係選自由動物學之分類上屬於眼蟲屬(綠蟲藻屬)之種、及其變異種所組成之群中之1種以上之原生動物。作為眼蟲例如可列舉:小眼蟲藻(Euglena gracilis)、其Z株(Euglena gracilis Z)、小眼蟲藻桿狀變種(Euglena gracilis var. bacillaris)、或綠眼蟲藻(Euglena viridis)等。適宜之培養條件已經過了詳細之研究,就容易培養之觀點而言,本說明書中之「眼蟲」較佳為選自由小眼蟲藻、其Z株、及小眼蟲藻桿狀變種所組成之群中之1種以上之原生動物。
於自宿主製作本形質轉換體時,本行業者可根據宿主之種類,自公知之形質轉換法中適當選擇合適之方法進行實施。作為將真細菌用作宿主之情形之形質轉換法,例如可列舉:藉由電氣脈衝瞬間地在細胞膜上打開微細之孔而將本多核苷酸或含有其之重組載體帶入至細胞內之電穿孔法、或者將含有本多核苷酸之質體或噬菌體DNA或者重組載體於氯化鈣之存在下帶入至勝任細胞(competent cell)化之細菌細胞內的方法等。作為將酵母用作宿主之情形之形質轉換法,例如可列舉乙酸鋰法(參照非專利文獻4)。將眼蟲用作宿主之情形之形質轉換法例如可為電穿孔法,就容易將本多核苷酸帶入至細胞內之觀點而言,較佳為粒子槍(particle gun)法。粒子槍法係如下方法:以在金或鎢等金屬之微粒子上塗佈本多核苷酸或重組載體而成者作為子彈,高速地射出而將本多核苷酸或重組載體帶入至細胞內。
就容易活用作本酵素劑之製造用或本二肽化合物之生成用之觀點而言,較佳為與原始宿主相比,本形質轉換體之編碼本酵素劑之說明中前述之本酵素的基因之轉錄量增加,或本酵素之表現量增加。可藉由將宿主與本形質轉換體中由如下鹼基序列轉錄之mRNA之含量進行比較而確認轉錄量增加,上述鹼基序列具有本多核苷酸之說明中前述之選自由(d)、(e)、(f)、及(g)所組成之群中之1種多核苷酸之鹼基序列,且編碼具有選自由Arg-Asn連接酶活性、Asn-Arg連接酶活性、Arg-Gln連接酶活性、及Gln-Arg連接酶活性所組成之群中之1種以上之酵素活性之二肽合成酵素。作為評價mRNA之含量之方法,例如可列舉:北方雜交法、或RT-PCR等。該mRNA之含量只要與宿主相比,在本形質轉換體中增加即可,例如為2.0質量倍以上,較佳為3.0質量倍以上,進而較佳為5.0質量倍以上,進而更佳為10質量倍以上。或者,可使用抗體藉由西方墨點法確認本酵素之表現量增加。本酵素之表現量只要與原始宿主相比,在本形質轉換體中增加即可,例如為2.0質量倍以上,較佳為3.0質量倍以上,進而較佳為5.0質量倍以上,進而更佳為10質量倍以上。
認為根據原始宿主之種類不同,可製作「與將細胞內生成之本二肽化合物持續蓄積於細胞內之眼蟲不同,具有將本二肽化合物分泌至細胞外之特性的本形質轉換體」。具有此種特性之情形之本形質轉換體就能夠高效率地大量生成本二肽化合物之觀點而言,較佳為以能夠進行培養之存活狀態固定化於載持體而活用作本二肽化合物之生成用生物反應器。此處之載持體只要不溶於水則無特別限定,例如較佳為列舉:如分相玻璃製之玻璃珠、燒結玻璃、輕石、或聚胺酯發泡體般設置有大量能夠載持本形質轉換體之尺寸之孔的多孔質體。
<套組>
本發明之套組(以下稱為「本套組」)係具有選自由前述之本酵素劑、前述之本多核苷酸、包含本多核苷酸之重組載體、及前述之本形質轉換體所組成之群中之一種以上的套組。本套組可活用作後述本發明之組成物之第1實施形態之製造用套組、或後述本發明之組成物之第3實施形態之製造用套組。本發明之組成物之第3實施形態之製造用之情形之本套組就容易製造本發明之組成物之第3實施形態之觀點而言,較佳為進而具有含有本形質轉換體能夠進行氮同化之氮源之培養液。或者,在本套組具有選自由前述之本多核苷酸、包含本多核苷酸之重組載體、及本形質轉換體所組成之群中之一種以上之情形時,就能夠活用作本酵素劑之製造用套組之觀點而言較佳。
<組成物之第1實施形態>
本發明之組成物之第1實施形態(以下稱為「本組成物1」)係含有本二肽化合物之組成物。例如,本組成物1能夠使用本酵素劑、與含有Arg及Asn之水溶液進行製造。或者,例如本組成物1能夠使用本酵素劑、與含有Arg及Gln之水溶液進行製造。已知若經口攝取二肽,則藉由刷狀緣之H+
依賴性運輸載體,與氫離子一起被吸收至體內,其吸收速度快於游離胺基酸。因此,推測若經口攝取本組成物1,則本二肽化合物被吸收至體內而轉移至血中,發揮ACE阻礙作用。若持續經口攝取本組成物1,則可能起因於ACE阻礙作用而發揮血壓上升抑制作用。因此,本組成物1可活用作基於經口攝取之ACE阻礙用或血壓上升抑制用之組成物。
本組成物1中之本二肽化合物之含量就容易發揮ACE阻礙作用之觀點而言,較佳為0.10 mg/L以上,進而較佳為0.40 mg/L以上,進而更佳為2.0 mg/L以上。本組成物1中之本二肽化合物之含量就即便少量攝取亦容易發揮ACE阻礙作用之觀點而言,較佳為10 mg/L以上,進而較佳為30 mg/L以上,進而更佳為60 mg/L以上。就將純化等所需之成本抑制得較低之觀點而言,本組成物1中之本二肽化合物之含量較佳為500 g/L以下,進而較佳為100 g/L以下,進而更佳為10 g/L以下。本說明書中「含量」於相應之化合物含有2種以上之情形時,意指合計之含量。「g」為質量克。
作為測定本二肽化合物之含量之方法,可列舉如下方法:將以實質上不含脂質與蛋白質之方式進行了純化之分析用試樣供於液相層析質量分析(以下稱為「LC/MS」)或使用串聯四極質譜儀之液相層析質量分析(以下稱為「LC/MS/MS」),測定由該分析用試樣中含有之本二肽化合物產生而被檢測到之波峰之面積。能夠比較分析用試樣中之該波峰面積與對本二肽化合物之標準品同樣地進行分析而檢測到之波峰之面積,並且此外考慮為了純化或分析而進行之稀釋倍率,算出分析用試樣之基礎之本發明之組成物中之本二肽化合物之含量。在後述之實驗例1至實驗例3中,對該測定方法之例進行說明。如上所述進行測定之結果,例如在分析用試樣之基礎之本發明之組成物中之本二肽化合物之含量未達0.10 mg/L之情形時,就使ACE阻礙作用等容易發揮之觀點而言,較佳為以該含量成為0.10 mg/L以上之方式將本發明之組成物濃縮或純化而提高本二肽化合物之含有率。
本二肽化合物不具有例如像培哚普利(Perindopril)等ACE阻礙藥那樣強之ACE阻礙活性。於經口攝取ACE阻礙藥之情形時,血壓會在短時間內迅速下降,與此相對,在持續經口攝取本二肽化合物之情形時,血壓上升可被抑制得緩慢或血壓可緩慢地下降。因此,認為經口攝取ACE阻礙藥之情形時可能產生之副作用在持續經口攝取本二肽化合物之情形時幾乎不會產生,不會造成問題。出於該理由,含有本二肽化合物之本組成物1較佳為ACE阻礙用或血壓上升抑制用之食品組成物。食品組成物例如係選自由加工食品、調味料、食品添加物、補充品、及該等中摻合之食品材料所組成之群中之1種以上之組成物。食品組成物之情形之本組成物1可為與1種以上之公知之食品素材混合之形態。
加工食品之情形之本組成物1例如可取含有本二肽化合物之醃漬物、乾貨、漿製品、粉類、罐頭、冷凍食品、方便食品、乳製品、點心類、嗜好品、或飲料等形態。飲料之情形之本組成物1例如可取含有本二肽化合物之水、果汁、茶、咖啡、清涼飲料水、或酒精飲料等形態。補充品之情形之本組成物1例如可為本二肽化合物與藥理學上容許之1種以上之公知之添加劑混合而成之組成物,可取散劑、粉劑、顆粒劑、錠劑、片劑、丸劑、膠囊劑、或咀嚼劑等形態。作為公知之添加劑,例如可列舉賦形劑、甜味料、抗氧化劑、黏滑劑、潤滑劑、稀釋劑、緩衝劑、著香劑、或者著色劑等。食品添加物之情形之本組成物1例如為了獲得ACE阻礙用或血壓上升抑制用之食品組成物,亦可為與1種以上之食品或其原料混合使用之乾燥粉末。例如本組成物1可為收容於食品隨附之小袋中之乾燥粉末之形態,消費者藉由打開小袋將乾燥粉末撒於食品,從而在食用了該食品之消費者之體內發揮ACE阻礙作用。
就可藉由持續之經口攝取而無副作用地緩慢抑制血壓上升之觀點而言,本組成物1進而較佳為高血壓之預防用或改善用之食品組成物。高血壓為血壓超過正常範圍而維持得較高之狀態。人類若收縮期血壓(Systolic Blood Pressure:以下稱為「SBP」)為140 mmHg以上及/或擴張期血壓(Diastolic Blood Pressure:以下稱為「DBP」)為90 mmHg以上,則可被診斷為高血壓。高血壓之預防用或改善用之食品組成物之情形之本組成物1可作為選自由特定保健用食品、營養功能食品、病人用食品、及高齡者用食品所組成之群中之1種以上之健康食品在市場流通。就容易讓消費者明白之觀點而言,該健康食品之容器或包裝材料等上較佳為附有說明藉由持續經口攝取而起因於ACE阻礙作用發揮之功能的標識。標識之語句無特別限定,例如可列舉:「降低血壓」、「期待血壓降低」、「抑制血壓之上升」、「減緩血壓之上升」、「預防高血壓」、或者「有助於高血壓之改善」等。就同樣之觀點而言,本組成物1亦進而較佳為起因於高血壓之疾病之預防用之食品組成物。起因於高血壓之疾病無特別限定,例如可列舉:腦出血、腦梗塞、大動脈瘤、腎硬化症、心肌梗塞、心臟肥大、或眼底出血等。起因於高血壓之疾病之預防用之食品組成物之情形之本組成物1亦可作為健康食品於市場上流通,此時,例如較佳為在容器或包裝材料等上附以「保護腎功能」等說明起因於ACE阻礙作用等而發揮之功能的標識。
本組成物1就不易混入夾雜物,將本二肽化合物之純化成本抑制得較低之觀點而言,較佳為藉由以下說明之本發明之組成物之製造方法之第1實施態樣而製造的組成物。
<組成物之製造方法之第1實施態樣>
以下,在說明本發明之組成物之製造方法之第1實施態樣(以下稱為「本製法1」)時,與前述之本酵素劑或本組成物1有較多共通事項,大致省略共通事項之說明,主要對不同之事項進行說明。如圖1所示,本製法1包括準備步驟S11、酵素反應步驟S12、及乾燥步驟S14,係能夠製造前述之本組成物1之方法。
在準備步驟S11中,準備前述之本酵素劑。例如在準備步驟S11中,準備本酵素劑,其含有如下二肽合成酵素,上述二肽合成酵素具有選自由以下之(a)、(b)、以及(c)所組成之群中之1種多肽之胺基酸序列:(a)由序列編號1所記載之胺基酸序列構成之多肽;(b)由相對於序列編號1所記載之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列構成之多肽;(c)由在序列編號1所記載之胺基酸序列中置換、插入、缺失、及/或附加1個以上且20個以下之胺基酸殘基而成之胺基酸序列構成的多肽;且上述二肽合成酵素具有選自由Arg-Asn連接酶活性、Arg-Gln連接酶活性、Asn-Arg連接酶活性、及Gln-Arg連接酶活性所組成之群中之1種以上之酵素活性。準備步驟S11中準備之本酵素劑理想的是滿足對本酵素劑前述之較佳之事項。
在準備步驟S11中,較佳為進而準備二肽合成酵素之受質、或含有上述受質之受質溶液。二肽合成酵素之受質係選自由Arg及其鹽所組成之群中之1種以上之化合物(以下亦稱為「第1受質」)與選自Asn、Gln、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之化合物(以下亦稱為「第2受質」)。就促進本酵素之說明中前述之化學反應式之酵素反應之觀點而言,較佳為進而準備選自由鎂鹽、ATP、及含有該等之溶液所組成之群中之1種以上。就避免酵素反應前第2受質脫醯胺而轉化為Asp或Glu之觀點而言,亦較佳為進而準備螯合劑、或pH緩衝劑。
酵素反應步驟S12中,在第1受質、第2受質、及本酵素劑之存在下,使本酵素劑所含有之二肽合成酵素進行酵素反應,生成本二肽化合物。為了進行酵素反應,將含有第1受質、第2受質、及本酵素劑之溶液保持於適合酵素反應之液溫或pH。在製備該溶液時,將受質、本酵素劑、及溶劑混合之順序無特別限定。例如可在將第1受質、第2受質、及本酵素劑混合後添加水,亦可在含有第1受質與第2受質之受質溶液中添加本酵素劑,或者亦可在向含有第1受質之受質溶液中添加本酵素劑後添加第2受質。在酵素反應步驟S12中,就促進本酵素劑之說明中前述之化學反應式之酵素反應之觀點而言,較佳為在選自由鎂鹽、ATP、pH緩衝劑、及螯合劑所組成之群中之1種以上之進而存在下使二肽合成酵素進行酵素反應。混合鎂鹽、ATP、pH緩衝劑、及/或螯合劑之順序亦無特別限定。
在乾燥步驟S14中,將上一酵素反應步驟S12中生成之含有本二肽化合物之溶液乾燥,獲得本組成物1。如本組成物1之說明中前述,在乾燥步驟S14中,較佳為以本二肽化合物之含量例如成為0.10 mg/L以上之方式使溶液乾燥。在乾燥步驟S14中,可使含有本二肽化合物之溶液加熱乾燥,但就避免不期望之加熱變性之觀點而言,較佳為使溶液冷凍乾燥。於製造加工食品之情形之本組成物1之情形時,較佳為進而使燥步驟S14中所獲得之乾燥物與公知之食品素材等混合。
<組成物之第2實施形態>
以下,在說明本發明之組成物之第2實施形態(以下稱為「本組成物2」)時,與前述之本組成物1有較多共通事項,大致省略共通事項之說明,主要對不同事項進行說明。本組成物2係由含有源自未經基因重組之眼蟲細胞之分子質量未達4.0 kDa之肽的水溶性成分之組分構成、或包含上述組分而成之組成物。就去除夾雜物而相對地提高本二肽化合物之含有率之觀點而言,本組成物2不含源自眼蟲細胞之脂質、或源自上述細胞之分子質量為4.0 kDa以上之蛋白質、及源自上述細胞之分子質量為4.0 kDa以上之多肽。本二肽化合物由於為水溶性,故而在源自上述細胞之水溶性成分之組分中,在源自上述細胞之分子質量未達4.0 kDa之肽中包含本二肽化合物。因此,本組成物2能夠活用作基於經口攝取之ACE阻礙用或血壓上升抑制用之組成物。
就容易在細胞內大量蓄積本二肽化合物之觀點而言,本組成物2中作為原料之眼蟲細胞較佳為在眼蟲細胞能夠進行氮同化之氮源之存在下培養而生長者。再者,眼蟲細胞由於不具有亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、及脲酶,故而無法使亞硝酸態氮(NO2 -
)、硝酸態氮(NO3 -
)、及脲(CO(NH2
)2
)氮同化。另一方面,作為眼蟲細胞能夠進行氮同化之氮源,例如可列舉選自由氨態氮、游離胺基酸、肽、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之化合物。氨態氮係選自由氨及銨鹽所組成之群中之1種以上之化合物所包含之NH3
或NH4 +
之氮原子。例如,七鉬酸六銨四水合物((NH4
)6
Mo7
O24.4
·H2
O)之1.0 mol當量相當於以氨態氮計6.0 mol當量。作為銨鹽,例如可列舉:硫酸銨、磷酸銨、硝酸銨、碳酸銨、或氯化銨等。就眼蟲細胞容易生成本二肽化合物之觀點而言,作為氮源,較佳為列舉選自由Arg及其鹽所組成之群中之化合物與選自由Asn及其鹽所組成之群中之化合物之組合。就同樣之觀點而言,作為氮源,較佳為列舉選自由Arg及其鹽所組成之群中之化合物與選自由Gln及其鹽所組成之群中之化合物之組合。就同樣之觀點而言,作為氮源,進而較佳為列舉選自由Arg及其鹽所組成之群中之化合物、選自由Asn及其鹽所組成之群中之化合物、及選自由Gln及其鹽所組成之群中之化合物之組合。
本組成物2中,以在培養基中生長之眼蟲細胞為原料之情形時,該眼蟲細胞可為生長後加熱而乾燥之乾燥物,就避免不期望之加熱變性之觀點而言,較佳為生長後進行冷凍乾燥而乾燥之乾燥物。由於藉由水分之減少,本二肽化合物之含有率會相對地提高,故而進一步容易發揮ACE阻礙作用。認為若由於乾燥而細胞內液減少,或細胞膜損壞,則抑制眼蟲細胞中之代謝,本二肽化合物不易分解,故而容易長期保管本組成物2。或者,就進一步避免由於代謝而導致之分解,從而容易長期保管之觀點而言,本組成物2中之培養基中生長之眼蟲細胞較佳為生長後經乾燥且破碎之細胞(細胞破碎物)。或者,就進一步相對地提高本二肽化合物之含有率之觀點而言,眼蟲細胞例如較佳為生長後或破碎後藉由例如無極性溶劑而脫脂者。
脂質係指源自生物且可溶於無極性溶劑之物質。作為源自眼蟲細胞之脂質,例如可列舉n-3系PUFA等。本組成物2中,為了相對地提高本二肽化合物之含有率,源自眼蟲細胞之脂質作為夾雜物被實質上去除。因此,本組成物2不含源自眼蟲細胞之脂質。本說明書中,所謂「不含」,意味著即便應去除之成分因分離操作之精度之問題而微量地殘存,亦只要為不妨礙本發明所發揮之作用效果之程度之殘存量,則在本發明之內容或本質上不成問題,故而容許。本說明書中,「應去除之成分之含量(殘存量)」相對於「本二肽化合物之含量」之質量比(應去除之成分之含量(殘存量)/本二肽化合物之含量)例如可未達0.050,較佳為未達0.010,進而較佳為未達0.0010。
例如,可使眼蟲細胞分離為油相與水相,將藉由使該水相之組分通過分子篩而獲得之「不含源自眼蟲細胞之脂質或分子質量為4.0 kDa以上之蛋白質或多肽且含有源自眼蟲細胞之分子質量未達4.0 kDa之肽的水溶性成分之組分」直接作為本組成物2。即,本組成物2可為實質上由不含源自眼蟲細胞之脂質或分子質量為4.0 kDa以上之蛋白質或多肽之眼蟲水性萃取物、及藥理學上容許之親水性溶劑構成的組成物。作為此處之分子篩,例如可列舉凝膠過濾層析等。本組成物2就相對地提高本二肽化合物之含有率之觀點而言,較佳為藉由針對含有源自眼蟲細胞之分子質量未達4.0 kDa之肽的水溶性成分之組分,將該組分濃縮而實質上去除親水性溶劑所獲得的濃縮物,進而較佳為以本二肽化合物之含有率進一步提高之方式純化該濃縮物所得之純化物。本組成物2亦較佳為此處所列舉之含有源自眼蟲細胞之分子質量未達4.0 kDa之肽的水溶性成分之組分、濃縮物、或純化物、以及藥理學上容許之1種以上之公知之添加劑或1種以上之公知之食品素材混合而成的食品組成物。
就去除夾雜物而相對地提高本二肽化合物之含有率之觀點而言,上述純化物較佳為藉由利用例如凝膠過濾層析等分子篩進行純化,從而不含源自眼蟲細胞之分子量為1,000以上之蛋白質或多肽或寡肽的組成物,進而更佳為不含源自眼蟲細胞之分子量為500以上之蛋白質或多肽或寡肽的組成物。又,就相對地提高具有強於Arg之ACE阻礙活性的本二肽化合物之含有率之觀點而言,本組成物2較佳為以不含作為源自眼蟲細胞之游離胺基酸的Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、L-甲硫胺酸、L-半胱胺酸、L-升半胱胺酸、牛磺酸、及該等游離胺基酸之鹽之方式經純化的組成物,進而較佳為不限於該等游離胺基酸之例,實質上去除了游離胺基酸及其鹽的組成物。
此外,於本組成物2中,本二肽化合物之含量、其測定方法、用途、作為食品組成物可取之形態、或標識等有關之較佳之事項與關於本組成物1而前述者相同。就能夠高效率地製造之觀點而言,本組成物2較佳為藉由以下說明之本發明之組成物之製造方法之第2實施態樣而製造者。
<組成物之製造方法之第2實施態樣>
以下,在說明本發明之組成物之製造方法之第2實施態樣(以下稱為「本製法2」)時,與前述之本組成物2有較多共通事項,大致省略共通事項之說明,主要對不同之事項進行說明。如圖2所示,本製法2包括準備步驟S21、培養步驟S22、收集步驟S23、乾燥步驟S24、破碎步驟S25、除蛋白步驟S26、脂質去除步驟S27、濃縮步驟S28、及純化步驟S29,係能夠製造本組成物2之方法。
在準備步驟S21中,準備眼蟲之活細胞。例如,雖可採集在室外日照良好之水坑等中野生之眼蟲,但接受由研究機構提供之實驗用之眼蟲細胞株較為高效率。
在培養步驟S22中,在眼蟲細胞能夠進行氮同化之氮源之存在下,培養眼蟲之活細胞使其生長,增加細胞數並使眼蟲細胞生成本二肽化合物。至於培養基,就容易應對污染之觀點而言,例如可為瓊脂斜面培養基等固體培養基,但就廉價且容易製備,容易攪拌,容易高密度地培養眼蟲細胞之觀點而言,較佳為液體培養基。作為以往一直用於眼蟲培養之液體培養基,例如可列舉:以下表1所示之Cramer-Myers培養基(以下稱為「CM培養基」;參照非專利文獻5)、表2所示之Hutner培養基(參照非專利文獻6)、或者表3所示之Koren-Hutner培養基(以下稱為「KH培養基」;參照非專利文獻7)等。
[表1]
CM培養基中之組成之剩餘部分為水。在CM培養基中,Glu化合物之含量為0 mmol/L,氨態氮之含量為15.1 mmol/L。
成分 | 含量 (g/L) | 成分 | 含量 (g/L) | ||
維生素B1 | 1.0×10-4 | MgSO4 •7H2 O | 0.20 | ||
維生素 | 維生素B12 | 5.0×10-7 | CaCl2 •2H2 O | 0.020 | |
碳水化合物 | 檸檬酸3Na•2H2 O | 0.80 | Fe2 (SO4 )3 •7H2 O | 3.0×10-3 | |
其他無機鹽 | MnCl2 •4H2 O | 1.8×10-3 | |||
銨鹽 | (NH4 )2 HPO4 | 1.0 | CoSO4 •7H2 O | 1.5×10-3 | |
ZnSO4 •7H2 O | 4.0×10-4 | ||||
pH緩衝劑 | KH2 PO4 | 1.0 | Na2 MoO4 •2H2 O | 2.0×10-4 | |
CuSO4 •5H2 O | 2.0×10-5 |
[表2]
Hutner培養基中之組成之剩餘部分為水。在Hutner培養基中,Glu化合物之含量為34.0 mmol/L,氨態氮之含量為3.1 mmol/L。
成分 | 含量 (g/L) | 成分 | 含量 (g/L) | ||
維生素 | 維生素B1 | 1.0×10-3 | MgSO4 •7H2 O | 0.50 | |
維生素B12 | 2.0×10-7 | CaCO3 | 0.20 | ||
碳水化合物 | 蘋果酸 | 2.0 | FeCl3 | 5.0×10-3 | |
胺基酸 | Glu | 5.0 | 其他無機鹽 | MnSO4 •H2 O | 0.011 |
銨鹽 | (NH4 )2 HPO4 | 0.20 | ZnSO4 •7H2 O | 0.023 | |
Fe(NH4 )2 (SO4 )2 •6H2 O | 0.012 | CuSO4 •5H2 O | 3.5×10-4 | ||
(NH4 )6 Mo7 O24 •4H2 O | 1.6×10-4 | CoSO4 •7H2 O | 2.1×10-3 | ||
pH緩衝劑 | KH2 PO4 | 0.40 | NaVO4 •16H2 O H3 BO3 | 1.6×10-4 5.0×10-4 |
[表3]
KH培養基中之組成之剩餘部分為水。在KH培養基中,Glu化合物之含量為27.2 mmol/L,氨態氮之含量為11.0 mmol/L。
成分 | 含量 (g/L) | 成分 | 含量 (g/L) | ||
維生素 | 維生素B1 | 2.5×10-3 | (NH4 )2 SO4 | 0.50 | |
維生素B12 | 5.0×10-6 | 銨鹽 | NH4 HCO3 | 0.25 | |
碳水化合物 | 葡萄糖 | 12.0 | Fe(NH4 )2 (SO4 )2 •6H2 O | 0.050 | |
蘋果酸 | 6.5 | (NH4 )6 Mo7 O24 •4H2 O | 4.0×10-3 | ||
檸檬酸3Na | 0.50 | NH4 VO3 | 5.0×10-4 | ||
琥珀酸2Na | 0.10 | MgCO3 | 0.60 | ||
胺基酸 | Arg鹽酸鹽 | 0.50 | CaCO3 | 0.12 | |
Asp | 0.30 | MnSO4 •H2 O | 0.018 | ||
Glu | 4.0 | ZnSO4 •7H2 O | 0.025 | ||
甘胺酸 | 0.30 | 其他無機鹽 | CuSO4 | 1.2×10-3 | |
L-組胺酸鹽酸鹽 | 0.050 | CoSO4 •7H2 O | 5.0×10-4 | ||
緩衝劑 | KH2 PO4 | 0.25 | H3 BO3 | 6.0×10-4 | |
螯合劑 | EDTA-Na2 | 0.050 | NiSO4 •6H2 O | 5.0×10-4 |
培養步驟S22中使用之培養基亦可為與表1至表3所示之組成類似之組成之培養基。只要不違背本發明之目的,培養基中較佳為含有螯合劑或pH調整劑。例如,表1至表3所示之EDTA-Na2
(乙二胺四乙酸二鈉鹽)發揮作為螯合劑之作用。磷酸鹽或檸檬酸發揮作為pH調整劑之作用。眼蟲細胞能夠進行氮同化之氮源例如係選自由氨、銨鹽、游離胺基酸、肽、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之化合物。因此,培養基中亦可摻合銨鹽、含有肽之組成物、或氨水。作為含有肽之組成物,例如可列舉:蛋白腖、酪蛋白胺基酸、酵母萃取物、或玉米浸液等。
培養步驟S22中,就容易以大量蓄積本二肽化合物之方式使眼蟲細胞生長之觀點而言,培養基中之氨態氮之含量較佳為38 mmol/L以上。就同樣之觀點而言,較佳為選自由Glu及其鹽所組成之群中之1種以上之化合物(以下稱為「Glu化合物」)於培養基中之含量為3.4 mmol/L以上,氨態氮之含量為13 mmol/L以上。該等培養基例如能夠在表1至表3之任一配方中進而追加摻合Glu化合物或銨鹽而製備。就同樣之觀點與高效率地增加細胞數之觀點而言,氨態氮之含量為14 mmol/L以上之培養基中之Glu化合物之含量較佳為24 mmol/L以上,進而較佳為40 mmol/L以上。就避免含量過多而妨礙細胞數增加之觀點而言,培養基中之氨態氮之含量較佳為1.0 mol/L以下,進而較佳為100 mmol/L以下。同樣地就避免妨礙細胞數增加之觀點而言,培養基中之Glu化合物之含量較佳為1.0 mol/L以下,進而較佳為100 mmol/L以下。
在培養步驟S22中,可藉由以往為了增加眼蟲之細胞數而進行之培養方法來使眼蟲細胞生長。例如,可用厚黑布遮蓋培養容器,將培養基保持為黑暗下,使眼蟲細胞生長。或者,可設置包括對培養基照射光之明期與將培養基保持為暗黑下之暗期的明暗週期,使眼蟲細胞生長。培養步驟S22中,就藉由光合中所獲得之營養素使眼蟲細胞生長而高效率地增加細胞數之觀點而言,較佳為對培養基持續照射光使眼蟲細胞生長。培養溫度例如為20℃以上且未達34℃,就良好地生長之觀點而言,較佳為28℃以上且30℃以下。就同樣之觀點而言,對培養基照射之光之強度較佳為2,000 lux以上且8,000 lux以下。就同樣之觀點而言,例如較佳為一面藉由攪拌器攪拌培養基一面進行培養,亦較佳為一面藉由振盪器對培養基以每分鐘80次以上且120次以下進行振盪一面進行培養。就同樣之觀點而言,較佳為使通過除菌過濾器之空氣或含有1質量%以上且5質量%以下二氧化碳之空氣通入培養基。培養基之初始pH例如為2.0以上且7.0以下,就高效率地增加細胞數之觀點而言較佳為3.0以上且5.0以下。亦可為了調整初始pH而於培養基中添加少量之稀硫酸。例如,於藉由該等較佳之培養條件對KH培養基持續照射光而使眼蟲細胞生長之情形時,在自培養開始起2天至3天到達對數增殖期,在4天至5天到達靜止期。
與本製法1之說明中前述之酵素反應步驟S12(圖1)相比,在圖2所示之本製法2之培養步驟S22中,眼蟲細胞可代謝銨鹽而生成Arg(參照非專利文獻1與非專利文獻2),因此有培養基之組成無需Arg或其鹽之優點。再者,Asn有容易脫醯胺化而轉化為Asp之問題,同樣地,Gln亦有容易轉化為Glu之問題。另一方面,眼蟲細胞分別能夠自Asp生成Asn,能夠自Glu生成Gln。因此,在培養步驟S22中,有培養基之組成無需Asn、Gln、或該等之鹽之優點。又,在培養步驟S22中,眼蟲細胞發揮引入氮源而在細胞內提高氮化合物之密度的天然濃縮器之作用,因此就即便培養基所含有之氮源之濃度較細胞低亦能夠製造本組成物2之觀點而言亦較佳。培養步驟S22中,即便為例如作為食品製造之副產物而生成之產業廢棄物,只要含有選自由銨鹽、胺基酸、肽、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之氮化合物,則亦能夠用作氮源,故而就容易再利用產業廢棄物之觀點或能夠降低本組成物2之製造成本之觀點而言亦較佳。
收集步驟S23中,為了在下一乾燥行程S24中提高處理效率,在培養期間結束後,收集培養基中生長之眼蟲細胞,獲得該細胞之密度提高之收集物。例如,可對培養基進行加熱濃縮而提高培養基中之細胞之密度,但就避免不期望之加熱變性而在短時間內高效率地收集之觀點而言,較佳為採集使培養基進行離心分離而形成之沈澱物(細胞之顆粒)。例如將培養基每次300 mL地分注至試管,在約4℃施以2,000×G左右之離心力,採集形成於試管內底之顆粒。「G」為標準重力加速度(9.80665 m/s2
)。
在乾燥步驟S24中,為了提高後續之步驟(S25至S27等)中之處理效率,避免在眼蟲細胞內本二肽化合物因代謝而分解,而使該細胞之收集物(例如經濃縮之培養基或細胞之顆粒)乾燥,獲得含有乾燥之眼蟲細胞之乾燥物。雖可對收集物進行加熱乾燥,但就避免不期望之加熱變性之觀點而言,較佳為對收集物進行冷凍乾燥。
在破碎步驟S25中,為了使後續行程(S26或S27等)中容易去除脂質等,而使乾燥物中含有之眼蟲細胞破碎,獲得含有破碎之眼蟲細胞之破碎處理物。為此,可採用為了自細胞萃取蛋白質而進行之公知之細胞破碎法。例如可列舉:選自由滲壓休克法、酵素消化法、超音波處理、法式壓碎機、藉由杵進行之粉碎、藉由均質機進行之破碎、及藉由玻璃珠進行之破碎所組成之群中之1種或組合2種以上而成之細胞破碎法。就避免破碎時之不期望之變性之觀點而言,較佳為將使乾燥物懸浮於少量之緩衝液而成之細胞懸浮液供於破碎處理。再者,滲壓休克法係將乾燥物懸浮於滅菌水等低張液而使細胞破裂之方法。酵素消化法係於細胞懸浮液中添加各種酵素來消化細胞之方法。但較佳為避免添加能夠分解本二肽化合物之二肽酶。超音波處理係藉由超音波之剪力而使細胞破碎之方法。法式壓碎機係在高壓下將細胞懸浮液從小孔強制地擠出,藉由剪力來破碎細胞之方法。藉由杵進行之粉碎係藉由杵在研缽上將細胞磨碎之方法。藉由均質機進行之破碎係藉由均質機將細胞懸浮液進行均質化,對所獲得之溶解產物進行過濾或離心分離而去除不溶物,並採集上清液的方法。藉由玻璃珠進行之破碎係於細胞懸浮液中添加玻璃珠,一面冷卻一面反覆進行藉由漩渦混合器進行攪拌之操作,對所獲得之溶解產物進行過濾或離心分離而去除不溶物,採集上清液的方法。
在除蛋白步驟S26中,為了去除夾雜物而相對地提高本二肽化合物之含有率,對破碎處理物實施除蛋白處理而獲得除蛋白處理物。為此,可採用以往為了自破碎處理物去除蛋白質而一直進行之公知之除蛋白處理法。例如,可列舉選自由蛋白質變性沈澱法、藉由液相層析而分離蛋白質加以去除之方法、及超濾所組成之群中之1種或2種以上之組合。分子量越大之多肽或蛋白質越容易被除,分子量較小之本二肽化合物殘存於除蛋白處理物中。
在除蛋白步驟S26中進行蛋白質變性沈澱法之情形時,將破碎處理物與沈澱劑進行混合,藉由離心分離使蛋白質沈澱,以沈澱物(蛋白質)不混入之方式採集水層,視作除蛋白處理物。例如,較佳為將破碎處理物1.0質量份與沈澱劑0.2質量份以上且4質量份以下加以混合並攪拌,在陰涼處靜置15分鐘以上,使蛋白質析出,施以20,000×G左右之離心力15分鐘左右,使蛋白質沈澱,以沈澱物(蛋白質)不混入之方式採集水層(除蛋白處理物)。作為沈澱劑,例如可列舉:乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、三氯乙酸、過氯酸、或該等之混合物。在除蛋白步驟S26中進行超濾之情形時,使破碎處理物通過極限分子量為30,000以下之超濾膜,採集通過膜之濾液,視作除蛋白處理物。作為超濾膜,例如可列舉:Amicon Ultra離心式超濾過濾器(Merck公司製造,Amicon為註冊商標)。蛋白質或分子量較大之多肽無法通過膜而被去除。在除蛋白步驟S26中藉由液相層析(例如凝膠過濾層析、離子交換層析等)而分離蛋白質之情形時,例如作為預備實驗,預先使胺基酸、二肽、三肽、多肽、及蛋白質之標準試樣通過管柱,並藉由層析圖記錄各標準品之滯留時間。其後,洗淨管柱,使破碎處理物通過洗淨後之管柱,採集含有胺基酸、二肽、及三肽之滯留時間之組分,視作除蛋白處理物。若不採集含有多肽或蛋白質之組分,則多肽或蛋白質被去除。
在脂質去除步驟S27中,為了去除夾雜物而相對地提高本二肽化合物之含有率,自除蛋白處理物去除脂質而獲得眼蟲水性萃取物。例如可對除蛋白處理物施以離心分離或靜置於陰暗處,將成分按每種比重分離,去除形成之脂質層而獲得眼蟲水性萃取物。或者,可使除蛋白處理物通過液相層析(例如逆相層析)之分離管柱,採集通過管柱之含有水溶性成分之組分,視作眼蟲水性萃取物。
在脂質去除步驟S27中,就簡易迅速地去除脂質之觀點而言,較佳為使除蛋白處理物與極性溶劑混合。極性溶劑例如可為甲醇,但就避免脂質之混入而高效率地萃取水溶性成分之觀點而言,較佳為於20℃之介電常數為35以上之溶劑,例如可列舉:乙腈、甲酸、水、或該等之混合液。在將除蛋白處理物與極性溶劑混合之情形時,脂質留於萃取殘餘層(油層)與沈澱物,水溶性成分被萃取至極性溶劑(例如水)中,故而可採集混合後形成之極性溶劑之層(例如水層)視作眼蟲水性萃取物。或者,就同樣之觀點而言,亦較佳為將除蛋白處理物與無極性溶劑進行混合。無極性溶劑例如可為乙酸乙酯、氯仿、或該等之混合液。就同樣之觀點而言,無極性溶劑較佳為於20℃之介電常數為4.5以下之溶劑,例如可列舉:己烷、苯、甲苯、二乙醚、或該等之混合液。在將除蛋白處理物與無極性溶劑混合之情形時,脂質被萃取至無極性溶劑,水溶性成分殘存於萃取殘餘層(水層)與沈澱物中,故而可採集混合後形成之萃取殘餘層(水層),視作眼蟲水性萃取物。或者,就同樣之觀點而言,亦較佳為將除蛋白處理物與極性溶劑及無極性溶劑混合,採集形成之極性溶劑之層(例如水層)。在脂質去除步驟S27中使用極性溶劑或無極性溶劑之情形時,就同樣之觀點而言,較佳為使除蛋白處理物乾燥後與溶劑混合,進而較佳為使除蛋白處理物冷凍乾燥後與溶劑混合。在採集極性溶劑之層(例如水層)時,避開與無極性溶劑之層(油層)之界面或接近沈澱物之部分進行採集就亦能夠去除位於界面之兩親媒性之成分(例如磷脂質、糖脂質)或位於沈澱物之不溶性成分之觀點而言較佳。
在濃縮步驟S28中,為了去除溶劑(例如水)而相對地提高本二肽化合物之含有率,濃縮眼蟲水性萃取物而獲得濃縮物。為此,可對眼蟲水性萃取物進行加熱乾燥,但就避免不期望之加熱變性之觀點而言,較佳為藉由冷凍乾燥而獲得濃縮物,亦較佳為使用離心濃縮機(離心蒸發器)藉由離心濃縮而獲得濃縮物。
在純化步驟S29中,為了去除夾雜物而相對地提高本二肽化合物之含有率,對濃縮物進行純化而獲得純化物。為此,較佳為藉由選自由分子篩(例如超濾或凝膠過濾層析)、離子交換層析、及吸附層析所組成之群中之1種或2種以上之組合而去除源自眼蟲細胞之脂質或分子質量為4.0 kDa以上之蛋白質或多肽。在自濃縮物去除游離胺基酸、寡肽、多肽、蛋白質、及該等之鹽之情形時,較佳為使濃縮物通過凝膠過濾層析之管柱,在每一定之滯留時間進行區分,採集含有二肽或三肽之滯留時間之組分,視作純化物。
在以上所說明之本製法2中,準備步驟S21、培養步驟S22、收集步驟S23、乾燥步驟S24、及破碎步驟S25之組合發揮作為準備在培養基中生長並乾燥之眼蟲細胞經破碎所獲得之破碎處理物之步驟的功能。除蛋白步驟S26、脂質去除步驟S27、及純化步驟S29之組合發揮作為自破碎處理物去除源自眼蟲細胞之脂質與分子質量為4.0 kDa以上之蛋白質及多肽,獲得源自眼蟲細胞之分子質量未達4.0 kDa之水溶性成分之組分之步驟的功能。純化步驟S29中獲得之純化物可視作本組成物2。
<組成物之第3實施形態>
以下,在說明本發明之組成物之第3實施形態(以下稱為「本組成物3」)時,與前述之本形質轉換體、本組成物1、本製法1、本組成物2、及本製法2有較多共通事項,大致省略共通事項之說明,主要說明不同之事項。本組成物3係藉由包含選自由本形質轉換體、在含有本形質轉換體能夠進行氮同化之氮源之培養基中被培養之本形質轉換體、本形質轉換體之乾燥物、及本形質轉換體之細胞破碎物所組成之群中之1種以上,從而含有本二肽化合物的組成物。本組成物3由於含有藉由本形質轉換體而生成之本二肽化合物,故而能夠活用作基於經口攝取之ACE阻礙用或血壓上升抑制用之組成物。本形質轉換體相關之較佳事項如前所述。
就本二肽化合物之含量較多之觀點而言,本組成物3中用作原料之本形質轉換體較佳為在本形質轉換體能夠進行氮同化之氮源之存在下被培養者。能夠進行氮同化之氮源由於根據本形質轉換體之原始宿主之種類而異,故而根據原始宿主之種類而適當準備。例如,與眼蟲不同,若為源自具有亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、或脲酶之微生物之情形之本形質轉換體,則可將亞硝酸態氮、硝酸態氮、或脲用作氮源。氮源就將原料成本抑制得較低之觀點而言,較佳為本形質轉換體能夠進行氮同化之無機態氮,但就不論本形質轉換體之原始宿主之種類均能夠進行氮同化之觀點而言,較佳為選自由游離胺基酸、多肽、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之化合物。除了同樣之觀點,就容易生成本二肽化合物之觀點而言,氮源進而較佳為包含選自由Arg及其鹽所組成之群中之1種以上之化合物、及選自由Asn、Gln、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之化合物。
本組成物3中使本形質轉換體乾燥之方法例如可為加熱乾燥,但就避免損害本二肽化合物等對維持健康有用之各種成分之觀點而言,較佳為冷凍乾燥。本組成物3中,對本形質轉換體實施至少包含乾燥之處理所得之處理物只要為本二肽化合物實質上不變性之程度,則可為進而亦實施了乾燥以外之處理所得之處理物。作為乾燥以外之處理,例如可列舉選自由加熱、冷凍、加壓、減壓、細胞破碎、及放射線照射所組成之群中之1種以上之處理。處理物可為殘存有源自本形質轉換體之本酵素或其變性蛋白質者。例如,可列舉未對本形質轉換體或其乾燥物進行除蛋白處理或純化之處理物。就去除夾雜物之觀點而言,本組成物3較佳為不含源自本形質轉換體之脂質、源自本形質轉換體之分子質量為4.0 kDa以上之蛋白質、及源自本形質轉換體之分子質量為4.0 kDa以上之多肽的組成物。
本組成物3中,本二肽化合物之含量、其測定方法、用途、作為食品組成物可取之形態、標識、濃縮、純化、或眼蟲等有關之較佳事項與關於本組成物1或本組成物2前述者同樣。本組成物3就能夠高效率地製造之觀點而言,較佳為藉由以下說明之本發明之組成物之製造方法之第3實施態樣而製造者。
<組成物之製造方法之第3實施態樣>
在說明本發明之組成物之製造方法之第3實施態樣(以下稱為「本製法3」)時,與前述之本製法1、本製法2、及本組成物3有較多共通事項,大致省略共通事項之說明,主要說明不同之事項。如圖3所示,本製法3包括準備步驟S31與培養步驟S32,係能夠使用本形質轉換體製造本組成物3之方法。本形質轉換體有關之較佳事項如前所述。
在準備步驟S31中,準備前述之本形質轉換體、及含有本形質轉換體能夠進行氮同化之氮源之培養基。本形質轉換體由於能夠與原始宿主在同樣之條件下培養,故而根據原始宿主之種類準備適於本形質轉換體之培養之培養基即可。例如,在準備使眼蟲進行形質轉換而成之本形質轉換體之情形時,準備本製法2之說明中前述之CM培養基(表1)、Hutner培養基(表2)、KH培養基(表3)、或自該等培養基變更一部分配方所得之培養基即可。例如在準備使酵母進行形質轉換而成之本形質轉換體之情形時,可準備YNB(Yeast Nitrogen Base,酵母氮源基礎)培養基、於YNB培養基中添加碳源或硫酸銨而成之DOB培養基、或於DOB培養基中添加各種胺基酸或腺嘌呤等而成之SD培養基等一般適於酵母之培養之培養基。一般在SD培養基之配方中包含Arg。就容易生成本二肽化合物之觀點而言,培養基中之氮源較佳為包含選自由Arg及其鹽所組成之群中之1種以上之化合物、與選自由Asn、Gln、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之化合物。
在藉由本製法3例如以含有本二肽之醬油或味噌等形態製造本組成物3之情形時,於準備步驟S31中,準備使麴菌進行形質轉換而成之本形質轉換體、作為培養基之膨潤之大豆與米及/或小麥即可。在以含有本二肽化合物之乳酪、朝鮮泡菜、或熟壽司等形態製造本組成物3之情形時,準備將乳酸菌進行形質轉換而成之本形質轉換體與作為培養基之奶、白菜、或魚肉即可。在以含有本二肽化合物之納豆等形態製造本組成物3之情形時,準備使納豆菌進行形質轉而成之本形質轉換體、及作為培養基之膨潤之大豆即可。在以含有本二肽化合物之醋等形態製造本組成物3之情形時,準備使醋酸菌進行形質轉換而成之本形質轉換體、及作為培養基之糖化之醪即可。在以含有本二肽化合物之啤酒之形態製造本組成物3之情形時,較佳為準備使啤酒酵母(例如釀酒酵母菌)進行形質轉換而成之本形質轉換體、及作為培養基之冷卻至5℃左右之麥汁。在以含有本二肽化合物之日本酒之形態製造本組成物3之情形時,較佳為準備使釀酒酵母菌進行形質轉換而成之本形質轉換體、及作為培養基之醪。在以含有本二肽化合物之葡萄酒或蘋果酒之形態製造本組成物3之情形時,較佳為準備使釀酒酵母菌進行形質轉換而成之本形質轉換體、及作為培養基之葡萄果汁或蘋果果汁。在以含有本二肽化合物之麵包之形態製造本組成物3之情形時,較佳為準備使釀酒酵母菌進行形質轉換而成之本形質轉換體、及作為培養基之中種。
在培養步驟S32中,在培養基之存在下培養本形質轉換體,使本形質轉換體生長而增加細胞數之過程中,使本形質轉換體生成本二肽化合物。在準備使眼蟲進行形質轉換而成之本形質轉換體之情形時,可與針對前述本製法2之培養步驟S22(圖2)之說明同樣地進行圖3所示之培養步驟S32。在準備使眼蟲以外之微生物進行形質轉換而成之本形質轉換體之情形時,藉由適合使原始之宿主生長而增加細胞數之培養條件,從而避免雜菌之繁殖地培養本形質轉換體。例如,在準備使麴菌進行形質轉換而成之本形質轉換體之情形時,較佳為在培養基(大豆、小麥、米等)之存在下,保持為25℃以上且35℃以下左右之溫度數天,一面使培養基醱酵一面進行培養。例如,在準備使納豆菌進行形質轉換而成之本形質轉換體之情形時,較佳為在培養基(膨潤之大豆)之存在下,保持為38℃以上且42℃以下左右之溫度約1天,一面使培養基醱酵一面進行培養。例如在準備使啤酒酵母(釀酒酵母菌)進行形質轉換而成之本形質轉換體之情形時,較佳為在培養基(麥汁)之存在下,將液溫保持為0℃以上且6℃以下左右之溫度7天以上且數十天以下,一面使培養基醱酵一面進行培養。例如,在以含有本二肽化合物之葡萄酒之形態製造本組成物3之情形時,較佳為在培養基(葡萄果汁)之存在下,在10℃以上且30℃以下左右之溫度下培養使釀酒酵母菌進行形質轉換而成之本形質轉換體。
在本製法3中,在結束了培養步驟S32中之培養期間之培養基(以下稱為「培養結束之培養基」)中,含有生長而增加了細胞數之本形質轉換體。可將該培養結束之培養基本身視作本組成物3。培養結束之培養基中含有之大量之本形質轉換體在培養期間中代謝氮源,生成本二肽化合物並蓄積於細胞內或分泌至細胞外。因此,若經口攝取培養結束之培養基,則容易在體內起因於ACE阻礙作用而抑制血壓上升。
但是,多數情況下,上述培養結束之培養基本身在食用方面關於風味之良好或長期保存性等存在問題。為了消除該問題,根據欲製造之食品組成物(本組成物3)之形態,只要為無損本二肽化合物之程度,則較佳為進一步進行加工以適合食用培養結束之培養基,但未進行圖示。例如,在以味噌之形式製造本組成物3之情形時,在培養結束之培養基(豆麴)中混合鹽水並裝入桶中等進行長期熟成就作為味噌之風味或保存性良好之觀點而言較佳。例如,在以納豆之形式製造本組成物3之情形時,將培養結束之培養基(醱酵之大豆)冷藏進行熟成就作為納豆之風味或保存性良好之觀點而言較佳。例如,在以醋或葡萄酒之形式製造本組成物3之情形時,使培養結束之培養基(醱酵之醪或葡萄果汁)熟成就作為醋或葡萄酒之風味或保存性良好之觀點而言較佳。例如,在以日本酒製造本組成物3之情形時,壓榨培養結束之培養基(醱酵之醪),分離酒粕或為了防止腐敗而進行加熱殺菌就作為日本酒之風味或保存性良好之觀點而言較佳。
又,培養步驟S32中所獲得之培養結束之培養基本身中,源自培養基之成分之含有率較多,故而亦有生成之本二肽化合物之含有率相對地不太多之問題。又,例如,在如前述之本製法2中之培養步驟S22(圖2)般培養使眼蟲進行形質轉換而成之本形質轉換體之情形時,就風味等觀點而言,源自培養基之成分不適合食用。於此種情形時,將源自培養基之成分作為夾雜物去除就能夠相對地提高本二肽化合物之含有率而製造容易進一步發揮ACE阻礙作用之本組成物3之觀點而言較佳。就該觀點而言,進而較佳為對培養結束之培養基進一步實施相當於選自由前述本製法2中說明之圖2所示之收集步驟S23、乾燥步驟S24、破碎步驟S25、除蛋白步驟S26、脂質去除步驟S27、濃縮步驟S28、及純化步驟S29所組成之群中之1種以上之步驟的加工處理,此處所列舉之加工處理之數量越多,則進一步更佳。除了同樣之觀點,就抑制純化成本之觀點而言,例如亦較佳為以本二肽化合物之含量成為0.10 mg/L以上且500 g/L以下之方式對培養結束之培養基進行濃縮或純化,該情形時,關於進而較佳之含量,與本組成物1之說明中前述者同樣。
另一方面,例如眼蟲細胞中蓄積有眼蟲澱粉(Paramylon),酵母中含有抗性蛋白(resistant protein)等,根據原始之宿主之種類,可在本形質轉換體中除了本二肽化合物以外亦蓄積有對維持健康有用之各種功能性成分。就避免損害此種功能性成分之觀點而言,對培養步驟32中獲得之培養結束之培養基實施進一步之加工處理之情形時,較佳為避免實施相當於選自由圖2所示之除蛋白步驟S26、脂質去除步驟S27、及純化步驟S29所組成之群中之1種以上之步驟的加工處理。例如,亦較佳為藉由對培養步驟32中所獲得之培養結束之培養基避免除蛋白步驟S26地實施進一步之加工處理,從而以含有前述包含本酵素之1種以上之二肽合成酵素或其變性蛋白質之方式製備本組成物3。
<組成物之製造方法之其他實施態樣>
本發明之組成物之製造方法只要不違背本發明之目的,則亦可為如以下所例示般變更圖2所示之本製法2或圖3所示之本製法3之態樣。準備步驟(S21或S31)中能夠大量地準備已蓄積有許多本二肽化合物之眼蟲細胞或本形質轉換體之情形時,就簡化步驟之觀點而言,可省略培養步驟(S22或S32)。於該情形時,可準備已乾燥之眼蟲細胞或本形質轉換體、或者已脫脂之眼蟲細胞或本形質轉換體,細胞可已死亡。準備步驟(S21或S31)中能夠大量地準備以高密度含有已蓄積有許多本二肽化合物之眼蟲細胞或本形質轉換體之乾燥物或懸浮液之情形時,可不僅省略培養步驟(S22或S32),亦省略收集步驟S23與乾燥步驟S24。
培養步驟(S22或S32)中獲得了培養中水分蒸發而細胞之密度較高之培養基之情形時,可省略收集步驟S23。本製法2中,在破碎步驟S25、除蛋白步驟S26、脂質去除步驟S27、及濃縮步驟S28之各步驟中處理之效率變差亦無問題之情形時,就簡化步驟之觀點而言,可省略收集步驟S23與乾燥步驟S24。在培養步驟(S22或S32)中使用之培養基少量(例如1.0 L以下)之情形時,可將收集步驟S23與乾燥步驟S24彙總進行。可藉由加熱使培養結束之培養基蒸乾,但就避免不期望之加熱變性之觀點而言,較佳為對培養後之培養基進行冷凍乾燥,亦較佳為對培養後之培養基進行離心濃縮。
在破碎步驟S25中,就提高下一除蛋白步驟S26之效率之觀點而言,較佳為對破碎處理物進行濃縮後供於除蛋白步驟S26。為此,例示有採集對破碎處理物進行離心分離而形成之下層、或對破碎處理物進行冷凍乾燥、或對破碎處理物進行離心濃縮等方法。就同樣之觀點而言,在除蛋白步驟S21中,較佳為對除蛋白處理物進行濃縮而供於下一脂質去除步驟S27。或者,就將破碎步驟S25與脂質去除步驟S27彙總而簡化步驟之觀點而言,較佳為將含有眼蟲細胞之乾燥物或細胞懸浮液與無極性溶劑混合,採集形成之萃取殘餘層(水層)。眼蟲為微小之單細胞生物,使細胞乾燥時,細胞膜等略有損壞,故而若將乾燥之眼蟲細胞與無極性溶劑混合,則能夠自該細胞花時間去除脂質。該情形時,較佳為對採集之萃取殘餘層(水層)實施除蛋白處理。或者,就將除蛋白步驟S26與脂質去除步驟S27彙總而簡化步驟之觀點而言,亦較佳為將含有破碎之眼蟲細胞之破碎處理物與發揮作為蛋白質沈澱劑之功能之極性溶劑混合,採集形成之萃取層(極性溶劑之層或水層)。或者,就將破碎步驟S25、除蛋白步驟S26、及脂質去除步驟S27彙總而進一步簡化步驟之觀點而言,亦較佳為將含有眼蟲細胞之乾燥物或細胞懸浮液與發揮作為蛋白質沈澱劑之功能之極性溶劑混合,採集形成之萃取層(極性溶劑之層或水層)。作為發揮作為蛋白質沈澱劑之功能之極性溶劑,例如可列舉乙腈水溶液。或者,可自含有乾燥之眼蟲細胞之乾燥物去除脂質,對獲得之水溶液實施除蛋白處理,將獲得之除蛋白處理物視作眼蟲水性萃取物(本組成物2)。
在純化步驟S29中進行除蛋白處理之情形時,可省略除蛋白步驟S26。本組成物2中,在本二肽化合物之含有率較少亦無問題之情形時、或除本二肽化合物以外含有較多夾雜物亦無問題之情形時,可省略選自由圖2所示之除蛋白步驟S26、濃縮步驟S27、及純化步驟S29所組成之群中之1種以上之步驟。該情形時,可將脂質去除步驟S27中採集之水溶液本身視作眼蟲水性萃取物(本組成物2)。本製法2中,就去除夾雜物而相對地提高本二肽化合物之含有率之觀點而言,可將使眼蟲細胞之收集物與無極性溶劑混合而略微經脫脂之細胞供於乾燥步驟S24。就同樣之觀點而言,可將含有乾燥之眼蟲細胞之乾燥物與無極性溶劑混合而獲得含有略微經脫脂之細胞而成之組成物。
在將本組成物1、本組成物2、或本組成物3製造成加工食品之情形時,較佳為在圖1所示之本製法1、圖2所示之本製法2、或圖3所示之本製法3中,進而混合藥理學上容許之公知之添加劑或公知之食品素材。
本發明亦能夠以在不脫離其主旨之範圍內基於本行業者之知識加以各種改良、修正、或變化之形態或態樣實施,亦可以在產生同一作用效果之範圍內將任意發明特定事項置換成其他技術之形態或態樣實施。以下,示出實施例等對本發明具體地進行說明,但本發明不限於以下之實施例。
[實施例]
<眼蟲細胞中蓄積之二肽之分析>
本發明者等人自大阪府立大學之食品代謝營養學研究室接受該研究室中管理之實驗用之小眼蟲藻細胞株之提供。為了培養該眼蟲細胞使其生長,在燒瓶內製備前述之KH培養基(表3)150 mL作為實驗例1之培養基。又,分別在不同之燒瓶內製備與實驗例1之培養基(KH培養基)相比,除了如以下表4所示摻合較多之游離之Glu、硫酸銨((NH4
)2
SO4
)、及磷酸氫二銨((NH4
)2
HPO4
)以外為相同組成之實驗例2之培養基及實驗例3之培養基各150 mL。
[表4]
實驗例1 | 實驗例2 | 實驗例3 | |
培養基中之Glu之含量 (g/L) | 4.0 | 13.5 | 10.8 |
培養基中之(NH4 )2 SO4 之含量(g/L) | 0.50 | 2.0 | 1.5 |
培養基中之(NH4 )2 HPO4 之含量(g/L) | 0 | 1.3 | 0.63 |
對實驗例1至實驗例3之各培養基,在燒瓶之口部塞上棉塞,藉由高壓釜在2個大氣壓、121℃加壓滅菌15分鐘。將滅菌後之培養基放置於清潔台內,待培養基冷卻後,以雜菌不會混入之方式,對每個培養基以含有1.0×104
個以上且3.0×104
個以下左右之眼蟲細胞之方式,少量地添加細胞之懸浮液。在保持為28℃以上且30℃以下之培養室內,一面對添加有細胞之培養基藉由振盪器以80 rpm左右進行振盪,一面對該培養基持續照射5,000 lux左右之強度之光,培養細胞7天使其生長。
對培養後之實驗例1至實驗例3之各培養基,藉由冷凍乾燥機進行冷凍乾燥而獲得冷凍乾燥物。將冷凍乾燥物200 mg在試管內懸浮於80質量%乙腈水溶液5.0 mL中,製備細胞懸浮液。一面連同試管一起對細胞懸浮液進行水冷,一面藉由超音波破碎機(Tomy Seiko股份有限公司製造,型號名:UR-21P)對細胞懸浮液施加10秒之超音波之振動,將該處理反覆進行3次,獲得細胞之破碎處理液。藉由離心分離機對破碎處理液在4℃施加6,000×G之離心力10分鐘,採集藉由離心分離而形成之上清液約5 mL。藉由離心濃縮機(Tomy Seiko股份有限公司製造,型號名:CC-105)將該上清液離心濃縮至200 μL以下,獲得濃縮物。
為了純化上述之濃縮物以提高本二肽化合物之含有率,製備100 mmol/L之鹽酸作為管柱平衡緩衝液。將該緩衝液注入至固相萃取管柱(Waters Corporation製造,Oasis(註冊商標)MCX管柱)進行平衡化。將實驗例1至實驗例3之各濃縮物與100 mmol/L之鹽酸800 μL混合,將所獲得之混合液注入至已平衡化之管柱。進而,注入甲醇而將管柱內洗淨之後,注入含有500 mmol/L之氨之甲醇,採集自管柱溶出之水溶液。利用離心濃縮使採集之水溶液蒸乾,藉此獲得純化物。
為了進行LC/MS(液相層析質量分析)或LC/MS/MS(使用串聯四極質譜儀之液相層析質量分析),準備LC-MS/MS(Waters Corporation製造,LC之型號:Alliance e 2965、MS/MS之型號:Xevo TQD)。將實驗例1至實驗例3之各純化物溶解於2.0質量%單氟乙酸水溶液中,作為LC/MS用之試樣。又,作為標準試樣,製備含有Gln-Arg與Arg-Gln各1.0 μmol/L,或含有Asn-Arg與Arg-Asn各1.0 μmol/L的2.0質量%單氟乙酸水溶液。作為流動相A,製備含有0.1質量%之甲酸的乙腈溶液。作為流動相B,製備含有100 mmol/L之甲酸銨的水溶液。將胺基酸分析用管柱(Imtakt股份有限公司製造,Intrada Amino Acid,內徑2.0 mm×管柱長50 mm)之管柱溫度保持為40℃,向該管柱中注入20 μL之LC/MS用之試樣及標準試樣之任一者,進而如以下之表5所示般控制流動相A及流動相B之濃度梯度,對該管柱以0.3 mL/分鐘之流速進行送液,使各成分分離,藉此進行LC/MS或LC/MS/MS。
[表5]
試樣注入後之經過時間 | 流動相A | 流動相B |
(分鐘) | (體積%) | (體積%) |
0~0.1 | 100→20 | 0→80 |
0.1~10.1 | 15→10 | 85→90 |
在藉由LC/MS而自標準試樣(Gln-Arg與Arg-Gln)獲得之總離子層析圖中,如圖4所示,在滯留時間6.49分鐘確認到由Gln-Arg產生之波峰,在滯留時間6.88分鐘確認到由Arg-Gln產生之波峰。又,若對Gln-Arg或Arg-Gln實施LC/MS/MS,則由於分子內所具有之精胺酸殘基而產生H2
NC(:NH)NHCH2 -
離子。該產物離子之質荷比為約70。因此,在圖5所示之m/z=70之選擇離子監測之層析圖中,亦在同樣之滯留時間確認到由Gln-Arg產生之波峰與由Arg-Gln產生之波峰。
如圖5所示,在實驗例1至實驗例3之各試樣中,在滯留時間6.88分鐘前後確認到較大之波峰,故而提示任一試樣均含有較多Arg-Gln。在圖5之滯留時間6.49分鐘前後,在實驗例1及實驗例2中未確認到波峰,但在實驗例3中確認到微小之波峰。因此,表示與實驗例1或實驗例2相比,實驗例3之試樣中含有多至可被檢測到之程度之Gln-Arg。如圖5所示,在實驗例1中,確認到多個由Gln-Arg或Arg-Gln以外之肽產生之微小之波峰,與此相對,在實驗例2及實驗例3中,幾乎未確認到同樣之波峰。亦考慮前述之表3或表4,認為與實驗例1之培養基(KH培養基)相比,在實驗例3之培養基中,起因於Glu化合物或氨態氮之含量較多,在培養基中生長之眼蟲細胞中,Arg容易以Arg-Gln或Gln-Arg之形態蓄積。
藉由MassLynx質量分析(MS)用軟體(Waters Corporation製造,4.1版),自圖5所示之層析圖去除雜訊,獲得圖6所示之層析圖。在圖6中之標準試樣中,由Arg-Gln產生之波峰之面積相當於1.0 μmol/L,據此在實驗例1至實驗例3之各試樣中,根據由Arg-Gln產生之波峰之面積算出各試樣中之Arg-Gln之含量。
[表6]
實驗例1 | 實驗例2 | 實驗例3 | |
培養基中之Glu化合物之含量 (mmol/L) | 27.2 | 91.8 | 73.1 |
培養基中之氨態氮之含量 (mmol/L) | 11.0 | 52.6 | 35.6 |
LC/MS用之試樣中之Arg-Gln之含量* 1 (μmol/L) | 4.3×10-3 | 3.4×10-2 | 4.0×10- 2 |
*1 基於由Arg-Gln產生之波峰(圖5)之面積所算出之含量。 |
如表6所示,在實驗例2與實驗例3之各試樣中,與實驗例1之試樣相比,Arg-Gln之含量超過8倍而較多。因此,提示與在實驗例1之培養基(KH培養基)中生長並經過乾燥之眼蟲細胞相比,在實驗例2之培養基或實驗例3之培養基中生長並經過乾燥之眼蟲細胞中含有較多Arg-Gln。認為由於眼蟲細胞在Glu化合物或氨態氮之含量多於KH培養基之培養基中生長,故而該細胞內由Glu化合物或氨態氮大量合成了Arg-Gln。
在根據標準試樣(Asn-Arg與Arg-Asn)藉由LC/MS所獲得之總離子層析圖中,如圖7所示,在滯留時間6.15分鐘確認到由Asn-Arg產生之波峰,在滯留時間6.79分鐘確認到由Arg-Asn產生之波峰。在實驗例1之試樣中確認到該由Asn-Arg產生之波峰,但未在實驗例2及實驗例3之試樣中確認到該由Asn-Arg產生之波峰。又,在實驗例2之試樣中確認到該由Arg-Asn產生之波峰,但未在實驗例1及實驗例3之試樣中確認到該由Arg-Asn產生之波峰。因此,認為Asn-Arg或Arg-Asn根據使眼蟲細胞生長之培養基之組成,有容易蓄積之情形與不易蓄積之情形。
<胺基酸與二肽各自所具有之ACE阻礙活性之評價>
作為具有ACE阻礙活性之游離胺基酸,分別準備Asn、Asp、Gln、Glu、及Arg(均為協和醱酵麒麟股份有限公司製造)。另外準備將該等5種游離胺基酸每種等質量地混合而成之混合組成物。作為ACE阻礙活性測定用之一套受質溶液或酵素溶液等,準備同仁化學研究所股份有限公司製造之ACE Kit-WST。
在18 mΩ之Milli-Q水中,溶解上述游離胺基酸之任1種或混合組成物,製備比較試驗用之溶液。依據ACE Kit-WST之說明書所記載之測定操作方法,混合比較試驗用之溶液20 μL、受質溶液20 μL、及酵素溶液20 μL,製備混合液60 μL。以該混合液中游離胺基酸之含量例如成為500 mg/L、或1,000 mg/L之方式進行製備。作為不含ACE阻礙物質之對照組,製備混合Milli-Q水代替比較試驗用之溶液而成之混合液。作為不含ACE之對照組,製備混合有Milli-Q水代替酵素溶液而成之混合液。將該等混合液分別在37℃保持10分鐘後,測定針對波長450 μm之光之光學密度(以下稱為「OD450
」)。將不含ACE阻礙物質之對照組中之OD450
之測定值視為顯示ACE阻礙率0%者,將不含ACE之對照組中之OD450
之測定值視為顯示ACE阻礙率100%者,然後基於OD450
之測定結果算出各混合液之ACE阻礙率。將算出結果之平均值示於以下表7。
[表7]
游離胺基酸之含量 | |||||
100 mg/L | 200 mg/L | 500 mg/L | 1,000 mg/L | ||
ACE阻礙率 (%) | Asn | - | - | 11.9 | 30.7 |
Asp | - | - | 35.7 | 43.3 | |
Gln | - | - | 9.4 | 29.3 | |
Glu | - | - | 11.7 | 18.0 | |
Arg | - | - | 11.0 | 21.2 | |
游離胺基酸之混合組成物*2 | 37.2 | 47.2 | 48.4 | 64.9 | |
n=2,表中之「-」意味著未進行ACE阻礙率之測定。 *2 等質量之Asn、Asp、Gln、Glu、及Arg混合而成之組成物。 |
又,委託GenScript公司之肽合成受託服務,準備Arg-Gln、Gln-Arg、Arg-Asn、及Asn-Arg。該等二肽係以游離之Arg與Asp、或游離之Arg及Gln為原料,藉由肽合成而製備。在測定基於該等二肽各自之ACE阻礙率時,在混合液中,以0.12 mg/L、0.62 mg/L、3.1 mg/L、15 mg/L、或77 mg/L之任一濃度含有Arg-Gln、Gln-Arg、Arg-Asn、及Asn-Arg之任1種二肽,除此以外,藉由與前述之游離胺基酸中之ACE阻礙率之測定同樣之方法進行測定,算出ACE阻礙率。將算出之平均值示於圖8與以下之表8。
[表8]
二肽之含量 | ||||||
0.12 mg/L | 0.62 mg/L | 3.1 mg/L | 15 mg/L | 77 mg/L | ||
ACE阻礙率 (%) | Arg-Gln | N.D. | 6.1 | 21.9 | 65.5 | 87.3 |
Gln-Arg | 3.5 | 14.9 | 27.2 | 53.7 | 82.8 | |
Arg-Asn | 8.1 | 11.1 | 48.8 | 81.3 | 94.6 | |
Asn-Arg | N.D. | N.D. | 31.7 | 66.5 | 91.8 | |
n=2 N.D.意味著因測定值之誤差而無法算出ACE阻礙率。 |
如圖8與表8所示,在含有4種二肽中之任1種之混合液中,二肽之含量越多則ACE阻礙率之值越大。比較表7與表8,雖然與游離胺基酸相比二肽之量少,但ACE阻礙率之值亦較高。根據該實驗結果,本發明者等人發現:Arg-Gln、Gln-Arg、Arg-Asn、及Asn-Arg分別係具有強於Arg等游離胺基酸之ACE阻礙活性之二肽。如表8所示,二肽之含量為3.1 mg/L至77 mg/L之混合液中之ACE阻礙率之值較大,因此認為若對記載為「N.D.」之部分再次進行實驗,則可獲得具有較小之值之ACE阻礙活性的實驗資料。
<包含眼蟲水性成分而成之組成物之試製>
與前述之實驗例1同樣地,接受小眼蟲藻之細胞株之提供。為了培養眼蟲使之生長,自前述之CM培養基(表1)變更組成之一部分,在燒瓶內製備以下表9所示之組成之培養基150 mL作為實驗例4之培養基。又,在單獨之燒瓶內分別製備150 mL與實驗例4之培養基(表9)相比,除了如表10所示Glu或磷酸氫二銨((NH4
)2
HPO4
)之含量較多以外為相同之組成的實驗例5至實驗例10之各培養基。
[表9]
成分 | 含量 (g/L) | 成分 | 含量 (g/L) | ||
維生素 | 維生素B1 維生素B12 | 1.0×10-4 5.0×10-7 | MgSO4 •7H2 O CaCl2 •2H2 O | 0.20 0.020 | |
碳水化合物 | 葡萄糖 | 0.50 | Fe2 (SO4 )3 •7H2 O | 3.0×10-3 | |
檸檬酸3Na•2H2 O | 0.80 | 其他無機鹽 | MnCl2 •4H2 O | 1.8×10-3 | |
胺基酸 | Glu | 0 | CoSO4 •7H2 O | 1.5×10-3 | |
銨 鹽 | (NH4 )2 SO4 | 1.0 | ZnSO4 •7H2 O | 4.0×10-4 | |
(NH4 )2 HPO4 | 0 | Na2 MoO4 •2H2 O | 2.0×10-4 | ||
pH緩衝劑 | KH2 PO4 | 1.0 | CuSO4 •5H2 O | 2.0×10-5 | |
實驗例4之培養基之組成之剩餘部分為水。 |
[表10]
實驗例4 | 實驗例5 | 實驗例6 | 實驗例7 | 實驗例8 | 實驗例9 | 實驗例10 | |
培養基中之Glu之含量 (g/L) | 0 | 0 | 0 | 0 | 1.0 | 2.0 | 5.0 |
培養基中之(NH4 )2 HPO4 之含量 (g/L) | 0 | 1.0 | 2.0 | 5.0 | 0 | 0 | 0 |
與前述之實驗例1同樣地,對實驗例4至實驗例10之各培養基進行加壓滅菌並冷卻後,添加眼蟲細胞之懸浮液,一面振盪一面照射光,花7天進行培養,藉此使細胞生長。在培養期間結束時,攪拌各培養基並少量採集,滴加至血球計上,在液滴上貼附覆蓋玻璃。利用顯微鏡進行觀察,數出血球計上之1.0 mm×1.0 mm之區塊內存在之細胞數,藉由以下之數式1算出培養基每1.0 mL之眼蟲細胞數。
將培養後之實驗例4至實驗例10之各培養基分注至試管,藉由離心分離機在4℃施以2,000×G之離心力。採集藉由離心分離而形成之細胞之顆粒,將該顆粒懸浮於少量之tris-鹽酸緩衝液中,藉此獲得以高密度含有眼蟲細胞之細胞懸浮液。將該細胞懸浮液與超音波破碎機之振動棒放入至燒杯內,一面對燒杯進行水冷一面反覆施加20 kHz之振動,獲得眼蟲細胞之破碎處理液。將該破碎處理液移至新的試管內,在4℃施加6,000×G之離心力,回收形成之上清液。將該上清液與三氯乙酸進行混合,在4℃施加6,000×G之離心力,使蛋白質沈澱,獲得經過了除蛋白處理之上清液。將該上清液與二乙醚混合,將上清液中所含有之脂質萃取至二乙醚中。去除形成了二乙醚之層,採集形成之水層。將該水層藉由冷凍乾燥機進行乾燥,獲得實驗例4至實驗例10之各冷凍乾燥物(包含眼蟲水性成分而成之組成物)。稱量該等冷凍乾燥物各自之總質量。
<試製之組成物中之ACE阻礙活性之評價>
對實驗例4至實驗例10之各者採集上述冷凍乾燥物中之200 μg,溶解於pH5.0之乙酸緩衝液20 μL,進而與0.5質量%茚三酮試液40 μL進行混合。將冷凍乾燥物與乙酸緩衝液與茚三酮試液之混合液在沸騰熱水浴中加熱15分鐘後,在室溫(20℃前後)下放置30分鐘進行冷卻。向放置了30分鐘之混合液中混合50體積%乙醇水溶液260 μL,對所獲得之溶液藉由分光光度計測定對波長595 μm之光之光學密度(OD595
)。基於藉由游離之Arg之標準品所得的校準曲線(以下將此稱為「Arg換算」),算出各實驗例之冷凍乾燥物中之胺基酸之絕對量(游離胺基酸與構成肽之胺基酸之合計量)。
另外採集實驗例4至實驗例10之各冷凍乾燥物之一部份,與Milli-Q水混合,藉此製備用以測定ACE阻礙活性之試樣溶液。使用前述之ACE Kit-WST,依據該說明書所記載之測定操作之方法,混合試樣溶液20 μL、受質溶液20 μL、及酵素溶液20 μL。藉由該混合,以Arg換算中之胺基酸之絕對量成為45 mg/L之方式,製備含有實驗例4至實驗例10之各冷凍乾燥物之任一者之混合液60 μL。將該混合液在37℃保持10分鐘後測定OD450
,如前所述算出ACE阻礙率。將算出結果之平均值示於以下表11。
[表11]
實驗例4 | 實驗例5 | 實驗例6 | 實驗例7 | 實驗例8 | 實驗例9 | 實驗例10 | |
培養基中之Glu之含量 (mmol/L) | 0 | 0 | 0 | 0 | 6.8 | 13.6 | 34.0 |
培養基中之氨態氮之含量 (mmol/L) | 15.1 | 30.3 | 45.4 | 90.9 | 15.1 | 15.1 | 15.1 |
培養了7天之培養基每1.0 ml中存在之眼蟲之細胞數*3 (個) | 2.2×106 | 1.9×106 | 1.8×106 | 1.1×106 | 3.0×106 | 3.3×106 | 6.4×106 |
冷凍乾燥物之總質量 (mg) | 52 | 36 | 56 | 34 | 35 | 116 | 39 |
冷凍乾燥物每1,000 mg中之原料眼蟲之細胞數*4 (個) | 1.8×109 | 7.9×109 | 4.8×109 | 4.9×109 | 1.3×1010 | 4.3×109 | 2.5×1010 |
冷凍乾燥物每1,000 mg中之胺基酸之絕對量*5 (mg) | 50.4 | 87.1 | 80.8 | 81.4 | 71.4 | 90.0 | 96.6 |
胺基酸之絕對量為45 mg/L之混合液之ACE阻礙率*6 (%) | 38.1 | 38.1 | 49.3 | 75.7 | 54.6 | 47.4 | 70.3 |
*3 前述數式1中之NC 之值。 *4 藉由[NC (個/ml)x150(ml)x1,000(mg)]/[冷凍乾燥物之總共質量(mg)]之計算式算出。 *5 胺基酸之絕對量之值係藉由Arg換算而算出。 *6 n=2 |
如表11所示,實驗例4至實驗例10均「胺基酸之絕對量為45 mg/L之混合液之ACE阻礙率」之值為38%以上。若亦考慮前述表7及表8所示之ACE阻礙率之值,則推測實驗例4至實驗例10之各冷凍乾燥物含有本二肽化合物之形態之Arg多於游離胺基酸之形態之Arg。又,根據表11所示之實驗例4至實驗例7之比較,顯示「培養基中之氨態氮之含量」越增加,則「培養了7天之培養基每1.0 mL中存在之眼蟲細胞數」越減少。另一方面,與實驗例4或實驗例5相比,在實驗例6或實驗例7中,「培養基中之氨態氮之含量」越增加,則「胺基酸之絕對量為45 mg/L之混合液之ACE阻礙率」之值越大。因此,認為若培養基中之氨態氮之含量為38 mmol/L以上,則氨態氮之含量越增加,細胞數越不易增加,但單個細胞中本二肽化合物容易大量地蓄積。
藉由表11所示之實驗例4、或實驗例8至實驗例10之比較,顯示在培養基中之氨態氮之含量為15.1 mmol/L之情形時,培養基中之Glu之含量越多,則「培養了7天之培養基每1.0 mL中存在之眼蟲細胞數」越增加,「胺基酸之絕對量為45 mg/L之混合液之ACE阻礙率」之值越大。又,與實驗例4至實驗例7相比,在實驗例8與實驗例10中,「冷凍乾燥物每1,000 mg中之原料之眼蟲細胞數」較多。因此,推測在培養基中之氨態氮之含量為15.1 mmol/L之情形時,若培養基中之Glu之含量變多,則細胞數容易增加,藉此於冷凍乾燥物中聚集大量之本二肽化合物。
<動物實驗>
進行對於經口攝取本發明之組成物而發揮之ACE阻礙作用等加以驗證之動物實驗。為了試製供於動物實驗之組成物(實驗例11之冷凍乾燥物),準備GE Healthcare Japan股份有限公司製造之Sephadex G-10作為凝膠過濾層析用載體,填充於直徑1.5 cm×長度15 cm之管柱。Sephadex G-10之排除極限為700 Da。排除極限係通過管柱內之分子被固定相(載體)捕捉而能夠區分之分子量之上限值。因此,Sephadex G-10係適合區分如本二肽化合物般分子量相對較小之肽的載體。作為預備實驗,在約20℃之室溫下,使含有Gln-Arg、Glu、及Arg之溶液通入至填充有Sephadex G-10之管柱,調查含有Gln-Arg但實質上不含Glu或Arg之組分自管柱流出之滯留時間。又,與前述實驗例1同樣地,接受小眼蟲藻細胞株之提供。自前述之KH培養基(表3)變更組成之一部分,在燒瓶內製備以下表12所示之組成之實驗例11之培養基150 mL。
[表12]
成分 | 含量 (g/L) | 成分 | 含量 (g/L) | ||
維生素 | 維生素B1 | 2.5×10-3 | (NH4 )2 SO4 | 2.0 | |
維生素B12 | 5.0×10-6 | (NH4 )2 PO4 | 1.0 | ||
碳水化合物 | 葡萄糖 | 12.0 | 銨鹽 | NH4 HCO3 | 0.25 |
蘋果酸 | 6.5 | Fe(NH4 )2 (SO4 )2 •6H2 O | 0.050 | ||
檸檬酸3Na | 0.50 | (NH4 )6 Mo7 O24 •4H2 O | 4.0×10-3 | ||
琥珀酸2Na | 0.10 | NH4 VO3 | 5.0×10-4 | ||
胺基酸 | Arg鹽酸鹽 | 0.50 | MgCO3 | 0.60 | |
Asp | 0.30 | CaCO3 | 0.12 | ||
Glu | 10.0 | MnSO4 •H2 O | 0.018 | ||
甘胺酸 | 0.30 | 其他無機鹽 | ZnSO4 •7H2 O | 0.025 | |
L-組胺酸鹽酸鹽 | 0.050 | CuSO4 | 1.2×10-3 | ||
緩衝劑 | KH2 PO4 | 0.25 | CoSO4 •7H2 O | 5.0×10-4 | |
螯合劑 | EDTA-Na2 | 0.050 | H3 BO3 NiSO4 •6H2 O | 6.0×10-4 5.0×10-4 | |
實驗例11之培養基中之組成之剩餘部分為水。在實驗例11之培養基中,Glu化合物之含量為68.0 mmol/L,氨態氮之含量為48.9 mmol/L。 |
除了使用上述之實驗例11之培養基以外,以與前述之實驗例1同樣之方式,培養眼蟲細胞使之生長,使培養後之培養基冷凍乾燥,製備細胞懸浮液並施以超音波破碎,從而獲得破碎處理液。將該破碎處理液在約20℃之室溫下注入至填充有Sephadex G-10之管柱中進行區分,以與前述之預備實驗中流出本二肽化合物相同之滯留時間獲得自管柱流出之組分。此處所獲得之組分係實質上不含源自眼蟲細胞之脂質、蛋白質、游離胺基酸及其鹽、以及分子量相對較大之多肽或寡肽,含有以本二肽化合物之含有率提高之方式經純化之眼蟲水性萃取物的溶液。使該組分進行冷凍乾燥,獲得實驗例11之冷凍乾燥物。以與前述之實驗例4至實驗例10同樣之方式測定實驗例11之冷凍乾燥物中之胺基酸之絕對量(游離胺基酸與構成肽之胺基酸之合計量)。其後,將實驗例11之冷凍乾燥物以胺基酸之絕對量成為2.0 mg/L之方式與生理鹽水混合,製備試樣水。
自Charles River Laboratories Japan股份有限公司購買12隻SPF(Specific Pathogen Free,無特定病原)化之12週齡之雄性SHR/NCrlCrlj大鼠(以下稱為「SHR大鼠」)。SHR大鼠係伴隨年齡增加,高血壓自然發病之系統之實驗動物。動物實驗係依據美國國立衛生研究所之「關於動物實驗之管理與使用之方針」實施。在20℃以上且26℃以下、相對濕度保持為50%RH以上且70%RH以下之飼養室內,將12隻SHR大鼠分成6隻對照組大鼠與6隻實驗組大鼠,使它們自由攝取以下之表13所示之配方之飼料(以下稱為「飼養用飼料」),花6天進行預備飼養後,使它們絕食12小時。
[表13]
摻合量 (質量%) | ||
β化玉米澱粉 | 46.57 | |
α化玉米澱粉 | 15.50 | |
砂糖 | 10.00 | |
乳酪蛋白 | 14.00 | |
精製大豆油 | 4.00 | |
纖維素粉 | 5.00 | |
複合礦物質 | 3.50 | |
複合維生素 | 1.00 | |
DL-甲硫胺酸 | 0.18 | |
酒石酸氫膽鹼 | 0.25 | |
準備基於非侵入法之大鼠用血壓計(Softron股份有限公司製造,型號:BP-98A-L)。將前述之12小時之絕食結束之時點作為實驗開始時,在該時點,在飼養室內之環境下使用大鼠用血壓計,測定尾巴根部之收縮期血壓(SBP)與擴張期血壓(DBP)。實驗開始時測定血壓後,使對照組大鼠自由攝取生理鹽水與飼養用飼料,使實驗組大鼠自由攝取前述之試樣水與飼養用飼料,分別在飼養室內飼養7週。在預備飼養或之後之飼養中,任一大鼠均在外觀或體重增加方面未見異常。關於對照組大鼠之生理鹽水之攝取量與實驗組大鼠之試樣水之攝取量,每隻大鼠可見若干個體差異,但6隻對照組大鼠之平均值與6隻實驗組大鼠之平均值為同程度。同樣地,關於飼養用飼料之攝取量亦可見若干個體差異,但6隻對照組大鼠之平均值與6隻實驗組大鼠之平均值為同程度。自實驗開始經過5週、6週、及7週時,與實驗開始時同樣地測定SBP及DBP。經過7週時測定SBP與DBP後,自尾靜脈採血,對獲得之血液進行離心分離而獲得血清。使用該血清與大鼠用血管收縮素II定量套組(Cloud-Clone Corp. WUHAN公司製造,型號:KSA005Ra11),利用依據該套組之說明書之測定方法測定血管收縮素II之血中濃度。將測定結果示於圖9(a)、圖9(b)、及以下之表14。
[表14]
對照組大鼠 | 實驗組大鼠 | ||
SBP (mmHg) | 實驗開始時 (經過0週時) | 193.7±8.2 | 194.2±7.3 |
經過5週時 | 266.3±13.5 | 252.7±14.8 | |
經過6週時 | 284.8±11.6 | 228.8±16.2 | |
經過7週時 | 265.0±10.1 | 243.5±13.5 | |
DBP (mmHg) | 實驗開始時 (經過0週時) | 153.8±10.2 | 154.8±7.0 |
經過5週時 | 204.5±11.2 | 193.2±11.2 | |
經過6週時 | 221.7±10.2 | 190.7±11.0 | |
經過7週時 | 211.0±12.2 | 198.7±11.4 | |
血管收縮素II之血中濃度 (pg/mL) | 經過7週時 | 196±23 | 128±43 |
n=6、平均值±標凖偏差 |
如圖9(a)與表14所示,對實驗開始時之SBP與DBP未在對照組大鼠與實驗組大鼠之間實質上確認到差。另一方面,自實驗開始起經過5週、6週、及7週時,關於SBP與DBP,實驗組大鼠均顯示低於對照組大鼠之值。關於經過6週時之SBP與DBP,實驗組大鼠顯示較對照組大鼠有意義地低之值。如圖9(b)與表14所示,關於實驗開始起經過7週時之血管收縮素II之血中濃度,實驗組大鼠顯示較對照組大鼠有意義地低之值。根據該等結果,提示在持續經口攝取實驗例11之冷凍乾燥物之實驗組大鼠中,實驗開始時之伴隨年齡增加之血壓上升被抑制得緩慢。認為該作用係由於在實驗組大鼠之體內,實驗例11之冷凍乾燥物所含有之本二肽化合物發揮ACE阻礙作用,藉此將血管收縮素II之生成量抑制得較少。若考慮到該作用機制,則認為實驗組11之冷凍乾燥物不限於SHR大鼠,適合作為包括人在內之哺乳動物中高血壓之預防用或改善用之食品組成物。
<形質轉換體之製作、及二肽連接酶之純化>
以下,對本發明者等人進行之形質轉換體之試製與二肽連接酶之純化進行說明時,自眼蟲細胞單離編碼二肽連接酶之多核苷酸之方法、製作含有單離之多核苷酸之重組載體之方法、將重組載體導入至微生物製作形質轉換體之方法、培養製作之形質轉換體使之增殖之方法、自增殖之形質轉換體萃取酵素進行純化之方法分別可由本行業者根據需要將公知之方法適當組合來實施,故而省略詳細之說明。作為此處所謂之公知之方法,例如可列舉:Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、或者Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Press (1989)等中記載之方法。
本發明者等人使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool,基礎區域排列搜尋工具)等程式進行鹼基序列之相同性檢索,自小眼蟲藻Z株之染色體DNA之鹼基序列中發現了與編碼其他種類之微生物所具有之連接酶之公知之鹼基序列相比有50%左右之相同性的序列編號2所記載之鹼基序列。基於相同性檢索之結果,如以下所說明,使用小眼蟲藻Z株進行選殖,單離出具有序列編號2所記載之鹼基序列(2,955 bp)與包含其上游側之啟動子序列與下游側之終止子序列之鹼基序列的多核苷酸(2,970 bp),將單離出之多核苷酸導入至大腸桿菌或酵母,藉此試製表現源自眼蟲細胞之二肽連接酶之形質轉換體。
在培養室內一面將KH培養基(前述之表3)之液溫保持為26℃,一面對小眼蟲藻之Z株利用KH培養基花6天進行振盪培養。對培養後之培養基進行離心分離(1,500 rpm、6分鐘),以形成之沈澱物回收被培養之眼蟲細胞。自回收之眼蟲細胞藉由CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,溴化十六烷基三甲銨)法(Nucleic Acids Research, volume 8, Issue 19, pp.4321-4325 (1980))製備包含mRNA之總RNA。自製備之總RNA使用TAKARA BIO股份有限公司製造之PrimeScript™ II 1st
strand cDNA Synthesis Kit,製作源自眼蟲細胞之cDNA庫。基於序列編號2所記載之鹼基序列與位於其上游側或下游側之鹼基序列之資訊,設計並準備由序列編號3所記載之鹼基序列構成之正義引子(sense primer)與由序列編號4所記載之鹼基序列構成之反義引子(antisense primer)。使用該正義引子與反義引子進行PCR法,自源自眼蟲細胞之cDNA庫獲得擴增cDNA片段而成之PCR擴增產物。採集該PCR擴增產物之一部分進行瓊脂糖凝膠電泳,藉此確認到PCR擴增產物實質上由約2,970 bp之cDNA片段構成。確認之後,藉由乙醇沈澱法純化PCR擴增產物,獲得純化之cDNA片段。
準備Promega公司製造之BL21(DE)pLysS勝任細胞與TAKARA BIO股份有限公司製造之表現載體pColdTM
II DNA(4,392 bp之環狀質體,本案申請時之說明書URL https://catalog.takara-bio.co.jp/PDFS/3362_DS_j.pdf)、及TAKARA BIO股份有限公司製造之表現載體pColdTM
TF DNA(5,769 bp之環狀質體,本案申請時之說明書URL https://catalog.takara-bio.co.jp/PDFS/3365_DS_j.pdf)。在pColdTM
II DNA與pCold™ TF DNA各者中,藉由在環狀質體之多重選殖位點所包含之NdeI位點與EcoRI位點之間接合經純化之cDNA片段,從而製作2種重組載體,該2種重組載體含有:由包括序列編號2所記載之鹼基序列、包含位於上游側之啟動子序列之鹼基序列、及包含位於下游側之終止子序列之鹼基序列的鹼基序列構成之多核苷酸。將2種重組載體分別導入至大腸桿菌(E.coli)株BL21(DE)pLysS勝任細胞之細胞內。將導入有2種重組載體之大腸桿菌株在含有安比西林與氯黴素之LB瓊脂培養基盤上進行培養,採集培養基盤上形成之白色菌落,藉此選擇地採集經形質轉換之大腸桿菌株。使用經形質轉換之大腸桿菌株所包含之大腸桿菌,藉由鹼-SDS法製備環狀質體DNA。對製備之環狀質體DNA藉由限制酶處理分別在NdeI位點與EcoRI位點進行切斷,藉由瓊脂糖凝膠電泳確認切出之插入DNA為約2,070 bp。藉由使用Thermo Fisher Scientific公司製造之ABI PRISM(註冊商標)3100基因分析儀,從而確認插入DNA具有序列編號2所記載之鹼基序列。因此,提示試製之大腸桿菌為將含有由序列編號2所記載之鹼基序列構成之多核苷酸之重組載體導入至細胞內而進行了形質轉換之形質轉換體。
以對於pColdTM
II DNA組入有由包括序列編號2所記載之鹼基序列、包含上游側之啟動子序列之鹼基序列、及包含下游側之終止子序列之鹼基序列的鹼基序列構成之多核苷酸而成之重組載體為模板,藉由PCR法擴增具有編碼由序列編號1所記載之胺基酸序列與His標籤序列構成之多肽之鹼基序列(3,081 bp)的cDNA片段。在該PCR法中,使用TAKARA BIO股份有限公司製造之PrimeSTAR(註冊商標)Max DNA聚合酶、由序列編號5所記載之鹼基序列構成之正義引子、及由序列編號6所記載之鹼基序列構成之反義引子,獲得使該cDNA片段擴增而成之PCR擴增產物。採集該PCR擴增產物之一部分,進行瓊脂糖凝膠電泳,藉此確認PCR擴增產物實質上由約3,081 bp之cDNA片段構成。確認之後,藉由利用乙醇沈澱法純化PCR擴增產物,從而獲得具有編碼由序列編號1所記載之胺基酸序列與His標籤序列構成之多肽之鹼基序列的cDNA片段之純化物。
藉由PCR法擴增Thermo Fisher Scientific公司製造之pYES2酵母表現載體(5,856 bp之環狀質體,本案申請時之說明書URL https://assets.fishersci.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pyes2_man.pdf?_ga =2.240319687.539912641.1601619011-1502215192.1601619011)之片段。在該PCR法中,使用前述之PrimeSTAR(註冊商標)Max DNA聚合酶、由序列編號7所記載之鹼基序列構成之正義引子、及由序列編號8所記載之鹼基序列構成之反義引子,獲得使pYES2酵母表現載體之片段擴增而成之PCR擴增產物。採集該PCR擴增產物之一部分進行瓊脂糖凝膠電泳,藉此確認PCR擴增產物實質上由約5,896 bp之DNA片段構成。確認之後,藉由乙醇沈澱法純化PCR擴增產物,獲得擴增之pYES2酵母表現載體之片段之純化物。
使用TAKARA BIO股份有限公司製造之In-Fusion(註冊商標)HD選殖套組、具有編碼由序列編號1所記載之胺基酸序列與His標籤序列構成之多肽之鹼基序列的cDNA片段之純化物、及經擴增之pYES2酵母表現載體之片段之純化物,製備該cDNA片段組入至pYES2酵母表現載體之片段中而成之重組載體。將該重組載體導入至SciTrove公司製造之大腸桿菌(E.coli)Competent high DH5α之細胞內。將導入有該重組載體之大腸桿菌株在含有安比西林之LB瓊脂培養基盤上進行培養,採集培養基盤上形成之白色菌落,藉此選擇地採集經形質轉換之大腸桿菌株。使用經形質轉換之大腸桿菌株所含之大腸桿菌,藉由鹼-SDS法製備質體DNA。針對製備之質體DNA,藉由前述之ABI PRISM(註冊商標)3100基因分析儀,確認包含序列編號2所記載之鹼基序列及編碼His標籤之鹼基序列。於該確認之後,將pYES2酵母表現載體之片段中組入了具有編碼包含序列編號1所記載之胺基酸序列及His標籤序列之多肽之鹼基序列的cDNA片段而成的重組載體導入至酵母(釀酒酵母菌)W303-1A株之細胞內。將該導入了重組載體之酵母株在以自葡萄糖含量為2質量%之固體狀之SD培養基去除了尿嘧啶之配方製備的SD(-Ura)培養基盤中進行培養,採集培養基盤上形成之白色菌落,藉此選擇地採集經形質轉換之酵母株。此處採集之經形質轉換之酵母株為本形質轉換體之說明中前述之酵母株(NITE ABP-03293)。
自酵母株(NITE ABP-03293)採集一部分酵母,誘導包含His標籤之二肽連接酶之表現。為此,首先藉由自通常用於酵母培養之SD培養基之配方去除了尿嘧啶之配方,製備SD(-Ura)培養基。然後,準備以作為酵母之碳源之葡萄糖含量成為2質量%之方式製備的3 mL之SD(-Ura)液體培養基、及以作為酵母之碳源之葡萄糖含量成為0.1質量%之方式製備之100 mL之SD(-Ura)。將3 mL之SD(-Ura)培養基之液溫保持為30℃,將自酵母株(NITE ABP-03293)採集之一部分酵母在該培養基中振盪培養一晚。次日早上,向100 mL之SD(-Ura)液體培養基以對於波長600 μm之光之光學密度(OD600
)測定值成為OD600
=0.12之方式繼代培養酵母株。將繼代培養之約100 mL之SD(-Ura)液體培養基之液溫保持為30℃,對該培養基進行振盪培養直至OD600
=0.6左右。向OD600
=0.6左右之約100 mL之SD(-Ura)液體培養基以半乳糖之最終濃度成為2質量%之方式添加半乳糖後,將液溫保持為30℃,花費20小時進行振盪培養,藉此在酵母中誘導具有His標籤之二肽連接酶之表現。
其後,藉由離心分離機將約100 mL之SD(-Ura)液體培養基進行離心分離(8,000 rpm,4℃,10分鐘),以形成之沈澱物回收酵母。將回收之酵母藉由安井器械股份有限公司製造之破碎機Multi-Beads Shocker(註冊商標)進行細胞破碎後,進行離心分離(14,000 rpm,4℃,10分鐘),採集形成之上清液。又,準備填充有使用對His標籤具有高特異性之Co2+
之固定化金屬親和層析樹脂TALON(註冊商標)金屬親和樹脂(TAKARA BIO股份有限公司製造)的管柱。將採集之上清液通入該管柱內,藉此對上清中含有之與His標籤結合之二肽連接酶進行親和純化。採集經親和純化之二肽連接酶之一部分,進行SDS-PAGE(SDS Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis,SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳),結果獲得了圖10所示之電泳凝膠。根據基於該電泳凝膠所示之分子質量標記物之條帶而製成之校準曲線,針對圖10所示之純化酵素(即經親和純化之二肽連接酶)之條帶,算出純化酵素之分子質量約為111 kDa。另一方面,與His標籤結合之二肽連接酶之分子質量基於序列編號1所記載之胺基酸序列進行計算,算出為111,222 Da,因此與基於圖10所算出之分子質量約111 kDa一致。因此,確認獲得了包含序列編號1所記載之胺基酸序列之多肽之純化物、即源自酵母株(NITE ABP-03293)之二肽連接酶之純化物。
<使用二肽連接酶之含有二肽之組成物之試製>
本發明者等人為了確認能否使用上述之源自酵母株(NITE ABP-03293)之二肽連接酶之純化物試製含有二肽之組成物,想到以非專利文獻8為參考,應用非專利文獻9所記載之丙酮酸激酶與乳酸脫氫酶之ATP/NADH結合系統進行實驗。為了進行該實驗,分別製備以下表15所示之4種反應溶液、即(Arg/Asn)+、(Arg/Asn)-、(Arg/Gln)+、及(Arg/Gln)-。
[表15]
(Arg/Asn)+ | (Arg/Asn)- | (Arg/Gln)+ | (Arg/Gln)- | |
源自酵母株(N1TE ABP-03293)之二肽連接酶之純化物 | 添加 | 未添加 | 添加 | 未添加 |
tris-磷酸緩衝液(pH7.2) | 50 mmol/L | 50 mmol/L | 50 mmol/L | 50 mmol/L |
氯化鉀 | 10 mmol/L | 10 mmol/L | 10 mmol/L | 10 mmol/L |
氯化鎂 | 10 mmol/L | 10 mmol/L | 10 mmol/L | 10 mmol/L |
ATP | 5.0 mmol/L | 5.0 mmol/L | 5.0 mmol/L | 5.0 mmol/L |
磷烯醇丙酮酸 | 2.5 mmol/L | 2.5 mmol/L | 2.5 mmol/L | 2.5 mmol/L |
NADH | 0.8 mmol/L | 0.8 mmol/L | 0.8 mmol/L | 0.8 mmol/L |
丙酮酸激酶 | 30 unit/mL | 30 unit/mL | 30 unit/mL | 30 unit/mL |
LDH | 50 unit/mL | 50 unit/mL | 50 unit/mL | 50 unit/mL |
Arg | 5.0 mmol/L | 5.0 mmol/L | 5.0 mmol/L | 5.0 mmol/L |
Asn | 5.0 mmol/L | 5.0 mmol/L | - | - |
Gln | - | - | 5.0 mmol/L | 5.0 mmol/L |
組成之剩餘部分為純化水。 |
為了分別製備表15所示之4種反應溶液,首先製備含有50 mmol/L且pH7.2之tris-鹽酸緩衝液、10 mmol/L之氯化鉀、10 mmol/L之氯化鎂、5 mmol/L之ATP(富士膠片和光純藥股份有限公司製造,製品名:結晶三磷酸-5'-腺苷二鈉鹽三水合物,型號:18-16911)、2.5 mmol/L之磷烯醇丙酮酸(Sigma-Aldrich公司製造,製品名:磷(烯醇)丙酮酸單鉀鹽,型號:860077-250MG)、0.8 mmol/L之NADH(Oriental Yeast製造,製品名:β-菸醯胺腺嘌呤二核苷酸(還原型),製品編號:44320000)、30 unit/mL之丙酮酸激酶(Oriental Yeast股份有限公司製造,製品名:丙酮酸激酶(來源於兔肌肉),製品編號:46665002)、及50 unit/mL之LDH(Oriental Yeast股份有限公司製造,製品名:L-乳酸脫氫酶(重組,兔肌肉),製品編號:46776003)之溶液。使用該溶液製備(Arg/Asn)+時與製備(Arg/Gln)-時,分別添加Arg(富士膠片和光純藥股份有限公司製造,製品名:L(+)-精胺酸,型號:019-04611)與Asn(富士膠片和光純藥股份有限公司製造,製品名:L(+)-麩醯胺酸,型號:019-04812)各5.0 mmol/L,製備(Arg/Gln)+時與製備(Arg/Gln)-時分別添加Arg(富士膠片和光純藥股份有限公司製造,上述L(+)-精胺酸)與Gln(富士膠片和光純藥股份有限公司製造,製品名:L(+)-麩醯胺酸、型號:076-00521)各5.0 mmol/L。製備(Arg/Asn)+時與製備(Arg/Gln)+時添加相同量之源自酵母株(NITE ABP-03293)之二肽連接酶之純化物,與此相對,製備(Arg/Asn)-時與製備(Arg/Gln)-時未添加。
使用分光光度計,將(Arg/Asn)+、(Arg/Asn)-、(Arg/Gln)+、及(Arg/Gln)-之各反應溶液保持為液溫26℃,測定5分鐘對波長340 nm之光之光學密度(OD340
)。與酵素反應前相比,酵素反應後之(Arg/Asn)-與(Arg/Gln)-未見OD340
之測定值之變化,與此相對,酵素反應後之(Arg/Asn)+與(Arg/Gln)+之OD340
之測定值大幅減少。因此,提示關於酵素反應後之(Arg/Asn)+與(Arg/Gln)+,藉由二肽連接酶而生成了二肽。基於OD340
之測定值與NADH之毫莫耳吸光係數(ε=6.22 mmol/L/cm)算出源自酵母株(NITE ABP-03293)之二肽連接酶所具有之酵素活性,結果Arg-Asn連接酶活性為18.7 μmol/min/mg蛋白,Arg-Gln連接酶活性為9.2 μmol/min/mg蛋白。
針對酵素反應後之(Arg/Asn)+、(Arg/Asn)-、(Arg/Gln)+、及(Arg/Gln)-之各者,使用LC-MS/MS(前述之Alliance e 2965與Xevo TQD),藉由LC/MS/MS測定二肽含量。為此,將自酵素反應後之(Arg/Asn)+、(Arg/Asn)-、(Arg/Gln)+、或(Arg/Gln)-之任一者採集之溶液200 μL利用100 mmol/L之鹽酸稀釋10倍,進行離心分離(15,000 rpm,4℃,5分鐘),採集形成之上清液。又,利用100 mmol/L之鹽酸使固相萃取管柱(前述之Oasis(註冊商標)MCX管柱)平衡化。將採集之上清液中之30 μL注入至經平衡化之固相萃取管柱。進而注入1 mL之甲醇洗淨管柱內後,將1 mol/L之氨水注入至管柱,採集自管柱溶出之水溶液。將該採集之水溶液利用離心濃縮機(前述之CC-105)進行離心濃縮而蒸乾後,溶解於2質量%之甲酸水溶液,製成LC/MS/MS用試樣。
作為用以進行LC/MS或LC/MS/MS之胺基酸分析用管柱,準備前述之Intrada Amino Acid(內徑2.0 mm×管柱長50 mm)。作為流動相A,製備含有甲酸0.1質量%之乙腈溶液。作為流動相B,製備含有甲酸銨100 mmol/L之水溶液。將胺基酸分析用管柱之管柱溫度保持為40℃,將以Arg-Asn、Asn-Arg、Arg-Gln、或Gln-Arg之任1種之含量成為1.0 μmol/L之方式製備之2質量%之甲酸水溶液注入至管柱,進而如表5中前述,以流動相A與流動相B控制濃度梯度,向管柱中以流速0.3mL/分鐘進行送液,使各成分分離而純化二肽時,關於純化之二肽之回收率,Asn-Arg為11質量%,Arg-Asn為25質量%,Gln-Arg為19質量%,Arg-Gln為31質量%。又,作為LC/MS或LC/MS/MS之標準試樣,分別準備以Arg-Asn、Asn-Arg、Arg-Gln、或Gln-Arg之任1種之含量成為250 μmol/L、62.5 μmol/L、15.6 μmol/L、或3.91 μmol/L之方式製備之2質量%之甲酸水溶液。
將胺基酸分析用管柱(Intrada Amino Acid)之管柱溫度保持為40℃,向該管柱中注入LC/MS/MS用試樣之任一者或標準試樣之任一者20 μL,進而如表5中前述,以流動相A與流動相B控制濃度梯度,向管柱中以流速0.3 mL/分鐘進行送液,使各成分分離,藉此進行LC/MS與LC/MS/MS。將標準試樣注入至胺基酸分析用管柱之情形時,在LC/MS中記錄生成由Arg-Asn、Asn-Arg、Arg-Gln、或Gln-Arg產生之波峰之滯留時間,在LC/MS/MS中獲得該滯留時間下m/z=70之選擇離子層析圖。自該選擇離子層析圖,藉由前述之MassLynx質量分析(MS)用軟體去除雜訊,對每個二肽測量起因於分子內所具有之精胺酸殘基而形成之波峰之面積,藉此對每個二肽製作基於波峰面積之濃度之校準曲線。在將自酵素反應後之(Arg/Asn)+、(Arg/Asn)-、(Arg/Gln)+、或(Arg/Gln)-之任一者製備之LC/MS/MS用試樣注入至胺基酸分析用管柱之情形時,使用利用標準試樣所獲得之滯留時間與校準曲線,與標準試樣同樣地自m/z=70之選擇離子層析圖去除雜訊,對每個二肽基於起因於分子內所具有之精胺酸殘基之波峰之面積測量值,測量二肽之含量。對於LC/MS/MS用試樣,各進行5次二肽含量之測量。將分別對5次之測量值考慮前述之二肽回收率之數值進行修正(Asn-Arg含量為100/11質量倍,Arg-Asn為100/25質量倍,Gln-Arg含量為100/19倍,及Arg-Gln含量為100/31質量倍)後之平均值示於以下之表16與圖11。
[表16]
(Arg/Asn)+ | (Arg/Asn)- | (Arg/Gln)+ | (Arg/Gln)- | |
Asn-Arg(nmol/L) | 4.65±0.15 | 1.77±0.15 | - | - |
Arg-Asn(nmol/L) | 8.15±0.16 | 3.02±0.15 | - | - |
Gln-Arg(nmol/L) | - | - | 32.19±0.63 | 14.69±0.31 |
Arg-Gln(nmol/L) | - | - | 12.86±0.24 | 1.90±0.12 |
n=5、平均值±標凖偏差 |
如表16與圖11所示,在添加了源自酵母株(NITE ABP-03293)之二肽連接酶之純化物之(Arg/Asn)+中,與未添加該純化物之(Arg/Asn)-相比,Asn-Arg之含量與Arg-Asn之含量分別有意義地高(p<0.001)。同樣地,在添加了該純化物之(Arg/Gln)+中,與未添加該純化物之(Arg/Gln)-相比,Gln-Arg之含量與Arg-Gln之含量分別有意義地高(p<0.001)。因此,提示源自酵母株(NITE ABP-03293)之二肽連接酶具有選自由Arg-Asn連接酶活性、Arg-Gln連接酶活性、Asn-Arg連接酶活性、及Gln-Arg連接酶活性所組成之群中之1種以上之酵素活性。認為儘管未添加源自酵母株(NITE ABP-03293)之二肽連接酶之純化物,在(Arg/Asn)-中亦檢測到少量之Asn-Arg與Arg-Asn,在(Arg/Gln)-中亦檢測到少量之Gln-Arg與Arg-Gln可能係由於在(Arg/Asn)-與(Arg/Gln)-之各反應溶液中潛藏有可不經由二肽連接酶而誘發游離胺基酸彼此之肽鍵之某種因素。
<使用形質轉換體之ACE阻礙用或血壓上升抑制用之組成物之試製>
藉由自通常用於酵母培養之SD培養基之配方中去除尿嘧啶並以Asn含量成為5.0 mmol/L之方式添加了Asn的配方,製備SD(-Ura、+Asn)培養基。其後,準備以葡萄糖含量成為2質量%之方式製備之3 mL之SD(-Ura、+Asn)液體培養基、及以葡萄糖含量成為0.1質量%之方式製備之100 mL之SD(-Ura、+Asn)。將3 mL之SD(-Ura、+Asn)培養基之液溫保持為30℃,將自酵母株(NITE ABP-03293)採集之一部分酵母在該培養基中振盪培養一晚。次日早上,於100 mL之SD(-Ura、+Asn)液體培養基中以OD600
之測定值成為0.12之方式繼代培養經形質轉換之酵母。將繼代培養之約100 mL之SD(-Ura、+Asn)液體培養基之液溫保持為30℃,並進行振盪培養直至OD600
之測定值成為0.6左右。向OD600
之測定值成為0.6左右之約100 mL之SD(-Ura、+Asn)液體培養基中以半乳糖之最終濃度成為2質量%之方式添加半乳糖後,將培養基之液溫保持為30℃,並振盪培養20小時,藉此在酵母中誘導二肽連接酶之表現,促進Asn-Arg或Arg-Asn之生成。其後,對約100 mL之SD(-Ura、+Asn)液體培養基進行離心分離(8,000 rpm、4℃、10分鐘),採集所形成之沈澱物。將採集之沈澱物利用破碎機(前述之Multi-Beads Shocker(註冊商標))進行細胞破碎,對獲得之細胞破碎物進行離心分離(14,000 rpm、4℃、10分鐘),採集所形成之上清液。在採集之上清液中,OD340
之測定值較低,故而提示含有大量二肽。
將如上所述採集之上清液中之200 μL利用100 mmol/L之鹽酸稀釋10倍,並進行離心分離(15,000 rpm、4℃、5分鐘),採集所形成之上清液中之30 μL,注入至利用100 mmol/L之鹽酸進行了平衡化之固相萃取管柱(前述之Oasis(註冊商標)MCX管柱)。進而注入1 mL之甲醇洗淨管柱內後,將1 mol/L之氨水注入至管柱,採集自管柱溶出之水溶液。將採集之水溶液利用離心濃縮機(前述之CC-105)進行離心濃縮而蒸乾後,溶解於2質量%之甲酸水溶液中,製成LC/MS/MS用試樣。對於該LC/MS/MS用試樣,與前述之表16所示之(Arg/Asn)+或(Arg/Asn)-中測量Asn-Arg之含量或Arg-Asn之含量之情形同樣地進行LC/MS與LC/MS/MS。其結果,在注入至固相萃取管柱之30 μL之上清液中,算出Asn-Arg含量為110.9 nmol/L,算出Arg-Asn含量為72.3 nmol/L。因此,提示藉由在含有Asn及Arg之SD(-Ura、+Asn)液體培養基之存在下,培養自酵母株(NITE ABP-03293)採集之一部分酵母,從而能夠製造含有具有ACE阻礙活性之Asn-Arg及Arg-Asn的ACE阻礙用或血壓上升抑制用之組成物。
又,藉由自SD培養基之配方去除尿嘧啶並以Gln含量成為5.0 mmol/L之方式添加了Asn之配方,製備SD(-Ura、+Gln)培養基。與如前所述使用SD(-Ura、+Asn)培養基培養酵母或者測量Asn-Arg或Arg-Asn之含量之情形相比,將培養基變更為SD(-Ura、+Gln)培養基,除此以外,在同樣之條件下,培養自酵母株(NITE ABP-03293)採集之一部分酵母,製備注入至固相萃取管柱之30 μL之上清液,進行LC/MS或LC/MS/MS。其結果,關於注入至固相萃取管柱之30 μL之上清液,算出Gln-Arg含量為17.3 nmol/L,算出Arg-Gln含量為246.0 nmol/L。因此提示藉由在含有Gln及Arg之SD(-Ura、+Gln)液體培養基之存在下,培養自酵母株(NITE ABP-03293)採集之一部分酵母,從而能夠製造含有具有ACE阻礙活性之Gln-Arg與Arg-Gln的ACE阻礙用或血壓上升抑制用之組成物。例如,期待今後藉由研究培養基中之Arg、Asn、及Gln之各者之最佳之摻合量,能夠製造本二肽化合物之含量進而較多之組成物。
無
[圖1]係對本發明之組成物之製造方法之第1實施態樣進行說明之流程圖。
[圖2]係對本發明之組成物之製造方法之第2實施態樣進行說明之流程圖。
[圖3]係對本發明之組成物之製造方法之第3實施態樣進行說明之流程圖。
[圖4]係藉由LC/MS(液相層析質量分析)而由實驗例1至實驗例3之試樣與標準試樣(Gln-Arg與Arg-Gln)分別獲得之總離子層析圖。圖4至圖7中,縱軸表示檢測強度,橫軸表示滯留時間(分鐘)。
[圖5]係藉由LC/MS/MS(使用串聯四極質譜儀之液相層析質量分析),由實驗例1至實驗例3之試樣與標準試樣(Gln-Arg與Arg-Gln)分別獲得之m/z=70之選擇離子監測之層析圖。
[圖6]係為了測量由Arg-Gln產生之波峰之面積,從圖5進一步去除雜訊後之層析圖。將由Arg-Gln產生之波峰之範圍塗成黑色。
[圖7]係藉由LC/MS,由實驗例1至實驗例3之試樣與標準試樣(Asn-Arg與Arg-Asn)分別獲得之總離子層析圖。
[圖8]係表示基於Arg-Gln、Gln-Arg、Arg-Asn、或Asn-Arg之ACE阻礙率之圖。縱軸表示ACE阻礙率(%),橫軸表示二肽之含量(mg/L)。n=2。
[圖9](a)係對自由攝取了生理鹽水之對照組之雄性SHR/NCrlCrlj大鼠(SHR大鼠)與自由攝取了含有從眼蟲細胞分離純化之二肽之試樣水的實驗組之SHR大鼠,分別在從實驗開始(對照組大鼠可自由攝取生理鹽水、實驗組大鼠可自由攝取試樣水之時點)起經過5週時、經過6週時、及經過7週時表示擴張期血壓與收縮期血壓之圖。(a)中縱軸表示血壓(mmHg)、#表示單因子變異數分析中,p<0.07時存在有意義差,ab間表示Tukey-Kramer法中p<0.05時存在有意義差。(b)係表示實驗開始起經過7週時之對照組大鼠與實驗組大鼠各自之血管收縮素II之血中濃度之圖,縱軸表示上述血中濃度(pg/mL)。(a)與(b)中均n=6,*表示單因子變異數分析中p<0.05時存在有意義差。
[圖10]係表示對源自酵母株(NITE ABP-03293)之二肽連接酶之純化物實施SDS-PAGE電泳法之情形時,提示上述二肽連接酶之分子質量約為111 kDa之電泳凝膠之照片的圖。圖中之「純化酵素」表示於電泳凝膠中,使源自酵母株(NITE ABP-03293)之二肽連接酶之純化物泳動所獲得之條帶(lane)。
[圖11]係表示確認使源自酵母株(NITE ABP-03293)之二肽連接酶進行酵素反應而生成之Asn-Arg、Arg-Asn、Gln-Arg、及Arg-Gln各自之生成量所獲得之試驗結果的圖。(a)中,圖縱軸表示Asn-Arg含量,(b)中,圖縱軸表示Arg-Asn含量,(c)中,圖縱軸表示Gln-Arg含量,(d)中,圖縱軸表示Arg-Gln含量。(Arg/Asn)+與(Arg/Gln)+分別為添加有源自酵母株(NITE ABP-03293)之二肽連接酶之純化物的反應溶液,(Arg/Asn)-與(Arg/Gln)-分別表示未添加該純化物之反應溶液。**表示在單因子變異數分析中,p<0.01時存在有意義差。
Claims (12)
- 一種酵素劑,其含有二肽合成酵素,其特徵在於: 上述二肽合成酵素具有選自由以下(a)、(b)、以及(c)所組成之群中之1種多肽之胺基酸序列: (a)由序列編號1所記載之胺基酸序列構成之多肽; (b)由相對於序列編號1所記載之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列構成之多肽; (c)由在序列編號1所記載之胺基酸序列中置換、插入、缺失、及/或附加1個以上且20個以下之胺基酸殘基而成之胺基酸序列構成的多肽; 上述二肽合成酵素具有選自由L-精胺醯基-L-天冬醯胺酸(Arg-Asn)連接酶活性、L-精胺醯基-L-麩醯胺酸(Arg-Gln)連接酶活性、L-天冬醯胺醯基-L-精胺酸(Asn-Arg)連接酶活性、及L-麩胺醯基-L-精胺酸(Gln-Arg)連接酶活性所組成之群中之1種以上之酵素活性。
- 一種ACE阻礙用或血壓上升抑制用之組成物之製造方法,其包括如下步驟: 準備請求項1之酵素劑;及 在選自由L-精胺酸(Arg)及其鹽所組成之群中之1種以上之化合物、以及選自由L-天冬醯胺酸(Asn)、L-麩醯胺酸(Gln)、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之化合物、以及上述酵素劑之存在下,使上述二肽合成酵素進行酵素反應,生成具有血管收縮素I轉化酶(ACE)阻礙活性之二肽化合物,該二肽化合物係選自由Arg-Asn、Arg-Gln、Asn-Arg、Gln-Arg、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之化合物。
- 一種多核苷酸,其具有編碼二肽合成酵素之鹼基序列,其特徵在於: 上述編碼二肽合成酵素之鹼基序列具有選自由以下(d)、(e)、(f)、以及(g)所組成之群中之1種多核苷酸之鹼基序列: (d)由序列編號2所記載之鹼基序列構成之多核苷酸; (e)由相對於序列編號2所記載之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列構成之多核苷酸; (f)由在序列編號2所記載之鹼基序列中置換、插入、缺失、及/或附加1個以上且20個以下之鹼基而成之鹼基序列構成的多核苷酸; (g)在嚴格(stringent)之條件下與DNA雜交的多核苷酸,該DNA係由與序列編號2所記載之鹼基序列互補之鹼基序列構成; 上述編碼二肽合成酵素之鹼基序列係編碼具有酵素活性之酵素的鹼基序列,該酵素活性係選自由Arg-Asn連接酶活性、Arg-Gln連接酶活性、Asn-Arg連接酶活性、及Gln-Arg連接酶活性所組成之群中之1種以上。
- 一種重組載體,其包含請求項3之多核苷酸。
- 一種形質轉換體,其係微生物利用請求項3之多核苷酸或請求項4之重組載體被形質轉換而成者。
- 如請求項5之形質轉換體,其中,上述微生物為眼蟲或酵母。
- 一種套組,其具有選自由請求項1之酵素劑、請求項3之多核苷酸、請求項4之重組載體、請求項5之形質轉換體、及請求項6之形質轉換體所組成之群中之1種以上。
- 一種ACE阻礙用或血壓上升抑制用之組成物之製造方法,其包括如下步驟: 準備請求項5或6之形質轉換體、及含有上述形質轉換體能夠進行氮同化之氮源之培養基;及 在上述培養基之存在下培養上述形質轉換體,生成具有ACE阻礙活性之二肽化合物,該二肽化合物係選自由Arg-Asn、Arg-Gln、Asn-Arg、Gln-Arg、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之化合物。
- 如請求項8之ACE阻礙用或血壓上升抑制用之組成物之製造方法,其中,上述氮源包含選自由Arg及其鹽所組成之群中之1種以上之化合物、以及選自由Asn、Gln、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之化合物。
- 一種ACE阻礙用或血壓上升抑制用之組成物,其藉由含有選自由請求項5或6之形質轉換體、在含有上述形質轉換體能夠進行氮同化之氮源之培養基中被培養之該形質轉換體、該形質轉換體之乾燥物、及該形質轉換體之細胞破碎物所組成之群中之1種以上, 從而含有具有ACE阻礙活性之二肽化合物,該二肽化合物係選自由Arg-Asn、Arg-Gln、Asn-Arg、Gln-Arg、及該等之鹽所組成之群中之1種以上之化合物。
- 如請求項10之ACE阻礙用或血壓上升抑制用之組成物,其含有上述二肽合成酵素或其變性蛋白質。
- 如請求項10或11之ACE阻礙用或血壓上升抑制用之組成物,其中,上述二肽化合物之含量為0.10 mg/L以上。
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2020
- 2020-10-09 WO PCT/JP2020/038390 patent/WO2021070961A1/ja active Application Filing
- 2020-10-09 JP JP2021551737A patent/JPWO2021070961A1/ja active Pending
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Publication number | Publication date |
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WO2021070961A1 (ja) | 2021-04-15 |
JPWO2021070961A1 (zh) | 2021-04-15 |
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