TW202116338A - 用於治療非酒精性脂肪肝的去殼台灣紅藜萃取物及其應用 - Google Patents
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Abstract
一種利用去殼台灣紅藜(Chenopodium formosanum)萃取物用於製備一組合物的用途,其中該組合物係用於以下至少一者:減少肝臟中脂肪細胞的油滴、縮小脂肪細胞體積或降低脂肪細胞累積,從而達到治療或預防非酒精性脂肪肝的效果。
Description
本發明係關於去殼紅藜萃取物之應用,尤其是關於去殼台灣紅藜水萃取物的應用,包括使用該去殼台灣紅藜水萃取物於治療或預防減少肝臟中脂肪細胞的油滴、縮小脂肪細胞體積或降低脂肪細胞累積之疾病,尤其是使用該去殼台灣紅藜水萃取物用於抑制非酒精性脂肪肝的形成。
脂肪肝的形成能區分為許多種原因,例如:酗酒、肥胖、脂肪代謝異常、藥物、病毒、急速減肥或營養不良等。而於醫界中,常習慣分成兩大類,分別為酗酒所造成的酒精性脂肪肝,另一類則為非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)。
然而,非酒精性脂肪肝是目前全球最常見的慢性肝臟疾病,其發生率在西方國家約為15~30%,而台灣、東南亞國家、韓國、日本及中國等則逐年上升當中,約為15~45%,亦已引起亞洲各國政府的關注。
近年於非酒精性脂肪肝疾病的研究顯示,此族群中約八九成的病人都是單純的肝臟脂肪堆積狀態,對於肝臟的影響不大;但其中有約一成的非酒精性脂肪肝患者會合併發炎甚至壞死的情況,意即脂肪肝炎。這些患者的肝臟會由肝纖維化慢慢進展成肝硬化,約有0.5%發生肝癌的機率。
目前脂肪肝的治療方式以控制體重、控制血糖、控制血脂肪及適度的運動並依照營養師所設計之菜單降低所攝入熱量,而藉由體重的控制,最終可達到改善肝功能和脂肪肝的程度。然而,現階段測試的藥物中,如胰島素致敏劑pioglitazone、雙胍類藥物之胰島素致敏劑metformin、pentoxifylline等仍需更大型的試驗來證實可有效改善脂肪肝的效果。
有鑑於此,如何開發可一方面長期給予患者服用,另一方面又不致於導致副作用,而患者接收度高之飲食補充方式來預防或緩解非酒精性脂肪肝之症狀,進而解決現有技術之缺失,實為相關技術領域者目前所迫切需要解決問題。
緣此,本發明之一目的,在於提供一種去殼台灣紅藜(Chenopodium formosanum)萃取物於製備一組合物之用途,其中該組合物係用於以下之至少一者:減少肝臟中脂肪細胞的油滴、縮小脂肪細胞體積或降低脂肪細胞累積。較佳地,該去殼紅藜萃取物係去殼紅藜水萃取物,且該組合物係一醫藥組合物或食品組合物。
本發明之另一目的係提供一種去殼紅藜水萃取物之用途,其係用於製備預防/治療非酒精性脂肪肝之組合物。該去殼紅藜水萃取物用於減少肝臟細胞中脂肪的累積,有效保護肝臟降低因脂肪累積而造成的影響。
本發明去殼紅藜水萃取物用於製備減少肝臟中脂肪細胞的油滴、縮小脂肪細胞體積或降低脂肪細胞累積及/或預防/治療非酒精性脂肪肝組合物之用途,其中該組合物係用於改善及/或調理肝臟。此外,
該組合物亦可為一食品或一醫療保健品,其中該食品包括但不限於飲品、果凍、乳製品、代餐包等。
〔圖1〕係本發明去殼台灣紅藜水萃取物之萃取流程圖。
〔圖2A~圖2B〕係本發明又一實施例之去殼台灣紅藜萃取物(如圖2A所示)與帶殼台灣紅藜萃取物(如圖2B所示)高效能液相層析圖。
〔圖3〕係本發明再一實施例去殼台灣紅藜水萃取物抑制肝臟細胞內脂肪累積的實驗結果,前述實驗係以Nile Red染色相較DAPI染色所獲得的相對螢光強度百分比(Relative fluorescence intensity(%))進行數值分析。
〔圖4A~圖4D〕係本發明另一實施例之非酒精性脂肪肝模式動物經餵食如0.1%去殼台灣紅藜萃取物等之肝臟組織蘇木紫-伊紅(haematoxylin-eosin,H&E)染色圖。
〔圖5〕係本發明再一實施例評估3T3-L1細胞內脂質堆積之試驗時程圖。
〔圖6A~圖6Q〕係本發明藉由施予10μg/mL、30μg/mL、100μg/mL不同劑量等多種萃取方法之去殼台灣紅藜萃取物之3T3-L1細胞脂質堆積之Nile Red/Hoechst染色圖,其中圖6A為控制組(CTL),圖6B為空白組(Vehicle),圖6C~圖6E為PDC-2749組,圖6F~圖6H為PDC-2899組,圖6I~圖6K為PDC-2900組,圖6L~圖6N為PDC-2948組,圖6O~圖6Q為silymarin組,圖6C、圖6F、圖6I、圖6L、圖6O之施予前述各組劑量濃度為10μg/mL,圖6D、圖6G、圖6J、圖6M、圖6P之施予前述各組劑量濃度為30μg/mL,圖
6E、圖6H、圖6K、圖6N、圖6Q之施予前述各組劑量濃度為100μg/mL。
〔圖7〕係本發明施予不同劑量的多種萃取方法之去殼台灣紅藜萃取物之3T3-L1細胞脂質堆積之Nile Red染色相對螢光強度百分比(Relative fluorescence intensity(%))數值分析圖。
〔圖8〕係本發明施予不同劑量的多種萃取方法之去殼台灣紅藜萃取物之3T3-L1細胞脂質堆積之Hoechst染色相對螢光強度百分比(Relative fluorescence intensity(%))數值分析圖。
〔圖9〕係本發明施予不同劑量的多種萃取方法之去殼台灣紅藜萃取物之3T3-L1細胞脂質堆積之Nile Red染色相較Hoechst染色所獲得的相對螢光強度百分比(Relative fluorescence intensity(%))數值分析圖。
以下藉由特定的具體實施形態說明本發明之技術內容,熟悉此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容而瞭解本發明之優點與功效。然在不背離本發明精神下,本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐或加以應用。
於本發明的一具體實施例中,該萃取物可藉由食品、保健食品、健康食品、機能性食品、營養補充品、特殊營養食品、膳食補充物、或藥品等實施例予以實施。
於本發明再一實施例中,亦可將萃取物與其他食品或飲料組合,以適於食用之樣態供生物體以口服方式服用。
再者,本文中所使用的術語「個體」係指哺乳動物,該哺乳動物可以為人類或非人動物。於本發明另一實施例中,其中該個體係選自
一伴侶動物,例如包括狗、貓、倉鼠等。
另外,本文中所使用的術語「治療」,不應被解釋為治療一個體直至完全恢復,而應包括將一個體之疾病進展或症狀維持在一實質上靜態之程度、增加一個體之恢復速率、改善一具體病況的嚴重性、或提高一患者之生命品質。除此之外,本文中所使用的所謂「預防」係指抑制或防止一具體病況的發作、或維持敏感個體之良好健康狀態或建立該個體對疾病的耐受性。
不僅如此,根據本發明所提供之組合物係可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率食用,端視投予生物個體之年齡、體重、及健康狀況而異。亦可針對特定族群之需要,調整據本發明所提供之組合物中之萃取物的含量,例如,調整至每日應服用的量。
於本發明一實施例中,評估肝臟脂肪變性範圍評分標準如表一所示。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明,其中該等實施例於此僅提供作為說明之用。
實施例
實施例一、去殼台灣紅藜萃取物製備方法
請參閱圖1係為本發明去殼台灣紅藜水萃取物之萃取流程,去殼台灣紅藜加入10倍等重量的RO純水,以加熱包加熱沸騰萃取0.5~2小時,使用篩網過濾,收集第一次萃取濾液。去殼台灣紅藜殘渣繼續加入10倍藥材等重量的RO純水,以加熱包加熱沸騰萃取0.5~2小時,使用篩網過濾,收集第二次萃取濾液。前述二次萃取濾液收集混合均勻後,進行下述指紋圖譜(HPLC)分析,同時利用大型減壓濃縮機濃縮與冷凍乾燥機凍乾,進而獲得本發明去殼台灣紅藜水萃取物之乾粉率相關數據。於本發明另一實施例中,台灣紅藜(即帶殼台灣紅藜)水萃取物之萃取流程也依循前述去殼台灣紅藜水萃取物之萃取流程進行之。
實施例二、去殼台灣紅藜萃取物之HPLC成分分析
請參閱圖2A~圖2B,藉由高效液相層析儀高效能液相層析(high performance liquid chromatography,HPLC)化學指紋圖譜分析去殼台灣紅藜萃取物(如圖2A所示)與台灣紅藜萃取物(如圖2B所示),前述圖2A~圖2B之HPLC 203nm分析圖譜其可得知去殼台灣紅藜萃取物與台灣紅藜萃取物二者之層析峰(chromatographic peak)的面積及峰高等具有差異性,如其中去殼台灣紅藜萃取物於滯留時間4分鐘(min)與24分鐘(min)左右之層析峰面積及高度與台灣紅藜萃取物均不相同,因此可推知去殼台灣紅藜萃取物及台灣紅藜萃取物中的化學物質不同。
實施例三、去殼台灣紅藜萃取物於非酒精性脂肪肝細胞模式試驗
於另一實施例中,係藉肝細胞株(HepG2 cell)來評估本發明去殼台灣紅藜萃取物是否具降低肝細胞內脂質堆積之功效。請參閱圖3,
肝細胞株(HepG2 cell)給予棕櫚酸(Palmitic acid;PA)及油酸(Oleic acid;OA)誘發對肝細胞株脂質生成,其中去殼台灣紅藜萃取物之施予劑量為10~100μg/mL,進而利用尼羅紅(Nile Red)染色進行肝細胞脂質堆積分析,同時也藉由DAPI染色進行評估去殼台灣紅藜萃取物對肝細胞株(HepG2 cell)的存活分析。其中去殼紅藜萃取物於中劑量(30μg/mL)、高劑量(100μg/mL)具降低肝細胞內脂質堆積之功效。其中空白組係以肝細胞株(HepG2 cell)同樣給予棕櫚酸及油酸誘發對肝細胞株脂質生成。
實施例四、去殼台灣紅藜萃取物於非酒精性脂肪肝模式動物實驗
於再一實施例中,本發明藉高脂飼料誘導小鼠產生非酒精性脂肪肝損傷的試驗模式,來評估本發明去殼台灣紅藜萃取物是否具改善個體脂肪肝之脂肪堆積功效。所有模式動物於餵食高脂飼料的前1週開始施予0.1%去殼台灣紅藜萃取物、0.1%台灣紅藜萃取物或去離子水(如空白組),再給予8週高脂飼料誘導脂肪肝。試驗期間定期進行採血、秤量動物體重,最後試驗於預期可誘導肝損傷成功時結束,並採集肝臟測量其重量,將最大右葉肝切割出約0.5公分見方之肝組織塊,固定於10%的中性福馬林溶液,接著以石蠟包埋、切片、貼附在載玻片上,進而以蘇木紫-伊紅(haematoxylin-eosin,H&E)染色,來進行肝臟組織病理學觀察與肝臟脂肪變性評分。綜言之,於本發明之實施例中,模式動物測試組別包括控制組(無餵食高脂飼料,如圖4A所示)、空白組(如圖4B所示)、0.1%去殼台灣紅藜萃取物組(如圖4C所示)、0.1%帶殼台灣紅藜萃取物組(如圖4D所示),其對應脂肪變性評分分別為0.00±0.00、2.14±0.69、1.13±0.83、1.38±0.74,
其中本發明去殼台灣紅藜萃取物於肝臟組織切片判讀與對應脂肪變性評分具有效降低肝臟脂肪數量的功效。
換言之,本發明去殼台灣紅藜萃取物每次施予所需生物個體如非酒精性脂肪肝個體之有效劑量為1000毫克/公斤體重,其中前述去殼台灣紅藜萃取物可有效回復脂肪肝(Steatosis)變性程度為47.2%。
實施例五、去殼台灣紅藜萃取物於降低體細胞脂肪評估測試
請參閱圖5~圖9,本發明於另一實施例係利用體細胞來評估多種去殼台灣紅藜萃取物抑制體細胞內脂肪生成的效果,該評估測試方法係以胰島素(insulin)、地塞米松(dexamethasone)和羅格列酮(rosiglitazone)誘導體細胞3T3-L1細胞株分化與脂質生成,進而施予10μg/mL、30μg/mL、100μg/mL等不同劑量的PDC-2747(去殼台灣紅藜水萃物)、PDC-2749(去殼台灣紅藜之50E萃物)、PDC-2898(去殼台灣紅藜之50E-EA layer-not partitioned hexane layer萃物)、PDC-2899(去殼台灣紅藜之50E-Butanol layer-not partitioned hexane layer萃物)、PDC-2900(去殼台灣紅藜之50E-H2O layer-not partitioned hexane layer萃物)、PDC-2948(去殼台灣紅藜之50E-H2O layer-only partitioned EA萃物)等多種萃取方法之去殼台灣紅藜萃取物是否具降低細胞內脂質堆積之功效,並輔以silymarin作為一對照組進行測試。其中前述50E是指50% ethanol,前述EA是指ethyl acetate。其中於圖7、圖8與圖9,CTL係為控制組,Vehicle係為空白組,前述空白組係以體細胞3T3-L1細胞株同樣以胰島素、地塞米松和羅格列酮誘導分化與脂質生成。
進一步,請參閱圖5,前述評估測試方法之實驗步驟如下所述:(1)將3T3-L1小鼠胚胎成纖維細胞株種於黑孔透明底的微量培養盤96
孔,每一微孔以4000個細胞均勻分散於多孔盤,以10% NBCS(new born calf serum)的DMEM在培養箱溫度為37℃及5% CO2環境中培養,當細胞生長至微量培養盤每一孔約8~9成滿,即可配置3T3-L1細胞分化套組(differentiation cocktail,#K579-100,BioVision,USA)於10%胎牛血清蛋白的DMEM/F12(1:1)中,加入前述每一微孔之細胞中並繼續培養72小時以誘導細胞分化;(2)另將胰島素(1.5ug/mL)配置於10%胎牛血清蛋白的DMEM/F12(1:1)而成為一Maintenance kit以誘導細胞脂質堆積,並分別加入前述10μg/mL、30μg/mL、100μg/mL等不同劑量之多種萃取方法的去殼台灣紅藜萃取物,培養48小時後,更換培養液並進而再次培養48小時;(3)藉磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗,加入含10%福馬林(formalin)固定細胞1小時;(4)移除10%福馬林,以二次水清洗後加入10μg/mL尼羅紅(Nile Red,#72485,Sigma,USA),染色10分鐘;(5)移除尼羅紅,以二次水清洗後加入10μg/mL Hoechst 33342(H3570,Invitrogen,USA),染色10分鐘;(6)移除Hoechst 33342,以二次水清洗後檢測數值(Nile red:RFU485/580nm;Hoechst:RFU350/461nm),並以螢光顯微鏡進行細胞脂質拍照紀錄(如圖6A~圖6Q所示)與進一步分析。
請參閱圖7、圖8與圖9,前述實驗結果顯示,儘管PDC-2747與PDC-2898並沒有隨著施予劑量增加而抑制細胞脂肪生成的結果,然而PDC-2749、PDC-2899、PDC-2900、PDC-2948與silymarin組的細胞內脂肪顯著降低,顯示具有緩解細胞脂質堆積之功效。此外,PDC-2899與PDC-2948抑制細胞脂質堆積之功效較PDC-2749為佳。
上述實施例僅為說明本發明之原理及其功效,其目的在使熟
習前述技術者能瞭解本發明之內容並據以實施,並非限制本發明。因此習於此技術之人士對上述實施例進行等效修飾、修改及變化仍不脫本發明之精神。本發明之權利範圍應如後述之申請專利範圍所列。
Claims (9)
- 一種製備治療非酒精性脂肪肝的醫藥組合物之應用,其中該醫藥組合物包含一台灣紅藜萃取物。
- 一種製備治療肥胖的醫藥組合物之應用,其中該醫藥組合物包含一台灣紅藜萃取物。
- 如請求項1或請求項2所述之應用,其中該台灣紅藜萃取物係以水為溶劑進行萃取。
- 如請求項3所述之應用,其中該台灣紅藜萃取物係為一去殼台灣紅藜萃取物。
- 如請求項1所述之應用,其中治療非酒精性脂肪肝係為改善肝臟中脂肪累積、油滴累積。
- 如請求項1所述之應用,其中該醫藥組合物可有效回復脂肪肝(Steatosis)變性程度為35%~60%。
- 如請求項2所述之應用,其中治療肥胖係為抑制脂肪累積。
- 如請求項4所述之應用,其中該去殼台灣紅藜萃取物係以一有效劑量施予一所需生物個體或一生物細胞,其中該組合物之每次施予該所需生物個體之有效劑量為800~1200毫克/公斤體重,其中該組合物之每次施予該所需生物細胞之有效劑量濃度為10~100μg/mL。
- 如請求項8所述之應用,其中該生物係選自一哺乳動物、一伴侶動物。
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