TW202112815A - Pd—1促效劑及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種包含免疫球蛋白重鏈多肽及免疫球蛋白輕鏈多肽之PD-1結合劑,以及相關組合物及用於製造及使用其之方法。
Description
程式化死亡蛋白1(PD-1)(亦稱為程式化細胞死亡蛋白1)係最初藉由對經歷細胞凋亡之小鼠T細胞系進行減性雜交而識別之268個胺基酸之I型跨膜蛋白(Ishida等人,Embo J
.,11
: 3887-95 (1992))。PD-1係T細胞調節劑之CD28/CTLA-4家族的成員,且據報告係在活化T細胞、B細胞及髓系細胞上表現(Greenwald等人,Annu. Rev. Immunol.
,23
: 515-548 (2005);及Sharpe等人,Nat. Immunol.
,8
: 239-245 (2007))。
已識別PD-1之兩個配體PD配體1(PD-L1)及PD配體2(PD-L2),其二者均屬於B7蛋白超家族(Greenwald等人,同前述)。PD-L1在多種細胞類型中表現,包括肺、心臟、胸腺、脾臟及腎臟之細胞(參見,例如,Freeman等人,J. Exp. Med
.,192
(7): 1027-1034 (2000);及Yamazaki等人,J. Immunol.
,169
(10): 5538-5545 (2002))。PD-L1表現在巨噬細胞及樹突細胞(DC)上應脂多醣(LPS)及GM-CSF處理而上調,及在T細胞及B細胞上在經由T細胞受體及B細胞受體之信號傳導後上調。PD-L1亦表現於多種鼠類及人類腫瘤細胞系中(參見,例如,Iwai等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
,99
(19): 12293-12297 (2002);及Blank等人,Cancer Res
.,64
(3): 1140-1145 (2004))。相反地,PD-L2展現更受限之表現模式且主要由抗原呈現細胞(例如樹突細胞及巨噬細胞)及一些腫瘤細胞系表現(參見,例如,Latchman等人,Nat. Immunol.
,2
(3): 261-238 (2001))。
PD-1負調節T細胞活化,且該抑制功能係與胞質域中免疫受體酪胺酸基開關基序(ITSM)相關(參見,例如,Greenwald等人,同前述;及Parry等人,Mol. Cell. Biol.
,25
: 9543-9553 (2005))。已發現PD-L1誘導PD-1叢集會引起SHP2磷酸酶之募集,該SHP2磷酸酶優先使CD28脫磷酸,從而抑制T細胞功能(Hui等人,Science , 355
: 1428-1433 (2017))。PD-1缺乏會導致自體免疫性。例如,C57BL/6 PD-1基因敲除小鼠已顯示發展狼瘡樣症候群(參見,例如,Nishimura等人,Immunity
,11
: 141-1151 (1999))。在人類中,PD-1基因中之單核苷酸多態性係與全身性紅斑狼瘡、1型糖尿病、類風濕性關節炎、及多發性硬化症之發展之發生率較高相關(參見,例如,Nielsen等人,Tissue Antigens
,62
(6): 492-497 (2003);Bertsias等人,Arthritis Rheum
.,60
(1): 207-218 (2009);Ni等人,Hum. Genet
.,121
(2): 223-232 (2007);Tahoori等人,Clin. Exp. Rheumatol.
,29
(5): 763-767 (2011);及Kroner等人,Ann. Neurol.
,58
(1): 50-57 (2005))。
儘管在抑制PD-1活性以治療各種類型之癌症及用於免疫增強(例如,以治療感染性疾病)方面取得最新進展,但仍需要以高親和力結合PD-1之促進負信號傳導並充當PD-1促效劑之PD-1結合劑(例如抗體)。
本發明提供促效性PD-1結合劑。在一個實施例中,該PD-1結合劑包含免疫球蛋白重鏈可變區及免疫球蛋白輕鏈可變區,其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含:包含SEQ ID NO: 1之CDR1;包含SEQ ID NO: 2之CDR2;及包含SEQ ID NO: 3之CDR3;及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含包含SEQ ID NO: 4之CDR1;包含SEQ ID NO: 5之CDR2;及包含SEQ ID NO: 6之CDR3。
亦提供抗PD-1結合劑,其包含與SEQ ID NO: 24至33中之任何一者具有至少80%、85%或90%序列一致性之免疫球蛋白重鏈可變區、及/或包含SEQ ID NO: 24至33之至少CDR區之重鏈可變區、及/或與SEQ ID NO: 34或35具有至少80%、85%或90%序列一致性之免疫球蛋白輕鏈可變區、或包含SEQ ID NO: 34或35之至少CDR區之輕鏈可變區。
在另一個態樣中,該PD-1結合劑包含免疫球蛋白重鏈可變區及免疫球蛋白輕鏈可變區,其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含:包含SEQ ID NO: 7之CDR1;包含SEQ ID NO: 8之CDR2;及包含SEQ ID NO: 9之CDR3;及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含包含SEQ ID NO: 10之CDR1;包含SEQ ID NO: 11之CDR2;及包含SEQ ID NO: 12之CDR3。
亦提供抗PD-1結合劑,其包含與SEQ ID NO: 43至47或61至63中之任何一者具有至少80%、85%或90%序列一致性之免疫球蛋白重鏈可變區、及/或與SEQ ID NO: 48至50具有至少80%、85%或90%序列一致性之免疫球蛋白輕鏈可變區、或包含至少其CDR區之輕鏈可變區。
另外,本發明提供編碼前述免疫球蛋白多肽之分離或純化的核酸序列,包含此類核酸序列之載體,包含前述免疫球蛋白多肽之分離的PD-1結合劑,編碼此類PD-1結合劑之核酸序列,包含此類核酸序列之載體,包含此類載體之分離的細胞,包含此類PD-1結合劑或此類載體與醫藥上可接受之載劑之組合物,及藉由對哺乳動物投與有效量之此類組合物抑制哺乳動物中免疫反應及治療發炎或自體免疫病症之方法。
相關申請案之交叉參考
本專利申請案主張2019年6月5日申請之美國臨時專利申請案62/857,699;2019年6月18日申請之美國臨時專利申請案62/863,193;及2020年2月28日申請之美國臨時專利申請案62/983,512之優先權,該等案之全部揭示內容係以引用之方式併入本文中。
本發明提供PD-1結合劑。如以上所述,程式化死亡蛋白1(PD-1)(亦稱為程式化細胞死亡蛋白1)係268個胺基酸I型跨膜蛋白質(Ishida等人,同前述)。PD-1係T細胞調節劑之CD28/CTLA-4家族的成員且據報告係在活化T細胞、B細胞及髓系細胞上表現(Greenwald等人,同前述;及Sharpe等人,同前述)。PD-1包含一個細胞外IgV域,其後係短細胞外莖、跨膜區及細胞內尾。PD-1細胞內尾包含位於免疫受體酪胺酸基抑制基序及免疫受體酪胺酸基開關基序中之兩個磷酸化位點,該等位點在磷酸化時藉由募集酪胺酸磷酸酶用於負向調節T細胞受體信號傳導(參見,例如,Ishida等人,同前述;及Blank等人,同前述)。
在一些實施例中,本文所提供的PD-1結合劑係促效的,意指PD-1結合劑結合至PD-1,但不顯著抑制PD-1結合至PD-1配體,從而維持PD-1負向調節T細胞受體信號傳導之能力。根據某些實施例,本文所提供的PD-1結合劑可誘導或刺激PD-1負向調節T細胞受體信號傳導並抑制免疫反應之能力。在一個特定實施例中,提供在抗原決定基結合PD-1之PD-1結合劑,該抗原決定基包含人類PD1之殘基33至41(序列:NPPTFSPAL)及/或人類PD-1之殘基96至110(序列:RVTQLPNGRDFHMSV),基本上由其組成,或由其組成。
PD-1結合劑包含免疫球蛋白重鏈可變區及免疫球蛋白輕鏈可變區,其等各包含三個互補決定區(CDR),通常稱為CDR1、CDR2或CDR3。該等CDR區亦可提及在命名中使用「H」或「L」以分別表示重鏈或輕鏈,亦即,CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3。給定Ig序列之CDR可藉由任何幾種習知編號方案來確定,諸如Kabat、Chothia、Martin(Enhanced Chothia)、IGMT或AHo(參見,例如,Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest
,美國衛生及公共服務部(U.S. Department of Health and Human Services),NIH (1991);Chothia等人,Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins
,J. Mol. Biol.,196: 901-917 (1987);Al-Lazikani等人,Standard Conformations for the Canonical Structures of Immunoglobulins
,J. Mol. Biol.,273:927 – 948 (1997);Abhinandan等人,Analysis and Improvements to Kabat and Structurally Correct Numbering of Antibody Variable Domains,Mol. Immunol.,45: 3832 – 3839 (2008);Lefranc等人,The IMGT unique numbering for immunoglobulins,T cell Receptors and Ig-like domains,The Immunologist,7: 132-136 (1999);Lefranc等人,IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and I superfamily V-like domains,Dev. Comp. Immunol.,27: 55 – 77 (2003);及Honegger等人,Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,J. Mol. Biol. 309: 657 – 670 (2001)。
根據本發明之一個態樣,PD-1結合劑之免疫球蛋白重鏈可變區包含包含SEQ ID NO: 1之CDR1;包含SEQ ID NO: 2之CDR2;及包含SEQ ID NO: 3之CDR3;及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含包含SEQ ID NO: 4之CDR1;包含SEQ ID NO: 5之CDR2;及包含SEQ ID NO: 6之CDR3。在一些實施例中,該重鏈CDR1包含SEQ ID NO: 13至18中之任何一者。另外或替代地,重鏈CDR3之一些實施例包含SEQ ID NO: 19至21中之任何一者。此外,輕鏈CDR1可包含SEQ ID NO: 22或23。
在特定實施例中,PD-1結合劑可包含SEQ ID NO: 24-33中之任何一者之免疫球蛋白重鏈可變區、或與SEQ ID NO: 24至33中之任何一者具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少8%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列。在其他實施例中,PD-1結合劑包含包含SEQ ID NO: 24至33中之任何一者之CDR之免疫球蛋白重鏈可變區,其中該等CDR係如以上所提供或如根據各種已知免疫球蛋白編號方案中之任何一者(例如,Kabat、Chothia、Martin(Enhanced Chothia)、IGMT或AHo)所確定。視需要,該包含SEQ ID NO: 24至33中之任何一者之CDR之免疫球蛋白重鏈可變區亦具有與SEQ ID NO: 24至33中之任何一者具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列。
除以上所述的Ig重鏈可變區外,或替代地,該抗PD-1結合劑可包含SEQ ID NO: 34或35之免疫球蛋白輕鏈可變區、或與SEQ ID NO: 34或35具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列。在其他實施例中,該PD-1結合劑包含包含SEQ ID NO: 34或35之CDR之免疫球蛋白輕鏈可變區,其中該等CDR係如以上所提供或如根據各種已知免疫球蛋白編號方案中之任何一者(例如,Kabat、Chothia、Martin(Enhanced Chothia)、IGMT或AHo)所確定。視需要,該包含SEQ ID NO: 34或35之CDR之免疫球蛋白輕鏈可變區亦具有與SEQ ID NO: 34或35具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列。
根據一個實施例,該PD-1結合劑可包含SEQ ID NO: 29之免疫球蛋白重鏈可變區或與其具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列;或包含至少SEQ ID NO: 29之CDR之免疫球蛋白重鏈可變區,其中該等CDR區係如以上所提供(例如,CDR1 - SEQ ID NO: 15、CDR2 - SEQ ID NO: 2及CDR3 - SEQ ID NO: 20)或如根據各種已知免疫球蛋白編號方案中之任何一者(例如,Kabat、Chothia、Martin(Enhanced Chothia)、IGMT或AHo)所確定;及SEQ ID NO: 35之免疫球蛋白輕鏈可變區或與其具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列、或包含至少SEQ ID NO: 35之CDR之免疫球蛋白輕鏈可變區;其中該等CDR區係如以上所提供(例如,CDR1 - SEQ ID NO: 23、CDR2 - SEQ ID NO: 5及CDR3 - SEQ ID NO: 6)或如根據各種已知免疫球蛋白編號方案中之任何一者(例如,Kabat、Chothia、Martin(Enhanced Chothia)、IGMT或AHo)所確定。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 29之重鏈可變區及SEQ ID NO: 35之輕鏈可變區、或至少其之如藉由Kabat所確定的CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 29之重鏈可變區及SEQ ID NO: 35之輕鏈可變區、或至少其之如藉由Chothia所確定的CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 29之重鏈可變區及SEQ ID NO: 35之輕鏈可變區、或至少其之如藉由Martin所確定之CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 29之重鏈可變區及SEQ ID NO: 35之輕鏈可變區、或至少其之如藉由IGMT所確定的CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 29之重鏈可變區及SEQ ID NO: 35之輕鏈可變區、或至少其之如藉由AHo所確定的CDR。以進一步實例說明之,該抗PD-1結合劑可包含包含SEQ ID NO: 36之免疫球蛋白重鏈及包含SEQ ID NO: 37之免疫球蛋白輕鏈、或分別與SEQ ID NO: 36及37具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列,視需要,其中該序列保留SEQ ID NO: 36及37各自的重鏈及輕鏈CDR,其中該等CDR係如以上所提供或如根據各種已知免疫球蛋白編號方案中之任何一者(例如,Kabat、Chothia、Martin(Enhanced Chothia)、IGMT或AHo)所確定。
根據另一個實施例,該PD-1結合劑可包含SEQ ID NO: 24之免疫球蛋白重鏈可變區或與其具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列;或包含至少SEQ ID NO: 24之CDR之免疫球蛋白重鏈可變區,其中該等CDR區係如以上所提供(例如,CDR1 - SEQ ID NO: 13、CDR2 - SEQ ID NO: 2及CDR3 - SEQ ID NO: 19)或如根據各種已知免疫球蛋白編號方案中之任何一者(例如,Kabat、Chothia、Martin(Enhanced Chothia)、IGMT或AHo)所確定;及SEQ ID NO: 34之免疫球蛋白輕鏈可變區或與其具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列、或包含至少SEQ ID NO: 34之CDR之免疫球蛋白輕鏈可變區;其中該等CDR區係如以上所提供(例如,CDR1 - SEQ ID NO: 22、CDR2 - SEQ ID NO: 5及CDR3 - SEQ ID NO: 6)或如根據各種已知免疫球蛋白編號方案中之任何一者(例如,Kabat、Chothia、Martin(Enhanced Chothia)、IGMT或AHo)所確定。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 24之重鏈可變區及SEQ ID NO: 34之輕鏈可變區、或至少其之如藉由Kabat所確定的CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 24之重鏈可變區及SEQ ID NO: 34之輕鏈可變區、或至少其之如藉由Chothia所確定的CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 24之重鏈可變區及SEQ ID NO: 34之輕鏈可變區、或至少其之如藉由Martin所確定的CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 24之重鏈可變區及SEQ ID NO: 34之輕鏈可變區、或至少其之如藉由IGMT所確定的CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 24之重鏈可變區及SEQ ID NO: 34之輕鏈可變區、或至少其之如藉由AHo所確定的CDR。
根據一個實施例,該PD-1結合劑可包含SEQ ID NO: 30之免疫球蛋白重鏈可變區或與其具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列;或包含至少SEQ ID NO: 30之CDR之免疫球蛋白重鏈可變區,其中該等CDR區係如以上所提供(例如,CDR1 - SEQ ID NO: 15、CDR2 - SEQ ID NO: 2及CDR3 - SEQ ID NO: 21)或如根據各種已知免疫球蛋白編號方案中之任何一者(例如,Kabat、Chothia、Martin(Enhanced Chothia)、IGMT或AHo)所確定;及SEQ ID NO: 35之免疫球蛋白輕鏈可變區或與其具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列、或包含至少SEQ ID NO: 35之CDR之免疫球蛋白輕鏈可變區;其中該等CDR區係如以上所提供(例如,CDR1 - SEQ ID NO: 23、CDR2 - SEQ ID NO: 5及CDR3 - SEQ ID NO: 6)或如根據各種已知免疫球蛋白編號方案中之任何一者(例如,Kabat、Chothia、Martin(Enhanced Chothia)、IGMT或AHo)所確定。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 30之重鏈可變區及SEQ ID NO: 35之輕鏈可變區、或至少其之如藉由Kabat所確定的CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 30之重鏈可變區及SEQ ID NO: 35之輕鏈可變區、或至少其之如藉由Chothia所確定的CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 30之重鏈可變區及SEQ ID NO: 35之輕鏈可變區、或至少其之如藉由Martin所確定的CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 30之重鏈可變區及SEQ ID NO: 35之輕鏈可變區、或至少其之如藉由IGMT所確定的CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 30之重鏈可變區及SEQ ID NO: 35之輕鏈可變區、或至少其之如藉由AHo所確定的CDR。
根據另一個態樣,該抗PD-1結合劑包含免疫球蛋白輕鏈可變區,其包含:包含SEQ ID NO: 7之CDR1;包含SEQ ID NO: 8之CDR2;及包含SEQ ID NO: 9之CDR3;及免疫球蛋白輕鏈可變區,其包含包含SEQ ID NO: 10之CDR1;包含SEQ ID NO: 11之CDR2;及包含SEQ ID NO: 12之CDR3。在一些實施例中,該重鏈CDR1包含SEQ ID NO: 57至60中之任何一者。在一些實施例中,該重鏈CDR2包含SEQ ID NO: 38至42中之任何一者。
在一些實施例中,該PD-1結合劑包含SEQ ID NO: 43至47或61至63中之任何一者之免疫球蛋白重鏈可變區、或與SEQ ID NO: 43至47或61至63中之任何一者具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列。在一些實施例中,該PD-1結合劑包含包含SEQ ID NO: 43至47或61至63中之任何一者之CDR之免疫球蛋白重鏈可變區,其中該等CDR係如以上所提供或如根據各種已知免疫球蛋白編號方案中之任何一者(例如,Kabat、Chothia、Martin(Enhanced Chothia)、IGMT或AHo)所確定。視需要,該包含SEQ ID NO: 43至47或61至63中之任何一者之CDR之免疫球蛋白重鏈可變區亦具有與SEQ ID NO: 43至47或61至63中之任何一者具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列。
除了以上所述的Ig重鏈可變區外(例如,SEQ ID NO: 43至47或61至63),或替代地,該抗PD-1結合劑可包含SEQ ID NO: 48至50中之任何一者之免疫球蛋白輕鏈可變區、或與SEQ ID NO: 48至50中之任何一者具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列。在其他實施例中,該PD-1結合劑包含包含SEQ ID NO: 48至50中之任何一者之CDR之免疫球蛋白輕鏈可變區,其中該等CDR係如以上所提供或如根據各種已知免疫球蛋白編號方案中之任何一者(例如,Kabat、Chothia、Martin(Enhanced Chothia)、IGMT或AHo)所確定。視需要,該包含SEQ ID NO: 48至50中之任何一者之CDR之免疫球蛋白輕鏈可變區亦具有與SEQ ID NO: 48至50中之任何一者具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列。
在一個特定實施例中,該抗PD-1結合劑包含SEQ ID NO: 47之免疫球蛋白重鏈可變區、或與SEQ ID NO: 47具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列;或包含至少SEQ ID NO: 47之CDR之免疫球蛋白重鏈可變區,其中該等CDR區係如以上所提供(例如,CDR1 - SEQ ID NO: 57、CDR2 - SEQ ID NO: 42及CDR3 - SEQ ID NO: 9)或如根據各種已知免疫球蛋白編碼方案中之任何一者(例如,Kabat、Chothia、Martin(Enhanced Chothia)、IGMT或AHo)所確定;及SEQ ID NO: 49之免疫球蛋白輕鏈、或分別與SEQ ID NO: 49具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列;或包含至少SEQ ID NO: 49之CDR之免疫球蛋白重鏈可變區;其中該等CDR區係如以上所提供(例如,CDR1 - SEQ ID NO: 10、CDR2 - SEQ ID NO: 11及CDR3 - SEQ ID NO: 12)或如根據各種已知免疫球蛋白編號方案中之任何一者(例如,Kabat、Chothia、Martin(Enhanced Chothia)、IGMT或AHo)所確定。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 47之重鏈可變區及SEQ ID NO: 49之輕鏈可變區、或至少其之如藉由Kabat所確定的CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 47之重鏈可變區及SEQ ID NO: 49之輕鏈可變區、或至少其之如藉由Chothia所確定的CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 47之重鏈可變區及SEQ ID NO: 49之輕鏈可變區、或至少其之如藉由Martin所確定的CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 47之重鏈可變區及SEQ ID NO: 49之輕鏈可變區、或至少其之如藉由IGMT所確定的CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 47之重鏈可變區及SEQ ID NO: 49之輕鏈可變區、或至少其之如藉由AHo所確定的CDR。以進一步實例說明之,該抗PD-1結合劑可包含包含SEQ ID NO: 51之免疫球蛋白重鏈及包含SEQ ID NO: 52之免疫球蛋白輕鏈、或與SEQ ID NO: 51及52具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列,視需要,其中該序列保留如以上所提供或如根據各種已知免疫球蛋白編號方案中之任何一者(例如,Kabat、Chothia、Martin(Enhanced Chothia)、IGMT或AHo)所確定的SEQ ID NO: 51及52之重鏈及輕鏈CDR。
在另一個實施例中,該抗PD-1結合劑包含SEQ ID NO: 46之免疫球蛋白重鏈可變區、或與SEQ ID NO: 46具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列;或包含至少SEQ ID NO: 46之CDR之免疫球蛋白重鏈可變區,其中該等CDR區域係如以上所提供(例如,CDR1 - SEQ ID NO: 57、CDR2 - SEQ ID NO: 41及CDR3 - SEQ ID NO: 9)或如根據各種已知免疫球蛋白編號方案中之任何一者(例如,Kabat、Chothia、Martin(Enhanced Chothia)、IGMT或AHo)所確定;及SEQ ID NO: 50之免疫球蛋白輕鏈可變區、或與SEQ ID NO: 50具有至少80%、85%或90%序列一致性(例如,至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性)之胺基酸序列;或包含至少SEQ ID NO: 50之CDR之免疫球蛋白重鏈可變區;其中該等CDR區係如以上所提供(例如,CDR1 - SEQ ID NO: 10、CDR2 - SEQ ID NO: 11及CDR3 - SEQ ID NO: 12)或如根據各種已知免疫球蛋白編號方案中之任何一者(例如,Kabat、Chothia、Martin(Enhanced Chothia)、IGMT或AHo)所確定。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 46之重鏈可變區及SEQ ID NO: 50之輕鏈可變區、或至少其之如藉由Kabat所確定的CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 46之重鏈可變區及SEQ ID NO: 50之輕鏈可變區、或至少其之如藉由Chothia所確定的CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 46之重鏈可變區及SEQ ID NO: 50之輕鏈可變區、或至少其之如藉由Martin所確定的CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 46之重鏈可變區及SEQ ID NO: 50之輕鏈可變區、或至少其之如藉由IGMT所確定的CDR。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO: 46之重鏈可變區及SEQ ID NO: 50之輕鏈可變區、或至少其之如藉由AHo所確定的CDR。
如本文所述,序列「一致性」可藉由比較所述核酸或胺基酸序列與參考核酸或胺基酸序列來確定。一致性百分比係所述序列與參考序列之間相同(亦即相同)之核苷酸或胺基酸殘基的數目除以最長序列的長度(亦即所述序列或參考序列中任一者的長度,以較長者為準)。用於獲得兩個或更多個序列之間的最佳比對及計算一致性之許多數學算法係已知且被併入至許多可用軟體程式中。此類程式之實例包括CLUSTAL-W、T-Coffee及ALIGN(用於核酸及胺基酸序列之比對)、BLAST程式(例如,BLAST 2.1、BL2SEQ及其更新版本)及FASTA程式(例如,FASTA3x、FASTM及SSEARCH)(用於序列比對及序列相似性搜索)。序列比對算法亦揭示於例如Altschul等人,J. Molecular Biol.
,215
(3): 403-410 (1990),Beigert等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
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(10): 3770-3775 (2009),Durbin等人編,Biological Sequence Analysis: Probalistic Models of Proteins and Nucleic Acids
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(7): 951-960 (2005),Altschul等人,Nucleic Acids Res.
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(17): 3389-3402 (1997)、及Gusfield,Algorithms on Strings, Trees and Sequences
,Cambridge University Press,Cambridge UK (1997))中。
序列一致性變化可藉由添加、取代或刪除一或多個胺基酸殘基來達成。胺基酸「置換」或「取代」係指多肽序列內給定位置或殘基上的一個胺基酸經相同位置或殘基上的另一個胺基酸置換。胺基酸置換或取代可係保守、半保守或非保守的,取決於取代是否係藉由具有類似於被取代殘基之性質之胺基酸殘基。定義單個胺基酸間共同性質之一種功能性方法係分析同源生物之相應蛋白質間胺基酸變化之標準化頻率(Schulz及Schirmer,Principles of Protein Structure
,Springer-Verlag,New York (1979))。根據此等分析,可定義胺基酸之組,其中組內的胺基酸優先彼此交換,及因此在其等對總體蛋白質結構之影響上彼此最相似(Schulz及Schirmer,同前述)。
胺基酸可大致分為「芳族」或「脂族」。芳族胺基酸包含芳族環。「芳族」胺基酸之實例包括組胺酸(H或His)、苯丙胺酸(F或Phe)、酪胺酸(Y或Tyr)及色胺酸(W或Trp)。非芳族胺基酸大致分為「脂族」。「脂族」胺基酸之實例包括甘胺酸(G或Gly)、丙胺酸(A或Ala)、纈胺酸(V或Val)、白胺酸(L或Leu)、異白胺酸(I或Ile)、甲硫胺酸(M或Met)、絲胺酸(S或Ser)、蘇胺酸(T或Thr)、半胱胺酸(C或Cys)、脯胺酸(P或Pro)、麩胺酸(E或Glu)、天冬胺酸(A或Asp)、天冬醯胺酸(N或Asn)、麩醯胺酸(Q或Gln)、離胺酸(K或Lys)及精胺酸(R或Arg)。
脂族胺基酸可細分為四個子組。「大脂族非極性子組」由纈胺酸、白胺酸及異白胺酸組成。「脂族微極性子組」由甲硫胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及半胱胺酸組成。「脂族極性/帶電荷子組」由麩胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、離胺酸及精胺酸組成。「小殘基子組」由甘胺酸及丙胺酸組成。「帶電荷/極性胺基酸」之組可細分為三個子組:由離胺酸及精胺酸組成之「帶正電荷子組」、由麩胺酸及天冬胺酸組成之「帶負電荷子組」及由天冬醯胺酸及麩醯胺酸組成之「極性子組」。
芳族胺基酸可細分為兩個子組。由組胺酸及色胺酸組成之「氮環子組」及由苯丙胺酸及酪胺酸組成之「苯基子組」。
保守胺基酸取代之實例包括以上所述的子組內的胺基酸之取代,例如,離胺酸取代精胺酸及反之亦然使得可維持正電荷,麩胺酸取代天冬胺酸及反之亦然使得可維持負電荷,絲胺酸取代蘇胺酸使得可維持游離-OH,及麩醯胺酸取代天冬醯胺酸使得可維持游離-NH2
。「半保守突變」包括本文所列出的相同組內而不是相同子組內的胺基酸之胺基酸取代。例如,天冬胺酸取代天冬醯胺酸或天冬醯胺酸取代離胺基涉及相同組內但不同子組內的胺基酸。「非保守突變」涉及不同組間的胺基酸取代,例如,離胺酸取代色胺酸、或苯丙胺酸取代絲胺酸等。
在一些實施例中,PD-1結合劑可包含本文所提供的免疫球蛋白重鏈及輕鏈可變區或完全重鏈及輕鏈多肽,基本上由其組成,或由其組成。分離的PD-1結合劑可係任何類型之包含至少指定免疫球蛋白重鏈及輕鏈可變區之分子或構築體。因此,PD-1結合劑可係(例如)如本文所述的完整免疫球蛋白或抗體、或抗原結合(PD-1結合)免疫球蛋白或抗體「片段」。關於抗體或免疫球蛋白使用的術語「片段」意指包含免疫球蛋白或抗體之某個部分並結合靶抗原之任何分子或構築體。此一片段一般包含至少包含CDR之重鏈及輕鏈可變區之部分,且亦可包含視需要與通常不是免疫球蛋白或抗體之部分之其他要素(例如連接子等)一起之恆定區之部分。此類「片段」之實例包括但不限於(i)Fab片段,其係由VL
、VH
、CL
及CH1
域組成之單價片段,(ii)F(ab’)2
片段,其係包含在鉸鏈區經二硫橋連接之兩個Fab片段之二價片段,(iii)由抗體之單個臂之VL
及VH
域組成之Fv片段;(iv)Fab’片段,其係因使用輕度還原條件破壞F(ab’)2
片段之二硫橋所產生;(v)雙功能抗體;(vi)單鏈可變區(scFv),及(vii)經二硫鍵穩定之Fv片段(dsFv)。
在一些實施例中,該PD-1結合劑包含免疫球蛋白重鏈恆定區,諸如片段可結晶(Fc
)區或其部分。Fc區可係任何Ig類別/亞類(IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)、IgM,包括其變體。在一個特定實施例中,該PD-1結合劑包含結合抗原呈現細胞(例如,樹突細胞、巨噬細胞、朗格漢斯(Langerhans)細胞或B細胞)之Fc受體之Fc區。該Fc受體可係Fcγ受體(FcγR),諸如FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)。在一個實施例中,該PD-1結合劑包含結合FcγR之Fc區,諸如IgG1。因此,在一些實施例中,該PD-1結合劑係「完整」或「完全」Ig(亦即抗體)。在另外實施例中,該PD-1結合劑係IgG抗體,特別是IgG1抗體。
分離的PD-1結合劑亦可係抗體結合物。在該態樣中,分離的PD-1結合劑可係包含PD-1結合劑(例如,抗PD-1抗體或抗體片段)及另一生物學活性部分之結合物。例如,該PD-1結合劑可經結合至肽、螢光分子或化學治療劑,特別是可用於抑制免疫反應之試劑。
分離的PD-1結合劑可係人類抗體、非人類抗體或嵌合抗體,或可自人類抗體、非人類抗體或嵌合抗體獲得。「嵌合」意指包含人類區域及非人類區域之抗體或其片段。較佳地,分離的PD-1結合劑係人類化抗體。「人類化」抗體係包含人類抗體支架及獲自或衍生自非人類抗體之至少一個CDR之單株抗體。非人類抗體包括分離自任何非人類動物,諸如(例如)囓齒動物(例如,小鼠或大鼠)之抗體。人類化抗體可包含獲自或衍生自非人類抗體之一個、兩個或三個CDR。在本發明之一個較佳實施例中,本發明PD-1結合劑之CDRH3係獲自或衍生自小鼠單株抗體,而本發明PD-1結合劑之其餘可變區及恆定區係獲自或衍生自人類單株抗體。
人類抗體、非人類抗體、嵌合抗體或人類化抗體可藉由任何方式獲得,包括藉由活體外來源(例如,融合瘤或重組產生抗體之細胞系)及活體內來源(例如囓齒動物)。用於產生抗體之方法係此項技術中已知且描述於例如Köhler及Milstein,Eur. J. Immunol
.,5
: 511-519 (1976);Harlow及Lane(編),Antibodies: A Laboratory Manual
,CSH Press (1988);及Janeway等人(編),Immunobiology ,第 5 版
,Garland Publishing,New York,NY (2001);Starkie等人,PLoS One
,11(3): e0152282 (2016))。在某些實施例中,人類抗體或嵌合抗體可使用轉基因動物(例如小鼠)產生,其中一或多個內源性免疫球蛋白基因係經一或多個人類免疫球蛋白基因置換。其中內源性抗體基因經人類抗體基因有效置換之轉基因小鼠之實例包括但不限於Medarex HUMAB-MOUSE™、Kirin TC MOUSE™及Kyowa Kirin KM-MOUSE™(參見,例如,Lonberg,Nat. Biotechnol
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: 1117-25 (2005)、及Lonberg,Handb. Exp. Pharmacol.
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: 69-97 (2008))。人類化抗體可使用此項技術中已知的任何適宜方法來產生(參見,例如,An, Z.(編),Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic
,John Wiley & Sons, Inc.,Hoboken,New Jersey (2009)),包括,例如,將非人類CDR接枝至人類抗體支架上(參見,例如,Kashmiri等人,Methods
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(1): 25-34 (2005);及Hou等人,J. Biochem
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(1): 115-120 (2008))。在一個實施例中,人類化抗體可使用描述於例如美國專利申請公開案2011/0287485 A1中之方法產生。
該PD-1結合劑可對人類PD-1具有任何適宜親和力。術語「親和力」係指兩種試劑之可逆結合之平衡常數且表示為解離常數(KD
)。結合劑對配體之親和力(諸如抗體對抗原決定基之親和力)可為例如約1皮莫耳(pM)至約100微莫耳(μM)(例如,約1皮莫耳(pM)至約1奈莫耳(nM)、約1 nM至約1微莫耳(μM)、或約1 μM至約100 μM)。在一個實施例中,該PD-1結合劑可以小於或等於1 nM(例如,0.9 nM、0.8 nM、0.7 nM、0.6 nM、0.5 nM、0.4 nM、0.3 nM、0.2 nM、0.1 nM、0.05 nM、0.025 nM、0.01 nM、0.001 nM或由任何兩個前述值界定的範圍)之KD
結合至PD-1蛋白質。在另一個實施例中,該PD-1結合劑可以小於或等於200 pM(例如,190 pM、175 pM、150 pM、125 pM、110 pM、100 pM、90 pM、80 pM、75 pM、60 pM、50 pM、40 pM、30 pM、25 pM、20 pM、15 pM、10 pM、5 pM、1 pM或由任何兩個前述值限定的範圍)之KD
結合至PD-1。在一些實施例中,該PD-1結合劑係以在關於人類PD-1所論述的前述範圍中之任何一個範圍內之親和力與食蟹獼猴PD-1交叉反應。免疫球蛋白對所述抗原或抗原決定基之親和力可使用任何技術公認的檢定進行測定。此類方法包括(例如)螢光活化細胞分選(FACS)、可分離之珠粒(例如磁性珠粒)、表面電漿共振(SPR)、溶液相競爭(KinExA®)、抗原淘选及/或ELISA(參見,例如,Janeway等人(編),Immunobiology
,第5版,Garland Publishing,New York,NY,2001)。
PD-1結合劑結合PD-1,但較佳不完全抑制PD-1負向調節免疫反應之能力,或在一些情況下,實質上不抑制PD-1負向調節免疫反應之能力或甚至增強PD-1負向調節免疫反應之能力。在一些實施例中,該PD-1結合劑不完全阻斷PD-1與PD-L1之間的結合,或較佳地,實質上不降低PD-1與PD-L1之間的結合。PD-1結合劑抑制PD-1調節免疫反應或PD-1結合至PD-L1之程度之評定可使用檢定(諸如彼等描述於實例中之檢定或此項技術中已知的其他檢定)來進行。在一些實施例中,該PD-1結合劑抑制PD-1結合至PD-L1不大於約80%、不大於約75%、不大於約70%、不大於約65%、不大於約60%、不大於約55%、不大於約50%、不大於約45%、不大於約40%、不大於約35%、不大於約30%、不大於約25%、不大於約20%、不大於約15%、不大於約10%。使用 / 治療方法
本發明提供一種藉由對哺乳動物投與本文所述的PD-1結合劑來抑制哺乳動物之免疫反應,特別是T細胞介導之免疫反應之方法。本發明進一步提供一種治療其中PD-1活性降低(例如,藉由降低之PD-L1結合而降低PD-1信號傳導,諸如降低免疫系統之負向調節)引起或促成疾病之病理效應之疾病或病症或其中PD-1活性增加(例如,藉由PD-L1結合增加PD-1信號傳導,諸如增加免疫反應之負向調節)將具有治療益處之任何疾病或病症之方法,該方法包括對哺乳動物投與本文所述的PD-1結合劑以減輕或消除病症之任何症狀,或預防或抑制此類症狀之發作。如本文所用,免疫系統之負向調節與免疫抑制同義。應明瞭,在一些情況下,PD-1結合劑可在症狀之發作之前投與(例如,在暴露至觸發免疫反應之抗原之前)以預防、抑制或降低抗原之引入後的免疫反應之嚴重度。
該疾病或病症可係發炎性或自體免疫病症。發炎性或自體免疫病症之實例包括(例如)感染(病毒、細菌、真菌及寄生蟲)、與感染相關之內毒素性休克、關節炎、類風濕性關節炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、骨盤發炎疾病、貝西氏病(Behcet disease)、茲海默氏症(Alzheimer's Disease)、發炎性腸病(包括克羅恩氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎)、佩羅尼氏病(Peyronie's Disease)、腹腔疾病、膽囊疾病、藏毛疾病、腹膜炎、牛皮癬、牛皮癬關節炎、血管炎、抗中性粒細胞胞質抗體相關(ANCA)血管炎、手術黏著、中風、I型糖尿病、萊姆病(lyme disease)、關節炎、腦膜腦炎、自體免疫葡萄膜炎、中樞及周邊神經系統之免疫介導之發炎病症,諸如多發性硬化症、狼瘡(諸如全身性紅斑狼瘡及慢性盤狀紅斑狼瘡)及格林蘭-巴爾(Guillain-Barr)症候群、異位性皮膚炎、多發性肌炎、皮肌炎、自體免疫肝炎、纖維化肺泡炎、格雷武司氏症(Grave's disease)、IgA腎病、特發性血小板減少性紫癜症、梅尼埃斯病(Meniere's disease)、天皰瘡、類天疱瘡、原發性膽汁性膽管炎、肝炎、類肉瘤病、硬皮病(局部硬皮病、全身性硬皮病及進行性全身性硬皮病)、肉芽腫病伴多血管炎、其他自體免疫病症、膽管炎、胰腺炎、創傷(手術)、移植物抗宿主病、移植排斥、心臟病(包括缺血性疾病,諸如心肌梗塞以及動脈粥樣硬化)、結節性動脈周圍炎(結節性多動脈炎及顯微性多血管炎)、過敏性肉芽腫性血管炎、超敏性血管炎、主動脈炎症候群(高安氏(Takayasu)動脈炎)、顳動脈炎、血管內凝血、骨吸收、骨質疏鬆症、骨關節炎、牙周炎及胃酸缺乏症、斯提耳氏病(Still's disease)、科干症候群(Cogan's syndrome)、RS3PE、風濕性多肌痛、肌纖維痛症候群、抗磷脂抗體症候群、嗜酸性筋膜炎、格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、重症肌無力、慢性萎縮性胃炎、古巴士德氏症候群(Goodpasture's syndrome)、快速進行性腎小球腎炎、巨幼細胞性貧血、溶血性貧血、自體免疫中性粒細胞減少、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、自體免疫腎上腺功能不全、原發性甲狀腺功能減退症、特發性阿狄森氏病(idiopathic Addison's disease)(慢性腎上腺功能不全)、妊娠皰疹、線性IgA大皰性皮膚病、後天性大皰性表皮鬆懈、斑禿、白斑病、原田病(Harada disease)、自體免疫視神經病變、特發性無精症、反復胎兒流產或與缺乏胎兒-母體耐受性有關之不育。
在一些實施例中,該疾病或病症係巨細胞動脈炎、風濕性多肌痛、原發性休格倫氏症候群(Primary Sjögren’s Syndrome)、TNF難治性類風濕性關節炎、斑禿、原發性膽汁性膽管炎(PBC)、移植物抗宿主病(GvHD)、白斑病、ANCA血管炎、1型糖尿病或非感染性葡萄膜炎。
「免疫反應」可包括例如抗體產生及/或免疫效應細胞(例如T細胞)之活化、發炎性細胞介素之產生、或本文所述或以其他方式在此項技術中已知之任何適應症或病症。如本文所用,術語「治療(treatment)」、「治療(treating)」及類似語係指獲得所需藥理及/或生理效應。較佳地,該效應係治療性的,亦即,該效應部分或完全治癒疾病及/或歸因於該疾病之不良症狀。為此,本發明方法包括投與「治療有效量」之PD-1結合劑。「治療有效量」係指在必要劑量及時間段內有效達成所需治療效應的量。治療有效量可根據因素(諸如個體之疾病狀態、年齡、性別及體重、及個體中PD-1結合劑引起所需反應之能力)而變化。
或者,藥理及/或生理效應可係預防性的,亦即,該效應完全或部分預防疾病或其症狀。在該態樣中,本發明方法包括投與「預防有效量」之PD-1結合劑。「預防有效量」係指在必要劑量及必要時間段下有效實現所需預防結果(例如,預防疾病發作)之量。
PD-1結合劑可係適於投與哺乳動物之組合物之部分。較佳地,該組合物係醫藥上可接受之(例如,生理上可接受之)組合物,其包含載劑(較佳係醫藥上可接受之(例如,生理上可接受之)載劑)、及本發明胺基酸序列、抗原結合劑或載體。可在本發明內文中使用任何適宜載劑,及此類載劑係此項技術中熟知。載劑之選擇將部分地由可投與組合物之特定部位及用於投與該組合物之特定方法來確定。該組合物亦可包含用於治療性分子(例如蛋白質或抗體)之調配物中之任何其他賦形劑,特別是非經腸調配物,包括(例如)緩沖劑、張力調節劑、穩定劑、表面活性劑及類似物。該組合物視需要可係無菌的。該組合物可經冷凍或凍乾以用於儲藏且在使用前在適宜無菌載劑中復水。該組合物可根據描述於例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy ,第 21 版,
Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,PA (2001)中之習知技術來產生。
PD-1結合劑之典型劑量可在例如1 pg/kg至20 mg/kg動物或人類體重之範圍內;然而,低於或高於該示例性範圍之劑量係在本發明之範疇內。每日非經腸劑量可為約0.00001 μg/kg至約20 mg/kg總體重(例如,約0.001 μg/kg、約0.1 μg/kg、約1 μg/kg、約5 μg/kg、約10 μg/kg、約100 μg/kg、約500 μg/kg、約1 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg或由任何兩個前述值限定的範圍),較佳係約0.1 μg/kg至約10 mg/kg總體重(例如,約0.5 μg/kg、約1 μg/kg、約50 μg/kg、約150 μg/kg、約300 μg/kg、約750 μg/kg、約1.5 mg/kg、約5 mg/kg或由任何兩個前述值限定的範圍),更佳係約1 μg/kg至5 mg/kg總體重(例如,約3 μg/kg、約15 μg/kg、約75 μg/kg、約300 μg/kg、約900 μg/kg、約2 mg/kg、約4 mg/kg或由任何兩個前述值限定的範圍),及甚至更佳係約0.5至15 mg/kg體重/天(例如,約1 mg/kg、約2.5 mg/kg、約3 mg/kg、約6 mg/kg、約9 mg/kg、約11 mg/kg、約13 mg/kg或由任何兩個前述值限定的範圍)。治療或預防效力可藉由定期評定所治療患者來監測。對於幾天或更長時間之重複投藥,取決於病狀,可重複治療直至發生疾病症狀之所需的抑制。然而,其他給藥方案可係有用的且係在本發明之範疇內。所需劑量可藉由單次推注投與組合物,藉由多次推注投與組合物,或藉由連續輸注投與組合物來遞送。
PD-1結合劑可使用標準投藥技術投與哺乳動物,包括口服、靜脈內、腹膜內、皮下、肺、經皮、肌肉內、鼻內、頰、舌下或栓劑投藥。該組合物較佳係適於非經腸投藥。如本文所用,術語「非經腸」包括靜脈內、肌肉內、皮下、直腸、陰道及腹膜內投藥。更佳地,該組合物係使用外周全身遞送藉由靜脈內、腹膜內或皮下注射將組合物投與哺乳動物。
一旦投與哺乳動物(例如人類),立刻可藉由此項技術中已知的任何適宜方法來測量本發明PD-1結合劑之生物學活性。例如,生物學活性可藉由確定特定PD-1結合劑之穩定性來評定生物活性。在本發明之一個實施例中,PD-1結合劑(例如抗體)具有在約30分鐘與45天之間(例如,約30分鐘、約45分鐘、約1小時、約2小時、約4小時、約6小時、約10小時、約12小時、約1天、約5天、約10天、約15天、約25天、約35天、約40天、約45天或由任何兩個前述值限定的範圍)之活體內半衰期。在另一個實施例中,該PD-1結合劑具有在約2小時與20天之間(例如,約5小時、約10小時、約15小時、約20小時、約2天、約3天、約7天、約12天、約14天、約17天、約19天或由任何兩個前述值限定的範圍)之活體內半衰期。在另一個實施例中,該PD-1結合劑具有在約10天與約40天之間(例如,約10天、約13天、約16天、約18天、約20天、約23天、約26天、約29天、約30天、約33天、約37天、約38天、約39天、約40天或由任何兩個前述值限定的範圍)之活體內半衰期。
本發明之PD-1結合劑可單獨或與其他活性劑或藥物組合投與。例如,該PD-1結合劑可與用於治療或預防本文所揭示的疾病之其他藥劑組合投與。在該態樣中,該PD-1結合劑可與至少一種其他發炎性或自體免疫病症抑制劑(包括,例如,其他單株抗體、疾病殺死病毒、基因療法及過繼性T細胞轉移、及/或手術)組合使用。本文所述的本發明PD-1結合劑亦可與至少一種其他免疫抑制劑(包括,例如,甲胺喋呤、腎上腺皮質類固醇及用於治療自體免疫及發炎性疾病之其他小分子藥劑)組合使用。當本發明方法治療感染性疾病時,該PD-1結合劑可與至少一種抗細菌劑或至少一種抗病毒劑組合投與。在該態樣中,該抗細菌劑可係此項技術中已知的任何適宜抗生素。該抗病毒劑可係特異性靶向特定病毒之任何適宜類型之任何疫苗(例如,活減毒疫苗、亞單位疫苗、重組載體疫苗及小分子抗病毒療法(例如,病毒複製抑制劑及核苷類似物)。
除治療用途外,本文所述的PD-1結合劑可用於診斷或研究應用。在該態樣中,該PD-1結合劑可用於診斷癌症或感染性疾病之方法中。依類似方式,該PD-1結合劑可用於監測所測試個體中與異常PD-1表現相關之疾病或病症之PD-1蛋白質濃度之檢定中。研究應用包括(例如)利用PD-1結合劑及標籤以偵測樣品中(例如,人類體液中或細胞或組織提取物中)PD-1蛋白質之方法。該PD-1結合劑可修飾或不修飾地使用,諸如用可偵測之部分進行共價或非共價標記。例如,該可偵測之部分可係放射性同位素(例如,3
H、14
C、32
P、35
S或125
I)、螢光或化學發光化合物(例如,異硫氰酸螢光素、羅丹明(rhodamine)或蟲螢光素)、酵素(例如,鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶)、或輔基。可在本發明內文中採用此項技術中已知用於分別結合抗原結合劑(例如抗體)至可偵測之部分之任何方法(參見,例如,Hunter等人,Nature
,194
: 495-496 (1962);David等人,Biochemistry
,13
: 1014-1021 (1974);Pain等人,J. Immunol. Meth.
,40
: 219-230 (1981);及Nygren,J. Histochem. Cytochem.
,30
: 407-412 (1982))。
PD-1蛋白質濃度可使用本發明PD-1結合劑藉由此項技術中已知的任何適宜方法來測量。此類方法包括(例如)放射免疫測定法(RIA)及FACS。PD-1蛋白質之正常或標準表現值可使用任何適宜技術來確定,例如,藉由在適於形成抗原-抗體複合物之條件下將包含或懷疑包含PD-1多肽之樣品與PD-1特異性抗體組合。該抗體係直接或間接經可偵測之物質標記以促進結合或未結合抗體之偵測。適宜之可偵測之物質包括各種酵素、輔基、螢光材料、發光材料及放射性材料(參見,例如,Zola,Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques
,CRC Press, Inc. (1987))。然後將在樣品中表現之PD-1多肽的量與標準值進行比較。
PD-1結合劑可以套組形式(亦即,預定量之試劑與用於進行診斷檢定之說明書之包裝組合)提供。若PD-1結合劑係經酵素標記,則該套組理想地包括為酵素所需的受質及輔因子(例如,提供可偵測之發色團或螢光團之受質前驅物)。另外,套組中可包括其他添加劑,諸如穩定劑、緩衝液(例如,阻斷緩衝液或裂解緩衝液)及類似物。可改變各種試劑之相對量以提供試劑之溶液中之濃度,此實質上最佳化檢定之靈敏度。該等試劑可呈乾粉(通常凍乾)提供,包括在溶解後將提供具有適宜濃度之試劑溶液之賦形劑。核酸、細胞、生產方法
本發明亦提供一或多種分離或純化之編碼PD-1結合劑或其單個重鏈或輕鏈免疫球蛋白多肽之核酸序列。因此,在一個實施例中,該核酸編碼如本文所提供的免疫球蛋白輕鏈可變區或完整免疫球蛋白輕鏈。在另一個實施例中,該核酸編碼如本文所提供的免疫球蛋白重鏈可變區或完整免疫球蛋白輕鏈。在又另一個實施例中,如本文所提供,該核酸編碼免疫球蛋白輕鏈可變區或完整免疫球蛋白輕鏈、及免疫球蛋白重鏈可變區或完整免疫球蛋白重鏈。編碼免疫球蛋白重鏈之核酸序列之實例係由SEQ ID NO: 53及55提供,其分別編碼SEQ ID NO:29及47之重鏈可變區、及分別SEQ ID NO: 36及51之完整重鏈及輕鏈。編碼免疫球蛋白輕鏈之核酸序列之實例係由SEQ ID NO: 54及56提供,其分別編碼SEQ ID NO:35及49之輕鏈可變區、及分別SEQ ID NO: 37及52之完整重鏈及輕鏈。
術語「核酸」及「核酸序列」意欲涵蓋DNA或RNA之聚合物,亦即,多核苷酸,其可係單股或雙股且其可包含非天然或改變之核苷酸。如本文所用,術語「核酸」及「多核苷酸」係指任何長度之核苷酸之聚合形式核糖核苷酸(RNA)或脫氧核糖核苷酸(DNA)。此等術語係指分子之一級結構,及因此包括雙股及單股DNA、及雙股及單股RNA。該等術語包括作為等效物之由核苷酸類似物及經修飾之多核苷酸(諸如但不限於甲基化及/或封端多核苷酸)製成的RNA或DNA之類似物。核酸通常係經磷酸酯鍵連接以形成核酸序列或多核苷酸,儘管在此項技術中已知許多其他鍵(例如,硫代磷酸酯、硼酸磷酸酯及類似物)。
核酸可係載體之部分。該載體可為(例如)質體、游離體(episome)、黏質體、病毒載體(例如逆轉錄病毒或腺病毒)、或噬菌體。適宜載體及載體製備方法係此項技術中熟知(參見,例如,Sambrook等人,Molecular Cloning, a Laboratory Manual ,第 3 版,
Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)、及Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology
,Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons,New York,N.Y. (1994))。
除編碼免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈之核酸序列外,載體可包含提供編碼序列在宿主細胞中之表現之表現控制序列,諸如啟動子、增強子、聚腺苷酸化信號、轉錄終止子、內部核糖體進入位點(IRES)及類似物。示例性表現控制序列係此項技術中已知且描述於例如Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology
,第185卷,Academic Press,San Diego, Calif. (1990)中。
來自多種不同來源之大量啟動子(包括組成型、誘導型及抑制型啟動子)係此項技術中熟知。啟動子之代表性來源包括(例如)病毒、哺乳動物、昆蟲、植物、酵母及細菌,及來自此等來源之適宜啟動子係可容易獲得的,或可基於可例如從諸如ATCC之保藏庫以及其他商業或個人來源公開獲得之序列合成製得。啟動子可係單向的(亦即,沿一個方向啟動轉錄)或雙向的(亦即,沿3’或5’方向啟動轉錄)。啟動子之非限制性實例包括(例如) T7細菌表現系統、pBAD (araA)細菌表現系統、巨細胞病毒(CMV)啟動子、SV40啟動子、RSV啟動子。誘導型啟動子包括(例如)Tet系統(美國專利5,464,758及5,814,618)、蛻皮激素誘導型系統(No等人,Proc. Natl. Acad. Sci.
,93
: 3346-3351 (1996))、T-REX™系統(Invitrogen,Carlsbad,CA)、LACSWITCH™系統(Stratagene,San Diego,CA)及Cre-ERT他莫昔芬(tamoxifen)誘導型重組酶系統(Indra等人,Nuc. Acid .Res.
,27
: 4324-4327 (1999);Nuc. Acid. Res.
,28
: e99 (2000);美國專利7,112,715;及Kramer & Fussenegger,Methods Mol. Biol.
,308
: 123-144 (2005))。
如本文所用,術語「增強子」係指增加例如可操作地連接至其之核酸序列之轉錄之DNA序列。增強子可位於距核酸序列之編碼區幾千個鹼基的地方且可介導調節因子之結合、DNA甲基化模式或DNA結構變化。來自多種不同來源之大量增強子係此項技術中熟知且可用作經選殖之多核苷酸(來自(例如)保藏庫(諸如ATCC)以及其他商業或個體來源)或可用於經選殖之多核苷酸(來自(例如)保藏庫(諸如ATCC)以及其他商業或個體來源)中。許多包含啟動子之多核苷酸(諸如常用CMV啟動子)亦包含增強子序列。增強子可位於編碼序列之上游、內部或下游。
載體亦可包含可選標記基因。如本文所用,術語「可選標記基因」係指以下核酸序列,其使細胞在相應選擇劑之存在下表現該特異性地選擇之核酸序列。適宜可選標記基因係此項技術中已知且描述於例如國際專利申請公開案WO 1992/008796及WO 1994/028143;Wigler等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
,77
: 3567-3570 (1980);O'Hare等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
,78
: 1527-1531 (1981);Mulligan & Berg,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
,78
: 2072-2076 (1981);Colberre-Garapin等人,J. Mol. Biol
.,150
: 1-14 (1981);Santerre等人,Gene
,30
: 147-156 (1984);Kent等人,Science
,237
: 901-903 (1987);Wigler等人,Cell
,11
: 223-232 (1977);Szybalska & Szybalski,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
,48
: 2026-2034 (1962);Lowy等人,Cell
,22
: 817-823 (1980);及美國專利5,122,464及5,770,359中。
在一些實施例中,載體係「游離型表現載體」或「游離體」,其能夠在宿主細胞中復製,且在適宜選擇壓力之存在下作為DNA之染色體外片段在宿主細胞內持續存在(參見,例如,Conese等人,Gene Therapy
,11
: 1735-1742 (2004))。代表性市售游離型表現載體包括但不限於利用愛潑斯坦巴爾核抗原1(Epstein Barr Nuclear Antigen 1)(EBNA1)及愛潑斯坦巴爾病毒(Epstein Barr Virus)(EBV)複製起點(oriP)之游離型質體。來自Invitrogen(Carlsbad,CA)之載體pREP4、pCEP4、pREP7及pcDNA3.1及來自Stratagene(La Jolla,CA)之pBK-CMV代表使用T抗原及SV40複製起點代替EBNA1及oriP之游離型載體之非限制性實例。
其他適宜載體包括整合表現載體,其可隨機整合至宿主細胞的DNA中,或可包括重組位點以實現表現載體與宿主細胞的染色體之間的特異性重組。此類整合表現載體可利用宿主細胞的染色體之內源性表現控制序列來實現所需蛋白質之表現。以位點特異性方式整合之載體之實例包括(例如)來自Invitrogen(Carlsbad,CA)之flp-in系統之組分(例如,pcDNA™5/FRT)、或cre-lox系統,諸如在來自Stratagene(La Jolla,CA)之pExchange-6 Core Vectors中找到。隨機整合至宿主細胞染色體中之載體之實例包括(例如)來自ThermoFisher(Carlsbad,CA)之pcDNA3.3(在不存在T-抗原下引入時)、來自Millipore(Billerica,MA)之UCOE及來自Promega(Madison,WI)之pCI或pFN10A(ACT) FLEXI™。
亦可使用病毒載體。代表性市售病毒表現載體包括但不限於可從Crucell, Inc.(Leiden,The Netherlands)獲得之基於腺病毒之Per.C6系統、來自ThermoFisher(Carlsbad,CA)之基於慢病毒之pLP1及來自Agilent(Stratagene,La Jolla,CA)之逆轉錄病毒載體pFB-ERV plus pCFB-EGSH。
可將編碼本發明胺基酸序列之核酸序列提供至相同載體上之細胞(亦即,以順式)。可使用單向啟動子來控制每個核酸序列之表現。在另一個實施例中,雙向啟動子及單向啟動子之組合可用於控制多個核酸序列之表現。或者,可將編碼本發明胺基酸序列之核酸序列提供至單獨載體上之細胞群(亦即,以反式)。每個單獨載體中之每個核酸序列可包含相同或不同表現控制序列。該等單獨載體可同時提供至細胞。
可將包含編碼本發明胺基酸序列之核酸之載體引入至能夠表現藉由其編碼的多肽之宿主細胞(包括任何適宜原核細胞或真核細胞)中。因此,本發明提供包含本發明載體之活體外細胞或細胞系。本發明亦提供表現免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈多肽或表現PD-1結合劑之活體外細胞或細胞系。較佳宿主細胞係彼等可容易且可靠地生長,具有相當快生長速率,具有明確表徵的表現系統,且可容易且有效地轉形或轉染之宿主細胞。
適宜原核細胞之實例包括但不限於來自以下屬之細胞:芽孢桿菌(諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis
)及短芽孢桿菌(Bacillus brevis
))、大腸埃希氏菌(Escherichia
)(諸如大腸桿菌(E. coli
))、假單胞菌(Pseudomonas
)、鏈黴菌、沙門氏菌(Salmonella
)及歐文氏菌(Erwinia
)。特別有用的原核細胞包括各種大腸埃希氏菌(Escherichia coli
)菌株(例如,K12、HB101(ATCC No. 33694)、DH5α、DH10、MC1061(ATCC No. 53338)及CC102)。
在一些實施例中,將載體引入至真核細胞中。適宜真核細胞係此項技術中已知且包括(例如)酵母細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞。適宜酵母細胞之實例包括彼等來自以下屬之酵母細胞:克魯維酵母菌(Kluyveromyces
)、畢赤酵母(Pichia
)、犀牛-孢子蟲(Rhino-sporidium
)、酵母菌屬(Saccharomyces
)及裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces
)。較佳酵母細胞包括(例如)釀酒酵母(Saccharomyces cerivisae
)及巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris
)。
適宜昆蟲細胞描述於例如Kitts等人,Biotechniques
,14
: 810-817 (1993);Lucklow,Curr. Opin. Biotechnol.
,4
: 564-572 (1993);及Lucklow等人,J. Virol.
,67
: 4566-4579 (1993)中。較佳昆蟲細胞包括Sf-9及HI5(Invitrogen,Carlsbad,CA)。
在一些實施例中,哺乳動物細胞係用於本發明中。許多適宜哺乳動物宿主細胞係此項技術中已知,且許多可從美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection)(ATCC,Manassas,VA)獲得。適宜哺乳動物細胞之實例包括但不限於中國倉鼠卵巢細胞(CHO)(例如,ATCC No. CCL61)、CHO DHFR細胞(例如,Urlaub等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
,97
: 4216-4220 (1980))、人類胚胎腎(HEK) 293或293T細胞(例如,ATCC No. CRL1573)及3T3細胞(例如,ATCC No. CCL92)。其他適宜哺乳動物細胞系係猴COS-1(例如,ATCC No. CRL1650)及COS-7細胞系(例如,ATCC No. CRL1651)、以及CV-1細胞系(例如,ATCC No. CCL70)。其他示例性哺乳動物宿主細胞包括靈長類動物細胞系及囓齒動物細胞系,包括小鼠細胞系NS0(小鼠骨髓瘤細胞系MOPC21(例如Tysabri)之衍生物)及轉形細胞系。正常二倍體細胞(衍生自初級組織之活體外培養之細胞品系)以及初級外植體亦適宜。其他適宜哺乳動物細胞系包括但不限於小鼠神經母細胞瘤N2A細胞、HeLa、小鼠L-929細胞、及BHK或HaK倉鼠細胞系,該等細胞系均可從ATCC獲得。用於選擇適宜哺乳動物宿主細胞之方法及用於轉形、培養、擴增、篩选及純化細胞之方法係此項技術中已知。
在一些實施例中,哺乳動物細胞係人類細胞。例如,哺乳動物細胞可係人類淋巴或淋巴衍生細胞系,諸如源自前B淋巴細胞之細胞系。人類淋巴細胞系之實例包括但不限於RAMOS (例如,CRL-1596)、Daudi (例如,CCL-213)、EB-3 (例如,CCL-85)、Raji細胞(例如,CCL-86)及其衍生物。
可藉由任何適宜技術(諸如藉由「轉染」、「轉形」或「轉導」)將編碼本發明胺基酸序列之核酸序列引入至細胞中。如本文所用,「轉染」、「轉形」或「轉導」係指藉由使用物理或化學方法將一或多種外源多核苷酸引入至宿主細胞中。許多轉染技術係此項技術中已知且包括(例如)磷酸鈣DNA共沉澱(參見,例如,Murray E.J.(編),Methods in Molecular Biology
,第 7 卷, Gene Transfer and Expression Protocols
, Humana Press (1991));DEAE-葡聚糖;電穿孔;陽離子脂質體介導之轉染;鎢粒子促進之微粒轟擊(Johnston,Nature
,346
: 776-777 (1990));及磷酸鍶DNA共沉澱(Brash等人,Mol. Cell Biol.
,7
: 2031-2034 (1987))。在感染性顆粒於適宜包裝細胞中生長後,可將噬菌體或病毒載體引入至宿主細胞中,其中許多係可商業購得。
核酸及細胞可用於任何目的,諸如用於本文所述的PD-1結合劑之製造。在該態樣中,本發明提供一種製備PD-1結合劑之方法,該方法包括培養包含編碼PD-1結合劑之重及/或輕免疫球蛋白多肽之核酸之細胞。換言之,該方法包括在細胞中表現編碼PD-1結合劑之免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈之核酸。應瞭解,免疫球蛋白重鏈及輕鏈可自單個核酸於給定細胞中表現,或免疫球蛋白重鏈及輕鏈可自單獨核酸於相同細胞中表現。該方法可進一步包括使用已知技術自細胞或細胞培養基收穫及/或純化PD-1結合劑。
以下實例進一步說明本發明,但是,當然,不應被解釋為以任何方式限制本發明之範圍。
實例
以下實例描述根據本發明之實施例之特定抗PD-1抗體重鏈多肽及輕鏈多肽序列。用於此等實例中之抗體如下所述。
437M5-112抗體係衍生自來自免疫化小鼠脾臟之經分選之PD-1結合IgG轉換B細胞上的單個細胞PCR。3.7C6抗體係衍生自藉由標準融合技術自免疫化小鼠之脾臟細胞產生之小鼠雜交瘤。該等抗體係使用本文所述的標準技術加以人類化。最終最佳化抗體係在CHO細胞中表現。抗體序列概述於表1A、1B及1C中,其中「H」鏈及「L」鏈分別指重鏈及輕鏈,及CDR係經確定包含根據Kabat定義及IMGT定義之胺基酸(表1B)或針對某些抗體根據Kabat或IMGT之胺基酸(表1C)。
表1A
表1B
表1C
實例1
AKA 437M5-112 | 表現條件 | H 鏈可變區 | L 鏈可變區 |
APE12044 | SEQ ID NO: 30 | SEQ ID NO:35 | |
APE11844 | SEQ ID NO:24 | SEQ ID NO:34 | |
APE12043 | ExpiCHO-S™瞬時 | SEQ ID NO:29 | SEQ ID NO:35 |
APE12538 | CHO-S分選穩定池 | SEQ ID NO:29 (全H鏈SEQ ID NO: 36) | SEQ ID NO:35 (全L鏈SEQ ID NO: 37) |
AKA 3.7C6 | 表現條件 | H 鏈可變區 | L 鏈可變區 |
APE12093 | SEQ ID NO:46 | SEQ ID NO:50 | |
APE12095 | ExpiCHO-S™瞬時 | SEQ ID NO:47 | SEQ ID NO:49 |
APE12537 | CHO-S分選穩定池 | SEQ ID NO:47 (全H鏈SEQ ID NO: 51) | SEQ ID NO:49 (全L鏈SEQ ID NO: 52) |
APE12890 | CHO-S | SEQ ID NO:47 (全H鏈SEQ ID NO: 51) | SEQ ID NO:49 (全L鏈SEQ ID NO: 52) |
抗體 | CDR序列(SEQ ID NO) | |||||
CDRH1 | CDRH2 | CDRH3 | CDRL1 | CDRL2 | CDRL3 | |
APE12044 | 15 | 2 | 21 | 23 | 5 | 6 |
APE11844 | 13 | 2 | 19 | 22 | 5 | 6 |
APE12043 | 15 | 2 | 20 | 23 | 5 | 6 |
APE12538 | 15 | 2 | 20 | 23 | 5 | 6 |
APE12093 | 57 | 41 | 9 | 10 | 11 | 12 |
APE12095 | 57 | 42 | 9 | 10 | 11 | 12 |
APE12537 | 57 | 42 | 9 | 10 | 11 | 12 |
APE12890 | 57 | 42 | 9 | 10 | 11 | 12 |
3.7C6(APE12095 、 APE12537 、 APE12890) | SEQ ID NO | Kabat 序列 |
CDRH1 | 64 | DYSMH |
CDRH2 | 65 | WINIETYYPTYADQFKG |
CDRH3 | 66 | DYYGRFYYAMDY |
CDRL1 | 67 | TASSSVSSSYFH |
CDRL2 | 68 | STSNLAS |
CDRL3 | 69 | HQYHRSPLT |
3.7C6(APE12095 、 APE12537 、 APE12890) | IMGT 序列 | |
CDRH1 | 70 | NYTFTDYS |
CDRH2 | 71 | INIETYYP |
CDRH3 | 72 | ARDYYGRFYYAMDY |
CDRL1 | 73 | SSVSSSY |
CDRL2 | 74 | STS |
CDRL3 | 75 | HQYHRSPLT |
437M5(APE12043 及 APE12538) | Kabat 序列 | |
CDRH1 | 76 | SYSMH |
CDRH2 | 77 | YINPSSGFTNYIQKFRD |
CDRH3 | 78 | DYYGRYYYVMDY |
CDRL1 | 79 | TASSSVSSSFLH |
CDRL2 | 80 | STSDLAS |
CDRL3 | 81 | HQYHRSPLT |
437M5(APE12043 及 APE12538) | IGMT 序列 | |
CDRH1 | 82 | GYTFTSYS |
CDRH2 | 83 | INPSSGFT |
CDRH3 | 84 | ARDYYGRYYYVMDY |
CDRL1 | 85 | SSVSSSF |
CDRL2 | 86 | STS |
CDRL3 | 87 | HQYHRSPLT |
此實例證實本文所揭示的抗體展現飽和結合至在穩定轉染之HEK 293細胞中表現之人類及食蟹獼猴PD-1。
穩定轉染HEK 293細胞以表現人類PD-1或食蟹獼猴PD-1。藉由AccutaseTM
處理(Innovative Cell Technologies,San Diego,CA)收穫細胞,用親油性螢光染料Vybrant® DiD(ThermoFisher Scientific,Carlsbad,CA)處理表現食蟹獼猴PD-1之細胞,且然後與相同數目之表現人類PD-1之未標記的HEK 293細胞混合。用指示濃度之每種抗體在4℃伴隨輕輕振盪下染色細胞(每個樣品總共2 x 105
個)40分鐘,離心並洗一次。在室溫下,在含在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之2%多聚甲醛中固定細胞10分鐘,洗,且在4℃伴隨輕輕振盪下用藻紅蛋白(PE)共軛山羊抗人類κ(Southern Biotechnology,Birmingham,AL)偵測抗體15分鐘。洗細胞,再懸浮,及在BD FACSArrayTM
(BD Biosciences,San Jose,CA)上定量結合的抗體螢光。使用FlowJo®分析軟體(FlowJo,LLC)分析資料之中值螢光強度(MFI)。EC50
值係在GraphPad Prism 5.0(GraphPad軟體)中使用log(促效劑)與反應–可變斜率(4參數)曲線擬合來確定。結果顯示於圖1及2中,及EC50
值列於表2(人類)及表3(食蟹獼猴)中。APE06339係對雞蛋溶菌酶具有特異性之人類IgG1同型對照抗體。APE08145係參考抗PD-1抗體。
表2.
表3.
實例2
抗體 | 類型 | EC50 (nM) |
APE12043.02 | 437M5-112 | 4.88 |
APE12043.03 | 437M5-112 | 3.13 |
APE12043.05 | 437M5-112 | 2.95 |
APE12095.03 | 3.7C6 | 11.92 |
APE12095.04 | 3.7C6 | 9.04 |
APE12095.06 | 3.7C6 | 11.82 |
APE08145.05 | 參考抗PD1 | 20.80 |
APE08145.06 | 參考抗PD1 | 10.91 |
APE06339.08 | IgG1同型對照 | 不結合 |
抗體 | 類型 | EC50 (nM) |
APE12043.02 | 437M5-112 | 3.69 |
APE12043.03 | 437M5-112 | 2.69 |
APE12043.05 | 437M5-112 | 2.59 |
APE12095.03 | 3.7C6 | 7.99 |
APE12095.04 | 3.7C6 | 6.17 |
APE12095.06 | 3.7C6 | 7.47 |
APE08145.05 | 參考抗PD1 | 91.14 |
APE08145.06 | 參考抗PD1 | 65.68 |
APE06339.08 | IgG1同型對照 | 不結合 |
此實例證實本文所揭示的抗體結合至2天抗CD3/抗CD28活化人類外周血液CD4+
T細胞。
使用外周血液單核細胞(PBMC)之磁珠分離(CD4+
T細胞分離套組,Miltenyi Biotec,Auburn,CA)製備初級人類外周血液CD4+
T細胞且在6孔板中用經塑料塗覆之抗CD3及抗CD28活化48小時。洗細胞(每個樣品1 x 105
個)且在4℃伴隨輕輕振蕩下在V型底96孔板中用指示濃度之每種抗體染色30 min,離心並洗一次。在室溫下在含在PBS中之4%多聚甲醛中固定細胞10 min,洗,且在4℃下用Alexa Fluor 647共軛F(ab’)2山羊抗人類IgG Fc(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)偵測抗體10 min。洗細胞,再懸浮,及在BD FACSArrayTM
(BD Biosciences,San Jose,CA)上定量結合的抗體螢光。使用FlowJo®分析軟體(FlowJo,LLC)分析資料之幾何平均螢光強度(MFI)。EC50
值係在GraphPad Prism 7.02(GraphPad軟體)中使用log(促效劑)與反應–可變斜率(4參數)曲線擬合來確定。結果顯示於圖3中,及EC50
值列於表4中。APE10787係對PD-1具有特異性之人類IgG1陽性對照抗體,及APE06339係對雞蛋溶菌酶具有特異性之人類IgG1同型對照抗體。
表4.
實例3
抗體 | 描述 | EC50 (nM) |
APE10787 | 抗PD-1陽性對照 | 0.36 |
APE06339.08 | IgG1同型對照 | 不結合 |
APE12043.03 | 437M5-112 | 2.99 |
APE12043.05 | 437M5-112 | 3.06 |
APE12095.04 | 3.7C6 | 39.07 |
APE12095.06 | 3.7C6 | 53.87 |
此實例證明本文所揭示的抗體與PD-L1及PD-L2競爭結合至人類PD-1轉染之CHO-K1細胞之程度。
進行競爭檢定以測試抗PD-1抗體與PD-L1-Fc或PD-L2-Fc構築體之間的PD-1結合競爭。如圖4至7中所顯示,所測試抗體顯示與PD-L1之競爭中等(~70%最大抑制)及與PD-L2之強烈競爭;另一所測試抗體顯示與PD-L1之弱/最小競爭(~15%最大抑制)及與PD-L2之中等競爭(~70%最大抑制)。
穩定轉染CHO-K1細胞以表現人類PD-1且選擇高程度表現純系。藉由AccutaseTM
處理(Innovative Cell Technologies,San Diego,CA)收穫細胞,且置於U型底96孔板中(2 x 105
個細胞/孔)。為測試PD-L1,將競爭抗體進行系列稀釋且與DyLight 650 (DyL650)標記之人類PD-L1小鼠IgG1 Fc融合蛋白(Abcam,Cambridge,MA)預混合(10 nM終濃度DyL650- PD-L1-Fc及抗體濃度,如圖4及5中所示)。在冰上培養10 min後,在4℃伴隨輕輕振蕩下添加抗體/DyL650-PD-L1-Fc混合物至細胞30 min。離心細胞,洗一次,再懸浮於包含碘化丙啶之緩衝液中,及在BD FACSArrayTM
(BD Biosciences,San Jose,CA)上定量結合的PD-L1-Fc螢光。使用FlowJo®分析軟體(FlowJo,LLC)分析資料之PD-L1幾何中值螢光強度(MFI)。IC50
值係在GraphPad Prism 7.02(GraphPad軟體)中使用log(促效劑)與反應–可變斜率(4參數)曲線擬合來確定。結果顯示於圖4及5中,及所得的IC50
值列於表4至5中。APE10787(「10787」)係對PD-1具有特異性之人類IgG1陽性對照拮抗劑抗體,及APE06339(「06339.08」)係對雞蛋溶菌酶具有特異性之人類IgG1同型對照抗體。APE08145(「08145.05」及「08145.06」)係參考抗體。APE12043(「12043.02」及「12043.03」)係描述於實例1中之437M5-112抗PD-1抗體。APE12095(「12095.03」及「12095.04」)係描述於實例1中之3.7C6抗PD-1抗體。
藉由AccutaseTM
處理(Innovative Cell Technologies,San Diego,CA)收穫穩定表現高程度人類PD-1之CHO-K1細胞純系,且置於U型底96孔板中(2 x 105
個細胞/孔)。為測試PD-L2,將競爭抗體進行系列稀釋且與DyL650標記之人類PD-L2小鼠IgG1 Fc融合蛋白(Abcam,Cambridge,MA)預混合(10 nM終濃度DyL650- PD-L2-Fc及抗體濃度,如圖6及7中所示)。在冰上培養10 min後,在4℃伴隨輕輕振蕩下添加抗體/DyL650-PD-L2-Fc混合物至細胞30 min。離心細胞,洗一次,再懸浮於包含碘化丙啶之緩衝液中,及在BD FACSArrayTM
(BD Biosciences,San Jose,CA)上定量結合的PD-L2-Fc螢光。使用FlowJo®分析軟體(FlowJo,LLC)分析資料之PD-L2幾何中值螢光強度(MFI)。IC50
值係在GraphPad Prism 7.02(GraphPad軟體)中使用log(促效劑)與反應–可變斜率(4參數)曲線擬合來確定。結果顯示於圖6及7中,及所得的IC50
值列於表6至7中。APE10787(「10787」)係對PD-1具有特異性之人類IgG1陽性對照拮抗劑抗體,及APE06339(「06339.08」)係對雞蛋溶菌酶具有特異性之人類IgG1同型對照抗體。APE08145(「08145.05」及「08145.06」)係參考抗體。APE12043(「12043.02」及「12043.03」)係描述於實例1中之437M5-112抗PD-1抗體。APE12095(「12095.03」及「12095.04」)係描述於實例1中之3.7C6抗PD-1抗體。
表4. PD-L1-Fc競爭
表5. PD-L1-Fc競爭
表6. PD-L2-Fc競爭
表7. PD-L2-Fc競爭
實例4
抗體 | 類型 | IC50 (nM) |
APE10787 | Anti-PD-1陽性對照 | 1.89 |
APE06339.08 | IgG1同型對照 | 不競爭 |
APE08145.05 | 參考抗PD-1 | 75.2 |
APE08145.06 | 參考抗PD-1 | 119.1 |
APE12043.02 | 437M5-11 | 11.6 |
APE12043.03 | 437M5-11 | 12.2 |
抗體 | 類型 | IC50 (nM) |
APE10787 | 抗PD-1陽性對照 | 1.59 |
APE06339.08 | IgG1同型對照 | 不競爭 |
APE12095.03 | 3.7C6 | 495.1 |
APE12095.04 | 3.7C6 | 632.1 |
抗體 | 類型 | IC50 (nM) |
APE10787 | 抗PD-1陽性對照 | 2.53 |
APE06339.08 | IgG1同型對照 | 不競爭 |
APE08145.05 | 參考抗PD-1 | 不競爭 |
APE08145.06 | 參考抗PD-1 | 不競爭 |
APE12043.02 | M5-11 | 5.8 |
APE12043.03 | M5-11 | 5.5 |
抗體 | 類型 | IC50 (nM) |
APE10787 | 抗PD-1陽性對照 | 1.78 |
APE06339.08 | IgG1同型對照 | 不競爭 |
APE12095.03 | 3.7C6 | 30.4 |
APE12095.04 | 3.7C6 | 20.0 |
此實例證實本文所揭示的抗體在基於珠粒及基於板之促效劑檢定中顯示一致的促效劑活性。
對於基於珠粒之促效劑檢定,根據製造商說明書,將Dynabeads® M-280 Tosylactivated(Invitrogen–Life Technologies,Carlsbad,CA)與抗CD3(10 µg)、抗PD-1或PD-L1-Fc(40 µg)及結合雞蛋溶菌酶之陰性對照抗體(50 µg)偶聯,偶聯總共100 µg蛋白質。珠粒偶聯之程度係藉由流式細胞儀定量。使用PBMC之磁珠分離(CD4+
T細胞分離套組,Miltenyi Biotec,Auburn,CA)來製備初級人類外周血液CD4+
T細胞。在可溶性抗CD28 (eBioscience;250 ng/ml、100 ng/ml或50 ng/ml,如所示)之存在下將經純化之CD4+
T細胞(1 x 105
個細胞/孔)與不同數目之所示珠粒(珠粒:T細胞為4:1、2:1或1:1比)培養72小時。培養上清液中之分泌的IFNγ係藉由ELISA(R&D Systems,Minneapolis,MN)定量。如圖8A及8B中所顯示,及表8中所概述,本文所揭示的抗PD-1抗體(437M5-112及3.7C6)在珠粒檢定中證實與PD-L1-Fc相當的一致抑制(促效劑)活性。
如圖9A至9C中所顯示,在基於珠粒之檢定中,3.7C6變體APE12093及APE12095係最佳促效劑,與PD-L1-Fc相比具有更強抑制。與親本抗體APE11844相比,437M5-112變體APE12043及APE12044具有改良之促效劑活性。
表8.
候選抗體 | 所測試供體的數量 | IFNγ 之抑制 % ( 平均值 ±SEM) |
437M5-112 (APE12043) | 7 | 83 ± 6 |
3.7C6 (APE12095) | 6 | 77± 7 |
PD-L1-Fc | 10 | 83 ± 3 |
在基於珠粒之促效劑檢定中測試的供體中本文所揭示的抗PD-1抗體對IFNγ產生之抑制顯示於圖10A至10B及圖11A至11C中。
對於基於板之促效劑檢定,依次地,在4℃下將96孔板塗覆抗CD3(0.3 µg/ml)過夜,吸清孔及用PBS洗,及然後在4℃下用各種濃度之抗PD-1抗體或PD-L1-Fc進行第二次塗覆過夜,如圖12至14中所示。在植物血凝素(PHA;2 µg/ml)之存在下培養新鮮或冷凍人類PBMC 48小時,收穫,洗以移除PHA,及在IL-2之存在下培養過夜。收穫細胞,洗及在人類γ球蛋白(100 µg/ml)之存在下在抗CD3/抗PD-1塗覆孔(1 x 105
個細胞/孔)中培養48小時。培養上清液中之分泌的IL-2係藉由ELISA(R&D Systems,Minneapolis,MN)定量。三個PBMC供體中PD-1抗體對IL-2產生之抑制顯示於圖12A至12B、13A至13B及14A至14B中。本文所揭示的抗PD-1抗體對IL-2產生之抑制與PD-L1-Fc誘導之抑制相當。
實例5
此實例證實本文所揭示的抗PD-1抗體在阻斷性抗PD-L1/抗PD-L2之存在下在溶液中展現促效劑抗體活性。
1:3稀釋破傷風類毒素免疫化供體之全血且在U型底96孔板中在破傷風類毒素(Astarte Biologics,Bothell,WA;5 µg/ml)、抗PD-L1+抗PD-L2(BioLegend,San Diego,CA;各2 µg/ml)及所示濃度之本文所述的四聚物PD-L1-Fc、抗PD-1 IgG1抗體(3.7C6 APE12095;437M5-112 APE12043)或對照人類IgG1之存在下培養4天。培養上清液中之分泌的IFNγ係藉由ELISA(R&D Systems,Minneapolis,MN)定量。在此破傷風類毒素喚起反應全血檢定中,在阻斷性抗PD-L1/抗PD-L2之存在下觀測到本文所揭示的抗PD-1抗體之有效促效劑抗體活性,如圖15A(陽性及陰性對照)及15B(抗PD-1抗體)中所顯示。
將IgG1 3.7C6抗PD-1抗體與經製備為人類IgG2之相同抗體進行比較(圖15C及15D)。抗體之抗PD-1 IgG2變體具有與抗PD-1 IgG1相同之活化T細胞結合,但不顯示促效劑活性。抗體之IgG2、IgG4或IgG1(L234A、L235A)同型物亦缺乏促效劑活性,此證實功能性促效劑活性需要FcγR參與/抗體叢集。
實例6
此實例證實本文所提供的抗PD-1抗體以濃度依賴性方式降低全血中之免疫反應。
當供體先前已經歷暴露至所述抗原時,經適宜抗原活體外刺激之人類全血將引發特異性T細胞喚起免疫反應。免疫反應可藉由IFN-γ及IL-17A濃度來測量。
針對抗原破傷風類毒素之活體外喚起反應預篩選健康人類供體(N=6),該等供體以前可能在常見破傷風疫苗接種期間暴露至破傷風類毒素。在破傷風類毒素及抗PD-1 3.7C6抗體(APE12890)或無關人類IgG1同型對照之存在下培養來自供體之全血96小時。培養96小時後,使用細胞介素偵測套組(Meso Scale Diagnostics,Rockville,MD)檢定上清液之細胞介素IFN-γ及IL-17A之存在。結果提供於圖22A及22B中。
所有供體藉由產生大量IFN-γ及IL-17A對破傷風類毒素特異性刺激反應,儘管一些供體反應比其他供體更為強烈。相對於IgG1同型對照抗體,3.7C6抗體以濃度依賴性方式減少IFN-γ及IL-17A二者之分泌,如圖22A及22B中所顯示。確定人類全血破傷風類毒素喚起檢定中3.7C6之中值IC50
及平均IC50
±SD對於IFN-γ抑制分別為0.053 nM及0.091±0.115 nM,及對於IL-17A抑制分別為0.097 nM及0.119±0.098 nM。
實例7
此實例證實本文所揭示的抗體之結合動力學(親和力)及熱穩定性。
藉由表面電漿共振(SPR),3.7C6(APE12095.06及APE12537.01)顯示與人類及食蟹獼猴PD-1相當的結合動力學。緊密結合動力學接近儀器的極限。SPR資料與藉由動力學排除檢定(KinExA®)確定的對APE12095之平衡結合親和力極吻合。最終親和力測量為:人類PD-1之KinExA® KD
:75 pM;及食蟹獼猴PD-1之KinExA® KD
:450 pM。
藉由SPR,437M5-112(APE12043.05及APE12538.01)亦顯示與人類及食蟹獼猴PD-1相當之結合動力學極。緊密結合動力學接近儀器的極限。SPR資料與藉由KinExA®確定的對APE12043之平衡結合親和力極吻合。最終親和力測量為:人類PD-1之KinExA® KD
:51 pM;及食蟹獼猴PD-1之KinExA® KD
:210 pM。藉由表面電漿共振及KinExA®針對於本文所揭示的抗PD-1抗體之KD
測量之概述列於表9中。
表9.
抗體 / 批次 | 人類 PD-1 KD (SPR) | 食蟹獼猴 PD-1 KD (SPR) | 人類 PD-1 KD (KinExA) | 食蟹獼猴 PD-1 KD (KinExA) |
APE12043.05 | 31 pM | 90 pM | ||
APE12538.01 | 51 pM | 217 pM | ||
APE12043.04 | 51 pM | 210 pM | ||
APE12095.06 | 51 pM | 244 pM | ||
APE12537.01 | 43 pM | 445 pM | ||
APE12095.04 | 75 pM | 450 pM |
將APE12537抗體結合親和力及熱穩定性與命名為「030-13263/ 030-13264」之相似抗體之結合親和力及熱穩定性進行比較。APE12537與030-13263/ 030-13264之不同之處在於重鏈中之兩個突變:藉由Kabat編碼之A52aI及D62Q(A53I及D63Q,使用序列表中的位置)。提供於表10中之結果顯示此等突變增加結合親和力及熱穩定性。
表10
抗體 | 重鏈可變區 (SEQ ID) | 輕鏈可變區 (SEQ ID) | KD 人類 PD-1 (nM) | KD 食蟹獼猴 PD-1 (nM) | Fab Tm ( ℃ ) |
小鼠嵌合 | -- | -- | 4.3 | n.d. | n.d. |
030-13263/ 030-13264 (CDR-接枝) | 43 | 49 | 0.186 | 1.02 ± 0.08 N=2 | 61.2 ± 0.3 N=3 |
APE12537 (CDR接枝且最佳化) | 47 | 49 | 0.060 | 0.64 ± 0.10 N=2 | 66.1 |
在Biacore T200 (GE Healthcare Life Sciences,Pittsburgh,PA)上進行用於藉由表面電漿共振(SPR)篩選之KD
測量,且使用1:1結合模型總體擬合動力學常數。在Biacore感測器晶圓SA(GE Healthcare Life Sciences,Pittsburgh,PA)上以1 nM濃度捕捉生物素化人類或食蟹獼猴PD-1細胞外域單體,且用鏈黴親和素(streptavidin)預固定羧甲基化葡聚糖表面。靶向捕捉之抗原濃度以產生低反應以防止親和力對解離速率之影響。Tm測量係藉由基於螢光之熱位移及差示掃描量熱法來確定。
實例8
此實例證實本文所揭示的抗PD-1抗體在異種NSG/Hu-PBMC移植物抗宿主病(GvHD)模型中顯示活體內效力。
測試本文所揭示的抗PD-1抗體之效力之異種NSG/Hu-PBMC GvHD模型係在The Jackson Laboratory JAX® In Vivo Pharmacology Services(Sacramento,CA)進行。用1 Gy照射NOD-scid IL2rγnull
(NSG)小鼠,接著對每隻小鼠靜脈內註射3 x 106
個人類PBMC,如圖16A中所說明。從PBMC注射後的第二天開始,每週兩次以10 mg/kg腹膜內給與抗體4週,及每週三次以75 µg/小鼠腹膜內給與貝拉西普(belatacept)生物類似物4週。研究中之給藥方案及劑量組顯示於圖16B中。藉由體重損失、死亡及GvHD分數(測量:體重損失、活動、皮毛質地、蒼白及姿勢)每週三次監測疾病。每天疾病監測展現體重損失超過10%之動物,且將展現從起始體重損失超過20%體重之動物安樂死。
本文所揭示的3.7C6 PD-1促效劑抗體(APE12095)顯示與同型對照相比在體重損失10%之時間上之統計學顯著效力(圖16C)。本文所揭示的437M5-112抗PD-1促效劑抗體亦顯示與同型對照相比在體重損失10%之時間上之統計學顯著效力(圖16D)。對兩種抗PD-1抗體之反應均係雙峰的,且每組中一部分動物在研究中完全存活(圖16C及16D)。
實例9
此實例證實食蟹獼猴單劑量藥物動力學及耐受性研究之研究設計。
食蟹獼猴單劑量藥物動力學及耐受性研究之研究設計列於表11中。研究期間之評定如下:
● 臨床病理學,給藥前(兩次),第2天、第6天、第22天及第35天(Charles River Laboratories(CRL))
● 血液FACS板–主要白細胞群及20個T細胞子組,給藥前(兩次),第2天、第6天、第22天及第35天(CRL)
- B、T、NK、單核細胞
- CD4、CD8、T中央記憶、T效應子記憶、PD-1+
、活化CD4+
及CD8+
、Treg
● 受體佔有率,第4天、第14天、第28天、第35天
● 給藥前及第35天之PK樣本分析、抗藥物抗體分析
● 血清細胞介素分析(17-plex:IL-1β、IL-1Ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、IL-13、IL-17a、G-CSF、GM-CSF、IFNγ、MIP1β、MIP1α、TNF-α)、給藥前、4 h及24 h、第7天及第35天
● 使用Phoenix® WinNonlin®(Certara,USA)之PK參數分析。
兩種PD-1抗體在第28天在所有動物中均顯示良好藥物動力學性質及可檢測之藥物濃度(圖17A及17B)。該研究在第35天完成。劑量耐受良好,未觀測到不良臨床征兆或臨床病理變化。研究結果列於表11及12中。
表11. 食蟹獼猴單劑量藥物動力學及耐受性研究之研究設計。
表12.藥物動力學參數、細胞介素及抗藥物抗體反應之分析。
*平均值(±SD),3隻動物/組。†Tmax,至Cmax之時間;Cmax,最大濃度;C0,初始濃度;AUCall,至最後觀測之曲線下面積;AUCINF_obs,基於最後一次觀測之至無窮大之AUC;Cavg,平均濃度;CLss,在穩定狀態下之清除率;Vz,末期相分佈量;Vss obs,基於最後一次觀察之穩態分佈量;F,生物可利用性百分比。
表13. 抗藥物抗體(ADA)反應及細胞介素之分析
組 | 劑量 (mg/kg) | 雄性動物數 | 測試物件 | 投藥途徑 |
1 | 10 | 3 | 437M5-112穩定CHO-S池 | 靜脈內(IV) |
2 | 10 | 3 | 437M5-112穩定CHO-S池 | 皮下(SC) |
3 | 10 | 3 | 3.7C6穩定CHO-S池 | 靜脈內(IV) |
4 | 10 | 3 | 3.7C6穩定CHO-S池 | 皮下(SC) |
參數 * | 單位 | IV ( 組 1) | SC ( 組 2) | IV ( 組 3) | SC ( 組 4) |
半衰期 | hr | 63.1 (11.6) | 91.3 (4.9) | 127.9 (7.4) | 115.2 (57.8) |
Tmax† | hr | 0.67 (0.29) | 37.67 (22.2) | 0.50 (0) | 28.83 (19.70) |
Cmax | ng/mL | 417,616 (62,049) | 51,210 (4.163) | 342,115 (31,785) | 46,365 (14,645) |
C0 | ng/mL | 439,299 (15,116) | 392234 (36,564) | ||
AUCall | hr* ng/mL | 13,422,916 (2,068,923) | 8,265,256 (353,998) | 12,199,665 (2,639,065) | 8,518,430 (1,899,319) |
AUCINF_obs | hr* ng/mL | 13,473,226 (2,100,523) | 8,272,411 (357,502) | 12,263,340 (2,686,651) | 8,621,009 (1,985,163) |
Cavg | ng/mL | 16,043 (2,499) | 9,840 (421) | 14,536 (3,128) | 10,1412 (2,260) |
CLss或CL/F | mL/hr/kg | 0.753 (0.108) | 1.211 (0.052) | 0.842 (0.163) | 1.22 (0.31) |
Vz或Vz/F | mL/kg | 69.8 (21.3) | 159.3 (5.7) | 154.3 (22.3) | 185.6 (65.6) |
Vss_obs | mL/kg | 55.7 (18.9) | 98.7 (15.4) | ||
F | % | 61.4 | 70.3 |
動物 | 抗體 APE12538.01 群組 | 給藥前 ADA | 第 36 天 ADA | 第 36 天 ADA 效價 |
1001 | 10 mg/kg IV | 陰性 | 陽性 | 320 |
1002 | 10 mg/kg IV | 陰性 | 陽性 | 80 |
1003 | 10 mg/kg IV | 陰性 | 陽性 | 320 |
2001 | 10 mg / kg SC | 陰性 | 陽性 | 20 |
2002 | 10 mg/kg SC | 陰性 | 陽性 | 320 |
2003 | 10 mg/kg SC | 陰性 | 陽性 | 20 |
動物 | 抗體 APE12537.01 群組 | 給藥前 ADA | 第 36 天 ADA | 第 36 天 ADA 效價 |
3001 | 10 mg/kg IV | 陰性 | 陰性 | |
3002 | 10 mg/kg IV | 陰性 | 陰性 | |
3003 | 10 mg/kg IV | 陰性 | 陽性 | 64 |
4001 | 10 mg/kg SC | 陰性 | 陰性 | |
4002 | 10 mg/kg SC | 陰性 | 陰性 | |
4003 | 10 mg/kg SC | 陰性 | 陽性 | 128 |
如所示,在第36天,給與抗體APE12538.01之所有6隻動物均具有可測量/低效價之抗藥物抗體。在第36天,給與抗體APE12537.01之6隻動物中之兩隻具有可測量/低效價之抗藥物抗體。評估的任何細胞介素均無有意義的變化。進一步如圖18A及18B中所顯示,在除了#1001(IV給與437M5-112)之外的所有動物中觀測到至第14天之持續受體佔有率;至第28天,大多數動物中均發現某種佔有率。
實例10
此實例證實本文所揭示的抗PD-1抗體誘導磷酸酶SHP2募集至PD-1轉染之Jurkat細胞中之PD-1胞質域。
將識別雞蛋溶菌酶之抗體3.7C6(APE12890)或人類IgG1同型對照抗體及恆定量之抗CD3(UCHT1純系;BioLegend,San Diego,CA)偶聯至磁珠(Dynabeads™ M-280 Tosylated;Invitrogen™/ThermoFisher Scientific)。珠粒上的抗PD-1抗體模擬抗原呈現細胞上抗體之FcγR結合。用所示珠粒刺激穩定人類PD-1轉染之Jurkat細胞2分鐘或10分鐘,細胞裂解,且藉由添加3.7C6偶聯珠粒進行PD-1免疫沉澱。藉由SDS-PAGE分析免疫沉澱,接著用抗PD-1(圖19A,上圖)、抗SHP2(圖19A,中圖)或抗SHP1(圖19A,下圖)進行免疫轉漬。在此信號傳導檢定中,用抗CD3活化PD-1 Jurkat細胞後,本文所述的3.7C6抗體(而非同型對照抗體)誘導磷酸酶SHP2(而非SHP1)募集至PD-1胞質域,如圖19A(免疫轉漬)及19B(免疫轉漬之密度測定法定量)中所顯示。如圖19A至B中所顯示,在抗CD3塗覆珠粒之存在下,PD-1拮抗劑抗體納武單抗(以含在溶液中之100 nM使用)不誘導SHP2或SHP1募集至PD-1。針對可溶性納武單抗未發現SHP募集。與T細胞活化及CD28共刺激組合,抗體3.7C6亦減少ZAP70及LAT磷酸化(資料未顯示)。在不存在T細胞活化下,抗體3.7C6對信號傳導通路沒有影響。
實例11
此實例證實人類PD-1上經本文所揭示的3.7C6抗體所結合的抗原決定基係在PD-1之與PD-L1結合位點的相對面上。
使用重組人類PD-1單體在Biomotif AB (Danderyd,Sweden)進行本文所揭示的3.7C6抗體(APE12537)所結合的PD-1上肽之氫-氘交換圖譜分析。PD-1之結構可藉由美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)(Bethesda,MD)操作之蛋白質資料庫(PDB)在登錄號4ZqK下公開獲得(亦可參見Zak, K. M.等人,2015,Structure 23:2341-2348;及PDB accession 5GGR(亦可參見,J. Y.等人,2016,Nat Commun.,7:13354)。在圖20A及20B中,一種主要肽(經標記為「經HDX圖譜分析之β-髮夾」)係經3.7C6抗體保護免受氫-氘交換影響。「經HDX圖譜分析之β-髮夾」包含PD-1之胺基酸96至110,該等胺基酸具有序列RVTQLPNGRDFHMSV。另一主要肽包含PD-1之胺基酸33至41,該等胺基酸具有序列NPPTFSPAL。圖20A及20B顯示人類PD-1細胞外域(黑色)之晶體結構與人類PD-L1細胞外結合域(淺灰色)(PD-1及來自NCBI PDB之PD-L1結構)之晶體結構之空間填充模型對接之帶狀模型。分子以PD-1膜近端區域定向在左下方(圖20A),且旋轉90°,顯示PD-1膜近端區域在左下方(圖20B)。表現在限定表面區域中包含不同組突變之人類PD-1單體,且藉由表面電漿共振評估本文所揭示的3.7C6抗體(APE12095)之結合。圖20A及20B中區域標記「PD-1三點突變體」中之突變完全消除本文所揭示的3.7C6抗體之結合。圖20A及20B中環標記「經HDX圖譜分析之β-髮夾」之頂部中之突變不影響本文所揭示的3.7C6抗體之結合。氫-氘交換及PD-1突變圖譜分析之組合證實,本文所揭示的3.7C6 PD-1促效劑抗體顯示結合至圖20B中用虛線圓圈描繪的區域,該區域係在PD-1之與PD-L1結合位點的相對面上。
實例12
此實例證實本文所揭示的抗PD-1抗體抑制來自經角質細胞肽抗原刺激之斑禿供體之外周血液單核細胞(PBMC)中IFNγ之產生。
斑禿係由免疫系統介導之脫髮。當毛囊之免疫特權被產生IFNγ之角質細胞及黑色素細胞抗原特異性T細胞破壞時,會導致脫髮。T細胞滲入毛囊根鞘。活化的T細胞產生過量IFNγ。主要組織相容性複合物類別I及II分子異常表現,導致隨後的毛囊細胞破壞及脫髮。
從斑禿供體之血液分離PBMC且在板中在角質細胞肽抗原(肽抗原池係如Wang等人,J Invest Dermatol.
2016年8月;136(8):1617-1626)、及指定濃度之四聚物PD-L1-IgG1 Fc、IgG1 3.7C6抗PD-1抗體(APE12890)或對照IgG1同型四聚物、或對照IgG1同型物之存在下培養(2 x 105
個細胞/孔)。五天後,洗該等細胞且在ELISpot板中再培養20小時以偵測分泌IFNγ之細胞的數量。將每個供體及治療組之結果標準化至未處理的孔以允許統計比較來自治療組之12個供體及陰性對照之資料。
如圖21A中所顯示,與對照IgG1同型物相比,IgG1 3.7C6抗PD-1抗體以濃度依賴性方式抑制IFNγ之產生。如圖21B中所顯示,與對照IgG1同型四聚物相比,與IgG1同型四聚物相比,陽性對照PD-L1-IgG1 Fc四聚物以濃度依賴性方式抑制IFNγ之產生。本文所述的抗PD-1抗體及PD-L1-IgG1 Fc四聚物在等於或高於1 nM之濃度下均顯著抑制IFNγ分泌細胞的數量(p<0.001),如圖21C及21D中所顯示。
實例13
此實例證實本文所揭示的抗PD-1抗體抑制來自經黑色素細胞肽抗原刺激之斑禿供體之外周血液單核細胞(PBMC)中IFNγ之產生。
斑禿係由免疫系統介導之脫髮。當毛囊之免疫特權被產生IFNγ之角質細胞及黑色素細胞抗原特異性T細胞破壞時,會導致脫髮及/或頭髮色素沉著損失。T細胞滲入毛囊根鞘。活化的T細胞產生過量IFNγ。主要組織相容性複合物類別I及II分子異常表現,導致隨後的毛囊細胞破壞及脫髮。皮膚中類似黑色素細胞特異性T細胞反應導致白斑病中黑色素細胞之破壞。
從斑禿供體之血液分離PBMC且在板中在黑色素細胞肽抗原(肽抗原池係如Wang等人,J Invest Dermatol. 2016年8月;136(8): 1617-1626)、及指定濃度之四聚物PD-L1-IgG1 Fc、IgG1 3.7C6抗PD-1抗體(APE12890)或對照IgG1同型四聚物、或對照IgG1同型物之存在下培養(2 x 105
個細胞/孔)。五天後,藉由Meso Scale Discovery (Meso Scale Diagnostics,Rockville,MD)定量培養上清液中之分泌的IFNγ。將每個供體及治療之結果標準化至未處理的孔以允許統計比較來自治療組之12個供體及陰性對照之資料。另外,五天後,洗該等細胞及在ELISpot檢定中再培養20小時以偵測分泌IFNγ之細胞的數量。將每個供體及治療之結果標準化至未處理的孔以允許統計比較來自治療組之12個供體及陰性對照之資料。結果呈現於圖23A至23D中。
如圖23A中所顯示,與對照IgG1同型物相比,IgG1 3.7C6抗PD-1抗體以濃度依賴性方式抑制IFNγ之產生。如圖23B中所顯示,與對照IgG1同型四聚物相比,與IgG1同型四聚物相比,陽性對照PD-L1-IgG1 Fc四聚物以濃度依賴性方式抑制IFNγ之產生。本文所述的抗PD-1抗體及PD-L1-IgG1 Fc四聚物在等於或高於100 nM之濃度下均顯著抑制IFNγ之產生(p<0.001)。本文所述的抗PD-1抗體及PD-L1-IgG1 Fc四聚物在等於或高於10 nM之濃度下均顯著減少IFNγ分泌細胞的數量(p<0.001),如圖23C及23D中所顯示。
實例14
此實例證實本文所揭示的抗PD-1抗體在異種NSG/Hu-PBMC移植物抗宿主病(GvHD)模型中在3 mg/kg之劑量下顯示活體內效力。
測試本文所揭示的抗PD01抗體之效力之異種NSG/Hu-PBMC GvHD模型係在The Jackson Laboratory (Sacramento,CA)進行。用1 Gy照射NOD-scid IL2rγnull
(NSG)小鼠,接著對每隻小鼠靜脈內註射0.9 x 107
個人類PBMC,如圖24A中所說明。從PBMC注射後的第二天開始,每週兩次以30 mg/kg、10 mg/kg或3 mg/kg腹膜內給與抗體4週。第四組每週兩次以30 mg/kg給與無關同型對照抗體及第五組每週三次以75 µg/小鼠給與CTLA-4-IgG (模型中已知的效力陽性對照)。研究中之給藥方案及劑量組顯示於圖24B中。藉由體重損失、死亡及GvHD分數(測量:體重損失、活動、皮毛質地、蒼白及姿勢)每週三次監測疾病。每天疾病監測展現體重損失超過10%之動物,且將展現從起始體重體重損失超過20%之動物安樂死。
本文所揭示的3.7C6 PD-1促效劑抗體(APE12890)顯示與同型對照相比在存活率(增加中值存活時間)上之統計學顯著效力(圖24C)。在研究過程中,當分別給與30 mg/kg之同型對照IgG1、30 mg/kg之抗PD-1促效劑IgG1(3.7C6)、10 mg/kg之抗PD-1促效劑IgG1(3.7C6)、3 mg/kg之抗PD-1促效劑IgG1(3.7C6)及75 µg/劑量之CTLA-4-Ig(陽性對照)時,個體動物的起始體重百分比顯示於圖24D、24E、24F、24G及24H中。
抗PD-1促效劑IgG1(3.7C6) 30 mg/kg與抗PD-1促效劑IgG1(3.7C6) 3 mg/kg劑量組之間存活率沒有顯著差異。此表明在GvHD模型中之效力可在小於3 mg/kg之劑量下獲得。
本文引用的所有參考文獻(包括公開案、專利申請案及專利)均以引用之方式併入本文中,其引用程度如同每個參考文獻被單獨地且特定地指出以引用之方式併入並以其全文描述於本文中。
除非另外於本文中指明或者內容明顯矛盾,否則,在描述本發明之情況中(尤其在隨後之申請專利範圍情況中)使用術語「一」及「一個」及「該」及「至少一個」及類似指示係解釋為包含單數及複數。除非另外於本文中指明或者內容明顯矛盾,否則,使用術語「至少一個」連接一列一或多個條目(例如,「A及B中之至少一者」)係解釋為意指選自所列條目中之一個條目(A或B)或所列條目中之兩者或更多者之任何組合(A及B)。除非另外註明,否則術語「包括」、「具有」、「包含」、及「含有」應解釋為開放式術語(亦即意指「包括,但不限於」)。除非文中另有說明,否則文中敘述之數值範圍僅係意欲作為個別提及介於該範圍內之各個別數值的快捷方法,及將各個別數值併入本說明書中如同其經個別引述於文中。除非於本文中另外指明或者前後文明顯相衝突,否則述於本文中之所有方法可以任何適宜順序進行。除非另有聲明,否則本文中提供之任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」)之使用僅欲更佳地說明本發明且不對本發明範疇造成限制。不應將本說明書中之語言理解為將任何非主張要素指示為實施本發明之必要條件。
本文描述本發明之較佳實施例,包括發明人已知用於進行本發明之最佳方式。一般技術者在閱讀上述說明後當可明瞭該等較佳實施例之變化形式。發明人預期熟習此項技藝者當能適當地使用該等變化形式,且發明人意欲以除如本文所明確描述之外的方式實施本發明。因此,本發明包括為適用法律准許之本發明隨附申請專利範圍中所列舉標的之所有修改及等效物。此外,除非另外於本文中指明或者前後文明顯相衝突,否則本發明包含上述要素之其所有可能變化形式之任何組合。
圖1係描繪抗PD-1抗體結合至經人類PD-1穩定轉染之HEK 293細胞之結果的圖。
圖2係描繪抗PD-1抗體結合至經食蟹獼猴PD-1穩定轉染之HEK 293細胞之結果的圖。
圖3係描繪抗PD-1抗體結合至2天抗CD3/抗CD28活化人類外周血液CD4+
T細胞之結果的圖。
圖4至7係顯示抗PD-1抗體與PD-L1-Fc或PD-L2-Fc競爭結合至PD-1 CHO-K1細胞之測試結果的圖。
圖4係描繪競爭檢定之結果的圖,其說明抗PD-1抗體與PD-L1-Fc競爭結合至經人類PD-1穩定轉染之CHO-K1細胞之能力。
圖5係描繪競爭檢定之結果的圖,其說明抗PD-1抗體與PD-L1-Fc競爭結合至經人類PD-1穩定轉染之CHO-K1細胞之能力。
圖6係描繪競爭檢定之結果的圖,其說明抗PD-1抗體與PD-L2-Fc競爭結合至經人類PD-1穩定轉染之CHO-K1細胞之能力。
圖7係描繪競爭檢定之結果的圖,其說明抗PD-1抗體與PD-L2-Fc競爭結合至經人類PD-1穩定轉染之CHO-K1細胞之能力。
圖8A係描繪在使用2:1珠粒與細胞比之基於珠粒之CD4+
T細胞促效劑檢定中抗PD-1抗體之促效劑活性性能的圖。
圖8B係描繪在使用1:1珠粒與細胞比之基於珠粒之CD4+
T細胞促效劑檢定中抗PD-1抗體之促效劑活性性能的圖。
圖9A係描繪在使用4:1珠粒與細胞比之基於珠粒之CD4+
T細胞促效劑檢定中抗PD-1抗體之促效劑活性性能的圖。
圖9B係描繪在使用2:1珠粒與細胞比之基於珠粒之CD4+
T細胞促效劑檢定中抗PD-1抗體之促效劑活性性能的圖。
圖9C係描繪在使用1:1珠粒與細胞比之基於珠粒之CD4+
T細胞促效劑檢定中抗PD-1抗體之促效劑活性性能的圖。
圖10A係描繪在針對抗PD-1抗體之基於珠粒之CD4+
T細胞促效劑檢定中跨多個供體之IFNγ產生之平均抑制%的圖。
圖10B係提供抗PD-1抗體之描述、IFNγ之抑制%及包括於圖10A中之供體之數量的圖表。
圖11A係描繪在針對抗PD-1抗體之基於珠粒之CD4+
T細胞促效劑檢定中跨多個供體之IFNγ產生之平均抑制%的圖。
圖11B係描繪在針對參考PD-1促效劑PD-L1-Fc之基於珠粒之CD4+
T細胞促效劑檢定中跨相同供體之IFNγ產生之平均抑制%的圖。
圖11C係提供候選抗體、抗體之描述、IFNγ之抑制%及包括於圖11A及11B中之供體之數量的圖表。
圖12A係描繪在基於板之人類PBMC促效劑檢定(供體#747)中抗PD-1抗體在抑制IL-2產生中之促效劑效力的圖。
圖12B係描繪在基於板之人類PBMC促效劑檢定(供體#500)中抗PD-1抗體及PD-L1-Fc在抑制IL-2產生中之促效劑效力的圖。
圖13A係描繪在基於板之人類PBMC促效劑檢定(冷凍供體#500)中抗PD-1抗體及PD-L1-Fc 在抑制IL-2產生中之促效劑效力的圖。
圖13B係描繪在基於板之人類PBMC促效劑檢定(冷凍供體#500)中抗PD-1抗體及PD-L1-Fc在抑制IL-2產生中之促效劑效力的圖。
圖14A係描繪在基於板之人類PBMC促效劑檢定(冷凍供體#1202)中抗PD-1抗體及PD-L1-Fc在抑制IL-2產生中之促效劑效力的圖。
圖14B係描繪在基於板之人類PBMC促效劑檢定(冷凍供體#1202)中抗PD-1抗體及PD-L1-Fc在抑制IL-2產生中之促效劑效力的圖。
圖15A係描繪在全人類血液破傷風喚起檢定中所觀察到的PD-L1-Fc四聚物之促效劑活性及在阻斷性抗PD-L1/抗PD-L2的存在下納武單抗(nivolumab)之促效劑活性之缺乏的圖。
圖15B係描繪在阻斷性抗PD-L1/抗PD-L2的存在下在全人類血液破傷風喚起檢定中所觀察到的PD-1促效劑抗體之促效劑活性的圖。
圖15C係描繪在全人類血液破傷風喚起檢定中WT IgG1抗PD-1促效劑抗體(實心三角形數據點)對IFNγ之效應的圖。
圖15D係描繪在全人類血液破傷風喚起檢定中IgG2同型抗PD-1抗體(空心三角形數據點)對IFNγ之效應的圖。
圖16A係根據本發明之實施例之用於描述於實例8中之移植物抗宿主病研究之異種NSG/Hu-PBMC小鼠模型的示意圖。
圖16B係顯示根據本發明之實施例之描述於實例8中之NSG/Hu-PBMC移植物抗宿主病研究之時間線、給藥時間表及模型組的示意圖。
圖16C係描繪實例8中針對於抗PD-1抗體之NSG/Hu-PBMC移植物抗宿主病研究之>
10%體重損失的時間之結果的圖。
圖16D係描繪實例8中針對於抗PD-1抗體之NSG/Hu-PBMC移植物抗宿主病研究之>
10%體重損失的時間之結果的圖。
圖17A係描繪在10 mg/kg靜脈內或皮下單劑量抗PD-1抗體後食蟹獼猴之藥物動力學性質的圖。
圖17B係描繪在10 mg/kg靜脈內或皮下單劑量抗PD-1抗體後食蟹獼猴之藥物動力學性質的圖。
圖18A係描繪在10 mg/kg靜脈內或皮下單劑量抗PD-1抗體後食蟹獼猴之CD3+
T細胞PD-1受體佔有率的圖。
圖18B係描繪在10 mg/kg靜脈內或皮下單劑量抗PD-1抗體後食蟹獼猴之CD3+
T細胞PD-1受體佔有率的圖。
圖19A係顯示以抗PD-1(上圖)、抗SHP2(中圖)或抗SHP1(下圖)免疫轉漬PD-1免疫沉澱物之結果之SDS-PAGE凝膠。
圖19B係描繪顯示於圖19A中之免疫轉漬之密度定量的圖。
圖20A係人類PD-1細胞外域(黑色)之晶體結構與人類PD-L1細胞外結合域(灰色)之晶體結構之空間填充模型對接之帶狀模型說明。該分子係以PD-1之膜近端區域定向在左下方。
圖20B係人類PD-1細胞外域(黑色)之晶體結構與人類PD-L1細胞外結合域(灰色)之晶體結構之空間填充模型對接之帶狀模型說明。與顯示於圖20A中的視圖相比,該分子旋轉90°,顯示PD-1之膜近端區域在底部中心。
圖21A係描繪與IgG1同型物相比,IgG1 3.7C6抗PD-1抗體對來自經角質細胞抗原刺激之斑禿供體之PBMC中分泌的IFNγ之效應的圖。
圖21B係描繪與IgG1同型四聚物相比,PD-L1-IgG1 Fc四聚物對來自經角質細胞抗原刺激之斑禿供體之PBMC中分泌的IFNγ之效應的圖。
圖21C係描繪IgG1 3.7C6抗PD-1抗體對自經角質細胞抗原刺激之斑禿供體分離之PBMC中之IFNγ斑點形成細胞(SFC)數量之效應的圖。
圖21D係描繪PD-L1 IgG1-Fc四聚物對自經角質細胞抗原刺激之斑禿供體分離之PBMC中之IFNγ斑點形成細胞(SFC)數量之效應的圖。
圖22A係描繪在破傷風類毒素特異性抗原喚起檢定中,與IgG1同型物相比,IgG1 3.7C6抗PD-1抗體對分泌的INFγ之效應的圖。
圖22B係描繪在破傷風類毒素特異性抗原喚起檢定中,與IgG1同型物相比,IgG1 3.7C6抗PD-1抗體對分泌的IL-17A之效應的圖。
圖23A係描繪在來自經黑色素細胞抗原刺激之斑禿供體之PBMC中,與igG1同型物相比,IgG1 3.7C6抗PD-1抗體對分泌的IFNγ之效應的圖。
圖23B係描繪在來自經黑色素細胞抗原刺激之斑禿供體之PBMC中,與IgG1同型四聚物相比,PD-L1-IgG1-Fc四聚物對分泌的IFNγ之效應的圖。
圖23C係描繪IgG1 3.7C6抗PD-1抗體對自經黑色素細胞抗原刺激之斑禿供體分離之PBMC中之IFNγ SFC數量之效應的圖。
圖23D係描繪PD-L1 IgG1-Fc四聚物對自經黑色素細胞抗原刺激之斑禿供體分離之PBMC中之IFNγ SFC數量之效應的圖。
圖24A係根據本發明之實施例之用於描述於實例15中之移植物抗宿主病研究之異種NSG/Hu-PBMC小鼠模型的示意圖。
圖24B係顯示根據本發明之實施例之描述於實例15中之NSG/Hu-PBMC移植物抗宿主病研究之時間線、給藥時間表及模型組的示意圖。
圖24C係描繪實例15中針對於抗PD-1促效劑IgG1抗體3.7C6之NSG/Hu-PBMC移植物抗宿主病研究之至死亡的時間之結果的圖。
圖24D係描繪在研究時間期間從針對於同型對照之單個動物之研究開始體重變化百分比之結果的圖。
圖24E係描繪在研究時間期間從針對於30 mg/kg劑量之抗PD-1促效劑IgG1抗體3.7C6之個體動物之研究開始體重變化百分比之結果的圖。
圖24F係描繪在研究時間期間從針對於10 mg/kg劑量之抗PD-1促效劑IgG1抗體3.7C6之個體動物之研究開始體重變化百分比之結果的圖。
圖24G係描繪在研究時間期間從針對於3 mg/kg劑量之抗PD-1促效劑IgG1抗體3.7C6之個體動物之研究開始體重變化百分比之結果的圖。
圖24H係描繪在研究時間期間從針對於陽性對照CTLA-4-Ig之個體動物之研究開始體重變化百分比之結果的圖。
Claims (38)
- 一種抗PD-1結合劑,其包含免疫球蛋白重鏈可變區及免疫球蛋白輕鏈可變區,其中 (a) 該免疫球蛋白重鏈可變區包含: 包含SEQ ID NO: 1之CDR1; 包含SEQ ID NO: 2之CDR2;及 包含SEQ ID NO: 3之CDR3; 及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含 包含SEQ ID NO: 4之CDR1; 包含SEQ ID NO: 5之CDR2;及 包含SEQ ID NO: 6之CDR3; (b) 該免疫球蛋白重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 24至33中之任何一者至少80%之序列一致性,及/或包含至少SEQ ID NO: 24至33中之任何一者之CDR區,及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 34或35至少80%之序列一致性,及/或包含至少SEQ ID NO: 34或35中之任何一者之CDR區; (c) 該免疫球蛋白重鏈可變區包含: 包含SEQ ID NO: 7之CDR1; 包含SEQ ID NO: 8之CDR2;及 包含SEQ ID NO: 9之CDR3; 及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含 包含SEQ ID NO: 10之CDR1; 包含SEQ ID NO: 11之CDR2;及 包含SEQ ID NO: 12之CDR3; 或 (d) 該免疫球蛋白重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 43至47或61至63中之任何一者至少80%之序列一致性,及/或包含至少SEQ ID NO: 43至47或61至63中之任何一者之CDR區,及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 48至50至少80%之序列一致性,及/或包含至少SEQ ID NO: 48至50中之任何一者之CDR區。
- 如請求項1之抗PD-1結合劑,其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 24至33中之任何一者至少90%之序列一致性,及/或包含至少SEQ ID NO: 24至33中之任何一者之CDR區。
- 如請求項1之抗PD-1結合劑,其包含SEQ ID NO: 24至33中之任何一者之免疫球蛋白重鏈可變區。
- 如請求項1至3中任一項之抗PD-1結合劑,其中該免疫球蛋白輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 34或35至少90%之序列一致性,及/或包含至少SEQ ID NO: 34或35中之任何一者之CDR區。
- 如請求項1至3中任一項之抗PD-1結合劑,其包含SEQ ID NO: 34或35之免疫球蛋白輕鏈可變區。
- 如請求項1之抗PD-1結合劑,其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含: 包含SEQ ID NO: 1之CDR1; 包含SEQ ID NO: 2之CDR2;及 包含SEQ ID NO: 3之CDR3; 及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含 包含SEQ ID NO: 4之CDR1; 包含SEQ ID NO: 5之CDR2;及 包含SEQ ID NO: 6之CDR3。
- 如請求項6之抗PD-1結合劑,其中該免疫球蛋白重鏈可變區CDR1包含SEQ ID NO: 13至18中之任何一者。
- 如請求項6或7之抗PD-1結合劑,其中該免疫球蛋白重鏈可變區CDR3包含SEQ ID NO: 19至21中之任何一者。
- 如請求項5至8中任一項之抗PD-1結合劑,其中該免疫球蛋白輕鏈可變區CDR1包含SEQ ID NO: 22或23。
- 如請求項4之抗PD-1結合劑,其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含: 包含SEQ ID NO: 15之CDR1; 包含SEQ ID NO: 2之CDR2;及 包含SEQ ID NO: 20之CDR3; 及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含 包含SEQ ID NO: 23之CDR1; 包含SEQ ID NO: 5之CDR2;及 包含SEQ ID NO: 6之CDR3; 或 其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含: 包含SEQ ID NO: 15之CDR1; 包含SEQ ID NO: 2之CDR2;及 包含SEQ ID NO: 21之CDR3; 及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含 包含SEQ ID NO: 23之CDR1; 包含SEQ ID NO: 5之CDR2;及 包含SEQ ID NO: 6之CDR3; 或 其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含: 包含SEQ ID NO: 13之CDR1; 包含SEQ ID NO: 2之CDR2;及 包含SEQ ID NO: 19之CDR3; 及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含 包含SEQ ID NO: 23之CDR1; 包含SEQ ID NO: 5之CDR2;及 包含SEQ ID NO: 6之CDR3。
- 如請求項1之抗PD-1結合劑,其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 29至少90%之序列一致性,或包含至少SEQ ID NO: 29之CDR區,及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 35至少90%之序列一致性,或包含至少SEQ ID NO: 35之CDR區; 或其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 30至少90%之序列一致性,或包含至少SEQ ID NO: 30之CDR區,及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 35至少90%之序列一致性,或包含至少SEQ ID NO: 35之CDR區; 或其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 24至少90%之序列一致性,或包含至少SEQ ID NO: 24之CDR區,及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 34至少90%之序列一致性,或包含至少SEQ ID NO: 34之CDR區。
- 如請求項11之抗PD-1結合劑,其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含SEQ ID NO: 29,及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 35; 或其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含SEQ ID NO: 30,及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 35; 或其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含SEQ ID NO: 24,及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 34。
- 如請求項1之抗PD-1結合劑,其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 43至47或61至63中之任何一者至少90%之序列一致性,或包含至少SEQ ID NO: 43至47或61至63中之任何一者之CDR區。
- 如請求項1或13之抗PD-1結合劑,其中該免疫球蛋白輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 48至50至少90%之序列一致性,或包含至少SEQ ID NO: 48至50中之任何一者之CDR區。
- 如請求項13或14之抗PD-1結合劑,其中該免疫球蛋白重鏈包含SEQ ID NO: 43至47或61至63中之任何一者。
- 如請求項13至15中任一項之抗PD-1結合劑,其包含SEQ ID NO: 48至50中任一項之免疫球蛋白輕鏈可變區。
- 如請求項1之抗PD-1結合劑,其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含: 包含SEQ ID NO: 7之CDR1; 包含SEQ ID NO: 8之CDR2;及 包含SEQ ID NO: 9之CDR3; 及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含 包含SEQ ID NO: 10之CDR1; 包含SEQ ID NO: 11之CDR2;及 包含SEQ ID NO: 12之CDR3。
- 如請求項17之抗PD-1結合劑,其中該免疫球蛋白重鏈可變區CDR1包含SEQ ID NO: 57至60中之任何一者。
- 如請求項17或18之抗PD-1結合劑,其中該免疫球蛋白重鏈可變區CDR2包含SEQ ID NO: 38至42中之任何一者。
- 如請求項17之抗PD-1結合劑,其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含: 包含SEQ ID NO: 57之CDR1; 包含SEQ ID NO: 42之CDR2;及 包含SEQ ID NO: 9之CDR3; 及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含 包含SEQ ID NO: 10之CDR1; 包含SEQ ID NO: 11之CDR2;及 包含SEQ ID NO: 12之CDR3 或 其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含: 包含SEQ ID NO: 57之CDR1; 包含SEQ ID NO: 41之CDR2;及 包含SEQ ID NO: 9之CDR3; 及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含 包含SEQ ID NO: 10之CDR1; 包含SEQ ID NO: 11之CDR2;及 包含SEQ ID NO: 12之CDR3。
- 如請求項1之抗PD-1結合劑,其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 47至少90%之序列一致性,或包含至少SEQ ID NO: 47之CDR區; 及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 49至少90%之序列一致性,或包含至少SEQ ID NO: 49之CDR區; 或其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 46至少90%之序列一致性,或包含至少SEQ ID NO: 46之CDR區; 及該免疫球蛋白輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 50至少90%之序列一致性,或包含至少SEQ ID NO: 50之CDR區。
- 如請求項21之抗PD-1結合劑,其包含SEQ ID NO: 47之免疫球蛋白重鏈可變區、及SEQ ID NO: 49之免疫球蛋白輕鏈可變區; 或包含SEQ ID NO: 46之免疫球蛋白重鏈可變區、及SEQ ID NO: 50之免疫球蛋白輕鏈可變區。
- 如請求項1至22中任一項之抗PD-1結合劑,其中該抗PD-1結合劑係抗體、抗體結合物或其抗原結合片段。
- 如請求項1至23中任一項之抗PD-1結合劑,其中該抗PD-1結合劑係F(ab’)2 、Fab’、Fab、Fv、scFv、dsFv或單鏈結合多肽。
- 如請求項1至24中任一項之抗PD-1結合劑,其中該抗PD-1結合劑包含結合抗原呈現細胞上的Fc受體之IgG Fc區。
- 如請求項1至25中任一項之抗PD-1結合劑,其中該抗PD-1結合劑包含IgG1之Fc區或結合FcγR之其他Fc區。
- 如請求項1之抗PD-1結合劑,其包含包含SEQ ID NO: 36之免疫球蛋白重鏈及包含SEQ ID NO: 37之免疫球蛋白輕鏈。
- 如請求項1之抗PD-1結合劑,其包含包含SEQ ID NO: 51之免疫球蛋白重鏈及包含SEQ ID NO: 52之免疫球蛋白輕鏈。
- 一種醫藥組合物,其包含(a)如請求項1至28中任一項之抗PD-1結合劑,及(b)醫藥上可接受之載劑。
- 一種抑制哺乳動物之免疫反應之方法,該方法包括對該哺乳動物投與如請求項1至28中任一項之抗PD-1結合劑或如請求項29之醫藥組合物。
- 一種治療哺乳動物之發炎性或自體免疫病症之方法,該方法包括對罹患發炎性或自體免疫病症之哺乳動物投與如請求項1至28中任一項之抗PD-1結合劑或如請求項29之醫藥組合物,因此,該病症受到治療。
- 如請求項31之方法,其中該發炎性或自體免疫病症係原發性膽汁性膽管炎(PBC)、移植物抗宿主病(GvHD)、白斑病、ANCA血管炎、1型糖尿病或非感染性葡萄膜炎。
- 一種核酸,其視需要在載體中編碼如請求項1至28中任一項之抗PD-1結合劑之免疫球蛋白重鏈及/或免疫球蛋白輕鏈。
- 一種細胞,其表現如請求項1至28中任一項之抗PD-1結合劑。
- 一種製備如請求項1至28中任一項之抗PD-1結合劑之方法,該方法包括在細胞中表現編碼如請求項1至28中任一項之抗PD-1結合劑之免疫球蛋白重鏈之核酸序列及編碼如請求項1至28中任一項之抗PD-1結合劑之免疫球蛋白輕鏈之核酸序列。
- 如請求項1至28中任一項之抗PD-1結合劑或如請求項29之醫藥組合物,其係用於抑制哺乳動物之免疫反應。
- 如請求項1至28中任一項之抗PD-1結合劑或如請求項29之醫藥組合物,其係用於治療哺乳動物之發炎性或自體免疫病症。
- 如請求項37之抗PD-1結合劑或醫藥組合物,其中該發炎性或自體免疫病症係原發性膽汁性膽管炎(PBC)、移植物抗宿主病(GvHD)、白斑病、ANCA血管炎、1型糖尿病或非感染性葡萄膜炎。
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