KR20230096024A

KR20230096024A - B 및 t 림프구 약화인자 (btla) 조절제 및 이의 사용 방법

Info

Publication number: KR20230096024A
Application number: KR1020237017524A
Authority: KR
Inventors: 마틴 에드워드 달; 스티븐 팜리; 마릴린 케리; 진 다 실바 코레이아; 모레나 쇼
Original assignee: 아납티스바이오, 아이엔씨.
Priority date: 2020-10-23
Filing date: 2021-10-22
Publication date: 2023-06-29
Also published as: CA3196493A1; IL302135A; AU2021365611A9; AU2021365611A1; US20230391872A1; EP4232480A2; MX2023004633A; WO2022087441A2; JP2023546713A; WO2022087441A3

Abstract

본 개시의 요약
BTLA 결합제 및 상기 결합제의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드, 뿐만 아니라, 자가면역질환 또는 염증성 질환과 같이 BTLA 작용에 반응하는 장애 또는 질환을 치료하기 위해 BTLA 결합제를 사용하는 방법.

Description

B 및 T 림프구 약화인자 (BTLA) 조절제 및 이의 사용 방법

관련 출원에 대한 상호-참조

본 특허 출원은 2021년 5월 25일에 출원된 미국 가출원 63/192,984호 및 2020년 10월 23일에 출원된 미국 가출원 63/105,067호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 개시 내용은 본원에 참조로서 통합된다.

전자적으로 제출된 자료의 참조에 의한 통합

본 문서와 동시에 제출된 컴퓨터-판독가능한 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록은 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.

T 림프구는 미경험 상태(na

ve state)로부터 T 세포 수용체(TCR) 관여(engagement) 및 보조자극 분자(costimulatory molecule) 유래 양성 신호(positive signal)의 조합에 의해 활성화된다. 반대로, 보조억제 분자(coinhibitory molecule)는 양성 보조자극 신호와 균형을 맞추기 위해 음성 신호(negative signal)를 전달하여 T 세포 활성을 조절하는 데 중요한 역할을 한다. 보조억제 분자는 감염 및 염증과 같은 면역 손상을 해결한 후 자기에 대한 면역적 내성의 유지 및 활성화된 T 세포의 제어를 위한 체크포인트 역할을 한다.

CD28은 T 세포 상의 지배적인 보조자극 분자로서, 항원 제시 세포(APC) 표면의 리간드 B7.1 또는 B7.2와 결함하면, TCR 관여를 수반하며 T세포 증식 및 분화를 향상시키는 세포 내 신호를 전달한다. 동일한 리간드가 T 세포 상의 보조억제 분자 세포 독성 T 림프구 항원-4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4, CTLA-4)와 결합하면 T 세포 증식 및 이펙터 기능(effector function)이 억제된다(Chambers et al., Ann. Rev. Immunol., 19:565-594, 2001; Egen et al., Nature Immunol., 3:611-618, 2002). 유사하게, T 세포 증식 및 이펙터 기능은 PD-L1을 발현하는 세포가 T 세포 상의 보조억제 분자 PD-1과 결합할 때 억제된다(Carter et al. Eur J Immunol., 32:634-43, 2002).

음성 체크포인트 신호의 기능 장애는 자가 반응성 B 림프구 및 T 림프구를 정상적으로 제어하는 억제 신호를 방해함으로써 만성 염증 병태를 유발할 수 있다. 자가면역질환 환자의 경우, 면역 시스템은 정상적인 신체 조직에 대해 외래(foreign)인 것처럼 반응하여, 자가-항원에 대한 내성이 손상된 활성화된 T 세포 및 B 세포에 의해 조직이 침윤될 수 있다. 결과적으로, 상기 자가면역 T 림프구 및 B 림프구는 염증과 조직 손상을 매개한다. B 림프구 및 T 림프구 약화인자(B and T lymphocyte attenuator, BTLA), 세포독성 T 림프구 항원-4(CTLA-4), 및 PD-1과 같은 보조억제 분자를 발현하는 림프구는 일반적으로 상응하는 리간드를 발현하는 조직 내 다른 면역 또는 비-면역 세포에 의해 억제된다.

보조억제 분자의 녹아웃 또는 상기 보조억제 상호 작용의 약리학적 차단은 다양한 암의 동물 모델에서 억제 단절(suppressive break)을 해제하고 종양 특이적 T 세포 집단의 확장을 유도하여 종양 세포를 공격하고 사멸시키도록 유도하는 것으로 나타났다. BTLA 녹아웃 마우스의 경우 실험용 자가면역성 뇌척수염에 대한 민감도가 증가하였다(Watanabe et al., Nat. Immunol., 4:670-679, 2003). 반대로, 마우스 BTLA를 표적으로 하는 작용제 항체는 T세포 활성을 억제하는 것으로 나타났으며, 이식 편 대 숙주 질환(graft versus-host disease, GvHD) 마우스 모델에서 효능이 입증되었다.

BTLA에 대한 리간드는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 멤버 14(tumor necrosis factor receptor superfamily member 14, TNFRSF14)로도 알려진 헤르페스 바이러스 진입 매개체(Herpes virus entry mediator, HVEM)이다. HVEM은 또한 두 가지 분비 성장 인자인 림포톡신 알파(lymphotoxin alpha) 및 LIGHT에 결합하는 양성 보조자극 분자이며, 단순 헤르페스 바이러스(HSV)가 세포에 침투할 때 사용하기도 한다. 종양 세포 또는 다른 면역 세포 상에 발현된 HVEM에 의한 T 세포 상 BTLA 관여는 음성, 억제 신호를 발생시킨다. BTLA에 결합하고 이에 작용하는 항-BTLA 항체는 자연적(native) 리간드 HVEM이 전달하는 것과 유사한 직접적인 음성 신호를 유도하여 자가면역 및 염증성 질환에서 자가 반응성 T 세포 및 B 세포 반응을 억제할 수 있다. 또한, 자연적 HVEM-BTLA 상호작용을 방해하지 않으면서 BTLA와 결합하는 작용제 항체는 자연적 보조억제 신호를 강화할 수 있다.

따라서, BTLA와 결합하여 면역 체크포인트 신호를 조절할 수 있는 약제가 필요하다.

본 발명의 간단한 요약

본원은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 BTLA-결합제를 제공한다.

또한, 본원은 포유동물에서 HVEM 및 BTLA 간 상호작용 및/또는 T 세포 반응을 조절하기 위해 BTLA-결합제를 사용하는 방법을 제공한다.

하기 상세한 설명으로부터 명백해지는 바와 같이, 또한, 관련 조성물 및 방법을 제공한다.

도면(들)의 여러 관점에 대한 간단한 설명
도 1은 인간 BTLA 및 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이 BTLA 세포 외 도메인에 대한 6G3 항체의 표면 플라즈몬 공명 결합 동역학(surface plasmon resonance binding kinetics)의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 2는 인간 BTLA 및 시노몰구스 원숭이 BTLA 세포 외 도메인에 대한 6G3 항체의 동역학 배제 분석(Kinetic Exclusion Assay) 결합 동역학의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 3은 인간 BTLA 및 시노몰구스 원숭이 BTLA로 안정적으로 형질감염된 293c18 세포에 대한 6G3 항체의 결합 결과를 도시하는 그래프이다.
도 4는 정상 도너 인간 말초 혈액 CD4⁺ T 세포, CD8⁺ T 세포, 및 CD20⁺ B 세포에 대한 6G3 항체의 결합 결과를 도시하는 그래프이다.
도 5a는 정상 시노몰구스 원숭이 말초 혈액 CD3⁺ T 세포에 대한 6G3 항체의 결합 결과를 도시하는 그래프이다.
도 5b는 정상 시노몰구스 원숭이 말초 혈액 CD20⁺ T 세포에 대한 6G3 항체의 결합 결과를 도시하는 그래프이다.
도 5c는 정상 시노몰구스 원숭이 말초 혈액 CD3⁺ 및 CD3^-세포에 대한기준(reference) 항-BTLA 항체의 결합 결과를 기술하는 유세포 분석 도트 플롯이다.
도 5d는 정상 시노몰구스 원숭이 말초 혈액 CD3⁺ 및 CD3^-세포에 대한6G3 항체의 결합 결과를 도시하는 유세포 분석 도트 플롯이다.
도 6은 경쟁 분석(competition assay) 결과를 도시하는 그래프로서, 안정적으로 인간 BTLA 형질감염된 293c18 세포에 대한 결합에 대해, 항-BTLA 항체가 HVEM-Fc 및 사전-형성된(pre-formed) HVEM-Fc/삼량체 LIGHT 복합체(HVEM-Fc/trimeric LIGHT complex)와 경쟁하는 능력을 나타낸다.
도 7a는 인간 HVEM 세포 외 결합 도메인(회색)의 결정 구조의 공간-채움 모델과 도킹되어 있는 인간 BTLA 세포 외 도메인(검은색)의 결정 구조에 대한 리본-모델 일러스트레이션이다. 상기 모델은 6G3 항체와 결합된 인간 BTLA 상의 펩티드를 매핑하는 수소-중수소 교환 실험의 결과를 도시한다.
도 7b는 인간 HVEM 세포 외 결합 도메인(회색)의 결정 구조의 공간-채움 모델과 도킹되어 있는 인간 BTLA 세포 외 도메인(검은색)의 결정 구조에 대한 리본-모델 일러스트레이션이다. 상기 분자는 도 7a에 나타낸 분자의 관점(view)와 비교하여 30° 회전되었으며, 기준 항-BTLA 작용제 항체와 결합된 인간 BTLA 상의 펩티드를 매핑하는 수소-중수소 교환 실험의 결과를 도시한다.
도 8은 BTLA 및 HVEM이 동일한 세포에서 발현될 때 LIGHT-유도된 HVEM 신호전달을 측정하는 HVEM-NF-κB HEK 293 루시퍼라제 리포터 분석에서 6G3 항체의 억제 활성을 도시하는 그래프이다.
도 9a는 형질감염된 293c18 세포의 표면에서 BTLA 및 HVEM의 결합을 측정하는 형광 공명 에너지 전이 분석 결과를 도시하는 그래프이며, 이는 동일한 세포 표면에서 BTLA 및 HVEM 결합과 경쟁하는 항-BTLA 항체의 능력을 나타낸다.
도 9b는 형질감염된 293c18 세포의 표면에서 BTLA 및 HVEM의 결합을 측정하는 형광 공명 에너지 전이 분석 결과를 도시하는 그래프이며, 이는 형광 도너(donor) 항-BTLA 항체가 항-HVEM 억셉터(acceptor) 항체와 함께 에너지 전달 신호를 생성하는 능력을 나타낸다.
도 10은 BTLA 및 HVEM이 다른 세포 상에서 발현될 때 BTLA-유도된 HVEM 신호전달을 측정하는 HVEM-NF-κB HEK 293 루시퍼라제 리포터 분석에서 6G3 항체의 부분 억제 활성을 도시하는 그래프이다.
도 11은 SHP2 recruitment PathHunter Jurkat BTLA 신호전달분석에서 용해성 항체로서 첨가된 6G3 항체의 작용제 활성을 도시하는 그래프이다.
도 12는 BTLA 신호전달이 형질감염된 U-2 OS 세포주 상의 HVEM에 의해 유도된, SHP2 recruitment PathHunter Jurkat BTLA 신호전달분석에서 항-BTLA 항체의 억제 활성을 도시하는 그래프이다.
도 13은 FcγR 관여를 제공하기 위해 FcγRIa 형질감염된 U-2 OS 세포를 부가한 SHP2 recruitment PathHunter Jurkat BTLA 신호전달분석에서 6G3 항체의 작용제 활성을 도시하는 그래프이다.
도 14a는 본 발명의 구체예에 따라 본원에 기재된 이식편 대 숙주 질환 연구를 위한 이종 NSG/Hu-PBMC 마우스 모델의 개략도이다.
도 14b는 본 발명의 구체예에 따라 본원에 기재된 NSG/Hu-PBMC 이식편 대 숙주 질환 연구의 타임라인, 투여 일정 및 모델 그룹을 나타내는 개략도이다.
도 14c는 1 mg/kg, 3 mg/kg 또는 10 mg/kg의 6G3 항체를 매주 2회 투여한 동물 그룹에 대한 NSG/Hu-PBMC 이식편 대 숙주 질환 연구에서 전체 생존 결과를 도시하는 그래프이다.
도 15는 6G3 항체를 주 2회 1, 3, 10 mg/kg(IP)으로 투여한 후 GvHD의 인간화 뮤린(murine) 모델에서 용량 그룹별 인간 sBTLA의 개별 및 평균(SD) 농도를 나타낸 플롯이다. 혈장 샘플은 연구 중간 시점에 심장 채혈을 통해 수집하였다.
도 16은 6G3 IgG4를 투여 후 시노몰구스 원숭이에서 용량 그룹별 시노 sBTLA의 평균(SD) 혈청 농도를 나타낸 플롯이다. 모든 동물에게 단일 용량의 6G3 IgG4를 IV 또는 SC로 투여하고 투여 전, 투여 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 168, 240, 336, 504, 672, 840시간 후 모든 그룹의 모든 동물에서 혈액 샘플을 수집하였다.
도 17은 6G3 IgG4를 투여 후 시노몰구스 원숭이에서 용량 그룹별 시노 sBTLA의 평균(SD) 혈청 농도를 나타낸 플롯이다. 모든 동물에게 1, 8, 15일째에 6G3 IgG4의 주 용량(weekly dose)을 IV 또는 SC로 투여하고 모든 그룹의 모든 동물에서 1, 8, 15일째에 투여 전, 3, 24, 48, 72, 96시간 후에 혈액 샘플을 수집하였다.
도 18은 6G3 IgG4를 투여 후 시노몰구스 원숭이에서 용량 그룹별 6G3 IgG4의 평균(SD) 혈청 농도(μg/ml) 를 나타낸 플롯이다. 모든 동물에게 1, 8, 15일째에 6G3 IgG4의 주 용량을 IV 또는 SC로 투여하고 모든 그룹의 모든 동물에서 1, 8, 15일째에 투여 전, 3, 24, 48, 72, 96시간 후에 혈액 샘플을 수집하였다.
도 19는 시노몰구스 원숭이에게 6G3 IgG4, 이소타입 대조군 또는 CTLA-4-Ig 대조군을 투여한 후 용량 그룹별 다양한 데이터를 나타내는 4개의 플롯이다. 첫번째 플롯은 용량 그룹별 BTLA 발현(MFI)을 나타낸다. 두번째 플롯은 용량 그룹별 BTLA+ T 세포 비율을 나타낸다. 세번째 플롯은 용량 그룹별 혈액 μl 당 인간 T 세포의 수를 나타낸다. 네번째 플롯은 용랑 그룹 별 CD25 양성 비율을 나타낸다.
도 20은 6G3 IgG4 투여 후 시노몰구스 원숭이에서 용량 그룹별 T세포 및 B세포의 수용체 점유 및 BTLA 표면 발현을 나타내는 4개의 플롯이다. 모든 동물에게 1, 8일 및 15일째에 IV 또는 SC로 6G3 IgG4 또는 대조군의 주 용량(weekly dose)을 투여하였다. 첫 번째 플롯은 기저선 대비 T 세포의 자유 수용체(free receptor) 백분율 변화를 나타낸다. 두 번째 플롯은 기저선 대비 T 세포의 BTLA 발현 백분율 변화를 나타낸다. 세 번째 플롯은 기저선 대비 B 세포의 자유 수용체 백분율 변화를 나타낸다. 네 번째 플롯은 기저선 대비 B 세포의 BTLA 발현 백분율 변화를 나타낸다.
도 21a는 6G3 IgG4 처리된 CD3+ T 세포 상에 이소타입 대조군의 중첩된 히스토그램으로서 제시되는 건강한 대조군 및 아토피성 피부염 도너의 2개의 히스토그램이다.
도 21b는 건강한 대조군 및 아토피성 피부염 도너에서 6G3 IgG4에 의한 T 세포 증식 감소를 나타내는 2개의 플롯이며, 증식 감소 백분율(좌측) 및 분열 지수(우측)로서 나타내었다.
도 21c는 100 nM의 6G3 IgG4 또는 이소타입 대조군의 존재 또는 부재 하에 항-CD3 및 항-CD28 자극 72시간 후 건강한 대조군 및 아토피성 피부염 도너 PBMC 배양 상청액의 IFNγ 수준을 나타내는 2개의 플롯이다.
도 21d는 건강한 대조군 및 아토피성 피부염 도너 유래 CD3+ T 세포의 표면 BTLA 발현 수준(평균 형광 강도(MFI)로 표시됨)을 나타내는 플롯이다.

발명의 상세한 설명

본원은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 BTLA-결합제를 제공한다. BTLA는 면역글로불린 유사 세포 외 도메인, 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM) 및 면역수용체 티로신 기반 스위치 모티프(immunoreceptor tyrosine-based switch motif, ITSM)를 갖는 30킬로달톤(kD) 타입 1 막관통 단백질이다. BTLA는 B세포와 T세포에서 발현되며, 종양 세포 또는 APC에서 발현되는 이의 수용체, 헤르페스 바이러스 진입 매개체(HVEM)와의 상호작용을 통해 B세포 및 T세포 활성에 대한 음성 조절 인자(negative regulator) 역할을 한다. 일부 구체예에서, 상기 BTLA-결합제는 BTLA와 HVEM 간의 결합을 억제하지 않으면서 BTLA에 결합한다. 일 양상에서, 상기 BTLA-결합제는 BTLA와 HVEM 사이의 결합을 강화시킨다.

PD-1 결합제는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이들 각각은 일반적으로 CDR1, CDR2, 또는 CDR3으로 지칭되는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. CDR 영역은 또한 명명법에서 "H" 또는 "L"을 사용하여 언급될 수 있는데, 각각 중쇄 또는 경쇄 즉, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 또는 CDRL3를 나타내기 위해서이다. 주어진 Ig 서열의 CDR 은 Kabat, Chothia, Martin(Enhanced Chothia), IGMT, 또는 AHo와 같은 몇 가지 통상적인 넘버링 방식에 의해 결정될 수 있다(이들은 본 분야에 널리 알려진 넘버링 방식을 위해 일반적으로 쓰이는 이름이며 예를 들어,"Kabat" 넘버링 방식을 기재하는 Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH(1991); "Chothia" 넘버링 방식을 기재하는 Chothia, et al., Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins, J. Mol. Biol., 196:901-917(1987) 및 Al-Lazikani et al., Standard Conformations for the Canonical Structures of Immunoglobulins, J. Mol. Biol., 273:927 - 948(1997); "Martin" 또는"Enhanced Chothia" 넘버링 방식을 기재하는 Abhinandan et al., Analysis and Improvements to Kabat and Structurally Correct Numbering of Antibody Variable Domains, Mol. Immunol., 45: 3832 - 3839(2008);"IMGT" 넘버링 방식을 기재하는 Lefranc et al., The IMGT unique numbering for immunoglobulins, T cell Receptors and Ig-like domains, The Immunologist, 7: 132-136(1999) 및 Lefranc et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and I superfamily V-like domains, Dev. Comp. Immunol., 27: 55 - 77(2003); 및 "AHo" 넘버링 방식을 기재하는 Honegger et al., Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool, J. Mol. Biol. 309: 657 - 670(2001)의 간행된 문헌에 기재되어 있다). 본원에서 제공하는 BTLA 결합제는 인공적이고 비자연적으로 발생한다. 이들은 실험실 기술에 의해 생성되었으며, 따라서 재조합 또는 합성 아미노산 서열을 포함하는 재조합 또는 합성 분자로 적절히 여겨진다. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 이들이 생산되는 환경(예: 세포 배양)에서 제거되고 어느 정도 정제된다는 의미에서 "분리(isolated)" 될 수 있다.

본 개시의 일 양상에 따르면, 상기 BTLA-결합제는 서열번호 1-15, 207, 208, 217, 또는 218 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 BTLA-결합제의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 또는 적어도 이의 CDR; 또는 서열번호 1-15, 207, 208, 217, 또는 218 중 어느 하나에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89 %, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99 %)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 CDR은 Kabat, Chothia, Martin(Enhanced Chothia), IGMT 또는 AHo와 같은 임의의 공지된 넘버링 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 일부 구체예에서, CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 1-15, 207, 208, 217 또는 218의 잔기 31-35(CDRH1), 50-66(CDRH2) 및 99-106(CDRH3)을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 면역글로불린 중쇄는 하기 CDR을 포함한다:

(a) Asp Tyr Thr Ile His(서열번호 27)을 포함하는 CDRH1;

(b) Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Xaa1 Phe Lys Xaa2(서열번호 30)을 포함하는 CDRH2, 여기서 Xaa1은 리신(Lys) 또는 글루탐산(Glu), 및 Xaa2는 아스파르트산(Asp) 또는 발린(Val)인 것이고(예를 들어 서열번호 28, 30, 31, 212, 또는 222); 및

(c) Arg Xaa1 Xaa2 Tyr Xaa3 Met Xaa4 Tyr(서열번호 32)을 포함하는 CDRH3, 여기서 Xaa1은 아스파라진(Asn) 또는 세린(Ser)이고, Xaa2는 티로신(Tyr) 또는 히스티딘(His)이고, Xaa3은 알라닌(Ala) 또는 발린(Val)이고, 및 Xaa4는 글루탐산(Glu) 또는 아스파르트산(Asp)이다. 이러한 CDRH3 서열의 예는 예를 들어 서열번호 29, 33, 34, 213 또는 223을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 서열 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Xaa1 Thr Xaa2 Thr Asp Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Xaa3 Phe Lys Xaa4 Arg Val Thr Ile Thr Xaa5 Asp Xaa6 Ser Xaa7 Xaa8 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Xaa9 Cys Ala Arg Arg Xaa10 Xaa11 Tyr Xaa12 Met Xaa13 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala(서열번호 26), 또는 적어도 이의 CDR 영역을 포함하고, 여기서

Xaa1는 페닐알라닌(Phe) 또는 티로신(Tyr)이고,

Xaa2는 페닐알라닌(Phe) 또는 류신(Leu)이고,

Xaa3은 리신(Lys) 또는 글루탐산(Glu)이고,

Xaa4는 아스파르트산(Asp) 또는 발린(Val)이고,

Xaa5는 알라닌(Ala) 또는 아르기닌(Arg)이고,

Xaa6은 리신(Lys) 또는 트레오닌(Thr)이고,

Xaa7은 알라닌(Ala) 또는 세린(Ser)이고,

Xaa8은 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr)이고,

Xaa4는 티로신(Tyr) 또는 페닐알라닌(Phe)이고, 및

Xaa10은 아스파라진(Asn) 또는 세린(Ser)이고,

Xaa11은 티로신(Tyr) 또는 히스티딘(His)이고,

Xaa12은 알라닌(Ala) 또는 발린(Val)이고, 및

Xaa13은 글루탐산(Glu) 또는 아스파르트산(Asp)이다.

일부 구체예에서, 상기 Ig 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 1-15, 207, 208, 217, 또는 218 중 어느 하나와 동일한 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 보유하는 것을 조건으로 서열번호 26을 포함한다.

본 개시의 이 양상에 따르면, 상기 BTLA-결합제의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 16-25, 209, 210, 219, 또는 220 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 적어도 이의 CDR을 포함하거나; 또는 서열번호 16-25, 209, 210, 219, 또는 220 중 어느 하나에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89 %, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99 %, 또는 적어도 100% 서열 동일성)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. Ig 중쇄와 마찬가지로, CDR은 Kabat, Chothia, Martin(Enhanced Chothia), IGMT 또는 AHo와 같은 임의의 공지의 넘버링 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 16-25, 209, 210, 219, 또는 220의 잔기 24-34(CDRL1), 50-56(CDRL2), 및 89-97(CDRL3)을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 Ig 경쇄는 하기 CDR을 포함한다:

(a) Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn Val Ala(서열번호 36)을 포함하는 CDRL1;

(b) Ser Ala Ser Tyr Arg Xaa Ser(서열번호 39)을 포함하는 CDRL1, 여기서 Xaa는 티로신(Tyr) 또는 세린(Ser)이고(예: 서열번호 37, 40, 215, 또는 225); 및

(c) Gln Gln Tyr Xaa1 Xaa2 Tyr Pro Tyr Thr(서열번호 41)을 포함하는 CDRL3, 여기서 Xaa1은 세린(Ser) 또는 아스파라진(Asn)이고, Xaa2은 트레오닌(Thr) 또는 세린(Ser)이다(예: 서열번호 38, 41, 42, 216, 또는 226).

다른 구체예에서, 상기 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 아미노산 서열 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Xaa1 Pro Lys Xaa2 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Xaa3 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Xaa4 Cys Gln Gln Tyr Xaa5 Xaa6 Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg(서열번호 35), 또는 적어도 이의 CDR 영역을 포함하고, 여기서

Xaa1는 세린(Ser) 또는 프롤린(Pro)이고,

Xaa2는 프롤린(Pro) 또는 류신(Leu)이고,

Xaa3은 티로신(Tyr) 또는 세린(Ser)이고,

Xaa4는 티로신(Tyr) 또는 페닐알라닌(Phe)이고,

Xaa5는 세린(Ser) 또는 아스파라진(Asn)이고, 및

Xaa6은 트레오닌(Thr) 또는 세린(Ser)이다.

일부 구체예에서, 상기 Ig 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 16-25, 209, 210, 219, 또는 220 중 어느 하나와 동일한 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 보유하는 것을 조건으로 서열번호 35를 포함한다.

본 개시의 또다른 양상에 있어서, 상기 BTLA-결합제는 서열번호 43-156 중 어느 하나를 포함하는 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 또는 적어도 이의 CDR; 또는 서열번호 43-156 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 또는 90%의 서열 동일성(예: 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 CDR은 Kabat, Chothia, Martin(Enhanced Chothia), IGMT 또는 AHo와 같은 임의의 공지된 넘버링 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 일부 구체예에서, CDR1, CDR2 및 CDR3는, 서열번호 66에서 CDRH1은 잔기 50-67 및 CDRH3는 잔기 100-114가 될 수 있고; 서열번호 141, 150, 152, 153, 155 및 156에서 CDRH3는 잔기 100-114가 될 수 있다는 점을 제외하고는, 서열번호 43-156의 잔기 31-35(CDRH1), 50-66(CDRH2) 및 99-113(CDRH3)을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 하기 CDR을 포함한다:

(a) X¹SX²MN(서열번호 195)을 포함하는 CDRH1, 여기서 X¹은N 또는 T이고, 및 X²는W, F, H, G, P, R, K, D, S, L, V, N, 또는 Y인 것이고;

(b) RIYPX¹GX²X³DTNYX⁴GKFK(서열번호 196)을 포함하는 CDRH2 , 여기서:

X¹은 부재하거나 또는A이고;

X²는D, Y, Q, G, L, F, H, S, P, R, 또는 T이고;

X³은 G, Y, A, F, S, D, V, T, E, K, 또는 R이고; 및

X⁴는 N, V, Q, R, A, F, Y, S, G, P, 또는 T이고; 및

(c) X¹SGTFX²X³GNYX⁴X⁵YFDV(서열번호 197)을 포함하는 CDRH3, 여기서:

X¹은 K 또는 R이고;

X²은N 또는 D이고;

X³은 D, S, F, Y, F, V, S, G, T, R, I, L, 또는 E이고;

X⁴는 R 또는 H이고; 및

X⁵는 W, R, F, L, N, Y, P, I, V, A, S, G, R, 또는 K이다.

일부 구체예에서, 상기 Ig 중쇄는 서열번호 201을 포함하는 CDRH1; 서열번호 202를 포함하는 CDRH2; 및 서열번호 203을 포함하는 CDRH3을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 BTLA-결합제는 서열 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYX¹FSX²SX³MNWVRQAPGQGLEWMGRIYPX⁴GX⁵X⁶DTNYX⁷GKFKGRVTITADKX⁸TX⁹TAYMELX¹⁰SLRSEX¹¹TAVX¹²YX¹³CAX¹⁴SGTFX¹⁵X¹⁶GNYX¹⁷X¹⁸YFDVWGKGTTVTVSSA(서열번호 193), 또는 적어도 이의 CDR을 포함하는 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 포함하고, 여기서

X¹는A 또는 V이고;

X²는 N 또는 T이고;

X³은 W, F, H, G, P, R, K, D, S, L, V, N, 또는 Y이고;

X⁴ 는부재하거나 또는A이고;

X⁵ 는D, Y, Q, G, L, F, H, S, P, R, 또는 T이고;

X⁶ 은 G, Y, A, F, S, D, V, T, E, K, 또는 R이고;

X⁷ 은 N, V, Q, R, A, F, Y, S, G, P, 또는 T이고;

X⁸은S 또는 F이고;

X⁹는 S, T, 또는 N이고;

X¹⁰은S 또는 R이고;

X¹¹은 D 또는 V이고;

X¹²은부재하거나 또는Y이고;

X¹³은Y 또는 F이고;

X¹⁴는K 또는 R이고;

X¹⁵는 N 또는 D이고;

X¹⁶은 D, S, F, Y, F, V, S, G, T, R, I, L, 또는 E이고;

X¹⁷은 R 또는 H이고; 및

X¹⁸은 W, R, F, L, N, Y, P, I, V, A, S, G, R, 또는 K이다.

일부 구체예에서, 상기 Ig 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 43-156 중 어느 하나와 동일한 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 보유하는 것을 조건으로 서열번호 193을 포함한다.

본 개시의 이 양상에 따르면, 상기 결합제는 추가로 Ig 경쇄를 포함하며, 상기 Ig 경쇄는 서열번호 157-192 중 어느 하나, 또는 적어도 이의 CDR; 또는 서열번호 157-192 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 또는 90%의 서열 동일성(예: 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 CDR은 Kabat, Chothia, Martin(Enhanced Chothia), IGMT 또는 AHo와 같은 임의의 공지된 넘버링 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 일부 구체예에서, CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 157-192의 잔기 24-34(CDRL1), 50-56(CDRL2), 및 89-97(CDRL3)을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 BTLA-결합제는 하기를 포함하는 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 포함할 수 있다:

(a) RX¹SENIYX²X³LA(서열번호 198)을 포함하는 CDRL1, 여기서

X¹는A 또는 V이고;

X²는S 또는 N이고; 및

X³은H, N, 또는 Y이고;

(b) X¹AX²NLAX³(서열번호 199)을 포함하는 CDRL2, 여기서

X¹은A 또는 N이고;

X²는T 또는 K이고; 및

X³은N, L, Q, G, F, V, K, S, R, T, H, 또는 P이고; 및

(c) QX¹FX²GPPLT(서열번호 200)을 포함하는 CDRL3, 여기서

X¹은L 또는 H이고; 및

X²는W, F, Y, P, N, V, K, M, L, G, 또는 S이다.

일부 구체예에서, 상기 Ig 경쇄는 서열번호 204를 포함하는 CDRL1 ; 서열번호 205를 포함하는 CDRL2; 및 서열번호 206을 포함하는 CDRL3을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 서열 X¹IQX²TQSPSSLSASVGDRVTITCRX³SENIYX⁴X⁵LAWYQQKX⁶GKAPKLLIYX⁷AX⁸NLAX⁹GVPSRFSGSGSGTDX¹⁰TLTISSLQPEDFATYYCQX¹¹FX¹²GPPLTFGGGTKVEIKR(서열번호 194), 또는 적어도 이의 CDR을 포함하고, 여기서

X¹는A 또는 D이고;

X²는 L 또는 M이고;

X³은A 또는 V이고;

X⁴는S 또는 N이고;

X⁵는H, N, 또는 Y이고;

X⁶은 P 또는 Q이고;

X⁷은 A 또는 N이고;

X⁸은 T 또는 K이고;

X⁹는 N, L, Q, G, F, V, K, S, R, T, H, 또는 P이고;

X¹⁰은F 또는 Y이고;

X¹¹은 L 또는 H이고;

X¹²는 W, F, Y, P, N, V, K, M, L, G, S이다.

일부 구체예에서, 상기 Ig 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 157-192 중 어느 하나와 동일한 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 보유하는 것을 조건으로 서열번호 194을 포함한다.

일 구체예에 따르면, 상기 BTLA-결합제는 서열번호 144 또는 이와 적어도 80%, 85%, 또는 90%의 서열 동일성(예: 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열의 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 또는 적어도 서열번호 144의 CDR을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 CDR 영역은 상기 제공된 바(예: CDR1 - 서열번호 201, CDR2 - 서열번호 202, 및 CDR3 - 서열번호 203)와 같거나 또는 임의의 다양한 공지된 면역글로불린 넘버링 방법(예: Kabat, Chothia, Martin(Enhanced Chothia), IGMT, 또는 AHo)에 따라 결정된 바와 같으며; 및 서열번호 174 또는 이와 적어도 80%, 85%, 또는 90%의 서열 동일성(예: 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열의 면역글로불린 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 서열번호 174의 CDR을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 CDR 영역은 상기 제공된 바(예: CDR1 - 서열번호 204, CDR2 - 서열번호 205, 및 CDR3 - 서열번호 206)와 같거나 또는 임의의 다양한 공지된 면역글로불린 넘버링 방법(예: Kabat, Chothia, Martin(Enhanced Chothia), IGMT, 또는 AHo)에 따라 결정된 바와 같다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 서열번호 144의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 174의 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 Kabat에 의해 결정된 이의 CDR을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 서열번호 144의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 174의 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 Chothia에 의해 결정된 이의 CDR을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 서열번호 144의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 174의 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 Martin에 의해 결정된 이의 CDR을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 서열번호 144의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 174의 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 IGMT에 의해 결정된 이의 CDR을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 서열번호 144의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 174의 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 AHo에 의해 결정된 이의 CDR을 포함한다.

또한 본원에 제시되는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 BTLA-결합제와 동일한 에피토프에 결합하는 BTLA-결합제가 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 BTLA-결합제는 서열번호 144의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 174의 경쇄 가변 영역을 포함하는 BTLA 결합제와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 BTLA-결합제는 서열번호 5의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 17의 경쇄 가변 영역을 포함하는 BTLA 결합제; 서열번호 207의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 209의 경쇄 가변 영역을 포함하는 BTLA 결합제; 또는 서열번호 217의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 219의 경쇄 가변 영역을 포함하는 BTLA 결합제와 동일한 에피토프에 결합한다. BTLA-결합제는 BTLA에 대한 결합에 대해 본원에 기술된 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 BTLA-결합제와 경쟁하는 경우 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 여겨진다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공하는 BTLA 결합제는 인간 BTLA의 아미노산 잔기 52-65 및/또는 100-106(예: 서열번호: 227 및/또는 228)(기준 서열 UniProt ID Q7Z6A9 또는 자연적으로 발생하는 변이 인간 BTLA의 상응하는 서열 위치)에 결합하는 BTLA 결합제이다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공하는 BTLA 결합제는 인간 BTLA의 아미노산 잔기 46065, 82-91, 또는 100-106(예: 서열번호: 229, 230 및/또는 231)(기준 서열 UniProt ID Q7Z6A9 또는 자연적으로 발생하는 변이 인간 BTLA의 상응하는 서열 위치)에 결합하는 BTLA 결합제이다.

핵산 또는 아미노산 서열과 관련하여 사용되는 서열 "동일성"은 관심 핵산 또는 아미노산 서열을 기준 핵산 또는 아미노산 서열과 비교함으로써 결정될 수 있다. 동일성 백분율은 최적으로 정렬되었을 때 관심 서열과 기준 서열 사이에서 같은(즉, 동일한) 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 퍼센트이다. 최적의 정렬을 획득하고 둘 이상의 서열 사이의 동일성을 계산하기 위한 많은 수학적 알고리즘이 알려져 있으며 공개적으로 이용 가능하다. 이러한 프로그램의 예로는 CLUSTAL-W, T-Coffee, 및 ALIGN(핵산 및 아미노산 서열 정렬용), BLAST 프로그램(예: BLAST 2.1, BL2SEQ, 및 National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD에 의해 수행되는 이의 후기 버전) 및 FASTA 프로그램(예: FASTA3x, FASTM, 및 SSEARCH)(서열 정렬 및 서열 유사성 조사용)을 포함한다. 서열 정렬 알고리즘은 또한 예를 들어 Altschul et al., J. Molecular Biol., 215(3): 403-410(1990), Beigert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(10): 3770-3775(2009), Durbin et al., eds., Biological Sequence Analysis: Probalistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK(2009), Soding, Bioinformatics, 21(7): 951-960(2005), Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402(1997), 및 Gusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge University Press, Cambridge UK(1997))에 개시되어 있다.

상술한 중쇄 및 경쇄 서열과 100% 미만의 동일성을 갖는 서열과 관련하여, 폴리펩티드 활성(예: BTLA 결합제의 일부로서 존재하는 경우 BTLA와 결합하는 능력)이 실질적으로 유지되는 것을 전제로, 상기 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 경쇄 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 대체 또는 치환될 수 있고/있거나, 하나 이상의 아미노산이 개시된 아미노산 서열로부터 삭제되거나 개시된 아미노산 서열 내에 삽입될 수 있다. BTLA 결합제의 "생물학적 활성"은 예를 들어 특정 BTLA 에피토프에 대한 결합 친화도(BTLA의 이의 수용체에 대한 결합을 억제하지 않고/않거나 생체 내 BTLA 활성(예:IC₅₀)을 저해하지 않음), 약동학 및 교차-반응성(예: BTLA 단백질의 비인간 동족체(homolog) 또는 상동체(orthologue) 또는 다른 단백질 또는 조직과의 반응)을 지칭한다. 일부 구체예에서, 상기 BTLA-결합제의 생물학적 활성은 BTLA의 이의 수용체(들)에 대한 BTLA-결합을 향상시키고/시키거나 그렇지 않으면 생체 내 BTLA 활성을 증가시키는 약제(agent)의 능력을 포함한다. 당업계에서 인식되는 항원 결합제의 다른 생물학적 특성 또는 특징은 예를 들어 친화력(avidity), 선택성, 용해도, 접힘(folding), 면역독성, 발현 및 제형을 포함한다. 앞서 언급한 특성 또는 특징은 ELISA, 경쟁적 ELISA, 표면 플라즈몬 공명 분석(BIACORE™), 또는 용액 상 경쟁(solution phase competition)(KINEXA™), 시험관 또는 생체 내 중화 분석, 수용체-리간드 결합 분석, 사이토카인 또는 성장 인자 생성 및/또는 분비 분석, 및 신호 전달 및 면역 조직 화학 분석을 포함하되 이에 제한되는 것은 아닌 표준 기술을 사용하여 관찰, 측정 및/또는 평가될 수 있다.

아미노산 대체 또는 치환은 보존적, 반-보존적 또는 비보존적일 수 있다. "보존적 아미노산 치환" 또는 "보존적 변이(mutation)"라는 구는 하나의 아미노산을 공통 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것을 지칭한다. 개별 아미노산 사이의 공통 특성을 정의하는 기능적 방법은 상동 유기체의 상응하는 단백질 사이에서 아미노산 변화의 정규화된 빈도를 분석하는 것이다(Schulz and Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York(1979)). 이러한 분석에 따르면, 아미노산 그룹은 그룹 내의 아미노산이 서로 우선적으로 교환되어 전체 단백질 구조에 미치는 영향이 가장 유사한 아미노산 그룹으로 정의될 수 있다(Schulz and Schirmer, 상기 참조).

아미노산은 크게 "방향족" 또는 "지방족"으로 분류된다. 방향족 아미노산은 방향족 고리를 포함한다. "방향족" 아미노산의 예로는 히스티딘(H 또는 His), 페닐알라닌(F 또는 Phe), 티로신(Y 또는 Tyr), 및 트립토판(W 또는 Trp)을 포함한다. 비방향족 아미노산은 크게 "지방족"으로 분류된다. "지방족" 아미노산의 예로는 글리신(G 또는 Gly), 알라닌(A 또는 Ala), 발린(V 또는 Val), 류신(L 또는 Leu), 이소류신(I 또는 Ile), 메티오닌(M 또는 Met), 세린(S 또는 Ser), 트레오닌(T 또는 Thr), 시스테인(C 또는 Cys), 프롤린(P 또는 Pro), 글루탐산(E 또는 Glu), 아스파르트산(A 또는 Asp), 아스파라진(N 또는 Asn), 글루타민(Q 또는 Gln), 리신(K 또는 Lys), 및 아르기닌(R 또는 Arg)을 포함한다.

지방족 아미노산은 4개의 서브-그룹으로 세분될 수 있다. "큰 지방족 비극성 서브-그룹"은 발린, 류신 및 이소류신으로 구성된다. "지방족 약-극성 서브-그룹"은 메티오닌, 세린, 트레오닌 및 시스테인으로 구성된다. "지방족 극성/전하를 띤 서브-그룹"은 글루탐산, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루타민, 리신, 및 아르기닌으로 구성된다. "작은-잔기 서브-그룹"은 글리신 및 알라닌으로 구성된다. 상기 전하를 띤/극성 아미노산 그룹은 3개의 서브-그룹으로 세분될 수 있다: 라이신 및 아르기닌으로 구성된 "양전하 서브-그룹", 글루탐 및 아스파르트산으로 구성된 "음전하 서브-그룹", 및 아스파라긴 및 글루타민으로 구성된 "극성 서브-그룹".

방향족 아미노산은 2개의 서브-그룹으로 세분될 수 있다: 히스티딘 및 트립토판으로 구성된 "질소 고리 서브-그룹" 및 페닐알라닌 및 티로신으로 구성된 "페닐 서브-그룹".

보존적 아미노산 치환은 아미노산을 상기 서브-그룹 내에서 치환하는 것, 예를 들어 양전하를 유지할 수 있도록 라이신을 아르기닌으로 또는 그 반대로, 음전하를 유지할 수 있도록 아스파르트산을 글루탐산으로 또는 그 반대로, 유리 -OH를 유지할 수 있도록 세린을 트레오닌으로, 유리 -NH₂ 를 유지할 수 있도록 글루타민을 아스파라긴으로 치환하는 것 등을 포함한다. "반-보족적 변이"는 상기 나열된 동일한 그룹 내이지만, 동일한 서브-그룹 내는 아닌 아미노산으로의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 아스파라긴을 아스파르트산으로 대체하거나 라이신을 아스파라긴으로 대체하는 것은 같은 그룹 내 아미노산이지만 다른 서브-그룹의 아미노산을 포함한다. "비-보존적 변이"는 예를 들어 트립토판을 라이신으로, 세린을 페닐알라닌으로 치환하는 것 등과 같이 서로 다른 그룹 간의 아미노산 치환을 포함한다.

전술한 변이(예: 치환)는 Ig 사슬의 임의의 영역에서 이루어질 수 있다. 일부 구체예에서, 아미노산(들)은 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 경쇄 폴리펩티드의 CDR(예: CDR1, CDR2 또는 CDR3)에서 치환되고; 다른 구체예에서, 상기 아미노산(들)은 CDR이 아닌 프레임워크 영역에서 치환되고; 또 다른 실시예에서, 아미노산은 프레임워크 영역 및 CDR 모두에서 치환된다. 일부 구체예에서, 전술한 변이는 CDR 이외의 영역에서 이루어진다. 즉, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 본원에서 제공하는 서열에 대해 언급된 서열 동일성을 가질 수 있지만, 구체적으로 본원에서 제공하는 서열의 CDR을 보유한다.

또한, 하나 이상의 아미노산은, BTLA 결합제의 맥락에서 폴리펩티드의 기능을 억제하지 않는다면(예를 들어, BTLA가 그 수용체에 결합하는 것을 억제하지 않으면서 상기 폴리펩티드를 포함하는 결합제가 BTLA에 결합하는 것을 방해하지 않는다면), 상기 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 경쇄 폴리펩티드에 삽입될 수 있다. 임의의 수의 임의의 적합한 아미노산이 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 경쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열에 삽입될 수 있다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 아미노산(예: 2 이상, 5 이상 또는 10 이상의 아미노산), 그러나 20개 이하의 아미노산(예: 18 이하, 15 이하 또는 12 이하) 아미노산)은 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 경쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열에 삽입될 수 있다. 다른 구체예에서, 1-10개의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산)이 상기 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 경쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열에 삽입된다. 이와 관련하여, 상기 아미노산(들)은 임의의 적합한 위치에서 전술한 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 경쇄 폴리펩티드 중 어느 하나에 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 아미노산(들)은 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 경쇄 폴리펩티드의 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2 또는 CDR3)에 삽입되고; 다른 구체예에서, 상기 아미노산(들)은 프레임워크 영역에 삽입되고 CDR에는 삽입되지 않으며; 또 다른 구체예에서, 상기 아미노산은 프레임워크 영역 및 CDR 모두에 삽입된다.

본 발명의 분리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 특정 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 제한되지 않으며, BTLA 결합제에 포함될 때 BTLA에 결합하기 위해 본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 또는 경쇄 폴리펩티드 경쟁하는 임의의 중쇄 폴리펩티드 또는 경쇄 폴리펩티드 또한 포함한다. 이러한 관점에서, 예를 들어, 상기 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 또는 경쇄 폴리펩티드는 BTLA 결합제에 포함될 때 본원에 기재된 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드에 의해 인식되는 BTLA의 동일한 에피토프에 결합하는 임의의 중쇄 폴리펩티드 또는 경쇄 폴리펩티드 일 수 있다. 항체 경쟁은 ELISA, 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학 방법을 사용하는 통상적인 펩티드 경쟁 분석법을 사용하여 분석할 수 있다(예: 미국 특허 제4,828,981 및 8,568,992호; 및 Braitbard et al., Proteome Sci., 4: 12(2006) 참조).

상기 BTLA-결합제는 BTLA 단백질에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단백질성 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)이다. 일부 구체예에서, 상기 BTLA-결합제는 방해 없이 BTLA에 결합하거나, 또는 일부 구체예에서, 상기 BTLA-결합제는 BTLA의 이의 수용체에 대한 BTLA-결합을 억제하지 않으면서 BTLA에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 BTLA-결합제는 BTLA-매개 신호전달을 증가시키기 위해 HVEM에 대한 BTLA의 결합을 향상시킨다. BTLA의 이의 수용체에 대한 결합 또는 BTLA-매개 신호전달과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "억제하다"는 결합제의 부재 하에서의 이러한 결합 또는 신호전달과 비교하여 결합제의 존재 하에서의 BTLA의 이의 수용체에 대한 결합 또는 BTLA-HVEM 매개 신호전달을 실질적으로(전체적으로 또는 부분적으로) 길항하고(antagonize), 제지하고(prohibit), 방해하고(prevent), 제한하고(restrain), 늦추고(slow), 저해하고(disrupt), 변경하고(alter), 제거하고(eliminate), 또는 중단하는(stop) 능력을 지칭한다. BTLA의 수용체에 대한 결합 또는 BTLA 매개 신호전달과 관련하여 사용되는 "증가" 또는 "강화"라는 용어는 결합제 부재 하의 결합 또는 신호전달과 비교하여 결합제 존재 하에서의 어떤 방식과 정도에서든 그러한 결합 또는 신호전달을 증가시키거나 강화하는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, BTLA의 이의 수용체에 대한 BTLA-결합 또는 BTLA 매개 신호전달은 BTLA 활성 결핍과 연관된 질환 또는 병태의 임의의 증상을 감소 또는 완화시키거나, BTLA 활성 강화로부터 혜택을 받거나, 또는 그러한 질환 또는 병태의 진행 또는 중증도를 역전시키기에 충분하게 증가된다. 일부 구체예에서, 상기 BTLA-결합제는 BTLA-수용체 결합을 25% 초과로 억제하지 않는다(예를 들어, BTLA-수용체 결합을 10% 초과 또는 5% 초과로 억제하지 않음). 일부 구체예에서, 상기 BTLA-결합제는 상기 BTLA-결합제 부재 시의 BTLA의 활성과 비교하여 적어도 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 또는 상기 값 중 임의의 두 값에 의해 정의되는 범위만큼 BTLA-수용체 결합을 증가시킨다.

상기 BTLA-결합제는 BTLA 및 다른 항원에 결합하는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적(bispecific) 또는 "이중 반응성(dual reactive)") 작제물(예를 들어, 이중특이적 또는 이중 반응성 항체와 같은 다중특이적 항체)의 일부일 수 있다. 이러한 작제물은 본원에 기재된 바와 같은 BTLA에 결합하는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 BTLA 이외의 항원에 결합하는 면역글로불린 유래의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄와 함께 포함할 수 있다. 이러한 이중특이적 BTLA 결합제는 예를 들어 BTLA와 세포독성 T 림프구 항원-4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4, CTLA-4), T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인-3(T Cell Immunoglobulin and Mucin Domain-3, TIM-3), 프로그램된 사멸 1(programmed death 1, PD-1) 및/또는 림프구 활성화 유전자 3 단백질(Lymphocyte Activation Gene 3 protein, LAG-3)과 같은 면역계의 다른 음성 조절 인자와 결합할 수 있다. 그러한 다른 표적 항원에 결합하는 면역글로불린은 당업계에 공지되어 있다.

본원은 항체 접합체(conjugate)를 또한 제공한다. 예를 들어, 상기 BTLA-결합제는(1) 항-BTLA 항체 또는 이의 단편, 및(2) 2차 단백질 또는 비단백질 모이어티의 접합체일 수 있다. 추가 예시로서, 상기 BTLA-결합제는 다른 펩티드, 형광 분자 또는 화학 요법제(chemotherapeutic agent)에 접합된 항-BTLA 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 BTLA-결합제는 "전체(whole)" 면역글로불린 또는 항원-결합 면역글로불린 "단편"일 수 있다. "전체" 면역글로불린은 일반적으로 4개의 폴리펩티드: 2개의 중쇄(H) 폴리펩티드 및 2개의 경쇄(L) 폴리펩티드로 구성된다. 각 중쇄는 하나의 N-말단 가변(V_H) 영역 및 3개의 C-말단 불변(C_H1, C_H2, 및 C_H3) 영역을 함유하고, 각 경쇄는 하나의 N-말단 가변(V_L) 영역 및 하나의 C-말단 불변(C_L) 영역을 함유한다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 두 구별되는 유형인 카파(kappa: k) 또는 람다(lambda: λ) 중 어느 하나로 할당될 수 있다. 일반적인 면역글로불린에서, 각각의 경쇄는 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 두 개의 중쇄는 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 이 구성에서, 경쇄 가변 영역은 일반적으로 중쇄의 가변 영역과 정렬되고, 경쇄 불변 영역은 중쇄의 제 1 불변 영역과 정렬된다. 중쇄의 남은 불변 영역은 일반적으로 서로 정렬된다.

중쇄 및 경쇄의 각 쌍의 가변 영역 또는 초가변(hypervariable) 영역은 항체의 항원 결합 부위를 형성한다. V_H 및 V_L 영역은 동일한 일반 구조를 가지며 각 영역은 4개의 프레임워크(FW 또는 FR) 영역을 포함한다. 상기 용어 "프레임워크 영역(framework region)"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 초가변 또는 상보성 결정 영역(CDR) 사이에 위치한 가변 영역 내의 비교적 보존된 아미노산 서열을 지칭한다. 각 가변 도메인에 4개의 프레임워크 영역이 있고, 이것은 FR1, FR2, FR3 및 FR4으로 지정된다. 상기 프레임워크 영역은 상기 가변 영역의 구조적 프레임워크를 제공하는 β 시트를 형성한다(예를 들어, C.A. Janeway et al.(eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY(2001) 참조). 상기 프레임워크 영역들은 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된다. CDR1, CDR2 및 CDR3으로 알려진 세 개의 CDR은 일반적으로 항원 결합을 담당하는 것으로 여겨지는 항체의 "초가변 영역"을 형성한다.

상기 용어 "항체 단편(antibody fragment)" 및 유사 용어(예: "항체의 단편", "항체 단편", "항체의 기능적 단편(functional fragment of an antibody)"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 의미하는 것으로 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다(일반적으로, Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9): 1126-1129(2005) 참조). 본원 및 당업계에서 통상적으로 사용되는 항체 "단편"은 문자 그대로의 의미에서 전체 항체의 단편 또는 조각뿐만 아니라, 항체 단편 외에 천연 항체에서 발생하지 않는 링커 또는 기타 요소를 포함할 수 있는 기타 공지된 조작된(engineered) 항체 유사 구조물도 포함한다. 항체 단편은, 예를 들어, CDR, 가변 영역(또는 그 일부), 불변 영역(또는 그 일부) 또는 이들의 일부 조합 중 하나 이상(또는 전부)을 포함할 수 있다. 항체 단편의 예로는(i) V_L, V_H, C_L, 및 CH₁ 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편,(ii) 힌지 영역에서 이황화 브릿지(disulfide bridge)로 연결된 두 개의 Fab 단편으로 구성된 2가 단편인 F(ab')₂단편,(iii) 항체 단일 암(arm)의 V_L 및 V_H 도메인으로 구성된 Fv 단편,(iv) 약한 환원 조건을 사용하여 F(ab')₂ 단편의 이황화 브릿지를 절단하여 생성된 Fab' 단편,(v) 이황화-안정화된 Fv 단편(a disulfide-stabilized Fv fragment, dsFv),(vi) 항원에 특이적으로 결합하는 항체 단일 가변 영역 도메인(VH 또는 VL) 폴리펩티드인 도메인 항체(domain antibody, dAb)을 포함하고, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 BTLA-결합제는 또한 단일 사슬(single chain) 항체 단편일 수 있다. 단일 사슬의 예는(i) 두 도메인을 단일 폴리펩티드 사슬(쇄)로 합성될 수 있는 합성 링커에 의해 연결된 Fv 단편의 두 도메인(즉, VL 및 VH)으로 이루어진 1가 분자인 단쇄 Fv(scFv)(예를 들어, Bird et al., Science, 242: 423-426(1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883(1988); 및 Osbourn et al., Nat. Biotechnol., 16: 778(1998) 참조) 및(ii) 폴리펩티드 사슬의 이량체로서, 각 폴리펩티드 사슬은 너무 짧아서 같은 폴리펩티드 사슬에서 VH와 VL 간의 쌍을 이룰 수 없고, 그에 의해 다른 VH -VL 폴리펩티드 사슬에 동일성 도메인들 간의 쌍을 만들어서 두 기능적 항원 결합 부위를 갖는 이량체 분자를 생산하는 펩티드 링커에 의해 VL에 이어진 VH 를 포함한 것인 디아바디(diabody)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 항체 단편들이 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 공개 제2009/0093024호 A1에 더 상세히 기재되어 있다.

일부 구체예에서, 상기 BTLA-결합제는 단편 결정화 (F_c) 영역 또는 이의 부분과 같은 중쇄 불변 영역을 포함한다. Fc 영역은 임의의 Ig 클래스/서브클래스((IgA(IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4), IgM(이의 변이체 포함)일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 BTLA-결합제는 "전체" 또는 "완전한" Ig(즉, 항체)이다. 일부 구체예에서, 상기 BTLA 결합제는 IgG1 또는 IgG4와 같은 IgG Fc 영역을 포함한다. 예를 들어, 상기 BLTA 결합제는 IgG1 또는 IgG4 항체일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 BTLA 결합제는 각각 서열번호 144 및 174의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역, 또는 적어도 이의 CDR(본원에서 제공하는 바와 같거나, 또는 Kabat, Chothia, Martin(Enhanced Chothia), IGMT 또는 AHo 넘버링에 따라 결정된 바와 같은 것), 또는 이와 90% 동일성을 포함하는 서열을 포함하며, 여기서 BTLA 결합제는 IgG1 항체이다. 일부 구체예에서, 상기 BTLA 결합제는 각각 서열번호 144 및 174의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역, 또는 적어도 이의 CDR(본원에서 제공하는 바와 같거나, 또는 Kabat, Chothia, Martin(Enhanced Chothia), IGMT 또는 AHo 넘버링에 따라 결정된바와 같은 것), 또는 이와 90% 동일성을 포함하는 서열을 포함하며, 여기서 BTLA 결합제는 IgG4 항체이다.

상기 BTLA-결합제는 인간 항체, 비인간 항체 또는 키메라 항체(chimeric antibody)일 수 있거나 이로부터 수득될 수 있다. "키메라"는 인간 및 비인간 영역 모두를 포함하는 항체 또는 이의 단편을 의미한다. 바람직하게는, 상기 BTLA-결합제는 인간화 항체이다. "인간화" 항체는 인간 항체 스캐폴드 및 비-인간 항체로부터 얻어지거나 유래된 적어도 하나의 CDR을 포함하는 모노클로날 항체이다. 비인간 항체는 예를 들어 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)와 같은 임의의 비인간 동물로부터 분리된 항체를 포함한다. 인간화 항체는 비인간 항체로부터 얻거나 유래된 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 BTLA-결합제의 CDRH3은 마우스 모노클로날 항체로부터 얻거나 유래된 것인 반면, 본 발명의 BTLA-결합제의 나머지 가변 영역 및 불변 영역은 인간 모노클로날 항체로부터 얻거나 유래된다.

인간 항체, 비인간 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체는 시험관 내 공급원(예: 항체를 재조합적으로 생산하는 하이브리도마 또는 세포주) 및 생체내 공급원(예: 설치류)을 포함하는 임의의 수단으로부터 얻어질 수 있다. 항체를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Kφhler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5: 511-519(1976); Harlow and Lane(eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press(1988); 및 Janeway et al.(eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY(2001)에 기재되어 있다. 특정 구체예에서, 인간 항체 또는 키메라 항체는 하나 이상의 내인성 면역글로불린 유전자가 하나 이상의 인간 면역글로불린 유전자로 대체된 트랜스제닉 동물(예: 마우스)을 사용하여 생성될 수 있다. 내인성 항체 유전자가 인간 항체 유전자로 효과적으로 대체된 트랜스제닉 마우스의 예에는 Medarex HUMAB-MOUSE??, the Kirin TC MOUSE??, 및 the Kyowa Kirin KM-MOUSE??를 포함하고, 이에 제한되는 것은 아니다(예를 들어, Lonberg, Nat. Biotechnol., 23(9): 1117-25(2005), 및 Lonberg, Handb. Exp. Pharmacol., 181: 69-97(2008) 참조). 인간화 항체는 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 인간 항체 스캐폴드에 비인간 CDR을 이식하는 것(예를 들어, Kashmiri et al., Methods, 36(1): 25-34(2005); 및 Hou et al., J. Biochem., 144(1): 115-120(2008) 참조)을 포함하는 방법을 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, An, Z.(ed.), Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey(2009) 참조). 일 구체예에서, 인간화 항체는 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제 2011/0287485호 A1 에 기재된 방법을 사용하여 생산할 수 있다.

상기 BTLA 결합제는 이의 에피토프에 대한 특정 친화도에 의해 제한되지 않는다. 용어 "친화도"는 두 물질의 가역적 결합에 대한 평형 상수를 지칭하며, 해리 상수(K_D)로 표현된다. 그러나, 일부 구체예에서, 상기 BTLA는 약 1 피코몰(pM) 내지 약 100 마이크로몰(mM)(예를 들어, 약 1 피코몰(pM) 내지 약 1 나노몰(nM), 약 1 nM 내지 약 1 마이크로몰(μM), 또는 약 1 μM 내지 약 100 μM)의 BTLA에 대한 친화도를 가질 수 있다. 일 구체예에서, 상기 BTLA-결합제는 1 나노몰 이하(예를 들어, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.1 nM, 0.05 nM, 0.025 nM, 0.01 nM, 0.001 nM 또는 상기 값 중 임의의 두 값으로 정의되는 범위)의 K_D 로 BTLA 단백질에 결합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 BTLA-결합제는 200 pM 이하(예를 들어, 190 pM, 175 pM, 150 pM, 125 pM, 110 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 75 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 또는 상기 값 중 임의의 두 값으로 정의되는 범위)의 K_D 로 BTLA에 결합할 수 있다. 관심 있는 항원 또는 에피토프에 대한 면역글로불린 친화도는 당업계에서 인정되는 임의의 분석법을 사용하여 측정할 수 있다. 이러한 방법에는 예를 들어 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting, FACS), 분리 가능한 비드(예: 자기 비드), 표면 플라즈몬 공명(SPR), 용액상 경쟁(KINEXA™), 항원 패닝(antigen panning), 경쟁적 결합 분석 및/또는 ELISA가 포함된다(예를 들어, Janeway et al.(eds.), Immunobiology, 5th ed., Garland Publishing, New York, NY, 2001 참조). 일부 구체예에서, 상기 BTLA 결합제는 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 측정할 때 상기 기재된 바와 같은 BTLA에 대한 친화도(예를 들어, 1 nM 이하 또는 200 pM 이하)를 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 BTLA 결합제는 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 측정할 때 상기 기재된 바와 같은 BTLA에 대한 친화도(예를 들어, 1 nM 이하 또는 200 pM 이하)를 갖는다.

본원에서 제공하는 BTLA-결합제는 포유동물에서 BTLA 신호전달을 조절(예를 들어, 촉진 또는 향상)하고, 포유동물에서 면역 반응을 조절(예를 들어, 억제)하고/하거나 BTLA 신호전달 결핍과 관련된 질병 또는 병태(예를 들어, BTLA-매개 면역반응과 관련된)를 치료 또는 예방하는 것과 같은 임의의 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 일 양상에서, 본 발명은 본원에 기술된 BTLA-결합제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 BTLA 신호전달을 촉진 또는 강화하는 방법을 제공하며, 이로써 BTLA-결합제는 HVEM에 대한 BTLA의 결합을 촉진 또는 강화하거나 또는 BTLA 신호전달을 촉진 또는 향상시킨다.

포유동물은 BTLA 신호전달 결핍과 관련되거나 BTLA-매개 면역반응과 관련된 질환 또는 병태에 걸린 포유동물일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 면역 억제에 의해 개선되는 질병 또는 병태에 걸린 것일 수 있다. 이러한 질환은 BTL 효능작용(agonism)에 반응하여 포유동물에 대한 BTLA-결합제의 투여가 상기 질환 또는 병태를 치료하거나 예방할 것이다. BTLA 신호전달과 연관되고 BTLA 효능작용에 반응하는 질환, 병태 또는 장애는 BTLA 활성의 증가가 포유동물, 바람직하게는 인간에서 치료적 혜택을 갖거나 또는 BTLA 활성 감소가 질병 또는 장애의 병리학적 효과를 야기하거나 병리학적 효과에 기여하는 임의의 질환 또는 장애일 수 있다. 임의의 이론 또는 작용 메카니즘에 구애됨 없이, BTLA-결합제는 면역억제성 BTLA-HVEM 신호전달을 용이하게 하고, 따라서 면역 반응을 억제하는 것으로 여겨진다.

"면역 반응"은 예를 들어 항체 생성 및/또는 면역 이펙터 세포(예: T-세포)의 활성화, 염증성 사이토카인의 생성, 또는 본원에 기술되거나 당업계에 달리 공지된 임의의 징후 또는 장애를 수반할 수 있다. 본원에서 사용되는 "치료", "치료하는" 등의 용어는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 효과는 치료적이며, 즉, 상기 효과는 질환 및/또는 질환에 기인한 이상 증상을 부분적으로 또는 완전히 치료한다. 이를 위해, 본 발명의 방법은 BTLA-결합제의 "치료적 유효량"을 투여하는 것을 포함한다. "치료적 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하는 데 필요한 용량과 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 치료적으로 유효량은 개인의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중, 개인에게 원하는 반응을 유도하는 BTLA 결합제의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다.

또는 약리학적 및/또는 생리적 효과는 예방적(prophylactic) 효과, 즉 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 효과일 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법은 BTLA-결합제의 "예방적 유효량"을 투여하는 것을 포함한다. "예방적 유효량"은 원하는 예방적 결과(예를 들어, 질병 발병의 예방)를 달성하는데 필요한 용량과 기간동안 효과적인 양을 지칭한다.

상기 BTLA-결합제는 항원에 대한 면역 반응을 억제하고 비정상적이거나 과도한 면역 반응과 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 데 유용하다. 상기 질환 또는 장애는 염증성 또는 자가면역 장애일 수 있다. 염증성 또는 자가 면역 질환의 예로는, 예를 들어, 감염(바이러스성, 박테리아성, 곰팡이성 및 기생충성), 감염과 관련된 내독성 쇼크, 관절염, 류마티스 관절염, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 골반 염증성 질환, 베체트병, 알츠하이머병, 크론병 및 궤양성 대장염을 포함한 염증성 장질환, 페이로니병, 셀리악 병(coeliac disease), 담낭 질환(gallbladder disease), 필로니병(Pilonidal disease), 복막염, 건선, 건선성 관절염, 혈관염, 항호중구 세포질 항체 관련(antineutrophil cytoplasmic antibody-associated, ANCA) 혈관염, 수술 유착, 뇌졸중, 제 1형 당뇨병, 라임병, 관절염, 뇌수막염, 자가면역 포도막염, 다발성 경화증과 같은 중추 및 말초 신경계의 면역 매개 염증성 질환, 루푸스(예를 들어, 전신성 홍반성 루푸스 및 만성 원반성 홍반성 루푸스) 및 길랑-바 증후군, 아토피성 피부염, 다발성 근염, 피부근염, 자가면역성 간염, 섬유화 폐포염, 그레이브스병, IgA 신증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 메니에르병, 천포창, 유사천포창(pemphigoid), 원발성 담즙성 담관염, 간염, 유육종증, 경피증(국소 경피증, 전신 경피증 및 진행성 전신 경피증), 다발성 혈관염을 동반한 육아종증, 기타 자가 면역 질환, 담관염, 췌장염, 외상(수술), 이식편 대 숙주 질환, 이식 거부 반응, 심근경색과 같은 허혈성 질환 및 죽상 동맥 경화증을 포함한 심장 질환, 결절성 동맥 주위염(결절성 다발성 동맥염 및 미세한 다발성 혈관염), 알레르기성 육아종성 혈관염, 과민성 혈관염, 대동맥염 증후군(다카야스 동맥염), 측두동맥염, 혈관 내 응고, 골 흡수, 골다공증, 골관절염, 치주염 및 저염수증, 스틸병, 코간 증후군, RS3PE, 류마티스성 다발성 근육통, 섬유근육통 증후군, 항인지질항체 증후군, 호산구성 근막염, 길랑-바레 증후군, 중증 근무력증, 만성 위축성 위염, 굿패스터 증후군, 빠르게 진행되는 사구체신염, 거대아구성 빈혈, 용혈성 빈혈, 자가 면역 호중구 감소증, 하시모토 갑상선염, 자가 면역 부신 기능 부전, 원발성 갑상선 기능 저하증, 특발성 애디슨병(만성 부신 기능 부전), 임신성 포진, 선형 IgA 수포성 피부 질환, 수포성 표피 박리증, 원형 탈모증, 백반증, 하라다병, 자가 면역 시신경 병증, 특발성 무정자증, 재발성 태아 손실 또는 태아-모체 내성 부족과 관련된 불임을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 질환 또는 장애는 관절염(예를 들어, 류마티스 관절염 또는 TNF 불응성 류마티스 관절염), 거대 세포 동맥염, 류마티스성 다발성 근육통, 원발성 쇼그렌 증후군, 원형 탈모증, 원발성 담즙성 담관염(PBC), 백반증, ANCA 혈관염, 제1형 당뇨병, 비감염성 포도막염 건선, 이식편 대 숙주 질환(GvHD) 또는 염증성 장 질환이다.

본원에서 사용되는 "치료", "치료하는" 등의 용어는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 효과는 치료적이며, 즉, 상기 효과는 질환을 부분적으로 또는 완전히 치료하고/하거나 상기 질환환에 기인한 이상 증상을 어느 정도로든 경감시킨다. 이를 위해, 본 발명의 방법은 BTLA-결합제의 "치료적 유효량"을 투여하는 것을 포함한다. "치료적 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하는 데 필요한 용량과 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 치료적으로 유효량은 개인의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중, 개인에게 원하는 반응을 유도하는 BTLA 결합제의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 BTLA-결합제의 치료적 유효량은 인간에서 BTLA 생체활성을 증가시키는 양이다.

또는 약리학적 및/또는 생리적 효과는 예방적 효과, 즉 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 효과일 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법은 BTLA-결합제의 "예방적 유효량"을 투여하는 것을 포함한다. "예방적 유효량"은 원하는 예방적 결과(예를 들어, 질병 발병의 예방)를 달성하는데 필요한 용량과 기간동안 효과적인 양을 지칭한다.

상기 BTLA-결합제는 포유동물에게 투여하기에 적합한 조성물의 일부일 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 담체, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한(예를 들어, 생리학적으로 허용 가능한) 담체 및 본 발명의 아미노산 서열, 항원- 결합제 또는 벡터를 포함하는 약학적으로 허용 가능한(예를 들어, 생리학적으로 허용 가능한) 조성물이다. 임의의 적합한 담체가 본 발명의 맥락 내에서 사용될 수 있으며, 이러한 담체는 당업계에 잘 알려져 있다. 담체의 선택은 부분적으로 조성물이 투여될 수 있는 특정 부위 및 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 결정될 것이다. 이 조성물은 또한 치료 분자(예: 단백질 또는 항체)의 제형, 특히 비경구 제형에 사용되는 다른 부형제, 예를 들어 버퍼, 강장제(tonicity modifiers), 안정제, 계면활성제 등을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 선택적으로 무균일 수 있다. 조성물은 저장을 위해 동결 또는 동결건조될 수 있고 사용 전에 적합한 멸균 담체에서 재구성될 수 있다. 상기 조성물은 예를 들어 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA(2001)에 기재된 통상적인 기술에 따라 생성될 수 있다.

전형적인 용량은 예를 들어 동물 또는 사람 체중의 1g/kg 내지 20 mg/kg 범위일 수 있지만, 이 예시적인 범위 이하 또는 그 이상의 용량은 본 발명의 범위 내이다. 일일 비경구 용량은 총 체중의 약 0.00001 ㎍/kg 내지 약 20 mg/kg(e.g., 약 0.001 ㎍/kg, 약 0.1 ㎍ /kg , 약 1 ㎍ /kg, 약 5 ㎍/kg, 약 10 ㎍/kg, 약 100 ㎍ /kg, 약 500 ㎍/kg, 약 1 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 또는 상기 값 중 임의의 두 값에 의해 정의되는 범위), 바람직하게는 총 체중의 약 0.1 ㎍/kg 내지 약 10 mg/kg(e.g., 약 0.5 ㎍/kg, 약 1 ㎍/kg, 약 50 ㎍/kg, 약 150 ㎍/kg, 약 300 ㎍/kg, 약 750 ㎍/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 5 mg/kg, 또는 상기 값 중 임의의 두 값에 의해 정의되는 범위), 더욱 바람직하게는 총 체중의 약 1 ㎍/kg 내지 5 mg/kg(e.g., 약 3 ㎍/kg, 약 15 ㎍/kg, 약 75 ㎍/kg, 약 300 ㎍/kg, 약 900 ㎍/kg, 약 2 mg/kg, 약 4 mg/kg, 또는 상기 값 중 임의의 두 값에 의해 정의되는 범위), 및 더욱 더 바람직하게는 일일당 체중의 약 0.5 내지 15 mg/kg(e.g., 약 1 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 9 mg/kg, 약 11 mg/kg, 약 13 mg/kg, 또는 상기 값 중 임의의 두 값에 의해 정의되는 범위)일 수 있다. 치료 또는 예방 효능은 처리된 환자의 주기적인 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 수일 이상에 걸쳐 반복 투여하는 경우, 상태에 따라 원하는 질환 증상의 억제가 발생할 때까지 반복 치료하거나 또는 환자의 평생 동안 치료를 계속할 수 있다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있고 이는 본 발명의 범위 내이다. 원하는 정량(dosage)은 조성물의 단일 볼러스(bolus) 투여, 조성물의 다중 볼러스 투여 또는 조성물의 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.

투여는 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 협측, 설하 또는 좌약 투여를 포함하는 임의의 표준 투여 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 조성물은 바람직하게는 비경구 투여에 적합하다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 및 복강내 투여를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 조성물은 정맥내, 복강내 또는 피하 주사를 통한 말초 전신 전달을 사용하여 포유동물에게 투여된다.

포유동물(예를 들어, 인간)에게 일단 투여되면, 상기 BTLA-결합제의 생물학적 활성은 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법에 의해 측정될 수 있다. 생물학적 활성은 체내에서 BTLA-결합제의 안정성과 상관관계가 있을 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 BTLA-결합제(예를 들어, 항체)는 약 30분 내지 45일(예를 들어, 약 30 분, 약 45 분, 약 1 hour, 약 2 시간, 약 4 시간, 약 6 시간, 약 10 시간, 약 12 시간, 약 1 일, 약 5 일, 약 10 일, 약 15 일, 약 25 일, 약 35 일, 약 40 일, 약 45 일, 또는 상기 값 중 임의의 두 값에 의해 정의되는 범위)의 생체 내 반감기를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 상기 BTLA-결합제는 약 2 시간 내지 20 일(예를 들어, 약 5 시간, 약 10 시간, 약 15 시간, 약 20 시간, 약 2 일, 약 3 일, 약 7 일, 약 12 일, 약 14 일, 약 17 일, 약 19 일, 또는 상기 값 중 임의의 두 값에 의해 정의되는 범위)의 생체 내 반감기를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 상기 BTLA-결합제는 약 10 일 내지 약 40 일(예를 들어, 약 10 일, 약 13 일, 약 16 일, 약 18 일, 약 20 일, 약 23 일, 약 26 일, 약 29 일, 약 30 일, 약 33 일, 약 37 일, 약 38 일, 약 39 일, 약 40 일, 또는 상기 값 중 임의의 두 값에 의해 정의되는 범위)의 생체 내 반감기를 갖는다.

본 발명의 BTLA-결합제는 단독으로 또는 다른 약물과 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 BTLA-결합제는 본원에 개시된 질환의 치료 또는 예방을 위한 다른 약제, 예를 들어 항염증제 또는 면역 억제제와 함께 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들어, 상기 BTLA-결합제는 예를 들어 당업계에 알려진 임의의 항염증제, 글루코코르티코이드, 소분자 면역 억제제, 백신, 생물학적 치료제(예: 기타 모노클로날 항체, 바이러스, 유전자 치료 및 입양 T 세포 전달) 및/또는 수술과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 방법이 감염성 질병을 치료할 때, 상기 BTLA-결합제는 적어도 하나의 항균제 또는 적어도 하나의 항바이러스제와 함께 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 상기 항균제는 당업계에 알려진 임의의 적합한 항생제일 수 있다. 상기 항바이러스제는 특정 바이러스를 특이적으로 표적하는 임의의 적합한 유형의 임의의 백신(예를 들어, 생약독화 백신, 서브유닛 백신, 재조합 벡터 백신) 및 임의의 소분자 항바이러스 치료제(예를 들어, 바이러스 복제 억제제 및 뉴클레오시드 아날로그)일 수 있다.

치료적 용도 이외에, 본원에 기술된 BTLA-결합제는 진단 또는 연구 적용에 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 상기 BTLA-결합제는 BTLA의 부적절한 발현(예를 들어, 과소발현) 또는 감소된 활성이 질환 또는 장애의 병리학적 효과를 유발하거나 이에 기여하는 장애 또는 질병을 진단하는 방법에 사용될 수 있다. 유사한 방식으로, 상기 BTLA-결합제는 BTLA 촉진에 반응하는 질환 또는 장애에 대해 테스트되는 개체에서 BTLA 단백질 수준을 모니터링하기 위한 분석에 사용될 수 있다. 연구 적용은 예를 들어 샘플, 예를 들어 인체 체액 또는 세포 또는 조직 추출물에서 BTLA 단백질을 검출하기 위해 BTLA-결합제 및 표지를 이용하는 방법을 포함한다. 상기 BTLA-결합제는 검출가능한 모이어티를 사용한 공유 또는 비공유 표지와 같은 변형과 함께 또는 변형 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출가능한 모이어티는 방사성동위원소(예: ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, 또는 ¹²⁵I), 형광 또는 화학발광 화합물(예: 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린), 효소(예: 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 홀스래디시 과산화효소) 또는 보결 원자단(prosthetic group)일 수 있디. 항원-결합제(예: 항체)를 검출 가능한 모이티어에 개별적으로 접합시키는 당업자에게 알려진 임의의 방법이 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다(예를 들어, Hunter et al., Nature, 194: 495-496(1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014-1021(1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40: 219-230(1981); 및 Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412(1982) 참조).

BTLA 단백질 수준은 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법에 의해 본원에서 제공하는 BTLA-결합제를 사용하여 측정할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 방사면역측정법(radioimmunoassay, RIA) 및 FACS를 포함한다. BTLA의 정상 또는 표준 발현 값은 항원-항체 복합체를 형성하기에 적합한 조건 하에서 BTLA를 포함하거나 포함될 것으로 의심되는 샘플을 BTLA 특이적 항체와 결합하는 등 임의의 적절한 기술을 사용하여 수립할 수 있다. 항체는 결합 또는 비결합 항체의 검출을 용이하게 하기 위해 검출 가능한 물질로 직접 또는 간접적으로 표지되어 있다. 적합한 검출가능한 물질은 다양한 효소, 보결원자단, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다(예를 들어, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc.(1987) 참조). 그런 다음 샘플에서 발현된 BTLA 폴리펩티드의 양을 표준 값과 비교한다.

임의의 특정 이론 또는 작용 메커니즘에 구애됨 없이, 본원에 기재된 바와 같이 BTLA 결합제를 투여하면 BTLA가 발현되는 세포 중 적어도 일부에서 BTLA가 발산(shed)되고, 그 결과 BTLA 결합제가 투여되는 개체의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직(예: 피부 조직)에 존재하는 용해성 BTLA(sBTLA)가 증가하는 것으로 여겨진다. 따라서, 본원에서는 개체에서 BTLA 결합제의 약리 활성을 검출, 측정 또는 모니터링하는 방법(예를 들어, 시험관 내 방법)을 제공하며, 이 방법은 BTLA 결합제가 투여된 개체의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직(예컨대, 피부 조직)의 샘플에서 가용성 BTLA(sBTLA)를 검출하는 것을 포함한다. 또한 본원에서는 환자의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직(예컨대, 피부 조직) 샘플에서 sBTLA를 검출 또는 측정(예컨대, 시험관 내)하여 BTLA 결합제 치료 대상 환자를 선정하는 방법을 제공하며, 여기서 환자는 동일한 유형의 정상적이고 질병이 없는 개체와 비교하여 sBTLA 수준이 증가하면 치료를 위해 선택된다. 상기 sBTLA는 검출될 수 있고, 선택적으로 당업계에 알려진 임의의 여러 기술을 사용하여 정량화될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 sBTLA는 개체의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플을 본원에서 제공하는 BTLA 결합제와 접촉시킴으로써 검출된다(예를 들어, 시험관내). 일부 구체예에서, 상기 개체의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플에서 검출된 sBTLA는 BTLA 결합제(예를 들어, 이전에 투여된 BTLA 결합제)에 결합된다.

일부 구체예에서, 개체에게 투여되어 개체에서 BTLA의 발산(shedding)을 유도하는 BTLA 결합제는 BTLA의 HVEM에 대한 결합을 억제하지 않는 BTLA 결합제이다. 상기 BTLA 결합제는 본원에 기재된 임의의 BTLA 결합제와 같은 임의의 BTLA 결합제일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 BTLA 결합제는 서열번호 1-15, 207, 208, 217 또는 218 중 어느 하나의 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 또는 적어도 이의 CDR, 또는 이와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열번호 16-25, 209, 210, 219, 또는 220 중 어느 하나의 면역글로불린 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 이의 CDR; 또는 이와 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 BTLA 결합제는 서열번호 27, 30, 32, 36, 39 및 41로 표시되는 CDR을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 BTLA 결합제는 서열번호 43-156 중 어느 하나의 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 또는 적어도 이의 CDR, 또는 이와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열번호 157-192 중 어느 하나의 면역글로불린 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 이의 CDR; 또는 이와 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 BTLA 결합제는 서열번호 195-200로 표시되는 CDR을 포함할 수 있고; 예를 들어, 서열번호 201-206을 포함하는 CDR을 포함하는 BTLA 결합제, 또는 각각 서열번호 193 및 194 또는 서열번호 144 및 147의 Ig 중쇄 및 경쇄, 또는 적어도 이의 CDR, 또는 서열번호 193 및 194 또는 서열번호 144 및 147와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 Ig 중쇄 및 경쇄를 포함하는 BTLA 결합제일 수 있다.

일부 구체예에서, BTLA가 투여된 개체의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직(예를 들어, 피부 조직) 내의 sBTLA는 sBTLA에 결합하는 캡처(capture) 항체를 사용하여 검출된다. 상기 캐버 항체는 BTLA에 결합하는 모든 항체일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 캡처 항체는 본원에서 제공하는 BTLA 항체이다. 상기 캡처 항체는 개체에게 투여되는 BTLA 결합제와 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 sBTLA 캡처 항체는 개체에게 투여되는 BTLA 결합제와 상이하다. 일부 구체예에서, 상기 캡처 항체는 서열번호 1-15, 207, 208, 217 또는 218 중 어느 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 적어도 이의 CDR, 또는 이와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열번호 16-25, 209, 210, 219, 또는 220 중 어느 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 이의 CDR, 또는 이와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 본원에 기재된 다른 특징 중 일부 또는 전부를 가질 수 있다. 추가 구체예에서, 상기 캡처 항체는 서열번호 27, 30 및 32로 표시되는 중쇄 CDR 1-3; 및 서열번호 36, 39 및 41로 표시되는 경쇄 CDR 1-3; 또는 본원에 제공된 보다 구체적으로 언급된 CDR 중 임의의 CDR을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 캡처 항체는 서열번호 26(예를 들어, 서열번호 1-15, 207, 208, 217 또는 218 중 어느 하나)의 Ig 중쇄 및 서열번호 35(예를 들어, 서열번호 16-25, 209, 210, 219, 또는 220 중 어느 하나)의 Ig 경쇄를 포함할 수 있다. 선택적으로, 이러한 구체예와 조합하여, 개체에게 투여되는 BTLA 결합제는 서열번호 43-156 중 어느 하나, 또는 적어도 이의 CDR; 또는 이와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 157-192 중 어느 하나, 또는 적어도 이의 CDR; 또는 이와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고; 본원에 기재된 다른 특징 중 일부 또는 전부를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 BTLA 결합제는 서열번호 195-200로 표시되는 CDR을 포함할 수 있고; 예를 들어, 서열번호 201-206을 포함하는 CDR을 포함하거나, 또는 서열번호 193 및 194 또는 서열번호 144 및 147의 Ig 중쇄 및 경쇄를 포함하는 BTLA 결합제일 수 있다.

임의의 특정 이론 또는 작용 메카니즘에 구애됨 없이, 본원에 기재된 바와 같이 HVEM에 대한 BTLA의 결합을 억제하지 않는 BTLA(또는 sBTLA)의 항체에 대한 결합은 캡처 항체의 sBTLA에 대한 결합을 향상시키는 것으로 여겨진다. 따라서, 본원에서는 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직(예컨대, 피부 조직)에서 sBTLA를 검출 및/또는 정량화하는 분석법도 제공하며, 이 분석법은 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직(예컨대, 피부 조직) 샘플을 캡처 항체 및 BTLA와 HVEM의 결합을 억제하지 않는 BTLA 결합제와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, BTLA의 HVEM에 대한 결합을 억제하지 않는 BTLA 결합제는 서열번호 43-156 중 어느 하나의 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 또는 적어도 이의 CDR; 또는 이와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열번호 157-192 중 어느 하나의 면역글로불린 경쇄 가변 영역의 면역글로불린 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 이의 CDR; 또는 이와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 본원에 기재된 다른 특징 중 일부 또는 전부를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 BTLA 결합제는 서열번호 195-200로 표시되는 CDR을 포함할 수 있고; 예를 들어, 서열번호 201-206을 포함하는 CDR을 포함하거나, 또는 서열번호 193 및 194 또는 서열번호 144 및 147의 Ig 중쇄 및 경쇄를 포함하는 BTLA 결합제일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 캡처 항체는 서열번호 1-15, 207, 208, 217 또는 218 중 어느 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 적어도 이의 CDR, 또는 이와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열번호 16-25, 209, 210, 219, 또는 220 중 어느 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 이의 CDR, 또는 이와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 본원에 기재된 다른 특징 중 일부 또는 전부를 가질 수 있다. 에를 들어, 상기 캡처 항체는 서열번호 27, 30 및 32로 표시되는 중쇄 CDR 1-3; 및 서열번호 36, 39 및 41로 표시되는 경쇄 CDR 1-3; 또는 본원에서 제공하는 보다 구체적으로 언급된 CDR 중 임의의 CDR을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 캡처 항체는 서열번호 26(예를 들어, 서열번호 1-15, 207, 208, 217 또는 218 중 어느 하나)의 Ig 중쇄 및 서열번호 35(예를 들어, 서열번호 16-25, 209, 210, 219, 또는 220 중 어느 하나)의 Ig 경쇄를 포함할 수 있다.

전술한 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직에서 sBTLA를 검출, 측정 또는 얻는(qualifying) 방법의 일부 구체예에서, 상기 방법은 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플에서 sBTLA의 농도를 기준 sBTLA 농도와 비교하는 것을 더 포함할 수 있다. 임의의 적절한 표준 농도가 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 표준 sBTLA 농도는 BTLA 결합제의 투여 전 동일한 환자 또는 개체로부터의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플 중 sBTLA의 농도이다. 대안적으로, 또는 추가로, 상기 기준 sBTLA 농도는 다른 개체, 예를 들어 BTLA 결합제 투여를 받지 않은 동일한 유형의 정상, 질환이 없는 개체의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직에 있는 sBTLA 농도 또는 그러한 개체 집단의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직에 있는 sBTLA 농도의 통계적 분석에 의해 수립된 표준 sBTLA 농도(예를 들어, BTLA 결합제 치료를 받지 않은 정상적이고 질환이 없는 개체 집단의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플에서 sBTLA의 평균 농도)일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 기준 sBTLA 농도는 개체의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플 또는 개체 집단으로부터의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플을 전술한 바와 같이 캡처 항체와 접촉시키는 단계; 선택적으로, 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플을 본원에 기재된 바와 같이 HVEM에 대한 BTLA 결합을 억제하지 않는 BTLA 결합제와 동시 또는 순차적으로 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수립된다.

다른 구체예에서, 상기 방법은 BTLA 결합제가 투여된 개체의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 내 sBTLA의 농도를 개체에게 BTLA 결합제가 투여되기 전 또는 후의 다른 시점에 동일한 개체의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플 내 sBTLA의 농도와 비교하는 단계를 포함한다. 예를 들어, BTLA 결합제 투여 후 두 개 이상의 시점에 sBTLA 농도를 측정하고 비교하여 시간 경과에 따른 BTLA 결합제의 효과를 평가할 수 있으며, 선택적으로 하나 이상의 BTLA 결합제 추가 중간 투여를 포함할 수 있다. 이러한 방식으로 BTLA 결합제로의 치료를 모니터링할 수 있다.

또한, 본원에서는 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직에서 sBTLA를 검출, 측정 또는 모니터링하는 전술한 방법에 유용한 BTLA의 HVEM에 대한 결합을 억제하지 않는 BTLA 결합제 및 sBTLA에 결합하는 제2 캡처 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, BTLA의 HVEM에 대한 결합을 억제하지 않는 BTLA 결합제는 서열번호 43-156 중 어느 하나의 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 또는 적어도 이의 CDR; 또는 이와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열번호 157-192 중 어느 하나의 면역글로불린 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 이의 CDR; 또는 이와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 본원에 기재된 다른 특징 중 일부 또는 전부를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 BTLA 결합제는 서열번호 195-200로 표시되는 CDR을 포함할 수 있고; 예를 들어, 서열번호 201-206을 포함하는 CDR을 포함하거나, 또는 서열번호 193 및 194 또는 서열번호 144 및 147의 Ig 중쇄 및 경쇄를 포함하는 BTLA 결합제일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 캡처 항체는 서열번호 1-15, 207, 208, 217 또는 218 중 어느 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 적어도 이의 CDR, 또는 이와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열번호 16-25, 209, 210, 219, 또는 220 중 어느 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 이의 CDR, 또는 이와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 본원에 기재된 다른 특징 중 일부 또는 전부를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 캡처 항체는 서열번호 27, 30 및 32로 표시되는 중쇄 CDR 1-3; 및 서열번호 36, 39 및 41로 표시되는 경쇄 CDR 1-3; 또는 본원에서 제공하는 보다 구체적으로 언급된 CDR 중 임의의 CDR을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 캡처 항체는 서열번호 26(예를 들어, 서열번호 1-15, 207, 208, 217 또는 218 중 어느 하나)의 Ig 중쇄 및 서열번호 35(예를 들어, 서열번호 16-25, 209, 210, 219, 또는 220 중 어느 하나)의 Ig 경쇄를 포함할 수 있다.

상기 BTLA-결합제, 캡처 항체 또는 조성물을 키트, 즉 진단 분석 수행 지침과 함께 미리 정해진 양의 시약의 포장된 조합으로 제공할 수 있다. BTLA-결합제가 효소로 표지된 경우, 상기 키트는 바람직하게는 효소에 의해 요구되는 기질 및 보조인자(예를 들어, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함한다. 또한, 안정화제, 버퍼(예: 차단 버퍼 또는 용해 버퍼) 등과 같은 기타 첨가제가 키트에 포함될 수 있다. 분석의 민감도를 실질적으로 최적화하는 시약 용액의 농도를 제공하기 위해 다양한 시약의 상대적인 양은 다를 수 있다. 시약은 용해시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 부형제를 포함하는 건조 분말(일반적으로 동결 건조됨)로 제공할 수 있다.

핵산

본 발명은 또한 본원에서 제공하는 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 및 BTLA 결합제를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 제공한다.

상기 용어 "핵산 서열(nucleic acid sequence)"은 DNA 또는 RNA의 중합체 즉, 폴리뉴클레오티드를 포괄하는 것으로 의도되고, 이것은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고 비-천연 또는 변경된(altered) 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 본원에서 사용되는 상기 용어 "핵산(nucleic acid)" 및 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체의 형태이고, 리보뉴클레오티드(RNA) 또는 데옥시뉴클레오티드(DNA) 중 어느 하나를 지칭한다. 이 용어들은 상기 분자의 1차 구조를 말하고, 따라서 이중- 및 단일-가닥 DNA, 및 이중- 및 단일-가닥 RNA를 포함한다. 상기 용어는 균등물로서 뉴클레오티드 유사체로부터 만들어진 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체, 및 예컨대 메틸화된 및/또는 캡핑된(capped) 폴리뉴클레오티드이지만 이에 제한되는 것은 아닌 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 핵산은 일반적으로 인산 결합을 통해 연결되어 핵산 서열 또는 폴리뉴클레오티드를 형성하지만, 많은 다른 결합들이 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포스페이트(boranophosphate), 기타 등).

면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 또는 BTLA-결합제를 코딩하는 핵산은 벡터의 일부일 수 있다. 상기 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 에피솜(episome), 코스미드, 바이러스성 벡터(예를 들어, 레트로바이러스성 또는 아데노바이러스성), 또는 파지(phage)일 수 있다. 적절한 벡터 및 벡터 제작 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001), 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates 및 John Wiley & Sons, New York, N.Y.(1994) 참조).

상기 벡터는 일반적으로 숙주 세포 내에서 코딩 서열의 발현을 위해 제공되는 발현 제어 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결자, 신포 펩티드(예: 오스테오넥틴(osteonectin) 신호 펩티드), 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry sites: IRES) 등을 포함한다. 예시적인 발현 조절 서열은 당업계에 알려져 있으며 예를 들어, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990)에 기재되어 있다.

항시성(constitutive), 유도성(inducible) 및 억제성(repressible) 프로모터를 포함하는, 다양한 상이한 공급원(source)으로부터의 다수의 프로모터가 당업계에 잘 알려져 있다. 프로모터의 대표적인 공급원은 예를 들어, 바이러스, 포유동물, 곤충, 식물, 효모 및 세균을 포함하고, 이 공급원 유래 적합한 프로모터는 쉽게 입수가능하거나, 또는 예를 들어, 다른 상업적 또는 개인적 공급원 뿐만 아니라 ATCC와 같은 기탁기관으로부터 공개적으로 입수가능한 서열에 기초하여 합성적으로 제작할 수 있다. 프로모터는 단일방향성(즉, 한 방향으로 전사를 개시함) 또는 양-방향성(즉, 3' 또는 5' 방향 중 어느 하나에서 전사를 개시함)일 수 있다. 프로모터의 비제한적 예는 예를 들어, T7 박테리아 발현 시스템, pBAD(araA) 박테리아 발현 시스템, 세포거대바이러스(cytomegalovirus: CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터는 예를 들어, Tet 시스템(미국 특허 제5,464,758호 및 제5,814,618호), 엑디손(Ecdysone) 유도성 시스템(No et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 3346-3351(1996)), T-REX™ 시스템(Invitrogen, Carlsbad, CA), LACSWITCH™ 시스템(Stratagene, San Diego, CA), 및 Cre-ERT 타모목시펜(tamoxifen) 유도성 재조합효소 시스템(Indra et al., Nuc. Acid. Res., 27: 4324-4327(1999); Nuc. Acid. Res., 28: e99(2000); 미국 특허 제7,112,715호; 및 Kramer & Fussenegger, Methods Mol. Biol., 308: 123-144(2005)을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "인핸서(enhancer)"는 예를 들어, 이것이 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 증가시키는 DNA 서열을 말한다. 인핸서는 상기 핵산 서열의 코딩 영역으로부터 수 킬로베이스 떨어져 위치할 수 있고 조절 인자의 결합, DNA 메틸화의 패턴, 또는 DNA 구조 변화를 매개할 수 있다. 다양한 상이한 공급원으로부터의 다수의 인핸서가 당업계에 잘 알려져 있고 클로닝된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 다른 상업적 또는 개인적 공급원 뿐만 아니라 ATCC와 같은 기탁기관 유래)로서 또는 이내에서 입수가능하다. 프로모터(예컨대 흔히-이용되는 CMV 프로모터)를 포함하는 여러 폴리뉴클레오티드가 또한 인핸서 서열을 포함한다. 인핸서는 코딩 서열의 상류, 안에, 또는 하류에 위치할 수 있다.

상기 벡터는 또한 "선별가능한 마커 유전자(selectable marker gene)"를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "선별가능한 마커 유전자"는 핵산 서열을 발현하는 세포가 상응하는 선택적 작용제(selective agent)의 존재 하에 특이적으로 선택되거나 선택되지 않도록 하는 핵산 서열을 지칭한다. 적합한 선별가능한 마커 유전자는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 International Patent Application Publications WO 1992/008796 및 WO 1994/028143; Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567-3570(1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527-1531(1981); Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072-2076(1981); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150: 1-14(1981); Santerre et al., Gene, 30: 147-156(1984); Kent et al., Science, 237: 901-903(1987); Wigler et al., Cell, 11: 223-232(1977); Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026-2034(1962); Lowy et al., Cell, 22: 817-823(1980); 및 미국 특허 제5,122,464호 및 제5,770,359호에 기재되어 있다.

일부 구체예에서, 상기 벡터는 "에피솜 발현 벡터(episomal expression vector)" 또는 "에피솜(episome)"이고, 이것은 숙주 세포에서 복제 가능하고, 적절한 선별 압력의 존재에서 숙주 세포 내에서 DNA의 염색체외 분절로서 지속된다(예를 들어, Conese et al., Gene Therapy, 11: 1735-1742(2004) 참조). 대표적인 상업적으로 입수가능한 에피솜 발현 벡터는 엡스테인 바 핵 항원 1(Epstein Barr Nuclear Antigen 1: EBNA1) 및 엡스테인 바 바이러스(Epstein Barr Virus: EBV) 복제 기점(origin of replication: oriP)을 이용하는 에피솜 플라스미드를 포함하고, 이에 제한되는 것은 아니다. Invitrogen 사(Carlsbad, CA)의 벡터 pREP4, pCEP4, pREP7 및pcDNA3.1, 및 Stratagene 사(La Jolla, CA)의 pBK-CMV는 EBNA1 및 oriP 대신에 T-항원 및 SV40 복제기점을 이용하는 에피솜 벡터의 비제한적인 예를 나타낸다.

다른 적합한 벡터는 통합성(integrating) 발현 벡터를 포함하고, 이는 숙주 세포의 DNA로 무작위적으로 통합되거나, 또는 상기 발현 벡터와 숙주 세포의 염색체 간의 특이적 재조합을 가능하게 하는 재조합 부위를 포함할 수 있다. 이러한 통합성 발현 벡터는 숙주 세포의 염색체의 내인성 발현 조절 서열을 이용하여 원하는 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 부위 특이적 방식으로 통합하는 벡터의 예는 예를 들어, Invitrogen 사(Carlsbad, CA)의 flp-in 시스템(예: pcDNA™5/FRT), 또는 예컨대 Stratagene 사(La Jolla, CA)의 pExchange-6 코어 벡터에서 발견될 수 있는 것과 같은 cre-lox 시스템의 구성요소를 포함한다. 숙주 세포 염색체에 무작위적으로 통합하는 벡터의 예는 예를 들어, Life Technologies 사(Carlsbad, CA)의 pcDNA3.1(T-항원의 부재시 도입되는 경우), Millipore 사(Billerica, MA)의 UCOE, 및 Promega 사(Madison, WI)의 pCI 또는 pFN10A(ACT) FLEXI™을 포함한다.

바이러스성 벡터가 또한 사용될 수 있다. 대표적인 상업적으로 입수가능한 바이러스성 발현 벡터는 Crucell, Inc.(Leiden, 네덜란드)로부터 입수가능한 아데노바이러스-기반 Per.C6 시스템, Invitrogen 사(Carlsbad, CA)의 렌티바이러스성-기반 pLP1, 및 Stratagene 사(La Jolla, CA)의 레트로바이러스성 벡터 pFB-ERV 플러스 pCFB-EGSH를 포함하고, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열들은 같은 벡터에서(즉, 시스(cis)로) 세포에 제공될 수 있다. 단일방향성 프로모터가 각 핵산 서열의 발현을 조절하는데 이용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 양방향성 및단일방향성 프로모터의 조합이 다중의 핵산 서열의 발현을 조절하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열은 대안적으로 별개의 벡터에서(즉, 트랜스(trans)로) 세포의 군집에 제공될 수 있다. 별개의 벡터의 각각 중 각각의 핵산 서열은 같거나 또는 다른 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 별개의 벡터는 동시에 또는 순차로 세포에 제공될 수 있다.

본 발명의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)을 포함하는 벡터(들)은 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 적절한 원핵 또는 진핵 세포를 포함하는 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 분리된 세포를 제공한다. 바람직한 숙주 세포는 쉽고 신뢰할 수 있게 성장할 수 있고, 합리적으로 빠른 성장률을 가지며, 잘 특성화된 발현 시스템을 갖고, 및 쉽고 효율적으로 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 것이다.

적절한 원핵 세포의 예는 바실러스(Bacillus)(예를 들어, 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 브레비스(Bacillus brevis)), 에스케리치아(Escherichia)(예를 들어, E. coli), 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토미세스(Streptomyces), 살모넬라(Salmonella), 및 에르위니아(Erwinia) 속(genera) 유래 세포를 포함하하고, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히 유용한 원핵 세포는 다양한 스트레인(strain)의 Escherichia coli(예를 들어, K12, HB101(ATCC 번호 33694), DH5α, DH10, MC1061(ATCC 번호 53338), 및 CC102)을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 벡터는 진핵 세포로 도입된다. 적절한 진핵 세포는 당업계에 알려져 있고 예를 들어, 효모 세포, 곤충 세포, 및 포유동물 세포를 포함한다. 적절한 효모 세포의 예는 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 피치아(Pichia), 리노-스포리디움(Rhino-sporidium), 사카로미세스(Saccharomyces) 및 스키조사카로미세스(Schizosaccharomyces) 속(genera) 유래를 포함한다. 바람직한 효모 세포는 예를 들어, 사카로미세스 세레비사에(Saccharomyces cerivisae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다.

적절한 곤충 세포는 예를 들어, Kitts et al., Biotechniques, 14: 810-817(1993); Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol., 4: 564-572(1993); 및 Lucklow et al., J. Virol., 67: 4566-4579(1993)에 기재되어 있다. 바람직한 곤충 세포는 Sf-9 및 HI5(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 포함한다.

일부 구체예에서, 포유동물 세포는 본 발명에 이용된다. 여러 적합한 포유동물 숙주 세포는 당업계에 알려져 있고, 다수가 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)로부터 입수가능하다. 적합한 포유동물 세포의 예로는 중국 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary: CHO)(예: CHO-K1 세포, ATCC 번호 CCL61), CHO DHFR-세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 4216-4220(1980)), 인간 배아 신장(human embryonic kidney, HEK) 293 또는 293T 세포(ATCC 번호 CRL1573), 및 3T3 세포(ATCC 번호 CCL92)를 포함하고, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 적합한 포유동물 세포주는 원숭이 COS-1(ATCC 번호 CRL1650) 및 COS-7 세포주(ATCC 번호 CRL1651), 뿐만 아니라 CV-1 세포주(ATCC 번호 CCL70)이다. 추가 예시적인 포유동물 숙주 세포는 형질전환된 세포주를 포함하는, 영장류 세포주 및 설치류 세포주를 포함한다. 정상 이배체(diploid) 세포, 1차 조직의 시험관 내 배양으로부터 유래된 세포 스트레인, 뿐만 아니라 1차 조직절편(explant) 또한 적합하다. 다른 적합한 포유동물 세포주는 마우스 신경아세포종 N2A 세포, HeLa, 마우스 L-929 세포, 및 BHK 또는 HaK 햄스터 세포주를 포함하고, 이에 제한되는 것은 아니며, 이들 모두는 ATCC로부터 입수가능하다. 적합한 포유동물 숙주 세포를 선별하는 방법 및 세포의 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 정제 방법은 당업계에 알려져있다.

일 구체예에서, 상기 포유동물 세포는 인간 세포이다. 예를 들어, 상기 포유동물 세포는 인간 림프성 또는 림프성 유래 세포주, 예를 들어 전(pre)-B 림프구 기원의 세포주일 수 있다. 인간 림프성 세포주의 예는 RAMOS(CRL-1596), Daudi(CCL-213), EB-3(CCL-85), DT40(CRL-2111), 18-81(Jack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 1581-1585(1988)), Raji 세포(CCL-86), PER.C6 세포(Crucell Holland B.V., Leiden, The Netherlands), 및 이의 유도체를 포함하고, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 "형질감염(transfection)", "형질전환(transformation)", 또는 "형질유도(transduction)"에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 본원에 사용되는 "형질감염", "형질전환", 또는 "형질유도"는 물리적 또는 화학적 방법을 이용함으로써 숙주 세포 내로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드의 도입을 지칭한다. 많은 적합한 기법이 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 칼슘 인산염 DNA 공-침전(예를 들어Murray E.J.(ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press(1991) 참조); DEAE-덱스트란; 전기천공법; 양이온성 리포좀-매개 형질감염; 텅스텐 입자-촉진된 미세입자 충격(microparticle bombardment)(Johnston, Nature, 346: 776-777(1990)); 및 스트론튬 인산염 DNA 공-침전(Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034(1987))을 포함한다. 파지 또는 바이러스성 벡터는 적합한 패키징 세포에서 감염성 입자의 성장 후, 숙주 세포로 도입될 수 있고, 이들 중 다수가 상업적으로 입수가능하다.

상기 핵산 및 세포는 본원에 기재된 BTLA-결합제의 제조와 같은 임의의 목적을 위해 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 BTLA-결합제의 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 것을 포함하는 BTLA-결합제의 제조 방법을 제공한다. 다르게 표현하면, 상기 방법은 세포(예를 들어, CHO 및 CHO-K1 세포를 포함하여 본원에서 논의되는 임의의 세포주와 같은 시험관 내 세포)에서 BTLA 결합제의 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산을 발현하는 것을 포함한다. 상기 면역글로불린 중쇄 및 경쇄는 주어진 세포에서 단일 핵산으로부터 발현될 수 있가니, 또는 상기 면역글로불린 중쇄 및 경쇄는 동일한 세포에서 별도의 핵산으로부터 발현될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 상기 방법은 공지된 기술을 사용하여 세포 또는 세포 배양 배지로부터 BTLA 결합제를 수확 및/또는 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

다음의 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하되, 물론 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예

표 2는 서열번호 1-15의 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16-25의 경쇄 가변 영역을 포함하는 BTLA 결합제(예: 항체 또는 항체 단편)의 실시예를 제공한다.

[표 2]

표 2의 항체 또는 항체 단편의 경우, Kabat 넘버링된 CDR은 다음과 같다: CDRH1은 각 VH 서열의 31-35번 위치; CDRH2는 각 VH 서열의 50-66번 위치; CDRH3은 각 VH 서열의 99-106번 위치; CDRL1은 각 VL 서열의 24-34번 위치; CDRL2는 각 VL 서열의 50-56번 위치; CDRL3은 각 VL 서열의 89-97번 위치에 위치한다. 표 2에 제시되는 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 이들의 CDR의 쌍을 갖는 BTLA 결합제는 본 개시의 특정 구체예를 제공한다. 표 2의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 또는 적어도 이들의 CDR의 추가 쌍은 또 다른 BTLA 결합제를 제공할 수 있으며, 이는 본 개시의 범위 내인 것으로 고려된다.

표 3은 서열번호 43-156 의 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열번호 157-192의 경쇄 가변 영역을 포함하는 BTLA 결합제(예: 항체 또는 항체 단편)의 실시예를 제공한다.

[표 3]

표 3의 항체 또는 항체 단편에서 Kabat 넘버링된 CDR 영역은 다음과 같다: CDRH1은 각 VH 서열의 위치 31-35에 위치하고, CDRH2는 각 VH 서열의 위치 50-66에 위치하되, *로 표시된 항체는 제외하며, 이 경우 CDRH2는 각 VH 서열의 위치 50-67에 위치하고; CDRH3는 각 VH 서열의 99-113 위치에 위치하되, †로 표시된 항체는 제외하며, 이 경우 CDRH3는 100-114 위치에 위치하고, CDRL1은 각 VL 서열의 24-34 위치에 위치하고, CDRL2는 각 VL 서열의 50-56 위치에 위치하고; CDRL3는 각 VL 서열의 89-97 위치에 위치한다. 표 3에 제시되는 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 이들의 CDR의 쌍을 갖는 BTLA 결합제는 본 개시의 특정 구체예를 제공한다. 표 3의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 또는 적어도 이들의 CDR의 추가 쌍은 또 다른 BTLA 결합제를 제공할 수 있으며, 이는 본 개시의 범위 내인 것으로 고려된다.

하기 실시예에서 참조되는 항체는 다음과 같다.

실시예 1

항체 6G3은 BTLA 면역된 마우스의 비장 세포에서 표준 융합 기법으로 생성된 마우스 하이브리도마로부터 유래되었다. 상기 항체는 본원에 기재된 표준 기법을 사용하여 인간화되었다. 최종적으로 최적화된 항체는 표 1에 요약된 벡터를 사용하여 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되었다.

[표 1.]

실시예 2

본 실시예는 본원에 개시된 6G3 항 BTLA 항체가 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정되는 바와 같이 K_D~5nM의 인간 BTLA에 대한 결합 친화도 및 K_D~11nM의 시노몰구스 원숭이 BTLA에 대해 결합 친화도를 가짐을 보여준다.

표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석은 Biacore T200(GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 수행하였다. 동역학 상수(Kinetic constant) 는 Biacore T200 Evaluation Software의 1:1 결합 모델을 사용하여 온- 및 오프- 비율(각각 k_a 및 k_d) 및 전체 친화도의 척도로서 해리 상수(K_D)를 계산하여 결정되었다. 항-인간 IgG(GE Healthcare Life Sciences)는 EDC 활성화 아민 커플링 화학을 사용하여 CM5 칩에 고정시켰다(10μl/분의 유속에서 420초 접촉). 10μl/분의 유속으로 플로우 셀과 60초 동안 접촉시켜 항체(APE10585.04 6G3 IgG1 및 APE10840.05 6G3 IgG4, 각각 0.5μg/ml)를 캡처하였다. 60 nM, 20 nM, 6.7 nM 및 2.2 nM 농도의 단량체 인간 BTLA-his 또는 시노몰구스 원숭이 BTLA-his를 포집된 항체 위에 흐르게 했다(480초 결합, 1800초 해리). 25°C에서 실행했으며 이동상 및 모든 희석액에 10 mM HEPES, pH 7.6, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% polysorbate 20(HBS-EP+, pH 7.6; Teknova) 을 함유하는 버퍼를 사용하였다. 각 사이클이 끝날 때, 결합된 항원을 3 M MgCl2(30 μl/분)에 두 번 연속 노출(60초 및 90초)하여 재생함으로써 제거했다. 실험에 상응하는 센서그램(Sensorgram) 및 결합 상수는 도 1(인간 BTLA) 및 도 1(시노몰구스 원숭이 BTLA)에 나타내었다. 공명 단위(resonance unit, RU)의 항체 캡처 수준은 각 패널의 오른쪽에 나열하였다.

실시예 3

본 실시예는 본원에 개시된 6G3 항 BTLA 항체가 동역학 배제 분석에 의해 결정되는 바와 같이 K_D~410 pM 의 인간 BTLA에 대한 결합 친화도 및 K_D~1.66 nM의 시노몰구스 원숭이 BTLA에 대해 결합 친화도를 가짐을 보여준다.

BTLA에 결합하는 6G3 IgG4(APE10840.04(H 사슬 서열번호 144, L 사슬 서열번호 174))의 용액- 기반 친화도 측정은 KinExA 3000(Sapidyne Instruments)에서 결정되었다. 아즈락톤(Azlactone) 비드(ThermoFisher Scientific)를 50mM Na₂CO₃에서2시간 동안 실온에서 인간 BTLA ECD-his(30μg/ml) 또는 시노몰구스 원숭이 BTLA ECD-his(20μg/ml)로 코팅하고 10mg/ml BSA로 차단하였다. 인간 및 시노몰구스 원숭이 BTLA 실험 모두에서 결합을 위해 6G3 IgG4 APE10840.04 농도를 100 pM으로 일정하게 유지하였다. 인간 또는 시노몰구스 원숭이 BTLA ECD-his를 25°C에서 2.5배 희석하여 1000nM 내지 68fM으로 부가하였다. 샘플 세트를 4°C에서 72시간 동안 평형화시킨 후 실온에서 6시간 동안 보관한 후 BTLA-커플링된 아즈락톤 비드로 유리 항체를 캡처하였다. 비드에 결합된 6G3을 정량화하기 위한 2차 항체는 Alexa -Fluor -647 AffiPure Donkey- 항-인간 IgG(250 ng/ml, Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 사용하였다. 최대 및 배경 신호는 각각 6G3만 있는 샘플과 버퍼만 있는 샘플에서 결정되었다. 데이터는 KinExA Pro 소프트웨어 3.2.6을 사용하여 분석하였다. 인간 BTLA 및 시노몰구스 원숭이 BTLA에 대한 6G3 항체 결합의 K_D 값 분석의 95% 신뢰 구간은 도 2에 나타내었다.

실시예 4

본 실시예는 본원에 개시된 6G3 항체가 안정적으로 형질감염된 293c18 세포에서 발현된 인간 및 시노몰구스 원숭이 BTLA에 대해 포화 결합(saturation binding)을 나타냄을 보여준다.

인간 BTLA 작제물을 안정적으로 발현하는 293c18 세포 클론 1E4 또는 시노몰구스 원숭이 BTLA를 안정적으로 발현하는 클론 1G5를 Accutase 용액(Millipore Sigma/Sigma-Aldrich)으로 수확하고 인산 완충 식염수, 1% BSA로 1회 세척하였다. 293c18 시노몰구스 원숭이 BTLA 세포에 친유성 카보시아닌 염료인 DiD(2 μM, 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라멘틸인도디카보시아닌; ThermoFisher Scientific)를 실온에서 10분 동안 부드럽게 흔들어서 로딩하였다. DiD-염색 세포를 PBS, 1% BSA로 세척하고 동일한 양의 인간 BTLA 293c18 세포 및 시노몰구스 원숭이 BTLA 293c18-DiD-염색 세포를 혼합하였다. 세포(총 세포 수 2 x 10⁵ 개/샘플)를 표시된 농도의 정제된 6G3 IgG4(두 가지 생산 로트, APE10840.03 및 APE10840.04(H 사슬 서열번호 144, L 사슬 서열번호 174)) 또는 닭 알 리소자임에 특이적인 인간 IgG4 이소타입 대조군 항체와 함께 4°C에서 10분 동안 부드럽게 흔들면서 FACS 버퍼(PBS, 1% BSA, 0.02% 아지드화 나트륨)에서 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리하고 FACS 버퍼로 1회 세척하고 FACS 버퍼에 재현탁한 후 추가로 4°C에서 20분간 부드럽게 흔들어 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리하고 BSA가 없는 FACS 버퍼로 1회 세척한 후 PBS 내 2% 파라포름알데히드 100μl/웰에서 실온에서 10분 동안 고정시켰다. 세포를 FACS 버퍼로 1회 세척하고 2차 항체(염소 항-인간 카파-PE, FACS 버퍼 내 0.2 μg/ml, SouthernBiotech)를 사용하여 4°C에서 10분간 부드럽게 흔들면서 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 FACS 버퍼에 재현탁한 후 BD FACSArray(BD Biosciences)에서 형광을 분석하였다. 시노몰구스 원숭이 BTLA를 발현하는 DiD 염색 세포(도 3) 및 인간 BTLA를 발현하는 세포의 중간 형광 강도(median fluorescence intensity, MFI)를 별도로 분석하였다(도 3). GraphPad Prism(GraphPad Software, Inc.)에서 log(억제제) 대 반응- 가변 기울기(4개의 파라미터) 최소 제곱 피팅 분석으로 곡선을 피팅하였다.

본원에 개시된 두 개의 6G3 항체 로트(APE10840.03 및 APE10840.04)는 도 3에 나타낸 바와 같이 인간 BTLA 293c18 세포(각각 EC₅₀ ~1.7nM 및 1.8nM)와 시노몰구스 원숭이 BTLA 293c18 세포(EC₅₀ ~2.3nM)에 대해 유사한 농도 의존적 및 포화 결합을 나타낸다.

실시예 5

본 실시예는 본원에 개시된 6G3 항체가 정상 도너 인간 말초혈액 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 CD20+ B 세포에 포화 결합을 나타냄을 보여준다.

인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)는 San Diego Blood Bank(San Diego, CA)에서 얻은 정상 도너 혈액의 Histopaque(Sigma-Aldrich) 밀도-구배 원심분리를 통해 분리하였다. PBMC를 세척한 후 Human BD Fc Block(2.5 μg/1 x 10⁶ 세포, BD Biosciences) 및 LIVE/DEAD® Fixable Yellow Dead Cell Stain(30 μl, ThermoFisher Scientific) 을 사용하여 FACS 버퍼(PBS, 1% BSA, 0.02% 아지드화 나트륨)에서 2 x 10⁷ 세포/ml로 10분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 버퍼에서 1회 세척하고, 1 x 10⁷ 세포/ml로 FACS 버퍼에 재현탁한 후 다음과 같은 표현형 항체를 부가하였다: Alexa Fluor 488-항-인간 CD3ε 클론 SK7, Brilliant Violet 421-항-인간 CD4 클론 OKT4, Brilliant Violet 785-항-인간 CD8 클론 SK1, 및 Brilliant Violet 570-항-인간 CD20 클론 2H7(각각 50 μl; 모두 BioLegend, Inc. 로부터 얻음) 표현형 항체를 첨가한 세포(1 x 10⁶ 세포/샘플)를 U-바닥 96 웰 플레이트에 플레이트하고 표시된 농도의 DyLight 650-표지 항-BTLA 또는 이소타입 대조군 항체와 함께 4°C에서 20분간 부드럽게 흔들면서 FACS 버퍼에서 인큐베이션하였다. 6G3 IgG4(APE10916.02)는 DyLight 650(3.44mol DyL650/mol 항체)으로 표지된 APE10840이었다. 닭 알 리소자임에 특이적인 인간 IgG4 이소타입 대조군 항체에 DyLight 650(3.22mol DyL650/mol 항체)을 표지하였다. 표준 항-BTLA 항체 MIH26은 BioLegend, Inc.에서 Allophycocyanin(APC)-표지 항체로 구입하였다. 샘플을 FACS 버퍼로 1회 세척하고 150μl/웰 FACS 버퍼에 재현탁한 후 4°C에서 10분간 추가로 세척하였다. 샘플을 원심분리하고 인산염 완충 식염수 내 4% 파라포름알데히드 용액에 넣어 실온에서 10분간 고정하였다. 샘플을 FACS 버퍼로 두 번 세척하고 150μl/웰 FACS 버퍼에 재현탁한 후 NovoCyte 유세포 분석기(ACEA Biosciences, Inc.)에서 형광을 분석했다. 데이터는 NovoExpress 소프트웨어(ACEA 바이오사이언스, Inc.)를 사용하여 분석했다. 게이팅된 CD4+ T 세포(도 4), CD8+ T 세포(도 4) 또는 CD20+ B 세포(도 4)에서의 항-BLA 또는 이소타입 염색의 중간 형광 강도를 GraphPad Prism(GraphPad Software, Inc.)에서 그래프로 표시하고, EC₅₀ 계산을 위해 log(작용제) 대 반응(3개 파라미터) 최소 제곱 피팅으로 곡선을 피팅하였다.

본원에 개시된 6G3 항체는 DyLight 650으로 표지되어 건강한 도너 CD4+ T 세포(도 4), CD8+ T 세포(도 4) 및 B 세포(도 4)에 대해 농도 의존적 및 포화 결합을 나타낸다(도 4). 6G3 항체는 CD4+ T 세포에 EC₅₀ ~2.4nM로, CD8+ T 세포에 EC₅₀ ~3.2nM로, CD20+ B 세포에 EC₅₀ ~0.5nM로 결합한다. 양성 대조군 항-BLA 항체 MIH26-APC를 사용한 염색은 6G3 항체의 염색과 유사(parallel)하다. DyLight 650 표지된 인간 IgG4 이소타입 대조군 항체는 이러한 세포 집단에 염색을 나타내지 않았다(도 4).

실시예 6

본 실시예는 본원에 개시된 6G3 항체가 정상 시노몰구스 원숭이 말초혈액 CD3+ T 세포 및 CD20+ B 세포에 농도 의존적 결합을 나타냄을 보여준다.

안정적으로 형질감염된 CHO-K1 세포의 풀에서 제조한 6G3 IgG4(APE13308)를 제조업체의 지침에 따라 Alexa Fluor 647(AF647)(Alexa Fluor Antibody Labeling Kit; ThermoFisher Scientific/Molecular Probes) 로 표지하고 이를 APE13766.02(6G3-AF647)로 지정하였다. 정상 시노몰구스 원숭이 유래 새로운 말초 혈액을 Altasciences로부터 얻었다. 전혈 샘플(800 μl)을 실온에서 10분간 FcR 차단 시약, 인간(Miltenyi Biotec, Inc.)과 함께 인큐베이션한 후 실온에서 20분간 암실에서 형광 표지 항체의 혼합물로 염색하여 시노몰구스 원숭이 T 및 B 세포 집단을 구별하였다 [PerCP-Cy5.5 마우스 항-인간 CD3(클론 SP34-2; BD Biosciences), BD Horizon V450 마우스 항-인간 CD4(클론 L200; BD Biosciences), APC/Cy7 마우스 항-인간 CD8(클론 SK1; BD Biosciences), Brilliant Violet 785 항-CD20(클론 2H7; BioLegend, Inc. ), BD Horizon V500 마우스 항-NHP CD45(클론 D058-1283; BD Biosciences)]. 그런 다음 혈액을 웰에 애리쿼트(aliquot)하고 표시된 농도의 6G3-AF647(APE13766.02) 또는 APC-마우스 항-인간 CD272(BTLA) 표준 항체(클론 J168-540; BD Biosciences)와 함께 실온에서 30분 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 적혈구를 2.0ml 희석된 BD Pharm Lyse 용해 용액(BD Biosciences)을 부가하여 10분간 용해하고, 샘플을 200 x g에서 5분간 원심분리한 후, FACS 버퍼[Dulbecco's PBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음(Gibco/ThermoFisher Scientific), 25 mM HEPES, pH 7. 2, 0.1% BSA, 0.1% 아자드화 나트륨]로 세척하고 4% 파라포름알데히드(200 μl/샘플)에 10분 동안 실온에서 고정하였다. 샘플을 FACS 버퍼로 두 번 세척한 후 NovoCyte Quanteon 유세포 분석기(ACEA Biosciences, Inc.)에서 형광을 분석했다. 데이터는 NovoExpress 소프트웨어(ACEA 바이오사이언스, Inc.)를 사용하여 분석했다. 평균 형광 강도(Mean fluorescence intensity, MFI) 값을 그래프에 표시하고 GraphPad Prism(GraphPad Software, Inc.)의 비선형 회귀 분석으로 피팅하였다. 총 CD3+ 세포에 대한 각 항-BLA 항체의 MFI 값은 도 5a에 나타내었고, 총 CD20+ 세포에 대한 각 항-BLA 항체의 MFI 값은 도 5b에 나타내었다. 도 5c는 항-CD3 염색 및 33nM APC-표지 항-BTLA 표준 항체(클론 J168-540) 염색의 도트 플롯 분석을 나타낸다. 도 5d는 항-CD3 염색 및 100nM 6G3-AF647 염색의 도트 플롯 분석을 나타낸다. 도 5c 및 도 5d에서 각 항-BLA 항체의 CD3- 세포에 대한 결합(각 패널 하단 사분면의 녹색 세포)은 CD20+ B 세포에 대한 결합을 반영한다.

본원에 개시된 AF647로 표지된 6G3 항체는 정상 시노몰구스 원숭이의 말초 혈액 CD3+ T 세포 및 CD20+ B 세포에 대해 농도 의존적 결합을 나타낸다. 사용된 염색 조건 하 CD3+ 말초혈액 T 세포에 대한 결합은 100 nM 항체에서 포화되지 않으며(도 5a)(대략 EC₅₀ ~3.4nM), CD20+ 말초혈액 B 세포에 대한 6G3-AF647의 결합은 포화되기 시작한다(대략 EC₅₀ ~1.4 nM)(도 5b). B 세포의 6G3-AF647 염색의 MFI는 T 세포의 6G3-AF647 염색의 MFI보다 약 9배 더 크다. 정상 CD3⁺ 및 CD3-(CD20⁺) 시노몰구스 원숭이 세포에서 6G3-AF647 100nM의 염색 패턴은 시판되는 기준 APC-표지 항-BTLA 항체 J168 33nM 의 염색 패턴과 매우 유사히다(각각 도 5d 및 5c).

실시예 7

본 실시예는 본원에 개시된 항-BTLA 항체가 HVEM 또는 HVEM/LIGHT 복합체와 경쟁하지 않으며 세포 표면 BTLA에 결합함을 보여준다.

293c18 세포, 인간 BTLA를 안정적으로 발현하는 클론 1E4를 Accutase 용액(밀리포어 시그마/시그마-알드리치)으로 수확한 후 PBS, 1% BSA로 1회 세척했다. 세포를 U-바닥 96웰 플레이트에 2 x 10⁵/웰로 플레이팅하고 얼음 위에 놓았다. 표시된 농도의 두 배로 정제된 항체를 FACS 버퍼(PBS, 1% BSA, 0.02% 아지드화 나트륨)에서 3배로 연속 희석시켰다. 닭 알 리소자임에 특이적인 인간 IgG4 이소타입 대조군 항체, 표준 BTLA IgG4 길항제 항체 및 6G3 IgG4(APE10840.06) 항체를 테스트하였다. 등몰량(각각 60nM)의 DyLight 650-HVEM 인간 IgG1 Fc 및 삼량체 LIGHT-foldon-his를 혼합하고 실온에서 15분 동안 사전-인큐베이션하여 삼량체 HVEM/LIGHT 복합체를 사전-형성하였다. DyLight 650-HVEM-Fc(최종 농도 100nM; 도 6의 A) 또는 사전-형성된 DyLight 650-HVEM/LIGHT 복합체(HVEM/LIGHT의 최종 농도, 각각 30nM; 도 6의 B)를 희석된 항체(표시된 대로의 최종 항체 농도)에 부가하고 15분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리하고 항체 및 HVEM(도 6의 A)의 혼합물 또는 항체 및 HVEM/LIGHT 복합체(도 6의 B)의 혼합물에 부드럽게 재현탁하고 얼음에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리하고, FACS 버퍼로 1회 세척하고, 실온에서 10분 동안 PBS 중 2% 파라포름알데히드에서 고정시켰다. 세포를 1회 세척하고, FACS 버퍼에 재현탁한 후 BD FACSArray(BD Biosciences)에서 형광을 분석하였다. 중간 형광 강도(Median fluorescence intensities, MFI)를 GraphPad Prism(GraphPad Software, Inc.)에서 그래프로 표시하고, log(작용제) 대 반응(3개 파라미터) 최소 제곱 피팅으로 곡선을 피팅하였다.

본원에 개시된 6G3 항체(APE10840.06)는 세포 표면 BTLA에 대한 HVEM-Fc의 결합(도 6의 A) 또는 HVEM/LIGHT 복합체(도 6의 B)의 결합과 경쟁하지 않는다. 6G3 항체의 존재 하에, 세포 표면 BTLA에 대한 HVEM-Fc의 증가된 결합이 관찰되었다(도 6의 A). 6G3-의존적 HVEM 결합의 증가는 HVEM/LIGHT 복합체를 사용했을 때도 관찰되지만, HVEM-Fc 단독 사용 시 더욱 뚜렷하게 나타난다(도 6의 A 및 B). 표준 길항 항체는 농도 의존적으로 BTLA에 대한 HVEM 및 HVEM/LIGHT 결합을 억제하는 것으로 나타난다(도 6의 A 및 B). 관련성이 없는 이소타입-매칭된 IgG4 항체는 HVEM 또는 HVEM/LIGHT의 BTLA에 대한 결합에 영향을 미치지 않는다.

실시예 8

본 실시예는 본원에 개시된 6G3 및 10D8 항체와 결합하는 인간 BTLA의 에피토프가 HVEM 결합 부위와 반대편에 있다는 것을 보여준다.

본원에 개시된 6G3 및 10D8 항체에 의해 결합된 BTLA 상의 펩티드의 수소-중수소 교환 맵핑은 재조합 인간 BTLA 단량체를 사용하여 수행하였다. 상기 실험에 사용된 BTLA는 hBTLA 아미노산 번호 31-155(UniProt ID # Q7Z6A9)에 6-his 태그가 결합된 것이다. 도 7a, 7b, 및 7c는 Protein Data Bank 구조유래 PyMOL로 렌더링한 인간 HVEM 세포외 결합 도메인 결정 구조의 공간 채우기 모델(밝은 회색)과 복합된 인간 BTLA 세포외 도메인 결정 구조의 리본 모델(검은색)을 나타낸다(Compaan et al., J. Biol Chem 280: 39553-39561(2005)). 도 7a는 6G3 항체(APE12839.05(H 사슬 서열번호 144, L 사슬 서열번호 174))를 사용한 수소-중수소 교환 실험을, 도 7b는 10D8 항체(APE11482.06)를 사용한 수소-중수소 교환 실험을, 도 7c는 표준 BTLA 길항 항체(APE10693.17)를 사용한 수소-중수소 교환 실험을 요약한다.

각 실험에서 BTLA/항체 혼합물 또는 BTLA 단독을 4분, 10분 또는 60분 동안 중수소 표지하여 교환 동역학을 확인하였다. 인큐베이션 후, BTLA 단백질을 산성 pH에서 급속 효소 단백질 분해하고, 생성된 펩티드에 통합된 중수소를 크로마토그래피-질량 분석법으로 정량하였다.

매핑 결과 다음과 같은 BLTA 잔기가 관여하는 것으로 나타났다:

실시예 9

본 실시예는 BTLA 및 HVEM이 동일한 세포에서 발현될 때 본원에 개시된 6G3 항체가 NF-κB 루시퍼라제 리포터 분석에서 LIGHT-유도된 HVEM 신호전달을 억제함을 보여준다.

전장 인간 BTLA, 전장 인간 HVEM,및 pGL4.32 유래 NF-kB-루시퍼라제 리포터 작제물 [luc2P/NF-κB-RE/Hygro](Promega)을 안정적으로 발현하는 293c18 세포를 생성하고 단일 세포 클로닝하여 huHVEM/huBTLA/NF-κB 루시퍼라제, 클론 8으로 지정하였다. 전장 인간 LIGHT를 안정적으로 발현하는 CHO-S 세포를 생성하고 2회 분류하여 LIGHT 발현이 가장 높은 세포를 안정 풀(stable pool)로 하였다. huHVEM/huBTLA/NF-κB 루시퍼라제 세포를 Accutase 용액(Sigma-Aldrich/Millipore Sigma)으로 수확하고, 10% 태아 소 혈청이 보충된 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에 재현탁한 후, 평평한 바닥 96웰 플레이트에 플레이팅하였다(5 x 10⁴ 세포/웰). 37°C, 5% CO₂에서 1시간 인큐베이션 후, 표시된 농도의 6G3 IgG4(APE12839.07(H 사슬 서열번호 144, L 사슬 서열번호 174)), 닭 알 리소자임에 특이적인 인간 IgG4 이소타입 대조군 항체 또는 인간 IgG4 기준 항-BLA 길항 항체를 세포에 부가하였다. 실온에서 30분간 인큐베이션 한 후 CHO-S LIGHT 세포를 수확하여 부가하였다(0.55 x10⁴ 세포/웰; 최종 조건, 9:1 HVEM-NF-κB 반응자:CHO-S LIGHT 자극 세포, 이는 NF-κB 반응의 EC₅₀ 을 나타냄). 37℃, 5% CO₂에서 4시간 후, 동일한 부피의 Steady-Glo 루시퍼라제 분석 시스템(Promega)을 웰에 부가하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 샘플의 발광은 0.1초의 측정 시간으로 EnVision Multimode Plater Reader(PerkinElmer)에서 판독하였다. GraphPad Prism(GraphPad Software)로 상대 광도 단위(relative light unit, RLU)로 발광을 그래프로 표시하고 log(작용제) 대 반응(3개 파라미터) 최소 제곱 피팅으로 곡선을 피팅하였다.

도 8에 나타낸 NF-κB 루시퍼라제 리포터 분석은 BTLA와 HVEM이 동일한 세포에서 발현되는 경우 본원에 개시된 6G3 항체가 CHO-S LIGHT에 대한 반응으로 농도-의존적 방식으로 HVEM-의존적 NF-κB 신호전달을 억제함을 보여준다. 이는 이러한 조건 하에서 본원에 개시된 6G3 항체가 동일한 세포에서 HVEM과 BTLA 간의 상호작용을 촉진하여 LIGHT-유발된 HVEM-의존적 NF-κB 신호전달을 감소시킬 수 있음을 시사한다.

도 8에 나타낸 NF-κB 루시퍼라제 리포터 분석은 BTLA와 HVEM이 동일한 세포에서 발현되는 경우 기준 길항 항체가 CHO-S LIGHT에 대한 반응으로 농도-의존적 방식으로 LIGHT-매개 HVEM-의존적 NF-κB 신호전달을 향상시킴을 보여준다. 길항 항체는 동일한 세포에서 BTLA와 HVEM의 상호작용을 저재함으로써 더 많은 비결합 HVEM 분자가 LIGHT와 상호작용할 수 있도록 하여 LIGHT-유발 HVEM-의존적 NF-κB 신호전달을 증가시킬 수 있다.

실시예 10

본 실시예는 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 분석에서 본원에 개시된 6G3 항체가 동일한 세포 표면의 BTLA/HVEM 복합체를 저해하지 않음을 보여준다.

도 9a에서, 전장 인간 BTLA 및 인간 HVEM을 안정적으로 발현하는 293c18 세포 클론을 Accutase 용액(Millipore Sigma/Sigma-Aldrich)으로 수확하고, FACS 버퍼(PBS, 1% BSA, 0.02% 아지드화 나트륨)으로 세척하고, 흰색 U-바닥 96-웰 플레이트(2 x 10⁵ 세포/웰)에 플레이팅하였다. 세포를 원심분리하고 표시된 농도로 연속적으로 3배 희석된 항체를 부가한 후 4°C에서 부드럽게 흔들면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 6G3 IgG4(APE12839.05(H 사슬 서열번호 144, L 사슬 서열번호 174)), 기준 길항 항체 IgG4, 및 닭 알 리소자임에 특이적인 인간 IgG4P 이소타입 대조군 항체를 테스트하였다. 세포를 원심분리하고, FACS 버퍼로 세척하고, FRET 억셉터(acceptor) 항체, APC-항-HVEM(15㎍/ml; 클론 122, BioLegend)에 재현탁시켰다. FRET 도너(donor) 항체는 비오틴-인간화 10D8(APE12774.02)이었고, 0.025㎍/ml Streptavidin-Eu(LANCE Eu-W8044-Streptavidin AD0060, PerkinElmer)와 실온에서 20분 동안 인큐베이션하여 10㎍/ml로 사전-복합화되었다. 상기 도너 복합체 비오틴-항-BTLA/스트렙타아비딘-Eu를 억셉터 APC-항-HVEM 항체와 함께 플레이트에 부가하고 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 차가운 FACS 버퍼로 세척하고 샘플의 형광을 EnVision Multimode Plater Reader(PerkinElmer, Santa Clara, CA)로 판독하였다. GraphPad Prism(GraphPad Software)에서 665 nm/615 nm에서의 형광 비율을 그래프로 표시하였다. 각 포인트는 세 개의 독립적인 복제 실험의 평균 ± SEM이다. 각 실험의 각 샘플 조건이 5개의 복제 웰에서 존재하였다.

도 9a에 나타낸 FRET 분석은 형질감염된 293c18 세포 상에 BTLA/HVEM 복합체가 존재하며, 본원에 개시된 6G3 항체가 이소타입 대조군 항체와 유사하게 최대 40μg/ml 농도에서 BTLA/HVEM FRET 신호를 억제하지 않음을 보여준다. 이 결과는 본원에 개시된 6G3 항체가 동일 세포 표면 상 BTLA 및 HVEM의 상호작용을 억제하지 않음을 확인시킨다.

도 9a에 나타낸 FRET 분석은 기준 길항 항체가 약 0.65μg/ml의 IC₅₀ 으로 농도-의존적 방식으로 BTLA/HVEM 복합체 FRET 신호를 억제함을 보여준다.

도 9b에서, 전장 인간 BTLA 및 인간 HVEM을 안정적으로 발현하는 293c18 세포 클론을 Accutase 용액(Millipore Sigma/Sigma-Aldrich)으로 수확하고, FACS 버퍼로 세척하고, 흰색 U-바닥 96-웰 플레이트(2 x 10⁵ 세포/웰)에 플레이팅하였다. 세포를 원심분리하고, FRET 억셉터 항체 APC-항-HVEM(클론 122, BioLegend) 또는 APC-마우스 IgG1 이소타입 대조군 항체를 표시된 농도로 3배 연속 희석하여 플레이트에 부가하였다. 비오틴화된 FRET 도너 항체는 실온에서 20분 동안 인큐베이션함으로써 0.025㎍/ml 스트렙타아비딘-Eu(LANCE Eu-W8044-Streptavidin AD0060, PerkinElmer)와 10㎍/ml로 사전-복합화되었다. 테스트한 비오틴 접합 FRET 도너 항체는 비오틴-6G3 IgG4(APE13124.01, 비오틴 접합 APE12839.05(H 사슬 서열번호 144, L 사슬 서열번호 174)), 비오틴-기준 길항 IgG4 항체 및 닭 알 리소자임에 특이적인 비오틴-인간 IgG4 이소타입 대조군 항체였다. 모든 웰의 도너 비오틴-항체/스트렙타아비딘-Eu 복합체 최종 농도는 0.3μg/ml 항체, 및 0.75ng/ml 스트렙타비딘-Eu 였다. 플레이트를 4°C에서 24시간 배양하고 차가운 FACS 버퍼로 세척한 후 샘플의 형광을 EnVision Multimode Plater Reader(PerkinElmer)로 판독하였다. GraphPad Prism(GraphPad Software)에서 665 nm/615 nm에서의 형광 비율을 그래프로 표시하였다. 각 포인트는 2 복제 웰의 평균 ± SEM이다.

도 9b에 나타낸 FRET 분석은 스트렙타아비딘-Eu와 복합화된 본원에 개시된 비오틴-6G3 항체의 존재 하에서, APC-항-HVEM의 농도 증가는 농도-의존적 FRET 신호 증가를 생성함을 보여준다. 이 실시예는 6G3 항체가 세포 표면 BTLA에 결합할 때 BTLA가 여전히 동일한 세포 표면에서 HVEM과 복합체를 형성할 수 있음을 보여준다.

도 9b에 나타낸 FRET 분석은 스트렙타아비딘-EU와 복합화된 비오틴-기준 길항 항체의 존재 하에서 BTLA/HVEM 복합체 FRET 신호가 검출되지 않으며 비오틴-이소타입 대조군 항체의 신호와 유사함을 보여준다. 이 실시예는 기준 BTLA 길항 항체가 동일한 세포 표면에서 BTLA-HVEM 복합체를 저해함을 보여준다.

실시예 11

본 실시예는 BTLA 및 HVEM이 상이한 세포에서 발현될 때 본원에 개시된 6G3 항체가 NF-κB 루시퍼라제 리포터 분석에서 BTLA-유도된 HVEM 신호전달을 부분적으로 억제함을 보여준다.

전장 인간 HVEM 및 NF-κB-루시퍼라제 리포터 작제물을 안정적으로 발현하는 293c18 세포를 생성하고 HVEM/NF-κB 루시퍼라제, 클론 11로 지정하였다. 전장 인간 BTLA를 안정적으로 발현하는 293c18 세포를 생성하고, 단일 세포 클로닝하고, huBTLA 293c18, 클론 2로 지정하였다. 인간 BTLA 293c18 세포를 Accutase 용액(Sigma-Aldrich/Millipore Sigma)으로 수확하고, 10% FBS가 보충된 DMEM에 재현탁하고, 평평한 바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅했다(0.5 x10⁴ 세포/웰). 안정적으로 형질감염된 CHO-K1 세포 풀에서 제조된 표시된 농도의 6G3 IgG4(APE13308.03) 항체, 닭 알 리소자임에 특이적인 인간 IgG4 이소타입 대조군 항체, 또는 IgG4 기준 항-BTLA 길항 항체)를 세포에 부가했다. 실온에서 30분 인큐베이션 한 후, HVEM/NF-κB 세포를 수확하고 부가하였다(5 x10⁴ 세포/웰). 37°C, 5% CO₂에서 5시간 후, 동일한 부피의 Steady-Glo 루시퍼라제 분석 시스템(Promega)을 웰에 부가하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 샘플의 발광은 0.3초의 측정 시간으로 GloMax Navigator Microplate Luminometer(Promega)에서 판독되었다. GraphPad Prism(GraphPad Software)로 상대 광도 단위(relative light unit, RLU)로 발광을 그래프로 표시하고 log(작용제) 대 반응(3개 파라미터) 최소 제곱 피팅으로 곡선을 피팅하였다.

도 10에 나타낸 NF-κB 루시퍼라제 리포터 분석은 HVEM 및 BTLA가 상이한 세포에서 발현되는 경우 본원에 개시된 6G3 항체가 BTLA 293c18 세포에 대한 반응으로 농도-의존적 방식으로 HVEM-의존적 NF-κB 신호전달을 부분적으로 억제함을 보여준다. 이는 이러한 조건 하에서 본원에 개시된 6G3 항체가 BTLA가 다른 세포 상에 있을 때 HVEM 신호전달을 부분적으로 억제할 수 있음을 시사한다. 인간 BTLA 293c18 세포가 본원에 개시된 6G3 항체와 함께 인큐베이션 전에 파라포름알데히드로 고정될 때 또는 세포가 엔도사이토시스(endocytosis)를 차단하는 다이나민 GTPase의 억제제로 처리될 때 동일한 결과가 얻어진다.

도 10에 나타낸 NF-κB 루시퍼라제 리포터 분석은 기준 길항 항-BTLA 항체를 부가하면 HVEM 및 BTLA가 다른 세포에서 발현될 때 BTLA-매개 HVEM-의존적 NF-κB 신호전달이 농도-의존적으로 완전히 억제됨을 보여준다.

실시예 12

본 실시예는 SHP2 recruitment PathHunter Jurkat BTLA 신호전달분석에서 본원에 개시된 6G3 항체의 직접적인 BTLA 작용제 활성을 보여준다.

β-갈락토시다제 효소 도너(enzyme donor, ED)-태깅된 인간 BTLA 및 β-갈락토시다제 효소 억셉터(enzyme acceptor, EA)-태깅된 인간 SHP2를 안정적으로 발현하는 클론 Jurkat 세포주를 Eurofins DiscoverX(Fremont, CA)에서 생성하여 Jurkat BTLA-ED SHP2-EA 세포로 지정하였다. 분석 설정을 위해 Jurkat BTLA-ED SHP2-EA 세포를 수확하여 96웰 플레이트(2 x10⁴ 세포/웰)에 플레이팅했다. 항체 희석액은 별도의 플레이트에 준비하였다. 테스트된 항체 및 단백질은 안정적으로 형질감염된 CHO-K1 세포 풀에서 제조된 6G3 IgG4(APE13308.03) 항체, 닭 알 리소자임에 특이적인 인간 IgG4 이소타입 대조군 항체, 기준 BTLA 길항 IgG4 항체, 및 용해성 인간 HVEM-IgG1 Fc/삼량체 LIGHT 복합체(몰비 1:1.1의 APE11989.16 및 APE07872.05)였다. 항체 및 단백질을 세포 분석 플레이트에 부가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. PathHunter Bioassay Detection 시약을 모든 웰에 부가하고 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 Bioassay Detection Reagent 2를 모든 웰에 부가하고 0.1초 통합 시간으로 EnVision Multimode Plater Reader(PerkinElmer)에서 발광 신호를 측정하기 전에 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. GraphPad Prism(GraphPad 소프트웨어)에서 데이터를 그래프로 표시하였다. EC₅₀ 값은 제약 조건 없이 가변 기울기(4개 파라미터)를 갖는 S자형 용량 반응 곡선 피팅(sigmoidal dose response curve fit) 및 최소 제곱 피팅 방법을 사용하여 계산하였다. 데이터는 각 포인트에 대해 3개 샘플의 평균(± 표준 편차)을 나타낸다. 분석 및 데이터 분석은 Project ID: DRX-ANAB-190724 하에 Eurofins DiscoverX(Fremont, CA)에서 수행되었다.

도 11에 나타낸 SHP2 recruitment PathHunter Jurkat BTLA 신호전달분석은 본원에 개시된 6G3 항체가 용해성 항체로서 직접적인 BTLA 작용제 활성을 갖고 농도-의존적인 낮은 정도의 BTLA 신호전달(EC₅₀ = 125 ng/ml)을 유도함을 보여준다. BTLA 세포질 도메인으로의 SHP2 모집(recruitment)을 유도함으로써 본원에 개시된 6G3 항체는 활성화된 T 및 B 세포에서 억제 신호전달을 개시함으로써 기능할 수 있다.

도 11에 나타낸 SHP2 recruitment PathHunter Jurkat BTLA 신호전달분석은 용해성 항체인 기준 BTLA 길항 항체가 용해성 항체로서 직접적인 BTLA 작용제 활성을 갖고 농도-의존적인 BTLA 신호전달(EC₅₀ = 28.8 ng/ml)을 6G3 항체보다 더 높은 최대 신호로 유도함을 보여준다. 도 11에 나타낸 SHP2 recruitment PathHunter Jurkat BTLA 신호전달분석에서 용해성 HVEM/LIGHT 복합체는 항체에 비해 BTLA에 대한 용해성 HVEM의 낮은 친화도로 인해 포화되지 않는 약한 농도-의존적 유도된 BTLA 신호를 유도한다.

실시예 13

본 실시예는 SHP2 recruitment PathHunter Jurkat BTLA 신호전달분석에서 본원에 개시된 6G3 항체가 형질감염된 U-2 OS 세포주에서 HVEM에 의해 유도된 BTLA 신호전달을 억제하지 않음을 보여준다.

β-갈락토시다제 효소 도너(ED)-태깅된 인간 BTLA 및 β-갈락토시다제 효소 억셉터(EA)-태깅된 인간 SHP2를 안정적으로 발현하는 클론 Jurkat 세포주 및 인간 HVEM을 안정적으로 발현하는 U-2 OS 골육종 세포주(U-2 OS hHVEM 세포)를 Eurofins DiscoverX(Fremont, CA)에서 생성하였다. 분석 설정을 위해 Jurkat BTLA-ED SHP2-EA 세포를 수확하여 96웰 플레이트(2 x10⁴ 세포/웰)에 플레이팅했다. 항체 희석액은 별도의 플레이트에 준비하였다. 테스트된 항체는 안정적으로 형질감염된 CHO-K1 세포 풀에서 제조된 6G3 IgG4(APE13308.03) 항체, 닭 알 리소자임에 특이적인 인간 IgG4 이소타입 대조군 항체, 및 기준 BTLA 길항 IgG4 항체였다. 표시된 농도의 항체를 분석 플레이트에 부가하고 37°C, 5% CO₂의 가습한(humidified) 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션했다. U-2 OS hHVEM 세포를 수확하고, 재현탁하고, Jurkat BTLA-ED SHP2-EA 세포와 함께 분석 플레이트에 부가하고(5 x10⁴ 세포/웰) 실온에서 2시간 동안 인큐베이션했다. PathHunter Bioassay Detection 시약을 모든 웰에 부가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 Bioassay Detection Reagent 2를 모든 웰에 부가하고 0.1초 통합 시간으로 EnVision Multimode Plater Reader(PerkinElmer)에서 발광 신호를 측정하기 전에 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. GraphPad Prism(GraphPad 소프트웨어)에서 데이터를 그래프로 표시하였고; IC₅₀ 값은 제약 조건 없이 가변 기울기(4개 파라미터)를 갖는 S자형 용량 반응 곡선 피팅(sigmoidal dose response curve fit) 및 최소 제곱 피팅 방법을 사용하여 계산하였다. 데이터는 각 포인트에 대해 3개 샘플의 평균(± 표준 편차)을 나타낸다. 분석 및 데이터 분석은 Project ID: DRX-ANAB-191210 하에 Eurofins DiscoverX(Fremont, CA)에서 수행되었다.

도 12에 나타낸 SHP2 recruitment PathHunter Jurkat BTLA 신호전달분석은 본원에 개시된 6G3 항체가 상이한 세포 상의 HVEM에 의해 유도된 BTLA에 대한 SHP2 모집에 영향을 미치지 않음을 보여준다.

도 12에 나타낸 SHP2 recruitment PathHunter Jurkat BTLA 신호전달분석은 기준 BTLA 길항 항체가 상이한 세포 상의 HVEM에 의해 유도된 BTLA 신호전달의 강력한 농도-의존적 억제를 나타냄을 보여준다(IC₅₀ = 8.9 ng/ml).

실시예 14

본 실시예는 FcγR 관여를 제공하기 위해 FcγRIa(CD64a) 형질감염된 U-2 OS세포를 부가하여 SHP2 recruitment PathHunter Jurkat BTLA 신호전달분석에서 본원에 개시된 6G3 항체의 증가된 직접적인 BTLA 작용제 활성을 보여준다.

β-갈락토시다제 효소 도너(ED)-태깅된 인간 BTLA 및 β-갈락토시다제 효소 억셉터(EA)-태깅된 인간 SHP2를 안정적으로 발현하는 클론 Jurkat 세포주 및 인간 FcγRIa/CD64a 을 안정적으로 발현하는 U-2 OS 골육종 세포주(U-2 OS hFcγRIa/CD64a 세포)를 Eurofins DiscoverX(Fremont, CA)에서 생성하였다. U-2 OS hFcγRIa 세포를 수확하고 96-웰 플레이트(1 x10⁴ 세포/웰)에 플레이팅하였다. 항체 희석액은 별도의 플레이트에 준비하고, 분석 플레이트에 부가하고 37°C, 5% CO₂의 가습한(humidified) 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 테스트된 항체는 안정적으로 형질감염된 CHO-K1 세포 풀에서 제조된 6G3 IgG4(APE13308.03) 항체, 닭 알 리소자임에 특이적인 인간 IgG4 이소타입 대조군 항체, 및 기준 BTLA 길항 IgG4 항체였다. Jurkat BTLA-ED SHP2-EA 세포를 수확하고 U-2 OS hFcγRIa 세포와 함께 분석 플레이트(2 x10⁴ 세포/웰)에 부가하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. PathHunter Bioassay Detection 시약을 모든 웰에 부가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. Bioassay Detection Reagent 2를 모든 웰에 부가하고 0.1초 통합 시간으로 EnVision Multimode Plater Reader(PerkinElmer)에서 발광 신호를 측정하기 전에 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. GraphPad Prism(GraphPad 소프트웨어)에서 데이터를 그래프로 표시하였고; EC₅₀ 값은 제약 조건 없이 가변 기울기(4개 파라미터)를 갖는 S자형 용량 반응 곡선 피팅(sigmoidal dose response curve fit) 및 최소 제곱 피팅 방법을 사용하여 계산하였다. 데이터는 각 포인트에 대해 3개 샘플의 평균(± 표준 편차)을 나타낸다. 분석 및 데이터 분석은 Project ID: DRX-ANAB-191210 하에 Eurofins DiscoverX(Fremont, CA)에서 수행되었다.

도 13에 나타낸 SHP2 recruitment PathHunter Jurkat BTLA 신호전달분석은 본원에 개시된 6G3 항체가 용해성 항체로서 FcγRIa 관여를 제공하는 세포의 존재 하에서 증가된 직접적인 BTLA 작용제 활성을 가지며 농도-의존적 BTLA 신호전달(EC₅₀ = 9.3 ng/ml)을 유도함을 보여준다.

도 13에 나타낸 SHP2 recruitment PathHunter Jurkat BTLA 신호전달분석은 기준 BTLA 길항 항체가 용해성 항체로서 FcγRIa 관여를 제공하는 세포의 존재 하에서 직접적인 BTLA 작용제 활성을 가지며 농도-의존적 BTLA 신호전달(EC₅₀ = 3.9 ng/ml)을 유도함을 보여준다.

도 13에 나타낸 SHP2 recruitment PathHunter Jurkat BTLA 신호전달분석은 본원에 개시된 6G3 항체 및 기준 BTLA 길항 항체 모두 FcγRIa가 없는 Jurkat BTLA 신호전달분석에 비해 세포 관련 FcγRIa가 있을 때 효능 작용제 활성이 증가함을 보여준다(6G3 ~13배 더 강력, 기준 BTLA 길항제 ~7.4배 더 강력)(도 11 및 도 13 비교). 본원에 개시된 용해성 6G3 항체는 BTLA 세포질 도메인에 SHP2의 모집을 유도하고 활성화된 T 및 B 세포에서 억제 신호전달을 개시할 수 있지만, 직접 억제 신호전달을 유도하는 FcγRIa-결합 6G3 항체의 잠재력은 향상될 수 있다.

실시예 15

본 실시예는 본원에 개시된 6G3 항체가 1 mg/kg, 3 mg/kg, 또는 10 mg/kg으로 4주 동안 매주 2회 투여될 때 이종 NSG/Hu-PBMC 이식편 대 숙주 질환(GvHD) 모델에서 생체 내 효능을 나타냄을 보여준다.

본원에 개시된 6G3 항-BTLA 항체의 효능을 테스트하는 이종 NSG/Hu-PBMC GvHD 모델을 The Jackson Laboratory JAX® In Vivo Pharmacology Services(Sacramento, CA)에서 수행하였다. NOD-scid IL2rγ ^null (NSG) 마우스에 1Gy를 방사선 조사한 후 도 14a에 설명된 바와 같이 각 마우스에 10 x 10⁶ 인간 PBMC를 정맥 주사하였다. 항체(닭 알 리소자임에 특이적인 인간 IgG4 이소타입 대조군 항체 및 안정적으로 형질감염된 CHO-K1 세포 풀로부터 제조된 6G3 IgG4 APE13308.05 항체)를 PBMC 주사 다음 날부터 4주 동안 매주 2회 복강내 투여하였다. 본원에 개시된 6G3 항체는 1 mg/kg, 3 mg/kg 또는 10 mg/kg으로 투여되었고, 인간 IgG4 이소타입 대조군 항체는 10 mg/kg으로 투여되었다. 각 항체 처리 그룹에는 12마리 동물/그룹이 있었다. 벨라타셉트(Belatacept) 바이오시밀러 양성 대조군은 4주 동안 매주 3회 75μg/마우스로 복강 내 투여되었다. 벨라타셉트 바이오시밀러 처리 그룹에는 8마리의 동물이 있었다. 연구에서의 투여 요법 및 용량 그룹은 도 14b에 제시되어 있다. 42일 연구 코스에서 체중 감소, 사망 및 GvHD 점수: 체중 감소, 활동성, 털의 질감, 창백함 및 자세로 매주 3회 질병을 모니터링했다. 10% 이상의 체중 감소를 나타내는 동물은 매일 질병 모니터링하고, 시작 체중에서 20% 이상의 체중 감소를 나타내는 동물을 안락사시켰다. 생존에는 죽은 것으로 발견된 동물과 The Jackson Laboratory JAX® In Vivo Pharmacology Services의 연구 프로토콜에 정의된 평가지표(endpoint)로 인해 연구에서 제외된 동물이 포함되었다. 생존 데이터는 Kaplan-Meier 생존 분석을 사용하여 GraphPad Prism(GraphPad Software)에서 그래프로 표시되었으며, 각 그룹의 중간 생존을 계산하였다. 이소타입 대조군과의 페어와이즈(pairwise) 비교에서 치료 그룹의 통계적 유의성은 GraphPad Prism에서 Gehan-Breslow-Wilcoxon 테스트를 사용하여 p값을 계산하였다.

도 14c에 나타낸 GvHD 연구에 대한 생존 결과는 본원에 개시된 6G3 항-BLA 항체가 이소타입 대조군 항체와 비교하여 테스트한 모든 용량에서 생존을 연장하는 데 통계적으로 매우 유의미한 효능을 나타냄을 보여준다. 6G3 항체의 효능은 용량 반응성이었으며, 1 mg/kg 용량 처리군은 3 mg/kg 및 10 mg/kg 처리군과 비교하여 감소된 생존율을 나타냈다. 연구 기간 동안 생존 기간 중앙값은 이소타입 대조군에서 16일, 1mg/kg 6G3 치료군에서 35일, 3mg/kg 및 10mg/kg 6G3 처리 그룹에서는 정의되지 않았다. 기준 길항 항-BTLA 항체는 2차 대조군으로서 10 mg/kg으로 투여되었다. 기준 대조군 처리된 동물과 비교하여 기준 길항 항체로 처리된 동물에서는 생존 혜택이 관찰되지 않았다.

실시예 16

본 실시예는 시노몰구스 원숭이 혈청에서 6G3 IgG4 항-BTLA 항체를 투여 후 BTLA 검출을 위한 96웰, 전기화학발광(ECL) 샌드위치 분석의 검증(qualification)을 설명한다.

방법 개발 중에 캡처 시약 농도, MRD, 분석 버퍼 타입 및 검출 시약 농도와 같은 분석 파라미터를 설정하였다. 그런 다음 분석-내 및 분석-간 정밀도 및 정확도, 희석 선형성, 특이성 및 동결 해동 안정성을 평가하여 분석의 방법 검증을 수행하였다. 최종 방법은 시노몰구스 원숭이에서 비-GLP 단일 또는 다중-투여 PK, TK 및 내약성 연구로부터 샘플을 분석하는 데 사용될 것이다.

96-웰 MSD 표준 결합 분석 플레이트(MSD Part #L15XA-3)를 1.0μg/mL 항-BTLA 클론 10D8(APE10134) 50μL로 4˚C에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 다음 날 코팅된 플레이트를 1X PBST로 3회 세척하고 250μL 차단 버퍼로 60 내지 120분 동안 차단하였다. BTLA는 보정 곡선 범위(calibration curve range) 500-7.8ng/mL 및 정량 범위(quantitative range) 500-7.8ng/mL이었다. 표준(Standards)은 100% 시노몰구스 혈청에서 2배 희석 시리즈(2-fold dilution series)를 사용하여 제조하였다. 품질 대조군(Quality control, QC)도 정량 범위에 걸친 5가지 상이한 농도로 100% 시노몰구스 혈청에서 제조 및 동결되었다. 그런 다음 모든 표준, 샘플 및 대조군을 100μg/ml 6G3 IgG4 를 함유하는 분석 버퍼에서 최소 필요 희석(minimum required dilution, MRD) 1:10으로 희석하고 실온에서 1시간 동안 쉐이커(shaker)를 사용하여 인큐베이션했다. 차단 후, 플레이트를 1X PBST로 세척하고 희석된 표준, 샘플 및 QC 50μL를 실온에서 2시간 동안 400-500rpm의 쉐이커에서 인큐베이션했다. 샘플 인큐베이션 후, 1X PBST로 플레이트를 3회 세척하고 0.25μg/mL의 비오틴화 항-BTLA 폴리클론성 검출 항체(PA5-95592 by ThermoFisher) 50μL를 각 웰에 부가하고 쉐이커에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 플레이트를 1X PBST로 3회 세척했다. 그런 다음 0.2μg/mL Strepavidin-SulfoTag 2차 검출 시약을 웰당 50μL씩 각 웰에 부가하고 쉐이커에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 플레이트를 1X PBST로 최종 3회 세척했다. 각 웰당 150μL의 2X MSD Read 버퍼 T를 각 웰에 부가하고 MSD Quickplex Plate Reader에서 플레이트를 판독했다. 표준, 샘플 및 대조군 복제물을 이중으로 테스트하였으며, 혈청 농도는 SoftMax Pro 7.01을 사용하여 선도 후보물질(lead candidate)의 기준 표준 곡선과 1/y^2 가중치가 적용된 4-파라미터 곡선 피팅 기반으로 다시 계산되었다.

방법 검증 시작하기 전에, 6G3 IgG4 항체에 대한 혈청 매트릭스 간섭(matrix interference)을 평가하였다. 매트릭스 효과는 관찰되지 않았고 1:10의 최소 필요 희석(minimum required dilution, MRD)을 선택하였다.

항체 10D8(APE10134)을 캡처 항체로 사용하였다. Cyno 혈청에서, BTLA에 대한 10D8의 결합은 6G3 IgG4 항체의 존재 하에 증가함을 발견하였으며, 6G3 IgG4에 결합 시 BTLA의 형태 변화를 통한 것일 수 있다. BTLA의 추정 형태 변화를 정규화하기 위해, 희석 버퍼 및 모든 표준, 샘플 및 대조군에 100 μg/ml 6G3을 부가하고 1:10의 MRD에 따라 희석한 후 실온에서 1시간 동안 쉐이커에서 인큐베이션한 후 10D8 코팅된 MSD 플레이트에 샘플을 부가하였다.

500, 50, 5, 0.5, 및 0 μg/ml 6G3 IgG4를 갖는 표준 곡선을 100 μg/ml 6G3 IgG4를 함유하는 분석 버퍼에서 MRD 1:10로 희석하여 BTLA의(%RE) 및 정밀도(%CV)를 평가하였다. 100μg/ml 6G3 IgG4와 함께 인큐베이션 된 5개의 표준 곡선 조건 모두 정량 분석 범위의 표준 농도를 가졌고 공칭 농도의 20% 이내인 평균 회수(%RE) 농도의 허용 기준을 통과했다. 정밀도(%CV)의 평균 결과는 허용 기준을 통과했으며 모든 샘플에서 20%를 초과하지 않았다. 총 오류율(%TE)은 BTLA의 경우 30%를 초과하지 않았다.

분석-간 정확도(%RE) 및 정밀도(%CV)는 서로 다른 2일에 수행된 6회 분석 실행에 걸쳐 평가되었으며, 각 플레이트의 보정 곡선과 정량 범위를 정의하는 5가지 수준의 QC를 포함했다. 평가된 QC의 5개 수준은 ULOQ(500ng/mL), HQC(400ng/mL), MQC(62.4ng/mL), LQC(15.6ng/mL) 및 LLOQ(7.8ng/mL)이다. 실행당 각 QC 수준에서 총 3개의 독립적인 복제물을 이중으로 분석했다. 정량 분석 범위의 모든 대조군 및 표준 농도에 대한 정확도(%RE)의 평균 결과는 공칭 농도의 20% 이내인 평균 회수 농도의 허용 기준을 통과하였다. 정밀도(%CV)의 평균 결과는 허용 기준을 통과했으며 모든 샘플에서 20%를 초과하지 않았다. 총 오차 백분율(%TE)은 BTLA의 경우 분석의 정량 범위 내 임의의 농도에 대해 표준 곡선 또는 품질 대조군 모두 30%를 초과하지 않았다.

이 방법의 분석-내 정확도(%RE) 및 정밀도(%CV)는 5개의 QG 수준의 6개의 독립적인 복제물을 사용하여 단일 실행으로 평가되었다. 대조군에 대한 정확도(%RE)의 평균 결과는 공칭 농도의 20% 이내인 평균 회수 농도의 허용 기준을 통과하였다. 정밀도(%CV)의 평균 결과는 허용 기준을 통과했으며 20%를 초과하지 않았다.

희석 선형성은 ULOQ 이상의 BTLA 농도로 스파이크된 샘플에 대해 다양한 희석을 수행함으로써 평가되었으며, 고농도의 테스트 물품이 정량 범위 내로 희석될 수 있고 분석에 프로존 효과(prozone effect)가 없음을 보여주었다. 분석의 정량 범위로 희석한 샘플 및 다시 계산된 농도를 평가하였다. 평균 결과는 최대 1:1600의 희석 계수를 사용하여 샘플을 정량 범위로 희석할 수 있음을 나타낸다. 평가된 농도에서 프로존 "후크 효과"가 나타나지 않았다.

상기 결과는 상기 분석법이 6G3 IgG4를 투여한 시노몰구스 원숭이 연구 유래 혈청 내 BTLA 농도를 평가하는데 민감하고 재현 가능함을 나타낸다.

실시예 17

다음 실시예는 전기화학발광(Electrochemiluminescence, ECL) 샌드위치 분석법을 사용하여 시노몰구스 원숭이 혈청 및 NOD scid 마우스 혈장에서 용해성 BTLA를 정량적으로 결정하는 방법을 예시한다.

96웰 MSD 표준 결합 분석 플레이트(MSD Part #L15XA-3)를 1.0μg/mL 항-BTLA 캡처 시약 클론 10D8(APE10134) 50μL로 4˚C에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 다음 날 코팅된 플레이트를 1X PBST로 3회 세척하고 250μL 차단 버퍼로 60 내지 120분 동안 차단하였다. sBTLA의 시노몰구스 원숭이 혈청에서 보정 곡선 범위는 7.8-500 ng/mL 및 정량 범위는 7.8-500ng/mL 였으며, CD1 마우스 혈장에서 보정 및 정량 범위 모두 2.0-1000ng/mL 였다. 표준은 100% 종-특이적 매트릭스에서 2배 희석 시리즈를 사용하여 제조하였다. 품질 대조군도 정량적 범위에 걸친 5가지 상이한 농도로 100% 종-특이적 매트릭스에서 제조 및 동결되었다. 그런 다음 모든 표준, 샘플 및 대조군을 100μg/mL 6G3를 함유하는 분석 버퍼에서 최소 필요 희석(minimum required dilution, MRD) 1:10으로 희석하고 실온에서 1시간 동안 쉐이커(shaker)를 사용하여 인큐베이션했다.

차단 후, 플레이트를 1X PBST로 세척하고 희석된 표준, 샘플 및 QC 50μL를 실온에서 2시간 동안 400-500rpm의 쉐이커에서 인큐베이션했다. 샘플 인큐베이션 후, 1X PBST로 플레이트를 3회 세척하고 0.25μg/mL의 비오틴화 항-BTLA 클론 PA5-95592(VC2963104B) 검출 항체 50μL를 각 웰에 부가하고 쉐이커에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 플레이트를 1X PBST로 3회 세척했다. 그런 다음 0.2μg/mL Strepavidin-SulfoTag 2차 검출 시약을 웰당 50μL씩 각 웰에 부가하고 쉐이커에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 플레이트를 1X PBST로 최종 3회 세척했다. 각 웰당 150μL의 2X MSD Read 버퍼 T를 각 웰에 부가하고 MSD Quickplex Plate Reader에서 플레이트를 판독했다. 표준, 샘플 및 대조군 복제물은 이중으로 테스트하였고 농도는 SoftMax Pro 7.01을 사용하여 BTLA에 대한 기준 표준 곡선과 1/y^2 가중치가 적용된 4-파라미터 곡선 피팅 기반으로 다시 계산하였다.

인간 PBMC가 이식된 NOD Scid 마우스(n=19)에 세 가지 용량 그룹(1, 3, 10 mg/kg IP)으로 6G3 IgG4 항체(APE13308)를 투여했다. 이소타입 대조군 IgG4(10 mg/kg) 또는 CTLA-4-Ig(75 μg)를 투여한 동물은 대조군으로 사용되었다. 동물에게 일주일에 두 번 약물을 투여하고 연구 중간 중간에 심장 채혈을 통해 혈장 샘플을 수집하였다. 결과를 도 15에 제시하였다. 또한 순환 인간 T 세포를 유세포 분석법으로 분석하여 BTLA 발현을 특성화하고, 인간 T 세포를 열거하고, 활성화 마커 CD25를 특성화했다. 결과를 도 19에 나타냈다. 6G3 IgG4는 모든 용량에서 인간 T 세포에서 BTLA 발현을 감소시켰고, 용량-의존적 방식으로 T 세포 확장을 억제했으며 활성화 마커 CD25의 발현을 감소시켰다.

두 연구의 시노몰구스 원숭이로부터 혈액 샘플을 분석했다. 첫 번째 연구(n=180)는 3개의 투여 그룹(10mg/kg IV; 10mg/kg SC; 및 1mg/kg SC)으로 구성되었다. 모든 동물에게 단일 용량의 6G3 IgG4를 IV 또는 SC로 투여하고 투여 전, 투여 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 168, 240, 336, 504, 672, 840시간 후 모든 그룹의 모든 동물에서 혈액 샘플을 수집하였다. 사전-투여 샘플 및 비히클 대조군 투여 동물이 대조군으로 사용되었다. 결과를 도 16에 제시하였다.

두 번째 연구에서, 시노몰구스 원숭이(n=380)에게 4개의 용량 그룹(10, 50 및 100mg/kg SC 및 100mg/kg IV)으로 6G3을 투여했다. 모든 동물에게 1, 8, 15일째에 6G3 IgG4의 주 용량(weekly dose)을 IV 또는 SC로 투여하고 모든 그룹의 모든 동물에서 1, 8, 15일째에 투여 전, 3, 24, 48, 72, 96시간 후에 혈액 샘플을 수집하였다. 결과를 도 17에 제시하였다. 6G3 IgG4의 혈청 수준 또한 측정하였다. 결과를 도 18에 제시하였다.

측정가능한 수준의 sBTLA가 IgG4 이소타입 대조군 또는 CTLA-4-Ig를 투여한 인간 PBMC 이식된 NOD scid 마우스의 샘플, 또는 시노몰구스 원숭이 연구의 사전-투여 또는 비히클 대조군 처리된 시노몰구스 원숭이 샘플에서 검출되지 않았다. 발산된 (shed) sBTLA는 마우스 연구에서 가장 낮은 용량 그룹(1 mg/kg)을 제외하고 6G3 IgG4를 투여한 모든 시노몰구스 원숭이의 혈청 샘플과 인간 PBMC 이식된 NOD scid 마우스의 모든 혈장 샘플에서 검출되었다. 상기 결과는 BTLA가 B 및 T 세포의 표면에서 발산되고 상기 sBTLA가 생체 내 6G3 IgG4 활성의 약역학적 마커임을 시사한다.

실시예 18

본 실시예는 6G3 IgG4가 시노몰구스 원숭이에서 수용체 점유(receptor occupancy)를 달성하고 T 및 B 세포 상의 BTLA 발현을 감소시킴을 보여준다.

용량 범위 탐색 연구(dose range finding study, DRFS)에서 유세포 분석법을 사용하여 시노몰구스 원숭이 말초 혈액을 분석하여 여러 용량의 6G3 IgG4의 효과를 확인하였다. 동물에게 4가지 상이한 치료 그룹(10 mg/kg SC, 50 mg/kg SC, 100 mg/kg SC, 100 mg/kg IV) 및 1개의 대조군으로 나누어 6G3 IgG4를 투여했다.

6G3 IgG4는 비히클 대조군 테스트 동물과 비교하여 T 세포, B 세포 및 NK 세포 절대 수(absolute count) 또는 백분율 분포에서 유의미한 변화를 일으키지 않았다. 형광색소 표지된 약물(6G3 IgG4-DyL488)의 결합은 비히클 대조군 처리된 그룹에 비해 6G3 IgG4를 투여한 모든 동물에서 억제되었으며, 도 20과 나타낸 바와 같이 6G3 IgG4의 BLTA의 수용체 점유가 T 세포의 경우 80% 이상, B 세포의 경우 ~70% 임을 보여준다.

6G3 IgG4를 투여한 모든 동물은 비히클 대조군 처리된 동물에 비해 형광색소 표지된 비경쟁 항-BTLA 항체(클론 10D8)로 검출했을 때 T세포 및 B세포에서 BTLA 표면 발현이 감소되었다. 도 20에 나타낸 바와 같이 T세포 및 B세포에서 BTLA의 표면 발현이 각각 ~75%, ~50% 감소했다.

상대적으로 느리게 발생하는 T세포와 B세포의 BTLA 발현 손실에 비해 매우 빠르게 발생하는 T세포와 B세포의 수용체 점유 속도에서 차이가 있는 것으로 나타났다. 이것은 6G3 IgG4 의존적 메커니즘이 BTLA 발산으로 이어진다는 것을 시사한다. 항-약물 항체(anti-drug antibodies, ADA)가 생긴 두 동물은 T 및 B 세포에서 수용체 점유의 일부 손실과 BTLA 발현의 회복을 보여주었다.

실시예 19

본 실시예는 BTLA 세포외 도메인(extracellular domain, ECD)이 막관통 도메인(transmembrane domain) 근처의 제안된 인식 부위에서 세린 프로테아제 3에 의해 절단됨을 보여준다.

프로테이나제 3(Proteinase 3, PR3)은 호중구 활성화 시 세포외 공간으로 방출되는 호중구 세린 프로테아제이다. PR3는 이전에 체크포인트 수용체 T세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 3(TIM-3)을 절단하여 세포 표면의 TIM-3 수준을 감소시키는 것으로 나타났다.

6개의 다른 레인을 정제된 재조합 PR3 및/또는 BTLA-ECD와 함께 최대 60분 동안 인큐베이션하였다. 그들은(1) PR3 대조군,(2) PR3 60m 대조군,(3) BTLA 대조군,(4) PR3+BTLA 0m,(5) PR3 + BTLA 30m, 및(5) PR3 + BTLA 60m로 구성된다.

공동-인큐베이션 후, 용해성 BLTA-ECD는 여러 개의 더 작은 단편으로 절단되었으며, 이는 PR3가 BTLA를 절단하는 능력을 가짐을 보여준다. 서열의 분석은 적어도 하나의 BTLA-ECD의 C-말단 쪽으로 PR2 인식 모티프를 제안한다.

실시예 20

본 실시예는 6G3 IgG4가 건강한 대조군(HC) 및 아토피성 피부염(AD) 도너에서 T 세포 증식 및 표면 BTLA 발현을 감소시킴을 보여준다.

HC 또는 AD 도너의 PBMC를 0.5μM CFSE로 표지한 후, 100 nM의 6G3 IgG4 또는 이소타입 대조군(IgG4-HyHel)의 존재 또는 부재 하에 72시간 동안 용해성 항-CD3(0.5ng/mL, Biolegend, cat# 300332) 및 용해성 항-CD28(0.5ng/mL, Biolegend, cat# 302943)로 자극하였다. 증식 세포는 CFSE 희석에 의해 결정되었다.

도 21a는 6G3 IgG4 처리된 CD3+ T 세포에 대한 이소타입 대조군 히스토그램을 오버레이하여 표시한 HC 및 AD 도너의 CFSE 히스토그램을 제공한다. 도 21b는 T-세포 증식 감소 백분율(왼쪽) 및 분열 지수(division index)(오른쪽)을 나타낸다. 분열 지수는 각 세대의 분열 수를 원래 세포 수로 나눈 값의 합계이며, NovoExpress 소프트웨어 자동 세포 주기 증식 분석으로 계산하였다. HC 및 AD 도너 PBMC 배양 상청액의 IFNγ 수준은 100 nM의 6G3 IgG4 또는 이소타입 대조군의 존재 또는 부재 하에 항-CD3 및 항-CD28 자극 72시간 후 Mesoscale MDS 분석에 의해 측정되었다. 결과를 도 21c에 나타냈다. 도 21d는 AF647 접합된 항-BTLA(클론 #10D8, AnaptysBio.)로 결정된 HC 및 AD 도너 CD3+ T 세포의 BTLA 표면 발현(평균 형광 강도(MFI)로 플롯팅됨)을 보여준다.

상기 결과는 6G3 IgG4가 대조군에 비해 T 세포 증식 및 표면 BTLA 발현을 감소시킴을 보여준다.

본원에 인용된 간행물, 특허 출원 및 특허를 포함한 모든 참조는 각 참조가 개별적으로 및 구체적으로 참조에 의해 통합되는 것으로 표시되고 각 참조가 이의 전문이 본원에 명시된 것과 동일한 범위로 참조로서 통합된다.

본 발명을 기술하는 맥락에서(특히 다음 청구항의 맥락에서) "a" 및 "an", "the" 및 "적어도 하나" 및 이와 유사한 지시어의 사용은 본원에 달리 명시되거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 단수 및 복수를 모두 커버하는 것으로 이해되어야 한다. 하나 이상의 항목 목록 뒤에 "적어도 하나"라는 용어를 사용하는 경우(예: "A와 B 중 적어도 하나"), 본원에 달리 명시되거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 나열된 항목(A 또는 B) 중에서 선택된 항목 하나 또는 나열된 항목 중 둘 이상의 조합(A와 B)을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "포함하는(comprising)", "갖는", "포함하는(including)" 및 "함유하는"은 달리 명시되지 않는 한 개방형 용어(즉, "포함하되 이에 제한되는 것은 아닌" 이라는 의미)로 이해되어야 한다. 본원에서 값의 범위의 기재는 본원에 달리 명시되지 않는 한, 그 범위에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하기 위한 약식 방법일 뿐이며, 각각의 개별 값은 본원에 개별적으로 기재된 것처럼 본 명세서에 통합된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에 달리 명시되거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적절한 순서로 수행할 수 있다. 본원에서 제공하는 모든 실시예 또는 예시적인 언어(예: "예를 들어(such as)")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 분명하게 하기 위한 것이며, 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범위에 제한을 가하는 것은 아니다. 본 명세서의 어떤 언어도 청구되지 않은 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.

본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 알려진 최선의 모드를 포함하여 본 발명의 바람직한 구체예가 본원에 기재된다. 이러한 바람직한 구체예의 변형은 전술한 기재을 읽을 때 당업자에게 명백해질 수 있다. 발명자들은 숙련된 기술자가 이러한 변형을 적절하게 채택할 것을 기대하고, 발명자는 본 발명이 여기에 구체적으로 기재된 것과 달리 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 적영되는 법률이 허용하는 바에 따라 본원에 첨부된 청구범위에 인용된 대상 물질(subject matter)의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 또한, 본원에서 달리 명시하거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한, 상기 요소들의 모든 가능한 변경의 임의의 조합은 본 발명에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> AnaptysBio, Inc. <120> B AND T LYMPHOCYTE ATTENUATOR (BTLA) MODULATORS AND METHOD OF USING SAME <130> 758015 <150> US 63/192,984 <151> 2021-05-25 <150> US 63/105,067 <151> 2020-10-23 <160> 234 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asn Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala 115 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 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MISC_FEATURE <222> (95)..(95) <223> Xaa is absent or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(97) <223> Xaa is Tyr or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100)..(100) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (105)..(105) <223> Xaa is Asn or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (106)..(106) <223> Xaa is Asp, Ser, Phe, Tyr, Val, Gly, Thr, Arg, Ile, Leu or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (110)..(110) <223> Xaa is Arg or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (111)..(111) <223> Xaa is Trp, Arg, Phe, Leu, Asn, Tyr, Pro, Ile, Val, Ala, Ser, Gly, Arg or Lys <400> 193 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Xaa Phe Ser Xaa Ser 20 25 30 Xaa Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Xaa Gly Xaa Xaa Asp Thr Asn Tyr Xaa Gly Lys 50 55 60 Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Xaa Thr Xaa Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Glu Leu Xaa Ser Leu Arg Ser Glu Xaa Thr Ala Val Xaa Tyr 85 90 95 Xaa Cys Ala Xaa Ser Gly Thr Phe Xaa Xaa Gly Asn Tyr Xaa Xaa Tyr 100 105 110 Phe Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 <210> 194 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Ala or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Leu or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa is Ala or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is Ser or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa is His, Asn or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa is Pro or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Ala or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa is Thr or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> Xaa is Asn, Leu, Gln, Gly, Phe, Val, Lys, Ser, Arg, Thr, His or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (71)..(71) <223> Xaa is Phe or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(90) 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Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 209 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 209 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn 20 25 30 Val 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Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 219 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 219 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 220 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 220 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 221 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 221 Asp Tyr Thr Ile His 1 5 <210> 222 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 222 Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Glu Phe Lys 1 5 10 15 Val <210> 223 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 223 Arg Asn Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr 1 5 <210> 224 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 224 Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 225 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 225 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 <210> 226 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 226 Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 227 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 227 Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala Asn 1 5 10 <210> 228 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 228 Leu His Phe Glu Pro Val Leu 1 5 <210> 229 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 229 His Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys 1 5 10 15 Tyr Cys Ala Asn 20 <210> 230 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 230 Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu 1 5 10 <210> 231 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 231 Leu His Phe Glu Pro Val Leu 1 5 <210> 232 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 232 Tyr Ile Lys 1 <210> 233 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 233 Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala 1 5 10 <210> 234 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 234 Ile Glu Ser His Ser Thr Thr Leu 1 5

Claims

면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 표 3에 제시된 BTLA-결합제로서,
상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은:
(a) X¹SX²MN(서열번호 195)을 포함하는 CDRH1, 여기서 X¹은N 또는 T이고, 및 X²는W, F, H, G, P, R, K, D, S, L, V, N, 또는 Y이고
(b) RIYPX¹GX²X³DTNYX⁴GKFK(서열번호 196)을 포함하는 CDRH2 , 여기서:
X¹은부재하거나 또는A이고;
X²는D, Y, Q, G, L, F, H, S, P, R, 또는 T이고;
X³은 G, Y, A, F, S, D, V, T, E, K, 또는 R이고; 및
X⁴는 N, V, Q, R, A, F, Y, S, G, P, 또는 T이고;
및
(c) X¹SGTFX²X³GNYX⁴X⁵YFDV(서열번호 197)을 포함하는 CDRH3, 여기서:
X¹은 K 또는 R이고;
X²은N 또는 D이고;
X³은 D, S, F, Y, F, V, S, G, T, R, I, L, 또는 E이고;
X⁴는 R 또는 H이고; 및
X⁵는 W, R, F, L, N, Y, P, I, V, A, S, G, R, 또는 K이고;
을 포함하거나,
또는 상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 서열번호 43-156 중 어느 하나, 또는 적어도 이의 CDR; 또는 이와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이고;
및
상기 면역글로불린 경쇄 가변 영역은:
(a) RX¹SENIYX²X³LA(서열번호 198)을 포함하는 CDRL1, 여기서
X¹는A 또는 V이고;
X²는S 또는 N이고; 및
X³은H, N, 또는 Y이고;
(b) X¹AX²NLAX³(서열번호 199)을 포함하는 CDRL2, 여기서
X¹은A 또는 N이고;
X²는T 또는 K이고; 및
X³은N, L, Q, G, F, V, K, S, R, T, H, 또는 P이고; 및
(c) QX¹FX²GPPLT(서열번호 200)을 포함하는 CDRL3, 여기서
X¹은L 또는 H이고; 및
X²는W, F, Y, P, N, V, K, M, L, G, 또는 S이고;
를 포함하거나,
또는 상기 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 서열번호 157-192 중 어느 하나, 또는 적어도 이의 CDR; 또는 이와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열인 것인, BTLA 결합제.
청구항 1에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYX¹FSX²SX³MNWVRQAPGQGLEWMGRIYPX⁴GX⁵X⁶DTNYX⁷GKFKGRVTITADKX⁸TX⁹TAYMELX¹⁰SLRSEX¹¹TAVX¹²YX¹³CAX¹⁴SGTFX¹⁵X¹⁶GNYX¹⁷X¹⁸YFDVWGKGTTVTVSSA(서열번호 193)을 포함하고, 여기서
X¹는A 또는 V이고;
X²는 N 또는 T이고;
X³은 W, F, H, G, P, R, K, D, S, L, V, N, 또는 Y이고;
X⁴ 는부재하거나 또는A이고;
X⁵ 는D, Y, Q, G, L, F, H, S, P, R, 또는 T이고;
X⁶ 은 G, Y, A, F, S, D, V, T, E, K, 또는 R이고;
X⁷ 은 N, V, Q, R, A, F, Y, S, G, P, 또는 T이고;
X⁸은S 또는 F이고;
X⁹는 S, T, 또는 N이고;
X¹⁰은S 또는 R이고;
X¹¹은 D 또는 V이고;
X¹²은부재하거나 또는Y이고;
X¹³은Y 또는 F이고;
X¹⁴는K 또는 R이고;
X¹⁵는 N 또는 D이고;
X¹⁶은 D, S, F, Y, F, V, S, G, T, R, I, L, 또는 E이고;
X¹⁷은 R 또는 H이고; 및
X¹⁸은 W, R, F, L, N, Y, P, I, V, A, S, G, R, 또는 K인 것인, BTLA-결합제.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 43-156 중 어느 하나, 또는 적어도 이의 CDR; 또는 이와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, BTLA-결합제.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 서열: X¹IQX²TQSPSSLSASVGDRVTITCRX³SENIYX⁴X⁵LAWYQQKX⁶GKAPKLLIYX⁷AX⁸NLAX⁹GVPSRFSGSGSGTDX¹⁰TLTISSLQPEDFATYYCQX¹¹FX¹²GPPLTFGGGTKVEIKR(서열번호 194)을 포함하고, 여기서
X¹는A 또는 D이고;
X²는 L 또는 M이고;
X³은A 또는 V이고;
X⁴는S 또는 N이고;
X⁵는H, N, 또는 Y이고;
X⁶은 P 또는 Q이고;
X⁷은 A 또는 N이고;
X⁸은 T 또는 K이고;
X⁹는 N, L, Q, G, F, V, K, S, R, T, H, 또는 P이고;
X¹⁰은F 또는 Y이고;
X¹¹은 L 또는 H이고;
X¹²는 W, F, Y, P, N, V, K, M, L, G, S인 것인, BTLA-결합제.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 157-192 중 어느 하나, 또는 적어도 이의 CDR; 또는 이와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, BTLA-결합제.
청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 서열번호 201을 포함하는 CDRH1;
(b) 서열번호 202을 포함하는 CDRH2;
(c) 서열번호 203을 포함하는 CDRH3;
(d) 서열번호 204을 포함하는 CDRL1;
(e) 서열번호 205를 포함하는 CDRL2; 및
(f) 서열번호 206을 포함하는 CDRL3을 포함하는 것인, BTLA-결합제.
청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 144의 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 적어도 이의 CDR; 및 서열번호 174 의 면역글로불린 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 이의 CDR을 포함하거나; 또는 서열번호 144와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 174의 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, BTLA-결합제.
면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 표 2에 제시된 BTLA-결합제로서:
상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은:
(a) Asp Tyr Thr Ile His(서열번호 27)을 포함하는 CDRH1,
(b) Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe Lys Xaa(서열번호 30)을 포함하는 CDRH2 , 여기서 Xaa는 아스파르트산(Asp) 또는 발린(Val)이고;
(c) Arg Xaa1 Xaa2 Tyr Xaa3 Met Xaa4 Tyr(서열번호 32)을 포함하는 CDRH3, 여기서:
Xaa1은 아스파라진(Asn) 또는 세린(Ser)이고,
Xaa2는 티로신(Tyr) 또는 히스티딘(His)이고,
Xaa3은 알라닌(Ala) 또는 발린(Val)이고, 및
Xaa4는 글루탐산(Glu) 또는 아스파르트산(Asp)이고;
을 포함하거나,
또는 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1-15, 207, 208, 217, 또는 218 중 어느 하나, 또는 적어도 이의 CDR, 또는 이와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
및
상기 면역글로불린 경쇄 가변 영역은:
(a) Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn Val Ala(서열번호 36)을 포함하는 CDRL1;
(b) Ser Ala Ser Tyr Arg Xaa Ser(서열번호 39)을 포함하는 CDRL1, 여기서 Xaa는 티로신(Tyr) 또는 세린(Ser)이고; 및
(c) Gln Gln Tyr Xaa1 Xaa2 Tyr Pro Tyr Thr(서열번호 41)을 포함하는 CDRL3, 여기서:
Xaa1은 세린(Ser) 또는 아스파라진(Asn)이고, 및
Xaa2는 트레오닌(Thr) 또는 세린(Ser)이고;
을 포함하거나,
또는 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 16-25, 209, 210, 219, 또는 220 중 어느 하나, 또는 적어도 이의 CDR, 또는 이와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, BTLA 결합제.
청구항 87에 있어서, 상기 CDRH2은 서열번호 31을 포함하고; 및 상기 CDRH3은 서열번호 33 또는 34를 포함하는 것인, BTLA-결합제.
청구항 8 또는 9에 있어서, 상기 CDRL2은 서열번호 40을 포함하고; 및 상기 CDRL3은 서열번호 42를 포함하는 것인, BTLA-결합제.
청구항 8 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제는 아미노산 서열 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Xaa1 Thr Xaa2 Thr Asp Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe Lys Xaa3 Arg Val Thr Ile Thr Xaa4 Asp Xaa5 Ser Xaa6 Xaa7 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Xaa8 Cys Ala Arg Arg Xaa9 Xaa10 Tyr Xaa11 Met Xaa12 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala(서열번호 26)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것이고, 여기서:
Xaa1는 페닐알라닌(Phe) 또는 티로신(Tyr)이고,
Xaa2는 페닐알라닌(Phe) 또는 류신(Leu)이고,
Xaa3는 아스파르트산(Asp) 또는 발린(Val)이고,
Xaa4는 알라닌(Ala) 또는 아르기닌(Arg)이고,
Xaa5는 리신(Lys) 또는 트레오닌(Thr)이고,
Xaa6은 알라닌(Ala) 또는 세린(Ser)이고,
Xaa7은 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr)이고,
Xaa8는 티로신(Tyr) 또는 페닐알라닌(Phe)이고,
Xaa9는 아스파라진(Asn) 또는 세린(Ser)이고,
Xaa10은 티로신(Tyr) 또는 히스티딘(His)이고,
Xaa11은 알라닌(Ala) 또는 발린(Val)이고, 및
Xaa12은 글루탐산(Glu) 또는 아스파르트산(Asp)인 것인, BTLA-결합제.
청구항 8 내지 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제는 서열번호 1 내지 15, 207, 208, 217, 또는 218 중 어느 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 적어도 이의 CDR, 또는 이와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, BTLA-결합제.
청구항 8 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제는 아미노산 서열 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Xaa Pro Lys Xaa Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Xaa Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Xaa Cys Gln Gln Tyr Xaa Xaa Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg(서열번호 35)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서
Xaa1는 세린(Ser) 또는 프롤린(Pro)이고,
Xaa2는 프롤린(Pro) 또는 류신(Leu)이고,
Xaa3은 티로신(Tyr) 또는 세린(Ser)이고,
Xaa4는 티로신(Tyr) 또는 페닐알라닌(Phe)이고,
Xaa5는 세린(Ser) 또는 아스파라진(Asn)이고, 및
Xaa6은 트레오닌(Thr) 또는 세린(Ser)인 것인, BTLA-결합제.
청구항 8 내지 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제는 서열번호 16-25, 209, 210, 219, 또는 220 중 어느 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 이의 CDR, 또는 이와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, BTLA-결합제.
청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 항체, 항체 접합체, 또는 이의 항원-결합 단편, 선택적으로 IgG1 또는 IgG4 항체인 것인, BTLA-결합제.
청구항 15에 있어서, F(ab')₂단편, Fab'단편, Fab 단편, Fv 단편, scFv 단편, dsFv 단편, dAb 단편, 또는 단일 사슬(single chain) 결합 폴리펩티드인 것인, BTLA-결합제.
청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 BTLA-결합제의 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드를 코딩하고, 선택적으로 벡터 내에서 코딩하는 것인, 핵산 서열.
청구항 17의 핵산을 포함하는 세포.
(a) 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 BTLA-결합제 또는 이를 코딩하는 핵산 및 (b) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 BTLA-결합제, 이를 코딩하는 핵산, 또는 이를 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 BTLA 신호전달을 조절하는 방법.
청구항 20에 있어서, 상기 포유동물은 BTLA 조절에 반응하여 치료되는 장애를 갖는 것인, 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 장애는 자가면역 또는 염증성 질환인 것인, 방법.
청구항 21 또는 22에 있어서, 상기 질환은 류마티스성 관절염, 이식편 대 숙주 질환, 건선 또는 염증성 장질환인 것인, 방법.
청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 따른 BTLA-결합제를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 상기 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 세포 내에서 발현하는 것을 포함하는 것인, 방법.
혈액, 혈장, 혈청 또는 조직에서 용해성 BTLA를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플을 청구항 8 내지 14 중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 단계를 포함하며, 선택적으로 상기 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플 내 용해성 BTLA는 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 항체에 결합되어 있거나, 또는 상기 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플이 청구항 8 내지 14 중 어느 한 항의 항체 및 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 항체와 접촉되어 있는 것인, 방법.
개체에서 BTLA 결합제의 약리 활성을 검출, 측정 또는 모니터링하거나, 또는 BTLA 결합제로 처리할 개체를 선택하는 방법으로서, 상기 방법은 BTLA 결합제가 투여된 개체의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플에서 용해성 BTLA(soluble BTLA , sBTLA)를 검출하는 것을 포함하는 것인, 방법.
청구항 26에 있어서, 상기 BTLA 결합제는 항-BTLA 항체인 것인, 방법.
청구항 26 또는 27에 있어서, 상기 BTLA 결합제는 HVEM에 대한 BTLA 결합을 실질적으로 저해하지 않으면서 BTLA에 결합하거나, 또는 BTLA에 결합하여 BTLA 신호를 강화하는 항-BTLA 항체인 것인, 방법.
청구항 26 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTLA 결합제는 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 BTLA 결합제인 것인, 방법.
청구항 26 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플 또는 이의 분획을 sBTLA에 결합하는 항-BTLA 캡처 항체와 접촉시켜 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플 내 sBTLA를 검출하는 것을 포함하는 것인, 방법.
청구항 30에 있어서, 상기 항-BTLA 캡처 항체는 청구항 8 내지 14 중 어느 한 항의 항체인 것인, 방법.
청구항 26 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플 내 sBTLA 농도를 기준(reference) sBTLA 농도와 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
청구항 32에 있어서, 상기 기준 sBTLA 농도는 BTLA 결합제 투여 전 동일한 환자의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플 내 sBTLA의 농도이거나; 또는 BTLA 결합제를 투여받지 않은 동일한 유형의 다른 정상적, 무-질환의 개체의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 내 sBTLA 농도이거나, 또는 그러한 개체 집단의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 내 sBTLA 농도의 통계적 분석에 의해 수립된 기준 sBTLA 농도인 것인, 방법.
청구항 26 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, BTLA 결합제를 개체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
청구항 26 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 BTLA 결합제가 투여된 개체의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플 내 sBTLA의 농도를 상기 개체에게 BTLA 결합제가 투여되기 전 또는 후의 상이한 시점에서 동일한 개체의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플 내 sBTLA의 농도와 비교하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
청구항 26 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플에서 검출된 sBTLA는 BTLA 결합제에 결합된 sBTLA인 것인, 방법.
청구항 32에 있어서, 상기 기준 sBTLA 농도는 개체의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플 또는 개체 집단으로부터의 혈액, 혈장, 혈청 또는 조직 샘플을 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 BTLA 결합제 및 청구항 8 내지 14 중 어느 한 항의 캡처 항체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의해 수립되는 것인, 방법.
청구항 20 내지 37 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 BTLA 결합제, 청구항 8 내지 14 중 어느 한 항의 BTLA 결합제, 또는 둘 모두를 포함하는 조성물.
포유동물에서 BTLA 조절에 반응하는 장애를 치료하기 위한 청구항 8 내지 14 중 어느 한 항의 BTLA 결합제.
포유동물에서 BTLA 조절에 반응하는 장애를 치료하기 위한 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 BTLA 결합제.
청구항 40의 BTLA 결합제로서, 상기 BTLA 결합제는, 서열번호 144의 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 적어도 이의 CDR; 및 서열번호 174 면역글로불린 경쇄 가변 영역 또는 적어도 이의 CDR을 포함하거나; 또는 서열번호 144와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 174의 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, BTLA 결합제.
청구항 39 내지 41 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장애는 자가면역 또는 염증성 질환인 것인, 방법.
청구항 39 내지 41 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환은 류마티스성 관절염, 이식편 대 숙주 질환, 건선 또는 염증성 장질환인 것인, 방법.