CN116685603A - B和t淋巴细胞衰减因子（btla）调节剂及其使用方法 - Google Patents

B和t淋巴细胞衰减因子（btla）调节剂及其使用方法 Download PDF

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Abstract

一种BTLA结合剂和所述结合剂的免疫球蛋白重链和轻链多肽，以及使用所述BTLA结合剂治疗对BTLA激动作用有反应的病症或疾病，如自身免疫性疾病或炎性疾病的方法。

Description

B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)调节剂及其使用方法
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2021年5月25日提交的美国临时专利申请63/192,984和2020年10月23日提交的美国临时专利申请63/105,067的优先权，其全部公开内容由此通过引用并入。
以电子方式提交的材料的通过引用的并入
通过引用整体并入本文的是与此同时提交的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表。
背景技术
T淋巴细胞通过T细胞受体(TCR)结合和来自共刺激分子的阳性信号的共同作用而从幼稚态(state)被激活。相反，共抑制分子通过传递阴性信号来抵消阳性共刺激信号而在调节T细胞活性中发挥重要作用。共抑制分子作为检查点来维持对自身的免疫耐受性并在解决如感染和炎症等免疫损伤后控制激活的T细胞。
CD28是T细胞上的主要共刺激分子，其一旦与抗原呈递细胞(APC)表面上的配体B7.1或B7.2结合，就传递增强T细胞增殖和分化的细胞内信号，同时伴随TCR结合。当相同的配体与T细胞上的共抑制分子细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)结合时，T细胞增殖和效应子功能受到抑制(Chambers等人,《免疫学年评(Ann.Rev.Immunol.)》,19:565-594,2001；Egen等人,《自然-免疫学(Nature Immunol.)》,3:611-618,2002)。类似地，当表达PD-L1的细胞与T细胞上的共抑制分子PD-1结合时，T细胞增殖和效应子功能也受到抑制(Carter等人《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol.)》,32:634-43,2002)。
阴性检查点信号的功能障碍可能通过阻止通常控制自身反应性B和T淋巴细胞的抑制信号而导致慢性炎性病状。在患有自身免疫性病症的患者中，免疫系统对正常身体组织的反应就像它们是外来的一样，并且组织可能被激活的T细胞和B细胞浸润，这些细胞已经破坏了对自身抗原的耐受性。因此，自身免疫性T和B淋巴细胞介导炎症和组织损伤。表达如B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)和PD-1等共抑制分子的淋巴细胞通常被组织中表达相对应配体的其它免疫或非免疫细胞抑制。
在各种癌症的动物模型中，已表明共抑制分子的敲除或共抑制相互作用的药理学阻断可释放抑制性破坏并诱导肿瘤特异性T细胞群的扩增，并且引导它们攻击和杀灭肿瘤细胞。BTLA基因敲除的小鼠对实验性自身免疫性脑脊髓炎的敏感性增加(Watanabe等人,《自然-免疫学(Nat.Immunol.)》,4:670-679,2003)。相反，已表明靶向小鼠BTLA的激动剂抗体可抑制T细胞活性，并且已在移植物抗宿主病(GvHD)小鼠模型中证明其功效(Albring等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》,207:2551-2559,2010)。
BTLA的配体是疱疹病毒进入介质(HVEM)，也被称为肿瘤坏死因子受体超家族成员14(TNFRSF14)。HVEM也是一种阳性共刺激分子，其结合两种分泌生长因子，淋巴毒素α和LIGHT，并且也供单纯疱疹病毒(HSV)进入细胞所用。肿瘤细胞或其它免疫细胞上表达的HVEM使BTLA在T细胞上结合，产生了阴性抑制信号。结合并激动BTLA的抗BTLA抗体可以诱导类似于天然配体HVEM传递的直接阴性信号，从而抑制自身免疫性和炎性疾病中的自身反应性T细胞和B细胞反应。此外，与BTLA结合而不干扰天然HVEM-BTLA相互作用的激动剂抗体可以增强天然共抑制信号。
因此，需要能够结合BTLA并调节免疫检查点信号的试剂。
发明内容简述
本文提供了包含免疫球蛋白重链和轻链多肽的BTLA结合剂。本文还提供了一种使用BTLA结合剂调节哺乳动物中的HVEM和BTLA之间的相互作用和/或T细胞反应的方法。
还提供了相关的组合物和方法，这将从以下详细描述中显而易见。
附图的几点看法的简要说明
图1描绘了6G3抗体与人BTLA和食蟹猴BTLA胞外结构域的表面等离子体共振结合动力学的结果。
图2是描绘6G3抗体与人BTLA和食蟹猴BTLA胞外结构域的动力学排除分析法结合动力学的结果的图。
图3是描绘6G3抗体与用人BTLA和食蟹猴BTLA稳定转染的293c18细胞的结合的结果的图。
图4是描绘6G3抗体与正常供体人外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD20+B细胞的结合的结果的图。
图5A是描绘6G3抗体与正常食蟹猴外周血CD3+T细胞的结合的结果的图。
图5B是描绘6G3抗体与正常食蟹猴外周血CD20+B细胞的结合的结果的图。
图5C是描绘参考抗BTLA抗体与正常食蟹猴外周血CD3+和CD3-细胞的结合的结果的流式细胞术点图。
图5D是描绘6G3抗体与正常食蟹猴外周血CD3+和CD3-细胞的结合的结果的流式细胞术点图。
图6是描绘竞争测定的结果的图，其示出了抗BTLA抗体在与用人BTLA稳定转染的293c18细胞结合方面与HVEM-Fc和预先形成的HVEM-Fc/三聚LIGHT复合物竞争的能力。
图7A是人BTLA胞外结构域(黑色)的晶体结构的带状模型图，其与人HVEM胞外结合结构域(灰色)的晶体结构的空间填充模型对接。所述模型描绘了氢-氘交换实验的结果，其绘出了由6G3抗体结合的人BTLA上的肽。
图7B是人BTLA胞外结构域(黑色)的晶体结构的带状模型图，其与人HVEM胞外结合结构域(灰色)的晶体结构的空间填充模型对接。所述分子相较于图7A中示出的分子视图旋转了30°并且描绘了氢-氘交换实验的结果，其绘出了由参考抗BTLA拮抗剂抗体结合的人BTLA上的肽。
图8是描绘当BTLA和HVEM在相同细胞上表达时，在测量LIGHT诱导的HVEM信号传导的HVEM-NF-κB HEK 293萤光素酶报告基因测定中的6G3抗体的抑制活性的图。
图9A是描绘测量转染293c18细胞的表面上的BTLA和HVEM的缔合的荧光共振能量转移测定的结果的图，其示出了抗BTLA抗体与BTLA和HVEM竞争在相同细胞表面上结合的能力。
图9B是描绘测量转染293c18细胞的表面上的BTLA和HVEM的缔合的荧光共振能量转移测定的结果的图，其示出了荧光供体抗BTLA抗体与抗HVEM受体抗体生成能量转移信号的能力。
图10是描绘当BTLA和HVEM在不同细胞上表达时，在测量BTLA诱导的HVEM信号传导的HVEM-NF-κB HEK 293萤光素酶报告基因测定中的6G3抗体的部分抑制活性的图。
图11是描绘在SHP2募集PathHunter Jurkat BTLA信号传导测定中作为可溶性抗体加入的6G3抗体的激动剂活性的图。
图12是描绘在SHP2募集PathHunter Jurkat BTLA信号传导测定中的抗BTLA抗体的抑制活性的图，其中BTLA信号传导由HVEM在转染U-2OS细胞系上诱导。
图13是描绘在SHP2募集PathHunter Jurkat BTLA信号传导测定中的6G3抗体的激动剂活性的图，其中加入了FcγRIa转染的U-2OS细胞以提供FcγR结合。
图14A是根据本发明的实施方式的用于本文所述的移植物抗宿主病研究的异种NSG/Hu-PBMC小鼠模型的示意图。
图14B是示出根据本发明的实施方式的本文所述的NSG/Hu-PBMC移植物抗宿主病研究的时间线、给药方案和模型组的示意图。
图14C是描绘将6G3抗体以1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg每周给药两次的动物组在NSG/Hu-PBMC移植物抗宿主病研究中的总存活的结果的图。
图15是示出在将6G3抗体以1、3和10mg/kg(IP)每周给药两次后，GvHD人源化鼠模型中的每个剂量组的人sBTLA的个体和平均(SD)浓度的图。在研究的中点经由心脏放血收集血浆样品。
图16是示出在将6G3 IgG4给药后，食蟹猴中的每个剂量组的食蟹猴sBTLA的平均(SD)血清浓度的图。对所有动物IV或SC施用单剂量的6G3 IgG4，并且在给药前以及给药后3、6、12、24、48、72、96、168、240、336、504、672和840小时从所有组中的所有动物收集血液样品。
图17是示出在将6G3 IgG4给药后，食蟹猴中的每个剂量组的食蟹猴sBTLA的平均(SD)血清浓度的图。所有动物在第1天、第8天和第15天IV或SC施用周剂量的6G3 IgG4，并且在第1天、第8天和第15天：给药前以及给药后3、24、48、72、96小时从所有组中的所有动物收集血液样品。
图18是示出在将6G3 IgG4给药后，食蟹猴中的每个剂量组的6G3 IgG4的平均(SD)血清浓度(μg/ml)的图。所有动物在第1天、第8天和第15天IV或SC施用周剂量的6G3IgG4，并且在第1天、第8天和第15天：给药前以及给药后3、24、48、72、96小时从所有组中的所有动物收集血液样品。
图19是示出在将6G3 IgG4、同型对照或CTLA-4-Ig对照给药后，食蟹猴中的每个剂量组的各种数据的四个图。第一个图示出了每个剂量组的BTLA表达(MFI)。第二个图示出了每个剂量组的T细胞BTLA+百分比。第三个图示出了每个剂量组的每μl血液中的人T细胞的数量。第四个图示出了每个剂量组的CD25阳性百分比。
图20是示出在将6G3 IgG4给药后，食蟹猴中的每个剂量组的T细胞和B细胞的受体占用率和BTLA表面表达的四个图。所有动物在第1天、第8天和第15天IV或SC施用周剂量的6G3 IgG4或对照。第一个图示出了T细胞上的游离受体相对于基线的变化百分比。第二个图示出了T细胞上的BTLA表达相对于基线的变化百分比。第三个图示出了B细胞上的游离受体相对于基线的变化百分比。第四个图示出了B细胞上的BTLA表达相对于基线的变化百分比。
图21A是健康对照和特应性皮炎供体的两个直方图，其呈现为在6G3 IgG4处理的CD3+T细胞上的同型对照的重叠直方图。
图21B是示出健康对照和特应性皮炎供体中的6G3 IgG4对T细胞增殖的减少的两个图，其被示出为增殖(左)和分裂指数(右)的减少百分比。
图21C是示出在存在或不存在100nM 6G3 IgG4或同型对照的情况下的抗CD3和抗CD28刺激后72小时，健康对照和特应性皮炎供体PBMC培养物上清液的IFNγ水平的两个图。
图21D是示出来自健康对照和特应性皮炎供体的CD3+T细胞上的表面BTLA表达水平(以平均荧光强度(MFI)绘制)的图。
具体实施方式
本文提供了一种包含免疫球蛋白重链和轻链多肽的BTLA结合剂。BTLA是一种30千道尔顿(kD)的1型跨膜蛋白，具有免疫球蛋白样胞外结构域、免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸基转换基序(ITSM)。BTLA在B细胞和T细胞上表达，并通过与其受体，即肿瘤细胞或APC上表达的疱疹病毒进入介质(HVEM)相互作用而作为B和T细胞活性的负调节因子(Watanabe等人,《自然-免疫学(Nat.Immunol.)》,4:670-679,2003)。在一些实施方式中，BTLA结合剂与BTLA结合，而不抑制BTLA和HVEM之间的结合。一方面，BTLA结合剂增强了BTLA和HVEM之间的结合。
PD-1结合剂包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，它们各自包含三个互补决定区(CDR)，通常被称为CDR1、CDR2或CDR3。CDR区也可以用术语中分别表示重链或轻链的“H”或“L”来指代，即CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3。给定Ig序列的CDR可以通过几种常规的编号方案中的任何一种来确定，例如Kabat、Chothia、Martin(增强Chothia)、IGMT或AHo(这些是本领域广泛已知的编号方案的常用名称，并且描述于公开的文献中，参见例如Kabat,等人,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of Proteinsof Immunological Interest)》,美国卫生与公众服务部,NIH(1991)，其描述了“Kabat”编号方案；Chothia等人,《免疫球蛋白高变区的典型结构(Canonical Structures for theHypervariable Regions of Immunoglobulins)》,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,196:901-917(1987)和Al-Lazikani等人,《免疫球蛋白的典型结构的标准构象(StandardConformations for the Canonical Structures of Immunoglobulins)》,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,273:927–948(1997)，其描述了“Chothia”编号方案；Abhinandan等人,《对抗体可变结构域的Kabat编号和结构正确编号的分析和改进(Analysis andImprovements to Kabat and Structurally Correct Numbering of Antibody VariableDomains)》,《分子免疫学(Mol.Immunol.)》,45:3832–3839(2008)，其描述了“Martin”或“增强Chothia”编号方案；Lefranc等人,《免疫球蛋白、T细胞受体和Ig样结构域的IMGT独特编号(The IMGT unique numbering for immunoglobulins,T cell Receptors and Ig-likedomains)》,《免疫学家(The Immunologist)》,7:132-136(1999)和Lefranc等人,《免疫球蛋白和T细胞受体可变结构域以及I超家族V样结构域的IMGT独特编号(IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Isuperfamily V-like domains)》,《发育与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》,27:55–77(2003)，其描述了“IMGT”编号方案；和Honegger等人,《免疫球蛋白可变结构域的又一种编号方案：自动建模和分析工具(Yet another numbering scheme for immunoglobulinvariable domains:an automatic modeling and analysis tool)》,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》309:657–670(2001)，其描述了“AHo”编号方案)。本文提供的BTLA结合剂是人造的和非天然存在的。它们是通过实验室技术而生成的，并且因此被适当地认为是包含重组或合成氨基酸序列的重组或合成分子。免疫球蛋白重链和轻链多肽在从产生它们的环境(例如，细胞培养物)中取出并纯化到任何程度的意义上说，它们可以是“分离的”。
根据本公开的一个方面，BTLA结合剂包含BTLA结合剂的免疫球蛋白重链多肽，其包含SEQ ID NO:1-15、207、208、217或218中的任一者的氨基酸序列或至少其CDR；或包含与SEQ ID NO:1-15、207、208、217或218中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)的氨基酸序列。CDR可以使用任何已知的编号方案来确定，例如Kabat、Chothia、Martin(增强Chothia)、IGMT或AHo。在一些实施方式中，CDR1、CDR2和CDR3包含SEQ ID NO:1-15、207、208、217或218的残基31-35(CDRH1)、50-66(CDRH2)和99-106(CDRH3)。
在一些实施方式中，免疫球蛋白重链包含以下CDR：
(a)包含Asp Tyr Thr Ile His(SEQ ID NO:27)的CDRH1；
(b)包含Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Xaa1 PheLys Xaa2(SEQ ID NO：30)的CDRH2，其中Xaa1是赖氨酸(Lys)或谷氨酸(Glu)，并且Xaa2是天冬氨酸(Asp)或缬氨酸(Val)(例如，SEQ ID NO:28、30、31、212或222)；和
(c)包含Arg Xaa1 Xaa2 Tyr Xaa3 Met Xaa4 Tyr(SEQ ID NO:32)的CDRH3，其中Xaa1是天冬酰胺(Asn)或丝氨酸(Ser)，Xaa2是酪氨酸(Tyr)或组氨酸(His)，Xaa3是丙氨酸(Ala)或缬氨酸(Val)，并且Xaa4是谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)。此类CDRH3序列的实例包括例如SEQ ID NO:29、33、34、213或223。
在一些实施方式中，免疫球蛋白重链多肽包含氨基酸序列Gln Val Gln Leu ValGln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys AlaSer Gly Xaa1 Thr Xaa2Thr Asp Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly GlnArg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn AspXaa3 Phe Lys Xaa4 Arg Val Thr Ile Thr Xaa5 Asp Xaa6 Ser Xaa7 Xaa8 Thr Ala TyrMet Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Xaa9 Cys Ala Arg ArgXaa10 Xaa11 Tyr Xaa12 Met Xaa13 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val SerSer Ala(SEQ ID NO:26)或至少其CDR区，其中
Xaa1是苯丙氨酸(Phe)或酪氨酸(Tyr)，
Xaa2是苯丙氨酸(Phe)或亮氨酸(Leu)，
Xaa3是赖氨酸(Lys)或谷氨酸(Glu)，
Xaa4是天冬氨酸(Asp)或缬氨酸(Val)，
Xaa5是丙氨酸(Ala)或精氨酸(Arg)，
Xaa6是赖氨酸(Lys)或苏氨酸(Thr)，
Xaa7是丙氨酸(Ala)或丝氨酸(Ser)，
Xaa8是丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)，
Xaa9是酪氨酸(Tyr)或苯丙氨酸(Phe)，并且
Xaa10是天冬酰胺(Asn)或丝氨酸(Ser)，
Xaa11是酪氨酸(Tyr)或组氨酸(His)，
Xaa12是丙氨酸(Ala)或缬氨酸(Val)，并且
Xaa13是谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)。
在一些实施方式中，所述Ig重链多肽包含SEQ ID NO:26，条件是它保留与SEQ IDNO:1-15、207、208、217或218中的任一者相同的CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。
根据本公开的这个方面，BTLA结合剂的免疫球蛋白轻链多肽可以包含SEQ ID NO:16-25、209、210、219或220中的任一者的氨基酸序列或至少其CDR；或与SEQ ID NO:16-25、209、210、219或220中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。如同所述Ig重链一样，CDR可以使用任何已知的编号方案来确定，例如Kabat、Chothia、Martin(增强Chothia)、IGMT或AHo。在一些实施方式中，CDR1、CDR2和CDR3包含SEQ ID NO:16-25、209、210、219或220的残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)。
在一些实施方式中，所述Ig轻链包含以下CDR：
(a)包含Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn Val Ala(SEQ ID NO:36)的CDRL1；
(b)包含Ser Ala Ser Tyr Arg Xaa Ser(SEQ ID NO:39)的CDRL2，其中Xaa是酪氨酸(Tyr)或丝氨酸(Ser)(例如，SEQ ID NO:37、40、215或225)；和
(c)包含Gln Gln Tyr Xaa1 Xaa2 Tyr Pro Tyr Thr(SEQ ID NO:41)的CDRL3，其中Xaa1是丝氨酸(Ser)或天冬酰胺(Asn)，并且Xaa2是苏氨酸(Thr)或丝氨酸(Ser)(例如，SEQ ID NO:38、41、42、216或226)。
在其它实施方式中，免疫球蛋白轻链多肽包含氨基酸序列Asp Ile Val Met ThrGln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys LysAla Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Xaa1Pro Lys Xaa2 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Xaa3 Ser Gly Val Pro Asp Arg PheSer Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala GluAsp Val Ala Val Tyr Xaa4 Cys Gln Gln Tyr Xaa5 Xaa6 Tyr Pro Tyr Thr Phe GlyGln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg(SEQ ID NO:35)或至少其CDR区，其中
Xaa1是丝氨酸(Ser)或脯氨酸(Pro)，
Xaa2是脯氨酸(Pro)或亮氨酸(Leu)，
Xaa3是酪氨酸(Tyr)或丝氨酸(Ser)，
Xaa4是酪氨酸(Tyr)或苯丙氨酸(Phe)，
Xaa5是丝氨酸(Ser)或天冬酰胺(Asn)，并且
Xaa6是苏氨酸(Thr)或丝氨酸(Ser)。
在一些实施方式中，所述Ig轻链多肽包含SEQ ID NO:35，条件是它保留与SEQ IDNO:16-25、209、210、219或220中的任一者相同的CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。
在本公开的另一方面，BTLA结合剂包含免疫球蛋白重链多肽，其包含SEQ ID NO:43-156中的任一者或至少其CDR；或与SEQ ID NO:43-156中的任一者具有至少80％、85％或90％序列同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。CDR可以使用任何已知的编号方案来确定，例如Kabat、Chothia、Martin(增强型Chothia)、IGMT或AHo。在一些实施方式中，CDR1、CDR2和CDR3包含SEQ ID NO:43-156的残基31-35(CDRH1)、50-66(CDRH2)和99-113(CDRH3)，例外：在SEQ ID NO:66中CDRH1可以是残基50-67，且CDRH3可以是残基100-114；并且在SEQ ID NO:141、150、152、153、155和156中，CDRH3可以是残基100-114。
在一些实施方式中，免疫球蛋白重链多肽包含以下CDR：
(a)包含X1SX2MN(SEQ ID NO:195)的CDRH1，其中X1是N或T，并且X2是W、F、H、G、P、R、K、D、S、L、V、N或Y；
(b)包含RIYPX1GX2X3DTNYX4GKFK(SEQ ID NO:196)的CDRH2，其中：
X1不存在或是A；
X2是D、Y、Q、G、L、F、H、S、P、R或T；
X3是G、Y、A、F、S、D、V、T、E、K或R；并且
X4是N、V、Q、R、A、F、Y、S、G、P或T；和
(c)包含X1SGTFX2X3GNYX4X5YFDV(SEQ ID NO:197)的CDRH3，其中：
X1是K或R；
X2是N或D；
X3是D、S、F、Y、F、V、S、G、T、R、I、L或E；
X4是R或H；并且
X5是W、R、F、L、N、Y、P、I、V、A、S、G、R或K。
在一些实施方式中，所述Ig重链包含：包含SEQ ID NO:201的CDRH1；包含SEQ IDNO:202的CDRH2；和包含SEQ ID NO:203的CDRH3。
在一些实施方式中，BTLA结合剂包含免疫球蛋白重链多肽，其包含以下序列：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYX1FSX2SX3MNWVRQAPGQGLEWMGRIYPX4G X5X6DTNYX7GKFKGRVTITADKX8TX9TAYMELX10SLRSEX11TAVX12YX13CAX14SGTFX15X16GNYX17X18YFDVWGKGTTVTVSSA(SEQ IDNO:193)或至少其CDR区，其中
X1是A或V；
X2是N或T；
X3是W、F、H、G、P、R、K、D、S、L、V、N或Y；
X4不存在或是A；
X5是D、Y、Q、G、L、F、H、S、P、R或T；
X6是G、Y、A、F、S、D、V、T、E、K或R；
X7是N、V、Q、R、A、F、Y、S、G、P或T；
X8是S或F；
X9是S、T或N；
X10是S或R；
X11是D或V；
X12不存在或是Y；
X13是Y或F；
X14是K或R；
X15是N或D；
X16是D、S、F、Y、F、V、S、G、T、R、I、L或E；
X17是R或H；并且
X18是W、R、F、L、N、Y、P、I、V、A、S、G、R或K。
在一些实施方式中，所述Ig重链多肽包含SEQ ID NO:193，条件是它保留与SEQ IDNO:43-156中的任一者相同的CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。
根据本公开的这个方面，所述结合剂进一步包含Ig轻链，其包含SEQ ID NO:157-192中的任一者或至少其CDR；或与SEQ ID NO:157-192中的任一者具有至少80％、85％或90％序列同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。CDR可以使用任何已知的编号方案来确定，例如Kabat、Chothia、Martin(增强型Chothia)、IGMT或AHo。在一些实施方式中，CDR1、CDR2和CDR3包含SEQ ID NO:157-192的残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)。
在一些实施方式中，所述BTLA结合剂可以包含免疫球蛋白轻链多肽，其包含：
(a)包含RX1SENIYX2X3LA(SEQ ID NO:198)的CDRL1，其中
X1是A或V；
X2是S或N；并且
X3是H、N或Y；
(b)包含X1AX2NLAX3(SEQ ID NO:199)的CDRL2，其中
X1是A或N；
X2是T或K；并且
X3是N、L、Q、G、F、V、K、S、R、T、H或P；和
(c)包含QX1FX2GPPLT(SEQ ID NO:200)的CDRL3，其中
X1是L或H；并且
X2是W、F、Y、P、N、V、K、M、L、G或S。
在一些实施方式中，所述Ig轻包含：包含SEQ ID NO:204的CDRL1；包含SEQ ID NO:205的CDRL2；和包含SEQ ID NO:206的CDRL3。
在一些实施方式中，所述免疫球蛋白轻链多肽包含以下序列：
X1IQX2TQSPSSLSASVGDRVTITCRX3SENIYX4X5LAWYQQKX6GKAPKLLIYX7AX8NLAX9GVPSRFSGSGSGTDX10TLTISSLQPEDFATYYCQX11FX12GPPLTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:194)或至少其CDR，其中
X1是A或D；
X2是L或M；
X3是A或V；
X4是S或N；
X5是H、N或Y；
X6是P或Q；
X7是A或N；
X8是T或K；
X9是N、L、Q、G、F、V、K、S、R、T、H或P；
X10是F或Y；
X11是L或H；
X12是W、F、Y、P、N、V、K、M、L、G、S。
在一些实施方式中，所述Ig轻链多肽包含SEQ ID NO:194，条件是它保留与SEQ IDNO:157-192中的任一者相同的CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。
根据一个实施方式，所述BTLA结合剂包含免疫球蛋白重链可变区，所述重链可变区是SEQ ID NO:144或与其具有至少80％、85％或90％序列同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性)的氨基酸序列；或至少包含SEQ ID NO:144的CDR的免疫球蛋白重链可变区，其中CDR区如上所提供(例如，CDR1-SEQ ID NO:201、CDR2-SEQ IDNO:202和CDR3-SEQ ID NO:203)或根据各种已知免疫球蛋白编号方案(例如，Kabat、Chothia、Martin(增强Chothia)、IGMT或AHo)确定；和免疫球蛋白轻链可变区，所述轻链可变区是SEQ ID NO:174或与其具有至少80％、85％或90％序列同一性(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，或至少包含SEQ ID NO:174的CDR的免疫球蛋白轻链可变区；其中CDR区如上所提供(例如，CDR1-SEQ ID NO:204、CDR2-SEQ IDNO:205和CDR3-SEQ ID NO:206)或根据任何各种已知免疫球蛋白编号方案(例如，Kabat、Chothia、Martin(增强Chothia)、IGMT或AHo)确定。在一些实施方式中，所述抗体包含SEQID NO:144的重链可变区和SEQ ID NO:174的轻链可变区或至少其通过Kabat确定的CDR。在一些实施方式中，所述抗体包含SEQ ID NO:144的重链可变区和SEQ ID NO:174的轻链可变区或至少其通过Chothia确定的CDR。在一些实施方式中，所述抗体包含SEQ ID NO:144的重链可变区和SEQ ID NO:174的轻链可变区或至少其通过Martin确定的CDR。在一些实施方式中，所述抗体包含SEQ ID NO:144的重链可变区和SEQ ID NO:174的轻链可变区或至少其通过IGMT确定的CDR。在一些实施方式中，所述抗体包含SEQ ID NO:144的重链可变区和SEQID NO:174的轻链可变区或至少其通过AHo确定的CDR。
还提供了一种与包含本文所述的免疫球蛋白重链和轻链多肽的BTLA结合剂结合相同表位的BTLA结合剂。在一些实施方式中，所述BTLA结合剂与包含SEQ ID NO:144的重链可变区和SEQ ID NO:174的轻链可变区的BTLA结合剂结合相同的表位。在一些实施方式中，所述BTLA结合剂与包含SEQ ID NO:5的重链可变区和包含SEQ ID NO:17的轻链可变区的BTLA结合剂；包含SEQ ID NO:207的重链可变区和包含SEQ ID NO:209的轻链可变区的BTLA结合剂；或包含SEQ ID NO:217的重链可变区和包含SEQ ID NO:219的轻链可变区的BTLA结合剂结合相同的表位。如果BTLA结合剂与包含本文所述的免疫球蛋白重链和轻链多肽的BTLA结合剂竞争结合BTLA，则认为它结合相同的表位。在一些实施方式中，本文提供了一种BTLA结合剂，其与人BTLA的氨基酸残基52-65和/或100-106(例如，SEQ ID NO:227和/或228)结合(参考序列UniProt ID Q7Z6A9或天然存在的变体人BTLA的相对应序列位置)。在一些实施方式中，本文提供了一种BTLA结合剂，其与人BTLA的氨基酸残基46065、82-91或100-106(例如，SEQ ID NO:229、230和/或231)结合(参考序列UniProt ID Q7Z6A9或天然存在的变体人BTLA的相对应序列位置)。
涉及核酸或氨基酸序列使用的序列“同一性”可以通过将感兴趣的核酸或氨基酸序列与参考核酸或氨基酸序列进行比较来确定。同一性百分比是在最佳比对时，感兴趣的序列和参考序列之间相同(即同一的)的核苷酸或氨基酸残基的百分比。用于获得最佳比对和计算两个或更多个序列之间的同一性的多种数学算法是已知的和公开可得的。此类程序的实例包括CLUSTAL-W、T-Coffee和ALIGN(用于核酸和氨基酸序列的比对)、BLAST程序(例如，BLAST 2.1、BL2SEQ及由马里兰州贝塞斯达的国家生物技术信息中心操作的其后续版本)和FASTA程序(例如，FASTA3x、FASTM和SSEARCH)(用于序列比对和序列相似性搜索)。序列比对算法还公开于例如Altschul等人,《分子生物学杂志(J.Molecular Biol.)》,215(3):403-410(1990)，Beigert等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,106(10):3770-3775(2009)，Durbin等人编,《生物序列分析：蛋白质和核酸的概率模型(Biological Sequence Analysis:Probalistic Models of Proteins and NucleicAcids)》,英国剑桥的剑桥大学出版社(2009)，Soding,《生物信息学(Bioinformatics)》,21(7):951-960(2005)，Altschul等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,25(17):3389-3402(1997)，和Gusfield,《字符串、树和序列的算法(Algorithms on Strings,Trees andSequences)》,英国剑桥的剑桥大学出版社(1997))中。
关于与上文具体阐述的重链和轻链序列具有小于100％同一性的序列，前述免疫球蛋白重链多肽和/或轻链多肽的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换或取代，和/或一个或多个氨基酸可以从所公开的氨基酸序列中缺失或插入到所公开的氨基酸序列中，条件是多肽的活性(例如，当作为BTLA结合剂的一部分存在时结合BTLA的能力)被基本保留。BTLA结合剂的“生物活性”是指例如对特定BTLA表位的结合亲和力(不抑制BTLA与其受体的结合和/或不抑制体内BTLA活性(例如，IC50))、药代动力学和交叉反应性(例如，与BTLA蛋白的非人同源物或直系同源物或与其它蛋白或组织的交叉反应性)。在一些实施方式中，BTLA结合剂的生物活性包括所述试剂增强BTLA与其受体的结合和/或以其它方式增加体内BTLA活性的能力。本领域公认的抗原结合剂的其它生物学性质或特性包括例如亲和性、选择性、溶解性、折叠、免疫毒性、表达和配方。上述性质或特性可以使用标准技术进行观察、测量和/或评估，所述标准技术包括但不限于ELISA、竞争性ELISA、表面等离子体共振分析(BIACORETM)或溶液相竞争(KINEXATM)、体外或体内中和测定、受体-配体结合测定、细胞因子或生长因子产生和/或分泌测定、以及信号传导和免疫组织化学测定。
氨基酸置换或取代可以是保守的、半保守的或非保守的。短语“保守氨基酸取代”或“保守突变”是指一个氨基酸被另一个具有共同性质的氨基酸置换。用于定义个别氨基酸之间的共同性质的实用方法是分析同源生物体的相对应蛋白质之间氨基酸变化的归一化频率(Schulz和Schirmer,《蛋白质结构原理(Principles of Protein Structure)》,纽约的施普林格出版社(1979))。根据此类分析，可以定义氨基酸组，其中一个组内的氨基酸优先彼此交换，并且因此在其对整体蛋白质结构的影响方面彼此最相似(Schulz和Schirmer,见上)。
氨基酸大致分组为“芳香族”或“脂肪族”。芳香族氨基酸包含芳香环。“芳香族”氨基酸的实例包括组氨酸(H或His)、苯丙氨酸(F或Phe)、酪氨酸(Y或Tyr)和色氨酸(W或Trp)。非芳香族氨基酸大致分组为“脂肪族”。“脂肪族”氨基酸的实例包括甘氨酸(G或Gly)、丙氨酸(A或Ala)、缬氨酸(V或Val)、亮氨酸(L或Leu)、异亮氨酸(I或Ile)、甲硫氨酸(M或Met)、丝氨酸(S或Ser)、苏氨酸(T或Thr)、半胱氨酸(C或Cys)、脯氨酸(P或Pro)、谷氨酸(E或Glu)、天冬氨酸(A或Asp)、天冬酰胺(N或Asn)、谷氨酰胺(Q或Gln)、赖氨酸(K或Lys)和精氨酸(R或Arg)。
脂肪族氨基酸可以细分成四个亚组。“大脂肪族非极性亚组”由缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸组成。“脂肪族微极性亚组”由甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸组成。“脂肪族极性/带电亚组”由谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸和精氨酸组成。“小残基亚组”由甘氨酸和丙氨酸组成。带电/极性氨基酸组可以细分成三个亚组：由赖氨酸和精氨酸组成的“带正电亚组”、由谷氨酸和天冬氨酸组成的“带负电亚组”和由天冬酰胺和谷氨酰胺组成的“极性亚组”。
芳香族氨基酸可以细分成两个亚组：由组氨酸和色氨酸组成的“氮环亚组”和由苯丙氨酸和酪氨酸组成的“苯基亚组”。
保守氨基酸取代的实例包括上文描述的亚组内的氨基酸取代，例如赖氨酸取代精氨酸，且反之亦然，使得可以维持正电荷；谷氨酸取代天冬氨酸，且反之亦然，使得可以维持负电荷；丝氨酸取代苏氨酸，使得可以维持游离-OH；和谷氨酰胺取代天冬酰胺，使得可以维持游离-NH2。“半保守突变”包括在上文列出的相同组内但不在相同亚组内的氨基酸取代。例如，天冬氨酸取代天冬酰胺，或天冬酰胺取代赖氨酸，涉及在相同组内但在不同亚组内的氨基酸。“非保守突变”涉及不同组之间的氨基酸取代，例如赖氨酸取代色氨酸，或苯丙氨酸取代丝氨酸等。
前述突变(例如，取代)可以在Ig链的任何区域中进行。在一些实施方式中所述免疫球蛋白重链多肽和/或轻链多肽的CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)中的氨基酸被取代；在其它实施方式中，框架区而非CDR中的氨基酸被取代；在其它实施方式中，框架区和CDR中的氨基酸都被取代。在一些实施方式中，前述突变在除CDR以外的区域中进行。换句话说，重链可变区和轻链可变区可以与本文提供的序列具有所述的序列同一性，但保留具体提供的序列的CDR。
此外，一个或多个氨基酸可以插入到前述免疫球蛋白重链多肽和/或轻链多肽中，条件是它不消除多肽在BTLA结合剂情况中的功能(例如，不阻止包含多肽的结合剂与BTLA结合，而不抑制BTLA与其受体结合)。任何数量的任何合适的氨基酸可以插入到所述免疫球蛋白重链多肽和/或轻链多肽的氨基酸序列中。在一些实施方式中，至少一个氨基酸(例如，2个或更多个、5个或更多个、或10个或更多个氨基酸)但不超过20个氨基酸(例如，18个或更少个、15个或更少个、或12个或更少个氨基酸)可以插入到所述免疫球蛋白重链多肽和/或轻链多肽的氨基酸序列中。在其它实施方式中，1-10个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)插入到所述免疫球蛋白重链多肽和/或轻链多肽的氨基酸序列中。在这方面，氨基酸可以在任何合适的位置插入到前述免疫球蛋白重链多肽和/或轻链多肽中的任一者中。在一些实施方式中，氨基酸插入到免疫球蛋白重链多肽和/或轻链多肽的CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)中；在其它实施方式中，氨基酸插入到框架区而非CDR中；在其它实施方式中，氨基酸插入到框架区和CDR中。
本发明的分离的免疫球蛋白重链多肽和轻链多肽不限于包含本文所述的特定氨基酸序列的多肽，还包括当包含在BTLA结合剂中时，与本发明的免疫球蛋白重链多肽或轻链多肽竞争结合BTLA的任何重链多肽或轻链多肽。在这方面，例如，所述免疫球蛋白重链多肽或轻链多肽可以是任何重链多肽或轻链多肽，当包含在BTLA结合剂中时，其结合由本文所述的重链和轻链多肽识别的BTLA的相同表位。抗体竞争可以使用常规的肽竞争测定法来测定，其利用ELISA、蛋白质印迹或免疫组织化学方法(参见例如美国专利4,828,981和8,568,992；和Braitbard等人,《蛋白质组科学(Proteome Sci.)》,4:12(2006))。
BTLA结合剂是一种蛋白质分子，包含本文所述的免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区，其特异性结合BTLA蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)。在一些实施方式中，BTLA结合剂结合BTLA而不消除或，在一些实施方式中，不抑制BTLA与其受体的结合。在一些实施方式中，BTLA结合剂增强BTLA与HVEM的结合，从而增加BTLA介导的信号传导。本文使用的关于BTLA与其受体的结合或BTLA介导的信号传导的术语“抑制”是指与不存在结合剂的情况下的BTLA与其受体的结合或BTLA-HVEM介导的信号传导相比，在存在结合剂的情况下实质上拮抗、禁止、预防、抑制、减缓、破坏、改变、根除或停止(全部或部分)这种结合或信号传导的能力。涉及BTLA与其受体的结合或BTLA介导的信号传导使用的术语“增加”或“增强”意指与不存在结合剂的情况下的这种结合或信号传导相比，在存在结合剂的情况下以任何方式和任何程度增加或增强这种结合或信号传导。在一些实施方式中，BTLA与其受体的结合或BTLA介导的信号传导被充分增加，以减少或减轻与BTLA活性不足相关联或受益于BTLA活性增强的疾病或病状的任何症状，或逆转这种疾病或病状的进展或严重程度。在一些实施方式中，BTLA结合剂对BTLA受体结合的抑制不超过25％(例如，对BTLA受体结合的抑制不超过10％或不超过5％)。在一些实施方式中，与不存在BTLA结合剂的情况下的BTLA的活性相比，BTLA结合剂将BTLA受体结合增加至少约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约100％或由前述值中的任两者限定的范围。
BTLA结合剂可以是结合BTLA和另一种抗原的多特异性(例如，双特异性或“双反应性”)构建体(例如，多特异性抗体，如双特异性或双反应性抗体)的一部分。这种构建体可以包含如本文所述的结合BTLA的免疫球蛋白重链和轻链多肽以及来自结合非BTLA抗原的免疫球蛋白的免疫球蛋白重链和轻链。这种双特异性BTLA结合剂可以结合例如BTLA和免疫系统的另一种负调节因子，例如细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3(TIM-3)、程序性死亡1(PD-1)和/或淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG-3)。结合这些其它靶抗原的免疫球蛋白是本领域中所已知的。
本文还提供了抗体缀合物。例如，BTLA结合剂可以是(1)抗BTLA抗体或其片段和(2)第二个蛋白质或非蛋白质部分的缀合物。作为进一步说明，BTLA结合剂可以包含与另一种肽、荧光分子或化疗剂缀合的抗BTLA抗体或其片段。
在一些实施方式中，BTLA结合剂可以是“完整的”免疫球蛋白或抗原结合免疫球蛋白“片段”。“完整的”免疫球蛋白通常由四个多肽组成：两个重(H)链多肽和两个轻(L)链多肽。每个重链含有一个N-端可变(VH)区和三个C-端恒定(CH1、CH2和CH3)区，而每个轻链含有一个N-端可变(VL)区和一个C-端恒定(CL)区。基于其恒定区的氨基酸序列，抗体的轻链可以分为两种不同类型，即κ或λ。在典型的免疫球蛋白中，每个轻链通过二硫键与重链相连，而两个重链通过二硫键相互连接。在这种构型中，轻链可变区通常与重链的可变区对齐，而轻链恒定区通常与重链的第一恒定区对齐。重链的其余恒定区通常相互对齐。
每对轻链和重链的可变区或高变区形成抗体的抗原结合位点。VH和VL区具有相同的一般结构，其中每个区包含四个框架(FW或FR)区。本文使用的术语“框架区”是指可变区内的相对保守的氨基酸序列，其位于高变区或互补决定区(CDR)之间。每个可变结构域中有四个框架区，分别命名为FR1、FR2、FR3和FR4。框架区形成β折叠以提供可变区的结构框架(参见例如C.A.Janeway等人(编),《免疫生物学(Immunobiology)》,第5版,纽约州纽约的加兰出版社(2001))。框架区由三个互补决定区(CDR)连接。被称为CDR1、CDR2和CDR3的这三个CDR形成抗体的“高变区”，其通常被认为负责抗原结合。
术语“抗体片段”和类似术语(例如，“抗体的片段”、“抗体片段”、“抗体的功能片段”)在本文中可互换使用，以意指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段或部分(通常参见Holliger等人,《自然-生物技术(Nat.Biotech.)》,23(9):1126-1129(2005))。本文和本领域常规使用的抗体“片段”不仅包括字面意义上的完整抗体的片段或碎片，还包括其它已知的工程改造抗体样构建体，所述构建体除了抗体片段之外还可能包含天然抗体中不存在的连接子或其它元件。抗体片段可以包含例如一个或多个(或全部)CDR、可变区(或其部分)、恒定区(或其部分)或其一些组合。抗体片段的实例包括但不限于(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包含由铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fv片段，其由抗体的单臂的VL和VH结构域组成；(iv)Fab'片段，其通过使用温和的还原条件断开F(ab')2片段的二硫键而产生；(v)二硫键稳定的Fv片段(dsFv)；和(vi)结构域抗体(dAb)，其是特异性结合抗原的抗体单可变区结构域(VH或VL)多肽。BTLA结合剂也可以是单链抗体片段。单链抗体片段的实例包括但不限于(i)单链Fv(scFv)，其是由通过合成连接子连接的Fv片段的两个结构域(即VL和VH)组成的单价分子，所述连接子能使两个结构域合成为单个多肽链(参见例如Bird等人,《科学(Science)》,242:423-426(1988)；Huston等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,85:5879-5883(1988)；和Osbourn等人,《自然-生物技术(Nat.Biotechnol.)》,16:778(1998))；和(ii)双抗体，其是多肽链的二聚体，其中每个多肽链包含通过肽连接子连接到VL的VH，所述肽连接子太短以至于不允许相同多肽链上的VH和VL之间的配对，从而驱动不同VH-VL多肽链上的互补结构域之间的配对，以生成具有两个功能性抗原结合位点的二聚分子。抗体片段是本领域中所已知的，并且更详细地描述于例如美国专利申请公开2009/0093024A1中。
在一些实施方式中，BTLA结合剂包含重链恒定区，例如片段可结晶(Fc)区或其部分。Fc区可以是任何Ig类/亚类(IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgM，包括其变体。在一些实施方式中，BTLA结合剂是“完整的”或“完全的”Ig(即抗体)。在一些实施方式中，所述BTLA结合剂包含IgG Fc区，例如IgG1或IgG4。例如，所述BLTA结合剂可以是IgG1或IgG4抗体。在一些实施方式中，所述BTLA结合剂包含分别包含SEQ ID NO:144和174的可变重链区和可变轻链区或至少其CDR(如本文提供或根据Kabat、Chothia、Martin(增强Chothia)、IGMT或AHo编号确定)，或与其包含90％同一性的序列，其中所述BTLA结合剂是IgG1抗体。在一些实施方式中，所述BTLA结合剂包含分别包含SEQ ID NO:144和174的可变重链区和可变轻链区或至少其CDR(如本文提供或根据Kabat、Chothia、Martin(增强Chothia)、IGMT或AHo编号确定)，或与其包含90％同一性的序列，其中BTLA结合剂是IgG4抗体。
所述BTLA结合剂可以是或可以获自人抗体、非人抗体或嵌合抗体。“嵌合”意指包含人和非人区两者的抗体或其片段。优选地，所述BTLA结合剂是人源化抗体。“人源化”抗体是包含人抗体支架和至少一个获自或衍生自非人抗体的CDR的单克隆抗体。非人抗体包括从任何非人动物，诸如例如啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)分离的抗体。人源化抗体可以包含获自或衍生自非人抗体的一个、两个或三个CDR。在本发明的一个实施方式中，本发明的BTLA结合剂的CDRH3获自或衍生自小鼠单克隆抗体，而本发明的BTLA结合剂的其余可变区和恒定区获自或衍生自人单克隆抗体。
人抗体、非人抗体、嵌合抗体或人源化抗体可以通过任何手段获得，包括经由体外来源(例如，杂交瘤或重组地产生抗体的细胞系)和体内来源(例如，啮齿动物)。用于生成抗体的方法是本领域中所已知的，并且描述于例如和Milstein,《欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)》,5:511-519(1976)；Harlow和Lane(编),《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》,CSH出版社(1988)；和Janeway等人(编),《免疫生物学(Immunobiology)》,第5版,纽约州纽约的加兰出版社(2001))中。在某些实施方式中，人抗体或嵌合抗体可以使用转基因动物(例如，小鼠)生成，其中一个或多个内源性免疫球蛋白基因被一个或多个人免疫球蛋白基因置换。其中内源性抗体基因被人抗体基因有效置换的转基因小鼠的实例包括但不限于Medarex HUMAB-MOUSETM、Kirin TC MOUSETM和KyowaKirin KM-MOUSETM(参见例如Lonberg,《自然-生物技术(Nat.Biotechnol.)》,23(9):1117-25(2005)，和Lonberg,《实验药理学手册(Handb.Exp.Pharmacol.)》,181:69-97(2008))。人源化抗体可以使用本领域已知的任何合适的方法生成(参见例如An,Z.(编),《治疗性单克隆抗体：从实验室到临床(Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench toClinic)》,新泽西州霍博肯的约翰威利父子公司(2009))，包括例如将非人CDR移植到人抗体支架上(参见例如Kashmiri等人,《方法(Methods)》,36(1):25-34(2005)；和Hou等人,《生物化学杂志(J.Biochem.)》,144(1):115-120(2008))。在一个实施方式中，人源化抗体可以使用例如美国专利申请公开2011/0287485A1中所描述的方法产生。
所述BTLA结合剂不受对其表位的任何特定亲和力的限制。术语“亲和力”是指两种试剂的可逆结合的平衡常数，并且表示为解离常数(KD)。然而，在一些实施方式中，所述BTLA对BTLA的亲和力可以为约1皮摩尔(pM)至约100微摩尔(μM)(例如，约1皮摩尔(pM)至约1纳摩尔(nM)、约1nM至约1微摩尔(μM)或约1μM至约100μM)。在一个实施方式中，所述BTLA结合剂可以以小于或等于1纳摩尔(例如，0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、0.05nM、0.025nM、0.01nM、0.001nM或或由前述值中的任两者限定的范围)的KD与BTLA蛋白结合。在另一个实施方式中，BTLA结合剂可以以小于或等于200pM(例如，190pM、175pM、150pM、125pM、110pM、100pM、90pM、80pM、75pM、60pM、50pM、40pM、30pM、25pM、20pM、15pM、10pM、5pM、1pM或由前述值中的任两者限定的范围)的KD与BTLA结合。免疫球蛋白对感兴趣的抗原或表位的亲和力可以使用任何本领域公认的测定来测量。这些方法包括例如荧光激活细胞分选(FACS)、可分离珠(例如，磁珠)、表面等离子体共振(SPR)、溶液相竞争(KINEXATM)、抗原淘选、竞争性结合测定和/或ELISA(参见例如Janeway等人(编),《免疫生物学(Immunobiology)》,第5版,纽约州纽约的加兰出版社,2001)。在一些实施方式中，当使用表面等离子体共振(SPR)测量时，所述BTLA结合剂具有对BTLA如上所述的亲和力(例如，1nM或更小或200pM或更小)。在一些实施方式中，当使用表面等离子体共振(SPR)测量时，所述BTLA结合剂具有对BTLA如上所述的亲和力(例如，1nM或更小或200pM或更小)。
本文提供的BTLA结合剂可以用于任何目的，例如调节(例如，促进或增强)哺乳动物中的BTLA信号传导，调节(例如，抑制)哺乳动物中的免疫反应，和/或治疗或预防与BTLA信号传导不足相关联(例如，与BTLA介导的免疫反应相关联)的疾病或病状。因此，一方面，本发明提供了一种促进或增强哺乳动物中的BTLA信号传导的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用本文所述的BTLA结合剂，由此所述BTLA结合剂促进或增强BTLA与HVEM的结合或以其它方式促进或增强BTLA信号传导。
所述哺乳动物可以是患有与BTLA信号传导不足相关联或与BTLA介导的免疫反应相关联的疾病或病状的哺乳动物。例如，哺乳动物可能患有可通过免疫抑制得到改善的疾病或病状。这种疾病将对BTL激动作用有反应，因此向所述哺乳动物施用所述BTLA结合剂将治疗或预防所述疾病或病状。与BTLA信号传导相关联并对BTLA激动作用有反应的疾病、病状或病症可以是任何疾病或病症，其中BTLA活性的增加在哺乳动物，优选人类中具有治疗益处，或者BTLA的低表达或活性降低导致或促成所述疾病或病症的病理效应。不希望受任何理论或作用机制的束缚，据信所述BTLA结合剂有助于免疫抑制性BTLA-HVEM信号传导，并因此抑制免疫反应。
“免疫反应”可需要例如抗体产生和/或免疫效应细胞(例如，T细胞)的激活、炎性细胞因子的产生或本文所描述或本领域中另外已知的任何适应症或病症。如本文使用，术语“治疗(treatment/treating)”等是指获得期望药理学和/或生理学效果。优选地，所述效果是治疗性的，即所述效果部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不良症状。为此，本发明的方法包括施用“治疗有效量”的BTLA结合剂。“治疗有效量”是指在必要的剂量下且在必要时间段内有效实现期望治疗结果的量。所述治疗有效量可能根据如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及所述BTLA结合剂在个体中引发期望反应的能力等因素而有所不同。
可替代地，药理学和/或生理学效果可以是预防性的，即所述效果完全或部分预防疾病或其症状。在这方面，本发明的方法包括施用“预防有效量”的所述BTLA结合剂。“预防有效量”是指在必要的剂量下且在必要时间段内有效实现期望预防结果(例如，预防疾病发病)的量。
所述BTLA结合剂可用于抑制对抗原的免疫反应，并治疗与异常或过度免疫反应相关联的任何疾病或病状。所述疾病或病症可以是炎性或自身免疫病症。炎性或自身免疫性病症的实例包括例如感染(病毒感染、细菌感染、真菌感染和寄生虫感染)、与感染相关联的内毒素休克、关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、盆腔炎性疾病、白塞氏病、阿尔茨海默病、包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎在内的炎性肠病、佩罗尼氏病、乳糜泻、胆囊疾病、藏毛病、腹膜炎、银屑病、银屑病性关节炎、血管炎、抗中性粒细胞胞浆抗体相关性(ANCA)血管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆病、关节炎、脑膜脑炎、自身免疫性葡萄膜炎、免疫介导的中枢和外周神经系统炎性病症，如多发性硬化、狼疮(例如，系统性红斑狼疮和慢性盘状红斑狼疮)和格林-巴利综合征、特应性皮炎、多肌炎、皮肌炎、自身免疫性肝炎、纤维化肺泡炎、格雷夫斯病、IgA肾病、特发性血小板减少性紫癜、梅尼埃病、天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性胆管炎、肝炎、结节病、硬皮病(局限性硬皮病、系统性硬皮病和进行性系统性硬皮病)、肉芽肿性多血管炎、其它自身免疫性病症、胆管炎、胰腺炎、创伤(手术)、移植物抗宿主病、移植排斥、心脏病，包括缺血性疾病，如心肌梗塞以及动脉粥样硬化、结节性动脉周围炎(结节性多动脉炎和显微镜下多血管炎)、过敏性肉芽肿性脉管炎、超敏性脉管炎、大动脉炎综合征(高安氏动脉炎)、颞动脉炎、血管内凝血、骨吸收、骨质疏松症、骨关节炎、牙周炎和胃酸过少、斯蒂尔病、柯根综合征、RS3PE、风湿性多肌痛、纤维肌痛综合征、抗磷脂抗体综合征、嗜酸性筋膜炎、格林-巴利综合征、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、古德帕斯彻氏综合征、急进性肾小球肾炎、巨成红细胞性贫血、溶血性贫血、自身免疫性嗜中性白血球减少症、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性肾上腺功能不全、原发性甲状腺功能减退症、特发性阿狄森氏病(慢性肾上腺功能不全)、妊娠疱疹、线状IgA大疱性皮肤病、获得性大疱性表皮松解症、斑秃、白癜风、原田病、自身免疫性视神经病变、特发性无精子症、复发性流产或与胎儿-母体耐受性缺乏相关的不孕症。
在一些实施方式中，所述疾病或病症是关节炎(例如，类风湿性关节炎或TNF-难治性类风湿性关节炎)、巨细胞动脉炎、风湿性多肌痛、原发性肖格伦综合征、斑秃、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、白癜风、ANCA血管炎、1型糖尿病、非感染性葡萄膜炎、银屑病、移植物抗宿主病(GvHD)或炎性肠病。
如本文使用，术语“治疗(treatment/treating)”等是指获得期望药理学和/或生理学效果。优选地，所述效果是治疗性的，即所述效果部分或完全治愈疾病和/或以任何程度减轻可归因于疾病的不良症状。为此，本发明的方法包括施用“治疗有效量”的所述BTLA结合剂。“治疗有效量”是指在必要的剂量下且在必要时间段内有效实现期望治疗结果的量。所述治疗有效量可能根据如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及所述BTLA结合剂在个体中引发期望反应的能力等因素而有所不同。例如，本发明的BTLA结合剂的治疗有效量是增加人类中的BTLA生物活性的量。
可替代地，药理学和/或生理学效果可以是预防性的，即所述效果完全或部分预防疾病或其症状。在这方面，本发明的方法包括施用“预防有效量”的所述BTLA结合剂。“预防有效量”是指在必要的剂量下且在必要时间段内有效实现期望预防结果(例如，预防疾病发病)的量。
所述BTLA结合剂可以是适合用于向哺乳动物施用的组合物的一部分。优选地，所述组合物是药学上可接受的(例如，生理学上可接受的)组合物，其包含载剂，优选药学上可接受的(例如，生理学上可接受的)载剂，以及本发明的氨基酸序列、抗原结合剂或载体。在本发明的上下文中，可以使用任何合适的载剂，并且这种载剂是本领域中所熟知的。载剂的选择将部分地通过可以施用组合物的特定部位和用于施用组合物的特定方法来确定。所述组合物还可以包含任何其它赋形剂，所述赋形剂用于治疗性分子(例如，蛋白质或抗体)制剂，尤其肠胃外制剂，包括例如缓冲液、张力调节剂、稳定剂、表面活性剂等。所述组合物任选地可以是无菌的。所述组合物可以冷冻或冻干储存并且在使用前在合适的无菌载剂中复原。所述组合物可以根据例如《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science andPractice of Pharmacy)》,第21版,宾夕法尼亚州费城的利平科特·威廉姆斯和威尔金斯(2001)中描述的常规技术生成。
典型的剂量可以例如在1pg/kg至20mg/kg动物或人体重的范围内；然而，低于或高于此示例性范围的剂量也在本发明的范围内。日肠胃外剂量可以为约0.00001μg/kg至约20mg/kg总体重(例如，约0.001μg/kg、约0.1μg/kg、约1μg/kg、约5μg/kg、约10μg/kg、约100μg/kg、约500μg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg或由前述值中的任两者限定的范围)，优选约0.1μg/kg至约10mg/kg总体重(例如，约0.5μg/kg、约1μg/kg、约50μg/kg、约150μg/kg、约300μg/kg、约750μg/kg、约1.5mg/kg、约5mg/kg或由前述值中的任两者限定的范围)，更优选约1μg/kg至5mg/kg总体重(例如，约3μg/kg、约15μg/kg、约75μg/kg、约300μg/kg、约900μg/kg、约2mg/kg、约4mg/kg或由前述值中的任两者限定的范围)，甚至更优选约0.5至15mg/kg体重/天(例如，约1mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约6mg/kg、约9mg/kg、约11mg/kg、约13mg/kg或由前述值中的任两者限定的范围)。治疗或预防功效可以通过定期评定所治疗的患者来监测。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病状，所述治疗被可以重复直到出现期望的疾病症状抑制，或可替代地，所述治疗可能持续患者的一生。然而，其它剂量方案可能是有用的并且在本发明的范围内。期望剂量可以通过单次施用所述组合物、通过多次施用所述组合物或通过连续输注施用所述组合物进行递送。
可以使用任何标准施用技术进行施用，包括口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺部、透皮、肌内、鼻内、口腔、舌下或栓剂施用。组合物优选适合于肠胃外施用。本文使用的术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。更优选地，组合物通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用外周全身递送向哺乳动物施用。
一旦施用于哺乳动物(例如，人)，所述BTLA结合剂的生物活性可以通过本领域已知的任何合适的方法来测量。所述生物活性可以与所述BTLA结合剂在体内的稳定性相关。在本发明的一个实施方式中，所述BTLA结合剂(例如，抗体)的体内半衰期在约30分钟至45天(例如，约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约10小时、约12小时、约1天、约5天、约10天、约15天、约25天、约35天、约40天、约45天或由前述值中的任两者限定的范围)。在另一个实施方式中，所述BTLA结合剂的体内半衰期为约2小时至20天(例如，约5小时、约10小时、约15小时、约20小时、约2天、约3天、约7天、约12天、约14天、约17天、约19天或由前述值中的任两者限定的范围)。在另一个实施方式中，所述BTLA结合剂的体内半衰期为约10天至约40天(例如，约10天、约13天、约16天、约18天、约20天、约23天、约26天、约29天、约30天、约33天、约37天、约38天、约39天、约40天或由前述值中的任两者限定的范围)。
本发明的BTLA结合剂可以单独施用或与其它药物组合施用。例如，所述BTLA结合剂可以与用于治疗或预防本文公开的疾病的其它试剂，例如其它抗炎剂或免疫抑制剂组合施用。在这方面，例如，所述BTLA结合剂可以与至少一种其它试剂组合使用，所述其它试剂包括例如本领域已知的任何抗炎剂、糖皮质激素、小分子免疫抑制剂、疫苗、生物疗法(例如，其它单克隆抗体、病毒、基因疗法和过继T细胞转移)和/或手术。当本发明的方法治疗感染性疾病时，所述BTLA结合剂可以与至少一种抗细菌剂或至少一种抗病毒剂组合施用。在这方面，抗细菌剂可以是本领域中已知的任何合适抗生素。抗病毒剂可以是特异性靶向特定病毒的任何合适类型的任何疫苗(例如，活减毒疫苗、亚单位疫苗、重组载体疫苗)和任何小分子抗病毒疗法(例如，病毒复制抑制剂和核苷类似物)。
除了治疗用途，本文所述的BTLA结合剂可以用于诊断或研究应用。在这方面，BTLA结合剂可以用于诊断病症或疾病的方法中，其中BTLA的不当表达(例如，低表达)或活性降低导致或促成所述疾病或病症的病理效应。以类似的方式，BTLA结合剂可以用于监测所测试的受试者中的BTLA蛋白水平的测定中，所述受试者被测试对BTLA促进有反应的疾病或病症。研究应用包括例如利用BTLA结合剂和标记来检测样品中，例如人体体液或细胞或组织提取物中的BTLA蛋白的方法。所述BTLA结合剂可以在有或没有修饰的情况下使用，例如用可检测部分的共价或非共价标记。例如，所述可检测部分可以是放射性同位素(例如，3H、14C、32P、35S或125I)、荧光或化学发光化合物(例如，异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素)、酶(例如，碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶)或辅基。在本发明的上下文中，可以采用本领域已知的用于将抗原结合剂(例如，抗体)分别缀合到可检测部分的任何方法(参见例如Hunter等人,《自然(Nature)》,194:495-496(1962)；David等人,《生物化学(Biochemistry)》,13:1014-1021(1974)；Pain等人,《免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)》,40:219-230(1981)；和Nygren,《组织化学和细胞化学杂志(J.Histochem.and Cytochem.)》,30:407-412(1982))。
BTLA蛋白水平可以通过本领域已知的任何合适的方法使用本文提供的BTLA结合剂来测量。此类方法包括例如放射免疫测定(RIA)和FACS。BTLA的正常或标准表达值可以使用任何合适的技术来建立，例如通过在适合形成抗原-抗体复合物的条件下将包含或怀疑包含BTLA的样品与BTLA特异性抗体组合。抗体用可检测物质直接或间接标记以便于结合或未结合抗体的检测。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料(参见例如Zola,《单克隆抗体：技术手册(Monoclonal Antibodies：AManual ofTechniques)》,CRC出版公司(1987))。然后，将样品中表达的BTLA多肽的量与标准值进行比较。
不希望受任何特定的理论或作用机制束缚，据信本文所述的BTLA结合剂的施用导致BTLA从至少一些表达其的细胞上脱落，从而导致施用所述BTLA结合剂的受试者的血液、血浆、血清或组织(例如，皮肤组织)中存在的可溶性BTLA(sBTLA)增加。因此，本文提供了一种检测、测量或监测受试者中的BTLA结合剂的药理学活性的方法(例如，体外方法)，所述方法包括检测来自经施用BTLA结合剂的受试者的血液、血浆、血清或组织(例如，皮肤组织)样品中的可溶性BTLA(sBTLA)。本文还提供了一种通过检测或测量(例如，体外)来自患者的血液、血浆、血清或组织(例如，皮肤组织)样品中的sBTLA来选择用BTLA结合剂治疗的患者的方法，其中当sBTLA水平与相同类型的正常、未患病受试者相比有所增加时，选择所述患者进行治疗。sBTLA可以使用本领域已知的数种技术中的任一者来检测并任选地进行定量。在一些实施方式中，sBTLA通过将来自受试者的血液、血浆、血清或组织样品(例如，体外)与本文提供的BTLA结合剂接触来检测。在一些实施方式中，在受试者的血液、血浆、血清或组织样品中检测到的sBTLA与BTLA结合剂(例如，先前施用的BTLA结合剂)结合。
在一些实施方式中，向受试者施用的诱导受试者中的BTLA脱落的BTLA结合剂是不抑制BTLA与HVEM结合的BTLA结合剂。BTLA结合剂可以是任何BTLA结合剂，例如本文所述的任何BTLA结合剂。在一些实施方式中，BTLA结合剂包含免疫球蛋白重链可变区，所述重链可变区是SEQ ID NO:1-15、207、208、217或218中的任一者或至少包含其CDR，或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和免疫球蛋白轻链可变区，所述轻链可变区是SEQ ID NO:16-25、209、210、219或220中的任一者或至少包含其CDR；或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。例如，BTLA结合剂可以包含由SEQ ID NO:27、30、32、36、39和41代表的CDR。在其它实施方式中，BTLA结合剂包含免疫球蛋白重链可变区，所述重链可变区是SEQ IDNO:43-156中的任一者或至少包含其CDR；或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和免疫球蛋白轻链可变区，所述轻链可变区是SEQ ID NO:157-192中的任一者或至少包含其CDR；或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；具有本文描述的任何或所有其它特征。例如，所述BTLA结合剂可以包含由SEQ ID NO:195-200代表的CDR；例如，BTLA结合剂包含CDR，所述CDR包含SEQ ID NO:201-206，或包含Ig重链和轻链，所述Ig重链和轻链是SEQID NO:193和194或SEQ ID NO:144和174或至少包含其CDR，或分别与SEQ ID NO:193和194或SEQ ID NO:144和174具有90％或更多序列同一性的Ig重链和轻链。
在一些实施方式中，经施用BTLA的受试者的血液、血浆、血清或组织(例如，皮肤组织)中的sBTLA使用结合sBTLA的捕获抗体来检测。捕获抗体可以是结合BTLA的任何抗体。在一些实施方式中，捕获抗体是本文提供的BTLA抗体。捕获抗体可以与向受试者施用的BTLA结合剂相同或不同。在一些实施方式中，sBTLA捕获抗体不同于向受试者施用的BTLA结合剂。在一些实施方式中，捕获抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1-15、207、208、217或218中的任一者或至少其CDR，或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:16-25、209、210、219或220中的任一者或至少其CDR，或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；具有本文描述的任何或所有其它特征。在进一步的实施方式中，捕获抗体可以包含由SEQ ID NO:27、30和32代表的重链CDR 1-3；和由SEQ ID NO:36、39和41代表的轻链CDR 1-3；或本文提供的更具体叙述的CDR中的任一者。例如，捕获抗体可以包含SEQ ID NO:26的Ig重链(例如，SEQ ID NO:1-15、207、208、217或218中的任一者)和SEQ ID NO:35的Ig轻链(例如，SEQ ID NO:16-25、209、210、219或220中的任一者)。任选地，与这些实施方式相结合，向受试者施用的BTLA结合剂可以包含免疫球蛋白重链可变区，所述重链可变区是SEQ ID NO:43-156中的任一者或至少包含其CDR；或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和免疫球蛋白轻链可变区，所述轻链可变区是SEQ ID NO:157-192中的任一者或至少包含其CDR；或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；具有本文描述的任何或所有其它特征。例如，BTLA结合剂可以包含由SEQ ID NO:195-200代表的CDR；例如，BTLA结合剂包含CDR，所述CDR包含SEQ ID NO:201-206，或包含SEQ ID NO:193和194或SEQ ID NO:144和174的Ig重链和轻链。
不希望受任何特定的理论或作用机制束缚，据信BTLA(或sBTLA)与如本文所述的不抑制BTLA与HVEM结合的抗体的结合增强了捕获抗体与sBTLA的结合。因此，本文还提供了一种用于检测和/或定量血液、血浆、血清或组织(例如，皮肤组织)中的sBTLA的测定法，所述方法包括将血液、血浆、血清或组织(例如，皮肤组织)样品与捕获抗体和不抑制BTLA与HVEM结合的BTLA结合剂接触。在一些实施方式中，不抑制BTLA与HVEM结合的BTLA结合剂是以下BTLA结合剂：所述BTLA结合剂包含免疫球蛋白重链可变区，所述重链可变区是SEQ IDNO:43-156中的任一者或至少包含其CDR；或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和免疫球蛋白轻链可变区，所述轻链可变区是SEQ ID NO:157-192中的任一者或至少包含其CDR；或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；具有本文描述的任何或所有其它特征。例如，所述BTLA结合剂可以包含由SEQ ID NO:195-200代表的CDR；例如，BTLA结合剂包含CDR，所述CDR包含SEQ ID NO:201-206，或包含SEQ ID NO:193和194或SEQ ID NO:144和174的Ig重链和轻链。在一些实施方式中，所述捕获抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1-15、207、208、217或218中的任一者或至少其CDR，或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:16-25、209、210、219或220中的任一者或至少其CDR，或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；具有本文描述的任何或所有其它特征。例如，所述捕获抗体可以包含由SEQ ID NO:27、30和32代表的重链CDR 1-3；和由SEQ ID NO:36、39和41代表的轻链CDR 1-3；或本文提供的更具体叙述的CDR中的任一者。例如，捕获抗体可以包含SEQ ID NO:26的Ig重链(例如，SEQ ID NO:1-15、207、208、217或218中的任一者)和SEQ ID NO:35的Ig轻链(例如，SEQ ID NO:16-25、209、210、219或220中的任一者)。
在前述检测、测量或定性血液、血浆、血清或组织中的sBTLA的方法的一些实施方式中，所述方法可以进一步包括将血液、血浆、血清或组织样品中的sBTLA浓度与参考sBTLA浓度进行比较。可以使用任何合适的参考浓度。在一些实施方式中，参考sBTLA浓度是在施用BTLA结合剂之前来自同一患者或受试者的血液、血浆、血清或组织样品中的sBTLA浓度。可替代地或另外地，参考sBTLA浓度可以由另一受试者，例如没有接受BTLA结合剂施用的相同类型的正常、未患病受试者的血液、血浆、血清或组织中的sBTLA浓度提供，或由通过统计分析此类受试者的群体的血液、血浆、血清或组织中的sBTLA浓度而建立的参考sBTLA浓度(例如，来自未接受BTLA结合剂治疗的此类正常、非患病受试者群体的血液、血浆、血清或组织样品中的sBTLA的平均浓度)。在一些实施方式中，参考sBTLA浓度通过以下方法而建立，所述方法包括将受试者的血液、血浆、血清或组织样品或来自受试者群体的血液、血浆、血清或组织样品与如上所述的捕获抗体接触；任选地，还同时或以任何顺序依次将所述血液、血浆、血清或组织样品与如本文所述的不抑制BTLA与HVEM结合的BTLA结合剂接触。
在其它实施方式中，所述方法包括将来自经施用BTLA结合剂的受试者的血液、血浆、血清或组织样品中的sBTLA浓度与在不同时间点来自同一受试者的血液、血浆、血清或组织样品中的sBTLA浓度进行比较，所述不同时间点可以是在向受试者施用BTLA结合剂之前或之后。例如，sBTLA浓度可以在施用BTLA结合剂之后的两个或更多个时间点测量，并进行比较以评估BTLA结合剂随时间的作用，任选地进行一次或多次另外的中间BTLA结合剂施用。以这种方式，可以监测用BTLA结合剂的治疗。
本文还提供了一种组合物，其包含不抑制BTLA与HVEM结合的BTLA结合剂和与sBTLA结合的第二捕获抗体，其可用于前述检测、测量或监测血液、血浆、血清或组织中的sBTLA的方法。在一些实施方式中，不抑制BTLA与HVEM结合的BTLA结合剂包含免疫球蛋白重链可变区，所述重链可变区是SEQ ID NO:43-156中的任一者或至少包含其CDR；或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区是SEQ ID NO:157-192中的任一者或至少包含其CDR；或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；具有本文描述的任何或所有其它特征。例如，BTLA结合剂可以包含由SEQ IDNO:195-200代表的CDR；例如，BTLA结合剂包含CDR，所述CDR包含SEQ ID NO:201-206，或包含SEQ ID NO:193和194或SEQ ID NO:144和174的Ig重链和轻链。在一些实施方式中，捕获抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1-15、207、208、217或218中的任一者或至少其CDR，或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:16-25、209、210、219或220中的任一者或至少其CDR，或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；具有本文描述的任何或所有其它特征。例如，捕获抗体可以包含由SEQ ID NO:27、30和32代表的重链CDR 1-3；和由SEQ ID NO:36、39和41代表的轻链CDR 1-3；或本文提供的更具体叙述的CDR中的任一者。例如，捕获抗体可以包含SEQ IDNO:26的Ig重链(例如，SEQ ID NO:1-15、207、208、217或218中的任一者)和SEQ ID NO:35的Ig轻链(例如，SEQ ID NO:16-25、209、210、219或220中的任一者)。
BTLA结合剂、捕获抗体或组合物可以提供在试剂盒中，即具有用于进行诊断测定的说明书的预定量的试剂的包装组合中。如果BTLA结合剂用酶标记，则试剂盒理想地包含酶所需的底物和辅因子(例如，提供可检测的发色团或荧光团的底物前体)。另外，试剂盒中可以包含其它添加剂，例如稳定剂、缓冲液(例如，阻断缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以有所不同，以提供试剂溶液中的多种浓度，其显著优化测定灵敏度。试剂可以提供为干粉(通常为冻干粉)，其包含溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。
核酸
本发明还提供了一种或多种编码本文提供的免疫球蛋白重链多肽、免疫球蛋白轻链多肽和BTLA结合剂的核酸。
术语“核酸序列”旨在涵盖DNA或RNA的聚合物，即多核苷酸，其可以是单链或双链的并且可以含有非天然的或改变的核苷酸。如本文使用，术语“核酸”和“多核苷酸”是指任何长度的聚合形式的核苷酸，核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)。这些术语是指分子的一级结构，并且因此包括双链和单链DNA以及双链和单链RNA。作为等效物，术语包括由核苷酸类似物制成的RNA或DNA的类似物和修饰的多核苷酸，例如但不限于甲基化和/或加帽多核苷酸。核酸通常经由磷酸酯键连接以形成核酸序列或多核苷酸，不过本领域中已知许多其它键(例如，硫代磷酸酯、硼代磷酸酯等)。
编码所述免疫球蛋白重链多肽、所述免疫球蛋白轻链多肽或所述BTLA结合剂的核酸可以是载体的一部分。载体可以是例如质粒、附加体、粘粒、病毒载体(例如，逆转录病毒或腺病毒)或噬菌体。合适的载体和载体制备方法是本领域中所熟知的(参见例如Sambrook等人,《分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning,a Laboratory Manual)》,第3版,纽约冷泉港的冷泉港出版社(2001)，和Ausubel等人,《最新分子生物学实验方法汇编(CurrentProtocols in Molecular Biology)》,纽约州纽约的格林出版公司和约翰威利父子公司(1994))。
载体通常包含表达控制序列，例如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、转录终止子、信号肽(例如，骨连接蛋白信号肽)、内部核糖体进入位点(IRES)等，其提供编码序列在宿主细胞中的表达。示例性表达控制序列是本领域中所已知的，并且描述于例如Goeddel,《基因表达技术：酶学方法(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology)》,第185卷,加利福尼亚州圣迭戈的学术出版社(1990)中。
来自各种不同来源的多种启动子，包括组成型、诱导型和阻抑型启动子，是本领域中所熟知的。启动子的代表性来源包括例如病毒、哺乳动物、昆虫、植物、酵母和细菌，并且来自这些来源的合适的启动子是容易获得的，或可以基于可公开获得的序列合成制备，所述序列例如可获自如ATCC等保藏机构以及其它商业或个人来源。启动子可以是单向的(即启动一个方向上的转录)或双向的(即启动3'或5'方向上的转录)。启动子的非限制性实例包括例如T7细菌表达系统、pBAD(araA)细菌表达系统、巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子。诱导型启动子包括例如Tet系统(美国专利5,464,758和5,814,618)、蜕皮激素诱导型系统(No等人,《国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》,93:3346-3351(1996))、T-REXTM系统(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰(Invitrogen))、LACSWITCHTM系统(加利福尼亚州圣迭戈的策略基因(Stratagene))和Cre-ERT他莫昔芬(tamoxifen)诱导型重组酶系统(Indra等人,《核酸研究(Nuc.Acid.Res.)》,27:4324-4327(1999)；《核酸研究(Nuc.Acid.Res.)》,28:e99(2000)；美国专利7,112,715；和Kramer和Fussenegger,《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》,308:123-144(2005))。
如本文使用，术语“增强子”是指增加例如与其可操作地连接的核酸序列的转录的DNA序列。增强子可以位于距核酸序列的编码区数千碱基处并且可以介导调节因子的结合、DNA甲基化的模式或DNA结构的变化。来自多种不同来源的多种增强子是本领域中所熟知的并且可作为克隆的多核苷酸或在克隆的多核苷酸内获得(例如，可获自如ATCC等保藏机构以及其它商业或个人来源)。多种包含启动子(例如，常用的CMV启动子)的多核苷酸还包含增强子序列。增强子可以位于编码序列的上游、内部或下游。
载体也可以包含“选择性标志物基因”。如本文使用，术语“选择性标志物基因”是指一种核酸序列，其在存在相对应的选择剂的情况下允许表达所述核酸序列的细胞被特异性选择或针对。合适的选择性标志物基因是本领域中所已知的，并且描述于例如国际专利申请公开WO 1992/008796和WO 1994/028143；Wigler等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,77:3567-3570(1980)；O'Hare等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,78:1527-1531(1981)；Mulligan和Berg,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,78:2072-2076(1981)；Colberre-Garapin等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,150:1-14(1981)；Santerre等人,《基因(Gene)》,30:147-156(1984)；Kent等人,《科学(Science)》,237:901-903(1987)；Wigler等人,《细胞(Cell)》,11:223-232(1977)；Szybalska和Szybalski,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,48:2026-2034(1962)；Lowy等人,《细胞(Cell)》,22:817-823(1980)；和美国专利5,122,464和5,770,359中。
在一些实施方式中，载体是“附加型表达载体”或“附加体”，其能够在宿主细胞中复制，并且在存在适当选择性压力的情况下保持为宿主细胞内的染色体外DNA区段(参见例如Conese等人,《基因疗法(Gene Therapy)》,11:1735-1742(2004))。代表性市售附加型表达载体包括但不限于利用爱泼斯坦-巴尔核抗原1(EBNA1)和爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)复制起点(oriP)的附加型质粒。来自英杰(加利福尼亚州卡尔斯巴德)的载体pREP4、pCEP4、pREP7和pcDNA3.1以及来自策略基因(加利福尼亚州拉荷亚)的载体pBK-CMV代表使用T抗原和SV40复制起点代替EBNA1和oriP的附加型载体的非限制性实例。
其它合适的载体包括整合表达载体，其可以随机整合到宿主细胞的DNA中，或可以包含重组位点以使得能够在表达载体和宿主细胞的染色体之间进行特异性重组。此类整合表达载体可以利用宿主细胞的染色体的内源性表达控制序列来实现期望蛋白质的表达。以位点特异性方式整合的载体的实例包括例如来自英杰(加利福尼亚州卡尔斯巴德)的flp-in系统的组分(例如，pcDNATM5/FRT)，或cre-lox系统，其例如可以在来自策略基因(加利福尼亚州拉荷亚)的pExchange-6核心载体中找到。随机整合到宿主细胞染色体中的载体的实例包括例如来自生命技术(Life Technologies)(加利福尼亚州卡尔斯巴德)的pcDNA3.1(在不存在T-抗原的情况下引入)、来自密理博(Millipore)(马萨诸塞州比勒利卡)的UCOE和来自普洛麦格(Promega)(威斯康辛州麦迪逊)的pCI或pFN10A(ACT)FLEXITM。
还可以使用病毒载体。代表性市售病毒表达载体包括但不限于可获自克鲁塞尔公司(Crucell,Inc.)(荷兰莱顿)的基于腺病毒的Per.C6系统、来自英杰(加利福尼亚州卡尔斯巴德)的基于慢病毒的pLP1以及来自策略基因(加利福尼亚州拉荷亚)的逆转录病毒载体pFB-ERV和pCFB-EGSH。
编码本发明的氨基酸序列的核酸序列可以在同一载体上(即顺式)提供给细胞。可以使用单向启动子来控制每个核酸序列的表达。在另一个实施方式中，可以使用双向启动子和单向启动子的组合来控制多个核酸序列的表达。可替代地，编码本发明的氨基酸序列的核酸序列可以在单独载体上(即反式)提供给细胞群。每个单独载体中的每个核酸序列可以包含相同或不同的表达控制序列。各单独载体可以同时或依次提供给细胞。
可以将包含编码本发明的氨基酸序列的核酸的载体引入到能够表达由此编码的多肽的宿主细胞中，包括任何合适的原核或真核细胞。因此，本发明提供了一种包含本发明的载体的分离细胞。优选的宿主细胞是可以容易且可靠地生长、具有合理地快的生长速率、具有良好表征的表达系统并且可以容易且有效地转化或转染的宿主细胞。
合适的原核细胞的实例包括但不限于来自芽孢杆菌属(例如，枯草芽孢杆菌和短芽胞杆菌)、埃希氏杆菌属(例如，大肠杆菌)、假单胞菌属、链霉菌属、沙门氏菌属和欧文氏菌属的细胞。特别有用的原核细胞包括各种大肠杆菌菌株(例如，K12、HB101(ATCC编号33694)、DH5α、DH10、MC1061(ATCC编号53338)和CC102)。
在一些实施方式中，将所述载体引入到真核细胞中。合适的真核细胞是本领域中所已知的并且包括例如酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。合适的酵母细胞的实例包括来自克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、鼻孢子菌属、酵母菌属和裂殖酵母属的酵母细胞。优选的酵母细胞包括例如酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母。
合适的昆虫细胞描述于例如Kitts等人,《生物技术(Biotechniques)》,14:810-817(1993)；Lucklow,《最新生物技术观点(Curr.Opin.Biotechnol.)》,4:564-572(1993)；和Lucklow等人,《病毒学杂志(J.Virol.)》,67:4566-4579(1993)中。优选的昆虫细胞包括Sf-9和HI5(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰)。
在一些实施方式中，哺乳动物细胞用于本发明。多种合适的哺乳动物宿主细胞是本领域中所已知的，并且许多可获自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection；ATCC)(弗吉尼亚州马纳萨斯)。合适的哺乳动物细胞的实例包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(例如，CHO-K1细胞，ATCC编号CCL61)、CHO DHFR细胞(Urlaub等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,97:4216-4220(1980))、人胚胎肾(HEK)293或293T细胞(ATCC编号CRL1573)和3T3细胞(ATCC编号CCL92)。其它合适的哺乳动物细胞系是猴COS-1(ATCC编号CRL1650)和COS-7细胞系(ATCC编号CRL1651)以及CV-1细胞系(ATCC编号CCL70)。进一步的示例性哺乳动物宿主细胞包括灵长动物细胞系和啮齿动物细胞系，包括经转化的细胞系。正常二倍体细胞、衍生自原代组织的体外培养物的细胞株以及原代外植体也是合适的。其它合适的哺乳动物细胞系包括但不限于小鼠成神经细胞瘤N2A细胞、HeLa、小鼠L-929细胞和BHK或HaK仓鼠细胞系，其均可获自ATCC。用于选择合适的哺乳动物宿主细胞的方法和用于进行细胞转化、培养、扩增、筛选和纯化的方法是本领域中所已知的。
在一个实施方式中，哺乳动物细胞是人细胞。例如，哺乳动物细胞可以是人淋巴样或淋巴样衍生细胞系，例如前B淋巴细胞来源的细胞系。人淋巴样细胞系的实例包括但不限于RAMOS(CRL-1596)、Daudi(CCL-213)、EB-3(CCL-85)、DT40(CRL-2111)、18-81(Jack等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,85:1581-1585(1988))、Raji细胞(CCL-86)、PER.C6细胞(荷兰莱顿的荷兰克鲁塞尔公司(Crucell Holland B.V.))及其衍生物。
编码本发明的氨基酸序列的核酸序列可以通过任何合适的方法引入到细胞中，例如通过“转染”、“转化”或“转导”。如本文使用，“转染”、“转化”或“转导”是指通过使用物理或化学方法将一种或多种外源性多核苷酸引入到宿主细胞中。多种合适的技术是本领域中所已知的，并且包括例如磷酸钙DNA共沉淀(参见例如Murray E.J.(编),《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,第7卷,《基因转移和表达方案(Gene Transfer andExpression Protocols)》,胡玛纳出版社(1991))；DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,《自然(Nature)》,346:776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,《分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)》,7:2031-2034(1987))。在感染性粒子在合适的包装细胞(其中多种是市售的)中生长后，可以将噬菌体或病毒载体引入到宿主细胞中。
所述核酸和细胞可以用于任何目的，例如用于制造本文所述的BTLA结合剂。在这方面，本发明提供了一种制备BTLA结合剂的方法，其包括培养包含编码BTLA结合剂的重和/或轻免疫球蛋白多肽的核酸的细胞。换句话说，所述方法包括在细胞(例如，体外细胞，如本文讨论的细胞系中的任一者，包括CHO和CHO-K1细胞)中表达编码BTLA结合剂的免疫球蛋白重链和/或轻链的核酸。应了解，免疫球蛋白重链和轻链可以由给定细胞中的单一核酸表达，或免疫球蛋白重链和轻链可以由相同细胞中的单独核酸表达。所述方法可以进一步包括使用已知技术从细胞或细胞培养基中收获和/或纯化BTLA结合剂。
以下实施例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。
实施例
表2提供了包含SEQ ID NO:1-15的免疫球蛋白重链可变区和SEQ ID NO:16-25的轻链可变区的BTLA结合剂(例如，抗体或抗体片段)的实施例。
表2
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对于表2中的抗体或抗体片段，Kabat编号的CDR如下：CDRH1位于相应VH序列的31-35位；CDRH2位于相应VH序列的50-66位；CDRH3位于相应VH序列的99-106位；CDRL1位于相应VL序列的24-34位；CDRL2位于相应VL序列的50-56位；CDRL3位于相应VL序列的89-97位。具有表2所示的配对的重链和轻链可变区或至少其CDR的BTLA结合剂提供了本公开的具体实施方式。表2的重链和轻链可变区的另外的配对或至少其CDR将提供其它BTLA结合剂，并且其被认为在本公开的范围内。
表3提供了包含SEQ ID NO:43-156的免疫球蛋白重链可变区和SEQ ID NO:157-192的轻链可变区的BTLA结合剂(例如，抗体或抗体片段)的实施例。
表3
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对于表3中的抗体或抗体片段，Kabat编号的CDR区如下：CDRH1位于相应VH序列的31-35位；CDRH2位于相应VH序列的50-66位，除了标有*的抗体，其中CDRH2位于相应VH序列的50-67位；CDRH3位于相应VH序列的99-113位，除了标有的抗体，其中CDRH3位于100-114位；CDRL1位于相应VL序列的24-34位；CDRL2位于相应VL序列的50-56位；CDRL3位于相应VL序列的89-97位。具有表3所示的配对的重链和轻链可变区或至少其CDR的BTLA结合剂提供了本公开的具体实施方式。表3的重链和轻链可变区的另外的配对或至少其CDR将提供其它BTLA结合剂，并且其被认为在本公开的范围内。
在以下实施例中，参考的抗体如下：
实施例1
抗体6G3衍生自通过标准融合技术从BTLA免疫小鼠的脾细胞生成的小鼠杂交瘤。使用本文描述的标准技术将抗体人源化。使用表1中总结的载体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达最终优化抗体。
表1.
实施例2
本实例证明，本文公开的6G3抗BTLA抗体对人BTLA具有的结合亲和力KD～5nM，并且对食蟹猴BTLA具有的结合亲和力KD～11nM，如通过表面等离子体共振确定。
使用Biacore T200(GE医疗生命科学(GE health care Life Sciences))进行表面等离子体共振(SPR)分析。使用Biacore T200评估软件中的1:1结合模型确定动力学常数，以计算结合速率和解离速率(分别为ka和kd)以及作为总亲和力量度的解离常数(KD)。使用EDC激活的胺偶联化学将抗人IgG(GE医疗生命科学)固定在CM5芯片上(以10微升/分钟的流速接触420秒)。抗体(APE10585.04 6G3 IgG1和APE10840.05 6G3 IgG4)，每一者均为0.5μg/ml)在以10微升/分钟的流速与流式细胞接触60秒后捕获。浓度为60nM、20nM、6.7nM和2.2nM的单体人BTLA-his或食蟹猴BTLA-his流过捕获的抗体(480秒缔合，1800秒解离)。实验(run)在25℃下进行，并使用含有10mM HEPES，pH 7.6，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％聚山梨醇酯20的缓冲液(HBS-EP+，pH 7.6；Teknova公司)用于流动相和所有稀释液。在每个周期结束时，通过两次连续暴露(60秒和90秒)于3M MgCl2(30微升/分钟)的再生去除结合的抗原。与实验相对应的传感图和结合常数在图1(人BTLA)和图1(食蟹猴BTLA)中示出。每个图的右侧列出了以共振单位(RU)为单位的抗体捕获水平。
实施例3
本实施例证明，本文公开的6G3抗BTLA抗体对人BTLA具有的结合亲和力KD～410pM，并且对食蟹猴BTLA具有的结合亲和力KD～1.66nM，如通过动力学排除测定确定。
6G3 IgG4(APE10840.04(H链SEQ ID NO:144，L链SEQ ID NO:174))与BTLA结合的基于溶液的亲和力测量在KinExA 3000(Sapidyne仪器(Sapidyne Instruments))上确定。吖内酯珠(赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific))在室温下用含人BTLA ECD-his(30μg/ml)或食蟹猴BTLA ECD-his(20μg/ml)的50mM Na2CO3包被2小时，并用10mg/ml BSA封闭。在人和食蟹猴BTLA实验中，将6G3 IgG4 APE10840.04的浓度保持恒定为100pM以进行结合。在25℃下加入人或食蟹猴BTLA ECD-his，其浓度为1000nM至68fM，以2.5倍稀释。在用BTLA偶联的吖内酯珠捕获游离抗体之前，样品组在4℃下平衡72小时，并置于室温下6小时。用于定量与珠结合的6G3的第二抗体是Alexa-Fluor-647 AffiPure驴抗人IgG(250ng/ml，杰克森免疫研究实验室(Jackson ImmunoResearch Laboratories))。分别在仅含6G3和仅含缓冲液的样品上确定最大和背景信号。使用KinExA Pro软件3.2.6分析数据。6G3抗体与人BTLA和食蟹猴BTLA结合的KD值分析中的95％置信区间在图2中示出。
实施例4
本实施例证明，本文公开的6G3抗体表现出与在稳定转染的293c18细胞中表达的人和食蟹猴BTLA的饱和结合。
稳定表达人BTLA构建体的293c18细胞克隆1E4或稳定表达食蟹猴BTLA的克隆1G5用Accutase溶液(密理博西格玛(Millipore Sigma)/西格玛-奥瑞奇(Sigma-Aldrich))收获，并用磷酸盐缓冲盐水/1％ BSA洗涤一次。通过在室温下轻轻摇晃10分钟，将293c18食蟹猴BTLA细胞负载亲脂性碳菁染料DiD(2μM，1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二碳菁；赛默飞世尔科技)。将DiD染色细胞在PBS/1％ BSA中洗涤，并且将等量的人BTLA 293c18细胞和食蟹猴BTLA 293c18-DiD染色细胞混合。通过在4℃下轻轻摇动10分钟，将细胞(2x105个总细胞/样品)与指示浓度的纯化6G3 IgG4(两个生产批次，APE10840.03和APE10840.04(H链SEQ ID NO:144，L链SEQ ID NO:174))或对鸡蛋溶菌酶具有特异性的人IgG4同型对照抗体一起在FACS缓冲液(PBS，1％ BSA，0.02％叠氮化钠)中孵育。将细胞离心并用FACS缓冲液洗涤一次，重悬于FACS缓冲液中，并通过在4℃下再轻轻摇动20分钟进行孵育。将细胞离心并用不含BSA的FACS缓冲液洗涤一次，并在室温下固定于100μl/孔的含2％多聚甲醛的PBS中10分钟。将细胞在FACS缓冲液中洗涤一次，并通过在4℃下轻轻摇动10分钟与第二抗体(山羊抗人κ-PE，0.2μg/ml，含于FACS缓冲液中，南方生物技术(SouthernBiotech))一起孵育。将细胞洗涤并重悬于FACS缓冲液中，并在BD FACSArray(BD生物科学(BD Biosciences))上分析荧光。对表达食蟹猴BTLA(图3)的DiD染色细胞与表达人BTLA(图3)的细胞分别进行中值荧光强度(MFI)分析。在GraphPad Prism(GraphPad软件公司(GraphPad Software,Inc.))中，用log(抑制剂)对响应-可变斜率(四参数)最小二乘拟合分析来进行曲线拟合。
如图3中所示，本文公开的两批6G3抗体(APE10840.03和APE10840.04)表现出与人BTLA 293c18细胞(EC50分别为～1.7nM和1.8nM)和食蟹猴BTLA 293c18细胞(EC50为2.3nM)的相似的浓度依赖性和饱和结合。
实施例5
本实施例证明，本文公开的6G3抗体表现出与正常供体人外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD20+B细胞的饱和结合。
通过获自从圣迭戈血库(加利福尼亚州圣迭戈)的正常供体血液的Histopaque(西格玛-奥瑞奇)密度-梯度离心来分离人外周血单核细胞(PBMC)。洗涤PBMC，并在FACS缓冲液(PBS，1％ BSA，0.02％叠氮化钠)中以2x 107个细胞/ml与人BD Fc阻断剂(2.5μg/1x 106个细胞，BD生物科学)和可固定黄色死细胞染色剂(30μl，赛默飞世尔科技)一起在冰上孵育10分钟。将细胞在FACS缓冲液中洗涤一次，以1x 107个细胞/ml重悬于FACS缓冲液中，并加入以下表型抗体：Alexa Fluor 488-抗人CD3ε克隆SK7、亮紫421-抗人CD4克隆OKT4、亮紫785-抗人CD8克隆SK1和亮紫570-抗人CD20克隆2H7(各50μl；全部来自BioLegend公司(BioLegend,Inc.))。将加入了表型抗体的细胞(1x 106个细胞/样品)铺在U形底96孔板中，并通过在4℃下轻轻摇动20分钟来与指示浓度的DyLight 650标记的抗BTLA或同型对照抗体一起在FACS缓冲液中孵育。6G3IgG4(APE10916.02)是用DyLight 650(3.44molDyL650/mol抗体)标记的APE10840。对鸡蛋溶菌酶具有特异性的人IgG4同型对照抗体用DyLight 650(3.22mol DyL650/mol抗体)标记。参考抗BTLA抗体MIH26为购自BioLegend公司的别藻蓝蛋白(APC)标记抗体。将样品在FACS缓冲液中洗涤一次，重悬于150μl/孔FACS缓冲液中，并在4℃下额外洗涤10分钟。将样品在室温下离心并在含4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水中固定10分钟。将样品在FACS缓冲液中洗涤两次，重悬于150μl/孔FACS缓冲液中，并在NovoCyte流式细胞仪(ACEA生物科学公司(ACEA Biosciences,Inc.))上分析荧光。使用NovoExpress软件(ACEA生物科学公司)分析数据。对门控CD4+T细胞(图4)、CD8+T细胞(图4)或CD20+B细胞(图4)上的抗BTLA或同型染色的中值荧光强度作图，并在GraphPad Prism(GraphPad软件公司)中用log(激动剂)对响应(三参数)最小二乘法拟合来进行曲线拟合以计算EC50。
用DyLight 650标记的本文公开的6G3抗体表现出与健康供体CD4+T细胞(图4)、CD8+T细胞(图4)和B细胞(图4)的浓度依赖性和饱和结合。6G3抗体与CD4+T细胞结合的EC50～2.4nM，与CD8+T细胞结合的EC50～3.2nM，与CD20+B细胞结合的EC50～0.5nM。阳性对照抗BTLA抗体MIH26-APC的染色与6G3抗体的染色相当。DyLight 650标记的人IgG4同型对照抗体未表现出这些细胞群的染色(图4)。
实施例6
本实施例证明，本文公开的6G3抗体表现出与正常食蟹猴外周血CD3+T细胞和CD20+B细胞的浓度依赖性结合。
根据制造商的说明用Alexa Fluor 647(AF647)(Alexa Fluor抗体标记试剂盒；赛默飞世尔科技/分子探针(ThermoFisher Scientific/Molecular Probes))标记的由稳定转染的CHO-K1细胞池制备的6G3 IgG4(APE13308)，并命名为APE13766.02(6G3-AF647)。从阿尔塔科学(Altasciences)获得来自正常食蟹猴的新鲜外周血。在室温下，将全血样品(800μl)与人FcR封闭试剂(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec,Inc.))一起孵育10分钟，然后在室温下在避光条件下用荧光标记抗体的混合物染色20分钟，以区分食蟹猴T和B细胞群[PerCP-Cy5.5小鼠抗人CD3(克隆SP34-2；BD生物科学)、BD Horizon V450小鼠抗人CD4(克隆L200；BD生物科学)、APC/Cy7小鼠抗人CD8(克隆SK1；BD生物科学)、亮紫785抗CD20(克隆2H7；BioLegend公司)、BD Horizon V500小鼠抗NHP CD45(克隆D058-1283；BD生物科学)]。然后，将血液等分到各孔中，并在室温下在避光条件下与指示浓度的6G3-AF647(APE13766.02)或APC-小鼠抗人CD272(BTLA)参考抗体(克隆J168-540；BD生物科学)一起孵育30分钟。孵育后，通过加入2.0ml稀释的BD Pharm Lyse裂解液(BD生物科学)裂解红细胞10分钟，样品以200x g离心5分钟，在FACS缓冲液[杜氏PBS，不含钙，不含镁(吉布科/赛默飞世尔科技(Gibco/ThermoFisher Scientific))，25mM HEPES，pH 7.2，0.1％ BSA，0.1％叠氮化钠]中洗涤，并在室温下在4％多聚甲醛(200μl/样品)中固定10分钟。将样品在FACS缓冲液中洗涤两次，并在NovoCyte Quanteon流式细胞仪(ACEA生物科学公司)上分析荧光。使用NovoExpress软件(ACEA生物科学公司)分析数据。在GraphPad Prism(GraphPad软件公司)中对平均荧光强度(MFI)值作图并用非线性回归分析进行拟合。总CD3+细胞上的每种抗BTLA抗体的MFI值在图5A中示出；总CD20+细胞上的每种抗BTLA抗体的MFI值在图5B中示出。图5C示出了抗CD3染色和33nM APC标记的抗BTLA参考抗体(克隆J168-540)染色的点图分析。图5D示出了抗CD3染色和100nM 6G3-AF647染色的点图分析。图5C和图5D中的每种抗BTLA抗体与CD3-细胞的结合(每个图的底部象限中的绿色细胞)反映了与CD20+B细胞的结合。
用AF647标记的本文公开的6G3抗体表现出与来自正常食蟹猴的外周血CD3+T细胞和CD20+B细胞的浓度依赖性结合。在所用的染色条件下，与CD3+外周血T细胞的结合对100nM抗体不饱和(图5A)(估计EC50～3.4nM)，而6G3-AF647与CD20+外周血B细胞的结合开始饱和(接近EC50～1.4nM)(图5B)。B细胞的6G3-AF647染色的MFI比T细胞的6G3-AF647染色的MFI高大约高9倍。正常CD3+和CD3-(CD20+)食蟹猴细胞上的6G3-AF647在100nM的染色图谱与市售参考APC标记的抗BTLA抗体J168在33nM的染色图谱非常相似(分别为图5D和5C)。
实施例7
本实施例证明，本文公开的抗BTLA抗体不与HVEM或HVEM/LIGHT复合物竞争与细胞表面BTLA的结合。
293c18细胞，即稳定表达人BTLA的克隆1E4用Accutase溶液(密理博西格玛/西格玛-奥瑞奇)收获，并用PBS/1％ BSA洗涤一次。将细胞以2x 105个/孔铺在U形底96孔板中，并置于冰上。将两倍指示浓度的纯化抗体在FACS缓冲液(PBS，1％ BSA，0.02％叠氮化钠)中连续稀释3倍。所测试的抗体是对鸡蛋溶菌酶具有特异性的人IgG4同型对照抗体、参考BTLAIgG4拮抗剂抗体和6G3 IgG4(APE10840.06)。通过混合等摩尔(各60nM)量的DyLight 650-HVEM人IgG1 Fc和三聚LIGHT-foldon-his并在室温下预孵育15分钟，预形成三聚HVEM/LIGHT复合物。将DyLight 650-HVEM-Fc(最终浓度100nM；图6A)或预形成的DyLight 650-HVEM/LIGHT复合物(HVEM/LIGHT的最终浓度，各30nM；图6B)加入稀释的抗体中(如所指示的抗体的最终浓度)，并在冰上孵育15分钟。将细胞离心，轻轻重悬于抗体和HVEM的混合物中(图6A)或抗体和HVEM/LIGHT复合物的混合物中(图6B)，并在冰上孵育30分钟。将细胞离心，用FACS缓冲液洗涤一次，并在室温下在含2％多聚甲醛的PBS中固定10分钟。将细胞洗涤一次，重悬于FACS缓冲液中，并在BD FACSArray(BD生物科学)上分析荧光。对中值荧光强度(MFI)作图，并在GraphPad Prism(GraphPad软件公司)中用log(激动剂)对响应(三参数)最小二乘法拟合来进行曲线拟合。
本文公开的6G3抗体(APE10840.06)不与HVEM-Fc(图6A)或HVEM/LIGHT复合物(图6B)竞争与细胞表面BTLA的结合。在存在6G3抗体的情况下，观察到HVEM-Fc与细胞表面BTLA的结合增加(图6A)。当使用HVEM/LIGHT复合物时，也观察到6G3依赖性的HVEM结合增加，但单独使用HVEM-Fc时更明显(图6A和6B)。参考拮抗剂抗体表现出对HVEM和HVEM/LIGHT与BTLA结合的浓度依赖性抑制(图6A和6B)。无关的同型匹配的IgG4抗体不影响HVEM或HVEM/LIGHT与BTLA的结合。
实施例8
本实施例证明，由本文公开的6G3和10D8抗体结合的人BTLA上的表位位于BTLA的与HVEM结合位点相反的面上。
使用重组人BTLA单体对由本文公开的6G3和10D8抗体结合的BTLA上的肽进行氢-氘交换图谱分析。实验中使用的BTLA是hBTLA氨基酸编号31-155(UniProt ID#Q7Z6A9)，其后接有6-his标签。图7A、7B和7C示出了人BTLA胞外结构域(黑色)的晶体结构的带状模型，其与来自蛋白质数据库结构的在PyMOL中渲染的人HVEM胞外结合结构域(浅灰色)的晶体结构的空间填充模型复合(Compaan等人,《生物化学杂志(J.Biol Chem)》280:39553-39561(2005))。图7A总结了使用6G3抗体(APE12839.05(H链SEQ ID NO:144，L链SEQ ID NO:174))的氢-氘交换实验，图7B总结了使用10D8抗体(APE11482.06)的氢-氘交换实验，而图7C总结了使用参考BTLA拮抗剂抗体(APE10693.17)的氢-氘交换实验。对于每个实验，将BTLA/抗体混合物或单独的BTLA进行氘标记4、10或60分钟，以便观察交换动力学。孵育后，使BTLA蛋白在酸性pH下进行快速酶促蛋白水解，并且通过液相色谱-质谱对所得肽中的氘掺入进行定量。
图谱分析示出了涉及BLTA的下列残基：
6G3结合
肽52-65DPFELECPVKYCAN(SEQ ID NO:227)
肽100-106LHFEPVL(SEQ ID NO:228)
10D8结合
肽46-65 HSILAGDPFELECPVKYCAN(SEQ ID NO:229)
肽82-91 LEDRQTSWKE(SEQ ID NO:230)
肽100-106LHFEPVL(SEQ ID NO:231)
参考拮抗剂结合
实施例9
本实施例证明，当BTLA和HVEM在相同细胞上表达时，本文公开的6G3抗体在NF-κB萤光素酶报告测定中抑制LIGHT诱导的HVEM信号传导。
生成稳定表达全长人BTLA、全长人HVEM和衍生自pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro](普洛麦格)的NF-κB-萤光素酶报告子构建体的293c18细胞，进行单细胞克隆，并命名为huHVEM/huBTLA/NF-κB萤光素酶，克隆8。生成稳定表达全长人LIGHT的CHO-S细胞，并针对最高LIGHT表达分选两次作为稳定池。huHVEM/huBTLA/NF-κB萤光素酶细胞用Accutase溶液(西格玛-奥瑞奇/密理博西格玛)收获，重悬于补充有10％胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基中，并铺在平底96孔板中(5x 104个细胞/孔)。在37℃、5％ CO2下孵育1小时后，向细胞中加入指示浓度的6G3 IgG4(APE12839.07(H链SEQ ID NO:144，L链SEQ ID NO:174))、对鸡蛋溶菌酶具有特异性的人IgG4同型对照抗体或人IgG4参考抗BTLA拮抗剂抗体。在室温下孵育30分钟后，收获CHO-S LIGHT细胞并加入(0.55x104个细胞/孔；最终条件，9:1HVEM-NF-κB响应细胞：CHO-S LIGHT刺激细胞，其代表NF-κB反应的EC50)。在37℃、5％ CO2下4小时后，向孔中加入等体积的Steady-Glo萤光素酶测定系统(普洛麦格)，并在室温下孵育10分钟。在EnVision多模式读板仪(珀金埃尔默(PerkinElmer))上以0.1秒的测量时间读取样品的发光。以相对光单位(RLU)为单位对发光作图，并在GraphPad Prism(GraphPad软件)中用log(激动剂)对响应(三参数)最小二乘法拟合来进行曲线拟合。
图8中示出的NF-κB萤光素酶报告测定表明，当BTLA和HVEM在相同细胞上表达时，本文公开的6G3抗体响应于CHO-S LIGHT以浓度依赖性方式抑制HVEM依赖性NF-κB信号传导。这表明，在这些条件下，本文公开的6G3抗体可以促进相同细胞上的HVEM和BTLA之间的相互作用，从而导致LIGHT驱动的HVEM依赖性NF-κB信号传导减少。
图8中示出的NF-κB萤光素酶报告测定表明，当BTLA和HVEM在相同细胞上表达时，参考拮抗剂抗体响应于CHO-S LIGHT以浓度依赖性方式增强LIGHT介导的HVEM依赖性NF-κB信号传导。通过破坏相同细胞上的BTLA和HVEM的相互作用，拮抗剂抗体将允许更多未结合的HVEM分子可与LIGHT相互作用，从而增加LIGHT驱动的HVEM依赖性NF-κB信号传导。
实施例10
本实施例证明在荧光共振能量转移(FRET)测定中，本文公开的6G3抗体不破坏相同细胞表面上的BTLA/HVEM复合物。
在图9A中，稳定表达全长人BTLA和人HVEM的293c18细胞克隆用Accutase溶液(密理博西格玛/西格玛-奥瑞奇)收获，在FACS缓冲液(PBS，1％ BSA，0.02％叠氮化钠)中洗涤，并铺在白色U形底96孔板中(2x 105个细胞/孔)。将细胞离心，加入以指示浓度连续稀释3倍的抗体，并通过在4℃下轻轻摇动培养细胞1小时。所测试的抗体是6G3IgG4(APE12839.05(H链SEQ ID NO:144，L链SEQ ID NO:174))、参考拮抗剂抗体IgG4和对鸡蛋溶菌酶具有特异性的人IgG4P同型对照抗体。将细胞离心，在FACS缓冲液中洗涤，并重悬于FRET受体抗体APC-抗HVEM(15μg/ml；克隆122，BioLegend公司)中。FRET供体抗体是生物素人源化的10D8(APE12774.02)，并通过在室温下孵育20分钟以10μg/ml与0.025μg/ml链霉亲和素-Eu(LANCE Eu-W8044-链霉亲和素AD0060，珀金埃尔默)预复合。将供体复合物生物素-抗BTLA/链霉亲和素-Eu加入含受体APC-抗HVEM抗体的板中，并在4℃下孵育24小时。将板在冷FACS缓冲液中洗涤，并在EnVision多模式读板仪(加利福尼亚州圣克拉拉的珀金埃尔默)上读取样品的荧光。在GraphPad Prism(GraphPad软件)中对665nm/615nm处的荧光比率作图。每个点是三个独立重复实验的平均值±SEM。每个实验的每个样品条件为5个重复孔。
图9A中示出的FRET测定证明，在转染的293c18细胞上存在BTLA/HVEM复合物，并且本文公开的6G3抗体在至多40μg/ml的浓度下没有表现出对BTLA/HVEM FRET信号的抑制，类似于同型对照抗体。此结果证实了本文公开的6G3抗体不抑制相同细胞表面上的BTLA和HVEM的相互作用。
图9A中示出的FRET测定证明，参考拮抗剂抗体以浓度依赖性方式抑制BTLA/HVEM复合物FRET信号，其IC50为大约0.65μg/ml。
在图9B中，稳定表达全长人BTLA和人HVEM的293c18细胞克隆用Accutase溶液(密理博西格玛/西格玛-奥瑞奇)收获，在FACS缓冲液中洗涤，并铺在白色U形底96孔板中(2x105个细胞/孔)。将细胞离心，将以指示浓度连续稀释3倍的FRET受体抗体APC-抗HVEM(克隆122，BioLegend公司)或APC-小鼠IgG1同型对照抗体加入板。通过在室温下孵育20分钟，将生物素化的FRET供体抗体以10μg/ml与0.025μg/ml链霉亲和素-Eu(LANCE Eu-W8044-链霉亲和素AD0060，珀金埃尔默)预复合。所测试的生物素缀合的FRET供体抗体是生物素-6G3IgG4(APE13124.01，其是生物素缀合的APE12839.05(H链SEQ ID NO:144，L链SEQ ID NO:174))、生物素-参考拮抗剂IgG4抗体和生物素-对鸡蛋溶菌酶具有特异性的人IgG4同型对照抗体。所有孔中的供体生物素-抗体/链霉亲和素-Eu复合物的最终浓度为0.3μg/ml抗体和0.75ng/ml链霉亲和素-Eu。将板在4℃下孵育24小时，在冷FACS缓冲液中洗涤，并在EnVision多模式读板仪(珀金埃尔默)上读取样品的荧光。在GraphPad Prism(GraphPad软件)中对665nm/615nm处的荧光比率作图。每个点是2个重复孔的平均值±SEM。
图9B中示出的FRET测定证明，在存在与链霉亲和素-Eu复合的本文公开的生物素-6G3抗体的情况下，增加APC-抗HVEM的浓度会生成浓度依赖性增加的FRET信号。本实施例证明，当6G3抗体与细胞表面BTLA结合时，BTLA仍然能够与相同细胞表面上的HVEM形成复合物。
图9B中示出的FRET测定证明，在存在与链霉亲和素-EU复合的生物素-参考拮抗剂抗体的情况下，检测不到BTLA/HVEM复合物FRET信号，与生物素-同型对照抗体的情况类似。本实施例证明，参考BTLA拮抗剂抗体破坏相同细胞表面上的BTLA-HVEM复合物。
实施例11
本实施例证明，当BTLA和HVEM在不同细胞上表达时，本文公开的6G3抗体在NF-κB萤光素酶报告测定中部分抑制BTLA诱导的HVEM信号传导。
生成稳定表达全长人HVEM和NF-κB-萤光素酶报告子构建体的293c18细胞，并命名为HVEM/NF-κB萤光素酶，克隆11。生成稳定表达全长人BTLA的293c18细胞，进行单细胞克隆，并命名为huBTLA 293c18，克隆2。人BTLA 293c18细胞用Accutase溶液(西格玛-奥瑞奇/密理博西格玛)收获，重悬于补充有10％ FBS的DMEM中，并铺在平底96孔板中(0.5x104个细胞/孔)。向细胞中加入指示浓度的由稳定转染的CHO-K1细胞池制备的6G3 IgG4(APE13308.03)抗体、对鸡蛋溶菌酶具有特异性的人IgG4同型对照抗体或IgG4参考抗BTLA拮抗剂抗体)。在室温下孵育30分钟后，收获并加入HVEM/NF-κB细胞(5x104个细胞/孔)。在37℃、5％ CO2下5小时后，向孔中加入等体积的Steady-Glo萤光素酶测定系统(普洛麦格)，并在室温下孵育10分钟。在GloMax Navigator微孔板光度计(普洛麦格)上以0.3秒的测量时间读取样品的发光。以相对光单位(RLU)为单位对发光作图，并在GraphPad Prism(GraphPad软件)中用log(激动剂)对响应(三参数)最小二乘法拟合来进行曲线拟合。
图10中示出的NF-κB萤光素酶报告测定证明，当HVEM和BTLA在不同细胞上表达时，本文公开的6G3抗体响应于BTLA 293c18细胞以浓度依赖性方式部分抑制HVEM依赖性NF-κB信号传导。这表明，在这些条件下，当BTLA在不同的细胞上时，本文公开的6G3抗体可以部分抑制HVEM信号传导。当人BTLA 293c18细胞在与本文公开的6G3抗体一起孵育之前用多聚甲醛固定时，或者当细胞用阻断胞吞作用的动力蛋白GTP酶抑制剂处理时，获得了相同的结果。
图10中示出的NF-κB萤光素酶报告测定证明，当HVEM和BTLA在不同细胞上表达时，加入参考拮抗剂抗BTLA抗体导致BTLA介导的HVEM依赖性NF-κB信号传导的浓度依赖性完全抑制。
实施例12
本实施例证明了本文公开的6G3抗体在SHP2募集PathHunter Jurkat BTLA信号传导测定中的直接BTLA激动剂活性。
在Eurofins DiscoverX(加利福尼亚州弗里蒙特)上生成稳定表达β-半乳糖苷酶酶供体(ED)标记的人BTLA和β-半乳糖苷酶酶受体(EA)标记的人SHP2的克隆Jurkat细胞系，并命名为Jurkat BTLA-ED SHP2-EA细胞。对于测定设置，收获Jurkat BTLA-ED SHP2-EA细胞并铺在96孔板中(2x104个细胞/孔)。在单独的板中制备抗体稀释液。所测试的抗体和蛋白质是由稳定转染的CHO-K1细胞池制备的6G3 IgG4(APE13308.03)抗体、对鸡蛋溶菌酶具有特异性的人IgG4同型对照抗体、参考BTLA拮抗剂IgG4抗体和人HVEM-IgG1Fc/三聚LIGHT的可溶性复合物(摩尔比为1:1.1的APE11989.16和APE07872.05)。将抗体和蛋白质加入细胞测定板，并在室温下孵育2小时。向所有孔中加入PathHunter生物测定检测试剂，并在室温下孵育20分钟。然后，向所有孔中加入生物测定检测试剂2，并在室温下孵育1小时，随后再在EnVision多模式读板仪(珀金埃尔默)上以0.1秒的积分时间测量发光信号。在GraphPad Prism(GraphPad软件)中对数据作图。使用无约束的具有可变斜率(四参数)的S形剂量响应曲线拟合并使用最小二乘拟合方法计算EC50值。数据代表每个点的三份样品的平均值(±标准偏差)。测定和数据分析在Eurofins DiscoverX(加利福尼亚州弗里蒙特)以项目ID：DRX-ANAB-190724进行。
图11中示出的SHP2募集PathHunter Jurkat BTLA信号传导测定证明，作为可溶性抗体的本文公开的6G3抗体具有直接BTLA激动剂活性，并诱导浓度依赖性低量级BTLA信号传导(EC50＝125ng/ml)。通过诱导SHP2募集到BTLA胞质结构域，本文公开的6G3抗体可以通过在激活的T和B细胞中启动抑制性信号传导而发挥作用。
图11中示出的SHP2募集PathHunter Jurkat BTLA信号传导测定证明，作为可溶性抗体的参考BTLA拮抗剂抗体具有直接BTLA激动剂活性，并诱导浓度依赖性BTLA信号传导(EC50＝28.8ng/ml)，其最大信号高于6G3抗体。在图11中示出的SHP2募集PathHunterJurkat BTLA信号传导测定中，可溶性HVEM/LIGHT复合物诱导微弱的浓度依赖性诱导型BTLA信号传导，其不饱和，可能因为与抗体相比，可溶性HVEM对BTLA的亲和力较低。
实施例13
本实施例在SHP2募集PathHunter Jurkat BTLA信号传导测定中证明，本文公开的6G3抗体不抑制转染的U-2OS细胞系上的由HVEM诱导的BTLA信号传导。
在Eurofins DiscoverX(加利福尼亚州弗里蒙特)生成稳定表达β-半乳糖苷酶酶供体(ED)标记的人BTLA和β-半乳糖苷酶酶受体(EA)标记的人SHP2的克隆Jurkat细胞系(Jurkat BTLA-ED SHP2-EA细胞)和稳定表达人HVEM的U-2OS骨肉瘤细胞系(U-2OS hHVEM细胞)。对于测定设置，收获Jurkat BTLA-ED SHP2-EA细胞并铺在96孔板中(2x104个细胞/孔)。在单独的板中制备抗体稀释液。所测试的抗体是由稳定转染的CHO-K1细胞池制备的6G3 IgG4(APE13308.03)抗体、对鸡蛋溶菌酶具有特异性的人IgG4同型对照抗体和参考BTLA拮抗剂IgG4抗体。将指示浓度的抗体加入测定板中，并在37℃、5％ CO2下在潮湿培养箱中孵育1小时。收获U-2OS hHVEM细胞，重悬，并加入含Jurkat BTLA-ED SHP2-EA细胞的测定板(5x104个细胞/孔)中，并在室温下孵育2小时。向所有孔中加入PathHunter生物测定检测试剂，并在室温下孵育30分钟。然后，向所有孔中加入生物测定检测试剂2，并在室温下孵育1小时，随后再在EnVision多模式读板仪(珀金埃尔默)上以0.1秒的积分时间测量发光信号。在GraphPad Prism(GraphPad软件)中对数据作图；使用无约束的具有可变斜率(四参数)的S形剂量响应曲线拟合并使用最小二乘拟合方法计算IC50值。数据代表每个点的三份样品的平均值(±标准偏差)。检测和数据分析在Eurofins DiscoverX(加利福尼亚州弗里蒙特)以项目ID：DRX-ANAB-191210进行。
图12中示出的SHP2募集PathHunter Jurkat BTLA信号传导测定证明，本文公开的6G3抗体对由不同细胞上的HVEM诱导的SHP2募集到BTLA没有影响。
图12中示出的SHP2募集PathHunter Jurkat BTLA信号传导测定证明，参考BTLA拮抗剂抗体表现出对由不同细胞上的HVEM诱导的BTLA信号传导的强效浓度依赖性抑制(IC50＝8.9ng/ml)。
实施例14
本实施例证明，在加入FcγRIa(CD64a)转染的U-2OS细胞以提供FcγR参与的SHP2募集PathHunter Jurkat BTLA信号传导测定中，本文公开的6G3抗体的直接BTLA激动剂活性增加。
在Eurofins DiscoverX(加利福尼亚州弗里蒙特)生成稳定表达β-半乳糖苷酶酶供体(ED)标记的人BTLA和β-半乳糖苷酶酶受体(EA)标记的人SHP2的克隆Jurkat细胞系(Jurkat BTLA-ED SHP2-EA细胞)和稳定表达人FcγRIa/CD64a的U-2OS骨肉瘤细胞系(U-2OS hFcγRIa细胞)。收获U-2OS hFcγRIa细胞并铺在96孔板中(1x104个细胞/孔)。在单独的板中制备抗体稀释液，加入测定板中，并在37℃、5％ CO2下在潮湿培养箱中孵育1小时。所测试的抗体是由稳定转染的CHO-K1细胞池制备的6G3 IgG4(APE13308.03)抗体、对鸡蛋溶菌酶具有特异性的人IgG4同型对照抗体和参考BTLA拮抗剂IgG4抗体。收获Jurkat BTLA-ED SHP2-EA细胞，并加入含U-2OS hFcγRIa细胞的测定板(2x104个细胞/孔)中。将板在室温下孵育2小时。向所有孔中加入PathHunter生物测定检测试剂，并在室温下孵育30分钟。向所有孔中加入生物测定检测试剂2，并在室温下孵育1小时，随后再在EnVision多模式读板仪(珀金埃尔默)上以0.1秒的积分时间测量发光信号。在GraphPad Prism(GraphPad软件)中对数据作图；使用无约束的具有可变斜率(四参数)的S形剂量响应曲线拟合并使用最小二乘拟合方法计算EC50值。数据代表每个点的三份样品的平均值(±标准偏差)。检测和数据分析在Eurofins DiscoverX(加利福尼亚州弗里蒙特)以项目ID：DRX-ANAB-191210进行。
图13中示出的SHP2募集PathHunter Jurkat BTLA信号传导测定证明，在存在提供FcγRIa参与的细胞的情况下，作为可溶性抗体的本文公开的6G3抗体具有增加的直接BTLA激动剂活性，并诱导浓度依赖性BTLA信号传导(EC50＝9.3ng/ml)。
图13中示出的SHP2募集PathHunter Jurkat BTLA信号传导测定表明，在存在提供FcγRIa参与的细胞的情况下，作为可溶性抗体的参考BTLA拮抗剂抗体具有直接BTLA激动剂活性，并诱导浓度依赖性BTLA信号传导(EC50＝3.9ng/ml)。
图13中示出的SHP2募集PathHunter Jurkat BTLA信号传导测定证明，与不含FcγRIa的Jurkat BTLA信号传导测定相比，在存在细胞相关FcγRIa的情况下，本文公开的6G3抗体和参考BTLA拮抗剂抗体都表现出效力增加的激动剂活性(6G3效力高～13倍；参考BTLA拮抗剂效力高～7.4倍)(比较图11和图13)。尽管本文公开的可溶性6G3抗体可以诱导SHP2募集到BTLA胞质结构域，并在激活的T和B细胞中启动抑制性信号传导，FcγRIa结合的6G3抗体诱导直接抑制性信号传导的潜力可能增强。
实施例15
本实施例证明，当以1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg每周给药两次，持续4周时，本文公开的6G3抗体在异种NSG/Hu-PBMC移植物抗宿主病(GvHD)模型中表现出体内功效。
在杰克森实验室体内药理学服务部(加利福尼亚州萨克拉门托)进行测试本文公开的6G3抗BTLA抗体的功效的异种NSG/Hu-PBMC GvHD模型。如图14A中所示，用1Gy辐射NOD-scid IL2rγnull(NSG)小鼠，然后在每个小鼠中静脉注射10x 106个人PBMC。从PBMC注射后的第二天开始，将抗体(对鸡蛋溶菌酶具有特异性的人IgG4同型对照抗体；和由稳定转染的CHO-K1细胞池制备的6G3 IgG4 APE13308.05抗体)腹膜内给药，每周两次，持续4周。将本文公开的6G3抗体以1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg给药，并且将人IgG4同型对照抗体以10mg/kg给药。每个抗体处理组有12个动物/组。将贝拉西普生物类似物阳性对照以75μg/小鼠腹膜内给药，每周三次，持续4周。在贝拉西普生物类似物处理组中有8个动物。研究中的给药方案和剂量组在图14B中示出。在42天的研究过程中，每周三次，通过测量体重减轻、死亡和GvHD评分来监测疾病：体重减轻、活动、皮毛质地、苍白和姿势。对体重减轻超过10％的动物每天进行疾病监测，而对体重减轻超过20％的动物实施安乐死。存活率包括被发现死亡的动物和由于杰克森实验室/>体内药理学服务部的研究方案中定义的终点而从研究中去除的动物。使用Kaplan-Meier存活分析在GraphPad Prism(GraphPad软件)中对存活数据作图，计算每组的中值存活率。将处理组在与同型对照组的成对比较中的统计显著性是在GraphPad Prism中，使用Gehan-Breslow-Wilcoxon检验计算p值。
图14C中示出的GvHD研究的存活结果证明，与同型对照抗体相比，本文公开的6G3抗BTLA抗体在所有测试剂量下均表现出高度统计学显著的存活延长功效。6G3抗体的功效是剂量响应性的，其中1mg/kg剂量处理组相较于3mg/kg和10mg/kg处理组表现出存活率降低。在研究过程中，同型对照组的中值存活时间为16天，1mg/kg 6G3处理组的中值存活时间为35天，而3mg/kg和10mg/kg 6G3处理组的中值存活时间未定义。参考拮抗剂抗BTLA抗体以10mg/kg给药，作为二级对照。与同型对照处理的动物相比，在用参考拮抗剂抗体处理的动物中没有观察到存活益处。
实施例16
本实施例说明了96孔电化学发光(ECL)夹心测定法对于在将6G3 IgG4抗BTLA抗体在食蟹猴血清中给药后检测BTLA的认证。
在方法开发期间，建立了多个检测参数，例如捕获试剂浓度、MRD、测定缓冲液类型和检测试剂浓度。然后，通过评估测定内和测定间的精确度和准确度、稀释线性、特异性和冻融稳定性来进行测定的方法认证。最终的方法将用于分析来自食蟹猴的非GLP单剂量或多剂量PK、TK和耐受性研究的样品。
在4℃下，将96孔MSD标准结合测定板(MSD部件号L15XA-3)用50μL 1.0μg/mL抗BTLA克隆10D8(APE10134)包被过夜。第二天，将包被板用1X PBST洗涤3次，并用250μL封闭缓冲液封闭60至120分钟。BTLA的校准曲线范围为500-7.8ng/mL，定量范围为500-7.8ng/mL。在100％食蟹猴血清中使用2倍稀释系列制备标准品。还制备了质量对照(QC)，并以定量范围内的五个不同浓度冷冻在100％食蟹猴血清中。然后，将所有标准品、样品和对照在含有100μg/ml 6G3 IgG4的检测缓冲液中以1:10的最低要求稀释度(MRD)稀释，并在室温下在摇床上孵育1小时。封闭后，将板用1X PBST洗涤，并且将50μL稀释的标准品、样品和QC在室温下在400-500rpm的摇床上孵育2小时。样品孵育后，将板在1X PBST中洗涤3次，并向每个孔中加入50μL 0.25μg/mL生物素化的抗BTLA多克隆检测抗体(赛默飞世尔的PA5-95592)，并在室温下在摇床上孵育1小时。然后，将板用1X PBST洗涤3次。接下来，向每个孔中加入每孔50μL的0.2μg/mL链霉亲和素-磺基标签二级检测试剂，并在室温下在摇床上孵育30分钟。然后，将板用1X PBST洗涤最后3次。向每个孔中加入每孔150μL的2X MSD读数缓冲液T，并在MSD Quickplex读板仪上读板。对标准品、样品和对照复制品进行重复的测试，并使用SoftMax Pro 7.01和具有1/y^2加权的4参数曲线拟合基于先导候选的参考标准曲线反算出血清浓度。
在开始方法认证之前，评估了6G3 IgG4抗体的血清基质干扰。未观察到基质效应，并且选择了1:10的最低要求稀释度(MRD)。
抗体10D8(APE10134)用作捕获抗体。经发现，在存在6G3 IgG4抗体的情况下，10D8与BTLA的结合可能通过与食蟹猴血清中的6G3 IgG4结合时的BTLA的构象变化而增加。为了使BTLA的推定构象变化归一化，将100μg/ml 6G3加入稀释缓冲液和所有标准品、样品和对照中，并根据1:10的MRD稀释，并在室温下在摇床上孵育1小时，随后再将样品加入10D8包被的MSD板中。
将含500、50、5、0.5和0μg/ml 6G3 IgG4的标准曲线在含有100μg/ml 6G3 IgG4的测定缓冲液中以MRD 1:10稀释，以评定BTLA的(％RE)和精确度(％CV)。与100μg/ml6G3IgG4一起孵育的所有五个标准曲线条件都具有定量测定范围内的标准浓度，并且通过了平均回收(％RE)浓度在标称浓度的20％以内的验收标准。所有样品的精确度(％CV)的平均结果通过了验收标准并且未超过20％。BTLA的总误差百分比(％TE)未超过30％。
测定间准确度(％RE)和精确度(％CV)在不同的2天进行的六个测定实验中评定，包括每个板上的限定定量范围的校准曲线和五个QC水平。所评定的五个QC水平是ULOQ(500ng/mL)、HQC(400ng/mL)、MQC(62.4ng/mL)、LQC(15.6ng/mL)和LLOQ(7.8ng/mL)。在每个实验的每个QC水平上，重复分析总共3个独立的复制品。定量测定范围内的所有对照和标准浓度的准确度(％RE)的平均结果通过了平均回收浓度在标称浓度20％以内的验收标准。所有样品的精确度(％CV)的平均结果通过了验收标准并且未超过20％。无论是标准曲线还是测定的定量范围内的任何浓度的质量对照，BTLA的总误差百分比(％TE)均未超过30％。
所述方法的测定内准确度(％RE)和精确度(％CV)在具有五个QC水平的六个独立复制品的单个实验中评定。对照的准确度(％RE)的平均结果通过了平均回收浓度在标称浓度20％以内的验收标准。精确度(％CV)的平均结果通过了验收标准并且未超过20％。
稀释线性通过对加标有浓度高于ULOQ的BTLA的样品进行一系列稀释来评定，以证明高浓度的测试物品可以稀释到定量范围内，并且所述检测没有前带效应。将样品稀释到测定的定量范围内，并对反算的浓度进行评定。平均结果指示，可以用至多1:1600的稀释系数将样品稀释到定量范围内。在所评估的浓度下，不存在前带“钩状效应”。
结果表明，所述测定对于评估从给予6G3 IgG4的食蟹猴研究中收集的血清中的BTLA浓度是灵敏的和可重复的。
实施例17
以下实施例说明了使用电化学发光(ECL)夹心测定法来定量确定食蟹猴血清和NOD scid小鼠血浆中的可溶性BTLA。
在4℃下，将96孔MSD标准结合测定板(MSD部件号L15XA-3)用50μL 1.0μg/mL抗BTLA捕获试剂克隆10D8(APE10134)包被过夜。第二天，将包被板用1X PBST洗涤3次，并用250μL封闭缓冲液封闭60至120分钟。sBTLA的校准曲线范围为7.8-500ng/mL，其中食蟹猴血清中的定量范围为7.8-500ng/mL，而CD1小鼠血浆中的校准和定量范围均为2.0-1000ng/mL。在100％物种特异性基质中使用2倍稀释系列制备标准品。还制备了质量对照(QC)，并以定量范围内的五个不同浓度冷冻在100％物种特异性基质中。然后，将所有标准品、样品和对照在含有100μg/mL 6G3的测定缓冲液中以1:10的最低要求稀释度(MRD)稀释，并在室温下在摇床上孵育1小时。
封闭后，将板用1X PBST洗涤，并且将50μL稀释的标准品、样品和QC在室温下在400-500rpm的摇床上孵育2小时。样品孵育后，将板在1X PBST中洗涤3次，并向每个孔中加入50μL 0.25μg/mL生物素化的抗BTLA克隆PA5-95592(VC2963104B)检测抗体，并在室温下在摇床上孵育1小时。然后，将板用1X PBST洗涤3次。接下来，向每个孔中加入每孔50μL的0.2μg/mL链霉亲和素-磺基标签二级检测试剂，并在室温下在摇床上孵育30分钟。然后，将板用1X PBST洗涤最后3次。向每个孔中加入每孔150μL的2X MSD读数缓冲液T，并在MSDQuickplex读板仪上读板。对标准品、样品和对照复制品进行重复的测试，并使用SoftMaxPro 7.01和具有1/y^2加权的4参数曲线拟合基于BTLA的参考标准曲线反算出浓度。
在三个剂量组(1、3和10mg/kg IP)中，向人PBMC移植NOD Scid小鼠(n＝19)给予6G3 IgG4抗体(APE13308)。被给予同型对照IgG4(10mg/kg)或CTLA-4-Ig(75μg)的动物作为对照。动物每周给药两次，并在研究的中点经由心脏放血收集血浆样品。结果呈现在图15中。此外，通过流式细胞术分析循环人T细胞以表征BTLA表达，计算人T细胞并表征激活标志物CD25。结果在图19中示出。6G3 IgG4降低了人T细胞上的BTLA表达，以剂量依赖性方式抑制了T细胞扩增并在所有剂量下降低了激活标志物CD25的表达。
对来自两项研究的食蟹猴的血液样品进行分析。第一项研究(n＝180)由三个剂量组(10mg/kg IV；10mg/kg SC；和1mg/kg SC)组成。对所有动物IV或SC施用单剂量的6G3IgG4，并在给药前以及给药后3、6、12、24、48、72、96、168、240、336、504、672和840小时从所有组中的所有动物收集血液样品。给药前样品和媒剂对照给药的动物用作对照。结果呈现在图16中。
在第二项研究中，在四个剂量组(10、50和100mg/kg SC以及100mg/kg IV)中，向食蟹猴(n＝380)给予6G3。所有动物在第1天、第8天和第15天IV或SC施用周剂量的6G3 IgG4，并在第1天、第8天和第15天：给药前以及给药后3、24、48、72、96小时从所有组中的所有动物收集血液样品。结果呈现在图17中。还测量了6G3 IgG4的血清水平。结果呈现在图18中。
在来自被给予IgG4同型对照或CTLA-4-Ig的人PBMC移植NOD scid小鼠的样品中，或在来自食蟹猴研究的食蟹猴给药前或媒剂对照处理的样品中，没有检测到可测量的sBTLA水平。在来自所有食蟹猴的血清样品和来自被给予6G3 IgG4的人PBMC移植NOD scid小鼠的所有血浆样品中检测到脱落的sBTLA，小鼠研究中的最低剂量组(1mg/kg)除外。结果表明，BTLA从B和T细胞表面脱落，并且sBTLA是体内6G3 IgG4活性的药效学标志物。
实施例18
本实施例证明，在食蟹猴中，6G3 IgG4实现了受体占用并降低了T和B细胞上的BTLA表达。
在剂量范围发现研究(DRFS)中，使用流式细胞术分析食蟹猴外周血中多剂量6G3IgG4的作用。在四个不同的处理组(10mg/kg SC、50mg/kg SC、100mg/kg SC、100mg/kgIV)和一个对照组中，向动物给予6G3 IgG4。
与媒剂对照测试动物相比，6G3 IgG4未引起T细胞、B细胞和NK细胞绝对计数或分布百分比的显著变化。与媒剂对照处理组相比，在被给予6G3 IgG4的所有动物中，荧光染料标记的药物(6G3 IgG4-DyL488)的结合被消除，证明T细胞的6G3 IgG4对BLTA的受体占用率>80％，而B细胞的受体占用率～70％，如图20中所示。
当用荧光染料标记的非竞争性抗BTLA抗体(克隆10D8)检测时，与媒剂对照处理的动物相比，被给予6G3 IgG4的所有动物在T和B细胞上的BTLA表面表达均降低。T和B细胞上的BTLA表面表达分别降低了～75％和～50％，如图20中所示。
经发现，T和B细胞上的发生得非常快的受体占用，与T和B细胞上的发生得相对较慢的BTLA表达的丧失存在动力学差异。这表明，6G3 IgG4依赖性机制导致BTLA脱落。发展出抗药物抗体(ADA)的两个动物证明了受体占用率的一些损失和T和B细胞上的BTLA表达的恢复。
实施例19
本实施例证明，BTLA胞外结构域(ECD)被丝氨酸蛋白酶3在跨膜结构域附近的预计的识别位点切割。
蛋白酶3(PR3)是一种中性粒细胞丝氨酸蛋白酶，其在中性粒细胞激活时被释放到细胞外空间。PR3先前已被证明可切割检查点受体T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)，从而降低细胞表面上的TIM-3的水平。
在六个不同的泳道上孵育纯化的重组PR3和/或BTLA-ECD至多60分钟。它们由以下组成：(1)PR3对照，(2)PR3 60m对照，(3)BTLA对照，(4)PR3+BTLA 0m，(5)PR3+BTLA 30m，和(5)PR3+BTLA 60m。
共孵育后，可溶性BLTA-ECD被切割成多个更小的片段，证明PR3具有切割BTLA的能力。对序列的分析建议，至少一个PR2识别基序朝向BTLA-ECD的C-端。
实施例20
本实施例证明，6G3 IgG4降低了健康对照(HC)和特应性皮炎(AD)供体中的T细胞增殖和表面BTLA表达。
将HC或AD供体的PBMC用0.5μM CFSE标记，然后在存在或不存在100nM 6G3IgG4或同型对照(IgG4-HyHel)的情况下，用可溶性抗CD3(0.5ng/mL，BioLegend公司，目录号300332)和可溶性抗CD28(0.5ng/mL，BioLegend公司，目录号302943)刺激72小时。通过CFSE稀释确定增殖细胞。
图21A提供了HC和AD供体的CFSE直方图，其被示出为将同型对照置于6G3 IgG4处理的CD3+T细胞上的重叠直方图。图21B以增殖(左)和分裂指数(右)示出了T细胞增殖百分比减少。分裂指数是每代分裂数之和除以原始细胞数，并通过NovoExpress软件自动细胞周期增殖分析进行计算。在存在或不存在100nM 6G3 IgG4或同型对照的情况下，在抗CD3和抗CD28刺激72小时后，通过中尺度MDS测定测量HC和AD供体PBMC培养上清液的IFNγ水平。结果在图21C中示出。图21D示出了通过AF647缀合的抗BTLA(克隆#10D8，阿纳蒂斯比奥(AnaptysBio))确定的HC和AD供体CD3+T细胞上的BTLA表面表达(绘制为平均荧光强度(MFI))。
结果表明，与对照组相比，6G3 IgG4降低了T细胞增殖和表面BTLA表达。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利由此通过并入，其程度与每篇参考文献被单独并且具体地指示以通过引用并入并且在本文中整体阐述一样。
在描述本发明的背景下(尤其在下述权利要求的背景下)，使用术语“一种/一个(a)”和“一种/一个(an)”和“所述(the)”以及“至少一个”和类似的指示词，应被解释为覆盖单数和复数形式，除非本文另外指示或明显与上下文相矛盾。除非本文另外指示或明显与上下文相矛盾，否则在一个或多个条目的列表后使用的术语“至少一者”(例如，“A和B中的至少一者”)应解释为意指选自所列条目中的一个条目(A或B)或者所列条目中的两个或更多个的任何组合(A和B)。除非另有说明，否则术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”应被解释为开放式术语(即意指“包括但不限于”)。除非本文另外指示，否则本文中对值的范围的引述仅旨在用作个别地提及属于所述范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值并入本说明书中，如同其在本文中个别地引用一样。除非本文另外指示或明显与上下文相矛盾，否则本文所述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于本发明的实践是必不可少的。
本文描述了本发明的优选实施方式，包括发明人进行本发明所已知的最佳模式。在阅读前文描述之后，那些优选实施方式的变型对于本领域普通技术人员可以变得显而易见。发明人期望本领域的技术人员视需要采用此类变型，并且发明人希望本发明以不同于本文所具体描述的其它方式来实践。因此，本发明包括适用法律所允许的随附权利要求中所引述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另外指示或另外明显与上下文相矛盾，否则本发明涵盖上述元素在其所有可能的变型中的任何组合。
序列表
<110> 安奈普泰斯生物有限公司(AnaptysBio, Inc.)
<120> B和T淋巴细胞衰减因子（BTLA）调节剂及其使用方法
<130> 758015
<150> US 63/192,984
<151> 2021-05-25
<150> US 63/105,067
<151> 2020-10-23
<160> 234
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
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<213> 人工序列
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<223> 合成
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<220>
<223> 合成
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe
50 55 60
Lys Val Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser His Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala
115
<210> 8
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe
50 55 60
Lys Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asn Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala
115
<210> 9
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser His Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala
115
<210> 10
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe
50 55 60
Lys Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser His Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala
115
<210> 11
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asn Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala
115
<210> 12
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asn Tyr Tyr Val Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala
115
<210> 13
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe
50 55 60
Lys Val Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asn Tyr Tyr Val Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala
115
<210> 14
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asn Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala
115
<210> 15
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asn Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala
115
<210> 16
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 17
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 17
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 18
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 19
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 20
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 21
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 22
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 23
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 23
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 24
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 25
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 25
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 26
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> Xaa是Phe或Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> Xaa是Phe或Leu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (63)..(63)
<223> Xaa是Lys或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (66)..(66)
<223> Xaa是Asp或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (72)..(72)
<223> Xaa是Ala或Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (74)..(74)
<223> Xaa是Lys或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (76)..(76)
<223> Xaa是Ala或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是Ser或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (95)..(95)
<223> Xaa是Tyr或Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (100)..(100)
<223> Xaa是Asn或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (101)..(101)
<223> Xaa是Tyr或His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (103)..(103)
<223> Xaa是Ala或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (105)..(105)
<223> Xaa是Glu或Asp
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Xaa Thr Xaa Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Xaa Phe
50 55 60
Lys Xaa Arg Val Thr Ile Thr Xaa Asp Xaa Ser Xaa Xaa Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Xaa Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Xaa Xaa Tyr Xaa Met Xaa Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala
115
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 27
Asp Tyr Thr Ile His
1 5
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 28
Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 29
Arg Asn Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr
1 5
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa是Lys或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Xaa是Asp或Val
<400> 30
Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Xaa Phe Lys
1 5 10 15
Xaa
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 31
Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe Lys
1 5 10 15
Val
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Asn或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Tyr或His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Ala或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Glu或Asp
<400> 32
Arg Xaa Xaa Tyr Xaa Met Xaa Tyr
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 33
Arg Ser His Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 34
Arg Asn Tyr Tyr Val Met Glu Tyr
1 5
<210> 35
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> Xaa是Ser或Pro
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (46)..(46)
<223> Xaa是Pro或Leu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(55)
<223> Xaa是Tyr或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (87)..(87)
<223> Xaa是Tyr或Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (92)..(92)
<223> Xaa是Ser或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa是Thr或Ser
<400> 35
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Xaa Pro Lys Xaa Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Xaa Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Xaa Cys Gln Gln Tyr Xaa Xaa Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 36
Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 37
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 38
Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Tyr或Ser
<400> 39
Ser Ala Ser Tyr Arg Xaa Ser
1 5
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 40
Ser Ala Ser Tyr Arg Ser Ser
1 5
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Ser或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
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<223> 合成
<400> 67
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<211> 125
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<223> 合成
<400> 68
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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<400> 69
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 122
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Ser Thr Ser
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<220>
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<400> 145
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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<220>
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<400> 146
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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<220>
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<400> 147
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 148
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Ser Thr Ser
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<223> 合成
<400> 149
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Ser Thr Ser
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<400> 176
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<223> 合成
<400> 177
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<223> 合成
<400> 178
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Phe Trp Gly Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 179
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 179
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Glu Asn Ile Tyr Ser His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Gln Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Phe Trp Gly Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 180
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 180
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Glu Asn Ile Tyr Ser His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Phe Ser Gly Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 181
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 181
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Glu Asn Ile Tyr Ser His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Phe Gly Gly Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 182
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 182
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Glu Asn Ile Tyr Ser His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Phe Leu Gly Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 183
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 183
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Glu Asn Ile Tyr Ser His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Phe Met Gly Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 184
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 184
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Glu Asn Ile Tyr Ser His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Phe Lys Gly Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 185
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 185
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Glu Asn Ile Tyr Ser His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Phe Val Gly Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 186
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 186
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Glu Asn Ile Tyr Ser His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Phe Asn Gly Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 187
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 187
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Glu Asn Ile Tyr Ser His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Phe Pro Gly Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 188
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 188
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Glu Asn Ile Tyr Ser His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Leu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Phe Tyr Gly Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 189
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 189
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Glu Asn Ile Tyr Ser His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Leu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Phe Phe Gly Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 190
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 190
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Glu Asn Ile Tyr Asn His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Leu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Phe Trp Gly Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 191
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 191
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Glu Asn Ile Tyr Asn His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Leu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Phe Phe Gly Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 192
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 192
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Leu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Phe Trp Gly Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 193
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> Xaa是Ala或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> Xaa是Asn或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> Xaa是Trp、Phe、His、Gly、Pro、Arg、Lys、Asp、Ser、Leu、Val、Asn或Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (54)..(54)
<223> Xaa不存在或是Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (56)..(56)
<223> Xaa是Asp、Tyr、Gln、Gly、Leu、Phe、His、Ser、Pro、Arg或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (57)..(57)
<223> Xaa是Gly、Tyr、Ala、Phe、Ser、Asp、Val、Thr、Glu、Lys或Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (62)..(62)
<223> Xaa是Asn、Val、Gln、Arg、Ala、Phe、Tyr、Ser、Gly、Pro或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (76)..(76)
<223> Xaa是Ser或Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (78)..(78)
<223> Xaa是Ser、Thr或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> Xaa是Ser或Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (91)..(91)
<223> Xaa是Asp或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (95)..(95)
<223> Xaa不存在或是Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (97)..(97)
<223> Xaa是Tyr或Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (100)..(100)
<223> Xaa是Lys或Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (105)..(105)
<223> Xaa是Asn或Asp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (106)..(106)
<223> Xaa是Asp、Ser、Phe、Tyr、Val、Gly、Thr、Arg、 Ile、Leu或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (110)..(110)
<223> Xaa是Arg或His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (111)..(111)
<223> Xaa是Trp、Arg、Phe、Leu、Asn、Tyr、Pro、Ile、Val、Ala、Ser、Gly、Arg或Lys
<400> 193
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Xaa Phe Ser Xaa Ser
20 25 30
Xaa Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Xaa Gly Xaa Xaa Asp Thr Asn Tyr Xaa Gly Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Xaa Thr Xaa Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Xaa Ser Leu Arg Ser Glu Xaa Thr Ala Val Xaa Tyr
85 90 95
Xaa Cys Ala Xaa Ser Gly Thr Phe Xaa Xaa Gly Asn Tyr Xaa Xaa Tyr
100 105 110
Phe Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 194
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Ala或Asp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Leu或Met
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> Xaa是Ala或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> Xaa是Ser或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> Xaa是His、Asn或Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> Xaa是Pro或Gln
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> Xaa是Ala或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> Xaa是Thr或Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (56)..(56)
<223> Xaa是Asn、Leu、Gln、Gly、Phe、Val、Lys、Ser、Arg、Thr、His或Pro
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (71)..(71)
<223> Xaa是Phe或Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (90)..(90)
<223> Xaa是Leu或His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (92)..(92)
<223> Xaa是Trp、Phe、Tyr、Pro、Asn、Val、Lys、Met、Leu、Gly或Ser
<400> 194
Xaa Ile Gln Xaa Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Xaa Ser Glu Asn Ile Tyr Xaa Xaa
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Xaa Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Xaa Ala Xaa Asn Leu Ala Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Xaa Phe Xaa Gly Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 195
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Asn或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Trp、Phe、His、Gly、Pro、Arg、Lys、Asp、Ser、Leu、Val、Asn或Tyr
<400> 195
Xaa Ser Xaa Met Asn
1 5
<210> 196
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa不存在或是Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Asp、Tyr、Gln、Gly、Leu、Phe、His、Ser、Pro、Arg或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Gly、Tyr、 Ala、Phe、 Ser、 Asp、 Val、Thr、 Glu、 Lys或Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是Asn、Val、Gln、Arg、Ala、Phe、Tyr、Ser、Gly、Pro或Thr
<400> 196
Arg Ile Tyr Pro Xaa Gly Xaa Xaa Asp Thr Asn Tyr Xaa Gly Lys Phe
1 5 10 15
Lys
<210> 197
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Lys或Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Asn或Asp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Asp、Ser、Phe、Tyr、Phe、Val、Ser、Gly、Thr、Arg、Ile、Leu或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是Arg或His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是Trp、Arg、Phe、Leu、Asn、Tyr、Pro、Ile、Val、Ala、Ser、Gly、Arg或Lys
<400> 197
Xaa Ser Gly Thr Phe Xaa Xaa Gly Asn Tyr Xaa Xaa Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 198
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Ala或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Ser或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是His、Asn或Tyr
<400> 198
Arg Xaa Ser Glu Asn Ile Tyr Xaa Xaa Leu Ala
1 5 10
<210> 199
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Ala或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Thr或Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Asn、Leu、Gln、Gly、Phe、Val、Lys、Ser、Arg、Thr、His或Pro
<400> 199
Xaa Ala Xaa Asn Leu Ala Xaa
1 5
<210> 200
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Leu或His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Trp、Phe、Tyr、Pro、Asn、Val、Lys、Met、Leu、Gly或Ser
<400> 200
Gln Xaa Phe Xaa Gly Pro Pro Leu Thr
1 5
<210> 201
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 201
Thr Ser Trp Met Asn
1 5
<210> 202
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 202
Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Thr Asn Tyr Val Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 203
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 203
Ser Gly Thr Phe Asn Phe Gly Asn Tyr Arg Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 204
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 204
Arg Val Ser Glu Asn Ile Tyr Ser His Leu Ala
1 5 10
<210> 205
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 205
Ala Ala Thr Asn Leu Ala Leu
1 5
<210> 206
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 206
Gln Leu Phe Trp Gly Pro Pro Leu Thr
1 5
<210> 207
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 207
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe
50 55 60
Lys Val Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asn Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala
115
<210> 208
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 208
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe
50 55 60
Lys Val Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asn Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 209
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 209
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 210
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 210
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 211
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 211
Asp Tyr Thr Ile His
1 5
<210> 212
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 212
Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe Lys
1 5 10 15
Val
<210> 213
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 213
Arg Asn Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr
1 5
<210> 214
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 214
Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 215
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 215
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
1 5
<210> 216
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 216
Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 217
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 217
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Glu Phe
50 55 60
Lys Val Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asn Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 218
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 218
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Glu Phe
50 55 60
Lys Val Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asn Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 219
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 219
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 220
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 220
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 221
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 221
Asp Tyr Thr Ile His
1 5
<210> 222
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 222
Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Glu Phe Lys
1 5 10 15
Val
<210> 223
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 223
Arg Asn Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr
1 5
<210> 224
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 224
Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 225
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 225
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
1 5
<210> 226
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 226
Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 227
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 227
Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala Asn
1 5 10
<210> 228
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 228
Leu His Phe Glu Pro Val Leu
1 5
<210> 229
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 229
His Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys
1 5 10 15
Tyr Cys Ala Asn
20
<210> 230
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 230
Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu
1 5 10
<210> 231
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 231
Leu His Phe Glu Pro Val Leu
1 5
<210> 232
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 232
Tyr Ile Lys
1
<210> 233
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 233
Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala
1 5 10
<210> 234
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 234
Ile Glu Ser His Ser Thr Thr Leu
1 5

Claims (43)

1.一种BTLA结合剂，其包含：
免疫球蛋白重链可变区，其包含：
(a)包含X1SX2MN(SEQ ID NO:195)的CDRH1，其中X1是N或T，并且X2是W、F、H、G、P、R、K、D、S、L、V、N或Y
(b)包含RIYPX1GX2X3DTNYX4GKFK(SEQ ID NO:196)的CDRH2，其中：
X1不存在或是A；
X2是D、Y、Q、G、L、F、H、S、P、R或T；
X3是G、Y、A、F、S、D、V、T、E、K或R；并且
X4是N、V、Q、R、A、F、Y、S、G、P或T；
和
(c)包含X1SGTFX2X3GNYX4X5YFDV(SEQ ID NO:197)的CDRH3，其中：
X1是K或R；
X2是N或D；
X3是D、S、F、Y、F、V、S、G、T、R、I、L或E；
X4是R或H；并且
X5是W、R、F、L、N、Y、P、I、V、A、S、G、R或K；
或包含SEQ ID NO:43-156中的任一者或至少其CDR的免疫球蛋白重链可变区；或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
和
免疫球蛋白轻链可变区，其包含：
(a)包含RX1SENIYX2X3LA(SEQ ID NO:198)的CDRL1，其中
X1是A或V；
X2是S或N；并且
X3是H、N或Y；
(b)包含X1AX2NLAX3(SEQ ID NO:199)的CDRL2，其中
X1是A或N；
X2是T或K；并且
X3是N、L、Q、G、F、V、K、S、R、T、H或P；和
(c)包含QX1FX2GPPLT(SEQ ID NO:200)的CDRL3，其中
X1是L或H；并且
X2是W、F、Y、P、N、V、K、M、L、G或S；
或包含SEQ ID NO:157-192中的任一者或至少其CDR的免疫球蛋白轻链可变区；或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
或表3中列出的BTLA结合剂。
2.根据权利要求1所述的BTLA结合剂，其中所述免疫球蛋白重链多肽包含以下序列：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYX1FSX2SX3MNWVRQAPGQGLEWMGRIYPX4GX5X6DTNYX7GKFKGRVTITADKX8TX9TAYMELX10SLRSEX11TAVX12YX13CAX14SGTFX15X16GNYX17X18YFDVWGKGTTVTVSSA(SEQ IDNO:193)，其中
X1是A或V；
X2是N或T；
X3是W、F、H、G、P、R、K、D、S、L、V、N或Y；
X4不存在或是A；
X5是D、Y、Q、G、L、F、H、S、P、R或T；
X6是G、Y、A、F、S、D、V、T、E、K或R；
X7是N、V、Q、R、A、F、Y、S、G、P或T；
X8是S或F；
X9是S、T或N；
X10是S或R；
X11是D或V；
X12不存在或是Y；
X13是Y或F；
X14是K或R；
X15是N或D；
X16是D、S、F、Y、F、V、S、G、T、R、I、L或E；
X17是R或H；并且
X18是W、R、F、L、N、Y、P、I、V、A、S、G、R或K。
3.根据权利要求1或2所述的BTLA结合剂，其中所述免疫球蛋白重链多肽包含SEQ IDNO:43-156中的任一者或至少其CDR；或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的BTLA结合剂，其中所述免疫球蛋白轻链多肽包含以下序列：
X1IQX2TQSPSSLSASVGDRVTITCRX3SENIYX4X5LAWYQQKX6GKAPKLLIYX7AX8NLA X9GVPSRFSGSGSGTDX10TLTISSLQPEDFATYYCQX11FX12GPPLTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:194)，其中
X1是A或D；
X2是L或M；
X3是A或V；
X4是S或N；
X5是H、N或Y；
X6是P或Q；
X7是A或N；
X8是T或K；
X9是N、L、Q、G、F、V、K、S、R、T、H或P；
X10是F或Y；
X11是L或H；
X12是W、F、Y、P、N、V、K、M、L、G、S。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的BTLA结合剂，其中所述免疫球蛋白轻链多肽包含SEQ ID NO:157-192中的任一者或至少其CDR；或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的BTLA结合剂，其包含
(a)包含SEQ ID NO:201的CDRH1；
(b)包含SEQ ID NO:202的CDRH2；
(c)包含SEQ ID NO:203的CDRH3；
(d)包含SEQ ID NO:204的CDRL1；
(e)包含SEQ ID NO:205的CDRL2；和
(f)包含SEQ ID NO:206的CDRL3。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的BTLA结合剂，所述的BTLA结合剂包含免疫球蛋白重链可变区，所述重链可变区是SEQ ID NO:144或至少包含其CDR；和免疫球蛋白轻链可变区，所述轻链可变区是SEQ ID NO:174或至少包含其CDR；或包含与SEQ ID NO:144具有90％或更多序列同一性的免疫球蛋白重链可变区，和SEQ ID NO:174的免疫球蛋白轻链可变区。
8.一种BTLA结合剂，其包含：
重链免疫球蛋白可变区，其包含：
(a)包含Asp Tyr Thr Ile His(SEQ ID NO:27)的CDRH1，
(b)包含Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe LysXaa(SEQID NO:30)的CDRH2，其中Xaa是天冬氨酸(Asp)或缬氨酸(Val)；
(c)包含Arg Xaa1 Xaa2 Tyr Xaa3 Met Xaa4 Tyr(SEQ ID NO:32)的CDRH3，其中：
Xaa1是天冬酰胺(Asn)或丝氨酸(Ser)，
Xaa2是酪氨酸(Tyr)或组氨酸(His)，
Xaa3是丙氨酸(Ala)或缬氨酸(Val)，并且
Xaa4是谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)；
或包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1-15、207、208、217或218中的任一者或至少其CDR，或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和
轻链免疫球蛋白可变区，其包含：
(a)包含Lys Ala Ser Gln Asn Val Phe Thr Asn Val Ala(SEQ ID NO:36)的CDRL1；
(b)包含Ser Ala Ser Tyr Arg Xaa Ser(SEQ ID NO:39)的CDRL2，其中Xaa是酪氨酸(Tyr)或丝氨酸(Ser)；和
(c)包含Gln Gln Tyr Xaa1 Xaa2 Tyr Pro Tyr Thr(SEQ ID NO:41)的CDRL3，其中：
Xaa1是丝氨酸(Ser)或天冬酰胺(Asn)，并且
Xaa2是苏氨酸(Thr)或丝氨酸(Ser)；
或包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:16-25、209、210、219或220中的任一者或至少其CDR，或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
或
如表2中列出的BTLA结合剂。
9.根据权利要求87所述的BTLA结合剂，其中所述CDRH2包含SEQ ID NO:31；并且CDRH3包含SEQ ID NO:33或34。
10.根据权利要求8或9中任一项所述的BTLA结合剂，其中所述CDRL2包含SEQ ID NO:40；并且CDRL3包括SEQ ID NO:42。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的BTLA结合剂，其中所述结合剂包含重链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu ValLys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Xaa1 Thr Xaa2 ThrAsp Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met GlyTrp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe Lys Xaa3 Arg ValThr Ile Thr Xaa4 Asp Xaa5 Ser Xaa6 Xaa7 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser LeuArg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Xaa8 Cys Ala Arg Arg Xaa9 Xaa10 Tyr Xaa11 MetXaa12 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala(SEQ ID NO:26)，其中：
Xaa1是苯丙氨酸(Phe)或酪氨酸(Tyr)，
Xaa2是苯丙氨酸(Phe)或亮氨酸(Leu)，
Xaa3是天冬氨酸(Asp)或缬氨酸(Val)，
Xaa4是丙氨酸(Ala)或精氨酸(Arg)，
Xaa5是赖氨酸(Lys)或苏氨酸(Thr)，
Xaa6是丙氨酸(Ala)或丝氨酸(Ser)，
Xaa7是丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)，
Xaa8是酪氨酸(Tyr)或苯丙氨酸(Phe)，
Xaa9是天冬酰胺(Asn)或丝氨酸(Ser)，
Xaa10是酪氨酸(Tyr)或组氨酸(His)，
Xaa11是丙氨酸(Ala)或缬氨酸(Val)，并且
Xaa12是谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的BTLA结合剂，其中所述结合剂包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1-15、207、208、217或218中的任一者或至少其CDR，或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的BTLA结合剂，其中所述结合剂包含轻链可变区，所述轻链可变区包含氨基酸序列Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser LeuAla Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val PheThr Asn Val Ala Trp Tyr GlnGln Lys Pro Gly Gln Xaa Pro Lys Xaa Leu Ile TyrSer Ala Ser Tyr Arg Xaa Ser Gly Val Pro AspArg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GlyThr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp ValAla Val Tyr XaaCys Gln Gln Tyr Xaa Xaa Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu GluIleLys Arg(SEQ ID NO:35)，其中
Xaa1是丝氨酸(Ser)或脯氨酸(Pro)，
Xaa2是脯氨酸(Pro)或亮氨酸(Leu)，
Xaa3是酪氨酸(Tyr)或丝氨酸(Ser)，
Xaa4是酪氨酸(Tyr)或苯丙氨酸(Phe)，
Xaa5是丝氨酸(Ser)或天冬酰胺(Asn)，并且
Xaa6是苏氨酸(Thr)或丝氨酸(Ser)。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的BTLA结合剂，其中所述结合剂包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:16-25、209、210、219或220中的任一者或至少其CDR，或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的BTLA结合剂，所述结合剂是抗体、抗体缀合物或其抗原结合片段，任选地是IgG1或IgG4抗体。
16.根据权利要求15所述的BTLA结合剂，其是F(ab')2片段、Fab'片段、Fab片段、Fv片段、scFv片段、dsFv片段、dAb片段或单链结合多肽。
17.一种编码根据权利要求1至16中任一项所述的BTLA结合剂的所述免疫球蛋白重链和/或轻链多肽的核酸序列，所述核酸序列任选地位于载体中。
18.一种包含权利要求17所述的核酸的细胞。
19.一种组合物，其包含(a)根据权利要求1至16中任一项所述的BTLA结合剂或编码其的核酸和(b)药学上可接受的载体。
20.一种调节哺乳动物中的BTLA信号传导的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用根据权利要求1至16中任一项所述的BTLA结合剂、编码其的核酸或包含其的组合物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述哺乳动物患有对BTLA调节有反应的病症，并且所述病症由此得到治疗。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述病症是自身免疫性疾病或炎性疾病。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述疾病是类风湿性关节炎、移植物抗宿主病、银屑病或炎性肠病。
24.一种制备根据权利要求1至16中任一项所述的BTLA结合剂的方法，所述方法包括在细胞中表达编码所述免疫球蛋白重链多肽的核苷酸序列和编码所述免疫球蛋白轻链多肽的核酸。
25.一种检测血液、血浆、血清或组织中的可溶性BTLA的方法，其包括将血液、血浆、血清或组织样品与权利要求8至14中任一项的抗体接触，任选地，其中所述血液、血浆、血清或组织样品中的所述可溶性BTLA与权利要求1至7中任一项的抗体结合，或者其中所述血液、血浆、血清或组织样品与权利要求8至14中任一项的抗体和权利要求1至7中任一项的抗体接触。
26.一种检测、测量或监测受试者中的BTLA结合剂的药理学活性或选择用BTLA结合剂治疗的受试者的方法，所述方法包括检测来自经施用BTLA结合剂的受试者的血液、血浆、血清或组织样品中的可溶性BTLA(sBTLA)。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述BTLA结合剂是抗BTLA抗体。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述BTLA结合剂是抗BTLA抗体，所述抗体结合BTLA而基本上不抑制BTLA与HVEM的结合，或者其结合BTLA并增强BTLA信号传导。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述BTLA结合剂是根据权利要求1至7中任一项所述的BTLA结合剂。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述方法包括检测所述血液、血浆、血清或组织样品中的sBTLA，所述检测是通过将所述血液、血浆、血清或组织样品或其部分接触与sBTLA结合的抗BTLA捕获抗体。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述抗BTLA捕获抗体是权利要求8至14中任一项的抗体。
32.根据权利要求26至31中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述血液、血浆、血清或组织样品中的sBTLA浓度与参考sBTLA浓度进行比较。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述参考sBTLA浓度是在施用所述BTLA结合剂之前来自同一患者的血液、血浆、血清或组织样品中的sBTLA浓度；或没有接受BTLA结合剂施用的另一个相同类型的正常、未患病受试者的血液、血浆、血清或组织中的sBTLA浓度，或通过统计分析此类受试者的群体的血液、血浆、血清或组织中的sBTLA浓度而建立的参考sBTLA浓度。
34.根据权利要求26至33中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用BTLA结合剂的步骤。
35.根据权利要求26至34中任一项所述的方法，其中所述方法包括将来自经施用BTLA结合剂的受试者的血液、血浆、血清或组织样品中的sBTLA浓度与在不同时间点来自同一受试者的血液、血浆、血清或组织样品中的sBTLA浓度进行比较，所述不同时间点为在向所述受试者施用所述BTLA结合剂之前或之后。
36.根据权利要求26至36中任一项所述的方法，其中在所述受试者的所述血液、血浆、血清或组织样品中检测到的所述sBTLA是与所述BTLA结合剂结合的sBTLA。
37.根据权利要求32所述的方法，其中所述参考sBTLA浓度通过以下方法来建立，所述方法包括将所述受试者的血液、血浆、血清或组织样品或来自受试者群体的血液、血浆、血清或组织样品与根据权利要求1至7中任一项所述的BTLA结合剂和权利要求8至14中任一项的捕获抗体接触。
38.一种组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的BTLA结合剂、根据权利要求8至14中任一项所述的BTLA结合剂或两者，用于根据权利要求20至37中任一项所述的方法。
39.根据权利要求8至14中任一项所述的BTLA结合剂，其用于治疗哺乳动物中对BTLA调节有反应的病症。
40.根据权利要求1至7中任一项所述的BTLA结合剂，其用于治疗哺乳动物中对BTLA调节有反应的病症。
41.根据权利要求40所述的BTLA结合剂，其中所述BTLA结合剂包含免疫球蛋白重链可变区，所述重链可变区是SEQ ID NO:144或至少包含其CDR；和免疫球蛋白重轻链可变区，所述轻链可变区是SEQ ID NO:174或至少包含其CDR；或包含与SEQ ID NO:144具有90％或更多序列同一性的免疫球蛋白重链可变区，和SEQ ID NO:174的免疫球蛋白轻链可变区。
42.根据权利要求39至41中任一项所述的方法，其中所述病症是自身免疫性疾病或炎性疾病。
43.根据权利要求39至41中任一项所述的方法，其中所述疾病是类风湿性关节炎、移植物抗宿主病、银屑病或炎性肠病。
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