TW202045708A

TW202045708A - 一種可即時偵測一種以上螢光訊號之聚合酶鏈式反應裝置

Info

Publication number: TW202045708A
Application number: TW108120548A
Authority: TW
Inventors: 賴盈達; 歐育誠; 吳俊德; 黃瑜雯; 陳翰毅
Original assignee: 新加坡商克雷多生物醫學私人有限公司
Priority date: 2019-06-13
Filing date: 2019-06-13
Publication date: 2020-12-16
Also published as: KR20200143639A; EP3750629A1; TWI715997B; US11680291B2; JP7162628B6; JP7162628B2; JP2020198869A; KR102352586B1; US20200392559A1

Abstract

本發明揭露一種可即時偵測一種以上螢光訊號之聚合酶鏈式反應裝置。本裝置係透過控制試劑容器容置空間的升降溫區間以進行聚合酶鏈式反應，並透過加入專一性探針、螢光物質、光源、以及光譜儀來偵測產生之螢光訊號。同時，本裝置亦預載一演算法用以即時分析並定量螢光訊號。

Description

一種可即時偵測一種以上螢光訊號之聚合酶鏈式反應裝置

本發明涉及一種聚合酶鏈式反應的裝置。更具體的，本發明更涉及一種可即時定量一個以上螢光訊號的聚合酶鏈式反應裝置。

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, 以下簡稱PCR)為一種快速放大DNA訊號的技術，其原理及主要操作步驟為(a)變性(denature)：利用高溫（90-95℃）將雙股DNA解離成單股DNA，再以單股DNA作為複製的模板；(b)引子黏合(primer annealing)：溫度降低到適當溫度時，引子會黏附到正確的目標基因位置；(c)引子延長(primer extension)：反應溫度修正到72℃，DNA聚合酶將脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate, 以下簡稱dNTPs）逐次黏附於引子之後，合成另一股新DNA 片段。

透過變性-引子黏合-引子延長三個步驟不斷重複進行核酸訊號放大，每重複一次三個步驟的操作，目標基因的數目就可擴增一倍，若設定三個步驟操作共進行40次循環，目標基因的數量就可以放大近10⁹ 倍，PCR可體外大量獲得目標基因片段，因此做為目前臨床診斷大量使用之分子診斷技術之一，可應用於包含遺傳疾病診斷、病原菌診斷、腫瘤癌症之診斷預後評估、以及基礎研究等項目，因此同樣作為目前被臨床診斷大量運用之技術。

近年來因應技術發展需求，開發出即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time polymerase chain reaction)，又稱定量即時聚合酶鏈鎖反應(Quantitative real-time polymerase chain reaction，簡稱為Q-PCR)(本文以下皆稱之為real-time PCR)。Real-time PCR和傳統PCR雖然都是利用熱循環步驟使目標基因之微量DNA進行擴增達到放大的目的，但二者不同的是，Real-time PCR係透過加入非專一性的螢光物質或具專一性之螢光探針於PCR反應中，透過每一次PCR擴增循環後，目標基因DNA放大的同時亦產生螢光訊號，偵測並記錄其生成產物之螢光訊號，待PCR反應完成後，以cycle number和螢光訊號作圖，可得到一反應曲線圖形，完整呈現PCR反應中每一次循環的產物生成情形，再透過內建程式分析以達到即時定量之結果。

目前常用的非專一性的螢光染料為SYBR Green 1，其係與DNA的次溝槽(minor groove)結合後釋放出螢光，因此在PCR過程中可在每一次循環的引子延長步驟結束時測量螢光強度，就可知每一次循環中產生了多少PCR產物。但由於SYBR Green I會跟所有的雙股DNA結合，所以無法分辨特異性產物與非特異性產物，因此其對於產物的專一性較差，有時候會出現偽陽性的測驗結果。

而目前常用的專一性之螢光探針則為TaqMan probe，其係為一人工合成的寡核甘酸(oligonucleotide)，具有對目標基因序列之專一性，並在寡核甘酸的兩端分別標記上不同的螢光物質，5’端螢光稱為信息基團(reporter)而3’端螢光稱淬滅體(quencher)。假如該專一性探針在游離狀態時，信息基團及淬滅體的交互作用會互相遮蔽對方的螢光，因此不會有螢光產生；但當PCR產物生成時，該專一性探針被水解後，淬滅體就失去可以遮蔽淬滅體的效果，因此reporter的螢光即可被偵測到。由於該專一性探針係唯一針對目標基因具有特異性之寡核甘酸，因此不會與其他非特異性產物結合。目前實務上常與TaqMan probe合併使用的螢光染劑包含FAM、VIC、HEX、ROX、CY3、CY5、CY5.5、JOE、TET、Texas Red、TAMRO、NED、Quasar705、Alexa488、Alexa546、Alexa594、Alexa633、Alexa643、Alexa680。

這些螢光染劑各自有其最佳吸收波長範圍及散射波長範圍，但上述螢光染劑之間之最佳吸收波長範圍及散射波長亦多有重疊，因此若要同時針對同一檢體在同一試管內進行二個以上不同的目標基因定量而需要使用二個以上的螢光染劑時，實務會選擇較不會產生高度訊號重疊(crosstalk)的螢光染劑來組合使用，並以傳統數據方式針對取得之數據進行分析，最後得到具有可分辨性的螢光訊號協助判讀；另一個方法則是一次僅在一個試管內測試該檢體一個目標基因，但同時有數個試管偵測同一檢體的不同目標基因，最後再合併檢視該檢體的數個檢測標的檢測結果，以避免因螢光訊號重疊造成數據無法分析之情形。前者的優點是不論測試幾個不同的目標基因，都可以在同一管試管中進行，較不會造成耗材的浪費，缺點則是因為有多種螢光訊號來源，會產生訊號重疊的現象而造成數據分析的錯誤，或是無法有效辨識訊號重疊部分究竟屬於哪一個目標基因，極易造成實驗結果之誤判；後者則因為一次僅在一個試管內測試一個目標基因，再將多個測試結果組合判斷，因此的確可有效解決訊號重疊的問題，訊號判讀之準確度亦較前者高出許多，但會造成耗材上的浪費，所須檢體的量也較多。目前實務上若有需要針對同一檢體進行多個目標基因定量時，多半仍採用後者之方式。

目前在實驗室常被使用來進行real-time PCR的裝置多半以溫控金屬作為加熱器，利用其可快速加熱及冷卻的特性，進行反覆升溫降溫之操作，以達到變性、引子黏合、及引子延伸三個步驟之反應溫度，透過加熱塑料製成之試劑容器傳遞熱量至試管內的試劑以及反應物(其內包含目標基因之片段)，來達成目標基因訊號放大並偵測螢光訊號的效果。但此種利用溫控金屬反覆升降溫的機台一般而言體積較大，此係為求有效溫控，整個溫控系統必須具有較大的體積及熱容比，且依照目前機台之設計，多數時間用於等待溫控金屬之升溫或降溫至反應溫度，如以一般試驗所需的循環次數約為30-35次左右，則利用傳統機台所需反應時間約介於二至三個小時間，造成反應時間較難縮減，也因此無法應用於需要在極短時間得知結果之試驗。

為了改良傳統裝置的問題，有研究人員開發將real-time PCR應用於微流體晶片技術。此種技術之優點在於微流體晶片可減少試劑或反應物的體積以及整體熱容比，因此可減少反應時間以及試劑的消耗，但由於此技術仍需要反覆在三個不同溫度區間升降溫，因此仍存在有升降溫時間過長的問題。

另一種已開發的real-time PCR微流體晶片則排除加熱器反覆升降溫的設定，而係利用特殊設計之推動力對流道內之反應物及試劑加壓，使反應物及試劑在特殊加工設計的流道中，反覆流經三個不同的溫度區間，而完成目標基因放大並偵測訊號之效果。利用此種技術進行real-time PCR雖可以排除因升降溫造成之時間耗費，但由於此種技術的系統需要包含複雜的加壓系統及液體驅動系統，且液體驅動系統又與液體的體積之黏度息息相關，造成系統及儀器製作及調控上的困難，因此也間接地限制了此種技術的發展。

亦有研究人員開發另一種利用熱對流循環進行real-time PCR的技術來解決傳統機台高電容比及高耗時的問題。此種技術係利用兩個不同溫度之熱源，對一封閉式且內含試劑及反應物之試管上下端進行加熱，透過上下端溫差進驅動試管內的試劑及反應物流經不同的溫度區間以進行real-time PCR反應。此種技術雖然克服加熱器因反覆升降溫而造成之時間耗損，亦不需要透過外部加壓的方式來驅動試管內之液體流動循環，但由於加熱器多半為塊狀金屬，因此機台的體積因無法降低熱容比而無法縮小，且其複雜之溫控機制及金屬加熱系統亦使製造費用居高不下。

若要針對同一檢體進行多個目標基因或標的定量時，前述關於螢光探針組合及機台的問題則會更加突顯。亦即為取得可靠度較高之螢光訊號值，實務上多半採用一次僅在一個試管內測試一個目標基因，再將多個測試結果組合判斷，如此將會造成每一檢體的測試需要多個試管進行測試，若使用裝置係為前述實驗室常使用的機台，或是在不同溫度區間反覆升降溫之微流體晶片，除仍有測試時間較長的問題外，亦存有耗材浪費及所需檢體量也較多的問題；而即便是在特殊流道設計的微流體晶片或利用熱循環進行real-time PCR測試的裝置上進行測試，雖可排除測試時間過長的問題，仍無法排除耗材浪費及所需檢體量也較多的問題。

鑒於上述問題，本發明揭露一種可以解決前述機台體積過大、反覆升降溫造成時間耗損，以及可以同時解決耗材浪費及所需檢體量較多等問題的聚合酶鏈鏈式反應裝置。

本發明係涉及一種可即時偵測一種以上螢光訊號的聚合酶鏈式反應裝置。此裝置包含一試劑容器容置空間，試劑容器容置空間由一耐熱物質組構而成，此耐熱物質表層可包含一耐熱絕緣物質或由導電物質(conductive material)塗佈之導電薄膜或兩者兼具；且此試劑容器容置空間可依試劑容器外部廓型不同及其與溫控條件不同而有相異之構造設計，亦可加入其他導電配件如電路板或導電金屬配件等，以利操作。該耐熱物質可以為金屬或非金屬；若耐熱物質為金屬，則其可為鋁片、銅片、或其他耐熱金屬；若耐熱物質為非金屬，則其可為玻璃、塑膠、或陶瓷；若該耐熱物質為金屬，則會在金屬上先進行塗佈一層耐熱絕緣物質，如三氧化二鋁，鐵氟龍、及聚醯亞胺(polyimide)等。

而不論該耐熱物質為金屬與否，是否要在其表層塗佈一導電薄膜以提供一特定電阻值，則視試劑容器容置空間的加熱機構設計而定。若該加熱機構設計僅包含一金屬材質之導電物質，並無其他配件可以提供升溫時，此時本發明揭露之裝置就會在該耐熱物質之表層塗佈一導電薄膜，則由於導電薄膜具有一定電阻值，當接收到來自導電物質之電流後即可開始升溫加熱；反之，若該加熱機構設計直接包含一電熱裝置，如已銲接電熱元件之電路板，一但通電即可讓試劑容器容置空間開始加熱升溫，則該耐熱物質上就不需要再塗佈一層導電薄膜。本發明之導電物質可為氧化錫、氧化銦、氧化鋅、氧化銦錫、鉻、鈦、鉭或銅，本發明之電熱元件可為電阻或電路佈線 (PCB layout)。透過本發明揭露之加熱機構設計，可大幅度縮減加熱機構之體積，相較於傳統PCR機台，具有更多體積上之優勢及可衍生性。

試劑容器容置空間與試劑容器接觸的部位設有至少一個溫度感測器，其放置位置及個數可視實際試劑容器置入試劑容器容置空間時之相對較易偵測溫度變化又不致影響反應之位置而定，溫度感測器用以監測並回報該處之溫度。

本發明亦包含一電源供應器、一散熱裝置、及一處理器。電源供應器用於供應試劑容器容置空間之升降溫以及整個裝置運作所需之電源，散熱裝置則用於系統降溫，而處理器預載一程式以利用演算法定量及分析一種以上的螢光訊號，該演算法可為依據最小平方法設定參數之演算法。

前述處理器除分析螢光訊號外，且亦可用於控制電源供應器啟動提供電源給試劑容器容置空間升溫、啟動散熱裝置、以及系統光源開關之時間點。電源供應器與試劑容器容置空間連接，更精確的說，電源供應器的接頭可與試劑容器容置空間表層的導電薄膜連接，或是與試劑容器容置空間的其他電熱裝置連接。當電源供應器開始供電時，試劑容器容置空間開始升溫加熱至預定溫度，此時設於試劑容器容置空間的溫度感測器會開始偵測溫度並回報給處理器，而當溫度感測器偵測到試劑容器容置空間的溫度超過系統預設之最高溫度時，就會在預定時間內啟動散熱裝置開始降溫至系統預設之低溫溫度區間。散熱裝置的裝設或相對於試劑容器容置空間的位置並未特定，只要可以快速有效降低裝置溫度即可。在本發明之溫度設定中，可允許試劑容器容置空間升溫的溫度區間為85℃至130℃，而可允許試劑容器容置空間低溫的溫度區間為50℃至75℃。

在本發明一較佳實施例中，在本發明之一較佳實施例中，散熱裝置可為風扇，且亦可增加熱電致冷器(TE cooler)或一個以上風扇與散熱裝置合併使用達到快速有效將溫的效果，而組構試劑容器容置空間之耐熱物質上亦可包含數個洞穿的散熱孔洞，以加速散熱效果。

本發明揭露之裝置配備有至少各一之光源、光譜儀、光激發透鏡(light illumination lens)、及光偵測透鏡(light detection lens)。光源用於激發螢光染料或螢光探針產生可被偵測之螢光，在本發明揭露之裝置亦可組合使用複數個不同激發光波長之光源。光源射出之光線，透過可以一特定角度經光激發透鏡射入前述試劑容器，並激發螢光物質產生螢光訊號，產生之螢光訊號經螢光訊號射出口穿過光偵測透鏡及光譜儀將該訊號送至處理器進行分析。本發明可應用之光源包含有LED燈、雷射燈、或其他光波長與螢光染料或螢光探針波長相符之光源，亦可組合使用；而本發明可應用之光激發透鏡及光偵測透鏡可為雙凸透鏡、平凸透鏡、雙重透鏡、非球面透鏡、消色差透鏡、消像差透鏡、菲涅爾透鏡、平凹透鏡、雙凹透鏡、正/負彎月透鏡、軸稜鏡、梯度折射率透鏡、微透鏡陣列、柱狀透鏡、繞射光學元件、及全像光學元件，亦可為上述各種透鏡、元件、及陣列之組合。處理器可以控制光源開啟及關閉的時間，亦可控制光譜儀與光源是否要在同時時段開始偵測螢光訊號。

本發明揭露裝置，其光源、光譜儀、光激發透鏡、光偵測透鏡及試劑容器容置空間並未有特別限定的排列方式，基本上只要確認光源及其光線射出路徑與光激發透鏡位於試劑容器容置空間的一側，且光源之射出之光線可穿過光激發透鏡導向試劑容器中以有效激發試劑中之螢光染劑或螢光探針；另一部分，當螢光訊號產生後，可穿過光偵測透鏡將螢光訊號傳送至光譜儀，再傳送至處理器中分析相關訊號。在本發明之一較佳實施例中，光源及光激發透鏡位於試劑容器容置空間之鉛直下方，而光偵測透鏡及光譜儀則與前述光源及光激發透鏡呈90度角排列。在本發明揭露一較佳實施例中，試劑容器容置空間將會在螢光射出的路徑位置設有一螢光訊號射出口，以利本發明揭露裝置之實施運作。

在本發明揭露之裝置，其可使用之光譜儀可偵測之螢光訊號範圍介於340nm至850nm之間。而本發明可使用之螢光染劑或螢光探針的發射光譜（Emission Wavelength）亦需介於340nm至850nm之間，包含但不限於下列物質:FAM、VIC、HEX、ROX、CY3、CY5、CY5.5、JOE、TET、SYBR、Texas Red、TAMRO、 NED、Quasar705、Alexa488、Alexa545、Alexa594、Alexa633、Alexa643、Alexa680。若有其他螢光染劑之發射光譜落在340nm至850nm之間，亦可應用於本發明中。

本發明揭露裝置可在同一試劑容器中進行多個目標基因或標的檢測，亦即在同一個試劑容器中加入一種以上的螢光染劑或螢光探針進行real-time PCR，並蒐集每一次反應的螢光訊號，透過處理器預載之演算法分析螢光訊號以達多個目標基因或標的定性及定量之效果。若加入一種以上的螢光染劑或螢光探針時，螢光訊號會產生訊號重疊的狀況，為有效即時在同一試劑容器中偵測並鑑別兩種以上的螢光訊號，首先針對預計使用之螢光染料或螢光探針，輸入其標準螢光頻譜至處理器預載之該演算法中，同時亦將裝置使用之激發光光源標準頻譜輸入至處理器中，將二者作為演算法之對照標準值，再將測得之原始螢光訊號與標準頻譜透過演算法運算比對後即可得到其螢光訊號值。舉例來說，若預計在同一試劑容器中偵測六種不同的目標基因或標的，即需使用六種不同螢光染劑或螢光探針，因此首先需先輸入六種螢光染劑或螢光探針之標準頻譜至處理器預載之演算法中，同時亦將激發光光源之標準頻譜先輸入至處理器預載之演算法中，再開始進行real-time PCR。在程序運作完畢後，處理器會先取得量測的頻譜原始數據，此原始數據係為六種螢光染劑或螢光探針的總累計螢光訊號，接著扣除背景值後，利用該演算法計算每一次PCR循環之六種螢光訊號在螢光頻譜中之各別佔比值，透過運算即可分離並得到各螢光染劑或螢光探針之即時螢光訊號值，再透過換算即可得到六種不同目標基因或標的之定性或定量結果。

本發明揭露之裝置在運作時，首先電源供應器會先啟動，導電物質隨即開始通電，試劑容器容置空間開始升溫。將添加有反應物及試劑之試劑容器置放於試劑容器容置空間，透過快速且反覆對試劑容器容置空間升溫與降溫，反應物及試劑即開始進行變性(denature)、引子黏合(primer annealing)以及引子延長(primer extension)的等步驟。此時處理器會啟動光源開關，射出之激發光源通過光激發透鏡射入試劑容器並激發其內之螢光物質發出螢光，產生之螢光過光偵測透鏡被光譜儀接收訊號，該訊號再被傳送至處理器進行訊號分析，最後可針對試劑容器內欲檢測之目標基因或標的進行定性或定量之分析。

本發明揭露之裝置利用導電薄膜或電熱元件，結合一小體積加熱機構提供快速升降溫的功能，有效縮短PCR反應時間。同時，亦透過內建之演算法可即時分析一個以上螢光訊號之螢光值，達到在短時間針對目標基因定性及定量的功能。為了達成前述目的，依據本發明提供一較佳實施例如後。

以下即配合附圖詳細說明本發明之一較佳實施例的結構及功效。另外，本說明書中對於機構或其部位在其位置描述上冠以「前」、「後」、「左」、「右」、「上」、「下」等，對應於使用者在操作本較佳實施例時的空間關係。

請參考第1圖，本發明一較佳實施例之裝置（1）組成零件配置如圖所示。本發明一較佳實施例裝置（1）包含一試劑容器容置空間（10）、一試劑容器（20）、一第一透鏡（30）、一光源（40）、一第二透鏡（50）、一光譜儀（60）、一風扇（70）、一熱電致冷器（80）、一處理器（90）、及一電源供應器（100）。其中試劑容器容置空間（10）用於容置試劑容器（20）及提供試劑及反應物加熱升溫之場域，且電源供應器（100）與試劑容器容置空間（10）直接連接，而風扇（70）及熱電致冷器（80）則用於為裝置（1）降溫。

請參考第2-1圖至第第2-4圖，本發明一較佳實施例之試劑容器容置空間（10）如圖所示。包含一具有第一凹面（1011）之第一基板（101）、一具有第二凹面（1021）之第二基板（102）、一第一金屬片（103）、一第二金屬片（104）。第一基板（101）上具有一散熱孔洞（105）及第二散熱孔洞（107）作為散熱使用，且第一基板（101）上還具有一第一螢光訊號射出口（106），及一第一溫度感測器（108），第一溫度感測器（108）係用來偵測試劑容器容置空間（10）的溫度，並回報溫度給處理器（90）。第二基板（102）上則僅具有第一散熱孔洞（105）及第二散熱孔洞（107）。

第一基板（101）與第二基板（102）以相互平行排列的方式使得第一凹面（1011）與第二凹面（1021）以垂直水平面的方式互相耦合並形成一空間供試劑容器（20）置放，且試劑容器（20）外壁分別與第一凹面（1011）及第二凹面（1021）相接。第一凹面（1011）及第二凹面（1021）之形狀並無特別限制，基本上只要與試劑容器（20）相符即可，在本實施例中，因試劑容器（20）為試管，因此第一凹面（1011）及第二凹面（1021）耦合而成提供試劑容器（20）置放之空間外型及為試管外壁之形狀。第一金屬片（103）與第二金屬片（104）被第一基板（101）與第二基板（102）夾持，並約略與第一基板（101）與第二基板（102）平行，且第一金屬片（103）與第二金屬片（104）分別位於第一基板（101）與第二基板（102）之兩側。第一金屬片（103）與第二金屬片（104）並分別與電源供應器（100）連接。

在本實施例中，第一基板（101）與第二基板（102）的基底材質為鋁，基底材質先經陽極電鍍處理，鍍上一層三氧化二鋁(Aluminum Oxide)，再在其上鍍一層導電薄膜，本實施例之導電薄膜的材質可為氧化錫、氧化銦、氧化鋅、氧化銦錫、鉻、鈦、鉭或銅；至於第一金屬片（103）與第二金屬片（104）的材質在本實施例中則為銅。

請參考第1圖，在本實施例中，光源（40）為一雷射二極體，可用於激發螢光染料或螢光探針產生可被偵測之螢光訊號。若有其他需求時，光源（40）亦可變更為雷射光組或LED。第一透鏡（30）為一遠心透鏡，用於將光源（40）發出之光線導向試劑容器（20）。在本實施例中，試劑容器（20）已置放試劑容器容置空間（10）中，光源（40）及第一透鏡（30）位於試劑容器（20）下方，與試劑容器（20）之成鉛直排列，且第一透鏡（30）位於光源（40）及試劑容器（20）之間。這樣的排列方式可確保光源（40）射出之激發光被第一透鏡（30）導向試劑容器（20）底部，以激發試劑容器（20）內之螢光染料或螢光探針。

請參考第1圖，在本實施例中，第二透鏡（50）為共軛焦透鏡，用於將產生之螢光訊號傳遞給光譜儀（60），光譜儀（60）再傳送至處理器（90）進行訊號分析。第二透鏡（50）與光譜儀（60）位於試劑容器容置空間（10）較靠近第一基板（101）那側，且第二透鏡（50）、光譜儀（60）與第一螢光訊號射出口（106）三者須盡量成水平排列，使得試劑容器（20）中被激發的螢光訊號可以先後穿過第一螢光訊號射出口（106）及第二透鏡（50）直線射出，並被光譜儀（60）偵測。在本實施例中，第二透鏡（50）與光譜儀（60）位於試劑容器容置空間（10）的右側，且第二透鏡（50）與光譜儀（60）之排列與第一透鏡（30）及光源（40）之排列約略成垂直的角度。

請參考第1圖，在本實施例中，風扇（70）為散熱裝置，與熱電致冷器（80）合併搭配使用，其位置並未特定，在本實施例中，風扇（70）位於試劑容器容置空間（10）較靠近第二基板（102）那側，而熱電致冷器（80）則位於其上方，當裝置（1）開始降溫時，第一散熱孔洞（105）與第二散熱孔洞（107）將協同進行散熱。本實施例一包含一處理器（90），其內預載一利用最小平方法的演算法進行螢光訊號分析。在本實施例中，須預先輸入預使用之螢光染劑或螢光探針標準頻譜，以及光源（40）之波長，作為後續數據分析使用。

處理器（90）亦接收第一溫度感測器（108）的訊號，當試劑容器容置空間（10）的溫度高於系統設定溫度範圍時，即啟動風扇（70）與熱電致冷器（80）開始為試劑容器容置空間（10）降溫；而當試劑容器容置空間（10）的溫度高於系統設定溫度範圍時，則會電源供應器（100）開始為裝置（1）加溫。在本實施例中，為配合升溫速度控制，處理器（90）更可以進一步控制同時對第一金屬片（103）與第二金屬片（104）進行通電加熱，或是只針對第一金屬片（103）或第二金屬片（104）單一加熱。

本實施例亦包含一電源供應器（100），用於提供整個裝置（1）所需之電量。當電源供應器（100）啟動時，會將電流傳送至第一金屬片(103)及第二金屬片（104），由於第一金屬片（103）及第二金屬片（104）的材質是銅，可以傳導電流至第一基板（101）及第二基板（102）與其接觸的部位，又由於第一基板（101）及第二基板（102）表層塗佈有導電薄膜，其具有一定之電阻值，因此試劑容器容置空間（10）開始升溫至95℃至100℃的溫度區間，此溫度區間即為本實施例設定之升溫溫度區間，且在本實施例中，處理器（90）設定試劑容器容置空間（10）會維持在此升溫溫度區間約6秒至15秒以提供試劑容器（20）內之real-time PCR反應進行。接著處理器（90）會啟動風扇（70）與熱電致冷器（80）開始為試劑容器容置空間（10）降溫至60℃至62℃的溫度區間，此溫度區間即為本實施例設定之低溫溫度區間，在本實施例中，處理器（90）設定試劑容器容置空間（10）會維持在此低溫溫度區間約1秒至5秒以提供試劑容器（20）內之real-time PCR反應進行。為提供有效及足量的反應時間及溫度，處理器（90）亦調控在反應進行時，試劑容器容置空間（10）的溫度將一直在升溫溫度區間及低溫溫度區間內反覆循環直至反應結束，而當試劑容器容置空間（10）的溫度在這樣穩定的升降時，試劑容器（20）內的反應物及試劑即可隨之達到real-time PCR三個需要的溫度區間。

當Real-time PCR反應開始進行時，試劑容器（20）與試劑容置空間（10）接觸部位的試劑及反應物首先開始加熱，當較靠近接觸部位的反應物及試劑加熱至95℃時，該部位之反應物及試劑即開始進行變性(denature)的步驟，藉由控制試劑容器容置空間（10）的溫度循環達到進行引子黏合(primer annealing) 以及引子延長(primer extension)的溫度。

此時處理器（90）會啟動光源（40）開關，射出之激發光通過第一透鏡（30）進入試劑容器（20）並激發其內之螢光物質發出螢光，產生之螢光過第二透鏡（50）被光譜儀（60）接收原始螢光訊號，該原始螢光訊號再被傳送至處理器（90），透過處理器（90）內預載之利用最小平方法之演算法，扣除背景光訊號值後，再將將數據與預先輸入的螢光染劑或螢光探針標準頻譜進行驗證分析，最後可得到每一螢光染劑或螢光探針所占之比例值，透過換算即可針對試劑容器（20）內欲檢測之目標基因或標的進行定性或定量之分析。

透過本實施例前述的設定，若在四個試劑容器（20）內分別加入四種濃度不同濃度的螢光探針，且每一個試劑容器（20）內均包含四種同樣濃度的FAM、VIC、Alexa594、以及Alexa647螢光探針，透過本裝置（1）之實施，可以先得到四個試劑容器（20）內之混合之原始螢光數據如圖3，再透過內建之利用最小平方法運算之演算法及分析後即可得到每一種螢光探針在四個試劑容器（20）內的濃度分析如圖4。

請參考圖5-1與圖5-2，在另一較佳實施例中，本裝置（1）亦可使用另一試劑容器容置空間（210）取代上述之試劑容器容置空間（10），其餘之裝置設置皆與上一個實施例相同。試劑容器容置空間（210）包含一第三基板（201）、一第四基板（202）、一絕緣片（204）。第三基板（2101）上具有一溫度感測器（205），溫度感測器（2105）係用來偵測試劑容器容置空間（210）的溫度，並回報溫度給處理器（90）。第三基板（201）與第四基板（202）為同一耐熱物質，其僅以特定角度彎折後以相對稱的方式排列，彎折處即構成試劑容器容置處（203）。試劑容器容置處（203）之形狀並無特別限制，基本上只要與試劑容器（220）相符即可。在本實施例中，因試劑容器（220）為試管，因此試劑容器容置處（2103）即為試劑容器（220）外壁之形狀。第三基板（201）與第四基板（202）之間包含一絕緣片（204），且第三基板（201）與第四基板（202）並分別與電源供應器（100）連接。

在本實施例中，第三基板（201）與第四基板（202）的基底材質為鋁，基底材質先經陽極電鍍處理，鍍上一層三氧化二鋁(Aluminum Oxide)，再在其上鍍一層導電薄膜，本實施例之導電薄膜的材質可為氧化錫、氧化銦、氧化鋅、氧化銦錫、鉻、鈦、鉭或銅。電源供應器（100）分別與第三基板（201）與第四基板（202）連接通電，第三基板（201）與第四基板（202）分別為正負極，且透過絕緣片（204）確保正負極不會相觸。

請參考圖6-1與圖6-2，在另一較佳實施例中，本裝置（1）亦可使用另一試劑容器容置空間（310）取代上述之試劑容器容置空間（10），其餘裝置（1）之零件及配置與前述揭露實施例相同。試劑容器容置空間（310）包含一具有第三凹面（3011）之第五基板（301）、一具有第四凹面（3021）之第六基板（102）、一第一電路板（303）、一第二電路板（304）。第五基板（301）上具有一第三散熱孔洞（305）及第四散熱孔洞（307）作為散熱使用，且第五基板（301）上還具有一第二螢光訊號射出口（306），及一第二溫度感測器（308），第二溫度感測器（308）係用來偵測試劑容器容置空間（310）的溫度，並回報溫度給處理器（90）。第六基板（302）上則僅具有第三散熱孔洞（305）及第四散熱孔洞（307）。

第五基板（301）與第六基板（302）以相互平行排列的方式使得第三凹面（3011）與第四凹面（3021）以垂直水平面的方式互相耦合並形成一空間供試劑容器（20）置放，且試劑容器（20）外壁分別與第三凹面（3011）及第四凹面（3021）相接。第三凹面（3011）及第四凹面（3021）之形狀並無特別限制，基本上只要與試劑容器（20）相符即可，在本實施例中，因試劑容器（20）為試管，因此第三凹面（3011）及第四凹面（3021）耦合而成提供試劑容器（20）置放之空間外型及為試管外壁之形狀。第一電路板（303）與第二電路板（304）被第五基板（301）與第六基板（302）夾持，並約略與第五基板（301）與第六基板（302）平行，且第一電路板（303）與第二電路板（304）分別位於第五基板（301）與第六基板（302）之兩側。其中，第一電路板（303）與第二電路板（304）正反兩面各焊接有電阻（309），並與第五基板（301）與第六基板（302）相接合。第一電路板（303）與第二電路板（304）亦分別與電源供應器（100）連接。在本實施例中，第五基板（301）與第六基板（302）的基底材質為鋁，基底材質經陽極電鍍處理，鍍上一層三氧化二鋁(Aluminum Oxide)。

當電源供應器（100）啟動時，會將電流傳送至第一電路板（303）及第二電路板（304），此時電阻（309）通電後開始升溫，並帶動第五基板（301）與第六基板（302）隨之開始升溫，因此試劑容器容置空間（310）開始升溫至95℃至100℃的溫度區時，real-time PCR反應開始進行，第二溫度感測器（308）將偵測試劑容器容置空間（310）之溫度並回報給處理器，當溫度超過系統設置之升溫溫度區間時，第三散熱孔洞（305）及第四散熱孔洞（307）將協助風扇（70）及熱電致冷器（80）進行降溫。real-time PCR反應進行產生螢光訊號後，螢光訊號將透過螢光訊號射出口（306）射出，並被第二透鏡（50）及光譜儀（60）偵測。

1:裝置 10:試劑容器容置空間 20:試劑容器 30:第一透鏡 40:光源 50:第二透鏡 60:光譜儀 70:風扇 80:熱電致冷器 90:處理器 100:電源供應器 101:第一基板 102:第二基板 103:第一金屬片 104:第二金屬片 105:第一散熱孔洞 106:第一螢光訊號射出口 107:第二散熱孔洞 108:第一溫度感測器 201:第三基版 202:第四基板 203:試劑容器容置處 204:絕緣片 205:溫度感測器 210:試劑容器容置空間 220:試劑容器 301:第五基版 302:第六基板 303:第一電路板 304:第二電路板 305:第三散熱孔洞 306:螢光訊號射出口 307:第四散熱孔洞 308:第二溫度感測器 309:電阻 310:試劑容器容置空間 1011:第一凹面 1021:第二凹面 3011:第三凹面 3021:第四凹面

圖1是本發明一較佳實施例裝置之零件配置示意圖。

圖2-1及圖2-2為本發明一較佳實施例之試劑容器容置空間、散熱孔洞、及溫度感測器示意圖。

圖2-3為本發明一較佳實施例之試劑容器容置空間俯視圖。

圖2-4為本發明一較佳實施例之試劑容器容置空間側試圖。

圖3為本發明一較佳實施例之原始螢光訊號顯示圖。

圖4為本發明一較佳實施例之螢光訊號分析結果圖。

圖5-1為本發明另一較佳實施例之試劑容器容置空間示意圖。

圖5-2為本發明另一較佳實施例之試劑容器容置空間俯視圖。

圖6-1為本發明另一較佳實施例之試劑容器容置空間示意圖。

圖6-2為本發明另一較佳實施例之試劑容器容置空間示意圖。

1:裝置

10:試劑容器容置空間

20:試劑容器

30:第一透鏡

40:光源

50:第二透鏡

60:光譜儀

70:風扇

80:熱電致冷器

90:處理器

100:電源供應器

Claims

一種可即時偵測並定量一種以上螢光訊號的聚合酶鏈式反應裝置，前述裝置包含有：一試劑容器，裝載有一反應物及一試劑，且前述試劑包含一種以上之螢光探針或螢光染料；一試劑容器容置空間，設於一水平面，用於放置試劑容器，其中前述試劑容器容置空間由一耐熱物質組構；一溫度感測器，固定於前述試劑容器容置空間之一側，用於測量前述試劑容器容置空間之溫度；一光源，位於前述試劑容置空間之一側，其中前述光源射出之光線可以特定角度射入前述試劑容器並激發前述螢光探針或螢光染料產生前述螢光；一第一透鏡，位於前述試劑容器容置空間與前述光源之間，可將前述光源聚合導向前述試劑容器並激發前述螢光探針或螢光染料以產生前述螢光訊號；一光譜儀，用於偵測及接收前述螢光訊號，且位於前述試劑容器容置空間之另一側；一第二透鏡，位於前述試劑容器容置空間與前述光譜儀之間，用於聚合前述一種以上螢光訊號並將之導向前述光譜儀；一散熱裝置，用於散熱；一電源供應器，用於提供前述試劑容器容置空間升降溫所需之電源，亦供應前述裝置所需之電源；一處理器，預載一演算法以定量前述一種以上的螢光訊號，前述處理器亦控制前述電源供應器提供電源給前述試劑容器容置空間之升溫及降溫循環及前述光源開關之時點；其中，前述電源供應器連結到前述試劑容器容置空間並開始通電加熱，前述試劑容器亦隨之開始升溫，前述處理器控制前述試劑容器容置空間之溫度於一第一溫度區間及一第二溫度區間循環，此時前述反應物與試劑隨即開始進行聚合酶鏈式反應，前述光源穿過前述第一透鏡激發前述螢光探針或螢光染劑產生前述一種以上螢光訊號，前述一種以上螢光訊號穿過前述第二透鏡並被前述光譜儀偵測後，前述訊號即被送至前述處理器進行分析；其中，前述溫度感測器測得前述試劑容器容置空間溫度已超過前述第一溫度區間時，會反饋給前述處理器，前述處理器則會啟動前述散熱裝置進行降溫;其中，前述溫度感測器測得前述試劑容器容置空間低於前述第二溫度區間時，會反饋給前述處理器，前述處理器則會啟動通電開始加熱。
如申請專利範圍第1項所述之裝置，其中前述試劑容器容置空間可由一具有一第一凹面之第一基板、一具有一第二凹面之第二基板、一第一導電配件、及一第二導電配件組成。
如申請專利範圍第1項所述之裝置，其中前述試劑容器容置空間可由一耐熱物質以特定角度彎折後以相對稱的方式重合而成，且前述以特定角度彎折之耐熱物質包含一第三基板及一第四基板，且前述第三基板與第四基板之間更包含一絕緣物質。
如申請專利範圍第1項所述之裝置，前述耐熱物質可為金屬或非金屬。
如申請專利範圍第4項所述之裝置，前述耐熱物質若為金屬，則其可為鋁片、銅片、或其他導熱快速之金屬。
如申請專利範圍第4項所述之裝置，前述耐熱物質若為非金屬，則其可為玻璃、塑膠或陶瓷。
如申請專利範圍第5項所述之裝置，前述耐熱物質表層更包含一耐熱絕緣物質。
如申請專利範圍第7項所述之裝置，其中前述耐熱絕緣物質可為三氧化二鋁、鐵氟龍、或聚醯亞胺。
如申請專利範圍第1項所述之裝置，其中前述演算法可為一利用最小平方法之演算法。
如申請專利範圍第2項所述之裝置，前述第一導電配件及第二導電配件可為金屬片或電路板。
如申請專利範圍第10項所述之裝置，若前述第一導電配件及第二導電配件為金屬片，則前述第一基板及前述第二基板表層之耐熱絕緣物質上更可包含一導電薄膜，且前述導電薄膜之材質可為氧化錫、氧化銦、氧化鋅、氧化銦錫、鉻、鈦、鉭或銅。
如申請專利範圍第10項所述之裝置，若前述第一導電配件及第二導電配件為電路板，則其更可包含一個以上的電熱元件。
如申請專利範圍第12項所述之裝置，其中前述電熱元件可為電阻或電路佈線。
如申請專利範圍第2項所述之裝置，其中前述第一基板與前述第二基板相互平行排列使前述第一凹面與前述第二凹面以約略垂直水平面之方向沿相應耦合面相互耦合並形成前述試劑容器容置空間。
如申請專利範圍第14項所述之裝置，其中，前述第一導電配件及前述第二導電配件被前述第一基板與前述第二基板夾持並約略與前述第一基板及前述第二基板平行；其中前述第一導電配件位於前述試劑容器容置空間之一側，前述第二導電配件則位於前述容器容置空間之另一側。
如申請專利範圍第2項所述之裝置，其中前述電源供應器可分別與前述第一導電配件及前述第二導電配件連接並分別或同時通電。
如申請專利範圍第3項所述之裝置，其中前述電源供應器可分別與前述第三基板與前述第四基板連接並分別或同時通電。
如申請專利範圍第1項所述之裝置，其中前述光源可為LED雷射光、或一個以上不同光譜之LED光組或雷射光組，且前述光源與前述第一透鏡可與前述加熱裝置呈垂直排列於前述試劑容器容置空間鉛直下方，其中前述LED光組或雷射光組更包含一可濾除與前述螢光訊號無關之光源。
如申請專利範圍第1項所述之裝置，其中前述第一透鏡及第二透鏡可為雙凸透鏡、平凸透鏡、雙重透鏡、非球面透鏡、消色差透鏡、消像差透鏡、菲涅爾透鏡、平凹透鏡、雙凹透鏡、正/負彎月透鏡、軸稜鏡、梯度折射率透鏡、微透鏡陣列、柱狀透鏡、繞射光學元件、或全像光學元件。
如申請專利範圍第1項所述之裝置，前述第二透鏡與前述光譜儀可與前述加熱裝置平行排列並位於同一水平面上。
如申請專利範圍第2項所述之裝置，前述第一基板可具有一螢光訊號射出口，且前述第一基板位於前述第二基板與前述第二透鏡之間。
如申請專利範圍第1項所述之裝置，其中前述處理器可控制前述光源於固定時間間隔開啟或關閉，其中前述光譜儀與前述光源開啟時段同步偵測前述一種以上螢光訊號。
如申請專利範圍第1項所述之裝置，其中前述光譜儀可偵測之範圍為340nm至850nm之間。
如申請專利範圍第23項所述之裝置，其中前述光譜儀更包含一用於濾除非偵測前述一種以上螢光訊號波長之其他光源。
如申請專利範圍第1項所述之裝置，其中前述螢光探針或螢光染劑可為FAM、VIC、HEX、ROX、CY3、CY5、CY5.5、JOE、TET、SyBR、Texas Red、TAMRO、NED、Quasar705、Alexa488、Alexa546、Alexa594、Alexa633、Alexa643、Alexa680或其他波長介於340nm至850nm之間之螢光探針或螢光染劑。
如申請專利範圍第1項所述之裝置，其中前述第一溫度區間為85℃至130℃，且前述第二溫度區間為50℃至75℃。
如申請專利範圍第26項所述之裝置，其中更包含與前述第一溫度區間與前述第二溫度區間不同之一第三溫度區間，且前述處理器將控制前述試劑容器容置空間之溫度反覆於前述第一溫度區間、第二溫度區間與前述第三溫度區間循環升降溫。
如申請專利範圍第1項所述之裝置，其中前述散熱裝置可為一風扇。
如申請專利範圍第28項所述之裝置，其中前述裝置更包含一熱電致冷器(TE cooler, thermoelectric cooler)或一個以上風扇，可與前述風扇組合加速前述裝置之降溫速度。
如申請專利範圍第2項或第3項所述之裝置，前述耐熱物質具有一個以上的散熱孔洞。
如申請專利範圍第1項所述之裝置，其中前述溫度感測器可用於即時測量前述試劑容器容置空間之溫度。