TW202034953A

TW202034953A - 抗平足蛋白抗體

Info

Publication number: TW202034953A
Application number: TW108147262A
Authority: TW
Inventors: 刑部伸彦; 藤田直也; 柿野衛; 川島愛; 藤原伸哉; 合田直樹
Original assignee: 公益財團法人癌研究會; 日商亞碧股份有限公司
Priority date: 2019-03-15
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2020-10-01
Also published as: SG11201913540VA; WO2020188836A1; KR20210141794A; JP2020150947A; CN113646332A

Abstract

本發明之課題在於提供一種作為人源化抗體或小鼠-人嵌合抗體之抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段，藉由包含預定之胺基酸序列且經單離之作為人源化抗體或小鼠-人嵌合抗體之抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段而解決該課題。

Description

抗平足蛋白抗體

本發明係關於一種抗平足蛋白抗體。詳細而言，本發明係關於一種作為抗人源化抗體或小鼠-人嵌合抗體之抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段。

已報告有血小板凝聚而覆蓋癌細胞膜，由此促進對血流的剪切應力之抵抗性或避免來自免疫細胞之攻擊，促進轉移癌細胞之生存，並且促進腫瘤塊之形成及栓塞形成，進而由於促進腫瘤增殖、上皮間質轉化(EMT)、血管新生等機制而助長轉移灶之形成(非專利文獻1、非專利文獻2)。另一方面，已報告有於癌細胞上已鑒定出作為誘導血小板凝聚之蛋白質的平足蛋白，平足蛋白經由平足蛋白的PLAG(Platelet aggregation；血小板凝聚)結構域，較佳為PLAG4結構域而與作為血小板上之受體的CLEC-2(C-type lectin-like receptor-2；C型凝集素樣受體-2)結合(非專利文獻1至非專利文獻4)。亦已報告有平足蛋白係於間皮瘤、腦腫瘤、睪丸腫瘤、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、淋巴管瘤、海綿狀血管瘤、血管肉瘤、肺鱗狀上皮癌(lung squamous cell carcinoma)、卵巢癌、胚芽細胞瘤、神經膠細胞瘤、胚細胞腫瘤、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、骨與軟組織腫瘤(原發性骨腫瘤(骨肉瘤、軟骨肉瘤)、軟組織肉瘤))、食道癌等癌高表達，使癌細胞之浸潤能力或轉移能力亢進(非專利文獻5至非專利文獻17)。因此已啟示：藉由阻礙癌細胞上之平足蛋白與血小板上之CLEC-2的結合，而抑制腫瘤塊之形成或栓塞之形成，進而能夠藉由抑制腫瘤增殖、上皮間質轉化(EMT)、血管新生而抑制轉移灶之形成，且能夠預防癌相關之血栓症(非專利文獻1、非專利文獻4)。關於靜脈血栓症，已知於血管壁中平足蛋白之表達受到促進，亦報告有血栓之存在引起炎症，故而藉由預防血栓而能夠期待炎症之預防(非專利文獻4、非專利文獻18)。進而，期待能夠抑制上述癌之浸潤或轉移。

此種狀況下，正推進阻礙癌細胞上之平足蛋白與血小板上之CLEC-2的結合之新治療藥之開發。關於該新治療藥之一，已建立有作為以PLAG4結構域為目標之抗人平足蛋白抗體之PG4D2抗體(IgG2a亞型)(非專利文獻1、專利文獻1)。該抗體係平衡解離常數(K_D )為0.3nM以下之結合活性非常強之抗體，另外，關於該抗體，亦確認到抑制平足蛋白陽性腫瘤細胞依賴性之血小板凝聚或轉移之發生頻率的活性。然而，該PG4D2抗體係對小鼠進行免疫而得之小鼠PG4D2抗體，尚未確立人源化抗體及小鼠-人嵌合抗體。小鼠抗體係於人類之活體內(in vivo)之半生期相對較短。另外，小鼠抗體係對於人類而言免疫原性高，因此在人類中之治療價值受到限定。小鼠抗體若長期間或數次投予，則擔心引起對患者造成非理想之過敏性反應之風險般的免疫反應。因此，該技術領域中，存在有人源化抗體或小鼠-人嵌合抗體之必要性。 [先前技術文獻] [專利文獻]

專利文獻1：國際公開2017/010463號。 [非專利文獻]

非專利文獻1：醫學之腳步，265(1)，60-65(2018)。非專利文獻2：日本血栓止血學會雜誌，27(1)，3-10(2016)。非專利文獻3：日本血栓止血學會雜誌，27(1)，11-17(2016)。非專利文獻4：日本血栓止血學會雜誌，28(4)，518-526(2017)。非專利文獻5：「30 對骨肉瘤之高感度抗平足蛋白抗體之樹立」，[2019年1月21日檢索]，網際網路>URL:https://www.jstage.jst.go.jp/article/jsmtmr/30/0/30_70/_pdf>。非專利文獻6：組織病理學(Histopathology)，Apr；46(4)：396-402(2005)。非專利文獻7：人類病理學(Hum. Pathol.)，Apr；36(4)：372-80(2005)。非專利文獻8：腫瘤生物學(Tumour Biol.)，Jul-Aug；26(4)：195-200(2005)。非專利文獻9：美國病理學期刊(Am. J. Pathol.)，Mar；166(3)：913-21(2005)。非專利文獻10：神經病理學報(Acta Neuropathol.)，May；111(5)：483-8(2006)。非專利文獻11：癌細胞(Cancer Cell)，Apr；9(4)：261-72(2006)。非專利文獻12：神經病理學報(Acta Neuropathol.)，Jan；113(1)：87-94(2007)。非專利文獻13：國際癌症期刊(Int. J. Cancer)，Jun1；134(11)：2605-14(2014)。非專利文獻14：國際病理學(Pathol. Int.)，Mar；60(3)：193-202(2010)。非專利文獻15：腫瘤學報告(Oncol. Rep.)，Mar；25(3)：599-607(2011)。非專利文獻16：美國病理學期刊(Am. J. Pathol.)，Aug；179(2)：1041-9(2011)。非專利文獻17：免疫診斷與免疫療法中之單株抗體(Monoclon. Antib. Immunodiagn. Immunother.)，Jun；34(3)：154-61(2015)。非專利文獻18：血液(Blood)，Apr 6；129(14)：1896-1898(2017)。

[發明所欲解決之課題]

本發明之課題在於提供一種抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段，該抗平足蛋白抗體係人源化抗體或小鼠-人嵌合抗體。 [用以解決課題的手段]

本發明者等人進行了潛心研究，結果發現，藉由使用預定之序列將小鼠PG4D2抗體進行人源化或小鼠-人嵌合化而能夠解決前述課題，從而完成了本發明。本發明係如以下所示。

本發明係一種抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段，該抗平足蛋白抗體係包含下述胺基酸序列，且經單離之人源化抗體或小鼠-人嵌合抗體。其中，下述重鏈之CDR(Complementarity Determining Region；互補性決定區)1至CDR3及輕鏈之CDR1至CDR3之胺基酸序列亦可分別為與下述序列編號1至序列編號6所表示之胺基酸序列具有90%以上之一致性的胺基酸序列。重鏈之CDR1之胺基酸序列為序列編號1之胺基酸序列；重鏈之CDR2之胺基酸序列為序列編號2之胺基酸序列；重鏈之CDR3之胺基酸序列為序列編號3之胺基酸序列；輕鏈之CDR1之胺基酸序列為序列編號4之胺基酸序列；輕鏈之CDR2之胺基酸序列為序列編號5之胺基酸序列；並且，輕鏈之CDR3之胺基酸序列為序列編號6之胺基酸序列。

前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段係以下述情況作為較佳態樣：為人源化抗體，且可變區包含下述(I)或(II)之胺基酸序列。其中，於下述(I)中，下述重鏈之FR(Framework Region；骨架區)1至FR4及輕鏈之FR1至FR4之胺基酸序列亦可分別為與下述序列編號7至序列編號14所表示之胺基酸序列具有90%以上之一致性的胺基酸序列，於下述(II)中，下述重鏈之FR1至FR4及輕鏈之FR1至FR4之胺基酸序列亦可分別為與下述序列編號7、序列編號15、序列編號16、序列編號10至序列編號14所表示之胺基酸序列具有90%以上之一致性的胺基酸序列。 (I)：重鏈之CDR1之胺基酸序列為序列編號1之胺基酸序列；重鏈之CDR2之胺基酸序列為序列編號2之胺基酸序列；重鏈之CDR3之胺基酸序列為序列編號3之胺基酸序列；輕鏈之CDR1之胺基酸序列為序列編號4之胺基酸序列；輕鏈之CDR2之胺基酸序列為序列編號5之胺基酸序列；輕鏈之CDR3之胺基酸序列為序列編號6之胺基酸序列；重鏈之FR1之胺基酸序列為序列編號7之胺基酸序列；重鏈之FR2之胺基酸序列為序列編號8之胺基酸序列；重鏈之FR3之胺基酸序列為序列編號9之胺基酸序列；重鏈之FR4之胺基酸序列為序列編號10之胺基酸序列；輕鏈之FR1之胺基酸序列為序列編號11之胺基酸序列；輕鏈之FR2之胺基酸序列為序列編號12之胺基酸序列；輕鏈之FR3之胺基酸序列為序列編號13之胺基酸序列；並且，輕鏈之FR4之胺基酸序列為序列編號14之胺基酸序列。 (II)：重鏈之CDR1之胺基酸序列為序列編號1之胺基酸序列；重鏈之CDR2之胺基酸序列為序列編號2之胺基酸序列；重鏈之CDR3之胺基酸序列為序列編號3之胺基酸序列；輕鏈之CDR1之胺基酸序列為序列編號4之胺基酸序列；輕鏈之CDR2之胺基酸序列為序列編號5之胺基酸序列；輕鏈之CDR3之胺基酸序列為序列編號6之胺基酸序列；重鏈之FR1之胺基酸序列為序列編號7之胺基酸序列；重鏈之FR2之胺基酸序列為序列編號15之胺基酸序列；重鏈之FR3之胺基酸序列為序列編號16之胺基酸序列；重鏈之FR4之胺基酸序列為序列編號10之胺基酸序列；輕鏈之FR1之胺基酸序列為序列編號11之胺基酸序列；輕鏈之FR2之胺基酸序列為序列編號12之胺基酸序列；輕鏈之FR3之胺基酸序列為序列編號13之胺基酸序列；並且，輕鏈之FR4之胺基酸序列為序列編號14之胺基酸序列。

前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段係以下述情況作為較佳態樣：為小鼠-人嵌合抗體，且可變區包含下述胺基酸序列。其中，下述重鏈之FR1至FR4及輕鏈之FR1至FR4之胺基酸序列亦可分別為與下述序列編號17至序列編號24所表示之胺基酸序列具有90%以上之一致性的胺基酸序列。重鏈之CDR1之胺基酸序列為序列編號1之胺基酸序列；重鏈之CDR2之胺基酸序列為序列編號2之胺基酸序列；重鏈之CDR3之胺基酸序列為序列編號3之胺基酸序列；輕鏈之CDR1之胺基酸序列為序列編號4之胺基酸序列；輕鏈之CDR2之胺基酸序列為序列編號5之胺基酸序列；輕鏈之CDR3之胺基酸序列為序列編號6之胺基酸序列；重鏈之FR1之胺基酸序列為序列編號17之胺基酸序列；重鏈之FR2之胺基酸序列為序列編號18之胺基酸序列；重鏈之FR3之胺基酸序列為序列編號19之胺基酸序列；重鏈之FR4之胺基酸序列為序列編號20之胺基酸序列；輕鏈之FR1之胺基酸序列為序列編號21之胺基酸序列；輕鏈之FR2之胺基酸序列為序列編號22之胺基酸序列；輕鏈之FR3之胺基酸序列為序列編號23之胺基酸序列；並且，輕鏈之FR4之胺基酸序列為序列編號24之胺基酸序列。

前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段係以下述情況作為較佳態樣：前述抗平足蛋白抗體包含人IgG(immunoglobulin G；免疫球蛋白G)抗體之恆定區。

另外，本發明提供一種平足蛋白與CLEC-2之結合阻礙劑，係含有前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段。

另外，本發明提供一種醫藥組成物，係含有前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段。前述醫藥組成物係以用於抑制癌細胞之增殖或轉移作為較佳態樣。另外，前述醫藥組成物係以用於抑制血小板凝聚、抗血栓或抗炎症作為較佳態樣。另外，前述醫藥組成物係以下述情況作為較佳態樣：前述癌細胞為平足蛋白陽性之腫瘤細胞。

另外，本發明提供一種編碼前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段的蛋白質部分之DNA(Deoxyribonucleic acid；去氧核糖核酸)。另外，本發明提供一種重組載體，係含有前述DNA。另外，本發明提供一種宿主細胞，係含有前述DNA或前述重組載體。 [發明功效]

根據本發明，能夠提供一種抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段，該抗平足蛋白抗體係人源化抗體或小鼠-人嵌合抗體。該抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段具有阻礙癌細胞上之平足蛋白與血小板上之CLEC-2之結合的作用，故而作為例如用於抑制癌細胞之增殖或轉移、抑制血小板凝聚、抗血栓、或抗炎症之醫藥組成物而有用。

以下，對本發明加以詳細說明。另外，本說明書中之抗體之胺基酸序列係由Kabat所定義。

本發明係一種抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段，該抗平足蛋白抗體係包含下述胺基酸序列，且經單離之人源化抗體(包含完全人類抗體)或小鼠-人嵌合抗體。重鏈之CDR1之胺基酸序列為序列編號1之胺基酸序列；重鏈之CDR2之胺基酸序列為序列編號2之胺基酸序列；重鏈之CDR3之胺基酸序列為序列編號3之胺基酸序列；輕鏈之CDR1之胺基酸序列為序列編號4之胺基酸序列；輕鏈之CDR2之胺基酸序列為序列編號5之胺基酸序列；並且，輕鏈之CDR3之胺基酸序列為序列編號6之胺基酸序列。

前述重鏈之CDR1至CDR3及輕鏈之CDR1至CDR3之胺基酸序列亦可分別為與前述序列編號1至序列編號6所表示之胺基酸序列具有90%以上，較佳為95%以上之一致性的胺基酸序列。亦即，對於前述重鏈之CDR1至CDR3及輕鏈之CDR1至CDR3之胺基酸序列而言，只要這些胺基酸序列所構成之抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段的抗原結合活性，與前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段實質上相同，則亦可分別為與前述序列編號1至序列編號6所表示之胺基酸序列具有90%以上，較佳為95%以上之一致性的胺基酸序列。另外，對於前述重鏈之CDR1至CDR3及輕鏈之CDR1至CDR3之胺基酸序列而言，只要這些胺基酸序列所構成之抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段具有阻礙平足蛋白與存在於血小板上之CLEC-2之結合的活性，則亦可分別為與前述序列編號1至序列編號6所表示之胺基酸序列具有90%以上，較佳為95%以上之一致性的胺基酸序列。所謂與預定之胺基酸序列具有預定之一致性的胺基酸序列，為於該預定之胺基酸序列中進行替換、缺失、插入或添加而得之胺基酸序列。

該替換較佳為保守性替換。所謂「保守性替換」，係指以實質上不改變肽的活性之方式，對胺基酸殘基以其他化學上類似之胺基酸殘基進行替換。例如可列舉：某疏水性殘基經另一疏水性殘基替換之情形、某極性殘基經具有相同電荷之另一極性殘基替換之情形等。關於能夠進行此種替換之功能上類似之胺基酸之例，作為非極性(疏水性)胺基酸，可列舉丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、脯胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸等。作為極性(中性)胺基酸，可列舉甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、半胱胺酸等。作為具有陽電荷之(鹼性)胺基酸，可列舉精胺酸、組胺酸、離胺酸等。另外，作為具有負電荷之(酸性)胺基酸，可列舉天冬胺酸、麩胺酸等。

所謂本發明之「經單離」，意指並非存在於生體內。例如，不包含由某個體所產生且存在於該個體內之狀態之抗體。

本發明之「人源化抗體」係可變區由公知之源自小鼠PG4D2抗體的互補性決定區與源自人類抗體的骨架區所構成，恆定區由源自人類抗體的恆定區所構成之抗體。前述人類抗體的亞型只要發揮本發明之效果，則並無特別限制，較佳為IgG，更佳為IgG4。作為恆定區的胺基酸序列，例如為該IgG4抗體的恆定區之胺基酸序列，重鏈之胺基酸序列可列舉序列編號25之胺基酸序列，輕鏈之胺基酸序列可列舉序列編號26之胺基酸序列。另外，本發明之「人源化抗體」亦可為「完全人類抗體」。

本發明之「小鼠-人嵌合抗體」係可變區為公知之源自小鼠PG4D2抗體的可變區，恆定區為源自人類抗體的恆定區。前述人類抗體的亞型只要發揮本發明之效果，則並無特別限制，較佳為IgG，更佳為IgG4。作為恆定區的胺基酸序列，例如為該IgG4抗體的恆定區的胺基酸序列，與上述相同，重鏈之胺基酸序列可列舉序列編號25之胺基酸序列，輕鏈之胺基酸序列可列舉序列編號26之胺基酸序列。

本發明中所謂「包含抗原結合區域之抗體片段」，係指包含抗體的一部分之蛋白質，且能夠與抗原結合。作為抗體片段之例，可列舉F(ab’)₂ 、Fab’、抗原結合片段(Fragment of antigen binding；Fab)、抗體可變區(variable fragment of antibody；Fv)、二硫鍵Fv、單鏈抗體(single-chain variable fragment；scFv)及這些之聚合物等。該抗體片段亦可以化學方式或基因工程學方式與聚乙二醇(polyethyleneglycol；PEG)等非肽性聚合物、放射性物質、毒素、低分子化合物、細胞激素、生長因子、白蛋白(albumin)、酵素、其他抗體等功能分子結合。

前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段只要發揮本發明之效果，則較佳為人源化抗體，且較佳為可變區包含下述(I)或(II)之胺基酸序列。 (I)：重鏈之CDR1之胺基酸序列為序列編號1之胺基酸序列；重鏈之CDR2之胺基酸序列為序列編號2之胺基酸序列；重鏈之CDR3之胺基酸序列為序列編號3之胺基酸序列；輕鏈之CDR1之胺基酸序列為序列編號4之胺基酸序列；輕鏈之CDR2之胺基酸序列為序列編號5之胺基酸序列；輕鏈之CDR3之胺基酸序列為序列編號6之胺基酸序列；重鏈之FR1之胺基酸序列為序列編號7之胺基酸序列；重鏈之FR2之胺基酸序列為序列編號8之胺基酸序列；重鏈之FR3之胺基酸序列為序列編號9之胺基酸序列；重鏈之FR4之胺基酸序列為序列編號10之胺基酸序列；輕鏈之FR1之胺基酸序列為序列編號11之胺基酸序列；輕鏈之FR2之胺基酸序列為序列編號12之胺基酸序列；輕鏈之FR3之胺基酸序列為序列編號13之胺基酸序列；並且，輕鏈之FR4之胺基酸序列為序列編號14之胺基酸序列。 (II)：重鏈之CDR1之胺基酸序列為序列編號1之胺基酸序列；重鏈之CDR2之胺基酸序列為序列編號2之胺基酸序列；重鏈之CDR3之胺基酸序列為序列編號3之胺基酸序列；輕鏈之CDR1之胺基酸序列為序列編號4之胺基酸序列；輕鏈之CDR2之胺基酸序列為序列編號5之胺基酸序列；輕鏈之CDR3之胺基酸序列為序列編號6之胺基酸序列；重鏈之FR1之胺基酸序列為序列編號7之胺基酸序列；重鏈之FR2之胺基酸序列為序列編號15之胺基酸序列；重鏈之FR3之胺基酸序列為序列編號16之胺基酸序列；重鏈之FR4之胺基酸序列為序列編號10之胺基酸序列；輕鏈之FR1之胺基酸序列為序列編號11之胺基酸序列；輕鏈之FR2之胺基酸序列為序列編號12之胺基酸序列；輕鏈之FR3之胺基酸序列為序列編號13之胺基酸序列；並且，輕鏈之FR4之胺基酸序列為序列編號14之胺基酸序列。

於前述(I)中，前述重鏈之FR1至FR4及輕鏈之FR1至FR4之胺基酸序列亦可分別為與前述序列編號7至序列編號14所表示之胺基酸序列具有90%以上，較佳為95%以上之一致性的胺基酸序列，於前述(II)中，前述重鏈之FR1至FR4及輕鏈之FR1至FR4之胺基酸序列亦可分別為與前述序列編號7、序列編號15、序列編號16、序列編號10至序列編號14所表示之胺基酸序列具有90%以上，較佳為95%以上之一致性的胺基酸序列。詳細情況與上文已述之內容相同。

另外，前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段如上文已述，只要發揮本發明之效果，則亦較佳為小鼠-人嵌合抗體，且亦較佳為可變區包含下述胺基酸序列。重鏈之CDR1之胺基酸序列為序列編號1之胺基酸序列；重鏈之CDR2之胺基酸序列為序列編號2之胺基酸序列；重鏈之CDR3之胺基酸序列為序列編號3之胺基酸序列；輕鏈之CDR1之胺基酸序列為序列編號4之胺基酸序列；輕鏈之CDR2之胺基酸序列為序列編號5之胺基酸序列；輕鏈之CDR3之胺基酸序列為序列編號6之胺基酸序列；重鏈之FR1之胺基酸序列為序列編號17之胺基酸序列；重鏈之FR2之胺基酸序列為序列編號18之胺基酸序列；重鏈之FR3之胺基酸序列為序列編號19之胺基酸序列；重鏈之FR4之胺基酸序列為序列編號20之胺基酸序列；輕鏈之FR1之胺基酸序列為序列編號21之胺基酸序列；輕鏈之FR2之胺基酸序列為序列編號22之胺基酸序列；輕鏈之FR3之胺基酸序列為序列編號23之胺基酸序列；並且，輕鏈之FR4之胺基酸序列為序列編號24之胺基酸序列。

前述重鏈之FR1至FR4及輕鏈之FR1至FR4之胺基酸序列亦可分別為與前述序列編號17至序列編號24所表示之胺基酸序列具有90%以上，較佳為95%以上之一致性的胺基酸序列。詳細情況與上文已述之內容相同。

本發明之抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段能夠基於構成該結構之胺基酸序列來使用公知之基因工程學方法而製造。另外，於該抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段之製造中，亦可包括將所得之前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段回收之步驟。該回收步驟亦可為精製步驟、濃縮步驟等。該精製步驟中，能夠使用公知之精製技術，亦可精製至本發明之抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段變得均勻為止。

本發明之抗平足蛋白抗體包含多特異性抗體(multispecific antibody)、功能改變抗體、及共軛抗體(conjugate antibody)。作為該抗體之製造方法，可列舉公知之方法。

本發明之另一態樣係一種平足蛋白與CLEC-2之結合阻礙劑(以下有時稱為「本態樣之結合阻礙劑」等)，係含有前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段。另外，本態樣之結合阻礙劑亦可為結合阻礙用組成物。另外，本態樣之結合阻礙劑及結合阻礙用組成物亦可為混合物，該混合物之成分可均勻亦可不均勻。

本態樣之結合阻礙劑具有阻礙平足蛋白與CLEC-2之結合的作用，故而具有藉由阻礙平足蛋白與CLEC-2之結合而獲得之效果。

本態樣之結合阻礙劑可含有前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段中之一種，亦可含有多種。關於前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段相對於本態樣之結合阻礙劑總量的含量，只要阻礙平足蛋白與CLEC-2之結合，則並無特別限定，以前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段之總量計，通常為0.5mg/mL以上，較佳為1mg/mL以上，更佳為10mg/mL以上，另外，通常為500mg/mL以下，較佳為200mg/mL以下，更佳為100mg/mL以下。本態樣之結合阻礙劑之其他詳細情況係援用與後述的「含有前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段的醫藥組成物」有關之記載。

本發明之另一態樣係一種含有前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段的醫藥組成物(以下有時稱為「本態樣之醫藥組成物」等)。本態樣之醫藥組成物具有阻礙平足蛋白與CLEC-2之結合的作用，故而具有藉由阻礙平足蛋白與CLEC-2之結合而獲得之效果。例如可列舉：癌細胞之增殖或轉移之抑制效果、血小板凝聚抑制效果、抗血栓效果、抗炎症效果等。因此，本態樣之醫藥組成物能夠用作用於抑制癌細胞之增殖或轉移、用於抑制血小板凝聚、用於抗血栓或用於抗炎症之醫藥組成物等。

前述癌細胞較佳為平足蛋白陽性之腫瘤細胞。所謂平足蛋白陽性陽性之腫瘤細胞，例如可列舉：間皮瘤、腦腫瘤、睪丸腫瘤、卡波西肉瘤、淋巴管瘤、海綿狀血管瘤、血管肉瘤、肺鱗狀上皮癌、卵巢癌、胚芽細胞瘤、神經膠細胞瘤、胚細胞腫瘤、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、骨與軟組織腫瘤(原發性骨腫瘤(骨肉瘤、軟骨肉瘤)、軟組織肉瘤))、食道癌之細胞等。

因此，本態樣之醫藥組成物能夠用於藉由抑制癌細胞之增殖或轉移、抑制血小板凝聚、抗血栓、抗炎症等而可預防或治療之疾病的預防或治療。「治療」包含改善。作為該疾病，例如可列舉：間皮瘤、腦腫瘤、睪丸腫瘤、卡波西肉瘤、淋巴管瘤、海綿狀血管瘤、血管肉瘤、肺鱗狀上皮癌、卵巢癌、胚芽細胞瘤、神經膠細胞瘤、胚細胞腫瘤、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、骨與軟組織腫瘤(原發性骨腫瘤(骨肉瘤、軟骨肉瘤)、軟組織肉瘤))、食道癌等。

本態樣之醫藥組成物含有前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段。亦即，本態樣之醫藥組成物可含有前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段中之一種，亦可含有多種。

本態樣之醫藥組成物之投予形態並無特別限制，能夠以經口投予或非經口投予之方式投予。作為非經口投予，例如可列舉：靜脈注射、肌肉注射、皮下投予、直腸投予、經皮投予、腦內投予、脊髓內投予、其他局部投予。

用於經口投予及非經口投予之劑型及其製備方法係發明所屬技術領域中具有通常知識者所周知，能夠藉由將前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段與藥學上容許之攜帶體(carrier)等調配而製造醫藥組成物。

用於非經口投予之劑型可列舉：注射用製劑、外用劑、栓劑、吸入劑、眼劑、眼軟膏劑、滴鼻劑、滴耳劑、微脂粒劑等。作為注射用製劑，例如可列舉：點滴注射劑、靜脈注射劑、肌肉注射劑、皮下注射劑、皮內注射劑、腦內投予製劑、脊髓內投予製劑等。作為外用劑，例如可列舉：軟膏劑、糊劑、洗劑等。尤其於欲直接作用於中樞神經組織之情形時，能夠利用滲透壓泵之醫療用微泵持續地注入，亦能夠與血纖維蛋白膠等混合製成緩釋製劑後留置於患部組織。其中，例如注射用製劑通常係將抗體溶解於注射用蒸餾水而製備，視需要能夠添加助溶劑、緩衝劑、pH調整劑、等張劑、鎮痛劑、保存劑、穩定劑等。另外，亦能夠製成使用時製備用之冷凍乾燥製劑。

用於經口投予之劑型可列舉固體或液體之劑型，具體可列舉錠劑、包覆錠劑、丸劑、微粒劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑、糖漿劑、乳劑、懸浮劑、注射劑、含劑等。

本態樣之醫藥組成物亦可進而含有於治療上有效之其他藥劑，另外，視需要亦能夠調配殺菌劑、消炎劑、維生素類、胺基酸等成分。

作為藥理學上容許之攜帶體，例如可列舉：固形製劑中之賦形劑、潤滑劑、結合劑及崩解劑；或液狀製劑中之溶劑、助溶劑、懸浮劑、等張劑、緩衝劑及鎮痛劑等。進而，視需要亦能夠適當地適量使用通常之防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甜味劑、吸附劑、濕潤劑等添加物。

本態樣之醫藥組成物之投予量例如係由醫師根據投予路徑、疾病之種類、症狀之程度、患者之年齡、性別、體重、疾病之嚴重程度、藥物動態及毒物學特徵等藥理學見解、有無利用藥物遞送系統、以及是否作為其他藥物之組合之一部分而投予等各種因素而決定。

本態樣之醫藥組成物能夠以經口或非經口之方式投予。於非經口投予之情形時，能夠以靜脈內注入、皮下注入、肌肉注入、腹腔注入、內皮投予、局部投予、鼻內投予、肺內投予及直腸內投予等方式投予，但不限定於這些。投予量並無特別限制，通常為每一天約0.01μg/kg至約1000mg/kg，較佳為每一天約0.01mg/kg至約100mg/kg，進而較佳為每一天約0.1mg/kg至約20mg/kg。醫藥組成物係能夠以每天、一週1次、一個月1次至4次、或一年1次至7次等的間隔而投予，但不限定於這些。

本態樣之醫藥組成物可單獨投予，亦可與其他醫藥組成物或醫藥併用，例如亦可與用於預防或治療間皮瘤、腦腫瘤、睪丸腫瘤、卡波西肉瘤、淋巴管瘤、海綿狀血管瘤、血管肉瘤、肺鱗狀上皮癌、卵巢癌、胚芽細胞瘤、神經膠細胞瘤、胚細胞腫瘤、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、骨與軟組織腫瘤(原發性骨腫瘤(骨肉瘤、軟骨肉瘤)、軟組織肉瘤))、食道癌之醫藥組成物或醫藥等併用。

另外，本發明包含下述態樣。 [1]一種抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段之用途，係用於製造平足蛋白與CLEC-2之結合阻礙劑或用以阻礙平足蛋白與CLEC-2之結合的組成物。 [2]一種抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段，係用於藉由阻礙平足蛋白與CLEC-2之結合而可預防或治療之疾病的預防或治療之用途。 [3]一種藉由阻礙平足蛋白與CLEC-2之結合而可預防或治療之疾病的預防方法或治療方法，係包含：將前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段之預防有效量或治療有效量投予給需要預防或治療之人或患者。 [4]一種抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段之用途，係用於阻礙平足蛋白與CLEC-2之結合。 [5]一種抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段，係用於阻礙平足蛋白與CLEC-2之結合。 [6]一種阻礙平足蛋白與CLEC-2之結合之方法，係包括：將(i)前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段、(ii)平足蛋白與CLEC-2之結合阻礙劑、或(iii)用以阻礙平足蛋白與CLEC-2之結合的組成物投予給人之階段。

本發明之另一態樣係一種編碼前述抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段的蛋白質部分之DNA。編碼前述抗平足蛋白抗體的蛋白質部分之DNA的鹼基序列，若是發明所屬技術領域中具有通常知識者就能夠基於該蛋白質之胺基酸序列容易地設計。作為具體例，可列舉記載於實施例之核苷酸序列(序列編號27至序列編號52)。另外，於本態樣之DNA亦可添加編碼訊息肽之序列或Kozak序列(Kozak consensus sequence；科扎克共有序列)。本態樣之DNA能夠使用公知之基因工程學方法而製造。

本發明之另一態樣係一種重組載體，係含有前述DNA。作為本態樣之重組載體，可為公知之載體，能夠列舉質體載體、病毒載體。亦可為於大腸桿菌般之原核細胞中可表達之載體，但較佳為於真核細胞中可表達之載體，更佳為於源自哺乳動物之細胞中可表達之載體。

本發明之另一態樣係一種宿主細胞(轉形體)，係含有前述DNA或前述重組載體。本態樣之宿主細胞係導入前述DNA或前述重組載體並轉形而成。作為本態樣之宿主細胞，可為公知之細胞，例如亦可為大腸桿菌、枯草桿菌般之原核細胞，但較佳為真核細胞，更佳為源自哺乳動物之細胞。

作為前述宿主細胞，例如可列舉CHO(Chinese Hamster Ovary；中國倉鼠卵巢)細胞(作為其系統之CHO-S細胞等)等，作為於該細胞進行表達之載體，例如可列舉Freedom(註冊商標)pCHO 1.0(賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific))等。 [實施例]

以下使用實施例對本發明進行具體說明，但本發明不限定於這些實施例。

[實施例1] (作為抗平足蛋白抗體之人源化抗體的胺基酸序列之決定) 為了改變小鼠PG4D2抗體而製作人源化抗體，使用作為抗體資料庫之IMGT(the international ImMunoGeneTics information system；國際免疫遺傳學資訊系統)及Abysis資料庫(Abysis database)，藉由Kabat編號而決定小鼠PG4D2抗體的重鏈及輕鏈之各CDR及各FR區域。繼而，使用IMGT資料庫，自重鏈及輕鏈之FR區域的序列中分別選定與該胺基酸序列一致性高之人類生殖細胞系(germline，GL)的FR區域。使用FR重排(shuffling)之方法，對FR1至FR4分別選定胺基酸一致性最高之FR序列，決定FR1至FR4之組合。對於重鏈及輕鏈，分別於所選定之人類生殖細胞系的FR區域移植小鼠PG4D2抗體的互補性決定區，設計成人源化抗體的候選序列。進而，基於下述研究而決定兩種人源化抗體K4、K5之胺基酸序列：是否將預定之胺基酸殘基全部完全地保留；FR區域的等電點(pI)是否明顯不高；所選定之GL的FR序列的使用頻率是否明顯不低；是否不具有化學修飾部位；關於與小鼠PG4D2抗體比較而未保留之胺基酸殘基，就胺基酸側鏈的疏水性、體積及物理化學性質之三個觀點而言，是否具有兩個以上性質不同之殘基；胺基酸序列一致性是否高等。亦即，人源化抗體K4、人源化抗體K5並非將小鼠PG4D2抗體的重鏈及輕鏈之各FR區域之胺基酸序列簡單地替換而獲得。

[製造例1]作為抗平足蛋白抗體之人源化抗體之製造將所製造之人源化抗體K4、人源化抗體K5之各胺基酸序列示於以下。關於人源化抗體K4之胺基酸序列，可變區為重鏈之CDR1：序列編號1之胺基酸序列、重鏈之CDR2：序列編號2之胺基酸序列、重鏈之CDR3：序列編號3之胺基酸序列、輕鏈之CDR1：序列編號4之胺基酸序列、輕鏈之CDR2：序列編號5之胺基酸序列、輕鏈之CDR3：序列編號6之胺基酸序列、重鏈之FR1：序列編號7之胺基酸序列、重鏈之FR2：序列編號8之胺基酸序列、重鏈之FR3：序列編號9之胺基酸序列、重鏈之FR4：序列編號10之胺基酸序列、輕鏈之FR1：序列編號11之胺基酸序列、輕鏈之FR2：序列編號12之胺基酸序列、輕鏈之FR3：序列編號13之胺基酸序列、輕鏈之FR4：序列編號14之胺基酸序列，恆定區為人IgG4抗體的胺基酸序列，該恆定區的重鏈之胺基酸序列為序列編號25之胺基酸序列，該恆定區的輕鏈之胺基酸序列為序列編號26之胺基酸序列。

關於人源化抗體K5之胺基酸序列，可變區為重鏈之CDR1：序列編號1之胺基酸序列、重鏈之CDR2：序列編號2之胺基酸序列、重鏈之CDR3：序列編號3之胺基酸序列、輕鏈之CDR1：序列編號4之胺基酸序列、輕鏈之CDR2：序列編號5之胺基酸序列、輕鏈之CDR3：序列編號6之胺基酸序列、重鏈之FR1：序列編號7之胺基酸序列、重鏈之FR2：序列編號15之胺基酸序列、重鏈之FR3：序列編號16之胺基酸序列、重鏈之FR4：序列編號10之胺基酸序列、輕鏈之FR1：序列編號11之胺基酸序列、輕鏈之FR2：序列編號12之胺基酸序列、輕鏈之FR3：序列編號13之胺基酸序列、輕鏈之FR4：序列編號14之胺基酸序列，恆定區與上述人源化抗體K4的恆定區的胺基酸序列相同。

另外，作為編碼上述各胺基酸序列之核苷酸序列，使用下述序列之核苷酸序列。作為編碼序列編號1至序列編號16之胺基酸序列之核苷酸序列，分別使用序列編號27至序列編號42之核苷酸序列。作為編碼序列編號25(重鏈之恆定區)之胺基酸序列之核苷酸序列，使用序列編號43的核苷酸序列，並且作為編碼序列編號26(輕鏈之恆定區)之胺基酸序列之核苷酸序列，使用序列編號44之核苷酸序列。

為了於CHO細胞(賽默飛世爾科技)進行表達，採用Freedom(註冊商標)pCHO 1.0(賽默飛世爾科技)作為表達載體。

將表達人源化抗體K4及人源化抗體K5之CHO細胞分別溶解後，擴大培養，於攪拌型細胞培養槽中進行10L規模之饋料批式培養(fed-batch culture)。培養條件係設為攪拌速度100rpm、培養溫度37℃、pH值7.0，培養6天至8天後，回收培養液。將回收之培養液精製，獲得人源化抗體K4及人源化抗體K5。另外，所回收之培養液之上清液係用於後述之實施例2、實施例3之測定。

[製造例2]作為抗平足蛋白抗體之小鼠-人嵌合抗體之製造將小鼠-人嵌合抗體chPG4D2的各胺基酸序列示於以下。關於小鼠-人嵌合抗體chPG4D2之胺基酸序列，可變區為重鏈之CDR1：序列編號1之胺基酸序列、重鏈之CDR2：序列編號2之胺基酸序列、重鏈之CDR3：序列編號3之胺基酸序列、輕鏈之CDR1：序列編號4之胺基酸序列、輕鏈之CDR2：序列編號5之胺基酸序列、輕鏈之CDR3：序列編號6之胺基酸序列、重鏈之FR1：序列編號17之胺基酸序列、重鏈之FR2：序列編號18之胺基酸序列、重鏈之FR3：序列編號19之胺基酸序列、重鏈之FR4：序列編號20之胺基酸序列、輕鏈之FR1：序列編號21之胺基酸序列、輕鏈之FR2：序列編號22之胺基酸序列、輕鏈之FR3：序列編號23之胺基酸序列、輕鏈之FR4：序列編號24之胺基酸序列，恆定區與上述人源化抗體K4的恆定區的胺基酸序列相同。

關於小鼠-人嵌合抗體chPG4D2，發明所屬技術領域中具有通常知識者即能夠容易地理解，若設計出編碼上述序列編號1至序列編號6及序列編號17至序列編號24之各胺基酸序列及上述人源化抗體K4的恆定區的各胺基酸序列之各核苷酸，則能夠與製造例1同樣地製造。此時，作為編碼上述各胺基酸序列之核苷酸序列，例如能夠使用下述序列之核苷酸序列。作為編碼序列編號1至序列編號6、序列編號17至序列編號24之胺基酸序列之核苷酸序列，能夠分別使用序列編號27至序列編號32、序列編號45至序列編號52之核苷酸序列。另外，編碼恆定區的胺基酸序列之核苷酸序列能夠使用與製造例1中記載的核苷酸序列相同之核苷酸序列。

將表達小鼠-人嵌合抗體chPG4D2之CHO細胞溶解後，擴大培養，於攪拌型細胞培養槽中進行5L規模之分批培養。培養條件係設為攪拌速度100rpm、培養溫度37℃、pH值7.0，培養7天後，回收培養液。將回收之培養液精製，獲得小鼠-人嵌合抗體chPG4D2。另外，所回收之培養液之上清液係用於後述之實施例2、實施例3之測定。

[實施例2]各抗體的平足蛋白結合活性使用製造例1及製造例2中回收之培養液之上清液，藉由依據專利文獻1所記載之ELISA(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay；酵素連結免疫吸附分析)法之方法測定對平足蛋白PLAG4結構域之結合活性。作為抗原肽，將人平足蛋白PLAG4結構域肽(WT-hPLAG4(金斯瑞(Genscript)，788349-1))固相化，於檢測中，使用山羊抗人IgG Fc(生物素)預吸附二抗(Goat Anti-Human IgG Fc(Biotin)preadsorbed)(艾博抗(Abcam)，ab98618)、及鏈黴親和素/β-Gal共軛物(Streptavidin/β-Gal conjugate)(羅氏醫療診斷(Roche-Diagnostics)，11112481001)。將結果示於表1。另外，結合活性(抗體效價)係將小鼠-人嵌合抗體chPG4D2之情形設為100%而表示。

[表1] 表1

抗體	結合活性(抗體效價)(％)
人源化抗體K4	84.8-171.8
人源化抗體K5	90.0-111.5
小鼠-人嵌合抗體chPG4D2	100

[實施例3]各抗體之CLEC-2與平足蛋白之結合阻礙活性使用製造例1及製造例2中所得之各培養上清液，藉由依據專利文獻1所記載之ELISA法之方法測定CLEC-2與平足蛋白之結合阻礙活性。作為抗原肽，將重組人CLEC-2(Recombinant Human CLEC-2)(R&D，1718-CL-050)固相化，作為與該抗原肽結合之蛋白質，使用重組人平足蛋白Fc嵌合體(Recombinant Human Podoplanin Fc Chimera)(R&D，3670-PL)，於檢測中，使用山羊抗人IgG Fc(生物素)預吸附二抗(Abcam，ab98618)、及鏈黴親和素/β-Gal共軛物(西格瑪(SIGMA)，S3887，羅氏(Roche)，11112481001)。另外，作為陽性對照組，使用小鼠PG4D2抗體(PG4D2)。小鼠PG4D2抗體為由NITE P-02071(PG4D2)之融合瘤所得之單株抗體。將結果示於表2。

[表2] 表2

抗體	IC₅₀ (ng/mL)	阻礙形式
人源化抗體K4	360	完全阻礙
人源化抗體K5	364	完全阻礙
小鼠-人嵌合抗體chPG4D2	406	完全阻礙
小鼠PG4D2抗體(PG4D2)	371±14(平均值(mean)±SD)	完全阻礙

[實施例4]各抗體於活體外之血小板凝聚抑制效果已知若於作為不引起血小板凝聚之細胞株之CH0細胞導入人平足蛋白基因，則會引起血小板凝聚(生物化學期刊(J. Biol. Chem. )，Dec19；278(51)：51599-605(2003))。將人平足蛋白陽性之骨肉瘤細胞株SJSA-1(ATCC CRL-2098)添加至人全血，使用全血血小板凝聚測定裝置WBA CARNA(太陽(TAIYO))而分析各抗體是否抑制受到誘導之血小板凝聚。骨肉瘤細胞株SJSA-1(ATCC CRL-2098)能夠從美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，地址：12301帕克勞大道，羅克維爾，馬裡蘭20852，美國(12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America))獲取。另外，作為使用人源化抗體K4及人源化抗體K5之體系中之陰性對照組，使用人IgG4抗體(中美冠科生物(CrownBio)，C0004)。另外，該活體外分析體系係經過微孔過濾器(micromesh filter)而吸引包含細胞誘導之凝聚塊之全血，測定因凝聚塊所致之堵塞而上升之吸引壓力，由此算出凝聚率。作為陽性對照組，使用小鼠PG4D2抗體(PG4D2)。另外，作為使用小鼠PG4D2抗體之體系中之陰性對照組，使用小鼠IgG2a抗體(西格瑪(Sigma)，M9144)。將結果示於圖1至圖3。人源化抗體K4及人源化抗體K5係與陽性對照組同樣地，濃度依賴性地抑制血小板凝聚。

[實施例5]各抗體之向肺之血行性轉移抑制效果使用血行性轉移模型而分析各抗體之血行性轉移抑制效果，上述血行性轉移模型係自重度複合免疫不全小鼠SCID-Beige(CB17.Cg-Prkdc^scid Lyst^bg-J /CrlCrlj)(日本查爾斯河(Charles River)，雌性，6週齡)之尾靜脈注射人平足蛋白陽性之骨肉瘤細胞株SJSA-1(ATCC CRL-2098)，於20天後測量形成於肺表面之轉移結節數。於SJSA-1細胞注射之前一天，將對照組抗體(人IgG4抗體(中美冠科生物))、人源化抗體K4或人源化抗體K5以尾靜脈路徑投予給各群6隻小鼠，研究對平足蛋白依賴性之實驗性肺轉移造成之影響。將結果示於圖4。藉由事先投予人源化抗體K4或人源化抗體K5，SJSA-1細胞株之肺轉移明顯得到抑制。

[實施例6]各抗體之抗腫瘤效果將人平足蛋白陽性之5×10⁶ 個之骨肉瘤細胞株SJSA-1(ATCC CRL-2098)移植至重度複合免疫不全小鼠SCID-Beige(CB17.Cg-Prkdc^scid Lyst^bg-J /CrlCrlj)(日本查爾斯河，雌性，5週齡)之皮下，製作異種移植小鼠(Xenograft mouse)，評價人源化抗體K4、人源化抗體K5於活體內之抗腫瘤效果。對於K4投予群、K5投予群，分別自移植第一天開始一週2次(第1天、第4天、第8天、第11天、第15天)以5mg/kg投予人源化抗體K4、人源化抗體K5。一週2次進行腫瘤尺寸(1/2長徑×(短徑)² )及體重之測定(n=6)。於終點(經過20天後)進行照片拍攝、摘出之腫瘤之重量測定。另外，作為陰性對照組，使用人IgG4抗體(義翹神州生物技術(Sino Biological)，HG4K)。將結果(移植後之天數與腫瘤尺寸之平均之關係)示於圖5(根據克魯斯卡沃利斯(Kruskal-Wallis)檢定，*p>0.05，**p>0.01)。於K4投予群、K5投予群中，確認到腫瘤增殖之抑制效果。另外，該試驗時之小鼠之體重顯著性減少係均未確認到。

無。

圖1係表示本發明之實施例中的由小鼠PG4D2抗體所得之活體外(in vitro)的血小板凝聚抑制效果之圖表。圖2係表示本發明之實施例中的由人源化抗體K4所得的活體外之血小板凝聚抑制效果之圖表。圖3係表示本發明之實施例中的由人源化抗體K5所得的活體外之血小板凝聚抑制效果之圖表。圖4係表示本發明之實施例中的由人源化抗體K4或人源化抗體K5所得的向肺之血行性轉移抑制效果之圖表。圖5係表示本發明之實施例中的由人源化抗體K4或人源化抗體K5所得的抗腫瘤效果之圖表。

Claims

一種抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段，該抗平足蛋白抗體係包含下述胺基酸序列，且經單離之人源化抗體或小鼠-人嵌合抗體；其中，下述重鏈之互補性決定區1至互補性決定區3及輕鏈之互補性決定區1至互補性決定區3之胺基酸序列亦可分別為與下述序列編號1至序列編號6所表示之胺基酸序列具有90%以上之一致性的胺基酸序列；重鏈之互補性決定區1之胺基酸序列為序列編號1之胺基酸序列；重鏈之互補性決定區2之胺基酸序列為序列編號2之胺基酸序列；重鏈之互補性決定區3之胺基酸序列為序列編號3之胺基酸序列；輕鏈之互補性決定區1之胺基酸序列為序列編號4之胺基酸序列；輕鏈之互補性決定區2之胺基酸序列為序列編號5之胺基酸序列；並且，輕鏈之互補性決定區3之胺基酸序列為序列編號6之胺基酸序列。
如請求項1所記載之抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段，該抗平足蛋白抗體係人源化抗體，並且，可變區包含下述(I)或(II)之胺基酸序列；其中，於下述(I)中，下述重鏈之骨架區1至骨架區4及輕鏈之骨架區1至骨架區4之胺基酸序列亦可分別為與下述序列編號7至序列編號14所表示之胺基酸序列具有90%以上之一致性的胺基酸序列；於下述(II)中，下述重鏈之骨架區1至骨架區4及輕鏈之骨架區1至骨架區4之胺基酸序列亦可分別為與下述序列編號7、序列編號15、序列編號16、序列編號10至序列編號14所表示之胺基酸序列具有90%以上之一致性的胺基酸序列； (I)：重鏈之互補性決定區1之胺基酸序列為序列編號1之胺基酸序列；重鏈之互補性決定區2之胺基酸序列為序列編號2之胺基酸序列；重鏈之互補性決定區3之胺基酸序列為序列編號3之胺基酸序列；輕鏈之互補性決定區1之胺基酸序列為序列編號4之胺基酸序列；輕鏈之互補性決定區2之胺基酸序列為序列編號5之胺基酸序列；輕鏈之互補性決定區3之胺基酸序列為序列編號6之胺基酸序列；重鏈之骨架區1之胺基酸序列為序列編號7之胺基酸序列；重鏈之骨架區2之胺基酸序列為序列編號8之胺基酸序列；重鏈之骨架區3之胺基酸序列為序列編號9之胺基酸序列；重鏈之骨架區4之胺基酸序列為序列編號10之胺基酸序列；輕鏈之骨架區1之胺基酸序列為序列編號11之胺基酸序列；輕鏈之骨架區2之胺基酸序列為序列編號12之胺基酸序列；輕鏈之骨架區3之胺基酸序列為序列編號13之胺基酸序列；並且，輕鏈之骨架區4之胺基酸序列為序列編號14之胺基酸序列； (II)：重鏈之互補性決定區1之胺基酸序列為序列編號1之胺基酸序列；重鏈之互補性決定區2之胺基酸序列為序列編號2之胺基酸序列；重鏈之互補性決定區3之胺基酸序列為序列編號3之胺基酸序列；輕鏈之互補性決定區1之胺基酸序列為序列編號4之胺基酸序列；輕鏈之互補性決定區2之胺基酸序列為序列編號5之胺基酸序列；輕鏈之互補性決定區3之胺基酸序列為序列編號6之胺基酸序列；重鏈之骨架區1之胺基酸序列為序列編號7之胺基酸序列；重鏈之骨架區2之胺基酸序列為序列編號15之胺基酸序列；重鏈之骨架區3之胺基酸序列為序列編號16之胺基酸序列；重鏈之骨架區4之胺基酸序列為序列編號10之胺基酸序列；輕鏈之骨架區1之胺基酸序列為序列編號11之胺基酸序列；輕鏈之骨架區2之胺基酸序列為序列編號12之胺基酸序列；輕鏈之骨架區3之胺基酸序列為序列編號13之胺基酸序列；並且，輕鏈之骨架區4之胺基酸序列為序列編號14之胺基酸序列。
如請求項1所記載之抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段，該抗平足蛋白抗體係小鼠-人嵌合抗體，並且，可變區包含下述胺基酸序列；其中，下述重鏈之骨架區1至骨架區4及輕鏈之骨架區1至骨架區4之胺基酸序列亦可分別為與下述序列編號17至序列編號24所表示之胺基酸序列具有90%以上之一致性的胺基酸序列；重鏈之互補性決定區1之胺基酸序列為序列編號1之胺基酸序列；重鏈之互補性決定區2之胺基酸序列為序列編號2之胺基酸序列；重鏈之互補性決定區3之胺基酸序列為序列編號3之胺基酸序列；輕鏈之互補性決定區1之胺基酸序列為序列編號4之胺基酸序列；輕鏈之互補性決定區2之胺基酸序列為序列編號5之胺基酸序列；輕鏈之互補性決定區3之胺基酸序列為序列編號6之胺基酸序列；重鏈之骨架區1之胺基酸序列為序列編號17之胺基酸序列；重鏈之骨架區2之胺基酸序列為序列編號18之胺基酸序列；重鏈之骨架區3之胺基酸序列為序列編號19之胺基酸序列；重鏈之骨架區4之胺基酸序列為序列編號20之胺基酸序列；輕鏈之骨架區1之胺基酸序列為序列編號21之胺基酸序列；輕鏈之骨架區2之胺基酸序列為序列編號22之胺基酸序列；輕鏈之骨架區3之胺基酸序列為序列編號23之胺基酸序列；並且，輕鏈之骨架區4之胺基酸序列為序列編號24之胺基酸序列。
如請求項1所記載之抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段，其中前述抗平足蛋白抗體包含人免疫球蛋白G抗體的恆定區。
一種抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段之用途，係將如請求項1所記載之抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段用於製造用以阻礙平足蛋白與C型凝集素樣受體-2之結合的組成物。
一種醫藥組成物，係含有如請求項1所記載之抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段。
一種抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段之用途，係將如請求項1所記載之抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段用於製造用於抑制癌細胞之增殖或轉移之醫藥組成物。
一種抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段之用途，係將如請求項1所記載之抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段用於製造用於抑制血小板凝聚、抗血栓或抗炎症之醫藥組成物。
如請求項7所記載之抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段之用途，其中前述癌細胞為平足蛋白陽性之腫瘤細胞。
一種去氧核糖核酸，係編碼如請求項1所記載之抗平足蛋白抗體或包含該抗平足蛋白抗體的抗原結合區域之抗體片段的蛋白質部分。
一種重組載體，係含有如請求項10所記載之去氧核糖核酸。
一種宿主細胞，係含有如請求項10所記載之去氧核糖核酸。
一種宿主細胞，係含有如請求項11所記載之重組載體。