TW201925192A - Urat1抑制劑的晶型及其製備方法 - Google Patents

Abstract

本發明公開了一種URAT1抑制劑的晶型及其製備方法。

Description

URAT1抑制劑的晶型及其製備方法

本申請要求申請日為2017年11月23日的中國專利申請CN201711181960.2的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。

本發明是關於一種URAT1抑制劑的晶型及其製備方法。

尿酸是動物體內嘌呤類化合物代謝的產物。對人類而言，由於人體內缺乏將尿酸繼續氧化降解的尿酸酶，尿酸在人體內作為嘌呤代謝的最終產物通過腸道和腎臟排出體外，其中腎臟排泄是人體內尿酸排泄的主要途徑。人體內正常的尿酸濃度範圍的上限是：男性400 μmol/L (6.8 mg/dL)，女性360 μmol/L (6 mg/dL)。人體內尿酸水平異常往往是由於尿酸生成的增加或者尿酸排泄的減少。與尿酸水平異常相關的病症有高尿酸血症，痛風等。

高尿酸血症是指人體內嘌呤的物質的新陳代謝發生紊亂，致使人體尿酸的合成增加或排出減少，血液中尿酸水平異常高的病症。痛風性關節炎是指當尿酸在人體血液中濃度超過7 mg/dL時，尿酸以單鈉鹽的形式沉積在關節、軟骨和腎臟中，導致身體免疫系統過度反應（敏感）而造成痛苦的炎症。一般發作部位為大拇趾關節，踝關節，膝關節等。急性痛風發作部位出現紅、腫、熱、劇烈疼痛，一般多在子夜發作，可使人從睡眠中驚醒。痛風初期，發作多見於下肢的關節。高尿酸血症是痛風性關節炎的病理基礎，使用藥物降低血內尿酸濃度是預防痛風性關節炎的常用方法之一。

在歐美，高尿酸血症和痛風疾病的發作呈現上升態勢。流行病學研究表明痛風性關節炎的發病人數占總人口的1-2%，是成年男性最主要的關節炎類型。彭博社預估在2021年將有1770萬痛風患者。在中國，調查顯示在20至74年齡段人口中，25.3%人口血尿酸含量偏高，0.36%人口患有痛風疾病。目前，臨床治療藥物主要包括1) 抑制尿酸生成類藥物，比如黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇和非布索坦；2) 促尿酸排泄類藥物，比如丙磺舒和苯溴馬隆；3) 炎症抑制劑，比如秋水仙鹼等。這些藥物在治療上都有一定的缺陷，療效差，副作用大，花費大是其臨床應用的一些主要瓶頸。據報導，40%-70%患者在接受標準流程治療後，血尿酸的含量沒有達到預期治療目標（＜6mg/dL）。

作為促尿酸排泄劑，其作用機理是通過抑制近曲腎小管刷狀邊緣膜上的URAT1轉運體，減少對尿酸的重吸收。尿酸是體內嘌呤的代謝產物，主要以原形經腎小球濾過，腎小管重吸收和再分泌，最後通過尿液排出體外，極少部分可由腸系膜細胞分泌入腸腔中。近曲腎小管S1段是尿酸重吸收的場所，98%～100%濾過的尿酸在此處通過小管上皮細胞刷狀緣膜上的尿酸轉運體URAT1和有機陰離子轉運體OAT4進入上皮細胞。進入上皮細胞的尿酸再經腎小管基側膜被重吸收入腎小管周圍毛細血管。近曲腎小管S2段是尿酸再分泌的場所，分泌的量約為腎小球濾過量的50%。腎間質中的尿酸首先經過腎小管上皮細胞基側膜上陰離子轉運體OAT1、OAT3進入上皮細胞內。進入上皮細胞的尿酸再經過刷狀緣膜上另一種陰離子轉運體MRP4，排入腎小管腔內。近曲小管的S3段可能是尿酸分泌後的再吸收場所，再吸收的量約為腎小球濾過量的40%，而且與第一步重吸收類似，URAT1可能為關鍵的重吸收轉運體。因此，如果能顯著抑制尿酸鹽轉運體URAT1，將會增強體內尿酸的排泄，從而降低血尿酸水平，降低痛風發作的可能性。

2015年12月，美國FDA批准了第一個URAT1抑制劑Zurampic（Leinurad）。批准了其200mg劑量與黃嘌呤氧化酶抑制劑XOI（如Febuxostat等）聯用用於高尿酸血症和痛風性關節炎的治療，但是聯合用藥與黃嘌呤氧化酶抑制劑單獨用藥對比，其附加效應並不十分顯著。Zurampic 400mg劑量未獲批准，原因在於高劑量下顯著的毒副作用（腎相關的不良事件發生率特別是腎結石的發病率）。因此，FDA要求Zurampic標籤加註黑框警告，警示醫務人員Zurampic引起急性腎衰竭的風險，特別是在不與XOI聯用的情況下更常見，如果超批准劑量使用Zurampic，引起腎衰竭的風險更高。同時，FDA要求Zurampic上市後，阿斯利康繼續進行對腎臟和心血管安全性的考察。所以，開發一種新型的安全的降血尿酸藥物成為該領域的強烈需求。

WO2009070740公開了Leinurad，其結構如下：。

本發明提供了式（Ⅰ）化合物的A晶型，其X射線粉末繞射圖譜在下列2θ角處具有特徵繞射峰：7.50±0.2°，13.04±0.2°，21.43±0.2°。

本發明的一些方案中，上述A晶型的X射線粉末繞射圖譜在下列2θ角處具有特徵繞射峰：7.50±0.2°，9.66±0.2°，13.04±0.2°，14.42±0.2°，17.46±0.2°，18.57±0.2°，21.43±0.2°，26.18±0.2°。

本發明的一些方案中，上述A晶型的XRPD圖譜如圖1所示。

本發明的一些方案中，上述A晶型的XRPD圖譜解析數據如表1所示： 表1：A晶型的XRPD圖譜解析數據

本發明的一些方案中，上述A晶型的差示掃描量熱曲線在169.42±3℃處有一個吸熱峰的起始點。

本發明的一些方案中，上述A晶型的DSC圖譜如圖2所示。

本發明的一些方案中，上述A晶型的熱重分析曲線在100±3℃處失重達0.04491%。

本發明的一些方案中，上述A晶型的TGA圖譜如圖3所示。

本發明還提供了式（Ⅰ）化合物的B晶型，其X射線粉末繞射圖譜在下列2θ角處具有特徵繞射峰：9.88±0.2°，10.56±0.2°，20.38±0.2°。

本發明的一些方案中，上述B晶型的X射線粉末繞射圖譜在下列2θ角處具有特徵繞射峰：9.88±0.2°，10.56±0.2°，12.23±0.2°，13.04±0.2°，14.62±0.2°，17.57±0.2°，20.38±0.2°，26.89±0.2°。

本發明的一些方案中，上述B晶型的XRPD圖譜如圖4所示。

本發明的一些方案中，上述B晶型的XRPD圖譜解析數據如表2所示： 表2：B晶型的XRPD圖譜解析數據

本發明的一些方案中，上述B晶型的差示掃描量熱曲線在163.51±3℃處有一個吸熱峰的起始點。

本發明的一些方案中，上述B晶型的DSC圖譜如圖5所示。

本發明的一些方案中，上述B晶型的熱重分析曲線在120±3℃處失重達0.1191%，從120±3℃到153.60±3℃處失重達0.6282%。

本發明的一些方案中，上述B晶型的TGA圖譜如圖6所示。

技術效果

本發明式（Ⅰ）化合物在穩定轉染URAT1（尿酸轉運蛋白）基因的HEK293細胞系上，對於URAT1介導的¹⁴ C-尿酸的轉運，展現了更優的體外抑制活性；本發明式（Ⅰ）化合物有較好的藥物代謝的穩定性，同時也大大提高了藥物的口服吸收生物利用度；其晶型的溶解度、穩定性較好。因此本發明化合物具有良好的成藥前景。

定義和說明

除非另有說明，本文所用的下列術語和短語旨在含有下列含義。一個特定的短語或術語在沒有特別定義的情況下不應該被認為是不確定的或不清楚的，而應該按照普通的含義去理解。當本文出現商品名時，旨在指代其對應的商品或其活性成分。

本發明的中間體化合物可以通過本領域技術人員所熟知的多種合成方法來製備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其他化學合成方法的結合所形成的實施方式以及本領域技術上人員所熟知的等同替換方式，優選的實施方式包括但不限於本發明的實施例。

本發明具體實施方式的化學反應是在合適的溶劑中完成的，所述的溶劑須適合於本發明的化學變化及其所需的試劑和物料。為了獲得本發明的化合物，有時需要本領域技術人員在已有實施方式的基礎上對合成步驟或者反應流程進行修改或選擇。

下面會通過實施例具體描述本發明，這些實施例並不意味著對本發明的任何限制。

本發明所使用的所有溶劑是市售的，無需進一步純化即可使用。

本發明所使用的溶劑可經市售獲得。本發明採用下述縮略詞：DCM代表二氯甲烷；DMF 代表N ， N -二甲基甲醯胺；DMSO代表二甲亞碸；EtOH代表乙醇；MeOH代表甲醇；TFA代表三氟乙酸；TsOH代表對甲苯磺酸；mp代表熔點；EtSO₃ H代表乙磺酸；MeSO₃ H代表甲磺酸；ATP代表三磷酸腺苷；HEPES代表4-羥乙基呱嗪乙磺酸；EGTA代表乙二醇雙(2-胺基乙基醚)四乙酸；MgCl₂ 代表二氯化鎂；MnCl₂ 代表二氯化錳；DTT代表二硫蘇糖醇。

粉末X-射線繞射（X-ray powder diffractometer, XRPD） 儀器型號：布魯克D8 advance X-射線繞射儀 測試方法：大約10~20 mg樣品用於XRPD檢測。 詳細的XRPD 參數如下： 光管：Cu, kα, (λ=1.54056 Å). 光管電壓：40 kV，光管電流：40 mA 發散狹縫：0.60 mm 探測器狹縫：10.50 mm 防散射狹縫：7.10 mm 掃描範圍：4-40 deg (或3-40 deg) 步徑：0.02 deg 步長：0.12 秒 樣品盤轉速：15 rpm

差熱分析（Differential Scanning Calorimeter, DSC） 儀器型號：TA Q2000差示掃描量熱儀 測試方法：取樣品（~1 mg）置於DSC鋁鍋內進行測試，在50 mL/min N2條件下，以10℃/min的升溫速率，加熱樣品從25℃到300℃。

熱重分析（Thermal Gravimetric Analyzer, TGA） 儀器型號：TA Q5000IR熱重分析儀 測試方法：取樣品（2~5 mg）置於TGA鉑金鍋內進行測試，在25 mL/min N2條件下，以10℃ /min的升溫速率，加熱樣品從室溫到失重20%。

具體實施方式

為了更好的理解本發明的內容，下面結合具體實施例來做進一步的說明，但具體的實施方式並不是對本發明的內容所做的限制。

實施例1: 式（Ⅰ）化合物的製備

合成路線：

步驟1：化合物2的合成

在三口燒瓶（10 L）中加入二甲基亞碸 4.5 L，在攪拌下加入三級丁醇鉀（836.66 g, 7.46 mol, 2 eq），加畢繼續攪拌10分鐘至溶解澄清，然後用冰水浴冷卻到反應液內溫20-25℃。向上述溶液中滴加化合物1（500.05 g, 3.73 mol, 1 eq）的二甲基亞碸（500 mL）溶液，滴畢，攪拌反應30分鐘，接著向其中滴加二硫化碳（283.86 g, 3.73 mol, 1 eq），滴畢，繼續攪拌反應30分鐘。再向其中滴加溴代乙酸乙酯（1250 g, 7.46 mol, 2 eq），滴畢，繼續攪拌反應2小時。最後加入碳酸鉀（515.52 g, 7.46 mol, 1 eq），升至內溫65℃繼續攪拌反應8小時。反應完畢，將反應液冷卻到室溫。將反應液用乙酸乙酯（10L）稀釋，然後加入1M鹽酸（2 L）和水（2 L）攪拌10分鐘，靜置分液。分出水層，有機相用水（2 L×3）洗滌。合併水層，用乙酸乙酯（3 L）萃取。合併所有有機相，用飽和食鹽水（2 L×2）洗滌。有機相用適量無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，濾液減壓除去溶劑得粗品。以相同規模，平行投料6批，合併後得黑紅色油狀粗品。粗品靜置72小時後有大量固體析出，向其中加入乙醇（2 L），攪拌30分鐘，過濾，收集濾餅並真空乾燥得化合物2。¹ H NMR (400MHz, CDCl₃ ) δ: 4.32 (q,J =7.2 Hz, 2H), 4.19 (q,J =7.2 Hz, 2H), 3.56 (s, 2H), 3.25 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 3.19 (t,J =14.4 Hz, 2H), 2.26-2.17 (m, 2H), 1.37 (t,J =7.2 Hz, 3H), 1.27(t,J =7.2Hz, 3H)；MSm/z= 364.8 [M+H]⁺ 。

步驟2：化合物3的合成

將化合物2（241.00 g, 0.66 mol）溶解在乙醇（1 L）中並置於高壓釜（5 L）中，在氬氣保護下加入雷尼鎳（120 g），然後再補加乙醇（2 L）。裝好高壓釜並用氬氣置換三次，再用氫氣置換三次，充氫氣到釜內壓力2.0MP，攪拌並加熱到釜內溫度85℃反應28小時。停止反應，並將反應體系冷卻到室溫，反應液過濾，濾餅以乙醇沖洗三遍，每次0.5 L。合併濾液，然後旋乾得到化合物3。¹ H NMR (400MHz, CDCl₃ ) δ: 7.09 (s, 1H), 4.26 (q,J =7.2 Hz, 2H), 3.20 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 3.12 (t,J =14.4 Hz, 2H), 2.20-2.10 (m, 2H), 1.30 (t,J =6.8 Hz, 3H)；MSm/z =247.0 [M+H]⁺ 。

步驟3：化合物4的合成

將化合物3（406.2 g, 1.65 mol, 1 eq）溶解在乙腈（6 L）中，然後緩慢加入N -溴代丁二醯亞胺（1484.2 g, 6.60 mol, 4 eq），所得反應液在23~25℃下攪拌反應12小時。反應結束後，將反應液體濃縮到約1.0 L。過濾除去固體，向濾液中加亞硫酸氫鈉飽和溶液（1 L）並攪拌10分鐘。加入酸乙酯，萃取三遍，每次2 L。合併有機相，加入適量無水硫酸鈉乾燥。過濾除去乾燥劑，將濾液減壓濃縮。向殘留物中加入石油醚（3 L），在30℃下充分攪拌30分鐘。過濾，濾餅用石油醚洗5遍，每次200 mL，直至濾餅中沒有產品殘留。合併所有有機相，旋乾得粗品。向粗品中加入石油醚（100 mL），充分攪拌，過濾，收集濾餅並真空乾燥得到化合物4。¹ H NMR (400MHz, CDCl₃ ) δ: 4.24 (q,J =7.2 Hz, 2H), 3.19 (t,J =6.8 Hz, 2H), 2.95 (t,J =14.4 Hz, 2H), 2.17-2.07 (m, 2H), 1.29 (t,J =7.2 Hz, 3H)。

步驟4：化合物5的合成

將化合物4（340.21 g，1.05 mol），環丙基硼酸（108.12 g，1.26mol），無水磷酸鉀（444.98 g，2.10 mol），醋酸鈀（12.03 g，53.58mmol）和2-二環己基磷-2',4',6'-三異丙基聯苯（23.86 g，50.05mmol）加入到甲苯和水的混合溶劑（10:1，3.4 L/340 mL）中，反應瓶用氮氣置換六次後將其置於油浴鍋中。加熱反應液在內溫80℃，並在此溫度下攪拌反應16小時。反應完成後，將反應液冷卻到室溫，向反應液中加入三聚硫氰酸（6.51 g懸浮於乙醇34 mL中）攪拌0.5小時。以類似規模（300.00 g化合物4），平行投料5批，合併處理。過濾，分出有機相，水相用乙酸乙酯（250 mL×2）萃取。合併有機相，加入適量無水硫酸鈉乾燥。過濾除去乾燥劑，將濾液減壓濃縮得到黑色油狀粗品。粗品靜置20小時後有黃色固體析出，向其中加入石油醚（3 L）攪拌1小時。過濾，濾餅真空乾燥得到化合物5。¹ H NMR (400MHz, CDCl₃ ) δ: 4.29 (q,J =7.2 Hz, 2H), 3.23 (t,J =6.4 Hz, 2H), 3.16 (t,J =14.8 Hz, 2H), 2.24-2.18 (m, 2H), 1.95-1.85 (m, 1H), 1.35 (t,J =6.8Hz, 3H), 1.09-1.07 (m, 2H), 0.77-0.75 (m, 2H)。

步驟5：化合物6的合成

將化合物5（619.27 g，2.16 mol）加入到氫氧化鈉（173.55 g，4.33 mol）的乙醇和水的混合溶液（3 L/3 L）中，並將反應液加熱升至內溫60℃攪拌反應3小時。反應完畢，將反應液冷卻到室溫。以類似規模（750.17 g化合物5），平行投料1批，合併處理。合併後的反應液用石油醚（4 L）萃取。分出有機相，有機相用水（1.5 L×2）反洗兩次。合併水相，減壓濃縮除去乙醇。向水相中加水稀釋到13 L，然後緩慢加入稀鹽酸（3 M）調節到pH=2，有大量淡黃色固體析出。過濾，濾餅用水淋洗（3.0 L×2）。抽乾，收集濾餅，經過真空烘箱60℃真空乾燥得到化合物6。¹ H NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 12.79 (brs, 1H), 3.23 (t,J =14.8 Hz, 2H), 3.07 (t,J =6.8 Hz, 2H), 2.27-2.20 (m, 2H), 2.19-2.02 (m, 1H), 1.09-1.04 (m, 2H), 0.68-0.66 (m, 2H)。

步驟6：化合物7的合成

在攪拌下，將化合物6（641.27 g，2.48 mol），三乙胺（754.07 g，7.45 mol）和疊氮磷酸二苯酯（1025.34g，3.73 mol）加入到三級丁醇（6.5 L）中。將反應液置於100℃油浴中加熱16小時。反應完成後冷卻至室溫。以類似規模（650.00 g化合物6），平行投料4批，合併處理。合併反應液，減壓濃縮除去三級丁醇。剩餘黑色殘留物用乙酸乙酯（10 L）溶解，所得乙酸乙酯溶液用氫氧化鈉水溶液（5%，5.0 L×2）洗滌，再用飽和食鹽水（5.0L）洗滌。加入適量無水硫酸鈉乾燥。過濾除去乾燥劑，將濾液減壓濃縮得到棕黑色固體粗品，靜置後有固體析出。將石油醚（8 L）加入到粗品中攪拌2小時。過濾，濾餅用石油醚（1 L）分次淋洗，濾餅經過真空烘箱60℃真空乾燥得到化合物7。¹ H NMR (400MHz, CDCl₃ ) δ: 6.31(brs, 1H), 3.11 (t, J=14.8 Hz, 2H), 2.66 (t, J=6.8 Hz, 2H), 2.23-2.15 (m, 2H), 1.82-1.75 (m, 1H), 1.51 (s, 9H), 0.94-0.90 (m, 2H), 0.68-0.65 (m, 2H)。

步驟7：化合物8的合成

將化合物7（1199.17 g，3.64 mol）加入到乙酸乙酯（2 L）中，攪拌均勻後再加入氯化氫的乙酸乙酯溶液（4 L，16.00 mol，4M）。反應液在15℃反應2.5小時，然後置於40℃溫水浴中繼續反應2小時。反應完成後，有大量暗紅色固體析出。過濾，濾餅用乙酸乙酯（2.0 L）分次淋洗。濾餅經過真空烘箱60℃真空乾燥後得到化合物8。¹ H NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 3.17 (t, J=14.8 Hz, 2H), 2.82 (t, J=6.8 Hz, 2H), 2.25-2.15 (m, 2H), 2.00-1.94 (m, 1H), 0.99-0.95 (m, 2H), 0.58-0.54 (m, 2H)；MSm/z =229.8 [M+H-HCl]⁺ 。

步驟8：化合物9的合成

在3 L三口燒瓶中，將化合物8（301.25 g）加入到四氫呋喃（600 mL）中，冰水浴冷卻下攪拌降至內溫0~10℃。滴加二異丙基乙基胺（635.72 g），滴加完畢後撤去冰水浴，在內溫10~15℃下攪拌約10 分鐘。過濾，濾餅用四氫呋喃洗滌（100 mL× 2）。合併濾液，得到溶液A備用。

將四氫呋喃（2 L）加入裝有硫光氣（257.48 g）的5 L反應瓶中。冰水浴下攪拌冷卻至內溫0~10 ℃，緩慢滴加溶液A，保溫約5.5小時內滴加完畢，繼續攪拌10分鐘。反應完成後過濾，濾餅用四氫呋喃洗滌（150 mL× 2）。合併濾液，減壓濃縮除去溶劑。向殘餘物中加入四氫呋喃（400 mL），溶解得到溶液B備用。

將水合肼（112.94 g）加入到四氫呋喃（2.5 L）中，冰水浴下攪拌冷卻至內溫5~10℃。滴加溶液B，保溫約2小時滴加完畢，繼續攪拌10分鐘。反應完成後，停止反應。撤去冰水浴，加入N,N -二甲基甲醯胺二甲縮醛（333.45 g），加熱至內溫60~65℃，保溫反應3 小時後停止反應。

將反應液旋乾，向殘留物中加入乙酸乙酯（2 L）和純水（1 L），攪拌均勻。用10%氫溴酸調節pH至5~6，繼續攪拌5分鐘，靜置10分鐘。分液，分出水相。有機相用純水（500 mL×2）洗滌。合併水相，用乙酸乙酯（1 L）萃取，合併有機相，加入適量無水硫酸鈉乾燥。過濾除去乾燥劑，濾液減壓濃縮至乾得化合物9粗品。向粗品中加入正庚烷（2.0 L）和三級丁基甲基醚（150 mL），打漿（攪拌轉速550 轉/分鐘）18小時。過濾，濾餅用正庚烷（150 mL）洗滌。收集濾餅，濾餅經過真空烘箱60℃真空乾燥後得化合物9。¹ H NMR (400MHz, CDCl₃ ) δ: 7.82 (s, 1H), 3.20 (t, J=14.8 Hz, 2H), 2.74 (t, J=6.8 Hz, 2H), 2.28-2.10 (m, 2H), 1.98-1.82 (m, 1H), 1.06-1.02 (m, 2H), 0.75-0.71 (m, 2H)； MSm/z =313.9 [M+H]⁺ 。

步驟9：化合物10的合成

將乙腈（3 L）加入5 L三口燒瓶中。攪拌下，先加入化合物9（303.25 g）和碳酸鉀（261.83 g）。再加入2-溴代異丁酸甲酯（203.85 g），用氮氣置換反應體系後，加熱至內溫60~65℃，保溫反應約2小時。反應結束後，停止加熱，攪拌下自然冷卻至15~20℃。過濾，濾餅用乙酸乙酯（100 mL×3）洗滌。合併濾液，減壓濃縮至乾得粗品。粗品經過柱層析（流動相：乙酸乙酯/正庚烷 = 1:5~2:1）純化得化合物10。¹ H NMR (400MHz, CDCl₃ ) δ: 8.20 (s, 1H), 3.68 (s, 3H), 3.19 (t, J=14.4 Hz, 2H), 2.57 (t, J=6.8 Hz, 2H), 2.22-2.12 (m, 2H), 1.93-1.83 (m, 1H), 1.67 (s, 6H), 1.08-1.03 (m, 2H), 0.73-0.69 (m, 2H)；MSm/z =414.0 [M+H]⁺ 。

步驟10：化合物11的合成

在5 L三口燒瓶中加入乙腈（3.17 L）。攪拌下，加入化合物10（317.22 g）和硫羰基二咪唑（26.94 g），保溫16~20℃攪拌5分鐘。加入N -溴代丁二醯亞胺（158.60 g），保溫攪拌約30 分鐘。反應結束後，停止反應。過濾，濾液減壓濃縮得到黑色粗品。粗品經過柱層析（流動相：乙酸乙酯/正庚烷=0~50%）純化得黃色固體粗品340.62 g。此粗品用乙酸乙酯（3.50 L）溶解，再用純水（700 mL×4）洗滌。分出有機相，有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。過濾除去乾燥劑，濾液減壓濃縮至乾得化合物11。¹ H NMR (400MHz, CDCl₃ ) δ: 3.73 (s, 3H), 3.22 (t, J=14.4 Hz, 2H), 2.53 (t, J=6.8 Hz, 2H), 2.24-2.14 (m, 2H), 1.95-1.91 (m, 1H), 1.71 (d, J= 4.4 Hz, 6H), 1.11-1.07 (m, 2H), 0.78-0.74 (m, 2H)；MSm/z =491.7 [M+H]⁺ , 493.7 [M+H+2]⁺ 。

步驟11：式(Ⅰ)化合物的合成

在5 L反應瓶中加入四氫呋喃（1.2 L），攪拌下加入化合物11 (243.03 g)。溶清後，加入純水（1.2 L），然後加入一水合氫氧化鋰（125.46 g），保溫20~25℃攪拌約2.5小時。反應完成後，停止反應。反應液在40℃減壓濃縮除去有機溶劑。殘留物中加入純水（1 L），用三級丁基甲基醚（300 mL）反萃，分出有機相。將水相置於10 L三口瓶中，冰浴降溫至5~10℃。用40%氫溴酸溶液調節其pH至2~3，有大量淡黃色固體析出。繼續攪拌30 分鐘，複測pH為2~3不變。繼續攪拌20分鐘，過濾。濾餅用純水（150 mL×3）洗滌。收集濾餅，加入純水（1500 mL），室溫打漿1小時。過濾，濾餅用純水（150 mL×2）洗滌，收集濾餅，在40℃真空乾燥3小時，得式(Ⅰ)化合物。¹ H NMR (400MHz, CD₃ OD) δ: 3.27 (t, J=15.6 Hz, 2H), 2.60-2.47 (m, 2H), 2.27-2.17 (m, 2H), 2.10-2.03 (m, 1H), 1.68 (d, J=1.2 Hz, 6H), 1.15-1.10 (m, 2H), 0.80-0.71 (m, 2H)；MSm/z =477.99 [M+H]⁺ , 480.1 [M+H+2]⁺ 。

實施例2: 式（Ⅰ）化合物的A晶型的製備

將式（Ⅰ）化合物（50 mg）加入到玻璃瓶中，分別加入甲醇（0.4 mL），攪拌成懸濁液或溶液。將上述懸濁液樣品置於恆溫混勻儀（40℃）中，在40℃下振搖60小時後離心，收集樣品。將上述溶清樣品在室溫下揮發後離心，收集樣品。將上述樣品置於真空乾燥箱中（40℃）乾燥過夜，XRPD檢測其晶型狀態，得到終產物晶型為式（Ⅰ）化合物的A晶型。

將式（Ⅰ）化合物（50 mg）加入到玻璃瓶中，分別加入乙酸乙酯（0.4 mL），攪拌成懸濁液或溶液。將上述懸濁液樣品置於恆溫混勻儀（40℃）中，在40℃下振搖60小時後離心，收集樣品。將上述溶清樣品在室溫下揮發後離心，收集樣品。將上述樣品置於真空乾燥箱中（40℃）乾燥過夜，XRPD檢測其晶型狀態，得到終產物晶型為式（Ⅰ）化合物的A晶型。

實施例3: 式（Ⅰ）化合物的B晶型的製備

將式（Ⅰ）化合物（50 mg）加入到玻璃瓶中，加入四氫呋喃（0.4 mL），攪拌至溶清。將上述溶清樣品在室溫下揮發後離心，收集樣品。收集樣品置於真空乾燥箱中（40℃）乾燥過夜，XRPD檢測其晶型狀態，得到終產物晶型為式（Ⅰ）化合物的B晶型。

實施例4:式（Ⅰ）化合物的A晶型的溶解度試驗

1.稀釋劑及流動相的製備

稀釋劑：準確量取300mL純水和100mL純乙腈，混合於1L玻璃瓶中，超聲脫氣10分鐘後備用。

流動相A：0.1%磷酸水溶液

如：移取2.0 mL磷酸加入到2000 mL水中，超聲10分鐘，混勻，放冷至室溫，作為流動相A。

流動相B：乙腈。

2.對照品溶液的製備（以A晶型自身作為對照樣品）

準確稱取5mg 的A晶型，置於樣品瓶中，加入稀釋劑10mL，超聲5分鐘後，放冷至室溫後混合均勻，標記為工作對照品溶液STD-1。

準確稱取5mg 的A晶型，置於樣品瓶中，加入稀釋劑10mL，超聲5分鐘後，放冷至室溫後混合均勻，標記為工作對照品溶液STD-2。

3.線性溶液的製備

將上述工作對照品溶液STD-1逐級稀釋1倍，10倍，100倍，1000倍和2000倍，記為線性溶液L1，L2，L3，L4和L5。

4.溶解度測試試驗

分別準確稱取6mg的A晶型加入到8mL的玻璃瓶中，然後準確加入3mL不同溶媒（0.1N鹽酸溶液, 0.01N鹽酸溶液，純化水，pH3.8緩衝溶液，pH4.5緩衝溶液，pH5.5緩衝溶液，pH6.0緩衝溶液，pH7.4緩衝溶液，pH6.8緩衝溶液），製成混懸液。在上述混懸液中加入攪拌子，在37℃下避光充分攪拌。攪拌後，pH7.4緩衝溶液和pH6.8緩衝溶液中固體全部溶解，分別準確稱量6mg的A晶型，補加入緩衝溶液中，並再次充分攪拌製備成混懸液。攪拌4小時和24小時後取樣離心，溶液用濾膜過濾後用HPLC測定其濃度，其中，HPLC分析方法如表3所示。 表3：HPLC分析方法

結果如表4所示： 表4：A晶型在9種媒介中的溶解度試驗結果 註：LOQ表示低於檢測限；上述不同pH的緩衝液是指各pH的特定鹽溶液。

結論：式（Ⅰ）化合物的A晶型在高pH值緩衝液中具有較好的溶解度。

測試例1：式（Ⅰ）化合物的體外評價

1. 各工作液的配製

1）用DMSO作為200倍工作液的溶媒，將儲備液稀釋成各給藥濃度的200倍工作液。 晶型A：0、0.002、0.006、0.02、0.06、0.2和0.6 mmol/L； lesinurad：0、0.06、0.2、0.6、2、6和20 mmol/L。

2）用Hanks平衡鹽溶液（無Cl-）作為轉運蛋白URAT1 2倍工作液的溶媒，將1）中200倍工作液稀釋100倍後得到各給藥濃度的2倍工作液。

3）用Hanks平衡鹽溶液（無Cl-）配製藥物轉運蛋白URAT1放標底物的2倍工作液，之後同2）中各濃度2倍工作液等體積混合，混合均勻後備用。

2. 給藥方法

2.1. 攝入型細胞抑制實驗

攝入抑制實驗所用細胞培養基為DMEM培養基添加10% FBS（含青黴素和鏈黴素）。

人藥物轉運體過表達的細胞株（HEK293A-URAT1）及空載體細胞(HEK293A-pcDNA3.1) 經過復甦和傳代培養後，選取生長良好的貼壁細胞用胰酶消化使其分散為單細胞懸液，之後用培養基調節細胞密度至2.0 ~3.0×10⁵ cells/mL，然後將細胞懸液以1 mL/孔的量接種至24孔細胞培養板，在37℃、5%CO₂ 、飽和空氣濕度的培養箱內培養2~3天使細胞長滿各孔。

先移去培養板內培養液，用Hanks緩衝鹽溶液（無Cl-）清洗一次，之後每孔加入37℃ Hanks緩衝鹽溶液（無Cl-）孵育10 min，然後以500 µL含放射性標記的探針底物溶液置換24孔板中Hanks緩衝鹽溶液（無Cl-）開始給藥；給藥結束後（2 min），用各自預冷的緩衝鹽溶液終止反應，並清洗細胞3次；然後每孔添加400 µL 0.1 mmol/L NaOH裂解細胞；取細胞裂解液於閃爍瓶中，添加3 mL的Aquasol-2閃爍液，並用Tri-Carb 2910TR液閃儀測定樣品中的放射性強度。細胞轉運試驗中每個濃度及陽性對照、空白對照（mock）設置3孔（n=3）。

2.2. 數據處理

2.2.1. 抑制作用計算

將僅含放標底物給藥組轉運體細胞的攝入值（扣除本底background組即空載細胞的攝入值U₀ ）定義為100%（control，Uc），以此為標準計算加入待測化合物後各給藥組扣除本底後的攝入值U與control組的攝入值Uc的百分比（%），並計算各濃度對轉運體活性的抑制率（IR），以此表示化合物對轉運體抑制作用的強弱，公式如下： IR =1- [100×(U-U₀ )/(Uc-U₀ )]% 每一給藥濃度設置3個重複（即n=3），Mean ± standard error （SD）用Microsoft® Excel 2010軟體中統計學公式計算。

根據每種轉運體各給藥濃度抑制率（IR），通過Prism5.0 並結合Microsoft® Excel 2010軟體中Forecast函數計算化合物對藥物轉運體轉運活性影響的IC₅₀ 。

2.2.2. 統計學方法

各樣本平均數差異分析採用t-test（p＜0.05視為差異顯著）。

3. 實驗結果

式（Ⅰ）化合物、lesinurad對尿酸轉運體URAT1介導的¹⁴ C-UA攝入具有較為顯著的抑制作用（p ＜0.001），IC₅₀ 分別為0.034 μmol/L和6.01 μmol/L。式（Ⅰ）化合物對URAT1的抑制作用約為參照化合物lesinurad的177倍，抑制效果更為顯著。

測試例2：式（Ⅰ）化合物的藥代動力學評價

實驗目的：式（Ⅰ）化合物單次靜脈注射和灌胃給藥，以及8天重複灌胃給藥後雌雄SD大鼠體內血漿藥代動力學。

實驗過程：

1.本實驗中12隻SD大鼠，雌雄各半，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。按體重相近分成2組，每組3雌3雄，給藥方案及採血方案詳分別見表5、表6： 表5：給藥方案 註：DMSO表示二甲基亞碸；HP-β-CD 表示羥丙基-β-環糊精；MC表示甲基纖維素；IV表示靜脈注射給藥；PO表示灌胃給藥。 表6：採血方案

2.樣品收集及分析方法

實驗動物從頸靜脈穿刺採集血液樣本0.15 mL，立即轉移至貼有標簽的含K₂ -EDTA(0.5 M)的離心管中，並於30 分鐘之內離心分離血漿（離心條件：3000 g，4 ℃，15分鐘）。採用已驗證的LC/MS/MS分析方法進行測定血漿濃度；採用WinNonlin™ Version 6.3 (Pharsight, Mountain View, CA)藥動學軟體的非房室模型處理血漿濃度，使用線性對數梯形法方法計算藥動學參數。

3.實驗結果及結論

SD大鼠靜脈給藥後，式（Ⅰ）化合物在體內迅速分佈並緩慢清除，雄性大鼠的血漿清除率為 9.76 ± 2.29 mL/min/kg，穩態表觀分佈容積（Vd_ss ）為1.65 ± 0.440 L/kg，T_1/2 和AUC_0-inf 分別為2.52 ± 0.671 h和3530 ± 723 ng•h/mL；雌性大鼠的血漿清除率為 6.41 ± 0.656 mL/min/kg，穩態表觀分佈容積（Vd_ss ）為1.55 ± 0.408 L/kg，消除半衰期（T_1/2 ）和AUC_0-inf 分別為3.04 ± 1.12 h和5240 ± 544 ng•h/mL。

SD大鼠單次灌胃給予式（Ⅰ）化合物 4.0mg/kg後，雄性大鼠的達峰濃度（C_max ）為1130 ± 483 ng/mL，AUC_0-inf 為2510 ng•h/mL，達峰時間（T_max ）為0.417 ± 0.144 h，消除半衰期（T_1/2 ）為1.72h；雌性大鼠的達峰濃度（C_max ）為2110 ± 1350ng/mL，AUC_0-inf 為9010 ± 4670ng•h/mL，達峰時間（T_max ）為0.667 ± 0.289 h，消除半衰期（T_1/2 ）為3.48 ± 0.835 h。雄性大鼠的生物利用度為35.6%，雌性大鼠的生物利用度為86.0%。（注：AUC_0-inf 表示從0時間到外推至無窮大時的血漿濃度-時間曲線下面積）。

綜上，式（Ⅰ）化合物大大提高了藥物代謝的穩定性，同時也大大提高了藥物的口服吸收生物利用度。

無

圖1為A晶型的Cu-Kα輻射的XRPD譜圖。 圖2為A晶型的DSC譜圖。 圖3為A晶型的TGA譜圖。 圖4為B晶型的Cu-Kα輻射的XRPD譜圖。 圖5為B晶型的DSC譜圖。 圖6為B晶型的TGA譜圖。

Claims (14)

1. 一種式（Ⅰ）化合物的A晶型，其X射線粉末繞射圖譜在下列2θ角處具有特徵繞射峰：7.50±0.2°，13.04±0.2°，21.43±0.2°。
2. 如請求項1所述的A晶型，其X射線粉末繞射圖譜在下列2θ角處具有特徵繞射峰：7.50±0.2°，9.66±0.2°，13.04±0.2°，14.42±0.2°，17.46±0.2°，18.57±0.2°，21.43±0.2°，26.18±0.2°。
3. 如請求項2所述的A晶型，其XRPD圖譜如圖1所示。
4. 如請求項1-3中任一項所述的A晶型，其差示掃描量熱曲線在169.42±3℃處有一個吸熱峰的起始點。
5. 如請求項4所述的A晶型，其DSC圖譜如圖2所示。
6. 如請求項1-3中任一項所述的A晶型，其熱重分析曲線在100±3℃處失重達0.04491%。
7. 如請求項6所述的A晶型，其TGA圖譜如圖3所示。
8. 一種式（Ⅰ）化合物的B晶型，其X射線粉末繞射圖譜在下列2θ角處具有特徵繞射峰：9.88±0.2°，10.56±0.2°，20.38±0.2°。
9. 如請求項8所述的B晶型，其X射線粉末繞射圖譜在下列2θ角處具有特徵繞射峰：9.88±0.2°，10.56±0.2°，12.23±0.2°，13.04±0.2°，14.62±0.2°，17.57±0.2°，20.38±0.2°，26.89±0.2°。
10. 如請求項9所述的B晶型，其XRPD圖譜如圖4所示。
11. 如請求項8-10中任一項所述的B晶型，其差示掃描量熱曲線在163.51±3℃處有一個吸熱峰的起始點。
12. 如請求項11所述的B晶型，其DSC圖譜如圖5所示。
13. 如請求項8-10中任一項所述的B晶型，其熱重分析曲線在120±3℃處失重達0.1191%；從120±3℃到153.60±3℃處失重達0.6282%。
14. 如請求項13所述的B晶型，其TGA圖譜如圖6所示。