TW201920674A - 致免疫性組成物 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容提供：(a)單離之致免疫性CEA多肽；(b)編碼(i)致免疫性CEA多肽、(ii)致免疫性CEA多肽與致免疫性MUC1多肽、(iii)致免疫性CEA多肽與致免疫性TERT多肽或(iv)致免疫性CEA多肽、致免疫性MUC1多肽及致免疫性TERT多肽之單離之核酸分子；(c)包含單離之核酸分子之組成物；及(d)有關使用該等致免疫性CEA多肽、核酸分子及組成物之方法。

Description

致免疫性組成物
本發明概括而言係有關免疫療法且特別是針對治療或預防腫瘤疾患之疫苗及方法。
癌症為全球性死亡的主要原因。彼等可能發生於例如胰臟、乳房、肺、胃、結腸及直腸等多種器官及組織。在美國，胰臟癌為癌症死亡第四個最常見原因。胰臟癌可能發生於胰臟的外分泌或內分泌成分。外分泌癌症包括(1)胰腺癌，為目前最常見類型；(2)腺泡細胞癌，佔外分泌胰臟癌的5%；(3)囊腺癌，佔胰臟癌的1%及(4)其他罕見型癌症，例如胰臟母細胞瘤、腺鱗癌、印環細胞癌、肝樣癌、膠體癌、未分化癌及具破骨細胞樣巨細胞的未分化癌。
乳癌(BrC)為美國女性間另一常見癌症及女性癌症死亡之第二主要原因。根據例如雌激素受體(ER)、黃體激素受體(PR)及人類表皮生長因子受體2(HER2)等多種腫瘤標記，乳癌可分為主要亞型，例如(1)激素受體陽性癌(其中癌細胞含有雌激素受體或黃體激素受體)；(2)激素受體陰性癌(其中癌細胞不具雌激素受體或黃體激素受體)；(3)HER2/neu陽性癌(其中具過量HER2/neu蛋白或額外拷貝的HER2/neu基因之癌症)；(4)HER2/neu陰性癌症(其中癌症不具過量HER2/neu)；(5)三重陰性癌症(其中乳癌細胞不具雌激素受體、黃體激素受體或過量HER2)及(6)三重陽性癌症(其中癌症為雌激素受體陽性、黃體激素受體陽性及具有過多HER2)。
肺癌佔所有癌症死亡的四分之一以上且為全球性癌症相關死亡之主要原因。大約85％病例於組織學上被分類為非小細胞肺癌(NSCLC)。NSCLC可進一步分類為數個亞型，例如鱗狀細胞(表皮樣)癌、腺癌、大細胞(未分化)癌、腺鱗癌及肉瘤樣癌。肺癌之第二個常見類型為小細胞肺癌(SCLC)，佔所有肺癌之約10%至15%。
胃癌(GaC)為全世界癌症相關死亡的第三個最常見原因。約90-95%之胃癌為腺癌；其他較少見類型包括淋巴瘤、GISTs及類癌瘤。
在美國，結腸直腸癌(CRC)亦為癌症相關死亡之主要原因。腺癌為CRC之最常見類型，佔結腸直腸癌之95%以上。其他較少見之CRC類型包括類癌瘤、胃腸道基質腫瘤(GISTs)、淋巴瘤及肉瘤。
癌症管理之傳統療法於循環癌症及實體癌症選擇性組別的管理上已很成功。然而，許多類型癌症抗拒傳統途徑。近年來，癌症的免疫療法已被探究，特別是癌症疫苗及抗體療法。癌症免疫療法之一途徑涉及給予免疫原以對標靶癌細胞上的腫瘤相關抗原(TAA)產生活性全身性免疫反應。雖然已鑑定大量腫瘤相關抗原且許多這些抗原已被探究成為治療或預防癌症之病毒、細菌、蛋白質、肽或DNA等系之疫苗；惟迄今多數臨床試驗仍無法產生治療產品。因此，業界對於可用於治療或預防癌症的免疫原或疫苗仍存在需求。
本揭示內容係有關衍生自MUC1、CEA或TERT等腫瘤相關抗原之致免疫性多肽；編碼該等致免疫性多肽之核酸分子；包含該等致免疫性多肽或核酸分子(例如疫苗)之組成物與該等多肽、核酸分子及組成物之用途。
人類黏蛋白1蛋白質(MUC1；亦為所謂episialin、PEM、H23Ag、EMA、CA15-3及MCA)係於單層皮膜及腺上皮頂端表面表現之多形性跨膜醣蛋白。MUC1基因編碼包含訊息肽序列之單一多肽鏈前體。於轉譯該訊息肽序列後立即被移除且該MUC1前體餘留部分進一步被切割成兩個肽片段：較長的N端次單元(MUC1-N或MUC1α)及較短的C端次單元(MUC1-C或MUC1β)。成熟的MUC1包含經由穏定氫鍵結合之MUC1-N及MUC1-C。MUC1-N，為胞外結構域，含有具20個胺基酸殘基之可變數目縱排重複序列(VNTR)，不同個體之重複序列數從20至125個不等。由可變數目縱排重複序列組成的MUC1蛋白區域於本揭示內容中亦稱為"VNTR區域"。MUC1-C含有短的胞外區域(大約53個胺基酸)、跨膜結構域(大約28個胺基酸)及細胞質尾部(大約72個胺基酸)。MUC1細胞質尾部(MUC1-CT)含有經生長因子受體及細胞內激酶磷酸化的高度保守之絲胺酸及酪胺酸殘基。人類MUC1以由不同類型MUC1 RNA交替接合產生之多種同功型存在。全長人類MUC1同功型1蛋白前體(同功型1，Uniprot P15941-1)之胺基酸序列提供於SEQ ID NO：1("MUC1參考多肽")。迄今至少已有16種其他同功型人類MUC-1經報導(Uniprot P15941-2至P15941-17)，其等相較於該同功型1序列，包括各種嵌入、缺失或取代。這些同功型為所謂同功型2、3、4、5、6、Y、8、9、F、Y-LSP、S2、M6、ZD、T10、E2及J13(分別為Uniprot P15941-2至P15941-17)。該全長人類MUC1同功型1前體蛋白由1255個胺基酸組成，其包括胺基酸1-23之訊息肽序列。成熟MUC1蛋白的MUC1-N及MUC1-C結構域分別由24-1097及1098-1255個胺基酸組成。
癌胚抗原相關細胞黏附分子(亦為所謂CEACAM)係免疫球蛋白(Ig)超級家族醣蛋白中之一組醣蛋白。於結構上，CEACAM群組由單個N端結構域及最多六個二硫鍵連接的內部結構域組成，類似於C2型Ig結構域。該群組含有12種蛋白質(CEACAM1、3 - 8、16、18 - 21)，其中數種，例如CEACAM1、CEACAM5及CEACAM6，於例如黑色素瘤、肺癌、直腸結腸癌及胰臟癌等多種癌症中，已被視為有效的臨床標記及有希望的治療標靶。CEACAM5之過度表現，於此項技藝中已知且於本文中亦稱為CEA，已於大多數人體癌症中發現。CEACAM5表現為702-胺基酸前體蛋白，係由：(1)訊息肽(胺基酸1-34)；(2)N結構域(胺基酸35-144)；(3)包含稱為A1(胺基酸146-237)、B1(胺基酸238 - 322)、A2(胺基酸324 - 415)及B2(胺基酸416 - 498)、A3(胺基酸502 - 593)與B3(胺基酸594 - 677)六個恒定C2樣結構域的三個重複單元；及(4)前肽(胺基酸686-702)組成。該訊息肽於運輸至細胞表面期間從成熟蛋白質被切開。全長人類CEA前體蛋白之胺基酸序列可從UniProt獲得(Accession No. P06731)且亦示於本文SEQ ID NO：2("CEA參考多肽")中。
端粒酶反轉錄酶(或TERT)為端粒酶的催化成分，其為利用添加端粒重複TTAGGG負責維持端粒末端之核糖核蛋白聚合酶。除了TERT之外，端粒酶亦包含作為該端粒重複模板用之RNA成分。人類TERT基因編碼1132個胺基酸蛋白質。存在從交替接合產生的數種同功型人類TERT。同功型1、同功型2、同功型3及同功型4之胺基酸序列可從Uniprot獲得(＜www.uniprot.org＞；分別為Uniprot識別符O14746-1、O14746-2、O14746-3及O14746-4)。人類全長TERT同功型1蛋白(同功型1、Genbank AAD30037、Uniprot O14746-1)之胺基酸序列亦提供於本文SEQ ID NO：3("TERT參考多肽")中。相較於TERT同功型1(O14746-1)，同功型2(O14746-2)具胺基酸764-807之置換(STLTDLQPYM...LNEASSGLFD→LRPVPGDPAG...AGRAAPAFGG)與C端胺基酸808-1132之缺失，同功型3(O14746-3)具胺基酸885-947之缺失及同功型4(O14746-4)具胺基酸711-722與808-1132之缺失及胺基酸764-807之置換(STLTDLQPYM...LNEASSGLFD→LRPVPGDPAG...AGRAAPAFGG)。
於若干態樣中，本揭示內容提供衍生自腫瘤相關抗原(TAA)MUC1、CEA及TERT的單離之致免疫性多肽，舉例而言，其可於活體內(例如於包括人類之動物中)引出免疫反應，或作為醫藥組成物(包括疫苗)之成分，用於治療癌症。
於其他態樣中，本揭示內容提供各自編碼本揭示內容提供的一或多種致免疫性多肽之核酸分子(亦稱為"抗原建構體")。於若干具體實例中，本揭示內容提供各自編碼二、三或多種致免疫性TAA多肽之多抗原核酸建構體。
本揭示內容亦提供含有本揭示內容提供的一或多種核酸分子之載體。該等載體用於選殖或表現由核酸分子編碼的致免疫性TAA多肽，或用於遞送組成物中之核酸分子(例如疫苗)至宿主細胞或宿主動物或人類。於一態樣中，本揭示內容提供含有本揭示內容亦提供的一或多種核酸分子之載體，其係作為疫苗或於疫苗中使用。
於若干進一步態樣中，本揭示內容提供包含一或多種致免疫性多肽、編碼致免疫性TAA多肽的單離抗原建構體，或含有編碼一或多種致免疫性TAA多肽的抗原建構體之載體或質體之組成物。於若干具體實例中，該組成物為用於在哺乳動物(例如小鼠、狗、猴子或人類)中引出TAA的免疫反應之致免疫性組成物。於若干具體實例中，該組成物為用於免疫處理哺乳動物(例如人類)、用於抑制異常細胞增殖、用於針對癌症之進展提供保護(作為預防劑)或用於治療(作為治療劑)與TAA過度表現相關之疾患(例如癌症，特別是胰臟癌、卵巢癌、肺癌、直腸結腸癌、胃癌及乳癌)之疫苗組成物。
於若干進一步態樣中，本揭示內容提供編碼一或多種致免疫性TAA多肽之單離之核酸分子或含有編碼如本文揭示之一或多種致免疫性TAA多肽的核酸分子之載體(例如病毒載體及質體載體)以供於哺乳動物(例如小鼠、狗、猴子或人類)中引出針對TAA的免疫反應之方法中使用。於若干進一步態樣中，本揭示內容提供編碼一或多種致免疫性TAA多肽之單離之核酸分子或含有編碼如本文揭示之一或多種致免疫性TAA多肽的核酸分子之載體(例如病毒載體及質體載體)以供於抑制哺乳動物中異常細胞增殖之方法中使用。於若干進一步態樣中，本揭示內容提供編碼一或多種致免疫性TAA多肽之單離之核酸分子或含有編碼如本文揭示之一或多種致免疫性TAA多肽的核酸分子之載體(例如病毒載體及質體載體)以供於哺乳動物中針對癌症之進展提供保護，以治療癌症，或治療與TAA過度表現相關疾患之方法中使用。
於若干進一步態樣中，本揭示內容提供編碼一或多種致免疫性TAA多肽之單離之核酸分子或含有編碼如本文揭示之一或多種致免疫性TAA多肽的核酸分子之載體或質體以作為抗癌劑用。於若干特定態樣中，該癌症為胰臟癌、卵巢癌、肺癌、直腸結腸癌、胃癌或乳癌。
於又其他態樣中，本揭示內容提供使用致免疫性TAA多肽、單離之核酸分子及組成物之方法。於若干具體實例中，本揭示內容提供於哺乳動物(特別是人類)中引出針對TAA的免疫反應之方法，包含給予該哺乳動物有效量之本發明提供之對標靶TAA具致免疫性的多肽、有效量之編碼該等致免疫性多肽的單離之核酸分子或包含該等致免疫性多肽或編碼該等致免疫性多肽的單離之核酸分子之組成物。該多肽或核酸組成物可與一或多種佐劑或免疫調節劑一起使用。
於又其他態樣中，本揭示內容提供本文揭示之作為藥劑用之致免疫性TAA多肽、單離之核酸分子及組成物。該多肽或核酸組成物可與一或多種佐劑或免疫調節劑一起使用。
於本發明之一態樣中，涵蓋由編號項目各自敘述之下述具體實例： 　　1.一種抗原建構體，其包含如本文揭示之編碼致免疫性CEA多肽之核苷酸序列。 　　2.根據第1項目之抗原建構體，進一步包含如本文揭示之編碼致免疫性MUC1多肽之核苷酸序列。 　　3.根據第1或2項目之抗原建構體，進一步包含如本文揭示之編碼致免疫性TERT多肽之核苷酸序列。 　　4.根據第1項目之抗原建構體，進一步包含如本文揭示之編碼致免疫性MUC1多肽之核苷酸序列及如本文揭示之編碼致免疫性TERT多肽之核苷酸序列。 　　5.根據第2、3或4項目中任一項目之抗原建構體，進一步包含如本文揭示之間隔子核苷酸序列。 　　6.根據第5項目之抗原建構體，其中該間隔子核苷酸序列編碼2A肽。 　　7.根據第5項目之抗原建構體，其中該間隔子核苷酸序列編碼選自由EMC2A、ERA2A、ERB2A及T2A所組成組群之2A肽。 　　8.根據第1至7項目中任一項目之抗原建構體，其中該致免疫性CEA多肽係選自由下列所組成之群組： 　　(1)包含SEQ ID NO：2之胺基酸2-702、SEQ ID NO：2之胺基酸323-702或SEQ ID NO：2之胺基酸323-677或由其組成之多肽； 　　(2)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列或SEQ ID NO：15之胺基酸4-704或由其組成之多肽； 　　(3)包含SEQ ID NO：17胺基酸序列或SEQ ID NO：17胺基酸4-526或由其組成之多肽； 　　(4)包含SEQ ID NO：19胺基酸序列或SEQ ID NO：19胺基酸4-468或由其組成之多肽；或 　　(5)為上述(1)至(4)中任一多肽的功能性變異體之多肽。 　　9.根據第3至8項目中任一項目之抗原建構體，其中該致免疫性TERT多肽係選自由下列所組成之群組： 　　(1)包含SEQ ID NO：9胺基酸序列或SEQ ID NO：9胺基酸2-893之多肽； 　　(2)包含SEQ ID NO：11胺基酸序列或SEQ ID NO：11胺基酸3-791之多肽； 　　(3)包含SEQ ID NO：13胺基酸序列或SEQ ID NO：13胺基酸4-594之多肽；及 　　(4)為上述(1)至(3)中任一多肽的功能性變異體之多肽。 　　10.根據第2及4至9項目中任一項目之抗原建構體，其中該致免疫性MUC1多肽係選自由下列所組成之群組： 　　(1)包含SEQ ID NO：5胺基酸序列或SEQ ID NO：5胺基酸4-537之多肽； 　　(2)包含SEQ ID NO：7胺基酸序列或SEQ ID NO：7胺基酸4-517之多肽；及 　　(3)上述(1)或(2)之多肽之功能性變異體。 　　11.根據第1至10項目中任一項目之抗原建構體，其包含編碼選自由下列所組成群組的胺基酸序列之核苷酸序列： 　　(1)SEQ ID NO：31胺基酸序列或包含SEQ ID NO：31胺基酸4-1088之胺基酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：33胺基酸序列或包含SEQ ID NO：33胺基酸4-1081之胺基酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：35胺基酸序列或包含SEQ ID NO：35胺基酸4-1085之胺基酸序列； 　　(4)SEQ ID NO：37胺基酸序列或包含SEQ ID NO：37胺基酸4-1030之胺基酸序列； 　　(5)SEQ ID NO：39胺基酸序列或包含SEQ ID NO：39胺基酸4-1381之胺基酸序列；及 　　(6)SEQ ID NO：41胺基酸序列或包含SEQ ID NO：41胺基酸4-1441之胺基酸序列。 　　12.根據第1至11項目中任一項目之抗原建構體，其包含選自由下列所組成群組之核苷酸序列： 　　(1)SEQ ID NO：30核苷酸序列或包含SEQ ID NO：30核苷酸10-3264之核苷酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：32核苷酸序列或包含SEQ ID NO：32核苷酸10-3243之核苷酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：34核苷酸序列或包含SEQ ID NO：34核苷酸10-3255之核苷酸序列； 　　(4)SEQ ID NO：36核苷酸序列或包含SEQ ID NO：36核苷酸10-3090之核苷酸序列； 　　(5)SEQ ID NO：38核苷酸序列或包含SEQ ID NO：38核苷酸10-4143之核苷酸序列； 　　(6)SEQ ID NO：40核苷酸序列或包含SEQ ID NO：40核苷酸10-4323之核苷酸序列；及 　　(7)為上述(1)至(6)中任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。 　　13.根據第1至12項目中任一項目之抗原建構體，其包含編碼選自由下列所組成群組的胺基酸序列之核苷酸序列： 　　(1)SEQ ID NO：43胺基酸序列或包含SEQ ID NO：43胺基酸4-2003之胺基酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：45胺基酸序列或包含SEQ ID NO：45胺基酸4-2001之胺基酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：47胺基酸序列或包含SEQ ID NO：47胺基酸4-2008之胺基酸序列； 　　(4)SEQ ID NO：49胺基酸序列或包含SEQ ID NO：49胺基酸4-1996之胺基酸序列； 　　(5)SEQ ID NO：51胺基酸序列或包含SEQ ID NO：51胺基酸4-1943之胺基酸序列；及 　　(6)SEQ ID NO：53胺基酸序列或包含SEQ ID NO：53胺基酸4-1943之胺基酸序列。 　　14.根據第1至13項目中任一項目之抗原建構體，其包含選自由下列所組成群組之核苷酸序列： 　　(1)SEQ ID NO：42核苷酸序列或包含SEQ ID NO：42核苷酸10-6009之核苷酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：44核苷酸序列或包含SEQ ID NO：44核苷酸10-6003之核苷酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：46核苷酸序列或包含SEQ ID NO：46核苷酸10-6024之核苷酸序列； 　　(4)SEQ ID NO：48核苷酸序列或包含SEQ ID NO：48核苷酸10-5988之核苷酸序列； 　　(5)SEQ ID NO：50核苷酸序列或包含SEQ ID NO：50核苷酸10-5829之核苷酸序列； 　　(6)SEQ ID NO：52核苷酸序列或包含SEQ ID NO：52核苷酸10-5829之核苷酸序列；及 　　(7)為上述(1)至(6)中任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。 　　15.根據第1至14項目中任一項目之抗原建構體，其包含： 　　(1)SEQ ID NOS：87、88、89、90、91及92中任一核苷酸序列；或 　　(2)SEQ ID NOS：87、88、89、90、91及92中任一核苷酸序列之簡併變異體。 　　16.一種醫藥組成物，其包含：(i)根據第1至15項目中任一項目之抗原建構體和(ii)醫藥上可接受之載劑。 　　17.根據第16項目之醫藥組成物，其為疫苗。 　　18.一種於需要治療的人類中治療癌症之方法，該方法包括給予該人類有效量之根據第16或17項目之醫藥組成物。 　　19.根據第18項目之方法，其中該癌症過度表現選自MUC1、CEA或TERT之一或多種腫瘤相關抗原。 　　20.根據第18項目之方法，其中該癌症為胰臟癌、卵巢癌、乳癌、胃癌、肺癌或結腸直腸癌。 　　21.根據第18項目之方法，其中該癌症為三重陰性乳癌、雌激素受體陽性乳癌或HER2陽性乳癌。 　　22.根據第18項目之方法，該方法進一步包括給予該病患有效量之免疫調節劑。 　　23.根據第22項目之方法，其中該免疫調節劑為CTLA-4抑制劑、IDO1抑制劑、PD-1抑制劑或PD-L1抑制劑。 　　24.根據第18項目之方法，該方法進一步包括給予該人類佐劑。 　　25.一種載體，其包含根據第1至15項目中任一項目之抗原建構體。 　　26.根據第25項目之載體，其為質體載體。 　　27.根據第26項目之載體，其包含SEQ ID NOs：57、59、61、63、65、67、69、70、71、72、73及74中任一核苷酸序列。 　　28.根據第25項目之載體，其為病毒載體。 　　29.根據第28項目之載體，其包含SEQ ID NOs：58、60、62、64、66及68中任一核苷酸序列。 　　30.一種(1)根據第1至15項目中任一項目之抗原建構體、(2)根據第16或17項目之醫藥組成物或(3)根據第25至29項目中任一項目之載體作為藥劑之用途。 　　31.根據第30項目之用途，其中該藥劑係用於治療癌症。 　　32.一種(1)根據第1至14項目中任一項目之抗原建構體或(2)根據第25至29項目中任一項目之載體於製造用於治療癌症的藥劑之用途。
A.界定
"佐劑"一詞係指，於給予宿主哺乳動物(例如人類)時，能增強、加速或延長由該宿主中的疫苗或免疫原引出抗原特異性免疫反應之物質。
"促效劑"一詞係指促進(誘發、引起、增強或增加)另一分子(例如受體)的活性之物質。促效劑一詞涵蓋結合受體之物質及促進受體功能而不與其結合之物質。
"拮抗劑"或"抑制劑"一詞係指部分或完全封阻、抑制或中和另一分子或受體的生物活性之物質。
"抗原"一詞係指於引入宿主哺乳動物(直接或呈，例如，DNA疫苗表現)時，能被宿主哺乳動物的免疫系統識別，例如與抗體或T細胞上的抗原受體結合之物質。抗原可為蛋白質或蛋白片段、碳水化合物、神經節苷脂、半抗原或核酸。當物質能與免疫系統的抗原識別分子(例如抗體或T細胞抗原受體)特異性相互作用時，則稱該物質具"抗原性"。腫瘤相關抗原"或"TAA"一詞"係指被腫瘤細胞特異性表現，或相較於相同組織類型之非腫瘤細胞以較高頻率或密度被腫瘤細胞表現之抗原。TAA可為被宿主不正常表現之分子，或者由宿主正常表現之突變、截短、錯誤折疊或者異常表現之分子。TAA之實例包括CEA、TERT及MUC1。
"共同給予"一詞係指給予相同個體兩種或兩種以上製劑作為治療方案的一部分。該兩種或兩種以上製劑可涵蓋於單一調配劑中從而同時給予。替代地，該兩種或兩種以上製劑可於分開之物理調配劑中且依序或同時分別給予個體。"同時地給予"或"同時給予"一詞意指第一製劑之給予與第二製劑之給予在時間上相互重疊，而"依序地給予"或"依序給予"一詞意指第一製劑之給予與第二製劑之給予在時間上未相互重疊。
"胞質型"一詞意指於編碼特定多肽之核苷酸序列經宿主細胞表現後，該經表現之多肽被預期保留於宿主細胞內。
"簡併變異體"一詞係指具有鹼基取代惟仍編碼相同多肽或胺基酸序列之核酸序列。
"有效量"一詞係指給予哺乳動物足以於該哺乳動物中引起期望作用之量。
胺基酸序列之"功能性變異體"或致免疫性TAA多肽(統稱為"參考多肽")一詞係指包含90%至100%之參考多肽胺基酸數量之胺基酸序列或多肽，具有低於100%惟高於95%之參考多肽胺基酸序列之同一性，並擁有與參考多肽相同或類似之致免疫性特性。
"完全相同"一詞係指分別共有確切相同之核苷酸或胺基酸序列之兩種或兩種以上核酸或兩種或兩種以上多肽。"同一性百分比"一詞敘述兩種或兩種以上核酸或多肽間相似性之程度。當經由生物資訊學軟體序列排比兩個序列時，將序列間確切之核苷酸/胺基酸配對數乘以100，並除以序列排比區之長度(包括空隙)，計算"同一性百分比"。舉例而言，序列排比時展現10個誤配的兩條100個胺基酸長之多肽將為90%完全相同。
"免疫效應細胞增強子"或"IEC增強子"一詞係指物質一詞係指能增加及/或增強哺乳動物一或多種類型免疫效應細胞之數量、品質、及/或功能之物質。免疫效應細胞之實例包括細胞溶解性樹突細胞、CD8 T細胞、CD4 T細胞、NK細胞及B細胞。
"免疫調節劑"一詞係指能改變(例如抑制、減少、增加、增強或刺激)哺乳動物之先天性、體液或細胞免疫系統之任何成分之運轉或功能之物質。因此，"免疫調節劑"一詞涵蓋如本文界定之"免疫效應細胞增強子"以及影響哺乳動物免疫系統之任何其他成分之物質。
"免疫反應"一詞係指宿主哺乳動物之適應性免疫系統對特定物質(例如抗原或免疫原)之任何可檢測之反應，包括細胞傳介之免疫反應(如由T細胞傳介之反應，例如抗原特異性T細胞及免疫系統之非特異性細胞)與體液免疫反應(如由B細胞傳介之反應，例如抗體之產生及分泌至血漿、淋巴、及/或組織液中)。免疫反應之實例包括細胞介素(如，Th1、Th2或Th17型細胞介素)或趨化素釋放之改變(如，增加)、巨噬細胞活化、樹突細胞活化、T細胞(如，CD4+或CD8+T細胞)活化、誘發B細胞反應(如，抗體產生)、誘發細胞毒性T淋巴細胞("CTL")反應及免疫系統細胞(如，T細胞與B細胞)之擴增(如，細胞族群之增長)。
"免疫原的"或"免疫原性"一詞係指，於宿主哺乳動物中，無論單獨或連接載劑，佐劑存在或不存在下，一物質於給予宿主哺乳動物(例如人類)後，導致、引出、刺激或誘發免疫反應或增進、增強、增加或延長業已存在的免疫反應之能力。該等物質稱為"免疫原"。
"致免疫性組成物"一詞係指具免疫原性之組成物。
"致免疫性MUC1多肽"一詞係指針對人類原態MUC1蛋白或針對表現人類原態MUC1蛋白之細胞具致免疫性之多肽。相較於人類原態MUC1蛋白之胺基酸序列，該多肽可具有與人類原態MUC1蛋白相同之胺基酸序列或顯示一或多個突變。
"致免疫性CEA多肽"一詞係指針對人類原態CEA蛋白或針對表現人類原態CEA蛋白之細胞具致免疫性且相較於人類原態CEA蛋白之胺基酸序列顯示一或多個突變(例如刪除一或多種胺基酸)之多肽。
"致免疫性TERT多肽"一詞係指針對人類原態TERT蛋白或針對表現人類原態TERT蛋白之細胞具致免疫性之多肽。相較於人類原態TERT蛋白之胺基酸序列，該多肽可具有與人類原態TERT蛋白相同之胺基酸序列或顯示一或多個突變。
"致免疫性TAA多肽"一詞係指各如上文界定之"致免疫性CEA多肽"、"致免疫性MUC1多肽或"致免疫性TERT多肽。
"免疫壓制細胞抑制劑"或"ISC抑制劑"一詞係指能減少及/或壓制哺乳動物免疫壓制細胞之數量及/或功能之物質。免疫壓制細胞之實例包括調控性T細胞("Tregs")、骨髓衍生性抑制細胞及腫瘤相關之巨噬細胞。
"哺乳動物"一詞係指哺乳動物綱之任何動物物種。哺乳動物之實例包括：人類；非人類之靈長類動物例如猴子；實驗動物例如大鼠、小鼠、天竺鼠；家畜例如，貓、狗、兔、牛、羊、山羊、馬及豬；與圈養野生動物例如獅、虎、象等。
"膜連型"一詞意指編碼特定多肽之核苷酸序列由宿主細胞表現後，該經表現之多肽以結合、依附或其他方式與細胞膜組合。
"腫瘤疾患"一詞係指其中細胞以異常高且不受控制的速率增殖之狀況，該速率超過且與周圍正常組織不協調。其通常導致實體病灶或腫塊，稱為"腫瘤"。此術語涵蓋良性與惡性腫瘤疾患。"惡性腫瘤疾患"一詞，其於本揭示內容中與可與"癌症"一詞互換使用，係指其特徵在於腫瘤細胞擴散到體內其他位置的能力(所謂"轉移")之腫瘤疾患。"良性腫瘤疾患一詞"係指其中腫瘤細胞缺乏轉移能力的腫瘤疾患。
"突變"一詞係指相較於參考蛋白質或多肽之胺基酸序列，一蛋白質或多肽之胺基酸序列中胺基酸殘基之缺失、加成或取代。
"醫藥組成物"一詞係指適於給予個體(例如人類病患)以引出期望之生理、藥理或治療效果之固態或液態組成物。除含一或多種活性成分外，醫藥組成物可含一或多種醫藥上可接受之賦形劑。
"醫藥上可接受之賦形劑"一詞係指醫藥組成物(例如疫苗)中，除了活性成分(如，抗原、抗原編碼之核酸、免疫調節劑或佐劑)以外之物質，其與活性成分相容且不對所給予之個體引起顯著之不利作用。
於醫藥組成物場合中使用之"賦形劑"一詞係指通常不具醫藥性質，為了簡化藥物產品之製造及/或促進活性藥物物質之穩定、遞送與吸收目的而包含於組成物中之物質。"醫藥上可接受之賦形劑"一詞係指醫藥組成物(例如疫苗組成物)中之賦形劑，其與組成物中之活性成分(如，抗原或免疫原、編碼抗原之核酸、免疫調節劑或佐劑)相容且不對所給予之個體引起顯著之不利作用。
"肽"、"多肽"及"蛋白質"等詞於本文中可互換使用，且係指經由肽鍵連接在一起之聚合型胺基酸。彼等可為任何長度且可包括編碼與非編碼胺基酸，經化學或生物化學修飾或衍生化之胺基酸。
"預防"一詞係指(a)阻止疾患發生，(b)延遲疾患之發病或疾患症狀之發病或(c)最小化疾患之發生率或影響。
"經分泌"一詞於多肽之場合中意指編碼多肽之核苷酸序列經由宿主細胞表現後，該經表現之多肽被分泌到宿主細胞外面。
"次最佳劑量"一詞用於敘述免疫調節劑(例如蛋白激酶抑制劑)之量時，係指免疫調節劑之劑量低於單獨給予病患該免疫調節劑時對所治療疾病產生期望治療效果所需之最小量。
"治療"一詞係指消除疾患、減少疾患之嚴重度或減少疾患症狀之嚴重度或發生頻率。
"疫苗"一詞係指給予哺乳動物(例如人類)以針對特定抗原(等)引出保護性免疫反應之致免疫性組成物。疫苗之主要活性成分為免疫原(等)。含致免疫性多肽作為免疫原之疫苗亦稱為"肽疫苗"。不含致免疫性多肽而含編碼致免疫性多肽之核酸分子的疫苗稱為"DNA疫苗"或"RNA疫苗"(取決於其可能情況)。於遞送DNA或RNA疫苗進入宿主細胞後，宿主細胞將表現由核酸分子編碼之致免疫性多肽，產生保護性免疫反應。DNA或RNA疫苗中之核酸分子可為裸露核酸、質體或病毒載體之形式，或任何其他適於遞送核酸之形式。
"載體"一詞係指能將外來核酸分子轉運或轉移到宿主細胞中之核酸分子或經改良之微生物。該外來核酸分子稱為"嵌入體"或"轉殖基因"。載體通常由嵌入體與用作載體骨架之較大序列構成。根據載體之結構或起源，載體之主要類型包括質體載體、黏接質體載體、噬菌體載體(例如λ噬菌體)、病毒載體(例如腺病毒載體)、人工染色體及細菌載體。 B.致免疫性TAA多肽
於若干態樣中，本揭示內容提供單離之致免疫性TAA多肽，其可用於，例如，於活體內(例如於包括人類之動物中)或活體外引出免疫反應、活化效應T細胞或產生對TAA具特異性之抗體或作為用於治療例如胰臟癌、肺癌、結腸直腸癌、胃癌或乳癌等癌症的醫藥組成物(包括疫苗)之成分用。
這些致免疫性TAA多肽可根據本揭示內容利用此項技藝中已知之方法製備。該等多肽引出免疫反應的能力可於活體外分析或活體內分析中測量。用於測定多肽或DNA建構體引出免疫反應能力之活體外分析為此項技藝中已知。該等活體外分析之一實例如美國專利案7,387,882(其揭示內容併入本申請案)中所述，測量該多肽或表現多肽的核酸刺激T細胞反應之能力。該分析方法包含下述步驟：(1)使培養中的抗原呈現細胞與抗原接觸從而使該抗原可被抗原呈現細胞吸收且處理，產生一或多種經處理之抗原；(2)於足以使T細胞對該一或多種經處理之抗原反應的條件下使抗原呈現細胞與T細胞接觸；(3)測定T細胞是否對該一或多種經處理之抗原反應。所用T細胞可為CD8+ T細胞或CD4+ T細胞。T細胞反應可利用測量一或多種細胞介素(例如干擾素-γ及介白素-2)之釋放，與抗原呈現細胞(腫瘤細胞)之溶解測定。B細胞反應可利用測量抗體的產生測定。 B-1.致免疫性MUC1多肽
於一態樣中，本揭示內容提供經由於人類原態MUC1蛋白引入一或多種突變之衍生自人類原態MUC1之致免疫性MUC1多肽。該等突變之實例包括刪除MUC1蛋白VNTR區域中20個胺基酸的一些，而非全部，縱排重複序列；刪除全部或部分訊息肽序列及刪除於MUC1同功型中發現的非共識胺基酸序列之胺基酸。因此，於若干具體實例中，致免疫性MUC1多肽包含(1)人類MUC1蛋白20個胺基酸之3至30個縱排重複序列之胺基酸序列及(2)VNTR區域側翼的人類MUC1蛋白之胺基酸序列。於若干特定具體實例中，致免疫性MUC1多肽包含(1)人類MUC1之5至25個縱排重複序列之胺基酸序列及(2)VNTR區域側翼的人類MUC1蛋白之胺基酸序列。於若干具體實例中，致免疫性MUC1多肽由(1)人類MUC1蛋白20個胺基酸之3至30個縱排重複序列之胺基酸序列及(2)VNTR區域側翼的人類MUC1蛋白之胺基酸序列組成。於若干特定具體實例中，致免疫性MUC1多肽由(1)人類MUC1之5至25個縱排重複序列之胺基酸序列及(2)VNTR區域側翼的人類MUC1蛋白之胺基酸序列組成。於若干進一步具體實例中，致免疫性MUC1多肽呈胞質型(或"cMUC1")。"胞質型"一詞係指缺少人類原態MUC1蛋白的全部或部分分泌序列(胺基酸1-23；亦為所謂"訊息肽序列")之致免疫性MUC1多肽。刪除分泌序列之胺基酸被預期於細胞中表現時防止該多肽進入分泌途徑。於若干其他具體實例中，致免疫性MUC1多肽呈膜連型。致免疫性MUC1多肽可由此項技藝中已知或未來發現之任何人類MUC1同功型胺基酸序列衍生、建構或製備，包括，例如，Uniprot同功型1、2、3、4、5、6、Y、8、9、F、Y-LSP、S2、M6、ZD、T10、E2及J13(分別為Uniprot P15941-1至P15941-17)。於若干具體實例中，致免疫性MUC1多肽包含為人類MUC1同功型1一部分之胺基酸序列，其中人類MUC1同功型1之胺基酸序列示於SEQ ID NO：1。於若干具體實例中，致免疫性MUC1多肽由為人類MUC1同功型1一部分之胺基酸序列組成，其中人類MUC1同功型1之胺基酸序列示於SEQ ID NO：1。於特定具體實例中，致免疫性MUC1多肽包含SEQ ID NO：1胺基酸序列之胺基酸22-225及946-1255。於若干其他特定具體實例中，本揭示內容提供選自於下之致免疫性MUC1多肽： 　　(1)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列或由其組成之多肽(質體1027多肽)； 　　(2)包含SEQ ID NO：5之胺基酸4-537或由其組成之多肽； 　　(3)包含SEQ ID NO：5之胺基酸24-537或由其組成之多肽； 　　(4)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列或由其組成之多肽(質體1197多肽)； 　　(5)包含SEQ ID NO：7之胺基酸4-517或由其組成之多肽； 　　(6)包含SEQ ID NO：7之胺基酸4-517或由其組成之多肽，其中於SEQ ID NO：7中，位置513之胺基酸為T；及 　　(7)上述(1)至(6)中任一多肽之功能性變異體。
於若干明確具體實例中，致免疫性MUC1多肽包含SEQ ID NO：5(質體1027多肽)或SEQ ID NO：7(質體1197多肽)之胺基酸序列。於若干明確具體實例中，致免疫性MUC1多肽由SEQ ID NO：5(質體1027多肽)或SEQ ID NO：7(質體1197多肽)之胺基酸序列組成。
於一態樣中，本發明提供本文揭示的任一致免疫性MUC1多肽之功能性變異體。 B-2.致免疫性TERT多肽
於另一態樣中，本揭示內容提供經由刪除TERT蛋白之多達600個N端胺基酸而衍生自人類TERT蛋白之致免疫性TERT多肽。因此，致免疫性TERT多肽可包含從任何人類TERT蛋白同功型位置601開始之C端胺基酸序列。於若干具體實例中，致免疫性TERT多肽包含示於SEQ ID NO：3之TERT同功型1之胺基酸序列，其中缺少源自TERT同功型1胺基酸序列N端(胺基端)之多達約600個胺基酸。致免疫性TERT多肽中可缺少至多600個之任何數量之源自TERT同功型1 N端之胺基酸。舉例而言，SEQ ID NO：3之TERT同功型1位置1至位置50、100、50、200、250、300、350、400、450、500、550或600之N端胺基酸可不存在致免疫性TERT多肽中。因此，致免疫性TERT多肽可包含SEQ ID NO：3之胺基酸51-1132、101-1132、151-1132、201-1132、251-1132、301-1132、351-1132、401-1132、451-1132、501-1132或551-1132。於一具體實例中，致免疫性TERT多肽包含SEQ ID NO：3胺基酸601-1132之胺基酸序列。於另一具體實例中，本揭示內容提供包含SEQ ID NO：3胺基酸241-1132之胺基酸序列之致免疫性TERT多肽。
致免疫性TERT多肽可由SEQ ID NO：3胺基酸51-1132、101-1132、151-1132、201-1132、251-1132、301-1132、351-1132、401-1132、451-1132、501-1132或551-1132組成。於一具體實例中，致免疫性TERT多肽由SEQ ID NO：3胺基酸序列之胺基酸601-1132組成。於另一具體實例中，本揭示內容提供由SEQ ID NO：3胺基酸序列之胺基酸241-1132組成之致免疫性TERT多肽。
致免疫性TERT多肽亦可由其他TERT同功型建構。當致免疫性TERT多肽係以具C端截切之TERT同功型(例如同功型2、3或4)建構時，較佳為從該蛋白質N端刪除較少胺基酸。
於若干進一步具體實例中，致免疫性TERT多肽進一步包含使TERT催化結構域失活的一或多種胺基酸突變。該等胺基酸突變之實例包括SEQ ID NO：3位置712以丙胺酸取代天冬胺酸(D712A)及SEQ ID NO：3位置713以異白胺酸取代纈胺酸(V713I)。於若干具體實例中，致免疫性TERT多肽包含D712A及V713I二突變。於一具體實例中，該(等)突變包括SEQ ID NO：3位置712天冬胺酸之取代及/或SEQ ID NO：3位置713之纈胺酸取代(V713I)，其中該(等)突變使TERT催化結構域失活。於另一具體實例中，該突變由SEQ ID NO：3位置712天冬胺酸之取代及/或SEQ ID NO：3位置713之纈胺酸取代(V713I)組成，其中該(等)突變使TERT催化結構域失活。於又另一具體實例中，該突變由SEQ ID NO：3位置712以丙胺酸取代天冬胺酸(D712A)及/或SEQ ID NO：3位置713以異白胺酸取代纈胺酸(V713I)組成。
於若干明確具體實例中，本揭示內容提供選自於下之致免疫性TERT多肽： 　　(1)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列(質體1112多肽)或SEQ ID NO：9之胺基酸2-893或由其組成之多肽； 　　(2)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列(質體1326多肽)或SEQ ID NO：11之胺基酸3-791或由其組成之多肽； 　　(3)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列(質體1330多肽)或SEQ ID NO：13之胺基酸4-594或由其組成之多肽；或 　　(4)為上述(1)至(3)中任一多肽的功能性變異體之多肽。
於一態樣中，本發明提供本文揭示的任一致免疫性TERT多肽之功能性變異體。 B-3.致免疫性CEA多肽
於另一態樣中，本揭示內容提供經由於人類原態CEA前體蛋白引入一或多種突變之衍生自人類原態CEA的單離之致免疫性CEA多肽。所引入之突變實例包括刪除一、二、三、四或五個C2樣結構域；刪除全部或部分訊息肽序列及刪除該前肽之一些或所有胺基酸。因此，於若干具體實例中，本揭示內容提供之免疫性CEA多肽包含(1)N結構域之胺基酸序列及(2)人類CEA蛋白1至5個C2樣結構域之胺基酸序列。於若干特定具體實例中，致免疫性CEA多肽包含(1)至少四個(例如A2、B2、A3及B3)C2樣結構域之胺基酸序列與(2)N結構域之胺基酸序列。於若干進一步具體實例中，致免疫性CEA多肽呈胞質型(或"cCEA")。"胞質型"一詞係指缺少人類原態CEA前體蛋白之全部或部分訊息肽序列(胺基酸1-34)之致免疫性CEA多肽。刪除訊息序列之胺基酸被預期於細胞中表現時防止該多肽進入分泌途徑。於若干其他具體實例中，致免疫性CEA多肽呈膜連型(或"mCEA")。致免疫性mCEA多肽包括訊息肽之胺基酸且，被宿主細胞表現後，仍保持與宿主細胞的膜結合或者相連。
本揭示內容提供的致免疫性CEA多肽可由此項技藝中已知或未來發現之任何人類CEA同功型胺基酸序列衍生、建構或製備。於若干具體實例中，致免疫性CEA多肽包含具SEQ ID NO：2之胺基酸序列的人類CEA同功型1前體蛋白一部分之胺基酸序列。
於若干明確具體實例中，本揭示內容提供下述任一致免疫性CEA多肽： 　　(1)包含SEQ ID NO：2之胺基酸2-702、SEQ ID NO：2之胺基酸323-702或SEQ ID NO：2之胺基酸323-677之多肽； 　　(2)由SEQ ID NO：2之胺基酸2-702、SEQ ID NO：2之胺基酸323-702或SEQ ID NO：2之胺基酸323-677組成之多肽； 　　(3)包含SEQ ID NO：15之胺基酸(由質體1361編碼之胺基酸序列)或SEQ ID NO：15之胺基酸4-704之多肽； 　　(4)由SEQ ID NO：15之胺基酸(由質體1361編碼之胺基酸序列)或SEQ ID NO：15之胺基酸4-704組成之多肽； 　　(5)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列(由質體1386編碼之胺基酸序列)或SEQ ID NO：17之胺基酸4-526之多肽； 　　(6)由SEQ ID NO：17之胺基酸序列(由質體1386編碼之胺基酸序列)或SEQ ID NO：17之胺基酸4-526組成之多肽； 　　(7)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列(由質體1390編碼之胺基酸序列)或SEQ ID NO：19之胺基酸4-468之多肽； 　　(8)由SEQ ID NO：19之胺基酸序列(由質體1390編碼之胺基酸序列)或SEQ ID NO：19之胺基酸4-468組成之多肽；或 　　(9)為上述(1)至(8)中任一多肽功能性變異體之多肽。
於一態樣中，本發明提供本文揭示的任一致免疫性TERT多肽之功能性變異體。 C.編碼一或多種致免疫性TAA多肽之抗原建構體
於若干態樣中，本揭示內容提供編碼一、二、三或多種不同致免疫性TAA多肽之單離之核酸分子。該等核酸分子於本揭示內容中亦稱為"抗原建構體"。只編碼一種致免疫性TAA多肽之核酸分子於本文中亦稱為"單抗原建構體"及編碼一種以上致免疫性TAA多肽之核酸分子亦稱為"多抗原建構體"。編碼兩種不同致免疫性TAA多肽之核酸分子亦稱為"雙抗原建構體"及編碼三種不同致免疫性TAA多肽之核酸分子亦稱為"三抗原建構體"。該等核酸分子可為去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。因此，核酸分子可包含本文揭示之核苷酸序列，其中胸腺嘧啶核苷(T)亦可為尿嘧啶(U)，其反映DNA及RNA化學結構間之差異。關於對應於本揭示內容中DNA核苷酸序列之RNA核苷酸序列，"對應"一詞係指RNA之核苷酸序列除了DNA核苷酸序列中之胸腺嘧啶核苷(T)被RNA核苷酸序列中之尿嘧啶(U)替換外，與DNA之參考核苷酸序列完全相同。核酸分子可呈經修飾形式、單股或雙股形式或線性或環狀形式。
抗原建構體，包括DNA及RNA建構體二者，可根據本揭示內容使用此項技藝中已知之方法製備。於下文進一步敘述製造單抗原建構體及多抗原建構體方法之方法。附加地，已確立的為將mRNA注射入宿主細胞中導致表現經編碼之蛋白質及免疫反應。經由使用此項技藝中已知之各種元件/系統(例如UTR's、PolyA、封端系統及密碼子最佳化)，可穩定地產生活體外轉錄之mRNA及可有效地轉譯經編碼之蛋白質。另外，熔酶體或核內體靶向訊息與mRNA編碼多肽之熔融可增強T細胞免疫反應。mRNA可未經調配或經由EP或於脂質或其他賦形劑中調配遞送。C-1 CEA 單抗原建構體
於若干具體實例中，本揭示內容提供編碼上文敘述之任一致免疫性CEA多肽的抗原建構體。
於若干明確具體實例中，抗原建構體編碼選自於下之致免疫性CEA多肽： 　　(1)包含SEQ ID NO：2之胺基酸2-702、SEQ ID NO：2之胺基酸323-702或SEQ ID NO：2之胺基酸323-677之多肽； 　　(2)包含SEQ ID NO：15之胺基酸(由質體1361編碼之胺基酸序列)或SEQ ID NO：15之胺基酸4-704之多肽； 　　(3)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列(由質體1386編碼之胺基酸序列)或SEQ ID NO：17之胺基酸4-526之多肽； 　　(4)包含SEQ ID NO：19之序列(由質體1390編碼之胺基酸序列)或SEQ ID NO：19之胺基酸4-468之多肽；或 　　(5)為上述(1)至(4)之任一多肽的功能性變異體之多肽。
於若干明確具體實例中，抗原建構體編碼選自於下之致免疫性CEA多肽： 　　(1)由SEQ ID NO：2之胺基酸2-702, SEQ ID NO：2之胺基酸323-702或SEQ ID NO：2之胺基酸323-677組成之多肽； 　　(2)由SEQ ID NO：15之胺基酸(由質體1361編碼之胺基酸序列)或SEQ ID NO：15之胺基酸4-704組成之多肽； 　　(3)由SEQ ID NO：17之胺基酸序列(由質體1386編碼之胺基酸序列)或SEQ ID NO：17之胺基酸4-526組成之多肽； 　　(4)由這些SEQ ID NO：19之序列(由質體1390編碼之胺基酸序列)或SEQ ID NO：19之胺基酸4-468組成之多肽；或 　　(5)為上述(1)至(4)之任一多肽的功能性變異體之多肽。
於若干特定具體實例中，本揭示內容提供抗原建構體，其為DNA且包含選自由下列所組成群組之核苷酸序列： 　　(1)SEQ ID NO：14之核苷酸序列(質體1361開放閱讀框架)或包含SEQ ID NO：14核苷酸10 - 2112之核苷酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：16之核苷酸序列(質體1386開放閱讀框架)或包含SEQ ID NO：16核苷酸10 - 1578之核苷酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：18之核苷酸序列(質體1390開放閱讀框架)或包含SEQ ID NO：18核苷酸10 - 1404之核苷酸序列；及 　　(4)為(1)至(3)之核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於若干其他特定具體實例中，本揭示內容提供抗原建構體，其為DNA且由選自由下列所組成群組之核苷酸序列組成： 　　(1)SEQ ID NO：14之核苷酸序列(質體1361開放閱讀框架)或由SEQ ID NO：14核苷酸10 - 2112組成之核苷酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：16之核苷酸序列(質體1386開放閱讀框架)或由SEQ ID NO：16核苷酸10 - 1578組成之核苷酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：18之核苷酸序列(質體1390開放閱讀框架)或由SEQ ID NO：18核苷酸10 - 1404組成之核苷酸序列；及 　　(4)為(1)至(3)之核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。於若干其他特定具體實例中，本揭示內容提供抗原建構體，其為RNA且包含對應於選自由下列所組成群組的核苷酸序列之核苷酸序列： 　　(1)SEQ ID NO：14之核苷酸序列(質體1361開放閱讀框架)或包含SEQ ID NO：14核苷酸10 - 2112之核苷酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：16之核苷酸序列(質體1386開放閱讀框架)或包含SEQ ID NO：16核苷酸10 - 1578之核苷酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：18之核苷酸序列(質體1390開放閱讀框架)或包含SEQ ID NO：18核苷酸10 - 1404之核苷酸序列；及 　　(4)為(1)至(3)之核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。C-2. 多抗原建構體
於另一態樣中，本揭示內容提供各編碼二、三或多種不同致免疫性TAA多肽之抗原建構體。
建構用於共表現源自單一核酸的兩種或兩種以上多肽之載體(亦為此項技藝中已知之"多基因表現載體(multicistronic vectors")之方法及技術為此項技藝中已知。本揭示內容提供之多抗原建構體可根據該揭示內容使用該等技術製備。舉例而言，多抗原建構體可利用併入多個獨立啓動子至單一質體中建構[Huang, Y., Z. Chen, et al.(2008). "Design, construction, and characterization of a dual-promoter multigenic DNA vaccine directed against an HIV-1 subtype C/B' recombinant." J Acquir Immune Defic Syndr 47(4)：403-411；Xu, K., Z. Y. Ling, et al.(2011). " Broad humoral and cellular immunity elicited by a bivalent DNA vaccine encoding HA and NP genes from an H5N1 virus." Viral Immunol 24(1)：45-56]。該質體可經工程處理以攜帶多個表現匣，各個表現匣由a)有或無增強子元件下，用於啓動RNA聚合酶依賴性轉錄之真核啓動子、b)標靶抗原編碼基因及c)轉錄終止子序列組成。遞送質體至經轉染之細胞核後，將從各啓動子開始轉錄，導致產生各自編碼一種標靶抗原之單獨mRNAs。該等mRNA將獨立轉譯，從而產生所需抗原。
本揭示內容提供之多抗原建構體亦可經由使用病毒2A肽建構[Szymczak, A. L. and D. A. Vignali(2005). "Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors." Expert Opin Biol Ther 5(5)：627-638；de Felipe, P., G. A. Luke, et al.(2006). "E unum pluribus：multiple proteins from a self-processing polyprotein." Trends Biotechnol 24(2)：68-75；Luke, G. A., P. de Felipe, et al.(2008). "Occurrence, function and evolutionary origins of '2A-like' sequences in virus genomes. " J Gen Virol 89(Pt 4)：1036-1042；Ibrahimi, A., G. Vande Velde, et al.(2009). "Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences." Hum Gene Ther 20(8)：845-860；Kim, J. H., S. R. Lee, et al.(2011). "High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice." PLoS One 6(4)：e18556]。這些胜肽，亦稱為裂解匣或CHYSELs(順式作用水解酶元件)，約20個胺基酸長，具高度保守之羧基端D-V/I-EXNPGP基序。 　　這些胜肽於自然界中罕見，最常見於例如口蹄疫病毒(FMDV)、馬鼻炎A病毒(ERAV)、馬鼻炎B病毒(ERBV)、腦心肌炎病毒(EMCV)、豬睾丸病毒(PTV)及明脈扁刺蛾β四體病毒(TAV)[Luke, G. A., P. de Felipe, et al.(2008). "Occurrence, function and evolutionary origins of '2A-like' sequences in virus genomes." J Gen Virol 89(Pt 4)：1036-1042]等病毒中發現。這些胜肽之若干胺基酸序列提供於表17。使用2A系多抗原表現策略，將編碼多種標靶抗原的基因於單一開放閱讀框架(ORF)中連接在一起，由編碼病毒2A肽之序列隔開。可將整個開放閱讀框架轉殖入具單一啓動子及終止子之載體中。將建構體遞送至宿主細胞後，編碼多種抗原之mRNA將被轉錄且轉譯為單一多蛋白。於轉譯2A肽期間，核糖體跳過C端甘胺酸及脯胺酸之間的鍵結。核醣體跳躍扮演類似共轉譯自動催化"裂解"之作用，其將2A肽上游肽序列從下游肽序列釋出。在兩種蛋白抗原間併入2A肽可導致於上游多肽C端添加~20個胺基酸及於下游蛋白質N端添加1個胺基酸(脯胺酸)。於此方法之改編中，蛋白酶裂解位點可併入2A匣之N端俾使普遍存在的蛋白酶將裂解源自上游蛋白質之該匣[Fang, J., S. Yi, et al.(2007). "An antibody delivery system for regulated expression of therapeutic levels of monoclonal antibodies in vivo." Mol Ther 15(6)：1153-1159]。可用於建構本揭示內容多抗原建構體的特定2A-肽序列之實例包括揭示於Andrea L. Szymczak & Darrio AA Vignali：Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opinion Biol. Ther.(2005)5(5)627-638以及於國際專利申請案WO2015/063674中者，其揭示內容併入本文以資參考。
可用於建構多抗原建構體之另一方法涉及使用內部核糖體進入位點或IRES。內部核糖體進入位點係於特定RNA分子5'非轉譯區發現的RNA元件[Bonnal, S., C. Boutonnet, et al.(2003). "IRESdb：the Internal Ribosome Entry Site database." Nucleic Acids Res 31(1)：427-428]。彼等吸引真核核糖體至RNA以促進下游開放閱讀框架之轉譯。不同於正常細胞之7-甲基鳥苷帽依賴性轉譯，IRES傳介之轉譯可於遠在RNA分子內的AUG密碼子處啓動。此高效率方法可開發以於多基因表現載體中使用[Bochkov, Y. A. and A. C. Palmenberg(2006). "Translational efficiency of EMCV IRES in bicistronic vectors is dependent upon IRES sequence and gene location." Biotechniques 41(3)：283-284, 286, 288]。通常，將兩個轉殖基因嵌入啟動子與轉錄終止子間之載體中，作為由IRES分開的兩個獨立開放閱讀框架。於遞送建構體至宿主細胞後，將轉錄編碼兩個轉殖基因之單一長轉錄本。第一個ORF將以傳統之帽依賴性方式轉譯，在IRES上游之終止密碼子處停止。第二個ORF將使用IRES以非帽依賴性方式轉譯。以此方式，可從具單一表現匣之載體轉錄單一mRNA，產生兩個獨立蛋白質。IRES序列之實例包括小兒麻痺症病毒(PV)IRES、腦心肌炎病毒(EMCV)IRES、口蹄疫病毒(FMDV)IRES、A型肝炎病毒IRES、B型肝炎病毒IRES、卡波西氏(Kaposi's)肉瘤相關疱疹病毒(KSHV)IRES及豬瘟病毒IRES。EMCV IRES之核苷酸序列揭示於WO2013/165754(圖3)中並示於本揭示內容之SEQ ID NO：93中。最小之EMCV IRES元件排除SEQ ID NO：93核苷酸序列3'端之15個核苷酸(其代表EMCV L蛋白最前面5個密碼子)。
於本揭示內容中，嵌入核酸分子開放閱讀框架(ORF)中兩個編碼序列或轉殖基因間並起作用以容許源自核酸分子之二獨立基因產物共表現或轉譯之核苷酸序列係稱為"間隔子核苷酸序列"。可用於多抗原建構體之特定間隔子核苷酸序列之實例包括真核啟動子、編碼2A肽之核苷酸序列及內部核醣體進入位點(IRES)序列。特定2A肽之實例包括急性蜜蜂麻痺病毒(ABP2A)、蟋蟀麻痺病毒(CrP2A)、馬鼻炎A病毒(ERA2A)、馬鼻炎B病毒(ERB2A)、腦心肌炎病毒(EMC2A)、口蹄疫病毒(FMD2A或F2A)、人類輪狀病毒(HT2A)、傳染性家蠶軟化症病毒(IF2A)、豬鐵士古病毒(PT2A或P2A)、豬輪狀病毒(PR2A)及明脈扁刺蛾β四體病毒(T2A、TA2A或TAV2A)。
於若干態樣中，本揭示內容提供抗原建構體，其包含(i)編碼致免疫性CEA多肽之至少一種核苷酸序列及(ii)編碼一或多種其他致免疫性TAA多肽(例如致免疫性TERT多肽、致免疫性MUC1多肽、致免疫性MSLN多肽、致免疫性PSA多肽、致免疫性PSMA多肽或致免疫性PSCA多肽)之一或多種核苷酸序列。
於若干具體實例中，本揭示內容提供抗原建構體，其包含(i)編碼致免疫性CEA多肽之至少一種核苷酸序列及(ii)編碼致免疫性TERT多肽或者致免疫性MUC1多肽之至少一種核苷酸序列。編碼致免疫性CEA多肽之核苷酸序列可為另一編碼核苷酸序列之上游或下游。該建構體可進一步於該等編碼核苷酸序列之間包含間隔子核苷酸序列。該等雙抗原建構體之結構式於式(I)及式(II)： 　　TAA-SPACER-CEA (I) 　　CEA-SPACER-TAA (II) 　　其中於各個式(I)及(II)中：(i)CEA表示編碼致免疫性CEA多肽之核苷酸序列；(ii)TAA表示編碼致免疫性MUC1多肽或者致免疫性TERT多肽之核苷酸序列及(iii)SPACER為間隔子核苷酸序列且可不存在。可包括於雙抗原建構體的間隔子核苷酸序列之實例包括編碼口蹄疫病毒2A肽(FMD2A或FMDV2A)、馬鼻炎A病毒2A肽(ERA2A)、馬鼻炎B病毒2A肽(ERB2A)、腦心肌炎病毒2A肽(EMC2A或EMCV2A)、豬睾丸病毒2A肽(PT2A)及明脈扁刺蛾β四體病毒2A肽(T2A、TA2A或TAV2A)。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性CEA多肽。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性TERT多肽。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性MUC1多肽。
於若干其他態樣中，本揭示內容提供多抗原建構體，其包含(i)編碼致免疫性CEA多肽之至少一種核苷酸序列、(ii)編碼致免疫性MUC1多肽之至少一種核苷酸序列及(iii)編碼致免疫性TERT多肽之至少一種核苷酸序列。於若干具體實例中，多抗原建構體進一步包含間隔子核苷酸序列。多抗原建構體的結構示於式(III)： 　　TAA1-SPACER1-TAA2-SPACER2-TAA3(III) 　　其中於式(III)中：(i)TAA1、TAA2及TAA3各表示編碼選自由致免疫性MUC1多肽、致免疫性CEA多肽及致免疫性TERT多肽所組成組群的致免疫性TAA多肽之核苷酸序列，其中TAA1、TAA2及TAA3編碼不同致免疫性TAA多肽；及(ii)SPACER1及SPACER2各表示間隔子核苷酸序列，其中(a)SPACER1及SPACER2可相同或不同且(b)SPACER1及SPACER2之一或二者可不存在。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2，獨立地，為編碼2A肽之核苷酸序列或編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2為編碼2A肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2為編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1為編碼2A肽之核苷酸序列及SPACER2為編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1為編碼GGSGG之核苷酸序列及SPACER2為編碼2A肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性CEA多肽。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性TERT多肽。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性MUC1多肽。
於若干具體實例中，本揭示內容提供式(III)之多抗原建構體，其中於式(III)中：(i)TAA1為編碼致免疫性MUC1多肽之核苷酸序列；(ii)TAA2為編碼致免疫性CEA多肽之核苷酸序列；及(iii)TAA3為編碼致免疫性TERT多肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2，獨立地，為編碼2A肽之核苷酸序列或編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2為編碼2A肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2為編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1為編碼2A肽之核苷酸序列及SPACER2為編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1為編碼GGSGG之核苷酸序列及SPACER2為編碼2A肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性CEA多肽。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性TERT多肽。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性MUC1多肽。
於若干其他具體實例中，本揭示內容提供式(III)之多抗原建構體，其中於式(III)中：(i)TAA1為編碼致免疫性MUC1多肽之核苷酸序列；(ii)TAA2為編碼致免疫性TERT多肽之核苷酸序列；及(iii)TAA3為編碼致免疫性CEA多肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2，獨立地，為編碼2A肽之核苷酸序列或編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2為編碼2A肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2為編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1為編碼2A肽之核苷酸序列及SPACER2為編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1為編碼GGSGG之核苷酸序列及SPACER2為編碼2A肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性CEA多肽。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性TERT多肽。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性MUC1多肽。
於又其他具體實例中，本揭示內容提供式(III)之多抗原建構體，其中於式(III)中：(i)TAA1為編碼致免疫性CEA多肽之核苷酸序列；(ii)TAA2為編碼致免疫性TERT多肽之核苷酸序列；及(iii)TAA3為編碼致免疫性MUC1多肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2，獨立地，為編碼2A肽之核苷酸序列或編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2為編碼2A肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2為編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1為編碼2A肽之核苷酸序列及SPACER2為編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1為編碼GGSGG之核苷酸序列及SPACER2為編碼2A肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性CEA多肽。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性TERT多肽。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性MUC1多肽。
於若干進一步具體實例中，本揭示內容提供式(III)之多抗原建構體，其中於式(III)中：(i)TAA1為編碼致免疫性CEA多肽之核苷酸序列；(ii)TAA2為編碼致免疫性MUC1多肽之核苷酸序列；及(iii)TAA3為編碼致免疫性TERT多肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2，獨立地，為編碼2A肽之核苷酸序列或編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2為編碼2A肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2為編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1為編碼2A肽之核苷酸序列及SPACER2為編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1為編碼GGSGG之核苷酸序列及SPACER2為編碼2A肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性CEA多肽。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性TERT多肽。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性MUC1多肽。
於又其他具體實例中，本揭示內容提供式(III)之多抗原建構體，其中於式(III)中：(i)TAA1為編碼致免疫性TERT多肽之核苷酸序列；(ii)TAA2為編碼致免疫性MUC1多肽之核苷酸序列；及(iii)TAA3為編碼致免疫性CEA多肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2，獨立地，為編碼2A肽之核苷酸序列或編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2為編碼2A肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2為編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1為編碼2A肽之核苷酸序列及SPACER2為編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1為編碼GGSGG之核苷酸序列及SPACER2為編碼2A肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性CEA多肽。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性TERT多肽。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性MUC1多肽。
於又其他具體實例中，本揭示內容提供式(III)之多抗原建構體，其中於式(III)中：(i)TAA1為編碼致免疫性TERT多肽之核苷酸序列；(ii)TAA2為編碼致免疫性CEA多肽之核苷酸序列；及(iii)TAA3為編碼致免疫性MUC1多肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2，獨立地，為編碼2A肽之核苷酸序列或編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2為編碼2A肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1及SPACER2為編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1為編碼2A肽之核苷酸序列及SPACER2為編碼GGSGG之核苷酸序列。於若干具體實例中，SPACER1為編碼GGSGG之核苷酸序列及SPACER2為編碼2A肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性CEA多肽。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性TERT多肽。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性MUC1多肽。
於若干明確具體實例中，本揭示內容提供選自由下列所組成群組之式之多抗原建構體： 　　(1)MUC1-2A-CEA-2A-TERT (IV) 　　(2)MUC1-2A-TERT-2A-CEA (V) 　　(3)CEA-2A-MUC1-2A-TERT(VI) 　　(4)CEA-2A-TERT-2A-MUC1(VII) 　　(5)TERT-2A-MUC1-2A-CEA(VIII) 　　(6)TERT-2A-CEA-2A-MUC1(IX) 　　其中於式(IV)-(IX)各式中：(i)MUC1、CEA及TERT分別表示編碼致免疫性MUC1多肽、致免疫性CEA多肽及致免疫性TERT多肽之核苷酸序列與(ii)2A為編碼2A肽之核苷酸序列。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性CEA多肽。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性TERT多肽。於若干具體實例中，抗原建構體編碼上文敘述之任一致免疫性MUC1多肽。
由多抗原建構體(包括雙抗原建構體及三抗原建構體)編碼之致免疫性CEA多肽、致免疫性MUC1多肽及致免疫性TERT多肽，可呈膜連型或胞質型。於若干明確具體實例中，致免疫性TAA多肽呈胞質型。
於若干具體實例中，由多抗原建構體編碼之致免疫性CEA多肽包含(1)N結構域之胺基酸序列及(2)人類CEA蛋白1、2、3、4或5C樣結構域之胺基酸序列。於若干特定具體實例中，致免疫性CEA多肽包含(1)至少四個C樣結構域(例如A2、B2、A3及B3)之胺基酸序列及(2)N結構域之胺基酸序列。於若干進一步具體實例中，致免疫性CEA多肽呈胞質型(或"cCEA")或膜連型(或"mCEA")。
於若干明確具體實例中，由多抗原建構體編碼之致免疫性CEA多肽包含選自於下之胺基酸序列： 　　(1)包含(i)SEQ ID NO：2之胺基酸323-677或(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸35-144及323-677或由其組成之胺基酸序列； 　　(2)包含(i)SEQ ID NO：2之胺基酸323-702或(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸2-144及323-702或由其組成之胺基酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：17之胺基酸序列[由質體1386編碼之胺基酸序列(mCEA)]或SEQ ID NO：17之胺基酸4-526； 　　(4)SEQ ID NO：19之胺基酸序列[由質體1390編碼之胺基酸序列(cCEA)]或SEQ ID NO：19之胺基酸4-468；或 　　(5)上述(1)至(4)中任一胺基酸序列之功能性變異體。
於若干明確具體實例中，由多抗原建構體編碼之致免疫性CEA多肽由選自於下之胺基酸序列組成： 　　(1)包含(i)SEQ ID NO：2之胺基酸323-677或(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸35-144及323-677或由其組成之胺基酸序列； 　　(2)包含(i)SEQ ID NO：2之胺基酸323-702或(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸2-144及323-702或由其組成之胺基酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：17之胺基酸序列[由質體1386編碼之胺基酸序列(mCEA)]或SEQ ID NO：17之胺基酸4-526； 　　(4)SEQ ID NO：19之胺基酸序列[由質體1390編碼之胺基酸序列(cCEA)]或SEQ ID NO：19之胺基酸4-468；或 　　(5)上述(1)至(4)中任一胺基酸序列之功能性變異體。
於若干特定具體實例中，多抗原建構體為DNA且包含(1)SEQ ID NO：14之核苷酸序列、(2)SEQ ID NO：16之核苷酸序列、(3)SEQ ID NO：18之核苷酸序列或(4)SEQ ID NO：14、16或18核苷酸序列之簡併變異體。於若干其他特定具體實例中，多抗原建構體為RNA且包含對應於(1)SEQ ID NO：14之核苷酸序列、(2)SEQ ID NO：16之核苷酸序列、(3)SEQ ID NO：18之核苷酸序列或(4)SEQ ID NO：14、16或18核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於若干具體實例中，由多抗原建構體編碼之致免疫性MUC1多肽包含(1)人類MUC1蛋白20個胺基酸之3至30個縱排重複序列之胺基酸序列及(2)VNTR區域側翼的人類MUC1蛋白之胺基酸序列。於若干明確具體實例中，由多抗原建構體編碼之致免疫性MUC1多肽包含選自由下列所組成群組之胺基酸序列： 　　(1)SEQ ID NO：5之胺基酸序列(質體1027多肽)； 　　(2)包含SEQ ID NO：5胺基酸4-537之胺基酸序列； 　　(3)包含SEQ ID NO：5胺基酸24-537之胺基酸序列； 　　(4)SEQ ID NO：7之胺基酸序列(質體1197多肽)； 　　(5)包含SEQ ID NO：7胺基酸4-517之胺基酸序列；及 　　(6)包含SEQ ID NO：7胺基酸4-517之胺基酸序列，附帶條件為位置513之胺基酸為T。
於若干具體實例中，由多抗原建構體編碼之致免疫性MUC1多肽由(1)人類MUC1蛋白20個胺基酸之3至30個縱排重複序列之胺基酸序列及(2)VNTR區域側翼的人類MUC1蛋白之胺基酸序列組成。於若干明確具體實例中，由多抗原建構體編碼之致免疫性MUC1多肽由選自由下列所組成群組之胺基酸序列組成： 　　(1)SEQ ID NO：5之胺基酸序列(質體1027多肽)； 　　(2)包含SEQ ID NO：5胺基酸4-537之胺基酸序列； 　　(3)包含SEQ ID NO：5胺基酸24-537之胺基酸序列； 　　(4)SEQ ID NO：7之胺基酸序列(質體1197多肽)； 　　(5)包含SEQ ID NO：7胺基酸4-517之胺基酸序列；及 　　(6)包含SEQ ID NO：7胺基酸4-517之胺基酸序列，附帶條件為位置513之胺基酸為T。
於若干明確具體實例中，由多抗原建構體編碼之致免疫性MUC1多肽由選自由下列所組成群組之胺基酸序列組成： 　　(1)由SEQ ID NO：5胺基酸4-537組成之胺基酸序列； 　　(2)由SEQ ID NO：5胺基酸24-537組成之胺基酸序列； 　　(3)由SEQ ID NO：7胺基酸4-517組成之胺基酸序列；及 　　(4)由SEQ ID NO：7胺基酸4-517組成之胺基酸序列，附帶條件為位置513之胺基酸為T。
於若干特定具體實例中，多抗原建構體為DNA且包含(1)SEQ ID NO：4之核苷酸序列、(2)SEQ ID NO：6之核苷酸序列或(3)SEQ ID NO：4或6核苷酸序列之簡併變異體。於若干其他特定具體實例中，多抗原建構體為RNA且包含對應於(1)SEQ ID NO：4之核苷酸序列、(2)SEQ ID NO：6之核苷酸序列或(3)SEQ ID NO：4或6核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
由多抗原建構體編碼之致免疫性TERT多肽可為全長TERT蛋白或TERT蛋白之任何截短或突變型。全長TERT蛋白被預期比截短型產生更強之免疫反應。然而，取決於所選擇遞送建構體之特定載體，該載體可能未具攜帶編碼全長TERT蛋白基因之能力。因此，可能從該蛋白刪除一些胺基酸俾使轉殖基因適合特定載體。刪除胺基酸可從TERT蛋白序列(例如源自SEQ ID NO：3之TERT蛋白)的N端、C端或任何地方進行。可進行附加之刪除以去除核定位訊息，從而使多肽細胞質化，增加接近細胞抗原處理/呈現機制的機會。於若干具體實例中，源自致免疫性TERT多肽(例如源自SEQ ID NO：3之TERT蛋白)的TERT蛋白N端高達位置200、300、400、500或600之胺基酸不存在。
於若干明確具體實例中，SEQ ID NO：3之TERT蛋白N端胺基酸1-343(TERT343)、1-240(TERT240)或1-541(TERT541)不存在。因此，於一具體實例中，由本發明多抗原建構體編碼之致免疫性TERT多肽之胺基酸序列為下述任一者： 　　(1)包含SEQ ID NO：3胺基酸51-1132及缺少SEQ ID NO：3胺基酸1至50之胺基酸序列； 　　(2)包含SEQ ID NO：3胺基酸101-1132及缺少SEQ ID NO：3胺基酸1至100之胺基酸序列； 　　(3)包含SEQ ID NO：3胺基酸151-1132及缺少SEQ ID NO：3胺基酸1至150之胺基酸序列； 　　(4)包含SEQ ID NO：3胺基酸201-1132及缺少SEQ ID NO：3胺基酸1至200之胺基酸序列； 　　(5)包含SEQ ID NO：3胺基酸241-1132及缺少SEQ ID NO：3胺基酸1至240之胺基酸序列； 　　(6)包含SEQ ID NO：3胺基酸301-1132及缺少SEQ ID NO：3胺基酸1至300之胺基酸序列； 　　(7)包含SEQ ID NO：3胺基酸351-1132及缺少SEQ ID NO：3胺基酸1至350之胺基酸序列； 　　(8)包含SEQ ID NO：3胺基酸401-1132及缺少SEQ ID NO：3胺基酸1至400之胺基酸序列； 　　(9)包含SEQ ID NO：3胺基酸451-1132及缺少SEQ ID NO：3胺基酸1至450之胺基酸序列； 　　(10)包含SEQ ID NO：3胺基酸501-1132及缺少SEQ ID NO：3胺基酸1至500之胺基酸序列； 　　(11)包含SEQ ID NO：3胺基酸551-1132及缺少SEQ ID NO：3胺基酸1至550之胺基酸序列；或 　　(12)包含SEQ ID NO：3胺基酸601-1132及缺少SEQ ID NO：3胺基酸1-600之胺基酸序列。
於一具體實例中，由本發明多抗原建構體編碼之致免疫性TERT多肽之胺基酸序列為下述任一者： 　　(1)由SEQ ID NO：3胺基酸51-1132、101-1132、151-1132、201-1132、251-1132、301-1132、351-1132、401-1132、451-1132、501-1132或551-1132組成之胺基酸序列； 　　(2)由SEQ ID NO：3胺基酸601-1132組成之胺基酸序列； 　　(3)由SEQ ID NO：3胺基酸542-1132組成之胺基酸序列； 　　(4)由SEQ ID NO：3胺基酸344-1132組成之胺基酸序列； 　　(5)由SEQ ID NO：3胺基酸241-1132組成之胺基酸序列。
可引入附加之胺基酸突變俾使TERT催化結構域失活。該等突變之實例包括於SEQ ID NO：3位置712天冬胺酸之取代，例如D712A，及於SEQ ID NO：3位置713纈胺酸之取代，例如V713I。因此，於一具體實例中，經多抗原建構體編碼之致免疫性TERT多肽由上文揭示之任何TERT多肽組成，其中在對應於SEQ ID NO：3位置712天冬胺酸經取代及/或在對應於SEQ ID NO：3位置713纈胺酸經取代，及其中該(等)突變使TERT催化結構域失活。於一具體實例中，該突變由在對應於SEQ ID NO：3位置712天冬胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO：3位置713纈胺酸之取代組成，其中該(等)突變使TERT催化結構域失活。於一具體實例中，該突變由在對應於SEQ ID NO：3位置712以丙胺酸取代天冬胺酸(D712A)及在對應於SEQ ID NO：3位置713以異白胺酸取代纈胺酸(V713I)組成。
於若干明確具體實例中，由多抗原建構體編碼之致免疫性TERT多肽包含選自由下列所組成群組之胺基酸序列： 　　(1)SEQ ID NO：9之胺基酸序列(質體1112多肽)或包含SEQ ID NO：9胺基酸2-893之胺基酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：11之胺基酸序列(質體1326多肽)或包含SEQ ID NO：11胺基酸4-791之胺基酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：13之胺基酸序列(質體1330多肽)或包含SEQ ID NO：13胺基酸4-594之胺基酸序列；或 　　(4)為上述(1)至(3)中任一胺基酸序列功能性變異體之胺基酸序列。
於若干明確具體實例中，由多抗原建構體編碼之致免疫性TERT多肽由選自由下列所組成群組之胺基酸序列組成： 　　(1)SEQ ID NO：9之胺基酸序列(質體1112多肽)或包含SEQ ID NO：9胺基酸2-893之胺基酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：11之胺基酸序列(質體1326多肽)或包含SEQ ID NO：11胺基酸4-791之胺基酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：13之胺基酸序列(質體1330多肽)或包含SEQ ID NO：13胺基酸4-594之胺基酸序列；或 　　(4)為上述(1)至(3)中任一胺基酸序列功能性變異體之胺基酸序列。
於若干明確具體實例中，由多抗原建構體編碼之致免疫性TERT多肽由選自由下列所組成群組之胺基酸序列組成： 　　(1)由SEQ ID NO：9胺基酸2-893組成之胺基酸序列； 　　(2)由SEQ ID NO：11胺基酸4-791組成之胺基酸序列； 　　(3)由SEQ ID NO：13胺基酸4-594組成之胺基酸序列；或 　　(4)為上述(1)至(3)中任一胺基酸序列功能性變異體之胺基酸序列。
於若干特定具體實例中，多抗原建構體為DNA且包含(1)SEQ ID NO：8之核苷酸序列、(2)SEQ ID NO：10之核苷酸序列、(3)SEQ ID NO：12之核苷酸序列或(4)SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12核苷酸序列之簡併變異體。於若干其他特定具體實例中，多抗原建構體為RNA且包含對應於(1)SEQ ID NO：8核苷酸序列、(2)SEQ ID NO：10核苷酸序列、(3)SEQ ID NO：12核苷酸序列或(4)SEQ ID NO：8、10或12核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於若干特定具體實例中，本揭示內容提供多抗原建構體，其包含(i)編碼致免疫性CEA多肽之至少一種核苷酸序列及(ii)編碼致免疫性MUC1多肽或者致免疫性TERT多肽之至少一種核苷酸序列，其中該多抗原建構體編碼之胺基酸序列包括： 　　(1)SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：31胺基酸4-1088之胺基酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：33胺基酸4-1081之胺基酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：35胺基酸4-1085之胺基酸序列； 　　(4)SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：37胺基酸4-1030之胺基酸序列； 　　(5)SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：39胺基酸4-1381之胺基酸序列；或 　　(6)SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：41胺基酸4-1441之胺基酸序列。
於若干特定具體實例中，本揭示內容提供多抗原建構體，其包含(i)編碼致免疫性CEA多肽之至少一種核苷酸序列及(ii)編碼致免疫性MUC1多肽或者致免疫性TERT多肽之至少一種核苷酸序列，其中該多抗原建構體編碼由下列者組成之胺基酸序列： 　　(1)SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：31胺基酸4-1088之胺基酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：33胺基酸4-1081之胺基酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：35胺基酸4-1085之胺基酸序列； 　　(4)SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：37胺基酸4-1030之胺基酸序列； 　　(5)SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：39胺基酸4-1381之胺基酸序列；或 　　(6)SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：41胺基酸4-1441之胺基酸序列。
於若干明確具體實例中，本揭示內容提供多抗原建構體，其為DNA且包含(i)編碼致免疫性CEA多肽之至少一種核苷酸序列及(ii)編碼致免疫性MUC1多肽或者致免疫性TERT多肽之至少一種核苷酸序列，其中該多抗原建構體包含選自由下列所組成群組之核苷酸序列： 　　(1)SEQ ID NO：30核苷酸序列或包含SEQ ID NO：30核苷酸10-3264之核苷酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：32核苷酸序列或包含SEQ ID NO：32核苷酸10-3243之核苷酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：34核苷酸序列或包含SEQ ID NO：34核苷酸10-3255之核苷酸序列； 　　(4)SEQ ID NO：36核苷酸序列或包含SEQ ID NO：36核苷酸10-3090之核苷酸序列； 　　(5)SEQ ID NO：38核苷酸序列或包含SEQ ID NO：38核苷酸10-4143之核苷酸序列； 　　(6)SEQ ID NO：40核苷酸序列或包含SEQ ID NO：40核苷酸10-4323之核苷酸序列；或 　　(7)為上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於若干明確具體實例中，本揭示內容提供多抗原建構體，其為DNA且包含(i)編碼致免疫性CEA多肽之至少一種核苷酸序列及(ii)編碼致免疫性MUC1多肽或者致免疫性TERT多肽之至少一種核苷酸序列，其中該多抗原建構體包含選自由下列所組成群組之核苷酸序列： 　　(1)由SEQ ID NO：30核苷酸10-3264組成之核苷酸序列； 　　(2)由SEQ ID NO：32核苷酸10-3243組成之核苷酸序列； 　　(3)由SEQ ID NO：34核苷酸10-3255組成之核苷酸序列； 　　(4)由SEQ ID NO：36核苷酸10-3090組成之核苷酸序列； 　　(5)由SEQ ID NO：38核苷酸10-4143組成之核苷酸序列； 　　(6)由SEQ ID NO：40核苷酸10-4323組成之核苷酸序列；或 　　(7)為上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於若干其他特定具體實例中，本揭示內容提供多抗原建構體，其為RNA(例如mRNA)且包含(i)編碼致免疫性CEA多肽之至少一種核苷酸序列及(ii)編碼致免疫性MUC1多肽或者致免疫性TERT多肽之至少一種核苷酸序列，其中該多抗原建構體包含對應於選自由下列所組成群組的核苷酸序列之核苷酸序列： 　　(1)SEQ ID NO：30核苷酸序列或包含SEQ ID NO：30核苷酸10-3264之核苷酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：32核苷酸序列或包含SEQ ID NO：32核苷酸10-3243之核苷酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：34核苷酸序列或包含SEQ ID NO：34核苷酸10-3255之核苷酸序列； 　　(4)SEQ ID NO：36核苷酸序列或包含SEQ ID NO：36核苷酸10-3090之核苷酸序列； 　　(5)SEQ ID NO：38核苷酸序列或包含SEQ ID NO：38核苷酸10-4143之核苷酸序列； 　　(6)SEQ ID NO：40核苷酸序列或包含SEQ ID NO：40核苷酸10-4323之核苷酸序列；或 　　(7)為上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於若干其他特定具體實例中，本揭示內容提供多抗原建構體，其為RNA(例如mRNA)且包含(i)編碼致免疫性CEA多肽之至少一種核苷酸序列及(ii)編碼致免疫性MUC1多肽或者致免疫性TERT多肽之至少一種核苷酸序列，其中該多抗原建構體包含對應於選自由下列所組成群組的核苷酸序列之核苷酸序列： 　　(1)由SEQ ID NO：30核苷酸10-3264組成之核苷酸序列； 　　(2)由SEQ ID NO：32核苷酸10-3243組成之核苷酸序列； 　　(3)由SEQ ID NO：34核苷酸10-3255組成之核苷酸序列； 　　(4)由SEQ ID NO：36核苷酸10-3090組成之核苷酸序列； 　　(5)由SEQ ID NO：38核苷酸10-4143組成之核苷酸序列； 　　(6)由SEQ ID NO：40核苷酸10-4323組成之核苷酸序列；或 　　(7)為上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於若干其他具體實例中，本揭示內容提供多抗原建構體，其包含(1)編碼致免疫性CEA多肽之至少一種核苷酸序列、(2)編碼致免疫性MUC1多肽之至少一種核苷酸序列及(3)編碼致免疫性TERT多肽之至少一種核苷酸序列，其中該多抗原建構體包含編碼選自由下列所組成群組的胺基酸序列之核苷酸序列： 　　(1)SEQ ID NO：43胺基酸序列或包含SEQ ID NO：43胺基酸4-2003之胺基酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：45胺基酸序列或包含SEQ ID NO：45胺基酸4-2001之胺基酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：47胺基酸序列或包含SEQ ID NO：47胺基酸4-2008之胺基酸序列； 　　(4)SEQ ID NO：49胺基酸序列或包含SEQ ID NO：49胺基酸4-1996之胺基酸序列； 　　(5)SEQ ID NO：51胺基酸序列或包含SEQ ID NO：51胺基酸4-1943之胺基酸序列；或 　　(6)SEQ ID NO：53胺基酸序列或包含SEQ ID NO：53胺基酸4-1943之胺基酸序列。
於若干其他具體實例中，本揭示內容提供多抗原建構體，其包含(1)編碼致免疫性CEA多肽之至少一種核苷酸序列、(2)編碼致免疫性MUC1多肽之至少一種核苷酸序列及(3)編碼致免疫性TERT多肽之至少一種核苷酸序列，其中該多抗原建構體包含編碼選自由下列所組成群組的胺基酸序列之核苷酸序列： 　　(1)由SEQ ID NO：43胺基酸4-2003組成之胺基酸序列； 　　(2)由SEQ ID NO：45胺基酸4-2001組成之胺基酸序列； 　　(3)由SEQ ID NO：47胺基酸4-2008組成之胺基酸序列； 　　(4)由SEQ ID NO：49胺基酸4-1996組成之胺基酸序列； 　　(5)由SEQ ID NO：51胺基酸4-1943組成之胺基酸序列；或 　　(6)由SEQ ID NO：53胺基酸4-1943組成之胺基酸序列。
於若干特定具體實例中，本揭示內容提供多抗原建構體，其包含(1)編碼致免疫性CEA多肽之至少一種核苷酸序列、(2)編碼致免疫性MUC1多肽之至少一種核苷酸序列及(3)編碼致免疫性TERT多肽之至少一種核苷酸序列，其中該多抗原建構體為DNA且包含選自由下列所組成群組之核苷酸序列： 　　(1)SEQ ID NO：42核苷酸序列或包含SEQ ID NO：42核苷酸10-6009之核苷酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：44核苷酸序列或包含SEQ ID NO：44核苷酸10-6003之核苷酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：46核苷酸序列或包含SEQ ID NO：46核苷酸10-6024之核苷酸序列； 　　(4)SEQ ID NO：48核苷酸序列或包含SEQ ID NO：48核苷酸10-5988之核苷酸序列； 　　(5)SEQ ID NO：50核苷酸序列或包含SEQ ID NO：50核苷酸10-5829之核苷酸序列； 　　(6)SEQ ID NO：52核苷酸序列或包含SEQ ID NO：52核苷酸10-5829之核苷酸序列；及 　　(7)為上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於若干特定具體實例中，本揭示內容提供多抗原建構體，其包含(1)編碼致免疫性CEA多肽之至少一種核苷酸序列、(2)編碼致免疫性MUC1多肽之至少一種核苷酸序列及(3)編碼致免疫性TERT多肽之至少一種核苷酸序列，其中該多抗原建構體為DNA且包含選自由下列所組成群組之核苷酸序列： 　　(1)由SEQ ID NO：42核苷酸10-6009組成之核苷酸序列； 　　(2)由SEQ ID NO：44核苷酸10-6003組成之核苷酸序列； 　　(3)由SEQ ID NO：46核苷酸10-6024組成之核苷酸序列； 　　(4)由SEQ ID NO：48核苷酸10-5988組成之核苷酸序列； 　　(5)由SEQ ID NO：50核苷酸10-5829組成之核苷酸序列； 　　(6)由SEQ ID NO：52核苷酸10-5829組成之核苷酸序列；及 　　(7)為上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於若干其他特定具體實例中，本揭示內容提供多抗原建構體，其中該多抗原建構體為RNA(例如mRNA)且包含對應於選自由下列所組成群組的核苷酸序列之核苷酸序列： 　　(1)SEQ ID NO：42核苷酸序列或包含SEQ ID NO：42核苷酸10-6009之核苷酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：44核苷酸序列或包含SEQ ID NO：44核苷酸10-6003之核苷酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：46核苷酸序列或包含SEQ ID NO：46核苷酸10-6024之核苷酸序列； 　　(4)SEQ ID NO：48核苷酸序列或包含SEQ ID NO：48核苷酸10-5988之核苷酸序列； 　　(5)SEQ ID NO：50核苷酸序列或包含SEQ ID NO：50核苷酸10-5829之核苷酸序列； 　　(6)SEQ ID NO：52核苷酸序列或包含SEQ ID NO：52核苷酸10-5829之核苷酸序列；及 　　(7)為上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於若干其他特定具體實例中，本揭示內容提供多抗原建構體，其中該多抗原建構體為RNA(例如mRNA)且包含對應於選自由下列所組成群組的核苷酸序列之核苷酸序列： 　　(1)由SEQ ID NO：42核苷酸10-6009組成之核苷酸序列； 　　(2)由SEQ ID NO：44核苷酸10-6003組成之核苷酸序列； 　　(3)由SEQ ID NO：46核苷酸10-6024組成之核苷酸序列； 　　(4)由SEQ ID NO：48核苷酸10-5988組成之核苷酸序列； 　　(5)由SEQ ID NO：50核苷酸10-5829組成之核苷酸序列； 　　(6)由SEQ ID NO：52核苷酸10-5829組成之核苷酸序列；及 　　(7)為上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於又其他特定具體實例中，本揭示內容提供包含(1)編碼致免疫性CEA多肽之至少一種核苷酸序列、(2)編碼致免疫性MUC1多肽之至少一種核苷酸序列及(3)編碼致免疫性TERT多肽之至少一種核苷酸序列之多抗原建構體，其中該多抗原建構體為RNA(例如mRNA)且包含選自由下列所組成群組之核苷酸序列： 　　(1)SEQ ID NO：87之核苷酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：88之核苷酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：89之核苷酸序列； 　　(4)SEQ ID NO：90之核苷酸序列； 　　(5)SEQ ID NO：91之核苷酸序列； 　　(6)SEQ ID NO：92之核苷酸序列；及 　　(7)SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：92任一核苷酸序列之簡併變異體。
於又其他特定具體實例中，本揭示內容提供包含(1)編碼致免疫性CEA多肽之至少一種核苷酸序列、(2)編碼致免疫性MUC1多肽之至少一種核苷酸序列及(3)編碼致免疫性TERT多肽之至少一種核苷酸序列的多抗原建構體，其中該多抗原建構體為RNA(例如mRNA)且係由選自由下列所組成群組之核苷酸序列組成： 　　(1)SEQ ID NO：87之核苷酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：88之核苷酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：89之核苷酸序列； 　　(4)SEQ ID NO：90之核苷酸序列； 　　(5) SEQ ID NO：91之核苷酸序列； 　　(6)SEQ ID NO：92之核苷酸序列；及 　　(7)SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：92任一核苷酸序列之簡併變異體。 　　 D.含有抗原建構體之載體
本發明之另一態樣係有關含有一或多種本揭示內容提供的任一抗原建構體之載體，包括單抗原建構體、雙抗原建構體、三抗原建構體及其他多抗原建構體。載體係用於選殖或表現由抗原建構體編碼之致免疫性TAA多肽或用於遞送組成物(例如疫苗)中之抗原建構體至宿主細胞或宿主動物(例如人類)。
可製備各式各樣載體以包含及表現本揭示內容提供的抗原建構體，例如質體載體、黏接質體載體、噬菌體載體及病毒載體。除了亦稱為開放閱讀框架(ORF)之轉殖基因嵌入序列(即，本揭示內容提供之單抗原建構體或多抗原建構體)之外，載體之結構通常包含賦予或促進表現之其他成分或元件，例如複製起點、多選殖位點及可選擇標記。
於若干具體實例中，本揭示內容提供含有本揭示內容提供的抗原建構體之質體載體。適當質體載體之實例包括pBR325、pUC18、pSKF、pET23D及pGB-2。質體載體之其他實例、以及建構該等載體之方法見述於U.S. Pat. Nos. 5,589,466、5,688,688及5,814,482。包含單抗原建構體、雙抗原建構體或三抗原建構體等特定例示性質體載體之建構亦見述於本揭示內容。
於若干明確具體實例中，本揭示內容提供包含SEQ ID NOs：54、55、56、57、59、61、63、65、67、69、70、71、72、73及74任一核苷酸序列之質體載體。
於其他具體實例中，本發明提供從病毒[包括DNA病毒及RNA病毒(反轉錄病毒)]建構之載體(即，病毒載體)。可用以建構載體之DNA病毒實例包括單純疱疹病毒、細小病毒、痘瘡病毒及腺病毒。可用以建構載體之RNA病毒實例包括α病毒、黃病毒、瘟疫病毒、流感病毒、狂犬病病毒及水疱病毒。源自各種病毒的載體之建構為此項技藝中已知。反轉錄病毒載體之實例見述於U.S. Pat. Nos. 5,716,613、5,716,832及5,817,491。可從α病毒產生的載體之實例見述於U.S. Pat. Nos. 5,091,309、5,843,723及5,789,245。其他載體之實例包括：(1)痘病病毒，例如金絲雀痘病病毒或痘瘡病毒(U.S. Pat. Nos. 4,603,112、4,769,330及5,017,487；WO 89/01973)；(2)SV40(Mulligan et al., Nature 277：108-114, 1979)；(3)皰疹(Kit, Adv. Exp. Med. Biol. 215：219-236, 1989；U.S. Pat. No. 5,288,641)及(4)慢病毒例如HIV(Poznansky, J. Virol. 65：532-536, 1991)。
於若干特定具體實例中，本揭示內容提供衍生自非人類靈長類腺病毒(例如猿猴腺病毒)之腺病毒載體。該等腺病毒載體之實例，以及其製備，見述於PCT申請公告案WO2005/071093及WO2010/086189，且包括以猿猴腺病毒建構之非複製性載體，例如ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63、ChAd68、ChAd82、ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、Pan Ad2與Pan Ad3，及以腺病毒Ad4或Ad7建構之具複製能力之載體。較佳為，於以猿猴腺病毒建構腺病毒載體中，選自E1A、E1B、E2A、E2B、E3及E4之源自該病毒基因體區域之一或多個早期基因利用刪除或突變而缺失或使其不具功能。於特定具體實例中，該載體係以ChAd68建構。黑猩猩腺病毒ChAd68於文獻中亦稱為猿猴腺病毒25、C68、AdC68、Chad68、SAdV25、PanAd9或Pan9。建構源自ChAd68之載體供表現多抗原建構體用之方法見述於國際專利申請公告案WO2015/063647中。表現載體通常包括一或多種與待表現核酸序列連接之可操作控制元件。"控制元件"一詞概括地係指啓動子區域、多聚腺苷酸化訊息、轉錄終止序列、上游調控結構域、複製起始點、內部核醣體進入位點("IRES")、增強子等，其概括地提供受體細胞中編碼序列之複製、轉錄及轉譯。只要所挑選之編碼序列能於適當宿主細胞中被複製、轉錄及轉譯，所有這些控制元件非必要一直存在。根據熟習此項技藝人士已知之一些因素(例如特定之宿主細胞及其他載體成分之來源或結構)挑選控制元件。為了增強致免疫性TAA多肽之表現，可於編碼致免疫性TAA多肽序列之上游提供Kozak序列。已知脊椎動物之Kozak序列為(GCC)NCCATGG，其中N為A或G且GCC較不保守。可使用之例示Kozak序列包括GAACATGG、ACCAUGG及ACCATGG。
於若干具體實例中，載體包含編碼(i)至少一種致免疫性CEA多肽及(ii)至少一種致免疫性MUC1多肽或至少一種致免疫性TERT多肽之多抗原建構體。載體可為DNA質體載體、DNA病毒載體、RNA質體載體或RNA病毒載體。於若干明確具體實例中，載體為DNA載體且包括含有選自由下列所組成群組的核苷酸序列之多抗原建構體： 　　(1)SEQ ID NO：30核苷酸序列或包含SEQ ID NO：30核苷酸10-3264之核苷酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：32核苷酸序列或包含SEQ ID NO：32核苷酸10-3243之核苷酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：34核苷酸序列或包含SEQ ID NO：34核苷酸10-3255之核苷酸序列； 　　(4)SEQ ID NO：36核苷酸序列或包含SEQ ID NO：36核苷酸10-3090之核苷酸序列； 　　(5)SEQ ID NO：38核苷酸序列或包含SEQ ID NO：38核苷酸10-4143之核苷酸序列； 　　(6)SEQ ID NO：40核苷酸序列或包含SEQ ID NO：40核苷酸10-4323之核苷酸序列；及 　　(7)為上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於若干其他特定具體實例中，本揭示內容提供RNA載體，其包含對應於選自由下列所組成群組的核苷酸序列之核苷酸序列： 　　(1)SEQ ID NO：30核苷酸序列或包含SEQ ID NO：30核苷酸10-3264之核苷酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：32核苷酸序列或包含SEQ ID NO：32核苷酸10-3243之核苷酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：34核苷酸序列或包含SEQ ID NO：34核苷酸10-3255之核苷酸序列； 　　(4)SEQ ID NO：36核苷酸序列或包含SEQ ID NO：36核苷酸10-3090之核苷酸序列； 　　(5)SEQ ID NO：38核苷酸序列或包含SEQ ID NO：38核苷酸10-4143之核苷酸序列； 　　(6)SEQ ID NO：40核苷酸序列或包含SEQ ID NO：40核苷酸10-4323之核苷酸序列；及 　　(7)為上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於若干其他具體實例中，載體含有編碼(i)至少一種致免疫性MUC1多肽、(ii)至少一種致免疫性CEA多肽及(iii)至少一種致免疫性TERT多肽之多抗原建構體。該載體可為DNA質體載體、DNA病毒載體、RNA質體載體或RNA病毒載體。於若干明確具體實例中，本揭示內容提供DNA載體，其包括含有選自由下列所組成群組的核苷酸序列之多抗原建構體： 　　(1)SEQ ID NO：42核苷酸序列或包含SEQ ID NO：42核苷酸10-6009之核苷酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：44核苷酸序列或包含SEQ ID NO：44核苷酸10-6003之核苷酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：46核苷酸序列或包含SEQ ID NO：46核苷酸10-6024之核苷酸序列； 　　(4)SEQ ID NO：48核苷酸序列或包含SEQ ID NO：48核苷酸10-5988之核苷酸序列； 　　(5)SEQ ID NO：50核苷酸序列或包含SEQ ID NO：50核苷酸10-5829之核苷酸序列；或 　　(6)SEQ ID NO：52核苷酸序列或包含SEQ ID NO：52核苷酸10-5829之核苷酸序列；及 　　(7)為上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於若干其他特定具體實例中，本揭示內容提供RNA載體，其包含對應於選自由下列所組成群組的核苷酸序列之核苷酸序列： 　　(1)SEQ ID NO：42核苷酸序列或包含SEQ ID NO：42核苷酸10-6009之核苷酸序列； 　　(2)SEQ ID NO：44核苷酸序列或包含SEQ ID NO：44核苷酸10-6003之核苷酸序列； 　　(3)SEQ ID NO：46核苷酸序列或包含SEQ ID NO：46核苷酸10-6024之核苷酸序列； 　　(4)SEQ ID NO：48核苷酸序列或包含SEQ ID NO：48核苷酸10-5988之核苷酸序列； 　　(5)SEQ ID NO：50核苷酸序列或包含SEQ ID NO：50核苷酸10-5829之核苷酸序列； 　　(6)SEQ ID NO：52核苷酸序列或包含SEQ ID NO：52核苷酸10-5829之核苷酸序列；及 　　(7)為上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於若干明確具體實例中，本揭示內容提供包含SEQ ID NOs：58、60、62、64、66及68任一核苷酸序列之DNA病毒載體。於若干其他特定具體實例中，本揭示內容提供包含SEQ ID NOs：57、59、61、63、65、67、69、70、71、72、73及74任一核苷酸序列之DNA質體載體。
於若干明確具體實例中，該載體為DNA載體且包括含有選自由下列所組成群組的核苷酸序列之多抗原建構體： 　　(1)由SEQ ID NO：30核苷酸10-3264組成之核苷酸序列； 　　(2)由SEQ ID NO：32核苷酸10-3243組成之核苷酸序列； 　　(3)由SEQ ID NO：34核苷酸10-3255組成之核苷酸序列； 　　(4)由SEQ ID NO：36核苷酸10-3090組成之核苷酸序列； 　　(5)由SEQ ID NO：38核苷酸10-4143組成之核苷酸序列； 　　(6)由SEQ ID NO：40核苷酸10-4323組成之核苷酸序列；及 　　(7)為上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於若干其他特定具體實例中，本揭示內容提供RNA載體，其包含對應於選自由下列所組成群組的核苷酸序列之核苷酸序列： 　　(1)由SEQ ID NO：30核苷酸10-3264組成之核苷酸序列； 　　(2)由SEQ ID NO：32核苷酸10-3243組成之核苷酸序列； 　　(3)由SEQ ID NO：34核苷酸10-3255組成之核苷酸序列； 　　(4)由SEQ ID NO：36核苷酸10-3090組成之核苷酸序列； 　　(5)由SEQ ID NO：38核苷酸10-4143組成之核苷酸序列； 　　(6)由SEQ ID NO：40核苷酸10-4323組成之核苷酸序列；及 　　(7)為上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於若干其他具體實例中，載體含有編碼(i)至少一種致免疫性MUC1多肽、(ii)至少一種致免疫性CEA多肽及(iii)至少一種致免疫性TERT多肽之多抗原建構體。該載體可為DNA質體載體、DNA病毒載體、RNA質體載體或RNA病毒載體。於若干明確具體實例中，本揭示內容提供DNA載體，其包括含有選自由下列所組成群組的核苷酸序列之多抗原建構體： 　　(1)由SEQ ID NO：42核苷酸10-6009組成之核苷酸序列； 　　(2)由SEQ ID NO：44核苷酸10-6003組成之核苷酸序列； 　　(3)由SEQ ID NO：46核苷酸10-6024組成之核苷酸序列； 　　(4)由SEQ ID NO：48核苷酸10-5988組成之核苷酸序列； 　　(5)由SEQ ID NO：50核苷酸10-5829組成之核苷酸序列；或 　　(6)由SEQ ID NO：52核苷酸10-5829組成之核苷酸序列；及 　　(7)為上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於若干明確具體實例中，本揭示內容提供由SEQ ID NOs：58、60、62、64、66及68任一核苷酸序列組成之DNA病毒載體。於若干其他特定具體實例中，本揭示內容提供由SEQ ID NOs：57、59、61、63、65、67、69、70、71、72、73及74任一核苷酸序列組成之DNA質體載體。
於若干其他特定具體實例中，本揭示內容提供RNA載體，其包含對應於選自由下列所組成群組的核苷酸序列之核苷酸序列： 　　(1)由SEQ ID NO：42核苷酸10-6009組成之核苷酸序列； 　　(2)由SEQ ID NO：44核苷酸10-6003組成之核苷酸序列； 　　(3)由SEQ ID NO：46核苷酸10-6024組成之核苷酸序列； 　　(4)由SEQ ID NO：48核苷酸10-5988組成之核苷酸序列； 　　(5)由SEQ ID NO：50核苷酸10-5829組成之核苷酸序列； 　　(6)由SEQ ID NO：52核苷酸10-5829組成之核苷酸序列；及 　　(7)為上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。 E.包含抗原建構體或載體之組成物
本揭示內容亦提供組成物，其包含單離之核酸分子(即，抗原建構體)或本揭示內容提供之載體。組成物可只包含一種單獨之抗原建構體，例如雙抗原建構體或三抗原建構體。其亦可包含兩種或兩種以上不同之單獨抗原建構體，例如單抗原建構體及雙抗原建構體之組合或編碼不同致免疫性TAA多肽之三或多種單抗原建構體之組合。該組成物可用於在哺乳動物(包括人類)活體外或活體內引出針對TAA蛋白之免疫反應。於若干具體實例中，該組成物為致免疫性組成物或醫藥組成物。於若干特定具體實例中，該組成物為給予人類以用於(1)抑制異常細胞增殖、針對癌症之進展提供保護(作為預防劑)、(2)治療與TAA過度表現相關之癌症(作為治療劑)或(3)對特定人類TAA(例如CEA、MUC1及TERT)引出免疫反應之疫苗組成物。
於若干具體實例中，本揭示內容所提供之組成物包含多抗原建構體或包含多抗原建構體之載體，其中該多抗原建構體編碼兩種或兩種以上致免疫性TAA多肽。舉例而言，多抗原建構體可編碼下述任一組合中之兩種或兩種以上致免疫性TAA多肽： 　　(1)致免疫性CEA多肽及致免疫性MUC1多肽； 　　(2)致免疫性CEA多肽及致免疫性TERT多肽；及 　　(3)致免疫性CEA多肽、致免疫性MUC1多肽及致免疫性TERT多肽。
於若干特定具體實例中，本揭示內容所提供之組成物包含雙抗原建構體或包含雙抗原建構體之載體，其中該雙抗原建構體包含選自由下列所組成群組之核苷酸序列： 　　(1)編碼SEQ ID NO：31胺基酸序列或SEQ ID NO：31胺基酸4-1088之核苷酸序列； 　　(2)編碼SEQ ID NO：33胺基酸序列或SEQ ID NO：33胺基酸4-1081之核苷酸序列； 　　(3)編碼SEQ ID NO：35胺基酸序列或SEQ ID NO：35胺基酸4-1085之核苷酸序列； 　　(4)編碼SEQ ID NO：37胺基酸序列或SEQ ID NO：37胺基酸4-1030之核苷酸序列； 　　(5)編碼SEQ ID NO：39胺基酸序列或SEQ ID NO：39胺基酸4-1381之核苷酸序列； 　　(6)編碼SEQ ID NO：41胺基酸序列或SEQ ID NO：41胺基酸4-1441之核苷酸序列； 　　(7)SEQ ID NO：30核苷酸序列或包含SEQ ID NO：30核苷酸10-3264之核苷酸序列； 　　(8)SEQ ID NO：32核苷酸序列或包含SEQ ID NO：32核苷酸10-3243之核苷酸序列； 　　(9)SEQ ID NO：34核苷酸序列或包含SEQ ID NO：34核苷酸10-3255之核苷酸序列； 　　(10)SEQ ID NO：36核苷酸序列或包含SEQ ID NO：36核苷酸10-3090之核苷酸序列； 　　(11)SEQ ID NO：38核苷酸序列或包含SEQ ID NO：38核苷酸10-4143之核苷酸序列； 　　(12)SEQ ID NO：40核苷酸序列或包含SEQ ID NO：40核苷酸10-4323之核苷酸序列；及 　　(13)為上述(1)至(12)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於若干其他特定具體實例中，本揭示內容所提供之組成物包含(1)三抗原建構體或(2)包含三抗原建構體之載體，其中該三抗原建構體包含選自由下列所組成群組之核苷酸序列： 　　(1)編碼SEQ ID NO：43胺基酸序列或SEQ ID NO：43胺基酸4-2003之核苷酸序列； 　　(2)編碼SEQ ID NO：45胺基酸序列或SEQ ID NO：45胺基酸4-2001之核苷酸序列； 　　(3)編碼SEQ ID NO：47胺基酸序列或SEQ ID NO：47胺基酸4-2008之核苷酸序列； 　　(4)編碼SEQ ID NO：49胺基酸序列或SEQ ID NO：49胺基酸4-1996之核苷酸序列； 　　(5)編碼SEQ ID NO：51胺基酸序列或SEQ ID NO：51胺基酸4-1943之核苷酸序列； 　　(6)編碼SEQ ID NO：53胺基酸序列或SEQ ID NO：53胺基酸4-1943之核苷酸序列； 　　(7)SEQ ID NO：42核苷酸序列或包含SEQ ID NO：42核苷酸10-6009之核苷酸序列； 　　(8)SEQ ID NO：44核苷酸序列或包含SEQ ID NO：44核苷酸10-6003之核苷酸序列； 　　(9)SEQ ID NO：46核苷酸序列或包含SEQ ID NO：46核苷酸10-6024之核苷酸序列； 　　(10)SEQ ID NO：48核苷酸序列或包含SEQ ID NO：48核苷酸10-5988之核苷酸序列； 　　(11)SEQ ID NO：50核苷酸序列或包含SEQ ID NO：50核苷酸10-5829之核苷酸序列； 　　(12)SEQ ID NO：52核苷酸序列或包含SEQ ID NO：52核苷酸10-5829之核苷酸序列；及 　　(13)為上述(1)至(12)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於若干其他特定具體實例中，本揭示內容所提供之組成物包含三抗原建構體或包含三抗原建構體之載體，其中該三抗原建構體包含選自由下列所組成群組之核苷酸序列： 　　(1)由SEQ ID NO：42核苷酸10-6009組成之核苷酸序列； 　　(2)由SEQ ID NO：44核苷酸10-6003組成之核苷酸序列； 　　(3)由SEQ ID NO：46核苷酸10-6024組成之核苷酸序列； 　　(4)由SEQ ID NO：48核苷酸10-5988組成之核苷酸序列； 　　(5)由SEQ ID NO：50核苷酸10-5829組成之核苷酸序列； 　　(6)由SEQ ID NO：52核苷酸10-5829組成之核苷酸序列；及 　　(7)為上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
於其他特定具體實例中，本揭示內容所提供之組成物包含RNA三抗原建構體或包含RNA三抗原建構體之載體，其中該三抗原建構體包含對應於(1)SEQ ID NOs：42、44、46、48、50、52之任一序列或(2)為SEQ ID NOs：42、44、46、48、50、52任一核苷酸序列之簡併變異體之核苷酸序列。
於其他特定具體實例中，本揭示內容所提供之組成物包含RNA三抗原建構體或包含RNA三抗原建構體之載體，其中該三抗原建構體由對應於(1)SEQ ID NOs：42、44、46、48、50、52任一序列之核苷酸序列或(2)為SEQ ID NOs：42、44、46、48、50、52任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列組成。
於又其他特定具體實例中，本揭示內容所提供之組成物包含三抗原建構體或包含三抗原建構體之載體，其中該三抗原建構體包含(1)SEQ ID NOS：87、88、89、90、91及92中任一核苷酸序列或(2)SEQ ID NOS：87、88、89、90、91及92中任一核苷酸序列之簡併變異體。於若干其他特定具體實例中，本揭示內容提供包含質體之組成物，其中該質體包含SEQ ID Nos：57、59、61、63、65及67任一核苷酸序列。於又其他特定具體實例中，本揭示內容提供包含載體之組成物，其中該載體包含SEQ ID NOs：58、60、62、64、66及68之任一核苷酸序列。
於又其他特定具體實例中，本揭示內容所提供之組成物包含三抗原建構體或包含三抗原建構體之載體，其中該三抗原建構體由(1)SEQ ID NOS：87、88、89、90、91及92之任一核苷酸序列或(2)SEQ ID NOS：87、88、89、90、91及92之任一核苷酸序列之簡併變異體組成。於若干其他特定具體實例中，本揭示內容提供包含質體之組成物，其中該質體由SEQ ID Nos：57、59、61、63、65及67之之任一核苷酸序列組成。於又其他特定具體實例中，本揭示內容提供包含載體之組成物，其中該載體由SEQ ID NOs：58、60、62、64、66及68之任一核苷酸序列組成。
組成物，例如醫藥組成物或疫苗組成物，可進一步包含醫藥上可接受之賦形劑。適用於核酸組成物(包括DNA疫苗及RNA疫苗組成物)之醫藥上可接受之賦形劑為熟習此項技藝人士所悉知。此類賦形劑可為水性或非水性溶液、懸浮液及乳液。非水性賦形劑之實例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄欖油)及注射用有機酯(例如油酸乙酯)。水性賦形劑之實例包括水、酒精性/水性溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水及緩衝介質。適當之賦形劑亦包括有助於細胞攝取多核苷酸分子之製劑。此類製劑之實例為(i)修飾細胞滲透性之化學製品，例如布比卡因(bupivacaine)；(ii)用於膠囊化多核苷酸之脂質體或病毒顆粒；或(iii)其本身與多核苷酸結合之陽離子性脂質或二氧化矽、金或鎢微粒。陰離子性及中性脂質體為此項技藝中悉知[關於製造脂質體方法之詳細說明參見例如，Liposomes：A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press(1990)]且有用於遞送廣泛範圍之產品(包括多核苷酸)。
本揭示內容提供之致免疫性組成物、醫藥組成物或疫苗組成物可與一或多種免疫調節劑結合或組合使用。該組成物亦可與一或多種佐劑結合或組合使用。另外，該組成物可與一或多種免疫調節劑及一或多種佐劑結合或組合使用。免疫調節劑或佐劑可與抗原建構體或載體分開調配，或彼等可為相同組成物調配劑之一部分。因此，於若干具體實例中，本揭示內容提供醫藥組成物，其包含(1)由本揭示內容提供之抗原建構體或含此類抗原建構體之載體及(2)免疫調節劑。於若干進一步具體實例中，該醫藥組成物進一步包含佐劑。免疫調節劑及佐劑之實例於下文中提供。
組成物，包括疫苗組成物，可製備成任何適當劑型，例如液態形式(如，溶液、懸浮液或乳液)及固態形式(如，膠囊、錠劑或粉劑)，且可利用熟習此項技藝者已知之方法製備。 F.抗原建構體、載體及組成物之用途
於其他態樣中，本揭示內容提供(1)抗原建構體、載體及組成物作為藥劑之用途；(2)抗原建構體、載體及組成物用於製造引出針對TAA之免疫反應、抑制異常細胞增殖或治療癌症的藥劑之用途及(3)使用抗原建構體、載體及組成物之方法；其中該抗原建構體、載體及組成物如上文中所述。
於一態樣中，本揭示內容提供使用(1)編碼一或多種致免疫性TAA多肽之抗原建構體、(2)含該等抗原建構體之載體或(3)含該等抗原建構體或載體之組成物以於哺乳動物(例如人類)中引出針對TAA之免疫反應之用途。於若干具體實例中，本揭示內容提供於哺乳動物(特別是人類)中引出針對TAA的免疫反應之方法，該方法包含給予該哺乳動物有效量之包含(1)編碼一或多種致免疫性TAA多肽的抗原建構體或(2)含有編碼一或多種致免疫性TAA多肽抗原建構體的載體之組成物。於若干具體實例中，本揭示內容提供於哺乳動物(特別是人類)中引出針對CEA的免疫反應之方法，其包含給予該哺乳動物有效量之包含本揭示內容提供的抗原建構體之組成物，其中該抗原建構體包含(1)編碼致免疫性CEA多肽之至少一種核苷酸序列及(2)編碼致免疫性MUC1多肽或致免疫性TERT多肽之至少一種核苷酸序列。於若干其他具體實例中，本揭示內容提供於哺乳動物(特別是人類)中引出針對MUC1的免疫反應之方法，其包含給予該哺乳動物有效量之包含本揭示內容提供的抗原建構體之組成物，其中該抗原建構體包含(1)編碼致免疫性MUC1多肽之至少一種核苷酸序列及(2)編碼致免疫性CEA多肽或致免疫性TERT多肽之至少一種核苷酸序列。於若干進一步具體實例中，本揭示內容提供於哺乳動物(特別是人類)中引出針對TERT的免疫反應之方法，其包含給予該哺乳動物有效量之包含本揭示內容提供的抗原建構體之組成物，其中該抗原建構體包含(1)編碼致免疫性TERT多肽之至少一種核苷酸序列及(2)編碼致免疫性MUC1多肽或致免疫性CEA多肽之至少一種核苷酸序列。
於另一態樣中，本揭示內容提供使用(1)編碼一或多種致免疫性TAA多肽之抗原建構體、(2)含該等抗原建構體之載體或(3)含該等抗原建構體或載體之組成物以於哺乳動物(例如人類)中抑制異常細胞增殖之用途。於若干具體實例中，本揭示內容提供於哺乳動物(特別是人類)中抑制異常細胞增殖之方法，包含給予該哺乳動物有效量之包含(1)編碼一或多種致免疫性TAA多肽的抗原建構體或(2)含有編碼一或多種致免疫性TAA多肽抗原建構體的載體之組成物，其中該異常細胞增殖與腫瘤相關抗原CEA、MUC1或TERT過度表現有關。異常細胞增殖可能在人類任何器官或組織例如乳房、胃、卵巢、肺、膀胱、大腸(例如結腸及直腸)、腎臟、胰臟及攝護腺中。於若干具體實例中，該方法係用於抑制乳房、卵巢、胰臟、結腸、肺、胃及直腸中之異常細胞增殖。所給予組成物中之抗原建構體或載體編碼衍生自過度表現之腫瘤相關抗原或對其具致免疫性之至少一種致免疫性多肽。抗原建構體可為單抗原建構體或多抗原建構體，例如雙抗原建構體或三抗原建構體。於若干明確具體實例中，組成物包含編碼致免疫性CEA多肽、致免疫性MUC1多肽及致免疫性TERT多肽之三抗原建構體。
於又一態樣中，本揭示內容提供使用(1)編碼一或多種致免疫性TAA多肽之抗原建構體、(2)含該等抗原建構體之載體或(3)含該等抗原建構體或載體之組成物以於哺乳動物(例如人類)中作為用於治療癌症的藥劑之用途。於若干具體實例中，本揭示內容提供治療人體癌症之方法，其中該癌症與一或多種腫瘤相關抗原CEA、MUC1或TERT之過度表現有關。該方法包括給予該人類有效量之組成物，其包含編碼至少一種致免疫性多肽之抗原建構體，該致免疫性多肽係衍生自特定癌症中過度表現之腫瘤相關抗原或對其具致免疫性。抗原建構體可為單抗原建構體或多抗原建構體，例如雙抗原建構體或三抗原建構體。於若干明確具體實例中，組成物包含編碼致免疫性CEA多肽、致免疫性MUC1多肽及致免疫性TERT多肽之三抗原建構體。過度表現腫瘤相關抗原MUC1、CEA、及/或TERT之任何癌症可利用本揭示內容提供之方法治療。癌症之實例包括乳癌、卵巢癌、肺癌(例如小細胞肺癌及非小細胞肺癌)、結腸直腸癌、胃癌、及胰臟癌。於若干特定具體實例中，本揭示內容提供治療人體癌症之方法，其包括給予該人類有效量之包含三抗原建構體之組成物，其中該癌症為(1)乳癌，例如雌激素受體及/或黃體激素受體陽性乳癌、HER2陽性乳癌或三重陰性乳癌；(2)肺癌，例如NSCLC或SCLC；(3)胃癌；(4)胰臟癌；或(5)結腸直腸癌。
於若干明確具體實例中，本揭示內容提供引出針對TAA免疫反應之方法、抑制異常細胞增殖之方法或治療哺乳動物(特別是人類)癌症之方法，該方法包含給予該哺乳動物有效量之包含多抗原建構體或包含多抗原建構體的載體之組成物，其中該多抗原建構體包含編碼SEQ ID Nos：43、45、47、49、51及53任一胺基酸序列之核苷酸序列。於其他特定具體實例中，本揭示內容提供引出針對TAA免疫反應之方法、抑制異常細胞增殖之方法或治療哺乳動物(特別是人類)癌症之方法，該方法包含給予該哺乳動物有效量之包含多抗原建構體之組成物，其中該多抗原建構體包含SEQ ID Nos：42、44、46、48、50、52及87至92之任一核苷酸序列。於其他特定具體實例中，本揭示內容提供引出針對TAA免疫反應之方法、抑制異常細胞增殖之方法或治療哺乳動物(特別是人類)癌症之方法，該方法包含給予該哺乳動物有效量之包含載體之組成物，其中該載體包含SEQ ID Nos：57至68之任一核苷酸序列。
組成物可經由此項技藝中已知之一些適當方法給予哺乳動物(包括人類)。適當方法之實例包括：(1)肌內、皮內、表皮內或皮下給藥，(2)口服給藥，及(3)局部施用(例如眼部、鼻腔及陰道內施用)。核酸疫苗組成物(特別是含DNA質體之組成物)之皮內或表皮內給藥之一特殊方法為使用由PowderMed銷售之顆粒傳介之表皮遞送(PMEDTM )之疫苗遞送裝置進行基因槍遞送。PMED為給予動物或人類疫苗之無針法。PMED系統涉及使DNA沈澱於精微金顆粒上，然後由氦氣推進到表皮中。將塗覆DNA之金顆粒遞送到表皮之APC及角質細胞中，一旦進入這些細胞之核中，DNA就從金洗脫出來且成為具轉錄活性，產生經編碼之蛋白質。用於肌內給予核酸疫苗之另一特殊方法涉及電穿孔。電穿孔使用經控制之電脈衝於細胞膜中產生暫時之細孔，其促進注射到肌肉中的核酸疫苗之細胞攝取。當CpG及核酸疫苗組合使用時，可使CpG與核酸疫苗於一種調配劑中一起調配並利用電穿孔肌內給予該調配劑。
於特定方法中給予組成物之有效量可由熟習此項技藝人員容易地決定且將取決於若干因素。治療癌症(例如胰臟癌、卵巢癌、肺癌、結腸直腸癌、胃癌及乳癌)之方法中，決定有效量可能考慮因素包括待治療之個體(包括個體之免疫狀態及健康狀況)、待治療癌症之嚴重性或階段、經表現之特異性致免疫性TAA多肽、期望保護或治療之程度、給藥方法及計畫與所使用之其他治療劑(如佐劑或免疫調節劑)。調配及遞送方法為確定引出有效免疫反應所需核酸劑量之關鍵因素。舉例而言，當疫苗調配為水性溶液且經由皮下注射針注射或氣動注射給予時，疫苗中核酸之有效量可在每劑2 μg-10 mg之範圍內，而當核酸製備為塗覆之金顆粒且使用基因槍技術遞送時，則僅需要每劑16 ng-16 μg。利用電穿孔之疫苗中核酸劑量範圍通常在每劑0.5-10 mg之範圍內。於核酸疫苗與CpG以共調配劑利用電穿孔一起給予之情形下，核酸疫苗之劑量可在每劑0.5-5 mg之範圍內且CpG之劑量通常在每劑0.05 mg-5 mg/劑之範圍內，例如每人每劑量0.05、0.2、0.6或1.2 mg。
本揭示內容提供之疫苗組成物可用於接觸增強策略以誘發強健且持久之免疫反應。根據重複注射相同致免疫性建構體之接觸及增強疫苗接種規程為眾所周知。一般而言，第一劑疫苗可能無法產生保護性免疫，惟僅"接觸"免疫系統。第二次、第三次或隨後之劑量("增強")後逐漸產生保護性免疫反應。根據習知之技術進行增強，且當與另一疫苗一起給予時，可就給藥計畫、給藥途徑、佐劑選擇、劑量及潛在序列，憑經驗進一步最佳化。於一具體實例中，於習知之同源接觸增強策略中使用疫苗組成物，其中於接觸以及增強劑量上都給予動物相同疫苗。舉例而言，於初始劑量("接觸")以及隨後劑量("增強")中均給予含質體載體之相同疫苗組成物。於另一具體實例中，於異源接觸增強疫苗接種中使用疫苗組成物，其中在預定之時間間隔下給予表現相同致免疫性TAA多肽之不同類型疫苗。例如，以接觸劑量之質體載體形式及以增強劑量之病毒載體形式給予抗原建構體，或反之亦然。
疫苗組成物可與一或多種佐劑一起使用。適當佐劑之實例包括：(1)水包油型乳液調配劑，例如MF59及AS03；(2)皂素佐劑，例如QS21及Iscomatrix®[聯邦血清實驗室(Commonwealth Serum Laboratories)，澳洲]；(3)佛氏完全佐劑(CFA)及佛氏不完全佐劑(IFA)；(4)細胞介素，例如介白素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12)、干擾素(如γ干擾素)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)及腫瘤壞死因子(TNF)；(5)單磷醯脂質A(MPL)或3-O-去醯基MPL(3dMPL)；(6)包含CpG模體之寡核苷酸及(7)金屬鹽，包括鋁鹽(明礬)，例如磷酸鋁及氫氧化鋁。
另外，為了治療哺乳動物(包括人類)中包括癌症之腫瘤疾患，可將組成物與一或多種免疫調節劑組合給予。免疫調節劑可為免疫壓制細胞抑制劑(ISC抑制劑)或免疫效應細胞增強子(IEC增強子)。另外，一或多種ISC抑制劑可與一或多種IEC增強子組合使用。免疫調節劑可利用任何適當方法及途徑給予，包括(1)全身性給藥例如靜脈內、肌內或口服給藥；及(2)局部給藥例如皮內及皮下給藥。於適當或合適之情況下，局部給藥通常優於全身性給藥。任何免疫調節劑之局部給藥可於哺乳動物身體之任何適於藥物局部給藥之位置進行；然而，更佳為這些免疫調節劑於靠近疫苗排出之淋巴結附近局部給藥。
組成物，例如疫苗，可與所用之任何或所有免疫調節劑同時或依序給藥。同樣地，當使用兩種或兩種以上免疫調節劑時，彼等可彼此關連地同時或依序給藥。於若干具體實例中，疫苗與一免疫調節劑彼此關連地同時(如，於混合物中)給藥，惟與一或多種附加之免疫調節劑則彼此關連地依序給藥。疫苗及免疫調節劑之共同給藥可包括其中給予疫苗及至少一種免疫調節劑俾使各自同時存在給藥部位(例如疫苗排出之淋巴結)，即使抗原與免疫調節劑未同時給予之情況。疫苗與免疫調節劑之共同給藥亦可包括其中疫苗或免疫調節劑從給藥部位清除，惟清除疫苗或免疫調節劑之至少一種細胞效應於給藥部位(例如疫苗排出之淋巴結)存留，至少直到將一或多種附加之免疫調節劑給予給藥部位之情況。於核酸疫苗及CpG組合給予之情況中，疫苗及CpG可包含於單一調配劑中且利用任何適當方法一起給予。於若干具體實例中，共調配劑(混合物)中之核酸疫苗及CpG係利用肌內注射組合電穿孔給予。
於若干具體實例中，免疫調節劑為ISC抑制劑。ISC抑制劑之實例包括(1)蛋白激酶抑制劑，例如伊馬替尼(imatinib)、索拉非尼(sorafenib)、拉帕替尼(lapatinib)、BIRB-796及AZD-1152、AMG706、Zactima(ZD6474)、 MP-412、索拉非尼(BAY 43-9006)、達沙替尼(dasatinib)、CEP-701 [來他替尼(lestaurtinib)]、XL647、XL999、Tykerb(拉帕替尼)、MLN518(前稱CT53518)、PKC412、ST1571、AEE 788、OSI-930、OSI-817、蘋果酸蘇尼替尼(sunitinib)(Sutent)、阿西替尼(axitinib)(AG-013736)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、阿西替尼、博舒替尼(bosutinib)、替昔羅莫司(temsirolismus)及尼羅替尼(nilotinib)(AMN107)；於若干特定具體實例中，蛋白激酶抑制劑為酪胺酸激酶抑制劑，包括蘇尼替尼、索拉非尼或蘇尼替尼或索拉非尼之醫藥上可接受之鹽或衍生物(例如蘋果酸鹽或甲苯磺酸鹽)；(2)環氧合酶-2(COX-2)抑制劑，例如塞來昔布(celecoxib)及羅非昔布(rofecoxib)；(3)第五型磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑，例如阿伐那非(avanafil)、羅地那非(lodenafil)、米羅那非(mirodenafil)、西地那非(sildenafil)、他達拉非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、烏地那非(udenafil)、扎普司特(zaprinast)；(4)DNA交聯劑，例如環磷醯胺；(5)PARP抑制劑，例如塔拉佐帕尼(talazoparib)及(6)CDK抑制劑，如帕博塞克(palbocyclib)。
於若干具體實例中，與核酸組成物組合使用之免疫調節劑為IEC增強子。可一起使用兩種或兩種以上IEC增強子。可使用的IEC增強子之實例包括：(1)TNFR促效劑，例如OX40、4-1BB(例如BMS-663513)、GITR(例如TRX518)及CD40(例如CD40促效型抗體)等促效劑；(2)CTLA-4抑制劑，例如易普利姆單抗(Ipilimumab)及德美利姆單抗(Tremelimumab)；(3)TLR促效劑，例如 CpG 7909(5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3')、 CpG 24555(5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT3'及 CpG 10103(5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT3')；(4)程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)抑制劑，例如納武單抗(nivolumab)及派姆單抗(pembrolizumab)；(5)PD-L1抑制劑，例如阿替珠單抗(atezolizumab)、度伐單抗(durvalumab)、阿維單抗(avelumab)；及(6)IDO1抑制劑。
於若干具體實例中，IEC增強子為CD40促效劑抗體，其可為人類、擬人化或部分人類嵌合抗CD40抗體。特異性CD40促效劑抗體之實例包括G28-5、mAb89、EA-5或S2C6單株抗體及CP870,893。CP-870,893係已經臨床研究作為抗腫瘤療法之完全人類促效型CD40單株抗體(mAb)。CP870,893之結構及製備揭示於WO2003041070(其中抗體經由內部鑑定之"21.4.1"鑑定且抗體重鏈及輕鏈胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：41)。為了與本揭示內容組成物組合使用，CP-870,893可經由任何適當途徑(例如皮內、皮下或肌內注射)給予。CP870893之有效量通常在0.01-0.25 mg / kg之範圍內。於若干具體實例中，CP870893係以0.05-0.1 mg / kg之量給予。
於若干其他具體實例中，IEC增強子為CTLA-4抑制劑，例如易普利姆單抗及德美利姆單抗。以YERVOY銷售之易普利姆單抗(亦為所謂MEX-010或MDX-101)為人類抗人類CTLA-4抗體。易普利姆單抗亦可以其CAS登錄編號477202-00-9被提及且於PCT公告案No. WO 01/14424中揭示為抗體10DI。德美利姆單抗(亦為所謂CP-675,206)為完全人類IgG2單株抗體且具有CAS編號745013-59-6。德美利姆單抗揭示於美國專利案編號：6,682,736中，該案全部內容併入本文以資參考，其被鑑定為抗體11.2.1且其重鏈及輕鏈胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：42及43。為了與本揭示內容所提供組成物組合使用，德美利姆單抗可局部(特別是皮內或皮下)給予。皮內或皮下給予德美利姆單抗之有效量一般為每人每劑量在5-200 mg之範圍內。於若干具體實例中，德美利姆單抗之有效量為每人每劑量在10-150 mg之範圍內。於若干特定具體實例中，德美利姆單抗之有效量為每人約10、25、50、75、100、125、150、175或200 mg/劑。
於若干其他具體實例中，免疫調節劑為PD-1抑制劑或PD-L1抑制劑。PD-1抑制劑之實例包括納武單抗(商品名Opdivo)、派姆單抗(商品名Keytruda)、RN888(抗PD-1抗體)、皮地利珠單抗(pidilizumab)(Cure Tech)、AMP-224(GSK)、AMP-514(GSK)及PDR001(Novartis)。PD-L1抑制劑之實例包括阿替珠單抗(PD-L1特異性單抗；商品名Tecentriq)、度伐單抗(PD-L1特異性單抗；商品名Imfinzi)、阿維單抗(PD-L1特異性單抗；商品名Bavencio)、及BMS-936559(BMS)。亦參見Okazaki T et al., International Immunology(2007);19,7：813-824及Sunshine J et al., Curr Opin Pharmacol. 2015 Aug;23：32-8。於若干明確具體實例中，PD-1抑制劑為RN888。RN888為特異性結合PD-1之單株抗體。RN888揭示於國際專利申請公告案 WO2016/092419中，其中該抗體經鑑定為具有SEQ ID NO：29全長重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：39全長輕鏈胺基酸序列之mAb7。
於其他具體實例中，免疫調節劑為吲哚胺2,3-二加氧酶1(亦為所謂"IDO1")之抑制劑。發現IDO1將免疫細胞功能調節為壓制性表現型，因此認為其對腫瘤之逃避宿主免疫監視負有部分責任。該酵素降解必需胺基酸色胺酸成為犬尿胺酸及其他代謝物。發現此等代謝物及缺乏色胺酸導致抑制效應T細胞功能及調節性T細胞之加強分化。IDO1抑制劑可為大分子，例如抗體，或小分子，例如化合物。
於若干特定具體實例中，本揭示內容所提供之多肽或核酸組成物與揭示於WO2010/005958之1,2,5-噁二唑衍生物IDO1抑制劑組合使用。特定1,2,5-噁二唑衍生物IDO1抑制劑之實例包括下述化合物： 　　4-({2-[(胺基磺醯基)胺基]乙基}胺基)-N-(3-溴-4-氟苯基)-N'-羥基-l,2,5-噁二唑-3-甲脒； 　　4-({2-[(胺基磺醯基)胺基]乙基}胺基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-N'-羥基-1,2,5-噁二唑 3-甲脒； 　　4-({2-[(胺基磺醯基)胺基]乙基}胺基)-N-[4-氟-3-(三氟甲基)苯基]-N'-羥基-1,2,5-噁二唑-3-甲脒； 　　4-({2-[(胺基磺醯基)胺基]乙基}胺基)-N'-羥基-N-[3-(三氟甲基)苯基]-1,2,5-噁二唑-3-甲脒； 　　4-({2-[(胺基磺醯基)胺基]乙基}胺基)-N-(3-氰基-4-氟苯基)-N'-羥基-1,2,5-噁二唑 3-甲脒； 　　4-({2-[(胺基磺醯基)胺基]乙基}胺基)-N-[(4-溴-2-呋喃基)甲基]-N'-羥基-1,2,5-噁二唑-3-甲脒；或 　　4-({2-[(胺基磺醯基)胺基]乙基}胺基)-N-[(4-氯-2-呋喃基)甲基]-N'-羥基-1,2,5-噁二唑-3-甲脒。
1,2,5-噁二唑衍生物IDO1抑制劑通常每天口服給予一次或兩次且口服給予之有效量每一病患每劑量通常在25 mg-1000 mg(例如25 mg、50 mg、100 mg、200 mg、300 mg、400 mg、500 mg、600 mg、700 mg、800 mg或1000 mg)之範圍內。於特定具體實例中，本揭示內容所提供之多肽或核酸組成物以每劑量25 mg或50 mg每天口服給予兩次與4-({2-[(胺基磺醯基)胺基]乙基}胺基)-N-(3-溴-4-氟苯基)-N'-羥基-l,2,5-噁二唑-3-甲脒組合使用。該1,2,5-噁二唑衍生物可如美國專利案No. 8,088,803中所述合成，其全部內容併入本文以資參考。
於若干其他特定具體實例中，本揭示內容提供之多肽或核酸組成物與揭示於WO2015/173764中之吡咯啶-2,5-二酮衍生物IDO1抑制劑組合使用。特定吡咯啶 -2,5-二酮衍生物抑制劑之實例包括下述化合物： 　　3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮； 　　(3-2 H)-3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮； 　　(-)-(R)-3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮； 　　3-(1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮； 　　(-)-(R)-3-(1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮； 　　3-(5-氯-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮； 　　(-)-(R)-3-(5-氯-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮； 　　3-(5-溴-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮； 　　3-(5,6-二氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮；及 　　3-(6-氯-1H-吲哚-3-基)吡咯啶-2,5-二酮。
吡咯啶-2,5-二酮衍生物IDO1抑制劑通常每天口服給予一次或兩次且口服給予之有效量每一病患每劑量通常在50 mg-1000 mg(例如125 mg、250 mg、500 mg、750 mg或1000 mg)之範圍內。於特定具體實例中，本揭示內容所提供之多肽或核酸組成物以每一病患每劑量125-100 mg每天口服給予一次與3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)吡咯啶 -2,5-二酮組合使用。該吡咯啶-2,5-二酮衍生物可如美國專利申請公告案US2015329525中所述合成，其全部內容併入本文以資參考。 G.實施例
茲提供下述實施例以說明本發明之特定具體實例。彼等不擬被解釋為以任何方式對本發明構成局限。從上述討論及這些實施例，熟習此項技藝者可確定本發明之必要特徵，且在不離開其精神與範圍下，可進行本發明之各種變化與修飾以使其適應各種用法及狀況。 　　實施例1. 含單抗原建構體或多抗原建構體質體之建構
實施例1說明含單抗原建構體、雙抗原建構體或三抗原建構體質體載體之建構。除非另行說明，否則提及MUC1、CEA及TERT蛋白之胺基酸位置或殘基係分別指如SEQ ID NO：1中所示之人類MUC1同功型1前體蛋白之胺基酸序列、如SEQ ID NO：2中所示之人類癌胚抗原(CEA)同功型1前體蛋白之胺基酸序列及如SEQ ID NO：3中所示之人類TERT同功型1前體蛋白之胺基酸序列。表16中提供質體建構中所使用的一些引子之結構。 1A.含單抗原建構體之質體
質體 1027(MUC1) 。 使用基因合成及限制片段交換技術產生質體1027。將具有5X縱排重複序列VNTR區之人類MUC1之胺基酸序列提交GeneArt以供基因最適化及合成。使編碼該多肽之基因最適化以供表現、合成及選殖。該MUC-1開放閱讀框架經由以NheI及BglII酶切從GeneArt載體切除並嵌入被同樣酶切之質體pPJV7563中。質體1027之開放閱讀框架(ORF)核苷酸序列示於SEQ ID NO：4。由質體1027編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：5。
質體 1361(CEA) 。 使用基因合成、PCR及無縫選殖技術建構質體1361。首先，在DNA2.0將編碼CEA參考序列之基因進行密碼子最適化以供表現。使用引子ID1361-1362_PCRF及ID1361-1362_PCRR，利用PCR擴增編碼胺基酸2-702之序列。經由無縫選殖將擴增子選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1361之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：14。由質體1361編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：15。
質體 1386(mCEA) 。 使用PCR及無縫選殖技術建構編碼膜連型致免疫性CEA多肽(mCEA)之質體1386。首先，使用引子f pmed CEA SS及r CEA D1利用PCR從質體1361擴增編碼CEA胺基酸2-144之基因片段。其次，使用引子f CEA D1-D4及r pmed CEA GPI，利用PCR從質體1361擴增編碼CEA胺基酸323-702之基因片段。連接擴增子且經由無縫選殖將其選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1386之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：16。由質體1386編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：17。
質體 1390(cCEA) 。 使用PCR及無縫選殖技術建構編碼胞質型致免疫性CEA多肽(cCEA)之質體1390。首先，使用引子f pmed CEA D1及r CEA D1利用PCR從質體1361擴增編碼CEA胺基酸35-144之基因片段。其次，使用引子f CEA D1-D4及r pmed CEA D7利用PCR從質體1361擴增編碼CEA胺基酸323-677之基因片段。連接擴增子且經由無縫選殖將其選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1390之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：18。由質體1390編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：19。
質體 1065( 全長 TERT D712A/V713I) 。 使用基因合成及限制片段交換技術產生質體1065。將經設計以不活化酵素活性之具兩個突變(D712A/V713I)之人類TERT之胺基酸序列提交DNA2.0以供基因最適化及合成。使編碼該多肽之基因最適化以供表現、合成及選殖。該TERT開放閱讀框架經由以NheI及BglII酶切從DNA2.0載體切除並嵌入被同樣酶切之質體pPJV7563中。由質體1065編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：81。質體1065之開放閱讀框架(ORF)核苷酸序列示於SEQ ID NO：82。
質體 1112(TERT240) 。 使用PCR及無縫選殖技術建構質體1112。首先，使用引子f pmed TERT 241G及r TERT co# pMed利用PCR從質體1065擴增編碼TERT胺基酸241-1132之基因。經由無縫選殖將擴增子選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1112之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：8。由質體1112編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：9。
質體 1197(cMUC1) 。 使用PCR及無縫選殖技術建構編碼胞質型致免疫性MUC1多肽(cMUC1)之質體1197。首先，使用引子ID1197F及ID1197R利用PCR從質體1027擴增編碼MUC1胺基酸22-225、946-1255之基因。經由無縫選殖將擴增子選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1197之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：6。由質體1197編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：7。
質體 1326(TERT343) 。 使用PCR及無縫選殖技術建構質體1326。首先，使用引子TertΔ343-F及Tert-R利用PCR從質體1112擴增編碼TERT胺基酸344-1132之基因。經由無縫選殖將擴增子選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1326之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：10。由質體1326編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：11。
質體 1330(TERT541) 。 使用PCR及無縫選殖技術建構質體1330。首先，使用引子TertΔ541-F及Tert-R利用PCR從質體1112擴增編碼TERT胺基酸542-1132之基因。經由無縫選殖將擴增子選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1330之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：12。由質體1330編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：13。 1B.含雙抗原建構體之質體
質體 1269(Muc1-Tert240) 。 使用PCR及無縫選殖技術建構質體1269。首先，使用引子f tg link Ter240及r pmed Bgl Ter240利用PCR從質體1112擴增編碼人類端粒酶胺基酸241-1132之基因。使用引子f pmed Nhe Muc及r link muc利用PCR從質體1027擴增編碼人類黏蛋白-1胺基酸2-225、946-1255之基因。PCR導致於Tert之5'端及Muc1之3'端添加重疊之GGSGG連接子。使擴增子混合在一起並經由無縫選殖將其選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1269之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：20。由質體1269編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：21。
質體 1270(Muc 1- ERB2A - Tert240) 。使用PCR及無縫選殖技術建構質體1270。首先，使用引子f2 ERBV2A、f1 ERBV2A Ter240及r pmed Bgl Ter240利用PCR從質體1112擴增編碼人類端粒酶胺基酸241-1132之基因。使用引子f pmed Nhe Muc及r ERB2A Bamh Muc利用PCR從質體1027擴增編碼人類黏蛋白-1胺基酸2-225、946-1255之基因。PCR導致於Tert之5'端及Muc1之3'端添加重疊之ERBV 2A序列。使擴增子混合在一起並經由無縫選殖將其選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1270之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：22。由質體1270編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：23。
質體 1271(Tert240 - ERB2A - Muc1) 。 使用PCR及無縫選殖技術建構質體1271。首先，使用引子f pmed Nhe Ter240及r ERB2A Bamh Ter240利用PCR從質體1112擴增編碼人類端粒酶胺基酸241-1132之基因。使用引子f2 ERBV2A、f1 ERBV2A Muc及r pmed Bgl Muc利用PCR從質體1027擴增編碼人類黏蛋白-1胺基酸2-225、946-1255之基因。PCR導致於Tert之3'端及Muc1之5'端添加重疊之ERBV 2A序列。使擴增子混合在一起並經由無縫選殖將其選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1271之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：24。由質體1271編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：25。
質體 1286(cMuc1 - ERB2A - Tert240) 。 使用PCR及無縫選殖技術建構質體1286。首先，使用引子f2 ERBV2A、f1 ERBV2A Ter240及r pmed Bgl Ter240利用PCR從質體1112擴增編碼人類端粒酶胺基酸241-1132之基因。使用引子f pmed Nhe cytMuc及r ERB2A Bamh Muc利用PCR從質體1197擴增編碼人類黏蛋白-1胺基酸之基因22-225、946-1255。PCR導致於Tert之5'端及Muc1之3'端添加重疊之ERBV 2A序列。使擴增子混合在一起並經由無縫選殖將其選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1286之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：26。由質體1286編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：27。
質體 1287(Tert240 - ERB2A - cMuc1) 。 使用PCR及無縫選殖技術建構質體1287。首先，使用引子f pmed Nhe Ter240及r ERB2A Bamh Ter240利用PCR從質體1112擴增編碼人類端粒酶胺基酸241-1132之基因。使用引子f2 ERBV2A、f1 ERBV2A cMuc及r pmed Bgl Muc利用PCR從質體1197擴增編碼人類黏蛋白-1胺基酸之基因22-225、946-1255。PCR導致於Tert之3'端及Muc1之5'端重疊之ERBV 2A序列。使擴增子混合在一起並經由無縫選殖將其選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1287之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：28。由質體1287編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：29。
質體 1409(Muc1 - EMC2A - mCEA) 。 使用PCR及無縫選殖技術建構質體1409。首先，使用引子f pmed Nhe Muc及r EM2A Bamh Muc利用PCR從質體1027擴增編碼人類黏蛋白-1胺基酸2-225、946-1255之基因。使用引子f2 EMCV2A、1 EMC2a CEAss及r pmed CEA GPI利用PCR從質體1386擴增編碼CEA胺基酸2-144、323-702之基因。PCR導致於CEA之5'端及Muc1之3'端添加重疊之EMCV 2A序列。使擴增子混合在一起並經由無縫選殖將其選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1409之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：30。由質體1409編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：31。
質體 1410(mCEA - T2A-Muc1) 。 使用PCR及無縫選殖技術建構質體1410。首先，使用引子f pmed CEA SS及r T2A CEA利用PCR從質體1386擴增編碼CEA胺基酸2-144、323-702之基因。使用引子f2 T2A 63, f1 T2a Muc及r pmed Bgl Muc利用PCR從質體1027擴增編碼人類黏蛋白-1胺基酸2-225、946-1255之基因。PCR導致於CEA之3'端及Muc1之5'端添加重疊之T2A序列。使擴增子混合在一起並經由無縫選殖將其選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1410之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：32。由質體1410編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：33。
質體 1411(mCEA- 弗林蛋白酶 -T2A-Muc1) 。 使用PCR及無縫選殖技術建構質體1411。首先，使用引子f pmed CEA SS及r T2A弗林蛋白酶CEA利用PCR從質體1386擴增編碼CEA胺基酸2-144、323-702之基因。使用引子f2 T2A 63、f1 T2a Muc及r pmed Bgl Muc利用PCR從質體1027擴增編碼人類黏蛋白-1胺基酸2-225、946-1255之基因。PCR導致於CEA之3'端與Muc1之5'端添加重疊之弗林蛋白酶切割位點及T2A序列。使擴增子混合在一起並經由無縫選殖將其選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1411之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：34。由質體1411編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：35。
質體 1431(Muc1 - EMC2A - cCEA) 。 使用PCR及無縫選殖技術建構質體1431。首先，使用引子f pmed Nhe Muc及r EM2A Bamh Muc利用PCR從質體1027擴增編碼人類黏蛋白-1胺基酸2-225、946-1255之基因。使用引子f2 EMCV2A、f EMC2a CEA d1及r pmed CEA D7利用PCR從質體1390擴增編碼CEA胺基酸35-144、323-677之基因。PCR導致於CEA之5'端及Muc1之3'端添加重疊之EMCV 2A序列。使擴增子混合在一起並經由無縫選殖將其選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1431之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：36。由質體1431編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：37。
質體1432(cCEA - T2A - Tert240)。使用PCR及無縫選殖技術建構質體1432。首先，使用引子f pmed CEA D1及r T2a CEA D7利用PCR從質體1390擴增編碼CEA胺基酸35-144、323-677之基因。使用引子f2 T2A 63、f1 T2A Tert240及r pmed Bgl Ter240利用PCR從質體1112擴增編碼人類端粒酶胺基酸241-1132之基因。PCR導致於Tert之5'端及CEA之3'端添加重疊之TAV 2A序列。使擴增子混合在一起並經由無縫選殖將其選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1432之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：38。由質體1432編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：39。
質體1440(Tert240 - ERA2A - mCEA)。使用PCR及無縫選殖技術建構質體1440。首先，使用引子f pmed Nhe tert240及r ERA2A Tert利用PCR從質體1112擴增編碼人類端粒酶胺基酸241-1132之基因。使用引子f2 ERAV2A、f1 ERA2A ssCEA及r pmed CEA GPI利用PCR從質體1386擴增編碼CEA胺基酸2-144、323-702之基因。PCR導致於Tert之3'端及CEA之5'端添加重疊之ERAV 2A序列。使擴增子混合在一起並經由無縫選殖將其選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1440之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：40。由質體1440編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：41。 1C.含三抗原建構體之質體
質體1424(Muc1 - ERB2A - Tert240 - ERA2A - mCEA)。使用PCR及無縫選殖技術建構質體1424。首先，使用引子f pmed Nhe Muc及r tert 1602-1579利用PCR從質體1270擴增編碼人類黏蛋白-1胺基酸2-225、946-1255、ERBV 2A肽及人類Tert240胺基端一半之基因。使用引子 f tert 1584-1607及r pmed CEA GPI利用PCR從質體1440擴增編碼Tert240羧基端一半、ERAV 2A肽及人類CEA胺基酸2-144、323-702之基因。部分重疊之擴增子以Dpn I切開，混合在一起，並經由無縫選殖將其選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1424之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：42。由質體1424編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：43。
質體1425(mCEA - T2A-Muc1 - ERB2A - Tert240)。使用PCR及無縫選殖技術建構質體1425。首先，使用引子f pmed CEA SS及r muc 986-963利用PCR從質體1410擴增編碼人類CEA胺基酸2-144、323-702、TAV 2A肽及人類黏蛋白-1胺基端一半之基因。使用引子f Muc 960-983及r pmed Bgl Ter240利用PCR從質體1270擴增編碼人類黏蛋白-1羧基端一半、ERBV 2A肽及人類端粒酶胺基酸241-1132之基因。部分重疊之擴增子以Dpn I切開，混合在一起，並經由無縫選殖將其選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1425之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：44。由質體1425編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：45。
質體1426(Tert240 - ERB2A - Muc1 - EMC2A - mCEA)。使用PCR及無縫選殖技術建構質體1426。首先，使用引子f pmed Nhe Ter240及r muc 986-963利用PCR從質體1271擴增編碼人類端粒酶胺基酸241-1132、ERBV 2A肽及人類黏蛋白-1胺基端一半之基因。使用引子f Muc 960-983及r pmed CEA GPI利用PCR從質體1409擴增編碼人類黏蛋白-1羧基端一半、EMCV 2A肽及CEA胺基酸2-144、323-702之基因。部分重疊之擴增子以Dpn I切開，混合在一起，並經由無縫選殖將其選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1426之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：46。由質體1426編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：47。
質體1427(Tert240 - ERA2A - mCEA - T2A-Muc1)。使用PCR及無縫選殖技術建構質體1427。首先，使用引子f pmed Nhe Ter240及R CEA SR2利用PCR從質體1440擴增編碼人類端粒酶胺基酸241-1132、ERAV 2A肽及mCEA胺基端一半之基因。使用引子f cCEA 562-592及 r pmed Bgl Muc利用PCR從質體1410擴增編碼mCEA羧基端一半、TAV 2A肽及人類黏蛋白-1胺基酸2-225、946-1255之基因。部分重疊之擴增子以Dpn I切開，混合在一起，並經由無縫選殖將其選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1427之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：48。由質體1427編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：49。
質體1428(Muc1 - EMC2A - cCEA - T2A - Tert240)。使用PCR及無縫選殖技術建構質體1428。首先，使用引子f pmed Nhe Muc及r cCEA 849-820，利用PCR從質體1431擴增編碼人類黏蛋白-1胺基酸2-225、946-1255、EMCV 2A肽及cCEA胺基端一半之基因。使用引子 f CEA 833-855及r pmed Bgl Ter240，利用PCR從質體1432擴增編碼cCEA羧基端一半、TAV 2A肽及人類端粒酶胺基酸241-1132之基因。部分重疊之擴增子以Dpn I切開，混合在一起，並經由無縫選殖將其選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1428之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：50。由質體1428編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：51。
質體1429(cCEA - T2A - Tert240 - ERB2A - Muc1)。使用PCR及無縫選殖技術建構質體1429。首先，使用引子f pmed CEA D1及r tert 1602 -1579利用PCR從質體1432擴增編碼人類CEA胺基酸35-144、323-677、TAV 2A肽及人類Tert240胺基端一半之基因。使用引子f tert 1584 -1607及r pmed Bgl Muc利用PCR從質體1271擴增編碼人類Tert240羧基端一半、ERBV 2A肽及人類黏蛋白-1胺基酸2-225、946-1255之基因。部分重疊之擴增子以Dpn I切開，混合在一起，並經由無縫選殖將其選殖入pPJV7563之Nhe I / Bgl II位點中。質體1429之開放閱讀框架核苷酸序列示於SEQ ID NO：52。由質體1429編碼之胺基酸序列示於SEQ ID NO：53。 1D.載體建構
此實施例說明攜帶多抗原建構體載體之建構。如於國際專利申請公告案WO2015/063647中所述，從黑猩猩腺病毒AdC68基因體序列建構如1424、1425、1426、1427、1428及1429各質體所攜帶之攜帶相同三抗原建構體(開放閱讀框架)之載體。此等載體分別稱為AdC68Y-1424、AdC68Y-1425、AdC68Y-1426、AdC68Y-1427、AdC68Y-1428及AdC68Y-1429。圖1提供此等載體之結構。
AdC68之全長基因體序列可從Genbank得到，登錄編號為AC_000011.1，亦於WO2015/063647中提供。利用電腦模擬設計，經工程處理於病毒中引入E1及E3缺失造成複製缺陷並創造轉殖基因嵌入空間的無轉殖基因之AdC68骨架("空載體")。鹼基456-3256及27476-31831缺失之載體AdC68Y，經工程處理成為具有比先前AdC68載體增進之生長特性。利用活體外寡核苷酸合成(oligo synthesis)及隨後重組傳介之中間組裝，以多階段程序生物化學地合成空載體，作為大腸桿菌(E. coli )及/或酵母中之人工染色體。分別使用Muc1-20bp-F-98 / mCEA-20bp-R-100、Y-mCEA-S2 / Y-Tert-A2、Y-Tert-S / Y-CEA-A、 Y-Tert-S / Y-MUC-A、Y-MUC-S2 / Y-Tert-A2及cCEA-20bp-F-106 / Muc1-20BP-R-108等引子利用PCR從質體1424、1425、1426、1427、1428及1429擴增編碼各種致免疫性TAA多肽之開放閱讀框架。然後將擴增子嵌入空載體骨架中。利用以PacI酶切從人造細菌染色體釋放重組病毒基因體，並將線性化核酸轉染入E1互補之黏附性HEK293細胞株中。於可看見之細胞病變效應及腺病毒病灶形成後，立即經由多回合冷凍/解凍從細胞釋放病毒收獲培養物。利用標準技術擴增及純化病毒。 實施例2.MUC1單抗原建構體之免疫原性於 HLA-A2/DR1 小鼠中之研究
研究設計。 使用PMED法，以DNA建構體質體1027(其編碼SEQ ID NO：5之膜連型致免疫性MUC1多肽)或質體1197(其編碼SEQ ID NO：7之細胞溶質致免疫性MUC1多肽)於第0天接觸12隻混合性別之HLA-A2/DR1小鼠並於第14天增強。第21天犧牲小鼠，並以干擾素-γ(IFN-g)ELISpot及細胞內細胞介素染色(ICS)分析評估脾細胞之MUC1特異性細胞免疫原性。
顆粒傳介之表皮遞送 (PMED) 。 PMED為給予動物或病患疫苗之無針法。PMED系統涉及使DNA沈澱於精微金顆粒上，然後由氦氣推進到表皮中。ND10，單次使用裝置，使用源自內部圓筒之加壓氦氣遞送金顆粒及X15，重複器遞送裝置，使用與X15連在一起之外部氦氣罐經由高壓軟管遞送金顆粒。此二裝置於研究中均被用以遞送MUC1 DNA質體。金顆粒直徑通常為1-3 µm並將顆粒調配成每1 mg金顆粒含有2 µg抗原DNA質體。[Sharpe, M. et al.：P. Protection of mice from H5N1 influenza challenge by prophylactic DNA vaccination using particle mediated epidermal delivery. Vaccine, 2007, 25(34)：6392-98；Roberts LK, et al.：Clinical safety and efficacy of a powdered Hepatitis B nucleic acid vaccine delivered to the epidermis by a commercial prototype device. Vaccine, 2005; 23(40)：4867-78]。
IFN- g ELISpot 分析 。於IFN-g ELISpot盤中，使源自個別動物之脾細胞與個別Ag特異胜肽(每槽各肽2-10 μg/ml、2.5-5e5個細胞)或15聚體Ag特異性肽匯集(重疊11個胺基酸，包含全部Ag特異性胺基酸序列；參見表15；每槽各肽2-5 μg/ml、1.25-5e5個細胞)三重複共培育。於37°C、5% CO2 培育該等盤~16小時，然後依照廠商指示進行洗滌及顯影。以CTL讀取計計數IFN-g斑點形成細胞(SFC)之數量。計算三重複之平均值並減去不含肽之陰性對照槽之反應。然後將SFC計數標準化至敘述每1e6個脾細胞之反應。表中之抗原特異性反應表示Ag特異性肽或肽匯集反應之總和。
ICS 分 析。於U形底96槽盤組織培養盤中，使源自個別動物之脾細胞及H-2b-、HLA-A2-或HLA-A24-限制性Ag特異胜肽(各肽5-10 μg/ml，每槽1-2e6個細胞)或15聚體Ag特異性肽匯集(重疊11個胺基酸，包含全部Ag特異性胺基酸序列；參見表15；每槽各肽2-5 μg/ml、1-2e6個脾細胞)共培育。於37°C、5% CO2 培育該等盤~16小時。然後將細胞染色以檢測源自CD8+ T細胞之細胞內IFN-g表現並固定。於流式細胞儀上取得細胞。數據以每隻動物在扣除不含肽之陰性對照槽中所得反應後之肽Ag-或肽匯集Ag特異性IFN-g+ CD8+ T細胞之頻率呈現。
三明治型 ELISA 分析 。 使用Tecan Evo、Biomek FxPBioTek 405 Select TS自動化儀器進行標準三明治型ELISA分析。使用於1X PBS中之1.0 µg/mL人類MUC1或人類CEA蛋白(抗原)，以25 µl/槽塗覆於384槽微量盤(平底槽、高結合力)，並於4°C培育過夜。第二天早上，於室溫下，以於含0.05% Tween 20之PBS(PBS-T)中之5% FBS封阻該等盤1小時。於96 U形底槽盤中，以於PBS-T中之1/100起始稀釋度製備小鼠血清。於PBS-T中，Tecan Evo在9個稀釋增量點上進行½對數系列稀釋，隨後從96槽盤將25 µl/槽經稀釋之血清沖壓至384槽盤。室溫下，於振盪器上以600 RPM培育該等384槽盤1小時，然後，使用BioTek EL 405 Select TS盤洗滌器，以PBS-T洗滌諸盤4次。將二次小鼠抗IgG-HRP抗體稀釋至適當稀釋度並經由Biomek FxP 以25 µl/槽沖壓至384槽盤中，然後在室溫下於振盪器上以600 RPM培育1小時，隨後重複洗滌5次。使用Biomek FxP ，將盤以25 µl/槽之RT TMB基質沖壓並於室溫下在黑暗中培育30分鐘，隨後利用25 µl/槽1N H2 SO4 之沖壓中止酵素反應。在Molecular Devices之Spectramax 340PC/384 Plus上，於波長450nm讀取諸盤。報導數據為OD 1.0時之計算力價，檢測極限為99.0。於各盤中使用抗原特異性之市售單株抗體作為陽性對照以追蹤盤對盤之變異表現；以經不相關疫苗接種之小鼠血清作為陰性對照，只有PBS-T之槽用以監測非特異性結合背景值。表中之力價表示從個別動物所引出之抗原特異性IgG力價。
結果。 表1顯示源自分別與衍生自MUC1肽庫之肽匯集(參見表15)或MUC1肽aa516-530一起培養的HLA-A2/DR1脾細胞之ELISpot及ICS數據。第3欄之數值表示以MUC1肽匯集再刺激及扣除背景值後之IFN-g斑點數/106 個脾細胞。第4欄之數值表示以MUC1肽aa516-530再刺激及扣除背景值後CD8+ T細胞為IFN-g+ 之頻率。陽性反應界定為SFC ＞100且IFN-g+ CD8+ T細胞之頻率＞0.1%。如表1所示，以全長膜連型(質體1027)及胞質型(質體1197)之MUC1建構體建造之致免疫性MUC1多肽能誘發MUC1特異性T細胞反應(包括HLA-A2限制性MUC1肽aa516-530特異性CD8+ T細胞反應)。胞質型MUC1抗原形式誘發最高強度之T細胞反應。重要的是，衍生自癌症病患之針對MUC1肽aa516-530之T細胞反應已顯示與活體外抗腫瘤效力相互關聯[Jochems C et al., Cancer Immunol Immunother(2014)63：161-174]，證明提升針對此特異性抗原決定區細胞反應之重要性。於HLA-A24小鼠中之研究
研究設計。 經由PMED給藥，以DNA建構體質體1027，於第0天接觸混合性別之HLA-A24小鼠並於第14、28及42天增強。第21天犧牲小鼠並評估脾細胞之MUC1特異性細胞免疫原性(ELISpot)。
結果。 表2顯示源自與衍生自MUC1肽庫之肽匯集(參見表15)一起培養之HLA-A24脾細胞之ELISpot數據。第3欄之數值表示以MUC1肽匯集再刺激及扣除背景值後之IFN-g斑點數/106 個脾細胞。呈粗體字之數值指示至少有1個測試之肽匯集太多而無法計數，因此真實數字至少為所述值。陽性反應界定為SFC＞100。如表2所示，膜連型MUC1建構體能誘發MUC1特異性細胞反應。於猴子中之研究
研究設計。 經由雙側肌內注射(總共1 mL) 2e11個病毒顆粒，以編碼胞質型MUC1多肽(由質體1197編碼之相同多肽)或全長膜連型MUC1多肽(由質體1027編碼之相同多肽)之腺病毒載體AdC68W接觸14隻源自中國之食蟹獼猴。29天後，經由電穿孔由肌內雙側遞送質體1197或質體1027 (總共2 mL)以增強動物。於第1天(32 mg)及第29天(50 mg)皮下給予抗CTLA-4。最後一次免疫14天後，進行動物採血並單離PBMC及血清以分別評估MUC1特異性細胞(ELISpot、ICS)及體液(ELISA)反應。於此及本揭示內容之其他實施例中所用之腺病毒載體AdC68W係根據國際專利申請案WO2015/063647中所述方法從黑猩猩腺病毒AdC68建構。NHP 特異性免疫分析
ELISpot 分析。 於IFN-g ELISpot盤中，使源自個別動物之PBMC及15聚體Ag特異性肽匯集(重疊11個胺基酸，包含全部Ag特異性胺基酸序列)，各肽2 μg/ml，每槽4e5個細胞，二重複共培育(參見表15)。於37°C、5% CO2 培育該等盤~16小時，然後依照廠商指示進行洗滌及顯影。以CTL讀取計計數IFN-g斑點形成細胞(SFC)之數量。計算二重複之平均值並減去不含肽之陰性對照槽之反應。然後將SFC計數標準化至敘述每1e6個PBMC之反應。表中之抗原特異性反應表示Ag特異性肽匯集反應之總和。
ICS 分析 。於U形底96槽盤組織培養盤中，使源自個別動物之PBMC及15聚體MUC1肽匯集(重疊11個胺基酸，包含全部原態全長MUC1胺基酸序列；參見表15)，各肽2 μg/ml，每槽1.5-2e6個PBMC共培育。於37°C、5% CO2 培育該等盤~16小時，然後染色以檢測源自CD8+ T細胞之細胞內IFN-g表現。固定後，於流式細胞儀上取得細胞。結果以每隻個別動物在扣除不含肽之陰性對照槽中所得到之反應並標準化至1e6個CD8+ T細胞後之MUC1、CEA或TERT-特異性之IFN-g+ CD8+ T細胞之數值呈現。
三明治型 ELISA 分析 。 使用Tecan Evo、Biomek FxPBioTek 405 Select TS自動化儀器進行標準三明治型ELISA分析。使用於1X PBS中之1.0 µg/mL人類MUC1或人類CEA蛋白(抗原)，以25 µl/槽塗覆於384槽微量盤(平底槽、高結合力)，並於4°C培育過夜。第二天早上，於室溫下，以於含0.05% Tween 20之PBS(PBS-T)中之5% FBS封阻該等盤1小時。於96 U形底槽盤中，以1/100起始稀釋度於PBS-T中製備源自中國的食蟹獼猴血清。於PBS-T中，Tecan Evo在9個稀釋增量點上進行½對數系列稀釋，隨後從96槽盤將25 µl/槽經稀釋之血清沖壓至384槽盤。室溫下，於振盪器上以600 RPM培育該等384槽盤1小時，然後，使用BioTek EL 405 Select TS盤洗滌器，以PBS-T洗滌諸盤4次。將與石蟹獼猴IgG交叉反應之二次恆河猴抗IgG-HRP抗體稀釋至適當稀釋度並經由Biomek FxP 以25 µl/槽沖壓至384槽盤中，然後在室溫下於振盪器上以600 RPM培育1小時，隨後重複洗滌5次。使用Biomek FxP ，將盤以25 µl/槽之RT TMB基質沖壓並於室溫下在黑暗中培育30分鐘，隨後利用25 µl/槽1N H2 SO4 之沖壓中止酵素反應。在Molecular Devices之Spectramax 340PC/384 Plus上，於波長450nm讀取諸盤。報導數據為OD 1.0時之計算力價，檢測極限為99.0。於各盤中使用抗原特異性之市售單株抗體作為陽性對照以追蹤盤對盤之變異表現；以經不相關疫苗接種之小鼠血清作為陰性對照，只有PBS-T之槽用以監測非特異性結合背景值。表中之力價表示從個別動物所引出之抗原特異性IgG力價。
結果。 表3顯示源自與衍生自MUC1肽庫之肽匯集(表15)一起培養的源自中國食蟹獼猴PBMC之ELISpot及ICS數據，及源自中國食蟹獼猴血清之ELISA數據。第3欄之數值表示以MUC1肽匯集再刺激及扣除背景值後之IFN-g斑點數/106 個PBMC。第4欄之數值表示以MUC1肽匯集再刺激及扣除背景值後之IFN-g+ CD8+ T細胞數/106 個CD8+ T細胞。第5欄之數值表示抗MUC1 IgG力價[光學密度(O.D)=1，檢測極限(L.O.D)= 99.0]。陽性反應界定為SFC ＞50、IFN-g+ CD8+ T細胞數/1e6個CD8+ T細胞＞50且IgG力價＞99。如表3所示，以胞質型(質體1197)及原態全長膜連型(質體1027)MUC1建構體建造之致免疫性MUC1多肽能誘發MUC1特異性T及B細胞反應。原態全長膜連型MUC1建構體(質體1027)顯示誘發整體最佳MUC1特異性細胞及體液反應。實施例3. CEA單抗原建構體之免疫原性於 Pasteur (HLA-A2/DR1) 小鼠中之免疫反應研究
研究設計。 經由電穿孔，於第0天以攜帶編碼人類膜連型(質體1386)或胞質型CEA多肽(質體1390)之單抗原建構體之質體接觸混合性別之HLA-A2/DR1小鼠並於第14天增強。7天後於IFN-g ELISpot及ICS分析中測量抗原特異性T細胞反應。
結果。 表4顯示源自與衍生自CEA肽庫之肽匯集(亦參見表15)一起培養的HLA-A2/DR1脾細胞之ELISpot及ICS數據，該CEA肽庫係由以建構體1386所免疫小鼠之aa1-699及以質體1390所免疫小鼠之aa37-679(移除訊息序列及GPI序列)組成。第3及第4欄之數值分別表示於以相關之CEA肽匯集再刺激及扣除背景值後所引出之 IFN-g+ 斑點/106 個脾細胞及IFN-g+ CD8+ T細胞之頻率。表5顯示源自與CEA肽aa693-701一起培養之HLA-A2/DR1脾細胞之ELISpot數據。陽性反應界定為SFC＞100且IFN-g+ CD8+ T細胞之頻率＞0.1%。如表4所示，以上文實施例1A所述之膜連型(質體1386)及胞質型(質體1390)CEA建構體建造之致免疫性CEA多肽能誘發CEA特異性T細胞反應。膜連型及胞質型CEA抗原形式二者均誘發可相較強度之CEA特異性T細胞反應。如表5所示，以膜連型建構體1386免疫可誘發針對CEA肽aa693-701之HLA-A2限制性T細胞反應，其已於文獻中顯示由HLA-A2處理及呈現[Conforti Aet al. , J Immunother (2009)32:744-754]。 於 HLA-A24 小鼠中之免疫反應研究
研究設計。 經由DNA電穿孔法，以人類膜連型(質體1386)或胞質型CEA (質體1390)DNA建構體於第0天接觸16隻混合性別之HLA-A24小鼠並於第14天增強。最後一次免疫7天後，於IFN-g ELISpot及ICS分析中測量CEA特異性T細胞反應。
結果。 表6顯示源自與衍生自CEA肽庫之肽匯集(亦參見表15)一起培養之HLA-A24脾細胞之ELISpot及ICS數據。第3欄之數值表示，在用涵蓋aa1-699之CEA肽匯集再刺激及扣除背景值後之IFN-g斑點數/106 個脾細胞。第4欄之數值表示，在用涵蓋aa37-679之CEA肽匯集再刺激及扣除背景值後CD8+ T細胞為IFN-g+ 之頻率。陽性反應界定為SFC ＞100且IFN-g+ CD8+ T細胞之頻率＞0.1%。呈粗體字之數值指示至少有1個測試之肽匯集太多而無法計數，因此真實數字至少為所述值。如表6所示，以膜連型(質體1386)及胞質型CEA (質體1390)建構體建造之致免疫性CEA多肽，如經由ELISpot所測量，能誘發可相較之CEA特異性細胞反應。然而，經由ICS測量，用胞質型CEA建構體(質體1390)疫苗接種，誘發較強之CEA特異性之IFN-g+ CD8+ T細胞反應。實施例4.免疫原性OF TERT單抗原建構體於 HLA-A2/DR1 小鼠上中之免疫反應研究
研究設計。 經由肌內注射(50 μl)1e10個病毒顆粒，以編碼截短的(D240)胞質型致免疫性TERT多肽之AdC68W腺病毒載體(質體1112)接觸6隻混合性別之HLA-A2/DR1小鼠。28天後，經由電穿孔(2x20 μl)由肌內雙側遞送編碼截短的(D240)胞質型TERT抗原之50 μg DNA (質體1112)以增強動物。7天後於IFN-g ELISpot及ICS分析中測量抗原特異性T細胞反應。
結果。 表7顯示源自分別與衍生自TERT肽庫之肽匯集(亦參見表15)或TERT肽aa861-875一起培養的HLA-A2/DR1脾細胞之ELISpot及ICS數據。第3欄之數值表示以TERT肽匯集再刺激及扣除背景值後之IFN-g斑點數/106 個脾細胞。第4欄之數值表示以TERT肽aa861-875再刺激及扣除背景值後CD8+ T細胞為IFN-g+ 之頻率。陽性反應界定為SFC＞100且IFN-g+ CD8+ T細胞之頻率＞0.1%。如表7所示，以截短的(D240)胞質型TERT建構體建造之致免疫性TERT多肽能誘發HLA-A2-限制性之TERT特異性CD8+ T細胞反應。 於 HLA-A24 小鼠中之免疫反應研究
研究設計。 經由雙側肌內注射(各脛骨前肌50 μl)總共1e10個病毒顆粒，以編碼截短的(D240)胞質型TERT多肽(由質體1112編碼之相同多肽)之AdC68W腺病毒載體接觸8隻混合性別之HLA-A24小鼠。14天後，經由電穿孔(2×20 μl)由肌內雙側遞送編碼截短的(D240)胞質型TERT多肽之50 μg DNA(質體1112)以增強動物。7天後於IFN-g ELISpot及ICS分析中測量抗原特異性T細胞反應。
結果。 表8顯示源自分別與衍生自TERT肽庫之肽匯集(亦參見表15)或TERT肽aa841-855一起培養之HLA-A24脾細胞之IFN-g ELISpot及ICS數據。第3欄之數值表示以TERT肽匯集再刺激及扣除背景值後之IFN-g斑點數/106 個脾細胞。第4欄之數值表示以TERT肽aa841-855再刺激及扣除背景值後CD8+ T細胞為IFN-g+ 之頻率。呈粗體字之數值指示至少有1個測試之肽匯集太多而無法計數，因此真實數字至少為所述值。陽性反應界定為SFC＞100且IFN-g+ CD8+ T細胞之頻率＞0.1%。如表8所示，以截短的(D240)胞質型TERT建構體(質體1112)建造之致免疫性TERT多肽能誘發HLA-A24-限制性之TERT特異性CD8+ T細胞反應。 於猴子中之免疫反應研究
研究設計。 經由雙側肌內注射(總共1 mL) 2e11個病毒顆粒，以編碼截短的(D240)胞質型TERT抗原之AdC68W腺病毒載體(質體1112)接觸8隻源自中國之食蟹獼猴。30及64天後，經由電穿孔由肌內雙側遞送(總共2 mL)編碼截短的(D240)胞質型TERT抗原之DNA(質體1112)以增強動物。於第1天(32 mg)、第31天(50 mg)及第65天(75 mg)皮下給予抗CTLA-4。最後一次免疫14天後，進行動物採血並單離PBMC以評估TERT特異性細胞(ELISpot、ICS)反應。
結果。 表9顯示源自與衍生自TERT肽庫之肽匯集(亦參見表15)一起培養的源自中國食蟹獼猴PBMC之ELISpot及ICS數據。第3欄之數值表示以TERT肽匯集再刺激及扣除背景值後之IFN-g斑點數/106 個脾細胞。第4欄之數值表示以TERT肽匯集再刺激及扣除背景值後之 IFN-g+ CD8+ T細胞數/106 個CD8+ T細胞。陽性反應界定為SFC＞50且IFN-g+ CD8+ T細胞數/1e6個CD8+ T細胞＞50。如表9所示，以截短的(D240)胞質型TERT建構體(質體1112)建造之致免疫性TERT多肽能誘發TERT特異性T細胞反應。實施例5.雙抗原建構體之免疫原性於猴子中之免疫反應研究
研究設計。 經由雙側肌內注射(總共1 mL) 2e11個病毒顆粒，以編碼人類原態全長膜連型MUC1 (MUC1)及人類截短的(D240)胞質型TERT(TERTD 240 )多肽(質體1270、1271及1269)之雙抗原腺病毒AdC68W載體接觸24隻源自中國之食蟹獼猴。30及64天後，經由電穿孔由肌內雙側遞送(總共2 mL)編碼相同兩種抗原之雙抗原DNA建構體(質體1270、1271及1269)以增強動物。於第1天(32 mg)、第31天(50 mg)及第65天(75 mg)皮下給予抗CTLA-4。最後一次免疫14天後，進行動物採血且單離PBMC及血清以分別評估MUC1及TERT特異性細胞(ELISpot、ICS)與MUC1特異性體液(ELISA)反應。總共，評估共表現兩種抗原之三種不同之雙抗原疫苗建構體：a)MUC1-2A-TERTD 240 (質體1270)，AdC68W載體及編碼經由2A肽連接MUC1與TERT之DNA質體；b)TERTD 240 -2A-MUC1(質體1271)，AdC68W載體及編碼經由2A肽連接TERT與MUC1之DNA質體；c)MUC1-TERTD 240 (質體1269)，AdC68W載體及編碼MUC1-TERT融合蛋白之DNA質體。
結果。 表10顯示源自與衍生自MUC1及TERT肽庫之肽匯集(亦參見表15)一起培養之源自中國食蟹獼猴PBMC之ELISpot及ICS數據，及源自中國食蟹獼猴血清之ELISA數據。陽性反應界定為SFC＞50、IFN-g+ CD8+ T細胞數/1e6個CD8+ T細胞＞50及IgG力價＞99。第3及6欄之數值分別表示以MUC1及TERT肽匯集再刺激及扣除背景值後之IFN-g斑點數/106 個脾細胞。呈粗體字之數值指示至少有1個測試之肽匯集太多而無法計數，因此真實數字至少為所述值。第4及7欄之數值分別表示以MUC1肽匯集及TERT肽匯集再刺激及扣除背景值後之IFN-g+ CD8+ T細胞數/106 個CD8+ T細胞。第5欄之數值表示抗MUC1之IgG力價[光學密度(O.D)=1、檢測極限(L.O.D)=99.0]。如表10所示，以MUC1及TERT表現雙抗原建構體(質體1270、1271及1269)建造之致免疫性MUC1及TERT多肽能誘發MUC1及TERT特異性T細胞反應與MUC1特異性B細胞反應。編碼MUC1-TERT融合蛋白之雙抗原建構體1269顯示誘發最強之整體MUC1特異性細胞反應；對照之下，雙抗原建構體質體1271(TERT-2A-MUC1)顯示誘發最強之整體TERT特異性細胞反應。三種雙抗原建構體全部顯示誘發可相較之MUC1特異性體液反應。實施例6.三抗原建構體之免疫原性
實施例6說明攜帶表現人類原態全長膜連型MUC1多肽(MUC1)、人類膜連型或胞質型CEA多肽(mCEA或cCEA)及人類截短的(D240)胞質型TERT多肽(TERTD 240 )之三抗原建構體之質體及腺病毒載體引出對全部三種經編碼癌抗原之Ag特異性之T及B細胞反應之能力。於 C57BL/6J 小鼠中使用 DNA 電穿孔法之免疫反應研究
研究設計。 以編碼人類MUC1、mCEA或cCEA及TERTD 240 之三抗原DNA建構體免疫48隻C57BL/6J母小鼠。於接觸/增強療法中，伴隨電穿孔由肌內雙側遞送(各脛骨前肌總共20 μl)三抗原DNA疫苗(50 μg)，各疫苗接種間間隔兩週。最後一次免疫7天後，分別於IFN-g ELISpot分析及ELISA分析中測量MUC1、CEA及TERT特異性細胞反應與MUC1及CEA特異性體液反應。總共，使用六種不同之攜帶各編碼由2A肽連接的三種TAA多肽之三抗原DNA建構體質體如下：MUC1-2A-TERTD 240 -2A-mCEA (質體1424)、mCEA-2A-MUC1-2A-TERTD 240 (質體1425)、TERTD 240 -2A-MUC1-2A-mCEA(質體1426)、 TERTD 240 -2A-mCEA-2A-MUC1(質體1427)、 MUC1-2A-cCEA-2A-TERTD 240 (質體1428)、 cCEA-2A-TERTD 240 -2A-MUC1 (質體1429)。
結果。 表11A-C顯示源自與衍生自MUC1、CEA及TERT肽庫之肽匯集(亦參見表15)一起培養之C57BL/6J脾細胞之ELISpot數據、源自與TERT肽aa1025-1039一起培養之C57BL/6J脾細胞之ICS數據及源自C57BL/6J小鼠血清之ELISA數據。陽性反應界定為SFC ＞100、IFN-g+ CD8+ T細胞之頻率＞0.1%及IgG力價＞99。表11A-C第3欄之數值分別表示於以MUC1、CEA或TERT肽匯集再刺激及扣除背景值後之IFN-g斑點數/106 個脾細胞。呈粗體字之數值指示至少有1個測試之肽匯集太多而無法計數，因此真實數字至少為所述值。表11A-B第4欄之數值分別表示抗MUC1及CEAIgG力價[光學密度(O.D)=1、檢測極限(L.O.D)=99.0]。表11C第4欄之數值表示以TERT特異性肽TERT aa1025-1039再刺激及扣除背景值後CD8+ T細胞為IFN-g+ 之頻率。如表11A-C所示，以表現MUC1、CEA及TERT之三抗原建構體建造之致免疫性MUC1、CEA及TERT多肽能誘發針對全部三種抗原之T細胞反應及針對MUC1之B細胞反應。對照之下，儘管含三抗原建構體(質體1424-1427)之mCEA能誘發針對CEA之B細胞反應，然而含三抗原建構體(質體1428-1429)之cCEA誘發較弱或者不具CEA特異性之B細胞反應。 於 C57BL/6J 小鼠中使用腺病毒 載體之免疫反應研究
研究設計。 經由肌內注射(各脛骨前肌50 μl)1e10個病毒顆粒，以編碼人類MUC1、mCEA或cCEA及TERTD 240 之三抗原腺病毒載體接觸48隻C57BL/6J母小鼠。14天後，伴隨電穿孔由肌內雙側遞送(各脛骨前肌20 μl)三抗原DNA建構體(50 μg)以增強動物。最後一次免疫7天後，分別於IFN-g ELISpot及ICS分析與ELISA分析中測量MUC1、CEA及TERT特異性細胞反應與MUC1及mCEA特異性體液反應。總共，使用六種三抗原腺病毒及編碼由2A肽連接之MUC1、mCEA或cCEA及TERTD 240 之DNA建構體如下：MUC1-2A-TERTD 240 -2A-mCEA(質體1424)、mCEA-2A-MUC1-2A-TERTD 240 (質體1425)、TERTD 240 -2A-MUC1-2A-mCEA (質體1426)、TERTD 240 -2A-mCEA-2A-MUC1(質體1427)、MUC1-2A-cCEA-2A-TERTD 240 (質體1428)、cCEA-2A-TERTD 240 -2A-MUC1 (質體1429)。
結果。 表12A-C顯示源自與衍生自MUC1、CEA及TERT肽庫之肽匯集(亦參見表15)一起培養之C57BL/6J脾細胞之ELISpot數據、源自與TERT肽aa1025-1039一起培養之C57BL/6J脾細胞之ICS數據及源自C57BL/6J小鼠血清之ELISA數據。陽性反應界定為SFC ＞100、IFN-g+ CD8+ T細胞之頻率＞0.1%及IgG力價＞99。表12A-C第3欄數之值分別表示於以MUC1、CEA或TERT肽匯集再刺激及扣除背景值後之IFN-g斑點數/106 個脾細胞。呈粗體字之數值指示至少有1個測試之肽匯集太多而無法計數，因此真實數字至少為所述值。表12C第4欄之數值表示以TERT特異性肽TERT aa1025-1039再刺激及扣除背景值後之IFN-g+ CD8+ T細胞數/106 個CD8+ T細胞。表12A-B第4欄之數值分別表示抗MUC1及抗CEA之IgG力價[光學密度(O.D)=1、檢測極限(L.O.D)= 99.0]。如表12A-C所示，以表現MUC1、CEA及TERT之三抗原建構體建造之致免疫性MUC1、CEA及TERT多肽能誘發針對全部三種抗原之T細胞反應及針對MUC1之B細胞反應。對照之下，儘管含三抗原建構體(質體1424-1427)之mCEA能誘發針對CEA之B細胞反應，然而含三抗原建構體(質體1428-1429)之cCEA誘發較弱或者不具CEA特異性之B細胞反應。 於 HLA-A24 小鼠中之免疫反應研究
研究設計。 經由肌內注射(各脛骨前肌50μl)1e10個病毒顆粒，以編碼人類MUC1、mCEA或cCEA及TERTD 240 之腺病毒AdC68Y三抗原建構體(質體1426：TERTD 240 -2A-MUC1-2A-mCEA或質體1428：MUC1-2A-cCEA-2A-TERTD 240 )接觸16隻混合性別之HLA-A24小鼠。14天後，以編碼相同三種抗原之50 μg三抗原DNA建構體(質體1426或1428)由肌內增強動物(伴隨電穿孔遞送20 μl至各脛骨前肌)。最後一次免疫7天後，於IFN-g ELISpot分析中測量HLA-A24-限制性MUC1特異性細胞反應。
結果。 表13顯示源自與MUC1肽aa524-532一起培養的HLA-A24脾細胞之ELISpot數據。陽性反應界定為SFC＞50。第3欄之數值表示以MUC1肽aa524-532再刺激及扣除背景值後之IFN-g斑點數/106 個脾細胞。如表13所示，以表現MUC1、CEA及TERT之三抗原建構體1426及1428建造之致免疫性MUC1多肽能誘發HLA-A24-限制性MUC1肽aa524-532特異性CD8+ T細胞反應。重要的是，衍生自癌症病患之針對此特異性MUC1肽之T細胞反應已顯示與活體外抗腫瘤效力相關聯[Jochems C et al., Cancer Immunol Immunother (2014)63:161-174]，證明提升針對此特異性抗原決定區細胞反應之重要性。 於猴子中之免疫反應研究
研究設計。 於第1天，經由雙側肌內注射(總共1 mL)2e11個病毒顆粒，以編碼人類原態全長膜連型MUC1(MUC1)、人類膜連型或胞質型CEA(mCEA或cCEA)及人類截短的(D240)胞質型TERT(TERTD 240 )抗原之AdC68Y腺病毒載體接觸42隻源自中國之食蟹獼猴。第30天及第57天，經由電穿孔由肌內雙側遞送編碼相同三種抗原之DNA(總共2 mL)以增強動物。於第1天(32 mg)、第30天(50 mg)及第57天(75 mg)皮下給予抗CTLA-4。最後一次免疫15天後，進行動物採血且單離PBMC及血清以分別評估MUC1、CEA及TERT特異性細胞(ELISpot、ICS)與MUC1及mCEA特異性體液(ELISA)反應。總共，評估六種三抗原腺病毒及編碼由2A肽連接之MUC1、mCEA或cCEA及TERTD 240 之DNA建構體如下： MUC1-2A-TERTD 240 -2A-mCEA(質體1424)、 mCEA-2A-MUC1-2A-TERTD 240 (質體1425)、 TERTD 240 -2A-MUC1-2A-mCEA(質體1426)、 TERTD 240 -2A-mCEA-2A-MUC1(質體1427)、 MUC1-2A-cCEA-2A-TERTD 240 (質體1428)、 cCEA-2A-TERTD 240 -2A-MUC1(質體1429)。
結果。 表14A、14B及14C顯示源自與衍生自MUC1、CEA及TERT肽庫之肽匯集(亦參見表15)一起培養的源自中國食蟹獼猴PBMC之ELISpot及ICS數據，及源自中國食蟹獼猴血清之ELISA數據。陽性反應界定為SFC＞50、IFN-g+ CD8+ T細胞數/1e6個CD8+ T細胞＞50及IgG力價＞99。表14A-C第3欄之數值分別表示以MUC1、CEA或TERT肽匯集再刺激及扣除背景值後之IFN-g斑點數/106 個脾細胞。呈粗體字之數值指示至少有1個測試之肽匯集太多而無法計數，因此真實數字至少為所述值。表14A-C第4欄之數值分別表示以MUC1、CEA或TERT肽匯集再刺激及扣除背景值後之IFN-g+ CD8+ T細胞數/106 個CD8+ T細胞。表14A-B第5欄之數值分別表示抗MUC1及抗CEA之IgG力價[光學密度(O.D)=1、檢測極限(L.O.D)=99.0]。如表14A-C所示，以表現MUC1、CEA及TERT之三重Ag建構體建造之致免疫性MUC1、CEA及TERT多肽能誘發細胞針對全部三種抗原之細胞反應及針對MUC1之體液反應。然而，含mCEA之三抗原建構體比含cCEA者誘發更強之CEA特異性B細胞反應。 表18. 序列索引 序列說明(部分)
圖1.描述攜帶三抗原建構體(即，稱為載體AdC68Y-1424、AdC68Y-1425、AdC68Y-1426、AdC68Y-1427、 AdC68Y-1428及AdC68Y-1429)的AdC68載體結構之圖式。E1及E3缺失的AdC68載體骨架之設計係源自Genbank參考序列AC_000011.1。轉殖基因開放閱讀框架嵌入E1區域，在CMV立即早期增強子/啓動子及SV40多腺苷酸終止子之間。tet操緃子序列嵌入啓動子之後。

Claims (31)

  1. 一種抗原建構體，其包含編碼致免疫性CEA多肽之核苷酸序列。
  2. 根據申請專利範圍第1項之抗原建構體，其進一步包含編碼致免疫性MUC1多肽之核苷酸序列。
  3. 根據申請專利範圍第1項之抗原建構體，其進一步包含編碼致免疫性TERT多肽之核苷酸序列。
  4. 根據申請專利範圍第1項之抗原建構體，其進一步包含編碼致免疫性MUC1多肽之核苷酸序列和編碼致免疫性TERT多肽之核苷酸序列。
  5. 根據申請專利範圍第4項之抗原建構體，其進一步包含間隔子核苷酸序列。
  6. 根據申請專利範圍第5項之抗原建構體，其中該間隔子核苷酸序列編碼2A肽。
  7. 根據申請專利範圍第5項之抗原建構體，其中該間隔子核苷酸序列編碼選自由EMC2A、ERA2A、ERB2A及T2A所組成組群之2A肽。
  8. 根據申請專利範圍第1至7項中任一項之抗原建構體，其中該致免疫性CEA多肽係選自由下列所組成之群組： 　　(1)包含SEQ ID NO：2之胺基酸2-702、SEQ ID NO：2之胺基酸323-702或SEQ ID NO：2之胺基酸323-677或由其組成之多肽； 　　(2)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列或SEQ ID NO：15之胺基酸4-704或由其組成之多肽； 　　(3)包含SEQ ID NO：17胺基酸序列或SEQ ID NO：17胺基酸4-526或由其組成之多肽； 　　(4)包含SEQ ID NO：19胺基酸序列或SEQ ID NO：19胺基酸4-468或由其組成之多肽；及 　　(5)上述(1)至(4)之任一多肽的功能性變異體之多肽。
  9. 根據申請專利範圍第3至7項中任一項之抗原建構體，其中該致免疫性TERT多肽係選自由下列所組成之群組： 　　(1)包含SEQ ID NO：9胺基酸序列或SEQ ID NO：9胺基酸2-893之多肽； 　　(2)包含SEQ ID NO：11胺基酸序列或SEQ ID NO：11胺基酸3-791之多肽； 　　(3)包含SEQ ID NO：13胺基酸序列或SEQ ID NO：13胺基酸4-594之多肽；及 　　(4)上述(1)至(3)之任一多肽的功能性變異體之多肽。
  10. 根據申請專利範圍第2及4至7項中任一項之抗原建構體，其中該致免疫性MUC1多肽係選自由下列所組成之群組： 　　(1)包含SEQ ID NO：5胺基酸序列或SEQ ID NO：5胺基酸4-537之多肽； 　　(2)包含SEQ ID NO：7胺基酸序列或SEQ ID NO：7胺基酸4-517之多肽；及 　　(3)上述(1)或(2)之多肽之功能性變異體。
  11. 根據申請專利範圍第1項之抗原建構體，其包含編碼選自由下列所組成群組的胺基酸序列之核苷酸序列： 　　(1) SEQ ID NO：31胺基酸序列或包含SEQ ID NO：31胺基酸4-1088之胺基酸序列； 　　(2) SEQ ID NO：33胺基酸序列或包含SEQ ID NO：33胺基酸4-1081之胺基酸序列； 　　(3) SEQ ID NO：35胺基酸序列或包含SEQ ID NO：35胺基酸4-1085之胺基酸序列； 　　(4) SEQ ID NO：37胺基酸序列或包含SEQ ID NO：37胺基酸4-1030之胺基酸序列； 　　(5) SEQ ID NO：39胺基酸序列或包含SEQ ID NO：39胺基酸4-1381之胺基酸序列；及 　　(6) SEQ ID NO：41胺基酸序列或包含SEQ ID NO：41胺基酸4-1441之胺基酸序列。
  12. 根據申請專利範圍第1項之抗原建構體，其包含選自由下列所組成群組之核苷酸序列： 　　(1) SEQ ID NO：30核苷酸序列或包含SEQ ID NO：30核苷酸10-3264之核苷酸序列； 　　(2) SEQ ID NO：32核苷酸序列或包含SEQ ID NO：32核苷酸10-3243之核苷酸序列； 　　(3) SEQ ID NO：34核苷酸序列或包含SEQ ID NO：34核苷酸10-3255之核苷酸序列； 　　(4) SEQ ID NO：36核苷酸序列或包含SEQ ID NO：36核苷酸10-3090之核苷酸序列； 　　(5) SEQ ID NO：38核苷酸序列或包含SEQ ID NO：38核苷酸10-4143之核苷酸序列； 　　(6) SEQ ID NO：40核苷酸序列或包含SEQ ID NO：40核苷酸10-4323之核苷酸序列；及 　　(7)上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
  13. 根據申請專利範圍第1項之抗原建構體，其包含編碼選自由下列所組成群組的胺基酸序列之核苷酸序列： 　　(1) SEQ ID NO：43胺基酸序列或包含SEQ ID NO：43胺基酸4-2003之胺基酸序列； 　　(2) SEQ ID NO：45胺基酸序列或包含SEQ ID NO：45胺基酸4-2001之胺基酸序列； 　　(3) SEQ ID NO：47胺基酸序列或包含SEQ ID NO：47胺基酸4-2008之胺基酸序列； 　　(4) SEQ ID NO：49胺基酸序列或包含SEQ ID NO：49胺基酸4-1996之胺基酸序列； 　　(5) SEQ ID NO：51胺基酸序列或包含SEQ ID NO：51胺基酸4-1943之胺基酸序列； 　　(6) SEQ ID NO：53胺基酸序列或包含SEQ ID NO：53胺基酸4-1943之胺基酸序列；及 　　(7)上述(1)至(6)之任一胺基酸序列之功能性變異體。
  14. 根據申請專利範圍第1項之抗原建構體，其包含選自由下列所組成群組之核苷酸序列： 　　(1) SEQ ID NO：42核苷酸序列或包含SEQ ID NO：42核苷酸10-6009之核苷酸序列； 　　(2) SEQ ID NO：44核苷酸序列或包含SEQ ID NO：44核苷酸10-6003之核苷酸序列； 　　(3) SEQ ID NO：46核苷酸序列或包含SEQ ID NO：46核苷酸10-6024之核苷酸序列； 　　(4) SEQ ID NO：48核苷酸序列或包含SEQ ID NO：48核苷酸10-5988之核苷酸序列； 　　(5) SEQ ID NO：50核苷酸序列或包含SEQ ID NO：50核苷酸10-5829之核苷酸序列； 　　(6) SEQ ID NO：52核苷酸序列或包含SEQ ID NO：52核苷酸10-5829之核苷酸序列；及 　　(7)上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
  15. 根據申請專利範圍第1項之抗原建構體，其包含： 　　(1) SEQ ID NOS：87、88、89、90、91及92中任一核苷酸序列；或 　　(2) SEQ ID NOS：87、88、89、90、91及92中任一核苷酸序列之簡併變異體。
  16. 一種載體，其包含根據申請專利範圍第1至7項中任一項之抗原建構體。
  17. 根據申請專利範圍第16項之載體，其中該抗原建構體包含編碼選自由下列所組成群組的胺基酸序列之核苷酸序列： 　　(1) SEQ ID NO：43胺基酸序列或包含SEQ ID NO：43胺基酸4-2003之胺基酸序列； 　　(2) SEQ ID NO：45胺基酸序列或包含SEQ ID NO：45胺基酸4-2001之胺基酸序列； 　　(3) SEQ ID NO：47胺基酸序列或包含SEQ ID NO：47胺基酸4-2008之胺基酸序列； 　　(4) SEQ ID NO：49胺基酸序列或包含SEQ ID NO：49胺基酸4-1996之胺基酸序列； 　　(5) SEQ ID NO：51胺基酸序列或包含SEQ ID NO：51胺基酸4-1943之胺基酸序列； 　　(6) SEQ ID NO：53胺基酸序列或包含SEQ ID NO：53胺基酸4-1943之胺基酸序列；及 　　(7)上述(1)至(6)之任一胺基酸序列之功能性變異體。
  18. 根據申請專利範圍第16項之載體，其中該抗原建構體包含選自由下列所組成群組之核苷酸序列： 　　(1) SEQ ID NO：42核苷酸序列或包含SEQ ID NO：42核苷酸10-6009之核苷酸序列； 　　(2) SEQ ID NO：44核苷酸序列或包含SEQ ID NO：44核苷酸10-6003之核苷酸序列； 　　(3) SEQ ID NO：46核苷酸序列或包含SEQ ID NO：46核苷酸10-6024之核苷酸序列； 　　(4) SEQ ID NO：48核苷酸序列或包含SEQ ID NO：48核苷酸10-5988之核苷酸序列； 　　(5) SEQ ID NO：50核苷酸序列或包含SEQ ID NO：50核苷酸10-5829之核苷酸序列； 　　(6) SEQ ID NO：52核苷酸序列或包含SEQ ID NO：52核苷酸10-5829之核苷酸序列；及 　　(7)上述(1)至(6)之任一核苷酸序列的簡併變異體之核苷酸序列。
  19. 根據申請專利範圍第16項之載體，其為質體載體。
  20. 根據申請專利範圍第18項之載體，其包含SEQ ID NOs：57、59、61、63、65、67、69、70、71、72、73及74中任一核苷酸序列。
  21. 根據申請專利範圍第16項之載體，其為病毒載體。
  22. 根據申請專利範圍第21項之載體，其包含SEQ ID NOs：58、60、62、64、66及68中任一核苷酸序列。
  23. 一種醫藥組成物，其包含(i)根據申請專利範圍第16項之載體；和(ii)醫藥上可接受之載劑。
  24. 根據申請專利範圍第23項之醫藥組成物，其為疫苗。
  25. 一種根據申請專利範圍第16項之載體於製造用於治療人體癌症的藥劑之用途。
  26. 根據申請專利範圍第25項之用途，其中該癌症過度表現選自MUC1、CEA或TERT之一或多種腫瘤相關抗原。
  27. 根據申請專利範圍第25項之用途，其中該癌症為胰臟癌、卵巢癌、乳癌、胃癌、肺癌或結腸直腸癌。
  28. 根據申請專利範圍第25項之用途，其中該癌症為三重陰性乳癌、雌激素受體陽性乳癌或HER2陽性乳癌。
  29. 根據申請專利範圍第25項之用途，其中該藥劑進一步包含免疫調節劑。
  30. 根據申請專利範圍第29項之用途，其中該免疫調節劑為CTLA-4抑制劑、IDO1抑制劑、PD-1抑制劑或PD-L1抑制劑。
  31. 根據申請專利範圍第29項之用途，其中該藥劑進一步包含佐劑。
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